KR102632608B1 - 약독화된 살모넬라 갈리나룸 생균 및 사균을 포함하는 가금티푸스 예방용 백신 조성물 - Google Patents

약독화된 살모넬라 갈리나룸 생균 및 사균을 포함하는 가금티푸스 예방용 백신 조성물 Download PDF

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Abstract

약독화된 살모넬라 갈리나룸 생균 및 사균을 포함하는 가금티푸스 예방용 백신 조성물에 관한 것이다. 일 양상에 따른 백신 조성물은 살모넬라 약독백신주의 생균과 사균을 혼합한 생사독백신을 제공함으로써, 생균 또는 사균 단독 접종시보다 강력하고 지속적인 항체가가 유지되어 가금티푸스의 예방 및 경감에 유용하게 사용될 것으로 기대된다.

Description

약독화된 살모넬라 갈리나룸 생균 및 사균을 포함하는 가금티푸스 예방용 백신 조성물{A vaccine composition for preventing Fowl Typhoid comprising live attenuated and killed Salmonella gallinarum}
약독화된 살모넬라 갈리나룸 생균 및 사균을 포함하는 가금티푸스 예방용 백신 조성물에 관한 것이다.
가금티푸스(Fowl typhoid)는 형태학적으로 그람음성인 단간균인 살모넬라 갈리나룸(Salmonella enterica subsp. enterica serovar Gallinarum biovar Gallinarum, S. Gallinarum)에 의해 발생하는 중요 세균성 질병으로, 닭 및 칠면조 등의 조류에서 발생하는 급성 및 만성의 전염병이다. 해당 질병은 모든 일령에서 나타날 수 있으며 패혈증에 의해 높은 폐사율이 나타난다. 닭이 가금티푸스에 감염되어 나타나는 일반적인 증상은 급성 폐사, 간, 비장, 그리고 신장의 종대, 간의 흰색 괴사반점 및 청동간, 수양성 내지는 점액성의 노란색 설사, 산란 감소 등이 일어날 수 있으며, 산란 중에 티푸스 발병 시 오랜 기간에 걸친 산발적인 폐사가 일어날 수 있다.
가금티푸스의 원인체인 살모넬라 갈리나룸은 혈청학적으로 D형 O-항원을 가지고 있으며 그 중에서도 O1, O9 및 O12를 소유한다. 이는 살모넬라 풀로룸과 동일하여 혈청학적 검사로는 구분하기 어렵다. 또한, 평판응집반응을 통한 검사 역시 다른 살모넬라의 감염이나 기타 세균성 질병에 의해 비특이 반응이 일어날 수 있다. 따라서, 최근에는 ELISA를 통한 혈청검사가 일반적이나 O-항원의 LPS(lipopolysaccharide)의 일부가 소실된 백신주(rough strain)를 접종하여도 일부 양성으로 검출되는 검사 결과가 나타나 모니터링에 혼선이 일어날 수 있다.
살모넬라는 일반적으로 편모 단백질인 H-항원이 숙주(host) 초기 면역반응을 자극하지만 살모넬라 갈리나룸은 H-항원이 없어 운동능력이 상실되며 면역반응이 늦게 나타난다. 이에 따라 전신감염이 일어날 확률이 높아 일반적인 살모넬라보다 더 병원성이 강하게 나타난다. 살모넬라는 그람음성 균이 일반적으로 지니고 있는 내독소에 의해 고열이나 쇼크, 장기부전 등을 일으킬 수 있으며, 병원성 유전자의 집합체인 SPI-2(Salmonella Pathogenicity Island-2)는 제3형 분비 시스템(type 3 secretion system: T3SS)을 활성화시켜 내피세포로의 침투를 돕는다. 살모넬라의 병원성 플라스미드(virulence plasmid)에 존재하는 spv locus는 액틴 중합을 억제하여 숙주세포에 독성 효과를 줄 뿐만 아니라 오토파지(autophage)를 억제하여 병원성에 핵심적인 역할을 수행한다.
