CN102329746B - 猪链球菌、副猪嗜血杆菌病二联灭活疫苗及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种猪链球菌、副猪嗜血杆菌病二联灭活疫苗及制备方法，其步骤：a．分别将猪链球菌株菌种、副猪嗜血杆菌株菌种和副猪嗜血杆菌株菌种增殖培养，得到猪链球菌菌液、副猪嗜血杆菌株菌液和副猪嗜血杆菌株菌液；b．分别向猪链球菌株菌液、副猪嗜血杆菌株菌液和副猪嗜血杆菌株菌液中加入甲醛溶液，灭活；c．将收集的猪链球菌株菌液、副猪嗜血杆菌株菌液和副猪嗜血杆菌株菌液混合，加入吐温-80制成水相，将白油、司本-80和硬脂酸铝制成油相，水相与油相混合，制成均匀乳剂，为油乳剂灭活疫苗；d．将油乳剂灭活疫苗进行分装。该疫苗能有效的预防猪链球菌病和副猪嗜血杆菌病，只需一针免疫，降低了成本，而且不存在散毒的隐患，安全可靠。

Description

猪链球菌、副猪嗜血杆菌病二联灭活疫苗及制备方法

技术领域

本发明猪链球菌病(2型)、副猪嗜血杆菌病(4型、5型)二联灭活疫苗属于生物技术领域，更具体涉及一种猪链球菌、副猪嗜血杆菌病二联灭活疫苗，同时还涉及一种猪链球菌、副猪嗜血杆菌病二联灭活疫苗的制备方法；制备的猪链球菌、副猪嗜血杆菌病二联灭活疫苗主要适用于母猪，公猪及仔猪。

技术背景

猪链球菌和副猪嗜血杆菌均是条件性致病菌，在机体免疫力降低的情况下容易导致疾病的发生。

猪链球菌是引起猪链球菌病的重要致病性细菌，其共有33种血清型，其中猪链球菌2型可引起猪急性败血症、脑膜脑炎、关节炎和急性死亡，也可导致生猪从业人员中的特定人群感染和死亡(J Clin Microbiol，2002，40(8)：2922～2929.)。2005年6～8月，四川省资阳市、内江市等地区暴发了猪链球菌2型病，并导致204人感染，38人死亡(畜牧兽医学报，2007，38(4)：367～381.)。

副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis，HPS)能引起猪的多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎，可以影响从2周龄的哺乳仔猪到4月龄的育肥猪，主要在断奶后和保育阶段发病，多见于5～8周龄的猪，发病率一般在10％～15％，严重时死亡率高达50％。其易与猪链球菌、猪繁殖与呼吸障碍综合症、支原体肺炎以及其它疾病发生混合或继发感染，而且据多篇文献报道，副猪嗜血杆菌病容易被误诊(华中农业大学学报，2005，24(1)：55～58)。因此，在临床上控制副猪嗜血杆菌病不仅对本病本身而且也为其它疾病的控制，进而提高猪群整体健康水平提供了保障。

目前，市面上使用的疫苗只有单独预防猪链球菌病、副猪嗜血杆菌病的灭活疫苗。同时预防猪链球菌病与副猪嗜血杆菌病的灭活疫苗，国内外还未见报道。而且，由于抗生素的滥用，导致了耐药菌株的产生，使药物治疗趋向无效、浪费；抗生素药物的残留，也使得肉用动物在出口时面临不能通过的难题。因此，使用疫苗来预防猪链球菌病与副猪嗜血杆菌病是当前最经济、最有效的方法。

因此，急需发明一种新的能同时预防猪链球菌病、副猪嗜血杆菌病的二联灭活疫苗以解决上述问题。本公司经大量试验后，研制出了该二联灭活疫苗，试验结果证明本疫苗效果良好。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种猪链球菌、副猪嗜血杆菌病二联灭活疫苗，该疫苗能同时有效的预防猪链球菌病和副猪嗜血杆菌病，而且只需一针免疫，减少了猪只的应激，降低了成本。临床上达到“一针多防”的效果，而且不存在散毒的隐患，安全可靠。

