CN109439602B - 嗜盐弧菌yl5-2及其菌剂在高盐条件下降解转化污染物中的应用 - Google Patents

嗜盐弧菌yl5-2及其菌剂在高盐条件下降解转化污染物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了嗜盐弧菌YL5‑2及其菌剂在高盐条件下降解转化污染物中的应用。嗜盐弧菌YL5‑2可应用于高盐条件下进行污染物的降解转化，特别是超高盐废水的处理，污染物降解率高达95％左右。

Description

嗜盐弧菌YL5-2及其菌剂在高盐条件下降解转化污染物中的 应用
技术领域
本发明属于微生物领域，涉及嗜盐弧菌YL5-2及其菌剂在高盐条件下降解转化污染物中的应用。
背景技术
嗜盐微生物是在高盐环境下能够正常生长、繁衍的一类极端微生物，尤其在高盐环境治理方面体现出巨大的开发潜力。常见的嗜盐菌属包括嗜盐球菌属Halococcus、嗜盐杆菌属Halobacterium、嗜盐单胞菌属Halomonas、嗜盐弧菌属Halovibrio、盐水球菌属Salinicoccus、海球菌属Marinococcus、芽孢杆菌属Bacillus、交替单胞菌属Alteromonas、不动杆菌属Acinetobacter、海单胞菌属Marinomonas、产黄菌属Flavobacterium、盐红菌属Halrubrum、富盐菌属Haloferax、盐合菌属Haloarcula、盐棒杆菌属Halobaculum、无色嗜盐菌属Natialba、嗜盐碱单胞菌属Natronomonas、嗜盐碱球菌属Natronoccoccus等。
嗜盐弧菌属Halovibrio是一类重要的嗜盐微生物，但是目前该属仅有2个种。Fendrich(Fendrich C.Halovibrio variabilis gen.nov.sp.nov.,Pseudomonashalophila sp.nov.and a new halophilic aerobic coccoid eubacterium from GreatSalt Lake,Utah,USA.Syst Appl Microbiol 1988；11:36–43.)于1988年从美国大盐湖中分离得到得到第一个嗜盐弧菌Halovibrio variabilis。直到2006年，Sorokin DY等(Tourova TP,Galinski EA,Belloch C,Tindall BJ.Extremely halophilicdenitrifying bacteria from hypersaline inland lakes,Halovibrio denitrificanssp.nov.and Halospina denitrificans gen.nov.,sp.nov.,and evidence that thegenus name Halovibrio Fendrich 1989 with the type species Halovibriovariabil.Int J Syst Evol Microbiol 2006；56:379–388.)从一个内陆盐湖中分离得到嗜盐弧菌属Halovibrio的第二个种Halovibrio denitrificans。目前Halovibrio属仅有Halovibrio variabilis与Halovibrio denitrificans两个种，对应的模式菌分别是Halovibrio variabilis DSM 3050T与Halovibrio denitrificans DSM 15503T。
高盐环境中已分离得到的嗜盐弧菌Halovibrio属都属极端嗜盐菌，能够在NaCl质量分数大于10％甚至20％以上的环境条件下快速的生长代谢，在环境污染治理方面具有很大的应用潜力。从高盐环境中筛选Halovibrio新菌种，将其制备成环保微生物菌剂并进行应用，一直是环境工作者需要解决的技术难题之一。
发明内容
本发明的目的之一是提供嗜盐弧菌YL5-2在高盐条件下降解转化污染物中的应用。
本发明的目的之二将嗜盐弧菌(Halovibrio)新菌种制备成的环保微生物菌剂应用于高盐条件下污染物的降解及转化。
本发明要解决的技术问题是通过以下技术方案实现的：
保藏号为CGMCC NO.16315的嗜盐弧菌Halovibrio sp.YL5-2在制备用于高盐条件下污染物降解转化的微生物菌剂中的应用；所述污染物选自乙酸、丙酸、葡萄糖、乙醇、丙醇、NO3 -、NO2 -中的一种或多种。
本发明公开的嗜盐弧菌Halovibrio sp.YL5-2保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，其保藏号为CGMCC NO.16315，保藏日期为2018年8月20日。
本发明公开的嗜盐弧菌Halovibrio sp.YL5-2为嗜盐弧菌(Halovibrio)属新菌种，证明材料如下：
本发明嗜盐弧菌Halovibrio sp.YL5-2的16S rRNA序列的GenBank/EMBL/DDBJ的登录号为MF782425，全基因组序列的GenBank/EMBL/DDBJ的登录号为NSKD00000000。
