WO2022008848A1 - Procede de preparation d'une composition vaccinale a partir d'antigenes lyophilises - Google Patents

Procede de preparation d'une composition vaccinale a partir d'antigenes lyophilises Download PDF

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WO2022008848A1
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poly
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Didier Betbeder
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Vaxinano
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Definitions

  • the invention relates to the field of extemporaneous preparation of vaccine composition from freeze-dried antigens. More particularly, the invention relates to the use of cationic nanoparticles to solubilize freeze-dried antigens without the addition of lyophilization adjuvant with a view to extemporaneous use for the administration of a vaccine composition. In a particular embodiment, it makes it possible to prepare a vaccine formulation or to add one or more valences to a previously formulated vaccine composition.
  • a pharmaceutical composition comprising as active ingredient a mixture of: (i) a solid nanoparticle comprising a cationic polysaccharide core, said core being porous and loaded with at least one phospholipid anionic; and -(ii) at least one antigen obtained from an intracellular pathogen; and (iii) a pharmaceutically acceptable solvent.
  • Means of vaccine molecular transport are also known from the state of the art. Mention may be made of application WO98/29099A2 which discloses a method for the administration in the mucous membranes of a substance to a mammal thanks to a biovector which comprises a natural polymer, or a derivative or a hydrolyzate of a natural polymer, or a mixture of these. Mention may also be made of application FR2803526A1 which discloses a polymeric matrix characterized in that it comprises a macromolecular hydrophilic matrix bearing a positive or negative ionic charge and in which is incorporated a lipid phase of opposite sign to that of the matrix. Said matrix can be used in particular for the transport of antigens for vaccine use.
  • Albumin is conventionally used to solubilize small lipophilic molecules.
  • application FR3005858 which describes the preparation of soluble antimalarial compositions comprising nanoparticles.
  • albumin is used as an agent for solubilizing the antimalarial molecule, and the authors show that the therapeutic properties are not lost.
  • freeze-drying adjuvants such as arginine and histidine have also been described as facilitating the solubilization of freeze-dried proteins.
  • Application EP 0638091 describes the preparation of a complex composition of freeze-dried Factor VIII which, on contact with water, is reconstituted in less than one minute at room temperature.
  • This preparation comprises (i) adding a solubilizing agent comprising arginine, in an amount sufficient to increase the solubility of Factor VIII, and histidine to the aqueous solution to thereby form a Factor VII solution l/ arginine/histidine wherein the histidine is present in the Factor VII l/arginine/histidine solution at a concentration of 0.025M and (ii) lyophilizing the Factor VII l/arginine/histidine solution to thereby give a complex composition of Factor VIII with increased solubility.
  • Application EP 2458990 also proposes using arginine and histidine, but also sucrose and mannitol.
  • these lyophilization adjuvants can have undesirable effects, in particular if the extemporaneous composition reconstituted from freeze-dried proteins is intended for vaccine use.
  • the solubilization of freeze-dried proteins poses a problem due to the heterogeneity of the characteristics of the antigens, or the presence of adjuvants associated with these proteins.
  • the inventors have developed a method making it possible to simply and quickly prepare a vaccine composition from freeze-dried antigens; this process is based on the use of cationic nanoparticles dissolved in an aqueous medium. Unlike conventional solubilization processes, this process does not require the addition of freeze-drying adjuvant.
  • the invention relates to a method for preparing a vaccine composition from a freeze-dried antigen comprising the steps of:
  • an aqueous solution comprising a cationic nanoparticle consisting of a cationic polysaccharide core and associated or not with antigenic proteins. Solubilize said freeze-dried antigen in said aqueous solution. Incubate the composition thus obtained at ambient temperature.
  • solubilization process is simple and fast; indeed, it suffices to resuspend the freeze-dried antigens in the solution of nanoparticles, to mix them and to leave to incubate at ambient temperature. An extemporaneous composition is thus obtained in less than 30 minutes.
  • the composition does not contain any solubilizing agent (other than the nanoparticles themselves), which avoids the undesirable effects associated with this type of molecule.
  • the vaccine composition contains only freeze-dried antigens, it also does not contain any vaccine adjuvant. This is advantageous since the mineral adjuvants (namely mineral salts such as aluminum salts) remain in the body for a very long time (several decades).
  • Nanoparticles therefore play a quadruple role: solubilizing agent, stabilizing agent and antigen transport vector, and vaccine adjuvant.
  • the solubilization of hydrophobic or hydrophilic proteins is obtained thanks to the nanoparticles, whatever the size of the proteins. Small proteins are absorbed by the nanoparticles. Large proteins are surrounded by nanoparticles, which prevents them from aggregating together.
  • antigens of different sizes for example a mixture of antigens obtained by grinding the whole pathogen.
  • the antigenic presentation is broad spectrum and the chances of successful vaccination are increased compared to conventional approaches based on the choice of an antigen, or a mixture of determined or poorly presented antigens.
  • the present invention represents a technological advance in the field of vaccines.
  • the antigen preparations in solution used today are not stable for more than a few months and must therefore be produced regularly, with destruction of the stocks of unused antigens.
  • the present invention makes it possible to provide a solution to this problem by making it possible to solubilize antigens stored for months or years in freeze-dried form. It is therefore possible, thanks to the use of cationic nanoparticles, to (re)solubilize on a custom basis and extemporaneously, any antigenic preparation stored in freeze-dried form.
  • the management of antigen preparation stocks is improved, allowing a reduction in costs and more flexibility in the preparation of vaccines.
  • Another advantage of the invention is that it makes it possible to add antigens to existing vaccines in order to increase their valency.
  • the antigens to be added available in freeze-dried form, are added to the existing vaccine composition in which cationic nanoparticles have previously been added.
  • the invention relates to a method for preparing a vaccine composition from at least one lyophilized antigen comprising the steps of:
  • Providing an aqueous solution comprising a cationic nanoparticle consisting of a cationic polysaccharide core, said nanoparticle being associated or not with antigenic proteins Add said freeze-dried antigen to said aqueous solution. Incubate the composition thus obtained at room temperature.
  • the aqueous solution comprises the nanoparticles necessary for the solubilization of the freeze-dried antigens.
  • the addition of the aqueous solution and the incubation allow the solubilization of the freeze-dried antigen.
  • the method according to the invention makes it possible to increase the valence of a monovalent or multivalent vaccine composition.
  • valence is meant the part of a vaccine corresponding to the protection against a single germ.
  • a multivalent vaccine can protect against several germs causing the same disease (such as the 13-valent pneumococcal vaccine) or against different diseases (such as the measles-mumps-rubella vaccine).
  • said aqueous solution comprises at least one antigenic protein.
  • the antigenic protein (from the initial vaccine composition) is combined with the nanoparticles before adding the freeze-dried antigen. It is possible to add one or more freeze-dried antigens to the initial vaccine composition.
  • cationic nanoparticle consisting of a cationic polysaccharide core
  • a solid nanoparticle comprising a cationic polysaccharide core.
  • the NP can be cross-linked or not. Its core may or may not be charged with an anionic phospholipid. This NP is not surrounded by any phospholipid layer.
  • the cationic polysaccharide forming the core of the NP is a non-crosslinked polymer obtained by the reaction between a polysaccharide chosen from starch, dextran, dextrin, and maltodextrin, poly-fructoses ( inulin), poly-mannoses, poly-galactoses, poly-galacto-mannans (guar gum) and at least one cationic ligand chosen from a primary, secondary, tertiary amine or quaternary ammoniums.
  • the core is not loaded with lipids.
  • the cationic polysaccharide forming the core of the NP is a cross-linked polymer obtained by the reaction between a polysaccharide chosen from starch, dextran, dextrin, and maltodextrin, poly-fructoses (inulin ), poly-mannoses, poly-galactoses, poly-galacto-mannans (guar gum) and at least one cationic ligand chosen from a primary, secondary, tertiary amine or quaternary ammoniums, then the addition of a cross-linking.
  • the crosslinking agent is chosen from epichloridrine, a dicarboxylic acid or an acid chloride, such as sebacic acid.
  • the core is not loaded with lipids.
  • the cationic polysaccharide is obtained by the reaction between maltodextrin and glycidyltrimethylammonium, whether the NP is crosslinked or not.
  • the cationic polysaccharide forming the core of the NP is loaded with an anionic phospholipid.
  • This anionic phospholipid can be chosen from diacylphosphatidyl glycerol, diacylphosphatidyl serine or diacylphosphatidyl inositol.
  • the anionic phospholipid is dipalmitoylphosphatidylglycerol (DPPG).