本发明的另一个目的是在于提供了一种猪链球菌、副猪嗜血杆菌病二联灭活疫苗的制备方法，该方法制备的疫苗产生的抗体较高且持久。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：

一种猪链球菌病(2型)、副猪嗜血杆菌病(4型、5型)二联灭活疫苗的制备方案，其步骤如下：

a.分别将猪链球菌2-LT株菌种(CCTCC NO：M2011282)、副猪嗜血杆菌4-MD0322株菌种(CCTCC NO：M2011283)和副猪嗜血杆菌5-SH0165株菌种(CCTCC NO：M2011284)增殖培养，得到猪链球菌2-LT菌液，副猪嗜血杆菌4-MD0322株菌液和副猪嗜血杆菌5-SH0165株菌液。

b.分别向a步骤培养好的猪链球菌2-LT株菌液、副猪嗜血杆菌4-MD0322株菌液和副猪嗜血杆菌5-SH0165株菌液中按总量加入0.3％～0.4％的甲醛溶液，置于37℃灭活48～72小时，期间每隔3～4小时搅拌1次。

c.将收集的猪链球菌2-LT株菌液，副猪嗜血杆菌4-MD0322株菌液和副猪嗜血杆菌5-SH0165株菌液按照1∶1∶1的体积比混合，再按吐温-80与混合菌液4～6∶94～96，优选4∶96的体积比，加入吐温-80，制成水相，将白油(埃克森美孚Marco152)、司本-80和硬脂酸铝按照94∶6∶1～2，优选94∶6∶1的比例制成油相，水相与油相按照40％～45％∶55％～60％体积比混合，优选40％∶60％体积比。将水相缓慢加入油相均质3～5分钟后，制成均匀乳剂，即为油乳剂灭活疫苗。本二联油乳剂灭活疫苗的保存条件为：2～8℃。

d、将步骤c得到的油乳剂灭活疫苗进行分装。

本发明猪链球菌病(2型)、副猪嗜血杆菌病(4型、5型)二联灭活疫苗的优选实施方式，所述的猪链球菌2型为猪链球菌2-LT株，所述的副猪嗜血杆菌4-MD0322株，副猪嗜血杆菌5-SH0165株。

各菌株分离鉴定如下：

1.猪链球菌2型菌株LT株(猪链球菌2-LT)的分离、筛选和鉴定

申请人从湖北省罗田某猪场送检的有神经症状、急性死亡猪的心血中分离得到一株具有致病性的猪链球菌2型(Streptococcus suis)菌株(菌株编号为LT株)，Streptococcus suis 2，CCTCC NO：M2011282，该菌株已保藏，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期：2011年8月9日，保藏编号：CCTCC NO：M2011282，分类命名：猪链球菌2-LT Streptococcus suis 2-LT。

1.1猪链球菌2-LT的分离

待分离的病料——各组织病料是申请人的发明人于2004年9月分离于湖北罗田某猪场有神经症状、急性死亡猪的心血中分离得到。其具体分离方法为：无菌采集心血接种于TSA平皿上，37℃培养12-24小时后观察。挑取直径为0.1mm-1.0mm、灰白色、半透明、表面光滑、圆形、边缘整齐的小菌落接种于TSB液体培养基中37℃摇床培养过夜。将纯培养后的细菌进行革兰氏染色镜检。然后用光学显微镜观察，革兰氏染色呈阳性、成双或短链状球菌，对其传代纯化。

1.2猪链球菌2型的分类鉴定

采用PCR方法、生化鉴定及玻片凝集试验进行了鉴定，具体步骤如下：

(1)PCR方法鉴定：根据参考文献合成猪链球菌通用引物和猪链球菌2型特异性引物。其中猪链球菌通用引物JP4和JP5是根据谷氨酸盐脱氢酶基因(gdh，基因登录号：gb|EF539838.1|)设计，

上游引物为JP4(5’-CCATGGACAGATAAAGATGG-3’)；

下游引物为JP5(5’-GCAGCGTATTCTGTCAAACG-3’)，可扩增长度为689bp的目的DNA片段(其PCR图片见图1)。

猪链球菌2型的特异性引物是根据猪链球菌具有型特异性的荚膜多糖抗原基因cps2J(基因登录号：JN024705.1)设计，上游引物为cps2J-F(5’-TGATAGTGATTTGTCGGGAGGG-3’)，

