ES2630023T3 - Vacuna de lawsonia y métodos de uso de la misma - Google Patents

Abstract

Uso de una cantidad eficaz de antígeno de Lawsonia intracellularis para la preparación de un medicamento para proporcionar una protección aumentada contra la infección de Lawsonia intracellularis en un animal joven mediante un método, en el que (A) la madre de dicho animal joven ha de ser vacunada con dicho medicamento mientras dicha madre está embarazada de dicho animal joven y (B) dicho animal joven ha de ser vacunado con una dosis eficaz de dicho medicamento durante las tres primeras semanas de vida, en donde dicho animal joven es un cochinillo, y, en donde dicho antígeno es una bacteria de Lawsonia intracellularis viva modificada.

Description

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DESCRIPCION

Vacuna de lawsonia y metodos de uso de la misma Antecedentes de la invencion Campo de la invencion

Se describen metodos mejorados de vacunacion para la inmunizacion contra la enteritis proliferativa porcina, conocida como ileftis, que es provocada por una bacteria intracelular obligada, la Lawsonia intracellularis (Lawsonia o L. intracellularis). Espedficamente, se describen metodos para proporcionar una proteccion incrementada contra L. intracellularis mediante la vacunacion de cerdas prenadas; mediante la vacunacion de cerdas prenadas y posterior vacunacion de los cochinillos en aproximadamente las primeras tres semanas de vida; y mediante la vacunacion de cochinillos en los primeros 25 o 26 dfas de vida, respectivamente.

Descripcion de la Tecnica Anterior

La enteritis proliferativa porcina (PPE) es una enfermedad natural que puede afectar a los cerdos desde las etapas de destetado hasta las de adulto joven. Se ha determinado que el agente causante es la Lawsonia intracellularis, una bacteria intracelular obligada, gram-negativa, que no puede ser cultivada empleando metodos bacteriologicos normales o medios convencionales libres de celulas, y se cree que es necesario que haya celulas para su crecimiento. S. McOrist y col., Infection and Immunity, Vol. 61, N° 19, 4286-4292 (1993) y G. Lawson y col., J. of Clinical Microbiology, Vol. 31, N° 5, 1136-1142 (1993) discuten la cultivacion de L. intracellularis usando monocapas de celulas epiteliales de intestino de rata IEC-18 en matraces convencionales de cultivo de tejidos. En las Patentes de EE.UU. N° 5.714.375 y 5.885.823, se describe el cultivo de L. intracellularis en celulas hospedantes suspendidas.

En el estado de la tecnica se conocen bien las cepas de bacterias L. intracellularis patogenicas y no patogenicas atenuadas. Por ejemplo, los documentos WO 96/39629 y WO 05/011731 describen cepas no patogenicas atenuadas de L. intracellularis. Otras cepas de bacterias atenuadas de L. intracellularis son descritas en los documentos WO 02/26250 y WO 03/00665. La enfermedad se caracteriza en primer lugar por su patologfa macroscopica y microscopica, y mas tarde por la presencia de la bacteria intracelular dentro de las celulas afectadas. La caractenstica patologica caractenstica de la enfermedad es la proliferacion de celulas epiteliales inmaduras en las criptas del fteon (parte final del intestino delgado), del intestino grueso o de ambos. Las secciones de tejido infectado se caracterizan por una mucosa engrosada enrojecida que se parece a una "manguera de jardm", y lesiones intestinales. El engrosamiento del intestino previene en ultima instancia la funcion normal del intestino, las capacidades de absorcion, y la transferencia de nutrientes. Los efectos clmicos de la enfermedad son perdida de peso cronica, incapacidad de que un animal joven crezca o gane peso a la razon promedio acostumbrada ("unthriftiness"), diarrea, y muerte. La enfermedad es de importancia economica debido a la perdida por muertes, el aumento de costes de medicacion, la escasa ganancia de peso y la disminucion de conversion del alimento en los animales afectados. Los casos clmicos de ileftis se observan especialmente en cerdos de 6-20 semanas de edad. Sin embargo, la presencia de L. intracellularis se ha confirmado (mediante PCR) en cerdos recientemente destetados (3-4 semanas de edad), lo que sugiere que la exposicion a L. intracellularis tiene lugar en el criadero y quizas es originada a partir de madres positivas en Lawsonia (Mauch y Bilkei (2004) Vet Rec 155: 532; Marsteller et al. (2003). Swine Health Prod 11:127-130; Stege y col. (2004). Vet Micro 104: 197-206). Estas observaciones subrayan la importancia de la incorporacion de estrategias de prevencion tales como la vacunacion temprana en el sistema de produccion. Walter et al. 2004 (J. od Swine Health Prod. 12(6): 310-313) describe la pauta de vacunacion para Lawsonia intracellularis.

Las actuales estrategias de vacunacion para la inmunizacion contra la ileftis implican la administracion oral de la vacuna a cerdos sensibles a Lawsonia desde tan solo tres semanas de edad en adelante, debido a que los cochinillos por debajo de este grupo de edad podnan presentar anticuerpos maternos positivos para la L. intracellularis debido a una exposicion o vacunacion previa de la cerda. Antes de los metodos aqrn descritos se crefa que la presencia de anticuerpos maternos o de otros factores lactogenicos podna interferir potencialmente con la eficacia de las vacunaciones de los cochinillos, debido a que los anticuerpos maternales tienen la capacidad de neutralizar la vacuna antes de que el sistema inmune del cochinillo pueda reconocerla y comenzar a segregar sus propios anticuerpos. Por lo tanto, la vacunacion de cochinillos jovenes se ha evitado en favor de la inmunidad materna.

Compendio de la invencion

La presente invencion supera las deficiencias de la tecnica anterior y proporciona el uso de una cantidad eficaz de antfgeno de Lawsonia intracellularis para la preparacion de un medicamento para proporcionar proteccion incrementada contra la infeccion por Lawsonia intracellularis.en un animal joven, en donde

(a) la madre de dicho animal joven se va a vacunar con dicho medicamento mientras que dicha madre esta en periodo de gestacion de dicho animal joven, y

(b) dicho animal joven se va a vacunar con uns dosis eficaz de dicho medicamento durante las tres primeras semanas de vida,

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en donde dicho animal joven es un lechon, y, en donde dicho antigeno es una bacteria Lawsonia intracellularis viva modificada.

Se describe un metodo para administrar una cantidad inmunologicamente eficaz de vacuna a cerdas, y/o a cochinillos jovenes en las primeras semanas de edad, con el fin de inmunizarlos contra la ileftis. Se descubrio que la transferencia de inmunidad materna desde una cerda vacunada contra Lawsonia, o expuesta a ella, a los cochinillos proporciona algo de proteccion contra la ileftis en los cochinillos durante al menos 6 semanas despues del nacimiento. Sin embargo, a menos que fueran vacunados, rapidamente se volvfan susceptibles a la enfermedad. Se ha demostrado que el uso de la vacuna en animales prenados en dosis elevadas, despues de dosis repetidas, e incluso cuando se administraba durante la segunda o la tercera etapa de gestacion, era sorprendentemente seguro y eficaz para proporcionar inmunidad materna.

Se describe un metodo para la vacunacion de animales prenados (preferiblemente cerdos) contra las infecciones de L. intracellularis, en el que dichos animales prenados son vacunados con antigeno de L. intracellularis. Adicionalmente, se describe la vacunacion con altas dosis y/o con dosis repetidas de antigeno de L. intracellularis. Ademas se describe un metodo para la vacunacion de animales prenados (preferiblemente cerdos) contra infecciones de L. intracellularis, en el que dichos animales prenados son vacunados durante la segunda o la tercera etapa de gestacion, preferiblemente dichos animales prenados son vacunados con altas dosis y/o con repetidas dosis de antigeno de L. intracellularis.

Se describe un metodo para vacunar cerdos contra la ileftis mediante la administracion de una vacuna de Lawsonia a una cerda prenada al menos una vez antes del parto, preferiblemente dos veces antes del parto y mas preferiblemente tres veces antes del parto (“dosis repetidas”). Preferiblemente las cerdas prenadas se vacunan con altas dosis del antfgeno de L. intracellularis. Cuando la vacuna se administra a la cerda tres veces, la primera administracion debena producirse entre 50 y 60 dfas antes del parto, preferiblemente entre 52 y 58 dfas antes del parto, y mas preferiblemente entre 54 y 56 dfas antes del parto. La segunda administracion debena producirse entre 30 y 40 dfas antes del parto, preferiblemente entre 32 y 38 dfas antes del parto, y mas preferiblemente entre 34 y 36 dfas antes del parto. La administracion final debena producirse entre 10 y 20 dfas antes del parto, preferiblemente entre 12 y 18 dfas antes del parto, y mas preferiblemente entre 14 y 16 dfas antes del parto. Una vez la cerda ha dado a luz se administra la vacuna a cada uno de los cochinillos, despues de que son destetados y hasta la matanza, pero preferiblemente antes de que alcancen las tres semanas de edad, en cualquier caso, al menos en los primeros 10 a 25-26 dfas de edad, respectivamente (preferiblemente entre 16 y 26 dfas de edad), mas preferiblemente entre 10 y 21 dfas de edad, incluso mas preferiblemente entre 15 y 21 dfas de edad, y aun mas preferiblemente entre 19 y 21 dfas de edad. Preferiblemente la vacuna se administra a cada uno de los cochinillos antes de los 26 dfas de edad, preferiblemente entre los 16 y los 26 dfas de edad, mas preferiblemente entre los 18 y los 24 dfas de edad, aun mas preferiblemente entre los 19 y los 22 dfas de edad, y aun mas preferiblemente a los 21 dfas de edad.

Se describe un metodo para vacunar cerdas prenadas asf como cochinillos recien nacidos. Preferiblemente, las cerdas prenadas y los cochinillos recien nacidos se vacunan como se ha descrito anteriormente.

Tambien se descubrio que la inmunidad materna, inesperadamente, no interfiere con la vacunacion exitosa de los cochinillos al poco de nacer, y de hecho los cochinillos vacunados en las primeras tres semanas despues del parto, tal como se describe en la presente memoria, presentan menos patologfa macroscopica asociada a la enfermedad en comparacion con los cochinillos no vacunados.

Por tanto, se describe un metodo para la vacunacion de animales jovenes (preferiblemente de cochinillos jovenes) en las primeras tres semanas desde el parto contra infecciones de L. intracellularis. Preferiblemente, dichos animales jovenes (preferiblemente cochinillos jovenes) se vacunan a la edad de 21 +5 dfas. Incluso mas preferiblemente, dichos animales jovenes (preferiblemente cochinillos jovenes) se vacunan respectivamente a la edad de 10 a 25 y 26 dfas. Incluso mas preferiblemente, dichos animales jovenes (preferiblemente cochinillos jovenes) se vacunan a la edad de 10 a 21 dfas. Incluso mas preferiblemente, dichos animales jovenes (preferiblemente cochinillos jovenes) se vacunan respectivamente a la edad de 12 a 21 dfas. Incluso mas preferiblemente, dichos animales jovenes (cochinillos jovenes preferiblemente) se vacunan respectivamente a la edad de 15 a 21 dfas, mas preferiblemente a la edad de 19 a 21 dfas. Preferiblemente la vacuna se administra a cada uno de los cochinillos antes de los 26 dfas de edad, preferiblemente entre los 16 y los 26 dfas de edad, mas preferiblemente entre los 18 y los 24 dfas de edad, aun mas preferiblemente entre los 19 y los 22 dfas de edad, y aun mas preferiblemente a los 21 dfas de edad. La vacuna para uso puede ser cualquier vacuna que proporcione proteccion contra L. intracellularis. Preferiblemente, la vacuna es una vacuna de virus vivo de L. intracellularis. Mas preferiblemente, la vacuna es Enterisol® Ileitis B3903 (Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc.).

