CN112331267A

CN112331267A - 一种基于质谱的不动杆菌数据库的构建方法及不动杆菌数据库

Info

Publication number: CN112331267A
Application number: CN202011026563.XA
Authority: CN
Inventors: 华孝挺; 俞云松; 张玲虹
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2020-09-25
Filing date: 2020-09-25
Publication date: 2021-02-05

Abstract

本发明公开了一种基于质谱的不动杆菌数据库的构建方法及不动杆菌数据库，包括：分离得到不动杆菌菌落，增菌冻存，保证得到的菌株纯度为100％；对菌株进行NGS测序，得到序列，将序列进行组装后和不动杆菌属的NCBI数据库基因组进行两两ANI计算，将计算结果中匹配度最高结果作为物种鉴定结果；分别采用直涂法和/或提取法对步骤一得到的菌株进行提取，提取后进行采谱，得到生物多肽指纹标准图谱；双击打开micro typer后处理软件，新建实验室不动杆菌自建库，按照界、门、纲、目、科、属、种顺序建立节点，选中所需添加的新的不动杆菌数据，选择高质量图谱创建数据，将确定的生物多肽指纹标准图谱与NGS测序所得菌株名称进行统一，加入对应的节点，完成该菌株的建库。

Description

一种基于质谱的不动杆菌数据库的构建方法及不动杆菌数据库

技术领域

本发明涉及质谱检测技术领域，尤其涉及一种基于质谱的不动杆菌数据库的构建方法及不动杆菌数据库。

背景技术

不动杆菌属细菌属于变形菌门，伽马变形菌纲，假单胞菌目，莫拉氏菌科细菌，是导致院内感染的重要条件致病菌，主要是威胁重症监护室的患者，引起的感染包括血流感染、呼吸机相关肺炎、尿路感染、脑膜炎和伤口感染，这些感染与感染患者的高发病率和死亡率有关。许多医院的感染暴发是由不动杆菌引起的，由于其在环境中的高耐药能力和对抗菌素的耐药能力，导致感染难以控制和治疗，并导致患者住院时间延长和产生高昂的住院费用。

不动杆菌菌株广泛存在于自然界中，包括湿地，废水，海水等环境以及各种商业食品和各种类型的牲畜。环境中的菌株通常蕴藏着抗生素耐药机制，包括碳青霉烯酶和超广谱β内酰胺酶，因此形成了一个重要的耐药基因环境储存库，有多条环境传播途径将耐药基因传播至临床相关菌株。临床常见的不动杆菌是鲍曼不动杆菌，而近来A.lowffii、A.junii、A.nosocomiali等在临床也常有报道，主要的治疗方式是以碳青霉烯类抗生素单独治疗或者与氨基糖苷类联用，近来也有出现四环素类抗生素替加环素及多肽类抗生素多粘菌素的使用，但由于抗菌素的耐药能力增强，时常出现不动杆菌的多重耐药，泛耐药现象，从而导致患者的预后十分不理想。因此不动杆菌菌株的快速和准确的鉴定对不动杆菌感染的临床治疗尤为重要，传统的鉴定方法包括革兰染色、生化试验、 VITEK 2仪器鉴定等，这些鉴定方法存在耗时长，工作量大，鉴定范围有限，十分影响不动杆菌的鉴定速度和准确性。

目前MALDI-TOF MS具有灵敏度高，检测线低，分析速度快等特点，在一些三甲医院也成为了日常快速，准确的鉴定方法，但是现有数据库菌种信息不全，对于菌种鉴定结果的准确度有待提高，易造成漏检及假阳性。而目前国际上公认的菌株之间平均核苷酸(average nucleotide identify,ANI)大于95％可被认为是同一菌种。将测序得到的序列直接与基因组数据库中所有不动杆菌菌种的基因组序列信息进行比对，观察待鉴定菌株与现有的菌株之间的序列同源性，若同源性大于95％可被认为同一不动杆菌菌种，若同源性小于95％则可被认为是新的不动杆菌菌种，选择全基因组测序后进行分析和比对得到的结果更为准确。

