WO2024170728A1 - Composition vaccinale comprenant un systeme de delivrance d'une bacterie entiere inactivee via des nanoparticules polysaccharidiques cationiques sans adjuvant - Google Patents

Composition vaccinale comprenant un systeme de delivrance d'une bacterie entiere inactivee via des nanoparticules polysaccharidiques cationiques sans adjuvant Download PDF

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WO2024170728A1 PCT/EP2024/053960 EP2024053960W WO2024170728A1 WO 2024170728 A1 WO2024170728 A1 WO 2024170728A1 EP 2024053960 W EP2024053960 W EP 2024053960W WO 2024170728 A1 WO2024170728 A1 WO 2024170728A1
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vaccine composition
nanoparticles
vaccine
coli
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PCT/EP2024/053960
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Didier Betbeder
Angélo SCUOTTO
François FASQUELLE
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Vaxinano
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Definitions

  • the invention relates to the field of vaccine compositions. It relates more particularly to a prophylactic vaccine composition intended for mammals and birds comprising a whole killed bacterium, said bacterium being coated with a cationic agent, in particular cationic nanoparticles.
  • Bacteria are responsible for many diseases. An infection by a bacterium can be enough to induce a fatal disease, with fatal economic consequences for livestock farms, particularly poultry farms.
  • the bacterium Escherichia coll is a commensal bacterium of the digestive tract of animals and humans. It is the most common bacterium. It is found both in their environment and in their intestinal flora. Other pathogenic bacteria such as Salmonella enterica, responsible for Salmonellosis, also represent a major challenge for the health of poultry.
  • prophylactic vaccines have been developed with the aim of immunizing individuals and eliminating the risks of infections and the resulting health consequences.
  • Prophylactic vaccination involves inducing an immune response in a healthy individual who has not yet been in contact with a pathogen in order to activate their immune defenses.
  • an antigen such as a pathogen or a fragment of a pathogen is presented to the individual's immune cells.
  • This presentation allows the activation of adaptive immune cells, B and T lymphocytes. They multiply and produce antibodies that neutralize and eliminate the antigen and/or a cellular response that destroys infected cells. This mechanism induces immune memory, allowing the individual to be protected during the next encounter with said pathogen.
  • Prophylactic vaccination therefore makes it possible to immunize healthy individuals in order to protect them from future diseases.
  • Patent EP2911688A1 relates to a serovar of Salmonella enterica serogroup Cl intended to be used to protect poultry against a disorder resulting from a Salmonella enterica infection.
  • This serovar of Salmonella enterica is in inactivated form.
  • the serovar is used to manufacture vaccines that can be multivalent.
  • the chicks are vaccinated at 30 hours of life.
  • the serovar is used to formulate a vaccine containing an adjuvant, such as for example aluminum hydroxide at approximately 25% v/v.
  • Patent EP0256792A2 describes a vaccine for protecting poultry against colibacillosis infections, comprising as active ingredient E. coll cells inactivated by an ultrasound treatment that destroys the bacteria.
  • the vaccine may contain adjuvants, for example an aluminum compound such as aluminum hydroxide gel.
  • the inoculation of the vaccine into poultry is preferably carried out via the cloaca.
  • the vaccine may also be inoculated in a conventional manner, for example, intramuscularly, intravenously or subcutaneously.
  • the essence of the invention is the implementation of ultrasonic cell membrane disruption in the manufacture of a vaccine against poultry colibacillosis.
  • Patent WO2022/008848 describes a process for preparing a vaccine composition from at least one lyophilized antigen comprising the steps of:
  • aqueous solution comprising a cationic nanoparticle consisting of a cationic polysaccharide core
  • the method according to this document comprises the presence of a partial or total extract of pathogen which may contain proteins, polysaccharides and lipids.
  • the antigen according to this document is a complex extract of proteins obtained from a whole pathogen.
  • Patent application US2021/093705 describes nanoparticle compositions for use as vaccines against Salmonella enteritidis in poultry.
  • the vaccine composition comprises: highly immunogenic protein antigens (outer membrane proteins (OMP) or whole antigenic protein (KAg) and flagellar protein extracted from killed Salmonella enteritidis. These antigens are entrapped inside polyanhydride or chitosan nanoparticles.
  • Patent application WO2021/021778 describes a composition comprising a mucosal adjuvant of polyacrylic acid and/or inactivated antigens from respiratory or intestinal bacteria or viruses.
  • the composition may comprise a cell suspension comprising non-cationic polyacrylic acid particles having a size ranging from 250 nm to 10 microns.
  • the paper Anthony Pavic ET al. describes a study regarding the development of an autologous inactivated trivalent vaccine.
  • the trivalent vaccine was produced from equal amounts of cell suspension (3x 108 cfu/mL), combined with an aluminum hydroxide adjuvant and administered intramuscularly into the breast to chickens at 12 to 17 weeks of age.
  • compositions proposed in the prior art all include vaccine adjuvants, necessary for their effectiveness, but whose side effects are widely documented.
  • the inventors have developed an adjuvant-free prophylactic vaccine composition for immunizing mammals and birds, particularly poultry, against pathogenic bacteria.
  • the inventors have developed a novel delivery system in which the coating of at least one whole and killed pathogenic bacterium with cationic nanoparticles (NPs) improves the cellular uptake mechanism. This has the effect of improving the mechanism for presenting bacterial antigens to immune cells and therefore activating the immune system more quickly and more effectively.
  • the vaccine composition can be multivalent so as to induce broad-spectrum protection. The vaccine composition can thus make it possible to produce combined vaccines.
  • Endocytosis is a mechanism allowing the entry of extracellular material into a cell, by invagination of the plasma membrane followed by the formation of vesicles isolating themselves in the cytoplasm.
  • endocytosis is carried out by specialized immune cells (neutrophils, macrophages, dendritic cells), it is called phagocytosis.
  • the prophylactic vaccine can be used as a treatment against avian salmonellosis, colibacillosis, campylobacteriosis, or any other bacterial infection.
  • the invention relates to an adjuvant-free prophylactic vaccine composition, in particular for mammals and birds, and more particularly poultry, comprising cationic nanoparticles consisting of a polysaccharide core and at least one inactivated bacterium, characterized in that said bacterium is whole and in that said cationic nanoparticles cover said bacterium.
  • This composition makes it possible to limit the risks of contamination with respect to at least one disease resulting from an infection by a pathogenic bacterium.
  • the invention relates to a multivalent prophylactic vaccine composition intended for the treatment of salmonellosis or colibacillosis, in particular for mammals and birds, more specifically poultry such as laying hens, broiler chickens, turkeys, ducks, guinea fowl, ostriches, emus, quails, etc.
  • the invention also relates to the use of a vaccine composition for preventing a bacterial infection, in particular colibacillosis, salmonellosis, campylobacteriosis.
  • a vaccine composition comprising whole inactivated pathogenic bacteria coated with cationic agents, such as, for example, cationic nanoparticles, constituted a novel antigen delivery system for effectively immunizing against a pathogen of bacterial origin.
  • cationic agents such as, for example, cationic nanoparticles
  • cationic nanoparticles have the ability to increase the endocytosis phenomenon of immune cells by delivering small antigens of a size of the order of 5 to 15 nanometers, such as protein antigens from fragmented pathogens. In this configuration, a significant amount of nanoparticles is required to internalize each element of the fragmented bacterial cell.
  • These delivery systems use cationic nanoparticles associated with a total or partial extract of a fragmented pathogenic bacterium which is, in this case, contained in the core of the nanoparticles; this “antigen in the core of the nanoparticle” configuration requires using more nanoparticles than antigens (by weight), preferably 10 to 100 times more nanoparticles than antigens.
  • This prior art delivery system cannot deliver whole bacteria, it only allows deliver small antigens of the order of 5 to 15 nanometers in size, whereas whole cells have a size of the minimum order of 1 to 10 microns.
  • the inventors have demonstrated, unexpectedly, that cationic nanoparticles enable the phenomenon of phagocytosis of whole bacterial cells.
  • the inventors have developed a delivery system for delivering bacteria that are at least 100 times larger than protein antigens.
  • This is therefore a new delivery system, in which the bacterium is covered by positively charged nanoparticles according to the invention, which makes possible its interaction with the cell membrane and its entry into immune cells by phagocytosis.
  • this combination makes it possible to imitate the process of entry of viruses into cells thanks to the modulation of the ionic charges provided by the nanoparticle.
  • the covering by nanoparticles according to the invention of a whole bacterium makes it possible to confer a positive charge to the combination "nanoparticle covering a whole bacterium".
  • This positive charge promotes interaction with the cell membrane and allows the entry of the whole bacteria-nanoparticles complex by phagocytosis.
  • This process is possible thanks to the particular combination, developed by the applicants, namely nanoparticles covering an inactive whole bacterium. No combination of the type covering a whole bacterium with nanoparticles has been described before.
  • This new delivery system has the innovative advantage of being able to introduce a whole bacterium into a cell, via the vaccine composition according to the invention.
  • a smaller quantity of nanoparticles can be used vs. the quantity by weight of proteins of the bacterium; in fact, the quantity of NP can be 3 to 100 times lower than that of bacterial proteins.
  • nanoparticles are sufficient for the entire bacterial cell to enter by phagocytosis and allow effective immunization.
  • Reducing the number of nanoparticles useful for vaccination makes it possible to considerably reduce the production costs of the vaccine composition, making vaccination against pathogenic bacteria accessible on a large scale, particularly in areas where cost is a real limit to vaccination campaigns. For example, poultry farming with in ovo vaccination.
  • the vaccine composition has the advantage of being able to be, depending on the embodiment of the invention, multivalent. That is to say, it can comprise at least two strains of bacteria, each of which ensures the prevention of an infection.
  • the invention makes it possible to easily obtain a combined vaccine.
  • the vaccine composition also makes it possible, depending on the embodiment of the invention, to acquire cross-immunity.
  • the vaccine composition may comprise a bacterium which induces immunity against variants of the strain considered.
  • Coli administered in ovo to the chick makes it possible to protect the chick from a colibacillosis-type infection at a non-lethal dose but also at a lethal dose in bacterial challenge experiments.
  • the bacterial load is reduced and the hatching rate is equivalent to that of unvaccinated eggs.
  • an intramuscular injection of a vaccine composition comprising a bacterial strain of Salmonella and cationic nanoparticles (NPL) in laying hens makes it possible to reduce the bacterial load and the hens lay more eggs than non-immunized hens.
  • NPL cationic nanoparticles
  • the vaccine composition does not contain any adjuvant, which avoids adverse effects. This is advantageous since mineral adjuvants (i.e. mineral salts such as aluminum salts) remain in the body for a very long time.
  • the nanoparticles act as a delivery agent for the killed bacteria to the immune cells and help induce a protective response against infection.
  • the vaccine composition can be administered in ovo, but also by mucosal (oral, ocular, nasal) or intramuscular route.
  • the vaccine approach according to the invention can be implemented in mammals as well as in birds, in particular in poultry.
  • composition according to the present invention therefore provides a composition of simple formulation, easy to prepare and inexpensive which can be administered in ovo in particular.
  • composition comprising a whole, inactivated bacterium also has the advantage of being an antigen that is simpler to characterize than a partial or total antigen extract.
  • a first subject of the present invention relates to an adjuvant-free vaccine composition
  • an adjuvant-free vaccine composition comprising cationic nanoparticles consisting of a polysaccharide core and at least one inactivated bacterium, characterized in that said bacterium is whole and in that said cationic nanoparticles cover said bacterium.
  • the vaccine composition is intended for mammals and birds.
  • the cationic nanoparticles cover said bacteria in a bacterial protein:NP ratio by weight greater than or equal to 1.
  • said bacterial protein:NP ratio by weight is greater than or equal to 2, preferably greater than 5, and even more preferably greater than 10, or even 50 or 500.
  • “Cationic nanoparticle consisting of a cationic polysaccharide core” means a solid nanoparticle comprising a cationic polysaccharide (NP) core.
  • the NP may or may not be cross-linked. Its core may or may not be loaded with an anionic phospholipid. This NP is not surrounded by any phospholipid layer.
  • cationic nanoparticles are particles having a size range of between 1 and 500 nanometers. More preferably, polysaccharide nanoparticles have a size range of between 10 and 300 nm, in particular between 20 and 250 nm.
  • a nanoparticle according to the invention is advantageously used in solution.
  • the term nanoparticle also includes particles or molecules that are in a nanoparticle form in solution, such as for example chitosan and its derivatives.
  • the solution may be an aqueous solution, a buffer solution or a serum solution.
  • the inventors have in fact observed that certain linear molecules such as chitosan form nanometric coils in solution, which behave like conventional nanoparticles. Chitosan can thus be used in the form of a classic nanoparticle (eg Qi et al, Carbohydrate Research, 2004, 339(16), 2693-2700) or as is or in the form of a hydrolyzate in solution.
  • the cationic polysaccharide forming the core of the nanoparticle (NP) is a non-crosslinked polymer obtained by the reaction between a chosen polysaccharide among starch, dextran, chitosan, dextrin, and maltodextrin, polyfructoses (inulin), polymannoses, polygalactoses, polygalactomannans (guar gum) and at least one cationic ligand chosen from a primary, secondary, tertiary amine or quaternary ammoniums.
  • the core is not loaded with lipids.
  • the nanoparticle is a cationic nanoparticle consisting of a non-crosslinked and non-lipid-loaded polysaccharide core consisting of (i) a polysaccharide chosen from starch, dextran, chitosan, dextrin, and maltodextrin, polyfructoses (inulin), polymannoses, polygalactoses, polygalactomannans (guar gum) and (ii) at least one cationic ligand chosen from a primary, secondary, tertiary amine or quaternary ammoniums.
  • the cationic polysaccharide forming the core of the nanoparticle (NP) is a crosslinked polymer obtained by the reaction between a polysaccharide chosen from starch, dextran, chitosan, dextrin, and maltodextrin, polyfructoses (inulin), polymannoses, polygalactoses, polygalactomannans (guar gum) and at least one cationic ligand chosen from a primary, secondary, tertiary amine or quaternary ammoniums, then the addition of a crosslinking agent.
  • the crosslinking agent is chosen from epichloridrine, a dicarboxylic acid or an acid chloride, such as sebacic acid.
  • the nanoparticle is a cationic nanoparticle consisting of a cross-linked polysaccharide core and not loaded with lipid consisting of (i) a polysaccharide chosen from starch, dextran, chitosan, dextrin, and maltodextrin, polyfructoses (inulin), polymannoses, polygalactoses, polygalactomannans (guar gum) (ii) at least one cationic ligand chosen from a primary, secondary, tertiary amine or quaternary ammoniums, and (iii) a cross-linking agent chosen from epichloridrine, a dicarboxylic acid or an acid chloride, such as sebacic acid.
  • the nanoparticle (NP) is a nanoparticle consisting of a non-crosslinked cationic polysaccharide core loaded with phospholipid.
  • the nanoparticle is a cationic nanoparticle consisting of a non-crosslinked polysaccharide core loaded with anionic phospholipid consisting of (i) a polysaccharide selected from starch, dextran, chitosan, dextrin, and maltodextrin, polyfructoses (inulin), polymannoses, polygalactoses, polygalactomannans (guar gum), (ii) at least one cationic ligand selected from a primary, secondary, tertiary amine or quaternary ammoniums, and (iii) an anionic phospholipid selected from diacylphosphatidyl glycerol, diacylphosphatidyl serine or diacylphosphatidyl inositol.
  • the nanoparticle (NP) is a cationic nanoparticle consisting of a crosslinked polysaccharide core and loaded with anionic phospholipid consisting of (i) a polysaccharide chosen from starch, dextran, chitosan, dextrin, and maltodextrin, polyfructoses (inulin), polymannoses, polygalactoses, polygalactomannans (guar gum), (ii) at least one cationic ligand chosen from a primary, secondary, tertiary amine or quaternary ammoniums, (iii) a crosslinking agent chosen from epichloridrine, a dicarboxylic acid or an acid chloride, such as sebacic acid, and (iv) an anionic phospholipid chosen from diacylphosphatidyl glycerol, serine, diacylphosphatidyl or diacylphosphatidyl inositol.
  • anionic phospholipid chosen from diacy
  • the cationic polysaccharide is based on maltodextrin; it is obtained by the reaction between maltodextrin and glycidyltrimethylammonium, whether the NP is crosslinked or not, lipidated or not.
  • the cationic polysaccharide core comprises maltodextrin and a glycidyltrimethylammonium.
  • the NP is a DPPG-loaded cationic polysaccharide nanoparticle, whether or not the NP is crosslinked.
  • Poultry within the meaning of the invention, are domesticated birds which serve as a source of eggs or meat and which include commercially important species such as, for example, chickens, laying hens, turkeys, ducks, geese, guinea fowls, pheasants, pigeons and peacocks.
  • the bacterium is selected from the following group: Salmonella enterica ser. Typhi; Streptococcus Pneumoniae; Haemophilus influenzae type b; Mycobacterium tuberculosis; Extraintestinal pathogenic E. Coli (ExPEC); enterotoxigenic E. Coli (ETEC); S. enterica ser.; Paratyphi A; Neisseria Gonorheae; Clostridium Difficile; Campylobacter spp; Shigella spp; Staphylobacter Aureus; Helicobacter pylori.
  • the term “whole bacterium” means an unfragmented bacterium in its complete form, in particular one whose cell membrane is intact. In other words, this means that the membranes of the bacteria remain unaltered. Conversely, bacteria whose membranes are damaged, fragmented or exploded cannot be considered as whole bacteria for the purposes of the present invention.
