CN105200039B - 大气细粒子基因组dna的提取方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了大气细粒子基因组DNA的提取方法。本发明所提供的大气细粒子基因组DNA的提取方法，包括：1)用采样滤膜采集大气细粒子，得到含有大气细粒子的采样滤膜；2)将所述含有大气细粒子的采样滤膜用PBS缓冲液清洗，得到PBS缓冲液清洗后的采样滤膜；3)将所述PBS缓冲液清洗后的采样滤膜进行超声清洗，得到超声清洗后的采样滤膜；4)将所述超声清洗后的采样滤膜用所述PBS缓冲液清洗，得到PBS缓冲液二次清洗后的采样滤膜；5)将所述PBS清洗后的滤膜浸于所述PBS缓冲液中进行震荡得到大气细粒子；6)提取所述大气细粒子基因组DNA，得到大气细粒子基因组DNA。

Description

大气细粒子基因组DNA的提取方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域中大气细粒子基因组DNA的提取方法。
背景技术
当前我国环境问题较为突出，环境污染已经威胁到人类健康，特别是大气污染问题日趋严重，霾锁连城事件频发。雾霾中的大气细粒子(PM)粒径较小(＜10μm)，可以被人体吸入，沉积在呼吸道、肺泡等部位从而引发疾病。颗粒物的直径越小，进入呼吸道的部位越深。10μm直径的颗粒物通常沉积在上呼吸道，5μm直径的可进入呼吸道的深部，2μm以下的可100％深入到细支气管和肺泡。根据其空气动力学直径(d)可以将大气细粒子分为3类：粗颗粒物(course particle，d<10um,PM10)、细颗粒物(fine particle，d<2.5um,PM2.5)、超细颗粒物(ultrafine particle,UFPs,d<0.1um,PM0.1)。随着大气细粒子的物理和化学特性研究的趋于成熟，大气细粒子中的微生物成分受到重视，建立检测大细粒子中的微生物组成成分的方法与手段变得至关重要。
目前多级大气细粒子采集主要利用滤膜式大气颗粒物采样器按照需要将不同粒径的大气细粒子采集到大气采样滤膜上；用于分析环境样品中微生物组成的手段主要是基于测序的方法。随着DNA提取技术的日益商业化，利用DNA提取试剂盒进行DNA提取显得更加方便快捷，在不破坏大气细粒子颗粒物内基因组DNA结构的条件下，提出有效地将大气细粒子颗粒物从大气采样滤膜上分离下来的具体方法，成为解决利用大气采样滤膜采样法获得大气细粒子颗粒物并有效提取得到大气细粒子颗粒物内基因组DNA的关键问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何将颗粒物从采样滤膜上分离下来，提高大气细粒子基因组DNA的提取质量和提取量。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了提取大气细粒子基因组DNA的方法。
本发明所提供的提取大气细粒子基因组DNA的方法，包括下述1)-6)：
1)用采样滤膜采集大气细粒子，得到含有大气细粒子的采样滤膜；
2)将所述含有大气细粒子的采样滤膜用PBS缓冲液清洗，得到PBS缓冲液清洗后的采样滤膜；
3)将所述PBS缓冲液清洗后的采样滤膜进行超声清洗，得到超声清洗后的采样滤膜；
4)将所述超声清洗后的采样滤膜用所述PBS缓冲液清洗，得到PBS缓冲液二次清洗后的采样滤膜；
5)将所述PBS清洗后的滤膜浸于所述PBS缓冲液中进行震荡得到大气细粒子；
6)提取所述大气细粒子基因组DNA，得到大气细粒子基因组DNA。
上述方法中，所述采样滤膜为石英滤膜。所述石英滤膜可小于等于9×10cm2。所述石英滤膜具体可为Munktell公司产品，产品目录号为420065。所述石英滤膜为无菌石英滤膜。所述无菌石英滤膜可在500-600℃下煅烧5-6小时得到。
所述PBS缓冲液可为无菌溶液，所述PBS缓冲液的pH可为7.2-7.4，所述PBS缓冲液可由Solarbio公司的10×PBS缓冲液(产品目录为P1022-500)稀释十倍得到。
上述方法中，所述将所述含有大气细粒子的采样滤膜用PBS缓冲液清洗可包括：将所述含有大气细粒子的采样滤膜浸于所述PBS缓冲液中，得到滤膜-PBS混合物；将所述滤膜-PBS混合物进行离心，得到PBS缓冲液清洗后的采样滤膜。