La vacuna se administra a animales, preferiblemente a mairftferos, y aun mas preferiblemente a cerdos, en cualquier modo convencional, mas preferiblemente mediante un empapado oral.

La dosificacion que se va a administrar dependera del caso particular, pero en cualquier caso, es la cantidad suficiente para inducir una respuesta inmune de anticuerpo protector y/o mediada por celulas contra la ileftis. La dosificacion apropiada puede determinarse empleando medios conocidos en la tecnica sin necesidad de experimentacion indebida, y casi siempre sera contingente con la vacuna concreta utilizada. En muchos casos, una

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dosificacion adecuada oscila entre 0,1 mL y 10 mL, y preferiblemente entre aproximadamente 1 mL y 5 mL. En el caso de Enterisol® Ileitis, la dosificacion es preferiblemente al menos 2 mL por cerdo. Tambien se pueden calcular las dosis en una base de peso seco por peso del cerdo para preparar vacunaciones no acuosas.

Los estudios presentados en los ejemplos mostrados a continuacion fueron llevados a cabo para evaluar la eficacia de la vacuna en cerdos derivados de cerdas expuestas a Lawsonia intracellularis y de cerdas negativas en Lawsonia. Ademas, los estudios evaluaron si existia alguna interferencia materna procedente de la vacunacion de los cochinillos de tres semanas de edad.

Descripcion detallada de la invencion

El termino "vacunacion" o "vacunar" como se utiliza en la presente memoria significa, pero no esta limitado a ello, un procedimiento que incluye la administracion de un antigeno de L. intracellularis a un animal, en el que dicho antfgeno de L. intracellularis, cuando se administra a dicho animal provoca o es capaz de provocar una respuesta inmunitaria en dicho animal contra la L. intracellularis.

El termino "animal" tal como se usa en la presente memoria, significa aunque sin limitarse a ellos, pajaros, peces y mairnferos tales como ganado, cerdos, caballos y primates. Sin embargo, preferiblemente, el animal es un cerdo, preferiblemente un cochinillo de 10 a 25 y 26 dfas de edad, respectivamente, preferiblemente entre 10 y 21 dfas de edad, incluso mas preferiblemente entre 15 y 21 dfas de edad, y aun mas preferiblemente entre 19 y 21 dfas de edad. Preferiblemente, el cochinillo tiene menos de 26 dfas de edad, preferiblemente entre 16 y 26 dfas de edad, mas preferiblemente entre 18 y 24 dfas de edad, aun mas preferiblemente entre 19 y 22 dfas de edad, y aun mas preferiblemente 21 dfas de edad.

El termino "una dosis eficaz" o "dosificacion eficaz" tal como se usa en la presente memoria significa, aunque sin limitarse a ello, una cantidad de antigeno que provoca o que es capaz de provocar una respuesta inmune en un animal, al que se le administra dicha dosis eficaz de antfgeno de L. intracellularis.

Una "respuesta inmunologica o inmune" a una composicion o vacuna es el desarrollo en el huesped de una respuesta inmune celular y/o mediada por anticuerpos a la composicion o vacuna de interes. Asf, la terminologfa "provoca o es capaz de provocar una respuesta inmunitaria" significa, pero no esta limitada a un proceso inmunologico en un anfitrion caracterizado por que dicho anfitrion desarrolla una respuesta inmunitaria celular y/o mediada por anticuerpos a la composicion o vacuna de interes. Habitualmente, una "respuesta inmune" incluye, pero no se limita a ello, uno o mas de los siguientes efectos: la produccion o activacion de anticuerpos, celulas B, celulas T auxiliares, celulas T supresoras y/o celulas T citotoxicas y/o celulas T yd, dirigidas espedficamente a un antfgeno o antfgenos incluidos en la composicion o vacuna de interes. Preferiblemente, el hospedante exhibira una respuesta

inmunologica terapeutica o protectora, de modo que la resistencia a la nueva infeccion resultara reforzada y/o la gravedad clmica de la enfermedad quedara reducida. Una proteccion de este tipo quedara demostrada por una reduccion, que incluye una reduccion de la gravedad, o por la carencia de los smtomas asociados con infecciones de hospedante segun se han descrito anteriormente.

La cantidad de antfgeno que es eficaz para provocar una respuesta inmunitaria o es capaz de provocar una respuesta inmunitaria en un animal depende de los ingredientes de la vacuna y el programa de administracion. Tfpicamente, cuando se usa antfgeno bacteriano muerto en la vacuna, la vacuna contiene una cantidad de aproximadamente 103 a aproximadamente 109 bacterias por dosis, preferiblemente de aproximadamente 104 a aproximadamente 108 bacterias por dosis, y aun mas preferiblemente de aproximadamente 105 a aproximadamente 106 bacterias por dosis.

En particular, cuando se usan bacterias L. intracellularis vivas modificadas en las vacunas, por ejemplo los elementos aislados de bacterias B3903, N° de acceso ATCC PTA-4926 y el elemento aislado designado N34NP40wk, N° de acceso ATCC 55783 (ambos descritos en el documento WO 96/39629 y en el WO 05/011731), la dosis recomendada para ser administrada al animal susceptible es preferiblemente de aproximadamente 3,0 TCID50 (dosis infectiva de cultivo de tejido de punto final 50%)/dosis a aproximadamente 6,0 TCID50/dosis, y mas preferiblemente de aproximadamente 4,0 TCID50/dosis a aproximadamente 5,0 TCID50/dosis. Preferiblemente el tftulo de la vacuna es aproximadamente 4,9 TCID50 /dosis segun se determina por el ensayo de dilucion de punto final de la Dosis Infectiva del 50% de los Cultivos Tisulares inoculados (TCID50).

Vacunas sub-unidad son administradas normalmente con un nivel de inclusion de antfgenos de al menos 0,2 |jg de antfgeno por dosis, preferiblemente con aproximadamente 0,2 hasta aproximadamente 400 jg/dosis, todavfa mas preferiblemente con aproximadamente 0,3 hasta aproximadamente 200 jg/dosis, incluso mas preferiblemente con aproximadamente 0,35 hasta aproximadamente 100 jg/dosis, aun mas preferiblemente con aproximadamente 0,4 hasta aproximadamente 50 jg/dosis, aun mas preferiblemente con aproximadamente 0,45 hasta aproximadamente 30 jg/dosis, aun mas preferiblemente con aproximadamente 0,6 hasta aproximadamente 15 jg/dosis, incluso mas preferiblemente con aproximadamente 0,75 hasta aproximadamente 8 jg/dosis, incluso mas preferiblemente con aproximadamente 1,0 hasta aproximadamente 6 jg/dosis, y aun mas preferiblemente con aproximadamente 1,3 hasta aproximadamente 3,0 jg/dosis.

En general, la cantidad de antfgeno se encontrara entre 5 y 5000 microgramos, y entre 102,0 y 109,0 TCID50,

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preferiblemente entre 103,0 y 10 6,0 TCID50, mas preferiblemente entre 10 4,0 y 10 5,0 TCID50, cuando se emplean bacterias purificadas.

Tal como se usa en la presente memoria, el termino "altas dosis" significa en general al menos tres veces la cantidad de antigeno de una dosis sencilla usada normalmente para la vacunacion de animales adultos. En particular, el termino "altas dosis" significa en relacion a L. intracellularis vivas modificadas una cantidad de al menos 3 x 1030 a 3 x 109,0 TCID50, preferiblemente de aproximadamente 3 x 104,5 a 3 x 106,0 TCID50. En particular, el termino "altas dosis" significa en relacion a antfgeno de L. intracellularis muertas una cantidad de al menos 3 x 1040 a 3 x 1090 organismos o bacterias, preferiblemente de aproximadamente 3 x 106,0 a 3 x 108,0 organismos o bacterias. En particular, el termino "altas dosis" significa en relacion a cualquier sub-unidad de antigeno de L. intracellularis una cantidad de al menos 3 x 0,2 a aproximadamente 3 x 400 (de 0,6 a aproximadamente 1200) pg/dosis. En esta solicitud, se administraron altas dosis de antfgeno de L. intracellularis a cerdas prenadas con el fin de inducir una respuesta inmunologica aumentada en la cerda prenada que se transmitiera al recien nacido y proporcionara algun grado de inmunidad a los cochinillos recien nacidos.

Tal como se usa en la presente memoria, el termino “dosis repetidas” significa la administracion del antfgeno de L. intracellularis en al menos dos veces, preferiblemente en tres veces. Anteriormente se han presentado ejemplos de un regimen de vacunacion de "dosis repetidas" para cerdas prenadas.

Tal como se usa en la presente memoria, el termino "proteccion aumentada" significa, aunque sin limitarse a ello, una reduccion significativa estadfsticamente en la gravedad o en la frecuencia de uno o mas smtomas clmicos y/o en el desarrollo de lesiones que estan asociadas a infecciones de L. intracellularis (por ejemplo, la frecuencia de lesiones cruzadas determinada mediante el metodo definido en el Ejemplo 1 y segun los criterios definidos en el mismo, etc.) en un grupo de animales vacunados frente a un grupo de animales de control no vacunados. El termino "reduccion estadfsticamente significativa de los smtomas clmicos" significa, aunque no se limita a ello, que la frecuencia de la incidencia de al menos un smtoma clmico y/o desarrollo de lesion en el grupo de animales vacunados es al menos un 20%, preferiblemente un 30%, incluso mas preferiblemente un 40%, aun mas preferiblemente un 50%, incluso mas preferiblemente un 60%, aun mas preferiblemente un 70%, incluso mas preferiblemente un 80%, aun mas preferiblemente un 90%, y todavfa mas preferiblemente un 95% menor que en el grupo de control no vacunado tras exposicion a bacterias infecciosas de L. intracellularis.

Tal como se usa en la presente memoria, el termino "L. intracellularis" o "Lawsonia" significa la bacteria intracelular curvada gram-negativa descrita con detalle por C. Gebhart ycol., Int'l. J. of Systemic Bacteriology, Vol. 43, N° 3, 533538 (1993) y S. McOrist y col., Int'l. J. of Systemic Bacteriology, Vol. 45, N° 4, 820-825 (1995), se incluye, pero no esta limitada a ellos, los elementos aislados descritos en el documento WO 96/39629 y en el documento WO 05/011731. En particular, la terminologfa “L. intracellularis" tambien significa, pero no esta limitada a ellos, los elementos aislados depositados bajo el Tratado de Budapest con la American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209 y con numero de registro de la ATCC asignado PTA 4926 o numero de registro de la ATCC 55783. Ambos elementos aislados se describen en el documento WO 96/39629 y en el documento WO 05/011731, respectivamente. El termino “L. intracellularis” tambien significa, aunque no esta limitado a ello, cualquier otra cepa de bacterias L. intracellularis, o elemento aislado, que tenga preferiblemente las propiedades inmunogenicas de al menos una de las cepas de L. intracellularis descritas en el documento WO 96/39629 y en el WO 05/011731, que tenga en particular las propiedades inmunogenicas de al menos uno de los elementos aislados del Tratado de Budapest con el American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209 y que tenga asignado el numero de acceso ATCC PTA 4926 o el numero de acceso ATCC 55783.

