CN101578108A

CN101578108A - 家禽中的沙门氏菌疫苗

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Publication number: CN101578108A
Application number: CNA2007800495661A
Authority: CN
Inventors: F-X·勒格罗; S·勒米埃
Original assignee: Merial Ltd
Current assignee: Merial Ltd
Priority date: 2006-12-11
Filing date: 2007-12-10
Publication date: 2009-11-11
Also published as: MX2009006178A; DK2099479T3; EP2099479B1; WO2008073891A3; RU2009126604A; CA2672026A1; BRPI0720111B1; HK1134783A1; JP5229637B2; BRPI0720111A2; RU2596208C2; SI2099479T1; ZA200904060B; UA100370C2; JP2010512412A; US20080220022A1; ES2398598T3; NZ577610A; AU2007333169A1; PT2099479E

Abstract

本发明涉及在动物(特别是禽类动物)中针对沙门氏菌进行疫苗接种的领域。本发明还包括沙门氏菌免疫原性组合物或疫苗的试剂盒和用途。本发明进一步涉及这样的方法和组合物，其包括至少一次初激施用减毒的免疫原性组合物或疫苗，所述减毒的免疫原性组合物或疫苗包含药学上或兽医学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体以及至少一种减毒的沙门氏菌，并且在至少一次加强施用灭活的免疫原性组合物或疫苗之前施用给禽类动物，所述灭活的免疫原性组合物或疫苗包含药学上或兽医学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体以及至少一种灭活的沙门氏菌。

Description

家禽中的沙门氏菌疫苗

通过提及而合并入

本申请要求于2006年12月11日提交的美国临时专利申请系列号60/869,524的利益。

本文所引用或提及的所有文献(“本文引用的文献”)，和在本文引用的文献中所引用或提及的所有文献，以及在本文中或在通过提及而合并入本文的任何文献中论及的任何产品的任何制造商指导、描述、产品说明书和产品印刷册，特此通过提及而合并入本文，并且可以在本发明的实践中使用。

发明领域

本发明涉及在动物(特别是禽类动物)中针对沙门氏菌(Salmonella)进行疫苗接种的领域。本发明还包括沙门氏菌免疫原性组合物或疫苗的试剂盒和用途。

发明背景

沙门氏菌属物种(Salmonella spp.)是除了慢性无症状带菌状态外还引起局限性或全身性感染的兼性细胞内病原体。它们具有世界范围的经济和公共卫生重要性。在家禽中，禽伤寒和鸡白痢病在下列的世界那些部分中持续导致经济损失：其中养禽业持续增强的那些部分，和其中常见开放式禽舍(open sided housing)的那些部分。许多引起人类胃肠炎的血清型也在渐增。在改善卫生和管理方面的成本或不实际性连同渐增的抗生素抗性问题表明，在家禽中进行疫苗接种作为现有防控措施的辅助措施将变得更有吸引力(Zhang-Barber L.等人，Vaccine，1999，17(20-21)：2538-45)。

沙门氏菌是人类中通过食物传播的疾病的主要原因之一。根据委员会关于人畜共患病的报告(European Commission：Trends andsources of zoonotic infections in animals，feed，food and manin the European Union and Norway in 2003)，在2003年由欧盟的15个成员国和挪威报告了135,546例的沙门氏菌病人类病例。

养禽业(尤其是在欧洲和美国中)处于来自卫生当局和消费者的要求降低人类受家禽来源的沙门氏菌污染(特别是沙门氏菌病)的风险的强大压力下(在美国中的病原体减少和HACCP，在EU中的CouncilDirective 92/117/EEC)。

因为沙门氏菌感染许多动物群体(例如哺乳动物、禽类)，所以始终存在患沙门氏菌病的风险，而不论哪个国家、哪个季节或哪种食物处理实践。

已经用现有的抗微生物剂来治疗人类胃肠感染的人畜共患病沙门氏菌属物种原因。自20世纪90年代早期开始，已出现了对一系列抗微生物剂具有抗性的沙门氏菌菌株，这使得感染的治疗效果降低，并且增加了人类感染由沙门氏菌属物种引起的胃肠道感染的风险。

如在前些年中，肠沙门氏菌肠亚种肠炎血清变种(Salmonellaenterica subspecies enterica serovar Enteritidis)(肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis))占优势，其导致了在欧盟和挪威中所有报告病例的61.8％(2002年：67.1％)。在单个国家中的比率为87.9％(在奥地利中)至33.3％(在法国中)。肠沙门氏菌肠亚种鼠伤寒血清变种(Salmonella enterica subspecies enterica serovarTyphimurium)(鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella Typhimurium))其次，其导致了所有病例的16.5％。在单个国家中的比率为5.8％(在奥地利中)至28.7％(在爱尔兰中)。如在前些年中，在肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌之后，大多数病例由肠沙门氏菌肠亚种维尔肖氏血清变种(Salmonella enterica subspecies enterica serovarVirchow)(维尔肖氏沙门氏菌(Salmonella Virchow))、肠沙门氏菌肠亚种婴儿血清变种(Salmonella enterica subspecies entericaserovar Infantis)(婴儿沙门氏菌(Salmonella Infantis))和肠沙门氏菌肠亚种哈达尔血清变种(Salmonella entericasubspecies enterica serovar Hadar)(哈达尔沙门氏菌(SallmonellaHadar))引起。这些血清变种中的每一种涉及小于1％的所有报告病例。

污染的主要来源是通过蛋和家禽肉消费。此类风险的降低通过在蛋和肉生产链中自始至终的措施组合来达到，例如良好的饲养、卫生实践和疫苗接种。

关于食品卫生和人畜共患病防控的共同体法规包括寻求控制和预防食品的沙门氏菌污染的许多条款。用于减少活动物中的沙门氏菌流行的措施被认为是减少粮食污染和人类沙门氏菌病病例数目的最有效方法之一。

在2003年，公布了新的关于人畜共患病的欧洲法规；Regulation2160/2003规定了沿着食物链的病原体减少目标的设定(主要对于动物群体)，以及国家防控计划的建立以便满足这些目标。沙门氏菌属物种是首要的目标，特别是被视为具有公共卫生重要性的血清型。目标将在不同动物群体中渐进地设定：原鸡(Gallus gallus)的繁殖群、产蛋母鸡、肉用仔鸡、火鸡和供屠宰肉用猪。迄今为止，仅对于原鸡的繁殖群建立了目标(Regulation 1003/2005)；该目标被设定为1％，这意味着到2009年底，在EU范围内肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、婴儿沙门氏菌、哈达尔沙门氏菌和维尔肖氏沙门氏菌阳性的畜(禽)群的最大百分比将必须是1％。

关于种畜(禽)，Regulation 1091/2005禁止将抗微生物剂用作针对沙门氏菌的防控措施，而接受和推荐使用疫苗。对于来自委员会的涉及使用疫苗来防控家禽中的沙门氏菌的要求，“Scientific Panelon Biological Hazards”的结论和建议(The EFSA Journal(2004)114，1-74)在很大程度上赞同在农场范围内使用疫苗来防控沙门氏菌。特别地，所述专家小组的结论尤其是：

·关于在家禽农场中成功防控沙门氏菌感染的基础是良好的饲养和卫生实践(包括涵盖饲喂、鸟类、管理、清洁和消毒、防治啮齿类动物等的所有方面)以及从生产中检测出和去除阳性禽群。禽类的疫苗接种被认为是用于增加鸟类针对沙门氏菌暴露的抵抗力和减少排菌(shedding)的措施。

·存在这样的实验和一些野外证据：在经疫苗接种的鸟类中水平减少的沙门氏菌生物的粪便排泄和全身性侵袭将导致食用蛋和环境的污染减少。

·如果防控计划靶向下蛋鸡/肉用仔鸡的种禽或者产蛋母鸡，并且禽群流行率高，那么疫苗接种在减少排菌和蛋污染方面可以是有用的。如果禽群流行率低，那么疫苗接种可能不是那么有用，但仍可以用作维持低流行率的预防措施之一。

沙门氏菌属细菌存在超过2,000种的血清变种。

Kauffman和White分类(http://en.wikipedia.org/wiki/Kauffman-White-classification)允许将沙门氏菌属的血清学变种彼此区分开。这个分类方案通过测定该细菌产生了哪些表面抗原来区分分离物。首先，测定“O”抗原类型。“O”抗原是与细菌外膜的脂多糖相关联的多糖。一旦确定了“O”抗原群，就测定了“H”抗原。“H”抗原是与细菌鞭毛相关联的蛋白质。沙门氏菌以两个时期存在：能动期和非能动期。这些也称为特异期(specific phase)和非特异期(non-specific phase)。依赖于沙门氏菌所处的时期而产生不同的“H”抗原。伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)的致病菌株携带另外的抗原——“Vi”，之所以这样称呼是因为产生这种抗原的菌株具有增强的毒力，所述抗原与细菌荚膜相关联。

根据Kauffman和White分类，形成了“O”-群沙门氏菌血清变种。

针对在鸡中C群沙门氏菌的菌株建群，基于cya缺失型/crp缺失型哈达尔沙门氏菌和phoP缺失型哈达尔沙门氏菌开发了减毒疫苗(Roland K.等人，Avian Dis.，2004，48(3)：445-52)。尽管cya缺失型/crp缺失型衍生物诱导了较高水平的血清抗体，但它不提供针对哈达尔沙门氏菌菌株建群的保护性免疫应答。

Chacana等人(Chacana P.A.等人，Avian Dis.，2006，50(2)：280-3)证实了，沙门氏菌减毒疫苗可以引发针对相同的Kauffmann-White分类方案血清群的成员的交叉免疫性。探究了由TAD沙门氏菌vacE(减毒的肠炎沙门氏菌疫苗)所赋予的针对禽伤寒的保护作用。从出生第一天开始，用不同的疫苗接种程序表对三组产蛋母鸡进行疫苗接种，并之后在第28周或第52周时用2×10⁵CFU的强毒鸡沙门氏菌(Salmonella Gallinarum)菌株进行感染。评估了死亡率、粪便排菌和鸡沙门氏菌的器官侵袭。肠炎沙门氏菌疫苗能够针对鸡沙门氏菌进行交叉免疫，根据Kauffmann-White分类，它们是D群沙门氏菌的两种菌株。在第28周时，用3个口服剂量或者用与1个皮下剂量相组合的2个口服剂量进行疫苗接种的母鸡受到该疫苗保护。然而，在第52周时，当母鸡在最后一次免疫接种后36周被感染时，该疫苗无法给予保护。