  • the term “cationic agent” means an agent with a positive electrical charge, such as a cationic nanoparticle.
  • inactivated or inactive bacteria means a non-living bacterium that has been previously killed but is intact.
  • intact means a bacterium whose membrane is unaltered. They may be killed, for example, by treatment with formaldehyde or any other inactivation method known to those skilled in the art.
  • the term "covered with cationic nanoparticles” means that the nanoparticles coat the surface of the inactivated bacteria.
  • the nanoparticles cover the killed bacteria with a homogeneous layer.
  • the coverage rate can be defined by the weight ratio of bacterial proteins:NP.
  • the weight ratio of bacterial proteins:NP is greater than or equal to 2, preferably greater than 5 and even more preferably greater than 10, or even 50 or 500.
  • a ratio of bacterial proteins (by dry weight): NP by weight of between 1:0.01 and 1:10 and more particularly between 1:0.01 and 1:3. That is to say approximately 100 times fewer nanoparticles by weight relative to the weight of the bacteria.
  • this ratio is greater than 1, in particular the amount by weight of bacterial proteins is at least equal to that of the NP and can be up to 100 times greater (ratio of between 1:1 and 1:0.01). In an even more preferred embodiment, the amount by weight of bacterial proteins is 2 to 100 times greater than that of NP (ratio is between 1:0.5 and 1:0.01).
  • the amount by weight of bacterial proteins is 10 to 100 times greater than that of NP (ratio is between 1:0.01 and 1:0.1). In particular embodiments, this ratio may be between 1:0.1 and 1:10 or even between 1:0.1 and 1:3.
  • the vaccine composition comprises at least one bacterium capable of inducing effective protection to prevent, or at least reduce, a bacterial infection.
  • the term "preventing infection” means that the vaccine composition can protect 100% against the risks of infection or, if it does not completely prevent the risk of infection, then the protection conferred by the vaccine is sufficient so that the individual does not trigger the disease or if it does trigger it, the symptoms of the infection are at least reduced and the individual avoids death. Preventing infection also means preventing the infection from spreading within the livestock.
  • the vaccine composition is prophylactic.
  • prophylactic vaccine composition means a vaccine composition which makes it possible to induce an immune response in a healthy individual who has not yet been in contact with a pathogen with the aim of activating their immune defenses and preparing the immune system to react against a future infection.
  • the vaccine composition is intended for birds.
  • the prophylactic vaccine composition is intended for poultry, in particular the embryo in the egg.
  • multivalent vaccine composition means that the vaccine composition comprises several different bacteria making it possible to induce immunity against several diseases associated with the different bacteria.
  • the vaccine composition makes it possible to develop combined vaccines.
  • the term “combined vaccines” means a vaccine composition comprising several bacteria of different species or families so as to induce, simultaneously, immunity against several different bacteria.
  • the vaccine composition comprises at least one whole, inactivated bacterium that can induce cross-immunity in the vaccinated individual.
  • cross-immunity means acquired immunity against a bacterial pathogen which confers immunity against another bacterial pathogen of a different species, strain or family which is not part of the vaccine composition.
  • Cross-immunity is related to the phenomenon of cross-reactivity. Antibodies are usually specific for a particular antigen. It is through this specificity that antibodies target and eliminate the antigens they have detected. A mutant bacterium retains common antigens that can be the target of a vaccine-induced response.
  • the vaccine composition is multivalent and comprises at least 2 different strains of bacteria of different species or families, said bacteria being whole and inactivated.
  • the vaccine composition can, for example, be composed of 3 inactivated E. coli strains mixed with lipidated maltodextrin nanoparticles (NPs) in order to prevent colibacillosis.
  • NPs lipidated maltodextrin nanoparticles
  • said composition may comprise:
  • At least two bacteria of different strains and/or species or families said bacteria being inactivated and whole, covered with cationic nanoparticles consisting of a core of porous polysaccharide in cross-linked form loaded with phospholipid.
  • At least two bacteria of different strains and/or species or families said bacteria being inactivated and whole, covered with cationic nanoparticles consisting of a polysaccharide core in cross-linked form not loaded with lipid.
  • At least two bacteria of different strains and/or species or families said bacteria being inactivated and whole, covered with cationic nanoparticles consisting of a core of porous polysaccharide in non-crosslinked form loaded with phospholipid.
  • At least two bacteria of different strains and/or species or families said bacteria being inactivated and whole, covered with cationic nanoparticles consisting of a polysaccharide core in non-crosslinked form not loaded with lipid.
  • a second subject of the invention relates to a vaccine composition as defined above comprising at least two different inactivated bacteria, characterized in that said bacteria are whole and that they are covered with cationic nanoparticles consisting of a core of polysaccharide. It is used in a form suitable for intramuscular, mucosal or in ovo administration. This composition is therefore multivalent and can be used to obtain a combined vaccine.
  • different inactivated bacteria means bacteria of different strains and/or species or families.
  • a third subject of the invention relates to the use of a vaccine composition as defined above to prevent a bacterial infection in a mammal or a bird.
  • the bacterial infection is salmonellosis, colibacillosis or campylobacteriosis.
  • this use applies to the prevention of bacterial infection in the poultry embryo in ovo (by in ovo administration).
  • the invention also relates to a method for preventing a disease linked to a bacterial infection intended for mammalian animals and birds, comprising a vaccine composition comprising at least one inactivated whole pathogenic bacterium covered with cationic nanoparticles consisting of a polysaccharide core and comprising the following steps:
  • cationic nanoparticles consisting of a polysaccharide core and at least one whole bacterium.
  • the mixture of cationic nanoparticles with said inactivated whole bacterium is carried out so that said nanoparticles cover said bacterium in a bacterial protein:NP ratio by weight greater than or equal to 1.
  • said bacterial protein:NP ratio by weight is greater than or equal to 5.
  • said cationic nanoparticles may be chosen from:
  • Cationic nanoparticles consisting of a non-crosslinked and non-lipid-loaded polysaccharide core consisting of (i) a polysaccharide selected from starch, dextran, chitosan, dextrin, and maltodextrin, polyfructoses (inulin), polymannoses, poly- galactoses, poly-galacto-mannans (guar gum) and (ii) at least one cationic ligand chosen from a primary, secondary, tertiary amine or quaternary ammoniums;
  • Cationic nanoparticles consisting of a cross-linked polysaccharide core not loaded with lipid consisting of (i) a polysaccharide selected from starch, dextran, chitosan, dextrin, and maltodextrin, polyfructoses (inulin), polymannoses, polygalactoses, polygalactomannans (guar gum) (ii) at least one cationic ligand selected from a primary, secondary, tertiary amine or quaternary ammoniums, and (iii) a cross-linking agent selected from epichloridrine, a dicarboxylic acid or an acid chloride, such as sebacic acid;
  • Cationic nanoparticles consisting of a non-crosslinked polysaccharide core loaded with anionic phospholipid consisting of (i) a polysaccharide selected from starch, dextran, chitosan, dextrin, and maltodextrin, polyfructoses (inulin), polymannoses, polygalactoses, polygalactomannans (guar gum), (ii) at least one cationic ligand selected from a primary, secondary, tertiary amine or quaternary ammoniums, and (iii) an anionic phospholipid selected from diacylphosphatidyl glycerol, diacylphosphatidyl serine or diacylphosphatidyl inositol;
  • Cationic nanoparticles consisting of a cross-linked polysaccharide core loaded with anionic phospholipid consisting of (i) a polysaccharide selected from starch, dextran, chitosan, dextrin, and maltodextrin, polyfructoses (inulin), polymannoses, polygalactoses, polygalactomannans (guar gum), (ii) at least one cationic ligand selected from a primary, secondary, tertiary amine or quaternary ammoniums, (iii) a cross-linking agent selected from epichloridrine, a dicarboxylic acid or an acid chloride, such as sebacic acid, and (iv) an anionic phospholipid selected from diacylphosphatidyl glycerol, diacylphosphatidyl serine or inositol. diacylphosphatidyl.
  • anionic phospholipid selected from diacylphosphatidyl g
  • the cationic polysaccharide is obtained by the reaction between maltodextrin and glycidyltrimethylammonium, whether or not the NP is crosslinked.
  • said prevention method comprises a vaccine composition inoculated via the mucosal route, injectable and/or administered in ovo.
  • the vaccine composition is administered to poultry, namely in ovo, mucosally and orally in chicks and intramuscularly in laying hens.
  • FIG. 1 E. coli uptake after NPL coating by cells.
  • the delivery of whole E. coli bacteria was evaluated in human H292 cells.
  • Fluorescent E. coli-FITC, alone or associated with NPL (ratio 1/3 to 1/0.05) were incubated with human H292 cells for 4 h, and the percentage of positive cells was measured by flow cytometry without or with trypan blue (TB). Results represent the mean ⁇ SEM of 3 experiments.
  • Statistical analysis two-way ANOVA, ** p ⁇ 0.01, *** p ⁇ ⁇ 0.001.
  • FIG. 2 Intracellular delivery by confocal microscopy, with a 1:3 ratio.
  • the delivery of E. coli bacteria was evaluated in H292 cells.
  • the fluorescent E. coli-FITC associated with NPLs (1:3 ratio) were incubated with H292 cells for 4h, and the intracellular localization was observed by confocal microscopy.
  • a representative image was taken. Red: plasma membrane; blue: nuclei; green: E. coli. Scale bar: 10pm.
  • Figure 3 Schematic of the vaccination protocol of the in ovo vaccination trial. The commercial vaccine was administered only to the positive control.
  • Figure 4 Intestinal permeability test for 8 birds from each group, 6 days after challenge (D20). Results represent mean ⁇ SD.
  • Figure 5 Analysis of anti-E. coli slgA in feces of 8 birds from each group, 13 days after challenge (D27). Results represent the mean ⁇ SD of absorbance values obtained by ELISA. Statistical analysis: one-way Anova, * p ⁇ 0.05.
  • Figure 6 Clinical score of liver lesions from 8 birds from each group, 6 days after challenge (D20). Results represent the mean ⁇ SD of group scores. Statistical analysis: one-way Anova, * p ⁇ 0.05.
  • Figure 7 Schematic diagram of the in ovo vaccination trial protocol. Only the positive group was vaccinated on day 1 with the commercial vaccine (Poulvac).
  • Figure 9 Measurement of bacterial load in the air sacs of birds from each group, assessed 2 days after challenge (D16) on 8 birds, by MPN. Results represent mean ⁇ SD. Statistical analyses were performed by one-way ANOVA, * p ⁇ 0.05.
  • Figure 10 Intestinal permeability of 8 birds from each group 6 days after challenge (D20). Results represent mean ⁇ SD. Statistical analyses were performed by oneway ANOVA, * p ⁇ 0.05.
  • Figure 11 Intestinal lesion score of 8 birds from each group 6 days after challenge (D20). Results represent mean ⁇ SD. Statistical analyses were performed by oneway ANOVA, * p ⁇ 0.05.
  • Figure 12 Schematic diagram of the intramuscular vaccination trial protocol.
  • Figure 13 Egg laying. Top: Daily number of eggs laid by hens in each group after the challenge. Error bars are hidden to clarify the graph. Bottom: Average daily number of eggs laid by hens in each group after the challenge.
  • Statistical analyses one-way Anova * p ⁇ 0.05, *** p ⁇ 0.001, **** p ⁇ 0.0001.
  • Figure 14 Quantification of bacterial load in the chicken caecum of each group, measured by qPCR. Results represent mean ⁇ SEM. Statistical analysis: one-way ANOVA ** p ⁇ 0.01, *** p ⁇ 0.001.
  • Figure 15 Quantification of bacterial load in the chicken caecum of each group, measured by qPCR. Results represent mean ⁇ SEM.
  • Figure 16 Timeline of the in ovo vaccination trial protocol. Only the “positive control” group was vaccinated on D1 with the commercial vaccine (Poulvac).
  • Figure 17 Measurement of bacterial infection in the trachea (above) and alveoli (below) of birds in each group, assessed on 8 birds, per most probable number (MPN). Results represent the number of positive and negative birds per group.
  • Figure 18 Analysis of anti-E.coli slgA in feces of 8 birds from each group after challenge. Results represent mean ⁇ SD of Ab titres. Statistical analysis: One-way ANOVA for each day.
  • Figure 19 Lung lesion score of 8 birds per group after challenge. Results represent the mean of each group. Statistical analyses were performed for each day by one-way ANOVA.
  • Fluorescent FITCs alone or associated with NPs, were incubated with H292 cells for 4 h, and the percentage of positive cells was measured by flow cytometry. Results represent the mean ⁇ SD of 2 experiments.
  • Figure 21 Delivery of whole E. coli bacteria was evaluated in THP-1 cells. Fluorescent i-FITC E. coli, alone or associated with NPs, were incubated with THP-1 cells for 4 h, and the percentage of positive cells was measured by flow cytometry. Results represent the mean ⁇ SD of 2 experiments.
  • NPL Cross-linked lipidated maltodextrin nanoparticles
  • the objective of this study is to confirm the efficacy as a delivery system of a composition, based on nanoparticle and an inactivated whole E. coli strain, to activate immune cells.
  • CNPs are cationic lipidated maltodextrin nanoparticles.
  • the composition was made with an inactivated E. coli strain mixed with cationic nanoparticles.
  • the E. coli bacteria were inactivated with 0.4% formaldehyde and then purified by centrifugation.
  • the protein content was measured by micro BCA assay.
  • the composition was made by mixing the killed bacteria with an aqueous solution of NPL, at different weight ratios (100 pg of E. coli proteins with 5, 10, 30, 50, 100 or 300 pg of NPL).
  • the size and surface charge of the formulation were characterized by dynamic light scattering (DLS) and electrophoretic light scattering (ELS) (Zetasizer NanoZS, Malvern Analytical, France), respectively, to observe whether the nanoparticles cover the surface of the killed bacteria.
  • DLS dynamic light scattering
  • ELS electrophoretic light scattering
  • Inactivated bacteria were labeled with fluorescein isothiocyanate (FITC), by mixing 5 mg of E. coli with 50 pg of FITC (1%, Sigma, France) in a sodium carbonate buffer at pH 8.3 for 2 h. They were then dialyzed on a 10 kDa dialysis cassette (Thermofisher, France). Protein content was measured by micro BCA assay (Pierce, France). Labeled bacteria were then associated with NPLs at different weight ratios.
  • FITC fluorescein isothiocyanate
  • H292 cell lines were seeded in 24-well plates at 50,000 cells per well, until confluent. Cells were then incubated with 1 pg equivalent of proteins alone or associated with different ratios of NPL, for 4 hours. Then, cells were washed with phosphate-buffered saline (PBS), harvested with trypsin, and analyzed by flow cytometry on an Attune Nxt (ThermoFisher, France). To distinguish intracellular delivery of bacteria from membrane fixation, cells were incubated with 40 pg/mL of Trypan blue (TB, Sigma France) to quench external FITC fluorescence.
  • PBS phosphate-buffered saline
  • H292 cell lines were seeded in Labtek chambers (Fisher Sci., France) at 10,000 cells per well until confluence. Then, cells were incubated with 1 pg equivalent of proteins alone from killed or NPL-associated whole bacteria for 4 hours. Cells were washed, and the nucleus was stained by incubating Hoechst 33342 (Sigma, France) at 0.1 pg/mL for 5 minutes at 37°C. Cells were then washed and the plasma membrane was labeled with AF-633-labeled agglutinin (WGA, Invitrogen France) at 1 pg/mL for 10 minutes at 37°C. The slides were washed again with PBS, fixed with 0.4% formaldehyde for 20 minutes, and mounted for observation under a microscope (LSM 710 Zeiss, France).
  • Table 1 Characterization of E. coli/NPL formulation size by dynamic light scattering (DLS) and zeta potential by electrophoretic light scattering (ELS). Inactivated whole E. coli were mixed with increasing amounts of NPL.
  • DLS dynamic light scattering
  • ELS electrophoretic light scattering
  • E. coli delivery by NPLs was assessed by flow cytometry (see Figure 1), on human airway epithelial cells (H292). Without NPLs, bacteria were endocytosed by 14% of the cells. As no difference was observed in the presence of TB, this suggests that the bacteria were truly endocytosed (inside the cells). When coated by NPLs, bacteria were taken up by at least 40% of cells, confirming their potential as a delivery system. Furthermore, delivery was significantly more efficient with low NPLs, and the highest release was observed with a ratio of 1:0.3 (77%) and 1:0.1 (75.7%).
  • the E. coli/NPL vaccine formulation consists of inactivated whole bacteria coated with NPL. Coating this bacteria, even with a small amount of NPL, has a significant impact on the ability of this bacteria to be taken up by cells.
  • the vaccine consists of 3 inactivated E. coli strains mixed with lipidated maltodextrin nanoparticles (LNPs). Briefly, strains O78:K80, O1:K1, O2:K1 were inactivated with 0.4% formaldehyde, and the protein content was measured by pBCA assay. Finally, 33.3pg per strain was mixed with LNP to obtain 100pg of protein per vaccine dose.
  • LNPs lipidated maltodextrin nanoparticles
  • Group 3 animals received, on D1 after hatching, a dose of Poulvac® E. coli live vaccine.
  • Group 4 animals received, on the 18th day of incubation, an in ovo application of the vaccine with a regulatory vaccine dose of 50 ⁇ L.
  • groups of one-day-old broiler chickens were housed in isolators (1.2 m 2 ) and were fed ad libitum according to the recommendations for their age.
