CN107860819B - 适用于maldi-tof ms检测的病原体样品前处理方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种具有生物安全性的枪头法微生物质谱检测试剂盒，涉及蛋白质指纹图谱检测和微生物样品无害化处理技术领域。本发明试剂盒含有：试剂A：50～90％甲酸与80～100％乙腈的等体积混合液；基质溶解液：1～5％三氟乙酸和40～60％乙腈水溶液；基质：α‑氰基‑4‑羟基肉桂酸及带滤芯的生物安全移液枪头。使用时将微生物用试剂A悬浮沉淀，混匀后用生物安全移液枪头移出悬浮液即为质谱上样前蛋白样本，常规方法对蛋白样本进行质谱检测。本发明的试剂盒处理的微生物样本安全性好，操作简单，适用于目前所有的基于MALDI‑TOF MS的微生物快速检测系统。
Description
技术领域
本发明涉及基于基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI -TOF MS)的肽质量指纹图谱微生物鉴定技术和微生物样品无害化处理技术领域，具体地，涉及一种适用于MALDI-TOF MS检测的微生物样品具有生物安全性的快速前处理方法以及具有生物安全性的枪头法微生物质谱检测试剂盒。
背景技术
病原体的快速、准确识别是临床感染诊断、传染病预防控制、食品安全等公共卫生问题的关键因素。随着软电离技术的发展，基于基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)微生物识别技术也随之问世，该技术是在完整的微生物中添加酸性基质辅助细胞裂解，激光激发细胞裂解物(小蛋白或多肽)形成肽质量指纹谱，与已构建的属、种水平的共性参考谱库进行比对分析，从而实现微生物的鉴定。目前该技术体系已经成熟，其快速、自动化、高通量、准确的特性已使其在全球临床诊断、质检、传染病监测、食品安全等领域占有一席之地，并迅速发展。商业化的质谱微生物鉴定系统继布鲁克及岛津公司之后，国内质谱研发及生产厂家正蓬勃发展，相应的仪器设备也不断地装备疾控、质检及临床检验系统。样本的快速前处理是保证快速、高通量鉴定的前提，目前没有用于样本快速处理的商业化试剂盒。确保生物安全性是病原微生物检测的前提，美国亚特兰大质谱炭疽检测的泄露事件已经向基于质谱的微生物检测的安全性敲响了警钟。目前全球范围内没有用于质谱微生物检测样本生物安全提取的商业化产品。
现有技术中基于质谱的微生物检测样本前处理方法有两种，一种是直接将未知菌落涂在样品靶上然后结合基质的直接菌落法；一种是采用乙醇/甲酸处理菌落的预提取法。第一种直接菌落法危险性非常高，与基质α-氰基-4-羟基肉桂酸结合并不能杀死所有的微生物，潜在危险性极高，不仅污染质谱设备，对操作人员也极具危险性；第二种预提取法经乙醇、甲酸、乙腈处理后能杀死部分病原体，但对于一些病原以及芽孢菌无法灭活，鉴定未知病原对仪器操作人员及环境存在危险性。另外，乙醇/甲酸法在点样前要经过加水、悬菌、加乙醇、离心、弃液、加甲酸、悬菌、加乙腈、离心、移液等一系列繁琐的过程，提取个样本的至少要10min，生物安全风险高，且操作费时不简便。本领域迫切需要一种简便、快速同时又具备生物安全性的处理微生物样品的方法和试剂盒。
发明内容
本发明的目的是为了提供一种操作步骤简单、具备生物安全性的微生物质谱检测试剂盒。
本发明的另一目的是提供一种具备生物安全性的、适用于 MALDI-TOF MS检测的微生物样品前处理方法。
本发明首先提供一种适用于MALDI-TOF MS检测的微生物样品前处理方法：用试剂悬浮适量的待检测微生物样品，混匀后用生物安全移液枪头移出悬浮液，即为MALDI-TOFMS检测上样前微生物的蛋白样本，所述试剂为50～90％甲酸和80～100％乙腈的等体积混合液。
所述试剂的用量为1mg菌加入20ul试剂A。
所述生物安全移液枪头底端具有可脱离的滤芯，见图1，滤芯孔径为0.003～0.2μm。
进一步地，本发明提供一种适用于MALDI-TOF MS检测的微生物样品前处理试剂盒，含有：
试剂A：50～90％甲酸和80～100％乙腈的等体积混合液；
带滤芯的生物安全移液枪头。
所述滤芯孔径为0.003～0.2μm。
本发明提供一种具有生物安全性的微生物质谱检测试剂盒，含有：
试剂A：50～90％甲酸和80～100％乙腈的等体积混合液；
基质溶解液：1％～5％三氟乙酸和40％～60％乙腈水溶液；