由于沙门氏菌血清变种的巨大数目，因此需要针对沙门氏菌的疫苗，所述疫苗能够诱导针对超过一种沙门氏菌血清变种和/或针对超过一个Kauffmann-White分类群的沙门氏菌的保护性免疫应答。

发明概述

因此，本发明涉及疫苗接种策略，其基于减毒的沙门氏菌免疫原性组合物或疫苗的至少一次初激施用(primo-administration)和灭活的沙门氏菌免疫原性组合物或疫苗的至少一次加强施用(boost-administration)。该疫苗接种策略可用于预防经疫苗接种的受试者中同源和异源沙门氏菌的承载(portage)。

本发明的目的还在于提供使用免疫原性组合物或疫苗以便在禽类动物中预防同源和/或异源沙门氏菌的方法，其中向禽类动物施行减毒的沙门氏菌免疫原性组合物或疫苗的至少一次初激施用，在数周后(尤其是在唯一的或第一次初激施用后2周至18周)施行灭活的沙门氏菌免疫原性组合物或疫苗的至少一次加强施用。

本发明的目的还在于提供使用免疫原性组合物或疫苗以便在禽类动物中预防携带同源和/或异源沙门氏菌的方法，其中向禽类动物施行减毒的D群沙门氏菌免疫原性组合物或疫苗的至少一次初激施用，在数周后(尤其是在唯一的或第一次初激施用后2周至18周)施行灭活的B群沙门氏菌和灭活的D群沙门氏菌免疫原性组合物或疫苗的至少一次加强施用。B群和D群沙门氏菌的例子在本文中提供。

本发明的目的还在于提供用于对禽类动物进行疫苗接种的试剂盒，其包含至少两个小瓶和具有施用指导的包装说明书(packageinsert)，其中第一个小瓶包含减毒的沙门氏菌免疫原性组合物或疫苗，和第二个小瓶包含灭活的沙门氏菌免疫原性组合物或疫苗。任选地，可以包括另外的小瓶，所述小瓶包含用于多次初激施用的减毒的沙门氏菌免疫原性组合物或疫苗，和/或所述小瓶包含用于多次加强施用的灭活的沙门氏菌免疫原性组合物或疫苗。

应当指出，在本公开内容中，特别是在权利要求书中，诸如“包含”、“包括”、“含有”等的术语可以具有在美国专利法中归于其的含义；例如，它们可以表示“包含......在内”、“包括......在内”、“含有......在内”等；并且诸如“基本上由......组成”的术语具有在美国专利法中归于其的含义，例如，它们允许未明确叙述的要素，但排除在现有技术中发现的或者影响本发明的基础或新颖特征的要素。

这些和其他实施方案通过下面的详细描述而得到公开，或者根据下面的详细描述是显而易见的，并且被下面的详细描述所包括。

附图简述

作为举例而给出的下面的详细描述(其并不希望将本发明限制于所描述的具体实施方案)可以结合通过提及而合并入本文的附图来理解，其中：

图1图解说明了在攻击后4-7天，在鸡的脾脏中攻击沙门氏菌菌株的再分离百分比。

图2图解说明了在攻击后4-7天，在鸡中攻击沙门氏菌菌株的平均盲肠计数，以及标准偏差，

对于图1和图2，“对照”是未疫苗接种的对照组，其相应于G.00；“L+K”是经两次疫苗接种的组，第一次用减毒的沙门氏菌疫苗和第二次用灭活的沙门氏菌疫苗，其相应于G.01；“杀死的”是仅用灭活的沙门氏菌疫苗进行疫苗接种的组，其相应于G.02。

发明详述

本发明涉及在禽类动物中使用免疫原性组合物或疫苗以便增加针对至少一种异源沙门氏菌的免疫应答的方法，其中向禽类动物施行减毒的免疫原性组合物或疫苗的至少一次初激施用，所述减毒的免疫原性组合物或疫苗包含药学上或兽医学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体以及至少一种减毒的属于一种沙门氏菌血清变种的沙门氏菌；在相隔数周(尤其是2周至18周)后，施行灭活的免疫原性组合物或疫苗的至少一次加强施用，所述灭活的免疫原性组合物或疫苗包含药学上或兽医学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体以及至少一种灭活的属于一种沙门氏菌血清变种的沙门氏菌。所述减毒的沙门氏菌和所述灭活的沙门氏菌可以来自相同的血清变种或来自不同的血清变种。异源沙门氏菌是不同于在初激施用期间和在加强施用期间施用的免疫原性组合物或疫苗之中所使用的那些的细菌，例如另一种血清变种的沙门氏菌或另一个沙门氏菌群的沙门氏菌(根据Kauffmann-White分类)。

本发明的方法可以在禽类动物中使用，以便交叉保护禽类动物免患由至少一种异源沙门氏菌引起的疾病和/或预防在禽类动物中携带至少一种异源沙门氏菌。

本发明的方法还可以在禽类动物中使用，以便减少在受感染的禽类动物的脾脏和/或盲肠中的C群沙门氏菌细菌的数目，尤其是减少在受感染的禽类动物的脾脏和/或盲肠中的C1群沙门氏菌和C2群沙门氏菌细菌的数目，或减少在受感染的禽类动物的脾脏和盲肠中的B群沙门氏菌细菌和C群沙门氏菌细菌的数目。C群沙门氏菌的例子在本文中提供。

术语“免疫原性组合物”是指这样的任何组合物，其一旦被注射到禽类动物中，就能够诱导或刺激针对沙门氏菌的免疫应答。

术语“疫苗组合物”或“疫苗”是指这样的任何组合物，其一旦被注射到动物尤其是禽类动物中，就能够诱导或刺激针对由沙门氏菌引起的疾病的保护性免疫应答，和/或诱导或刺激保护性免疫应答以预防或减少动物尤其是禽类动物中沙门氏菌的携带。

初激-加强方案包括使用至少一种通常的多肽、抗原、表位或免疫原来进行至少一次初激施用和至少一次加强施用。在初激施用中所使用的疫苗可以在性质上不同于用作随后的加强疫苗的那种疫苗。初激施用可以包括一次或多次施用。类似地，加强施用可以包括一次或多次施用。

本发明的方法包括向动物(优选禽类动物)至少一次初激施用和至少一次加强施用有效量的根据本发明的免疫原性组合物或疫苗。动物可以是雄性或雌性的。这种施用可以尤其通过肌内(IM)、皮内(ID)或皮下(SC)注射或者经由鼻内或口服施用来进行，其中口服施用包括但不限于在饲料上或者在饮用水、凝胶或喷雾剂中进行施用。

药学上或兽医学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体可以是水、注射用水、盐水或缓冲液。可以向所述减毒的免疫原性组合物或疫苗中添加稳定剂，例如甘油、糖类溶液，如蔗糖溶液。

在根据本发明方法的初激施用中使用的减毒的免疫原性组合物或疫苗包含药学上或兽医学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体以及至少一种减毒的沙门氏菌。减毒的沙门氏菌可以选自D群沙门氏菌和B群沙门氏菌，优选选自由肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis)、巴拿马沙门氏菌(Salmonella Panama)、都柏林沙门氏菌(SalmonellaDublin)、鸡沙门氏菌(Salmonella Gallinarum)、鸡白痢沙门氏菌(Salmonella Pullorum)组成的D群，和选自由鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella Typhimurium)、布伦登芦普沙门氏菌(SalmonellaBraenderup)、阿哥纳沙门氏菌(Salmonella Agona)、布雷登尼沙门氏菌(Salmonella Bredeney)、海德尔堡沙门氏菌(SalmonellaHeidelberg)、印地安那沙门氏菌(Salmonella Indiana)、圣保罗沙门氏菌(Salmonella Saint-Paul)、勃兰登堡沙门氏菌(SalmonellaBrandenburg)组成的B群。在一个优选的实施方案中，在根据本发明方法的初激施用中使用的减毒的免疫原性组合物或疫苗包含药学上或兽医学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体以及至少一种减毒的D群沙门氏菌。在另一个优选的实施方案中，在根据本发明方法的初激施用中使用的减毒的免疫原性组合物或疫苗包含药学上或兽医学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体以及至少一种减毒的B群沙门氏菌。在另一个优选的实施方案中，在根据本发明方法的初激施用中使用的减毒的免疫原性组合物或疫苗包含药学上或兽医学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体以及至少一种减毒的D群沙门氏菌和至少一种减毒的B群沙门氏菌。在一个最优选的实施方案中，在根据本发明方法的初激施用中使用的减毒的免疫原性组合物或疫苗包含药学上或兽医学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体以及减毒的肠炎沙门氏菌。在另一个最优选的实施方案中，在根据本发明方法的初激施用中使用的减毒的免疫原性组合物或疫苗包含药学上或兽医学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体以及减毒的肠炎沙门氏菌和减毒的鼠伤寒沙门氏菌。

各种Kauffman-White沙门氏菌分类群的例子包括A、B、C1-3、D、E1-4、F、G、H和I群，它们的例子在下面提供。

例如，A群包括肠沙门氏菌肠亚种甲型副伤寒血清变种(Salmonella enterica subspecies enterica serovar Paratyphi A)(甲型副伤寒沙门氏菌(Salmonella Paratyphi A))、甲型副伤寒沙门氏菌杜雷佐变种(Salmonella Paratyphi A variant durazzo)。

