BRPI0712164A2 - vacinação de animais jovens infecções por lawsonia intracellularis - Google Patents

Abstract

VACINAçãO DE ANIMAIS JOVENS CONTRA INFECçõES POR LAWSONIA INTRACELLULARIS. A presente invenção refere-se a um método de vacinação de um animal jovem contra-infecção por L. intracellularis, compreendendo esse método a etapa de administrar a esse animal uma dose eficaz de antígeno de L.Intracellularis. A presente invenção também proporciona um método de vacinação de um animal, preferencialmente um animal jovem, que apresenta anticorpos anti-L.Intraceilularis ou é exposto a anticorpos anti-L.Intracellularis. Em particular, esses anticorpos anti-L.Intracellularis são anticorpos maternalmente derivados.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "VACINAÇÃO DE ANIMAIS JOVENS CONTRA INFECÇÕES POR LAWSONIA INTRA- CELLULARIS"

PEDIDOS RELACIONADO

Este pedido reivindica o benefício de prioridade do Pedido Norte- americano Nq de Série 60/803.207, depositado em 25 de maio de 2006, cu- jos ensinamentos e conteúdo são incorporados aqui em sua totalidade como referência.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se amplamente a métodos de vaci- nação aperfeiçoados para imunização contra enterite proliferativa, chamada ileíte, preferencialmente, ileíte proliferativa porcina, que é causada por uma bactéria intracelular obrigatória Lawsonia Intracellularis. Especificamente, a invenção proporciona um método para proporcionar elevada proteção contra L. Intracellularis mediante vacinação de animais jovens, começando do pri- meiro (1) dia de idade, contra infecções por L. Intracellularis. Preferencial- mente, os animais jovens são vacinados do primeiro ao vigésimo primeiro (1) dia de idade, mais preferencialmente, do primeiro ao décimo dia de idade, ainda mais preferencialmente, do primeiro ao nono dia de idade, ainda mais preferencialmente, do primeiro ao sexto dia de idade, ainda mais preferenci- almente, no primeiro ou segundo dia de idade, e ainda mais preferencial- mente, no primeiro (1) dia de idade. Especificamente, esses animais jovens são leitões jovens, preferencialmente, leitões pré-desmamados.

DESCRIÇÃO DO ESTADO DA TÉCNICA

Enterite proliferativa porcina é uma doença de ocorrência natural que pode afetar porcos em estágio de desmame a adulto jovem. Estabele- ceu-se que o agente causador é Lausonia Intracellularis. L. Intracellularis é uma bactéria intracelular obrigatória que não pode ser cultivada por métodos bacteriológicos normais em meio convencional isento de células e acredita- se que exige células para seu crescimento. S. McOrist e et al., Infection and lmmunity, Vol. 61, Nq 19, 4286-4292 (1993), e G. Lawson e et al., J. of Clini- cal Microbiology, Vol. 31, N6 5, 1136-1142 (1993), discutem cultura de L. In- tracellularis usando monocamadas de células epiteliais intestinais de ratos IEC-18 em frascos de cultura convencional de tecidos. Nas Patentes Norte- americanas N— 5.714.375 e 5.885.823, as quais são incorporadas aqui em sua totalidade como referência, descreve-se cultura de L. Intracellularis em células hospedeiras suspensas.

Cepas de bactérias patogênicas e não-patogênicas atenuadas de L. Intracellularis são bem-conhecidas no estado da técnica. Por exemplo, WO 96/39629 e WO 05/011731 descrevem cepas não-patogênicas atenua- das de L. Intracellularis. Cepas de bactérias atenuadas de L. Intracellularis são adicionalmente descritas e conhecidas de WO 02/26250 e WO 03/00665.

A doença caracteriza-se primeiro por sua patologia espessa e microscópica e, em seguida, pela demonstração das bactérias intracelulares em células afetadas. O aspecto de caracterização patológica da doença é a proliferação de células epiteliais imaturas nas criptas do Neo (parte terminal do intestino delgado), do intestino grosso ou de ambos. Seções de tecido infestado caracterizam-se por uma mucosa com espessamento avermelha- do, similar a uma "mangueira de jardim", e lesões entéricas. O espessamen- to intestinal impede por fim função intestinal normal, capacidade de absorção e transferência de nutrientes. Efeitos clínicos da doença são perda crônica de peso, animais economicamente inviáveis, diarréia e morte. A doença é de importância econômica devido a perda por morte, elevados custos de medi- cação, ganho insuficiente de peso e redução na conversão de alimentos em animais afetados. Casos clínicos de ileíte são observados mais notavelmen- te em porcos de 6-20 semanas de idade. Entretanto, a presença de L Intra- cellularis foi confirmada (PCR) em porcos recentemente desmamados (3-4 semanas de idade), sugerindo que exposição a L Intracellularis ocorre no viveiro e talvez se origine de mães positivas a Lawsonia (Mauch e Bilkei (2004), Vet Rec 155:532; Marsteller e et al. (2003), Swine Health Prod 11:127-130; Stege e coladoradores (2004), Vet Micro 104:197-206). Essas observações ressaltam a importância da incorporação de estratégias de pre- venção, tais como vacinação antes do sistema de produção.

Estratégias correntes de vacinação para imunização contra ileíte envolvem administração oral da vacina a porcos originários de Lawsonia ex- clusivamente a partir de três semanas de idade e mais velhos, porque leitões abaixo desse grupo de idades apresentam anticorpos maternos positivos a L. Intracellularis devido à exposição anterior da porca ou vacinação. Antes do método da presente invenção, acreditava-se que a presença de anticor- pos maternos ou outros fatores lactogênicos pudesse interferir potencialmen- te na eficácia de vacinações nesses leitões, porque os anticorpos maternos tinham a capacidade de neutralizar a vacina antes de o sistema imune do leitão poder reconhecê-la e começar a secretar seus próprios anticorpos. Portanto, vacinação de leitões jovens era evitada em face de imunidade ma- terna.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

A figura 1 mostra o número de amostras de colostro positivas no IFAT a IgG, IgM e IgA; e

a figura 2 mostra o título de cultura de L. Intracellularis (médias de duas titulações) em amostras de leite de porca com diferente teor de Ig.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção baseia-se em duas surpreendentes obser- vações. Primeiro, anticorpos maternos e o leite de porca não parecem efica- zes para inativação de L. Intracellularis durante passagem gastrointestinal. A incubação de L. Intracellularis com colostro ou leite de porca não influencia- ram o título de uma cultura de L Intracellularis por um período de 4 horas de incubação à temperatura ambiente. Não há diferença entre amostras com alto ou baixo teor de Ig. Mesmo sob uma diluição 1:20 (5% de L. Intracellula- risí95% de leite), não se observou nenhum efeito sobre o título da cultura. Em conclusão, nenhum efeito direto de qualquer das amostras de leite de porca testadas sobre o título de uma cultura de L. Intracellularis foi detectado in vitro. No entanto, imunidade materna contra L. Intracellularis é discutida (Holyoake, P.K. e et al. (1994), J Clin Mierobiol 32, pp. 1980-1985; Mauch, C.H.Y. e G. Bilkei (2004), Vet. Ree. 155, 532), na medida em que leitões jo- vens usualmente não sofrem de ileíte. Como mostrado neste estudo, anti- corpos maternos e o leite de porca não parecem eficazes para inativação de L. Intracellularis durante passagem gastrointestinal.

Segundo, anticorpos maternos e leite de porca não interferem em antígeno de L. Intracellularis e, portanto, não impedem o estabelecimen- to de proteção ativa contra infecções por L. Intracellularis proporcionada por vacinação. De fato, leitões vacinados no primeiro (1) dia de idade apresen- tam patologia geral reduzida associada à doença em comparação com lei- tões não-vacinados.

Assim, a presente invenção supera deficiências do estado da técnica e proporciona novos métodos para proporcionar elevação de prote- ção de animais contra ileíte (infecções por L. Intracellularis). Em particular, a presente invenção proporciona um método de vacinação de um animal jo- vem contra infecções por L. Intracellularis, compreendendo esse método a etapa de administrar a esse animal jovem uma dose eficaz de antígeno de L. Intracellularis. Preferencialmente, esse animal jovem tem um (1) dia de idade ou mais. Além disso, de acordo com outro aspecto, a presente invenção proporciona um método de vacinação de um animal jovem que apresenta ou é exposto a anticorpos anti-L. Intracellularis, em particular, anticorpos anti-L.

Intracellularis maternalmente derivados, contra infecções por L Intracellula- ris, compreendendo a etapa de administrar a esse animal jovem uma dose eficaz de antígeno de L. Intracellularis. Preferencialmente, esse animal jo- vem tem um (1) dia de idade ou mais.

De acordo com outro aspecto, a presente invenção proporciona um método para vacinação de um animal que apresenta ou é exposto a anti- corpos anti-L. Intracellularis, em particular, anticorpos anti-L. Intracellularis maternalmente derivados, contra infecções por L. Intracellularis, compreen- dendo a etapa de administrar a esse animal uma dose eficaz de antígeno de L. Intracellularis.

O termo "vacinação", como usado neste relatório, significa, mas sem se limitar ao mesmo, um processo que inclui a administração de um antígeno de L. Intracellularis a um animal, no qual esse antígeno de L. Intra- cellularis, quando administrado a esse animal, origina ou é capaz originar uma resposta imune nesse animal contra L Intracellularis.

O termo "animal", como usado neste relatório, significa, mas sem se limitar aos mesmos, pássaros, peixes e mamíferos, tais como gado, porcos, cavalos ou primatas. Contudo, de acordo com modalidade preferida da presente invenção, o animal é um porco, preferencialmente, um leitão desmamado.

Assim, de acordo com um aspecto adicional, a presente inven- ção refere-se a um método de vacinação de um animal jovem contra- infecção por L Intracellularis, compreendendo a etapa de administrar a esse animal jovem, partindo do primeiro (1) dia de idade, uma dose eficaz de an- tígeno de L. Intracellularis, em que esse animal é um pássaro, peixe ou ma- mífero tal como gado, porco, cavalo ou primata. Preferencialmente, esse animal é um mamífero. Ainda mais preferencialmente, esse animal é um porco. Mais preferencialmente, esse animal é um leitão desmamado.

O termo "animal jovem", como usado neste relatório, refere-se a um animal de 1 dia de idade a 20 dias de idade. Preferencialmente, o termo "animal jovem" refere-se a um animal de 1 dia de idade a 10 dias de idade. Mais preferencialmente, o termo "animal jovem" refere-se a um animal de 1 dia de idade a 9 dias de idade, ainda mais preferencialmente, de 1 dia de idade a 8 dias de idade, ainda mais preferencialmente, de 1 dia de idade a 7 dias de idade, ainda mais preferencialmente, de 1 dia de idade a 6 dias de idade, ainda mais preferencialmente, de 1 dia de idade a 5 dias de idade, ainda mais preferencialmente, de 1 dia de idade a 4 dias de idade, ainda mais preferencialmente, de 1 dia de idade a 3 dias de idade, ainda mais pre- ferencialmente, de 1 ou 2 dias de idade, e ainda mais preferencialmente, a um animal de 1 dia de idade. O respectivo significado do termo "animal jo- vem" também se refere à idade do animal quando ele é vacinado pela pri- meira vez com antígeno de L. Intracellularis.