本发明嗜盐弧菌Halovibrio sp.YL5-2的16S rRNA与Halovibrio variabilisDSM3050T的16S rRNA相似性为97.7％，与Halovibrio denitrificans DSM15503T的相似性为97.3％，与Halospina denitrificans HGD 1-3T的相似性为95.5％，与Halospina属其他类型的菌株之间的16S rRNA基因序列相似性水平低于97.0％。YL5-2与Halovibriovariabilis DSM 3050、Halovibrio denitrificans DSM15503的DNA-DNA杂交值分别为43.5％和38.2％，远低于70％的阈值(物种划分通常被接受的阈值)。
本发明嗜盐弧菌Halovibrio sp.YL5-2为革兰氏阴性、好氧、直杆状或0.5～0.8μm×1.0～3.5μm的小弧菌性状，并且通过单极性鞭毛运动，其固体培养基上的菌落为光滑和浅黄色。
本发明嗜盐弧菌Halovibrio sp.YL5-2能够在盐浓度3％～30％、pH6.5～11.0、温度15～45℃范围内生长；最适生长盐环境为10％～25％，最适生长pH为7.5～8.0、最适生长温度为35℃。
本发明嗜盐弧菌Halovibrio sp.YL5-2主要的呼吸醌为Q-9，主要的脂肪酸为C18:1ω9c,C16:0,C19:0cycloω8c和Summed Feature 8，主要的极性脂质是Diphosphatidylglycerol(DPG)，Phosphatidylethanolamine(PE)，Phosphatidylglycerol(PG)，Phosphatidylcholine(PC)，均与YL5-2的亲缘种Halovibrio相同或接近。
本发明嗜盐弧菌Halovibrio sp.YL5-2可以利用溴-琥珀酸，丙酸和乙酸作为唯一碳源利用；但不能利用D-麦芽糖，D-果糖，D-半乳糖，D-纤维二糖，水苏糖，D-蜜二糖，N-乙酰基-D半乳糖胺，D-岩藻糖，L-鼠李糖，D-甘露醇，D-半乳糖醛酸，D-天冬氨酸，D-丝氨酸，D-葡萄糖醛酸，L-乳酸，奎尼酸，粘酸，D-苹果酸，γ-氨基-丁酸，甲酸，乙酰乙酸作为唯一碳源。嗜盐弧菌Halovibrio sp.YL5-2与Halovibrio variabilis DSM 3050T、Halovibriodenitrificans DSM 15503T及其它亲缘种的生理生化特征有明显差别。
基于16SrRNA系统发育分析、基因组测序、DNA杂交试验、脂肪酸构成、呼吸醌类别、生理生化和表型特征等差异，可以确定菌株YL5-2为Halovibrio属的新物种，命名为Halovibrio salipaludis sp.nov。本发明菌株YL5-2保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心的菌株为嗜盐弧菌Halovibrio sp.YL5-2。
所述的微生物菌剂优选复合微生物菌剂。
保藏号为CGMCC NO.16315的嗜盐弧菌Halovibrio sp.YL5-23在高盐条件下降解转化污染物中的应用；所述污染物选自乙酸、丙酸、葡萄糖、乙醇、丙醇、NO3 -、NO2 -中的一种或多种。
本发明嗜盐弧菌Halovibrio sp.YL5-2可以在盐浓度3％～32％范围内降解污染物，可以用于盐浓度超过3％的高盐废水处理，特别是盐浓度10％～25％的高盐废水的处理。
含有保藏号为CGMCC NO.16315的嗜盐弧菌Halovibrio sp.YL5-2的微生物菌剂在高盐条件下降解转化污染物中的应用；所述污染物选自乙酸、丙酸、葡萄糖、乙醇、丙醇、NO3 -、NO2 -中的一种或多种。
所述的微生物菌剂优选复合微生物菌剂，除Halovibrio sp.YL5-2菌液外还包含其他功能菌剂。
作为本发明的一种优选实施方式,所述的微生物菌剂除Halovibrio sp.YL5-2菌液外还包含保藏号为DSM 15503的嗜盐弧菌Halovibrio denitrificans DSM 15503菌液。
作为本发明的另一种优选实施方式,所述的微生物菌剂除Halovibrio sp.YL5-2菌液外还包含利用海水在TDS＞10％条件下富集培养得到的菌液。
有益效果：
本发明基于新发现的嗜盐弧菌Halovibrio sp.YL5-2提供了该菌及其制备的菌剂在高盐条件下降解转化含乙酸、丙酸、葡萄糖、乙醇、丙醇、NO3 -、NO2 -中的一种或多种污染物中的应用。本发明在对上述污染的降解率高达95％。
附图说明：
图1嗜盐弧菌Halovibrio sp.YL5-2细胞的透射电子显微镜(TEM)照片(比例尺为2μm)；
图2是嗜盐弧菌Halovibrio sp.YL5-2(a)与Halovibrio denitrificansDSM15503T(b)，Halovibrio variabilis DSM 3050T(c)的极性脂质图谱。
上述3种菌株的所有极性脂质，用含10％磷钼酸的95％乙醇染色的TLC板检测总脂质(如上图所示)，含0.2％茚三酮的1-丁醇用于检测氨基脂质(未示出)，钼蓝试剂(Sigma)用于检测磷脂(未示出)，Dragendorff试剂(Sigma)用于检测胆碱(未示出)；DPG：diphosphatidylglycerol；PG：phosphatidylglycerol；AL：Aminolipid；PL：Phospholipid；PE：Phosphatidylethanolamine；PGNL：Phosphoaminoglycolipid；f：第一维度；s：第二维度。