下游引物为cps2J-R(5’-GAGTATCTAAAGAATGCCTATTG-3’)，可扩增长度为557bp目的DNA片段(PCR图片如图2)。

(2)生化鉴定：从TSA平板上挑取步骤(1)中鉴定为阳性的单菌落，进行常规的生化鉴定试验。微量生化鉴定管购自杭州微生物试剂有限公司，按照该公司产品说明书进行操作。结果猪链球菌LT株的各项生化指标均符合。

(3)玻片凝集试验：将分离的猪链球菌LT株接种TSB培养基，置37℃摇床170rpm/min，培养8小时，使OD600达到1.3～1.5，采用玻片凝集的方法对该菌液进行血清学分型鉴定。操作方法如下：

取洁净玻片1张，用微量移液器吸取3μl猪链球菌(SS)标准阳性血清(购自丹麦哥本哈根国立血清研究所)滴于载玻片上，另吸取3μl生理盐水做对照，然后吸取3μl菌液分别加入血清和生理盐水中，充分混匀，(注：每次加样都要更换移液器的TIP头)。轻轻摇动载玻片，1～2min后观察结果。血清与待检菌液混合后出现明显可见的凝集块，液体变为透明，而盐水对照滴仍为均匀混浊状态，即为凝集反应阳性。若血清与菌液混合后为均匀混浊状态，没有出现明显可见的凝集块视为为阴性。玻片凝集试验表明，猪链球菌LT株仅与猪链球菌2型标准阳性血清(购自丹麦哥本哈根国立血清研究所)发生凝集反应，不与其他血清型凝集。

根据革兰氏染色、PCR方法、生化鉴定和玻片凝集试验，确定上述猪链球菌LT株为猪链球菌2型菌株，命名为猪链球菌2-LT。

2.副猪嗜血杆菌4型MD0322株(副猪嗜血杆菌4-MD0322)的分离、筛选和鉴定

申请人从湖北省枝江市某猪场患多发性浆膜炎与关节炎的猪中分离得到一株副猪嗜血杆菌血清型4型(菌株编号为MD0322株)，Haemophilus parasuis 4，CCTCC NO：M2011283，该菌株已保藏，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期：2011年8月9日，保藏编号：CCTCC NO：M2011283，分类命名：副猪嗜血杆菌4-MD0322Haemophilus parasuis 4-MD0322。

2.1副猪嗜血杆菌4-MD0322株的分离。

待分离的病料——各组织病料是申请人的发明人于2001年8月分离于湖北枝江市某猪场患多发性浆膜炎与关节炎的猪分离得到。其具体分离方法为：无菌操作从疑似病猪的关节液和脑组织等病料中取样，首先在巧克力琼脂平板或TSA固体培养基上划线接种，37℃培养24～48小时后挑取单个菌落，再进行纯培养。挑取上述纯培养菌落抹片，革兰氏染色后观察，细菌为革兰氏阴性细小杆菌，具有多种不同的形态，可见单个的球杆菌、杆菌或长的细长的以致丝状的菌体。将其命名为副猪嗜血杆菌MD0322株。

2.2副猪嗜血杆菌MD0322株的分类鉴定

采用PCR方法、生化鉴定及免疫琼脂扩散试验或间接血凝试验进行了鉴定，具体步骤如下：

(1)PCR方法鉴定：

根据副猪嗜血杆菌16S rRNA(基因登录号：GU226410.1)序列设计引物，由上海生工公司合成：

上游引物：5’-GGC TTC GTCACC CTC TGT-3’