Desse modo, um aspecto adicional da presente invenção refere- se a um método de vacinação de um animal jovem contra infecções por L Intracellularis, compreendendo a etapa de administrar a esse animal jovem uma dose eficaz de antígeno de L. Intracellularis, em que esse animal é va- cinado no 1s dia ao 20Q dia de idade. De acordo com uma modalidade adi- cional, a presente invenção refere-se a esse método de vacinação, no qual o animal é vacinado no 1- dia ao 10Q dia de idade. De acordo com uma moda- lidade adicional, a presente invenção refere-se a esse método de vacinação, no qual o animal é vacinado no 1Q dia ao 9Q dia de idade. De acordo com uma modalidade adicional, a presente invenção refere-se a esse método de vacinação, no qual o animal é vacinado no 19 dia ao 8Q dia de idade. De a- cordo com uma modalidade adicional, a presente invenção refere-se a esse método de vacinação, no qual o animal é vacinado no 1Q dia ao 7S dia de idade. De acordo com uma modalidade adicional, a presente invenção refé- re-se a esse método de vacinação, no qual o animal é vacinado no 1- dia ao 6- dia de idade. De acordo com uma modalidade adicional, a presente in- venção refere-se a esse método de vacinação, no qual o animal é vacinado no 1Q dia ao 5Q dia de idade. De acordo com uma modalidade adicional, a presente invenção refere-se a esse método de vacinação, no qual o animal é vacinado no 1Q dia ao 4- dia de idade. De acordo com uma modalidade adi- cional, a presente invenção refere-se a esse método de vacinação, no qual o animal é vacinado no 1Q dia ao 3S dia de idade. De acordo com uma modali- dade adicional, a presente invenção refere-se a esse método de vacinação, no qual o animal é vacinado no 1Q ou 2Q dia de idade. De acordo com uma modalidade adicional, a presente invenção refere-se a esse método de vaci- nação, no qual o animal é vacinado no 1s dia de idade.

O termo "que apresenta ou é exposto a anticorpos anti-L. Intra- cellularis" deve significar, mas sem se limitar ao mesmo, um animal que a- presenta ou é exposto a um título detectável de anticorpos anti-L. Intracellu- laris, preferencialmente, de pelo menos 1:4, mais preferencialmente, maior que 1:16, ainda mais preferencialmente, maior que 1:64, ainda mais prefe- rencialmente, maior que 1:128, ainda mais preferencialmente, de 1:256, ain- da mais preferencialmente, maior que 1:512 e ainda mais preferencialmente, maior que 1:1024, por ml. Preferencialmente,, esse título de anticorpos anti- L. Intracellularis é detectável e quantificável em um imunoenssaio específico a anti-L. Intracellularis, preferencialmente, no ensaio conforme descrito no Exemplo 4. Mais preferecialmente, esses anticorpos anti-L Intracellularis são anticorpos maternalmente derivados.

O termo "exposto a anticorpos anti-L. Intracellularis" significa, mas sem se limitar ao mesmo, ao fato de que os animais são alimentados com nutrientes, por exemplo colostro ou leite, obtendo um título detectável de anticorpos anti-L. Intracellularis, preferencialmente, de pelo menos 1:4, mais preferencialmente, maior que 1:16, ainda mais preferencialmente, mai- or que 1:64, ainda mais preferencialmente, maior que 1:128, ainda mais pre- ferencialmente, de 1:256, ainda mais preferencialmente, maior que 1:512 e ainda mais preferencialmente, maior que 1:1024, por ml ou grama de nutriente.

O termo "que apresenta anticorpos anti-L. Intracellularis" signifi- ca, mas sem se limitar ao mesmo, um título detectável de anticorpos anti-L. Intracellularis, em 1 ml de soro desse animal, preferencialmente, de pelo menos 1:4, ainda mais preferencialmente, maior que 1:16, ainda mais prefe- rencialmente, maior que 1:64, ainda mais preferencialmente, maior que 1:128, ainda mais preferencialmente, de 1:256, ainda mais preferencialmen- te, maior que 1:512 e ainda mais preferencialmente, maior que 1:1024.

Assim, de acordo com outro aspecto, a presente invenção pro- porciona um método de vacinação de um animal contra-infecção por L. In- tracellularis, compreendendo a etapa de administrar a esse animal uma dose eficaz de antígeno de L. Intracellularis, em que esse animal apresenta ou é exposto a um título detectável de anticorpos anti-L. Intracellularis, preferen- cialmente, de pelo menos 1:4, mais preferencialmente, maior que 1:16, ainda mais preferencialmente, maior que 1:64, ainda mais preferencialmente, mai- or que 1:128, ainda mais preferencialmente, de 1:256, ainda mais preferen- cialmente, maior que 1:512 e ainda mais preferencialmente, maior que 1:1024 por ml. Preferencialmente, esses anticorpos são anticorpos mater- nalmente derivados. Ainda mais preferencialmente, esses títulos de anticor- pos estão presentes nesse animal no dia de vacinação.

Assim, de acordo com outro aspecto, a presente invenção pro- porciona um método de vacinação de um animal jovem contra-infecção por L. Intracellularís, compreendendo a etapa de administrar a esse animal jo- vem uma dose eficaz de antígeno de L. Intracellularís, em que esse animal apresenta ou é exposto a um título detectável de anticorpos anti-L Intracellu- laris, preferencialmente, de pelo menos 1:4, mais preferencialmente, maior que 1:16, ainda mais preferencialmente, maior que 1:64, ainda mais prefe- rencialmente, maior que 1:128, ainda mais preferencialmente, de 1:256, ain- da mais preferencialmente, maior que 1:512 e ainda mais preferencialmente, maior que 1:1024 por ml. Preferencialmente, esses anticorpos são anticor- pos maternalmente derivados. Preferencialmente, esse animal jovem tem entre 1 dia de idade e 20 dias de idade. Mais preferencialmente, esse animal jovem tem entre 1 dia de idade e 10 dias de idade, ainda mais preferencial- mente, entre 1 dia de idade e 9 dias de idade, ainda mais preferencialmente, entre 1 dia de idade e 8 dias de idade, ainda mais preferencialmente, entre 1 dia de idade e 7 dias de idade, ainda mais preferencialmente, entre 1 dia de idade e 6 dias de idade, ainda mais preferencialmente, entre 1 dia de idade e 5 dias de idade, ainda mais preferencialmente, entre 1 dia de idade e 4 dias de idade, ainda mais preferencialmente, entre 1 dia de idade e 3 dias de ida- de, ainda mais preferencialmente, entre 1 e 2 dias de idade, e ainda mais preferencialmente, 1 dia de idade.

O termo "uma dose eficaz", como usado neste relatório, signifi- ca, mas sem se limitar à mesma, uma quantidade de antígeno que origina ou é capaz originar uma resposta imune em um animal ao qual a dose eficaz de antígeno de L Intracellularís é administrada.

Uma "resposta imunológica ou imune" a uma composição ou vacina é o desenvolvimento no hospedeiro de uma resposta imune celular e/ou mediada por anticorpos à composição ou vacina de interesse. Assim, o termo "origina ou é capaz de originar uma resposta imune" significa, mas sem se limitar ao mesmo, um processo imunológico em um hospedeiro ca- racterizado pelo fato de que esse hospedeiro desenvolve uma resposta imu- ne celular e/ou mediada por anticorpos à composição ou vacina de interes- se. Usualmente, "uma resposta imune" inclui, mas sem se limitar aos mes- mos, um ou mais dos seguintes efeitos: a produção ou ativação de anticor- pos, células B, células T auxiliadoras, células T supressoras e/ou células T citotóxicas e/ou células T yd, dirigidas especificamente a um antígeno ou antígenos incluídos na composição ou vacina de interesse. Preferencialmen- te, o hospedeiro exibirá uma resposta terapêutica ou imunológica protetora tal que reistência à nova infecção será aumentada e/ou a gravidade clínica da doença reduzida. Essa proteção será demonstrada por uma redução no número ou gravidade, ou falta dos sintomas associados a infecções do hos- pedeiro como descrito aqui.

A quantidade de antígeno que é eficaz para originar uma respos- ta imune ou é capaz de originar uma resposta imune em um animal depende dos ingredientes da vacina e do programa de administração. Tipicamente, quando antígeno bacteriano morto é usado na vacina, a vacina contém uma quantidade cerca de 103 a cerca de 109 unidades formadoras de colônia (UFC) da bactéria por dose, preferencialmente, cerca de 104 a cerca de 108 (UFC) da bactéria por dose, e mais preferencialmente, cerca de 105 a cerca de 106 (UFC) por dose.

Em particular, quando bactérias L. Intracellularis vivas modifica- das são usadas em vacinas, por exemplo, os isolados de bactérias isolado designado B3903, Ne de Acesso ATCC PTA-4926, e isolado designado N34NP40wk, N5 de Acesso ATCC 55783 (ambos descritos WO 96/39629 e WO 05/011731), a dose recomendada a ser administrada ao animal suscetí- vel é preferencialmente de cerca de 3,0 TCID50 (ponto final de 50% de dose infectante de cultura de tecido)/dose a cerca de 6,0 TCID50/dose e, mais pre- ferencialmente, cerca de 4,0 de TCID50/dose a cerca de 5,0 TCID5o/dose. Em uma modalidade preferida, o título da vacina é de cerca de 4,9 TCID50/dose como determinado por ensaio de diluição de ponto final de 50% de Dose Infectante de Cultura de Tecido (TCID50). Em geral, a quantidade de imunógeno será entre 5 e 5.000 microgramas, e entre 102,0 e 109,0 TCID50, preferencialmente, entre 103° e IO60TCID50, e mais preferencial- mente, entre 104,0 e IO5 0TCID50, quando são usadas bactérias purificadas.

Subunidades de vacinas são normalmente administradas com um nível de inclusão de antígeno de pelo menos 0,2 pg de antígeno por do- se, preferencialmente, com cerca de 0,2 a cerca de 400 pg/dose, ainda mais preferencialmente, com cerca de 0,3 a cerca de 200 pg/dose, ainda mais preferencialmente, com cerca de 0,35 a cerca de 100 pg/dose, ainda mais preferencialmente, com cerca de 0,4 a cerca de 50 yg/dose, ainda mais pre- ferencialmente, com cerca de 0,45 a cerca de 30 pg/dose, ainda mais prefe- rencialmente, com cerca de 0,6 a cerca de 15 pg/dose, ainda mais preferen- cialmente, com cerca de 0,75 a cerca de 8 pg/dose, ainda mais preferenci- almente, com cerca de 1,0 a cerca de 6 pg/dose, e ainda mais preferencial- mente, com cerca de 1,3 a cerca de 3,0 pg/dose.

