CN109022560A - 一种大气雾霾中载带病原微生物的检测方法 - Google Patents

Abstract

一种大气雾霾中载带病原微生物的检测方法。该方法以水溶性凝胶膜作为采样滤膜，以深层过滤的原理，将>99％的细菌、真菌、病毒截留在凝胶滤膜上，将凝胶膜在无菌条件下将凝胶膜溶解于无菌水，进行DNA分离富集、PCR扩增、高通量测序，鉴定雾霾细颗粒物所携带的病原微生物的多样性。该方法具有成本低廉、检测灵敏度高、操作快捷、能够对大气环境中的微生物进行实时监测等优点，从而为雾霾载带病原微生物导致的相关疾病流行与传播提供科学参考，减少相关疾病的发生。

Description

一种大气雾霾中载带病原微生物的检测方法

技术领域

本发明属于环境检测技术领域，具体涉及一种同时测定大气雾霾细颗粒物中可培养以及不可培养的病原微生物的方法。

背景技术

近年来，随着我国日益增长的能源需求、机动车数量以及工业的迅速扩张，大气环境质量受到严重污染并产生恶化现象，最终对地球生态系统和人体健康产生了巨大影响。研究表明，大气颗粒物能对人体健康造成巨大伤害，且粒径越小，危害越大。世界卫生组织(WHO)发布的报告显示，无论是发达国家还是发展中国家，目前大多数城市和农村人口均遭受到颗粒物对健康的影响，高污染城市中的死亡率超出相对清洁城市的15-20％，全球城市大气颗粒物污染造成每年至少100万居民死亡。研究表明，雾霾与多种疾病风险(包括呼吸系统疾病、心血管疾病、肺癌等)的增加存在紧密联系。由于雾霾具有极强的吸附性能和较大的比表面积，因而成为大气微生物的重要载体。大气雾霾中微生物主要来源是自然界的水体、土壤、动植物和人类，而人类的农业活动、动物饲养、工业生产、食品加工、污水处理、垃圾处理等也是空气微生物的重要来源。大气雾霾中微生物种类复杂、数量较多，包括细菌及其芽胞、放线菌、支原体、衣原体、病毒、真菌及孢子等。目前国内外对大气雾霾的研究主要包括质量浓度的时空分布、源解析、污染特征和影响因素、环境监测标准等方面。但对于大气雾霾所载带的微生物的研究国内外少有报道，相关研究表明，雾霾除含有大量的有机和无机污染物外，还携带细菌、真菌和病毒在内的各类微生物，与暴露人群哮喘、过敏性肺炎及多种传染性疾病的发生和流行紧密相关。研究者所关注空气中微生物群落分布的研究，大多只针对可培养微生物，忽略了空气中大多数微生物的不可培养性。并且，可培养微生物的培养、分离、纯化、鉴定等过程存在着操作复杂，培养周期长等诸多问题，因此，环境监测、医疗卫生等领域亟需一种快捷、准确的雾霾中病原微生物的检测方法，来检测雾霾中所有的病原微生物(包括可培养的及不可培养的病原微生物)，以便能够及时快速的检测出大气雾霾中所携带的病原微生物，从而制定出相关人群预防感染的相关措施，减少相关疾病的发生，达到减轻国家和家庭医务负担，促进家庭健康和谐的效果。

发明内容

本发明目的是解决大气雾霾中载带的病原微生物的检测方法单一，操作复杂，培养时间长等诸多问题，提供一种大气雾霾中载带病原微生物的快速，灵敏的检测方法。

本发明采用水溶性凝胶膜的方法，通过高通量测序手段，从而快速灵敏的对雾霾中载带的病原微生物进行快速检测，从而为有效控制雾霾中载带的病原微生物导致的相关疾病的流行与传播提供科学的参考依据，减少相关疾病的发生率。

本发明的技术方案

一种大气雾霾中载带病原微生物的快速检测方法，该方法的具体步骤包括：

第1、病原微生物的收集采样；

该方法采用深层过滤原理将悬浮在空气中的微生物粒子收集到凝胶膜内；所述的凝胶膜为DNA free凝胶膜,型号为：赛多利斯17528-80；凝胶膜特殊的结构保证≧99％的细菌、真菌被截留，并且保证活性。