图3是嗜盐弧菌Halovibrio sp.YL5-2与Halovibrio denitrificans DSM15503构建的基于16S rRNA的的系统发育树图。
该图用于描述嗜盐弧菌Halovibrio sp.YL5-2与Halovibrio denitrificansDSM15503及其它种属。系统发育树分支点处的数字表示置信值>50％(1000次重复)。标尺表示100个核苷酸中有5个被替换。将Pontibacter mucosus PB3T作为外类群。每种菌株都标明了GenBank登录号。
图4是嗜盐弧菌Halovibrio sp.YL5-2与Halovibrio variabilis DSM 3050T及其它菌种基于16S rRNA的最大简约法(MP)构建的系统发育树图。该图用于描述嗜盐弧菌Halovibrio sp.YL5-2与Halovibrio variabilis DSM 3050T及其它菌种的分类群之间的关系。Marinobacter oulmenensis Set74T(AY130994)作为外类群。括号里为GenBank登录号。系统发育树分支点处的数字表示置信值>50％(1000次重复)
图5是嗜盐弧菌Halovibrio sp.YL5-2基于GGD矩阵构建的系统发育树图。该图以外类群Marinobacterium aestuarii ST58-10T作为根节点，使用软件FastME构建的基于基因组-基因组(GGD)的系统发育树
生物材料保藏信息
YL5-2，分类命名为Halovibrio salipaludis，保藏日期为2018年8月20日，保藏单位为中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号：CGMCC NO.16315。
具体实施方式
实施例1嗜盐弧菌Halovibrio sp.YL5-2的分离及保藏
嗜盐弧菌Halovibrio sp.YL5-2是从中国青海省格尔木察尔汗盐湖(36°51′N,94°95′E)沉积土壤中分离得到。察尔汗盐湖湖水常年为饱和盐浓度或接近饱和盐浓度。
配置NaCl浓度为20％的LB液体培养基，并加入甘油250mg/L、葡萄糖250mg/L、甲醇50mg/L，在30～35℃条件下对察尔汗盐湖沉积土壤富集培养24～72h。利用YL固体培养基对富集培养液中的菌株进行分离。1L培养基中含有以下组分：葡萄糖：0.6g，柠檬酸三钠0.5g，甘油2mL，酵母提取物0.8g，蛋白胨1.6g，磷酸氢二钾0.35g，磷酸二氢钾0.1g，硫酸铵0.25g，氯化铵0.25g，MgSO4 0.5g，CaCl2 0.1g，NaCl 180g；微量元素SL-4 10mL，pH 7.0-7.2；琼脂2.5％。
菌株YL5-2通过平板划线分离和反复的划线纯化得到，其菌落边缘光滑，菌落颜色为浅黄色。YL5-2在YL培养基上37℃培养24h的透射电子显微镜照片如图1所示。
菌株YL5-2保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC NO.16315，保藏日期为2018年8月20日。
实施例2嗜盐弧菌Halovibrio sp.YL5-2的DNA测序、16S rRNA序列分析、DNA杂交试验和ANI分析与鉴定
菌株YL5-2基因组DNA提取采用TaKaRa试剂盒(TaKaRa MiniBEST BacteriaGenomic DNA Extraction 68Kit Ver.3.0)。
16S rRNA扩增采用通用细菌引物27F(5-AGAGTTTGATCMTGGCTCA G-3)和1492R(5-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3)。测序循环条件为：起始温度95℃维持7min，然后循环35次，每个周期包括变性95℃/0.5min、退火55℃/0.5min、延伸72℃/1.5min，最终72℃延伸7min。PCR产物纯化采用纯化试剂盒(MinElute PCR Purification Kit,QIAGEN)。PCR测序委托上海生工生物科技有限公司进行。菌株YL5-2完整的16S rRNA序列为1431bp。
菌株YL5-2的16S rRNA序列提交至NCBI GenBank进行序列比对(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。分别采用NJ邻接法、MP最大简约法和ML最大似然法三种方法在MEGA7软件中构建系统发育树，并且通过1000次重复检验拓扑发育树的结果的可靠性。基于16S rRNA的系统发育树表明菌株YL5-2属于Halovibrio属(图3、图4与图5)，且与且与Halovibrio variabilis DSM 3050T最密切相关，其中菌株YL5-2与Halovibriovariabilis DSM3050T的相似性为97.7％，与Halovibrio denitrificans DSM15503T的相似性为97.3％，，与Halospina denitrificans HGD 1-3的相似性为95.5％。菌株YL5-2与Halospina属其他类型的菌株之间的16S rRNA基因序列相似性水平低于97.0％，表明菌株YL5-2与GenBank中相近基因组的低同源性，可见菌株YL5-2是一种与Halovibrio属中其它菌种均不相同的新种。
