EP0391962A1 - Compositions presentant des proprietes immunostimulantes et leurs applications en medecine humaine et veterinaire - Google Patents

Compositions presentant des proprietes immunostimulantes et leurs applications en medecine humaine et veterinaire

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EP0391962A1
EP0391962A1 EP89900836A EP89900836A EP0391962A1 EP 0391962 A1 EP0391962 A1 EP 0391962A1 EP 89900836 A EP89900836 A EP 89900836A EP 89900836 A EP89900836 A EP 89900836A EP 0391962 A1 EP0391962 A1 EP 0391962A1
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EP
European Patent Office
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liposomes
composition according
properties
composition
treatment
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP89900836A
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German (de)
English (en)
Inventor
Pierre Perrin
Marie-Line Joffret
Claude Leclerc
Pierre Sureau
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institut Pasteur de Lille
Original Assignee
Institut Pasteur de Lille
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Filing date
Publication date
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Withdrawn legal-status Critical Current

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    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A61K9/1277—Processes for preparing; Proliposomes
    • A61K9/1278—Post-loading, e.g. by ion or pH gradient
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    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A61K38/2013—IL-2
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders

Definitions

  • the present invention relates to an immunostimulatory composition further having properties for amplifying the protective power of vaccinating antigens, and in particular of the rabies vaccine for human or veterinary use.
  • Interleukin-2 is a lymphokine that plays a key role in the immune response.
  • T cell growth factor IL-2 is produced by lymphoid cells (mainly T cells) stimulated by antigens or mitogens.
  • IL-2 has a wide variety of immunoregulatory properties. It promotes the proliferation and / or differentiation of cells which express a specific IL-2 receptor, in particular T cells, including CTL (cytotoxic T lymphocytes), natural killer cells (NK) and B cells. Due to its immunostimulatory action, IL-2 is now used in immunotherapy of human patients, such use is made all the easier since we now have recombinant human IL-2.
  • vaccines which consist of inactivated particles, which do not exhibit the usual undesirable local and general side reactions, due to the fact that they consist of very immunogenic "immunosomes", which are formed by antigens attached to the membrane of a preformed liposome, and which are more immunogenic than the viral antigen subunits used for the preparation of the immunosome.
  • the liposomes, on the membrane of which the antigens are anchored, are, in fact, transport structures of fundamental interest: these structures consist of a double layer of lipids, in general phospholipids such as lecithins, in alternation with water or an aqueous solution, closed to form a "droplet", to which one can add, by inclusion and / or anchoring, various constituents - drugs, enzymes in particular - which one seeks to make convey by the blood to target organs, without these constituents being degraded on their journey.
  • IJ FIDLER see his article "Activation of macrophages by liposomes containing both lymphokines and muramyl dipeptide for treatment of heterogeneous metastases", published in Dev. Target-Oriented Anticancer Drugs, 1983, 219-226, applied the properties of liposomes for the treatment of metastases from solid tumors.
  • immunosomes liposomes carrying on their membrane the purified glycoprotein which constitutes one of the forms of the rabies antigen
  • immunosomes are capable of inducing a specific IL-2 response whereas an equivalent quantity of the purified glycoprotein used alone does not determine production of IL-2.
  • VNAb antibody neutralizing the virus
  • CTL cytotoxic T lymphocytes
  • ADCC antibody-dependent cytotoxic cells
  • IFN Interferon
  • WIKTOR et al. PROC. NAT. ACAD. SCI. USA, 1977, 74, 334-338 and DEVELOP. BIOL STANDARD, 1978, 40, 255-264 have suggested that cytotoxic T cells play a role important role in the elimination of the rabies virus. From this and taking into account that the in vitro proliferation of CTLs depends on the presence of IL-2, the inventors have been able to establish, surprisingly, that IL-2 of exogenous origin is capable of ensuring , alone or associated with antigens, an immunoprotective or immunotherapeutic action, when it is associated with liposomes. They were also able to surprisingly establish:
  • IL-2 of exogenous origin associated with liposomes and with an antigen, in particular with the purified glycoprotein of the rabies virus, induces an amplification of the protective power of the atigen
  • the subject of the present invention is a composition having immunostimulatory properties, characterized in that it comprises a lipid support, interleukin-2 (IL-2) or another lymphokine exerting an action similar to that of IL- 2, as well as optionally an agent having immunizing properties.
  • IL-2 interleukin-2
  • said composition comprises in combination, preformed liposomes and interleukin-2 (IL-2) or another lymphokine which exerts an action similar to that of IL-2, which composition exhibits properties for amplifying the activity of IL-2.
  • IL-2 interleukin-2
  • the composition according to the invention comprises, in combination with preformed liposomes, ⁇ nterleukme-2 and an immunogenic agent, in particular an antigen, which composition has properties for amplifying the activity of IL-2.
