JP6196677B2 - 交差防御性サルモネラワクチン - Google Patents
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Description
図1B(研究2 ハダル(Hadar):個々のトリの総排出腔スワッブ)は、研究2における攻撃感染の3日後(●)、5日後(▲)および7日後(◆)に得られたデータを示す。
本発明は、双方の血清群からの血清型に対して十分な防御を提供する、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)血清群C1またはサルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)血清群C2‐3のいずれかのメンバーを含むワクチンを提供する。本発明の特定の実施形態において、該ワクチンは、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)の血清型エンテリティディス(S.Enteritidis)、チフィムリウム(Typhimurium)およびインファンティス(Infantis)の殺菌(例えば、ホルマリンまたは熱失活)鉄制限細胞の液体懸濁液である。より特定の実施形態において、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)の殺菌血清型は、ホルマリンにより殺菌される。当該実施形態の一において、各抗原の最終濃度は、約2x109細胞/mlである。他の実施形態において、ワクチンは約25%(v/v)の水酸化アルミニウムアジュバントを含む。関連する実施形態において、ワクチンは筋肉内投与される。他の関連する実施形態において、ワクチンは最少六週齢で家禽(例えば、鶏)に投与される。
本発明のワクチンおよび/免疫原性組成物は、任意の常法、例えば、限定するものではないが、筋肉内または皮下投与、静脈注射、皮内注射、卵内またはその組み合せ等の非経口投与を含む全身投与によって投与され得る。本発明のワクチンはまた、鼻腔内投与、気管内投与、直腸投与および/または眼投与等の粘膜投与によっても投与され得る。或いはワクチンは、皮膚パッチ、乱切および/または局所投与により投与され得る。本発明のワクチンはまた、受容者の飲料水および/または食物経由を含む経口投与によっても投与され得ることが意図される。
特定の実施形態において、本発明の二つの0.5mlのワクチン投与は、少なくとも四週の間隔を置いて与えられる。特定の実施形態において、最初のワクチン接種の最年少齢は6週齢であり、二回目の投与は産卵の少なくとも3ないし4週前に与えられるべきである。
実施例1
種々のサルモネラ(Salmonella)血清型を含有するワクチンの比較
ワクチンは、サルモネラ・エンテリティディス(Salmonella Enteritidis)(S.エンテリティディス(S.Enteritidis);SE)およびサルモネラ・チフィムリウム(Salmonella Typhimurium)(S.チフィムリウム(S.Typhimurium);ST)(注:S.エンテリティディス(S.Enteritidis)およびS.チフィムリウム(S.Typhimurium)血清型はSALENVAC Tの血清型と同じであった)の不活化血清型だけを含んで、またはサルモネラ・ハダル(Salmonella Hadar)(S.ハダル(S.Hadar);SH)および/またはサルモネラ・インファンティス(Salmonella Infantis)(S.インファンティス(S.Infantis);SI)の不活化血清型との組み合わせを含んで調製された。血清型のすべては鉄制限培地で増殖し、使用前にホルマリンで不活性化した。研究に使用したワクチン組成物を表1に記載する。
総排出腔スワッブからの単離の結果は、各々のトリに対する個々のポイントとして図1A〜1Cに示し、攻撃感染血清型のlog10cfu/gを表示する。各群の平均計数値は、明確にするために実線で繋いで示す。図2A〜2Bおよび図3A〜3Cの死後試料単離の結果は、攻撃感染の単離に関し陽性であった試料のパーセンテージとして表す。研究1において、試料は、各群のいくつかのトリからは攻撃感染の死後7日に、および残りからは死後14日に採取した。
研究1:図1Aは、S.ハダル(S.Hadar)による攻撃感染後の3日と5日の間に、対照トリからの排出がlog10で約3に維持され、5日目にすべてのトリが直接培養で陽性であったことを示す。S.インファンティス(S.Infantis)と共に製剤化された三価ワクチン(SE/ST/SI)を含めて、ワクチン接種した群であるSE/ST/SI、SE/ST/SHおよびQuad 1(上の表1を参照されたい)のすべてについて、平均排出は経時的に減少し、直接培養で陰性のトリの数が増加した。同種ワクチン(SE/ST/SH)が最も急激な減少を示したが、一方で四価ワクチン(Quad 1)が最多数の陰性のトリを有した。
研究1において、7日目にすべての群の大部分のトリからの盲腸内容物が陽性であった(図2Aを参照されたい)。肝臓において、各三価ワクチンは、どの試料も直接陽性でない程度までに浸潤を減少させた。直接陽性である脾臓試料の割合の減少は、血清型特異的効果を示しているように思えるが、ここでS.ハダル(S.Hadar)細胞を含有する三価ワクチンおよび四価ワクチンだけが減少を示した。攻撃感染14日後に採取された任意の肝臓または脾臓試料からの陽性の試料は、ほとんど存在しなかった。
S.インファンティス(S.Infantis)攻撃感染後排出に対する有効性