基质：α-氰基-4-羟基肉桂酸；
带滤芯的生物安全移液枪头。
所述滤芯孔径为0.003～0.2μm。
所述的微生物质谱检测试剂盒，其使用方法包括以下步骤：
(1)用试剂A悬浮待测微生物样品，混匀后用生物安全移液枪头移出悬浮液，即为适用于MALDI-TOF MS检测上样前微生物的蛋白样本；
(2)步骤(1)得到的蛋白样本直接检测或冻干备用；若直接检测，则将其加入质谱样本靶上，干燥后，按与蛋白样本的体积比 1:1在样品上覆盖基质，所述基质为α-氢基-4-羟基肉桂酸在1～5％三氟乙酸和40～60％乙腈水溶液中的过饱和液。
步骤(2)中，若蛋白样本冻干备用，则再用于质谱检测前，需用试剂A进行溶解。
本发明提供上述微生物样品生物安全前处理试剂盒或上述微生物质谱检测试剂盒在非疾病诊断目的的微生物质谱检测中的应用。
本发明通过优化配置，提供了一种具有生物安全性的微生物样本前处理方法和微生物质谱检测试剂盒，通过本发明方法处理后即适用于目前所有的基于MALDI-TOF MS的微生物快速检测系统，与传统方法相比使用过程更简便，在简单的操作步骤下实现了生物安全性保障；本发明方法处理获得的微生物蛋白样品在-20℃条件下可保存至少1年，所制备的样本稳定性至少可达半年。本试剂盒适用于目前国际及国内所有的基于MALDI-TOF MS的微生物快速检测系统，因其快速、制备的样本具有生物安全性，适用于在临床、疾控、质检等各种系统大规模商业推广使用。
附图说明
图1为本发明采用的具有可脱离滤芯的生物安全移液枪头结构示意图。
图2为离心与不离心移液头分离河流弧菌与蛋白MALDI-TOF MS图谱。
图3为离心与不离心移液头分离病原后样本生物安全性检测图。
图4为经本发明样品前处理方法处理后的蛋白样本与传统乙醇/ 甲酸法的MALDI-TOF MS图谱。图4A为传统方法，图4B为本发明方法。菌株从上至下依次为化脓性链球菌、幽门螺旋杆菌、霍乱弧菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯、副溶血弧菌、河流弧菌、鲍曼不动杆菌、嗜水气单胞菌、纹带棒状杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、屎肠球菌、肺炎链球菌。
图5为传统乙醇/甲酸法提取样本后菌体沉淀物纯培养(上图) 与本发明的微生物样品前处理方法提取蛋白样本纯培养(下图)的生物安全测试图，1、2化脓性链球菌，5、6幽门螺旋杆菌，7、8 霍乱弧菌，9、10大肠杆菌，11、12肺炎克雷伯，13、14副溶血弧菌，15、16河流弧菌，17、18鲍曼不动杆菌，19、20嗜水气单胞菌， 21、22纹带棒状杆菌，23、24金黄色葡萄球菌，25、26枯草芽孢杆菌，27、28蜡样芽孢杆菌，29、30屎肠球菌，33、34肺炎链球菌。
图6为本发明前处理微生物样本方法获得微生物蛋白样品的稳定性测试结果图，自上而下分别是2、4、6、8、10、12个月的金黄色葡萄球菌的肽质量指纹谱。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例中所用的试剂为市售。
本发明所用的试剂和主要耗材：试剂A：50～90％甲酸和80～ 100％乙腈等体积混合液；B液，即基质溶解液：1～5％三氟乙酸和 40～60％乙腈水溶液；C，即基质：α-氰基-4-羟基肉桂酸；带滤芯的生物安全移液枪头中，生物安全移液枪头和滤芯均为市售，滤芯孔径为0.003～0.2μm，将滤芯套在生物安全移液枪头的底端，结构见图1。
实施例1具有生物安全性的适用于MALDI-TOF MS的微生物样本前处理方法
1、离心次数的优化采用A试剂悬河流弧菌，菌株悬浊液经如下处理：
一是12000g离心2分钟后使用生物安全移液吸头分离病原和蛋白；二是不经离心直接用生物安全移液吸头分离病原体和蛋白。
质谱检测显示离心与否对谱图质量没有显著影响(图2)、蛋白样本培养没有菌落生长(图3)，因此在A试剂悬菌之后可省略高速离心，采用生物安全移液吸头直接分离获得生物安全样本。
2、微生物样本前处理方法的建立
(1)试剂A悬浮待测微生物样品。
微生物样品涵盖医院感染相关、胃肠道、呼吸道、食源性、动物源性的病原微生物，共计15个种，具体有：大肠杆菌、鲍曼不动杆菌、纹带棒状杆菌、幽门螺杆菌、肺炎链球菌、屎肠球菌、金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、副溶血弧菌、霍乱弧菌、河流弧菌、嗜水气单胞菌、肺炎克雷伯、蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌等各2 株，共30株，菌株为购置的ATCC菌株及分离株。