  • the antigen is chosen so that it is capable of inducing vaccination.
  • the liposomes are unilamellar and constituted by a single outer layer of a bilayer interfacial phase surrounding an aqueous polar phase, the interfacial layer containing at least one phospholipid chosen from the group which includes in particular phosphatidylcholine and cholesterol.
  • the process for preparing the compositions in accordance with the invention comprises mixing the lipid support, in particular liposomes preformed with IL-2 and optionally with an appropriate immunogenic agent.
  • the present invention also relates to pharmaceutical compositions containing an immunostimulatory composition according to the invention.
  • compositions according to the invention can be administered alone or in combination with inert carriers which are acceptable from the pharmaceutical point of view.
  • compositions according to the invention can be used, in humans or animals, in the prevention and treatment of viral infections, in particular herpes HSV2, as an adjuvant for prophylactic or therapeutic vaccination, in particular anti-rabies, as an immunostimulant, in particular in the treatment of cancers, etc ...
  • IL-2 which is hydrophobic in- would interact with liposomes (adsorption for example, as is the case with albumin and interferon alpha) and would then be better recognized by the T cell receptor whose proliferation would be amplified; or, the simultaneous solicitation of several receptors of the same cell by the IL-2 absorbed on the surface of the liposomes would be accompanied by a greater proliferation of the cells.
  • compositions according to the invention will be better understood using the additional description which follows, which refers to examples of preparations of the compositions according to the invention, reports of experiments relating to the potentiation of the substance associated with liposomes. , compositions according to the invention.
  • liposomes vesicles consisting of two monomolecular layers of phospholipids
  • OGP dialysable detergent
  • PC phosphatidylcholine
  • Chol cholesterol
  • Example 2 Preparation of a liposome-IL-2 mixture.
  • Example 3 0.3 ⁇ M of liposomes prepared according to Example 1 are mixed with 0.5 IU / ml of IL-2.
  • Example 4 The procedure is as described in Example 2, using 2.5 IU / ml of IL-2.
  • Example 4 The procedure is as described in Example 2, using 2.5 IU / ml of IL-2.
  • Example 6 Preparation of a liposome-IL-2-antigen mixture.
  • Example 3 The procedure is as described in Example 3 and, as antigen, envelope glycoprotein of the rabies virus is added.
  • Example 7 Effect of different antigens and liposomes on the activity of IL-2 and the proliferation of CTLL (Cytotoxic-T Lymphocytes line).
  • This table shows two series of experiments; in the first, the same amount of IL-2 was mixed with different antigens and then titrated for its ability to induce cell proliferation; in the second, IL-2 was previously mixed with liposomes (0.3 ⁇ M lipids), then with antigens.
  • the amplification factor is expressed by the ratio of the cpm measured with the IL-2-product mixture to the cpm measured with the same amount of IL-2 but without antigen or liposomes.
  • - CTLL cells correspond to T lymphocytes of mice which have been transformed and therefore can be maintained in culture by successive passages. These are cells whose survival and development depend on the presence of interleukme-2 (5-10 International Units per ml -Ul / ml-). They are grown in suspension in the presence of 10% fetal bovine serum and 10% CO 2 (complete RPMI-CTLL-1 medium). The CTLL cells used to assay IL-2 are therefore completely IL-2-dependent. In particular, two T-cytotoxic cell lines (CTLLD and CTLLc) were tested.
  • the amplification of proliferation is due to a potentiation of IL-2 by the liposomes (we can think of a simultaneous solicitation of several IL-2 receptors by the mixture IL-2-liposomes) rather than an interaction between the liposome and the antigen or cell.
  • the virus induces a greater proliferation of CTLL when it is added to a mixture of IL-2 and liposomes (amplification factor 3.7 to 4.5) than when it is mixed with liposomes then added to IL-2 (amplification factor 1.3 to 1.82).
  • the liposome mixed with IL-2 enhances cell proliferation. This amplification is illustrated in FIG.
  • This amplification is greater with the CTLLc line. It is dependent on the quantity of liposomes (expressed in nanomoles of lipids) and on the quantity of IL-2 whose activity is susceptible of being amplified. The best amplification was obtained with the CTLLc line for 0.046 to 0.187 units of IL-2 and 20 nanomole ⁇ of lipids (amplification by a factor equal to or greater than 2). The high liposome concentrations no longer amplify.
  • the lipo ⁇ ome ⁇ alone do not amplify the proliferation of CTLL cells, as shown in FIG. 2, which includes on the abscissa the concentration of liposomes expressed in nanomoles of lipid per 20,000 cells and on the ordinate the percentage of proliferation, taking as 100 %, the proliferation results obtained after treatment with the medium alone.