菌株YL5-2的全基因组测序采用上海上海派森诺生物科技有限公司IlluminaMiSeq 2000高通量测序平台。原始测序数据采用PRINSEQ(版本号v 0.20.4)软件进行过滤和修正，然后采用带有默认参数的SOAP denovo软件(版本号v1.05)软件进行基因组的碱基配对，然后使用CheckM软件(版本1.03)评估基因组的完整性。蛋白质编码开放阅读框架采用Glimmer软件(版本号1.2)进行预测。RNA预测采用RNAmmer软件(版本1.2)。菌株YL5-2全基因组序列共3,495,096bp，GenBank登录号为NSKD00000000。
DNA-DNA杂交试验通过菌株YL5-2与其遗传发育最接近的弧菌属Halovibrio模式菌株进行。该方法由De Ley等于1970年提出，DNA杂交值(dDDH)采用GGDC软件第2种模式(版本号2.0)进行基因序列的一一比对得到。DNA试验和分析结果表明，菌株YL5-2和Halovibrio variabilis DSM 3050T、Halovibrio denitrificans DSM15503T的DNA-DNA杂交值分别为43.5％和38.2％，远低于70％的阈值(物种划分通常被接受的阈值)。
核苷酸平均一致性值采用全基因组序列的碱基组进行1000次重复拓扑检验得到。该方法由Goris等于2007提出，使用的软件为MUMmer(版本号3.23)和Jspecies(版本号1.2.1)。基于Kim等人和Richter等人提出的物种划分的ANI阈值范围(95-96％)，对菌株YL5-2的基因组和GenBank中与之密切相关的基因组进行ANI分析(表1)。结果表明，菌株YL5-2其与Tamilnaduibacter alinus Mi 7的平均核苷酸一致性(ANI)值最高，为88.5％(Supplementary Table S1)，这为菌株YL5-2T属于Halovibrio属的一种新物种提供了论据。
表1嗜盐弧菌Halovibrio sp.YL5-2与GenBank中密切相关的基因组之间的平均核苷酸一致性(ANI)和DDH值。
Figure GDA0003145862770000061
Figure GDA0003145862770000071
实施例3嗜盐弧菌Halovibrio sp.YL5-2的表型特征和生理生化特征鉴定
嗜盐弧菌Halovibrio sp.YL5-2与弧菌属另外2种模式菌Halovibriodenitrificans DSM15503和Halovibrio variabilis DSM 3050同时进行表型和生理生化鉴定。
革兰氏染色特性采用BD革兰氏染色试剂盒进行测试。
细胞运动性使用半MA培养基(0.5％琼脂，w/v)测定。
细胞形态采用透射电子显微镜(TEM)分析检测。即从指数生长的培养液中挑取细胞，用0.5％乙酸铀酰染色细胞，并在显微镜(Tecnai Spirit,FEI,Hillsboro,OR,USA)下对细胞进行拍照。
氧化酶活性使用氧化酶试剂盒(bioMérieux)，通过将3.0％H2O2溶液倒入细菌菌落并观察气泡产生来测定过氧化氢酶活性。
温度生长条件在YL液体琼脂培养基上进行，温度分别为4、10、15、20、25、30、33、37、40、45和50℃，pH恒定为7.5，比较不同温度下菌株YL5-2T的生长速率确定其最佳生长温度。
耐盐能力在0.0-30.0％NaCl(w/v)的YL琼脂和YL液体培养基进行。用缓冲液(Na2HPO4/NaH2PO4(pH 5.0-7.0)，Na2CO3/NaHCO3(pH 8.0-12.0))将pH调至5.0、5.5、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0和11.0(15.0％NaCl，35℃)以测定适合生长的pH范围。
碳源利用能力和酶活性测试采用API 20NE，API ZYM(bioMérieux)和BiologGENIII微孔板。所有测试接种YL培养基上预生长的细胞，并用相关的接种培养基稀释。
菌株YL5-2的表型特征和生理生化特征鉴定结果如表2所示。
嗜盐弧菌Halovibrio sp.YL5-2是革兰氏染色阴性、好氧，直杆状或0.5-0.8x1.0-3.5μm的小弧菌形状，并且通过单极性鞭毛运动(图1)。菌株YL5-2在好氧条件下利用乙酸生长，在缺氧条件下则利用硝酸盐生长(API 20NE)。Biolog GENIII微孔板测试的结果也表明YL5-2与Halovibrio variabilis DSM 3050和Halovibrio denitrificans DSM15503及其它亲缘种的生理生化特征有明显区别。
表2嗜盐弧菌Halovibrio sp.YL5-2(a)与Halovibrio denitrificans DSM15503T(b)，Halovibrio variabilis DSM 3050T(c)在表型与生理生化等方面的区别特征比较
Figure GDA0003145862770000072
Figure GDA0003145862770000081
说明：+，阳性；-，阴性。
实施例4嗜盐弧菌Halovibrio sp.YL5-2细胞脂肪酸鉴定
细胞脂肪酸鉴定采用YL培养基上30℃培养3天的YL5-2、Halovibriodenitrificans DSM 15503和Halovibrio variabilis DSM 3050细胞。主要步骤为：从YL培养基上刮下100mg细胞的用含氢氧化钠的50％甲醇进行皂化；皂化后的细胞进行冷冻干燥，然后使用比例为1:2:0.8(v/v/v)的氯仿/甲醇/0.3％(w/v)NaCl水溶液提取细胞脂肪酸。