Como usado neste relatório, o termo "aumento de proteção" sig- nifica, mas sem se limitar à mesma, uma redução estatisticamente significa- tiva de um ou mais sintomas clínicos que são associados a infecções por L Intracellularis (freqüência de lesões cruzadas, etc.) em um grupo de animais vacinados versus um grupo de animais de controle não-vacinados. O termo "redução estatisticamente significativa de sintomas clínicos" significa, mas sem se limitar à mesma, que a freqüência na incidência de pelo menos um sintoma clínico no grupo de animais vacinados é pelo menos 20%, preferen- cialmente, de 30%, ainda mais preferencialmente, de 50%, e ainda mais pre- ferencialmente, de 70%, menor que no grupo de controle não-vacinado, a- pós o desafio com bactérias infecciosas de L. Intracellularis.

Como usado neste relatório, o termo "L Intracellularis" significa as bactérias intracelulares curvas gram-negativas descritas em detalhes por C. Gebhart e et al., InfI. J. of Systemic Bacteriology, Vol. 43, Nq 3, 533-538 (1993), e S. McOrist e et al., Int'l. J. of Systemic Bacteriology, Vol. 45, Ns 4, 820-825 (1995), cada um dos quais é incorporado aqui em sua totalidade como referência, e inclui, mas sem se limitar aos mesmos, os isolados des- critos no WO 96/39629 e WO 05/011731. Em particular, o termo "L. Intracel- lularis" também significa, mas sem se limitar aos mesmos, os isolados depo- sitados sob o Tratado de Budapeste com a Coleção de Culturas Tipo Ameri- cano, 10801 University Boulevard, Manassas, Virgínia 20110-2209, e desig- nados número de acesso ATCC PTA 4926 ou número de acesso ATCC 55783. Ambos os isolados são descritos no WO 96/39629 e WO 05/011731, respectivamente. O termo "L Intracellularis" também significa, mas sem se limitar aos mesmos, qualquer outra cepa, ou isolado, de bactérias L. Intracel- lularis, preferencialmente apresentando as propriedades imunogênicas de pelo menos uma das cepas de L. Intracellularis descritas no WO 96/39629 e WO 05/011731, em particular, apresentando as propriedades imunogênicas de pelo menos um dos isolados depositados sob o Tratado de Budapeste com a Coleção de Culturas Tipo Americano, 10801 University Boulevard, Manassas, Virgínia 20110-2209, e designados números de acesso ATCC PTA 4926 ou número de acesso ATCC 55783.

Uma cepa ou isolado apresenta as "propriedades imunogências" de pelo menos uma das cepas de L. Intracellularis descritas no WO 96/39629 e WO 05/011731, em particular, dos isolados depositados como números de acesso ATCC PTA 4926 ou número de acesso ATCC 55783, quando é detectável pelo menos com um dos anticorpos específicos anti-L Intracellularis, descritos no W006/01294, em um ensaio de detecção que é também descrito in W006/01294. Preferencialmente, esses anticorpos são selecionados dos anticorpos que apresentam os números de referência 301:39, 287:6, 268:29, 110:9, 113:2 e 268:18. Preferencialmente, o ensaio de detecção é um sanduíche ELISA conforme descrito nos Exemplos 2 e 3 de W006/12949, considerando que o anticorpo 110:9 é usado como anticor- po de captura e o anticorpo 268:29 é usado como anticorpo conjugado. To- dos os anticorpos descritos no W006/12949 são produzidos por células hi- bridomáticas, que estão depositadas no Centro para Microbiologia e Pesqui- sa Aplicadas (CAMR) e Coleção Européia de Culturas de Células (ECACC), Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, Reino Unido, como depósito de patente de acordo com o Tratado de Budapeste. A data de depósito foi 11 de maio de 2004. A LINHAGEM DE CÉLULAS DE HIBRIDOMA 110:9 está depositada de forma bem-sucedida sob N5 de Acesso ECACC 04092204. A LINHAGEM DE CÉLULAS DE HIBRIDOMA 113:2 está depositada de forma bem- sucedida sob N9 de Acesso ECACC 04092201. A LINHAGEM DE CÉLULAS DE HIBRIDOMA 268:18 está depositada de forma bem-sucedida sob Ns de Acesso ECACC 04092202. A LINHAGEM DE CÉLULAS DE HIBRIDOMA 268:29 está depositada de forma bem-sucedida sob Nq de Acesso ECACC 04092206. A LINHAGEM DE CÉLULAS DE HIBRIDOMA 287:6 está deposi- tada de forma bem-sucedida sob N5 de Acesso ECACC 04092203. Final- mente, a LINHAGEM DE CÉLULAS DE HIBRIDOMA 301:39 está depositada de forma bem-sucedida sob Nq de Acesso ECACC 04092205.

O termo "antígeno de L. Intracellularis", como usado neste rela- tório, significa, mas sem se limitar aos mesmos, qualquer composição de ingredientes que compreende pelo menos um antígeno que pode induzir, estimular ou elevar a resposta imune contra uma infecção causada por L. Intracellularis quando administrada a um animal. Preferencialmente, esse antígeno de L. Intracellularis é uma bactéria completa de L. Intracellularis, em particular, sob uma forma inativada (chamada bactéria morta), uma bac- téria viva modificada ou atenuada de L. Intracellularis (chamada MLB), qual- quer subunidade, polipeptídeo ou componente de L. Intracellularis, ou qual- quer vetor quimérico, no quais cada um compreende pelo menos uma se- qüência imunogênica de aminoácidos de L. Intracellularis. Os termos "prote- ína imunogênica", "polipeptídeo imunogênico" ou "seqüência de aminoácidos imunogênica", conforme usado neste relatório, referem-se a qualquer se- qüência de aminoácidos que origina uma resposta imune em um hospedeiro contra um patógeno que compreende essa proteína imunogênica, polipeptí- deo imunogênico ou seqüência de aminoácidos imunogênica. Em particular, uma "proteína imunogênica", "polipeptídeo imunogênico" ou "seqüência de aminoácidos imunogênica" de L Intracellularis significa qualquer seqüência de aminoácidos que codifica um antígeno que dá origem a uma resposta imunogênica contra L. Intracellularis em um hospedeiro ao qual a "proteína imunogênica", o "polipeptídeo imunogênico" ou a "seqüência de aminoácidos imunogênica" é administrada.

Uma "proteína imunogênica", "polipeptídeo imunogênico" ou "seqüência de aminoácidos imunogênica", conforme usado neste relatório, inclui, mas sem se limitar aos mesmos, a seqüência de comprimento com- pleto de quaisquer proteínas, análogos dessa seqüência ou fragmentos imu- nogênicos desta. O termo "fragmento imunogênico" significa um fragmento de uma proteína que inclui um ou mais epítopos e, assim, origina a resposta imunológica contra o patógeno correspondente. Esses fragmentos podem ser identificados usando qualquer número de técnicas de mapeamento de epítotos que são bem-conhecidos no estado da técnica. Ver, por exemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed. 1996) Humana Press, Totwa, New Jersey (Os ensinamentos e conteúdo são incorporados aqui como referência). Por exemplo, epítopos lineares poderão ser determinados, por exemplo, sintetizando concorrente- mente grandes números de peptídeos em suportes sólidos, os peptídeos que correspondem a porções da molécula de proteína, e reagindo os peptí- deos com anticorpos enquanto os peptídeos estão ainda ligados aos supor- tes. Essas técnicas são conhecidas no estado da técnica e descritos no, por exemplo, Patente Norte-americana Nq 4.708.871; Geysen e et al. (1984) Proc. Nati Acad. Sci USA, 81:3998-4002; Geysen e et al. (1986) Molec. Im- munol., 23:709-715. (Os ensinamentos e conteúdo são incorporados aqui como referência). Similarmente, epítopos conformativos são prontamente identificados mediante determinação de conformação espacial de aminoáci- dos, tais como, por exemplo, cristalografia de raios X e ressonância magné- tica nuclear bidimensional. Ver, por exemplo, Epitope Mapping Protocols, supra. Antígenos sintéticos são, também, incluídos na definição, por exem- plo, poliepítopos, epítopos flanqueadores e outros antígenos recombinantes ou sinteticamente derivados. Ver, por exemplo, Bergmann e et al. (1993), Eur. J. Immunol., 23:2777-2781; Bergmann e et al. (1996), J. Immunol., 157:3242-3249; Suhrbier, A. (1997), Immunol. and Cell Biol., 75:402-408; Gardner e et al., (1998) 12th WorIdAIDS Conference, Geneva, Suíça, 28 de junho-3 de julho, 1998. (Os ensinamentos e conteúdo são incorporados aqui como referência).

Antígenos de L. Intracellularis adequados incluem, mas sem se limitar aos mesmos, aqueles descritos no EP 1219711; US 6.605.696; WO 96/39629; WO 97/20050; WO 00/69903; WO 00/69904; WO 00/69905; WO 00/69906; WO 02/38594; WO 02/26250; WO 03/006665; WO 04/033631; WO 05/026200; e WO 05/011731.

Desse modo, vacina para uso de acordo com a presente inven- ção inclui qualquer antígeno de L. Intracellularis, como descrito acima, que origina ou é capaz de originar uma resposta imune contra L. Intracellularis.

Preferencialmente, essa vacina proporciona pelo menos elevação de prote- ção contra L. Intracellularis.

Assim, de acordo com um aspecto adicional, a presente inven- ção refere-se a um método de vacinação de um animal jovem contra infec- ções por L. Intracellularis, compreendendo a etapa de administrar a esse animal jovem, partindo do primeiro (1) dia de idade, uma dose eficaz de an- tígeno de L. Intracellularis, em que o antígeno de L. Intracellularis é selecio- nado do grupo que consiste em bactérias L. Intracellularis vivas modificadas, bactérias L. Intracellularis mortas ou uma ou mais subunidades de bactérias L. Intracellularis. Preferencialmente, a vacina compreende bactérias L. Intra- cellularis vivas modificadas. Mais preferencialmente, a vacina é EnterisoP Ileitis B3903 (Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc.). Como mencionado a - cima, preferencialmente a vacinação ocorre do primeiro ao vigésimo dia de idade, mais preferencialmente, do primeiro ao décimo dia de idade, ainda mais preferencialmente, do primeiro ao nono dia de idade, ainda mais prefe- rencialmente, do primeiro ao oitavo dia de idade, ainda mais preferencial- mente, do primeiro ao sétimo dia de idade, ainda mais preferencialmente, do primeiro ao sexto dia de idade, ainda mais preferencialmente, do primeiro ao quinto dia de idade, ainda mais preferencialmente, do primeiro ao quarto dia de idade, ainda mais preferencialmente, do primeiro ao terceiro dia de idade, ainda mais preferencialmente, no primeiro ou segundo dia de idade, e ainda mais preferencialmente, no primeiro (1) dia de idade.

