CN103566365B - 副猪嗜血杆菌病和猪多杀性巴氏杆菌病二联疫苗及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种副猪嗜血杆菌病和猪多杀性巴氏杆菌病二联疫苗，它包含至少一种副猪嗜血杆菌抗原和至少一种猪巴氏杆菌抗原；优选的是，所述副猪嗜血杆菌抗原至少包括4型和5型两种血清型，所述猪多杀性巴氏杆菌抗原至少包括A型、B型和D型三种荚膜血清型。使用本发明提供的二联疫苗，副猪嗜血杆菌和猪巴氏杆菌这两种抗原相互并不会相互干扰或影响，含副猪嗜血杆菌和猪巴氏杆菌抗原的疫苗组合物不仅对两种杆菌均能够产生保护性免疫应答，且副猪嗜血杆菌和猪巴氏杆菌的抗原具有相互增强的免疫效果；本发明的二联疫苗的免疫保护期长、可达一年之久。本发明还相应提供该二联疫苗的制备方法。

Description

副猪嗜血杆菌病和猪多杀性巴氏杆菌病二联疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种副猪嗜血杆菌病和猪多杀性巴氏杆菌病二联疫苗及其制备方法。

背景技术

副猪嗜血杆菌病和巴氏杆菌病是目前我国猪群中主要的两种细菌传染病。

副猪嗜血杆菌(Haemophilusparasuis,Hps)病又叫猪Glasser病，该病影响2周龄到4月龄的青年猪，主要在断奶前后和保育阶段发病，通常见于5~8周龄的猪，发病率一般在10~15%，严重时死亡率可达到50%。主要临床症状表现为咳嗽，呼吸困难，消瘦，跛行和被毛粗乱；主要剖检病变表现为胸膜炎，心包炎，腹膜炎，关节炎和脑膜炎等。此外，副猪嗜血杆菌还可引起败血症，在不出现典型的浆膜炎时就呈现发绀，皮下水肿和肺水肿，乃至死亡。副猪嗜血杆菌急性感染后可能留下后遗症，即母猪流产，公猪慢性跛行。在大量分离副猪嗜血杆菌的基础上，发现该菌的血清型复杂多样，按Kieletein-Rapp-Gabriedson(KRG)琼脂扩散血清分型方法，至少可将副猪嗜血杆菌分为15个血清型；根据我国血清流行病学调查和分离菌株的鉴定，以4、5型最为流行。近年来，由于抗生素滥用导致耐药株的出现，以及突发新的呼吸道综合征，使得该病日趋流行，危害日渐严重。

猪多杀性巴氏杆菌病(swine pasteurellosis)是由多杀性巴氏杆菌引起的一种传染病，又名猪肺疫、猪出血性败血症，俗称“锁喉风”。该病的特征最急性型呈败血症症状，咽喉部急性肿胀，高度呼吸困难；急性型呈纤维素性胸膜肺炎症状；慢性型症状不明显，多为慢性肺炎、胃肠炎以及逐渐消瘦，有时伴发关节炎，在国外又将该型称为肺炎巴氏杆菌病。该病广泛分布于世界各地，是猪的一种常见传染病；发病率达40%，死亡率在5%左右。多杀性巴氏杆菌按荚膜可分为A、B、D、E四种荚膜血清型。在美国及欧洲一些国家，猪多杀性巴氏杆菌病多以荚膜A型菌流行为主，其次是荚膜D型菌，B型菌所占比例较少。而在我国，过去多以流行B型菌为主，由于长期用B型菌苗免疫，取得较好的效果，B型菌株引起的多杀性巴氏杆菌病已较少发生。随着我国养猪业的规模化发展，A型和D型菌株在我国也呈流行趋势，并在一些地区已造成一定危害，随着我国集约化养猪业的迅猛发展，猪群巴氏杆菌病的报道逐渐增多。