例如，B群包括肠沙门氏菌肠亚种乙型副伤寒血清变种(Salmonella enterica subspecies enterica serovar Paratyphi B)(乙型副伤寒沙门氏菌(Salmonella Paratyphi B))、乙型副伤寒沙门氏菌欧登塞变种(Salmonella Paratyphi B variant odense)、肠沙门氏菌肠亚种爪哇血清变种(Salmonella enterica subspeciesenterica serovar Java)(爪哇沙门氏菌(Salmonella Java))、肠沙门氏菌肠亚种鼠伤寒血清变种(Salmonella entericasubspecies enterica serovar Typhimurium)(鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella Typhimurium))、肠沙门氏菌肠亚种布伦登芦普血清变种(Salmonella enterica subspecies enterica serovarBraenderup)(布伦登芦普沙门氏菌(Salmonella Braenderup))、肠沙门氏菌肠亚种阿哥纳血清变种(Salmonella entericasubspecies enterica serovar Agona)(阿哥纳沙门氏菌(SalmonellaAgona))、肠沙门氏菌肠亚种布雷登尼血清变种(Salmonella entericasubspecies enterica serovar Bredeney)(布雷登尼沙门氏菌(Salmonella Bredeney))、肠沙门氏菌肠亚种海德尔堡血清变种(Salmonella enterica subspecies enterica serovar Heidelberg)(海德尔堡沙门氏菌(Salmonella Heidelberg))、肠沙门氏菌肠亚种印地安那血清变种(Salmonella enterica subspecies entericaserovar Indiana)(印地安那沙门氏菌(Salmonella Indiana))、肠沙门氏菌肠亚种圣保罗血清变种(Salmonella entericasubspecies enterica serovar Saint-Paul)(圣保罗沙门氏菌(Salmonella Saint-Paul))、肠沙门氏菌肠亚种勃兰登堡血清变种(Salmonella enterica subspecies enterica serovar Brandenburg)(勃兰登堡沙门氏菌(Salmonella Brandenburg))、肠沙门氏菌肠亚种莱墨特血清变种(Salmonella enterica subspecies entericaserovar Limete)(莱墨特沙门氏菌(Salmonella Limete))、肠沙门氏菌肠亚种阿格玛血清变种(Salmonella enterica subspeciesenterica serovar Agama)(阿格玛沙门氏菌(Salmonella Agama))、肠沙门氏菌肠亚种德尔比血清变种(Salmonella entericasubspecies enterica serovar Derby)(德尔比沙门氏菌(SalmonellaDerby))、肠沙门氏菌肠亚种萨林纳斯血清变种(Salmonella entericasubspecies enterica serovar Salinatis)(萨林纳斯沙门氏菌(Salmonella Salinatis))、肠沙门氏菌肠亚种斯坦利血清变种(Salmonella enterica subspecies enterica serovar Stanley)(斯坦利沙门氏菌(Salmonella Stanley))。

例如，C1群包括肠沙门氏菌肠亚种丙型副伤寒血清变种(Salmonella enterica subspecies enterica serovar Paratyphi C)(丙型副伤寒沙门氏菌(Salmonella Paratyphi C))、肠沙门氏菌肠亚种婴儿血清变种(Salmonella enterica subspecies entericaserovar Infantis)(婴儿沙门氏菌(Salmonella Infantis))、肠沙门氏菌肠亚种姆班达卡血清变种(Salmonella entericasubspecies enterica seroar Mbandaka)(姆班达卡沙门氏菌(Salmonella Mbandaka))、肠沙门氏菌肠亚种利文斯通血清变种(Salmonella enterica subspecies enterica serovar Livingstone)(利文斯通沙门氏菌(Salmonella Livingstone))、肠沙门氏菌肠亚种维尔肖氏血清变种(Salmonella enterica subspecies entericaserovar Virchow)(维尔肖氏沙门氏菌(Salmonella Virchow))、肠沙门氏菌肠亚种俄亥俄血清变种(Salmonella entericasubspecies enterica serovar Ohio)(俄亥俄沙门氏菌(SalmonellaOhio))、肠沙门氏菌肠亚种蒙得维的亚血清变种(Salmonellaenterica subspecies enterica serovar Montevideo)(蒙得维的亚沙门氏菌(Salmonella Montevideo))、肠沙门氏菌肠亚种田纳西血清变种(Salmonella enterica subspecies enterica serovarTennessee)(田纳西沙门氏菌(Salmonella Tennessee))、肠沙门氏菌肠亚种罗森血清变种(Salmonella enterica subspeciesenterica serovar Rissen)(罗森沙门氏菌(Salmonella Rissen))、肠沙门氏菌肠亚种迪凯特血清变种(Salmonella entericasubspecies enterica serovar Decatur)(迪凯特沙门氏菌(Salmonella Decatur))、肠沙门氏菌肠亚种巴雷利血清变种(Salmonella enterica subspecies enterica serovar Bareilly)(巴雷利沙门氏菌(Salmonella Bareilly))、肠沙门氏菌肠亚种门斯顿血清变种(Salmonella enterica subspecies enterica serovarMenston)(门斯顿沙门氏菌(Salmonella Menston))、肠沙门氏菌肠亚种奥拉宁堡血清变种(Salmonella enterica subspeciesenterica serovar Oranienburg)(奥拉宁堡沙门氏菌(SalmonellaOranienburg))、肠沙门氏菌肠亚种汤普森血清变种(Salmonellaenterica subspecies enterica serovar Thompson)(汤普森沙门氏菌(Salmonella Thompson))。

例如，C2群包括肠沙门氏菌肠亚种哈达尔血清变种(Salmonellaenterica subspecies enterica serovar Hadar)(哈达尔沙门氏菌(Salmonella Hadar))、肠沙门氏菌肠亚种新港血清变种(Salmonellaenterica subspecies enterica serovar Newport)(新港沙门氏菌(Salmonella Newport))、肠沙门氏菌肠亚种科特布斯血清变种(Salmonella enterica subspecies enterica serovar Kottbus)(科特布斯沙门氏菌(Salmonella Kottbus))。

例如，C3群包括肠沙门氏菌肠亚种肯塔基血清变种(Salmonellaenterica subspecies enterica serovar Kentucky)(肯塔基沙门氏菌(Salmonella Kentucky))、肠沙门氏菌肠亚种阿尔巴尼血清变种(Salmonella enterica subspecies enterica serovar Albany)(阿尔巴尼沙门氏菌(Salmonella Albany))。

例如，D群包括肠沙门氏菌肠亚种伤寒血清变种(Salmonellaenterica subspecies enterica serovar Typhi)(伤寒沙门氏菌(Salmonella Typhi))、肠沙门氏菌肠亚种肠炎血清变种(Salmonellaenterica subspecies enterica serovar Enteritidis)(肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis))、肠沙门氏菌肠亚种巴拿马血清变种(Salmonella enterica subspecies enterica serovar Panama)(巴拿马沙门氏菌(Salmonella Panama))、肠沙门氏菌肠亚种都柏林血清变种(Salmonella enterica subspecies enterica serovarDublin)(都柏林沙门氏菌(Salmonella Dublin))、肠沙门氏菌肠亚种鸡血清变种(Salmonella enterica subspecies entericaserovar Gallinarum)(鸡沙门氏菌(Salmonella Gallinarum))、肠沙门氏菌肠亚种鸡白痢血清变种(Salmonella entericasubspecies enterica serovar Pullorum)(鸡白痢沙门氏菌(Salmonella Pullorum))、肠沙门氏菌肠亚种恩多洛血清变种(Salmonella enterica subspecies enterica serovar Ndolo)(恩多洛沙门氏菌(Salmonella Ndolo))、肠沙门氏菌肠亚种迈阿密血清变种(Salmonella enterica subspecies enterica serovar Miami)(迈阿密沙门氏菌(Salmonella Miami))、肠沙门氏菌肠亚种仙台血清变种(Salmonella enterica subspecies enterica serovarSendai)(仙台沙门氏菌(Salmonella Sendai))。

例如，E1群包括肠沙门氏菌肠亚种吉夫血清变种(Salmonellaenterica subspecies enterica serovar Give)(吉夫沙门氏菌(Salmonella Give))、肠沙门氏菌肠亚种鸭血清变种(Salmonellaenterica subspecies enterica serovar Anatum)(鸭沙门氏菌(Salmonella Anatum))、肠沙门氏菌肠亚种伦敦血清变种(Salmonella enterica subspecies enterica serovar London)(伦敦沙门氏菌(Salmonella London))、肠沙门氏菌肠亚种火鸡血清变种(Salmonella enterica subspecies enterica serovarMeleagridis)(火鸡沙门氏菌(Salmonella Meleagridis))。

例如，E2群包括肠沙门氏菌肠亚种剑桥血清变种(Salmonellaenterica subspecies enterica serovar Cambridge)(剑桥沙门氏菌(Salmonella Cambridge))、肠沙门氏菌肠亚种纽因吞血清变种(Salmonella enterica subspecies enterica serovar Newington)(纽因吞沙门氏菌(Salmonella Newington))。

例如，E3群包括肠沙门氏菌肠亚种明尼阿波利斯血清变种(Salmonella enterica subspecies enterica serovar Minneapolis)(明尼阿波利斯沙门氏菌(Salmonella Minneapolis))。

例如，E4群包括肠沙门氏菌肠亚种西姆斯伯利血清变种(Salmonella enterica subspecies enterica serovar Simsbury)(西姆斯伯利沙门氏菌(Salmonella Simsbury))、肠沙门氏菌肠亚种森夫顿堡血清变种(Salmonella enterica subspecies entericaserovar Senftenberg)(森夫顿堡沙门氏菌(SalmonellaSenftenberg))。

例如，F群包括肠沙门氏菌肠亚种阿柏丁血清变种(Salmonellaenterica subspecies enterica serovar Aberdeen)(阿柏丁沙门氏菌(Salmonella Aberdeen))。

例如，G群包括肠沙门氏菌肠亚种古巴血清变种(Salmonellaenterica subspecies enterica serovar Cubana)(古巴沙门氏菌(Salmonella Cubana))、肠沙门氏菌肠亚种浦那血清变种(Salmonella enterica subspecies enterica serovar Poona)(浦那沙门氏菌(Salmonella Poona))。

例如，H群包括肠沙门氏菌肠亚种赫维什血清变种(Salmonellaenterica subspecies enterica serovar Heves)(赫维什沙门氏菌(Salmonella Heves))、肠沙门氏菌肠亚种昂德斯特港血清变种(Salmonella enterica subspecies enterica serovarOnderstepoort)(昂德斯特港沙门氏菌(SalmonellaOnderstepoort))。

例如，I群包括肠沙门氏菌肠亚种巴西血清变种(Salmonellaenterica subspecies enterica serovar Brazil)(巴西沙门氏菌(Salmonella Brazil))、肠沙门氏菌肠亚种非丁伏斯血清变种(Salmonella enterica subspecies enterica serovarHvittingfoss)(非丁伏斯沙门氏菌(Salmonella Hvittingfoss))。