  • animals in groups 2, 3 and 4 were infected with 10 8 CFU of Escherichia coli (strain 19501, a different strain from that used in the vaccine), 100 pL/bird, orally.
  • the vaccination protocol is shown in Figure 3.
  • Intestinal permeability was assessed by oral administration of FITC-Dextran, a non-absorbable fluorescent marker (FITC-Dextran, 3000 to 4000 kDa), and identified in plasma/serum, to monitor gastrointestinal epithelial integrity (Vicui ⁇ a et al., 2015).
  • Cytokine expression was assessed by qPCR (IL-ip, IFNy, IL-10, IL-4), using specific primers for each target.
  • Ct cycle threshold
  • mRNA messenger RNA
  • the data were also normalized to the mean of the ACt of the control group, generating an AACt (ACt/mean of the ACt Control).
  • AACt ACt/mean of the ACt Control
  • E. coli-specific secretory IgA production was assessed by ELISA. Briefly, samples were diluted in 1% casein in PBS. ELISA plates were coated with E. coli LPS (field isolated strain). Plates were then washed three times with 200 ⁇ L/well PBS + 0.05% Tween20 for 5 min/wash. Wells were blocked with 1% casein in PBS. Samples were tested in serial dilution. Plates were washed, and chicken anti-IgA was added (BioRad) diluted in 0.1% casein. After washing, the assay was revealed with TM B solution (Life Technologies). Absorbance was read at 450 nm.
  • E. coli counts were determined according to standard microbiological methods (dilution in enrichment medium followed by plating in a selective/different medium). Briefly, samples were enriched in buffered peptone water (BPE), then in EC broth and finally in EMB and MacConkey agar. Samples were serially diluted in triplicate in BPE prior to incubation to allow quantification by the most probable number technique (Blodgett et al., 2015). For E. coli detection, only the serial dilution step was ignored. Isolated suspect colonies were tested biochemically and confirmed.
  • BPE buffered peptone water
  • Liver histology Birds were euthanized, and liver samples were collected and fixed according to the method of Rebel et al (2011). Samples were embedded in paraffin and mounted on slides. All histopathological assessments and readings were performed under the microscope by an experienced veterinary histopathologist.
  • Table 3 List of histological parameters for scoring liver lesions.
  • Intestinal anti-E. coli A-sIgA (LPS) Anti-LPS secretory IgA against E. coli was analyzed in feces by ELISA.
  • the absorbance obtained for negative control birds was approximately 0.05 AU, and 0.095 pg/mL for positive control birds, indicating that oral challenge did not induce intestinal IgA secretion.
  • the OD remained at 0.055 AU, as for the negative control, suggesting that this vaccine failed to promote a mucosal humoral response.
  • birds vaccinated in ovo with the VXN-E. coli formulation showed a significantly higher OD of 0.16 AU.
  • Liver lesion score was measured 6 days after challenge. Birds in the negative control group had a mean score of approximately 1, indicative of mild hyperplasia. In contrast, unvaccinated birds in the positive control group had a mean score of 2.35, suggesting liver lesions and necrosis induced by E. coli infection. When vaccinated with the commercial vaccine, the bird's mean lesion score was 1, as in the negative control group. Birds vaccinated in ovo had a mean lesion score ⁇ 1. These results show that both the commercial vaccine and in ovo vaccination protect against E. coli-induced liver lesions.
  • EXAMPLE 3 In ovo vaccination against a lethal E. coli challenge
  • each animal in the determined group was challenged with 4.2xl0 12 CFU of Escherichia coli (strain 19501), at a rate of 100 pL/bird in the air sacs.
  • Intestinal permeability was assessed by oral administration of FITC-Dextran, a non-absorbable fluorescent marker (FITC-Dextran, 3000 to 4000 kDa), and identified in plasma/serum, to monitor gastrointestinal epithelial integrity (Vicui ⁇ a et al., 2015).
  • E. coli counts were determined according to standard microbiological methods (dilution in enrichment medium followed by plating in a selective/different medium). Briefly, samples were enriched in buffered peptone water (BPE), then in EC broth, and finally in EMB and MacConkey agar. Samples were serially diluted in triplicate in EPB before incubation to allow quantification by the most probable number technique (Blodgett et al., 2015). For E. coli detection, only the serial dilution step was ignored. Isolated suspect colonies were tested biochemically and confirmed.
  • BPE buffered peptone water
  • Intestinal histology Birds were euthanized, and intestinal samples were collected and fixed according to the method of Rebel et al (2011). Ileal samples were embedded in paraffin and mounted on slides. All histopathological assessments and readings were performed under the microscope by an experienced veterinary histopathologist.
  • Table 4 List of histological parameters for the assessment of intestinal lesions (ileum).
  • Table 5 Percentage of hatching in the in ovo vaccinated group compared to the unvaccinated groups (negative control, positive control, commercial vaccine).
  • Hatchability was measured in this study to assess the safety of the in ovo VXN/E. coli vaccine.
  • a similar percentage of hatchability was observed between vaccinated (78.3%) and unvaccinated (81.2%) eggs. Therefore, the vaccine formulation is safe as it has no impact on hatchability.
  • E. coli challenge was performed on D14 with 4.2xl0 12 CFU and directly into the air sacs. Bird survival after lethal challenge is shown in Figure 8. This high dose had an impact on bird survival, as 26% mortality was observed in unvaccinated birds. Furthermore, mortality increased to 36% in birds vaccinated with the commercial mucosal vaccine, suggesting that it did not induce protection against lethal E. coli infection. In contrast, it was only 10% for birds vaccinated in ovo with the VXN/E. coli vaccine, suggesting better protection against infection.
  • Intestinal permeability of unvaccinated and unchallenged birds was 0.22 pg/mL, and 0.18 pg/mL for challenged and unvaccinated birds. Intestinal permeability is shown in Figure 10. Upon vaccination with the commercial vaccine or in ovo with the VXN/E. coli vaccine, permeability significantly decreased to 1.2 pg/mL, suggesting protection induced by vaccination.
  • Ileal lesion score was measured 6 days after challenge.
  • the intestinal lesion score is shown in Figure 11.
  • Birds in the negative control group had a mean score of less than 1 (0.25), representing a healthy and normal-appearing ileum, as expected.
  • unvaccinated birds in the positive control group had a significantly higher mean score of 1.7, suggesting ileal lesions with vascular disorders and desquamation, induced by E. coli infection.
  • the lesions significantly worsened with a mean score of 2.
  • birds vaccinated in ovo had a mean score of 1, suggesting protection against E. coli-induced intestinal lesions.
  • the vaccine is made from an inactivated strain of Salmonella enteritidis mixed with lipidated maltodextrin nanoparticles (LNPs). Briefly, Salmonella strain SE147 was inactivated and the protein content was measured by a pBCA assay. Finally, 200pg of killed bacteria were mixed with either LNPs (formulation named "Vaxinano 1") or non-crosslinked LNPs. (formulation named "Vaxinano 2”), at a rate of 200pg of proteins per dose of vaccine.
  • the non-crosslinked NPL is composed of linear cationic maltodextrin with an anionic inner core.
  • Infection was quantified by qPCR in the spleen and cecum of each chicken at W25.
  • the vaccine is made from 3 strains of inactivated E. coli bacteria, mixed with lipidated maltodextrin nanoparticles (LNPs). Strains O78:K80, O1:K1, O2:K1 were inactivated with 0.4% formaldehyde and the protein content was measured by BCA assay. Finally, 33.3 pg per strain was then mixed with LNP at a rate of 100 pg of protein per vaccine dose.
  • LNPs lipidated maltodextrin nanoparticles
  • IBV infectious bronchitis virus
  • the challenge strain was a field isolate that was confirmed as APEC by PCR identification of 5 pathogenicity genes (iuaT, iroN, ompC, iss, hly). It was also verified to belong to phylogroup F by the typing method described by Clermont (Clermont et al., 2013). All animals received a 100x dose of attenuated IBV vaccine (Massachusetts H-120 strain, Mass® I, Zoetis) on D14. E. coli challenge was performed in all groups except the “negative control” and 108 CFU/bird were used.
  • Quantification of anti-E IgA. coli The production of specific anti-E. coli IgA was assessed by ELISA. Briefly, samples were diluted in 1% casein in PBS. ELISA plates were coated with E. coli LPS (strain field isolate). Plates were then washed three times with 200 ⁇ L/well PBS + 0.05% Tween-20 for 5 min/wash. Wells were blocked with 1% casein in PBS. Samples were tested by serial dilution. Plates were washed and anti-chicken IgA was added (Bio-Rad) diluted in 0.1% casein. After washing, the test was revealed with a single solution of TMB (Life Technologies). Absorbance was read at 450 nm and quantification was performed with a proprietary methodology/kit developed by Imunova.
  • E. coli counts were determined according to standard microbiological methods (dilution in enrichment medium followed by plating in selective/differential medium). Briefly, samples were enriched in buffered peptone water (BPW), followed by EC broth and finally plating in EMB and MacConkey agar. Samples were serially diluted in triplicate in BPW prior to incubation, to allow quantification by the MPN technique (Blodgett et al., 2015). In E. coli detection, only the serial dilution step was skipped. Suspected isolated colonies were biochemically tested and confirmed.
  • BPW buffered peptone water
  • Table 8 List of histological parameters for the evaluation of pulmonary damage scores
  • Infection was assessed by quantifying the number of infected birds in the trachea and air sacs, by MPN. The extent of bacterial infection in the trachea and alveoli is shown in Figure 17. Three unchallenged birds were infected in the trachea and seven in the air sacs, probably due to the presence of natural pathogenic E. coli in the environment. In contrast, unvaccinated challenged birds were more infected in the trachea confirming the efficacy of the challenge. The same number of birds were infected in the group receiving the commercial vaccine compared to the infected control group, suggesting a lack of protection.
  • the vaccine formulations were made here with one of the inactivated E. coli strains used in the vaccine (11101), mixed with maltodextrin nanoparticles (NP+) or lipidated (NPL), as well as with cationized but non-crosslinked maltodextrin, simple (NP+NR) or lipidated (NPL-NR).
  • NP+ maltodextrin nanoparticles
  • NPL lipidated
  • the nanoparticles partially to very partially cover the bacteria.
  • NP+ nanoparticles synthesized from cationic and cross-linked maltodextrin. More precisely, the synthesis consists of maltodextrin (Roquette, France) dissolved in a 2M NaOH solution under magnetic stirring and at room temperature. Epichlorohydrin (Merck group, France) was then added as a cross-linking agent, as well as glycydyltrimethylammonium (GTMA, Merck group, France) as a cationizing agent. The gel obtained was then neutralized with acetic acid, then ground through a very high pressure homogenizer (LM20, Microfluidics, France).
  • LM20 very high pressure homogenizer
  • NP+ NP+
  • pathogens viruses, bacteria or parasites
  • NPLs are NP+ in which an anionic phospholipid core (DPPG) has been added.
  • DPPG dipalmitoyl-phosphatidylglycerol
  • solutol dipalmitoyl-phosphatidylglycerol
  • NP+ solution dipalmitoyl-phosphatidylglycerol
  • the phospholipids are incorporated into the core of the nanoparticle, forming NPLs.
  • These NPLs are also capable of encapsulating antigens from various pathogens (viruses, bacteria or parasites) and delivering them to immune cells (2-4).
  • NP+NR and NPL-NR constitute their respective equivalents, synthesized according to the same synthesis scheme but without crosslinking agent, thus forming linear cationic polymers.
  • the particles were characterized according to their size by dynamic light scattering (DLS) and according to their surface charge (or zeta potential) by electrophoretic light scattering (ELS), using a Zetasizer Nano ZS (Malvern, France).
  • DLS dynamic light scattering
  • ELS electrophoretic light scattering
  • Bacteria were inactivated with 0.4% formaldehyde and then purified by centrifugation. The protein content of whole bacteria was measured by micro BCA assay. The formulation was made by mixing the killed bacteria with an aqueous solution of particles, at different weight ratios (100 pg of E. coli proteins with 1, 5, 10, 30, 50 or 100 pg of particles).
  • Inactivated E. coli were labeled with fluorescein isothiocyanate (FITC), by mixing 5 mg of E. coli with 50 pg of FITC (1% w/w, Merck, France) in sodium carbonate buffer at pH 8.3 for 2 h. They were then dialyzed on a 10kDa dialysis cassette (Thermofisher, France). The protein content of whole bacteria was measured by micro BCA assay (Pierce, France). The labeled bacteria were then associated with particles at different weight ratios.
  • FITC fluorescein isothiocyanate
  • H292 cell lines were seeded in 24-well plates at 50,000 cells per well, and treated after 3 days of culture.
  • THP-1 cell lines were seeded in 24-well plates at 100,000 cells per well, and differentiated into macrophages with 20ng/mL PMA for 24h. After changing the culture medium, cells were incubated with 1pg equivalent of killed bacteria, alone or associated with particles, for 4h. Cells were then washed with phosphate-buffered saline (PBS), harvested with trypsin, and analyzed by flow cytometry on an Attune Nxt (ThermoFisher, France).
  • PBS phosphate-buffered saline
  • Table 9 Characterization of the size of the different particles (Z-average and Number) as well as their surface charge (zeta potential). The physicochemical characteristics of the different particles were analyzed after their synthesis (Table 9). The NP+ had a diameter of 33 nm and a surface charge of 36 mV, and the NPL had a diameter of 36 nm and a surface charge of 39 mV, indicating that the phospholipids were indeed associated with the particles not at their surface but inside their maltodextrin structure.
  • the NP+NRs exhibited a diameter of 17 nm with a surface charge of 32 mV, and the NPL-NRs had a diameter of 23 nm with a surface charge of 38 mV, similarly indicating that the phospholipids were well associated inside the maltodextrin structure.
  • E.coli phagocytosis by particles was assessed on differentiated macrophages (THP-1). Without particles, bacteria were phagocytosed by 0.2% of cells ( Figure 3). When they were covered by particles, their phagocytosis increased to reach 4 to 15% of positive cells depending on the ratios. Furthermore, the improvement of phagocytosis could be observed from the ratio 1/0.01 which demonstrates again that a small amount of particles covering the bacteria is sufficient to improve the delivery of bacteria.
  • Bacterial adhesion and uptake by respiratory epithelial cells and macrophages can be enhanced by single (NP + ) or lipidated (NPL) cationized maltodextrin nanoparticles, as well as by single (NP + NR) or lipidated (NPL-NR) non-crosslinked cationic maltodextrin, and this in an equivalent manner between the NPs.
  • a low dose of particles (10 to 100 times fewer particles than bacteria in %mass) is sufficient to improve this delivery to cells.

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Abstract

L'invention a trait au domaine des compositions vaccinales. Elle concerne plus particulièrement une composition vaccinale prophylactique à destination des mammifères et des oiseaux comprenant une bactérie entière tuée, ladite bactérie étant recouverte d'un agent cationique, en particulier des nanoparticules cationiques.

Description

DESCRIPTION
COMPOSITION VACCINALE COMPRENANT UN SYSTEME DE DELIVRANCE D'UNE BACTERIE ENTIERE INACTIVEE VIA DES NANOPARTICULES POLYSACCHARIDIQUES CATIONIQUES SANS ADJUVANT
L'invention a trait au domaine des compositions vaccinales. Elle concerne plus particulièrement une composition vaccinale prophylactique à destination des mammifères et des oiseaux comprenant une bactérie entière tuée, ladite bactérie étant recouverte d'un agent cationique, en particulier des nanoparticules cationiques.
Domaine de l'invention
Les bactéries sont responsables de nombreuses maladies. Une infection par une bactérie peut suffire à induire une maladie mortelle, avec des conséquences économiques fatales pour les élevages, et notamment les élevages de volailles. La bactérie Escherichia coll est une bactérie commensale du tractus digestif des animaux et des humains. Il s'agit de la bactérie la plus courante. Elle se retrouve tant dans leur environnement que dans leur flore intestinale. D'autres bactéries pathogènes tels que par exemple Salmonella enterica responsable de la Salmonellose, représentent également un enjeu majeur pour la santé des volailles.
Pour prévenir le risque d'infection des animaux d'élevages, des vaccins prophylactiques ont été développés dans le but d'immuniser les individus et d'écarter les risques d'infections et les conséquences sanitaires qui en résultent.
La vaccination prophylactique consiste à induire une réponse immunitaire chez un individu sain n'ayant pas encore été en contact avec un pathogène dans le but d'activer ses défenses immunitaires. Pour cela, un antigène tel qu'un pathogène ou un fragment de pathogène, est présenté aux cellules immunitaires de l'individu. Cette présentation permet l'activation des cellules immunitaires adaptatives, les lymphocytes B et T. Elles se multiplient et produisent des anticorps qui neutralisent et éliminent l'antigène et/ou une réponse cellulaire qui détruit les cellules infectées. Ce mécanisme induit une mémoire immunitaire, permettant à l'individu d'être protégé lors de la prochaine rencontre avec ledit pathogène. La vaccination prophylactique permet donc d'immuniser des individus sains afin de les préserver de futures maladies.
Pour que ce mécanisme soit efficace, il est primordial que le pathogène soit identifié comme un intru par le système immunitaire de l'individu afin qu'il développe une réponse immunitaire protectrice contre l'infection. L'art antérieur nous enseigne qu'il existe plusieurs types de vaccins prophylactiques permettant d'immuniser des volailles contre des bactéries pathogènes.
