CN108018228B - 一株大肠杆菌o157:h7弱毒株及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一株大肠杆菌O157:H7弱毒株及其在应用,属于生物技术领域。该大肠杆菌O157:H7的弱毒株JSC2株的保藏号为CCTCC M 2017356。通过制备该弱毒株菌液,对BALB/c小鼠和乳兔进行攻毒试验发现,该菌株不引起小鼠和乳兔的死亡,不导致明显的组织病理变化。且该弱毒株皮下接种小鼠1次后,可诱导高水平IgG抗体,抗体持续期长,能够提供受免动物良好的免疫效力,可用于大肠杆菌O157:H7疫苗和诊断试剂的研制。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及到一株大肠杆菌O157:H7弱毒株及其应用。
背景技术
大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)O157:H7,是一种常见的又称为肠出血性大肠杆菌,是重要的食源性人兽共患病原。近20余年来,由大肠杆菌O157:H7引发的食物中毒在世界各地以不同规模暴发流行,它的动物宿主范围非常广泛,其中反刍动物带菌率较高。相对来讲,动物作为传染源要比人类更为危险,它往往是动物源食品污染的根源。大肠杆菌O157:H7的感染因具有暴发流行趋势、强烈的致病性与致死性以及抗生素治疗会加剧病情等特点,已经成为全球性的公共卫生问题。目前对其感染缺乏理想的防治策略。
大肠杆菌O157:H7对不同动物的致病性有着明显不同。反刍动物是主要带菌者,但一般不引起明显临床症状,幼畜偶尔会出现腹泻症状。小鼠和乳兔是代表型实验动物,用来评估菌株致病力和免疫效力。3日龄乳兔,口服1×1010 CFU,3天可以导致腹泻,第7天腹泻加重,部分死亡。4-6周龄小鼠,口服1×1010 CFU,可以导致50-60%小鼠轻微腹泻并死亡,腹腔注射,可以导致85%以上小鼠死亡。
虽然市场上有商品化疫苗上市,但制备方法复杂,成本较高。例如加拿大Bioniche公司研制的Econiche,主要抗原成分为大肠杆菌 O157:H7提取物—Ⅲ型分泌蛋白(TTSP),目前在加拿大和美国部分区域上市销售,需在肉牛宰杀前至少3个月免疫,一定程度上降低大肠杆菌O157:H7在牛群中的传播,但抗原制备方法复杂、成本高,研制更加低廉而高效的疫苗,是研究的热点,也是全世界学者关注的领域。
发明内容
本发明的目的是提供一株大肠杆菌(Escherichia coli)O157:H7弱毒株,保藏号为CCTCC M 2017356,该菌株对BALB/c小鼠和乳兔无明显致病力,具有较好的免疫原性。
本发明的另一目的在于提供一种制备所述大肠杆菌(Escherichia coli)O157:H7弱毒株菌液的方法,该制备方法简单、安全、成本低。
本发明的再一目的在于提供所述大肠杆菌(Escherichia coli)O157:H7弱毒株在制备大肠杆菌O157:H7疫苗中的应用,该疫苗制备方法简单,成本低廉,保护效果好。
本发明的目的采用下述技术方案实现。
一株大肠杆菌(Escherichia coli)O157:H7弱毒株,是大肠杆菌(Escherichia coli)O157:H7 JSC2株,保藏号为CCTCC M 2017356。
本发明通过大肠杆菌显色平板筛选、聚合酶链式反应扩增、血清凝集试验,筛选得到大肠杆菌O157:H7 JSC2株。