  • DPPG dipalmitoylphosphatidylglycerol
  • the cationic polysaccharide forming the core of the NP is not cross-linked.
  • the NP is a nanoparticle of maltodextrin loaded with DPPG.
  • the cationic polysaccharide forming the core of the NP is not loaded with lipids and is not crosslinked.
  • NPs are cross-linked or not, and loaded with lipids or not, can be combined to give four types of NP:
  • Non-crosslinked NP not loaded with lipids (NP+ NR)
  • Non-crosslinked NP loaded with lipids NPL NR
  • the NPs in solution are used to solubilize a freeze-dried antigenic formulation.
  • a freeze-dried antigenic formulation can be ready for use or custom made from different freeze-dried antigens.
  • the process for preparing a composition according to the invention makes it possible to add one or more valences to an existing vaccine composition, already formulated.
  • the aqueous solution in which said freeze-dried antigen is resuspended is a vaccine composition comprising at least one other antigen already in solution associated with said cationic nanoparticle.
  • the steps of this process consist of:
  • NPs consisting of a cationic polysaccharide core as defined previously
  • the invention relates to a method for adding a new valence to a vaccine composition, it can be defined by the steps of:
  • This method is particularly advantageous for preparing multivalent vaccines from vaccines already formulated, which was not possible until then.
  • freeze-dried antigen within the meaning of the invention, is meant an antigenic protein, a mixture of antigenic proteins, or a partial or total extract of a pathogen.
  • the pathogen extract may contain proteins, polysaccharides and lipids.
  • the protein can be hydrophilic or lipophilic.
  • the antigens can be purified, alone or in combination.
  • Antigenic proteins can be lipophilic or hydrophilic.
  • the antigenic protein mixture is composed of one or more purified antigens or a pathogen extract.
  • the pathogen extract can be a total extract or a partial extract.
  • the antigen is a protein complex extract obtained from a whole pathogen.
  • the pathogen can be a parasite, a virus, a bacterium, a mycobacterium and a fungus.
  • a virus selected from herpes simplex virus 1 and 2, human papillomavirus, cytomegalovirus, mycobacterium tuberculosis, dengue, HIV, respiratory syncytial virus (RSV), hepatitis A virus, hepatitis B virus and hepatitis C virus, a coronavirus such as SARS-Cov2, rabies virus, or a veterinary virus such as African horse sickness virus, African swine fever virus, Virus Andes, Avian influenza virus, Equine influenza virus, Bluetongue virus, Chapare virus, Chikungunya virus, Choclo virus, Crimean-Congo hemorrhagic fever virus, Dengue virus, Dobrava-Belgrade virus , Eastern Equine Encephalitis Virus, Ebola virus, Ebola virus, Ebola virus, a virus selected from her
  • an intracellular parasite selected from Acanthamoeba spp., Babesia spp., Balantidium coli, Blastocytis, Dientamoebafragiiis, Entamoebahistolytica, Giardia lemblia, Isospora belli, Leishmania spp., Naegleriafowleri, Rhinosporidium seeberi, Trichomonasvaginalis, Trypanosomabrucei and Trypanosomacruzi, spp, Neospora caninum, Sarcocystis spp, Plasmodium spp (Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale, Plasmodium malariae, Plasmodium knowlesi for instance,) and Cryptosporidium spp.
  • a bacterium chosen from the strains Aeromonas hydrophila, Afipiafelis, Actinomyces israelii, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Achromobacter xylosoxidans, Acinetobacter baumannii, Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Bartonella henselae, Bartonella ciarridgeiae, Bordetella pertussis (bacillus of Bordet and Gengou), Bordetella para pertussis, Bordetella bronchiseptica, Borrelia burgdorferi, Borrelia recurrentis, Brucella, Burkholderia cepacian, Burkholderia mallei, Burkholderia pseudomallei (Whitmore's bacillus), Campylobacter coli, Campylobacter fetus, Campylobacter jejuni, Cardiobacterium hominis, Chlamydia
  • Mycoplasma pneumoniae Mycoplasma hominis, Mycoplasma genitalium, Neisseria gonorrhoeae (gonococcus), Neisseria meningitidis (meningococcus), Nocardia, Pantoea agglomerons, Pasteurella multocida, Plesiomonas shigelloides, Pneumococcus (usual name of Streptococcus pneumoniae), Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Providencia stuartii, Pseudomonas aeruginosa, pyocyanin bacillus, see Pseudomonades, Porphyromonas gingivalis, Rickettsia, Salmonella enterica (or salmonella), Serratia marcescens, Serratia proteamaculans, Shigella dysenteriae (or shigella), Shigella boy
  • a fungus selected from Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus, Aspergillus clavatus, Blastomyces dermatitidis, Candida albicans, Candida auris, Coccidioides immitis, Cryptococcus neoformans, Cryptococcus gattii, Histoplasma capsulatum, Mucormycosis, Paracoccidioides brasiliensis, Pneumocystis jirovecii, Pneumocystis Pneumoniix schenporothrickii , Stachybotrys chartarum, Talaromycosis
  • the NPs used for the preparation of the vaccine compositions form porous structures having the capacity to absorb the free antigens or to cover them so as to allow their solubilization in an aqueous solution.
  • the proteins thus solubilized are stabilized.
  • the method according to the invention therefore makes it possible to solubilize freeze-dried antigens in an aqueous solution without using a solubilization adjuvant.
  • the solution in which the lyophilized antigen is dissolved is for example an aqueous solution or a buffered solution, suitable for use in the context of a vaccine use.
  • this composition may contain vaccine or even solubilization adjuvants, without this calling into question the implementation of the method according to the invention, when an antigen is added in said vaccine composition.
  • “solubilization adjuvant” also called “freeze-drying adjuvant”
  • an agent allowing the solubilization of proteins as well as the stabilization of proteins.
  • surfactants like tween, empigen, triton, saccharides like sucrose, polyols like mannitol, inositol, polymers like Polyvinylpyrrolidone (PVP), ...
  • vacunaser adjuvant within the meaning of the invention, is meant an immuno-modulating agent.
  • adjuvants can be hydrophilic such as oligodeoxynucleotides (CpG), or lipophilic such as squalene, MPL, QS-21...
  • the NPs are not considered as adjuvants but as agents for solubilizing and delivering antigens.
  • the protein/nanoparticle (weight/weight) ratio is between 1/10 and 1/1. In a preferred embodiment, the protein/nanoparticle ratio is between 1/1 and 1/4, in particular 1/3.
  • the aqueous solution After adding the freeze-dried antigens, the aqueous solution is incubated at room temperature.
  • the incubation time can typically be between 3 minutes and 1 hour, preferably between 5 min and 30 minutes; it can be extended for 1 year without affecting the process.
  • the composition obtained can either be used directly as a vaccine composition, or be used to solubilize other freeze-dried proteins.
  • at least two different freeze-dried protein extracts are dissolved in the aqueous solution containing the nanoparticles. These different protein extracts may come from different pathogens or contain antigens from different strains of the same pathogen.
  • compositions obtained according to the invention can be used as a vaccine in the veterinary field or in human health.
  • FIG.l Figure 1: PAGE under native conditions of compositions comprising BSA or a total extract of E. Coli (ET) and NPLs as well as the addition of BSA/NPL in a composition comprising ET.
  • ET E. Coli
  • FIG.2 PAGE under native conditions of compositions comprising BSA or a total extract of E. Coli (ET) and NPLs as well as the addition of ET/NPL in a composition comprising BSA.
  • E. Coli E. Coli
  • FIG.3 PAGE under native conditions of compositions comprising BSA or a total extract of E. Coli (ET) and NPL NR as well as the addition of BSA/NPL NR in a composition comprising ET.
  • ET E. Coli
  • FIG.4 Figure 4: PAGE under native conditions of compositions comprising BSA or a total extract of E. Coli (ET) and NPL NR as well as the addition of ET/NPL NR in a composition comprising BSA.
  • E. Coli E. Coli
  • NPL NR NPL NR
  • Figure 5 PAGE under native conditions of compositions comprising BSA or a total extract of E. Coli (ET) and NP+ as well as the addition of BSA/NP+ in a composition comprising ET.
  • FIG.6 Figure 6: PAGE under native conditions of compositions comprising BSA or a total extract of E. Coli (ET) and NP+ as well as the addition of ET/NP+ in a composition comprising BSA.
  • FIG.7 PAGE under native conditions of compositions comprising BSA or a total extract of E. Coli (ET) and NP+ NR as well as the addition of BSA/NP NR in a composition comprising ET.