Le brevet EP2911688A1 concerne un serovar de Salmonella enterica sérogroupe Cl destiné à être utilisé pour protéger les volailles contre un trouble résultant d'une infection à Salmonella enterica. Ce serovar de Salmonella enterica étant sous forme inactivée. Le sérovar est utilisé pour fabriquer des vaccins pouvant être multivalents. Les poussins sont vaccinés à 30h de vie. Le sérovar est utilisé pour formuler un vaccin contenant un adjuvant, tel que par exemple hydroxyde d'aluminium à environ 25 % v/v.
Le brevet EP0256792A2 décrit un vaccin pour la protection des volailles contre les infections à la colibacillose, comprenant comme ingrédient actif des cellules E. coll inactivées via un traitement aux ultrasons qui détruit la bactérie. Le vaccin peut contenir des adjuvants, par exemple un composé d'aluminium tel qu'un gel d'hydroxyde d'aluminium. L'inoculation du vaccin à la volaille est préférentiellement effectuée par le cloaque. Toutefois, le vaccin peut également être inoculé de manière conventionnelle, par exemple, par voie intramusculaire, intraveineuse ou sous-cutanée. L'essence de l'invention est la mise en œuvre de la rupture de la membrane cellulaire par ultrasons dans la fabrication d'un vaccin contre la colibacillose de la volaille.
Le brevet W02022/008848 décrit un procédé de préparation d'une composition vaccinale à partir d'au moins un antigène lyophilisé comprenant les étapes de :
Fournir une solution aqueuse comprenant une nanoparticule cationique constituée d'un noyau de polysaccharide cationique ;
Ajouter ledit antigène lyophilisé dans ladite solution aqueuse
Incuber la composition ainsi obtenue à température ambiante.
Le procédé selon ce document, comprend la présence d'un extrait partiel ou total de pathogène pouvant contenir des protéines, des polysaccharides et des lipides. L'antigène selon ce document, est un extrait complexe de protéines obtenu à partir d'un pathogène entier.
La demande de brevet US2021/093705, décrit des compositions de nanoparticules destinées à être utilisées comme vaccins contre Salmonella enteritidis chez la volaille. La composition vaccinale comprend : des antigènes protéiques hautement immunogènes (protéines de la membrane externe (OMP) ou la protéine entière antigénique (KAg) et la protéine flagellaire extraite de Salmonella enteritidis tuée. Ces antigènes sont piégés à l'intérieur de nanoparticules de polyanhydride ou de chitosane. La demande de brevet WO2021/021778, décrit une composition comprenant un adjuvant muqueux d'acide polyacrylique et/ou des antigènes inactivés provenant de bactéries ou de virus respiratoires ou intestinaux. En outre, la composition peut comprendre une suspension cellulaire comprenant des particules d'acide polyacrylique non cationiques ayant une taille allant de 250 nm à 10 microns.
Le document Anthony Pavic ET al. décrit une étude concernant le développement d'un vaccin trivalent inactivé autologue. Le vaccin trivalent a été produit à partir de quantités égales de suspension cellulaire (3x 108 ufc/mL), combinées à un adjuvant d'hydroxyde d'aluminium et administrées aux poules par voie intramusculaire dans la poitrine, à l'âge de 12 à 17 semaines.
L'accessibilité des campagnes de vaccinations est souvent limitée par le coût d'une dose de composition vaccinale. En effet, les vaccins actuels sont souvent coûteux, ce qui limite leurs utilisations à grande échelle, notamment dans les élevages où le nombre d'individus à traiter est conséquent. Bien que des vaccins soient commercialisés pour prévenir les infections causées par des bactéries pour des mammifères et des oiseaux, ces vaccins ne sont pas satisfaisants car ils ne permettent pas de générer une protection totale et efficace à un coût accessible. De plus, les compositions proposées dans l'art antérieur comprennent toutes des adjuvants vaccinaux, nécessaires à leur efficacité, mais dont les effets secondaires sont largement documentés.
Exposé de l'invention
Les inventeurs ont mis au point une composition vaccinale prophylactique sans adjuvant, permettant d'immuniser les mammifères et les oiseaux, en particulier les volailles, contre des bactéries pathogènes. Particulièrement, les inventeurs ont mis au point un nouveau système de délivrance, dans lequel le recouvrement d'au moins une bactérie pathogène entière et tuée, par des nanoparticules cationiques (NP) permet d'améliorer le mécanisme de captation cellulaire. Cela a pour effet d'améliorer le mécanisme de présentation des antigènes bactériens aux cellules immunitaires et donc d'activer le système immunitaire plus rapidement et plus efficacement. De manière avantageuse, la composition vaccinale peut être multivalente de sorte à induire une protection de large spectre. La composition vaccinale peut ainsi permettre de réaliser des vaccins combinés.
L'endocytose est un mécanisme permettant l'entrée de matériel extracellulaire dans une cellule, par invagination de la membrane plasmique suivie de la formation de vésicules s'isolant dans le cytoplasme. Lorsque l'endocytose est réalisée par des cellules immunitaires spécialisées (polynucléaires neutrophiles, macrophages, cellules dendritiques), on parle alors de phagocytose. Le vaccin prophylactique peut être utilisé comme traitement contre la Salmonellose aviaire, la colibacillose, la campylobactériose, ou toute autre infection bactérienne.
Ainsi, l'invention concerne une composition vaccinale prophylactique sans adjuvant, en particulier à destination des mammifères et des oiseaux, et plus particulièrement des volailles, comprenant des nanoparticules cationiques constituées d'un noyau de polysaccharide et au moins une bactérie inactivée, caractérisée en ce que ladite bactérie est entière et en ce que lesdites nanoparticules cationiques recouvrent ladite bactérie. Cette composition permet de limiter les risques de contaminations vis-à-vis d'au moins une maladie résultant d'une infection par une bactérie pathogène. Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne une composition vaccinale prophylactique multivalente destinée au traitement de la salmonellose ou de la colibacillose notamment à destination des mammifères et oiseaux, plus spécifiquement des volailles telles que les poules pondeuses, les poulets de chair, dindes, canards, pintades, autruches, émeus, cailles...
L'invention concerne également l'utilisation d'une composition vaccinale pour prévenir une infection bactérienne, en particulier une colibacillose, salmonellose, campylobactériose.
Avantage de l'invention
De manière tout à fait surprenante, les inventeurs ont démontré que l'administration d'une composition vaccinale comprenant des bactéries pathogènes entières inactivées recouvertes d'agents cationiques, tels que par exemple, des nanoparticules cationiques, constituait un nouveau système de délivrance d'antigènes permettant d'immuniser efficacement contre un pathogène d'origine bactérienne.
Il est connu de l'art antérieur que des nanoparticules cationiques ont la capacité d'augmenter le phénomène d'endocytose des cellules immunitaires en délivrant de petits antigènes d'une taille de l'ordre de 5 à 15 nanomètres, telles que des antigènes protéiques provenant de pathogènes fragmentés. Dans cette configuration, une quantité importante de nanoparticules est nécessaire pour internaliser chaque élément de la cellule bactérienne fragmentée. Ces systèmes de délivrance utilisent des nanoparticules cationiques associées à un extrait total ou partiel d'une bactérie pathogène fragmentée qui est, dans ce cas, contenu dans le noyau des nanoparticules ; cette configuration « antigène dans le noyau de la nanoparticule » nécessite d'utiliser plus de nanoparticules que d'antigènes (en poids), de préférence de 10 à 100 fois plus de nanoparticules que d'antigènes. Ceci peut être même supérieur lorsqu'on utilise des de type PLGA ou liposomes par exemple. Ce système de délivrance de l'art antérieur ne peut pas délivrer des bactéries entières, il permet uniquement de délivrer de petits antigènes d'une taille de l'ordre de 5 à 15 nanomètres, alors que des cellules entières ont une taille de l'ordre minimum de 1 à 10 microns.
Dans le présent travail, les inventeurs ont démontré, de manière inattendue, que les nanoparticules cationiques permettent le phénomène de phagocytose des cellules bactériennes entières. Autrement dit, les inventeurs ont mis au point un système de délivrance permettant de délivrer des bactéries qui sont au moins 100 fois plus grandes que les antigènes protéiques. Il s'agit donc d'un nouveau système de délivrance, dans lequel la bactérie est recouverte par de nanoparticules chargées positivement selon l'invention, ce qui rend possible son interaction avec la membrane cellulaire et son entrée dans les cellules immunitaires par phagocytose. En effet, cette combinaison permet d'imiter le processus d'entrée des virus dans les cellules grâce à la modulation des charges ioniques apportées par la nanoparticule. Le recouvrement par des nanoparticules selon l'invention, d'une bactérie entière permet de conférer une charge positive à la combinaison « nanoparticule recouvrant une bactérie entière ». Cette charge positive favorise l'interaction avec la membrane cellulaire et permet l'entrée du complexe bactérie entière-nanoparticules par phagocytose. Ce procédé est possible grâce à la combinaison particulière, mise au point par les demandeurs, à savoir des nanoparticules recouvrant une bactérie entière inactive. Aucune combinaison de type recouvrement par des nanoparticules d'une bactérie entière n'a été décrit auparavant.
Ce nouveau système de délivrance présente l'innovant avantage de pouvoir faire entrer une bactérie entière dans une cellule, via la composition vaccinale selon l'invention. Avantageusement, on peut utiliser une quantité plus faible de nanoparticules vs la quantité en poids de protéines de la bactérie ; en effet, la quantité de NP peut être de 3 à 100 fois inférieure à celle des protéines bactériennes.
Ainsi, de manière très intéressante, une faible quantité de nanoparticules est suffisante pour que la cellule bactérienne entière entre par phagocytose et permette une immunisation efficace.
Réduire le nombre de nanoparticules utiles à la vaccination permet de réduire considérablement les coûts de production de la composition vaccinale, rendant la vaccination contre des bactéries pathogènes accessible à grande échelle, notamment dans des domaines où le coût est une réelle limite aux campagnes de vaccination. On peut citer par exemple l'élevage des volailles avec la vaccination in ovo.
De plus, la composition vaccinale a pour avantage de pouvoir être, en fonction du mode de réalisation de l'invention, multivalente. C'est-à-dire qu'elle peut comprendre au moins deux souches de bactéries dont chacune assure la prévention d'une infection. Ainsi, l'invention permet d'obtenir facilement un vaccin combiné. La composition vaccinale permet également, en fonction du mode de réalisation de l'invention, d'acquérir une immunité croisée. En effet, la composition vaccinale peut comprendre une bactérie qui induit une immunité contre des variants de la souche considérée.
Une application d'intérêt pour la présente technologie est l'inoculation in ovo. Cette approche est innovante : aucune stratégie vaccinale décrite auparavant n'a proposé d'administrer une bactérie entière inactive directement dans l'œuf. Ici, la combinaison de bactéries inactives entières recouvertes partiellement par des nanoparticules cationiques s'avère très efficace en termes de protection vaccinale et sans effet délétère sur l'éclosion, ni sur le poussin. De plus, en intervenant avant l'éclosion, les risques de contamination au sein de l'élevage (entre poussins) sont diminués ainsi que la transmission de la maladie dans les élevages. En particulier, les inventeurs ont montré qu'une composition vaccinale comprenant 3 souches différentes de E. Coli administrée in ovo chez le poussin, permet de protéger le poussin d'une infection de type colibacillose à dose non létale mais également à dose létale dans des expériences de challenge bactérien. La charge bactérienne est diminuée et le taux d'éclosion est équivalent à celui d'œufs non vaccinés.
D'autre part, dans une autre application, une injection intramusculaire d'une composition vaccinale comprenant une souche bactérienne de Salmonella et des nanoparticules cationiques (NPL) chez la poule pondeuse permet de diminuer la charge bactérienne et les poules pondent plus d'œufs que les poules non immunisées.
La composition vaccinale ne contient aucun adjuvant, ce qui évite les effets indésirables. Ceci est avantageux puisque les adjuvants minéraux (à savoir des sels minéraux tels que sels d'aluminium) restent très longtemps dans le corps. Les nanoparticules jouent le rôle d'agent de délivrance des bactéries tuées aux cellules immunitaires et permettent d'induire une réponse protectrice contre l'infection.
Dans le cas de la vaccination in ovo, le fait de ne pas introduire de molécules susceptibles de perturber le développement du poussin in ovo contribue à l'efficacité de l'approche vaccinale, le vaccin ne perturbant pas le développement du poussin et ni de l'éclosion.
La composition vaccinale peut être administrée in ovo, mais également par voie mucosale (orale, oculaire, nasale) ou intra-musculaire. De plus, l'approche vaccinale selon l'invention peut être mise en œuvre chez les mammifères ainsi que chez les oiseaux, notamment chez les volailles.
La composition selon la présente invention, fournit donc une composition de formulation simple, facile à préparer et peu coûteuse pouvant être notamment administrée in ovo. De plus, le fait que la composition comprenne une bactérie entière et inactivée présente également l'avantage d'être un antigène plus simple à caractériser qu'un extrait partiel ou total d'antigène.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
Un premier objet de la présente invention concerne une composition vaccinale sans adjuvant comprenant des nanoparticules cationiques constituées d'un noyau de polysaccharide et au moins une bactérie inactivée, caractérisée en ce que ladite bactérie est entière et en ce lesdites nanoparticules cationiques recouvrent ladite bactérie.
Dans un mode de réalisation particulier, la composition vaccinale est à destination des mammifères et oiseaux.
Dans un autre mode de réalisation particulier, les nanoparticules cationiques recouvrent ladite bactérie dans un ratio protéines bactériennes : NP en poids supérieur ou égal à 1. Dans un mode de réalisation préféré, ledit ratio protéines bactériennes : NP en poids est supérieur ou égal à 2, de manière préférée supérieur à 5, et de manière encore plus préférée supérieure à 10, voire à 50 ou 500.
Par « nanoparticule cationique constituée d'un noyau de polysaccharide cationique », on entend une nanoparticule solide comprenant un noyau de polysaccharide cationique (NP). La NP peut être réticulée ou non. Son noyau peut être chargé ou non d'un phospholipide anionique. Cette NP n'est entourée d'aucune couche phospholipidique.
Au sens de la présente invention, les nanoparticules cationiques sont des particules ayant une gamme de taille comprise entre 1 et 500 nanomètres. Plus préférentiellement, les nanoparticules polysaccharidiques ont une gamme de taille comprise entre 10 et 300 nm, notamment entre 20 et 250 nm. Par ailleurs, une nanoparticule selon l'invention est avantageusement utilisée en solution. Ainsi, le terme nanoparticule comprend également des particules ou des molécules qui sont sous une forme nanoparticulaire en solution, comme par exemple le chitosan et ses dérivés. La solution peut être une solution aqueuse, une solution tampon ou une solution sérique. Les inventeurs ont en effet constaté que certaines molécules linéaires telles que le chitosan forment en solution des serpentins nanométriques, qui se comportent comme des nanoparticules classiques. Le chitosan peut ainsi être utilisé sous forme de nanoparticule classique (eg Qi et al, Carbohydrate Research, 2004, 339(16), 2693- 2700) ou tel quel ou sous forme d'hydrolysat en solution.
Dans un premier mode de réalisation particulier, le polysaccharide cationique formant le noyau de la nanoparticule (NP) est un polymère non réticulé obtenu par la réaction entre un polysaccharide choisi parmi l'amidon, le dextrane, le chitosan, la dextrine, et la maltodextrine, des poly-fructoses (inuline), poly-mannoses, poly-galactoses, poly-galacto-mannanes (gomme de guar) et au moins un ligand cationique choisi entre une amine primaire, secondaire, tertiaire ou des ammoniums quaternaires. Le noyau n'est pas chargé en lipides. Autrement dit, dans ce mode de réalisation, la nanoparticule est une nanoparticule cationique constituée d'un noyau polysaccharide non réticulé et non chargé en lipide constitué (i) d'un polysaccharide choisi parmi l'amidon, le dextrane, le chitosan, la dextrine, et la maltodextrine, des poly-fructoses (inuline), poly-mannoses, poly-galactoses, poly-galacto-mannanes (gomme de guar) et (ii) d'un au moins un ligand cationique choisi parmi une amine primaire, secondaire, tertiaire ou des ammoniums quaternaires.
Dans un deuxième mode de réalisation particulier, le polysaccharide cationique formant le noyau de la nanoparticule (NP) est un polymère réticulé obtenu par la réaction entre un polysaccharide choisi parmi l'amidon, le dextrane, le chitosan, la dextrine, et la maltodextrine, des poly-fructoses (inuline), poly-mannoses, poly-galactoses, poly-galacto-mannanes (gomme de guar) et au moins un ligand cationique choisi parmi une amine primaire, secondaire, tertiaire ou des ammoniums quaternaires, puis l'ajout d'un agent de réticulation. L'agent de réticulation est choisi parmi l'épichloridrine, un diacide carboxylique ou un chlorure d'acide, tel que l'acide sébacique. Le noyau n'est pas chargé en lipides. Autrement dit, dans ce mode de réalisation, la nanoparticule est une nanoparticule cationique constituée d'un noyau polysaccharide réticulé et non chargé en lipide constitué (i) d'un polysaccharide choisi parmi l'amidon, le dextrane, le chitosan, la dextrine, et la maltodextrine, des poly-fructoses (inuline), poly-mannoses, poly-galactoses, poly-galacto-mannanes (gomme de guar) (ii) d'un au moins un ligand cationique choisi parmi une amine primaire, secondaire, tertiaire ou des ammoniums quaternaires, et (iii) d'un agent de réticulation est choisi parmi l'épichloridrine, un diacide carboxylique ou un chlorure d'acide, tel que l'acide sébacique.