(2)用带滤芯的生物安全移液枪头移出悬浮液，即为 MALDI-TOF MS检测上样前微生物的蛋白样本。
具体为取试剂A液100ul加入1.5ml离心管中，接种环刮取约 1mg菌落与管中试剂A液混匀，用加样器使用带滤芯的生物安全移液头吸取样本，去掉滤芯部分后直接将1ul样本点于样品靶上，干燥后在样本点上覆盖1ul C的饱和液(由B液做为溶解液配置)，干燥后进质谱检测。
(3)数据采集与数据库检索
布鲁克公司的Microflex质谱系统，采用FlexControl软件进行数据采集。采集参数为：线性阳离子模式；采集的质量范围为 2000-20000Da；源1电压，20kV，源2电压，18.5kV，透镜电压， 8.45kV；延时提取，320ns；激光频率，20.0Hz，80shots采集一个样品结晶点，平均每个样本结晶点采集8次，共计640shots形成一张谱图。布鲁克公司的商业化Biotyper数据库及中国疾病预防控制中心(CDC)自建参考谱库(参见文献Xiao D，Ye C，Zhang H， Kan B，Lu J，Xu J，Jiang X，Zhao F，You Y，Yan X，Wang D，Hu Y，Zhang M，ZhangJ.，The Construction and Evaluation of Reference Spectra for theIdentification of Human Pathogenic Microorganisms by MALDI-TOF MS，PLoS One，2014.09.02，9(9)：e106312)为数据搜索标准谱库。
(4)效果比对
本发明方法制备的样本，使用相同菌量，同一采集条件、谱图累加次数的情况下，与传统乙醇/甲酸提取法相比肽质量指纹谱没有明显差异(图4A和图4B)，数据库搜索的识别率没有差异。样本制备时间节约一倍。
实施例2本发明前处理微生物样本方法的生物安全性评估
选择涵盖医院感染相关、胃肠道、呼吸道、食源性、动物源性的病原微生物，共计15个种，具体有：大肠杆菌、鲍曼不动杆菌、纹带棒状杆菌、幽门螺杆菌、肺炎链球菌、化脓性链球菌、屎肠球菌、金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌、霍乱弧菌、河流弧菌、嗜水气单胞菌、肺炎克雷伯、蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌等各2株，共 30株ATCC菌株及分离株。
采用实施例1的微生物样本前处理方法处理后，将所制备的样本分别涂于新鲜哥伦比亚血平皿上，培养2天，重新在新鲜培养基上传代一次。观察菌株生长情况，对生长的菌株进行质谱鉴定排除污染的可能性。
培养结果显示，采用本发明实施例1的前处理方法提取的样本，均无菌落生长。传统的乙醇/甲酸法提取后剩余的菌株沉淀物培养后 15个种的病原体均能复活(图5)；本发明所制备的样本经纯培养两次后，没有菌株生长(图5)。因此，采用本发明的方法制备的样本可在普通分子生物学实验室操作，没有生物危害性，不会污染质谱仪及感染操作人员。
实施例3本发明前处理方法提取的微生物蛋白样本的使用期评估
按照实施例1的前处理微生物样本的方法，每间隔两个月制备相同的金黄色葡萄球菌菌株蛋白样本，-80℃下保存，采用实施例1 步骤(3)和(4)的方法，比较1年内样本的质谱肽质量指纹谱及数据搜索结果。结果显示，在12个月的时间内，采用本发明实施例 1的前处理方法得到的菌株蛋白样本的肽质量谱没有显著变化(图 6)。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (6)
1.一种具有生物安全性的、适用于MALDI-TOF MS检测的病原体样品前处理方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）用试剂A悬浮待测病原体样品，所述试剂A为50～90％甲酸和80～100％乙腈的等体积混合液，用量为1mg菌加入100ul试剂A；