某些减毒的沙门氏菌疫苗和某些灭活的沙门氏菌疫苗是商购可得的。

美国专利号7,045,122；6,923,957；6,905,691；6,605,285；5,843,426；5,733,760；5,424,065；5,389,368；和6,592,869涉及沙门氏菌疫苗，包括减毒的和灭活的疫苗。

沙门氏菌属物种可以通过将非回复性指定突变引入到基因组中来合理地进行减毒，从而产生活疫苗株。已经鉴定了几种这样的基因，当它们突变时，将使沙门氏菌减毒。特别地，在牵涉前分支酸(pre-chorismate)生物合成途径的基因中具有非回复性突变的沙门氏菌菌株产生极佳的口服疫苗，该疫苗在宿主中诱发强的体液、局部和细胞免疫应答(Chatfield S.N.等人，Vaccine，1989，7(6)：495-8；Chatfield S.N.等人，FEMS Immunol.Med.Microbiol.，1993，7(1)：1-7)，在芳香族生物合成途径的aro基因中具有非回复性突变的沙门氏菌菌株(EP-B1-0322237)，在鼠伤寒沙门氏菌的转录调节物RfaH突变体中具有非回复性突变的沙门氏菌菌株，其在小鼠中作为针对沙门氏菌病的减毒的口服疫苗是有效的(Nagy G.等人，Infect.Immun.，2006，74(10)：5914-25)。

沙门氏菌可以通过修饰该细菌的基因组结构来进行减毒，例如通过删除沙门氏菌基因的一部分，通过将异源核苷酸序列插入沙门氏菌基因中，和/或通过用异源核苷酸序列置换沙门氏菌基因的一部分。可以通过引入这样的突变来使沙门氏菌减毒，所述突变(i)赋予营养缺陷型，(ii)干扰糖代谢和脂多糖生物合成，或(iii)影响对于毒力的完全展示而言所需的调节基因的某些整体能力。

例如，减毒的沙门氏菌可以是包含至少一种链霉素和一种利福平抗性代谢漂移突变以用于减毒作用的细菌(EP-B1-0642796)，例如肠炎沙门氏菌的减毒株Sm 24/Rif 12/Ssq(EP-B1-0642796)；通过在phoP调节区中的第一个突变(其引起在所述区域控制下的基因的组成型表达)和通过在pag或prg基因处的第二个突变而减毒的肠炎沙门氏菌(EP-B1-0563311)；通过在htrA基因中的非回复性突变而减毒的肠炎沙门氏菌(US-A-5,804,194)；对于一种或多种选自苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸和对氨基苯甲酸的生长因子而言显示出营养缺陷型的减毒的沙门氏菌，从而在不存在所述一种或多种生长因子的情况下它不能在基本培养基上生长(US-A-6,231,871)，例如以登录号N93/43266保藏在澳大利亚政府分析实验室(Australian GovernmentAnalytical Laboratories)的鼠伤寒沙门氏菌菌株STM-1(US-A-6,231,871)；通过N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍诱变而衍生的肠炎沙门氏菌的营养缺陷型突变体，例如E3/49菌株、1/37菌株、C7/1菌株、C7/2菌株、C7/18菌株、C7/19菌株、E1/23菌株、E1/25菌株、E2/7菌株、E3/44菌株和E3/51菌株(Martin G.等人，Berl.Münch.Wschr.，1996，109(10)：325-9)；在芳香族生物合成途径的两个离散的aro基因(例如，aroA和aroC，aroA和aroD，aroA和aroE)的每一个中具有非回复性突变的减毒的鼠伤寒沙门氏菌(EP-B1-0322237)；具有经遗传限定的aroC衍生物的减毒的肠炎沙门氏菌(LVR02菌株，参见Betancor L.等人，Vet.Microbiol.，2005，107(1-2)：81-9)；以及具有突变的减毒的鼠伤寒沙门氏菌，所述突变使选自下列的基因失活：hupA、dksA、rfaY、sipC或clpB(WO-A1-98/02523)。

还可以通过插入转座子来获得减毒性突变。例如，将突变体EZ870中的转座子插入到肠炎沙门氏菌核苷酸序列中，所述肠炎沙门氏菌核苷酸序列与鼠伤寒沙门氏菌基因spiC(登录号U51927，Ochman H.，Soncini F.C.Solomon F.和Groisman E.A.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93，7800-7804，1996)同源(在188bp重叠区中具有98.4％的相同碱基对)。经遗传修饰的肠炎沙门氏菌EZ870具有在BCCM/LMGCulture Collection，Laboratorium voor Microbiologie，Ledeganckstraat 35，B-9000 Gent，Belgium处的保藏号LMGP-18484(WO-A-99/37759)。

在根据本发明方法的加强施用中所使用的灭活的免疫原性组合物或疫苗包含药学上或兽医学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体以及至少一种灭活的沙门氏菌。所述灭活的沙门氏菌可以选自E群沙门氏菌、D群沙门氏菌、C群沙门氏菌和B群沙门氏菌，优选地选自E1群沙门氏菌、E4群沙门氏菌、D群沙门氏菌、C1群沙门氏菌、C2群沙门氏菌、C3群沙门氏菌和B群沙门氏菌，和更优选地选自由鸭沙门氏菌组成的E1群，选自由森夫顿堡沙门氏菌组成的E4群，选自由肠炎沙门氏菌、巴拿马沙门氏菌、都柏林沙门氏菌、鸡沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌组成的D群，选自由婴儿沙门氏菌、姆班达卡沙门氏菌、利文斯通沙门氏菌、维尔肖氏沙门氏菌、俄亥俄沙门氏菌、蒙得维的亚沙门氏菌、田纳西沙门氏菌、罗森沙门氏菌组成的C1群，选自由哈达尔沙门氏菌、新港沙门氏菌、科特布斯沙门氏菌组成的C2群，选自由肯塔基沙门氏菌、阿尔巴尼沙门氏菌组成的C3群，以及选自由鼠伤寒沙门氏菌、布伦登芦普沙门氏菌、阿哥纳沙门氏菌、布雷登尼沙门氏菌、海德尔堡沙门氏菌、印地安那沙门氏菌、圣保罗沙门氏菌、勃兰登堡沙门氏菌组成的B群。

在一个优选的实施方案中，在根据本发明方法的加强施用中所使用的灭活的免疫原性组合物或疫苗包含药学上或兽医学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体以及至少一种灭活的B群沙门氏菌和至少一种灭活的D群沙门氏菌。在另一个优选的实施方案中，在根据本发明方法的加强施用中所使用的灭活的免疫原性组合物或疫苗包含药学上或兽医学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体以及至少一种灭活的B群沙门氏菌、至少一种灭活的C群沙门氏菌和至少一种灭活的D群沙门氏菌。在一个最优选的实施方案中，在根据本发明方法的加强施用中所使用的灭活的免疫原性组合物或疫苗包含药学上或兽医学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体以及灭活的鼠伤寒沙门氏菌和灭活的肠炎沙门氏菌。在另一个最优选的实施方案中，在根据本发明使用方法的加强施用中所使用的灭活的免疫原性组合物或疫苗包含药学上或兽医学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体以及灭活的鼠伤寒沙门氏菌和灭活的肠炎沙门氏菌和至少一种灭活的C2群沙门氏菌。在另一个最优选的实施方案中，在根据本发明方法的加强施用中所使用的灭活的免疫原性组合物或疫苗包含药学上或兽医学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体以及灭活的鼠伤寒沙门氏菌和灭活的肠炎沙门氏菌和至少一种灭活的C2群沙门氏菌和至少一种灭活的C1群沙门氏菌。

沙门氏菌可以通过用灭活试剂进行处理来化学灭活或者热灭活，所述灭活试剂例如为甲醛、吖丙啶、吖丙啶酰胺衍生物(例如乙酰吖丙啶)、2-甲基吖丙啶、β-丙内酯、硫柳汞、丙酮。在一个优选的实施方案中，所述灭活试剂是甲醛。

在某些方面，优选的根据本发明的在禽类动物中使用免疫原性组合物或疫苗的方法包括向禽类动物施行减毒的免疫原性组合物或疫苗的至少一次初激施用，所述减毒的免疫原性组合物或疫苗包含药学上或兽医学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体以及至少一种减毒的D群沙门氏菌；在相隔数周(例如2周至18周)后，施行灭活的免疫原性组合物或疫苗的至少一次加强施用，所述灭活的免疫原性组合物或疫苗包含药学上或兽医学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体以及至少一种灭活的B群沙门氏菌和至少一种灭活的D群沙门氏菌。在该优选方法的一个具体实施方案中，减毒的D群沙门氏菌细菌是肠炎沙门氏菌，灭活的B群沙门氏菌细菌是鼠伤寒沙门氏菌，和灭活的D群沙门氏菌细菌是肠炎沙门氏菌。

其他优选的根据本发明的在禽类动物中使用免疫原性组合物或疫苗的方法包括向禽类动物施行减毒的免疫原性组合物或疫苗的至少一次初激施用，所述减毒的免疫原性组合物或疫苗包含药学上或兽医学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体以及至少一种减毒的D群沙门氏菌；在相隔数周(尤其是2周至18周)后，施行灭活的免疫原性组合物或疫苗的至少一次加强施用，所述灭活的免疫原性组合物或疫苗包含药学上或兽医学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体以及至少一种灭活的B群沙门氏菌、至少一种灭活的C2群沙门氏菌和至少一种灭活的D群沙门氏菌。在该优选方法的一个具体实施方案中，减毒的D群沙门氏菌细菌是肠炎沙门氏菌，灭活的B群沙门氏菌细菌是鼠伤寒沙门氏菌，灭活的D群沙门氏菌细菌是肠炎沙门氏菌，和灭活的C2群沙门氏菌细菌是哈达尔沙门氏菌。