Una cepa o elemento aislado tiene las "propiedades inmunogenas" de al menos una de las cepas de L. intracellularis descritas en el documento WO 96/39629 y en el documento WO 05/011731, en particular, de los elementos aislados depositados como numero de acceso ATTC PTA 4926 o numero de acceso ATCC 55783, cuando es detectable al menos con uno de los anticuerpos espedficos anti-L .intracellularis, descritos en el documento WO06/01294, en un ensayo de deteccion que tambien se describe en el documento WO06/01294. Preferentemente estos anticuerpos se seleccionan de los anticuerpos que tienen los numeros de referencia 301:39, 287:6, 268:29, 110:9, 113:2 y 268:18. Preferiblemente, el ensayo de deteccion es un ELISA de tipo sandwich de doble anticuerpo como se describe en los Ejemplos 2 y 3 del documento WO06/12949, en los que se utiliza el anticuerpo 110:9 como un anticuerpo de captura y el anticuerpo 268:29 se utiliza como anticuerpo conjugado. Todos los anticuerpos descritos en el documento WO06/12949 estan producidos por celulas de hibridoma, los cuales estan depositados en el Centro para Microbiologfa Aplicada y Desarrollo (Centre for Applied Microbiology and Research) (CAMR) y en la Coleccion Europea de Cultivos Celulares (European Collection of Cell Cultures) (ECACC), Salisbury, Wiltshire SP4 0JG, R.U., como deposito de patente segun el Tratado de Budapest. La fecha de deposito fue el 11 de mayo de 2004. La LfNEA CELULAR DE HIBRIDOMA 110:9 se deposito satisfactoriamente bajo el N° de reg. de la ECACC 04092204. La LfNEA CELULAR DE HIBRIDOMA 113:2 se deposito satisfactoriamente bajo el N° de reg. de la ECACC 04092201. La LfNEA CELULAR DE HIBRIDOMA 268:18 se deposito satisfactoriamente bajo el N° de reg. de la ECACC 04092202. La LfNEA CELULAR DE HIBRIDOMA 268:29 se deposito satisfactoriamente bajo el N° de reg. de la ECACC 04092206. La LfNEA CELULAR DE HIBRIDOMA 287:6 se deposito satisfactoriamente bajo el N° de reg. de la ECACC 04092203. La LfNEA CELULAR DE HIBRIDOMA 301:39 se deposito satisfactoriamente bajo el N° de reg. de la ECACC 04092205.

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La terminolog^a “antigeno de L. intracellularis" tal como se utiliza en la presente memoria significa, pero no esta limitada a ello, cualquier composicion de materia, que comprende por lo menos un antigeno que puede inducir, estimular o potenciar la respuesta inmunitaria contra una infeccion causada por L. intracellularis, cuando se administra a un animal. Preferiblemente, dicho antigeno de L. intracellularis es una bacteria L. intracellularis completa, en particular en una forma inactivada (una asf llamada bacteria muerta), una bacteria L. intracellularis viva modificada o atenuada (una asf llamada MLB), cualquier sub-unidad, polipeptido o componente de L. intracellularis, o cualquier vector quimerico, que comprende al menos una secuencia de aminoacidos inmunogenica de L. intracellularis. Las expresiones "protema inmunogenica”, “polipeptido inmunogenico” o “secuencia de aminoacidos inmunogenica”, tal como se utiliza en la presente memoria, se refieren a cualquier secuencia de aminoacidos que provoca una respuesta inmunitaria en un hospedante contra un agente patogeno que comprende dicha protema inmunogenica, polipeptido inmunogenico o secuencia de aminoacidos inmunogenica. En particular, una "protema inmunogena", "polipeptido inmunogeno" o "secuencia de aminoacidos inmunogena" de L. intracellularis significa cualquier secuencia de aminoacidos que codifica un antfgeno que provoca una respuesta inmunologica contra L. intracellularis en un anfitrion al que se administra dicha protema inmunogena", "polipeptido inmunogeno" o "secuencia de aminoacidos inmunogena".

Una "protema inmunogenica", "polipeptido inmunogenico" o "secuencia de aminoacidos inmunogenica", tal como se utiliza en la presente memoria, incluye pero no esta limitada a ella, la secuencia de longitud completa de cualesquier protemas, sus analogos, o sus fragmentos inmunogenicos. La terminologfa "fragmento inmunogeno" significa un fragmento de una protema que incluye uno o mas epftopos y asf provoca la respuesta inmunologica contra el agente patogeno relevante. Tales fragmentos se pueden identificar utilizando cualquier numero de tecnicas de mapeo de epftopos que son bien conocidas en la tecnica. Vease, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, Nueva Jersey. Por ejemplo, los epftopos lineales pueden determinarse, por ejemplo, sintetizando concurrentemente grandes numeros de peptidos sobre soportes solidos, correspondiendo los peptidos a porciones de la molecula de la protema, y haciendo reaccionar los peptidos con anticuerpos, mientras los peptidos siguen estando fijados a los soportes. Tecnicas de este tipo son conocidas en la tecnica y se describen, por ejemplo, en la patente de EE.UU. n° 4.708.871; Geysen y col. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:3998-4002; y Geysen y col. (1986), Molec. Immunol., 23:709-715. De manera similar, los epftopos conformacionales se identifican facilmente determinando la conformacion espacial de aminoacidos tales como, por ejemplo, cristalograffa de rayos x y resonancia magnetica nuclear bidimensional. Vease, p. ej., Epitope Mapping Protocols, supra. Tambien se incluyen dentro de la definicion antfgenos sinteticos, por ejemplo poliepftopos, epftopos flanqueantes y otros antfgenos recombinantes u obtenidos de forma sintetica. Vease, por ejemplo, Bergmann y col. (1993) Eur. J. Immunol. 23:2777-2781; Bergmann y col. (1996), J. Immunol., 157:32423249; Suhrbier, A. (1997), Immunol. and Cell Biol., 75: 402-408; y Gardner y col., (1998) 12th World AIDS Conference, Ginebra, Suiza, 28 de junio - 3 de julio, 1998.

Los antfgenos de L.intracellularis adecuados incluyen, pero no se limitan a los descritos en los documentos EP 1219711; US 6.605.696; WO 96/39629; WO97/20050; WO 00/69903; WO 00/69904; WO 00/69905; WO 00/69906; WO 02/38594; WO 02/26250; WO 03/006665; WO 04/033631; WO 05/026200; y WO 05/011731.

Por tanto, la vacuna para uso incluye cualquier antfgeno de L. intracellularis como los descritos anteriormente que provoque o que sea capaz de provocar una respuesta inmune contra L. intracellularis. Preferiblemente, dicha vacuna proporciona al menos proteccion aumentada contra L. intracellularis.

Se describe un metodo de vacunacion de un animal joven contra infecciones de L. intracellularis que comprende la etapa de administrar a dicho animal joven en las tres primeras semanas de edad una dosis eficaz de antfgeno de L. intracellularis, en donde el antfgeno de L. intracellularis se selecciona del grupo que consiste en bacterias L. intracellularis vivas modificadas, bacterias L. intracellularis muertas o una o mas subunidades de bacterias L. intracellularis. Preferiblemente la vacunacion se produce entre el dfa 10 y el dfa 26 de edad, mas preferiblemente entre el dfa 12 y el dfa 21 de edad, incluso mas preferiblemente entre el dfa 15 y el dfa 21 de edad, y aun mas preferiblemente entre el dfa 19 y el dfa 21 de edad. La vacunacion se produce preferiblemente antes de los 26 dfas de edad, preferiblemente entre los 16 y los 26 dfas de edad, mas preferiblemente entre los 18 y los 24 dfas de edad, aun mas preferiblemente entre los 19 y los 22 dfas de edad, y aun mas preferiblemente a los 21 dfas de edad.

Preferiblemente, la vacuna comprende bacterias L. intracellularis vivas modificadas. Mas preferiblemente, la vacuna es Enterisol® Ileitis B3903 (Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc.).

Se describe un metodo de vacunacion de un animal joven, preferiblemente un cochinillo joven, contra infecciones de L. intracellularis que comprenden la etapa de administrar a dicho animal joven comenzando entre los 10 y los 26 dfas de edad, mas preferiblemente entre los 12 y los 21 dfas de edad, incluso mas preferiblemente entre los 15 y los 21 dfas de edad, y aun mas preferiblemente entre los 19 y los 21 dfas de edad, o al animal joven antes de los 26 dfas de edad, preferiblemente entre los 16 y los 26 dfas de edad, mas preferiblemente entre los 18 y los 24 dfas de edad, aun mas preferiblemente entre los 19 y los 22 dfas de edad, y mas preferiblemente a los 21 dfas de edad, una dosis de aproximadamente 3,0 TCID50 a aproximadamente 6,0 TCID50 de bacterias L. intracellularis vivas modificadas. Preferiblemente, dichas bacterias son las incluidas en la vacuna Enterisol® Ileitis B3903 (Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc.).

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Se describe un metodo de vacunacion de un animal joven, preferiblemente un cochinillo joven, contra infecciones de L. intracellularis que comprenden la etapa de administrar a dicho animal joven comenzando entre los 10 y los 26 dfas de edad, mas preferiblemente entre los 12 y los 21 dfas de edad, incluso mas preferiblemente entre los 15 y los 21 dfas de edad, y aun mas preferiblemente entre los 19 y los 21 dfas de edad, o al animal joven antes de los 26 dfas de edad, preferiblemente entre los 16 y los 26 dfas de edad, mas preferiblemente entre los 18 y los 24 dfas de edad, aun mas preferiblemente entre los 19 y los 22 dfas de edad, y mas preferiblemente a los 21 dfas de edad, una dosis eficaz de antigeno de L. intracellularis, en donde el animal joven es negativo en anticuerpos maternos L. intracellularis y anti-L. intracellularis.

Se describe un nuevo uso medicinal de una cantidad eficaz de antfgeno de L. intracellularis para la preparacion de un medicamento, preferiblemente una composicion de vacuna, para la vacunacion de un animal joven, preferiblemente un cochinillo joven, entre los 10 y los 26 dfas de edad, mas preferiblemente entre los 12 y los 21 dfas de edad, incluso mas preferiblemente entre los 15 y los 21 dfas de edad, y aun mas preferiblemente entre los 19 y los 21 dfas de edad, o antes de los 26 dfas de edad, preferiblemente entre los 16 y los 26 dfas de edad, mas preferiblemente entre los 18 y los 24 dfas de edad, aun mas preferiblemente entre los 19 y los 22 dfas de edad, y mas preferiblemente a los 21 dfas de edad.

Se describe el uso medicinal descrito anteriormente, el antigeno de L. intracellularis se selecciona del grupo que consiste en una bacteria L. intracellularis viva modificada, una bacteria L. intracellularis muerta o una o mas sub- unidades de la bacteria L. intracellularis. Preferiblemente, el antfgeno de L. intracellularis es bacteria L. intracellularis viva modificada. Mas preferiblemente, a dicho animal joven se le administra una dosis de aproximadamente 3,0 TCID50 a aproximadamente 6,0 TCID50 de bacterias L. intracellularis vivas modificadas. La fabricacion de las composiciones de vacuna que comprenden un antigeno de L. intracellularis es convencional en el estado de la tecnica y es conocida por el especialista en el campo. Por ejemplo, el experto en la tecnica puede conocer componentes adicionales que pueden estar comprendidos en dicha composicion (vease tambien Remington's Pharmaceutical Sciences, (1990), 18a ed. Mack Publ., Easton). El experto puede utilizar disoluciones esteriles inyectables conocidas, fisiologicamente aceptables. Para preparar una disolucion lista para el uso como inyeccion o infusion parenteral, se encuentran disponibles facilmente disoluciones isotonicas acuosas, tales como, por ejemplo, una disolucion salina o las correspondientes disoluciones de protemas en plasma. Las composiciones de vacunas pueden estar presentes en forma de liofilizados o preparaciones secas, las cuales se pueden reconstituir con una solucion inyectable conocida, directamente antes del uso bajo condiciones esteriles, p. ej. en forma de un kit de piezas.