研究1および2において、S.インファンティス(S.Infantis)が対照のトリの盲腸に定着するという明確な兆候は存在しなかった。攻撃感染7日後までに、直接培養による陽性のトリは存在しなかった。研究3において、各日における群間の平均計数値の差異は小さかったが、しかし四価ワクチン1および2は、攻撃感染3日後に対照およびQuad 3の双方と比較して直接培養における陽性のトリはより少なかった。以下の表4を参照されたい。計数値は各群において5日目から7日目までに顕著に増加し、攻撃感染の投与量が防御を打ち破るほどに十分高かったことを示している。
研究1のS.インファンティス(S.Infantis)による攻撃感染7日後に、ワクチン接種群のいずれにおいても、陽性の盲腸内容物試料は対照と比較してより少なかったが、対照からの陽性の肝臓および脾臓の割合は低すぎて意味のある解析を成し得なかった(図3Aを参照されたい)。攻撃感染14日後の脾臓試料のデータは、対照と比較して四価群(Quad 1)からの陽性の試料の割合の減少を示した(図3Bを参照されたい)。
S.ハダル(S.Hadar)またはS.インファンティス(S.Infantis)により4日齢時に攻撃感染されたブロイラー鶏における受動防御
親ドリを、Rehydrogel(登録商標)25%と共に、E.エンテリティディス(S.Enteritidis)+S.チフィムリウム(S.Typhimurium)+S.インファンティス(S.Infantis)の組み合わせワクチンによりワクチン接種し、もしくは未接種のまま対照として放置した。ワクチン接種した雌鶏またはワクチン未接種の雌鶏の卵から孵化した4日齢のブロイラー鶏は、これら2つの異なる血清型に対する受動防御を試験するために、S.ハダル(S.Hadar)またはS.インファンティス(S.Infantis)により攻撃感染した。
S.エンテリティディス(S.Enteritidis)、S.チフィムリウム(S.Typhimurium)およびS.インファンティス(S.Infantis)(SE/ST/SI)の組み合せワクチンを接種された親群、またはワクチン接種されなかった親群からの卵は、孵化したひな鳥の由来が確認できることを保証するために分離して保存し、孵化しさらにインキュベートした。一日齢時にひな鳥は、ワクチン接種トリからの15羽からなる四群およびワクチン未接種トリからの四群に割り当て、各群について別々に収容した。トリは、適切なサルモネラ(Salmonella)菌株および投与量により、群の割り当てに従って4日齢時に攻撃感染した(以下の表6を参照されたい)。
S..ハダル(S.Hadar)による攻撃感染後:
対照群と比較しての、ワクチン接種群からの排出における減少または盲腸の単離における差異は、どちらの攻撃感染投与量についても見出されなかった。
S.インファンティス(S.Infantis)による103cfuでの攻撃感染は、初期には3日目におけるワクチン接種群からの排出の減少を示したが、しかしながら群間のこの差異は、後の採取日に減少した。より高い投与レベルの攻撃感染(105cfu/投与)は、すべての時点にわたりワクチン接種群に関し排出の減少を示さなかった。ほとんどすべての盲腸試料は陽性であった。
ワクチン群は、双方のS.ハダル(S.Hadar)の攻撃感染レベルで、対照と比較して総排出腔排出(排出数および陽性の試料数)または盲腸内容物試料における減少を示さなかった。しかしながら双方の攻撃感染レベルにおけるワクチン群は、より低い攻撃感染レベル(102cfu)における攻撃感染10日後に見られる最大の差異を示して、器官への定着における減少を示した。従って、器官への定着を減少させることに関し、S.ハダル(S.Hadar)攻撃感染に対する交差防御の証拠が、S.インファンティス(S.Infantis)に対し受動免疫されたひな鳥において認められた。
14週齢の産卵鶏におけるS.ハダル(S.Hadar)攻撃感染に対する三価ワクチンの効力試験
要約
6週齢のSPF由来の産卵鶏型ひな鳥は、鉄制限条件下で増殖された同数のS.エンテリティディス(S.Enteritidis)、S.チフィムリウム(S.Typhimurium)およびS.インファンティス(S.Infantis)のホルマリン殺菌細胞を含有する三価ワクチンにより免疫した。二回目のワクチン投与は10週齢時に与えた。二回目のワクチン接種の四週後にトリおよびワクチン未接種のコホート(同齢集団)は、S.ハダル(S.Hadar)により経口ルートによって攻撃感染し、攻撃感染菌株の排出は総排出腔スワッブ検査によってモニターした。攻撃感染細菌の臓器への転移は、攻撃感染の10日後および14日後のトリの死後の検査によって究明した。
● 攻撃感染後の異なる採取日におけるワクチン接種トリ由来の新鮮な糞便試料中のS.エンテリカ(S.enterica)血清型ハダル(Hadar)の数は、採取の各時点で対照トリよりもワクチン接種トリにおいて低かった;経時的に合計排出を比較した場合、ワクチン接種トリによって排出された細菌数は、対照トリによるよりも有意に低かった。
SPF由来の産卵鶏は、共通の正常な腸内フローラを発達させるために、通常の鶏の飼育施設において研究の攻撃感染段階まで数週間一群として飼育した。55羽のトリは、胸筋肉内投与の0.5mlのワクチンにより6週齢時にワクチン接種した。四週後に、同じルートでワクチンの二回目の投与を行った。52羽のトリは、対照群としてワクチン未接種のままとした。攻撃感染投与時前にトリは、その独立した群において床飼いで収容するために封じ込め施設に移動した。
ワクチンは、S.チフィムリウム(S.Typhimurium)、S.エンテリティディス(S.Enteritidis)およびS.インファンティス(S.Infantis)の各々の鉄制限、ホルマリン殺菌細胞の1.5x109細胞、および水酸化アルミニウムアジュバントを含んだ。ワクチンは、使用前に無菌試験および分析試験に合格した。
トリは、微好気性環境下、37℃での一晩培養液から調製したばかりの、S.ハダル(S.Hadar)PT16株の3.8x108c.f.u.によりそれぞれ攻撃感染した。