가금티푸스는 감염계와의 접촉 및 감염계의 분변으로 배출된 균을 통해 음수나 사료 등을 통해 다른 계군으로 전염될 수 있다. 감염된 모계로부터 수직감염 또한 가능하다. 가금티푸스는 전세계적으로 발생되나 캐나다나 미국, 일부 유럽 국가들 같은 양계 선진국에서는 1980년대 이후 실용가금에서의 발생이 보고되지 않고 있다. 하지만 국내 가금티푸스 발병은 1992년 최초 보고 이래 2001년까지 점차 증가하였으며 2017년 발생 두수는 121,495, 2018년 112,009, 2019년 101,204으로 최근에도 지속적으로 발생하고 있다. 또한, 성계나 백세미에서의 가금티푸스는 그 증상이 심하게 나타나지 않아 현장에서 항생제 처치가 이루어지는 점을 감안하면 실제 발생빈도는 더 높을 것으로 예상되며 그 경제적 피해가 막대하다.
이러한 가금티푸스의 예방을 위해 여러 백신들이 개발되어 왔으며 현재 SG9R과 SR2-N6와 같은 약독화 생균백신이 선호된다. 그러나, 최근 야외 농장에서는 이러한 약독화 생균백신으로 방어가 완전하지 않아 추가접종을 실시하는 사례들이 증가하고 있으며, 그 원인으로 야외주의 병원성 증가가 보고되어 기존 백신의 효능을 강화한 신규 백신이 요구되는 실정이다.
이에 본 발명자들은 가금티푸스 약독백신주의 생균과 사균을 혼합한 백신 조성물을 접종한 결과 가금티푸스균의 방어와 관련된 세포성면역 뿐만 아니라 체액성면역도 강화하여 가금류에서 가금티푸스를 효과적으로 예방 및 경감시킬 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다. 이와 같이, 가금티푸스 약독백신주의 생균과 사균을 혼합한 백신의 방어 효능에 대한 연구는 현재까지 전무하다.
일 양상은 약독화된 살모넬라 갈리나룸(Salmonella Gallinarum)의 생균 및 사균을 포함하는 가금티푸스 예방용 백신 조성물을 제공하는 것이다.
다른 양상은 상기 백신 조성물을 가금에 접종하는 단계를 포함하는 가금티푸스를 예방하는 방법을 제공하는 것이다.
일 양상은 약독화된 살모넬라 갈리나룸(Salmonella Gallinarum)의 생균 및 사균을 포함하는 가금티푸스 예방용 백신 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 용어, "예방"은 일 양상에 따른 백신 조성물의 투여로 가금티푸스 감염을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 말한다.
본 명세서에서 용어 "백신"은 생체에 면역을 주는 항원을 함유한 생물학적인 제제로서, 감염증의 예방을 위하여 사람이나 동물에 주사하거나 경구 투여함으로써 생체에 면역이 생기게 하는 면역원 또는 항원성 물질을 말한다.
백신의 종류에는 크게 병원성을 약독화시킨 약독화 백신(attenuated vaccine)과 병원체를 완전히 죽인 불활화 백신(inactivated vaccine 또는 killed vaccine)이 있다. 상기 약독화 백신은 약독화백신 또는 생균백신이라고도 하며, 상기 불활화 백신은 사균백신 또는 사독백신이라고도 한다.
일 양상에 따른 백신 조성물은 약독화된 살모넬라 갈리나룸의 생균 및 사균을 모두 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "생균"은 생균백신 또는 생백신을 모두 포함하는 의미로 사용될 수 있으며, 상기 생균은 세균이나 바이러스를 병원성을 약하게 하여 동물에 투여되었을 때 질병의 임상적 증상이 없거나 감소되었음을 나타내는 바이러스를 의미하는 것이다. 상기 약독화된 살모넬라 갈리나룸은 당업계에 알려져 있는 방법, 예를 들어, 바이러스의 계대배양을 통해 분리될 수 있다.
본 명세서에서 용어 "사균"은 사균백신 또는 사독백신을 모두 포함하는 의미로 사용될 수 있으며, 상기 사균은 세균이나 바이러스를 가열하거나 포르말린이나 페놀 등의 화학약품에 의해서 면역원성을 잃지 않고 병원성을 불활성으로 한 것을 의미하는 것이다. 상기 불활화는 당업계에 알려진 방법이면 제한 없이 사용하여 수행할 수 있고, 바람직하게는 약독화된 살모넬라 갈리나룸 생균을 가열하여 불활화시킨 것일 수 있다.