下游引物：5’-GTG ATG AGG AAG GGT GGT GT-3’可扩增长度为821bp的目的DNA片段(其PCR图片见图3)。

PCR结果表明其为副猪嗜血杆菌。

(2)生化鉴定

用接种环分别挑取上述PCR鉴定为阳性的单菌落，水平划线于无NAD的绵羊鲜血平皿上，再挑取金黄色葡萄球菌垂直于水平线划线，37℃培养24～48小时，看是否有“卫星生长现象”(即在葡萄球菌菌苔附近待测菌菌落生长较大，而远侧菌落生长较小甚至没有菌落生长)，同时观察是否具有溶血现象。取具有“卫星生长现象”且不溶血的单菌落纯培养后接种于脲酶、氧化酶、接触酶、硝酸盐还原、葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、核糖、麦芽糖、乳糖、木糖和甘露糖等微型生化鉴定管(购自杭州天和微生物试剂有限责任公司)，按厂家说明书的方法操作，结果副猪嗜血杆菌MD0322株的各项生化指标均符合。

(3)免疫琼脂扩散试验

将待检副猪嗜血杆菌分离株接种于TSA固体培养基，37℃培养24小时，挑取单菌落重新接种TSA固体培养基纯化扩大，37℃培养12～16小时后再于TSA固体培养基上均匀划线进行大量增殖，37℃培养24小时，用PBS洗下菌苔，7000转/分钟，离心2分钟，弃上清，估测细菌沉淀的体积，加入菌体体积9倍的pH7.4的PBS，涡旋混合均匀后于121℃高压蒸汽处理2小时，7000转/分钟，离心10分钟，取上清即为用于琼脂扩散试验的分型抗原。

琼脂扩散试验中的琼脂浓度为1.0％，中央孔分别加入副猪嗜血杆菌抗原，周围孔加入2倍系列稀释的血清。置37℃温箱湿盒中作用，24小时后观察结果，连续观察三日，如在抗原孔相邻的抗体孔之间出现沉淀线，则判定其效价。琼脂扩散试验表明，副猪嗜血杆菌MD0322株仅与副猪嗜血杆菌4型标准阳性血清(购自华中农业大学动物传染病实验室)发生反应，不与其他血清型反应。

根据革兰氏染色、PCR方法、生化鉴定和琼脂扩散试验，确定上述副猪嗜血杆菌MD0322株为副猪嗜血杆菌4型菌株，命名为副猪嗜血杆菌4-MD0322。

3.副猪嗜血杆菌5型SH0165株(副猪嗜血杆菌5-SH0165)的分离、筛选和鉴定

申请人从湖北省枝江市某猪场患多发性浆膜炎与关节炎的猪中分离得到一株副猪嗜血杆菌血清型5型(菌株编号为SH0165)，Haemophilus parasuis 5，CCTCC NO：M2011284，该菌株已保藏，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期：2011年8月9日，保藏编号：CCTCC NO：M2011284，分类命名：副猪嗜血杆菌5-SH0165Haemophilus parasuis 5-SH0165。

3.1副猪嗜血杆菌5型SH0165株的分离。

待分离的病料——各组织病料是申请人的发明人于2001年4月分离于河北省石家庄市送检的病料中分离得到。其具体分离方法为：无菌操作从疑似病猪的心血、肺组织、脾组织、关节液等病料中取样，首先在巧克力琼脂平板或TSA固体培养基上划线接种，37℃培养24～48小时后挑取单个菌落，再进行纯培养。挑取上述纯培养菌落抹片，革兰氏染色后观察，细菌为革兰氏阴性细小杆菌，具有多种不同的形态，可见单个的球杆菌、杆菌或长的细长的以致丝状的菌体。将其命名为副猪嗜血杆菌SH0165株。

3.2副猪嗜血杆菌SH0165株的分类鉴定

采用PCR方法、生化鉴定及免疫琼脂扩散试验或间接血凝试验进行了鉴定，操作方法同上述2.2。

各项试验确定上述副猪嗜血杆菌SH0165株为副猪嗜血杆菌5型菌株，命名为副猪嗜血杆菌5-SH0165。

本疫苗主要应用于猪场中种猪和仔猪对猪链球菌病和副猪嗜血杆菌病的预防，降低猪场猪链球菌病和副猪嗜血杆菌病的发病率，提高仔猪存活效率。

本发明的优点是可以同时预防猪链球菌2型和猪副猪嗜血杆菌4型、5型引起的疾病，对于同血清型的免疫保护效果达到80％以上，相对于目前的商品疫苗来讲，可以单针免疫较多的血清型，达到“一针防多病”的目的，且使用方便，减少了猪只应激，而且不存在散毒的隐患，安全可靠。

