KR20080033411A

KR20080033411A - 로소니아 백신 및 이의 사용 방법

Info

Publication number: KR20080033411A
Application number: KR1020087003723A
Authority: KR
Inventors: 제리미 제이 크롤; 마이클 비 루프
Original assignee: 베링거잉겔하임베트메디카인코퍼레이티드
Priority date: 2005-07-15
Filing date: 2006-07-17
Publication date: 2008-04-16
Also published as: SG163598A1; RU2420310C2; WO2007011993B1; EP1917031A1; AU2006269965A1; DK2204184T3; WO2007011993A1; BRPI0613039A2; TW200744631A; CA2615389A1; US20070014815A1; MX2008000349A; JP2009501730A; ES2630023T3; RU2008105348A; US20130164332A1; AR054844A1; EP2204184B1; EP2204184A1; US8398994B2

Abstract

본 발명은 회장염에 대한 증가된 보호를 위한 향상된 백신접종 방법을 제공한다. 상기 방법은 10 내지 26일령의 새끼 동물, 바람직하게는 새끼돼지를 백신접종시키는 방법, 임신한 암퇘지를 임신 제2 또는 제3기 동안 백신접종시키는 방법, 및 이러한 방법의 조합을 제공한다. 임신한 암퇘지의 백신접종은 분만 전에 로소니아 항원의 반복 투여 및/또는 고용량 투여를 사용하여 실시할 수 있다.

로소니아 인트라셀룰라리스, 회장염, 돼지 증식성 장염, 로소니아 백신

Description

로소니아 백신 및 이의 사용 방법{Lawsonia vaccine and methods of use thereof}

관련 출원

본 출원은 설명 및 내용이 본원에 참조로서 인용된 2005년 7월 15일자 미국 가출원 제60/699,946호의 이익을 주장한다.

본 발명은 광범위하게, 편성(obligate) 세포내 세균인 로소니아 인트라셀룰라리스(Lawsonia intracellularis)(로소니아 또는 엘.인트라셀룰라리스)에 의해 발생하는, 회장염으로 알려진 돼지 증식성 장염(porcine proliferative enteritis)에 대한 면역화를 위한 향상된 백신접종 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 임신한 암퇘지를 백신접종시키고; 임신한 암퇘지를 백신접종시키고 나서 이들의 새끼 돼지를 생후 약 3주 이내에 백신접종시키고; 새끼 돼지를 생후 25 또는 26일 이내에 백신접종시키는 방법으로 각각, 엘.인트라셀룰라리스에 대한 증가된 보호를 제공하는 방법을 제공한다.

선행 기술에 관한 설명

돼지 증식성 장염(PPE)은 이유기 내지 자돈기, 성돈기의 돼지에 영향을 줄 수 있는 자연적으로 발생하는 질병이다. 원인균은 로소니아 인트라셀룰라리스인 것으로 확인되었고, 이는 편성 세포내 그람 음성 세균으로서, 일반적인 미생물학적 방법으로는 통상의 무세포 배지에서 배양시킬 수 없고, 성장을 위하여 세포를 필요로 하는 것으로 생각된다. 문헌[참조: S. McOrist et al., Infection and Immunity, Vol. 61, No. 19, 4286-4292 (1993) 및 G. Lawson et al., J. of Clinical Microbiology, Vol. 31, No. 5, 1136-1142 (1993)]에는 통상적인 조직 배양 플라스크에서 IEC-18 래트 장 상피 세포 단층을 사용한 엘.인트라셀룰라리스의 배양이 논의되어 있다. 전문이 본원에 참조로서 인용된 미국특허 제5,714,375호 및 제5,885,823호에는, 현탁된 숙주 세포에서의 엘.인트라셀룰라리스의 배양이 기술되었다.

엘.인트라셀룰라리스의 병원성 및 비병원성 약독화된 세균 균주는 당업계에 익히 공지되어 있다. 예를 들면, 국제공개공보 제WO 96/39629호 및 제WO 05/011731호에는 엘.인트라셀룰라리스의 비병원성 약독화된 균주가 기술되어 있다. 엘.인트라셀룰라리스의 추가적인 약독화된 세균 균주는 제WO 02/26250호 및 제WO 03/00665호로부터 공지되어 있다. 이러한 각각의 참조문헌의 설명 및 내용은 본원에 참조로서 인용된다.

상기 질병은 육안 및 현미경적 병리검사에 의해 처음으로 특성이 규명되었고, 이후, 감염된 세포 내의 세포내 세균의 입증에 의해 특성이 규명되었다. 상기 질병의 특징적인 병리학적 특성은 회장(소장의 말단 부분), 대장 또는 둘다의 음와(crypt)에서 미성숙 상피 세포가 증식하는 것이다. 감염된 조직의 절편은 "정원 호스(garden hose)"를 닮은 붉고 비후된 점막 및 장 병변을 특징으로 한다. 장 비후는 결국 정상적인 장 기능, 흡수 능력 및 영양소 전달을 방해한다. 상기 질병의 임상적 영향은 만성 체중 감소, 수척(unthriftiness), 설사 및 사망이다. 상기 질병은 감염된 동물에서 사망 손실, 증가된 약물 비용, 낮은 체중 증가 및 감소된 사료 전환율로 인해 경제적으로 중요하다. 회장염의 임상 증례는 6 내지 20주령의 돼지에서 가장 현저하게 관찰된다. 하지만, 엘.인트라셀룰라리스의 존재가 최근에 이유돈(3 내지 4주령)에서 (PCR에 의해) 확인되어, 엘.인트라셀룰라리스 노출이 자돈기에 발생하고 아마도 로소니아-양성 모돈으로부터 비롯된다는 것을 시사하였다[참조: Mauch and Bilkei (2004) Vet Rec 155: 532; Marsteller et al. (2003). Swine Health Prod 11:127-130; Stege et al. (2004). Vet Micro 104: 197-206]. 이러한 관찰은 백신접종과 같은 예방 전략을 보다 초기에 생산 시스템에 도입시켜야 하는 중요성을 강조한다.

회장염에 대한 면역화를 위한 현재의 백신접종 전략에는 3주령 이상의 로소니아-비경험(naive) 돼지에만 백신을 경구 투여하는 것이 포함되고, 이는 이 연령 그룹 미만의 새끼돼지는 이전의 암퇘지의 노출 또는 백신접종으로 인해 엘.인트라셀룰라리스에 대해 양성인 모계 항체를 가질 수 있기 때문이다. 본 발명의 방법 이전에는, 모계 항체 또는 다른 유선자극(lactogenic) 인자의 존재는 이러한 새끼돼지에서 백신접종의 효능을 잠재적으로 방해할 수 있다고 생각되었고, 이는 새끼 돼지의 면역 시스템이 백신을 인식하고 자신의 항체를 분비할 수 있기 전에 모계 항체가 백신을 중화시키는 능력을 갖기 때문이었다. 그러므로, 새끼 돼지의 백신접종은 모계 면역에 직면하여 실시되지 않았다.

발명의 요약

본 발명은 선행 기술의 부족한 부분을 극복하여 회장염에 대한 증가된 돼지 보호를 제공하는 새로운 방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 면역학적 유효량의 백신을 암퇘지 및/또는 생후 수주 내의 새끼 돼지에게 투여하여 회장염에 대해 면역화시키는 방법을 제공한다. 모계 면역은 로소니아에 대해 백신접종되거나 노출된 암퇘지로부터 새끼돼지에게 전달되어, 6주령 이상의 새끼돼지에서 회장염에 대한 다소의 보호를 제공한다는 것이 밝혀졌다. 하지만 백신접종되지 않은 경우, 빠르게 상기 질병에 대해 감염되기 쉬워진다. 본 발명의 방법은, 임신한 동물에서 백신을 반복 투여 후 고용량으로 사용하는 것은, 임신 제2 또는 제3기 동안 투여하는 경우에도, 모계 면역을 제공하는데 매우 안전하고 효과적이라는 것을 증명하였다.

따라서 본 발명은 일반적으로, 엘.인트라셀룰라리스 항원으로 백신접종하여 임신한 동물(바람직하게는 돼지)을 엘.인트라셀룰라리스 감염에 대해 백신접종시키는 방법에 관한 것이다. 추가적인 양상에 있어서, 백신접종은 엘.인트라셀룰라리스 항원의 고용량 및/또는 반복 투여로 실시한다. 또다른 양상에 있어서, 본 발명은, 임신 제2 또는 제3기 동안, 바람직하게는 엘.인트라셀룰라리스 항원의 고용량 및/또는 반복 투여로 백신접종하여 임신한 동물(바람직하게는 돼지)을 엘.인트라셀 룰라리스 감염에 대해 백신접종시키는 방법에 관한 것이다.

바람직한 양태에서, 임신한 암퇘지에게 로소니아 백신을 분만 전에 1회 이상, 바람직하게는 분만 전에 2회, 그리고 가장 바람직하게는 분만 전에 3회("반복 투여") 투여하여, 회장염에 대해 돼지를 백신접종시키는 방법이 제공된다. 일부 형태에서, 임신한 암퇘지를 고용량의 엘.인트라셀룰라리스 항원으로 백신접종시킨다. 백신을 암퇘지에게 3회 투여하는 경우, 제1의 투여는 분만하기 50 내지 60일 전, 바람직하게는 분만하기 52 내지 58일 전, 그리고 가장 바람직하게는 분만하기 54 내지 56일 전에 실시해야 한다. 제2의 투여는 분만하기 30 내지 40일 전, 바람직하게는 분만하기 32 내지 38일 전, 그리고 가장 바람직하게는 분만하기 34 내지 36일 전에 실시해야 한다. 최종 투여는 분만하기 10 내지 20일 전, 바람직하게는 분만하기 12 내지 18일 전, 그리고 가장 바람직하게는 분만하기 14 내지 16일 전에 실시해야 한다. 암퇘지가 출산한 후, 백신을 각각의 새끼돼지에게 이유 후부터 도살시까지 투여하지만, 바람직하게는 3주령이 되기 전에, 임의의 경우에, 적어도 10 내지 각각 25 및 26일령 (바람직하게는 16 내지 26일령), 가장 바람직하게는 10 내지 21일령, 보다 더 바람직하게는 15 내지 21일령, 그리고 가장 바람직하게는 19 내지 21일령 이내에 투여한다. 이 방법의 또다른 양태에서, 백신을 각각의 새끼돼지에게 26일령 전에, 바람직하게는 16 내지 26일령, 보다 바람직하게는 18 내지 24일령, 보다 더 바람직하게는 19 내지 22일령, 그리고 가장 바람직하게는 21일령일 때 투여한다.

따라서, 또다른 양태에서, 본 발명은 임신한 암퇘지 뿐만 아니라 분만된 새 끼돼지를 백신접종시키는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 임신한 암퇘지 및 분만된 새끼돼지를 상기한 바와 같이 백신접종시킨다.

예상외로 모계 면역은 분만 직후 새끼돼지의 성공적인 백신접종을 방해하지 않으며, 사실상, 본원에서 기술한 바와 같이, 약 3주령 이내에 백신접종된 새끼돼지는 비-백신접종된 새끼돼지와 비교하여 상기 질병과 관련된 병리소견이 육안상 감소한다는 것이 추가적으로 밝혀졌다.