일 구체예에서, 약독화된 살모넬라 갈리나룸의 사균은 약독화된 살모넬라 갈리나룸 생균을 55 내지 70℃, 30분 내지 3시간 동안 가열하여 불활화시킨 것일 수 있고, 바람직하게는 60 내지 70℃, 1시간 30분 내지 2시간 30분 동안 가열하여 불활화시킨 것일 수 있고, 가장 바람직하게는 65℃, 1시간 동안 가열하여 불활화시킨 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 약독화된 살모넬라 갈리나룸의 생균 및 사균은 백신 조성물 내에 각각 1 x 106 cfu(colony forming unit)/마리 내지 1 x 1010 cfu/마리로 포함될 수 있고, 바람직하게는 1 x 107 cfu(colony forming unit)/마리 내지 1 x 109 cfu/마리로 포함될 수 있다. 보다 바람직하게는, 상기 약독화된 살모넬라 갈리나룸의 생균 및 사균은 백신 조성물 내에 1:100의 균수비로 포함될 수 있으며, 예를 들어, 상기 백신 조성물이 가금에 접종될 때, 약독화된 살모넬라 갈리나룸 생균은 1 x 107 cfu/마리, 사균은 1 x 109 cfu/마리로 접종될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 백신 조성물의 투여량은 닭의 무게, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 달리할 수 있고, 일회 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 약독화된 살모넬라 갈리나룸의 생균 및 사균은 1:1의 부피비로 혼합될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 구체예에서, 상기 백신 조성물은 경구, 경피, 근육 내, 복막 내, 피내, 피하 내 및 비강 경로로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 경로로 투여될 수 있으며, 바람직하게는 근육 내 경로로 투여될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 구체예에서, 상기 조성물은 담체, 희석제 및 보조제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다.
상기 담체는 수의학적으로 허용 가능한 담체일 수 있다. 본 명세서에서 용어 "수의학적으로 허용 가능한 담체"란 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항원 보강제, 안정제, 희석제, 보존제, 항균제 및 항진균제, 등장성 작용제, 흡착 지연제 등을 포함한다. 백신 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제, 희석제로는 락토즈, 덱스트로스, 슈크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 말티톨, 전분, 글리세린, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘포스페이트, 칼슘실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 들 수 있다.
또한, 상기 백신 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형 및 드립(drip) 또는 스프레이 등의 비강용 제형 그리고 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용되는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제할 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 레시틴 유사 유화제에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다.
또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등을 사용할 수 있으며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성제, 현탁제, 유제, 동결건조제제가 포함된다. 비수용성제제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리 에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 비강내 투여를 위한 제제에 적합한 침투제는 일반적으로 당업자에게 공지되어 있다. 그러한 적합한 제형물은 안정성과 순응도를 위해 바람직하게 무균, 등장 및 완충되도록 제형화된다. 비강내 투여를 위한 제제는 또한 정상적인 섬모 작용을 유지시키기 위해 점액 분비를 여러 측면에서 자극하도록 제조되며, 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 18th Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA(1990))에 기술된 바와 같이, 적합한 제형이 바람직하게 등장성의, pH 5.5 내지 6.5를 유지하는 약간 완충된 제형이며, 가장 바람직하게 항미생물 방부제 및 적합한 약물 안정화제를 포함한다.
상기 백신 조성물은 안정제, 유화제, 수산화알루미늄, 인산알루미늄, pH 조정제, 계면활성제, 리포솜, 이스콤 (iscom) 보조제, 합성 글리코펩티드, 증량제, 카복시폴리메틸렌, 서브바이랄 (subviral) 입자 보조제, 콜레라 독소, N,N-디옥타데실-N',N'-비스(2-하이드록시에틸)-프로판디아민, 모노포스포릴 지질 A, 디메틸디옥타데실-암모늄 브로마이드, Marcol-Aracel, Chlorhexidine 및 이의 혼합물로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상의 제2 보조제를 추가로 함유할 수 있다. 바람직하게는 MONTANIDE ISA70 (VG), ISA71 (VG), ISA71R (VG), ISA206 (VG), ISA201 (VG), ISA763 (A VG), IMS1313 (VG N) 또는 GEL01를 사용할 수 있고, 가장 바람직하게는 MONTANIDE ISA70 (VG)을 어쥬번트로 사용할 수 있다.