通过BALB/c小鼠和乳兔口服实验,表明JSC2株不引起小鼠和乳兔的死亡,不导致明显的组织病理变化,而以标准菌株大肠杆菌O157:H7 EDL933株为对照,等量接种实验动物后,能引发动物发病、死亡,说明本发明筛选到的大肠杆菌为O157:H7 JSC2株为弱毒株。
通过在SMAC平板上的菌落观察,发现该菌落,具有典型大肠杆菌O157:H7的特征。
通过JSC2株1次皮下接种小鼠,再口腔灌服强毒株大肠杆菌O157:H7 EDL933株(1.0×1010CFU/只)攻毒后存活状况的观察和血清抗体的检测,说明JSC2株能够为动物提供良好的免疫保护效力,攻毒后120天抗体仍维持较高水平,因此JSC2株可用于大肠杆菌O157:H7疫苗的研制。
本发明提供所述大肠杆菌O157:H7弱毒株的菌液。
本发明提供制备所述大肠杆菌O157:H7弱毒株菌液的方法,包括采用肉汤培养基培养大肠杆菌(Escherichia coli)O157:H7 JSC2株的步骤。
在本发明中,大肠杆菌(Escherichia coli)O157:H7 JSC2株培养温度为35-40℃,培养时间为5-10h。
本发明还提供所述大肠杆菌O157:H7 弱毒株在制备大肠杆菌O157:H7疫苗中的应用。
本发明还提供以所述大肠杆菌O157:H7弱毒株为活性成分的疫苗。
有益效果
本发明申请人通过大量富有创造性的劳动,首次分离到了一株大肠杆菌O157:H7弱毒株JSC2株,其菌落形态具有典型大肠杆菌O157:H7的特征,但对BALB/c小鼠和乳兔无明显致病力,具有较好的免疫原性。小鼠注射JSC2株菌液后能抵抗强毒株的攻击,为动物提供良好的免疫保护效力,可应用于制备大肠杆菌O157:H7疫苗。在攻毒120天后,免疫动物体内的抗体仍能维持较高水平,说明该疫苗免疫后抗体持效期较长。采用本发明JSC2株制备疫苗,方法简单,成本较低。另外,JSC2株还可以应用于制备大肠杆菌O157:H7诊断试剂。
附图说明
图1显示rfbE/fliC二重PCR鉴定JSC2株的电泳图,其中泳道M为DL2000;泳道1和2为JSC2株二重PCR扩增产物;泳道3为大肠杆菌O157:H7阳性对照;泳道4为阴性对照。
图2显示JSC2株在SMAC平板上培养的菌落形态。
图3显示JSC2株革兰氏染色后的显微镜照片。
图4显示小鼠注射JSC2株菌液再经过攻毒后存活率随时间的变化。
图5显示小鼠注射JSC2株菌液免疫后血清IgG抗体随时间的变化。
具体实施方式
材料:
PCR Mix购自广州东盛生物科技有限公司。
DNA胶回收试剂盒购自Axygen公司。
大肠杆菌O157:H7强毒株EDL933:国际标准菌株,由南京农业大学预防兽医微生物组惠赠。
mEC肉汤:EC肉汤培养基(青岛海博生物),121℃高压灭菌20min,而后加入新生霉素至终浓度为100 ug/mL。
肠出血性大肠杆菌O157诊断血清和大肠杆菌H7诊断血清:购自宁波天润生物科技股份有限公司。
PBS缓冲液:0.01mM,pH7.0。氯化钾0.2g/L,磷酸二氢钾0.2g/L,氯化钠8.0g/L,二水合磷酸氢二钠1.56g/L。
实施例1 大肠杆菌O157:H7 JSC2株的分离和鉴定
(1)粪便采集:
从南京市朱家山奶牛场内采集多份新鲜牛粪,放置密封袋中,低温保存。
(2)增菌培养:
每份粪便样品称取25g至无菌锥形瓶中,加入225mL无菌的生理盐水,放入37℃培养箱中震荡2h;每个样品处理后,取10mL加入90mL的mEC肉汤中,37℃震摇培养6h,得到增菌液。
(3)免疫磁珠富集:
取出步骤(2)获得的增菌液1mL于无菌的离心管中,加入20uL Dynabeads®anti-E.coli O157(大肠杆菌免疫磁珠,购自Invitrogen公司),充分混匀后,放于磁力架富集;静置,吸走管中上清液,用0.01mM、pH7.0的PBS缓冲液洗涤磁珠3次,收集菌液。洗涤方法如下:用PBS缓冲液重悬磁珠,再置于磁力架中,静置,吸走管中上清液。在菌液中加入100uL PBS缓冲液混匀,涂布于科马嘉显色培养基(南京助研生物科技有限公司)中,37℃培养24h。观察后发现,科马嘉显色培养基上出现淡紫红色的菌落,边缘不整齐,较扁平。
(4)煮沸裂解法制备模板:
挑取步骤(3)所得淡紫红色菌落,接种于装有mEC肉汤的试管中,37℃培养7-8h,收集菌液。将菌液离心后取沉淀,采用PBS缓冲液重悬,在100℃水浴10 min,12 000 r/min离心5 min,吸取上清作为PCR鉴定中的模板。
(5)rfbE/fliC二重PCR方法鉴定:
采用rfbE/fliC二重PCR方法鉴定挑选到的菌株是否为大肠杆菌O157:H7(李丽,张雪寒,何孔旺,等。EHEC O157:H7二重PCR方法的建立及初步应用,华北农学报,2011,26(6):1-8)。
将步骤(4)所获模板以rfbE和fliC为引物采用二重PCR方法进行检测。实验结果发现,rfbE/fliC二重PCR扩增目的片段,分别为812bp和625bp,与大肠杆菌O157:H7阳性对照片段大小相同(见图1),判定步骤(3)挑选到的菌落为大肠杆菌O157:H7,命名为JSC2株。
(6)血清凝集实验鉴定:
采用血清凝集实验对JSC2株进行鉴定(叶青,张雪寒,何孔旺,等。牛源大肠杆菌O157:H7的分离及毒力因子鉴定,中国兽医学报,2012,32(8):1148-1153)。
将JSC2株分别与大肠杆菌O157诊断血清、H7诊断血清,通过玻板凝集进行血清型鉴定,结果显示JSC2株可以与O157和H7诊断血清发生凝集反应,出现明显的凝集颗粒。血清凝集实验结果表明,分离到的JSC2株为大肠杆菌O157:H7,与rfbE/fliC二重PCR方法鉴定结果一致。
(7)细菌形态特征:
将JSC2株采用划线法接种至SMAC(改良山梨醇麦康凯琼脂,购于青岛海博生物技术有限公司)平板,37℃培养12-20 h,观察菌落形态。结果如图2所示:该菌株不发酵山梨醇,在SMAC平板上呈现圆形、光滑、湿润、稍凸起、半透明菌落,有或无淡褐色中心,具有典型大肠杆菌O157:H7的特征。
运用革兰氏染色法对菌落染色,显微镜下可观察到红色的杆菌(图3),无芽胞,有鞭毛,为革兰氏阴性杆菌。
实施例2 大肠杆菌O157:H7 JSC2株的致病力实验
(1)EDL933株和JSC2株菌液的制备
从低温冻存冰箱中取出大肠杆菌O157:H7 EDL933株和JSC2株的冻存管,接种环蘸取后,划线于SMAC平板,37℃培养12-20 h后,挑取单菌落接种于mEC肉汤,37℃培养7-8h后,12 000r/min离心5min,将菌泥重悬于PBS缓冲液(0.01mM、pH7.0)中,攻击动物备用。
(2)BALB/c小鼠致病力试验
选用6周龄清洁级BALB/c小鼠(扬州大学医学院提供)20只,随机分为A、B两组,10只/组。A组,口腔灌服大肠杆菌O157:H7 JSC2株菌液,1.0×1010CFU/只;B组,口腔灌服同等体积的大肠杆菌O157:H7 EDL933株菌液,1.0×1010CFU/只。攻击后连续观察7天。试验发现攻毒后72h,B组的部分小鼠表现行动迟缓、被毛蓬松、嗜睡、厌食、喜好扎堆,便稀,并陆续死亡,直到监测期结束,死亡率达到50%。而A组小鼠未发生死亡。
(3)乳兔致病力试验