第2、凝胶膜的溶解；

将凝胶膜样品转移至无菌操作窒，在生物安全柜中将采集后的凝胶膜转移到无菌培养皿中，用移液枪加入预先加热到37℃的无菌水(5ml-10ml)，待凝胶膜完全融化，用无菌的枪头转移到EP管中，放于-20℃冰箱备用。

第3、DNA分离富集：采用碱性裂解液裂解第2步中得到的菌体细胞，采用聚季胺盐高分子修饰的磁性纳米粒子对DNA进行分离富集，得到雾霾样品中载带病原微生物总DNA；所有的DNA样品于-80℃条件下保存。

第4、凝胶膜上所有的病原微生物的分子生物学分析,微生物鉴定分子标记的扩增：分别采用细菌16S rDNA通用引物338F与806R，以及真菌ITS通用引物ITS1与ITS2，对第3步提取的DNA进行细菌16S rDNA扩增和真菌ITS扩增，得到总16S rDNA及ITS；具体方法是，根据设计好的PCR反应体系、PCR反应条件进行扩增，扩增结果用凝胶电泳检测，随后对目标条带进行割胶纯化回收，达到测序要求进行高通量测序。

细菌16S rDNA通用引物

338F：ACTCCTACGGGAGGCAGCA

806R：GGACTACHVGGGTWTCTAAT

真菌ITS通用引物

ITS1：CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA

ITS2：GCTGCGTTCTTCATCGATGC

预扩增程序如下：

PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸40s,32个循环；72℃延伸8min；4℃保存。

实验原理技术路线图如图1所示。

第5、16S rDNA和ITS高通量测序，最终确定载带病原微生物；具体方法是基于百迈客，北京Illumina HiSeq测序平台，利用双末端测序的方法，进行高通量测序:

第5.1、提取样品总DNA后，根据保守区设计得到引物，在引物末端加上测序接头，进行PCR扩增并对扩增产物进行纯化、定量和均一化形成测序文库，建好的文库先进行文库质检，对第4步高通测序得到的原始测序序列进行过滤、双端拼接，得到优化序列；

第5.2、将优化序列进行聚类，划分OTU，并根据OTU的序列组成得到物种分类；

第5.3、基于OTU分析结果，对样品在各个分类水平上进行分类学分析，获得各样品在门、纲、目、科、属、种分类学水平上的群落结构图、物种聚类热图、属分类学水平系统进化发生树及分类学树状图。

本发明的优点和有益效果：

本发明方法使用采用自制的碱性裂解液(NaOH 50mM，SDS 1％，蛋白酶K 10mg/L，RNase 20mg/L。)裂解菌体细胞，采用聚季胺盐高分子修饰的磁性纳米粒子对DNA进行分离富集，采用人工磁场分离吸附DNA的磁性纳米粒子，得到雾霾样品中载带病原微生物总DNA。本发明解决了大气雾霾中载带的病原微生物的检测方法单一，操作复杂，培养时间长等诸多问题，提供一种大气雾霾中载带病原微生物的快速，灵敏，高效的检测方法。

附图说明

图1是实验原理技术路线图。

图2是空白凝胶膜电子显微镜下形貌图。

图3是截留了雾霾颗粒物的凝胶膜电子显微镜下形貌图。

图4是各样品中门水平的物种丰度图。

图5是各样品属水平物种丰度图。

图6是各样品真菌属水平物种丰度图。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明进行详细的说明。

实施例1：不同功能区大气雾霾载带病原微生物的检测及应用。

一、不同功能区大气雾霾样品的采集方法。

于2016年11月30日至2017年12月21日，选取某功能区空地为采样点，见表1，采样高度为1.5米(为人的呼吸高度)。使用浮游菌微生物采样仪(赛多利斯，Airport MD8,德国)和DNA free凝胶膜(空白电子显微镜图见图2)，对大气颗粒物进行采集(截留了雾霾颗粒物的凝胶膜电子显微镜图见图3)，流速为40L/min，样品采集时间按照上午(8:30-10:55)、下午(14:30-16:55)、晚上(19:00-21:55)。用无菌镊子将采样后的凝胶膜取下，用无菌平皿包装密封带回实验室。