采用疫苗进行免疫预防是国内外控制副猪嗜血杆菌病和猪巴氏杆菌病的根本手段，而市场销售的商品疫苗只有副猪嗜血杆菌病灭活疫苗单苗，猪多杀性巴氏杆菌单苗和活苗；如专利申请CN101721696A提供一种猪副嗜血杆菌血清4型、5型和13型三价灭活油乳剂疫苗；它应用我国猪副嗜血杆菌三个主要的流行血清型的分离株作为抗原，通过用TSB肉汤培养扩繁24h后，经过0.3%甲醛灭活11-13h，三个血清型的抗原以1∶1∶1的比例混合，然后加入与抗原总体积相等的油相，再经乳化制备而成。用于预防由当前流行的猪副嗜血杆菌主要血清型菌株引起的猪的纤维素性多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎。这些疫苗的应用起到了一定的预防作用，但疫苗的免疫效果不太理想和保护期较短，另外，大多现有方案中使用的弱毒苗有不易保存和存在散毒的风险等问题。病原流行株的改变和混合感染已使现有疫苗很难达到预期的免疫效果；而且市售商品疫苗需多次免疫，成本较高，对猪只的应激较大；另外同时针对控制副猪嗜血杆菌病和猪巴氏杆菌病的疫苗，国内外的研究还是空白。因此，需要开发一种副猪嗜血杆菌病和猪巴氏杆菌病二联疫苗以解决上述问题。

发明内容

本发明目的在于提供一种可预防副猪嗜血杆菌病和多杀性巴氏杆菌病的二联疫苗，其中优选包含抗原成分为灭活的副猪嗜血杆菌4型和5型，多杀性巴氏杆菌A型、B型和D型，佐剂为兽医学可接受的佐剂。并提供制备该二联灭活疫苗的方法。本发明解决了副猪嗜血杆菌单苗和多杀性巴氏杆菌单苗免疫程序不同的问题，并且发现二者在免疫效果上具有相互促进的作用，本发明疫苗具有安全性能高、免疫原性好、免疫期长等优点；并能降低成本，降低免疫劳动量，减少动物应激，可以满足不同用户的要求。

本发明提供一种副猪嗜血杆菌病和猪多杀性巴氏杆菌病二联疫苗，它包含至少一种副猪嗜血杆菌抗原和至少一种猪巴氏杆菌抗原；优选的是，所述副猪嗜血杆菌抗原至少包括4型和5型两种血清型，所述猪多杀性巴氏杆菌抗原至少包括A型、B型和D型三种荚膜血清型。

本发明通过大量的筛选研究，发现副猪嗜血杆菌和猪巴氏杆菌的抗原制备的疫苗组合物，两种抗原并不会相互干扰或影响；相反地，含副猪嗜血杆菌和猪巴氏杆菌抗原的疫苗组合物对两种杆菌均能够产生保护性免疫应答的同时，还意外发现副猪嗜血杆菌和猪巴氏杆菌的抗原具有相互增强的免疫效果。因此本发明在于提供预防或治疗副猪嗜血杆菌和猪巴氏杆菌感染的疫苗组合物。

为了实现上述目的，本发明预防或治疗副猪嗜血杆菌和猪巴氏杆菌感染的抗原组合物，其包含至少一种副猪嗜血杆菌抗原和至少一种猪巴氏杆菌抗原。

本发明中，副猪嗜血杆菌抗原是指含有至少一种副猪嗜血杆菌抗原形式的任何组合物；所述副猪嗜血杆菌抗原接种猪可诱导、刺激或增强抵抗副猪嗜血杆菌感染的免疫应答。所述副猪嗜血杆菌为包括本领域技术人员熟知的临床分离的野毒株，如包含目前已鉴定的1~15个血清型。优选地，所述副猪嗜血杆菌抗原是完整的副猪嗜血杆菌；优选所述抗原为灭活形式；更优选，所述副猪嗜血杆菌抗原是灭活的血清型为4型和5型的混合抗原；最优选为灭活的副猪嗜血杆菌血清4型JS株，和灭活的副猪嗜血杆菌血清5型ZJ株。

本发明的副猪嗜血杆菌抗原还可以包含以下组合物的任一种抗原：如勃林格殷格翰公司的Ingelvac HP-1；海博莱公司（Hipra）的Hiprasuis-Glasser；武汉科前动物生物制品有限责任公司的副猪嗜血杆菌灭活疫苗（4型MD0322株+5型SH0165株）。

