CN104568680A

CN104568680A - 一种多粒径空气颗粒物携带微生物的群落监测方法

Info

Publication number: CN104568680A
Application number: CN201510017894.XA
Authority: CN
Inventors: 胡宝兰; 张旭; 王家骐; 何崭飞; 叶天强; 徐新华; 胡勤海; 郑平
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2015-01-14
Filing date: 2015-01-14
Publication date: 2015-04-29

Abstract

本发明公开了一种多粒径空气颗粒物携带微生物的群落监测方法。它包括以下步骤：1）仪器准备、2）样品采集、3）样品转移、4）DNA提取、5）PCR扩增、6）高通量测序、7）群落分析、8）数据库建立。本发明可在任何不同气象条件下对大气颗粒物携带微生物的群落结构进行调查，可分析TSP、PM10与PM2.5等多种颗粒表面携带的微生物，在大气微生物群落检测方面，与传统的培养分析方法相比，本发明具有覆盖面广，检测准确度和灵敏度高等优点，对评价雾霾中空气微生物对人体健康的影响以及判断雾霾的产生源等方面有着重要的价值。

Description

一种多粒径空气颗粒物携带微生物的群落监测方法

技术领域

本发明涉及一种多粒径空气颗粒物携带微生物的群落监测方法。

背景技术

雾霾是一种天气现象，在自然界中也会发生，但发生的频率很低。由于人类活动的影响，大气气溶胶细粒子污染日趋严重，雾霾天气越来越频繁。目前针对污染空气及雾霾现象已经有不少研究，主要集中在气溶胶的分析、污染空气的源解析以及大气污染模型的构建等方面，针对污染空气中微生物群落结构组成分析和影响微生物群落结构因素的研究并不多。已有研究表明，空气中颗粒物所携带的微生物和人类的活动与健康有着密不可分的关系，这些微生物中的病原体和致敏菌会造成人们在雾霾天气中易感染呼吸道疾病和过敏性等疾病，因而探明雾霾空气中不同微生物群落结构组成及主要影响因素，对探寻合适病原微生物控制方法，提高空气质量，保障居民身体健康具有重要的指导意义。

空气微生物的研究方法分为两大类：培养方法和非培养方法。培养法是传统的空气微生物检测方法，将采集的微生物经过培养繁殖生长成菌落后计数，然后进行分离、纯化和鉴定，确定为何种微生物。培养法需花费大量的时间和精力，但只能检测可以在特定培养基及特定培养条件下生长的微生物，因此通过培养法只能检测空气中很少部分的微生物。本发明在群落分析方面采用高通量测序技术，可以检测样品中可培养和不可培养的所有微生物，大大提升了样品中微生物的检出率和灵敏度。

发明内容

本发明的目的在于克服传统空气微生物监测中培养法耗时长及检测覆盖面小的缺点，提供一种快速及检出率高的多粒径空气颗粒物携带微生物的群落监测方法。

一种多粒径空气颗粒物携带微生物的群落监测方法的步骤如下：

1）仪器准备，准备采样仪及配件，所用器皿与物品要无菌处理；

2）样品采集，利用气泵使空气通过采样仪采样口上的无菌玻璃纤维滤膜，截留携带有微生物的颗粒物；

3）样品转移，将无菌玻璃纤维滤膜上携带有微生物的颗粒物转移至0.22μm孔径、直径47mm的聚四氟乙烯滤膜上；

4）DNA提取，提取聚四氟乙烯滤膜上的总DNA；

5）PCR扩增，扩增细菌16S rRNA和真核微生物18S rRNA基因；

6）高通量测序，利用高通量测序技术获得样品DNA目的片段序列；

7）群落分析，将所得DNA目的片段序列与数据库中的已知序列进行比对，确定所得空气微生物的系统分类；

8）数据库建立，建立某地区空气中细菌和真核微生物数据库；

监测方法在任何不同气象条件下的室外大气环境下进行。

所述步骤1）中采样仪为青岛崂山应用技术研究所2031型大流量空气采样仪，配备三种不同粒径的颗粒物切割器，可采集TSP、PM10、PM2.5颗粒物样品，采样之前将切割器用中性洗液擦洗后用70%酒精擦洗除菌，采样滤膜为亲水性普通玻璃纤维滤膜，滤膜事先灭菌，将处理后的切割器和滤膜组装在采样仪上，将采样仪搬至采样地点便可开始采样。

所述步骤2）中采样仪采样口距离地面的高度为12米，采样流量为1.0 m³/min，滤膜为长方形，有效面积为230 mm×180 mm，采样时间设为8 h、16 h和24 h。