Ademas, las composiciones inmunogenicas y de vacuna pueden incluir uno o mas soportes aceptables desde el punto de vista veterinario. Tal como se emplea en esta memoria,"un soporte aceptable desde el punto de vista veterinario" incluye uno y cualesquiera disolventes, medios dispersantes, recubrimientos, adyuvantes, agentes estabilizadores, diluyentes, conservantes, agentes antibacterianos y antifungicos, agentes isotonicos, agentes que demoran la adsorcion y similares.

Los "diluyentes" pueden incluir agua, disolucion salina, dextrosa, etanol, glicerol y similares. Los agentes isotonicos pueden incluir cloruro de sodio, dextrosa, manitol, sorbitol y lactosa, entre otros. Los estabilizantes incluyen albumina y sales alcalinas de acido etilendiamintetracetico, entre otros.

“Adyuvantes”, tal como se utilizan en la presente memoria, pueden incluir hidroxido de aluminio y fosfato de aluminio, saponinas, por ejemplo, Quil A, QS-21 (Cambridge Biotech Inc., Cambridge MA), GPI-0100 (Galenica Pharmaceuticals, Inc., Birmingham, AL), emulsion de agua en aceite, emulsion de aceite en agua o emulsion de agua en aceite en agua. La emulsion se puede basar, en particular, en aceite de parafina lfquido ligero (del tipo de la Farmacopea Europea); aceite isoprenoide, tales como escalano o escaleno; aceite resultante de la oligomerizacion de alquenos, en particular de isobuteno o deceno; esteres de acidos o de alcoholes que contienen un grupo alquilo lineal, mas particularmente aceites vegetales, oleato de etilo, di-(caprilato/caprato) de propilenglicol, tri- (caprilato/caprato) de glicerilo o dioleato de propilenglicol; esteres de acidos grasos o alcoholes ramificados, en particular esteres de acido isostearico. El aceite se utiliza en combinacion con emulsionantes para formar la emulsion. Los emulsionantes son preferiblemente tensioactivos no ionicos, en particular esteres de sorbitan, de manida (por ejemplo, oleato de anhidromanitol), de glicol, de poliglicerol, de propilenglicol y de acido oleico, isostearico, ricinoleico o hidroxiestearico, que estan opcionalmente etoxilados, y copolfmeros de bloques de polioxipropileno-polioxietileno, en particular los productos Pluronic, en especial el L121. Vease Hunter y col., The Theory y Practical Application of Adjuvants (Ed. Stewart-Tull, D. E. S.).John Wiley and Sons, NY, pag. 51-94 (1995), y Todd y col., Vaccine, 15: 564-570 (1997). Por ejemplo, es posible utilizar la emulsion SPT descrita en la pagina 147 de "Vaccine Design, The Subunit y Adjuvant Approach" editada por M. Powell y M. Newman, Plenum Press, 1995, y la emulsion MF59 descrita en la pagina 183 del mismo libro.

Un ejemplo adicional de adyuvante es un compuesto elegido entre los polfmeros de acido acnlico o metacnlico y los copolfmeros de antudrido maleico y derivado de alquenilo. Los compuestos adyuvantes ventajosos son los polfmeros del acido acnlico o metacnlico que estan reticulados, especialmente con poli(alquenil eteres) de azucares o polialcoholes. Estos compuestos se conocen por el termino carbomero (Phameuropa Vol. 8, n° 2, junio 1996). Los expertos en la tecnica tambien pueden referirse a la patente de EE.UU. N° 2.909.462 que describe polfmeros acnlicos de este tipo, reticulados con un compuesto polihidroxilado que tiene al menos 3 grupos hidroxilo, preferiblemente no

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mas de 8, estando los atomos de hidrogeno de al menos tres hidroxilos sustituidos por radicales alifaticos insaturados que tienen al menos 2 atomos de carbono. Los radicales preferidos son los que contienen de 2 a 4 atomos de carbono, por ejemplo, vinilos, alilos y otros grupos etilenicamente insaturados. Los radicales insaturados pueden contener por sf mismos otros sustituyentes tal como metilo. Los productos vendidos bajo el nombre Carbopol; (BF Goodrich, Ohio, EE.UU) son particularmente apropiados. Estan reticulados con una alil-sacarosa o con alil- pentaeritritol. Entre ellos, se pueden mencionar Carbopol 974P, 934P y 971P. Lo mas preferido es el uso de Cabopol 971P. Entre los copolfmeros de antudrido maleico y de derivado de alquenilo, se encuentran los copolfmeros EMA (Monsanto) que son copolfmeros de antudrido maleico y etileno. La disolucion de estos polfmeros en agua produce a una disolucion acida que sera neutralizada, preferiblemente hasta un pH fisiologico, con el fin de obtener la disolucion adyuvante en la que se incorporara la propia composicion inmunogenica, inmunologica o de vacuna. Adyuvantes adecuados adicionales incluyen, pero no se limitan a ellos, el sistema adyuvante RIBI (Ribi Inc.), co-polfmero de bloques (CytRx, Atlanta GA), SAF-M (Chiron, Emeryville CA), monofosforil- lfpido A, adyuvante de lfpido-amina Avridina, enterotoxina termicamente labil procedente de E. coli (recombinante o de otra forma), toxina de colera, IMS 1314, o dipeptido de muramilo, entre muchos otros.

Preferiblemente, el adyuvante se anade en una cantidad de aproximadamente 100 |jg hasta aproximadamente 10 mg por dosis. Incluso mas preferiblemente, el adyuvante se anade en una cantidad de aproximadamente 100 jg hasta aproximadamente 10 mg por dosis. Incluso mas preferiblemente, el adyuvante se anade en una cantidad de aproximadamente 500 jg hasta aproximadamente 5 mg por dosis. Incluso mas preferiblemente, el adyuvante se anade en una cantidad de aproximadamente 750 jg hasta aproximadamente 2,5 mg por dosis. Lo mas preferible, el adyuvante se anade en una cantidad de aproximadamente 1 mg por dosis.

La composicion de vacuna puede ademas incluir uno o mas de otros agentes inmunomoduladores tales como por ejemplo, interleucinas, interferones u otras citocinas. Las composiciones de vacuna pueden tambien incluir Gentamicina y Mertiolato. Si bien las cantidades y concentraciones de los adyuvantes y aditivos utiles pueden ser determinadas facilmente por el experto en la tecnica, las composiciones preferiblemente comprenden entre aproximadamente 50 jg y aproximadamente 2.000 jg de adyuvante y preferiblemente aproximadamente 250 jg/mL de dosis de la composicion de vacuna. Preferiblemente, las composiciones de vacuna comprenden de aproximadamente 1 jg/mL a aproximadamente 60 jg/mL de antibioticos, y mas preferiblemente menos de aproximadamente 30 jg/mL de antibioticos.

La vacuna se administra a animales, preferiblemente a mairnferos, y aun mas preferiblemente a cerdos, en cualquier modo convencional, mas preferiblemente mediante un empapado oral. La dosificacion que se va a administrar dependera del caso particular, pero en cualquier caso, es la cantidad suficiente para inducir un anticuerpo protector o respuesta inmunitaria mediada por la celula contra la ileitis.

Preferiblemente, las vacunas de L. intracellularis usadas para la vacunacion de los animales jovenes (preferiblemente los cochinillos jovenes) se administran en una o en repetidas dosis. La vacuna viva o muerta puede administrarse 1 o 2 veces en intervalos de 2 a 4 semanas despues de la vacunacion inicial. Para las vacunas vivas atenuadas se prefiere una dosis. Preferiblemente, la primera o unica administracion se lleva a cabo entre los 16 y los 26 dfas de edad, mas preferiblemente entre los 18 y los 24 dfas de edad, incluso mas preferiblemente entre los 19 y los 22 dfas de edad, y aun mas preferiblemente a los 21 dfas de edad, tal como se ha descrito anteriormente, o comenzando entre los 10 y los 26 dfas de edad, mas preferiblemente entre los 12 y los 21 dfas de edad, incluso mas preferiblemente entre los 15 y los 21 dfas de edad, y aun mas preferiblemente entre los 19 y los 21 dfas de edad.

Si es deseable o necesaria una segunda administracion, la segunda administracion se lleva a cabo de aproximadamente 1 a aproximadamente 4 semanas despues de la primera administracion de la vacuna. Preferiblemente, la revacunacion se realiza en un intervalo de 3 a 12 meses despues de la administracion de cualquier vacunacion previa. La administracion de las dosis subsiguientes de la vacuna preferiblemente se realiza segun una base semestral o anual.

Ejemplos

Los siguientes son ejemplos representativos de realizaciones preferidas de la presente invencion. Debe entenderse que nada de lo presentado debena ser considerado como una limitacion del alcance global de la invencion.

Ejemplo 1

Este ejemplo evaluo la eficacia de una vacuna de Lawsonia en cochinillos de tres semanas de edad nacidos de cerdas vacunadas contra Lawsonia y de cerdas no vacunadas, y determino si la vacunacion de las cerdas indujo interferencias inmunologicas maternas que impidieran una respuesta a la vacunacion del cochinillo, medido como una reduccion de la induccion de la enfermedad despues de una exposicion a cultivo virulento puro de los cochinillos vacunados y no vacunados. Los parametros primarios de estudio usados para medir la eficacia fueron las lesiones macroscopicas y microscopicas del fleo y del colon. Adicionalmente, este ejemplo evaluo la vacuna de Lawsonia en episodios de seguridad cuando se administra a cerdas prenadas durante la segunda y tercera etapas de la gestacion tras administracion de dosis sencilla y repetida.

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Materiales y Metodos

En un estudio a ciegas, se tomaron dieciseis cerdas sero-negativas de Lawsonia saludables y prenadas, y fueron divididas aleatoriamente en 2 grupos, cada uno de ellos con 8 cerdas. El grupo A recibio 3 dosis de Enterisol Ileitis B3903 por mojado oral en los dfas -55, -35 y -14, con la intencion de inducir un alto nivel de inmunidad materna antes del parto. Las cerdas del grupo B recibieron un placebo antes del parto y sirvieron a modo de control negativo. Al principio a las cerdas se las alimento con una racion de gestacion comercial no medicada, antes de cambiar a una dieta lactante no medicada. Se realizaron esfuerzos para obtener concepciones y partos uniformes para todas las cerdas, pero aun asf existio algo de variacion (10 dfas) en la fecha del parto. Con el fin de evitar los problemas de variabilidad asociados a tener multiples dfas de vacunacion y de exposicion, se establecio la media de las fechas de parto como dfa 0 del ensayo. Todos los cochinillos usados en la porcion de vacuna y de exposicion del estudio teman 21 ± 5 d^as de edad en el momento de la vacunacion (Dfa 21). Al principio los cochinillos fueron alimentados con una racion de inicio no medicada, seguida de una racion de cna no medicada, seguida de una racion finalizacion del crecimiento no medicada. Las muestras de serologfa tomadas de los cerdos se recogieron el mismo dfa del nacimiento, a los 7 dfas de edad y a los 14 dfas de edad, para asegurar una medida precisa de los anticuerpos maternos, en caso de que hubiera. Antes del parto se tomo la serologfa de las cerdas. Adicionalmente, las cerdas fueron sacrificadas en la jornada 22, sus tejidos de colon y de fleo fueron evaluados para determinar patologfas graves, su fleo, colon, nodos linfaticos mesentericos y airngdalas fueron evaluados mediante PCR, los cerdos nacidos muertos fueron evaluados mediante PCR, y se evaluo la capacidad reproductiva de camada de las cerdas se evaluo registrando los cerdos como recien nacidos, nacidos muertos o momias el dfa del parto.