따라서 본 발명은 약 3주령 이내의 새끼 동물(바람직하게는 새끼 돼지)의 엘.인트라셀룰라리스 감염에 대한 백신접종 방법에 관한 것이다. 바람직하게는, 이러한 새끼 동물(바람직하게는 새끼 돼지)을 21±5일령 이내에 백신접종시킨다. 보다 바람직하게는, 이러한 새끼 동물(바람직하게는 새끼 돼지)을 10 내지 각각 25 및 26일령 이내에 백신접종시킨다. 보다 바람직하게는, 이러한 새끼 동물(바람직하게는 새끼 돼지)을 10 내지 21일령 이내에 백신접종시킨다. 보다 바람직하게는, 이러한 새끼 동물(바람직하게는 새끼 돼지)을 12 내지 21일령 이내에 백신접종시킨다. 보다 더 바람직하게는, 이러한 새끼 동물(바람직하게는 새끼 돼지)을 15 내지 21일령 이내에, 가장 바람직하게는 19 내지 21일령 이내에 백신접종시킨다. 이 방법의 또다른 양태에서, 백신을 각각의 새끼돼지에게 26일령 전에, 바람직하게는 16 내지 26일령, 보다 바람직하게는 18 내지 24일령, 보다 더 바람직하게는 19 내지 22일령, 그리고 가장 바람직하게는 21일령일 때 투여한다. 본 발명에 따라 사용하기 위한 백신은 엘.인트라셀룰라리스에 대한 보호를 제공하는 임의의 백신일 수 있다. 바람직하게는, 백신은 살아있는 엘.인트라셀룰라리스 백신이다. 가장 바람직 하게는, 백신은 Enterisol® Ileitis B3903[판매원: Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc.]이다.

백신은 동물, 바람직하게는 포유동물, 그리고 보다 바람직하게는 돼지에게, 임의의 통상적인 방법으로, 가장 바람직하게는 경구 음약(oral drench)을 통해 투여된다.

투여될 용량은 특정 경우에 따라 달라질 것이지만, 임의의 경우에, 이는 회장염에 대한 보호 항체 및/또는 세포 매개 면역 반응을 유도하는데 충분한 양이다. 적당한 용량은 과도한 실험 없이 당업계에 공지된 수단으로 결정가능하며, 주로 대부분 사용되는 특정 백신을 조건으로 할 것이다. 많은 경우에, 적당한 용량은 0.1ml 내지 10ml, 그리고 바람직하게는 약 1ml 내지 5ml의 범위이다. Enterisol® Ileitis의 경우에, 용량은 바람직하게는 돼지 당 2ml 이상이다. 용량은 또한 비수성 백신접종의 경우에는 돼지의 체중 당 건조 중량으로 계산할 수 있다.

아래의 실시예에 제시된 연구는, 로소니아 인트라셀룰라리스에 노출된 및 로소니아-음성 암퇘지로부터 유래된 돼지에서 백신 효능을 평가하기 위하여 수행하였다. 또한, 연구를 통해 3주령인 새끼돼지의 백신접종으로부터 발생하는 임의의 모계 간섭이 존재하는지의 여부를 평가하였다.

본원에서 사용되는 "백신접종" 또는 "백신접종시킨다"라는 용어는 엘.인트라셀룰라리스 항원을 동물에게 투여하는 것을 포함하는 과정을 의미하지만, 이에 제한되는 것은 아니고, 상기 엘.인트라셀룰라리스 항원은 상기 동물에게 투여되는 경우, 상기 동물에서 엘.인트라셀룰라리스에 대해 면역 반응을 유도하거나 유도할 수 있다.

본원에서 사용되는 "동물"이라는 용어는 조류, 어류, 및 소, 돼지, 말 및 영장류와 같은 포유동물을 의미하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 하지만, 본 발명의 한가지 바람직한 양태에 있어서, 동물은 돼지이고, 바람직하게는 10 내지 각각 25 및 26일령, 바람직하게는 10 내지 21일령, 보다 바람직하게는 15 내지 21일령, 그리고 가장 바람직하게는 19 내지 21일령의 새끼돼지이다. 또다른 바람직한 양태에서, 새끼돼지는 26일령 미만, 바람직하게는 16 내지 26일령, 보다 바람직하게는 18 내지 24일령, 보다 더 바람직하게는 19 내지 22일령, 그리고 가장 바람직하게는 21일령이다.

본원에서 사용되는 "유효량" 또는 "효능량"이라는 용어는 상기 유효량의 엘.인트라셀룰라리스 항원이 투여된 동물에서 면역 반응을 유도하거나 유도할 수 있는 항원의 양을 의미하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

조성물 또는 백신에 대한 "면역학적 또는 면역 반응"은 숙주에서 관심대상의 조성물 또는 백신에 대한 세포 및/또는 항체 매개 면역 반응이 발생하는 것이다. 따라서, "면역 반응을 유도하거나 유도할 수 있다"는 용어는, 상기 숙주에서 관심대상의 조성물 또는 백신에 대한 세포 및/또는 항체 매개 면역 반응이 발생하는 것을 특징으로 하는 숙주에서의 면역학적 과정을 의미하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 일반적으로, "면역 반응"에는 하나 이상의 다음의 효과가 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다: 관심대상의 조성물 또는 백신에 포함된 항원(들)에 대해 특이적으로 반응하는, 항체, B 세포, 헬퍼 T 세포, 억제 T 세포 및/또는 세포독성 T 세포 및/또는 yd T 세포의 생산 또는 활성화. 바람직하게는, 숙주에서 치료 또는 보호 면역학적 반응을 보여, 신규 감염에 대한 내성이 향상되고/되거나 질병의 임상적 중증도가 감소할 것이다. 이러한 보호는 상기한 바와 같은 숙주 감염과 관련된 증상의 감소(예: 중증도의 감소) 또는 결여에 의해 증명될 것이다.

동물에서 면역 반응을 유도하는데 효과적이거나 면역반응을 유도할 수 있는 항원의 양은 백신의 성분 및 투여 스케줄에 따라 달라진다. 통상적으로, 죽인 세균 항원을 백신 중에 사용하는 경우, 백신은 용량 당 약 10³ 내지 약 10⁹개의 세균, 바람직하게는 용량 당 약 10⁴ 내지 약 10⁸개의 세균, 그리고 보다 바람직하게는 용량 당 약 10⁵ 내지 약 10⁶개의 세균의 양을 함유한다.

특히, 변형된 살아있는 엘.인트라셀룰라리스 세균, 예를 들면, 세균 분리주, 즉 B3903으로 명명된 분리주인 ATCC 수탁번호 PTA-4926 및 N34NP40wk로 명명된 분리주인 ATCC 수탁번호 55783 (둘다 국제공개공보 제WO 96/39629호 및 제WO 05/011731호에 기술되어 있음)을 백신 중에 사용하는 경우, 감수성 동물에 투여될 권장 용량은 바람직하게는 약 3.0 TCID₅₀(조직 배양 감염 용량 50% 종말점)/용량 내지 약 6.0 TCID₅₀/용량이고, 보다 바람직하게는 약 4.0 TCID₅₀/용량 내지 약 5.0 TCID₅₀/용량이다. 바람직한 양태에서, 백신의 역가는 조직 배양 감염 용량 50% 종말점(TCID₅₀) 희석 검정으로 측정된 바에 의하면 약 4.9 TCID₅₀/용량이다.

서브유닛 백신은 일반적으로 용량 당 0.2㎍ 항원 이상의 항원 포함 수준으로, 바람직하게는 약 0.2 내지 약 400㎍/용량으로, 보다 바람직하게는 약 0.3 내지 약 200㎍/용량으로, 보다 바람직하게는 약 0.35 내지 100㎍/용량으로, 보다 바람직하게는 약 0.4 내지 50㎍/용량으로, 보다 바람직하게는 약 0.45 내지 30㎍/용량으로, 보다 바람직하게는 약 0.6 내지 15㎍/용량으로, 보다 바람직하게는 약 0.75 내지 8㎍/용량으로, 보다 더 바람직하게는 약 1.0 내지 6㎍/용량으로, 그리고 보다 더 바람직하게는 약 1.3 내지 3.0㎍/용량으로 투여된다.

일반적으로, 정제된 세균을 사용하는 경우, 항원의 양은 5 내지 5000㎍일 것이고, 10^2.0 내지 10^9.0 TCID₅₀, 바람직하게는 10^3.0 내지 10^6.0 TCID₅₀, 그리고 보다 바람직하게는 10^4.0 내지 10^5.0 TCID₅₀일 것이다.

본원에서 사용되는 "고용량"이라는 용어는 일반적으로, 성체 동물의 백신접종에 일반적으로 사용되는 단일 용량의 3배 이상의 항원의 양을 의미한다. 특히, "고용량"이라는 용어는, 살아있는 변형된 엘.인트라셀룰라리스의 경우, 적어도 3 x 10^3.0 내지 3 x 10^9.0 TCID₅₀, 바람직하게는 약 3 x 10^4.5 내지 3 x 10^6.0 TCID₅₀의 양을 의미한다. 특히, "고용량"이라는 용어는, 죽인 엘.인트라셀룰라리스 항원의 경우, 적어도 3 x 10^4.0 내지 3 x 10^9.0개의 유기체 또는 세균, 바람직하게는 약 3 x 10^6.0 내지 3 x 10^8.0개의 유기체 또는 세균의 양을 의미한다. 특히, "고용량"이라는 용어는, 임의의 서브유닛 엘.인트라셀룰라리스 항원의 경우, 적어도 3 x 0.2 내지 약 3 x 400 (0.6 내지 약 1200) ㎍/용량의 양을 의미한다. 본 출원에서, 고용량의 엘.인트라셀룰라리스 항원을 임신한 암퇘지에 투여하여 임신한 암퇘지에서 상승된 면역학적 반응을 유도하였고, 이는 자손에게 전달되어 분만된 새끼돼지에게 어느 정도 수준의 면역이 제공될 것이다.

본원에서 사용되는 "반복 투여"라는 용어는 2회 이상, 바람직하게는 3회의 엘.인트라셀룰라리스 항원의 투여를 의미한다. 임신한 암퇘지에 대한 "반복 투여" 백신접종 방법의 예는 위에 주어져 있다.