发明内容

本发明实施例提供一种基于质谱的不动杆菌数据库的构建方法及不动杆菌数据库，以解决现有存在的不动杆菌质谱库菌种信息不全，准确度低的问题。

为了达到上述目的，本发明实施例所采用的技术方案如下：

第一方面，本发明实施例提供一种基于质谱的不动杆菌数据库的构建方法，包括以下步骤：

步骤(1)获得符合要求的菌株及NGS测序：

分离得到不动杆菌菌落，增菌冻存，保证得到的菌株纯度为100％；

对菌株进行NGS测序，得到序列，将序列进行组装后和不动杆菌属的NCBI数据库基因组进行两两ANI(fastANI)计算，将计算结果中匹配度最高结果作为物种鉴定结果；

步骤(2)菌株提取以及生物多肽指纹图谱采集：

分别采用直涂法和/或提取法对步骤一得到的菌株进行提取，提取后进行采谱，得到生物多肽指纹标准图谱；

步骤(3)建库：

双击打开micro typer后处理软件，新建实验室不动杆菌自建库，按照界、门、纲、目、科、属、种顺序建立节点，选中所需添加的新的不动杆菌数据，选择高质量图谱创建数据，将确定的生物多肽指纹标准图谱与NGS测序所得菌株名称进行统一，加入对应的节点，完成该菌株的建库；

步骤(4)，重复步骤(1)-步骤(3)，对收集到的菌株进行统一建库，得到最后的不动杆菌数据库。

进一步地，采谱时，每株菌株的每个靶点采集3～6张图谱，每张图谱由3次以上累加获得。

进一步地，所述生物多肽指纹标准图谱符合以下条件：主峰信噪比大于500、信号强度大于 e³⁺和分辨率700～1200。

进一步地，不动杆菌属菌株包括：A.baumannii、A.lowffii、A.schindleri、A.junii、A.nosocomialis、 A.pittii、A.johnsonii、A.radioresistens、A.ursingii、A.calcoaceticus、A.indicus、A.soli、A.bereziniae、 A.guillouiae、A.seifertii、A.tjernbergiae.。

第二方面，本发明实施例还提供一种基于质谱的不动杆菌数据库，所述基于质谱的不动杆菌数据库通过第一方面所述的一种基于质谱的不动杆菌数据库的构建方法构建获得。

根据以上技术方案，本发明的有益效果：将测序结果用ANI与拥有所有不动杆菌数据库信息比对后得到的菌种信息与MALDI-TOF MS指纹图谱结果联合，使得数据库更全面，准确度更高，不易出现漏检假阳性的结果，对不动杆菌感染做早期预防。另外通过自建质谱数据库补充了原有质谱数据库不存在的6种不动杆菌，包括A.indicus、A.soli、A.bereziniae、A.guillouiae、A.seifertii、 A.tjernbergiae，补充了原有数据库的不足。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1为本发明实施例中的菌株NGS测序序列分析流程图；

图2为本发明实施例中数据库建库流程；

图3为本发明实施例中ATCC25922校准数据；

图4为本发明实施例中可纳入的高质量图谱。

具体实施方式

本发明所述的16种不动杆菌生物多肽指纹图谱建立的数据库，联合NGS测序，提高了该数据库的准确度，补充和完善了现有数据库信息不足，避免漏检或造成假阳性。

为使本申请的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本申请具体实施例及相应的附图对本申请技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

实施例1：

本发明实施例提供一种基于质谱的不动杆菌数据库的构建方法，包括以下步骤：

步骤(1)获得符合要求的菌株及NGS测序：

如图1所示，分离得到不动杆菌菌落，增菌冻存，保证得到的菌株纯度为100％，对菌株进行编号为BJ2020295；再进行基因组提取DNA，Illumina Hiseq 2000分析序列，将序列进行组装后和不动杆菌属的NCBI数据库基因组进行两两ANI(fastANI)计算，执行命令为：fastANI-q [QUERY_GENOME]–r[REFFERENCE_GENOME]-o[OUTPUT_LIFE]，将计算结果中匹配度最高结果作为物种鉴定结果,BJ2020295菌株NGS测序鉴定结果为Acinetobacterschindler，ANI分值为97.13；得到的菌株高通量数据通过ANI在数据库中比对得到准确的菌株名称见表1。

表1:建库菌株信息

步骤(2)菌株提取以及生物多肽指纹图谱的采集：

分别采用直涂法和/或提取法对步骤一得到的菌株进行提取，提取后进行采谱，得到生物多肽指纹标准图谱；本实施例中采用直涂法未得到高质量图谱，后采用提取法具体操作如下：

(1)直涂法：

(a)：配制基质液(1mL)，称取15mgα-氰基-4羟基肉桂酸(HCCA)装入1.5mL离心管中，按以下顺序加入500μL乙腈、475μL去离子水、25μL三氟乙酸，涡旋2～3min, 置于4℃保存，有效期为1～2周；