De acordo com outro aspecto, a presente invenção proporciona um método de vacinação de um animal contra infecções por L. Intracellula- ris, compreendendo a etapa de administrar a esse animal uma dose eficaz de antígeno de L Intracellularis, em que o animal apresenta ou é exposto a um título detectável de anticorpos anti-L Intracellularis, preferencialmente, de pelo menos 1:4, mais preferencialmente, maior que 1:16, ainda mais pre- ferencialmente, maior que 1:64, ainda mais preferencialmente, maior que 1:128, ainda mais preferencialmente, de 1:256, ainda mais preferencialmen- te, maior que 1:512 e ainda mais preferencialmente, maior que 1:1024, por ml, e em que o antígeno de L. Intracellularis é selecionado do grupo que consiste em bactérias L. Intracellularis vivas modificadas, bactérias L. Intra- cellularis mortas ou uma ou mais subunidades de bactérias L. Intracellularis. Preferencialmente, a vacina compreende bactérias L. Intracellularis vivas modificadas. Mais preferencialmente, a vacina é EnterisoP Ileitis B3903 (Bo- ehringer Ingelheim Vetmedica, Inc.). Além disso, esses anticorpos são prefe- rencialmente maternalmente derivados. Ainda mais preferencialmente, esses títulos de anticorpos estão presentes nesse animal no dia de vacinação.

De acordo com outro aspecto, a presente invenção proporciona um método de vacinação de um animal jovem contra-infecção por L. Intracel- lularis, compreendendo a etapa de administrar a esse animal jovem uma dose eficaz de antígeno de L. Intracellularis, em que esse animal jovem a- presenta ou é exposto a um título detectável de anticorpos anti-L Intracellu- laris, preferencialmente, de pelo menos 1:4, mais preferencialmente, maior que 1:16, ainda mais preferencialmente, maior que 1:64, ainda mais prefe- rencialmente, maior que 1:128, ainda mais preferencialmente, de 1:256, ain- da mais preferencialmente, maior que 1:512, ainda mais preferencialmente, maior que 1:1024, por ml, e em que o antígeno de L Intracellularis é sele- cionado do grupo que consiste em bactérias L. Intracellularis vivas modifica- das, bactérias L. Intracellularis mortas ou uma ou mais subunidades de bac- térias L. Intracellularis. Preferencialmente, a vacina compreende bactérias L Intracellularis vivas modificadas. Mais preferencialmente, a vacina é Enteri- soP Ileitis B3903 (Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc.). Além disso, esses anticorpos são preferencialmente maternalmente derivados. Ainda mais pre- ferencialmente, esses títulos de anticorpos estão presentes nesse animal no dia de vacinação. Preferencialmente, esse animal jovem tem entre 1 dia de idade e 20 dias de idade. Mais preferencialmente, esse animal jovem tem entre 1 dia de idade e 10 dias de idade, ainda mais preferencialmente, entre 1 dia de idade e 9 dias de idade, ainda mais preferencialmente, entre 1 dia de idade e 8 dias de idade, ainda mais preferencialmente, entre 1 dia de ida- de e 7 dias de idade, ainda mais preferencialmente, entre 1 dia de idade e 6 dias de idade, ainda mais preferencialmente, entre 1 dia de idade e 5 dias de idade, ainda mais preferencialmente, entre 1 dia de idade e 4 dias de idade, ainda mais preferencialmente, entre 1 dia de idade e 3 dias de idade, ainda mais preferencialmente, 1 ou 2 dias de idade, e ainda mais preferencialmen- te, 1 dia de idade.

De acordo com um aspecto adicional, a presente invenção refe- re-se a um método de vacinação de um animal jovem contra infecções por L Intracellularis, compreendendo a etapa de administrar a esse animal jovem, partindo do primeiro (1) dia de idade, uma dose de cerca de 3,0 TCID50 a cerca de 6,0 TCID50 das bactérias L. Intracellularis vivas modificadas. Prefe- rencialmente, essas bactérias são aquelas incluídas na vacina EnterisoP Ileitis B3903 (Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc.). Como mencionado a- cima, preferencialmente a vacinação ocorre do primeiro ao vigésimo dia de idade, mais preferencialmente, do primeiro ao décimo dia de idade, ainda mais preferencialmente, do primeiro ao nono dia de idade, ainda mais prefe- rencialmente, do primeiro ao oitavo dia de idade, ainda mais preferencial- mente, do primeiro ao sétimo dia de idade, ainda mais preferencialmente, do primeiro ao sexto dia de idade, ainda mais preferencialmente, do primeiro ao quinto dia de idade, ainda mais preferencialmente, do primeiro ao quarto dia de idade, ainda mais preferencialmente, do primeiro ao terceiro dia de idade, ainda mais preferencialmente, no primeiro ou segundo dia de idade, e ainda mais preferencialmente, no primeiro (1) dia de idade.

De acordo com um aspecto adicional, a presente invenção refe- re-se a um método de vacinação de um animal contra-infecção por L. Intra- cellularis, compreendendo a etapa de administrar a esse animal uma dose de cerca de 3,0 TCID50 a cerca de 6,0 TCID50 das bactérias L. Intracellularis vivas modificadas, em que animal apresenta ou é exposto a um título detec- tável de anticorpos anti-L Intracellularis, preferencialmente, de pelo menos 1:4, mais preferencialmente, maior que 1:16, ainda mais preferencialmente, maior que 1:64, ainda mais preferencialmente, maior que 1:128, ainda mais preferencialmente, de 1:256, ainda mais preferencialmente, maior que 1:512 e ainda mais preferencialmente, maior que 1:1024, por ml. Preferencialmen- te, essas bactérias são aquelas incluídas na vacina EnterisoP Ileitis B3903 (Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc.).

De acordo com um aspecto adicional, a presente invenção refe- re-se a um método de vacinação de um animal jovem contra infecções por L Intracellularis, compreendendo a etapa de administrar a esse animal jovem uma dose de cerca de 3,0 TCID50 a cerca de 6,0 TCID50 das bactérias L. Intracellularis vivas modificadas, em que animal jovem apresenta ou é ex- posto a um título detectável de anticorpos anti-L. Intracellularis, preferenci- almente, de pelo menos 1:4, mais preferencialmente, maior que 1:16, ainda mais preferencialmente, maior que 1:64, ainda mais preferencialmente, mai- or que 1:128, ainda mais preferencialmente, de 1:256, ainda mais preferen- cialmente, maior que 1:512 e ainda mais preferencialmente, maior que 1:1024, por ml. Preferencialmente, essas bactérias são aquelas incluídas na vacina EnterisoP Ileitis B3903 (Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc.). Como mencionado acima, preferencialmente a vacinação ocorre do primeiro ao vigésimo dia de idade, mais preferencialmente, do primeiro ao décimo dia de idade, ainda mais preferencialmente, do primeiro ao nono dia de idade, ain- da mais preferencialmente, do primeiro ao oitavo dia de idade, ainda mais preferencialmente, do primeiro ao sétimo dia de idade, ainda mais preferen- cialmente, do primeiro ao sexto dia de idade, ainda mais preferencialmente, do primeiro ao quinto dia de idade, ainda mais preferencialmente, do primei- ro ao quarto dia de idade, ainda mais preferencialmente, do primeiro ao ter- ceiro dia de idade, ainda mais preferencialmente, no primeiro ou segundo dia de idade, e ainda mais preferencialmente, no primeiro (1) dia de idade.

De acordo com um aspecto adicional, a presente invenção refe- re-se a um método de vacinação de um animal jovem contra-infecção por L Intracellularis, compreendendo a etapa de administrar a esse animal jovem, partindo do primeiro (1) dia de idade, uma dose eficaz de antígeno de L. In- tracellularis, em que esse animal jovem é negativo a L. Intracellularis e a an- ticorpos maternos anti-L. Intracellularis. Como mencionado acima, preferen- cialmente a vacinação ocorre do primeiro ao vigésimo dia de idade, mais preferencialmente, do primeiro ao décimo dia de idade, ainda mais preferen- cialmente, do primeiro ao nono dia de idade, ainda mais preferencialmente, do primeiro ao oitavo dia de idade, ainda mais preferencialmente, do primei- ro ao sétimo dia de idade, ainda mais preferencialmente, do primeiro ao sex- to dia de idade, ainda mais preferencialmente, do primeiro ao quinto dia de idade, ainda mais preferencialmente, do primeiro ao quarto dia de idade, a- inda mais preferencialmente, do primeiro ao terceiro dia de idade, ainda mais preferencialmente, no primeiro ou segundo dia de idade, e ainda mais prefe- rencialmente, no primeiro (1) dia de idade.

De acordo com um aspecto adicional, a presente invenção tam- bém se refere a um novo uso medicinal de um antígeno de L. Intracellularis para a preparação de medicamento, preferencialmente uma composição de vacina, para a vacinação de um animal jovem, partindo do primeiro (1) dia de idade, contra infecções por L. Intracellularis, em que esse animal jovem é vacinado no primeiro (1) dia de idade ou mais com uma dose eficaz desse antígeno de L Intracellularis. Preferencialmente, a vacinação ocorre do pri- meiro ao vigésimo dia de idade, mais preferencialmente, do primeiro ao dé- cimo dia de idade, ainda mais preferencialmente, do primeiro ao nono dia de idade, ainda mais preferencialmente, do primeiro ao oitavo dia de idade, ain- da mais preferencialmente, do primeiro ao sétimo dia de idade, ainda mais preferencialmente, do primeiro ao sexto dia de idade, ainda mais preferenci- almente, do primeiro ao quinto dia de idade, ainda mais preferencialmente, do primeiro ao quarto dia de idade, ainda mais preferencialmente, do primei- ro ao terceiro dia de idade, ainda mais preferencialmente, no primeiro ou segundo dia de idade, e ainda mais preferencialmente, no primeiro (1) dia de idade.

De acordo com um aspecto adicional, a presente invenção tam- bém se refere a um novo uso medicinal de um antígeno de L. Intracellularis para a preparação de medicamento, preferencialmente uma composição de vacina, para a vacinação de um animal contra-infecção por L. Intracellularis, em que o animal apresenta ou é exposto a um título detectável de anticorpos anti-L. Intracellularis, preferencialmente, de pelo menos 1:4, mais preferenci- almente, maior que 1:16, ainda mais preferencialmente, maior que 1:64, ain- da mais preferencialmente, maior que 1:128, ainda mais preferencialmente, de 1:256, ainda mais preferencialmente, maior que 1:512 e ainda mais prefe- rencialmente, maior que 1:1024, por ml.