  • Figure 8 PAGE under native conditions of compositions comprising BSA or a total extract of E. Coli (ET) and NP+ NR as well as the addition of ET/NP+ NR in a composition comprising BSA.
  • NPL lipid nanoparticles
  • the NPLs are prepared as previously described in patent EP2708237 (Al) - 2014/03/19.
  • 100 g of maltodextrin is dissolved at room temperature in 2N sodium hydroxide with magnetic stirring.
  • the mixture is crosslinked by adding epichlorohydrin and then cationized overnight by adding GTMA to obtain a hydrogel.
  • the resulting hydrogel is then neutralized with acetic acid and ground using a high pressure homogenizer.
  • the size of the particles thus obtained is determined by dynamic light scattering (DLS) analysis.
  • the particles are then purified by tangential flow ultrafiltration on a 750 kDa membrane. The absence of salts and maltodextrin fragments are checked respectively by assaying silver nitrate and by DLS.
  • NP+ porous cationic maltodextrin nanoparticles
  • DPPG dipalmitoyl-phosphatidylglycerol
  • Non-crosslinked cationic maltodextrin nanoparticles are prepared in the same way as NP+ and NPL respectively, only the crosslinking step by adding epichlorohydrin is bypassed.
  • the resulting non-crosslinked nanoparticles are named “NPL NR” and “NP+ NR” depending on whether they are respectively loaded with phospholipids or not.
  • Bovine serum albumin (BSA) freeze-dried and 98% purified comes from Sigma Aldrich (ref. A9647) and is used as a model of purified antigen.
  • Case of a mixture of antigens from the total extract (TE) of E.coli The strain E.coli NC 9001, from the "Public Health England” bank, is cultured in Erlenus with stirring for 24 hours at 37°C in LB medium. The bacteria are centrifuged for 15 min at 11,000 xg then the pellet is washed by 4 successive rinses in sterile water. The bacterial pellet is then taken up in 70% isopropanol and incubated in ice for 45 min to inactivate the bacteria.
  • the pellet After centrifugation for 15 min at 11,000 xg, the pellet is washed in sterile water and then placed in an ultrasound bath for 10 min. After centrifugation for 15 min at 11,000 xg, the pellet is dried under PSM for 30 minutes before freezing then freeze-drying. 10mg of the lyophilisate is resuspended to determine the dry weight/protein weight ratio by the pBCA method.
  • lmg of antigen protein (BSA or ET E.coli) is taken up in 2ml of NPL at 1.5mg/ml before being vortexed for 30 sec to obtain a formulation in a 1/3 ratio (antigens/NPL ). After 30 min of incubation, a sample dosed with 1 mg of protein (BSA or ET E. coli) is added to an aqueous solution to prepare the vaccine composition.
  • DLS Dynamic Light Scattering or diffraction of polarized light
  • Zeta Potential measurement of size (nm) and surface charge (mV) (anionic free antigens vs cationic NPLs)
  • Electrophoresis in non-denaturing conditions The NPLs have a molecular mass that is too high to diffuse in the gel. Thus, unlike free antigenic proteins, associated proteins in NPLs do not diffuse into the gel. The protein profile of the antigens formulated in the NPLs is checked by electrophoresis under denaturing conditions (SDS-PAGE).
  • EXAMPLE 2 Analysis of the association of an antigen (BSA) and/or of a total extract of E. Coli with different nanoparticles at. Association with NPLs
  • the association of BSA with NPL is complete from 5 min of maturation at ambient temperature.
  • the Zeta potential of the BSA/NPL formulations is positive and the size is greater than 20 nm (Table 1).
  • Table 1 DLS and Zeta potential of the BSA/NPL formulations
  • the Z-av parameter represents the mean size of the NPLs.
  • the “number” parameter corresponds to the greatest number of particles of a given size.
  • the PDI corresponds to the Polydispersity Index; it is accepted that the particles are monodispersed when this index is less than 0.3.
  • the Zeta potential represents the surface charge of the nanoparticles. This is positive when the antigens (negatively charged) are absorbed inside the nanoparticle, or when the large antigens are covered by the nanoparticles.
  • NP+ NR The association of NP+ NR with BSA or ET of E. Coli is observed at 24 hours of incubation.
  • addition of a second protein to an NP+ NR formulation can be carried out in 5 min with an almost total association of BSA and ET E.coli with NP+ NR.
  • the Zeta potential of the formulations is positive and confirms the association of BSA and ET E.coli with NP+ (Table 3). Analysis by electrophoresis under native conditions confirms these results (FIGS. 7 and 8).
  • one or more antigens can be added to a vaccine composition which already comprises one or more formulated antigens; this or these additional antigens are dissolved in a pre-existing vaccine composition to which nanoparticles have been added beforehand.

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Abstract

L'invention se rapporte au domaine de la préparation extemporanée de composition vaccinale à partir d'antigènes lyophilisés. Plus particulièrement, l'invention concerne l'utilisation de nanoparticules cationiques pour solubiliser des antigènes lyophilisés sans ajout d'adjuvant de lyophilisation en vue d'une utilisation extemporanée pour l'administration d'une composition vaccinale. Dans un mode de réalisation particulier, il permet de préparer une formulation vaccinale ou d'ajouter une ou plusieurs valences à une composition vaccinale préalablement formulée.

Description

PROCEDE DE PREPARATION D'UNE COMPOSITION VACCINALE A PARTIR D'ANTIGENES LYOPHILISES
L'invention se rapporte au domaine de la préparation extemporanée de composition vaccinale à partir d'antigènes lyophilisés. Plus particulièrement, l'invention concerne l'utilisation de nanoparticules cationiques pour solubiliser des antigènes lyophilisés sans ajout d'adjuvant de lyophilisation en vue d'une utilisation extemporanée pour l'administration d'une composition vaccinale. Dans un mode de réalisation particulier, il permet de préparer une formulation vaccinale ou d'ajouter une ou plusieurs valences à une composition vaccinale préalablement formulée.
Etat de la technique
L'art antérieur concernant les nanoparticules enseigne notamment leurs utilisations pour augmenter la capacité infectieuse de virus non-enveloppé, telle que décrit dans la demande WO2018/104762A1. Il est également connu de l'art antérieur, par la demande EP2708237A1, une composition pharmaceutique comprenant comme principe actif un mélange de : (i) une nanoparticule solide comprenant un noyau polysaccharidique cationique, ledit noyau étant poreux et chargé d’au moins un phospholipide anionique ; et -(ii) au moins un antigène obtenu à partir d’un agent pathogène intracellulaire ; et (iii) un solvant pharmaceutiquement acceptable.
Il est également connu de l'état de l'art des moyens de transports moléculaires vaccinales. On peut citer la demande WO98/29099A2 qui divulgue une méthode pour l'administration dans les muqueuses d'une substance à un mammifère grâce à un biovecteur qui comprend un polymère naturel, ou un dérivé ou un hydrolysat d’un polymère naturel, ou un mélange de ceux-ci. On peut également citer la demande FR2803526A1 qui divulgue une matrice polymérique caractérisée en ce qu'elle comporte une matrice hydrophile macromoléculaire portant une charge ionique positive ou négative et dans laquelle est incorporée une phase lipidique de signe contraire à celui de la matrice. Ladite matrice est notamment utilisable pour le transport d'antigènes à usage vaccinal.
Les interactions entre les nanoparticules et des cellules épithéliales des voies respiratoires, leur capacité à traverser cette barrière et l'analyse de l'impact des lipides à l'intérieur de ces nanoparticules dans la délivrance et la transcytose des antigènes dans les cellules épithéliales ont été étudiés dans l'étude de BERNOCCHI B et AL "Mechanisms allowing protein delivery in nasal mucosa using NPL nanoparticles" JOURNAL OF CONTROLLED RELEASE, vol 232, 11 avril 2016. Cette étude évoque des particules formées de polysaccharides cationiques réticulés comprenant un phospholipide anionique ou non.
L'albumine est classiquement utilisée pour solubiliser de petites molécules lipophiles. A ce titre, on peut citer la demande FR3005858 qui décrit la préparation de compositions antipaludéennes solubles comprenant des nanoparticules. Dans cette composition, l'albumine est utilisée en tant qu'agent de solubilisation de la molécule antipaludéenne, et les auteurs montrent que les propriétés thérapeutiques ne sont pas perdues.