正如本领域技术人员所知，不同的微生物野外分离株在基因序列上有微小的变异，然而，当变异不影响其蛋白质合成、结构或者主要作用功能区时，该微生物之他种野外分离株即使基因序列无法百分之百相同，其基本的生理功能并不会有所改变。因此，目前国际上常使用16S Ribosomal RNA（16S rRNA）来进行细菌型的分辨，因此在相似性的比较上可以用16S rRNA来进行比对而得到其同源性。所以，在16S rRNA具有同源性的前提下，本发明所使用的副猪嗜血杆菌抗原并不限定于本发明所使用的野外分离株，16s rRNA基因是细菌染色体上编码rRNA相对应的DNA序列，存在于所有细菌的染色体基因组中。16S rRNA具有高度的保守性和特异性以及该基因序列足够长（包含约50个功能域）。

因此，本发明包括与副猪嗜血杆菌两株菌株（JS株、ZJ株）16S rRNA的同源性在80%上以上的菌株，更优选与JS株或ZJ株16S rRNA同源性在至少90%以上，优选地至少95%以上的副猪嗜血杆菌菌株；即不改变副猪嗜血杆菌两株菌株（JS株、ZJ株）16S rRNA的前提下，本领域技术人员可以通过简单的筛选或诱变本发明的副猪嗜血杆菌，获得与本发明副猪嗜血杆菌16S rRNA高度同源的菌株，并获得相应地具有相同或相似免疫原性的抗原组合物。

优选地，本发明的疫苗组合物中所述血清4型副猪嗜血杆菌JS株灭活前含量和所述血清5型副猪嗜血杆菌ZJ株灭活前含量均为1×10⁹CFU/头份。

猪巴氏杆菌抗原是指含有至少一种猪巴氏杆菌抗原形式的任何组合物，所述猪巴氏杆菌抗原接种猪可诱导、刺激或增强抵抗猪巴氏杆菌感染的免疫应答。猪巴氏杆菌为包括本领域技术人员熟知的临床分离的野毒株，如包含目前按荚膜区分已鉴定的A、B、D、E四种荚膜血清型。优选地，所述猪巴氏杆菌抗原是完整的猪巴氏杆菌；优选所述抗原为灭活形式，更优选，所述猪巴氏杆菌抗原是灭活的血清型为A型、B型和D型的混合抗原；最优选为灭活的猪巴氏杆菌血清A型HN5株，和灭活的猪巴氏杆菌血清B型C44-1株，和灭活的猪巴氏杆菌血清D型HB4株。

本发明包括与猪巴氏杆菌三株菌株（HN5株、C44-1株和HB4株）16S rRNA的同源性在80%上以上的菌株，更优选与HN5株或C44-1株或HB4株16S rRNA同源性在至少90%以上，优选地至少95%以上的猪巴氏杆菌菌株，即不改变猪巴氏杆菌三株菌株（HN5株、C44-1株、HB4株）16S rRNA的前提下，本领域技术人员可以通过简单的筛选或诱变本发明的猪巴氏杆菌，获得与本发明猪巴氏杆菌16S rRNA高度同源的菌株，并获得相应地具有相同或相似免疫原性的抗原组合物。

优选地，本发明的疫苗组合物中所述血清A型猪巴氏杆菌为HN5株、B型猪巴氏杆菌C44-1株、和D型猪巴氏杆菌HB4株灭活前含量均为1.0×10⁹CFU/头份。

本发明的优选方式涉及疫苗组合物的佐剂，优选为氢氧化铝胶、矿物油、卡波姆、Montanide^TM Gel、蜂胶、ISA206、ISA760VG、氢氧化铝、磷酸铝、皂苷、植物油、油酸乙酯、二（辛酸／癸酸）丙二醇酯、三（辛酸／癸酸）甘油酯、二油酸丙二醇酯、异硬脂酸酯、山梨聚糖、二缩甘露醇、甘油、聚甘油、丙二醇、油酸、异硬脂酸、蓖麻油酸、羟基硬脂酸酯、聚氧丙烯、聚氧乙烯嵌段共聚物、丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物、顺丁烯二酸酐与烯基衍生物共聚物、糖或多元醇的聚烯基醚交联的丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物的一种或几种的组合物。

本发明的疫苗组合物的制备方法，包括以下步骤：分别将保存的副猪嗜血杆菌菌种和多杀性巴氏杆菌菌种于固体平面活化，挑取单个菌落进行种子培养，之后扩大培养、即菌液培养16~24h，收获菌液，灭活；将上述至少两种灭活的抗原（副猪嗜血杆菌抗原和多杀性巴氏杆菌抗原）混合，辅以佐剂和可选择使用的无菌水制备成疫苗。