본원에서 사용되는 "증가된 보호"라는 용어는, 비-백신접종된 동물 대조군과 비교하여 백신접종된 동물군에서, 엘.인트라셀룰라리스 감염과 관련된 하나 이상의 임상적 증상 및/또는 병변 발생의 중증도 또는 빈도 (예: 실시예 1에서 정의된 기준에 따른 방법으로 측정된 육안 병변의 빈도 등)의 통계적으로 유의적인 감소를 의미하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. "임상적 증상의 통계적으로 유의적인 감소"라는 용어는, 백신접종된 동물군에서 하나 이상의 임상적 증상 및/또는 병변 발생의 발생 빈도가, 감염성 엘.인트라셀룰라리스 세균으로 시험감염(challenge)한 후, 비-백신접종된 대조군에서보다 적어도 20%, 바람직하게는 30%, 보다 바람직하게는 40%, 보다 바람직하게는 50%, 보다 바람직하게는 60%, 보다 바람직하게는 70%, 보다 바람직하게는 80%, 보다 더 바람직하게는 90%, 그리고 가장 바람직하게는 95% 낮은 것을 의미하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

본원에서 사용되는 "엘.인트라셀룰라리스" 또는 "로소니아"라는 용어는, 각각 전문이 본원에 참조로서 인용된 문헌[참조: C. Gebhart et al., Int'l. J. of Systemic Bacteriology, Vol. 43, No. 3, 533-538 (1993) 및 S. McOrist et al., Int'l. J. of Systemic Bacteriology, Vol. 45, No. 4, 820-825 (1995)]에 상세히 기술된 세포내 만곡형(curved) 그람 음성 세균을 의미하고, 국제공개공보 제WO 96/39629호 및 제WO 05/011731호에 기술된 분리주가 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 특히, "엘.인트라셀룰라리스"라는 용어는 또한, 부다페스트 조약 하에 기탁기관[American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209]에 기탁되어 ATCC 수탁번호 PTA 4926 또는 ATCC 수탁번호 55783을 부여받은 분리주를 의미하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 두 분리주는 각각 국제공개공보 제WO 96/39629호 및 제WO 05/011731호에 기술되어 있다. "엘.인트라셀룰라리스"라는 용어는 또한, 바람직하게는 국제공개공보 제WO 96/39629호 및 제WO 05/011731호에 기술된 하나 이상의 엘.인트라셀룰라리스 균주의 면역원성 특성을 갖고, 특히 부다페스트 조약 하에 기탁기관[American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209]에 기탁되어 ATCC 수탁번호 PTA 4926 또는 ATCC 수탁번호 55783을 부여받은 하나 이상의 분리주의 면역원성 특성을 갖는, 임의의 다른 엘.인트라셀룰라리스 균주 또는 분리주를 의미하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

균주 또는 분리주는, 국제공개공보 제WO 06/01294호에 기술된 하나의 항-엘.인트라셀룰라리스 특이적 항체를 사용하여, 마찬가지로 제WO 06/01294호에 기술된 검출 검정에서 적어도 검출가능한 경우, 제WO 96/39629호 및 제WO 05/011731호에 기술된 하나 이상의 엘.인트라셀룰라리스 균주의 "면역원성 특성", 특히 ATCC 수탁번호 PTA 4926 또는 ATCC 수탁번호 55783으로서 기탁된 분리주의 "면역원성 특성"을 갖는다. 바람직하게는 이러한 항체는 참조번호가 301:39, 287:6, 268:29, 110:9, 113:2 및 268:18인 항체로부터 선택된다. 바람직하게는, 검출 검정은 국제공개공보 제WO 06/12949호의 실시예 2 및 3에 기술된 샌드위치 ELISA이지만, 110:9 항체는 포획 항체로서 사용되고 268:29 항체는 접합된 항체로서 사용된다. 국제공개공보 제WO 06/12949호에 기술된 모든 항체는, 부다페스트 조약에 따라 특허 기탁으로서 기탁기관[Centre for Applied Microbiology and Research (CAMR) 및 European Collection of Cell Cultures (ECACC), Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, UK]에 기탁된 하이브리도마 세포에 의해 생산된다. 기탁일은 2004년 5월 11일이었다. 하이브리도마 세포주 110:9는 ECACC 수탁번호 04092204 하에 성공적으로 기탁되어 있다. 하이브리도마 세포주 113:2는 ECACC 수탁번호 04092201 하에 성공적으로 기탁되어 있다. 하이브리도마 세포주 268:18은 ECACC 수탁번호 04092202 하에 성공적으로 기탁되어 있다. 하이브리도마 세포주 268:29는 ECACC 수탁번호 04092206 하에 성공적으로 기탁되어 있다. 하이브리도마 세포주 287:6은 ECACC 수탁번호 04092203 하에 성공적으로 기탁되어 있다. 하이브리도마 세포주 301:39는 ECACC 수탁번호 04092205 하에 성공적으로 기탁되어 있다.

본원에서 사용되는 "엘.인트라셀룰라리스 항원"이라는 용어는, 동물에게 투여하는 경우, 엘.인트라셀룰라리스에 의한 감염에 대한 면역 반응을 유도하거나, 촉진시키거나, 향상시킬 수 있는 하나 이상의 항원을 포함하는 물질의 임의의 조성물을 의미하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는, 상기 엘.인트라셀룰라리스 항원은 완전한 엘.인트라셀룰라리스 세균, 특히 비활성화된 형태의 세균 (이른바 죽인 세균), 변형된 살아있거나 약독화된 엘.인트라셀룰라리스 세균 (이른바 MLB)이거나, 각각 적어도 엘.인트라셀룰라리스의 면역원성 아미노산 서열을 포함하는 경우, 엘.인트라셀룰라리스의 임의의 서브유닛, 폴리펩티드 또는 구성요소, 또는 임의의 키메릭 벡터이다. 본원에서 사용되는 "면역원성 단백질", "면역원성 폴리펩티드" 또는 "면역원성 아미노산 서열"이라는 용어는 상기 면역원성 단백질, 면역원성 폴리펩티드 또는 면역원성 아미노산 서열을 포함하는 병원체에 대해 숙주에서 면역 반응을 유도하는 임의의 아미노산 서열을 말한다. 특히, 엘.인트라셀룰라리스의 "면역원성 단백질", "면역원성 폴리펩티드" 또는 "면역원성 아미노산 서열"은 상기 "면역원성 단백질", "면역원성 폴리펩티드" 또는 "면역원성 아미노산 서열"이 투여된 숙주에서 엘.인트라셀룰라리스에 대해 면역학적 반응을 유도하는 항원을 암호화하는 임의의 아미노산 서열을 의미한다.

본원에서 사용되는 "면역원성 단백질", "면역원성 폴리펩티드" 또는 "면역원성 아미노산 서열"에는 임의의 단백질의 전체 길이 서열, 이의 유사체 또는 이의 면역원성 단편이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. "면역원성 단편"이라는 용어는, 하나 이상의 에피토프를 포함하여 관련된 병원체에 대해 면역학적 반응을 유도하는 단백질의 단편을 의미한다. 이러한 단편은 당업계에 익히 공지된 임의의 수의 에피토프 매핑 기술을 사용하여 확인될 수 있다[참조: Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, New Jersey (이의 설명 및 내용은 본원에 참조로서 인용된다)]. 예를 들면, 선형 에피토프는, 예를 들어 단백질 분자의 일부에 상응하는 다수의 펩티드를 고체 지지체 상에 동시에 합성하고, 펩티드가 지지체에 계속 부착되어 있는 동안 펩티드를 항체와 반응시켜 결정될 수 있다. 이러한 기술은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들면, 미국특허 제4,708,871호; 문헌[참조: Geysen et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998-4002; 및 Geysen et al. (1986) Molec. Immunol. 23:709-715]에 기술되어 있다 (이의 설명 및 내용은 본원에 참조로서 인용된다). 유사하게, 입체형태적 에피토프는, 예를 들어 엑스-레이 결정학 및 2차원 핵 자기 공명으로 아미노산의 공간적 입체형태를 결정하여 쉽게 확인된다[참조: Epitope Mapping Protocols, supra]. 합성 항원, 예를 들면, 폴리에피토프, 플랭킹 에피토프, 및 다른 재조합 또는 합성적으로 유도된 항원도 상기 정의 내에 포함된다[참조: Bergmann et al. (1993) Eur. J. Immunol. 23:2777-2781; Bergmann et al. (1996), J. Immunol. 157:3242-3249; Suhrbier, A. (1997), Immunol. and Cell Biol. 75:402-408; 및 Gardner et al., (1998) 12th World AIDS Conference, Geneva, Switzerland, June 28-July 3, 1998 (이의 설명 및 내용은 본원에 참조로서 인용된다)].

적당한 엘.인트라셀룰라리스 항원에는 유럽특허 제1219711호; 미국특허 제6,605,696호; 국제공개공보 제WO 96/39629호; 제WO 97/20050호; 제WO 00/69903호; 제WO 00/69904호; 제WO 00/69905호; 제WO 00/69906호; 제WO 02/38594호; 제WO 02/26250호; 제WO 03/006665호; 제WO 04/033631호; 제WO 05/026200호; 및 제WO 05/011731호에 기술된 항원이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

따라서 본 발명에 따라 사용하기 위한 백신에는 엘.인트라셀룰라리스에 대해 면역 반응을 유도하거나 유도할 수 있는 상기한 임의의 엘.인트라셀룰라리스 항원이 포함된다. 바람직하게는, 상기 백신은 적어도 엘.인트라셀룰라리스에 대해 증가된 보호를 제공한다.

따라서 추가적인 양상에 있어서, 본 발명은 3주령 이내의 상기 새끼 동물에게 유효량의 엘.인트라셀룰라리스 항원을 투여하는 단계를 포함하여, 엘.인트라셀룰라리스 감염에 대해 새끼 동물을 백신접종시키는 방법에 관한 것이고, 이때 엘.인트라셀룰라리스 항원은 살아있는 변형된 엘.인트라셀룰라리스 세균, 죽인 엘.인트라셀룰라리스 세균 또는 엘.인트라셀룰라리스 세균의 하나 이상의 서브유닛으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 한가지 양태의 경우 위에 언급한 바와 같이, 바람직하게는 백신접종은 10 내지 26일령, 보다 바람직하게는 12 내지 21일령, 보다 더 바람직하게는 15 내지 21일령, 그리고 가장 바람직하게는 19 내지 21일령일 때 실시한다. 또다른 양태의 경우, 백신접종은 바람직하게는 26일령 전, 바람직하게는 16 내지 26일령, 보다 바람직하게는 18 내지 24일령, 보다 더 바람직하게는 19 내지 22일령, 그리고 가장 바람직하게는 21일령일 때 실시한다.

바람직하게는, 백신에는 변형된 살아있는 엘.인트라셀룰라리스 세균이 포함된다. 보다 바람직하게는 백신은 Enterisol® Ileitis B3903[판매원: Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc.]이다.

추가적인 양상에 있어서, 본 발명은 10 내지 26일령, 보다 바람직하게는 12 내지 21일령, 보다 더 바람직하게는 15 내지 21일령, 그리고 가장 바람직하게는 19 내지 21일령의 상기 새끼 동물, 또는 26일령 전, 바람직하게는 16 내지 26일령, 보다 바람직하게는 18 내지 24일령, 보다 더 바람직하게는 19 내지 22일령, 그리고 가장 바람직하게는 21일령인 새끼 동물에게, 살아있는 변형된 엘.인트라셀룰라리스 세균의 약 3.0 TCID₅₀ 내지 약 6.0 TCID₅₀의 용량을 투여하는 단계를 포함하여, 엘.인트라셀룰라리스 감염에 대해 새끼 동물, 바람직하게는 새끼 돼지를 백신접종시키는 방법에 관한 것이다. 바람직하게는, 상기 세균은 백신 Enterisol® Ileitis B3903[판매원: Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc.] 중에 포함된 세균이다.

추가적인 양상에 있어서, 본 발명은 10 내지 26일령, 보다 바람직하게는 12 내지 21일령, 보다 더 바람직하게는 15 내지 21일령, 그리고 가장 바람직하게는 19 내지 21일령, 또는 26일령 전, 바람직하게는 16 내지 26일령, 보다 바람직하게는 18 내지 24일령, 보다 더 바람직하게는 19 내지 22일령, 그리고 가장 바람직하게는 21일령인 상기 새끼 동물에게, 유효량의 엘.인트라셀룰라리스 항원을 투여하는 단계를 포함하여, 엘.인트라셀룰라리스 감염에 대해 새끼 동물, 바람직하게는 새끼 돼지를 백신접종시키는 방법에 관한 것이고, 이때 새끼 동물은 엘.인트라셀룰라리스 및 항-엘.인트라셀룰라리스 모계 항체 음성이다.