De acordo com um aspecto adicional, a presente invenção tam- bém se refere a um novo uso medicinal de um antígeno de L. Intracellularis para a preparação de medicamento, preferencialmente uma composição de vacina, para a vacinação de um animal jovem contra-infecção por L. Intracel- lularis, em que o animal jovem apresenta ou é exposto a um título detectável de anticorpos anti-L. Intracellularis, preferencialmente, de pelo menos 1:4, mais preferencialmente, maior que 1:16, ainda mais preferencialmente, mai- or que 1:64, ainda mais preferencialmente, maior que 1:128, ainda mais pre- ferencialmente, de 1:256, ainda mais preferencialmente, maior que 1:512 e ainda mais preferencialmente, maior que 1:1024, por ml. Preferencialmente, a vacinação ocorre do primeiro ao vigésimo dia de idade, mais preferencial- mente, do primeiro ao décimo dia de idade, ainda mais preferencialmente, do primeiro ao nono dia de idade, ainda mais preferencialmente, do primeiro ao oitavo dia de idade, ainda mais preferencialmente, do primeiro ao sétimo dia de idade, ainda mais preferencialmente, no primeiro ao sexto dia de ida- de, ainda mais preferencialmente, do primeiro ao quinto dia de idade, ainda mais preferencialmente, no primeiro ao quarto dia de idade, ainda mais pre- ferencialmente, do primeiro ao terceiro dia de idade, ainda mais preferenci- almente, no primeiro ou segundo dia de idade, e ainda mais preferencial- mente, no primeiro (1) dia de idade.

De acordo com um aspecto adicional desses usos medicinais descritos acima, o antígeno de L. Intracellularis é selecionado do grupo que consiste em bactérias L Intracellularis vivas modificadas, bactérias L. Intra- cellularis mortas ou uma ou mais subunidades de bactérias L. Intracellularis. Preferencialmente, o antígeno de L. Intracellularis são bactérias L. Intracellu- laris vivas modificadas. Mais preferencialmente, esses animais são adminis- trados com uma dose de cerca de 3,0 TCID5O a cerca de 6,0 TCID50 das bac- térias L. Intracellularis vivas modificadas.

A produção de composições de vacina que compreendem um antígeno de L. Intracellularis constitui estado da técnica e é conhecida da- quele versado na técnica. Por exemplo, aquele versado na técnica é capaz de determinar componentes adicionais que poderão ser compreendidos nes- sas composições (ver, também, Remington's Pharmaceutieal Sciences (Ci- ências Farmacêuticas Remington) (1990), 18§ ed., Mack Pubi Eastorí). O especialista poderá usar soluções estéreis injetáveis fisiologicamente aceitá- veis. Para preparar uma solução pronta para uso para injeção ou infusão parenteral, soluções aquosas isotônicas, tais como, por exemplo, soluções salinas ou soluções protéicas plasmáticas correspondentes, são imediata- mente disponíveis. As composições de vacina poderão estar presentes co- mo Iiofilizados ou preparações secas, que podem ser reconstituídas com uma solução injetável conhecida diretamente antes de uso sob condições estéreis, por exemplo como um kit de partes.

Adicionalmente, as composições imunogênicas e de vacina da presente invenção podem incluir um ou mais veículos veterinariamente acei- táveis. Como usado neste relatório, "um veículo veterinariamente aceitável" inclui qualquer e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, ad- juvantes, agentes de estabilização, diluentes, conservantes, agentes anti- bacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos, agentes de retardamento de absorção e similares.

"Diluentes" podem incluir água, solução salina, dextrose, etanol, glicerol e similares. Agentes isotônicos podem incluir cloreto de sódio, dex- trose, manitol, sorbitol e lactose, entre outros. Estabilizantes incluem albumi- na e sais alcalinos de ácido etilenodiaminotetracético, entre outros.

"Adjuvantes", como usado neste relatório, podem incluir hidróxi- do de alumínio e fosfato de alumínio, saponinas, por exemplo, Quil A, QS-21 (Cambridge Biotech, Inc., Cambridge, MA), GPI-0100 (Galenica Pharmaceu- ticals, Inc., Birmingham, AL), emulsão água-em-óleo, emulsão óleo-em- água, emulsão água-em-óleo-em-água. A emulsão pode ser usada, em par- ticular, em óleo de parafina líquida leve (tipo Farmacopéia Européia); óleo isoprenóide tal como esqualano ou esqualeno; óleo resultante da oligomeri- zação de alquenos, em particular, de isobuteno ou deceno; ésteres de áci- dos ou de álcoois contendo um grupo alquila linear, mais particularmente, óleos vegetais, oleato de etila, propilenoglicol di-(caprilato/caprato), gliceril tri-(caprilato/caprato) ou dioleato de propilenoglicol; e ésteres de ácidos ou álcoois graxos ramificados, em particular, ésteres de ácido isoesteárico. O óleo é utilizado em combinação com emulsificantes para formar a emulsão. Os emulsificantes são preferencialmente tensoativos não-iônicos, em parti- cular, ésteres de sorbitano, de manida (por exemplo, oleato de anidromani- tol), de glicol, de poliglicerol, de propilenoglicol e de ácido oléico, isoesteári- co, ricinoléico ou hidroxiesteárico, que são opcionalmente blocos de copolí- mero etoxilado e de polioxipropileno-polioxietileno, em particular, os produtos Pluronic, especialmente LI21. Ver Hunter e et al., The Theory and Practical Application of Adjuvants (Teoria e Prática de Aplicação de Adjuvantes) (Ed. Stewart-Tull, D.E.S.), John-Wiley and Sons, Nova Iorque, pp. 51-94 (1995), e Todd e outros, Vaccine, 15-564-570 (1997), cujos ensinamentos e conteúdo são incorporados aqui como referência.

Por exemplo, é possível usar a emulsão SPT descrita à página 147 de "Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach" (Elaboração de Vacinas, Abordagem de Subunidades e Adjuvantes), editado por M. Po- well e M. Newman, Plenum Press, 1995, e a emulsão MF59, descrita à pági- na 183 desse mesmo livro (seus ensinamentos e conteúdo são incorporados aqui como referência).

Um exemplo adicional de um adjuvante é um composto escolhi- do dos polímeros de ácido acrílico ou metacrílico e dos copolímeros de ani- drido maléico e derivado de alquenila. Compostos adjuvantes vantajosos são os polímeros de ácido acrílico ou metacrílico que são reticulados, especial- mente com éteres polialquenílicos de açúcares ou poliálcoois. Esses com- postos são conhecidos pelo termo carbômeros (Phameuropa, Vol. 8, Ne 2, junho de 1996). Aqueles versados na técnica podem também referir-se à Patente Norte-americana Nq 2.909.462, que descreve esses polímeros acrí- licos reticulados com um composto poliidroxilado que apresenta pelo menos três grupos hidroxila, preferencialmente não mais que 8, os átomos de hi- drogênio de pelo menos três hidroxilas sendo substituídos por radicais alifá- ticos insaturados que apresentam pelo menos dois átomos de carbono. Os radicais preferidos são aqueles que contêm de 2 a 4 átomos de carbono, por exemplo, vinilas, alilas e outros grupos etilenicamente insaturados. Os radi- cais insaturados poderão eles mesmos conter outros substituintes, tal como metila. Os produtos comercializados sob o nome Carbopol (BF Goodrich, Ohio, EUA) são particularmente apropriados. Eles são reticulados com uma alil sacarose ou com alil pentaeritritol. Entre eles, poderão ser mencionados Carbopol 974P, 934P e 971P. Mais preferido é o uso de Carbopol 971P. En- tre os copolímeros de anidrido maléico e derivado de alquenila, estão os co- polímeros EMA (Monsanto), que são copolímeros de anidrido maléico e eti- leno. A dissolução desses polímeros em água conduz a uma solução ácida que será neutralizada preferencialmente em pH fisiológico, a fim de fornecer a solução de adjuvante em que a própria composição imunogênica, imuno- lógica ou de vacina será incorporada.

Adjuvantes adicionalmente adequados incluem, mas sem se li- mitar aos mesmos, o sistema adjuvante RIBI (Ribi, Inc.), copolímero em blo- co (CytRx, Atlanta, GA), SAF-M (Chiron, Emeryville, CA), monofosforil lipí- deo A, adjuvante lipídeo-amina Avridina, enterotoxina termicamente instável de E. coli (recombinante ou diferente), toxina de cólera, IMS 1314 ou mura- mil dipeptídeo entre muitos outros.

Preferencialmente, o adjuvante é adicionado em uma quantidade de cerca de 100 pg a cerca de 10 mg por dose. Ainda mais preferencialmen- te, o adjuvante é adicionado em uma quantidade de cerca de 100 pg a cerca de 10 mg por dose. Ainda mais preferencialmente, o adjuvante é adicionado em uma quantidade de cerca de 500 pg a cerca de 5 mg por dose. Ainda mais preferencialmente, o adjuvante é adicionado em uma quantidade de cerca de 750 pg a cerca de 2,5 mg por dose. Mais preferencialmente, o ad- juvante é adicionado em uma quantidade de cerca de 1 mg por dose.

A composição de vacina pode adicionalmente incluir um ou mais outros agentes imunomodulatórios tais como, por exemplo, interleucinas, interferons ou outras citocinas. As composições de vacina podem também incluir gentamicina e mertiolate. Embora as quantidades e concentrações de adjuvantes e aditivos úteis no contexto da presente invenção possam pron- tamente ser determinadas por aquele versado na técnica, a presente inven- ção contempla composições que compreendem de cerca de 50 pg a cerca de 2.000 pg de adjuvante e, preferencialmente, cerca de 250 pg/ml de dose da composição de vacina. Em outra modalidade preferida, a presente inven- ção contempla composições de vacina que compreendem de cerca de 1 pg/ml a cerca de 60 pg/ml de antibióticos, e mais preferencialmente, menos de cerca de 30 pg/ml de antibióticos.

A vacina é administrada a animais, preferencialmente mamífe- ros, e ainda mais preferencialmente, porcos, de maneira convencional, mais preferencialmente, por meio de dose oral forçada. A dosagem a ser adminis- trada dependerá do caso particular, mas, em qualquer caso, é a quantidade suficiente para induzir uma resposta imune protetora mediada por anticorpos ou células contra ileíte.