雌雄混合、初回ワクチン接種時6週齢のSPF白色レグホン産卵鶏。
環境試料の試験:
敷きわら試料は、檻の床の少なくとも異なる五カ所から糞便物質の試料を無菌容器に採取することによって、ワクチン接種時および攻撃感染時におけるサルモネラ(Salmonella)の存在に関する試験を行った。糞便物質は、1:10(w/v)の糞便対培養液の比率で緩衝ペプトン水に懸濁し、37℃で24時間までインキュベートした。ブロスの増殖液試料100μlを、ラパポート・バシリアディス(RV)ブロス10mlに接種し、42℃で72時間までインキュベ―トした。各RVブロス増殖液の一白金耳をBrilliance(登録商標)サルモネラ(Salmonella)選択培地(Oxoid)に接種し、37℃で24時間までインキュベートした。いかなるサルモネラ(Salmonella)の存在も藤色のコロニーの存在によって明らかにされた。いかなる疑わしいコロニーも血清学的同定によって確認した。環境からのサルモネラ(Salmonella)の単離は、研究を無効としたであろう。
血液試料を、攻撃感染前に各々の研究トリの径脈から採取した。血清試料は、内製のELISAを使用してS.チフィムリウム(S.Typhimurium)、S.エンテリティディス(S.Enteritidis)およびS.インファンティス(S.Infantis)に対する抗体の存在に関する試験を行った。該アッセイは、関連する血清型のサルモネラ(Salmonella)細胞から調製された鞭毛により前もって被覆されたマクロタイタープレート上での試験および対照血清の希釈液のインキュベーションを含んだ。洗浄後、結合した抗体は、基質とのインキュベーションが後に続く、ペルオキシダーゼに共役した抗ニワトリIgY抗体を使用して検出した。発色を酸により停止し、450nmで光学密度を読み取った。抗体レベルは、各々の血清型について対照血清と比較して算出した。
総排出腔スワッブおよび肝臓および脾臓の死後の試料は、実施例1に記載した通り攻撃感染細菌の存在に対して検査した。
総排出腔スワッブからの糞便グラム当たり単離されるサルモネラ(Salmonella)の数は、直接培養からの単離より算出した。集積後の各群からの陽性の試料の数もまた記録した。
サルモネラ・ハダル(Salmonella Hadar)攻撃感染菌株の排出‐総排出腔スワッブ結果;
攻撃感染後の総排出腔スワッブからの各時点における回収されたサルモネラ(Salmonella)の幾何平均数を算出した。盲腸内容物グラム当たりの計数値のlog10を算出し、各群についての各時点での平均を算出した(図4および表10を参照されたい)。
各時点において、直接培養からおよび合計としての双方において、ワクチン接種群からよりもワクチン未接種トリからより多くの陽性の試料が存在した。
本研究の目的は、異種性のS.ハダル(S.Hadar)の攻撃感染に対するサルモネラ三価ワクチンの有効性を証明することであった。
Claims (3)
- 家禽のサルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)血清群C2‐3感染に起因する障害に対する防御用の、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)血清群C1の血清型及び水酸化アルミニウムアジュバントを含むワクチン組成物であって、
該ワクチン組成物は、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)血清群Bの血清型及びサルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)血清群Dの血清型と組み合わせて用いられ、
ここで、該ワクチン組成物は、前記サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)血清群C1の血清型、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)血清群Bの血清型及びサルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)血清群Dの血清型の、ホルマリン殺菌、鉄制限細胞の液体懸濁液であり、
該サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)血清群C1の該血清型は、血清群C1およびC2−3の双方に対する交差防御を有することを特徴とする、ワクチン組成物。 - さらに鳥類の鼻気管炎、伝染性気管支炎ウイルス、ニューカスル病ウイルスおよびエッグドロップ症候群ウイルスの一または複数の菌株の使用を含む、請求項1に記載のワクチン組成物。
- サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)血清群C2‐3感染、またはサルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)血清群C2‐3およびサルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)血清群C1感染に起因する障害を防御するための家禽への投与用ワクチンの製造における、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)血清群C1の血清型の使用であって、
該サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)血清群C1の該血清型が不活性化されていることを特徴とする、使用。
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