추가적인 양상에 있어서, 본 발명은 또한, 새끼 동물, 바람직하게는 10 내지 26일령, 보다 바람직하게는 12 내지 21일령, 보다 더 바람직하게는 15 내지 21일령, 그리고 가장 바람직하게는 19 내지 21일령, 또는 26일령 전, 바람직하게는 16 내지 26일령, 보다 바람직하게는 18 내지 24일령, 보다 더 바람직하게는 19 내지 22일령, 그리고 가장 바람직하게는 21일령인 새끼 돼지의 백신접종을 위한, 약제, 바람직하게는 백신 조성물의 제조를 위한 유효량의 엘.인트라셀룰라리스 항원의 새로운 의약 용도에 관한 것이다.

상기한 의약 용도의 추가적인 양상에 있어서, 엘.인트라셀룰라리스 항원은 살아있는 변형된 엘.인트라셀룰라리스 세균, 죽인 엘.인트라셀룰라리스 세균 또는 엘.인트라셀룰라리스 세균의 하나 이상의 서브유닛으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 바람직하게는, 엘.인트라셀룰라리스 항원은 살아있는 변형된 엘.인트라셀룰라리스 세균이다. 보다 바람직하게는, 상기 새끼 동물에게 살아있는 변형된 엘.인트라셀룰라리스 세균의 약 3.0 TCID₅₀ 내지 약 6.0 TCID₅₀의 용량으로 투여한다. 엘.인트라셀룰라리스 항원을 포함하는 백신 조성물의 제조는 당업계의 기술 수준에서 통상적이고 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들면, 당업자는 상기 조성물 중에 포함될 수 있는 추가적인 성분을 알 수 있다[참조: Remington's Pharmaceutical Sciences. (1990). 18th ed. Mack Publ., Easton]. 전문가는 공지된 주사가능물질, 생리학적으로 허용되는 멸균 용액을 사용할 수 있다. 비경구 주사 또는 주입용으로 바로 사용가능한 용액을 제조하기 위한, 수성 등장 용액, 예를 들어 식염수 또는 상응하는 혈장 단백질 용액은 쉽게 구할 수 있다. 백신 조성물은 공지된 주사가능한 용액으로 사용 직전에 멸균 조건 하에서 재구성시킬 수 있는 동결건조물 또는 건조 제제로서, 예를 들어 부품 키트로서 존재할 수 있다.

또한, 본 발명의 면역원성 및 백신 조성물은 하나 이상의 수의학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 "수의학적으로 허용되는 담체"에는 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 애주번트, 안정화제, 희석제, 보존제, 항균제 및 항진균제, 등장제, 흡착 지연제 등이 포함된다.

"희석제"에는 물, 식염수, 덱스트로스, 에탄올, 글리세롤 등이 포함될 수 있다. 등장제에는 특히 염화나트륨, 덱스트로스, 만니톨, 소르비톨 및 락토스가 포함될 수 있다. 안정화제에는 특히 알부민 및 에틸렌디아민테트라아세트산의 알칼리염이 포함된다.

본원에서 사용되는 "애주번트"에는 알루미늄 하이드록사이드 및 알루미늄 포스페이트, 사포닌, 예를 들면, 퀼 에이(Quil A), QS-21[판매원: Cambridge Biotech Inc., Cambridge MA], GPI-0100[판매원: Galenica Pharmaceuticals, Inc., Birmingham, AL], 유중수형 에멀젼, 수중유형 에멀젼 또는 수중유중수형 에멀젼이 포함될 수 있다. 에멀젼은 특히 경질 액체 파라핀 오일(유럽 약전 유형); 스쿠알란 또는 스쿠알렌과 같은 이소프레노이드 오일; 알켄 (특히, 이소부텐 또는 데켄)의 올리고머화로부터 생성되는 오일; 선형 알킬 그룹을 함유하는 산 또는 알콜의 에스테르, 보다 특히 식물 오일, 에틸 올레에이트, 프로필렌 글리콜 디-(카프릴레이트/카프레이트), 글리세릴 트리-(카프릴레이트/카프레이트) 또는 프로필렌 글리콜 디올레에이트; 분지된 지방산 또는 알콜의 에스테르, 특히 이소스테아르산 에스테르를 기제로 할 수 있다. 오일을 유화제와 함께 사용하여 에멀젼을 형성한다. 유화제는 바람직하게는 비이온성 세제, 특히, 임의로 에톡실화된, 소르비탄, 만나이드(예: 안하이드로만니톨 올레에이트), 글리콜, 폴리글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 올레산, 이소스테아르산, 리시놀레산 또는 하이드록시스테아르산의 에스테르, 및 폴리옥시프로필렌-폴리옥시에틸렌 공중합체 블럭, 특히 플루로닉(Pluronic) 제품, 특히 L121이다[참조: Hunter et al., The Theory and Practical Application of Adjuvants (Ed.Stewart-Tull, D. E. S.). JohnWiley and Sons, NY, pp51-94 (1995) 및 Todd et al., Vaccine 15:564-570 (1997) (이의 설명 및 내용은 본원에 참조로서 인용된다)]. 예를 들면, 문헌[참조: "Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach" edited by M. Powell and M. Newman, Plenum Press, 1995]의 147 페이지에 기술된 SPT 에멀젼 및 동일한 문헌의 183 페이지에 기술된 에멀젼 MF59를 사용하는 것이 가능하다 (이의 설명 및 내용은 본원에 참조로서 인용된다).

애주번트의 추가의 예로는 아크릴산 또는 메타크릴산의 중합체 및 무수 말레산과 알케닐 유도체의 공중합체로부터 선택되는 화합물이 있다. 유리한 애주번트 화합물은, 특히 당 또는 폴리알콜의 폴리알케닐 에테르와 가교결합된 아크릴산 또는 메타크릴산의 중합체이다. 이러한 화합물은 카보머(carbomer)라는 용어로 공지되어 있다[참조: Phameuropa Vol. 8, No. 2, June 1996]. 당업자는 또한 미국특허 제2,909,462호를 참조할 수 있는데, 여기에는 3개 이상, 바람직하게는 8개 이하의 하이드록실 그룹을 갖는 폴리하이드록실화된 화합물과 가교결합되어 있고, 3개 이상의 하이드록실의 수소 원자가 2개 이상의 탄소 원자를 갖는 불포화 지방족 라디칼로 치환된 아크릴 중합체가 기술되어 있다. 바람직한 라디칼은 2 내지 4개의 탄소 원자를 함유하는 라디칼, 예를 들면, 비닐, 알릴 및 다른 에틸렌계 불포화 그룹이다. 불포화 라디칼은 그 자체에 메틸과 같은 다른 치환기를 함유할 수 있다. 카보폴(Carbopol; 판매원: BF Goodrich, Ohio, USA)이라는 명칭 하에 판매되는 제품이 특히 적당하다. 이들은 알릴 수크로스 또는 알릴 펜타에리트리톨과 가교결합되어 있다. 그 가운데, 카보폴 974P, 934P 및 971P가 언급될 수 있다. 카보폴 971P의 사용이 가장 바람직하다. 무수 말레산과 알케닐 유도체의 공중합체 가운데는, 무수 말레산과 에틸렌의 공중합체인 공중합체 EMA[판매원: Monsanto]가 있다. 이러한 중합체가 물에 용해되면 산성 용액이 되고, 바람직하게는 생리학적 pH로 중화시켜서, 애주번트 용액을 만들어 그 속에 면역원성, 면역학적 또는 백신 조성물 그 자체를 도입시킬 것이다. 추가적인 적당한 애주번트에는 특히 RIBI 애주번트 시스템[판매원: Ribi Inc.], 블럭 공중합체(Block co-polymer)[판매원: CytRx, Atlanta GA], SAF-M[판매원: Chiron, Emeryville CA], 모노포스포릴 리피드 A, 아브리딘(Avridine) 리피드-아민 애주번트, 이.콜라이(E. coli)로부터의 열-불안정성 장독소 (재조합체 등), 콜레라 독소, IMS 1314 또는 무라밀 디펩티드가 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

바람직하게는, 애주번트는 용량 당 약 100㎍ 내지 약 10mg의 양으로 첨가된다. 보다 바람직하게는, 애주번트는 용량 당 약 100㎍ 내지 약 10mg의 양으로 첨가된다. 보다 바람직하게는, 애주번트는 용량 당 약 500㎍ 내지 약 5mg의 양으로 첨가된다. 보다 더 바람직하게는, 애주번트는 용량 당 약 750㎍ 내지 약 2.5mg의 양으로 첨가된다. 가장 바람직하게는, 애주번트는 용량 당 약 1mg의 양으로 첨가된다.

백신 조성물은, 예를 들면, 인터루킨, 인터페론 또는 다른 사이토카인과 같은 하나 이상의 다른 면역조절제를 추가로 포함할 수 있다. 백신 조성물은 젠타마이신 및 메르티올레이트를 포함할 수도 있다. 본 발명과 관련하여 유용한 애주번트 및 첨가제의 양 및 농도는 당업자에 의해서 쉽게 결정될 수 있지만, 본 발명은 백신 조성물의 용량 1ml 당 약 50㎍ 내지 약 2000㎍, 그리고 바람직하게는 약 250㎍의 애주번트를 포함하는 조성물을 고려한다. 또다른 바람직한 양태에서, 본 발명은 약 1㎍/ml 내지 약 60㎍/ml의 항생제를 포함하고, 보다 바람직하게는 약 30㎍/ml 미만의 항생제를 포함하는 백신 조성물을 고려한다.

백신은 동물, 바람직하게는 포유동물, 그리고 보다 바람직하게는 돼지에게, 임의의 통상적인 방법으로, 가장 바람직하게는 경구 음약을 통해 투여된다. 투여될 용량은 특정 경우에 따라 달라질 것이지만, 임의의 경우에, 이는 회장염에 대한 보호 항체 또는 세포 매개 면역 반응을 유도하는데 충분한 양이다.

본 발명의 추가적인 양상에 있어서, 새끼 동물(바람직하게는 새끼 돼지)의 백신접종에 사용되는 엘.인트라셀룰라리스 백신은 1회 또는 반복 투여로 투여한다. 살아있는 또는 죽인 백신을 초기 백신접종 후 2 내지 4주 간격으로 1 또는 2회 투여할 수 있다. 약독화된 살아있는 백신의 경우, 1회 투여가 바람직하다. 바람직하게는, 제1 또는 단일 투여는, 상기한 바와 같이, 16 내지 26일령, 보다 바람직하게는 18 내지 24일령, 보다 더 바람직하게는 19 내지 22일령, 그리고 가장 바람직하게는 21일령일 때, 또는 10 내지 26일령, 보다 바람직하게는 12 내지 21일령, 보다 더 바람직하게는 15 내지 21일령, 그리고 가장 바람직하게는 19 내지 21일령일 때 실시한다.

제2의 투여가 바람직하거나 필요한 경우, 제2의 투여는 백신의 제1 투여 후 약 1 내지 약 4주 후에 실시한다. 추가적인 양상에 있어서, 재백신접종을 임의의 이전 백신접종 후 3 내지 12개월 간격으로 실시한다. 후속 백신 용량의 투여는 바람직하게는 6개월 내지 1년 단위로 실시한다.

다음의 실시예는 본 발명의 바람직한 양태를 대표한다. 이의 어떤 것도 본 발명의 전체적인 범위를 한정하는 것으로서 여겨서는 안된다는 것을 이해하여야 한다.