不同功能区包括：医院，学校，交通枢纽。

表1不同功能区分类及缩写

二、凝胶膜细菌多样性分析步骤

1、核酸提取步骤：无菌条件下将凝胶膜样品转移至无菌操作窒，在超净工作台或者生物安全柜中，每张滤膜加入预先预热到37℃无菌水5ml。将此无菌的空培养皿转移到37℃的培养箱中孵育20min，转移到超净工作台或者生物安全柜中，用移液枪转移到无菌EP管中。吸取200ul，加入事先高压灭菌的含有玻璃珠的EP管中，加入自制的碱性裂解液(NaOH50mM，SDS 1％，蛋白酶K 10mg/L，RNase 20mg/L。)，涡旋震荡5min，随后加入聚季胺盐高分子修饰的磁性纳米粒子，温和震荡孵育5min，采用人工磁场分离吸附DNA的磁性纳米粒子，采用洗脱液洗脱DNA，得到凝胶膜样品中的总DNA。所有的DNA样品于-80℃条件下保存。

根据保守区设计得到引物，见说明书，在引物末端加上测序接头，进行PCR扩增并对其产物进行纯化、定量和均一化形成测序文库，建好的文库先进行文库质检，质检合格的文库用Illumina HiSeq 2500进行测序。

PCR反应体系如下(总体积为25ul)：DEPC处理水14.3ul(RNA free H₂O)、2.5ul 10×PCR buffer(含15m mol/L的镁离子)、2.0ul d NTP(脱氧核糖核酸，2.5m molL^-1)、0.2ulrTaq酶，5ul DNA模板，0.5ul上游引物，SEQ ID NO:338F；0.5ul下游引物，SEQ ID NO:806R。

PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸40s,32个循环；72℃延伸8min；4℃保存。用离心柱式DNA回收试剂盒(Mo bio，美国)对目标条带进行割胶纯化，纯化后用核酸浓度检测仪检测每个样品的DNA浓度，平均值达到20ng/ul，达到测序要求。

高通量测序结果

图4PM1和PM2为医院大气样品，医院大气雾霾所携带的细菌群落丰度组成见图4。其中门水平上的丰度比例见图4。以变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)为主要菌类，PM1、PM2样品中变形菌门分别占30.8％，25.0％，厚壁菌门分别占19.7％，36.4％。其次为放线菌门(Actinobacterial)，分别占15.1％，27.3％，另外拟杆菌门(Bacteroidetes)分别占21.3％，4％。蓝细菌(Cyanobacteria)、奇异球菌(Deinococcus-thermus)，原始细菌(Saccharibacteria)相对丰度较低。其中发现少量的绿弯菌门(Chloroflexi)。

在属水平上相关丰度图，见图5，医院大气雾霾PM1、PM2样品中棒状杆菌Corynebacterium分别占了3.7％、8.8％；葡萄球菌Staphylococcus分别占2.8％、18.8％；副球菌Paracoccus分别占了5.53％、1.63％；Acinetobacter不动杆菌分别占3.52％、4.15％。尤其需要指出的是，交通枢纽的PM4样品中，棒状杆菌Corynebacterium占了36.5％。学校大气雾霾样品PM6中，Methylobacterium占了8.1％，Paracoccus占了7.9％，Acinetobacter占了8.1％。

由此可见，通过此种方法我们快速的从不同功能区空气雾霾样品中检测出多种微生物，其中人口较密集和流动性较大的医院和交通枢纽样品中占主导地位的为棒状杆菌属细菌，此类细菌通常分布于人和动物鼻腔、咽喉、外耳道、外阴、和皮肤，一般无致病性。但越来越多的报道证明，对于免疫力低下的老人、儿童，该菌属的多数菌种均可作为条件致病菌，通过呼吸和飞沫传播，引起宿主发生各类感染，并且在免疫力低下患者、上呼吸道感染，血液、导管或心瓣膜的使用者中感染率升高。有研究显示：棒状杆菌的致病机制主要为细菌外毒素的作用和细菌生物被膜的形成。该类细菌感染机体后，在鼻、咽粘膜上繁殖并分泌外毒素，渗出的纤维素和白细胞及坏死组织凝固在一起，形成灰白色膜状物，称为假膜。由于咽、喉、气管粘膜水肿及假膜脱落，可引起呼吸道阻塞，甚至造成窒息死亡。细菌一般不入血，只是细菌产生的外毒素入血，并与易感组织细胞如心肌、肝、肾上腺或支配咽、腭肌等的外周神经结合，可引起细胞变性、坏死、内脏出血和神经麻痹。临床上表现为心肌炎、软腭麻痹、声嘶、肾上腺功能障碍、血压下降等症状。其次为葡萄球菌属细菌，此种病原菌有较大一部分是人体条件致病菌，比如金黄色葡萄球菌，是人类化脓感染中最常见的病原菌，可引起局部化脓感染，肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。不仅如此，金黄色葡萄球菌还可以引起疖、痈、毛囊炎、蜂窝组织炎、伤口化脓、骨、关节的感染；以及内脏器官感染，如肺炎、脓胸、中耳炎、心包炎、心内膜炎等；全身感染：如败血症、脓毒血症等。随着抗菌药物的广泛使用，葡萄球菌属耐药菌株不断出现，尤其是耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA)的增多，给临床治疗带来了许多问题，金黄色葡萄球菌感染多为外源性因素引起，采取有效的消毒隔离，合理使用抗生素是减少金黄色葡萄球菌医院周围人群被感染的重点管理措施。