D'autres adjuvants de lyophilisation comme l'arginine et l'histidine ont également été décrits comme facilitant la solubilisation de protéines lyophilisées. La demande EP 0638091 décrit la préparation d’une composition complexe de Facteur VIII lyophilisé laquelle, au contact de l’eau, se reconstitue en moins d’une minute à température ambiante. Cette préparation comprend (i) l'ajout d'un agent solubilisant comprenant de l’arginine, en une quantité suffisante pour accroître la solubilité du facteur VIII, et d’histidine à la solution aqueuse pour former ainsi une solution de Facteur VII l/arginine/histidine dans laquelle l'histidine est présente dans la solution de facteur VII l/arginine/histidine à une concentration de 0,025M et (ii) la lyophilisation de la solution Facteur VII l/arginine/histidine pour donner ainsi une composition complexe de Facteur VIII avec une solubilité accrue. La demande EP 2458990 propose également d'utiliser de l'arginine et de l'histidine, mais aussi du saccharose et du mannitol.
Or ces adjuvants de lyophilisation peuvent avoir des effets indésirables, notamment si la composition extemporanée reconstituée à partir de protéines lyophilisées est destinée à un usage vaccinal.
Dans le cadre de la formulation de compositions vaccinales, la solubilisation de protéines lyophilisées pose problème en raison de l'hétérogénéité des caractéristiques des antigènes, ou de la présence d'adjuvants associés à ces protéines.
A ce jour, on ne dispose pas de méthode adaptée à la solubilisation des protéines lyophilisées qui ne nécessite pas l'ajout d'adjuvant compatible avec une administration en tant que composition vaccinale. Exposé de l'invention
Les inventeurs ont mis au point un procédé permettant de préparer de manière simple et rapide une composition vaccinale à partir d'antigènes lyophilisés ; ce procédé repose sur l'utilisation de nanoparticules cationiques solubilisées dans un milieu aqueux. Contrairement aux procédés classiques de solubilisation, ce procédé ne nécessite pas d'ajout d'adjuvant de lyophilisation.
Ainsi, l'invention concerne un procédé de préparation d'une composition vaccinale à partir d'un antigène lyophilisé comprenant les étapes de :
Fournir une solution aqueuse comprenant une nanoparticule cationique constituée d'un noyau de polysaccharide cationique et associée ou non à des protéines antigèniques Solubiliser ledit antigène lyophilisé dans ladite solution aqueuse Incuber la composition ainsi obtenue à température ambiante.
Avantages de l'invention
Le procédé de solubilisation est simple et rapide ; en effet, il suffit de remettre en suspension les antigènes lyophilisés dans la solution de nanoparticules, de les mélanger et de laisser incuber à température ambiante. Une composition extemporanée est ainsi obtenue en moins de 30 minutes.
La composition ne contient aucun agent de solubilisation (autre que les nanoparticules elles-mêmes), ce qui évite les effets indésirables associés à ce type de molécule. Lorsque la composition vaccinale ne contient que des antigènes lyophilisés, elle ne contient pas non plus d'adjuvant vaccinal. Ceci est avantageux puisque les adjuvants minéraux (à savoir des sels minéraux tels que sels d'aluminium) restent très longtemps dans le corps (plusieurs dizaines d'années).
Les antigènes s'associent aux nanoparticules en solution et sont délivrés au niveau des cellules immunitaires après administration, alors que les nanoparticules sont éliminées rapidement (en moins de 72h après administration nasale). Les nanoparticules jouent donc un quadruple rôle : agent de solubilisation, agent de stabilisation et vecteur de transport des antigènes, et adjuvant vaccinal.
Par la mise en oeuvre de la présente invention, la solubilisation des protéines hydrophobes ou hydrophiles est obtenue grâce aux nanoparticules, quelle que soit la taille des protéines. Les protéines de petite taille sont absorbées par les nanoparticules. Les protéines de grosse taille sont quant à elles entourées par les nanoparticules, ce qui évite qu'elles s'agrègent entre elles. Dans le cas d'une composition vaccinale, cela permet d'administrer des antigènes de tailles différentes, par exemple un mélange d'antigènes obtenu par broyage du pathogène entier. Ainsi, la présentation antigènique est de large spectre et les chances du succès de la vaccination augmentées par rapport aux approches classiques basées sur le choix d'un antigène, ou mélange d'antigènes déterminés ou mal présentés.
Grâce aux nanoparticules, on s'affranchit du besoin d'utiliser des adjuvants de solubilisation, qui ne sont pas compatibles avec une préparation à usage vaccinal.
Ainsi, la présente invention représente une avancée technologique dans le domaine des vaccins. En effet, les préparations d'antigènes en solution utilisées aujourd'hui ne sont pas stables plus de quelques mois et doivent donc être produites régulièrement, avec destruction des stocks d'antigènes non utilisés. La présente invention permet d'apporter une solution à ce problème en permettant de solubiliser des antigènes conservés pendant des mois ou des années sous forme lyophilisée. Il est donc possible grâce à l'utilisation des nanoparticules cationiques de (re)solubiliser à façon et de manière extemporanée, toute préparation antigénique conservée sous forme lyophilisée. Ainsi, la gestion des stocks de préparation d'antigènes est améliorée, permettant une diminution des coûts et plus de souplesse dans la préparation des vaccins.
Le fait de pouvoir solubiliser des antigènes lyophilisés permet de combiner différents antigènes ou préparations antigéniques pour produire des vaccins dont les cibles sont modulables : préparation de vaccins combinés, mais aussi de vaccins dont la valence est adaptée en fonction de la répartition géographique des souches pathogènes.
Un autre avantage de l'invention est qu'elle permet d'ajouter des antigènes à des vaccins existants pour en augmenter la valence. Pour cela, les antigènes à ajouter, disponibles sous forme lyophilisée, sont ajoutés à la composition vaccinale existante dans laquelle des nanoparticules cationiques ont préalablement été ajoutées.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
L'invention concerne un procédé de préparation d'une composition vaccinale à partir d'au moins un antigène lyophilisé comprenant les étapes de :
Fournir une solution aqueuse comprenant une nanoparticule cationique constituée d'un noyau de polysaccharide cationique, ladite nanoparticule étant associée ou non à des protéines antigéniques Ajouter ledit antigène lyophilisé dans ladite solution aqueuse Incuber la composition ainsi obtenue à température ambiante.
La solution aqueuse comprend les nanoparticules nécessaires à la solubilisation des antigènes lyophilisés. L'ajout de la solution aqueuse et l'incubation permettent la solubilisation de l'antigène lyophilisé.
Dans un mode de réalisation, le procédé selon l'invention permet d'augmenter la valence d'une composition vaccinale monovalente ou multivalente. Par « valence », on entend la partie d'un vaccin correspondant à la protection contre un germe unique. Un vaccin multivalent peut protéger contre plusieurs germes occasionnant une même maladie (comme le vaccin 13-valent contre le pneumocoque) ou contre différentes maladies (comme le vaccin rougeole-oreillons-rubéole).
Dans un tel mode de réalisation, ladite solution aqueuse comprend au moins une protéine antigénique. Dans ce cas, la protéine antigénique (de la composition vaccinale initiale) est associée aux nanoparticules avant ajout de l'antigène lyophilisé. Il est possible d'ajouter un ou plusieurs antigènes lyophilisés à la composition vaccinale initiale.
Par « nanoparticule cationique constituée d'un noyau de polysaccharide cationique », on entend une nanoparticule (NP) solide comprenant un noyau de polysaccharide cationique. La NP peut être réticulée ou non. Son noyau peut être chargé ou non d'un phospholipide anionique. Cette NP n'est entourée d'aucune couche phospholipidique.
Dans un premier mode de réalisation particulier, le polysaccharide cationique formant le noyau de la NP est un polymère non réticulé obtenu par la réaction entre un polysaccharide choisi parmi l'amidon, le dextrane, la dextrine, et la maltodextrine, des poly-fructoses (inuline), poly-mannoses, poly- galactoses, poly-galacto-mannanes (gomme de guar) et au moins un ligand cationique choisi entre une amine primaire, secondaire, tertiaire ou des ammoniums quaternaires. Le noyau n'est pas chargé en lipides.
Dans un deuxième mode de réalisation particulier, le polysaccharide cationique formant le noyau de la NP est un polymère réticulé obtenu par la réaction entre un polysaccharide choisi parmi l'amidon, le dextrane, la dextrine, et la maltodextrine, des poly-fructoses (inuline), poly-mannoses, poly- galactoses, poly-galacto-mannanes (gomme de guar) et au moins un ligand cationique choisi parmi une amine primaire, secondaire, tertiaire ou des ammoniums quaternaires, puis l'ajout d'un agent de réticulation. L'agent de réticulation est choisi parmi l'épichloridrine, un diacide carboxylique ou un chlorure d'acide, tel que l'acide sébacique. Le noyau n'est pas chargé en lipides.