  • the curve corresponds to the CTLLc line, the curve corresponds to the lineage
  • Liposomes 1/10 FA * 1/20 FA * ⁇ M lipids
  • liposomes to IL-2 in its "associated" form, amplifies the activity of the latter by a factor of 1.6-1.7.
  • Example 8 Combination of recombinant human interleukin-2 with rabies treatment.
  • IL-2 stimulates the proliferation of cytotoxic T lymphocytes which are mainly responsible for rabies protection.
  • this product could be used in humans if it was found to be non-toxic and effective in animals;
  • Table III above shows that, in the context of the control of vaccines after exposure to wild virus, hamsters have been treated with IMS or with the inactivated virus in combination or not with recombinant human IL-2; in the second experiment, liposomes were either mixed with IL-2 or injected separately two hours after IL-2.
  • Example 9 Potentiation of protective power test (pre-exposure) by the association of IL-2 with vaccination.
  • IL-2 Given the place of IL-2 in the immune response and the fact that wild rabies specifically rewards production, recombinant human IL-2 has been associated with vaccinations. In addition, it has been demonstrated a phenomenon of amplification of the proliferation of T cells in the presence of liposomes and IL-2 (Example 7); a mixture of liposomes and purified virus was also used to verify whether the liposomes amplified the action of exogenous IL-2, or even perhaps endogenous IL-2.
  • IL-2 is capable of amplifying the protective power of IMS. Indeed, while only 30% of the animals are protected when injecting IMS (at a dilution lower than the effective dose 50%), all of the animals are protected by adding IL-2 for amounts varying from 10 at 100 IU / ml. In addition, it appears that a late injection (14 days) is not as effective.
  • the level of mterIeukin-2 at the time of the recall (or in the vicinity) plays an important role in the subsequent protection against rabies.
  • This level of IL-2 is amplified by the presence of liposomes or immunosomes.
  • mice were vaccinated on days 0 and 7 and then tested on day 21. Some of them received one or more injections of human IL-2 recombinant. Protection is expressed by the ratio of the number of surviving animals to the number of animals tested. In addition, for some of them, the level of neutralizing antibody (AcN) and the level of IL-2 were determined on the day of the test after simple stimulation with the culture medium in the absence of antigen.
  • AcN neutralizing antibody

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Abstract

La présente invention est relative à des compositions présentant des propriétés immunostimulantes et à leurs applications en médecine humaine et vétérinaire. Les compositions conformes à l'invention contiennent en combinaison des liposomes préformés et de l'interleukine-2 (IL-2) ou une autre lymphokine exerçant une action similaire à celle de l'IL-2, et éventuellement un agent immunogène présentant des propriétés vaccinantes. Application desdites compositions à la prévention et au traitement des infections virales, en tant qu'adjuvant de vaccination prophylactique ou thérapeutique, notamment antirabique ou comme immunostimulant, notamment dans le traitement des cancers.

Description

COMPOSITIONS PRESENTANT DES PROPRIETES
IMMUNOSTIMULANTES ET LEURS APPLICATIONS EN
MEDECINE HUMAINE ET VETERINAIRE
La présente invention est relative à une composition immunostimulante présentant en outre des propriétés d'amplification du pouvoir protecteur d'antigènes vaccinants, et en particulier du vaccin antirabique à usage humain ou vétérinaire.
L'interleukine-2 (IL-2) est une lymphokine qui joue un rôle déterminant dans la réponse immune. Précédemment désignée sour le nom de "facteur de croissance des cellules T", l'IL-2 est produite par des cellules lymphoïdes (principalement des lymphocytes T) stimulées par des antigènes ou des mitogènes. L'IL-2 présente une grande variété de propriétés immunoregulatrices. Elle favorise la prolifération et/ou la différenciation de cellules qui expriment un récepteur spécifique d'IL-2, notamment des cellules T, y compris les CTL (lymphocytes T cytotoxiques), les cellules tueuses naturelles (NK) et les cellules B. En raison de son action immunostimulante, l'IL-2 est à présent utilisée en immunothérapie de patients humains, une telle utilisation est rendue d'autant plus facile que l'on dispose maintenant d'IL-2 humaine recombinante.
On connait, dans le brevet européen 0 047 480, des vaccins constitués par des particules inactivées, qui ne présentent pas les réactions secondaires locales et générales indésirables habituelles, en raison du fait qu'ils sont constitués par des "immunosomes" très immunogenes, qui sont formés par des antigènes fixés sur la membrane d'un liposome préformé, et qui sont plus immunogenes que les sous-unités d'antigène viral utilisées pour la préparation de l'immunosome.