优选地，本发明所述制备方法中，灭活方法为甲醛灭活法；更优地，本发明的甲醛溶液的终浓度为0.1~0.3%（v/v），灭活时间为24~48h。

优选地，本发明所述制备方法中，多种抗原的混合比例为等量体积混合。

本发明优选采用国内流行副猪嗜血杆菌血清4型JS株、5型ZJ株和猪多杀性巴氏杆菌A型HN5株、多杀性巴氏杆菌B型C44-1株和多杀性巴氏杆菌D型HB4株，毒株免疫效果良好，能够有效预防由副猪嗜血杆菌引起的副猪嗜血杆菌病和猪多杀性巴氏杆菌引起的猪巴氏杆菌菌病及二者的混合感染；克服了现有商品化疫苗只能预防副猪嗜血杆菌或者猪巴氏杆菌感染的不足，且二者在免疫效果上具有相互促进的作用。本发明优选采用了水性疫苗佐剂和适宜的配苗技术制备出副猪嗜血杆菌病和猪巴氏杆菌病二联灭活疫苗；水型佐剂安全、无不良副反应，免疫效果良好。本发明制备得到的二联疫苗还具有攻毒保护率达到80~100%，免疫保护期长等优点。

具体实施方式

在具体实施方式的实验中使用的菌种为：

副猪嗜血杆菌血清4型JS株（Haemophilus Parasuis Serotype 4,Strain JS），由普莱柯生物工程股份有限公司分离、鉴定，已在中国典型培养物保藏中心进行保藏，保藏日期：2011年5月18日，保藏号为：CCTCC NO：M2011172。

副猪嗜血杆菌血清5型ZJ株（Haemophilus Parasuis Serotype 5,Strain ZJ），由普莱柯生物工程股份有限公司分离、鉴定，已在中国典型培养物保藏中心进行保藏，保藏日期：2011年5月18日，保藏号为：CCTCC NO：M 2011173。

多杀性巴氏杆菌A型HN5株（Pasteurella multocida A Type HN5），由普莱柯生物工程股份有限公司分离、鉴定，已在中国典型培养物保藏中心进行保藏，保藏日期：2011年06月28日，保藏号为：CCTCC NO：M 2011222。

多杀性巴氏杆菌B型为荚膜B型（群）多杀性巴氏杆菌C44-1株，为中国兽医药品监察所鉴定、保管和供应。

多杀性巴氏杆菌D型HB4株（Pasteurella multocida D Type HB4），由普莱柯生物工程股份有限公司分离、鉴定，已在中国典型培养物保藏中心进行保藏，保藏日期：2011年06月28日，保藏号为：CCTCC NO：M 2011221。

实施例1：二联疫苗的配制

一、生产用种子的制备

一级种子的繁殖：副猪嗜血杆菌血清4型JS株、5型ZJ株冻干菌种，分别划线接种于TSA/NAD（TSA为BD公司生产，NAD为Roche公司生产）平板上，置37℃培养18~24小时，选取符合要求的菌落，接种于TSB/NAD（TSB为BD公司生产，NAD为Roche公司生产）液体培养基中，37℃培养12~16小时，作为一级种子；多杀性巴氏杆菌A型HN5株、多杀性巴氏杆菌B型C44-1株和多杀性巴氏杆菌D型HB4株冻干菌种，划线接种于TSA（10%鸡血清）（鸡血清为郑州佰安生物工程有限公司生产）平板上，置37℃培养18~24小时作为一级种子。

二级种子的繁殖：取副猪嗜血杆菌血清4型JS株、5型ZJ株一级种子的培养物，按1%的量加入TSB/NAD液体培养基中，37℃培养12~16小时，经检验纯粹后作为二级种子；多杀性巴氏杆菌A型HN5株、多杀性巴氏杆菌B型C44-1株和多杀性巴氏杆菌D型HB4株选取符合要求的菌落（一级种子），接种于含有BHI肉汤培养基中，37℃震荡培养12~16小时，经纯粹检验合格后作为二级种子。