Dans un troisième mode de réalisation, la nanoparticule (NP) est une nanoparticule constituée d'un noyau de polysaccharide cationique non réticulé et chargé en phospholipide. Autrement dit, dans ce mode de réalisation, la nanoparticule est une nanoparticule cationique constituée d'un noyau polysaccharide non réticulé et chargé en phospholipide anionique constitué (i) d'un polysaccharide choisi parmi l'amidon, le dextrane, le chitosan, la dextrine, et la maltodextrine, des poly-fructoses (inuline), poly-mannoses, poly-galactoses, poly-galacto-mannanes (gomme de guar), (ii) d'un au moins un ligand cationique choisi parmi une amine primaire, secondaire, tertiaire ou des ammoniums quaternaires, et (iii) d'un phospholipide anionique choisi parmi le glycérol de diacylphosphatidyle, la sérine de diacylphosphatidyle ou l'inositol de diacylphosphatidyle Dans un quatrième mode de réalisation de l'invention, la nanoparticule (NP) est une nanoparticule cationique constituée d'un noyau polysaccharide réticulé et chargé en phospholipide anionique constitué (i) d'un polysaccharide choisi parmi l'amidon, le dextrane, le chitosan, la dextrine, et la maltodextrine, des poly-fructoses (inuline), poly-mannoses, poly-galactoses, poly-galacto-mannanes (gomme de guar), (ii) d'un au moins un ligand cationique choisi parmi une amine primaire, secondaire, tertiaire ou des ammoniums quaternaires, (iii) d'un agent de réticulation est choisi parmi l'épichloridrine, un diacide carboxylique ou un chlorure d'acide, tel que l'acide sébacique, et (iv) d'un phospholipide anionique choisi parmi le glycérol de diacylphosphatidyle, la sérine de diacylphosphatidyle ou l'inositol de diacylphosphatidyle.
Dans un mode de réalisation préféré s'appliquant aux quatre types de nanoparticules (NP) décrites ci- dessus, le polysaccharide cationique est à base de maltodextrine ; il est obtenu par la réaction entre la maltodextrine et le glycidyltriméthylammonium, que la NP soit réticulée ou non, lipidée ou non. Autrement dit, le noyau de polysaccharide cationique comprend de la maltodextrine et un glycidyltriméthylammonium.
Dans un mode de réalisation préféré applicable aux nanoparticules (NP) dont le noyau est chargé en phospholipide, la NP est une nanoparticule de polysaccharide cationique chargée en DPPG, que la NP soit réticulée ou non.
Parmi le groupe des oiseaux, on entend particulièrement les volailles. Les volailles, au sens de l'invention, sont des oiseaux domestiques qui servent de source d'œufs ou de viande et qui comprennent des espèces commercialement importantes telles que, par exemple, les poulets, les poules pondeuses, les dindes, les canards, les oies, les pintades, les faisans, les pigeons et les paons.
Dans un mode de réalisation préféré, la bactérie est choisie parmi le groupe suivant : Salmonella enterica ser.Typhi; Streptococcus Pneumoniae; Haemophilus influenzae type b; Mycobacterium tuberculosis; Extraintestinal pathogenic E.Coli (ExPEC); enterotoxigenic E.Coli (ETEC); S.enterica ser.; Paratyphi A; Neisseria Gonorheae; Clostridium Difficile; Campylobacter spp; Shigella spp; Staphylobacter Aureus; Helicobacter pylori.
Par « bactérie entière » on entend au sens de l'invention, une bactérie non fragmentée, sous sa forme complète, en particulier dont la membranaire cellulaire est intacte. Autrement dit, cela signifie que les membranes des bactéries restent inaltérées. A contrario, des bactéries dont les membranes sont abimées, fragmentées ou explosées ne peuvent être considérées comme des bactéries entières au sens de la présente invention. Par « agent cationique » on entend au sens de l'invention, un agent de charge électrique positive, tel qu'une nanoparticule cationique.
Par « par bactéries inactivées ou inactives » on entend au sens de l'invention, une bactérie non vivante, qui a été préalablement tuée mais qui est intacte. Par intacte, on entend une bactérie dont la membrane est inaltérée. Elles peuvent être tuées par exemple par traitement au formaldehyde ou toute autre méthode d'inactivation connue de l'homme du métier.
Par « recouverte de nanoparticules cationiques » on entend au sens de l'invention, que les nanoparticules tapissent la surface de la bactérie inactivée. Les nanoparticules recouvrent d'une couche homogène les bactéries tuées. Le taux de recouvrement peut être défini par le ratio en poids des protéines bactériennes : NP. Dans un mode de réalisation préféré, le ratio en poids des protéines bactériennes : NP est supérieur ou égal à 2, de manière préférée supérieur à 5 et de manière encore plus préférée supérieure à 10, voire à 50 ou 500.
Une bonne efficacité des bactéries recouvertes de NP associée à une prévention de l'infection a été observée pour un ratio protéines bactériennes (en poids sec) : NP en poids compris entre 1 : 0,01 et 1 : 10 et plus particulièrement entre 1 : 0,01 et 1 : 3. Soit environ 100 fois moins de nanoparticules en poids par rapport au poids des bactéries. Dans un mode de réalisation particulier, ce ratio est supérieur à 1, en particulier la quantité en poids de protéines bactériennes est au minimum égal à celle des NP et peut être jusqu'à 100 fois supérieure (ratio compris entre 1 : 1 et 1 : 0,01). Dans un mode de réalisation encore plus préféré, la quantité en poids de protéines bactériennes est de 2 à 100 fois supérieure à celle de NP (ratio est compris entre 1 : 0,5 etl : 0,01). Dans un mode de réalisation encore préféré, la quantité en poids de protéines bactériennes est de 10 à 100 fois supérieure à celle de NP (ratio est compris entre 1 : 0,01 et 1 : 0,1). Dans des modes de réalisation particuliers, ce ratio peut être compris entre 1 : 0,1 et 1 : 10 voire entre 1 : 0,1 et 1 : 3.
La composition vaccinale comprend au moins une bactérie permettant d'induire une protection efficace pour éviter, ou tout du moins réduire, une infection bactérienne.
Par « éviter une infection » on entend au sens de l'invention, que la composition vaccinale peut protéger à 100% contre les risques d'infection ou, si elle n'évite pas totalement le risque d'infection, alors la protection conférée par le vaccin est suffisante pour que l'individu ne déclenche pas la maladie ou s'il la déclenche, les symptômes de l'infection sont au moins réduits et que l'individu évite la mort. Eviter une infection consiste également à éviter que l'infection se propage au sein de l'élevage.
Dans un mode de réalisation de l'invention, la composition vaccinale est prophylactique. Par « une composition vaccinale prophylactique » on entend au sens de l'invention, une composition vaccinale qui permet d'induire une réponse immunitaire chez un individu sain n'ayant pas encore été en contact avec un pathogène dans le but d'activer ses défenses immunitaires, et de préparer le système immunitaire à réagir contre une future infection.
Dans un autre mode de réalisation de l'invention, la composition vaccinale est à destination des oiseaux. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, la composition vaccinale prophylactique est à destination des volailles, en particulier l'embryon dans l'œuf.
Par « composition vaccinale multivalente » on entend au sens de l'invention que la composition vaccinale comprend plusieurs bactéries différentes permettant d'induire une immunité contre plusieurs maladies associées aux différentes bactéries.
Dans un mode de réalisation particulier, la composition vaccinale permet d'élaborer des vaccins combinés.
Par « vaccins combinés » on entend au sens de l'invention, une composition vaccinale comprenant plusieurs bactéries d'espèces ou de familles différentes de sorte à induire, simultanément, une immunité contre plusieurs bactéries différentes.
Dans un mode de réalisation, la composition vaccinale comprend au moins une bactérie entière et inactivée qui permet d'induire une immunité croisée chez l'individu ayant été vacciné.
Par « immunité croisée » on entend au sens de l'invention, une immunité acquise contre un pathogène bactérien qui confère une immunité contre un autre pathogène bactérien d'espèce, de souche ou de famille différente qui ne fait pas partie de la composition vaccinale.
L'immunité croisée est liée au phénomène de réactivité croisée. Les anticorps sont habituellement spécifiques d'un antigène particulier. C'est grâce à cette spécificité que les anticorps ciblent et éliminent les antigènes qu'ils ont détectés. Une bactérie mutante conserve des antigènes communs qui peuvent être la cible d'une réponse induite par la vaccination.
Ainsi, il peut exister des réactions croisées avec des bactéries d'espèces proches. Une bactérie possède de nombreux antigènes de surface. Lorsqu'un animal est immunisé contre une bactérie grâce à une injection de bactéries entières, il produit des anticorps contre de nombreux antigènes bactériens. Si deux bactéries possèdent un antigène identique ou similaire, l'individu aura acquis une immunité contre ces deux bactéries. Dans un autre mode de réalisation de l'invention, la composition vaccinale est multivalente et comprend au moins 2 souches différentes de bactéries d'espèces ou de familles différentes, lesdites bactéries étant entières et inactivées.
La composition vaccinale peut, par exemple, être composée de 3 souches d'E. coli inactivées mélangées à des nanoparticules (NP) de maltodextrine lipidées afin de prévenir la colibacillose.
Ainsi, selon les différents modes de réalisation de la composition vaccinale, ladite composition peut comprendre :
- Une bactérie inactivée et entière, recouverte de nanoparticules cationiques constituées d'un noyau de polysaccharide poreux sous forme réticulée chargé en phospholipide anionique.
- Une bactérie inactivée et entière, recouverte de nanoparticules cationiques constituées d'un noyau de polysaccharide poreux sous forme réticulée non chargé en lipide.
- Une bactérie inactivée et entière, recouverte de nanoparticules cationiques constituées d'un noyau de polysaccharide sous forme non réticulée chargé en phospholipide anionique.
- Une bactérie inactivée et entière, recouverte de nanoparticules cationiques constituées d'un noyau de polysaccharide sous forme non réticulée non chargé en lipide.
- Au moins deux bactéries de souches et/ou d'espèces ou de familles différente, lesdites bactéries étant inactivées et entières, recouvertes de nanoparticules cationiques constituées d'un noyau de polysaccharide poreux sous forme réticulée chargé en phospholipide.
- Au moins deux bactéries de souches et/ou d'espèces ou de familles différente, lesdites bactéries étant inactivées et entières, recouvertes de nanoparticules cationiques constituées d'un noyau de polysaccharide sous forme réticulée non chargé en lipide.
- Au moins deux bactéries de souches et/ou d'espèces ou de familles différente, lesdites bactéries étant inactivées et entières, recouvertes de nanoparticules cationiques constituées d'un noyau de polysaccharide poreux sous forme non réticulée chargé en phospholipide.
- Au moins deux bactéries de souches et/ou d'espèces ou de familles différentes, lesdites bactéries étant inactivées et entières, recouvertes de nanoparticules cationiques constituées d'un noyau de polysaccharide sous forme non réticulée non chargé en lipide.
Un deuxième objet de l'invention concerne une composition vaccinale telle que définie précédemment comprenant au moins deux bactéries inactivées différentes, caractérisée en ce que lesdites bactéries sont entières et qu'elles sont recouvertes de nanoparticules cationiques constituées d'un noyau de polysaccharide. Elle est utilisée sous une forme adaptée à une administration par voie intramusculaire, mucosale ou par administration in ovo. Cette composition est donc multivalente et peut être utilisée pour obtenir un vaccin combiné.
Par « bactéries inactivées différentes » on entend au sens de l'invention, des bactéries de souches et/ou d'espèces ou de familles différentes.
Un troisième objet de l'invention concerne l'utilisation d'une composition vaccinale telle que définie précédemment pour prévenir une infection bactérienne chez un mammifère ou un oiseau.
Dans des modes particuliers de réalisation de l'invention, l'infection bactérienne est une salmonellose, une colibacillose ou une campylobactériose.
Dans un mode de réalisation préféré, cette utilisation s'applique à la prévention d'une infection bactérienne chez l'embryon de volaille in ovo (par administration in ovo).
L'invention concerne aussi une méthode de prévention d'une maladie liée à une infection bactérienne à destination des animaux mammifères et oiseaux, comprenant une composition vaccinale comprenant au moins une bactérie pathogène entière inactivée recouverte de nanoparticules cationiques constituées d'un noyau de polysaccharide et comprenant les étapes suivantes :
Disposer de nanoparticules cationiques constituées d'un noyau de polysaccharide et d'au moins une bactérie entière.
Procéder à l'inactivation de ladite bactérie entière à l'aide de formaldéhyde.
Mélanger lesdites nanoparticules cationiques avec ladite bactérie entière inactivée pour obtenir ladite composition vaccinale
Administrer ladite composition vaccinale auxdites animaux.
Dans un mode de réalisation particulier, le mélange nanoparticules cationiques avec ladite bactérie entière inactivée est réalisé de sorte à ce que lesdites nanoparticules recouvrent ladite bactérie dans un ratio protéines bactériennes : NP en poids supérieur ou égal à 1. Dans un mode de réalisation préféré, ledit ratio protéines bactériennes : NP en poids est supérieur ou égal à 5.
Dans la composition vaccinale, lesdites nanoparticules cationiques peuvent être choisies parmi :
Des nanoparticules cationiques constituées d'un noyau polysaccharide non réticulé et non chargé en lipide constitué (i) d'un polysaccharide choisi parmi l'amidon, le dextrane, le chitosan, la dextrine, et la maltodextrine, des poly-fructoses (inuline), poly-mannoses, poly- galactoses, poly-galacto-mannanes (gomme de guar) et (ii) d'un au moins un ligand cationique choisi parmi une amine primaire, secondaire, tertiaire ou des ammoniums quaternaires ;
Des nanoparticules cationiques constituées d'un noyau polysaccharide réticulé et non chargé en lipide constitué (i) d'un polysaccharide choisi parmi l'amidon, le dextrane, le chitosan, la dextrine, et la maltodextrine, des poly-fructoses (inuline), poly-mannoses, poly-galactoses, poly-galacto-mannanes (gomme de guar) (ii) d'un au moins un ligand cationique choisi parmi une amine primaire, secondaire, tertiaire ou des ammoniums quaternaires, et (iii) d'un agent de réticulation est choisi parmi l'épichloridrine, un diacide carboxylique ou un chlorure d'acide, tel que l'acide sébacique ;
Des nanoparticules cationiques constituées d'un noyau polysaccharide non réticulé et chargé en phospholipide anionique constitué (i) d'un polysaccharide choisi parmi l'amidon, le dextrane, le chitosan, la dextrine, et la maltodextrine, des poly-fructoses (inuline), poly- mannoses, poly-galactoses, poly-galacto-mannanes (gomme de guar), (ii) d'un au moins un ligand cationique choisi parmi une amine primaire, secondaire, tertiaire ou des ammoniums quaternaires, et (iii) d'un phospholipide anionique choisi parmi le glycérol de diacylphosphatidyle, la sérine de diacylphosphatidyle ou l'inositol de diacylphosphatidyle ;
Des nanoparticules cationiques constituées d'un noyau polysaccharide réticulé et chargé en phospholipide anionique constitué (i) d'un polysaccharide choisi parmi l'amidon, le dextrane, le chitosan, la dextrine, et la maltodextrine, des poly-fructoses (inuline), poly-mannoses, poly- galactoses, poly-galacto-mannanes (gomme de guar), (ii) d'un au moins un ligand cationique choisi parmi une amine primaire, secondaire, tertiaire ou des ammoniums quaternaires, (iii) d'un agent de réticulation est choisi parmi l'épichloridrine, un diacide carboxylique ou un chlorure d'acide, tel que l'acide sébacique, et (iv) d'un phospholipide anionique choisi parmi le glycérol de diacylphosphatidyle, la sérine de diacylphosphatidyle ou l'inositol de diacylphosphatidyle.
Dans un mode de réalisation préféré, le polysaccharide cationique est obtenu par la réaction entre la maltodextrine et le glycidyltriméthylammonium, que la NP soit réticulée ou non.
Dans un mode de réalisation particulier, ladite méthode de prévention comprend une composition vaccinale inoculée par voie mucosale, injectable et/ou bien administrée in ovo.
Dans des modes de réalisation particuliers de l'invention, la composition vaccinale est administrée chez les volailles à savoir in ovo, mucosale et orale chez le poussin et en intramusculaire chez la poule pondeuse. DESCRIPTION DES FIGURES
La figure 1 : Captation d'E. coli après recouvrement par les NPL par les cellules. La délivrance de bactéries E. coli entières a été évaluée dans des cellules humaines H292. Les E. coli-FITC fluorescentes, seules ou associées aux NPL (ratio 1/3 à 1/0.05) ont été incubées avec des cellules humaines H292 pendant 4h, et le pourcentage de cellules positives a été mesuré par cytométrie en flux sans ou avec bleu trypan (TB). Les résultats représentent la moyenne ± SEM de 3 expériences. Analyse statistique : two-way ANOVA, ** p < 0,01, *** p < < 0,001.
La figure 2 : Délivrance intracellulaire par microscopie confocale, avec un ratio 1/3. La délivrance de bactéries E. coli a été évaluée dans des cellules H292. Les E. coli-FITC fluorescent associées aux NPL (ratio 1/3) ont été incubées avec des cellules H292 pendant 4h, et la localisation intracellulaire a été observée par microscopie confocale. Une image représentative a été prise. Rouge : membrane plasmique ; bleu : noyaux ; vert : E. coli. Barre d'échelle : 10pm.
La figure 3 : Schéma du protocole vaccinal de l'essai de vaccination in ovo. Le vaccin commercial a été administré uniquement sur le contrôle positif.