其他优选的根据本发明的在禽类动物中使用免疫原性组合物或疫苗的方法包括向禽类动物施行减毒的免疫原性组合物或疫苗的至少一次初激施用，所述减毒的免疫原性组合物或疫苗包含药学上或兽医学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体以及至少一种减毒的D群沙门氏菌；在相隔数周(例如2周至18周)后，施行灭活的免疫原性组合物或疫苗的至少一次加强施用，所述灭活的免疫原性组合物或疫苗包含药学上或兽医学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体以及至少一种灭活的B群沙门氏菌、至少一种灭活的C1群沙门氏菌、至少一种灭活的C2群沙门氏菌和至少一种灭活的D群沙门氏菌。在该优选方法的一个具体实施方案中，减毒的D群沙门氏菌细菌是肠炎沙门氏菌，灭活的B群沙门氏菌细菌是鼠伤寒沙门氏菌，灭活的D群沙门氏菌细菌是肠炎沙门氏菌，灭活的C2群沙门氏菌细菌是哈达尔沙门氏菌，和灭活的C1群沙门氏菌细菌是维尔肖氏沙门氏菌和/或婴儿沙门氏菌。

其他优选的根据本发明的在禽类动物中使用免疫原性组合物或疫苗的方法包括向禽类动物施行减毒的免疫原性组合物或疫苗的至少一次初激施用，所述减毒的免疫原性组合物或疫苗包含药学上或兽医学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体以及至少一种减毒的D群沙门氏菌和至少一种减毒的B群沙门氏菌；在相隔数周(例如2周至18周)后，施行灭活的免疫原性组合物或疫苗的至少一次加强施用，所述灭活的免疫原性组合物或疫苗包含药学上或兽医学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体以及至少一种灭活的B群沙门氏菌和至少一种灭活的D群沙门氏菌。在该优选方法的一个具体实施方案中，减毒的D群沙门氏菌细菌是肠炎沙门氏菌，减毒的B群沙门氏菌细菌是鼠伤寒沙门氏菌，灭活的B群沙门氏菌细菌是鼠伤寒沙门氏菌，和灭活的D群沙门氏菌细菌是肠炎沙门氏菌。

其他优选的根据本发明的在禽类动物中使用免疫原性组合物或疫苗的方法包括向禽类动物施行减毒的免疫原性组合物或疫苗的至少一次初激施用，所述减毒的免疫原性组合物或疫苗包含药学上或兽医学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体以及至少一种减毒的D群沙门氏菌和至少一种减毒的B群沙门氏菌；在相隔数周(尤其是2周至18周)后，施行灭活的免疫原性组合物或疫苗的至少一次加强施用，所述灭活的免疫原性组合物或疫苗包含药学上或兽医学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体以及至少一种灭活的B群沙门氏菌、至少一种灭活的C2群沙门氏菌和至少一种灭活的D群沙门氏菌。在该优选方法的一个具体实施方案中，减毒的D群沙门氏菌细菌是肠炎沙门氏菌，减毒的B群沙门氏菌细菌是鼠伤寒沙门氏菌，灭活的B群沙门氏菌细菌是鼠伤寒沙门氏菌，灭活的D群沙门氏菌细菌是肠炎沙门氏菌，和灭活的C2群沙门氏菌细菌是哈达尔沙门氏菌。

其他优选的根据本发明的在禽类动物中使用免疫原性组合物或疫苗的方法包括向禽类动物施行减毒的免疫原性组合物或疫苗的至少一次初激施用，所述减毒的免疫原性组合物或疫苗包含药学上或兽医学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体以及至少一种减毒的D群沙门氏菌和至少一种减毒的B群沙门氏菌；在相隔数周(例如2周至18周)后，施行灭活的免疫原性组合物或疫苗的至少一次加强施用，所述灭活的免疫原性组合物或疫苗包含药学上或兽医学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体以及至少一种灭活的B群沙门氏菌、至少一种灭活的C1群沙门氏菌、至少一种灭活的C2群沙门氏菌和至少一种灭活的D群沙门氏菌。在该优选方法的一个具体实施方案中，减毒的D群沙门氏菌细菌是肠炎沙门氏菌，减毒的B群沙门氏菌细菌是鼠伤寒沙门氏菌，灭活的B群沙门氏菌细菌是鼠伤寒沙门氏菌，灭活的D群沙门氏菌细菌是肠炎沙门氏菌，灭活的C2群沙门氏菌细菌是哈达尔沙门氏菌，和灭活的C1群沙门氏菌细菌是维尔肖氏沙门氏菌和/或婴儿沙门氏菌。

可以向细菌悬浮液中添加佐剂，尤其是在培养和灭活后获得的细菌悬浮液。佐剂可以选自氢氧化铝、皂苷、与禽类组织相容的任何油包水乳状液或水包油乳状液(参见例如，Herbert W.J.，The Lancet，1965，October 16：771；Brugh M.等人，Am.J.Vet.Res.，1983，44(1)：72-5；Boersma W.J.A.等人，44^th Forum in Immunology，“Characteristics and use of new-generation adjuvants”，503-511；Gast等人，Avian Diseases，1993，37(4)：1085-91；Stone，Avian Diseases，1993，37：399-405；Stone等人，Avian Diseases，1990，34：979-983；Stone等人，Avian Diseases，1983，27(3)：688-697；US-A-3,919,411；WO-A-05/009462，所有这些参考文献通过提及而合并入本文)。

佐剂的例子包括但不限于，基于矿物油和/或植物油的水包油、水包油包水乳状液，以及非离子型表面活性剂，例如嵌段共聚物、

此类乳状液尤其是在“Vaccine Design-The Subunitand Adjuvant Approach”，Pharmaceutical Biotechnology，1995，vol.6，Michael F.Powell和Mark J.Newman(编辑)，Plenum Press，New York and London的第147页中描述的那些，或者TS乳状液，尤其是TS6乳状液，以及LF乳状液，尤其是LF2乳状液(关于TS和LF乳状液，参见WO-A-04/024027)。其他合适的佐剂为例如，维生素E，皂苷类，和交联的丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物，即

(Noveon；参见WO-A-99/51269；WO-A-99/44633)，

氢氧化铝或磷酸铝(“Vaccine Design，The subunit and adjuvantapproach”，Pharmaceutical Biotechnology，vol.6，Michael F.Powell和Mark J.Newman(编辑)，1995，Plenum Press New York)，生物学佐剂(例如，C4b，尤其是鼠C4b(Ogata RT等人，J.Biol.Chem.1989，264(28)：16565-16572)或马C4b，GM-CSF，尤其是马GM-CSF(US-A-6,645,740))，毒素(例如，霍乱毒素CTA或CTB，大肠杆菌(Escherichia coli)热不稳定毒素LTA或LTB(Olsen C W等人，vaccine，1997，15(10)：1149-1156；Fingerut E等人，Vaccine，2005，23(38)：4685-4696；Zurbriggen R等人，Expert Rev Vaccines，2003，2(2)：295-304；Peppoloni S等人，Expert Rev Vaccines，2003，2(2)：285-293))，和CpG(例如，CpG#2395(参见Jurk M等人，Immunobiology2004，209(1-2)：141-154)，CpG#2142(参见EP-B1-1,221,955中的SEQ.ID.NO：890)，CpG#2135，CpG#2007，CpG#2336)。交联的丙烯酸或甲基丙烯酸(尤其是通过糖或多元醇的聚烯基醚交联的)的聚合物称为卡波姆(Pharmeuropa，vol.8，no.2，1996年6月)。本领域技术人员还可以参考美国专利号2,909,462，其提供了通过多羟基化合物而交联的此类丙烯酸类聚合物，所述多羟基化合物具有至少3个羟基，优选不超过8个此类基团，其中至少3个羟基的氢原子被具有至少2个碳原子的不饱和的脂族基团替代。优选的基团是含有2-4个碳原子的那些，例如，乙烯基、烯丙基和其他烯键式不饱和基团。不饱和基团还可以包含其他取代基，例如甲基。以

(Noveon)这一名称进行销售的产品是特别合适的。它们通过烯丙基蔗糖或烯丙基季戊四醇交联。其中，可提及Carbopol 974P、934P、934、940和971P。

根据本发明的免疫原性组合物或疫苗可以有利地与稳定剂一起进行冷冻干燥。可以根据众所周知的标准冷冻干燥操作程序来进行冷冻干燥。药学上或兽医学上可接受的稳定剂可以是碳水化合物(例如，山梨糖醇、甘露醇、乳糖、蔗糖、葡萄糖、葡聚糖、海藻糖)，谷氨酸钠(Tsvetkov T等人，Cryobiology 1983，20(3)：318-23；IsraeliE等人，Cryobiology 1993，30(5)：519-23)，蛋白质例如蛋白胨、白蛋白、乳清蛋白或酪蛋白，包含蛋白质的试剂例如脱脂乳(Mills CK等人，Cryobiology 1988，25(2)：148-52；Wolff E等人，Cryobiology 1990，27(5)：569-75)，和缓冲液(例如，磷酸盐缓冲液，碱金属磷酸盐缓冲液)。佐剂可以用于制备可溶的冷冻干燥制剂。

可用的油的例子包括但不限于，矿物油，例如石蜡油，

6VR，

80；

52；萜烯油，例如角鲨烯和角鲨烷；植物油，例如大豆油、橄榄油、玉米油、霍霍巴油、花生油、棉籽油、向日葵油、红花油、芝麻油、杏油、鳄梨油、小麦胚芽油、卡诺拉油菜油(canola oil)、亚麻籽油和杏仁油；鱼油，例如鲨鱼油、橘刺鲷(orange roughy)油、鲱鱼油和鳕鱼肝油；动物油，例如貂油、猪油和鸡脂肪油。

在乳状液疫苗中使用的表面活性剂的例子包括，例如

80(脱水山梨糖醇单油酸酯)、80(聚山梨酯80)、80、

85、

83(脱水山梨糖醇倍半油酸酯)、

85(脱水山梨糖醇倍半油酸酯)、和

61(聚氧乙烯脱水山梨糖醇)。适合于动物和植物性油包水疫苗的表面活性剂包括，例如粗黄(crude yellow)和纯化的蜂蜡。此外，适合于包含角鲨烯和角鲨烷的疫苗的表面活性剂包括