Despues del parto (en el dfa 21 del estudio), se bloquearon 100 cochinillos sanos por camada y a continuacion fueron asignados a uno de los seis grupos de tratamiento, cada uno de ellos alojado por separado a lo largo de todo el estudio. Los cochinillos procedentes de cerdas vacunadas (Grupo A) fueron asignados aleatoriamente a los grupos de tratamiento 1-3. Los cochinillos procedentes de cerdas no vacunadas (Grupo B) fueron asignados aleatoriamente a los grupos de tratamiento 4-6. En la jornada 21, los grupos de tratamiento 1 y 4, con 20 cochinillos cada uno, recibieron una dosis de 2 mL (1 X 105,0 log-10 TCID50/dosis) de vacuna de Enterisol Ileitis B3903 por mojado oral directo. Los grupos de tratamiento 2 y 5, cada uno de ellos con 20 cochinillos, recibieron una dosis de 2 mL de placebo por mojado oral directo. Los grupos de tratamiento 3 y 6, con 10 cochinillos por grupo, no recibieron tratamiento alguno y sirvieron como controles estrictos para validar la susceptibilidad del origen del cerdo a la infeccion de Lawsonia.

Tres semanas despues de la vacunacion (dfa 42 del estudio), los cochinillos del ensayo de los grupos de tratamiento 1, 2, 4 y 5 fueron expuestos mediante la administracion de una dosis de 10 mL (1 X 107,3 log-10 TCID50/dosis) de cultivo puro virulento de bajo pasaje del elemento aislado heterologo N101494 de Lawsonia, mediante saturacion gastrica. Sin embargo, se pueden utilizar otros elementos aislados de L. intracellularis naturales infecciosos o de bajo pasaje como bacterias de exposicion. En la jornada 63 del estudio (tres semanas despues de la exposicion), todos los grupos de tratamiento (1-6) fueron sometidos a eutanasia y sacrificados para realizar un analisis de lesiones macro y microscopicas de la PPE.

El criterio principal usado para determinar la eficacia de la vacuna de Enterisol Ileitis B3903 en cochinillos contra la exposicion a cultivo puro virulento heterologo fue la observacion del desarrollo de lesiones usando tanto tecnicas macroscopicas como microscopicas para evaluar las lesiones del fleo y del colon. Las lesiones macroscopica se evaluaron en secciones del fleo, en la union ileal-cecal y en el colon en el momento de finalizacion del estudio. Las lesiones intestinales fueron clasificadas en grados segun el nivel de gravedad, y se tomaron muestras adicionales de la zona infectada del tejido para realizar analisis PCR, IHC y H&E. La gravedad de las lesiones se determino a traves del grado de espesamiento mucosal encontrado en el recubrimiento mucosal del fleo. Una puntuacion de lesion de 0 indico que no habfa evidencia de espesamiento mucosal edema pliegues o fisuras de mucosa, o prominencia de reticulacion serosal. Una puntuacion de lesion de 1 indico un espesamiento suave que incluye la presencia de pequenos pliegues/grietas en la mucosa, edema suave de la pared mucosal y en algunos casos hiperemia. Una puntuacion de lesion de 2 se atribuyo a un espesamiento y/o inflamacion moderados. Quedo en evidencia a traves de pliegues/grietas profundos en la mucosa, edemas moderados de la pared mucosal, reticulacion de las superficies serosales y, en algunos casos, hiperemia. Una puntuacion de lesion de 3 indico un espesamiento y/o inflamacion grave, evidenciado por pliegues/grietas profundos en la mucosa, edemas moderados de la pared mucosal, reticulacion de las superficies serosales y, de nuevo en algunos casos, hiperemia. Una puntuacion de lesion de 4 indico un espesamiento y/o inflamacion grave y/o presencia de sangre. Dicha puntuacion de lesion quedo evidenciada por pliegues/grietas graves y profundos en la mucosa, por edemas moderados en la pared mucosal, reticulacion de las superficies serosales, de nuevo en algunos casos hiperemia, y por la presencia de contenidos sangumeos y/o de coagulos de sangre. Finalmente, una puntuacion de lesion de 5 indico necrosis evidenciada por lesiones graves de la superficie mucosal tales como presencia de necrosis, o en algunos casos que toda la superficie mucosal este mudada o separada debido a la gravedad de la lesion.

Lesiones microscopicas causadas por Lawsonia son patognomicas para la PPE. Las lesiones histopatologicas de la enfermedad incluyen la hiperplasia epitelial, especialmente en las criptas mucosales con una distinta ausencia de celulas copa. Normalmente, la Lawsonia se encuentra en las celulas epiteliales proliferativas de la cripta mucosal. Se colocaron secciones de fleo de aproximadamente 2-4 cm de longitud en formalina tamponada para el examen histologico usando los metodos de tincion de Hematoxilina y Eosina (H&E) y de IHC. Las tinciones de H&E detectan

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la presencia hiperplasia de cripta provocada por la infeccion de Lawsonia mientras que las tinciones de IHC explotan la especificidad de un anticuerpo monoclonal anti-Lawsonia al confirmar la presencia del organismo y del desarrollo de lesiones microscopicas en los tejidos afectados. El anticuerpo monoclonal anti-Lawsonia detecta espedficamente la celula completa de Lawsonia apuntando a la protema de membrana exterior de todos los elementos aislados de Lawsonia. Este anticuerpo monoclonal fue derivado a partir de la lrnea celular de hibridoma VPM53, desarrollada por investigadores de la Universidad de Edimburgo, Escocia. La presencia de organismos de Lawsonia y de gravedad de lesion microscopica determinada mediante tincion IHC de secciones ileales su puntuo con una puntuacion de 0, que indica que no hada enterocitos proliferativos (lesiones), con una puntuacion de 1, que indica lesiones focales moderadas, con una puntuacion de 2, que indica lesiones difusas moderadas, y con una puntuacion de 3, que indica lesiones difusas graves. Con respecto a la presencia de organismos, el sistema de puntuacion IHC determino la presencia de ningun organismo como 0, la presencia de pocos organismos focales como 1, la presencia de organismos difusos moderados como 2, y la presencia de organismos difusos graves como 3.

Los criterios secundarios de medidas fueron la observacion de smtomas clrnicos, la deteccion de Lawsonia en muestras fecales y tejidos mediante PCR, el ADWG y la seroconversion (IFAT) debido a la exposicion de cochinillos a Lawsonia.

Se realizo una vigilancia diaria de la salud desde la fecha del inicio del estudio hasta el dfa de la exposicion para animal ensayado. Los parametros de salud clrnica, que incluyen la diarrea, el comportamiento y la condicion corporal, fueron evaluados diariamente desde el dfa de la exposicion (dfa 42) hasta el dfa anterior a la finalizacion (dfa 62). La puntuacion reflejo la gravedad de la enfermedad. Para la diarrea, una puntuacion de 1 indico heces normales, una puntuacion de 2 indico heces semisolidas sin sangre, una puntuacion de 3 indico heces acuosas pero sin ninguna sangre o heces oscuras, y una puntuacion de 4 indico heces tenidas con sangre, independientemente de que estuvieran sueltas o formadas. Una puntuacion de comportamiento de 1 indico un comportamiento normal, una puntuacion de 2 indico un comportamiento deprimido de ligero a moderado (se mantiene aislado), y una puntuacion de 3 indico un comportamiento yacente o gravemente deprimido. Una puntuacion corporal de 1 indico una condicion corporal normal, una puntuacion de 2 indico una condicion corporal de ligera a moderadamente demacrada, y una puntuacion de 3 indico una condicion gravemente demacrada.

Se evaluo el derrame fecal de Lawsonia mediante PCR de ileitis evaluando muestras fecales (f-PCR) en los dfas -55, -35, -14, 21,28, 35, 42, 49, 56 y 63 del estudio. Las muestras fecales fueron analizadas para determinar la presencia de ADN de Lawsonia en heces usando PCR. Se tomaron secciones de tejido fresco de cada animal evaluado a la finalizacion del estudio, en la jornada 63. Se evaluo el analisis cualitativo del contenido de bacterias en los tejidos mediante PCR de ileftis (t-PCR) junto con una evaluacion histologica para determinar Lawsonia en el fteo, colon, airftgdalas y nodos linfaticos mesentericos en el dfa 63 del estudio. El ensayo de PCR fue desarrollado por Jones, y col., y explota la especificidad de dos cebadores de oligonucleotidos (de 20 pares base cada uno) para producir un fragmento de 319 pb a partir de ADN genomico de Lawsonia. Estos cebadores estan dirigidos a una secuencia previamente determinada de ADN genomico espedfico de Lawsonia. Los fragmentos de ADN producidos durante la PCR se comparan con controles de reaccion de PCR y de extraccion de ADN negativos y positivos en ileftis para confirmar un resultado "positivo" o "no positivo". El control de extraccion de ADN positivo es celula entera de Lawsonia con celulas McCoy infectadas en 1X Disolucion Salina Tamponada de Fosfato (PBS) (200jL/tubo). El control de extraccion de ADN negativo es celulas McCoy no infectadas en 1X PBS (200jL/tubo). Los controles de reaccion PCR de ileftis consisten en ADN genomico de Lawsonia purificado a partir de material recolectado de un cultivo celular (celulas Lawsonia + McCoy), mientras que el control negativo es agua libre de ARNasa (Amresco, Solon, Ohio). Un muestra de ensayo positiva en ADN de Lawsonia producira el fragmento de ADN de tamano identico (319 pb) al de ambos controles positivos de PCR de ileftis (extraccion y reaccion), mientras que las muestras negativas no produciran un fragmento de dicho tamano. Las preparaciones de ADN extrafdo de cada muestra de ensayo fueron obtenidas usando kits de extraccion de ADN ISO-QUlCK (ORCA Research, Inc., Bothell, Washington). Los resultados de PCR se usaron para determinar las deposiciones de Lawsonia en cochinillos vacunados con Enterisol Ileitis B3903 y/o expuestos al elemento aislado heterologo de Lawsonia N101494.

Se midieron los pesos el dfa de la vacunacion (dfa 21), el dfa de la exposicion (dfa 42) y el dfa de finalizacion del estudio (dfa 63) con el fin de calcular la ganancia media de peso diaria (ADWG, en sus siglas en ingles) de cada grupo de tratamiento. Se compararon las ADWG de todos los grupos para determinar la ADWG post-vacunacion y post-exposicion. Los pesos corporales se determinaron usando un sistema electronico de escala de barra de peso (Weigh-Tronix, Weigh-Tronix, Inc., Fairmont, Minnesota) calibrado usando pesos certificados de ensayo antes y despues de cada uso.

Se evaluo el suero usando el Ensayo de Anticuerpo Fluorescente Indirecto (IFAT en sus siglas en ingles) para detectar anticuerpos anti-Lawsonia en animales de ensayo. Se tomo sangre entera venosa en tubos de las cerdas en los dfas -55, -35 y -14 y de todos los animales a los 0, 7 y 14 dfas de edad, y en los dfas de ensayo 21,28, 35, 42, 49, 56 y 63 del estudio. Se dejo que la sangre coagulara antes de ser centrifugada, y se recolecto y congelo el suero. A continuacion el IFAT escruto el suero de cerdo para determinar la presencia de moleculas IgG anti-Lawsonia. Los anticuerpos anti-Lawsonia se unen a antfgenos de la membrana exterior de la celula entera de Lawsonia, cubriendo completamente el organismo que esta fijado al fondo de cada pocillo de una placa de microtitulacion de 96 pocillos. Se introdujo conjugado de anticuerpo secundario anti-IgG marcado con FITC para unirse a cualesquier complejos IgG-antfgeno de cada pocillo. Estos complejos ligados a FITC se iluminan en verde fluorescente bajo luz ultravioleta.