As vacinas de acordo com a invenção são geralmente adminis- tradas a animais suscetíveis, preferencialmente a leitões jovens e/ou leitões que apresentam anticorpos anti-L Intracellularis ou que são expostos a anti- corpos anti-L. Intracellularis em uma ou mais doses. Vacina viva ou morta poderá ser administrada uma ou duas vezes a intervalos de 2 a 4 semanas após a vacinação inicial. No caso de vacinas vivas atenuadas, uma dose é preferida. Preferencialmente, a primeira ou única administração é realizada do primeiro ao vigésimo dia de idade, mais preferencialmente, do primeiro ao décimo dia de idade, ainda mais preferencialmente, do primeiro ao nono dia de idade, ainda mais preferencialmente, do primeiro ao oitavo dia de idade, ainda mais preferencialmente, do primeiro ao sétimo dia de idade, ainda mais preferencialmente, no primeiro ao sexto dia de idade, ainda mais prefe- rencialmente, do primeiro ao quinto dia de idade, ainda mais preferencial- mente, no primeiro ao quarto dia de idade, ainda mais preferencialmente, do primeiro ao terceiro dia de idade, ainda mais preferencialmente, no primeiro ou segundo dia de idade, e ainda mais preferencialmente, no primeiro (1) dia de idade, conforme descrito acima.

Se uma segunda administração é desejável ou necessária, a segunda administração é realizada cerca de 1 a cerca de 4 semanas após a primeira administração da vacina. De acordo com um aspecto adicional, re- vacinação é realizada em um intervalo de 3 a 12 meses após administração de qualquer vacinação anterior. Administração de doses de vacina subse- qüentes é preferencialmente feita com base em 6 meses a um ano. Em outro aspecto preferido, animais vacinados antes da idade de cerca de 2 a 3 se- manas deverão ser revacinados. Administração de doses de vacina subse- qüentes é preferencialmente feita em base anual.

A presente invenção é adicionalmente descrita nos exemplos seguintes que são fornecidos com fins ilustrativos apenas e não devem ser considerados como limitativos. Na verdade, outras variantes da invenção serão prontamente evidentes àquele versado na técnica.

Todas as publicações e patentes citadas aqui são incorporadas em sua totalidade como referência.

EXEMPLOS

Exemplo 1

Detecção de anticorpos específicos a L. Intracellularis em amostras de co- lostro e leite de porcas (> 1 ninhada) e porcas jovens (1ª ninhada)

Material e Métodos

Amostras de colostro foram tomadas de 25 porcas e 25 porcas jovens dentro de 24 horas após parto. Amostras de leite foram tomadas nas primeira e segunda semanas de lactação dos mesmos porcos. Amostras foram centrifugadas duas vezes com 2.000 g por 10 minutos a 4°C para se- parar a porção gordurosa do leite. A porção aquosa das amostras foi arma- zenada a -20°C até análise. Anticorpos específicos contra L. Intracellularis foram detectados em diluições em série duas vezes começando com uma diluição inicial de 1:20 em um IFAT. O IFAT foi realizado como descrito no Exemplo 5 e alhures, com a exceção de que para cada amostra anticorpos IgG, IgM e IgA anti-suínos marcados com FITC foram usados para detectar as diferentes classes de Ig. Amostras de sangue paralelas das porcas e por- cas jovens foram tomadas dentro de 24 horas após parto. Essas amostras foram examinadas em EnterisoP Ileitis ELISA de acordo com as instruções do fabricante.

Resultados

Os resultados da detecção de anticorpos em amostras de colos- tro são resumidos na figura 1. A figura mostra o número de amostras que apresentam resultados positivos para IgG, IgM e IgA de diferentes diluições no IFAT. Nenhuma das amostras de colostro foi negativa em todos os exa- mes. Somente uma das amostras de colostro de porcas e uma de porcas jovens foram negativas a IgG, considerando que em uma amostra de porcas jovens e em três amostras de porcas nenhum IgM específico foi detectável. Oito de vinte e cinco amostras obtidas de porcas jovens e porcas, respecti- vamente, apresentaram-se negativas a IgA específico a L. Intracellularis. Nas amostras de leite, obtidas na 2- semana de lactação, somente duas amostras de porcas apresentaram um título de 1:20 para IgG, considerando que uma amostra de uma porca jovem mostrou-se positiva a IgA (1:20). Na 3ã semana de lactação, as amostras de uma porca e três porcas jovens a- presentaram resultados positivos a IgG sob uma diluição de 1:20. Todas as outras amostras da 2- e 3â semanas de lactação apresentaram teste negati- vo a IgG, IgM e IgA. Todas as amostras de sangue tomadas de porcas den- tre de 24 h após parto foram positivas em EnterisoP Ileitis ELISA, conside- rando que duas de vinte e cinco amostras obtidas de porcas jovens apresen- taram resultados negativos. Não houve correlação óbvia entre os resultados das amostras de sangue e os resultados das amostras de colostro. Pode-se concluir que em colostro de porcas e porcas jovens anticorpos das classes G, M e A de Ig, específicos a L Intracellularis, estão presentes. Entretanto, em amostras de leite tomadas uma semana após parto, somente baixos títu- los de anticorpos específicos a L Intracellularis puderam ser detectados em apenas 6% das amostras.

Referências

1. McOrist, S. e et al. (2003), Pig J. 51, 26-35.

2. Collins, A.M. e et al. (2001), Allen D. Leman, Swine, Conferência. 3. Holyoake, P.K. e et al. (1994), J Clin Microbiol32, 1980-1985, Kruse, P.E. (1983), Ann. Rech. Vet. 14, 349-353.

4. Bollwein, J. (2004), Doctoral thesis, LMU, Munique.

5. KnitteI, J.P. e et al. (1998), AJVR 59, 722-726.

Exemplo 2

Impacto direto de anticorpos de leite em L. Intracellularis durante passagem

gastrointestinal

Material e Métodos

Amostras de colostro foram tomadas de porcas e porcas jovens dentro de 24 horas após nascimento. Amostras de leite de porca foram to- madas na primeira e segunda semanas de lactação. Amostras foram centri- fugadas duas vezes com 2.000 g por 10 minutos a 4°C para separar a por- ção gordurosa do leite. A porção aquosa das amostras foi armazenada a - 20°C até análise. Anticorpos específicos contra L. Intracellularis foram detec- tados em diluições em série duas vezes começando com uma diluição inicial de 1:20 em um IFAT. O IFAT foi realizado como descrito no Exemplo 5 e alhures (5), com a exceção de que para cada amostra anticorpos IgG, IgM e IgA anti-suínos marcados com FITC foram usados para detectar as diferen- tes classes de Ig. Amostras de leite com diferentes teor de Ig foram selecio- nadas com base em resultados de IFAT. Uma cultura de L. Intracellularis foi incubada com diferentes diluições em amostras de colostro ou leite de porca a temperatura ambiente. Cada amostra foi testada duas vezes. A dose infec- tante de cultura de tecido (TCID50) de L. Intracellularis foi medida no início (0 hora) e após 4 horas de incubação à temperatura ambiente. Uma amostra não-diluída da cultura funcionou como controle para a realização do teste. Para cada determinação do valor de TCID5O, a amostra foi homogeneizada mediante 20 passagens através de uma agulha de bitola 20. Células de um frasco de cultura de tecido de 75 cm2 com uma monocamada 100% conflu- ente de células de McCoy, desenvolvidas com meio F12 DMEM/HAM, foram tripsinadas e divididas em quatro placas de microtitulação de 96 cavidades. Diluições em série de 10"1 a 10"7 das amostras foram inoculadas seis vezes cada uma nas células de McCoy novas. Após uma incubação de 6 dias a 37°C sob condições microaerofílicas, as células foram fixadas por meio de acetona/metanol gelado\/ce cold (50:50, v/v). Crescimento de L. Intracellula- ris foi detectado pelo uso de um anticorpo monoclonal específico anti- Lawsonia e subseqüente marcação por um anticorpo anticamundongo mar- cado com FITC. Cada cavidade contendo uma ou mais células de McCoy com cinco ou mais L. Intracellularis fluorescentes foi julgado positivo. TCID50 foi determinado pelo uso da fórmula de ponto final de 50% de acordo com Spearmann e Karber (6).

Resultados

Na figura 1, são resumidos os resultados dos testes de TCID50 e os títulos de IgG, IgA e IgM de 8 amostras de colostro (N— 1-5) e de leite (N— 6-8). A amostra de controle da cultura apresentou, em todos os experi- mentos, o valor de TCID50 esperado. Em nenhum dos testes o título de L. Intracellularis mudou substancialmente durante as 4 horas de incubação à temperatura ambiente. Assim, como mostrado nesse estudo, anticorpos ma- ternos e o leite de porca parecem não ser eficazes na inativação de L. Intra- cellularis durante passagem gastrointestinal.

Referências

1. van Aken, N. e et al. (2002), Proc. 17ê IPVS, Ames, lowa, EUA.

2. Kruse, P.E. (1983), Ann. Rech. Vet. 14, 349-353.

3. Collins, A.M. e et al. (2001), Allen D. Leman, Swine, Conferência.

4. Holyoake, P.K. e et al. (1994), J Clin Microbiol 32, 1980-1985.

5. Knittel, J.P. e et al. (1998), AJVR 59, 722-726.

6. Karber, G. (1931), Arch. Exp. Path. Pharma 162, 480.

7. Mauch, C.H.Y. e G. Bilkei (2004), Vet. Ree., 155, 532.

Exemplo 3

Eficácia de vacinação de leitões de um dia de idade contra infecções por L. Intracellularis

Material e Métodos

O estudo consistiu em três grupos experimentais envolvendo leitões em amamentação negativos a L. Intracellularis e negativos a anticor- pos maternos anti-Lawsonia no primeiro (1) dia de idade. No dia 0 do estudo, 20 leitões no grupo 1 (vacinados) receberam cada um uma dose oral de En- terisoP lleitis, isolado de vacina B3903, conforme instruções do rótulo (3). Vinte leitões no grupo 2 (controles) receberam um placebo consistindo em meio de crescimento. Leitões em todos os grupos foram desmamados no vigésimo dia do estudo. No vigésimo primeiro (1) dia, leitões nos grupos 1 e 2 receberam um homogenado intestinal contendo 3,5 χ 109 de L. Intracellula- ris 2688/2685 virulenta via alimentação forçada. Um terceiro grupo de 10 porcos (controles estritos) não receberam vacina, placebo ou desafio em qualquer período de tempo através de todo o estudo. No quadragésimo se- gundo dia, porcos em todos os grupos foram submetidos à eutanásia huma- namente e necropsiados. Parâmetros primários de eficácia incluíram lesões espessas e microscópicas do íleo, ceco e cólon especificamente causadas por L. Intracellularis. Parâmetros secundários incluíram saúde clínica (com- portamento, condição corporal e consistência das fezes), ganhos médios diários de peso, expulsão fecal (PCR) e soroconversão (IFAT) (1).