Les liposomes, sur la membrane desquels sont ancrés les antigènes, sont, en effet, des structures de transport d'un intérêt fondamental : ces structures se composent d'une double couche de lipides, en général des phospholipides tels que des lécithines, en alternance avec de l'eau ou une solution aqueuse, refermé pour former une "gouttelette", à laquelle on peut ajouter, par inclusion et/ou ancrage, divers constituants -médicaments, enzymes notamment - que l'on cherche à faire véhiculer par le sang jusqu'à des organes-cibles, sans que ces constituants soient dégradés sur leur parcours.
I.J. FIDLER (cf. son article "Activation of macrophages by liposomes containing both lymphokines and muramyl dipeptide for treatment of heterogeneous métastases"), paru dans Dev. Target-Oriented Anticancer Drugs, 1983, 219-226, a fait application des propriétés des liposomes pour le traitement des métastases de tumeurs solides. Il a pu établir, en effet, que les macrophages activés peuvent, de manière sélective, détruire des cellules tumorales, quel que soit leur type et il a montré que les liposomes multilamellaires contenant des immunomodulateurs, tels que les lymphokines ou le MDP (Muramyl dipeptide) ou les deux à la fois, constituent d'exceptionnels agents d'activation des macrophages de rongeurs, aussi bien in vivo qurin vitro, et augmentent ainsi la résistance de l'hôte aux métastases spontanées. De tels liposomes sont phagocytés et produisent une forte activation des macrophages.
Dans un article paru dans CELLULAR IMMUNOLOGY, 108, 220-226, 1987, D. OTH et al. font référence d'une part au fait que la production d'IL-2 par des cellules lymphoïdes, en particulier par les lymphocytes helper, est d'une importance majeure en ce qu'elle indique la présence d'un antigène et l'imminence des réactions immunologiques résultantes, et d'autre part au fait que les cellules lymphoïdes prélevées d'un organisme quelques jours après une première vaccination par des substances très antigémques, présentent une capacité accrue à produire de l'IL-2, qui peut également être restaurée par addition de l'antigène en cause au milieu de culture, même dans le cas où les cellules lymphoïdes ont été prélevées assez longtemps après une vaccination. Après avoir rappelé que ces observations ont été faites avec différentes sortes de stimuli antigé- niques, tels que des vaccinations contre des virus et qu'il a notamment été observé que les cellules T peuvent être activées après une vaccination antirabique, les Auteurs montrent que les immunosomes (liposomes portant sur leur membrane la glycoprotéine purifiée qui constitue l'une des formes de l'antigène rabique) sont capables d'induire une réponse IL-2 spécifique alors qu'une quantité équivalente de la glycoprotéine purifiée utilisée seule ne détermine pas de production d'IL-2.
Quatre facteurs semblent jouer un rôle important dans la réponse immune induite par la vaccination antirabique : 1) l'anticorps neutralisant le virus (VNAb) ; 2) les lymphocytes T cytotoxiques (CTL) ; 3) les cellules cytotoxiques anticorps-dépendantes (ADCC) ; 4) l ' interf éron (IFN).
WIKTOR et al. (PROC. NAT. ACAD. SCI. USA, 1977, 74, 334-338 et DEVELOP . BIOL STANDARD, 1978, 40, 255-264) ont suggéré que les lymphocytes T cytotoxiques jouent un rôle important dans l'élimination du virus de la rage. Partant de là et compte tenu du fait que la prolifération in vitro des CTL dépend de la présence d'IL-2, les Inventeurs ont pu établir, de façon surprenante, que l'IL-2 d'origine exogène est capable d'assurer, seule ou associée à des antigènes, une action immunoprotectrice ou immunothérapeu- tique, lorsqu'elle est associée à des liposomes. Ils ont également pu établir de façon surprenante :
- que i'IL-2 d'origine exogène induit une protection indépendamment de toute vaccination ;
- que l'IL-2 d'origine exogène, associée à des liposomes et a un antigène, notamment à la glycoprotéine purifiée du virus de la rage, induit une amplification du pouvoir protecteur de l'a'tigène ;
- que la présence des liposomes potentialise l'activité de l'IL-2 aussi bien exogène qu'endogène ;
- et que l'association de l'IL-2 avec des liposomes permet la mise en oeuvre de l'IL-2 à des doses non toxiques.
La présente invention a pour objet une composition présentant des propriétés immunostimulantes, caractérisée en ce qu'elle comprend un support lipidique, de l'interleukine-2 (IL-2) ou une autre lymphokine exerçant une action similaire à celle de l'IL-2, ainsi qu'éventuellement un agent présentant des propriétés immunisantes.
Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, ladite composition comprend en combinaison, des liposomes préformés et de l'interleukine-2 (IL-2) ou une autre lymphokine qui exerce une action similaire à celle de l'IL-2, laquelle composition présente des propriétés d'amplification de l'activité de l'IL-2.
