CN101363056A - 一种高通量微生物鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高通量微生物鉴定方法，包括以下步骤：取样；遗传物质提取；质谱分析；数据分析和微生物鉴定。本发明具有以下有益效果：能够同时鉴定数千种细菌、病毒、真菌和原生动物，而别的系统仅仅在同一时间只能鉴定很少的传染性病原体，其发展将受到数量限制；能够给出一个单一样品中多个病原体的相对量的多少，而目前大多数系统还没有这个能力；快速而不需要培养，一个样品可在少于4小时的时间内被分析，而培养则需要数周时间，当然一些样品根本就不能够培养；可分析所有媒介中的环境或临床样品，从空气到大部分复杂生物样品，这使得其非常通用；不需要测序，对于传染性病原体的鉴定来说是一个性价比非常好的解决方案。
Description
技术领域
本发明涉及微生物鉴定方法，尤其涉及基于PCR、蛋白纯化和高分辨串联质谱技术的高通量具有DNA、RNA或蛋白质等遗传物质的微生物鉴定方法。
背景技术
微生物传统的鉴定方法是建立在微生物的形态学、生态学、细胞生理和生化以及基因的基础上的，主要包括以下几类：生化方法、免疫学技术、分子生物学及分子遗传学方法、生物传感器、色谱技术。
上述方法都有速度慢、不适于大规模筛查鉴定的特点。它们仅仅能够鉴定事先假定存在于样品中的病原微生物。
目前，没有一种方法在不经过培养或利用特异生物体检测的前提下，就能够高通量的鉴定在一个样品中可能包含的1000多种病原体；也没有任何系统有能力对一个单个样品中的全部细菌和病毒基因组作平行分析、定量和鉴定。
目前，有美国IBIS公司的“Triangulation Identification for theGenetic Evaluation of Risks(TIGER)”系统，可以对遗传物质为DNA和RNA的病原体做高通量鉴定，而对以蛋白质为遗传物质的微生物则无能为力。国内也尚无成熟技术和装置的相关报道。
发明内容
为了克服现有技术存在的不足，本发明提出了一种高通量微生物鉴定方法，包括以下步骤：
(1)取样；
(2)遗传物质提取；
(3)质谱分析；
(4)数据分析和微生物鉴定。
步骤(2)中所述的遗传物质是DNA或RNA，用核酸抽提试剂盒提取。
步骤(2)中所述的遗传物质是蛋白质，提取后将蛋白质纯化。
所述的提取物是DNA或RNA，提取后还需要扩增，其扩增步骤为：设计通用引物，进行PCR扩增。
所述的提取物是蛋白质，蛋白质纯化后经浓缩酶解。
所述的微生物为病原微生物，所提取遗传物质为DNA或RNA遗传物质，包括以下步骤：
(1)病原微生物取样；
(2)DNA或RNA遗传物质提取；
(3)将提取物扩增；
(4)提取物扩增后脱盐；
(5)质谱分析；
(6)数据分析和微生物鉴定。
所述的微生物为病原微生物，所提取遗传物质为蛋白遗传物质，包括以下步骤：
(1)病原微生物取样；
(2)蛋白遗传物质提取；
(3)将提取物富集；
(4)提取物富集后酶解；
(5)质谱分析；
(6)数据分析和微生物鉴定。
本发明的有益之处在于：
1、本发明的鉴定方法可以广泛应用，实际上能够鉴定所有生物体；
2、能够同时鉴定数千种细菌、病毒、真菌和原生动物，而别的系统仅仅在同一时间只能鉴定很少的传染性病原体，其发展将受到数量限制；
3、能够给出一个单一样品中多个病原体的相对量的多少，而目前大多数系统还没有这个能力；
4、快速而不需要培养，一个样品可在少于4小时的时间内被分析，而培养则需要数周时间，当然一些样品根本就不能够培养；
5、可分析所有媒介中的环境或临床样品，从空气到大部分复杂生物样品，这使得其非常通用；
6、不需要测序，对于传染性病原体的鉴定来说是一个性价比非常好的解决方案；
7、质谱技术的参与使其具有极高的灵敏度和分辨率；