所述步骤3）中用无菌镊子将无菌玻璃纤维滤膜从采样仪采样口上取下，无菌低温条件下转移至无菌操作室，用无菌剪刀将无菌玻璃纤维滤膜剪成指甲盖大小的方块放入250mL无菌锥形瓶中，加入150 mL无菌洗脱液，超声洗脱5次，超声频率为45kHz，每次间隔为20 min，收集洗脱之后的液体，采用蠕动泵无菌压滤，蠕动泵转速设为50 rpm，全程采用一次性软管，滤膜和压滤装置均需事先灭菌，用0.22 μm滤膜收集洗脱下来的微生物，弃去滤液，在无菌操作室收集滤膜用于后续DNA的提取；所述无菌洗脱液配方为：0.85%氯化钠，0.1%吐温-80，0.1%的蛋白胨以及5-10%蔗糖。

所述步骤4）中提取聚四氟乙烯滤膜上的总DNA方法如下：将带有样品的水膜置于离心管内，加入细胞裂解缓冲液和研磨珠，涡旋混匀，之后按照DNA提取试剂盒说明书提取DNA，提取的DNA样品于-20℃条件下保存，所述裂解液配置方法为：加入10 mL 1 M Tris-HCl、8 mL 0.5 M EDT和10 mL 20%SDS溶液，用200 mM NaCl稀释至100 mL。

所述步骤5）中扩增细菌16S rRNA和真核微生物18S rRNA基因方法如下：细菌16S rRNA扩增引物采用515F/907R引物序列（AGATCACGTGCCAGCMGCC GCGG；AGACATGGTGCCAGCMGCCGCGG），PCR程序： 1= 95.0℃ For 5:00min；2=95.0℃ For 0:30min；3=55.0℃ For 0:30min；4=72.0℃ For 1:00min；5=GoTo 2 24Times；6=72.0℃ For 5:00min；7=4.0℃ Forever；8=end，真核微生物18S rRNA扩增引物采用3NDf-V4_ euk_R2引物序列（GGCAAGTCTGGTGCCAG；ACGGTATCTATC TCTTCG），PCR程序： 1=95.0℃ For 2:00min；2=95.0℃ For 0:30 min；3=GoTo 2 24Times；4=55.0℃ For 0:30min；5=72.0℃ For 1:30 min； 6=72.0℃ For 8:00min；7=4.0℃ Forever；8=end。

所述步骤7）群落分析中，通过OTUs聚类和多样性分析等方法比较样品之间的差异。

本发明的有益效果：1）本发明可在任何不同气象条件下对大气微生物群落结构进行调查，可分析TSP、PM10与PM2.5等多种颗粒表面携带的微生物，在微生物检测方面，与传统的培养分析方法相比，本发明具有覆盖面广，监测时间短以及准确度和灵敏度高等优点；2）本发明对雾霾天气中空气颗粒物进行分粒径分析，可以通过比较不同颗粒物中微生物种群与其他周围环境要素中微生物种群的相似度来判断雾霾颗粒物中微生物的产生源，为微生物污染源控制提供依据；3）本发明提供的基于大规模基因测序技术的大气颗粒物携带微生物群落监测方法，可对空气微生物的群落结构特征进行全面分析，从而建立某一地区细菌和真核微生物数据库，为雾霾中空气微生物对人体健康的影响评估提供信息方面的支持，用于指导人们健康出行和生活。

附图说明

图1是多粒径空气颗粒物携带微生物的群落监测方法的流程图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

如图1所示，一种多粒径空气颗粒物携带微生物的群落监测方法的步骤如下：

4）DNA提取，提取聚四氟乙烯滤膜上的总DNA；

5）PCR扩增，扩增细菌16S rRNA和真核微生物18S rRNA基因；

监测方法在任何不同气象条件下的室外大气环境下进行。

所述步骤1）中采样仪为青岛崂山应用技术研究所2031型大流量空气采样仪，配备三种不同粒径的颗粒物切割器，可采集TSP、PM10、PM2.5颗粒物样品，采样之前将切割器用中性洗液擦洗后用70%酒精擦洗除菌，采样滤膜为亲水性玻璃纤维滤膜，滤膜事先灭菌，将处理后的切割器和滤膜组装在采样仪上，将采样仪搬至采样地点便可开始采样。

所述步骤3）中用无菌镊子将无菌玻璃纤维滤膜从采样仪采样口上取下，无菌低温条件下转移至无菌操作室，用无菌剪刀将无菌玻璃纤维滤膜剪成指甲盖大小的方块放入250mL无菌锥形瓶中，加入150 mL无菌洗脱液，超声洗脱5次，超声频率为45kHz，每次间隔为20 min，收集洗脱之后的液体，采用蠕动泵无菌压滤，蠕动泵转速设为50 rpm，全程采用一次性软管，滤膜和压滤装置均需事先灭菌，用0.22 μm滤膜收集洗脱下来的微生物，弃去滤液，在无菌操作室收集滤膜用于后续DNA的提取；所述无菌洗脱液配方为：0.85%氯化钠，0.1%吐温-80，0.1%的蛋白胨以及5-10%蔗糖（该体系可维持微生物细胞渗透压，同时具有一定的缓冲作用，蔗糖可作为细胞保护剂）。