细胞脂肪酸总量使用磷钼酸方法检测。
脂肪酸定性和定量检测采用6890N气相色谱仪(Agilent)和Sherlock微生物鉴定系统中的标准MIS文库生成软件(VERSION 6.0and Date 4,Microbial ID Inc.,Newark,DE,USA)(Sasser，1990)。
基于细胞脂肪酸的菌种鉴定则采用德国DSMZ相关分析工具。
细胞脂肪酸鉴定结果如图2所示。
YL5-2的唯一呼吸醌与Halovibrio variabilis DSM 3050相同，都是泛醌Q-9。
YL5-2主要的细胞脂肪酸包括C18:1ω9c、C16:0、C19:0cycloω8c和Summed Feature 8(表3)；主要的极性脂质是Diphosphatidylglycerol(DPG)，Phosphatidylethanolamine(PE)，Phosphatidylglycerol(PG)，Phosphatidylcholine(PC)和两种未鉴定的脂质(L)。这些均与YL5-2的亲缘种Halovibrio variabilis与Halovibrio denitrificans相似。
表3嗜盐弧菌Halovibrio sp.YL5-2(a)与Halovibrio denitrificans DSM15503T(b)，Halovibrio variabilis DSM 3050T的细胞脂肪酸组成(％)比较。
Figure GDA0003145862770000091
说明：*Summed features表示不能通过GLC与MIDI系统分离的两种或三种脂肪酸的混合。Summed feature 3包括C16:1ω7c和/或C16:1ω6c，Summed feature 8包括C18:1ω6c和/或C18:1ω7c。
实施例5嗜盐弧菌Halovibrio sp.YL5-2的发酵培养试验
(1)培养基成分为甘油500mg/L、葡萄糖250mg/L、甲醇500mg/L、甲胺200mg/L、氯化钠100～250g/L，乙酸钠250mg/L，柠檬酸三钠250mg/L、酵母粉100mg/L、蛋白胨200mg/L、牛肉膏200mg/L，微量元素少量，pH为7.5～8.0。液体培养基进行灭菌，同时控制好水分蒸发。
(2)1L的三角瓶中接种后在35℃条件下培养48h，培养过程中补充水分的散失影响盐浓度的变化。48h后测得10％、15％、20％、25％盐浓度条件下OD600分别为1.72、1.65、1.62、1.60、1.63。进行两次转接培养，每次转接后均培养48h，驯化培养完成后OD600分别为2.56、2.68、2.72、2.68、2.52。
(3)1L培养液接种到20L的好氧发酵罐中进行培养，培养基成分保持不变。仍然培养48h，培养温度为35℃、搅拌速度为100rpm，溶解氧为2.0～4.0mg/L。48h后发酵罐中菌液的OD600可达到2.6～3.0之间。
(4)检验：培养过程中使用显微镜每日取样观察，检查是否有杂菌混入生长；同时观察YL5-2的生长及形态变化情况。
(5)结果：试验结果表明，菌株YL5-2可以快速的进行发酵培养和放大，这表明YL5-2具有大规模工程应用的潜力。
实施例6嗜盐弧菌Halovibrio sp.YL5-2的耐盐降解能力试验
(1)培养基成分为甘油50mg/L、葡萄糖25mg/L、甲醇50mg/L、甲胺20mg/L、氯化钠250g/L，乙酸钠25mg/L，柠檬酸三钠25mg/L、酵母粉10mg/L、蛋白胨20mg/L、牛肉膏20mg/L，琼脂20g/L。
(2)使用新鲜的上述培养基活化菌种，培养3天至菌苔生长丰富备用
(3)盐度梯度设置：根据YL5-2菌种的富集筛选条件，设置培养基的盐度梯度和范围为0％、0.5％、1％、2％、3％、24％、26％、28％、30％、32％、34％，摸索YL5-2菌种的耐盐范围、降解能力和耐毒性物质能力。
(4)制备培养基：根据设置的培养基配方制备培养基，盐度较高的培养基热水融化后灭菌，每瓶多加5ml的蒸发水，易挥发的培养基成分待灭菌后加入摇匀，待冷却至60℃左右，倒制平皿，盐度高极易凝固，因此，倒制平皿快速要快(32％盐度培养基倒制平皿时，冷却凝固后有少量盐析出，34％盐度有大量盐晶体析出)。
(5)接种：无菌条件下挑取一环新鲜菌苔接入各盐度培养基，由低盐度往高盐度梯度转接，34％盐度培养基划线后随着划线轨迹有大量盐晶体析出，接种完毕培养皿用封口膜封口，35-37℃培养3-7天，观察菌种生长情况。
(6)试验结果：YL5-2菌种耐盐范围为3-32％。YL5-2菌株在3-30％盐度培养基中三天内可以明显观察到新长出的菌苔，但是在32％饱和盐度培养基中生长7天以上才能长出肉眼可见菌苔。表明YL5-2在3％～30％的盐浓度范围内生长速度均较快。
实施例7利用嗜盐弧菌Halovibrio sp.YL5-2制备的微生物菌剂的应用
(1)培养基成分为甘油500mg/L、葡萄糖250mg/L、甲醇500mg/L、甲胺200mg/L、乙酸钠250mg/L，柠檬酸三钠250mg/L、酵母粉100mg/L、蛋白胨200mg/L、牛肉膏200mg/L，微量元素少量，pH为7.5～8.0；为比较不同盐浓度下YL5-2的降解效果，培养基中氯化钠浓度配制成3％、6％、10％、15％、20％、25％、30％。液体培养基进行灭菌，同时控制好水分蒸发。接种嗜盐弧菌Halovibrio sp.YL5-2在35℃条件下进行多次传代扩增培养，单个培养周期为60h，培养结束后控制OD600＞1.0。