Dans un mode de réalisation préféré, le polysaccharide cationique est obtenu par la réaction entre la maltodextrine et le glycidyltriméthylammonium, que la NP soit réticulée ou non.
Dans un troisième mode de réalisation particulier, le polysaccharide cationique formant le noyau de la NP est chargé d'un phospholipide anionique. Ce phospholipide anionique peut être choisi parmi le glycérol de diacylphosphatidyle, la sérine de diacylphosphatidyle ou l'inositol de diacylphosphatidyle. Dans un autre mode de réalisation préféré, le phospholipide anionique est du dipalmitoylphosphatidylglycérol (DPPG). Le polysaccharide cationique formant le noyau de la NP n'est pas réticulé.
Dans un mode de réalisation tout à fait préféré, la NP est une nanoparticule de maltodextrine chargée en DPPG.
Dans un quatrième mode de réalisation particulier, le polysaccharide cationique formant le noyau de la NP n'est pas chargé en lipides et n'est pas réticulé.
Les modes de réalisation selon lesquelles les NP sont réticulées ou non, et chargées en lipides ou non, sont combinables pour donner quatre types de NP :
NP réticulée non chargée en lipides (NP+)
NP réticulée chargée en lipides (NPL)
NP non réticulée non chargée en lipides (NP+ NR)
NP non réticulée chargée en lipides (NPL NR)
Ces quatre types de NP sont utilisables dans le procédé selon l'invention.
Dans un mode de réalisation préféré, on utilise les NP en solution pour solubiliser une formulation antigénique lyophilisée. Une telle formulation peut être prête à l'emploi ou composée à façon à partir de différents antigènes lyophilisés.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, le procédé de préparation d'une composition selon l'invention permet d'ajouter une ou plusieurs valences à une composition vaccinale existante, déjà formulée. Dans ce cas, la solution aqueuse dans laquelle est resuspendu ledit antigène lyophilisé est une composition vaccinale comprenant au moins un autre antigène déjà en solution associé à ladite nanoparticule cationique. Les étapes de ce procédé consistent à :
Fournir une composition vaccinale
Ajouter des NP constituées d'un noyau de polysaccharide cationique telle que définie précédemment
Remettre en suspension au moins un antigène additionnel lyophilisé dans ladite composition vaccinale contenant les NP
Incuber la composition obtenue à température ambiante.
Dans ce mode de réalisation, l'invention concerne un procédé d'ajout d'une nouvelle valence à une composition vaccinale elle peut se définir par les étapes de :
Fournir une composition vaccinale aqueuse d'une nanoparticule constituée d'un noyau de polysaccharide cationique contenant des antigènes associés
Remettre en suspension au moins un antigène additionnel lyophilisé dans ladite composition vaccinale aqueuse
Incuber la composition obtenue à température ambiante
Ce procédé est particulièrement avantageux pour préparer des vaccins multivalents à partir de vaccins déjà formulés, ce qui n'était jusqu'alors pas possible.
Par « antigène lyophilisé » au sens de l'invention, on entend une protéine antigénique, un mélange de protéines antigéniques, ou un extrait partiel ou total de pathogène. L'extrait de pathogène peut contenir des protéines, des polysaccharides et des lipides. La protéine peut être hydrophile ou lipophile. Les antigènes peuvent être purifiés, seuls ou en combinaison. Les protéines antigéniques peuvent être lipophiles ou hydrophiles.
Dans un mode de réalisation préféré, le mélange de protéines antigéniques est composé d'un ou de plusieurs antigènes purifiés ou d'un extrait de pathogène. L'extrait de pathogène peut être un extrait total ou un extrait partiel.
Dans un mode de réalisation préféré, l'antigène est un extrait complexe de protéines obtenu à partir d'un pathogène entier.
Le pathogène peut être un parasite, un virus, une bactérie, une mycobactérie et un champignon. Parmi les pathogènes d'intérêt on peut citer les exemples suivants : (i) un virus choisi parmi le virus herpès simplex 1 et 2, le papillomavirus humain, le cytomégalovirus, le mycobacterium tuberculosis, la dengue, le VIH, le virus respiratoire syncytial (VRS), le virus de l'hépatite A, le virus de l'hépatite B et le virus de l'hépatite C, un coronavirus tel que le SARS- Cov2, le virus de la rage, ou un virus vétérinaire tel que le Virus de la peste équine, Virus de la peste porcine africaine, Virus Andes, Virus de l’influenza aviaire, Virus de la grippe équine, Virus de la fièvre catarrhale ovine, Virus Chapare, Virus Chikungunya, Virus Choclo, Virus de la fièvre hémorragique de Crimée-Congo, Virus de la dengue, Virus Dobrava-Belgrade, Virus de l’encéphalite équine de l’Est, Virus Ebola, Virus de la fièvre aphteuse, Virus de la variole caprine, Virus Guanarito, Virus d’Hantaan, Virus Hendra (morbillivirus équin), Herpesvirus porcin (virus de la maladie d’Aujeszky), Herpesvirus equine, Virus de la peste porcine classique, Virus de l’encéphalite japonaise, Virus de Junin, Virus de la maladie de la forêt de Kyasanur, Virus Laguna negra, Virus de la fièvre de Lassa, Virus de l’encéphalomyélite ovine, Virus Lujo, Virus de la dermatose nodulaire contagieuse, Virus de la chorioméningite lymphocytaire, Virus Machupo, Virus de Marbourg, Virus de la variole du singe, Virus de l’encéphalite de Murray Valley, Virus de la maladie de Newcastle, Virus Nipah, Virus de la fièvre hémorragique d’Omsk, Virus Oropouche, Virus de la peste des petits ruminants, Entérovirus porcin type 9 (virus de la maladie vésiculeuse du porc), Virus de l’encéphalite Powassan, Virus de la rage et autres membres du genre Lyssavirus, Virus de la vallée du Rift, Virus de la peste bovine, Virus Rocio, Virus Sabia, Virus de Séoul, Virus de la variole ovine, Virus Sin Nombre, Virus de l’encéphalite de Saint-Louis, Virus de la maladie de Teschen (encéphalomyélite à entérovirus), Virus du Syndrome dysgénésique et respiratoire du porc, Virus de l’encéphalite à tiques (virus de l’encéphalite verno-estivale russe), Virus de la variole, Virus de l’encéphalite équine du Venezuela, Virus de la stomatite vésiculeuse, Virus de l’encéphalite équine de l’Ouest, Virus de la fièvre jaune, Virus leucémogène félin
(ii) un parasite intracellulaire choisi parmi, Acanthamoeba spp., Babesia spp., Balantidium coli, Blastocytis, Dientamoebafragiiis, Entamoebahistolytica, Giardia lemblia , Isospora belli, Leishmania spp., Naegleriafowleri, Rhinosporidiumseeberi, Trichomonasvaginalis, Trypanosomabrucei et Trypanosomacruzi, Toxoplasma gondii, Eimeria spp, Neospora caninum, Sarcocystis spp, Plasmodium spp (Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale, Plasmodium malariae, Plasmodium knowlesi for instance,) and Cryptosporidium spp. It may also be chosen among Acanthamoeba spp., Babesia spp., Balantidium coli, Blastocysts, Dientamoebafragiiis, Entamoebahistolytica, Giardia lamblia, Isospora belli, Leishmania spp., Naegleriafowleri, Rhinosporidiumseeberi, Trichomonasvaginalis, Trypanosomabrucei, et Trypanosomacruzi.