和

80。

优选地，佐剂是油以形成包含石蜡油和表面活性剂的油包水乳状液，尤其是石蜡油、多元醇与脂肪酸的酯、以及乙氧基化多元醇与脂肪酸的酯。

可以通过本发明的方法来进行疫苗接种的禽类动物包括小鸡、母鸡、火鸡、鸭、小鸭、鹅、小鹅、珠鸡、雉类、矮脚鸡、鹌鹑、鸽。

本发明的方法涉及减毒的沙门氏菌免疫原性组合物或疫苗的至少一次初激施用，以及灭活的沙门氏菌免疫原性组合物或疫苗的至少一次加强施用。1日龄的禽类动物可以通过根据本发明的方法来进行疫苗接种，也就是说，可以向1日龄的禽类动物施行唯一的或第一次初激施用。优选地，向1日-大约28日龄，更优选地1日-大约15日龄的禽类动物施行唯一的或第一次初激施用。当施行至少两次初激施用时，这些初激施用优选地以2-4周的间隔来进行施行。在唯一的或第一次初激施用后2-18周，优选地在唯一的或第一次初激施用后3-10周，和更优选地在唯一的或第一次初激施用后3-6周，施行加强施用。当施用至少2次加强施用时，这些加强施用优选相隔2-12周进行施用。

在一个优选的实施方案中，本发明的方法包括两次初激施用和两次加强施用。初激施用优选地以2-4周的间隔来进行施行。在第一次初激施用后6-10周，优选地在第一次初激施用后8-10周，施行第一次加强施用。在第一次初激施用后14-18周，优选地在第一次初激施用后15-16周，施行第二次加强施用。

在另一个优选的实施方案中，本发明的方法包括两次初激施用和一次加强施用。初激施用优选地以2-4周的间隔来进行施行。在第一次初激施用后6-18周，优选地在第一次初激施用后6-16周，和更优选地在第一次初激施用后11-16周，施行加强施用。

在另一个优选的实施方案中，本发明的方法包括一次初激施用和两次加强施用。在初激施用后2-10周，优选地在初激施用后3-6周，施行第一次加强施用。在初激施用后12-18周，优选地在初激施用后14-16周，施行第二次加强施用。

在另一个优选的实施方案中，本发明的方法包括一次初激施用和一次加强施用。在初激施用后2-18周，优选地在初激施用后3-10周，和更优选地在初激施用后3-6周，施行加强施用。

根据本发明的方法，对于初激施用而言，免疫原性组合物或疫苗的合适的施用途径包括，口服途径，例如通过饮用水，或者眼途径，例如通过喷雾。

根据本发明的方法，对于初激施用而言，减毒的免疫原性组合物或疫苗的剂量包括大约0.1mL-大约2.0mL，优选地大约0.2mL-大约1.0mL，和更优选地大约0.4mL-大约0.6mL。这些剂量具有大约10⁶菌落形成单位/剂(CFU/剂)至大约10¹⁰CFU/剂的每种沙门氏菌菌株，优选地大约10⁸CFU/剂的每种沙门氏菌菌株。当采用饮用水来将减毒的免疫原性组合物或疫苗由施用给禽类动物时，这些剂量被稀释为大约1mL-大约5mL饮用水/禽类动物。

根据本发明的方法，对于加强施用而言，免疫原性组合物或疫苗的合适的施用途径包括皮下(SC)途径和肌内(IM)途径。根据本发明的方法，免疫原性组合物或疫苗可以通过具有针的注射器或通过无针装置(例如，Pigjet，Avijet，Dermojet，Vitajet或Biojector(Bioject，Oregon，USA)，参见US-A-2006/0034867)来进行施用。

根据本发明的方法，对于加强施用而言，灭活的免疫原性组合物或疫苗的剂量可以为大约0.05mL-大约2.0mL，优选地大约0.1mL-大约1.0mL，和更优选地大约0.2mL-大约0.4mL。这些剂量具有大约10⁶CFU/剂(灭活前)至大约10¹⁰CFU/剂(灭活前)的每种沙门氏菌菌株，优选地大约10⁸CFU/剂(灭活前)的每种沙门氏菌菌株。

本发明的另一个方面是用于根据本发明对禽类动物进行疫苗接种的试剂盒。在一个实施方案中，试剂盒包含至少两个小瓶和具有施用指导的包装说明书(package insert)，第一个小瓶包含减毒的沙门氏菌免疫原性组合物或疫苗以用于根据本发明方法的初激施用，和第二个小瓶包含灭活的沙门氏菌免疫原性组合物或疫苗以用于根据本发明方法的加强施用。任选地，试剂盒可以包含含有用于多次初激施用的减毒的沙门氏菌免疫原性组合物或疫苗的小瓶，和/或含有用于多次加强施用的灭活的沙门氏菌免疫原性组合物或疫苗的小瓶。

在另一个实施方案中，用于对禽类动物进行疫苗接种的试剂盒包含至少两个小瓶和具有施用指导的包装说明书，第一个小瓶包含减毒的D群沙门氏菌免疫原性组合物或疫苗，和第二个小瓶包含灭活的B群沙门氏菌和灭活的D群沙门氏菌免疫原性组合物或疫苗。任选地，试剂盒可以包含含有用于多次初激施用的减毒的D群沙门氏菌免疫原性组合物或疫苗的小瓶，和/或含有用于多次加强施用的灭活的B群沙门氏菌和灭活的D群沙门氏菌免疫原性组合物或疫苗的小瓶。

现在，将通过下述非限制性实施例来进一步描述本发明。

实施例1：

为了产生减毒疫苗，使用肠炎沙门氏菌噬菌体型4(PT4)菌株的腺嘌呤/组氨酸营养缺陷型双重标记突变体，其通过N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍诱变而衍生得到。该沙门氏菌菌株被命名为E 3/49菌株(Martin G.等人，Berl.Münch.

Wschr.，1996，109(10)：325-9)。作为非通气培养物，将沙门氏菌E 3/49菌株于37℃±1℃在营养培养基中培养18-24小时，所述营养培养基包含酵母提取物、胰蛋白胨、Na₂HPO₄x2H₂O、MgSO₄x7H₂O和注射用水，pH 7.6±0.2。所述培养物用10体积％的甘油来进行稳定，以1.8ml的等分试样装入容器中，并贮存于-80℃±5℃。

将添加有葡萄糖的相同营养培养基用于细菌菌株的发酵。所述培养物是于37℃±1℃经历8-24小时的非通气培养物或经历8-16小时的摇瓶培养物。接种物为0.2-10体积％。

所述培养物于+2℃至+8℃贮存最多4天。

收获所获得的细菌，并且依据生物体计数用经缓冲的生理盐水和20体积％的蔗糖溶液(最大浓度60％)进行稀释。用NaOH或CH₃COOH将疫苗的pH调整至7.0±0.5。

然后，将细菌悬浮液冻干以用于贮存。

使托架(tray)从底部向上逐步冷却至0℃。将疫苗在冻干器中于-40℃的最低温度冷冻大约3-4小时。一旦达到所需的真空，就起始主要干燥过程(将托架温度控制在最高+10℃)，直至达到+5℃的产物温度。随后，在最高+35℃的托架温度下进行最多12小时的第二次干燥。

干燥后，用干燥的无菌氮气充满所述瓶，自动密封，抛光，并贮存在冷的室中。

在0.5mL用于禽类动物的饮用水中重构后获得的减毒疫苗中，减毒的肠炎沙门氏菌的滴度为10⁸菌落形成单位(CFU)/剂。

实施例2：

为了产生灭活疫苗，使用两种不同的沙门氏菌菌株，肠炎沙门氏菌PT 4菌株和鼠伤寒沙门氏菌DT 104菌株。

每种沙门氏菌菌株于在0.25％软琼脂中的胰胨豆胨培养液(TSA)中进行培养。

收获所获得的细菌，在注射用水中进行稀释，并且在冷冻保护剂(20％甘油和5％蔗糖)存在下在-70℃的目标温度下于袋中进行冷冻以用于贮存。

对于肠炎沙门氏菌PT 4菌株的灭活，将包含肠炎沙门氏菌PT 4菌株的袋解冻，并且将细菌悬浮液转移到无菌容器中。将灭活试剂，即35％甲醛溶液，以3.88％(甲醛溶液体积/培养物体积)的浓度加入到细菌悬浮液中。在通过搅拌进行混合后，将悬浮液转移到另一个无菌容器中。于24℃在搅拌下灭活24小时。

对于鼠伤寒沙门氏菌DT 104菌株的灭活，进行与对于肠炎沙门氏菌PT 4菌株所描述的相同的过程。

将灭活的细菌贮存于+5℃+/-3℃直至用于进行配制。

将灭活的肠炎沙门氏菌PT 4细菌和灭活的鼠伤寒沙门氏菌DT 104细菌混合，并且用油包水乳状液佐剂进行配制，所述油包水乳状液佐剂包含石蜡油、多元醇与脂肪酸的酯、以及乙氧基化多元醇与脂肪酸的酯。

在成品中以100μg/mL的终浓度添加防腐剂(即硫柳汞)。

在灭活疫苗中，肠炎沙门氏菌PT 4菌株的滴度为10^8.3CFU/剂(灭活前)，和鼠伤寒沙门氏菌DT 104菌株的滴度为10⁸CFU/剂(灭活前)。

实施例3：

在该研究的第0天时，随机选取30只1日龄的SPF(无特定病原体)鸡，随后分派到每组10只鸡的3个组中。

所述组如下限定：

-G.00＝对照组；

-G.01＝实施例1的减毒疫苗(1日龄时)+实施例2的灭活疫苗(21日龄时)；

-G.02＝实施例2的灭活疫苗(21日龄时)。

在鉴定后，将每个组分配至隔离单元直至第53天时。

在第0天时，通过口服途径(直接递送到口腔中)用1个剂量(至少10⁸CFU)的0.5mL的实施例1的减毒疫苗对G.01组的动物进行疫苗接种。

在第21天时，通过肌内途径(在左胸肌肉深区中)用1个剂量的实施例2的灭活疫苗对G.01和G.02组的动物进行疫苗接种，0.3mL/剂量，肠炎沙门氏菌滴度为10^8.3CFU/剂(灭活前)，鼠伤寒沙门氏菌滴度为10⁸CFU/剂(灭活前)。

G.01组最后进行疫苗接种，以避免与减毒的疫苗株的交叉污染。

在第49天，紧在攻击之前对所有组进行抽血，然后就特异性抗体来对所收集的血清进行测试。G.00、G.01和G.02组通过IDEXX ELISA试验和通过慢凝集试验(Slow Agglutination Test，SAT)来进行测试。