8、由于本发明能够在不培养病原体的条件下，广泛、快速的鉴定复杂混合物中的病原微生物，因此在疾病预防控制中心(CDC)的流行病学调查，生物制药企业的污染性微生物检测，医院的院内感染监测和传染病诊断领域，以及生物反恐等诸多领域都能发挥巨大作用。
具体实施方式
下面结合实施例详细说明本发明的技术方案，应理解的是，本发明不限于这些实施例。
1、一种高通量微生物鉴定方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)取样；
(2)遗传物质提取；
(3)质谱分析；
(4)数据分析和微生物鉴定。
(一)取样
流行病学样品以及直接来源于人类咽拭子、血液、尿液、脓液、土壤和食物样品中的微生物。而且，这些样品绝大多数是多种微生物的混合物，不需要纯培养。
优点：节省时间，一般微生物得到纯培养至少需要过夜，而很多的微生物比如病毒的培养是一个更加长的周期；还有的根本就是培养不出来的。
(二)遗传物质提取
1、DNA或RNA提取
这是一个成熟的技术，借助于一些常见的核酸抽提试剂盒就能轻松完成；一般推荐用FISHER、Ambion或是QIAGEN的试剂盒。
核酸PCR扩增
(1)原理
对于目前已经有认识的1,400多种致病病原菌，其核酸序列基本都已经知道；根据其中的保守序列(比如16sRNA)设计通用引物，通用引物只能与特异基因两翼相结合，不可能在全基因组范围有结合点，而这些保守序列之间的核酸序列在不同的种之间是有变异的，微生物就是根据可变序列来区分的。
通用引物：一般是指某基因外围保守序列。虽然这个基因可能是序列多变的，但两侧翼序列则是保守的。利用两侧翼保守序列设计出来的引物，称为通用引物，文献上叫Broad-range primer。
PCR反应同时会加入校准物，校准物是已经知道序列和分子量的序列，根据校准物定量各个病原体的相对含量。
(2)引物的设计
根据NCBI基因库里的信息，可以开发了很多的检测试剂盒(assay kits)。一个检测试剂盒包括：推荐的通用引物组、脱盐用的磁珠。
2、蛋白提取
提取纯化方法很多，一般推荐GE Healthcare的解决方法。
蛋白浓缩酶解
具有病原微生物特征的蛋白经纯化后，为提高检测的灵敏度，一般应用离心浓缩、冷冻干燥等方法将蛋白富集。由于蛋白数据库多为串联质谱检测其特征肽段的谱库，因此需要酶解蛋白。
(三)质谱分析
质谱分析得到的原始数据是扩增产物或酶解肽段的准确分子量，要求误差不大于25ppm，由准确的分子量就能够计算出该扩增产物的碱基组成，就是A、T、G、C的个数或蛋白质的种类。在数据库里，将有1400多种微生物的碱基、蛋白序列的原始数据。该数据库是以美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)开发的核酸序列数据库(GenBank)和蛋白质数据库(Nr)为基础的。
(四)数据分析和微生物鉴定
通过数据的分析，系统能告诉研究者如下的信息：
1、你所分析的样品里有哪些微生物种类———鉴定微生物；
2、某一种微生物的其他详细信息———药物抗性或室毒力因子；
3、建立自己研究范围内的微生物数据库————方便以后检测和使用的方便。
实施例1：提取物为DNA或RNA的高通量微生物鉴定方法
(1)取样
从培养的细菌中提取DNA，在培养物的0D值达到0.2左右时，约50微升的培养物被转移到300微升的ATL缓冲液中(Qiagen公司)进行预处理。
(2)遗传物质提取
用Qiagen公司的DNeasy Tissue试剂盒进行基因提取，按操作说明操作即可。
(3)扩增
细菌检测过程中的PCR条件为：50微升反应体积，于96孔PCR反应板中进行。PCR反应组成为：4ul，1×buffer II(Applied Biosystems，FosterCity，CA)，1.5mM氯化镁，0.4M三甲铵乙内酯，800μM dNTP混和物及每种引物250nM。混和物于95℃下10分钟，循环反应条件为：95℃，30分钟，48℃，30分钟，72℃，30分钟，每8个循环后，退火温度提高0.9℃。然后进行37个附加循环，95℃，15分钟；56℃，20分钟；72℃，20分钟。