다른 양상은 살모넬라 갈리나룸(Salmonella Gallinarum)의 생균 및 사균을 포함하는 사료 첨가제를 제공한다.
상기 사료 첨가제는 살모넬라 갈리나룸의 생균 및 사균을 동시에 포함하여, 가금티푸스에 대한 보호 효과뿐만 아니라, 가금의 세포성면역 및 체액성 면역반응 둘 다를 효과적으로 유도하므로, 이를 사료 첨가제로 사용할 경우 가금티푸스의 예방 및 면역증강에 기여할 수 있다.
상기 사료 첨가제는 살모넬라 갈리나룸의 생균 및 사균을 원형 그대로 사용하거나 또는 추가적으로 가금류 사육에 허용되는 곡류 및 그 부산물 등의 공지된 담체, 안정제 등을 가할 수 있으며, 필요에 따라 구연산, 후말산, 아디픽산, 젖산, 사과산 등의 유기산이나 인산나트륨, 인산칼륨, 산성 피로인산염, 폴리인산염(중합인산염) 등의 인산염이나, 폴리페놀, 카테킨, 알파-토코페롤, 로즈마리 추출물, 비타민 C, 녹차 추출물, 감초 추출물, 키토산, 탄닌산, 피틴산 등의 천연 항산화제, 항생물질, 항균제 및 기타의 첨가제 등을 가할 수도 있으며, 그 형상으로서는 분체, 과립, 펠릿, 현탁액 등의 적당한 상태일 수 있으며, 상기 사료첨가제를 공급하는 경우는 가금 등에 대하여 단독으로 또는 사료에 혼합하여 공급할 수 있다.
또 다른 양상은 일 양상에 따른 백신 조성물을 가금에 접종하는 단계를 포함하는 가금티푸스를 예방하는 방법을 제공한다.
일 구체예에서, 상기 가금은 닭, 오리, 칠면조, 거위, 메추리, 꿩 및 기러기로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 가금은 닭일 수 있으며, 보다 바람직하게는 3주령 이하의 병아리일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 양상에 따른 가금티푸스를 예방하는 방법은 상기 백신 조성물을 가금에 접종(예를 들어, 근육 내 경로로 접종)하여, 상기 백신 조성물이 약독화된 살모넬라 갈리나룸의 생균 및 사균을 모두 포함함으로써 살모넬라 갈리나룸에 대한 세포성면역(cell-mediated immunity)뿐만 아니라 체액성면역(humoral immunity) 반응을 유도하여 가금티푸스를 효과적으로 예방할 수 있다.
일 양상에 따른 백신 조성물은 살모넬라 약독백신주의 생균과 사균을 혼합한 생사독백신을 제공함으로써, 생균 또는 사균 단독 접종시보다 강력하고 지속적인 항체가가 유지되어 가금티푸스의 예방 및 경감에 유용하게 사용될 것으로 기대된다.
도 1은 다양한 조건에서 ELISA를 사용하여 측정된 체액성면역 반응의 평가 결과를 나타낸 도이다. A-D는 각각 OmpA-N-L3(A), OmpA-N-L4(B), OMP-l2(C) 및 Omp-ELISA(D)를 사용한 ELISA 결과이며, SG9R은 사균/오일 에멀젼 어쥬번트(OE), 생균 및 사균 혼합(MX), 또는 사균/PBS 현탁액(PS) 조건으로 접종하여 결과를 음성 대조군(CONT)와 비교하였다. *는 음성 대조군과 비교하여 유의한 차이를 나타낸다.
이하 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 생사독 혼합백신의 제조
1-1. 생균백신
백신 균주는 가금티푸스 약독생균백신인 SG9R을 접종한 내역이 있는 국내 가금의 간 및 분변에서 분리하였다. 구체적으로, 본 실험실에 병성감정 의뢰가 된 실용계에서 분리된 살모넬라 갈리나룸 균주를 SNU5161로 명명하였으며, 균 동정 결과 상기 SNU5161은 SG9R과 유전적으로 동일하였다. 해당 약독화 생균 백신주를 액체배지(LB: Difco, USA)에서 150ml, 37℃ 16시간 동안 배양한 후 CFU를 측정하여 1 x 108cfu/ml가 되도록 PBS로 희석하였다.