Selon un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, la composition selon l'invention comprend en combinaison des liposomes préformés, de l'ιnterleukme-2 et un agent immunogène, notamment un antigène, laquelle composition présente des propriétés d'amplification de l'activité de l'IL-2.
Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, l'antigène est choisi de manière à ce qu'il soit susceptible d'induire une vaccination.
Selon un autre mode de réalisation de la composition conforme à la présente invention, les liposomes sont unilamellaires et constitués par une seule couche externe d'une phase interfaciale en bicouche entourant une phase polaire aqueuse, la couche interfaciale contenant au moins un phospholipide choisi dans le groupe qui comprend notamment la phosphatidylcholine et le cholestérol.
Le procédé de préparation des compositions conformes à l'invention comprend le mélange du support lipidique, notamment des liposomes préformés avec l'IL-2 et éventuellement avec un agent immunogène approprié.
La présente invention a également pour objet des compositions pharmaceutiques contenant une composition immunostimulante selon l'invention.
Ces compositions pharmaceutiques selon l'invention peuvent être administrées seules ou en combinaison avec des supports inertes acceptables du point de vue pharmaceutique.
Ces compositions selon l'invention peuvent être utilisées, chez l'homme ou l'animal, dans la prévention et le traitement des infections virales, notamment l'herpès HSV2 , comme adjuvant de vaccination prophylactique ou thérapeutique, notamment antirabique, comme immunostimulant, notamment dans le traitement des cancers, etc...
Les Demandeurs formulent l'hypothèse, actuellement en cours de vérification, que l'amplification de la prolifération in vitro des cellules T-cytotoxiques (CTLL) par les liposomes en présence d'IL-2 est due à une interaction entre l'IL-2 et le liposome plutôt qu'à une interaction du liposome avec la cellule en présence d'IL-2. Une hypothèse peut être émise : l'IL-2 qui est hydrophobe in- teragirait avec les liposomes (adsorption par exemple, comme c'est le cas de l'albumine et de l'interféron alpha) et serait ensuite mieux reconnue par le récepteur des cellules T dont la prolifération serait amplifiée ; ou encore, la sollicitation simultanée de plusieurs récepteurs d'une même cellule par l'IL-2 absorbée à la surface des liposomes serait accompagnée d'une plus grande prolifération des cellules.
L'invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de préparations des compositions selon l'invention, des compte-rendus d'expérimentation relatifs à la potentialisation de la substance associée aux liposomes, compositions conformes à l'invention.
Exemple 1 : Préparation des liposomes.
La préparation des liposomes (vésicules constitués de deux couches monomoléculaires de phospholipides) est fondée sur la méthode d'injection dans une solution tamponnée, de lipides maintenus en solution à l'aide d'un détergent dialysable (substance amphophile : ici l'OGP (octyl-glucopyranoside)).
Les lipides utilisés sont : la phosphatidylcholine (PC) (Avanti Biochemicals Inc) et le cholestérol (Chol) (même fournisseur). Ils sont tout d'abord dissous séparément dans une solution 100 mM et 200 mM d'OGP respectivement (tampon 10 mM Tris-HCl pH = 7,4). Les lipides sont mélangés à raison de 8 molécules de PC pour une molécule de Chol. Le mélange est ensuite injecté à l'aide d'une fine aiguille (26 G) dans environ 20 volumes de PBS préalablement refroidi (glace fondante). Après agitation, la formation des liposomes est achevée au cours d'une dialyse contre du tampon PBS.
Cette méthode conduit à l'obtention de liposomes monoiamellaires de taille homogène (60 à 80 nm de diamètre). Exemple 2 : Préparation d'un mélange liposomes- IL-2.
On mélange 0,3 μM de liposomes préparés selon l'exemple 1 avec 0,5 Ul/ml d'IL-2. Exemple 3 :
On procède comme décrit dans l'exemple 2, en utilisant 2,5 Ul/ml d'IL-2. Exemple 4 :
On procède comme décrit dans l'exemple 2, en utilisant 5 Ul/ml d'IL-2.
Exemple 5 :
On procède comme décrit dans l'exemple 2, en utilisant 10 Ul/ml d'IL-2.
Exemple 6 : Préparation d'un mélange liposomes- IL-2-antigène.
On procède comme décrit dans l'exemple 3 et on ajoute comme antigène, de la glycoprotéine d'enveloppe du virus rabique.
Exemple 7 : Effet de différents antigènes et des liposomes sur l'activité de l'IL-2 et la prolifération des CTLL (Cytotoxic-T Lymphocytes line).