La figure 4 : Test de perméabilité intestinale pour 8 oiseaux de chaque groupe, 6 jours après le challenge (J20). Les résultats représentent la moyenne ± SD.
La figure 5 : Analyse des slgA anti-E. coli dans les fèces de 8 oiseaux issus de chaque groupe, 13 jours après le challenge (J27). Les résultats représentent la moyenne ± SD des valeurs d'absorbance obtenues par ELISA. Analyse statistique : one-way Anova, * p < 0,05.
La figure 6 : Score clinique des lésions hépatiques issus de 8 oiseaux de chaque groupe, 6 jours après le challenge (J20). Les résultats représentent la moyenne ± SD des scores des groupes. Analyse statistique : one-way Anova, * p < 0,05.
La figure 7 : Schéma du protocole de l'essai de vaccination in ovo. Seul le groupe positif a été vacciné à J1 avec le vaccin commercial (Poulvac).
La figure 8 : Le pourcentage de mortalité sur chaque groupe après le challenge léthal à J14 (n=30).
La figure 9 : La mesure de la charge bactérienne dans les sacs aériens des oiseaux issus de chaque groupe, évaluée 2 jours après le challenge (J16) sur 8 oiseaux, par MPN. Les résultats représentent la moyenne ± SD. Les analyses statistiques ont été réalisées par one-way ANOVA, * p < 0,05. La figure 10 : perméabilité intestinale de 8 oiseaux issus de chaque groupe 6 jours après le challenge (J20). Les résultats représentent la moyenne ± SD. Les analyses statistiques ont été réalisées par oneway ANOVA, * p < 0.05.
La figure 11 : Score de lésion intestinale de 8 oiseaux issus de chaque groupe 6 jours après le challenge (J20). Les résultats représentent la moyenne ± SD. Les analyses statistiques ont été effectuées par oneway ANOVA, * p < 0.05.
La figure 12 : Schéma du protocole de l'essai de vaccination intra-musculaire.
La figure 13 : Ponte des œufs. En haut : nombre quotidien d'œufs pondus par les poules de chaque groupe après le challenge. Les barres d'erreur sont cachées pour clarifier le graphique. En bas : Nombre quotidien moyen d'œufs pondus par les poules de chaque groupe après le challenge. Analyses statistiques : one-way Anova * p < 0.05, *** p < 0.001, **** p < 0.0001.
La figure 14 : Quantification de la charge bactérienne dans le caecum du poulet de chaque groupe, mesurée par qPCR. Les résultats représentent la moyenne ± SEM. Analyse statistique : one -way ANOVA ** p < 0.01, *** p < 0.001.
La figure 15 : quantification de la charge bactérienne dans le caecum du poulet de chaque groupe, mesurée par qPCR. Les résultats représentent la moyenne ± SEM.
La figure 16 : Calendrier du protocole de l'essai de vaccination in ovo. Seul le groupe « contrôle positif » a été vacciné à J1 avec le vaccin commercial (Poulvac).
La figure 17 : Mesure de l'infection bactérienne dans la trachée (ci-dessus) et les alvéoles (ci-dessous) des oiseaux de chaque groupe, évaluée sur 8 oiseaux, par most probable number (MPN). Les résultats représentent le nombre d'oiseaux positifs et négatifs par groupe.
La figure 18 : Analyse des slgA anti-E.coli dans les fèces de 8 oiseaux de chaque groupe après le challenge. Les résultats représentent la moyenne ± ET des titres d'Ac. Analyse statistique : Anova unidirectionnelle pour chaque jour.
La figure 19 : score des lésions du poumon de 8 oiseaux par groupe après le challenge. Les résultats représentent la moyenne de chaque groupe. Des analyses statistiques ont été faites pour chaque jour par one-way ANOVA.
La figure 20 : délivrance de bactéries E. coli entières a été évaluée dans des cellules H292. Les E. coli-
FITC fluorescentes, seules ou associées aux NP, ont été incubées avec des cellules H292 pendant 4h, et le pourcentage de cellules positives a été mesuré par cytométrie en flux. Les résultats représentent la moyenne ± SD de 2 expériences.
La figure 21 : délivrance de bactéries E. coli entières a été évaluée dans des cellules THP-1. Les E. col i- FITC fluorescentes, seules ou associées aux NP, ont été incubées avec des cellules THP-1 pendant 4h, et le pourcentage de cellules positives a été mesuré par cytométrie en flux. Les résultats représentent la moyenne ± SD de 2 expériences.
EXEMPLES
Abréviations :
• NPL : Nanoparticules de maltodextrine lipidées réticulées
• i.d : Intradermique
• i.n : Intranasal
• i.p : Intrapéritonéal
• i.m : Intramusculaire
EXEMPLE 1 : Optimisation de la formulation avec des nanoparticules cationiques
L'objectif de cette étude est de confirmer l'efficacité en tant que système de délivrance d'une composition, à base de nanoparticule et d'une souche E. coli entière inactivée, pour activer les cellules immunitaires.
1-A Matériel et méthodes :
A-Formulations vaccinales
Les nanoparticules cationiques (NPL) sont des nanoparticules de maltodextrine lipidées cationiques.
La composition a été réalisée avec une souche d'E. coli inactivée mélangées avec des nanoparticules cationiques. Les bactéries E. coli ont été inactivées avec du formaldéhyde à 0.4 %, puis purifiées par centrifugation. La quantité protéique a été mesurée par dosage micro BCA. La composition a été faite en mélangeant les bactéries tuées avec une solution aqueuse de NPL, à différents ratios de poids (lOOpg de protéines de E. coli avec 5, 10, 30, 50, 100 ou 300pg de NPL). La taille et la charge de surface de la formulation ont été caractérisées respectivement par diffusion dynamique de la lumière (DLS) et diffusion électrophorétique de la lumière (ELS) (Zetasizer NanoZS, Malvern Analytical, France), pour pouvoir observer si les nanoparticules recouvrent la surface des bactéries tuées.
B-Délivrance d'E. coli La capacité des NPL à augmenter la captation d'E. coli entière inactivée par les cellules immunitaires a été évaluée par cytométrie en flux et microscopie confocale.
• Marquage de E. coli avec de la fluorescéine :
Les bactéries inactivées ont été marquées avec de l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC), en mélangeant 5 mg d'E. coli avec 50pg de FITC (1%, Sigma, France) dans un tampon de carbonate de sodium à pH 8.3 pendant 2h. Elles ont ensuite été dialysées sur une cassette de dialyse lOkDa (Thermofisher, France). La teneur en protéines a été mesurée par dosage micro BCA (Pierce, France). Les bactéries marquées ont ensuite été associées à des NPL à différents rapports de poids.
• Cytométrie en flux :
Les lignées cellulaires H292 ont été ensemencées dans des plaques de 24 puits à raison de 50.000 cellules par puits, jusqu'à confluence. Les cellules ont ensuite été incubées avec l'équivalent de lpg de protéines seules ou associées à différents ratios de NPL, pendant 4 heures. Puis les cellules été lavées avec une solution saline de tampon phosphate (PBS), récoltées avec de la trypsine, et analysées par cytométrie en flux sur un Attune Nxt (ThermoFisher, France). Pour distinguer la délivrance intracellulaire des bactéries, à une fixation membranaire, les cellules ont été incubées avec 40 pg/mL de bleu Trypan (TB, Sigma France) pour quencher la fluorescence FITC externe.
• Microscopie confocale
Les lignées cellulaires H292 ont été ensemencées dans des chambres Labtek (Fisher Sci., France) à raison de 10.000 cellules par puits, jusqu'à confluence. Ensuite, les cellules ont été incubées avec l'équivalent de lpg de protéines seules des bactéries entières tuées ou associées aux NPL, pendant 4 heures. Les cellules ont été lavées, et le noyau a été coloré en incubant du Hoechst 33342 (Sigma, France) à 0.1 pg/mL pendant 5 minutes à 37°C. Les cellules ont ensuite été lavées et la membrane plasmique a été marquée avec de l'agglutinine (WGA, Invitrogen France) marquée au AF-633 à 1 pg/mL pendant 10 minutes à 37°C. Les lames ont été lavées à nouveau avec du PBS, fixées avec du formaldéhyde à 0.4 % pendant 20 minutes, et montées pour une observation au microscope (LSM 710 Zeiss, France).
1-B Résultats :
Caractérisation des formulations :
Figure imgf000020_0001
Tableau 1 : Caractérisation de la taille des formulations E. coli/NPL par diffusion dynamique de la lumière (DLS) et du potentiel zêta par diffusion électrophorétique de la lumière (ELS). Des E. coli entières inactivées ont été mélangées avec une quantité croissante de NPL.
Les analyses DLS et ELS ont montré que les E. coli inactivées avaient une taille homogène de 1.42 pm avec un PDI de 0.08, et une charge de surface anionique de -4.6 mV. Cela indique que la structure de la bactérie est restée intacte malgré l'inactivation. Lorsque des quantités croissantes de NPL ont été ajoutées, la taille globale n'a pas variée, mais le potentiel zêta a augmenté progressivement, jusqu'à devenir cationique à partir du ratio 1/0.5. Ceci indique que les bactéries ont été progressivement recouvertes par les NPL sans aucune agrégation.
La délivrance d'E. coli par les NPL a été évaluée par cytométrie de flux (voir Figure 1), sur des cellules épithéliales des voies respiratoires humaines (H292). Sans NPL, les bactéries ont été endocytées par 14 % des cellules. Comme aucune différence n'a été observée en présence de TB, cela suggère que les bactéries ont été réellement endocytées (à l'intérieur des cellules). Lorsqu'elles sont recouvertes par les NPL, les bactéries sont absorbées par au moins 40 % de cellules, ce qui confirme leur potentiel en tant que système de délivrance. De plus, la délivrance était significativement plus efficace avec une faible quantité de NPL, et la libération la plus importante a été observée avec un ratio 1/0.3 (77%) et 1/0.1 (75.7%). En présence de TB, 65.6 % des cellules étaient encore positives avec un ratio de 1/0.3 et 63 % avec un ratio de 1/0.1, ce qui confirme que la plupart des bactéries se trouvaient à l'intérieur des cellules. La délivrance intracellulaire a également été confirmée par microscopie confocale, avec un ratio 1/3. Environ 20 à 30 bactéries E. coli (vert) ont été observées dans chaque cellule, près des noyaux, confirmant la localisation intracellulaire.
Conclusion :
La formulation vaccinale E. coli/NPL est constituée de bactéries entières inactivées, recouvertes de NPL. Le recouvrement de cette bactérie, même avec une faible quantité de NPL, a un impact significatif sur la capacité de cette bactérie à être captée par les cellules.
EXEMPLE 2 : Essai de vaccination in ovo contre la colibacillose
2-A Matériel et méthodes :
A-Préparation des vaccins
Le vaccin est constitué de 3 souches d'E. coli inactivées mélangées à des nanoparticules de maltodextrine lipidées (NPL). En bref, les souches O78:K80, O1:K1, O2:K1 ont été inactivées avec 0.4% de formaldéhyde, et la teneur en protéines a été mesurée par dosage pBCA. Enfin, 33.3pg par souche ont été mélangés à la NPL pour obtenir lOOpg de protéines par dose de vaccin.
B-Animaux
Tous les travaux sur les animaux ont été évalués et approuvés par le Comité d'éthique pour la recherche sur les animaux d'Imunova Analises Biolôgicas, numéro de protocole 06/2021.
Pour cette expérience, une quantité de 390 œufs fertiles ont été acquis d'une couveuse commerciale et incubés, à l'unité expérimentale d'Imunova. Les œufs ont été répartis au hasard dans sept groupes expérimentaux différents et placés dans un couvoir industriel, avec un contrôle précis de la température, et de l'humidité, pendant 21 jours. Les groupes utilisés dans ce test étaient composés de 30 animaux et sont identifiés dans le tableau 1.
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Figure imgf000022_0001
Tableau 2 : Identification des groupes expérimentaux.
^ous les groupes, y compris le témoin négatif, ont reçu par voie orale le vaccin vivant atténué Mass I - H120, contre le virus de la bronchite infectieuse (VBI), à une dose 100 fois supérieure à celle recommandée par le fabricant, afin de sensibiliser les animaux à un challenge à E. coli. infection avec 108 CFU d' Escherichia coli, à la dose de 100 pL/oiseau par voie orale. Le challenge a été confirmée par la récupération microbiologique des bactéries de l'inoculum.
C-Vaccination
Les animaux du groupe 3 ont reçu, à J1 après l'éclosion, une dose de vaccin vivant Poulvac® E. coli. Les animaux du groupe 4 ont reçu, le 18eme jour d'incubation, une application in ovo du vaccin avec une dose vaccinale règlementaire de 50 pL. Après l'éclosion, les groupes de poulets de chair âgés d'un jour ont été logés dans des isolateurs (1,2 m2) et ont été nourris ad libitum selon les recommandations pour leur âge.
D-Challenge
À J10, tous les animaux, y compris ceux du groupe témoin négatif, ont reçu par voie orale un vaccin vivant atténué Mass I - H120, contre le virus de la bronchite infectieuse (VBI), à une dose 100 fois supérieure à celle recommandée par le fabricant.
À J14, les animaux du groupe 2, 3 et 4 ont été infecté par 108 UFC d'Escherichia coli (souche 19501, une souche différente de celle utilisée dans le vaccin), 100 pL/oiseau, par voie orale.
Le protocole vaccinal est représenté à la figure 3.
E-Échantillonnage
Les prélèvements et analyses ont été effectués sur 8 oiseaux, à J16, J20 ou J27.
F-Analyse
• Perméabilité intestinale :
La perméabilité intestinale a été évaluée par administration orale de FITC-Dextran, un marqueur fluorescent non absorbable (FITC-Dextran, 3000 à 4000 kDa), et identifié dans le plasma/sérum, pour suivre l'intégrité épithéliale gastro-intestinale (Vicuiïa et al., 2015).
Expression des cytokines L'expression des cytokines a été évaluée par qPCR (IL-ip, IFNy, IL-10, IL-4), en utilisant des amorces spécifiques pour chaque cible. Dans ce type d'analyse, chaque combinaison de cible et d'échantillon génère une valeur seuil, le Ct (cycle seuil) est une mesure relative de la concentration d'ARN messager (ARNm) spécifique à la cible dans l'échantillon. Cette valeur doit être normalisée en fonction de l'expression d'un certain gène de référence, dans ce cas, la moyenne géométrique des gènes GAPDH et ACTB a été utilisée, générant une valeur de ACt (Ct de la cible/Moyenne du Ct de GAPHD+ACTB) (Bustin et al., 2009). En plus de cette normalisation, les données ont également été normalisées par rapport à la moyenne des ACt du groupe contrôle, générant un AACt (ACt/moyenne des ACt Contrôle). Pour les résultats non définis, la valeur maximale de CT (40) a été considérée et, à des fins d'analyse, a été artificiellement modifiée à 41.
• Quantification des slgA anti-E. coli
La production d'IgA sécrétoires spécifique à E. coli a été évaluée par ELISA. En bref, les échantillons ont été dilués dans de la caséine à 1% dans du PBS. Les plaques ELISA ont été recouvertes de LPS d'E. coli (souche isolée sur le terrain). Les plaques ont ensuite été lavées trois fois avec 200 pL/puits de PBS + 0.05 % de Tween20 pendant 5 min/lavage. Les puits ont été bloqués avec 1% de caséine dans du PBS. Les échantillons ont été testés en dilution sérielle. Les plaques ont été lavées, et un anti IgA de poulet a été ajouté (BioRad) dilué dans 0,1% de caséine. Après lavage, le test a été révélé avec une solution de TM B (Life Technologies). L'absorbance a été lue à 450 nm.
• Détection et quantification d'E. coli
La détection et la quantification par MPN (Most probable number) d'E. coli a été effectuée selon la norme ISO 7251:2005. Les numérations d'E. coli ont été déterminées selon les méthodes microbiologiques standard (dilution dans un milieu d'enrichissement suivie d'un ensemencement dans un milieu sélectif/différent). En bref, les échantillons ont été enrichis dans de l'eau peptonée tamponnée (EPT), puis dans du bouillon EC et enfin dans des géloses EMB et MacConkey. Les échantillons ont été dilués en série en trois exemplaires dans l'EPB avant l'incubation, afin de permettre la quantification par la technique du nombre le plus probable (Blodgett et al., 2015). Pour la détection d'E. coli, seule l'étape de la dilution en série n'a pas été prise en compte. Les colonies suspectes isolées ont été testées par biochimie et confirmées.
Histologie hépatique : Les oiseaux ont été euthanasiés, et des échantillons de foie ont été collectés et fixés selon la méthode de Rebel et al (2011). Les échantillons ont été inclus dans de la paraffine et ont été montés sur des lames. Toutes les évaluations et lectures histopathologiques ont été effectuées au microscope par un vétérinaire histopathologiste expérimenté.
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Tableau 3 : Liste des paramètres histologiques pour le scoring des lésions hépatiques.
2-B Résultats : La perméabilité intestinale des oiseaux non vaccinés et non challengés (contrôle négatif) était de 0.26 pg/mL, et de 0.31 pg/mL pour les oiseaux challengés et non vaccinés (contrôle positif). Lors de la vaccination avec le vaccin commercial, la perméabilité était de 0,26 pg/mL, comme pour le contrôle négatif, ce qui confirme l'efficacité de ce vaccin. De plus, lorsqu'ils ont été vaccinés in ovo par la formulation VXN-E. coli, tous les oiseaux ont présenté une faible perméabilité (0,18 pg/mL), inférieure à celle du témoin négatif, bien que non significative.