1-2. 열처리 사독백신의 제조 및 생사독 혼합백신의 제조
상기 실시예 1-1과 마찬가지로, 국내 가금에서 분리된 살모넬라 갈리나룸 약독화 백신주 SNU5161을 액체배지에서 150ml, 37℃로 16시간 동안 배양하였다. 배양한 균을 3000rpm, 20분 동안 원심분리하여 상층액을 버리고 PBS 5ml에 균을 풀어 농축시켰다. 농축시킨 균의 CFU(colony forming unit)를 측정하고 65℃, 2시간 동안 워터 배스(water bath)에 튜브 전체가 잠기도록 중탕하여 불활화를 진행하였다. 2시간 후 워터 배스의 전원을 끄고 중탕한 채로 천천히 식혀 갑작스러운 온도변화에 따른 단백질 구조변화를 방지하였다. 온도가 실온에 도달 시 MHA 배지에 100μl을 접종하여 완전히 불활화가 이루어졌는지 확인한 후, 1 x 1010cfu/ml이 되도록 불활화 균주를 PBS로 희석하였다.
상기 제조한 약독화 생균 및 사균 희석액을 1:1로 섞어 총 200μl로 제조하였다. 즉, 닭에게 접종 시 생균 및 사균은 각각 1 x 107cfu/마리, 1 x 109cfu/마리로 접종되었다. 또한, 생사독 혼합백신의 효과를 관찰하기 위해 비교대조군으로서 오일 에멀젼(oil emulsion)을 어쥬번트로 사용한 사독백신(OE_killed)과 PBS(PS_killed)에 희석만 진행한 사독백신을 제조하였다. PBS에 희석한 사독백신(PS_killed)은 1 x 109cfu/마리로 제조하였고, 오일 에멀젼을 어쥬번트로 사용한 사독백신(OE_killed)은 1 x 1010cfu/ml로 희석한 뒤 ISA70과 3:7로 혼합하여 최종 역가 약 3 x 108cfu/마리로 제조하였다.
실시예 2. 백신 접종 및 채혈
살모넬라 갈리나룸 음성인 3주령 갈색계 닭(병아리)을 구입하였고, 군별로 10수 또는 5수씩 분배하여 총 5개의 실험군 및 대조군으로 구성하였다. 상기 실시예 1에서 제조한 오일 에멀젼을 어쥬번트로 사용한 사독백신(OE_killed), 약독화 생독백신(Live), 생사독 혼합백신(Mix), PBS에 희석한 사독백신(PS_killed) 및 대조군(CONT)의 가금티푸스 예방효과를 평가하기 위하여 백신을 근육 내로 접종하였고, 3주 동안 매주 혈청검사를 수행하였다 [1 week post injection (wpi) ~ 3wpi]. 각 군에 접종한 백신의 용량(dose)과 닭의 수를 하기 표 1에 나타내었다.
백신 종류 용매 용량(cfu/마리) 닭의 수 접종경로
OE_killed PBS adjuvanted with ISA 70 3x108 10 근육
Live PBS 1x107 10
MIX PBS 1x107(Live)+1x109(PS_killed) 10
PS_killed PBS 1x109 5
CONT PBS - 5
실시예 3. 백신 항체가 평가 및 비교
백신 접종에 의한 항체가 상승을 비교 평가하기 위하여 외막 단백질을 항원으로 이용한 ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)를 실시하였다. 살모넬라에서 면역원성이 높다고 알려진 단백질 OmpA에서 균 표면에 노출된 루프(loop) 구조의 아미노산 서열을 합성한 펩티드 2종(L3, L4)을 제조하고, 살모넬라 갈리나룸의 세포외막 단백질(outer membrane protein: OMP) 전체를 소듐 라우릴 사르코신(Sodium lauryl sarcosine)을 사용하여 추출하였다. 제조한 합성 펩티드의 아미노산 서열을 하기 표 2에 나타내었다.