在攻击前一天(第48天)，在室温下解冻一个等分试样的海德尔堡沙门氏菌(B群沙门氏菌)，然后悬浮在100mL的Bio Mérieux胰胨豆胨液体培养基(Tryptone Soya Broth medium，TSB)中，并于37℃温育14小时。

将获得的细菌悬浮液进行离心，并且将菌株粒状沉淀接种在新鲜的预温的TSB中，并且于37℃经过最佳生长时间段(5小时)进行温育。

一旦通过光密度(在620nm处测量)评估的正在发展中的细菌培养物的滴度高至足以成为滴度为10⁹CFU/0.2mL的悬浮液时，就将它用于感染所述鸡。

将接种物在TSB中的系列10倍稀释物接种在胰胨豆胨琼脂(TSA)上，并且于37℃温育24小时以用于计数，其中采用3次重复。

在第49天时，用滴度为10^8.9CFU/0.2ml的海德尔堡沙门氏菌液体培养基培养物攻击所有组。每只鸡通过口服途径来进行感染。

感染后4天(第53天)，对所有鸡实施安乐死。在每只鸡上对脾脏和盲肠进行无菌取样，并且置于经事先标示的独个管中。在收获结束时，对所述管进行处理以用于沙门氏菌的再分离。

-将每个脾脏磨碎入10mL注射器中，并且在10mL经缓冲的蛋白胨水(BPW)中进行稀释，

-将200μl的稀释物置于XLT4+氨苄青霉素(以50μg/mL的比率添加)培养基上以用于计数(种子在琼脂上扩散)。将平板于37℃温育48小时。

预富集阶段(PE)

-然后，将所有稀释的脾脏于37℃温育16-20小时，

-仅直接方法阴性的脾脏完全前进到下一个阶段。

富集阶段(E)

-将“PE”脾脏悬浮液以1∶100的比率(在500μl中的5μl)接种到Rappaport Vassiliadis大豆(Rappaport Vassiliadis Soya，RVS)培养液中，并且于42℃温育24小时。

选择性分离

-将“E”脾脏悬浮液在XLT4+氨苄青霉素培养基上进行铺板，然后于37℃温育48小时，其中铺板体积为10μl。典型的沙门氏菌菌落是黑色的或具有黑色中心，并且当存在这种类型的菌落时，将该样品评为阳性。

结果以“ccu/器官”来表示。

将收获的盲肠内容物(大约1g)无菌地收集在无菌管中，称重，并在BPW中以1∶10(重量/体积)进行稀释直至10e-7。

将10^-2、10^-3、10^-5和10^-7稀释物于37℃温育16-20小时(PE)，并且进一步进行处理以用于富集阶段(E)和选择性分离，如对于脾脏样品一样。

鉴定沙门氏菌菌落，并且标明阳性平板。

如下对再分离数据进行分析：

对于脾脏：

-在预富集和富集后的阴性样品的计数为0ccu/器官，

-在预富集和富集后为阳性的在直接铺板中的阴性样品的计数为10ccu/样品；

对于盲肠内容物：

-半定量结果以“ccu/g器官内容物”来表示，基于稀释方法和阳性(即，当为阳性时，50μl+450μl直至10^-2、10^-3、10^-5和10^-7的稀释度分别相应于10^2.3、10^3.3、10^5.3和10^7.3ccu/g沙门氏菌盲肠内容物)。

在疫苗接种后4周，所有经免疫接种的和未免疫接种的鸡的特异性抗体滴度的结果概括在表1中。

通过关于SAT的几何平均滴度(GMT)以及通过关于S/N和IP肠炎沙门氏菌ELISA结果的算术平均滴度(AMT)来表示所述值。

表1：

从未疫苗接种的组获得的SAT和ELISA血清学结果恒定地是阴性的。

关于鼠伤寒沙门氏菌SAT结果，单独的灭活疫苗显示出符合逻辑的血清转变(171SAT单位)，而减毒的肠炎沙门氏菌疫苗对于鼠伤寒沙门氏菌组分具有令人惊讶的协同效应(197SAT单位)(15.2％)。

关于G.01和G.02肠炎沙门氏菌ELISA结果，AMT在减毒疫苗加灭活疫苗中显示出比在单独的灭活疫苗中更高的IP单位值(6.8％)，分别为63和59，其中阳性受试者/组为10/10。

表2概括了在感染后4天在脾脏和盲肠内容物中海德尔堡沙门氏菌再分离的结果(表示为“阳性/总数”和“log₁₀ccu/脾脏或g”)。表2：

-：阴性

+：阳性

d.p.：直接铺板

a.e.：富集后

如表3中所记录的，在感染后4天，海德尔堡沙门氏菌攻击菌株显示出其达到对照组内部器官并在其中建群的能力(0/10的阴性样品)以及分别在脾脏和盲肠内容物中的10e1.2ccu/器官和10e4.7ccu/g的显著的沙门氏菌计数。

关于脾脏结果，由与减毒疫苗相联合的灭活疫苗(G.01)给予了针对海德尔堡沙门氏菌攻击的最佳保护，其中与对照组相比较，Δ＝10^1.2ccu/脾脏。在G：02组中通过单独使用的灭活疫苗也达到了显著结果(与对照组相比较，Δ＝10^0.9ccu/脾脏)。

关于盲肠内容物结果，与减毒疫苗相联合的灭活疫苗(G.01)显示出了极佳水平的保护，其中与对照组相比较，Δ＝10^2.8ccu/脾脏。灭活疫苗显示出显著水平的盲肠内容物保护，其中与对照组相比较，Δ＝10^1.2。

G.01组血清学结果显示出在1日龄时的减毒疫苗注射对于灭活疫苗血清转变的协同效应。与单独的灭活疫苗相比较，可定量的初激效应对于肠炎沙门氏菌组分而言为6.8％(63ELISA IP单位)，和对于鼠伤寒沙门氏菌组分而言为令人惊讶的15.2％(197SAT单位)。

与减毒疫苗相联合的灭活疫苗显示出比单独的灭活疫苗更完全的关于脾脏以及还有针对海德尔堡沙门氏菌盲肠内容物侵袭的保护效应，其中与对照结果相比较，Δ＝10^1.2ccu/脾脏和Δ＝10^2.8ccu/克盲肠内容物。存在有清晰的组间保护作用增加，其由在灭活的肠炎沙门氏菌+鼠伤寒沙门氏菌疫苗之上实施减毒的肠炎沙门氏菌疫苗初激而诱导。

实施例4：

进行与实施例3中所描述的相同的实验，除了攻击沙门氏菌菌株不是海德尔堡沙门氏菌而是婴儿沙门氏菌。

在疫苗接种后4周，所有经免疫接种的和未免疫接种的鸡的特异性抗体滴度的结果概括在表3中。

表3：

关于鼠伤寒沙门氏菌SAT结果，单独的灭活疫苗显示出符合逻辑的血清转变(139SAT单位)，而减毒的肠炎沙门氏菌疫苗对于鼠伤寒沙门氏菌组分具有令人惊讶的协同效应(184SAT单位)。

关于G.01和G.02肠炎沙门氏菌ELISA结果，AMT在减毒疫苗加灭活疫苗中显示出比在单独的灭活疫苗中更高的IP单位值，分别为60和56，其中阳性受试者/组为10/10。

表4概括了在感染后7天在脾脏和盲肠内容物中婴儿沙门氏菌再分离的结果(表示为“阳性/总数”和“log₁₀ccu/脾脏或g”)。

表4：

-：阴性

+：阳性

d.p.：直接铺板

a.e.：富集后

如表4中所记录的，在感染后7天，婴儿沙门氏菌攻击菌株显示出其达到对照组内部器官并在其中建群的能力(0/10的阴性样品)以及分别在脾脏和盲肠内容物中的10^2.3ccu/器官和10^6.1ccu/g的显著的沙门氏菌计数。

关于脾脏结果，由与减毒疫苗相联合的灭活疫苗(G.01)给予了针对婴儿沙门氏菌攻击的良好保护，其中与对照组相比较，Δ＝10^1.4ccu/脾脏。

关于盲肠内容物结果，与减毒疫苗相联合的灭活疫苗(G.01)显示出了极佳水平的保护，其中与对照组相比较，Δ＝10^3.2ccu/脾脏。灭活疫苗显示出显著水平的盲肠内容物保护，其中与对照组相比较，Δ＝10^2.2。

G.01组血清学结果显示出在1日龄时的减毒疫苗注射对于灭活疫苗血清转变的协同效应。与单独的灭活疫苗相比较，可定量的初激效应对于肠炎沙门氏菌组分而言为7％(60 ELISA IP单位)，和对于鼠伤寒沙门氏菌组分而言为32％(184SAT单位)。

与减毒疫苗相联合的灭活疫苗显示出主要关于盲肠保护而言的更好的保护效应(Δ＝10^3.2ccu/克)，和与单独的灭活疫苗相类似的对于脾脏的保护(其中与对照结果相比较，Δ＝10^1.4ccu/器官)。

实施例5：

进行与实施例3中所描述的相同的实验，除了攻击沙门氏菌菌株不是海德尔堡沙门氏菌而是维尔肖氏沙门氏菌。

在疫苗接种后4周，所有经免疫接种的和未免疫接种的鸡的特异性抗体滴度的结果概括在表5中。

表5：

关于鼠伤寒沙门氏菌SAT结果，单独的灭活疫苗显示出符合逻辑的血清转变(149SAT单位)，而减毒的肠炎沙门氏菌疫苗对于鼠伤寒沙门氏菌组分具有令人惊讶的协同效应(160SAT单位)。

关于G.01和G.02肠炎沙门氏菌ELISA结果，AMT在减毒疫苗加灭活疫苗中显示出比在单独的灭活疫苗中更高的IP单位值，分别为56和50，其中阳性受试者/组为10/10。

表6概括了在感染后4天在脾脏和盲肠内容物中维尔肖氏沙门氏菌再分离的结果(表示为“阳性/总数”和“log₁₀ccu/脾脏或g”)。

表6：

-：阴性

+：阳性

d.p.：直接铺板

a.e.：富集后

如表6中所记录的，在感染后4天，维尔肖氏沙门氏菌攻击菌株显示出其达到对照组内部器官并在其中建群的能力(0/10的阴性样品)以及分别在脾脏和盲肠内容物中的10^2.4ccu/器官和10^6.5ccu/g的显著的沙门氏菌计数。