A-sIgA intestinaux anti-E. coli (LPS) Les IgA sécrétoires anti-LPS dirigés contre E. coli ont été analysés dans les fèces par ELISA. L'absorbance obtenue pour les oiseaux du contrôle négatif était d'environ 0.05 UA, et de 0.095 pg/mL pour les oiseaux du contrôle positif, ce qui indique que le challenge oral n'a pas induit de sécrétion d'IgA intestinale. De plus, pour les oiseaux vaccinés par voie muqueuse avec le vaccin commercial, la DO est restée à 0.055 UA, comme pour le témoin négatif, ce qui suggère que ce vaccin n'a pas réussi à promouvoir une réponse humorale muqueuse. Au contraire, les oiseaux vaccinés in ovo avec la formulation VXN-E. coli ont présenté une DO significativement plus élevée de 0.16 UA.
B-Histopathologie du foie
Le score des lésions hépatiques a été mesuré 6 jours après le challenge. Les oiseaux du groupe témoin négatif avaient un score moyen d'environ 1, représentatif d'une discrète hyperplasie. Au contraire, les oiseaux non vaccinés du groupe témoin positif ont obtenu un score moyen de 2,35, suggérant des lésions hépatiques et une nécrose, induites par l'infection à E. coli. Lorsqu'ils ont été vaccinés avec le vaccin commercial, le score moyen des lésions de l'oiseau était de 1, comme dans le groupe témoin négatif. Les oiseaux vaccinés in ovo avaient un score moyen des lésions < 1. Ces résultats montrent que le vaccin commercial et la vaccination in ovo protègent contre les lésions hépatiques induites par E. coli.
Conclusion :
Ce premier essai indique que la vaccination in ovo avec le vaccin VXN-E. coli protège les oiseaux contre l'infection hépatique par E. coli et induit la sécrétion de slgA contre la bactérie dans l'intestin.
EXEMPLE 3 : vaccination in ovo contre un challenge léthal à E. coli
Ce deuxième essai était identique au premier essai in ovo en termes de calendrier, d'animaux par groupes et de traitement, mais avec un challenge léthal à E. coli. Les analyses ont ensuite été centrées sur la protection apportée par les vaccins contre la charge bactérienne dans les organes représentatifs, les anomalies physiologiques et la mortalité subséquente, observés dans chaque groupe.
3-A. Matériel et méthodes
A-Challenge
À J10, tous les animaux, y compris le témoin négatif, ont reçu par voie orale un vaccin vivant atténué Mass I - H120, contre le virus de la bronchite infectieuse (VBI), à une dose 100 fois supérieure à celle recommandée par le fabricant.
À J14, chaque animal du groupe déterminé a été confronté à 4.2xl012 CFU d' Escherichia coli (souche 19501), à raison de 100 pL/oiseau dans les sacs aériens.
Le calendrier général est détaillé à la figure 7.
B-Analyse
• Perméabilité intestinale :
La perméabilité intestinale a été évaluée par administration orale de FITC-Dextran, un marqueur fluorescent non absorbable (FITC-Dextran, 3000 à 4000 kDa), et identifié dans le plasma/sérum, pour suivre l'intégrité épithéliale gastro-intestinale (Vicuiïa et al., 2015).
• Détection et quantification d'E. coli :
La détection et la quantification par MPN (most probable number) d'E. coli a été effectuée selon la norme ISO 7251:2005. Les numérations d'E. coli ont été déterminées selon les méthodes microbiologiques standard (dilution dans un milieu d'enrichissement suivie d'un ensemencement dans un milieu sélectif/différent). En bref, les échantillons ont été enrichis dans de l'eau peptonée tamponnée (EPT), puis dans du bouillon EC et enfin dans des géloses EMB et MacConkey. Les échantillons ont été dilués en série en trois exemplaires dans l'EPB avant l'incubation, afin de permettre la quantification par la technique du nombre le plus probable (Blodgett et al., 2015). Pour la détection d'E. coli, seule l'étape de la dilution en série n'a pas été prise en compte. Les colonies suspectes isolées ont été testées par biochimie et confirmées.
Histologie intestinale : Les oiseaux ont été euthanasiés, et des échantillons intestinaux ont été collectés et fixés selon la méthode de Rebel et al (2011). Les échantillons d'iléon ont été inclus dans de la paraffine et ont été montés sur des lames. Toutes les évaluations et lectures histopathologiques ont été effectuées au microscope par un vétérinaire histopathologiste expérimenté.
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Tableau 4 : Liste des paramètres histologiques pour l'évaluation des lésions intestinale (iléon).
3-B. Résultats A-Éclosion Tl
Figure imgf000028_0001
Tableau 5 : Pourcentage d'éclosion dans le groupe vacciné in ovo par rapport aux groupes non vaccinés (contrôle négatif, contrôle positif, vaccin commercial).
L'éclosion a été mesurée dans cette étude afin d'évaluer la sûreté du vaccin in ovo VXN/E. coli. Ainsi, l'éclosion des œufs vaccinés (n=60) a été comparée à celle des œufs non vaccinés (n=180), et ce avant la randomisation dans chaque groupe (contrôle négatif, contrôle positif, et vaccin commercial). Un pourcentage similaire d'éclosion a été observé entre les œufs vaccinés (78,3 %) et non vaccinés (81,2 %). Par conséquent, la formulation du vaccin est sûre car elle n'a aucun impact sur l'éclosion.
B-Survie des oiseaux après challenge léthal
Le challenge par E. coli a été effectuée à J14 avec 4.2xl012 CFU et directement dans les sacs aériens. La survie des oiseaux après challenge léthal est représentée à la figure 8. Cette dose élevée a eu un impact sur la survie des oiseaux, puisque 26 % de mortalité a été observé chez les oiseaux non vaccinés. De plus, la mortalité a augmenté à 36 % chez les oiseaux vaccinés avec le vaccin mucosal commercial, ce qui suggère qu'il n'a pas induit de protection contre l'infection mortelle à E. coli. En revanche, elle n'était que de 10% pour les oiseaux vaccinés in ovo avec le vaccin VXN/E. coli, ce qui suggère une meilleure protection contre l'infection.
C-Quantification d'E. coli dans les sacs aériens par MPN
L'infection a été évaluée en quantifiant les bactéries dans les sacs aériens, par MPN. La mesure de la charge bactérienne dans les sac aériens par MPN est représentée à la figure 9. Les oiseaux du control négatif ne présentaient qu'une faible quantité de bactéries dans les sacs aériens, relative à la flore bactérienne naturelle. Les oiseaux non immunisés et challengés avaient une quantité plus élevée d'E. coli (104 MPN/g), ce qui confirme l'efficacité du challenge. Une infection significativement plus forte a été observée dans les sacs aériens des oiseaux vaccinés avec le vaccin mucosal commercial (106 MPN/g), corroborant les résultats de survie. En revanche, comme pour les résultats de survie, une infection plus faible a été observée pour les oiseaux vaccinés in ovo avec le vaccin E. coli/NPL (3xl03 MPN/g), confirmant son efficacité à protéger contre cette infection bactérienne.
D-Perméabilité intestinale
La perméabilité intestinale des oiseaux non vaccinés et non challengés était de 0.22 pg/mL, et de 0.18 pg/mL pour les oiseaux challengés et non vaccinés. La perméabilité intestinale est représentée à la figure 10. Lors de la vaccination avec le vaccin commercial ou in ovo avec le vaccin VXN/E. coli, la perméabilité a significativement diminué à 1.2 pg/mL, ce qui suggère une protection induite par la vaccination.
E-Histopathologie intestinale
Le score des lésions de l'iléon a été mesuré 6 jours après le challenge. Le score de lésion intestinal est représenté à la figure 11. Les oiseaux du groupe témoin négatif ont obtenu un score moyen inférieur à 1 (0.25), représentant un iléon sain et d'aspect normal, comme attendu. Au contraire, les oiseaux non vaccinés du groupe témoin positif ont obtenu un score moyen significativement plus élevé de 1.7, suggérant des lésions de l'iléon avec des troubles vasculaires et une desquamation, induits par l'infection à E. coli. De manière surprenante, lorsque les oiseaux ont été vaccinés avec le vaccin commercial, les lésions se sont significativement aggravées avec un score moyen de 2. Au contraire, les oiseaux vaccinés in ovo avaient un score moyen de 1, suggérant une protection contre les lésions intestinales induites par E. coli.
Conclusion :
Ce deuxième essai indique que le vaccin in ovo VXN-E. coli protège les oiseaux de la mortalité induite par une infection mortelle à E. coli. De plus, ce vaccin diminue la charge bactérienne dans les sacs aériens et les lésions intestinales dues à l'infection, confirmant l'intérêt de ce vaccin.
EXEMPLE 4 : Essai de vaccination intramusculaire contre Salmonella sur des poules pondeuses
2-A. Matériel et méthodes :
A-Préparation des vaccins
Le vaccin est fabriqué à partir d'une souche inactivée de Salmonella enteritidis mélangée à des nanoparticules lipidées de maltodextrine (NPL). En bref, la souche de Salmonella SE147 a été inactivée et la teneur en protéines a été mesurée par un test pBCA. Enfin, 200pg de bactéries tuées ont été mélangées soit avec des NPL (formulation nommée "Vaxinano 1") soit avec des NPL non réticulées (formulation nommée "Vaxinano 2"), à hauteur de 2OOpg de protéines par dose de vaccin. La NPL non réticulée est composée de maltodextrine cationique linéaire avec un noyau interne anionique.
B-Animaux
Pour cette expérience, un total de 84 poulets LSL (provenant d'une ferme d'élevage commerciale) ont été répartis au hasard dans 12 enclos (7 oiseaux/enclos) comme décrit dans le tableau 7. Le sérum a été collecté et testé pour le titre d'anticorps contre Salmonella (effectué par DGZ en utilisant le kit Biochek).
Figure imgf000030_0001
Tableau 6 : Identification des groupes expérimentaux.
C-Vaccination
A l'âge de W12, tous les poulets ont été vaccinés par voie IM dans la poitrine, avec soit 500pL d'une solution saline, soit 500pL de la formulation Vaxinano 1 ou Vaxinano 2 (contenant 200pg de protéines de Salmonella), soit avec le vaccin commercial. Un mois après, à W16, les animaux ont reçu une seconde dose de la même formulation vaccinale.
D-Challenge
Un mois après le boost, tous les animaux ont été challengés par voie intraveineuse avec 500pL de 1.3xl08 CFU de S. enteritidis SE147.
Le programme général est représenté figure 12.
E-Prélèvements
De W20 à W25, les œufs ont été collectés et analysés bactériologiquement individuellement pour la recherche de Salmonella. À W25, tous les poulets ont été euthanasiés, le sérum et le foie ont été collectés et stockés à -20°C. La rate et le caecum ont été analysés bactériologiquement pour la recherche de Salmonella.
F-Analyses
Ponte : Les œufs ont été collectés quotidiennement après le challenge (sauf le samedi) et stockés à 4°C. Le nombre d'œufs par groupe a été rapporté.
Infection : l'infection a été quantifiée par qPCR dans la rate et le caecum de chaque poulet à W25.
2-B. Résultats
A-Ponte des œufs
Le nombre moyen d'œufs pondus dans chaque groupe a été compté chaque jour après le test. La ponte d'œufs est représenté figure 13. Les poules vaccinées avec un vaccin fictif ont pondu un faible nombre d'œufs après le challenge, avec une moyenne de 2.6 œufs par jour, ce qui confirme l'infection de l'oiseau. Au contraire, les oiseaux vaccinés avec Salenvac ont pondu significativement plus d'œufs que le groupe control, avec une moyenne de 4.9 œufs par jour (p < 0.001), ce qui suggère une protection contre le challenge. De même, les deux formulations de Vaxinano ont permis aux poules de pondre significativement plus d'œufs, avec une moyenne de 4.3 œufs par jour pour Vaxinano 1 (p < 0.05) et 4.7 pour Vaxinano 2 (p < 0.001), suggérant une protection équivalente contre le challenge.
B-Infection du cæcum et de la rate
L'infection a été évaluée par une quantification de la charge bactérienne dans le cæcum et dans la rate.
L'infection après challenge a été évaluée par une quantification de la charge bactérienne dans le caecum et dans la rate. Cette quantification est représentée figure 14. Les poulets qui ont reçu une injection saline ont eu une importante infection, avec une infection moyenne de 400 UFC/g, mais avec plus de 50% d'oiseaux au-dessus de 1000 UFC/g. Au contraire, tous les oiseaux vaccinés avec la formulation de Vaxinano ou avec Salenvac ont eu une infection significativement plus faible, avec une moyenne d'infection inférieure au seuil des oiseaux vaccinés avec Vaxinano 1. Ceci confirme la forte protection apportée par la vaccination IM.
L'infection a finalement été quantifiée dans la rate. Cette quantification est représentée à la figure 15. Bien que l'infection ait été plus faible que dans le caecum, 77% des oiseaux vaccinés avec la solution saline étaient encore positifs dans la rate, alors que seulement 35% des oiseaux vaccinés avec Vaxinano 1, 36% des oiseaux vaccinés avec Vaxinano 2 et 35% des oiseaux vaccinés avec le vaccin commercial, confirmant la protection apportée par la vaccination IM. Conclusion :
Cet essai indique que le vaccin entier inactivé Salmonella/NP administré par voie intramusculaire protège les oiseaux d'une provocation par S. enteritidis, quelle que soit la formulation, ce qui permet aux oiseaux de pondre beaucoup plus d'œufs que les animaux non immunisés.
EXEMPLE 5 : Vaccination mucosale contre la colibacillose
Cet essai était planifié de la même manière que l'essai in ovo. Les analyses ont ensuite été centrées sur la protection apportée par les vaccins contre l'infection dans les organes cibles, les anomalies physiologiques et les titres d'anticorps muqueux.
5-A Matériel et méthode :
A-Préparation du vaccin
Le vaccin est fabriqué à partir de 3 souches de bactéries d'E. coli inactivées, mélangées à des nanoparticules de maltodextrine lipidées (NPL). Les souches O78:K80, O1:K1, O2:K1 ont été inactivées avec du formaldéhyde à 0,4% et la teneur en protéines a été mesurée par dosage BCA. Enfin, 33,3 pg par souche ont ensuite été mélangés avec du NPL à raison de 100 pg de protéines par dose de vaccin.
B-Animaux
Tous les travaux sur les animaux ont été évalués et approuvés par le comité d'éthique pour la recherche animale d'Imunova Analises Biologicas, numéro de protocole 06/2021.
Pour cette expérience, 150 poussins âgés d'un jour ont été acquis dans un couvoir commercial, et triés aléatoirement en cinq groupes expérimentaux, dans des unités d'isolement individuelles au sein d'Imunova, et ont été traités conformément au tableau suivant :
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Tableau 7 : Identification des groupes expérimentaux.
^ous les groupes, y compris le contrôle négatif, ont été infectés avec le vaccin vivant atténué Mass I - H120, contre le virus de la bronchite infectieuse (IBV), par voie orale, à une dose lOOx de celle recommandée par le fabricant afin de sensibiliser les animaux au challenge E. coli.
2 Infection par 108 UFC d'Escherichia coli, à une dose de 100 pL/oiseau par voie orale. L'infection a été confirmée par la récupération microbiologique des bactéries à partir de l'inoculum.
C-Vaccination
Les animaux des groupes 'Vaccin VXN SC', 'Vaccin VXN Mucosal' et 'Vaccin Commercial' (Poulvac® E. coli, Zoetis) ont reçu une primo-immunisation à J1 et une seconde dose à J12. Pour le « vaccin VXN mucosal » les administrations ont été faites dans l'œil, bec et narine et pour le « vaccin commercial » les doses ont été administrées dans l'eau de boisson.
D-Challenge
La souche du challenge était un isolat de terrain qui a été confirmé comme étant un APEC par identification par PCR de 5 gènes de pathogénicité (iuaT, iroN, ompC, iss, hly). Il a également été vérifié qu'il appartenait au phylogroupe F par la méthode de typage décrite par Clermont (Clermont et al., 2013). Tous les animaux ont reçu à J14 une dose lOOx de vaccin IBV atténué (souche Massachusetts H-120, Mass® I, Zoetis). Le challenge avec E. coli a été réalisée dans tous les groupes, sauf dans le « contrôle négatif » et 108 UFC/oiseau ont été utilisées.
Le calendrier global du protocole de l'essai de vaccination in ovo est présenté à la Figure 16.
E-Analyses
Quantification des IgA anti-E. coli : La production d'IgA spécifiques anti-E. coli a été évaluée par ELISA. En bref, les échantillons ont été dilués dans 1 % de caséine en PBS. Les plaques ELISA ont été tapissées de LPS d'E. coli (souche d'isolat de terrain). Les plaques ont ensuite été lavées trois fois avec 200 pL/puits de PBS + 0,05 % de Tween- 20 pendant 5 min/lavage. Les puits ont été bloqués avec 1 % de caséine en PBS. Les échantillons ont été testés par dilution en série. Les plaques ont été lavées et une IgA anti-poulet a été ajoutée (Bio- Rad) diluée dans 0,1 % de caséine. Après lavage, le test a été révélé avec une solution unique de TMB (Life Technologies). L'absorbance a été lue à 450 nm et la quantification a été réalisée avec une méthodologie/kit exclusif développé par Imunova.