选用3日龄乳兔(金陵种兔场提供)10只,随机分成A、B两组,5只/组。A组,口腔灌服JSC2株菌液,1.0×1010CFU/只;B组,口腔灌服同等体积的EDL933株菌液,1.0×1010CFU/只。攻毒后连续观察7天。结果:攻毒当天,B组家兔,部分出现腹泻,次日陆续出现死亡,直到监测期结束,死亡率达到50 %;而A组家兔,精神状态良好,没有发生死亡。
上述结果表明,分离的JSC2株为大肠杆菌O157:H7弱毒株。
因此于2017年6月22日将该大肠杆菌弱毒株送至中国典型培养物保藏中心保藏,保藏号为CCTCC NO: M 2017356。具体保藏信息如下:
分类命名:大肠杆菌 O157:H7 JSC2
即Escherichia coli O157:H7 JSC2;
保藏单位:中国典型培养物保藏中心;
地址:中国.武汉.武汉大学; 保藏日期:2017年6月22日;
保藏编号:CCTCC NO:M 2017356。
实施例3 大肠杆菌O157:H7 JSC2株的免疫攻毒保护实验
选用6周龄清洁级BALB/c小鼠40只,随机分为A、B、C、D四组,10只/组。A和B组,背部皮下注射JSC2株菌液(制备方法同实施例2标题1),1.0×106CFU/只;C和D组,背部注射同等体积的PBS缓冲液(0.01mM、pH7.0)。28天后,A和C组同时口腔灌服EDL933株菌液,1.0×1010CFU/只,观察小鼠发病和死亡情况。攻毒后72h,C组部分小鼠表现精神不佳、被毛蓬松、嗜睡、厌食、喜好扎堆,肛门稀薄粪便附着,并陆续出现死亡,直到监测期结束,死亡率达到50%(见图4);而A组小鼠,精神状态良好,没有发生死亡。
另B和D组分别于免疫注射开始时、免疫后28天、60天、90天和120天采血,无菌分离血清,采用间接ELISA方法监测抗体水平(张雪寒,张强,张碧成,等。检测产志贺毒素大肠杆菌抗体的间接ELISA试剂盒的研制,西南农业学报,2016,29(11):2738-2745)。血清中大肠杆菌O157:H7血清抗体水平如图5所示,在免疫后28天,B组血清OD450的检测结果远远大于阳性临界值0.244,而对照组D组血清OD450一直处于较低水平,远远低于临界值0.244,判定B组血清为抗体阳性。持续监测到免疫后120天,B组血清仍然维持较高的抗体水平,说明JSC2株菌液免疫后抗体水平较高,且抗体持续期较长。
综上所述,JSC2株1次皮下注射小鼠后,可诱导高水平血清IgG抗体,抗体持续期长,能够提供受免动物良好的免疫效力,可用于大肠杆菌O157:H7疫苗和诊断试剂的研制。
Claims (7)
1.一株大肠杆菌O157:H7弱毒株,是大肠杆菌(Escherichia coli)O157:H7 JSC2株,保藏号为CCTCC NO:M 2017356。
2.权利要求1所述大肠杆菌O157:H7弱毒株的菌液。
3.制备权利要求2所述大肠杆菌O157:H7弱毒株菌液的方法,包括采用肉汤培养基培养大肠杆菌(Escherichia coli)O157:H7 JSC2株的步骤。
4.根据权利要求3所述制备大肠杆菌O157:H7弱毒株菌液的方法,其特征在于培养温度为35-40℃,培养时间为5-10h。
5.权利要求1所述大肠杆菌O157:H7 弱毒株在制备大肠杆菌O157:H7疫苗中的应用。
6.一种以权利要求1所述大肠杆菌O157:H7弱毒株为活性成分的疫苗。
7.权利要求1所述大肠杆菌O157:H7弱毒株在制备大肠杆菌O157:H7诊断试剂方面的应用。
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