上述方法中，所述超声清洗可包括：将所述含有所述大气细粒子的采样滤膜浸于所述PBS缓冲液中进行超声清洗，得到滤膜-PBS超声混合物；将滤膜-PBS超声混合物进行离心，得到超声清洗后的采样滤膜。
上述方法中，所述超声清洗的条件可为10℃、功率40％；所述超声的时间可为10-20分钟，如15分钟。所述超声清洗可在超声清洗机中进行，所述超声清洗机具体可为昆山市超声仪器有限公司产品，型号为KQ-300DE型数控超声波清洗器。
上述方法中，所述将所述超声清洗后的采样滤膜用所述PBS缓冲液清洗可包括：将所述超声清洗后的采样滤膜浸于所述PBS缓冲液中，得到滤膜-PBS混合物；将所述滤膜-PBS混合物进行离心，得到PBS缓冲液二次清洗后的采样滤膜。
上述方法中，所述5)可包括：将所述PBS缓冲液二次清洗后的采样滤膜浸泡于所述PBS缓冲液中进行震荡，使所述PBS缓冲液二次清洗后的采样滤膜上所述大气细粒子悬浮在所述PBS缓冲液中，弃所述采样滤膜，得到大气细粒子悬浮液；用无菌过滤器过滤所述大气细粒子悬浮液使所述大气细粒子吸附于所述过滤器内的微孔滤膜上，得到吸附有所述大气细粒子的微孔滤膜。
上述方法中，所述过滤器可为可换膜针头式过滤器。
上述方法中，所述过滤器内的微孔滤膜孔径(直径)可小于等于0.22μm。
上述方法中，所述震荡的条件可为手动震荡，使所述PBS缓冲液二次清洗后的采样滤膜上所述大气细粒子悬浮在所述PBS缓冲液中即可。
上述方法中，所述提取所述大气细粒子基因组DNA可包括：将所述吸附有所述大气细粒子的滤膜剪碎，得到滤膜碎片；利用土壤微生物DNA的提取方法提取所述滤膜碎片上的基因组DNA，得到大气细粒子基因组DNA。
上述方法中，所述滤膜碎片的大小可为0.2-1cm2，具体可为0.5cm2。
上述方法中，所述利用土壤微生物DNA的提取方法提取所述滤膜碎片上的基因组DNA可用土壤提取试剂盒进行。所述土壤提取试剂盒具体可为MP公司的土壤基因组DNA提取试剂盒(Spin Kit for Soi l)，产品目录为116560200。
本发明中，所述离心可在4℃、200×g下进行；所述离心时间可为1小时。
上述方法中，所述大气细粒子是指空气动力学当量直径小于等于10μm的颗粒。
上述方法中，用采样滤膜采集大气细粒子可按照常规方法进行，如用带有采样滤膜的大气颗粒物采样器将大气细粒子采集于采样滤膜上。
实验证明，利用大气细粒子基因组DNA的提取方法每毫克大气细粒子可以得到0.0333μg的基因组DNA；利用大气细粒子基因组DNA的提取方法提取得到的PM2.5基因组DNA的量与采集得到PM2.5的量呈现较好的正相关，采集得到PM2.5颗粒越多，提取得到PM2.5基因组DNA越多；PCR-凝胶电泳检测法与分光光度检测法的检测结果显示利用大气细粒子基因组DNA的提取方法得到的DNA质量好，可以进行进一步的分子实验。
附图说明
图1为含有PM2.5的大气采样滤膜。其中，A1-A3为三个平行实验，Blank为空白对照。
图2为将裁剪后的滤膜放入装有PBS缓冲液的50mL离心管中后的图片。其中，A1-A3为三个平行实验，Blank为空白对照。
图3为手动震荡后得到PM2.5颗粒悬浮液体。其中，A1-A3为三个平行实验，Blank为空白对照。
图4为收集有PM2.5颗粒的微孔滤膜。其中，Sample为收集有PM2.5颗粒的微孔滤膜，Blank为空白对照。
图5为利用土壤基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA。其中，A1-A3为三个平行实验，Blank为空白对照。
图6为提取得到的DNA产物经PCR后的凝胶电泳图。其中，A1-A3为三个平行实验，Blank为空白对照，阳性为阳性对照，阴性为阴性对照。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中的实验条件，如无特殊说明，均为无菌条件，具体为在超净工作台中进行。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均需经过灭菌处理。
下述实施例中采集的大气细粒子为PM2.5(空气动力学当量直径小于等于2.5μm)。
下述实施例中的石英滤膜为Mulktell公司产品，产品目录号为420065，石英滤膜小于9×10cm2。石英滤膜需在采集大气细粒子前，在马弗炉中煅烧，得到无菌的石英滤膜；煅烧条件为500-600℃；煅烧时间为5-6小时。