Quantification et détection de l'infection à E. coli :
La détection d'E. coli par MPN (most probable number) a été effectuée sur la base de la norme ISO 7251:2005. Les numérations d'E. coli ont été déterminées selon les méthodes microbiologiques standard (dilution dans un milieu d'enrichissement suivie d'un étalement dans un milieu sélectif/différentiel). En bref, les échantillons ont été enrichis dans de l'eau peptonée tamponnée (BPW), suivis d'un bouillon EC et enfin d'un étalement dans de l'EMB et de la gélose MacConkey. Les échantillons ont été dilués en série en trois exemplaires dans du BPW avant l'incubation, pour permettre la quantification par la technique du MPN (Blodgett et al., 2015). Dans la détection d'E. coli, seule l'étape de dilution en série a été ignorée. Les colonies isolées suspectes ont été testées biochimiquement et confirmées.
Histologie des poumons :
Les oiseaux ont été euthanasiés et des échantillons pulmonaires ont été prélevés et fixés. Les échantillons ont été inclus dans de la paraffine et ont été montés sur des lames. Toutes les évaluations et lectures histopathologiques ont été effectuées au microscope par un histopathologiste vétérinaire expérimenté.
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Figure imgf000035_0001
Tableau 8 : Liste des paramètres histologiques pour l'évaluation des scores atteintes pulmonaires
5-B : Résultats Présence des E.coli dans les voies aériennes (MPN)
L'infection a été évaluée en quantifiant le nombre d'oiseaux infectés dans la trachée et dans les sacs aériens, par MPN. La mesure d'infection bactérienne dans la tachée et les alvéoles est représentée à la figure 17. Trois oiseaux non challengés étaient infectés dans la trachée et sept dans les sacs aériens, probablement en raison de la présence d'E. coli pathogènes naturels dans l'environnement. Au contraire, les oiseaux challengés non vaccinés étaient plus infectés dans la trachée confirmant l'efficacité du challenge. Le même nombre d'oiseaux était infecté dans le groupe recevant le vaccin commercial par rapport au groupe de contrôle infecté, suggérant une absence de protection. Cependant, parmi les oiseaux vaccinés avec le vaccin VXN mucosal, un seul oiseau était infecté dans la trachée et aucun dans les sacs aériens. Cela confirme que le vaccin VXN E. coli administré par voie muqueuse a protégé les oiseaux du challenge.
Présence d'sIgA anti E. coli slgA dans les fèces Les IgA sécrétoires anti-LPS d'E. coli ont été analysées dans les fèces, par ELISA. Les résultats de l'analyse des slgA anti-E.co// sont représentés figure 18. De J16 à J28, le titre d'Ac des oiseaux du contrôle négatif était le même que celui du contrôle positif, indiquant que le challenge oral n'a pas induit de sécrétion d'IgA intestinales. Cependant, pour les oiseaux vaccinés par voie muqueuse, tant avec la formulation VXN E. coli qu'avec le vaccin commercial, une augmentation significative des titres d'Ac a été observée à J21. Le vaccin muqueux a ainsi pu induire une réponse humorale au niveau de l'intestin.
Score clinique dans les
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Les scores des lésions pulmonaires ont été mesurés de J16 à J28. Les scores des lésions sont représentés à la figure 19. Bien qu'ils aient eu le score histopathologique le plus bas de J16 (score = 2) à J28 (score = 1,7), les oiseaux du groupe témoin négatif présentaient une endobronchite, une exsudation mucofibrineuse et une infiltration de neutrophiles polynucléaires, ce qui est probablement lié à l'infection naturelle (Figure 17). De plus, les oiseaux challengés non vaccinés du groupe témoin positif avaient le score le plus élevé, de 3,4 à J16 et 2,7 à J28, en raison de la provocation par E. coli. Au contraire, les oiseaux vaccinés par voie muqueuse avec la formulation VXN-E. coli avaient un score lésionnel moyen de 2,3 à J16, inférieur au vaccin commercial (score = 2,9). Enfin, à J28, les deux groupes d'oiseaux vaccinés par voie muqueuse avaient un score comparable au témoin négatif (1,6 pour le vaccin commercial, 1,8 pour le vaccin VXN) suggérant une protection contre les lésions pulmonaires induites par l'infection E. coli.
EXEMPLE 6 : Optimisation de la formulation avec différentes particules cationiques
Une étude a été réalisée sur une souche d'E. coli entière inactivée, pour comparer des formulations préparées avec différentes particules à base de maltodextrine, en mesurant leur captation par les cellules immunitaires in vitro.
6-A Matériel et méthodes :
A- Formulations vaccinales
Les formulations vaccinales ont ici été réalisées avec une des souches d'E. coli inactivées utilisées dans le vaccin (11101), mélangée à des nanoparticules de maltodextrine (NP+) ou lipidées (NPL), ainsi qu'à de la maltodextrine cationisée mais non réticulée, simple (NP+NR) ou lipidée (NPL-NR). Les nanoparticules recouvrent d'une manière partielle à très partielle les bactéries.
B- Synthèse des particules et caractérisation Les NP+ sont des nanoparticules synthétisées à partir de maltodextrine cationique et réticulée. Plus précisément, la synthèse consiste en de la maltodextrine (Roquette, France) dissoute dans une solution de NaOH 2M sous agitation magnétique et à température ambiante. De l'épichlohydrine (Merck groupe, France) a ensuite été ajoutée comme agent de réticulation, ainsi que du glycydyltrimethylammonium (GTMA, Merck groupe, France) comme agent cationisant. Le gel obtenu a ensuite été neutralisé à l'acide acétique, puis broyé à travers un homogénéisateur à très haute pression (LM20, Microfluidics, France). Le broyât a enfin été purifiée par filtration à flux tangentiel (AKTA flux 6, GE Healthcare, France) à travers une membrane de 750 kDa (GE Healthcare, France) pour obtenir des NP+ purifiée. Ces NP+ sont capables d'encapsuler des antigènes provenant de divers agents pathogènes (virus, bactéries ou parasites) et de les délivrer aux cellules immunitaires (1).
De même, les NPL sont des NP+ dans lesquelles un cœur de phospholipides anioniques (DPPG) a été ajouté. Plus précisément, une solution de dipalmitoyl-phosphatidylglycerol (DPPG, Lipoid, Allemagne) est dissoute dans du solutol, puis est injectée dans une solution de NP+ sous agitation, à un pourcentage massique de 70%. Les phospholipides s'incorporent dans le cœur de la nanoparticule, formant ainsi des NPL. Ces NPL et sont également capables d'encapsuler des antigènes provenant de divers agents pathogènes (virus, bactéries ou parasites) et de les délivrer aux cellules immunitaires (2- 4).
Enfin, les NP+NR et NPL-NR constituent leurs équivalents respectifs, synthétisés selon le même schéma de synthèse mais sans agent de réticulation, formant ainsi des polymères cationiques linéaires.
Les particules ont été caractérisées selon leur taille par diffusion dynamique de la lumière (DLS) et selon leur charge de surface (ou potentiel zêta) par diffusion électrophorétique de la lumière (ELS), à l'aide d'un Zetasizer Nano ZS (Malvern, France).
C - Inactivation des bactéries E.coli
Les bactéries ont été inactivées avec du formaldéhyde à 0.4 %, puis purifiées par centrifugation. La quantité protéique des bactéries entières a été mesurée par dosage micro BCA. La formulation a été faite en mélangeant les bactéries tuées avec une solution aqueuse particules, à différents ratios de poids (lOOpg de protéines de E. coli avec 1, 5, 10, 30, 50 ou 100 pg de particules).
D- Délivrance d'E.coli dans les cellules par les particules La capacité des particules à augmenter la captation par phagocytose d'E.coli entières inactivées par les cellules épithéliales et en macrophage a été évaluée par cytométrie en flux.
Marquage des protéines avec de la fluorescéine :
Les E.coli inactivées ont été marquées avec de l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC), en mélangeant 5 mg d'E. coli avec 50pg de FITC (1% w/w, Merck, France) dans un tampon de carbonate de sodium à pH 8.3 pendant 2h. Elles ont ensuite été dialysées sur une cassette de dialyse lOkDa (Thermofisher, France). La teneur en protéines des bactéries entières a été mesurée par dosage micro BCA (Pierce, France). Les bactéries marquées ont ensuite été associées aux particules à différents rapports de poids.
E- Cytométrie en flux :
Les lignées cellulaires H292 ont été ensemencées dans des plaques de 24 puits à raison de 50.000 cellules par puits, et traitées après 3 jours de culture. Les lignées cellulaires THP-1 ont été ensemencées dans des plaques de 24 puits à raison de 100.000 cellules par puits, et différenciées en macrophage avec 20ng/mL de PMA pendant 24h. Après avoir changé le milieu de culture, les cellules ont été incubées avec l'équivalent de lpg de bactérie tuées, seules ou associées aux particules, pendant 4 heures. Les cellules ont ensuite été lavées avec une solution saline de tampon phosphate (PBS), récoltées avec de la trypsine, et analysées par cytométrie en flux sur un Attune Nxt (ThermoFisher, France).
6-B Résultats :
Caractérisation des particules
Figure imgf000038_0001
Tableau 9 : Caractérisation de la taille des différentes particules (Z-average et Number) ainsi que de leur charge de surface (potentiel zêta). Les caractéristiques physicochimiques des différentes particules ont été analysées après leur synthèse (Tableau 9). Les NP+ avaient un diamètre de 33 nm ainsi qu'une charge de surface de 36 mV, et les NPL avaient un diamètre de 36 nm et une charge de surface de 39 mV, indiquant que les phospholipides étaient bien associés aux particules non pas à leur surface mais à l'intérieur de leur structure de maltodextrine.
Les NP+NR présentaient un diamètre de 17 nm pour une charge de surface de 32 mV, et les NPL-NR avaient un diamètre de 23 nm avec une surface de 38 mV, indiquant de la même manière que les phospholipides étaient bien associés à l'intérieur de la structure de maltodextrine.
En l'absence d'agent réticulant, les particules obtenues semblaient avoir un diamètre inférieur. En effet, sans agent réticulant, la maltodextrine en solution devrait rester majoritairement linéaire, mais elle pourrait également se replier sur elle-même à la faveur de liaison hydrophobes, formant ainsi des nanoparticules détectées lors de l'analyse.
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ès association avec les
Figure imgf000039_0002
La délivrance d'E. coli par les particules a tout d'abord été évaluée sur des cellules épithéliales respiratoires (H292). Sans particules, les bactéries n'ont pas été endocytées par les cellules (Figure 2). Lorsqu'elles étaient recouvertes par les particules, leur captation a grandement augmenté, atteignant 20 à 50 % de cellules positives, et ce quelles que soient les particules utilisées. Par ailleurs, l'amélioration de la phagocytose a pu être observée dès le ratio 1/0.01 ce qui démontre qu'une faible quantité de particules recouvrant partiellement les bactéries est suffisante pour améliorer la délivrance intra-cellulaire.
De même, la phagocytose d'E.coli par les particules a été évaluée sur les macrophages différenciés (THP-1). Sans particules, les bactéries ont été phagocytées par 0.2% des cellules (Figure 3). Lorsqu'elles furent recouvertes par les particules, leur phagocytose a augmenté pour atteindre 4 à 15% de cellules positives selon les ratios. Par ailleurs, l'amélioration de la phagocytose a pu être observée dès le ratio 1/0.01 ce qui démontre à nouveau qu'une faible quantité de particules recouvrant les bactéries est suffisante pour améliorer la délivrance des bactéries.
Conclusion
L'adhésion et la captation des bactéries par les cellules épithéliales respiratoires et par les macrophages peuvent être améliorées par des nanoparticules de maltodextrine cationisées simples (NP+) ou lipidées (NPL), ainsi que par de la maltodextrine cationique non réticulée, simple (NP+NR) ou lipidée (NPL-NR), et ce de manière équivalente entre les NP. Une faible dose de particules (10 à 100 fois moins de particules que de bactéries en %massique) est suffisante pour améliorer cette délivrance aux cellules.

Claims

REVENDICATIONS
1. Composition vaccinale sans adjuvant comprenant des nanoparticules cationiques constituées d'un noyau de polysaccharide et au moins une bactérie inactivée, caractérisée en ce que ladite bactérie est entière et en ce que lesdites nanoparticules cationiques recouvrent ladite bactérie.
2. Composition vaccinale selon la revendication 1, dans laquelle lesdites nanoparticules cationiques recouvrent ladite bactérie dans un ratio protéines bactériennes : NP supérieur ou égal à 1 (en poids).
3. Composition vaccinale selon la revendication 2, dans laquelle ledit ratio protéines bactériennes : NP est supérieur ou égal à 5 (en poids).
4. Composition vaccinale selon l'une des revendications 1 à 3, dans laquelle lesdites nanoparticules sont des nanoparticules cationiques constituées d'un noyau polysaccharide réticulé et non chargé en lipide constitué (i) d'un polysaccharide choisi parmi l'amidon, le dextrane, le chitosan, la dextrine, et la maltodextrine, des poly-fructoses (inuline), poly- mannoses, poly-galactoses, poly-galacto-mannanes (gomme de guar) (ii) d'un au moins un ligand cationique choisi parmi une amine primaire, secondaire, tertiaire ou des ammoniums quaternaires, et (iii) d'un agent de réticulation est choisi parmi l'épichloridrine, un diacide carboxylique ou un chlorure d'acide, tel que l'acide sébacique.
5. Composition vaccinale selon l'une des revendications 1 à 3, dans laquelle lesdites nanoparticules sont des nanoparticules cationiques constituées d'un noyau polysaccharide non réticulé et non chargé en lipide constitué (i) d'un polysaccharide choisi parmi l'amidon, le dextrane, le chitosan, la dextrine, et la maltodextrine, des poly-fructoses (inuline), poly- mannoses, poly-galactoses, poly-galacto-mannanes (gomme de guar) et (ii) d'un au moins un ligand cationique choisi parmi une amine primaire, secondaire, tertiaire ou des ammoniums quaternaires.
6. Composition vaccinale selon l'une des revendications 1 à 3, dans laquelle lesdites nanoparticules sont des nanoparticules cationiques constituées d'un noyau polysaccharide réticulé et chargé en phospholipides constitué (i) d'un polysaccharide choisi parmi l'amidon, le dextrane, le chitosan, la dextrine, et la maltodextrine, des poly-fructoses (inuline), poly- mannoses, poly-galactoses, poly-galacto-mannanes (gomme de guar), (ii) d'un au moins un ligand cationique choisi parmi une amine primaire, secondaire, tertiaire ou des ammoniums quaternaires, (iii) d'un agent de réticulation est choisi parmi l'épichloridrine, un diacide carboxylique ou un chlorure d'acide, tel que l'acide sébacique, et (iv) d'un phospholipide anionique choisi parmi le glycérol de diacylphosphatidyle, la sérine de diacylphosphatidyle ou l'inositol de diacylphosphatidyle.
7. Composition vaccinale selon l'une des revendications 1 à 3, dans laquelle lesdites nanoparticules sont des nanoparticules cationiques constituées d'un noyau polysaccharide non réticulé et chargé en phospholipide constitué (i) d'un polysaccharide choisi parmi l'amidon, le dextrane, le chitosan, la dextrine, et la maltodextrine, des poly-fructoses (inuline), poly- mannoses, poly-galactoses, poly-galacto-mannanes (gomme de guar), (ii) d'un au moins un ligand cationique choisi parmi une amine primaire, secondaire, tertiaire ou des ammoniums quaternaires, et (iii) d'un phospholipide anionique choisi parmi le glycérol de diacylphosphatidyle, la sérine de diacylphosphatidyle ou l'inositol de diacylphosphatidyle.
8. Composition vaccinale selon l'une des revendications 4 à 7, dans lequel ledit noyau de polysaccharide cationique comprend de la maltodextrine et un glycidyltriméthylammonium.
9. Composition selon l'une des revendications 6 ou 7 dans laquelle ledit noyau de polysaccharide cationique est chargé en phospholipide anionique choisi parmi le glycérol de diacylphosphatidyle, la sérine de diacylphosphatidyle ou l'inositol de diacylphosphatidyle.
10. Composition vaccinale selon l'une des revendications précédentes, comprenant au moins 2 souches différentes de bactéries.
11. Composition vaccinale selon l'une des revendications précédentes, dans laquelle ladite bactérie est choisie dans le groupe suivant : Salmonella enterica ser.Typhi; Streptococcus Pneumoniae; Haemophilus influenzae type b; Mycobacterium tuberculosis; Extraintestinal pathogenic E.Coli (ExPEC); enterotoxigenic E.Coli (ETEC); S.enterica ser.; Paratyphi A; Neisseria Gonorheae; Clostridium Difficile; Campylobacter spp; Shigella spp; Staphylococcus Aureus; Helicobacter pylori.
12. Composition vaccinale telle que à l'une des revendications des revendications précédentes, pour son utilisation sous une forme adaptée à une administration par voie intra-musculaire, mucosale ou par administration in ovo.
13. Composition vaccinale selon l'une des revendications précédentes, pour son utilisation dans la prévention d'une infection bactérienne chez un mammifère ou un oiseau.
14. Composition vaccinale selon l'une des revendications précédentes, pour son utilisation dans la prévention de la salmonellose, de la colibacillose ou de la campylobactériose.
15. Composition selon la revendication 14, pour son utilisation dans la prévention d'une infection bactérienne chez l'embryon de volaille in ovo.
PCT/EP2024/053960 2023-02-16 2024-02-16 Composition vaccinale comprenant un systeme de delivrance d'une bacterie entiere inactivee via des nanoparticules polysaccharidiques cationiques sans adjuvant WO2024170728A1 (fr)

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