在医院PM1、交通枢纽的PM4以及学校PM6样品中，还检测到了比例较高的不动杆菌属Acinetobacter，此类细菌是条件致病菌，当机体抵抗力降低时易引起机体感染，并且也是引起医院内感染的重要机会致病菌之一。本菌可引起呼吸道感染、败血症、脑膜炎、心内膜炎、伤口及皮肤感染、泌尿生殖道感染等。重症者可导致死亡。另外不动杆菌属的某些种对临床常用的青霉素类、头孢菌素类抗生素有较高的耐药性，对氨苄西林、头孢替安、头孢噻肟、头孢呋辛、头孢孟多全耐药，而对呋喃妥因和头孢替坦也近似全耐药。一旦发生暴发流行，普通的感染控制措施不足以控制泛耐药菌株的传播，必须采取严格的综合措施，包括隔离患者、对患者使用专用的医疗设备、洗手消除接触传播、指派专人制定控制策略和进行环境消毒等。

在交通枢纽的PM3样品中检测到12.6％的鞘氨醇单胞菌Sphingomonas，此类细菌可以通过感染伤口进入人体引起炎症和菌血症。在公共交通场所，由于人口密集导致的此菌的传播，会引起社区中免疫力低下的老人及儿童的获得性感染。目前该菌已有引起腹膜炎、泌尿生殖道感染、创口感染、术后眼内感染、肺炎、胆管感染的报道。

实施例2：大气雾霾载带病原性真菌的微生物的检测及应用。

一、样品的采集方法，凝胶膜载带的真菌多样性分析参见实施例1大气雾霾载带病原性细菌的微生物的检测方法。

PCR反应体系如下(总体积为25ul)：DEPC处理水14.3ul(RNA free H₂O)、2.5ul 10×PCR buffer(含15m mol/L的镁离子)、2.0ul d NTP(脱氧核糖核酸，2.5m molL^-1)、0.2ulrTaq酶，5ul DNA模板，0.5ul上游引物SEQ ID NO:ITS1；0.5ul下游引物SEQ ID NO:ITS2，具体引物的序列详见说明图书。

二、高通量测序结果如下：

由图6，真菌属水平上相关丰度图可见，医院大气雾霾样品中主要以马拉色霉菌属(Malassezia)为主，分别占了59.1％、55.7％；白念珠菌属(Candida)和曲霉属(Aspergillus)次之，白念珠菌属(Candida)分别占14.9％、16.9％、曲霉属(Aspergillus)分别占3.3％、2.5％；链孢霉属(Alternaria)分别占3.9％、2.5％；学校和交通枢纽大气雾霾样品中主要以链孢霉属为主，PM5和PM6分别占了57.1％，22.9％，PM3和PM4分别占了5.3％和5.4％。

马拉色霉菌属(Malassezia)主要存在于医院的大气环境中，其是一种条件致病菌，主要寄生于人体皮脂腺丰富部位如胸、背、头、面和颈等部，高危人群有心肺疾病的新生儿、严重胃肠道疾病患者、免疫低下的儿童及成人。马拉色霉菌感染主要为该真菌感染引起的耳炎，治疗这种罕见变异型需要长期系统和局部使用咪唑类药物，结合面部清洁。

念珠菌属(Candida)主要存在于医院的大气环境中，其是一种临床最常见的条件性致病真菌之一。在机体免疫力降低，或者局部微生态失调的情况下，该菌极易从共生态转变为致病态，从而引起浅层感染或者侵袭性感染，甚至危及生命。