TABLEAU I
Prolifération des CTLL : facteur d'amplification de l'efficacité de l'IL-2 mélangée à : Virus(a) G(b) NC(c) IMS(d) LIPOS(e) Virus
+ lipides
Quantité : d'IL-2 testée : (Ul/ml) :
0,5 : - - - 1,3 6
2,5 : 1,4 0,93 1,3 1,1 4,15
5 : - 2,0 3,33 10 : 1 0,91 1,2 1,75 5,5
Prolifération des CTLL : facteur d'amplification de l'IL-2 préalablement mélangée à 0,3 uM de liposomes et ensuite aux antigènes : Milieu Virus(a) G(b) NC(c) IMS d
2,5 4,1 4,6 3,6 4,6 4,5
10 3,92 3,74 2,85 3,55 3,7
(a) : virus rabique ; (b) : glycoprotéine d'enveloppe du virus rabique ; (c) : Nuciéocapside ; (d) : Immunosome ; (e) : Liposomes constitués des mêmes lipides que ceux du virus.
Ce tableau montre deux séries d'expériences ; dans la première, une même quantité d'IL-2 a été mélangée à différents antigènes puis titrée pour son aptitude à induire la prolifération des cellules ; dans la deuxième, l'IL-2 a préalablement été mélangée à des liposomes (0,3 μM de lipides), puis aux antigènes.
Le facteur d'amplification est exprimé par le rapport des cpm mesurés avec le mélange IL-2-produit sur les cpm mesurés avec la même quantité d'IL-2 mais sans antigène ni liposomes. - Les cellules CTLL correspondent à des lymphocytes T de souris qui ont été transformés et de ce fait peuvent être maintenus en culture par passages successifs. Ce sont des cellules dont la survie et le développement dépendent de la présence d'interleukme-2 (5-10 Unités Internationales par ml -Ul/ml-). Elles sont cultivées en suspension en présence de 10 % de sérum foetal bovin et de 10 % de CO2 (milieu RPMI-CTLL-1 complet). Les cellules CTLL utilisées pour doser l'IL-2 sont donc totalement IL-2-dépendantes. Deux lignées de cellules T- cytotoxic (CTLLD et CTLLc ) ont en particulier été testées. Les antigènes rabiqueε sont sans action directe sur les CTLL en l'absence d'IL-2. Cependant, on a remarqué que les IMS pouvaient, selon les préparations, induire en présence d'IL-2 une prolifération plus importante des cellules que ne le faisait l'IL-2 seule. L'IL-2 étant une protéine hydrophobe, les lipides et plus particulièrement les liposomes ont été pressentis comme étant responsables de ce phénomène. En effet, les résultats reportés dans le tableau I révèlent que les liposomes potentialisent l'action de l'IL-2 en augmentant la prolifération des CTLL. Il semble que l'amplification de la prolifération soit due à une potentialisation de l'IL-2 par les liposomes (on peut penser à une sollicitation simultanée de plusieurε récepteurs de l'IL-2 par le mélange IL-2-liposomes) plutôt qu'à une interaction entre le liposome et l'antigène ou la cellule. En effet, le virus induit une plus grande prolifération deε CTLL lorsqu'il est ajouté à un mélange d'IL-2 et de liposomes (facteur d'amplification 3,7 à 4,5) que lorsqu'il est mélangé à des liposomes puis ajouté à l'IL-2 (facteur d'amplification 1,3 à 1,82). De plus, le liposome mélangé à l'IL-2 amplifie la prolifération des cellules. Cette amplification est illustrée sur la figure 1 qui comprend en abscisse la quantité d'IL-2 et en ordonnée le nombre de cpm. Les résultats montrent le facteur d'amplification en présence de concentrations différentes de liposomeε exprimées en nanomoles de lipides ( : 0 nanomole de lipi-des/20 000 cellules ; 6 nanomoles de lipi-des/20 000 cellules ; : 20 nanomoles de lipides/20 000 cellules ; : 60 nanomoles de lipides/20 000 cellules).
Cette amplification est plus importante avec la lignée CTLLc. Elle est dépendante de la quantité de liposomes (exprimée en nanomoleε de lipides) et de la quantité d'IL-2 dont l'activité est suεceptibie d'être amplifiée. La meilleure amplification a été obtenue avec la lignée CTLLc pour 0,046 à 0,187 unités d'IL-2 et 20 nanomoleε de lipides (amplification d'un facteur égal ou supérieur à 2). Leε fortes concentrations en liposomes n'amplifient plus.
- Les lipoεomeε seuls n'amplifient pas la prolifération des cellules CTLL, comme le montre la figure 2, qui comprend en abscisse la concentration en liposomes exprimée en nanomoles de lipideε pour 20 000 cellules et en ordonnée le pourcentage de prolifération, en prenant comme 100 %, les résultats de prolifération obtenus après traitement par le milieu seul. La courbe correspond à la lignée CTLLc, la courbe correspond à la lignée
CTLLD.