실시예 1

이 실시예는 로소니아 백신의 효능을 로소니아 백신접종된 및 비-백신접종된 암퇘지로부터 태어난 3주령 새끼돼지에서 평가하였고, 암퇘지 백신접종이, 백신접종된 및 비-백신접종된 새끼돼지를 독성 순수 배양물로 시험감염(challenge)시킨 후 질병 유도의 감소로 측정되는 새끼돼지 백신접종에 대한 반응을 방해하는, 모계 면역 간섭을 일으키는지의 여부를 결정하였다. 효능을 측정하는데 사용된 1차 연구 변수는 회장 및 결장의 육안 및 현미경적 병변이었다. 또한, 이 실시예는 단일 및 반복 용량 투여 후 임신 제2 및 제3기 동안 임신한 암퇘지에게 투여하는 경우 안전성 문제에 대해 로소니아 백신을 평가하였다.

재료 및 방법

맹검 연구(blinded study)에서, 임신한 건강한 로소니아 혈청-음성 암퇘지 16마리를 얻어, 각각 8마리의 암퇘지를 갖는 2개의 그룹(A와 B)으로 무작위로 분류하였다. A 그룹에는 분만 전에 높은 수준의 모계 면역을 유도하기 위하여, -55, -35 및 -14일차에 경구 음약으로 Enterisol Ileitis B3903을 3회 투여하였다. B 그룹 암퇘지에는 분만 전에 위약을 투여하여 음성 대조군의 역할을 하였다. 비약물 수유 사료로 교체하기 전, 암퇘지에게 처음에는 시판되는 비약물 임신 사료를 공급하였다. 모든 암퇘지에서 동일하게 임신 및 분만이 되도록 노력하였지만, 분만 시기에 있어서 약간의 변이(10일)가 있었다. 백신접종일 및 시험감염일이 많아지는 것과 관련된 변이성 문제를 방지하기 위하여, 분만일들의 중간을 시험 0일차로 정하였다. 연구의 백신접종 및 시험감염 부분에서 사용된 모든 새끼돼지는 백신접종 시점(21일차)에 21±5일령이었다. 새끼돼지에게 처음에는 비약물 스타터(starter) 사료를 공급한 후, 비약물 자돈 사료를 공급하고 나서, 비약물 육성-비육돈 사료를 공급하였다. 돼지로부터 채취하는 혈청학 샘플을 실제 출생 일, 7일령 및 14일령일 때 채취하여, 모계 항체(존재하는 경우)가 정확하게 측정되게 하였다. 분만 전에 암퇘지로부터 혈청학 샘플을 채취하였다. 또한, 암퇘지를 22일차에 부검하여, 회장 및 결장 조직을 육안 병리학에 대해 평가하고, 회장, 결장, 장간막 림프절 및 편도선을 PCR로 평가하였으며, 사산 돼지를 PCR로 검사하였고, 분만 일에 돼지를 살아서 태어난 돼지, 사산 돼지 또는 미이라 돼지로 기록하여 암퇘지의 생식 번식 성적을 평가하였다.

분만 후 (연구 21일차에), 건강한 새끼돼지 100마리를 동복자(litter)끼리 사육하고 나서, 무작위로 6개의 처리 그룹 중 하나에 배정하고, 각 그룹을 본 연구 전체에 걸쳐 개별적으로 사육하였다. 백신접종된 암퇘지(A 그룹)로부터 분만된 새끼돼지를 무작위로 처리 그룹 1 내지 3에 배정하였다. 비-백신접종된 암퇘지(B 그룹)로부터의 새끼돼지를 무작위로 처리 그룹 4 내지 6에 배정하였다. 21일차에, 각각 그룹 당 20마리의 새끼돼지를 갖는 처리 그룹 1과 4에, 2ml 용량 (1 X 10^5.0 log₁₀ TCID₅₀/용량)의 Enterisol Ileitis B3903 백신을 직접 경구 음약으로 투여하였다. 각각 그룹 당 20마리의 새끼돼지를 갖는 처리 그룹 2와 5에는, 1회 2ml 용량 위약을 직접 경구 음약으로 투여하였다. 각각 그룹 당 10마리의 새끼돼지를 갖는 처리 그룹 3과 6에는 어떠한 처리도 하지 않고 완전(strict) 대조군으로서 역할을 하여 로소니아 감염에 대한 돼지 공급원의 감수성을 확인하였다.

백신접종 후 3주 후(연구 42일차)에, 처리 그룹 1, 2, 4 및 5의 검사 새끼돼지에 1회 10ml 용량 (1 X 10^7.3 log₁₀ TCID₅₀/용량)의 독성 저계대 순수 배양 로소니아 이종(heterologous) 분리주 N101494를 위관영양(gastric gavage)으로 투여하여 시험감염시켰다. 하지만, 임의의 다른 감염성 야생형 또는 저계대 엘.인트라셀룰 라리스 분리주를 시험감염 세균으로서 사용할 수 있다. 연구 63일차(시험감염 후 3주 후)에, 모든 처리 그룹(1 내지 6)을 안락사시키고 부검하여 PPE에 대한 육안 및 현미경적 병변 분석을 하였다.

새끼돼지에서 이종 독성 순수 배양물 시험감염에 대한 Enterisol Ileitis B3903 백신의 효능을 측정하는데 사용된 1차 기준은 육안 및 현미경적 기술을 사용하여 병변 발생을 관찰하여 회장 및 결장의 병변을 평가하는 것이었다. 육안 병변은 연구 종료 시점에 회장 절편, 회장/맹장 연결부 및 결장에서 평가하였다. 장 병변을 중증도의 수준에 따라 등급을 나누고, PCR, IHC 및 H&E 분석을 위하여 임의의 감염된 조직 부위로부터 추가적인 샘플을 채취하였다. 병변 중증도는 회장의 점막 내벽에서 발견되는 점막 비후의 정도에 따라 결정하였다. 병변 점수 0점은 점막 비후, 부종, 점막 융선(ridge)/주름 또는 장막 망상화(reticulation)의 현저성의 증거가 없음을 나타내었다. 병변 점수 1점은 점막에 작은 융선/주름의 존재를 포함하는 경증 비후, 점막벽의 경증 부종, 및 일부 경우에 충혈을 나타내었다. 병변 점수 2점은 중등증 비후 및/또는 염증과 동등하였다. 이는 점막의 현저한 깊은 융선/주름, 점막벽의 중등증 부종, 장막 표면의 망상화, 및 일부 경우에 충혈로 증명되었다. 병변 점수 3점은 중증 비후 및/또는 염증을 나타내었고, 이는 점막의 깊은 중증 융선/주름, 점막벽의 중등증 부종, 점막 표면의 망상화, 및 또한 일부 경우에 충혈로 증명되었다. 병변 점수 4점은 중증 비후 및/또는 염증 및/또는 혈액의 존재를 나타내었다. 이 병변 점수는 점막의 깊은 중증 융선/주름, 점막벽의 중등증 부종, 점막 표면의 망상화, 또한 일부 경우에 충혈, 및 혈액 내용물 및/또 는 혈병의 존재로 증명되었다. 마지막으로, 병변 점수 5점은 괴사를 나타내었고, 이는 점막 표면의 병변이 중증이어서 괴사가 존재하거나 일부 경우에 전체 점막 표면이 병변의 중증도로 인해 탈피되거나 박리되는 것으로 증명되었다.

로소니아에 의해 발생하는 현미경적 병변은 PPE에 대해 특징적이다. 상기 질병의 조직병리학적 병변에는, 특히 점막 음와(crypt)에서 배상 세포(goblet cell)가 뚜렷하게 부재하는, 상피 과증식이 포함된다. 로소니아는 일반적으로 점막 음와의 증식성 상피 세포 내에서 발견된다. 길이가 대략 2 내지 4cm인 회장 절편을 완충된 포르말린에 놓고 헤마톡실린과 에오신(H&E) 및 IHC 염색 방법을 사용하여 조직학적 검사를 하였다. H&H 염색은 로소니아 감염에 의해 발생하는 음와 과증식의 존재를 검출하지만, IHC 염색은 감염된 조직에서 유기체 및 현미경적 병변 발생의 존재를 확인하는데 있어서 항-로소니아 모노클로날 항체의 특이성을 사용한다. 항-로소니아 모노클로날 항체는 모든 로소니아 분리주에 존재하는 외막 단백질을 표적화하여 로소니아 전체 세포를 특이적으로 검출한다. 이 모노클로날 항체는 University of Edinburg(Scotland) 소속 연구원들이 개발한 하이브리도마 세포주 VPM53으로부터 유래하였다. 회장 절편의 IHC 염색으로 결정되는 로소니아 유기체의 존재 및 현미경적 병변 중증도를 점수화하여, 0점은 증식성 장세포(병변)의 부재를 나타내고, 1점은 경증 국소 병변을 나타내고, 2점은 중등증 미만성 병변을 나타내고, 3점은 중증 미만성 병변을 나타내었다. 유기체의 존재에 관해서는, IHC 점수화 시스템으로 유기체의 부재는 0점, 소수의 국소 유기체의 존재는 1점, 중등증 미만성 유기체의 존재는 2점, 그리고 중증 미만성 유기체의 존재는 3점으로 점수화하였다.

측정의 2차 기준은 로소니아에 대한 새끼돼지의 노출로 인한 임상적 증상의 관찰, PCR에 의한 분변 면봉 및 조직에서의 로소니아의 검출, ADWG 및 혈청전환(IFAT)이었다.

각각의 검사 동물에 대해 연구 개시일부터 시험감염일까지 매일 건강을 관찰하였다. 설사, 행동 및 신체 상태를 포함하는 임상적 건강 변수를 시험감염일(42일차)부터 종료 전일(62일차)까지 매일 점수화하였다. 점수는 질병의 중증도를 반영하였다. 설사의 경우, 1점은 정상적인 분변을 나타내고, 2점은 혈액이 없는 반-고형 분변을 나타내고, 3점은 혈액 또는 흑변이 없는 물이 많은 분변을 나타내고, 4점은 묽거나 굳은, 혈액 흔적 분변을 나타내었다. 행동 점수 1점은 정상적인 행동을 나타내고, 2점은 경증 내지 중등증 우울 행동(혼자 있음)을 나타내고, 3점은 중증 우울 또는 활력없는 행동을 나타내었다. 신체 상태 1점은 정상적인 신체 상태를 나타내고, 2점은 경증 내지 중등증의 수척한 신체 상태를 나타내고, 3점은 중증의 수척한 신체 상태를 나타내었다.