(iii) une bactérie choisie parmi les souches Aeromonas hydrophila, Afipiafelis, Actinomyces israelii, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Achromobacter xylosoxidans, Acinetobacter baumannii, Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Bartonella henselae, Bartonella ciarridgeiae, Bordetella pertussis (bacille de Bordet et Gengou), Bordetella para pertussis, Bordetella bronchiseptica, Borrelia burgdorferi, Borrelia recurrentis, Brucella, Burkholderia cepacian, Burkholderia mallei, Burkholderia pseudomallei (bacille de Whitmore), Campylobacter coli, Campylobacter fetus, Campylobacter jejuni, Cardiobacterium hominis, Chlamydia trachomatis, Chlamydophila pneumoniae, Chlamydophila psittaci, Clostridium botulinum , Clostridium difficile , Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Corynebacterium diphtheriae , Coxiella burnetiid ', Ehrlichia chaffeensis, Ehrlichia equi, Eikenella corrodens, Entérocoques : Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Enterococcus gallinarum , Enterococcus flavescens, Enterococcus casseliflavus , Erysipelothrix rhusiopathiae, Escherichia coli, Entérobactéries, Francisella tularensis, Haemophilus ducreyi, Haemophilus influenzae, Hélicobacter pylori, Kingella kingae, Klebsiella granulomatis, Klebsiella oxytoca, Klebsiella ozenae, Klebsiella planticola, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella rhinoscleromatis, Légionella pneumophila, Légionella longbeachae, Légionella micdadei, Leptospira interrogans, Listeria monocytogenes, Mycobacterium leprae (bacille de Hansen), Mycobacterium tuberculosis (bacille de Koch), Mycobacterium bovis, Mycobactéries atypiques (M. avium, M. bovis, M. intracellulare...), Mycoplasma pneumoniae, Mycoplasma hominis, Mycoplasma genitalium, Neisseria gonorrhoeae (gonocoque), Neisseria meningitidis (méningocoque), Nocardia, Pantoea agglomérons, Pasteurella multocida, Plesiomonas shigelloides, Pneumocoque (nom habituel de Streptococcus pneumoniae), Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Providencia stuartii, Pseudomonas aeruginosa, bacille pyocyanique, voir Pseudomonades, Porphyromonas gingivalis, Rickettsia, Salmonella enterica (ou salmonelle), Serratia marcescens, Serratia proteamaculans, Shigella dysenteriae (ou shigelle), Shigella boydii, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Spirillum minus, Staphylocoques (Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophyticus), Streptococcus pyogenes ou Streptocoques du groupe A, Streptococcus pneumoniae (ou pneumocoque), Treponema pallidum, Ureaplasma urealyticum, Vibrio cholerae (variétés cholerae et el tor), Yersinia pestis, Yersinia enterocolitica, Yersinia pseudotuberculosis
(v) un champignon choisi parmi Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus, Aspergillus clavatus, Blastomyces dermatitidis, Candida albicans, Candida auris, Coccidioides immitis, Cryptococcus neoformans, Cryptococcus gattii, Histoplasma capsulatum, Mucormycosis, Paracoccidioides brasiliensis, Pneumocystis jirovecii, Pneumocystis Pneumonia, Sporothrix schenckii, Stachybotrys chartarum, Talaromycosis
Les NP utilisées pour la préparation des compostions vaccinales forment des structures poreuses ayant la capacité d'absorber les antigènes libres ou de les recouvrir de sorte à permettre leur solubilisation dans une solution aqueuse. De plus, les protéines ainsi solubilisées sont stabilisées. Le procédé selon l'invention permet donc de solubiliser des antigènes lyophilisés dans une solution aqueuse sans utiliser d'adjuvant de solubilisation.
La solution dans laquelle est solubilisé l'antigène lyophilisé est par exemple une solution aqueuse ou une solution tamponnée, apte à être utilisée dans le cadre d'une utilisation vaccinale.
Lorsque l'antigène est solubilisé dans une composition vaccinale, il est entendu que cette composition peut contenir des adjuvants vaccinaux, voire de solubilisation, sans que cela ne remette en cause la mise en oeuvre du procédé selon l'invention, lorsqu'un antigène est ajouté dans ladite composition vaccinale.
Par « adjuvant de solubilisation » aussi appelé « adjuvant de lyophilisation», on entend au sens de l'invention, un agent permettant la solubilisation des protéines ainsi que la stabilisation des protéines. Comme exemple des surfactants comme le tween, empigen, triton, des saccharides comme le saccharose, des polyols comme le mannitol, inositol, des polymères comme le Polyvinylpyrrolidone (PVP), ...
Par « adjuvant vaccinal » au sens de l'invention, on entend un agent immuno-modulateur. De tels adjuvants peuvent être hydrophiles tels que des oligodésoxynucléotides (CpG), ou lipophiles tels que le squalène, MPL, QS-21...
Pour éviter toute confusion, il est expressément entendu que, dans le cadre de cette invention, les NP ne sont pas considérées comme des adjuvants mais comme agent de solubilisation et de délivrance d'antigènes.
Pour la remise en suspension de l'antigène lyophilisé, le ratio protéine/nanoparticule (poids/poids) est compris entre 1/10 et 1/1. Dans un mode de réalisation préféré, le ratio de protéine/nanoparticule est compris entre 1/1 et 1/4, notamment de 1/3.
Après l'ajout des antigènes lyophilisés, la solution aqueuse est incubée à température ambiante. Le temps d'incubation peut être typiquement compris entre 3 minutes et 1 heure, de préférence entre 5 min et 30 minutes ; il peut être prolongé pendant 1 an sans que cela n'affecte le procédé. Après incubation, la composition obtenue peut être soit utilisée directement en tant que composition vaccinale, soit être utilisée pour solubiliser d'autres protéines lyophilisées. Ainsi, dans un mode de réalisation particulier de l'invention, au moins deux extraits protéiques lyophilisés différents sont solubilisés dans la solution aqueuse contenant les nanoparticules. Ces extraits protéiques différents peuvent provenir de pathogènes différents ou contenir des antigènes provenant de souches différentes d'un même pathogène.
Les compositions obtenues selon l'invention peuvent être utilisées en tant que vaccin dans le domaine vétérinaire ou en santé humaine.
La présente invention sera mieux comprise à la lecture des exemples qui suivent, fournis à titre d'illustration et ne devant en aucun cas être considérés comme limitant la portée de la présente invention.
DESCRIPTION DES FIGURES
[Fig.l] Figure 1 : PAGE en conditions natives de compositions comprenant de la BSA ou un extrait total d'E.Coli (ET) et des NPL ainsi que l'ajout de BSA/NPL dans une composition comprenant ET.
[Fig.2] Figure 2 : PAGE en conditions natives de compositions comprenant de la BSA ou un extrait total d'E.Coli (ET) et des NPL ainsi que l'ajout de ET/NPL dans une composition comprenant BSA.
[Fig.3] Figure 3 : PAGE en conditions natives de compositions comprenant de la BSA ou un extrait total d'E.Coli (ET) et des NPL NR ainsi que l'ajout de BSA/NPL NR dans une composition comprenant ET.
[Fig.4] Figure 4 : PAGE en conditions natives de compositions comprenant de la BSA ou un extrait total d'E.Coli (ET) et des NPL NR ainsi que l'ajout de ET/NPL NR dans une composition comprenant BSA.
[Fig.5] Figure 5 : PAGE en conditions natives de compositions comprenant de la BSA ou un extrait total d'E.Coli (ET) et des NP+ ainsi que l'ajout de BSA/NP+ dans une composition comprenant ET.
[Fig.6] Figure 6 : PAGE en conditions natives de compositions comprenant de la BSA ou un extrait total d'E.Coli (ET) et des NP+ ainsi que l'ajout de ET/NP+ dans une composition comprenant BSA.
[Fig.7] Figure 7 : PAGE en conditions natives de compositions comprenant de la BSA ou un extrait total d'E.Coli (ET) et des NP+ NR ainsi que l'ajout de BSA/NP NR dans une composition comprenant ET. [Fig.8] Figure 8 : PAGE en conditions natives de compositions comprenant de la BSA ou un extrait total d'E.Coli (ET) et des NP+ NR ainsi que l'ajout de ET/NP+ NR dans une composition comprenant BSA.
EXEMPLES
EXEMPLE 1 : Préparation d'une composition aqueuse de protéines hydrophiles à partir de protéines lyophilisées
A. Préparation des nanoparticules lipidées (NPL)
Les NPL sont préparées comme précédemment décrit dans le brevet EP2708237 (Al) - 2014/03/19. 100 g de maltodextrine est dissous à température ambiante dans de l’hydroxyde de sodium 2N sous agitation magnétique. Le mélange est réticulé par ajout d'épichlorhydrine puis cationisé pendant une nuit par ajout de GTMA pour obtenir un hydrogel. L'hydrogel obtenu est ensuite neutralisé avec de l’acide acétique et broyé en utilisant un homogénéisateur à haute pression. La taille des particules ainsi obtenues est déterminée par analyse de la diffusion dynamique de la lumière (DLS). Les particules sont ensuite purifiées par ultrafiltration à flux tangentiel sur une membrane de 750 kDa. L’absence de sels et de fragments de maltodextrine sont contrôlées respectivement par dosage du nitrate d’argent et par DLS.
Les nanoparticules de maltodextrine cationiques poreuses (nommées NP+) résultantes sont ensuite chargées par des phospholipides anioniques par injection d'une solution de dipalmitoyl- phosphatidylglycérol (DPPG) préparée dans du solutol pour obtenir les nanoparticules nommées « NPL ».