二、菌液的培养（扩大培养）

在TSB培养基中，加入0.01~0.05%NAD、5~10%的小牛血清（浙江天杭生物科技有限公司）、0.1~5%的葡萄糖，将副猪嗜血杆菌血清4型JS株、5型ZJ株菌液（二级种子）按1%的量加进培养基中分别培养，混匀后置37℃培养16~18小时，当菌液的浓度OD₆₀₀达到2.5以上、DO值开始上升、pH值降低到6.5以下时停止培养。

在脑心浸液（BHI，BD公司生产）培养基中，将多杀性巴氏杆菌A型HN5株、多杀性巴氏杆菌B型C44-1株和多杀性巴氏杆菌D型HB4株菌液（二级种子）按1%的量加进培养基中培养，混匀后置37℃培养16~18小时，收获菌液。

纯粹检验：培养结束后，分别从制苗的五种菌液中取样，根据《中华人民共和国兽药典（二〇一〇年版）》附录进行纯粹检验，应纯粹。

活菌计数：分别从制苗菌液中取样，副猪嗜血杆菌用TSA/NAD平板培养进行活菌计数；多杀性巴氏杆菌用TSA（10%鸡血清，郑州佰安生物工程有限公司）进行活菌计数，以确定培养的菌数。

灭活：向上述五种培养好的菌液中，按总量的0.2%（V/V）加入37%的甲醛溶液（烟台市双双化工有限公司），放置于37℃灭活24h，期间搅拌3~5次。

灭活检验：方法一、取已经灭活的两种副猪嗜血杆菌菌液各5mL接种于100mL含0.01~0.05%NAD、5~10%的血清、0.1~5%的葡萄糖的副猪嗜血杆菌TSB培养基中，37℃培养24小时，再移植于上述100mL培养基中37℃培养24小时；方法二、取灭活的两种副猪嗜血杆菌菌液0.5mL划线接种于TSA/NAD平板培养基，37℃培养24小时；上述两种方法培养后，均应无菌生长。另外，方法一、取5mL已经灭活的三种多杀性巴氏杆菌菌液分别接种于100mLBHI中，37℃培养24小时，再移植于上述100mL培养基中37℃培养24小时；方法二、分别取已经灭活的三种多杀性巴氏杆菌各0.5mL划线接种于TSA（10%鸡血清）平板，37℃培养24小时；上述两种方法培养后，均应无菌生长。

安检：取上述已灭活的菌液分别静脉注射18~22g的Balb/C小鼠5只，每只0.2mL，三天内5/5健活，方为灭活彻底。

菌液的浓缩：将灭活后的菌液离心浓缩，弃上清，用PBS悬浮稀释菌体，使细菌含量相当于灭活前活菌数为1×10¹⁰CFU/mL。

三、疫苗配制

将上述已灭活、浓缩的副猪嗜血杆菌4型JS株菌液、5型ZJ株菌液和多杀性巴氏杆菌A型、多杀性巴氏杆菌B型和多杀性巴氏杆菌D型菌液按1:1:1:1:1比例混合，并加入疫苗总量0.01%的硫柳汞（北京市庆盛达化工技术有限公司），然后和Montanide IMS1313VG佐剂（法国赛比克公司）混合进行乳化，佐剂含量为10~50%；成品副猪嗜血杆菌病、猪巴氏杆菌病二联灭活疫苗抗原含量为灭活前副猪嗜血杆菌血清4型、5型、多杀性巴氏杆菌A型、多杀性巴氏杆菌B型和多杀性巴氏杆菌D型菌数均为1.0×10⁹CFU/头份。除上述五种抗原和佐剂外，还补充PBS使得本发明中疫苗成品剂量（每头份用量）为2ml。

实施例2：二联疫苗的无菌检验和安全试验

一、无菌检验

按《中华人民共和国兽用生物制品规程》2000版附录50页的方法对本发明制备得到的疫苗进行无菌检验；结果是，所得疫苗均未见菌落生长。

二、安全试验

小白鼠安全试验：选取3周龄BALB/c小鼠10只，分成两组，每组5只，一组各皮下注射本灭活苗0.5ml，另一组则于大腿肌肉注射0.1ml，注射后观察10日。结果是，小鼠精神状态良好，无不良反应，无死亡情况。