下述实施例中的PBS缓冲液为无菌磷酸盐缓冲液，PBS缓冲液的pH为7.2-7.4，PBS缓冲液由Solarbio公司的10×PBS缓冲液(产品目录为P1022-500)稀释十倍得到。
下述实施例中的超声清洗机为昆山市超声仪器有限公司产品，产品型号为KQ-300D型数控超声波清洗器。
下述实施例中的可换膜针头式过滤器(Swinnex Filter Holder)为Milipore公司产品，产品目录为SX0002500。
下述实施例中的微孔滤膜为Mil ipore公司的MF-Milipore表面滤膜(0.22μm，25mm)，产品目录为GSWP02500。
下述实施例中的基因组DNA提取试剂盒为MP-bio公司的土壤基因组DNA提取试剂盒(Spin Kit for Soil)，产品目录为116560200。
实施例1、大气细粒子基因组DNA的提取
大气细粒子基因组DNA的提取包括如下步骤：
1)用采样滤膜采集大气细粒子(PM2.5)，得到含有大气细粒子的采样滤膜；
2)将所述含有大气细粒子的采样滤膜用PBS缓冲液清洗，得到PBS缓冲液清洗后的采样滤膜；
3)将所述PBS缓冲液清洗后的采样滤膜进行超声清洗，得到超声清洗后的采样滤膜；
4)将所述超声清洗后的采样滤膜用所述PBS缓冲液清洗，得到PBS缓冲液二次清洗后的采样滤膜；
5)将所述PBS清洗后的滤膜浸于所述PBS缓冲液中进行震荡得到大气细粒子；
6)提取所述大气细粒子基因组DNA，得到大气细粒子基因组DNA。
实验重复三次，每次重复实验的设置三个平行实验，具体操作步骤如下：
1、用带有无菌大气采样滤膜(石英滤膜)的崂应2034型空气重金属采样仪将PM2.5颗粒物采集于大气采样滤膜上，采样时间23h以上，得到含有PM2.5的大气采样滤膜(图1中A1-A3)；
2、将步骤1的含有PM2.5的采样滤膜(所用采样滤膜小于等于9×10cm2)进行折叠，含有PM2.5的一面向内，不含PM2.5的一面向外，然后将其放入50mL离心管中，该采样滤膜与离心管的管壁呈一定夹角，滤膜不能贴在离心管的管壁上，向该离心管中加入PBS缓冲液(滤膜完全浸在PBS缓冲液中(图2中A1-A3))在4℃、200×g下离心1小时，弃液体，得到装有PBS缓冲液清洗后的采样滤膜的离心管；
3、向步骤2的装有PBS缓冲液清洗后的采样滤膜的离心管中加入PBS缓冲液(滤膜完全浸在PBS缓冲液中)，然后在超声清洗机中进行超声清洗，得到滤膜-PBS超声混合物，超声条件为10℃、功率40％，超声时间为15分钟；将滤膜-PBS超声混合物在4℃、200×g下继续离心1小时，弃液体，得到装有超声清洗后的采样滤膜的离心管；
4、向步骤3的装有超声清洗后的采样滤膜的离心管加入PBS缓冲液(滤膜完全浸在PBS缓冲液中)在4℃、200×g下离心1小时，弃液体，得到装有PBS缓冲液二次清洗后的采样滤膜的离心管；
5、向步骤4的装有PBS缓冲液二次清洗后的采样滤膜的离心管中加入PBS缓冲液(滤膜完全浸在PBS缓冲液中)，手动震荡该离心管，使颗粒物悬浮，弃去滤膜，得到PM2.5颗粒悬浮液体(图3中A1-A3)；用装入微孔滤膜的可换膜针头式过滤器过滤PM2.5颗粒悬浮液，使PM2.5颗粒悬浮液中的PM2.5颗粒被截留在微孔滤膜上，取出微孔滤膜得到收集有PM2.5颗粒的微孔滤膜(图4中Sample)；
6、将步骤4的收集有PM2.5颗粒的微孔滤膜自然风干(1-2min)后剪碎，得到滤膜碎片，滤膜碎片的大小为0.5cm2；
7、利用土壤基因组DNA提取试剂盒(Spin Kit for Soil)提取步骤5的滤膜碎片上PM2.5颗粒基因组DNA，得到PM2.5基因组DNA溶液。
将无菌大气采样石英滤膜置于崂应2034型空气重金属采样仪内得到的未采集PM2.5颗粒物的大气采样滤膜作为空白对照(Blank)，按照步骤1-7的方法将含有PM2.5的大气采样滤膜替换为未采集PM2.5颗粒物的大气采样滤膜，其他步骤均不变，得到空白对照溶液。
检测上述PM2.5基因组DNA溶液，并将空白对照溶液作为对照，具体方法如下：
1)、分光光度检测法：
取1μl无菌水清洗Thermo NanoDrop 2000/2000c分光光度计基座，反复清洗3次；再取1μl DES试剂于基座上进行检测作为空白，DES试剂为土壤基因组DNA提取试剂盒(Spin Kit for Soi l)中用于溶解DNA的试剂；分别取1μl提取得到的PM2.5基因组DNA溶液(A1-A3)检测得到DNA浓度结果；用同样的方法检测得空白组基因组DNA浓度结果为负值，无效。检测结果表1。