在学校大气样品中主要检测到链孢霉属(Alternaria)真菌和少量的曲霉属(Aspergillus)真菌。这两种真菌能够产生真菌毒素、孢子以及挥发性气体，严重的导致了不良的健康效应，比如：过敏性哮喘,过敏性肺泡炎、过敏性鼻炎、哮喘性尘肺等，部分真菌毒素如T-2毒素经呼吸道吸入引起的毒性是经消化道吸收引起毒性的40倍。

预防措施的制定：结合分子生物学的手段，建立大气雾霾污染背景下重要传染病监测方案。根据病原微生物分子鉴定数据，设计针对各种病原微生物的特异性引物。采用设计的特异性引物，对样本中潜在的各种病原微生物进行PCR检测。如果某种病原微生物引物能够扩增得到预期条带，则表明样本中存在该种病原微生物。

结合不同的病原微生物会导致的重要疾病的发生，提出此病原微生物可能导致的重要疾病的监测预警方案。结合药敏试验的结果，提出大气雾霾不同病原微生物的治疗控制药物方案。

建议：雾霾天气，因空气中携带大量的病原细菌和真菌，儿童、老年人和心脏病、肺病患者以及过敏性疾病患者应当停留在室内，停止户外运动，一般人群减少户外运动；医疗卫生机构加强对呼吸类疾病患者的防护宣传和就医指导。

Claims (5)

1.一种大气雾霾中载带病原微生物的检测方法，该方法的具体步骤包括：

第1、病原微生物的收集采样：基于深层过滤原理将悬浮在空气中的微生物粒子收集到凝胶膜内；所述的凝胶膜为DNA free凝胶膜，型号为：赛多利斯17528-80；

第2、凝胶膜的溶解：将凝胶膜样品转移至无菌操作室，在生物安全柜中将采集后的凝胶膜转移到无菌培养皿中，用移液枪加入预先加热到37℃的无菌水，待凝胶膜完全融化，用无菌的枪头转移到EP管中，放于-20℃冰箱备用；

第3、DNA分离富集：采用碱性裂解液裂解第2步凝胶膜中载带的菌体细胞，采用聚季胺盐高分子修饰的磁性纳米粒子对DNA进行分离富集，得到雾霾样品中载带病原微生物总DNA；

第4、微生物鉴定分子标记的扩增：采用细菌16S rDNA通用引物338F与806R，以及真菌ITS通用引物ITS1与ITS2，对第3步提取的DNA进行细菌16S rDNA扩增和真菌ITS扩增，得到总16S rDNA及ITS；

第5、16S rDNA和ITS高通量测序，最终确定载带病原微生物种类。

2.根据权利要求1所述大气雾霾中载带病原微生物的检测方法，其特征在于，第1步所述的病原微生物的收集采样，采用深层过滤原理将悬浮在空气中的微生物粒子收集到凝胶膜内；凝胶膜特殊的结构保证≧99％的细菌、真菌被截留，并且保证活性。

3.根据权利要求1所述大气雾霾中载带病原微生物的检测方法，其特征在于，采用无菌水对第2步所述的凝胶膜进行溶解，随后采用碱性裂解液裂解菌体细胞，继而采用聚季胺盐高分子修饰的磁性纳米粒子对DNA进行分离富集，实现雾霾样品中DNA的快捷高效提取。

4.根据权利要求书1所述的大气雾霾中载带病原微生物的检测方法，其特征在于，第4步所述环境DNA样品分子标记的扩增方法是，根据设计好的PCR反应体系、PCR反应条件对细菌及真菌分子标记进行扩增，扩增结果用凝胶电泳检测，随后对目标条带进行割胶纯化回收，达到测序要求进行高通量测序。

5.根据权利要求1所述大气雾霾中载带病原微生物的检测方法，其特征在于，第5步所述的16S rDNA和ITS引物高通量测序方法是：

第5.1、对第4步高通测序得到的原始测序序列进行过滤、双端拼接，得到优化序列；

第5.2、将优化序列进行聚类，划分OTU，并根据OTU的序列组成得到物种分类；

第5.3、基于OTU分析结果，对样品在各个分类水平上进行分类学分析，获得各样品在门、纲、目、科、属、种分类学水平上的群落结构图、物种聚类热图、属分类学水平系统进化发生树及分类学树状图。