로소니아의 분변 배출을, 연구의 -55, -35, -14, 21, 28, 35, 42, 49, 56 및 63일차에 회장염(Ileitis) PCR로 분변 면봉을 검사(f-PCR)하여 평가하였다. 분변 면봉을 분변 중의 로소니아 DNA의 존재에 대해 PCR을 사용하여 검사하였다. 새로운 조직 절편을 각각의 검사 동물로부터 연구 종료시인 63일차에 회수하였다. 조직 중의 세균 함량의 정성 분석을 회장, 결장, 편도선 및 장간막 림프절 중의 로소니아에 대한 조직학적 평가와 함께 연구 63일차에 회장염 PCR(t-PCR)로 평가하였 다. PCR 검정은 존스(Jones) 등에 의해 개발되었고, 이는 로소니아 게놈 DNA로부터 319bp 단편을 생성하는 2개의 올리고뉴클레오타이드 프라이머(각각 20 염기쌍)의 특이성을 사용한다. 이들 프라이머는 로소니아에 특이적인 이전에 결정된 게놈 DNA 서열을 표적화한다. PCR 동안 생성된 DNA의 단편을 "양성" 또는 "비양성" 결과의 확인을 위한 회장염-양성 및 -음성 DNA 추출 및 PCR 반응 대조군과 비교한다. 양성 DNA 추출 대조군은 1X 인산염 완충 식염수(PBS)(200㎕/관) 중의 로소니아 전체 세포로 감염된 McCoy 세포이다. 음성 DNA 추출 대조군은 1X PBS (200㎕/관) 중의 비감염 McCoy 세포이다. 회장염 PCR 반응 대조군은 세포 배양 회수 물질 (로소니아 + McCoy 세포)로부터 정제된 로소니아 게놈 DNA로 이루어지고, 음성 대조군은 RNAse-부재 물(Amresco, Solon, Ohio)이다. 로소니아 DNA에 대해 양성인 검사 샘플은 두 회장염 PCR-양성 대조군(추출 및 반응)과 동일한 크기의 DNA 단편(319bp)을 생성할 것이지만, 음성 샘플은 이 크기의 단편을 생성하지 않을 것이다. 각각의 검사 샘플로부터 ISO-QUICK DNA 추출 키트[판매원: ORCA Research, Inc., Bothell, Washington]를 사용하여 DNA를 추출하였다. PCR 결과를 사용하여, Enterisol Ileitis B3903으로 백신접종되고/되거나 로소니아 이종 분리주 N101494로 시험감염된 새끼돼지에서 로소니아의 배출을 측정하였다.

체중을 백신접종일(21일), 시험감염일(42일) 및 연구 종료일(63일)에 측정하여, 각각의 처리 그룹의 평균 일일 증체량(ADWG)을 계산하였다. 각각의 그룹에 대한 ADWG를 백신접종 후 및 시험감염 후의 ADWG에 대해 서로 비교하였다. 체중은 인증된 검사 분동(weights)을 사용하여 사용 전후에 교정한 전자 체중계(Weigh- Tronix, Weigh-Tronix, Inc., Fairmont, Minnesota)를 사용하여 측정하였다.

혈청을 간접 형광 항체 검사(IFAT)로 검사하여 검사 동물 내의 항-로소니아 항체를 검출하였다. 정맥 전혈을 암퇘지로부터 -55, -35 및 -14일차에 진공채혈관(vacutainer tube)에 채취하고, 0, 7 및 14일령일 때, 및 연구의 21, 28, 35, 42, 49, 56 및 63일차에 모든 검사 동물에서 채취하였다. 혈액을 응고시킨 후 원심분리하여 혈청을 수거하고 냉동시켰다. 이어서, IFAT로 항-로소니아 IgG 분자에 대해 돼지 혈청을 스크리닝하였다. 항-로소니아 항체는 96-웰 미세역가 플레이트의 각각의 웰의 바닥에 고정된 유기체를 완전히 덮고 있는 로소니아 전체 세포의 외막 항원에 부착된다. 이어서, 항-IgG FITC-태그화된 2차 항체 접합체를 도입하여 각각의 웰 내의 임의의 IgG-항원 복합체에 결합시켰다. 이러한 FITC-결합된 복합체는 자외선 하에서 녹색 형광을 발광한다. 양성 검사 샘플은, 로소니아 또는 많은 로소니아를 함유하는 감염된 McCoy 세포를 닮은, 많은 밝은 녹색의 작은 만곡형 막대기를 보인다. 음성 IFAT 검사 샘플은 McCoy 세포의 흐린(희미한) 녹색 배경을 보인다. IFAT로 확인한 결과를 사용하여, 백신접종 및/또는 검사 동물에서 로소니아 노출을 나타내는 독성 시험감염을 받은 그룹에서 혈청전환 패턴을 관찰하였다.

TCID₅₀ 종말점 검정을, 본 연구의 21일차에 검사 새끼돼지에게 투여한 각각의 백신 용량의 대표 샘플에 대해 실시하였다. 대표 검사 샘플의 5개의 반복체를 백신접종 및 시험감염 투여 전후에 햄의(Ham's) F12(DMEM F12) 및 5% 열 비활성화 된 신생 소 혈청(NBS)(JRH Biosciences, Lenexa, Kansas)이 강화된 둘베코의(Dulbecco's) 변형된 필수 배지 중에 10배 (10^-1 내지 10^-6) 희석시켰다. 희석된 샘플을 검사하여 각각의 검사 샘플 중의 살아있는 로소니아의 양을 측정하였다. 평균 역가를 백신 투여 전후 및 시험감염 투여 전후 5개의 반복체로부터 계산하고, 각각의 새끼돼지에게 주어진 검사 물질의 용적을 곱하여 용량 당 총 log10 로소니아를 측정하였다. 백신접종 또는 시험감염에 대한 총 평균 역가 (log₁₀ TCID₅₀/용량)를 평균 전후(2개의 역가) 적정 결과로부터 측정하였다.

처리 그룹 비교를 백신접종 후 및 시험감염 후의 ADWG, 임상 점수, 혈청전환 비(IFAT), 콜로니 형성(t-PCR), 분변 배출(f-PCR), 육안 병변 및 면역조직화학(IHC)에 의한 현미경적 병변 발생의 데이터를 분석하여 실시하였다.

새끼돼지 3마리(그룹 1의 1마리 및 그룹 5의 2마리)는 백신접종 후 연구 종료 전에 사망하였다. 그룹 1의 새끼돼지를 로소니아 감염에 대해 분석하였지만, 사망의 원인은 높은 수준의 이.콜라이로 인한 쇼크/패혈증인 것으로 결정되었다. 그룹 5의 사망한 새끼돼지 2마리에는 로소니아 감염의 전형적인 중증 육안 및 현미경적 병변이 있었고 사망의 원인은 로소니아로 인한 것으로 추정되었다.

결과

본 연구에서 수집한 분변 및 혈청 샘플의 평가는, A 그룹 또는 B 그룹의 암퇘지에서 분변 또는 회장 또는 결장 중에 검출가능한 로소니아가 없었다는 것을 나 타내었다. A 그룹 암퇘지는 8마리 중 5마리가 연구 동안 하나 이상의 종말점에서 검출가능한 IFAT 역가를 가졌다. B 그룹의 암퇘지는 동일한 기간 동안 검출가능한 IFAT 역가를 갖지 않았다. 이러한 데이터를 아래 표 1에 요약한다.

암퇘지 데이터

암퇘지 처리	육안 회장 병변	육안 결장 병변	조직 PCR (회장/결장/MLN/ 편도선)	IFA	살아서 태어난 평균 돼지수/ 동복자
A - 백신접종	0/8	0/8	0/8	5/8	9.4
B - 비-백신접종	0/8	0/8	0/8	0/8	7.6

모든 암퇘지를 부검하여 로소니아 감염의 전형적인 육안 병변에 대해 평가하였다. 하지만, 육안 병변 또는 t-PCR 검출에 대해 양성인 암퇘지는 없었다.

임신 제2 및 제3기 동안 백신을 투여했음에도 불구하고, 임상 시험 동안 임의의 암퇘지에 대해 비정상적인 전반적인 건강 관찰이 기록되지 않았다. A 그룹과 B 그룹 간의 분만 결과는 또한 매우 유사하여, 각 그룹에서 살아서 태어난 새끼돼지는 각각 평균 9.4 및 7.6마리였다. A 그룹 암퇘지의 경우, 동복자 당 사산 돼지는 평균 1.8마리였고 미이라 또는 분만 중 사망은 없었다. B 그룹 암퇘지의 경우, 동복자 당 사산 돼지는 평균 0.9마리, 미이라는 0.1 마리, 그리고 분만시 사망한 돼지는 0.1마리였다. 이러한 사산 돼지의 진단 평가로, 이들은 로소니아-음성이었고 생식과 관련된 통상의 손실이었다는 것이 밝혀졌다. 혈청학 결과는, 비-백신접종된 암퇘지는 혈청-음성으로 남아있고 일부 혈청-양성 동물이 A 그룹에서 관찰되었다는 점에서 예상한 바와 같았다. A 그룹 암퇘지는 비-백신접종 대조군과 비교하여 높은 돼지/동복자 값을 가졌다. 이 결과는 백신접종 방법 또는 내용으로 인한 음성 효과가 없었다는 것을 나타낸다. 이 데이터는 위의 표 1에 요약되어 있다.

육안 새끼돼지 병변 발생은, 연구 종료 시점에 PPE와 관련된 육안 병변에 대해 각각의 검사 동물의 회장 및 결장을 평가하고 점수화하여 측정하였다. 그룹 1과 4의 새끼돼지는 회장 점수가 각각 0.16 및 0.15로 가장 낮았다. 이들은 유의적으로 차이가 없었고, 백신접종된 및 비-백신접종된 암퇘지로부터의 돼지에서 백신 효능을 증명하였다. 그룹 2와 5는 회장 병변 점수가 각각 0.85 및 2.35였다. 이들은 유의적으로 차이가 있었고(P<0.05), 암퇘지 백신접종이 어느 정도 수준의 모계 보호를 제공하였다는 점 (그룹 2) 및 비경험(naive) 동물은 독성 시험감염에 민감하였다는 점(그룹 5)을 나타낸다. 그룹 4와 5는 또한 회장 점수에 유의적으로 차이가 있었고(P<0.05), 백신접종된 비경험 새끼돼지에서 백신의 효능이 확인된다. 그룹 1과 2의 회장 점수는 또한 유의적으로 차이가 있었고(P<0.05), 로소니아-양성 암퇘지에서 돼지의 백신접종은 모계 면역 이상의 유의적인 이점(P<0.05)을 제공한다는 것이 확인된다. 양성 동물의 % (양성/그룹 전체)에 있어서 회장 샘플에 대해 동일한 경향 및 유의성이 또한 관찰되었다. 그룹 5의 돼지의 80%에서 회장 병변이 관찰되었다. 대조적으로, 그룹 1과 4의 16% 미만의 동물에서 회장 병변이 관찰되었다.

결장의 육안 병변 점수 및 양성 동물의 %에 관하여, 그룹 4와 그룹 5 간에 유의적인 차이(P<0.05)가 있었다. 처리 그룹 간에 다른 유의적인 차이는 없었다. 완전 대조군(그룹 3과 6)은 회장 및 결장에서 육안 병변에 대해 음성이었고, 이로 인해 연구의 유효성이 확인된다. 이 검사의 결과를 아래 표 2에 제시한다.

IHC 및 H&E 방법을 사용하여 현미경적 새끼돼지 병변 발생을 평가하였다. 편도선, 장간막 림프절, 회장 말단 및 결장의 2 내지 4cm 길이의 절편을 연구 종료시(63일차)에 채취하여 IHC 분석을 위하여 10% 완충된 포르말린 중에 넣었다. 연구 종료시 어느 처리 그룹에서도 편도선 절편의 IHC 염색에 의해 로소니아가 검출되지 않았다. 그룹 5의 장간막 림프절 샘플 20개 중 2개에서 로소니아가 검출되었다. 모든 다른 그룹의 모든 다른 장간막 림프절 샘플은 음성이었고, 장간막 림프절 검사에 관하여 처리 그룹 간에 유의적인 차이가 없었다.