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Una muestra de ensayo positiva revela muchas varas pequenas de forma curva, de color verde brillante, que se asemejan a Lawsonia, o a celulas McCoy infectadas que contienen numerosas Lawsonia. Un muestra de ensayo negativa en IFAT muestra un fondo verde apagado (tenue) de celulas McCoy. Los resultados obtenidos mediante IFAT fueron usados para observar un modelo de seroconversion en grupos que reciben una vacunacion y/o una exposicion virulenta indicativa de presencia de Lawsonia en el animal.

En ensayo de punto final de TCID50 se llevo a cabo sobre muestras representativas de cada dosis de vacuna administrada a los cochinillos de ensayo el dfa 21 del estudio. Se diluyeron cinco replicas de muestras de ensayo representativas en una proporcion de 10 a 1 (de 10-1 a 10-6) antes y despues de la vacunacion y de la administracion de exposicion en Medio Esencial Modificado de Dulbecco reforzado con Ham's F12 (DMEM Fl2, de sus siglas en ingles) y con un 5% de Suero Bovino de Neonato (NBS en sus siglas en ingles) activado termicamente (JRH Biosciences, Lenexa, Kansas). Se evaluaron muestras diluidas para determinar la cantidad de Lawsonia vivas en cada muestra de ensayo. Se calcularon tftulos medios a partir de 5 replicas antes y despues de la administracion de exposicion, y se multiplicaron por el volumen de material de ensayo proporcionado a cada cochinillo para determinar el total de log10 de Lawsonia por dosis. Los tftulos medios totales (logi0 TCID50/dosis) para vacunacion o exposicion se determinaron a partir de los resultados de valoracion de antes y de despues (2 tftulos).

Las comparaciones de grupos de tratamiento se realizaron analizando los datos de ADWG, tanto despues de la vacunacion como despues de la exposicion, las puntuaciones clrnicas, las tasas de seroconversion (IFAT), la colonizacion (t-PCR), la perdida fecal (f-PCR), el desarrollo de lesiones macroscopicas, y el de lesiones microscopicas mediante inmunohistoqmmica (IHC).

Tres cochinillos murieron despues de la vacunacion (uno del Grupo 1 y dos del Grupo 5), pero antes de la finalizacion del estudio. El cochinillo del Grupo 1 fue analizado para determinar la presencia de infeccion de Lawsonia, pero se determino que la causa de muerte fue choque/septicemia debida a altos niveles de E.coli. Los dos cochinillos del Grupo 5 que murieron presentaron las lesiones macroscopicas y microscopicas tfpicas de la infeccion de Lawsonia y la causa presumible de muerte fue debida a la Lawsonia.

Resultados

La evaluacion de muestras fecales y de suero recogidas en este estudio indico que ninguna cerda del Grupo A o del Grupo B presentaba Lawsonia detectable en sus heces o en el fteo o el colon. Las cerdas del Grupo A teman de 5 a 8 animales con tftulos IFAT detectables en al menos un punto temporal del estudio. Ninguna cerda del Grupo B presento un tftulo IFAT detectable durante el mismo periodo de tiempo. Estos datos se presentan a continuacion en la Tabla 1.

Tabla 1: Datos de cerdas

Tratamiento de la cerda

Lesiones Macroscopicas del fteo Lesiones Macroscopicas del colon PCR de Tejido (Ileo/Colon/MLN/Amigdala) IFA Media de cerdos nacidos vivos/camada

A - Vacunada

0/8 0/8 0/8 5/8 9,4

B - No vacunada

0/8 0/8 0/8 0/8 7,6

Todas las cerdas fueron sacrificadas y evaluadas para determinar la presencia de lesiones macroscopicas tfpicas de la infeccion de Lawsonia. Sin embargo, ninguna cerda presento lesiones macroscopicas o dio positivo en la deteccion de t-PCR.

A pesar del hecho de que la vacuna se administro durante el 2° y el 3er trimestres del embarazo, no se registraron observaciones de salud general anormales para ninguna cerda durante el ensayo clrnico. Los resultados del parto entre las cerdas del Grupo A y del Grupo B tambien fueron muy similares, con una media de 9,6 y 7,6 cochinillos nacidos vivos en cada grupo, respectivamente. Las cerdas del Grupo A teman una media de 1,8 cerdos nacidos muertos por camada, y ninguna momia o mortalidad en el parto. Las cerdas del Grupo B presentaron una media de 0,9 mortinatos, 0,1 momias y 0,1 cerdos muertos durante el parto, por camada. La evaluacion diagnostica de dichos cerdos mortinatos indico que eran negativos en Lawsonia y que se encontraban dentro de las perdidas normales asociadas a la reproduccion. Los resultados de serologfa fueron como se esperaba en tanto que las cerdas no vacunadas permanecieron seronegativas y en el Grupo A se detectaron algunos animales seropositivos. Las cerdas del Grupo A teman mayores valores de cerdos/camada en comparacion con los controles no vacunados. El resultado indica que no habfa ningun efecto negativo debido a los metodos o al contenido de la vacunacion. Estos datos se resumen en la anterior Tabla 1.

El desarrollo de lesiones macroscopicas en cochinillos se determino evaluando y puntuando el fteo y el colon de cada animal ensayado para determinar lesiones macroscopicas asociadas a PPE en el momento de la finalizacion del

estudio. Los cochinillos de los Grupos 1 y 4 presentaron las menores puntuaciones de fleo con un 0,16 y un 0,15, respectivamente. Estos valores no fueron significativamente diferentes y demostraron la eficacia de la vacuna en cerdos procedentes tanto de cerdas vacunadas como no vacunadas. Los Grupos 2 y 5 presentaron puntuacion de lesiones de fleo de 0,85 y de 2,35, respectivamente. Estos valores fueron significativamente diferentes (P<0,05) e 5 indicaron que la vacunacion de las cerdas proporciona un cierto nivel de proteccion materna (Grupo 2) y que los animales recien nacidos eran sensibles a la exposicion virulenta (Grupo 5). Los Grupos 4 y 5 tambien presentaron puntuaciones de fleo significativamente diferentes (P<0,05) y confirmaron la eficacia de la vacuna en los cochinillos recien nacidos vacunados. Las puntuaciones de fleo de los Grupos 1 y 2 tambien fueron significativamente diferentes (P<0,05) y confirman que la vacunacion de cerdos procedentes de cerdas positivas en Lawsonia proporciona un 10 beneficio significativo (P<0,05) mas alla de la inmunidad materna. Se obtuvieron las mismas tendencias y significancias con las muestras de fleos en terminos de porcentaje de animales positivos (positivos/total del grupo). Se descubrieron lesiones de fleo en el 80% de los cerdos del Grupo 5. Por el contrario, menos del 16% de los animales de los Grupos 1 y 4 presentaron lesiones de fleo.

Con respecto a las puntuaciones de lesiones macroscopicas del colon y al porcentaje de animales positivos, se 15 produjo una diferencia significativa (P<0,05) entre el Grupo 4 y el Grupo 5. No se produjeron otras diferencias significativas entre los grupos de tratamiento. Los controles estrictos (Grupos 3 y 6) fueron negativos en cuanto a lesiones macroscopicas del fleo y del colon, confirmando con ello la validez del estudio. Los resultados de este ensayo se proporcionan en la Tabla 2 que figura a continuacion:

Tabla 2: Resumen de las puntuaciones de lesiones macroscopicas en cerdos de los diferentes grupos de tratamiento

Grupo

Grupo de tratamiento ileo (Pos/Total Grupo) Puntuacion Macroscopica de Ileo Colon (Pos/Total Grupo) Puntuacion Macroscopica de Colon

1

Cerda A - Cerdo vacunado 3/19b 0,16b 2/19 0,26

2

Cerda A - Cerdo placebo 9/20b,d 0,85b,d 4/20 0,45

3

Cerda A - Control Estricto 0/10 o o o 0/10 o o o

4

Cerda B - Cerdo vacunado 3/20e 0,15e 1/20e 0,05e

5

Cerda B - Cerdo placebo 16/20d,e 2,35d,e 6/20e 0,80e

6

Cerda B - Control Estricto 0/10 o o o 0/10 o o o

20 b La comparacion entre el Grupo 1 y el 2 es significativamente (P<0,05) diferente.

c La comparacion entre el Grupo 1 y el 4 es significativamente (P<0,05) diferente.

d La comparacion entre el Grupo 2 y el 5 es significativamente (P<0,05) diferente.

e La comparacion entre el Grupo 4 y el 5 es significativamente (P<0,05) diferente.

f Grupo no incluido en los analisis estadfsticos tal como se indica en el protocolo.

25 Se usaron metodos IHC y H&E para evaluar el desarrollo de lesiones microscopicas en cochinillos. Se tomaron secciones de 2-4 cm de longitud de amygdala, nodo linfatico mesenterico, fleo terminal y colon a la finalizacion del estudio (dfa 63), y fueron colocadas en formalina tamponada al 10% para el analisis IHC. No se detecto Lawsonia mediante tincion IHC de las secciones de airygdalas en ninguno de los grupos de tratamiento a la finalizacion del estudio. Se detecto Lawsonia en 2/20 de las muestras de nodo linfatico mesenterico del Grupo 5. Todas las demas 30 muestras de nodos linfaticos mesentericos de todos los grupos fueron negativas y no se observo ninguna diferencia significativa entre los grupos de tratamiento en relacion al ensayo de nodo linfatico mesenterico.

Los Grupos 1 y 4 presentaron puntuaciones de fleo microscopicas de 0,35 y de 0,15, respectivamente, y no fueron significativamente diferentes. El Grupo 5 presento la mayor puntuacion de fleo microscopica con 2,42 y fue significativamente diferente (P<0,05) a las de los grupos de tratamiento 2 y 4. Esto demuestra que existe un cierto 35 grado de inmunidad maternal en el Grupo 2 y que la vacuna proporciona eficacia en los cerdos recien nacidos vacunados. La evaluacion del porcentaje de muestras de fleo con lesiones microscopicas indico que el 95% de los cerdos del Grupo 5 presentaba lesiones y que dicho grupo es de nuevo significativamente (P<0,05) diferente de los Grupos 2 y 4. El Grupo 5 presento una puntuacion media de colon microscopica del 1,35%, y el 60% de los animales

de este grupo de tratamiento fueron positivos en la deteccion de lesion debido a Lawsonia. Este valor fue significativamente (P<0.05) mayor que los de los grupos de tratamiento 2 y 4. Los datos macroscopicos se resumen en la Tabla 3.

Tabla 3: Resumen de las lesiones microscopicas en tejidos de cerdos a la finalizacion del estudio

Grupo

Grupo de tratamiento Puntuacion Media de Lesion de iLEO Microscopica (IHC) ILEO (Gravedad) Cerdos Positivos por IHC en Microlesiones/Total Grupo Puntuacion Media de Lesion de COLON Microscopica (IHC) COLON (Gravedad) Cerdos Positivos por IHC en Microlesiones/Total Grupo

1

Cerda A - Cerdo vacunado 0,35 3/20 0,15 2/20

2

Cerda A - Cerdo placebo 0,70d 6/20d 0,55d “5/20

3

Cerda A - Control Estricto 0,00f 0/10f 0,00f 0/10f

4

Cerda B - Cerdo vacunado 0,15e 2/20e 0,05e 1/20e

5

Cerda B - Cerdo placebo 2,42d,e 18/19a,e" 1,35d,e 12/20d,e

6

Cerda B - Control Estricto 0,20f 1/10f 0,00f 0/10f

5 d La comparacion entre el Grupo 2 y el 5 es significativamente (P<0,05) diferente. e La comparacion entre el Grupo 4 y el 5 es significativamente (P<0,05) diferente. f Grupo no incluido en los analisis estadfsticos tal como se indica en el protocolo.