단백질 펩티드(N'-C')
OmpA_N-terminal TKSNV PGGPS (OmpA_L3)
TNNIG DANTI GTR (OmpA_L4)
상기 표 2의 합성 펩티드는 1μg/ml, 전체 OMP는 105ng/ml로 희석하고 100mM 중탄산염 버퍼(bicarbonate buffer, pH 9.6)를 사용하여 4℃, 오버나잇으로 immunoplate Maxi(SPL, Korea)에 코팅하였다. 각 항원으로 코팅이 이루어진 ELISA 플레이트는 Tween-20이 0.5% 함유된 PBS(PBST)로 2회 세척한 후 1% BSA(bovine serum albumin)으로 실온에서 2시간 동안 블로킹하였다. 플레이트를 위와 동일한 방법으로 세척하고, 1차 항체, 즉 혈청 또는 담즙을 1% BSA를 함유하는 PBST에서 1:300으로 희석 후 플레이트에 첨가하여 30분 동안 배양한 뒤, PBST로 4회 세척하였다. 그 후, 각각의 항원과 결합하는 항체에 특이적으로 결합하는 항체인 HRP-conjugated goat-anti chicken IgG 또는 IgA 항체를 1% BSA를 함유하는 PBST에서 1:10,000으로 희석하여 30분 동안 첨가하고, 플레이트를 세척하였다. TMB 기질을 10분 동안 첨가하여 발색을 유도한 후, 정지 용액으로 발색 반응을 정지시킨 뒤 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타낸 바와 같이, OmpA를 이용한 ELISA에서는 OE_killed, Live, Mix 군 모두에서 항체가가 대조군 대비 유의적으로 상승함을 확인하였다. 항체가는 접종 후 시간이 지날수록 떨어졌으나, Mix 군의 경우 접종 후 모든 구간에서 항체가가 대조군 대비 유의적으로 상승하였을 뿐만 아니라, 약독화 생균 단독 접종시(Live)보다도 높은 OD값을 나타냄을 확인하였다(도 1의 A, B). OmpA_L4를 이용한 ELISA에서는 3주차에 Mix 군이 유일하게 대조군 대비 유의하게 높은 항체가를 보임을 확인하였다. 전체 OMP를 이용한 ELISA에서는 OE_killed, Live 및 PS_killed 군 모두 시간이 지날수록 항체가가 상승하며 대조군 대비 유의적인 차이가 관찰되었으나, Mix 군이 다른 그룹 대비 유의적인 차이를 보이지는 않았다.
상기 결과를 통해, 일 양상에 따른 백신 조성물은 살모넬라 약독화주의 생균 및 사균을 모두 포함함으로써 생균 또는 사균 단독 접종시보다 강력하고 지속적인 항체가를 유지시켜, 강화된 체액성 면역으로 기존의 가금티푸스 약독화 생균 백신보다 훨씬 더 강력한 면역반응을 유도할 수 있음을 확인하였다.

Claims (8)

  1. 약독화된 살모넬라 갈리나룸(Salmonella Gallinarum)의 생균 및 사균을 포함하는 가금티푸스 예방용 백신 조성물로서, 상기 생균은 살모넬라 갈리나룸 SG9R과 유전적으로 동일한 살모넬라 갈리나룸 SNU5161이고, 상기 사균은 불활화된 살모넬라 갈리나룸 SNU5161이며, 상기 생균과 사균은 혼합되어 동시에 투여되는 것인 백신 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 약독화된 살모넬라 갈리나룸의 생균 및 사균은 각각 1 x 107 cfu/마리 내지 1 x 109 cfu/마리로 포함되는 것인, 백신 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 약독화된 살모넬라 갈리나룸의 생균 및 사균은 1:1의 부피비로 혼합되는 것인, 백신 조성물.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 백신 조성물은 경구, 경피, 근육 내, 복막 내, 피내, 피하 내 및 비강 경로로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 경로로 투여되는 것인, 백신 조성물.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 백신 조성물은 담체, 희석제 및 보조제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 추가로 포함하는 것인, 백신 조성물.
  6. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항의 백신 조성물을 가금에 접종하는 단계를 포함하는 가금티푸스를 예방하는 방법.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 가금은 닭, 오리, 칠면조, 거위, 메추리, 꿩 및 기러기로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인, 방법.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 가금은 3주령 이하의 병아리인 것인, 방법.
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