（2）混匀后用带滤芯的生物安全移液枪头移出悬浮液，接种环刮取约1mg菌落与管中试剂A液混匀，用加样器时 用带滤芯的生物安全移液头吸取样本，去掉滤芯部分后直接将1ul样本点于样品靶上，干燥后在样本点上覆盖1ul C的饱和液，即为MALDI-TOF MS检测上样前病原体的蛋白样本，干燥后进质谱检测；
所述生物安全移液枪头底端具有可脱离的滤芯，滤芯孔径为0.003～0.2μm；
所述1ul C的饱和液是用B液配制的，B液即基质溶解液，组成为：1～5％三氟乙酸和40～60％乙腈水溶液；
C液为基质α-氰基-4-羟基肉桂酸溶于B液做为溶解液配置而得。
2.一种试剂在适用于MALDI-TOF MS检测的、具有生物安全性的病原体样品前处理中的应用，所述试剂为50～90％甲酸和80～100％乙腈的等体积混合液；
所述病原体样品前处理方法包括以下步骤：
（1）用前述试剂悬浮待测病原体样品，所述试剂的用量为1mg菌加入100ul试剂A；
（2）混匀后用带滤芯的生物安全移液枪头移出悬浮液，接种环刮取约1mg菌落与管中试剂A液混匀，用加样器使用带滤芯的生物安全移液头吸取样本，去掉滤芯部分后直接将1ul样本点于样品靶上，干燥后在样本点上覆盖1ul C的饱和液，即为MALDI-TOF MS检测上样前病原体的蛋白样本，干燥后进质谱检测；所述生物安全移液枪头底端具有可脱离的滤芯，滤芯孔径为0.003～0.2μm；所述1ul C的饱和液是用B液配制的，B液即基质溶解液：1～5％三氟乙酸和40～60％乙腈水溶液；
C液为基质α-氰基-4-羟基肉桂酸溶于B液做为溶解液配置而得。
3.一种具有生物安全性的、适用于MALDI-TOF MS检测的病原体样品前处理试剂盒在非疾病诊断目的的病原体质谱检测中的应用，其特征在于，含有：50～90％甲酸和80～100％乙腈的等体积混合液；以及带滤芯、可脱离的生物安全移液枪头，可脱离的滤芯位于生物安全移液枪头底端，滤芯孔径为0.003～0.2μm；
所述应用包括以下步骤：
（1）用试剂A悬浮待测病原体样品，所述试剂A为前述含50～90％甲酸和80～100％乙腈的等体积混合液；
用量为1mg菌加入100ul试剂A；
（2）混匀后用带滤芯的生物安全移液枪头移出悬浮液，接种环刮取约1mg菌落与管中试剂A液混匀，用加样器使用带滤芯的生物安全移液头吸取样本，去掉滤芯部分后直接将1ul样本点于样品靶上，干燥后在样本点上覆盖1ul C的饱和液，即为MALDI-TOF MS检测上样前病原体的蛋白样本，干燥后进质谱检测；
所述1ul C的饱和液是用B液配制的，B液即基质溶解液：1～5％三氟乙酸和40～60％乙腈水溶液；
C液为基质α-氰基-4-羟基肉桂酸溶于B液做为溶解液配置而得。
4.一种具有生物安全性的病原体质谱检测试剂盒在非疾病诊断目的的病原体质谱检测中的应用，其特征在于，含有：
试剂A：50～90％甲酸和80～100％乙腈的等体积混合液；
基质溶解液：1～5％三氟乙酸和40～60％乙腈水溶液；
基质：α-氰基-4-羟基肉桂酸；
带滤芯、可脱离的生物安全移液枪头，可脱离的滤芯位于生物安全移液枪头底端，滤芯孔径为0.003～0.2μm；
所述应用包括以下步骤：
（1）用试剂A悬浮待测病原体样品；用量为1mg菌加入100ul试剂A；
（2）混匀后用带滤芯的生物安全移液枪头移出悬浮液，接种环刮取约1mg菌落与管中试剂A液混匀，用加样器使用前述带滤芯的生物安全移液头吸取样本，去掉滤芯部分后直接将1ul样本点于样品靶上，干燥后在样本点上覆盖1ul 基质的饱和溶解液，即为MALDI-TOF MS检测上样前病原体的蛋白样本，干燥后进质谱检测；
所述1ul 基质的饱和溶解液是将基质α-氰基-4-羟基肉桂酸用1～5％三氟乙酸和40～60％乙腈水溶液溶解配制而得。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，其使用方法包括以下步骤：
(1)用试剂A悬浮待测病原体样品，用量为1mg病原体加入100ul试剂A；混匀后用生物安全移液枪头移出悬浮液，即为适用于MALDI-TOF MS检测上样前病原体的蛋白样本；
(2)步骤(1)得到的蛋白样本直接检测或冻干备用；若直接检测，则将其加入质谱样本靶上，干燥后，按与蛋白样本的体积比1:1在样品上覆盖基质的饱和溶解液。
6.如权利要求5所述的病原体质谱检测试剂盒在非疾病诊断目的的病原体质谱检测中的应用，其特征在于，步骤(2)中，若蛋白样本冻干备用，则再用于质谱检测前，需用试剂A进行溶解。
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