附图说明

图1为一种猪链球菌通用引物扩增的PCR示意图。

M：DNA分子Marker；1～4：猪链球菌分离菌株和猪链球菌2型标准菌株；5：猪链球菌LT分离株。

图2为一种猪链球菌2型引物扩增的PCR示意图。

1：猪链球菌LT分离株；2：DNA分子Marker3～5：猪链球菌分离株；6：阴性对照(H2O。

图3为一种副猪嗜血杆菌16SrRNA引物扩增的PCR示意图。

M为Marker DL-2000；1为副猪嗜血杆菌4-MD0322株；2为阴性对照，3、4、5分别为其他待测菌。

具体实施方式

为了本发明更加容易理解，下面将进一步阐述本发明的实施例。结合实施对本发明做进一步的描述和论证。

实施例1：

一种猪链球菌病(2型)、副猪嗜血杆菌病(4型、5型)二联灭活疫苗的制备方案，其步骤如下：

本品是选用猪链球菌2型LT株、副猪嗜血杆菌4型MD0322株和副猪嗜血杆菌5型SH0165株接种于适宜的培养基培养，将培养物经甲醛容易灭活，去除残留毒素，加白油佐剂配置而成，用于预防由猪链球菌2型和副猪嗜血杆菌4型、5型所引起的各种细菌感染。这包括了目前流行的几种最重要的细菌性疾病。制造及检验本品用的菌种为猪链球菌2-LT株(CCTCC NO：M2011282)、副猪嗜血杆菌4-MD0322株(CCTCC NO：M2011283)和副猪嗜血杆菌5-SH0165株(CCTCC NO：M2011284)均在湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏。

制造及检验本品用的菌种为猪链球菌2-LT株、副猪嗜血杆菌4-MD0322株和副猪嗜血杆菌5-SH0165株均冻干保存。

1疫苗制造及半成品检验

1.1生产用种子的制备

1.1.1一级种子的繁殖

将冻干菌种接种于TSA固体培养基，置37℃培养24小时，然后选取生长良好的菌落，接种TSA固体培养基若干个，置37℃培养12～16小时，做为一级种子。在2～8℃保存，保存期不超过5日。在培养基上传代，不超过5代。

1.1.2二级种子繁殖取一级种子接种于TSB液体培养基中，置37℃培养12～16小时，按《中国兽药典》附录进行纯粹检验，合格后作为二级种子。在2～8℃保存，保存期不超过5日。

1.2制苗用培养基为TSB液体培养基。

1.3制苗菌液制备

1.3.1细菌培养三种血清型的菌液分别培养制备。将鉴定合格的猪链球菌2型二级种子液按1％接种于TSB液体培养基，置37℃培养12小时；将鉴定合格的副猪嗜血杆菌4型，5型二级种子液按1％接种于TSB液体培养基，置37℃培养24小时。

1.3.2纯粹检验及细菌计数取样进行活菌计数，并按现行《中国兽药典》附录进行纯粹检验，应纯粹。

1.3.3灭活检验合格的菌液，按菌液总量的0.4％加入甲醛溶液，37℃灭活48小时，期间每隔4小时搅拌1次，然后取样按《中国兽药典》进行灭活检验，应无细菌生长。

1.3.4浓缩将灭活检验合格的菌液离心，再按灭活前的活菌计数结果用生理盐水调节猪链球菌2型菌液浓度到1.125×10¹⁰CFU/ml，调节副猪嗜血杆菌4型和5型的菌液浓度到1.0×10¹⁰CFU/ml。取样做无菌检验，应无细菌生长。

1.4配苗

1.4.1油相的制备取埃克森美孚进口白油94份(以毫升为单位)，加入硬脂酸铝1份(以克为单位)，边加边搅拌，直到透明为止，再加入司本-80 6份(以毫升为单位)，充分混匀，130℃灭菌30分钟，冷却至室温备用。