表1、大气细粒子基因组DNA的提取结果
2)PCR-凝胶电泳检测法：
取2μl PM2.5基因组DNA为模板，选择细菌16srDNA引物27f:AGA GTT TGA TCC TGGCTC AG和1492r：TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT T作为引物，建立25μl PCR体系，对PM2.5基因组DNA进行PCR扩增，得到PM2.5基因组DNA扩增产物；将PM2.5基因组DNA扩增产物进行凝胶电泳，得到PM2.5基因组DNA扩增产物凝胶电泳图(图6，A1-A3)，将实验室内已知菌株(类球红细菌)菌落为模板作为阳性对照，将用无菌水为模板作为阴性对照，将无PCR产物的泳道作为空白对照。
分光光度检测法所得结果显示，每毫克大气细粒子可以得到0.0333μg的基因组DNA。利用大气细粒子基因组DNA的提取方法提取得到的PM2.5基因组DNA的量与采集得到PM2.5的量呈现较好的正相关，采集得到PM2.5颗粒越多，提取得到PM2.5基因组DNA越多；PCR-凝胶电泳检测法与分光光度检测法的检测结果显示利用大气细粒子基因组DNA的提取方法得到的DNA质量好，可以进行进一步的分子实验。

Claims (10)

1.提取大气细粒子基因组DNA的方法，包括下述1)-6)：
1)用采样滤膜采集大气细粒子，得到含有大气细粒子的采样滤膜；
2)将所述含有大气细粒子的采样滤膜用PBS缓冲液清洗，得到PBS缓冲液清洗后的采样滤膜；
3)将所述PBS缓冲液清洗后的采样滤膜进行超声清洗，得到超声清洗后的采样滤膜；
4)将所述超声清洗后的采样滤膜用所述PBS缓冲液清洗，得到PBS缓冲液二次清洗后的采样滤膜；
5)将所述PBS清洗后的滤膜浸于所述PBS缓冲液中进行震荡得到大气细粒子；
6)提取所述大气细粒子基因组DNA，得到大气细粒子基因组DNA。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述采样滤膜为石英滤膜。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述超声清洗包括：将所述含有所述大气细粒子的采样滤膜浸于所述PBS缓冲液中进行超声清洗，得到滤膜-PBS超声混合物；将滤膜-PBS超声混合物进行离心，得到超声清洗后的采样滤膜。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述离心在4℃、200×g下进行。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述超声清洗的条件为10℃、功率40％；所述超声的时间为15分钟。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述5)包括：将所述PBS缓冲液二次清洗后的采样滤膜浸泡于所述PBS缓冲液中进行震荡，使所述PBS缓冲液二次清洗后的采样滤膜上所述大气细粒子悬浮在所述PBS缓冲液中，弃所述采样滤膜，得到大气细粒子悬浮液；用无菌过滤器过滤所述大气细粒子悬浮液使所述大气细粒子吸附于所述过滤器内的微孔滤膜上，得到吸附有所述大气细粒子的微孔滤膜。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述过滤器为可换膜针头式过滤器。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述过滤器内的微孔滤膜孔径小于等于0.22μm。
9.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述震荡的条件为手动震荡。
10.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述提取所述大气细粒子基因组DNA包括：将所述吸附有所述大气细粒子的滤膜剪碎，得到滤膜碎片；利用土壤微生物DNA的提取方法提取所述滤膜碎片上的基因组DNA，得到大气细粒子基因组DNA。
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