그룹 1과 4는 현미경적 회장 점수가 각각 0.35 및 0.15였고, 유의적으로 차이가 없었다. 그룹 5는 현미경적 회장 점수가 2.42로 가장 높았고, 그룹 2 및 4 처리 그룹과 유의적으로(P<0.05) 차이가 있었다. 이는, 그룹 2에 어느 정도 수준의 모계 면역이 존재한다는 것과, 백신접종된 비경험 돼지에서 백신이 효능을 제공한다는 것을 증명한다. 현미경적 병변을 갖는 회장 샘플의 %의 평가는, 그룹 5의 돼지의 95%가 병변을 갖고 있었고, 이 그룹은 또한 그룹 2 및 4와 유의적으로(P<0.05) 차이가 있다는 것을 나타내었다. 그룹 5의 평균 현미경적 결장 점수는 1.35였고, 이 처리 그룹에서 60%의 동물이 로소니아 병변 검출에 대해 양성이었다. 이는 그룹 2 및 4 처리 그룹보다 유의적으로(P<0.05) 많았다. 현미경적 데이터를 표 3에 요약한다.

새끼돼지의 로소니아 분변 배출을 f-PCR로 평가하기 위하여, 각각의 처리 그룹의 모든 검사 동물로부터 분변 면봉을 매주 수거하여, 엘.인트라셀룰라리스의 존재에 대해 연구 21, 28, 35, 42, 49, 56 및 63일차에 회장염 PCR로 검사하였다. 21, 28 및 35일차에, 모든 처리 그룹의 새끼돼지는 엘.인트라셀룰라리스에 대해 f-PCR 음성이었다. 그룹 1의 새끼돼지는 42일차에 f-PCR 양성으로 검출되었고, 63일차까지 양성으로 남아있었으며, 이 기간 동안 11 내지 16%의 새끼돼지가 양성으로 검사되었다. 그룹 2의 새끼돼지는 49일차에 f-PCR 양성으로 검출되었고, 63일차까지 양성으로 남아있었으며, 이 기간 동안 5 내지 25%의 새끼돼지가 양성으로 검사되었다. 그룹 4의 새끼돼지는 42일차에 f-PCR 양성으로 검출되었고, 63일차까지 양성으로 남아있었으며, 이 기간 동안 5 내지 25%의 새끼돼지가 양성으로 검사되었다. 그룹 5의 새끼돼지는 49일차에 f-PCR 양성으로 검출되었고, 63일차까지 양성으로 남아있었으며, 이 기간 동안 15 내지 72%의 새끼돼지가 양성으로 검사되었다. 그룹 3과 6의 새끼돼지는 시험 기간 동안 계속 f-PCR 음성으로 남았다. 데이터의 카이-제곱 분석은, 42일차에 그룹 4와 5 간에, 63일차에 그룹 2와 5간에, 그리고 63일차에 그룹 4와 5간에 유의적인(P<0.05) 차이를 나타낸다. 분변 배출 데이터를 표 4에 요약한다.

돼지에서 로소니아 조직 콜로니 형성(t-PCR)을, 연구 종료시(63일차)에 회장 말단, 결장, 편도선 및 장간막 림프절의 조직 절편을 PCR 검사하여 평가하였다. 완전 대조군(그룹 3과 6)은 로소니아 검출에 대해 t-PCR 음성이었고, 이로 인해 돼지원 및 연구의 유효성이 확인된다. 모든 편도선 샘플은 t-PCR 음성이었다. 그룹 5의 결장 및 장간막 림프절 샘플만이 양성이었고, 5 내지 10%의 새끼돼지가 양성으로 검사되었다. 그룹 1과 2의 새끼돼지로부터의 회장 샘플은 각각 20% 및 25% t-PCR 양성 검사 결과를 보였다. 이와 비교하여, 그룹 4와 5로부터의 새끼돼지는 각각 5% 및 45% t-PCR 양성 검사 결과를 보였다. 그룹 3과 6으로부터의 모든 회장 샘플은 t-PCR 음성이었다. 카이-제곱 분석은 편도선, 장간막 림프절 또는 결장 샘플에서 처리 그룹 간에 유의적인 차이를 나타내지 않았다. 회장으로부터의 t-PCR 결과에서 그룹 4와 5 간에 유의적인 차이(P<0.05)가 있었고, 그룹 5는 시험에서 양성 %가 가장 높았다. 이 검사로부터의 데이터를 표 5에 요약한다.

ADWG를 백신접종 시점(21일차)부터, 시험감염 투여시(42일차)까지, 연구 종료시(63일차)까지, 그리고 시험감염(42일차)부터 연구 종료(63일차)까지 계산하였다. 백신접종일(21일차)에는, 처리 그룹 간에 유의적인 차이가 없었다. 유사하게, 백신접종 후 21일차부터 42일차까지 유의적인 차이가 없었다. 이러한 결과로, 백신이 안전하며 증체량으로 측정되는 성장에 영향을 주지 않는다는 것이 확인된다. 독성 시험감염 후, ADWG에서 그룹 1과 4, 그룹 2와 5, 및 그룹 4와 5 간에 유의적인 차이(P<0.05)가 있었다. 그룹 5는 연구에서 ADWG가 0.88lb/일로 가장 낮았다. 백신접종부터 시험감염을 거쳐 연구 종료시까지의 기간의 카이-제곱 평가는 또한 그룹 1과 4 및 그룹 4와 5 간에 유의적인 차이(P<0.05)를 나타내었다. 이 데이터를 아래 표 6에 요약한다.

돼지의 임상적 관찰을 각각의 동물에 대해 시험감염일(42일차)부터 연구종료시(63일차)까지 매일 기록하였다. 임상 점수를 계산하여, 독성 로소니아 분리주에 의한 시험감염으로 인한 처리 그룹 간에 중증도 및 질병의 지속기간을 반영하는 평균 일일 임상 점수를 얻었다. 3점은 정상적인 건강한 동물을 나타내었다. 임의의 그룹에서 독성 시험감염 후 "3점" 이외의 임상 점수는 거의 없었고, 임의의 처리 그룹 간에 유의적인 차이가 없었다. 각각의 처리 그룹에 대한 평균 임상 점수를 아래의 표 7에 요약한다.

항-로소니아 IgG 항체의 존재에 대한 IFAT 검사를 통한 새끼돼지의 혈청학적 평가를 모든 검사 동물로부터 매주 채취한 혈청 샘플에 대해 수행하였다. 혈청 샘플은 0, 7, 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56 및 63일차에 채취하였다. 시험감염 전, 그룹 1 내지 3의 일부 새끼돼지는 로소니아에 대해 혈청양성이었고, 이로 인해 일부 모계 면역이 암퇘지 백신접종 동안 유도되었다는 것이 확인된다. 대조적으로, 그룹 4 내지 6의 모든 새끼돼지는 로소니아에 대해 혈청음성이었다. 그룹 1의 새끼돼지는, 그룹 4와 비교하여 분만일 및 7 및 14일차에 혈청양성 동물의 수가 유의적으로 많았다(P<0.05). 그룹 1의 새끼돼지는 또한 시험 63일차에 그룹 2와 유의적으로 차이가 있었다(P<0.05). 그룹 2는 그룹 5와 비교하여 7, 14 및 28일차에 혈청양성 동물의 수가 유의적으로 많았다(P<0.05). 모계 항체 검출은 그룹 1 내지 3에서 28일차까지 지속되었다. 그룹 1 내지 3의 모든 동물은 35일차까지 혈청음성이었다. 독성 시험감염 후, 그룹 1, 2, 4 및 5에서 일부 혈청전환이 검출되었다. 시험 56일차에 그룹 1과 4 간에 유의적인 차이(P<0.05)가 관찰되었다. 각각의 그룹에 대한 혈청전환 비를 아래의 표 8에 요약한다.

고찰

본 연구는, 높은 수준의 모계 항체 반응을 유도하려는 의도로 임신 제2 및 제3기 동안 백신을 고역가로 반복 투여한 후, 암퇘지에서 로소니아 백신의 안전성을 평가하였다. 임의의 백신접종된 암퇘지에서 IHC, t-PCR, 또는 육안 병리학으로 측정되는 로소니아 감염의 징후에 따라, 조직에서 로소니아가 검출되지 않았다. 또한, 임의의 백신접종된 암퇘지에서 로소니아의 분변 배출이 검출되지 않았다. 마지막으로, 백신접종된 암퇘지는 살아있는 건강한 새끼돼지의 수가 많았다. 따라서, 모두 상기 백신이 임신한 동물에서 안전하다는 것을 나타낸다.

이 복합 연구에는 로소니아-양성(A 그룹) 및 로소니아-음성 암퇘지(B 그룹)가 포함되었고, 이어서 이들로부터 분만된 새끼돼지를 백신접종시키거나(그룹 1과 4) 백신접종시키지 않았다(그룹 2와 5). 그룹 3과 6의 새끼돼지는 완전 대조군으로서 역할을 하여 처리 또는 시험감염 노출을 받지 않았다. 단일 변수(새끼돼지 백신접종 또는 암퇘지 백신접종)만 상이한 처리 그룹을 비교하여, 데이터를 분석한 후 결론을 도출하였다.

비경험(naive) 새끼돼지에서의 백신 효능으로, 돼지 공급원이 감수성이라는 것과 이러한 새끼돼지의 백신접종이 독성 이종 시험감염에 대해 효능을 제공하였다는 것이 확인된다. 이는 둘다 로소니아-음성 암퇘지로부터 유래된 그룹 4(백신접종)와 그룹 5(비-백신접종)의 비교를 요구하였다. 상기 데이터는, 평균 육안 회장 점수, 평균 육안 결장 점수, 분변 배출(f-PCR), 회장의 조직 콜로니 형성(t-PCR) 및 ADWG에서 그룹 4는 그룹 5와 유의적으로 차이가 있다(P<0.05)는 것을 나타내었다. 방주(side note)로서, 본 연구로 또한 Enterisol Ileitis B3903이 단일 투여 후 유효한 보호를 제공한다는 것이 확인된다. 또한 시험에서 사용된 돼지 공급원이 이종 독성 시험감염 노출에 대해 감수성이었다는 것이 확인 및 입증된다.

그룹 2(암퇘지 A 그룹으로부터의 새끼돼지)와 그룹 5(암퇘지 B 그룹으로부터의 새끼돼지)를 비교하여, 암퇘지 백신접종으로부터 유래된 잠재적인 모계 보호를 평가하였다. 상기 데이터는 평균 육안 회장 점수, 평균 현미경적 회장 및 결장 점수, 분변 배출(f-PCR), ADWG 및 혈청학에서 그룹 2와 5 간에 유의적인 차이(P<0.05)가 있었다는 것을 나타내었다. 이 데이터는 또한 생후 6주 이상 동안 독성 시험감염 노출에 대해 보호를 제공하는 일부 모계 면역의 형태가 있었다는 것을 나타내었다. 본 연구는 혈청학(IFA)을 추가로 측정하였고, 혈청양성 새끼돼지가 그룹 1 내지 3에서 분만일부터 28일차까지 검출될 수 있다는 것을 밝혀내었다. 흥미있는 기록에는, 시험감염일에 모든 그룹의 모든 돼지가 IFA 검정으로 혈청음성이었고, 이는 아마도 이 시험에서 사용한 검정이 독성 로소니아 노출에 대한 면역의 정확한 지표를 제공하지 않는다는 것을 암시한다. 점막 병원체로서의 병원체의 성질 및 무독성 살아있는 백신의 사용이 주어지면, 일부 세포 면역의 형태가 요인일 수 있다는 것이 가능하다.