扩增引物可以选用：
所有细菌：5’AACTGGAGGAAGGTGGGGA 3’
5’AGGAGGTGATCCAACCGCA 3’
革兰氏阴性细菌：5’GCATCAGGTCAAGTCATC 3’
5’CCCGGCTTCGTATTCACC 3’
革兰氏阳性细菌：5’GCATCAGGTCAAGTCATC 3’
5’GGCTTCTGCTGTTACAAA 3’
还可以是其它引物。
在所有的PCR反应中可以通过加入内标来进行定量分析。加入的内标质粒的序列与所需测的关键微生物相近，但内标序列内部的碱基被部分剔除，使得内标的分子量与数据库中所有微生物目标片段的分子量有所区别。
(4)脱盐
PCR扩增之后的产物采用阳离子交换的方法进行脱盐，扩增物被吸附于阳离子交换树脂上，用含有可挥发盐类(40mM碳酸氢铵)和有机溶剂(20％甲醇)清洗树脂，以除去可能在随后的质谱分析中引起干扰的未消耗的dNTP，盐类及其它小分子物质。
(5)质谱检测、分析
用自动进样器从96孔板上经定量环直接吸取样品10微升。样品以100微升/小时的流速进入ESI源。在ESI源中，样品溶液经由电场形成带电雾滴，在电场作用下运动，并在脱溶剂气的共同作用在去溶剂，形成带点离子。离子进入飞行管道，经微通道板(MCP)信号放大后，在工作站上得到检测结果。为了提高信噪比和分析的速度(<1分钟/质谱样)，需优化检测过程中的诸多质谱参数。
在进样前，用高流速的缓冲液冲洗传输线路和喷雾针头，以免样品的交叉污染。清洗完以后，自动进样器进样，并切换到低流速。在短暂的平衡延时以后，开始进行数据采集。在谱图进行采集时，自动进样器继续传输线路和对进样口进行冲洗。一般地，两次对进样针的清洗和一次对进样口的清洗就可以使样品交叉达到最小化。在一些操作流程中，可以达到每100秒进一个样品。而在采用了快速清洗步骤较短的采集时间后，质谱可以在不到一分钟内检测完一个样品。
(6)数据分析
在细菌检测中，应用通用引物扩增出不同的基因片段，通过质谱测得其分子量相近的正链和负链DNA片段，平均测量误差在2ppm。
应用计算机对碱基组成进行拟合，将双链组成进行配对分析以后，即使在测量误达到20ppm的情况下，能够完全匹配的组成却是唯一的。因此，在误差小于20ppm时，完全能够通过核酸的分子量来分析确定其组成。
质谱数据的获得及谱图数据的保存可以应用仪器厂商提供的数据采集和存储软件来实现。
由于质谱检测的是产物序列的质量信息，它与已有病原微生物特征序列数据库进行比对需要一个桥梁。DNA双链存在互补配对的原则，由准确的分子量就能够计算出该扩增产物的碱基组成(就是A、T、G、C的个数)，单个A、T、G、C的质量是已知的。检测出来的顺义链和反义链质量数，在误差一定的情况下，经过软件运算，可以得到A、T、G、C四种碱基各自的系数w、x、y、z。Aw、Tx、Gy和Cz相加的结果与数据库中保存的该物种特异序列质量数信息比对在误差范围内，即可证明物种的存在。
由于以上核酸提取仪、PCR仪、自动化脱盐仪、质谱仪等实验设备均为成熟仪器，能够整合在如Beckman BRT等自动化工作平台上，实现实验室全程的自动化操作。所有设备都有其标准操作规程(SOP)，并能在自动化平台上协同工作。在半自动操作时，核酸提取耗时约60分钟、PCR过程需120分钟、脱盐程序需20分钟、质谱检测每个样品小于1分钟、数据分析5分钟，在加上过程中对仪器的调试时间，每次样品分析全过程小于4小时。因此在全自动化工作平台上，所有实验室条件均已优化的前提下，实验耗时将会更少。
实施例2：提取物为蛋白的高通量微生物鉴定方法
(1)取样
样品可来源于咽拭子、血液、尿液、脓液、土壤和食物等各种媒介，经保护液融解或稀释后，根据吸附柱柱容量的大小和溶液的粘稠度决定上样的大小。