1.4.2水相的制备将浓缩好的三种菌液按11∶1比例混合，加入灭菌后的吐温-80，边加边搅拌，至完全溶解，使其终浓度为4.0％。

1.4.3乳化水相与油相的比例为1∶1.5。将水相缓慢加入油相均质3～5分钟后，剪切，制成均匀乳剂。

1.5分装定量分装，加塞密封，置2～8℃保存。

实施例5效力研究

1试验方案：

用28～35日龄健康断奶仔猪30头，其中15头各肌肉注射实施例1制得的疫苗2ml，含1个使用剂量，首免后21日进行第二次免疫；剩下15头作为未免疫对照组。免疫后测定动物体温，观察临床表现。

二免后14日，猪链球菌2型采用静脉攻毒，副猪嗜血杆菌采用腹腔内攻毒。分别用2.0×10⁶CFU猪链球菌2-LT株，7.0×10⁹CFU的副猪嗜血杆菌4-MD03220株和6.0×10⁹CFU的副猪嗜血杆菌5-SH0165株攻毒，攻毒后观察其临床症状和死亡情况，计算每批疫苗的保护率。

2试验结果：

2.1疫苗接种后体温状况

疫苗接种猪无明显体温反应，食欲、精神正常，无其他可见临床反应出现，疫苗注射局部无肿胀等炎性反应(表1)。

表1：疫苗接种仔猪(28～35日龄)后的平均体温变化

如表1所示，疫苗对28～35日龄健康断奶仔猪免疫接种2ml后的观察结果表明，疫苗接种猪仅表现一过性的体温升高，并且平均体温升高不超过1℃。另外，所有仔猪接种后食欲、精神均表现正常，无其它可见临床反应。

2.2疫苗免疫效力测定

仔猪二免后14天，分别用2.0×10⁶CFU猪链球菌2型LT株，7.0×10⁹CFU的副猪嗜血杆菌4型(MD03220)和6.0×10⁹CFU的副猪嗜血杆菌5型(SH0165)攻毒，结果如表2所示。

表2：疫苗免疫保护力结果

实施例2：猪链球菌2-LT株(猪链球菌2-LT)的分离和鉴定。

待分离的病料——各组织病料是申请人的发明人于2004年9月分离于湖北罗田某猪场有神经症状、急性死亡猪的心血由分离得到。其具体分离方法为：无菌采集心血接种于TSA平皿上，37℃培养12-24小时后观察。挑取直径为0.1mm-1.0mm、灰白色、半透明、表面光滑、圆形、边缘整齐的小菌落接种于TSB液体培养基中37℃摇床培养过夜。将纯培养后的细菌进行革兰氏染色镜检。然后用光学显微镜观察，革兰氏染色呈阳性、成双或短链状球菌，对其传代纯化。

猪链球菌2型的分类鉴定，采用PCR方法、生化鉴定及玻片凝集试验进行了鉴定，具体步骤如下：

(1)PCR方法鉴定：根据参考文献合成猪链球菌通用引物和猪链球菌2型特异性引物。其中猪链球菌通用引物JP4和JP5是根据谷氨酸盐脱氢酶基因(gdh，基因登录号：gb|EF539838.1|)设计，

上游引物为JP4(5’-CCATGGACAGATAAAGATGG-3’)；

下游引物为JP5(5’-GCAGCGTATTCTGTCAAACG-3’)，可扩增长度为689bp的目的DNA片段(其PCR图片见图1)。

猪链球菌2型的特异性引物是根据猪链球菌具有型特异性的荚膜多糖抗原基因cps2J(基因登录号：JN024705.1)设计，上游引物为cps2J-F(5’-TGATAGTGATTTGTCGGGAGGG-3’)，

下游引物为cps2J-R(5’-GAGTATCTAAAGAATGCCTATTG-3’)，可扩增长度为557bp目的DNA片段。

PCR模板的制备：

取1ml菌液到无菌的1.5ml离心管中，12000r/min离心5分钟，去掉上清，用200μl无菌水悬浮混匀，100℃水浴中煮10分钟，然后迅速置于冰上冷却5分钟，12000r/min离心2分钟，上清即为PCR模板。