Resultados

Na necropsia (42- dia), vacinados (grupo 1) apresentaram núme- ros médios de lesões espessas significativamente menores (p<0,0003) no íleo (0,21), ceco (0,0) e cólon (0,0) em comparação com porcos de controle não-vacinados (íleo = 1,16, ceco = 0,42 e cólon = 0,16). A extensão média total da lesão intestinal (íleo, ceco e cólon) foi significativamente maior (p<0,0001) nos controles (8,89 cm) em comparação com porcos vacinados (1,42 cm). O grupo 3 (controles estritos) apresentou um número médio de lesões intestinais espessas de 0,22 e foi considerado normal.

Os números médios de lesões microscópicas específicas à Law- sonia no íleo foram significativamente maiores (p<0,02) nos controles (2,47) em comparação com porcos vacinados (0,53). Adicionalmente, o número total de lesões microscópicas (p<0,006) e a porcentagem de porcos positi- vos a IHC (p<0,0001) foi significativamente maior nos controles em compa- ração com o grupo vacinado. O grupo de controle apresentou números mé- dios de lesões microscópicas e porcentagem de animais positivos a IHC nominalmente maiores no ceco e cólon (p>0,05) do que no grupo vacinado. Significativamente (p<0,05), mais porcos de controle foram PCR positivo duas semanas após desafio (35e dia) do que o grupo vacinado. Porcos no grupo de controle (8/19) expeliram nominalmente mais L. Intracellularis do que no grupo vacinado (3/19) no último dia do estudo (429 dia, p>0,05). Não houve diferença significativa (p>0,05) em ganhos médios diários de peso ou números clínicos médios entre os grupos 1 e 2 durante o estudo. De modo geral, os parâmetros primários de eficácia (desenvolvimento de lesão intesti- nal espessa e microscópica) demonstraram que uma única dose oral de En- terisoP Ileitis é eficaz contra um desafio virulento quando administrada a Iei- tões originários de Lawsonia negativos a anticorpos maternais no primeiro (1) dia de idade. Propriedades lactogênicas não-específicas à Lawsonia po- tencialmente presentes no colostro e leite durante o período de amamenta- ção não interferiram ou impediram eficácia de vacina contra exposição a de- safio com L. Intracellularis virulenta neste estudo.

Tabela 1: Taxas de expulsão fecal de L. Intracellularis

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а,b Letras iguais indicam nenhuma diferença significativa (p<0,05).

φ Controles estritos não foram analisados estatisticamente.

* Um porco foi removido de cada grupo devido a saúde insuficiente não- relacionada com L. Intracellularis.

Referências

1. McOrist e et al. (1993), Infection and Immunity 61:4286-4292.

2. Knittel e et al. (1998), Am J Vet Res 59:722-726.

3. Kroll e et al. (2004), Am J Vet Res 65:559-565.

4. Mauch e Bilkei (2004), Vet Rec., 155:532.

5. Marsteller e et al. (2003), Swine Health Prod 11:127:130.

6. Stege e et al. (2004), Vet. Micro 104:197-206.

Exemplo 4

IFAT para detecção e quantificação de anticorpos anti-L. Intracellularis

Material e Métodos

Antes do início do estudo, 16 porcas saudáveis, grávidas e ne- gativas a L. Intracellularis foram aleatoriamente alocadas em 2 grupos; 8 controles hiper-imunizados (Grupo A) e 8 controles administrados com pla- cebo (Grupo B). Nos dias -55, -35 e -14 antes de parto cada porca no Grupo A foi hiper-imunizada com EnterisoP Ileitis comercialmente disponível por meio de dose oral forçada direta. A administração da dose de vacina por es- se método envolveu aplicação da vacina na porção posterior da cavidade oral usando uma seringa plástica estéril de 10 ml. O grupo de controle (Gru- po B) recebeu uma dose equivalente de placebo consistindo em células de McCoy não-infectadas suspensas em meio de crescimento. Hiperimunização de porcas grávidas no Grupo A foi realizada em uma tentativa de induzir um alto nível de imunidade materna antes do parto. Cada grupo de porcas grá- vidas foi alojado em ambientes separados, para evitar contaminação cruza- da, e sob as mesmas condições (temperatura, ventilação e tamanho do cer- cado). Porcas em cada ambiente foram mantidas no mesmo cercado.

Embora esforços tenham sido feitos pelo investigador do estudo para ter concepção e datas de parto uniformes, nem todas as porcas pariram no mesmo dia. Em vez disso, parto ocorreu durante um período de 10 dias.

Para impedir que se tivessem datas múltiplas de vacinação e desafio que pudessem levar à variabilidade excessiva entre grupos de porcos no estudo, a data média de parto durante o período de parto foi estabelecido no Dia o do estudo. Assim, os porcos tinham 3 semanas ± 5 dias de idade quando da vacinação (21Q Dia).

No 21Q Dia, cem leitões saudáveis desmamados foram escolhi- dos por ninhada e aleatoriamente destinados a seis grupos de tratamento. As restrições e condições de alojamento foram similares às dos grupos de porcas mencionados acima. Leitões derivados de porcas hiper-imunizadas (Grupo A) foram aleatoriamente destinados a Grupos 1 a 3 e identificados como leitões "hiper-imunoderivados" pelo resto do estudo. Leitões derivados de porcas de controle (Grupo B) foram aleatoriamente destinados a Grupos 4 a 6 e identificados como leitões "derivados de placebo" pelo resto do estu- do. Aos Grupos 1 e 4 (20 porcos/grupo, respectivamente) foi dada uma única dose de 2 ml de EnterisoP Ileitis por dose oral forçada direta. Aos Grupos 2 e 5 (20 porcos/grupo, respectivamente) foi dada uma dose equivalente de placebo (células de McCoy não-infectadas + meio). Os Grupos 3 e 6 (10 porcos/grupo) foram designados "controles negativos estritos" que não rece- beram um tratamento com vacina ou placebo e não foram expostos a desa- fio durante esse estudo. No 22- Dia, após o período de desmame, porcas foram submetidos à eutanásia humanamente e necropsiadas para avalia- ções de desenvolvimento de lesões intestinais devido a PE.

No 429 Dia do estudo, os Grupos 1, 2, 4 e 5 receberam 1 χ 1073 TCID50/dose de isolado N101494 de L. Intracellularis de cultura pura virulen- ta heteróloga via alimentação forçada. Todos os leitões foram examinados diariamente 21 dias após desafio quanto a sintomas clínicos relacionados com PE; diarréia, comportamento e condição corporal receberam uma clas- sificação de 1 a 4 dependendo da gravidade (1 = clinicamente normal; 4 = doença grave). Os porcos foram pesados no 21e, 42Q e 63s dias do estudo para calcular um ganho médio diário de peso por grupo de porcos. Ganhos médios diários de peso (ADWG) foram calculados para analisar os efeitos de tratamento em relação a desempenho de crescimento normal nos porcos.

Porcos foram inicialmente pesados para obter um peso médio de referência por grupo antes de receber um tratamento com vacina ou placebo. Verificou- se que todos os grupos eram de tamanho uniforme (variação < 0,63 kg/porco). O primeiro período-chave de avaliação de ADWG entre grupos ocorreu do 21 - Dia (vacinação) ao 42e Dia (exposição a desafio) para medir os efeitos imediatos de vacinação ou inoculação de placebo. O segundo pe- ríodo de avaliação foi do 42Q Dia ao 63s Dia (necropsia) para medir os efeitos de exposição a desafio com uma cultura pura virulenta de L. Intracellularis.

No 63e dia do estudo, todos os porcos foram submetidos à euta- násia humanamente e necropsiadas para avaliações de desenvolvimento de lesões intestinais devido a PE.

Resultados

Detecção de Anticorpos Maternos

Anticorpos IgG, IgA e IgM específicos a Lawsonia Intracellularis foram detectados no soro e colostro de porcas no Grupo A (hiper-imunizado) durante o período do parto. Sessenta e três por cento (5/8 porcas) de porcas do Grupo A foram anticorpos séricos positivos a anticorpos IgG anti- Lawsonia, enquanto 0% (0/8) das porcas do Grupo B (controle) foi positivo sob parto. Adicionalmente, anticorpos séricos IgG foram detectados em lei- tões derivados de porcas do Grupo A somente de parto (Dia 0) a 5 semanas de idade (289 Dia); ver Fig. 1. IgG, IgA e IgM anti-Lawsonia foram detectados no colostro de porcas no Grupo A sob 50%, 75% e 12,5%, respectivamente. As concentrações médias de anticorpos no colostro de porcas no Grupo A foram de 1:14 (IgG, faixa = 1 a 1:64), 1:10 (IgA1 faixa = 1 a 1:32) e 1,4 (IgM, faixa = 1 a 1:4). Porcas no Grupo B não apresentaram quaisquer anticorpos detectáveis IgM ou IgG anti-Lawsonia em seu colostro durante esse período de tempo. Um porco no Grupo B de porcas foi positivo a IgA sob um título de 1:16. Proteção Materna

A comparação de porcos de controle não-vacinados no Grupo 2 (porcos derivados do Grupo A de porcas) ao Grupo 5 (porcos do Grupo B de porcas) foi conduzida para avaliar o potencial de proteção materna contra exposição a L. Intracellularis virulenta derivada de porcas hiper-imunizadas com vacina (porcas do Grupo A).

Números médios de lesões espessas e microscópicas entre to- dos os grupos são resumidos na Tabela 1. Porcos no Grupo 5 (77%) apre- sentaram uma porcentagem de lesões específicas à Lawsonia no íleo e có- lon maior que nos porcos do Grupo 2 (27,5%). Porcos do Grupo 2 apresen- taram números médios de lesões espessas significativamente menores (p<0,05) no íleo e números médios de lesões microscópicas (IHC) no íleo e cólon em comparação com o Grupo 5 no 63Q dia do estudo.

Nenhuma expulsão detectável de L. Intracellularis nas fezes, por PCR, foi evidente em qualquer grupo do 212 Dia (vacinação) ao 42e Dia (de- safio) do estudo; ver Fig. 3. Os Grupos 2 e 5 foram inicialmente PCR fecal positivo começando no 49g Dia e permaneceram positivos até o 63e Dia (término do estudo) com 5% a 25% e 15% a 72%, respectivamente, dos por- cos que expulsam L. Intracellularis durante esse período de tempo. Expulsão fecal significativamente menor (p<0,05) foi detectada por PCR no Grupo 2 (25%) em comparação com o Grupo 5 (72%) no 63Q Dia do estudo. Uma porcentagem maior de PCRs teciduais positivos foi verificada nos íleos de porcos no Grupo 5 (45%) em comparação com o Grupo 2 (25%) no 632 Dia do estudo. Porcos no Grupo 2 foram PCR negativo a L. Intracellularis na tonsila, nodo linfático mesentérico e cólon. Vários PCRs positivos foram ob- servados no cólon e tecido linfático mesentérico dos porcos no Grupo 5 co- mo mencionado na Seção 3.4 acima.