본 연구의 또다른 목적은, 통상적으로 권장되거나 실시되는 것보다 초기에 새끼돼지를 백신접종시키는 방법을 사용하여, 모계 면역에 직면하여 유효한 백신접종이 달성될 수 있는지의 여부를 결정하는 것이었다. 이 검사를 위하여, 16 내지 26일령 새끼돼지의 유효한 백신접종을 확인하였다. 이 결정은 그룹 1(암퇘지 A 그룹으로부터의 백신접종된 새끼돼지)과 그룹 2(암퇘지 A 그룹으로부터의 비-백신접종된 새끼돼지)를 비교하여 수행하였다. 비교에 사용된 1차 변수는 회장 및 결장과 관련된 육안(거시적) 및 현미경적 병변이었다. 평균 육안 회장 점수는 그룹 1과 2의 경우에 각각 0.16 및 0.85였고, 유의적으로 차이가 있었다(P<0.05). 육안 병변이 있는 회장 샘플의 %는 그룹 1과 2의 경우에 각각 16% 및 45%였고, 이는 또한 유의적으로 차이가 있었다(P<0.05). 그룹 1의 새끼돼지는 또한 수적으로 육안 결장 점수가 낮았고, 회장 및 결장의 현미경적 병변이 적었으며, 조직 콜로니 형성(f-PCR)이 적었지만, 통계적으로 차이가 없었다. 전체적으로, 이 데이터에서 백신접종이 모계 면역 단독 이상으로 유효한 보호를 제공한다는 것이 확인된다.

위에서 논의된 하나를 제외한 모든 다른 그룹 비교는, 단일 연구 변수, 즉 암퇘지 백신접종 또는 새끼돼지 백신접종 둘다가 아닌 어느 하나를 기초로 하였다. 그룹 1과 5 간의 비교는 2개의 연구 변수(암퇘지 백신접종 및 새끼돼지 백신접종)에 직면한 데이터의 평가를 요구하였다. 그룹 2와 5는 일부 변수에서 통계적으로 차이가 있었고(P<0.05) 몇몇 다른 변수에서 수적으로 낮았다는 것을 유의해야 한다. 그룹 1과 5는 그룹 2와 5와 같이 대부분의 연구 변수에서 통계적으로 차이가 있을 것이라고 합리적으로 가정할 수 있다. 요약하면, 그룹 1과 5는 육안 회장 점수, 현미경적 회장 점수 및 현미경적 결장 점수의 1차 연구 변수를 포함하는 많은 변수에서 유의적인 차이(P<0.05)가 있는 것으로 결정되었다.

마지막으로, 그룹 3과 6(완전 대조군 그룹)에서 로소니아에 관한 돼지 상태를 확인하였고 돼지 공급원을 입증하였다. 이들 그룹은 통계 분석에 포함되지 않았다. 측정 및 평가한 모든 변수에서 이들 동물은, 로소니아-양성으로 기록된 그룹 6의 돼지 한마리의 현미경적 병변 점수를 제외하고는, 로소니아-음성이었다는 것이 확인된다. 모든 다른 변수로부터의 누적 데이터에 따라, 이는 착오였던 것으로 생각된다.

Claims

유효량의 로소니아 인트라셀룰라리스(Lawsonia intracellularis) 백신을 3주령 미만의 동물에게 투여하는 단계를 포함하여, 상기 동물에서 로소니아 인트라셀룰라리스 감염에 대해 증가된 보호를 제공하는 방법.
제1항에 있어서, 로소니아 인트라셀룰라리스 백신이 로소니아 인트라셀룰라리스 항원을 포함하는 방법.
제1항 내지 제2항 중의 어느 한 항에 있어서, 유효량이 용량 당 약 10³ 내지 약 10⁹ 개의 로소니아 인트라셀룰라리스 세균을 포함하는 방법.
제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 유효량이 용량 당 3.0 TCID₅₀ (조직 배양 감염 용량 50% 종말점) 내지 약 6.0 TCID₅₀의 로소니아 인트라셀룰라리스 세균을 포함하는 방법.
제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서, 동물이 돼지인 방법.
제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, 백신을 10일령 이상의 동물에게 투여하는 방법.
제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, 백신을 16일령 이상의 동물에게 투여하는 방법.
제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 있어서, 투여가 백신의 단일 투여를 포함하는 방법.
제1항 내지 제8항 중의 어느 한 항에 있어서, 투여가 경구 음약(oral drench)에 의한 것인 방법.
제1항 내지 제9항 중의 어느 한 항에 있어서, 어미가 동물을 임신하고 있는 동안 백신으로 상기 동물의 어미를 백신접종시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제10항에 있어서, 백신접종을 동물의 임신 제2 또는 제3기 동안 실시하는 방법.
제10항 또는 제11항 중의 어느 한 항에 있어서, 어미가 동물을 분만하기 전에 어미를 백신의 반복 투여로 백신접종시키는 방법.
제12항에 있어서, 어미가 동물을 분만하기 50 내지 60일 전에 제1의 백신접종을 실시하여 3회 백신접종시키는 방법.
제13항에 있어서, 동물을 분만하기 30 내지 40일 전에 제2의 백신접종을 실시하는 방법.
제13항 또는 제14항 중의 어느 한 항에 있어서, 동물을 분만하기 10 내지 20일 전에 제3의 백신접종을 실시하는 방법.
제10항 내지 제15항 중의 어느 한 항에 있어서, 고용량의 로소니아 인트라셀룰라리스 항원으로 백신접종시키는 방법.
제16항에 있어서, 고용량이 백신 중에 사용되는 로소니아 항원의 통상적인 양보다 3배 이상 많은 양의 로소니아 인트라셀룰라리스 항원을 포함하는 방법.
제10항 내지 제17항 중의 어느 한 항에 있어서, 항원이 변형된 살아있는 로소니아 인트라셀룰라리스 세균, 죽인 로소니아 인트라셀룰라리스 세균, 로소니아 인트라셀룰라리스 세균의 하나 이상의 서브유닛 및 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
제18항에 있어서, 변형된 살아있는 로소니아 인트라셀룰라리스 세균이 ATCC 수탁번호 PTA-4926, ATCC 수탁번호 55783 및 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
새끼돼지를 임신한 암퇘지를 로소니아 인트라셀룰라리스 감염에 대한 유효량의 백신으로 임신 제2 또는 제3기에 백신접종시키는 단계; 및

3주령 미만의 상기 새끼돼지를 로소니아 인트라셀룰라리스 감염에 대한 유효량의 백신으로 백신접종시키는 단계

를 포함하여, 새끼돼지에서 회장염에 대해 증가된 보호를 제공하는 방법.
제20항에 있어서, 백신접종을 새끼돼지를 분만하기 60일 전 이내에 실시하는 방법.
제20항 또는 제21항 중의 어느 한 항에 있어서, 암퇘지가 새끼돼지를 분만하기 전에 백신의 반복 투여로 암퇘지를 백신접종시키는 방법.
제20항 내지 제22항 중의 어느 한 항에 있어서, 암퇘지가 새끼돼지를 분만하기 50 내지 60일 전에 제1의 백신접종을 실시하여 3회 백신접종시키는 방법.
제23항에 있어서, 새끼돼지를 분만하기 30 내지 40일 전에 제2의 백신접종을 실시하는 방법.
제23항 내지 제24항 중의 어느 한 항에 있어서, 새끼돼지를 분만하기 10 내지 20일 전에 제3의 백신접종을 실시하는 방법.
제20항 내지 제25항 중의 어느 한 항에 있어서, 고용량의 로소니아 인트라셀룰라리스 항원으로 백신접종시키는 방법.
제26항에 있어서, 고용량이 백신 중에 사용되는 로소니아 항원의 통상적인 양보다 3배 이상 많은 양의 로소니아 인트라셀룰라리스 항원을 포함하는 방법.
제20항 내지 제27항 중의 어느 한 항에 있어서, 항원이 변형된 살아있는 로소니아 인트라셀룰라리스 세균, 죽인 로소니아 인트라셀룰라리스 세균, 로소니아 인트라셀룰라리스 세균의 하나 이상의 서브유닛 및 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
제28항에 있어서, 변형된 살아있는 로소니아 인트라셀룰라리스 세균이 ATCC 수탁번호 PTA-4926, ATCC 수탁번호 55783 및 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
로소니아 인트라셀룰라리스 감염에 대해 증가된 보호를 제공하는 유효량의 백신으로 10일령 이상 3주령 미만의 새끼 동물을 백신접종시키기 위한 약제의 제조를 위한 유효량의 로소니아 인트라셀룰라리스 항원의 의약 용도.
제30항에 있어서, 새끼 동물이 새끼돼지를 포함하는 의약 용도.
제30항 또는 제31항 중의 어느 한 항에 있어서, 유효량이 용량 당 약 10³ 내지 약 10⁹ 개의 세균을 포함하는 의약 용도.
제30항 내지 제32항 중의 어느 한 항에 있어서, 유효량이 용량 당 3.0 TCID₅₀내지 약 6.0 TCID₅₀을 포함하는 의약 용도.
제30항 내지 제33항 중의 어느 한 항에 있어서, 새끼 동물이 새끼돼지인 의약 용도.
제30항 내지 제34항 중의 어느 한 항에 있어서, 백신을 16일령 이상의 새끼 동물에게 투여하는 의약 용도.
제30항 내지 제35항 중의 어느 한 항에 있어서, 백신을 19일령 이상의 새끼 동물에게 투여하는 의약 용도.
제30항 내지 제36항 중의 어느 한 항에 있어서, 백신접종 단계가 단일 용량의 백신의 투여를 포함하는 의약 용도.
제30항 내지 제37항 중의 어느 한 항에 있어서, 백신접종 단계가 경구 음약에 의해 백신을 투여하는 단계를 포함하는 의약 용도.
제30항 내지 제38항 중의 어느 한 항에 있어서, 어미가 새끼 동물을 임신하고 있는 동안 약제로 상기 새끼 동물의 어미를 백신접종시키는 단계를 추가로 포함하는 의약 용도.
제39항에 있어서, 백신접종을 새끼 동물의 임신 제2 또는 제3기 동안 실시하는 의약 용도.
제39항 내지 제40항 중의 어느 한 항에 있어서, 어미가 새끼 동물을 분만하기 전에 백신의 반복 투여로 어미를 백신접종시키는 의약 용도.
제39항 내지 제41항 중의 어느 한 항에 있어서, 어미가 새끼 동물을 분만하 기 50 내지 60일 전에 제1의 백신접종을 실시하여 3회 백신접종시키는 의약 용도.
제42항에 있어서, 새끼 동물을 분만하기 30 내지 40일 전에 제2의 백신접종을 실시하는 의약 용도.
제42항 또는 제43항 중의 어느 한 항에 있어서, 새끼 동물을 분만하기 10 내지 20일 전에 제3의 백신접종을 실시하는 의약 용도.
제39항 내지 제44항 중의 어느 한 항에 있어서, 고용량의 로소니아 인트라셀룰라리스 항원으로 백신접종시키는 의약 용도.
제45항에 있어서, 고용량이 백신 중에 사용되는 로소니아 항원의 통상적인 양보다 3배 이상 많은 양의 로소니아 인트라셀룰라리스 항원을 포함하는 의약 용도.
제46항에 있어서, 항원이 변형된 살아있는 로소니아 인트라셀룰라리스 세균, 죽인 로소니아 인트라셀룰라리스 세균, 로소니아 인트라셀룰라리스 세균의 하나 이상의 서브유닛 및 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 의약 용도.
제47항에 있어서, 변형된 살아있는 로소니아 인트라셀룰라리스 세균이 ATCC 수탁번호 PTA-4926, ATCC 수탁번호 55783 및 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 의약 용도.