* 1 muestra presento necrosis y cafda de tejido severa y no pudo leerse mediante IHC.

Con el fin de evaluar la eliminacion fecal de Lawsonia en los cochinillos mediante f-PCR, se tomaron muestras 10 fecales semanalmente de todos los animales de ensayo de cada grupo de tratamiento y se evaluo la presencia de L. intracellularis mediante PCR de ileitis en los dfas 21, 28, 35, 42, 49, 56 y 63 del estudio. En los dfas 21, 28 y 35, los cochinillos de todos los grupos de tratamiento dieron negativo para L. intracellularis en las pruebas de f-PCR. Los cochinillos del Grupo 1 fueron detectados como positivos mediante f-PCR en el dfa 42, y permanecieron positivos hasta el dfa 63, con un 11-16% de los cochinillos dando positivo durante este periodo de tiempo. Los cochinillos del 15 Grupo 2 fueron detectados como positivos mediante f-PCR en el dfa 49, y permanecieron positivos hasta el dfa 63, con un 5-25% de los cochinillos dando positivo durante este periodo de tiempo. Los cochinillos del Grupo 4 fueron detectados como positivos mediante f-PCR en el dfa 42, y permanecieron positivos hasta el dfa 63, con un 5-25% de los cochinillos dando positivo durante este periodo de tiempo, respectivamente. Los cochinillos del Grupo 5 fueron detectados como positivos mediante f-PCR en el dfa 49, y permanecieron positivos hasta el dfa 63, con un 15-72% de 20 los cochinillos dando positivo durante este periodo de tiempo. Los cochinillos del Grupo 3 y del 6 permanecieron negativos por f-PCR durante todo el experimento. El analisis de chi-cuadrado de los datos indica una diferencia significativa (P<0,05) entre los grupos 4 y 5 en el dfa 42, entre los grupos 2 y 5 en el dfa 63, y entre los grupos 4 y 5 en el dfa 63. Los datos de eliminacion fecal se resumen en la Tabla 4.

Tabla 4: Resumen de la eliminacion fecal de L. intracellularis entre los grupos de tratamiento de cerdos

Grupos

1 2 3 4 5 6

Grupo de tratamiento

Cerda A - Cerdo vacunado Cerda A - Cerdo placebo Cerda A - Control Estricto Cerda B - Cerdo vacunado Cerda B - Cerdo placebo Cerda B - Control Estricto

Dia 21

0/20a 0/20a O O 0/20a 0/20a O O

Dia 28

0/20a 0/20a o o 0/20a 0/20a o o

Dia 35

0/20a 0/20a o o 0/20f 0/20a o o

D^a 42

3/20 0/20 o o 5/20e 0/20e o o

Dia 49

2/19a 1/20a o o 2/20a 3/20a o o

Dia 56

2/19a 3/20a o o 1/20e 8/19e o o

Dia 63

3/19 5/20d o o 2/20e 13/18d,e o o

a La comparacion global no es significativamente diferente por el ensayo Chi-cuadrado.

d La comparacion de los Grupos 2 y 5 es significativamente (P<0,05) diferente por el ensayo de Chi-cuadrado. d La comparacion de los Grupos 4 y 5 es significativamente (P<0,05) diferente por el ensayo de Chi-cuadrado. f Grupo no incluido en los analisis estadfsticos tal como se indica en el protocolo.

5 La colonizacion de tejidos por Lawsonia (t-PCR) en cerdos se evaluo a la finalizacion del estudio (dfa 63) mediante ensayo PCR de las secciones de tejido del fleo terminal, del colon, de las airngdalas y del nodo linfatico mesenterico. Los controles estrictos (Grupos 3 y 6) fueron negativos en t-PCR para la deteccion de Lawsonia, confirmando con ello la validez de la fuente de cerdos y del estudio. Todas las muestras de airngdala fueron negativas por t-PCR. Unicamente las muestras de colon y de nodo linfatico mesenterico del Grupo 5 dieron positivo, siendo positivos un 510 10% de los cochinillos. Las muestras de fleo de cochinillos del Grupo 1 y del 2 presentaron un 20% y un 25% de

resultados de ensayo positivos mediante t-PCR, respectivamente. En comparacion, los cochinillos del Grupo 4 y del 5 presentaron un 5% y un 45% de resultados de ensayo positivos mediante t-PCR, respectivamente. Todas las muestras de fleos de los Grupos 3 y 6 fueron negativas en el ensayo de t-PCR. El analisis de Chi-cuadrado no indico diferencias significativas entre los grupos de tratamiento en las muestras de airngdala, nodo linfatico mesenterico o 15 colon. No hubo una diferencia significativa (P<0,05) entre los Grupos 4 y 5 en los resultados de t-PCR del fleo, presentando el Grupo 5 el mayor porcentaje de positivos del experimento. Los datos de este ensayo se resumen en la Tabla 5.

Tabla 5: Resumen de colonizacion de tejidos por L. intracellularis entre los grupos de tratamiento de cerdos (positivos/total grupo)

Grupo

Grupo de tratamiento Amigdala positivo en t- PCR Nodo Linfatico Mesenterico positivo en t-PCR lleo positivo en t- PCR Colon positivo en t-PCR

1

Cerda A - Cerdo vacunado 0/20a 0/20a 4/20 0/20a

2

Cerda A - Cerdo placebo 0/20a 0/20a 5/20 0/20a

3

Cerda A - Control Estricto 0/10 0/10 0/10 0/10

4

Cerda B - Cerdo vacunado 0/20a 0/20a 1/20e 0/20a

5

Cerda B - Cerdo placebo 0/20a 2/20a 9/20e 1/20a

6

Cerda B - Control Estricto 0/10 0/10 0/10 0/10

20 a La comparacion global no es significativamente diferente por el ensayo Chi-cuadrado.

d La comparacion de los Grupos 4 y 5 es significativamente (P<0,05) diferente por el ensayo de Chi-cuadrado. f Grupo no incluido en los analisis estadfsticos tal como se indica en el protocolo.

Se calculo la ADWG desde el tiempo de vacunacion (dfa 21), hasta la administracion de la exposicion (dfa 42), hasta la finalizacion del estudio (dfa 63) y entre la exposicion (dfa 42) y la finalizacion del estudio (dfa 63). El dfa de la 25 vacunacion (dfa 21), no habfa ninguna diferencia significativa entre los grupos de tratamiento. De forma similar, no hubo diferencias significativas despues de la vacunacion desde el dfa 21 hasta el dfa 42. Dichos resultados confirman que la vacuna es segura y no afecta al desarrollo medido a traves de la ganancia de peso. Despues de la

exposicion virulenta, no se produjeron diferencias significativas (P<0,05) en la ADWG entre los Grupos 1 y 4, entre los Grupos 2 y 5, y entre los Grupos 4 y 5. El Grupo 5 presento la menor ADWG del estudio con un valor de 0,399 Kg/dfa. La evaluacion de Chi-cuadrado del periodo de tiempo que va desde la vacunacion hasta la exposicion y hasta el momento de finalizacion del estudio tambien indico que ha^a una diferencia significativa (P<0,05) entre los 5 Grupos 1 y 4 y entre los Grupos 4 y 5. Estos datos se resumen a continuacion en la Tabla 6.

Tabla 6: Resumen de las ganancias de peso medias diarias (ADWG) de los cerdos

Grupo

Grupo de tratamiento Peso Inicial Medio (Kg) el dia 21 Ganancia media de peso diaria (dias 21-42) (Kg) Vacunacion Ganancia media de peso diaria (dias 42-63) (Kg) Exposicion ADWG Total (dia 21 a dia 63) (Kg) Desde la Vacunacion hasta la Exposicion

1

Cerda A - Cerdo vacunado 6,52a 0,41a 0,45c 0,43c

2

Cerda A - Cerdo placebo 6,34a 0,39a 0,46d 0,42

3

Cerda A - Control Estricto 6770 0,46 0T52t 0,49

4

Cerda B - Cerdo vacunado 6,43a 0,44a 0,51c,e 0,47c,e

5

Cerda B - Cerdo placebo 6,07a 0,41a 0,039d,e 0,39e

6

Cerda B - Control Estricto 6T34t 4T53t 0,49 0,47t

a La comparacion global no es significativamente diferente por el ensayo Chi-cuadrado.

c La comparacion de los Grupos 1 y 4 es significativamente (P<0,05) diferente por el ensayo de Chi-cuadrado. d La comparacion de los Grupos 2 y 5 es significativamente (P<0,05) diferente por el ensayo de Chi-cuadrado.

10 d La comparacion de los Grupos 4 y 5 es significativamente (P<0,05) diferente por el ensayo de Chi-cuadrado. f Grupo no incluido en los analisis estadfsticos tal como se indica en el protocolo.

Las observaciones clmicas de los cochinillos fueron registradas diariamente para cada animal desde el dfa de la exposicion (dfa 42) hasta la finalizacion del estudio (dfa 63). Se calcularon las puntuaciones clmicas para obtener una puntuacion clmica diaria media que reflejase la gravedad y la duracion de la enfermedad entre los grupos de 15 tratamiento debida a la exposicion a un elemento aislado virulento de Lawsonia. Una puntuacion de 3 era indicativa de un animal normal y saludable. Hubo pocas puntuaciones clmicas diferentes a "3" en cualquiera de los grupos despues de la exposicion virulenta, y no se produjeron diferencias significativas entre cualquiera de los grupos de tratamiento. Las puntuaciones clmicas medias de cada grupo de tratamiento se resumen a continuacion en la Tabla 7.

Tabla 7: Puntuaciones clmicas medias de los cerdos

Grupo de tratamiento

Grupo de Identificacion Puntuacion Clmica Media

1

Cerda A - Cerdo vacunado 3,01a

2

Cerda A - Cerdo placebo 3,00a

3

Cerda A - Control Estricto 3,09

4

Cerda B - Cerdo vacunado 3,01a

5

Cerda B - Cerdo placebo 3,02a

6

Cerda B - Control Estricto 3,00

20 a La comparacion global no es significativamente diferente.

f Grupo no incluido en los analisis estadfsticos tal como se indica en el protocolo.

La evaluacion serologica de los cochinillos mediante ensayo IFAT para determinar la presencia de anticuerpos IgG anti-Lawsonia se llevo a cabo con muestras de suero que fueron extrafdas semanalmente de los animales evaluados. Las muestras de suero fueron extrafdas los dfas 0, 7, 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56 y 63. Antes de la exposicion, algunos cochinillos de los Grupos 1-3 fueron seropositivos para Lawsonia, confirmando con ello que se induce algo de 5 inmunidad materna durante la vacunacion de la cerda. Por el contrario, todos los cochinillos de los Grupos 4-6 fueron seronegativos para Lawsonia. Los cochinillos del Grupo 1 presentaron numeros significativamente mayores (P<0,05) de animales seropositivos, en comparacion con el Grupo 4, el dfa del parto y en los dfas 7 y 14. Los cochinillos del Grupo 1 tambien fueron significativamente diferentes (P<0,05) de los del Grupo 2 en el dfa 63 del experimento. El Grupo 2 presento numeros significativamente mayores (P<0,05) de animales seropositivos, en comparacion con el 10 Grupo 5, en los dfas 7, 14 y 28. La deteccion de anticuerpos maternos duro hasta el dfa 28 en los Grupos 1-3. Todos los animales de los Grupos 1-3 fueron seronegativos para el dfa 35. Tras la exposicion virulenta, se detecto algo de seroconversion en los Grupos 1, 2, 4 y 5. Se percibio una diferencia significativa (P<0,05) entre los Grupos 1 y 4 en el dfa 56 del experimento. Las tasas de seroconversion de cada grupo se resumen a continuacion en la Tabla 8.