仔猪安全试验：选取30日龄以内的健康易感仔猪10头，随机取5只按用法的双倍剂量（即4ml疫苗成品）颈部肌肉注射，其余5头为对照，注射后观察三周。结果是，未见有不良反应，仔猪进食正常，神状态良好，无死亡情况；三周后剖杀，所有脏器未见异常变化。

综合以上安全试验证明本发明制备得到的二联疫苗安全性良好。

实施例3：二联疫苗的效力检验

选择健康易感的3周龄断奶仔猪50头，分为两组，免疫组25头，对照组25头。3周龄仔猪进行第一次免疫，间隔2周，在仔猪第5周龄进行加强免疫，间隔2周，在7周龄用各个强毒株进行攻毒；每次免疫的疫苗用量为2ml二联疫苗成品；在攻毒后，观察14天统计结果。

副猪嗜血杆菌JS株：选取免疫猪5头，连同条件相同的未免疫株5头，腹腔注射副猪嗜血杆菌JS株，攻毒剂量为5.0×10⁹CFU/头，攻毒后观察14天，免疫仔猪4/5以上保护，对照仔猪4/5以上发病。

副猪嗜血杆菌ZJ株：选取免疫猪5头，连同条件相同的未免疫株5头，腹腔注射副猪嗜血杆菌ZJ株，攻毒剂量为6.0×10⁹CFU/头，攻毒后观察14天，免疫仔猪4/5以上保护，对照仔猪4/5以上发病。

多杀性巴氏杆菌A型HN5株：选取免疫猪5头，连同条件相同的未免疫株5头，皮下注射1个致死剂量的多杀性巴氏杆菌A型HN5株，攻毒后观察14天，免疫仔猪4/5以上保护，对照仔猪5/5死亡。

多杀性巴氏杆菌B型C44-1株：选取免疫猪5头，连同条件相同的未免疫株5头，皮下注射1个致死剂量多杀性巴氏杆菌B型C44-1株，攻毒后观察14天，免疫仔猪4/5以上保护，对照仔猪5/5死亡。

多杀性巴氏杆菌D型HB4株：选取免疫猪5头，连同条件相同的未免疫株5头，皮下注射1个致死剂量多杀性巴氏杆菌D型HB4株，攻毒后观察14天，免疫仔猪4/5以上保护，对照仔猪5/5死亡。

表1列出了上述五种毒株在单倍攻毒剂量时，对免疫组（按上述方法注射了副猪嗜血杆菌病和猪多杀性巴氏杆菌病二联灭活疫苗）的一共25头猪和未免疫组的25头猪攻毒后的具体结果。

表1

毒株	免疫组	未免疫组
			副猪嗜血杆菌JS株	5/5保护	5/5发病
副猪嗜血杆菌ZJ株	5/5保护	4/5发病
			多杀性巴氏杆菌A型HN5株	4/5保护	5/5死亡
多杀性巴氏杆菌B型C44-1株	5/5保护	5/5死亡
			多杀性巴氏杆菌D型HB4株	5/5保护	5/5死亡

表1的结果表明本发明中副猪嗜血杆菌病和猪多杀性巴氏杆菌病二联灭活疫苗效力检验合格，该疫苗能够承受各强毒株的攻毒检验。以上结果还表明副猪嗜血杆菌和巴氏杆菌二联疫苗应用于本发明的上述免疫程序对两种杆菌的免疫效力都达标，解决了针对这两种杆菌的免疫程序和免疫量不同的问题。

实施例4：二联疫苗的免疫期

选择健康易感的3周龄断奶仔猪100头，分为两组，免疫组50头，对照50头。3周龄仔猪进行第一次免疫，间隔2周，在仔猪第5周龄进行加强免疫，分别在六个月和一年后按实施例3中效力检验方法进行攻毒校检；每次免疫的疫苗用量为2ml二联疫苗成品。

表2列出了上述五种毒株在单倍攻毒剂量时，对免疫组（按上述方法注射了副猪嗜血杆菌病和猪多杀性巴氏杆菌病二联灭活疫苗）的一共25头猪和未免疫组的25头猪攻毒的结果，其中攻毒发生在“5周龄进行加强免疫”后的六个月。

表3列出了上述五种毒株在单倍攻毒剂量时，对免疫组（按上述方法注射了副猪嗜血杆菌病和猪多杀性巴氏杆菌病二联灭活疫苗）的一共25头猪和未免疫组的25头猪攻毒的结果，其中攻毒发生在“5周龄进行加强免疫”后的一年。