关于脾脏结果，由与减毒疫苗相联合的灭活疫苗(G.01)给予了针对维尔肖氏沙门氏菌攻击的最佳保护，其中与对照组相比较，Δ＝10^2.3ccu/脾脏。在G：02组中通过单独使用的灭活疫苗也达到了良好结果(与对照组相比较，Δ＝10^1.8ccu/脾脏)。

关于盲肠内容物结果，与减毒疫苗相联合的灭活疫苗(G.01)显示出了极佳水平的保护，其中与对照组相比较，Δ＝10^2.0ccu/脾脏。灭活疫苗显示出显著水平的盲肠内容物保护，其中与对照组相比较，Δ＝10^1.0。

G.01组血清学结果显示出在1日龄时的减毒疫苗注射对于灭活疫苗血清转变的协同效应。与单独的灭活疫苗相比较，可定量的初激效应对于肠炎沙门氏菌组分而言为12％(56 ELISA IP单位)，和对于鼠伤寒沙门氏菌组分而言为令人惊讶的7.4％(160SAT单位)。

与减毒疫苗相联合的灭活疫苗显示出比单独的灭活疫苗更好的主要关于脾脏保护而言但还有针对维尔肖氏沙门氏菌盲肠内容物侵袭的保护效应，其中与对照结果相比较，Δ＝10^2.3ccu/脾脏和Δ＝10^2.0ccu/克盲肠内容物。

实施例6：

进行与实施例3中所描述的相同的实验，除了攻击沙门氏菌菌株不是海德尔堡沙门氏菌而是哈达尔沙门氏菌。最终的攻击接种物滴度为10⁹CFU/0.2mL。

在疫苗接种后4周，所有经免疫接种的和未免疫接种的鸡的特异性抗体滴度的结果概括在表7中。

表7：

关于鼠伤寒沙门氏菌SAT结果，单独的灭活疫苗显示出符合逻辑的血清转变(171SAT单位)，而减毒的肠炎沙门氏菌疫苗对于鼠伤寒沙门氏菌组分具有令人惊讶的协同效应(211SAT单位)。

关于G.01和G.02肠炎沙门氏菌ELISA结果，AMT在减毒疫苗加灭活疫苗中显示出比在单独的灭活疫苗中更高的IP单位值(6.8％)，分别为58和51，其中阳性受试者/组为10/10。

表8概括了在感染后4天在脾脏和盲肠内容物中哈达尔沙门氏菌再分离的结果(表示为“阳性/总数”和“log₁₀ccu/脾脏或g”)。

表8：

-：阴性

+：阳性

d.p.：直接铺板

a.e.：富集后

如表8中所记录的，在感染后4天，哈达尔沙门氏菌攻击菌株显示出其达到对照组内部器官并在其中建群的能力(2/10和0/10的阴性样品)以及分别在脾脏和盲肠内容物中的10^1.3ccu/器官和10^5.1ccu/g的显著的沙门氏菌计数。

关于脾脏结果，由与减毒疫苗相联合的灭活疫苗(G.01)给予了针对哈达尔沙门氏菌攻击的最佳保护，其中与对照组相比较，Δ＝10^0.9ccu/脾脏。在G：02组中通过单独使用的灭活疫苗也达到了有限的结果(与对照组相比较，Δ＝10^0.2ccu/脾脏)。

关于盲肠内容物结果，与减毒疫苗相联合的灭活疫苗(G.01)或者灭活疫苗(G.02)显示出了相等水平的保护，其中与对照组相比较，Δ＝10^0.8ccu/脾脏。

G.01组血清学结果显示出在1日龄时的减毒疫苗注射对于灭活疫苗血清转变的协同效应。与单独的灭活疫苗相比较，可定量的初激效应对于肠炎沙门氏菌组分而言为14％(58 ELISA IP单位)，和对于鼠伤寒沙门氏菌组分而言为令人惊讶的23％(211 SAT单位)。

与对照结果相比较，与减毒疫苗相联合的灭活疫苗显示出比单独的灭活疫苗更好的主要针对哈达尔沙门氏菌盲肠内容物侵袭的保护效应。

表9概括了实施例3-6的结果，所述实施例3-6涉及在用异源血清变种的沙门氏菌进行攻击后在受感染的鸡的脾脏中的沙门氏菌分离。

表9：

这些结果显示，在根据本发明的方法进行两次疫苗接种(例如，第一次用减毒的沙门氏菌疫苗，和第二次用灭活的沙门氏菌疫苗)的组和仅用灭活的沙门氏菌疫苗进行疫苗接种的组之间，存在处于6.5％风险率(采用K2检验)的显著差异和处于5％单侧风险率(采用精确Fischer检验)的显著差异。

采用了使用减毒的肠炎沙门氏菌疫苗(D群)的初激施用的方法增强了二价的、含油的肠炎沙门氏菌/鼠伤寒沙门氏菌灭活疫苗针对来自B群以及来自C1和C2群的异源血清变种(它们不存在于所使用的疫苗配方中)攻击的功效。通过在用异源血清变种的沙门氏菌进行攻击后脾脏侵袭的减少，通过将根据本发明的方法进行两次疫苗接种的组与仅用灭活的沙门氏菌疫苗进行疫苗接种的组进行比较，而显著地显示出了这种增强。

Claims

1.一种方法，其包括：

向禽类动物施行减毒的免疫原性组合物或疫苗的至少一次初激施用，所述减毒的免疫原性组合物或疫苗包含药学上或兽医学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体以及至少一种减毒的沙门氏菌；之后施行灭活的免疫原性组合物或疫苗的至少一次加强施用，所述灭活的免疫原性组合物或疫苗包含药学上或兽医学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体以及至少一种灭活的沙门氏菌，

其中所述初激施用和加强施用以2-18周的间隔来施行。

2.一种方法，其包括：

向禽类动物施行灭活的免疫原性组合物或疫苗的至少一次初激施用，所述灭活的免疫原性组合物或疫苗包含药学上或兽医学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体以及至少一种灭活的沙门氏菌；之后施行减毒的免疫原性组合物或疫苗的至少一次加强施用，所述减毒的免疫原性组合物或疫苗包含药学上或兽医学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体以及至少一种减毒的沙门氏菌，

其中所述初激施用和加强施用以2-18周的间隔来施行。

3.权利要求1的方法，其中所述至少一种减毒的沙门氏菌或所述至少一种灭活的沙门氏菌选自B群沙门氏菌。

4.权利要求3的方法，其中所述B群沙门氏菌包括鼠伤寒沙门氏菌、布伦登芦普沙门氏菌、阿哥纳沙门氏菌、布雷登尼沙门氏菌、海德尔堡沙门氏菌、印地安那沙门氏菌、圣保罗沙门氏菌、勃兰登堡沙门氏菌。

5.权利要求4的方法，其中所述B群沙门氏菌的所述至少一种减毒的沙门氏菌或所述至少一种灭活的沙门氏菌是鼠伤寒沙门氏菌。

6.权利要求1的方法，其中所述至少一种减毒的沙门氏菌或所述至少一种灭活的沙门氏菌选自D群沙门氏菌。

7.权利要求6的方法，其中所述D群沙门氏菌包括肠炎沙门氏菌、巴拿马沙门氏菌、都柏林沙门氏菌、鸡沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌。

8.权利要求7的方法，其中所述D群沙门氏菌的所述至少一种减毒的沙门氏菌或所述至少一种灭活的沙门氏菌是肠炎沙门氏菌。

9.权利要求2的方法，其中所述至少一种减毒的沙门氏菌或所述至少一种灭活的沙门氏菌选自B群沙门氏菌。

10.权利要求9的方法，其中所述B群沙门氏菌包括鼠伤寒沙门氏菌、布伦登芦普沙门氏菌、阿哥纳沙门氏菌、布雷登尼沙门氏菌、海德尔堡沙门氏菌、印地安那沙门氏菌、圣保罗沙门氏菌、勃兰登堡沙门氏菌。

11.权利要求10的方法，其中所述B群沙门氏菌的所述至少一种减毒的沙门氏菌或所述至少一种灭活的沙门氏菌是鼠伤寒沙门氏菌。

12.权利要求2的方法，其中所述至少一种减毒的沙门氏菌或所述至少一种灭活的沙门氏菌选自D群沙门氏菌。

13.权利要求12的方法，其中所述D群沙门氏菌包括肠炎沙门氏菌、巴拿马沙门氏菌、都柏林沙门氏菌、鸡沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌。

14.权利要求13的方法，其中所述D群沙门氏菌的所述至少一种减毒的沙门氏菌或所述至少一种灭活的沙门氏菌是肠炎沙门氏菌。

15.权利要求1的方法：

其中所述至少一种减毒的沙门氏菌是D群的沙门氏菌，所述至少一种灭活的沙门氏菌是B群的沙门氏菌，

所述方法进一步包括在施用所述至少一种灭活的B群的沙门氏菌之后大约2-大约18周，至少一次施用D群的沙门氏菌。

16.权利要求14的方法，其中所述减毒的D群沙门氏菌属细菌是肠炎沙门氏菌，所述灭活的B群沙门氏菌属细菌是鼠伤寒沙门氏菌，和所述灭活的D群沙门氏菌属细菌是肠炎沙门氏菌。

17.用于对禽类动物进行疫苗接种的疫苗接种试剂盒或套件，其包含至少两个小瓶和具有施用指导的包装说明书，其中所述至少小瓶包含减毒的沙门氏菌和灭活的沙门氏菌，

其中所述疫苗接种试剂盒或套件可操作地进行装配，以便执行向所述禽类家族动物施用所述疫苗，并引发针对沙门氏菌的安全且保护性的免疫应答。

18.权利要求16的疫苗接种试剂盒或套件，其中第一个小瓶包含减毒的D群沙门氏菌免疫原性组合物或疫苗，和第二个小瓶包含灭活的B群沙门氏菌和灭活的D群沙门氏菌免疫原性组合物或疫苗。

19.权利要求16的疫苗接种试剂盒或套件，其中所述至少两个小瓶包含减毒的D群沙门氏菌免疫原性组合物或疫苗以用于多次初激施用，以及灭活的B群沙门氏菌和灭活的D群沙门氏菌免疫原性组合物或疫苗以用于多次加强施用。