(2)遗传物质提取、纯化
由于应用亲和层析的原理，进行样品的采集。在吸附柱中含有能够吸附病原体蛋白质的特异性抗体，抗体的种类是可以根据目标物的多少而改变。吸附样品后的层析柱，经过洗涤液冲洗去除残留的杂质。
(3)富集
再由洗脱液将特异性蛋白质从吸附柱上洗脱，收集后为提高检测的灵敏度，一般应用离心浓缩、冷冻干燥等方法将蛋白富集。
(4)酶解
由于蛋白数据库多为串联质谱检测其特征肽段的谱库，因此需要酶解蛋白。酶解的方法有多种，人工的方法时间较慢，自动酶解时间较快。该步骤为蛋白技术路线的瓶颈，在自动化酶解的前提下一个样品可在4小时内完成分析。
(5)质谱检测
优化质谱参数后(调节脱溶剂气流量，毛细管电压和锥孔电压的大小)，样品可以直接进样。
(6)数据分析
根据质谱信息，设定相关条件后比对数据库(Nr)数据，得到最终结果。
在公共突发卫生事件或遭遇生物攻击之后，早一分钟得到确切结果，就可能挽救众多的生命。目前，国际上微生物来源追踪依然依赖于生物基础数据库的建立，数据库中的信息是来源归因的重要依据，有可能区分基因工程菌株和自然发生的菌株。该技术能够于生理生化表形分析，序列分析，微阵列技术等方法共同采用，以避免实验误差、重组突变等引起的错误鉴定。
实施过程中，根据病原体的特征，在Genbank中查得其看家基因序列，人工合成该序列，并经过仪器检测，完成理论数据库。再由实际样品，应用通用引物扩增该种病原体的特征序列，经仪器测定后与理论数据库比对数据的一致性，结果验证无误后得到实际数据库。该实际数据库在应用过程中，与样品吻合度达97％，能够满足鉴定的要求。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例子。显然，本发明不限于以上实施例子，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
序列表
SEQ ID NO 1：
SEQ ID NO 2：
SEQ ID NO 3：
SEQ ID NO 4：
SEQ ID NO 5：
SEQ ID NO 6：
Claims (7)
1、一种高通量微生物鉴定方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)取样；
(2)遗传物质提取；
(3)质谱分析；
(4)数据分析和微生物鉴定。
2、根据权利要求1所述的一种高通量微生物鉴定方法，其特征在于：步骤(2)中所述的遗传物质是DNA或RNA，用核酸抽提试剂盒提取。
3、根据权利要求1所述的一种高通量微生物鉴定方法，其特征在于：步骤(2)中所述的遗传物质是蛋白质，提取后将蛋白质纯化。
4、根据权利要求1或2所述的一种高通量微生物鉴定方法，其特征在于：所述的提取物是DNA或RNA，提取后还需要扩增，其扩增步骤为：设计通用引物，进行PCR扩增。
5、根据权利要求1或3所述的一种高通量微生物鉴定方法，其特征在于：所述的提取物是蛋白质，蛋白质纯化后经浓缩酶解。
6、根据权利要求1所述的一种高通量微生物鉴定方法，其特征在于：所述的微生物为病原微生物，所提取遗传物质为DNA或RNA遗传物质，包括以下步骤：
(1)病原微生物取样；
(2)DNA或RNA遗传物质提取；
(3)将提取物扩增；
(4)提取物扩增后脱盐；
(5)质谱分析；
(6)数据分析和微生物鉴定。
7、根据权利要求1所述的一种高通量微生物鉴定方法，其特征在于：所述的微生物为病原微生物，所提取遗传物质为蛋白遗传物质，包括以下步骤：
(1)病原微生物取样；
(2)蛋白遗传物质提取；
(3)将提取物富集；
(4)提取物富集后酶解；
(5)质谱分析；
(6)数据分析和微生物鉴定。
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