C'est donc l'interaction des liposomeε avec l'IL-2 qui induit l'amplification de l'activité de cette dernière.
- Etude complémentaire de l'interaction IL-2/liposomes : L'IL-2 diluée dans du milieu de culture contenant 10 % de sérum foetal bovin a été mélangée à deε liposomes et filtrée sur SEPHADEX G200. La figure 3, qui comprend en abscisse le numéro de fraction et en ordonnée le nombre de cpm ; sur cette figure, ieε pics correspondent à de l'IL-2 en préεence de liposomes et les pics +—+ correεpondent à de l'IL-2 en préεence de PBS. Comme le montre les réεultatε reportés sur cette figure on n'observe pas de différence qualitative entre le produit qui a été mélangé aux liposomeε et celui qui ne l'a paε été. Cependant, εi l'on tient compte de la prolifération, on obtient leε réεultatε suivants : . Pour IL-2 + liposomes : Fractions 8 à 13 : 108 711 cpm soit 49,3 % Fractions 15 à 21 : 111 861 cpm soit 50,7 % . Pour IL-2 + PBS : Fractions 8 à 13 : 63 763 cpm soit 37,7 % Fractionε 15 à 21 : 105 606 cpm soit 62,3 % L'analyse de ces résultatε conduit à propoεer leε hypothèses suivantes : a) L'IL-2 diluée dans le sérum se présente sous une forme poiymérique (F8-13) ou plus vraisemblablement l'IL-2 se lie à certaines protéines sériques. b) Pour une même quantité d'IL-2, utilisée avec et sans liposomes, on constate que l'IL-2 "libre" (F15-21) se retrouve en quantité équivalente dans les deux cas (105 000 et 111 000 cpm) . Par contre on enregistre une prolifération plus importante au niveau des fractions correspondant aux masses moléculaires plus élevées (108 000 et 63 000 cpm).
Il semble que les liposomeε ont amplifié le pouvoir prolifératif de l'IL-2 "associée" (F8-13) : augmentation de l'activité d'un facteur 1,7. c) Afin de vérifier l'hypothèse ci-deεεuε quant au rôle des lipoεomeε, une quantité fixe d'IL-2 "associée" (provenant de la filtration sur G200, voir figure 3) et non mélangée à deε liposomes, a été mélangée soit à du tampon, soit à différentes quantités de liposomeε. On obtient leε réεultats de prolifération deε CTLLD comme montréε dans le tableau Il ci -après.
TABLEAU II
Nature du traitement Prolifération après dilution du produit traité
Liposomes 1/10 FA* 1/20 FA* μM lipides
IL-2 + PBS 0 18 595 - 9 127 -
IL-2 + Lipos. 0,4 30 546 1,64 15 639 1.71
IL-2 + Lipos. 0,2 27 095 1/46 15 250 1,67
IL-2 + Lipos. 0,1 27 549 1,48 11 421 1,25
IL-2 + Lipos. 0,05 22 419 1,2 9 245 1,01
IL-2 + Lipos. 0,025 21 614 1,16 9 719 1.06
* FA : Facteur d'amplification.
L'addition de liposomeε à de l'IL-2 sous sa forme "associée", amplifie l'activité de cette dernière d'un facteur 1,6-1,7.
Exemple 8 : Association d'interleukine-2 humaine recombinante au traitement antirabique.
L'IL-2 εtimule la prolifération de lymphocytes T cytotoxiqueε reεponεableε en majeure partie de la protection antirabique.
On a injecté de l'IL-2 à des hamsters préalablement infectés avec une dose létale de virus sauvage et éventuellement traités avec les IMS. On a choisi d'utiliser de llIL-2 humaine recombinante pour deux raisons :
1) ce produit pourrait être utilisé chez l'homme s'il s'avérait non toxique et efficace chez l'animal ;
2) parce que cette préparation de recombinant d'IL-2 est exempte de lymphokines ou de tout autre médiateur de l'immunité.
Les résultats obtenus lors de l'association d'IL-2 au traitement sont reportés dans le tableau III, ci-après. Lorsque l'IL-2 est injectée aux mêmes temps que l'antigène, on constate qu'elle n'amplifie pas son pouvoir protecteur. Par contre, lorsque l'IL-2 eεt injectée sanε antigène on enregistre une protection significative et du même niveau que celle obtenue par la vaccination : il semble que dans ce cas l'IL-2 potentialiserait l'action' soit de l'inoculum et l'immunité spécifique, soit de l'immunité non spécifique qui interviendrait pour éliminer le virus. Cependant, ce rôle de l'IL-2 est complexe, car il peut être positif ou négatif, comme en témoigne l'action d'un mélange d'IL-2 et de liposomes. En effet, on enregistre une mortalité plus importante lorsque l'IL-2 est mélangée aux liposomes que lorsque les deux produits sont injectés séparément (Tableau III). Ces résultats sembleraient signifier qu'un taux trop important de cette immuno-hormone, par un mécanisme non encore élucidé, inhiberait la (ou les) réponse(s) conduisant à la protection.