(b):移液枪头(10μL量程)挑取适量菌体，均匀涂抹在靶点内，不可过厚；

(c):滴加1μL加基质液覆盖样品；

(d)：待其自然晾干后进行采谱；

(2)提取法：

(a)：提取液A(70％甲酸，10mL)：吸取7mL甲酸于17mL离心管中，再加入3mL 去离子水，充分混匀，避光保存；提取液B(乙腈)，乙醇(95％)；

(b)：于1.5mL离心管中加入300μL无菌水，移液枪头或无菌接种环挑取5-10mgBJ2020295菌株菌体，放入无菌水中充分混匀，可用移液枪吹打使菌体分散更均匀；

(c)：加入900μL乙醇(无菌水：乙醇＝1:3)，旋涡振荡混匀；

(d)：离心机离心12000rpm，3min，弃上清，再一次离心12000rpm，离心1min，移液枪将上清液吸出，待其残留液体挥发干净；

(e)：在1.5mL离心管中加入50μL提取液A，移液枪将其吹打混匀，静置2min；再加入50μL提取液B(提取液A：提取液B＝1:1)，旋涡振荡；

(f)：离心机离心12000rpm，3min，用微量移液器取1用微上清滴加在靶板样品孔中，室温放置，待其晾干；

(g)：再滴加1μL基质液覆盖样品，自然晾干后上机采谱。

仪器校准：采集设备为MALDI-TOF MS，型号为micro Type MS。采谱前对仪器用质控菌株进行校准，对系统误差进行校正。采用实验室标准菌株大肠杆菌Escherichia coliATCC25922(分子量已知)，划板培养(37℃，8～24h)，选取6个均匀分布于靶板上的位置进行点样采谱；单击“校准”仪器上的按钮，选择自动寻峰，寻峰容差为1000ppm，校准的最大误差小于150ppm，单击计算，若获得的数据误差值在寻峰容差允许的范围内，校准成功，再点击保存定标参数，校准完成如图3。

步骤(3)建库：

如图2所示，双击打开micro typer后处理软件，在实验室不动杆菌自建库中，选中所需添加的 BJ2020295菌株高质量图谱如图4，将确定的BJ2020295生物多肽指纹标准图谱与NGS鉴定所得菌株名称进行统一，加入Acinetobacter schindleri节点，完成该菌株的建库。

步骤(4)：重复步骤(1)-步骤(3)，对收集到的菌株进行统一建库，得到最后的不动杆菌数据库。该质谱库具有较为全面的MALDI-TOF MS检测数据库中各种不动杆菌菌株的质谱图，对不同的不动杆菌菌株进行全面、快速、准确的鉴定，更有利于不动杆菌感染的早期预防。

本实施例还提供一种基于质谱的不动杆菌数据库，所述基于质谱的不动杆菌数据库通过上述的一种基于质谱的不动杆菌数据库的构建方法构建获得。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种基于质谱的不动杆菌数据库的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤(1)获得符合要求的菌株及NGS测序：

步骤(2)菌株提取以及生物多肽指纹图谱采集：

分别采用直涂法和/或提取法对步骤(1)得到的菌株进行提取，提取后进行采谱，得到生物多肽指纹标准图谱；

步骤(3)建库：

2.根据权利要求1所述的一种基于质谱的不动杆菌数据库的构建方法，其特征在于，采谱时，每株菌株的每个靶点采集3～6张图谱，每张图谱由3次以上累加获得。

3.根据权利要求1所述的一种基于质谱的不动杆菌数据库的构建方法，其特征在于，所述生物多肽指纹标准图谱符合以下条件：主峰信噪比大于500、信号强度大于e³⁺和分辨率700～1200。

4.根据权利要求1所述的一种基于质谱的不动杆菌数据库的构建方法，其特征在于，不动杆菌属菌株包括：A.baumannii、A.lowffii、A.schindleri、A.junii、A.nosocomialis、A.pittii、A.johnsonii、A.radioresistens、A.ursingii、A.calcoaceticus、A.indicus、A.soli、A.bereziniae、A.guillouiae、A.seifertii、A.tjernbergiae.。

5.一种基于质谱的不动杆菌数据库，所述基于质谱的不动杆菌数据库通过权利要求1所述的一种基于质谱的不动杆菌数据库的构建方法构建获得。