PCR反应体系(总体积25μl)：

10×Taq Buffer2.5μl，2μM dNTPs 1.5μl，20μM上、下游引物各1μl，TaqDNA聚合酶1μl，无菌水14μl，模板4μl。

退火温度为：94℃30秒，58℃60秒，72℃40秒，30循环。

PCR结果观察：

取PCR扩增反应产物10μl和Mark2000plus 5μl，加到含EB的0.8％(V/V)琼脂糖胶中，在80伏电压下电泳30分钟，然后在紫外线灯下观察。

(2)生化鉴定：从TSA平板上挑取步骤(1)中鉴定为阳性的单菌落，进行常规的生化鉴定试验。微量生化鉴定管购自杭州微生物试剂有限公司，按照该公司产品说明书进行操作。结果猪链球菌LT株的各项生化指标均符合(见表1)。

(3)玻片凝集试验：将分离的猪链球菌LT株接种TSB培养基，置37℃摇床170rpm/min，培养8小时，使OD600达到1.3～1.5，采用玻片凝集的方法对该菌液进行血清学分型鉴定。操作方法如下：

取洁净玻片1张，用微量移液器吸取3μl猪链球菌(SS)标准阳性血清(购自丹麦哥本哈根国立血清研究所)滴于载玻片上，另吸取3μl生理盐水做对照，然后吸取3μl菌液分别加入血清和生理盐水中，充分混匀(注：每次加样都要更换移液器的TIP头)。轻轻摇动载玻片，1～2min后观察结果。血清与待检菌液混合后出现明显可见的凝集块，液体变为透明，而盐水对照滴仍为均匀混浊状态，即为凝集反应阳性。若血清与菌液混合后为均匀混浊状态，没有出现明显可见的凝集块视为为阴性。玻片凝集试验表明，猪链球菌LT株仅与猪链球菌2型标准阳性血清发生凝集反应，不与其他血清型凝集。

表1猪链球菌2型生化鉴定试验

注：1、标准菌株为猪链球菌2型标准菌株，来自于中国农业科学院哈尔滨兽药研究所(赠送)。

实施例3：副猪嗜血杆菌4-MD0322株的分离和鉴定。

待分离的病料——各组织病料是申请人的发明人于2001年8月分离于湖北枝江市某猪场患多发性浆膜炎与关节炎的猪分离得到。其具体分离方法为：无菌操作从疑似病猪的关节液和脑组织等病料中取样，首先在巧克力琼脂平板或TSA固体培养基上划线接种，37℃培养24～48小时后挑取单个菌落，再进行纯培养。挑取上述纯培养菌落抹片，革兰氏染色后观察，细菌为革兰氏阴性细小杆菌，具有多种不同的形态，可见单个的球杆菌、杆菌或长的细长的以致丝状的菌体。将其命名为副猪嗜血杆菌MD0322株。

副猪嗜血杆菌MD0322株的分类鉴定

采用PCR方法、生化鉴定及免疫琼脂扩散试验或间接血凝试验进行了鉴定，具体步骤如下：

(1)PCR方法鉴定：

根据副猪嗜血杆菌16S rRNA(基因登录号：M75065)序列设计引物，由上海生工公司合成：

上游引物：5’-GGC TTC GTC ACC CTC TGT-3’

下游引物：5’-GTG ATG AGG AAG GGT GGT GT-3’可扩增长度为822bp的目的DNA片段。

反应体系(50μl)：10倍缓冲液5μl，25mmol/L MgCl₂1.5μl，dNTPs 1.0μl，1.5umol/L上游引物1.5μl，1.5umol/L下游引物1.5μl，ExTaqE 0.5μl，无菌水9μl，模板10μl。

反应条件：94℃变性4分钟；94℃50秒，59℃50秒，72℃1分钟，72℃10分钟，PCR产物4℃保存。

PCR结果观察：

取PCR扩增反应产物10μl和Mark2000plus 5μl，加到含EB的0.8％琼脂糖胶中，在80伏电压下电泳30分钟，然后在紫外线灯下观察。可见822bp的目的条带。