(2)所培养得到的菌液即为嗜盐弧菌Halovibrio sp.YL5-2微生物菌剂。
(3)使用该菌剂在好氧条件下处理TDS分别为3％、6％、10％、15％、20％、25％、30％，乙酸为1000mg/L的废水，72h后乙酸的降解率分别为88.3％、91.2％、91.6％、92.3％、92.2％、91.3％、88.2％。
(4)将该菌剂在35℃、缺氧条件下处理TDS分别为3％、6％、10％、15％、20％、25％、30％，乙酸为1000mg/L、NO3-N≤100mg/L的废水，48h后乙酸的降解率分别为81.3％、88.2％、89.5％、89.6％、89.3％、87.1％、81.9％。
(5)将该菌剂用于处理TDS分别为3％、6％、10％、15％、20％、25％、30％，乙酸为1000mg/L、NO2-N≤100mg/L的废水，48h乙酸降解率分别为86.5％、88.3％、92.2％、91.8％、90.7％、83.8％。
(6)将该菌剂用于处理TDS分别为3％、6％、10％、15％、20％、25％、30％、COD≤3000mg/L、NO3≤100mg/L的废水，72h后NO3-N降解率分别为84.3％、90.2％、93.4％、93.6％、91.8％、82.2％。
实施例8利用嗜盐弧菌Halovibrio sp.YL5-2制备的微生物菌剂的应用
(1)培养基成分为甘油500mg/L、葡萄糖250mg/L、甲醇500mg/L、甲胺200mg/L，乙酸钠250mg/L，柠檬酸三钠250mg/L、酵母粉100mg/L、蛋白胨200mg/L、牛肉膏200mg/L，微量元素少量，pH为7.5～8.0；为比较不同盐浓度下YL5-2的降解效果，培养基中氯化钠浓度配制成3％、6％、10％、15％、20％、25％、30％。液体培养基进行灭菌，同时控制好水分蒸发。接种嗜盐弧菌Halovibrio sp.YL5-2和Halovibrio denitrificans DSM15503，然后在35℃条件下进行多次传代扩增培养，单个培养周期为72h，培养结束后控制OD600＞1.0。
(2)所培养得到的菌液即为嗜盐弧菌混合微生物菌剂。
(3)使用该菌剂在好氧条件下处理TDS分别为3％、6％、10％、15％、20％、25％、30％，且乙酸为1000mg/L的废水，72h后乙酸的降解率分别为90.3％、92.6％、92.7％、92.8％、91.8％、90.7％、89.5％。
(4)将该菌剂在35℃、缺氧条件下处理TDS分别为3％、6％、10％、15％、20％、25％、30％，且乙酸为1000mg/L、NO3-N≤100mg/L的废水，72h后乙酸的降解率分别为84.5％、91.2％、91.8％、92.3％、92.2％、88.5％、83.2％。
(5)将该菌剂在30℃，缺氧条件下用于处理TDS分别为3％、6％、10％、15％、20％、25％、30％，且乙酸为1000mg/L、NO2≤100mg/L的废水，72h后乙酸降解率分别为83.6％、90.7％、92.0％、91.5％、91.9％、84.2％。
(6)将该菌剂在25℃，缺氧条件下用于处理TDS分别为3％、6％、10％、15％、20％、25％、30％、且COD≤3000mg/L、NO3≤100mg/L的废水，72h后NO3降解率分别为88.3％、93.1％、95.5％、95.6％、92.8％、86.6％。
实施例9利用嗜盐弧菌Halovibrio sp.YL5-2制备的复合微生物菌剂的应用
(1)培养基成分为甘油500mg/L、葡萄糖250mg/L、甲醇500mg/L、甲胺200mg/L、氯化钠120g/L，乙酸钠250mg/L，柠檬酸三钠250mg/L、酵母粉100mg/L、蛋白胨200mg/L、牛肉膏200mg/L，微量元素少量，pH为7.5～8.0。液体培养基进行灭菌，同时控制好水分蒸发。接种嗜盐弧菌Halovibrio sp.YL5-2和Halovibrio denitrificans DSM15503，然后在35℃条件下进行多次传代扩增培养，单个培养周期为48h，培养结束后控制OD600＞1.0。
(2)所培养得到的菌液即为嗜盐弧菌混合微生物菌剂。
(3)将该菌剂在好氧条件下用于处理TDS为5％、乙酸为1000mg/L的废水，24h、48h、72h后乙酸的降解率分别为22.5％、80.8％、90.6％。
(4)将该菌剂用于处理TDS为18％、乙酸为1200mg/L且NO3-N为100mg/L的废水，控制溶解氧＜0.5mg/L，72h后NO3-N的去除率为95.2％。
(5)将该菌剂用于处理TDS为12％、葡萄糖为800mg/L且NO3-N为100mg/L的废水，控制溶解氧＜0.2mg/L，72h后NO3-N的去除率为76.3％。
(6)将该菌剂用于处理TDS为16％、葡萄糖为900mg/L且NO3-N为100mg/L的废水，控制溶解氧＜0.2mg/L，72h后NO3-N的去除率为83.5％。
(7)将该菌剂用于处理TDS为22％、葡萄糖为900mg/L且NO3-N为100mg/L的废水，控制溶解氧＜0.2mg/L，24h、48h、72h后NO3-N的去除率分别为5.6％、32.8％、82.7％。