表2

毒株	免疫组	未免疫组
			副猪嗜血杆菌JS株	4/5保护	5/5发病
副猪嗜血杆菌ZJ株	5/5保护	4/5发病
			多杀性巴氏杆菌A型HN5株	4/5保护	5/5死亡
多杀性巴氏杆菌B型C44-1株	4/5保护	5/5死亡
			多杀性巴氏杆菌D型HB4株	5/5保护	5/5死亡

表3

毒株	免疫组	未免疫组
			副猪嗜血杆菌JS株	4/5保护	5/5发病
副猪嗜血杆菌ZJ株	5/5保护	4/5发病
			多杀性巴氏杆菌A型HN5株	4/5保护	5/5死亡
多杀性巴氏杆菌B型C44-1株	4/5保护	5/5死亡
			多杀性巴氏杆菌D型HB4株	4/5保护	5/5死亡

表2和表3的结果表明本发明中的副猪嗜血杆菌病和猪多杀性巴氏杆菌病二联灭活疫苗的免疫保护期可达一年之久。

实施例5：副猪嗜血杆菌单苗、猪巴氏杆菌病单苗和二联疫苗免疫效果比较

选择健康易感的3周龄断奶仔猪100头，分为两组，免疫组50头，对照50头。

其中免疫组中25头免疫本发明的副猪嗜血杆菌病和猪巴氏杆菌病二联灭活疫苗，3周龄仔猪进行第一次免疫，间隔2周，在仔猪第5周龄进行加强免疫，各肌肉注射疫苗2ml。间隔2周，在7周龄用各个强毒株进行攻毒。

免疫组另外10头免疫副猪嗜血杆菌二价灭活苗（抗原含量为灭活前副猪嗜血杆菌血清4型、5型活菌数均不少于5.0×10⁸CFU/mL。）3周龄仔猪进行第一次免疫，间隔2周，在仔猪第5周龄进行加强免疫，各肌肉注射疫苗2ml。间隔2周，在7周龄用各个强毒株进行攻毒。

免疫组另外15头免疫多杀性巴氏杆菌三价灭活苗（抗原含量为灭活前多杀性巴氏杆菌A型、多杀性巴氏杆菌B型和多杀性巴氏杆菌D型活菌数均不少于5.0×10⁸CFU/mL。）3周龄仔猪进行免疫，各皮下注射疫苗5ml，间隔2周，在5周龄用各个强毒株进行攻毒。

副猪嗜血杆菌JS株：选取免疫副猪嗜血杆菌病和猪巴氏杆菌病二联灭活疫苗猪5头，免疫副猪嗜血杆菌二价灭活苗猪5头，连同条件相同的未免疫猪10头，腹腔注射副猪嗜血杆菌JS株，攻毒量为1.0×10¹⁰CFU/头（攻毒量为实施例3中的毒量的两倍），攻毒后观察14天。

副猪嗜血杆菌ZJ株：选取免疫副猪嗜血杆菌病和猪巴氏杆菌病二联灭活疫苗猪5头，免疫副猪嗜血杆菌二价灭活苗猪5头，连同条件相同的未免疫猪10头，腹腔注射副猪嗜血杆菌ZJ株，攻毒量为1.2×10¹⁰CFU/头（攻毒量为实施例3中的毒量的两倍），攻毒后观察14天。

多杀性巴氏杆菌A型HN5株：选取免疫副猪嗜血杆菌病和猪巴氏杆菌病二联灭活疫苗猪5头，免疫多杀性巴氏杆菌三价灭活苗猪5头，连同条件相同的未免疫猪10头，皮下注射2个致死剂量的（攻毒量为实施例3中的毒量的两倍）多杀性巴氏杆菌A型HN5株，攻毒后观察14天。

多杀性巴氏杆菌B型C44-1株：选取免疫副猪嗜血杆菌病和猪巴氏杆菌病二联灭活疫苗猪5头，免疫多杀性巴氏杆菌三价灭活苗猪5头，连同条件相同的未免疫猪10头，皮下注射2个致死剂量的（攻毒量为实施例3中的毒量的两倍）多杀性巴氏杆菌B型C44-1株，攻毒后观察14天。