(2)生化鉴定：

用接种环分别挑取上述PCR鉴定为阳性的单菌落，水平划线于无NAD的绵羊鲜血平皿上，再挑取金黄色葡萄球菌垂直于水平线划线，37℃培养24～48小时，看是否有“卫星生长现象”(即在葡萄球菌菌苔附近待测菌菌落生长较大，而远侧菌落生长较小甚至没有菌落生长)，同时观察是否具有溶血现象。取具有“卫星生长现象”且不溶血的单菌落纯培养后接种于脲酶、氧化酶、接触酶、硝酸盐还原、葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、核糖、麦芽糖、乳糖、木糖和甘露糖等微型生化鉴定管(杭州天和微生物试剂有限责任公司生产)，按厂家说明书的方法操作，结果副猪嗜血杆菌MD0322株的各项生化指标均符合(结果见表2)。

(3)免疫琼脂扩散试验：

将待检副猪嗜血杆菌分离株接种于TSA固体培养基，37℃培养24小时，挑取单菌落重新接种TSA固体培养基纯化扩大，37℃培养12～16小时后再于TSA固体培养基上均匀划线进行大量增殖，37℃培养24小时，用PBS洗下菌苔，7000转/分钟，离心2分钟，弃上清，估测细菌沉淀的体积，加入菌体体积9倍的pH7.4PBS，涡旋混合均匀后于121℃高压蒸汽处理2小时，7000转/分钟，离心10分钟，取上清即为用于琼脂扩散试验的分型抗原。

琼脂扩散试验中的琼脂浓度为1.0％，中央孔分别加入副猪嗜血杆菌抗原，周围孔加入2倍系列稀释的血清。置37℃温箱湿盒中作用，24小时后观察结果，连续观察三日，如在抗原孔相邻的抗体孔之间出现沉淀线，则判定其效价。琼脂扩散试验表明，副猪嗜血杆菌MD0322株仅与副猪嗜血杆菌4型标准阳性血清发生反应，不与其他血清型反应。

表2副猪嗜血杆菌4型MD0322株生化鉴定试验

实施例4：副猪嗜血杆菌5-SH0165株的分离和鉴定

副猪嗜血杆菌5-SH0165株的分离和鉴定的方法操作见实施例2。

琼脂扩散试验表明，副猪嗜血杆菌SH0165株仅与副猪嗜血杆菌5型标准阳性血清发生反应，不与其他血清型反应。

SEQUENCE LISTING

 

<110>  武汉科前动物生物制品有限责任公司

<120>  猪链球菌、副猪嗜血杆菌病二联灭活疫苗及制备方法

<130>  猪链球菌、副猪嗜血杆菌病二联灭活疫苗及制备方法

<140>  2011102341929

<141>  2011-08-16

<160>  6    

<170>  PatentIn version 3.1

 

<210>  1

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工合成

<400>  1

ccatggacag ataaagatgg                                                 20

 

<210>  2

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工合成

<400>  2

gcagcgtatt ctgtcaaacg                                                 20

 

<210>  3

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工合成

<400>  3

tgatagtgat ttgtcgggag gg                                              22

 

<210>  4

<211>  23

<212>  DNA

<213>  人工合成

<400>  4

gagtatctaa agaatgccta ttg                                             23

 

<210>  5

<211>  18

<212>  DNA

<213>  人工合成

<400>  5

ggcttcgtca ccctctgt                                                   18

 

<210>  6

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工合成

<400>  6

gtgatgagga agggtggtgt                                                 20

 

Claims (4)

1.一种猪链球菌，其特征在于：猪链球菌（Streptococcus suis）2-LT，CCTCC NO：M2011282。

2.一种猪链球菌、副猪嗜血杆菌病二联灭活疫苗，其特征在于：该疫苗由猪链球菌（Streptococcus suis）2-LT，CCTCC NO：M2011282；副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis）4-MD0322，CCTCC NO：M2011283；和副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis）5-SH0165，CCTCC NO：M2011284组成。

3.权利要求2所述的二联灭活疫苗在制备预防猪链球菌病药物中的应用。

4.权利要求2所述的二联灭活疫苗在制备预防副猪嗜血杆菌病药物中的应用。

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