(8)将该菌剂用于处理TDS为28％、葡萄糖为900mg/L且NO3-N为100mg/L的废水，控制溶解氧＜0.2mg/L，24h、48h、72h后NO3-N的去除率分别为2.8％、40.2％、86.3％。
实施例10利用嗜盐弧菌Halovibrio sp.YL5-2制备的复合微生物菌剂
(1)培养基成分为甘油500mg/L、葡萄糖250mg/L、甲醇500mg/L、甲胺200mg/L、氯化钠100g/L，乙酸钠250mg/L，柠檬酸三钠250mg/L、酵母粉100mg/L、蛋白胨200mg/L、牛肉膏200mg/L，微量元素少量，pH为7.5～8.0。液体培养基进行灭菌，同时控制好水分蒸发。接种嗜盐弧菌Halovibrio sp.YL5-2和利用海水在TDS＞10％条件下富集培养得到的混合菌群，然后在35℃条件下进行多次传代扩增培养，单个培养周期为64h，培养结束后控制OD600＞1.0。
(2)所培养得到的菌液即为复合微生物菌剂。
(3)该复合菌剂处理TDS为3.5％、葡萄糖为200mg/L废水，48h后葡萄糖的去除效率可达到88.6％；该复合菌剂处理TDS为5％、葡萄糖为200mg/L废水，72h后葡萄糖的去除效率可达到93.5％；该复合菌剂处理TDS为9％、葡萄糖为200mg/L废水，80h后葡萄糖的去除效率可达到95.6％；该复合菌剂用于处理TDS为12％、葡萄糖浓度为200mg/L废水，72h后葡萄糖的去除效率可达到94.8％；该复合菌剂用于处理TDS为17％、葡萄糖浓度为500mg/L废水，48h后葡萄糖的去除效率可达到83.3％，96h后葡萄糖的去除效率可达到98.5％。
(4)将该复合菌剂用于处理TDS为5％、乙醇浓度为500mg/L废水，48h后乙醇的去除效率可达到86.3％；该复合菌剂用于处理TDS为10％、乙醇浓度为500mg/L废水，72h后乙醇的去除效率可达到92.3％；该复合菌剂用于处理TDS为15％、乙醇浓度为500mg/L废水，72h后乙醇的去除效率可达到93.3％；该复合菌剂用于处理TDS为20％、乙醇浓度为500mg/L废水，72h后乙醇的去除效率可达到93.6％；该复合菌剂用于处理TDS为25％、乙醇浓度为500mg/L废水，72h后乙醇的去除效率可达到91.5％；该复合菌剂用于处理TDS为30％、乙醇浓度为500mg/L废水，72h后乙醇的去除效率可达到88.3％，96h后乙醇的去除效率可达到93.5％。
(5)将该复合菌剂用于处理TDS为8％、丙酸浓度为200mg/L废水，72h后丙酸的去除效率可达到91.8％；该复合菌剂用于处理TDS为15％、丙酸浓度为300mg/L废水，72h后丙酸的去除效率可达到92.6％
(6)将该复合菌剂用于处理TDS为12％、丙醇浓度为200mg/L废水，72h后丙醇的去除效率可达到93.2％；该复合菌剂用于处理TDS为20％、丙醇浓度为200mg/L废水，72h后丙醇的去除效率可达到92.2％。
(7)该复合菌剂应用于TDS为4.5％的环氧丙烷废水处理，采用“活性污泥法”工艺并经过驯化培养，24h、48h、72h后COD去除率分别为62.5％、80.3％、85.6％。
(8)该复合菌剂应用于榨菜废水的处理，在TDS为3％～7％，进水COD为2000～3000mg/L的条件下，采用活性污泥法工艺，废水停留时间为72h，COD的去除率为82.2％～91.3％。
(9)该复合菌剂应用于TDS为21％～23％的环氧氯丙烷废水处理，在TOC≤1000mg/L条件下，采用接触氧化工艺，TOC去除率可达到80％。
(10)该复合菌剂应用于高盐农药废水污染的土壤，试验结果表明，加入复合菌剂后，土壤浸出液COD去除率相比不投加复合菌剂的对照组的COD去除率增加了约30％。
实施例11利用嗜盐弧菌Halovibrio sp.YL5-2制备的复合微生物菌剂的应用
(1)培养基成分为甘油500mg/L、葡萄糖250mg/L、甲醇500mg/L、甲胺200mg/L、氯化钠100～250g/L，乙酸钠250mg/L，柠檬酸三钠250mg/L、酵母粉100mg/L、蛋白胨200mg/L、牛肉膏200mg/L，微量元素少量，pH为7.5～8.0。液体培养基进行灭菌，同时控制好水分蒸发。接种嗜盐弧菌Halovibrio sp.YL5-2和利用盐湖沉积物在TDS＞10％条件下富集培养得到的混合菌群，然后在35℃条件下进行多次传代扩增培养，单个培养周期为24～72h，培养结束后控制OD600＞1.0。所培养得到的菌液即为复合微生物菌剂。
(2)该复合菌剂应用于TDS为5.5％、COD≤1000mg/L且BOD5≤300mg/L的废水，72h后COD的平均去除率可达85.6％。
(3)该复合菌剂应用于TDS为8.2％的癸二酸废水处理，在进水COD≤5000mg/L的条件下，72h后COD的平均去除率大于90％。
(4)该复合菌剂应用于生态湿地处理高盐化工废水，在进水COD≤200mg/L、NH3-N≤10mg/L、NO3-N≤20mg/L条件下，接种菌剂后湿地出水中COD≤60mg/L、NH3-N≤2mg/L、NO3-N≤5mg/L。
序列表
<110> 中蓝连海设计研究院有限公司
<120> 嗜盐弧菌YL5-2及其菌剂在高盐条件下降解转化污染物中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1431
<212> DNA
<213> Halovibrio属(Halovibrio sp.)