所述步骤4）中提取聚四氟乙烯滤膜上的总DNA方法如下：将带有样品的水膜置于离心管内，加入细胞裂解缓冲液和研磨珠，涡旋混匀，之后按照DNA提取试剂盒(PowerSoil® DNA Isolation Kit)说明书提取DNA，提取的DNA样品于-20℃条件下保存，所述裂解液配置方法为：加入10 mL 1 M Tris-HCl、8 mL 0.5 M EDT和10 mL 20%SDS溶液，用200 mM NaCl稀释至100 mL。

所述步骤7）群落分析中，通过OTUs（Operational Taxonomic Units）聚类和多样性分析等方法比较样品之间的差异。

所述步骤8）建立某一地区细菌和真核微生物数据库，为评价雾霾空气微生物对人体健康的影响以及解析雾霾源的产生方面提供基础数据。

以上所述仅为本发明的较佳实施方案，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种多粒径空气颗粒物携带微生物的群落监测方法，其特征在于，它的步骤如下：

4）DNA提取，提取聚四氟乙烯滤膜上的总DNA；

5）PCR扩增，扩增细菌16S rRNA和真核微生物18S rRNA基因；

监测方法在任何不同气象条件下的室外大气环境下进行。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1）中采样仪为青岛崂山应用技术研究所2031型大流量空气采样仪，配备三种不同粒径的颗粒物切割器，可采集TSP、PM10、PM2.5颗粒物样品，采样之前将切割器用中性洗液擦洗后用70%酒精擦洗除菌，采样滤膜为亲水性普通玻璃纤维滤膜，滤膜事先灭菌，将处理后的切割器和滤膜组装在采样仪上，将采样仪搬至采样地点便可开始采样。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2）中采样仪采样口距离地面的高度为12米，采样流量为1.0 m³/min，滤膜为长方形，有效面积为230mm×180 mm，采样时间设为8 h、16 h和24 h。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3）中用无菌镊子将无菌玻璃纤维滤膜从采样仪采样口上取下，无菌低温条件下转移至无菌操作室，用无菌剪刀将无菌玻璃纤维滤膜剪成指甲盖大小的方块放入250mL无菌锥形瓶中，加入150 mL无菌洗脱液，超声洗脱5次，超声频率为45kHz，每次间隔为20 min，收集洗脱之后的液体，采用蠕动泵无菌压滤，蠕动泵转速设为50 rpm，全程采用一次性软管，滤膜和压滤装置均需事先灭菌，用0.22 μm滤膜收集洗脱下来的微生物，弃去滤液，在无菌操作室收集滤膜用于后续DNA的提取；所述无菌洗脱液配方为：0.85%氯化钠，0.1%吐温-80，0.1%的蛋白胨以及5-10%蔗糖。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤4）中提取聚四氟乙烯滤膜上的总DNA方法如下：将带有样品的水膜置于离心管内，加入细胞裂解缓冲液和研磨珠，涡旋混匀，之后按照DNA提取试剂盒说明书提取DNA，提取的DNA样品于-20℃条件下保存，所述裂解液配置方法为：加入10 mL 1 M Tris-HCl、8 mL 0.5 M EDT和10 mL 20%SDS溶液，用200 mM NaCl稀释至100 mL。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤5）中扩增细菌16S rRNA和真核微生物18S rRNA基因方法如下：细菌16S rRNA扩增引物采用515F/907R引物序列（AGATCACGTGCCAGCMGCC GCGG；AGACATGGTGCCAGCMGCCGCGG），PCR程序： 1= 95.0℃ For 5:00min；2=95.0℃ For 0:30min；3=55.0℃ For 0:30min；4=72.0℃ For 1:00min；5=GoTo 2 24Times；6=72.0℃ For 5:00min；7=4.0℃ Forever；8=end，真核微生物18S rRNA扩增引物采用3NDf-V4_ euk_R2引物序列（GGCAAGTCTGGTGCCAG；ACGGTATCTATC TCTTCG），PCR程序： 1=95.0℃ For 2:00min；2=95.0℃ For 0:30 min；3=GoTo 2 24Times；4=55.0℃ For 0:30min；5=72.0℃ For 1:30 min； 6=72.0℃ For 8:00min；7=4.0℃ Forever；8=end。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤7）群落分析中，通过OTUs聚类和多样性分析等方法比较样品之间的差异。