Des nanoparticules de maltodextrine cationiques non réticulées sont préparées de la même manière que les NP+ et NPL respectivement, seule l'étape de réticulation par ajout de l'épichlorhydrine est shuntée. Les nanoparticules non réticulées résultantes sont nommées « NPL NR » et « NP+ NR » en fonction du fait qu'elles sont respectivement chargées en phospholipides ou non.
B. Préparation des antigènes
Cas d'un antigène purifié
La sérum albumine bovine (BSA) lyophilisée et purifiée à 98% provient de chez Sigma Aldrich (ref. A9647) et est utilisée comme modèle d'antigène purifié. Cas d'un mélange d'antigènes à partir de l'extrait total (ET) d'E.coli La souche E.coli NC 9001, issue de la banque « Public Health England », est cultivée en erlen sous agitation pendant 24h à 37°C en milieu LB. Les bactéries sont centrifugées pendant 15 min à 11000 x g puis le culot est lavé par 4 rinçages successifs dans de l'eau stérile. Le culot bactérien est ensuite repris dans de l'isopropanol 70% et incubé dans la glace pendant 45 min pour inactiver les bactéries. Après centrifugation pendant 15 min à 11000 x g, le culot est lavé en eau stérile puis placés dans un bain à ultrason pendant 10 min. Après centrifugation pendant 15 min à 11000 x g, le culot est séché sous PSM pendant 30 minutes avant congélation puis lyophilisation. lOmg du lyophilisât sont remis en suspension pour déterminer le ratio poids sec/poids protéique par la méthode pBCA.
C. Préparation d'une composition extemporanée
L'association des antigènes aux nanoparticules (NP+, NPL, NP+ NR et NPL NR) à température ambiante (20-25°C) est testée à différents temps de maturation : 5min, 30min, lh et 24h.
Pour chaque condition testée, lmg protéique d'antigène (BSA ou ET E.coli) est repris dans 2ml de NPL à 1.5mg/ml avant d'être vortexé pendant 30 sec pour obtenir une formulation en ratio 1/3 (antigènes/NPL). Après 30 min d'incubation, un échantillon dosé à lmg protéique (BSA ou ET E.coli) est ajouté à une solution aqueuse pour préparer la composition vaccinale.
D. Méthodes d'analyse de l'association des antigènes avec les NPL
L'association des antigènes aux NPL est analysée par :
DLS (Dynamic Light Scattering ou diffraction de la lumière polarisée) et Potentiel Zêta : mesure de la taille (nm) et de la charge de surface (mV) (antigènes libres anioniques vs NPL cationiques)
Electrophorèse en condition non dénaturante (Native PAGE) : Les NPL ont une masse moléculaire trop importante pour diffuser dans le gel. Ainsi, contrairement aux protéines antigèniques libres, les protéines associées dans les NPL ne diffusent pas dans le gel. Le profil protéique des antigènes formulés dans les NPL est contrôlé par électrophorèse en conditions dénaturantes (SDS- PAGE).
EXEMPLE 2 : Analyse de l'association d'un antigène (BSA) et/ ou d'un extrait total d'E. Coli aux différentes nanoparticules a. Association aux NPL
L'association de la BSA aux NPL est complète à partir de 5 min de maturation à température ambiante. Le potentiel Zêta des formulations BSA/NPL est positif et la taille est supérieure à 20nm (Tableau 1).
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Tableau 1 : DLS et potentiel Zêta des formulations BSA/NPL Le paramètre Z-av représente la taille moyenne des NPL. Ainsi, on observe que la BSA s'associe aux NPL est très effective en moins de 5 min.
La paramètre « number » correspond au plus grand nombre de particules d'une taille donnée.
Le PDI correspond à l'Indice de polydispersité ; il est admis que les particules sont monodispersées lorsque cet indice est inférieur à 0,3. Le potentiel Zêta représente la charge de surface des nanoparticules. Celui-ci est positif lorsque les antigènes (chargés négativement) sont absorbés à l'intérieur de la nanoparticule, ou lorsque les antigènes de grosse taille sont recouverts par les nanoparticules.
De plus, on constate que l'ajout d'une seconde protéine à une formulation peut être réalisé en 5 min. L'association de la BSA aux NPL puis de l'extrait protéique total d'E.coli est totale après 5 min. Le potentiel Zêta des formulations est positif et confirme l'association de la BSA et de l'ET E.coli aux NPL (tableau 1).
L'analyse par électrophorèse en conditions natives confirme l'association totale de la BSA aux NPL après 24h de maturation. De plus, cette analyse montre une association de l'extrait total d'E.Coli de 95% dès 5 min de maturation avec la BSA/NPL (Figure 1) ; une associtaion rapide et forte est aussi observée lorsque l'on associe la BSA à un extrait total d'E.Coli/ NPL (Figure 2). b. Association aux NPL NR
Les résultats d'association sont présentés au Tableau 2
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L'association des NPL NR à la BSA ou à l'ET d'E. Coli est observée à 24h d'incubation. De plus, l'ajout d'une seconde protéine à une formulation NPL NR est possible même si l'association de la BSA et de L'ET E.coli aux NPL NR est moins bonne que pour les NPL réticulées. Le potentiel Zêta des formulations est positif et confirme l'association de la BSA et de l'ET E.coli aux NPL (Tableau 2). L'analyse par électrophorèse en conditions natives confirme ces résultats (Figures 3 et 4). c. Association aux NP+
Les résultats d'association sont présentés au Tableau 3.
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Tableau 3. DLS & Potentiel Zêta des formulations NP+ L'association des NPL NR à la BSA ou à l'ET d'E. Coli est observée à 24h d'incubation. De plus, l'ajout d'une seconde protéine à une formulation NP+ est est réalisable en 5 min avec une association de la BSA et de L'ET E.coli aux NPL NR presque totale. Le potentiel Zêta des formulations est positif et confirme l'association de la BSA et de l'ET E.coli aux NP+ (Tableau 3). L'analyse par électrophorèse en conditions natives confirme ces résultats (Figures 5 et 6). d. Association aux NP+ NR
Les résultats d'association sont présentés au Tableau 4.
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Tableau 4. DLS & Potentiel Zêta des formulations NP+NR
L'association des NP+ NR à la BSA ou à l'ET d'E. Coli est observée à 24h d'incubation. De plus, l'ajout d'une seconde protéine à une formulation NP+ NR est réalisable en 5 min avec une association de la BSA et de L'ET E.coli aux NP+ NR presque totale. Le potentiel Zêta des formulations est positif et confirme l'association de la BSA et de l'ET E.coli aux NP+ (Tableau 3). L'analyse par électrophorèse en conditions natives confirme ces résultats (Figures 7 et 8). Conclusion
Les formulations extemporanées d'antigènes lyophilisées avec les 4 types de nanoparticules étudiées sont réalisées en moins de 30 min.
Ces résultats montrent : - D'une part la capacité à formuler un antigène lyophilisé dans une solution aqueuse
(solubilisation) pour préparer une composition vaccinale prête-à-l'emploi D'autre part que l'on peut ajouter un ou plusieurs antigènes (une ou plusieurs valences) à une composition vaccinale qui comprend déjà un ou plusieurs antigènes formulés ; ce ou ces antigènes additionnels sont solubilisés dans une composition vaccinale pré-existante à laquelle des nanoparticules ont été préalablement ajoutées.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de préparation d'une composition vaccinale à partir d'au moins un antigène lyophilisé comprenant les étapes de :
Fournir une solution aqueuse comprenant une nanoparticule cationique constituée d'un noyau de polysaccharide cationique
Ajouter ledit antigène lyophilisé dans ladite solution aqueuse Incuber la composition ainsi obtenue à température ambiante.
2. Procédé selon la revendication 1 permettant d'augmenter la valence d'une composition vaccinale dans lequel ladite solution aqueuse comprend au moins une protéine antigènique.
3. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2 dans lequel ledit noyau de polysaccharide cationique poreux est non réticulé et est obtenu par la réaction entre un polysaccharide choisi parmi l'amidon, le dextrane, la dextrine, et la maltodextrine, des poly-fructoses (inuline), poly-mannoses, poly-galactoses, poly-galacto-mannanes (gomme de guar) et au moins un ligand cationique choisi dans une amine primaire, secondaire ou tertiaire et des ammoniums quaternaires.
4. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2 dans lequel ledit noyau de polysaccharide cationique poreux est réticulé et est obtenu par la réaction entre un polysaccharide choisi parmi l'amidon, le dextrane, la dextrine, et la maltodextrine, des poly-fructoses (inuline), poly-mannoses, poly-galactoses, poly-galacto-mannanes (gomme de guar) et au moins un ligand cationique choisi dans une amine primaire, secondaire ou tertiaire et des ammoniums quaternaires puis l'ajout d'un agent de réticulation.