Comparações de ganhos médios de peso entre todos os grupos de teste são resumidas na Tabela 2. Os pesos médios iniciais foram unifor- mes entre os Grupos 2 e 5 no 21Q Dia (vacinação), com os porcos pesando 6,35 e 6,10 kg/porco, respectivamente. Nenhuma diferença significativa em ADWG foi verificada entre os Grupos 2 (0,40 kg/porco) e 5 (0,41 kg/porco) do 21Q Dia (vacinação) ao 42s Dia (desafio). Entretanto, ADWG significati- vamente maior (p<0,05) foi evidente em porcos do Grupo 2 (0,46 kg/porco) do que em porcos do Grupo 5 (0,40 kg/porco) durante os períodos de avalia- ção de 21 dias do 21e Dia (desafio) ao 63Q Dia (término) do estudo.

Eficácia da Vacina em Porcos Hiper-imunoderivados

A comparação de porcos vacinados com EnterisoP Ileitis no Grupo 1 com porcos de controle não-vacinados no Grupo 2 foi conduzida para confirmar que vacinação em face de imunidade materna poderia ser realizada avaliando imunidade protetora contra PE após vacinação de por- cos com três semanas de idade. Ambos os grupos de porcos foram deriva- dos de hiper-imunizados de porcas com vacina (porcas do Grupo A). Adicio- nalmente, parâmetros primários e secundários de eficácia foram analisados entre porcos tratados com vacina do Grupo 1 e do Grupo 4 para determinar se a eficácia da vacina é similar contra desafio com L. Intracellularis virulenta.

Números médios de lesões espessas microscópicas entre todos os grupos são resumidos na Tabela 1. Porcos no Grupo 2 (27,5%) apresentaram uma porcentagem de lesões específicas à Lawsonia no íleo e cólon maior que no Grupo 1 (12,5%). Porcos do Grupo 1 apresentaram números médios de Ie- sões espessas significativamente menores (p<0,05) (íleo) e números médios de lesões microscópicas (IHC) numericamente menores (íleo e cólon) em comparação com o Grupo 2 no 63s dia do estudo. Adicionalmente, não hou- ve diferenças significativas entre números médios de lesões espessas e mi- croscópicas ou gravidade de lesões em porcos que recebem uma vacinação (Grupos 1 e 4).

Nenhuma expulsão detectável de L. Intracellularis nas fezes, por PCR, foi evidente em qualquer grupo (1 ou 2) do 216 Dia (vacinação) ao 35s Dia do estudo; ver Fig. 3. Porcos no Grupo 1 foram inicialmente PCR fecal positivo no 42Q Dia (desafio) e permaneceram positivos até o 639 Dia (térmi- no do estudo) com 11% a 16% dos porcos que expulsam L. Intracellularis durante esse período de tempo. Porcos no Grupo 2 foram inicialmente PCR fecal positivo no 49Q Dia e permaneceram positivos até o 63s Dia (término do estudo) com 5% a 25% dos porcos que expulsam L. Intracellularis durante esse período de tempo. Porcos no Grupo 4 não foram PCR positivo em rela- ção a DNA de Lawsonia até o 429 Dia (desafio) e permaneceram positivos até o 639 Dia (término do estudo) com taxas reduzidas de expulsão de 25% a 5%. Nenhuma evidência de uma diferença significativa nas taxas de expul- são fecal de L. Intracellularis entre os Grupos 1 e 2 e os Grupos 1 e 4 duran- te o estudo.

Uma porcentagem ligeiramente maior de PCRs teciduais positi- vos foram verificados nos íleos de porcos no Grupo 2 (25%) em comparação com o Grupo 1 (20%) no 639 Dia (término) do estudo. Uma freqüência menor de PCRs teciduais positivos foi evidente no Grupo 4 (5%) em relação aos Grupos 1 e 2 no término do estudo. Nenhuma diferença significativa em P- CRs positivos foi observada entre os Grupos 1 e 2 e os Grupos 1 e 4, res- pectivamente. Porcos em todos os três grupos foram PCR negativo a L. In- tracellularis na tonsila, nodo linfático mesentérico e cólon.

Comparações de ganhos médios de peso entre todos os grupos de teste são resumidas na Tabela 2. Os pesos médios iniciais foram unifor- mes entre os Grupos 1 e 2 no 212 Dia (vacinação), com os porcos pesando 6,53 e 6,35 kg/porco, respectivamente. Pesos médios uniformes foram tam- bém observados entre os Grupos 1 e 4 no 21s Dia (6,53 kg/porco e 6,44 kg/porco, respectivamente). Não se verificou nenhuma diferença significativa em ADWG entre os Grupos 1 (0,40 kg/porco) e 2 (0,41 kg/porco) ou entre os Grupos 1 e 4 (0,44 kg/porco) do 215 Dia (vacinação) ao 42a Dia (desafio). Diferenças significativas (p<0,05) em ADWG foram evidentes em porcos do Grupo 1 (0,45 kg/porco) em comparação com porcos do Grupo 4 (0,51 kg/porco) durante os períodos de avaliação de 21 dias do 215 Dia (desafio) ao 63Q Dia (término) do estudo. Nenhuma diferença significativa em ADWG entre os Grupos 1 e 2 foram observada do 21Q Dia ao 63e Dia neste estudo.

Exemplo 5

IFAT para detecção e quantificação de anticorpos anti-L Intracellularis

Amostras de soro do sangue de cada porca e porco foram testa- das em relação à presença de anticorpos IgG contra L. Intracellularis pelo teste de anticorpos por imunofluorescência (IFAT) usando antígeno total fixo de Lawsonia em placas de microtitulação de poliestireno de 96 cavidades e anticorpos marcados com FITC dirigidos contra IgG porcino (Knitell e outros, 1998). O teste IFA foi modificado ligeiramente mediante uso de anticorpos marcados com FITC dirigidos contra IgM e IgA porcinos. Esse procedimento modificado foi usado para detectar esses anticorpos, além de IgG, em colos- tro de cada porca, para determinar a concentração de diferentes imunoglo- bulinas específicas à Lawsonia. O colostro foi diluído duas vezes em duplica- ta em PBS e transferido (100 μl/cavidade) para dois conjuntos de placas de 96 cavidades revestidas com Lawsonia, como mencionado acima. As placas inoculadas foram deixadas incubar por 30 minutos a 37°C e, em seguida, lavadas três vezes com PBS. Um anticorpo conjugado com FITC IgM ou IgM anti-suíno (Kirkegaard and Perry Laboratories, Inc.) previamente diluído 1:200 em PBS foi adicionado às placas e, em seguida, incubação e etapas de lavagem foram repetidas. O título de cada anticorpo específico anti- Lawsonia foi detectado utilizando microscopia UV. Porcentagem e valores médios de títulos de IFATs positivos para cada imunoglobulina foram calcu- lados para comparações de grupos a fim de determinar a freqüência e o ní- vel de anticorpos IgG, IgM e IGA em colostro presentes entre porcas.

Referência

1. Knittel e et al. (1998), Am J Vet Res 59:722-726.

Claims (22)

1. Método de vacinação de um animal jovem contra infecções por L. Intracellularis, ou vacinação de um animal que apresenta anticorpos anti-L Intracellularis ou é exposto a anticorpos anti-L. Intracellularis, com- preendendo esse método a etapa de administrar ao animal uma dose eficaz de antígeno de L. Intracellularis.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que o animal é vacinado do 1- dia ou 9e dia de idade.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que o ani- mal é vacinado do 1 - dia ou 6e dia de idade.

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a -3, em que o animal é vacinado no 1Q ou 2- dia de idade.

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a -4, em que o animal apresenta ou é exposto a um título detectável de anticor- pos anti-L. Intracellularis de pelo menos 1:4 por ml de soro ou fluido.

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a -4, em que o animal apresenta ou é exposto a um título detectável de anticor- pos anti-L. Intracellularis de pelo menos 1:64 por ml de soro ou fluido.

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a -6, em que o antígeno de L. Intracellularis é selecionado do grupo que consis- te em bactérias L. Intracellularis vivas modificadas, bactérias L. Intracellularis mortas ou uma ou mais subunidades de bactérias L. Intracellularis, e combi- nações das mesmas.

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a -6, em que o antígeno de L. Intracellularis são bactérias L. Intracellularis vivas modificadas.

9. Método, de acordo com a reivindicação 8, em que o animal jovem sofre administração de uma dose de cerca de 3,0 TCID50 a cerca de -6,0 TCID5O das bactérias L. Intracellularis vivas modificadas.

10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a -9, em que os animais são pássaros, peixes e mamíferos, tais como gado, porcos, cavalos e primatas.

11. Método, de acordo com a reivindicação 10, em que os ani- mais são porcos.

12. Uso de um antígeno de L. Intracellularis para a preparação de um medicamento para a vacinação de um animal jovem contra infecções por L. Intracellularis, ou de um animal que apresenta anticorpos anti-L Intra- cellularis ou é exposto a anticorpos anti-L. Intracellularis, uso este em que os animais são vacinados com uma dose eficaz desse antígeno de L. Intracellu- laris.

13. Uso, de acordo com a reivindicação 12, em que os animais são vacinados do 1 - dia ou 9- dia de idade.

14. Uso, de acordo com a reivindicação 12 ou 13, em que os animais são vacinados do 1- dia ou 6S dia de idade.

15. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a -14, em que os animais são vacinados no 1- ou 29 dia de idade.

16. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a -15, em que os animais apresentam ou são expostos a um título detectável de anticorpos anti-L. Intracellularis de pelo menos 1:4 por ml de soro ou flui- do.

17. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a -16, em que os animais apresentam ou são expostos a um título detectável de anticorpos anti-L. Intracellularis de pelo menos 1:64 por ml de soro ou fluido.

18. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a -17, em que o antígeno de L. Intracellularis é selecionado do grupo que con- siste em bactérias L. Intracellularis vivas modificadas, bactérias L. Intracellu- laris mortas, uma ou mais subunidades de bactérias L. Intracellularis, e com- binações das mesmas.

19. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a -18,em que o antígeno de L. Intracellularis são bactérias L. Intracellularis vi- vas modificadas.

20. Uso, de acordo com a reivindicação 19, em que o animal jovem sofre administração de uma dose de cerca de 3,0 TCID50 a cerca de -6,0 TCID5O das bactérias L. Intracellulariswwas modificadas.

21. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a -20, em que os animais são pássaros, peixes e mamíferos, tais como gado, porcos, cavalos e primatas.

22. Uso, de acordo com a reivindicação 21, em que os animais são porcos.