Tabla 8: Resumen de las tasas de seroconversion entre los grupos de tratamiento de cerdos

Grupos

1 2 3 4 5 6

Grupo de tratamiento

Cerda A - Cerdo vacunado Cerda A - Cerdo placebo Cerda A - Control Estricto Cerda B - Cerdo vacunado Cerda B - Cerdo placebo Cerda B - Control Estricto

Parto

5/20c 3/20 1/10f 0/20c 0/20 O O

D^a 7

7/20c 4/20d 3/10f 0/20c 0/20d o o

Dia 14

5/20c 4/20d 3/10f 0/20c 0/20d o o

Dia 21

2/20a 3/20a 2/10f 0/20a 0/20a o o

Dia 28

3/20 4/20d 3/10f 0/20a 0/20a o o

Dia 35

0/20a 0/20a 0/10 0/20a 0/20a o o

Dia 42

0/20a 0/20 0/10 1/20a 0/20 o o

Dia 49

0/19 0/20 O o 2/20a 1/20a o o

Dia 56

0/19a,c" 1/20a o o 4/20a,c 2/19a* o o

Dia 63

0/19a,b,c' 8/20b o o 5/20 9/18* o o

15 a La comparacion global no es significativamente diferente por el ensayo Chi-cuadrado.

b La comparacion de los Grupos 1 y 2 es significativamente (P<0,05) diferente por el ensayo de Chi-cuadrado. c La comparacion de los Grupos 1 y 4 es significativamente (P<0,05) diferente por el ensayo de Chi-cuadrado. d La comparacion de los Grupos 2 y 5 es significativamente (P<0,05) diferente por el ensayo de Chi-cuadrado. f Grupo no incluido en los analisis estadfsticos tal como se indica en el protocolo.

20 * Se produjo la muerte de animales en este grupo de tratamiento.

Discusion

Este estudio evaluo la seguridad de una vacuna de Lawsonia en cerdas despues de dosis elevadas y repetidas de la vacuna durante la segunda y la tercera etapas de la gestacion, cuyo objetivo era inducir un elevado nivel de respuesta de anticuerpos maternos. No se detecto Lawsonia en los tejidos mediante IHC o t-PCR, ni indicaciones de 25 infeccion de Lawsonia mediadas a traves de patologfas macroscopicas en cualquiera de las cerdas vacunadas. Ademas, no se produjo la deteccion de perdidas fecales de Lawsonia en ninguna de las cerdas vacunadas. Finalmente, las cerdas vacunadas presentaron valores numericamente superiores de cochinillos vivos y saludables. Por consiguiente, todo indica a que la vacuna es segura en animales prenados.

Este complejo estudio incluyo tanto cerdas positivas en Lawsonia (Grupo A) como cerdas negativas en Lawsonia 30 (Grupo B), cuyos cochinillos fueron vacunados posteriormente (Grupos 1 y 4) o no fueron vacunados (Grupos 2 y 5). Los cochinillos de los Grupos 3 y 6 sirvieron como controles estrictos y no recibieron tratamiento alguno o exposicion

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

a la bacteria. El analisis de los datos y las posteriores conclusiones se realizaron comparando los grupos de tratamiento que variaban en una unica variable (vacunacion de cochinillo o vacunacion de cerda).

La eficacia de la vacuna en los cochinillos recien nacidos confirma que la fuente del cerdo era susceptible, y que la vacunacion de dichos cochinillos proporciono eficacia contra la exposicion virulenta heterologa. Esto requirio una comparacion del Grupo 4 (vacunado) y del Grupo 5 (no vacunado), los cuales derivaban ambos de cerdas negativas en Lawsonia. Los datos indicaron que el Grupo 4 era significativamente diferente (P<0,05) del Grupo 5 en puntuaciones medias de fleo macroscopicas, en puntuaciones medias de colon macroscopicas, en eliminacion fecal (f-PCR), en colonizacion de tejido del fleo (t-PCR) y en ADWG. Como nota al margen, dicho estudio tambien confirmo que la Enterisol Ileitis B3903 proporciona una proteccion eficaz despues de una unica administracion. Ademas confirma y valida que la fuente de cerdos usada en el experimento era susceptible a la exposicion virulenta heterologa.

La comparacion del Grupo 2 (cochinillos procedentes de una cerda del Grupo A) y del Grupo 5 (cochinillos procedentes de una cerda del Grupo B) permitieron la evaluacion del potencial de proteccion materna obtenido a traves de la vacunacion de la cerda. Los datos indicaron que no habfa diferencias significativas (P<0,05) entre los Grupos 2 y 5 en las puntuaciones medias de fleo macroscopicas, en las puntuaciones medias microscopicas de fleo y de colon, en la eliminacion fecal (f-PCR), en la ADWG y en la serologfa. Estos datos tambien indicaron que habfa un cierto grado de inmunidad materna que proporciona proteccion frente a la exposicion virulenta durante al menos seis semanas despues del nacimiento. El estudio midio ademas la serologfa (IFA) y que determino que podfan detectarse cochinillos seropositivos en los Grupos 1-3 desde el dfa del parto y hasta el dfa 28. Cabe destacar que, el dfa del parto, todos los cerdos de todos los grupos eran seronegativos usando el ensayo IFA, lo que posiblemente implica que el ensayo usado en este experimento no proporciona un indicador preciso de inmunidad frente a la exposicion virulenta a Lawsonia. Dada la naturaleza del agente etiologico como patogeno mucosal y del uso de una vacuna viva no virulenta, es posible que alguna forma de inmunidad celular deba ser considerada como un factor.

Otro objetivo de este estudio era determinar si la vacunacion eficaz, cara a la inmunidad materna, podna llevarse a cabo vacunando a los cochinillos antes de lo que convencionalmente se hace o se recomienda. Para este ensayo, se confirmo la vacunacion eficaz de los cochinillos de 16 a 26 dfas de edad. Esta determinacion se realizo comparando el Grupo 1 (cochinillos vacunados procedentes de cerdas del Grupo A) y el Grupo 2 (cochinillos no vacunados procedentes de cerdas del Grupo A). Los parametros primarios usados en esta comparacion fueron las lesiones macroscopicas y microscopicas asociadas al fleo y al colon. Las puntuaciones medias de fleo macroscopicas fueron de 0,16 y 0,85 para los Grupos 1 y 2, respectivamente, siendo significativamente diferentes (P<0,05). El porcentaje de muestras de fleos con lesiones macroscopicas fue del 16% y del 45% para los Grupos 1 y 2, respectivamente, y esto tambien supuso una diferencia significativa (P<0,05). Los cochinillos del Grupo 1 tambien presentaron puntuaciones numericamente menores, aunque no significativamente diferentes, de lesiones de colon macroscopicas y de lesiones microscopicas de fleo y de colon, y tambien una menor colonizacion de tejidos (t-PCR). En total, estos datos confirman que la vacunacion proporciona una proteccion eficaz superior y a mayor plazo que la inmunidad materna por sf sola.

Todas las comparaciones de los demas grupos, excepto uno, discutidas anteriormente se basaron en un estudio de variable unica, bien la vacunacion de cerda bien la vacunacion de cochinillo, pero no de ambos. La comparacion entre los Grupos 1 y 5 requirio la evaluacion de los datos teniendo en cuenta dos variables de estudio (vacunacion de cerda y vacunacion de cochinillo). Se destaca que los Grupos 2 y 5 eran estadfsticamente diferentes (P<0,05) en algunos parametros y numericamente inferiores en otros. Se puede asumir razonablemente que los Grupos 1 y 5 senan estadfsticamente diferentes en la mayona de los parametros de estudio como en los Grupos 2 y 5. En resumen, se determino que los Grupos 1 y 5 eran significativamente diferentes (P<0,05) en numerosos parametros que incluyen los parametros de estudio primarios de puntuaciones macroscopicas de fleo, puntuaciones microscopicas de fleo y puntuaciones microscopicas de colon.

Finalmente, los Grupos 3 y 6 (los grupos de control estricto) confirmaron el status de los cerdos en relacion a la Lawsonia y validaron las fuentes de cerdos. Estos grupos no fueron incluidos en los analisis estadfsticos. Todos los parametros medidos y evaluados confirman que estos animales eran negativos en Lawsonia, excepto por las puntuaciones de lesiones microscopicas de un unico cerdo del Grupo 6, que fue registrado como positivo en Lawsonia. En base a los datos acumulados de todos los demas parametros, se cree que se trato de un error.

Claims (16)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   REIVINDICACIONES

   1. Uso de una cantidad eficaz de antigeno de Lawsonia intracellularis para la preparacion de un medicamento para proporcionar una proteccion aumentada contra la infeccion de Lawsonia intracellularis en un animal joven mediante un metodo, en el que

   (A) la madre de dicho animal joven ha de ser vacunada con dicho medicamento mientras dicha madre esta embarazada de dicho animal joven y

   (B) dicho animal joven ha de ser vacunado con una dosis eficaz de dicho medicamento durante las tres primeras semanas de vida,

   en donde dicho animal joven es un cochinillo, y, en donde dicho antfgeno es una bacteria de Lawsonia intracellularis viva modificada.
2. 2. El uso de la reivindicacion 1, comprendiendo dicha dosis eficaz en la etapa (b) entre aproximadamente 103 y aproximadamente 109 bacterias Lawsonia intracellularis por dosis.
3. 3. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, comprendiendo dicha dosis eficaz en la etapa (b) entre 3,0 TCID50 a aproximadamente 6,0 TCID50 bacterias Lawsonia intracellularis por dosis.
4. 4. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, administrandose dicha vacuna a dicho animal joven entre 12 y 21 dfas despues del nacimiento.
5. 5. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, administrandose dicha vacuna a dicho animal joven entre 15 y 21 dfas despues del nacimiento.
6. 6. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, administrandose dicha vacuna a dicho animal joven entre 19 y 21 dfas despues del nacimiento.
7. 7. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde en la etapa (b) dicho animal joven ha de ser vacunado antes de que dicho animal alcance las tres semanas de edad.
8. 8. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, comprndiendo dicha etapa de vacunacion (b) la administracion de una dosis unica de dicha vacuna.
9. 9. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, incluyendo dicha etapa de vacunacion la etapa de administrar dicha vacuna por via oral.
10. 10. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, estando dicha madre vacunada con dosis repetidas de vacuna antes de parir dicho animal joven.
11. 11. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, recibiendo dicha madre tres vacunaciones con dicha primera vacunacion entre 50 y 60 dfas antes de parir dicho animal joven.
12. 12. El uso de la reivindicacion 11, ocurriendo dicha segunda vacunacion entre 30 y 40 dfas antes de parir dicho animal joven.
13. 13. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 11 y 12, ocurriendo dicha tercera vacunacion entre 10 y 20 dfas antes de parir dicho animal joven.
14. 14. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 13, estando dicha vacunacion en la etapa (a) con una dosis de al menos 3 x 103,0 a 3 x 109,0 TCID50 de bacteria Lawsonia intracellularis modificada viva.
15. 15. El uso de la reivindicacion 14, en el que dicha bacteria viva modificada de Lawsonia intracellularis se selecciona del grupo que consiste en el N° de Acceso de ATCC PTA-4926, N° de Acceso ATCC 55783, y combinaciones de los mismos.
16. 16. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, dicha vacunacion de la madre de dicho animal joven se produce durante la segunda o tercera etapas de gestacion de dicho animal joven.