<400> 1
cccatggggg cagctacaca tgcagtcgag cggcagcagc tccttcggga ggctggcgag 60
cggcggacgg gtgagtaacg catgggaact tacccagtag tgggggatag cccggggaaa 120
cccggattaa taccgcatac gccctgaggg ggaaagcggg ctccggctcg cgctattgga 180
tgggcccatg tcggattagt tagttggtgg ggtaatggcc taccaaggcg acgatccgta 240
gctggtctga gaggatgatc agccacaccg ggactgagac acggcccgga ctcctacggg 300
aggcagcagt ggggaatatt ggacaatggg ggcaaccctg atccagccat gccgcgtgtg 360
tgaagaaggc cttagggttg taaagcactt tcagcaggga ggaaaagctg atcgttaata 420
ccggtcagtg ttgacgttac ctgcagaaga agcaccggct aactccgtgc cagcagccgc 480
ggtaatacgg agggtgcaag cgttaatcgg aattactggg cgtaaagggc gcgtaggcgg 540
tttggtaagc gagttgtgaa agccccgggc tcaacctggg aatggcaatt cgaactgcca 600
agctagaatg cagcagaggg cagtggaatt ccaggtgtag cggtgaaatg cgtagatatc 660
tggaggaaca ccagtggcga aggcgactgc ctgggctgac actgacgctg aggtgcgaaa 720
gcgtgggtag caaacaggat tagataccct ggtagtccac gctgtaaacg ctgagaacta 780
gtcgttgggg ctattagagc cttagtgacg cagctaacgc gataagttct ccgcctgggg 840
agtacggccg caaggttaaa actcaaatga attgacgggg gcccgcacaa gcggtggagc 900
atgtggttta attcgacgca acgcgaagaa ccttacctgg tcttgacatc ctgcgaactt 960
ggtagagata ccttggtgcc ttcgggagcg cagtgacagg tgctgcatgg ccgtcgtcag 1020
ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc gtaacgagcg caacccttgt ccttagttgc 1080
cagcggtccg gccgggaact ctagggagac tgccggtgac aaaccggagg aaggtgggga 1140
tgacgtcagg tcatcatggc ccttacggcc agggctacac acgtgctaca atggggcgca 1200
cagagggcag caagcgcgcg agtgcaagcg aatcccttaa aacgcctcgt agtccggatc 1260
ggagtctgca actcgactcc gtgaagtcgg aatcgctagt aatcgcagat cagaatgctg 1320
cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca caccatggga gtggactgca 1380
ccagaagcgg ttagtctaac cttcgggagg acgatcgcca cggtgtctgt a 1431

Claims (5)

1.保藏号为CGMCC NO.16315的嗜盐弧菌Halovibrio sp.YL5-2在制备用于高盐条件下污染物降解转化的微生物菌剂中的应用；所述污染物选自乙酸、丙酸、葡萄糖、乙醇、丙醇、NO3 -、NO2 -中的一种或多种；所述的高盐条件为盐浓度在3%~32%。
2.保藏号为CGMCC NO.16315的嗜盐弧菌Halovibrio sp.YL5-2在高盐条件下降解转化污染物中的应用；所述污染物选自乙酸、丙酸、葡萄糖、乙醇、丙醇、NO3 -、NO2 -中的一种或多种；所述的高盐条件为盐浓度在3%~32%。
3.含有保藏号为CGMCC NO.16315的嗜盐弧菌Halovibrio sp.YL5-2的微生物菌剂在高盐条件下降解转化污染物中的应用；所述污染物选自乙酸、丙酸、葡萄糖、乙醇、丙醇、NO3 -、NO2 -中的一种或多种；所述的高盐条件为盐浓度在3%~32%。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述的微生物菌剂为Halovibrio sp.YL5-2菌液和保藏号为DSM 15503的嗜盐弧菌Halovibrio denitrificans DSM 15503菌液。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述的微生物菌剂为Halovibrio sp.YL5-2菌液和利用海水在TDS＞10%条件下富集培养得到的菌液。
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