5. Procédé selon la revendication 4 dans lequel ledit agent de réticulation est choisi parmi l'épichloridrine, un diacide carboxylique ou un chlorure d'acide.
6. Procédé selon l'une des revendications 3 ou 4 dans lequel ledit noyau de polysaccharide cationique est obtenu par réaction entre une maltodextrine et un glycidyltriméthylammonium.
7. Procédé selon l'une des revendications précédentes dans lequel ledit noyau de polysaccharide cationique poreux est chargé d'un phospholipide anionique.
8. Procédé selon la revendication 7 dans lequel ledit phospholipide anionique est choisi parmi le glycérol de diacylphosphatidyle, la sérine de diacylphosphatidyle ou l'inositol de diacylphosphatidyle.
9. Procédé selon la revendication 8 dans lequel ledit phospholipide anionique est le dipalmitoylphosphatidylglycérol.
10. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6 dans lequel ledit noyau de polysaccharide cationique poreux n'est pas chargé en lipides.
11. Procédé selon l'une des revendications précédentes dans lequel l'antigène lyophilisé est une protéine antigénique ou un mélange de protéines antigéniques.
12. Procédé selon la revendication 11 dans lequel ledit mélange de protéines antigéniques est composé d'un ou de plusieurs antigènes purifiés ou d'un extrait de pathogène.
13. Procédé selon la revendication 12 dans lequel ledit pathogène est choisi parmi un parasite, un virus, une bactérie, une mycobactérie et un champignon.
14. Procédé selon la revendication 13 dans lequel ledit pathogène est :
(i) un virus choisi parmi le virus herpès simplex 1 et 2, le papillomavirus humain, le cytomégalovirus, le mycobacterium tuberculosis, la dengue, le VIH, le virus respiratoire syncytial (VRS), le virus de l'hépatite A, le virus de l'hépatite B et le virus de l'hépatite C, un coronavirus tel que le SARS-Cov2, le virus de la rage, ou un virus vétérinaire tel que le Virus de la peste équine, Virus de la peste porcine africaine, Virus Andes, Virus de l’influenza aviaire, Virus de la grippe équine, Virus de la fièvre catarrhale ovine, Virus Chapare, Virus Chikungunya, Virus Choclo, Virus de la fièvre hémorragique de Crimée-Congo, Virus de la dengue, Virus Dobrava-Belgrade, Virus de l’encéphalite équine de l’Est, Virus Ebola, Virus de la fièvre aphteuse, Virus de la variole caprine, Virus Guanarito, Virus d’Hantaan, Virus Hendra (morbillivirus équin), Herpesvirus porcin (virus de la maladie d’Aujeszky), Herpesvirus equine, Virus de la peste porcine classique, Virus de l’encéphalite japonaise, Virus de Junin, Virus de la maladie de la forêt de Kyasanur, Virus Laguna negra, Virus de la fièvre de Lassa, Virus de l’encéphalomyélite ovine, Virus Lujo, Virus de la dermatose nodulaire contagieuse, Virus de la chorioméningite lymphocytaire, Virus Machupo, Virus de Marbourg, Virus de la variole du singe, Virus de l’encéphalite de Murray Valley, Virus de la maladie de Newcastle, Virus Nipah, Virus de la fièvre hémorragique d’Omsk, Virus Oropouche, Virus de la peste des petits ruminants, Entérovirus porcin type 9 (virus de la maladie vésiculeuse du porc), Virus de l'encéphalite Powassan, Virus de la rage et autres membres du genre Lyssavirus, Virus de la vallée du Rift, Virus de la peste bovine, Virus Rocio, Virus Sabia, Virus de Séoul, Virus de la variole ovine, Virus Sin Nombre, Virus de l'encéphalite de Saint-Louis, Virus de la maladie de Teschen (encéphalomyélite à entérovirus), Virus du Syndrome dysgénésique et respiratoire du porc, Virus de l'encéphalite à tiques (virus de l'encéphalite verno-estivale russe), Virus de la variole, Virus de l'encéphalite équine du Venezuela, Virus de la stomatite vésiculeuse, Virus de l'encéphalite équine de l'Ouest, Virus de la fièvre jaune, Virus leucémogène félin, ou
(ii) un parasite intracellulaire choisi parmi, Acanthamoeba spp., Babesia spp., Balantidium coli, Blastocytis, Dientamoebafragiiis, Entamoebahistolytica, Giardia lemblia , Isospora belli, Leishmania spp., Naegleriafowleri, Rhinosporidiumseeberi, Trichomonasvaginalis, Trypanosomabrucei et Trypanosomacruzi, Toxoplasma gondii, Eimeria spp, Neospora caninum, Sarcocystis spp, Plasmodium spp (Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale, Plasmodium malariae, Plasmodium knowlesi for instance,) and Cryptosporidium spp. It may also be chosen among Acanthamoeba spp., Babesia spp., Balantidium coli, Blastocysts, Dientamoebafragiiis, Entamoebahistolytica, Giardia lamblia, Isospora belli, Leishmania spp., Naegleriafowleri, Rhinosporidiumseeberi, Trichomonasvaginalis, Trypanosomabrucei, et Trypanosomacruzi, ou
(iii) une bactérie choisie parmi les souches Aeromonas hydrophila, Afipia felis, Actinomyces israelii, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Achromobacter xylosoxidans, Acinetobacter baumannii, Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Bartonella henselae, Bartonella ciarridgeiae, Bordetella pertussis (bacille de Bordet et Gengou), Bordetella parapertussis, Bordetella bronchiseptica, Borrelia burgdorferi, Borrelia recurrentis, Brucella, Burkholderia cepacian, Burkholderia mallei, Burkholderia pseudomallei (bacille de Whitmore), Campylobacter coli, Campylobacter fétus, Campylobacter jejuni, Cardiobacterium hominis, Chlamydia trachomatis, Chlamydophila pneumoniae, Chlamydophila psittaci, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Corynebacterium diphtheriae, Coxiella burnetiid, Ehrlichia chaffeensis, Ehrlichia egui, Eikenella corrodens, Entérocogues : Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Enterococcus gallinarum, Enterococcus flavescens, Enterococcus casseliflavus, Erysipelothrix rhusiopathiae, Escherichia coli, Entérobactéries, Francisella tularensis, Haemophilus ducreyi, Haemophilus influenzae, Hélicobacter pylori, Kingella kingae, Klebsiella granulomatis, Klebsiella oxytoca, Klebsiella ozenae, Klebsiella planticola, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella rhinoscleromatis, Légionella pneumophila, Légionella longbeachae, Légionella micdadei, Leptospira interrogans, Listeria monocytogenes, Mycobacterium leprae (bacille de Hansen), Mycobacterium tuberculosis (bacille de Koch), Mycobacterium bovis, Mycobactéries atypigues (M. avium, M. bovis, M. intracellulare...), Mycoplasma pneumoniae, Mycoplasma hominis, Mycoplasma genitalium, Neisseria gonorrhoeae (gonocogue), Neisseria meningitidis (méningocogue), Nocardia, Pantoea agglomérons, Pasteurella multocida, Plesiomonas shigelloides, Pneumocogue (nom habituel de Streptococcus pneumoniae), Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Providencia stuartii, Pseudomonas aeruginosa, bacille pyocyanigue, voir Pseudomonades, Porphyromonas gingivalis, Rickettsia, Salmonella enterica (ou salmonelle), Serratia marcescens, Serratia proteamaculans, Shigella dysenteriae (ou shigelle), Shigella boydii,
Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Spirillum minus, Staphylocogues (Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophyticus), Streptococcus pyogenes ou Streptocogues du groupe A, Streptococcus pneumoniae (ou pneumocogue), Treponema pallidum, Ureaplasma urealyticum, Vibrio cholerae (variétés cholerae et el tor), Yersinia pestis, Yersinia enterocolitica, Yersinia pseudotuberculosis, ou
(iv) un champignon choisi parmi Aspergillus fumigatus, Aspergillusflavus, Aspergillus clavatus, Blastomyces dermatitidis, Candida albicans, Candida auris, Coccidioides immitis, Cryptococcus neoformans, Cryptococcus gattii, Histoplasma capsulatum, Mucormycosis, Paracoccidioides brasiliensis, Pneumocystis jirovecii, Pneumocystis Pneumonia, Sporothrix schenckii, Stachybotrys chartarum, Talaromycosis.
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