多杀性巴氏杆菌D型HB4株：选取免疫副猪嗜血杆菌病和猪巴氏杆菌病二联灭活疫苗猪5头，免疫多杀性巴氏杆菌三价灭活苗猪5头，连同条件相同的未免疫猪10头，皮下注射2个致死剂量的（攻毒量为实施例3中的毒量的两倍）多杀性巴氏杆菌D型HB4株，攻毒后观察14天。

表4列出了上述五种毒株在双倍治病或致死攻毒剂量时，对免疫组（按上述方法注射了副猪嗜血杆菌病和猪多杀性巴氏杆菌病二联灭活疫苗）的一共25头猪和未免疫组的25头猪攻毒后的具体结果。

表5列出了两种副猪嗜血杆菌在双倍治病或致死攻毒剂量时，对免疫组（按上述方法注射了副猪嗜血杆菌二价灭活疫苗）的一共10头猪和未免疫组的10头猪攻毒后的具体结果。

表6列出了三种多杀性巴氏杆菌在双倍治病或致死攻毒剂量时，对免疫组（按上述方法注射了多杀性巴氏杆菌三价灭活疫苗）的一共15头猪和未免疫组的15头猪攻毒后的具体结果。

表4

毒株	免疫组	未免疫组
			副猪嗜血杆菌JS株	4/5保护	5/5发病
副猪嗜血杆菌ZJ株	4/5保护	5/5发病
			多杀性巴氏杆菌A型HN5株	5/5保护	5/5死亡
多杀性巴氏杆菌B型C44-1株	4/5保护	5/5死亡
			多杀性巴氏杆菌D型HB4株	4/5保护	5/5死亡

表5

毒株	免疫组	未免疫组
			副猪嗜血杆菌JS株	3/5保护	5/5发病

副猪嗜血杆菌ZJ株

2/5保护

5/5发病

表6

毒株	免疫组	未免疫组
			多杀性巴氏杆菌A型HN5株	3/5保护	5/5死亡
多杀性巴氏杆菌B型C44-1株	2/5保护	5/5死亡
			多杀性巴氏杆菌D型HB4株	2/5保护	5/5死亡

因双倍的致病或致死攻毒剂量下比单倍剂量能更快更好地体现单独疫苗和二联疫苗的区别，因而本实施例中均采用双倍致病或致死剂量进行攻毒。表4~6的结果表明双倍致病或致死攻毒剂量下攻毒副猪嗜血杆菌病和猪巴氏杆菌病二联灭活疫苗的保护效果要远远好于副猪嗜血杆菌二价灭活疫苗和多杀性巴氏杆菌三价灭活疫苗，即二联疫苗在免疫效果上具有相互促进的作用。

Claims (4)

1.一种副猪嗜血杆菌病和猪多杀性巴氏杆菌病二联疫苗，它包括4型和5型两种副猪嗜血杆菌抗原，并包括A型、B型和D型三种猪多杀性巴氏杆菌抗原；所述4型和5型两种副猪嗜血杆菌抗原分别为4型JS株和5型ZJ株；所述A型、B型和D型三种猪多杀性巴氏杆菌抗原分别为A型HN5株、B型C44-1株和D型HB4株；

副猪嗜血杆菌血清4型JS株的保藏号为：CCTCC NO：M 2011172；

副猪嗜血杆菌血清5型ZJ株的保藏号为：CCTCC NO：M 2011173；

多杀性巴氏杆菌A型HN5株的保藏号为：CCTCC NO：M 2011222；

多杀性巴氏杆菌D型HB4株的保藏号为：CCTCC NO：M 2011221。

2.根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述副猪嗜血杆菌抗原为完整的副猪嗜血杆菌，所述猪多杀性巴氏杆菌抗原为完整的猪巴氏杆菌。

3.根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述二联疫苗为灭活疫苗，所述二联疫苗中还包括兽医学上可接受的佐剂。

4.一种如权利要求3所述疫苗的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：分别将保存的副猪嗜血杆菌菌种和多杀性巴氏杆菌菌种于固体平面活化，挑取单个菌落进行种子培养，之后扩大培养、即菌液培养16～24h，收获菌液，灭活；将灭活的抗原混合，辅以佐剂和可选择使用的PBS制备成疫苗。