TABLEAU III
Conséquences de l'adjonction d'IL-2 au traitement antirabique après exposition au virus
Activité protectrice après traitement avec
IL-2 (% d'animaux survivants)
1ère exp. Quantité d'IL-2 Ul/injection
Sans IL-2 10 5 1
Sans Ag 0 50 40 50
IMS 0,2 μg 33 33 ND* ND*
IMS 1 μg 33 33 ND* ND*
Activité protectrice après traitement avec IL-2
(% d'animaux survivants) 2ème exp.
Nombre et jours d'injection Sans IL-2 IL-2 seule IL-2 + lipos. IL-2 + lipos.
(mélange) (inj. séparées) 2 inj. 3 inj. 3 inj. 3 inj. (J0,J3) (J0,J3,J7) (J0,J3,J7) (J0,J3,J7) Sans Ag 0 ND* 60 40 ND*
IMS 0,5 μg 40 20 40 0 4C
Virus 0,5 μg 60 ND* 0 ND* ND*
ND* : non déterminé.
Le tableau III ci-dessus montre que, dans le cadre du teεt de contrôle deε vaccins après exposition au virus sauvage, deε hamsterε ont été traités par les IMS ou par le virus inactivé en association ou non avec l'IL-2 humaine recombinante ; dans la deuxième expérience, des liposomes ont été soit mélangés à l'IL-2 soit injectée εéparément deux heures après l'IL-2.
Exemple 9 : Essai de potentialisation du pouvoir protecteur (pré-exposition) par l'association d'IL-2 à la vaccination.
Compte-tenu de la place qu'occupe l'IL-2 dans la réponse immunitaire et du fait que la rage sauvage dé- prime spécifiquement sa production, l'IL-2 humaine recombinante a été associée aux vaccinations. De plus, il a été mis en évidence un phénomène d'amplification de la prolifération des cellules T en présence de liposomes et d'IL-2 (exemple 7) ; un mélange de lipoεomeε et de virus purifié a aussi été utilisé afin de vérifier si les liposomes amplifiaient l'action de l'IL-2 exogène, voire peut-être l'IL-2 endogène.
Tout d'abord, dans une expérience préliminaire on a étudié quels pouvaient être la dose d'IL-2 et le moment d'injection pour obtenir une éventuelle amplification du pouvoir protecteur deε IMS. D'après les résultats reportés dans le tableau IV, on constate que l'IL-2 est capable d'amplifier le pouvoir protecteur deε IMS. En effet, alors que seulement 30 % des animaux sont protégés lorsqu'on injecte des IMS (à une dilution inférieure à la dose efficace 50 %), la totalité deε animaux est protégée par addition d'IL-2 pour des quantités variant de 10 à 100 Ul/ml. De plus, il apparaît qu'une injection tardive (à 14 jours) n'est pas aussi efficace.
Dans une autre série d'expériences, (tableau V) on a étudié, pour une même dose d'IL-2 (10 UI/inj.), l'influence du moment de l'injection, de la dose d'antigène et de la présence éventuelle de liposomes. Pour une quantité d'IMS supérieure à la dose efficace 50 %, le rôle de l'IL-2 semble équivoque puisque nous n'observons que 75 % de protection au lieu de 100 %. Par contre, lorsque la quantité d'IMS est inférieure à la DE 50 % (ici 2 μg/injection), l'injection d'IL-2 (7ème jour) au moment du rappel antigenique augmente la protection induite par les IM'S mais aussi celle induite par le virus purifié.
Lors du traitement par l'IL-2 on a observé une mortalité précoce chez :
1) les animaux immunisés et traités avec l'IL-2 au jour 0 ; 2) les animaux immunisés et traités avec l'IL-2 au jour 7.
Le traitement au jour 7 conduit à un profil de mortalité identique à celui des IMS seuls. Par contre, l'adjonction de liposomes au vaccin entraîne une mortalité plus tardive. Tout semble se pasεer comme si : a) une meilleure protection (IL-2 à J7 le jour du rappel) résultait d'une diminution de la mortalité précoce ; b) une plus faible protection (IL-2 à JO) résultait d'une augmentation de la mortalité précoce. Cette constatation conduirait à penser que l'IL-2 exogène agirait plutôt sur un facteur immunopathologique (positivement ou négativement) que sur une fonction éliminant directement le virus.
Le taux d'mterIeukine-2 au moment du rappel (ou au voisinage) joue un rôle important pour la protection ultérieure contre la rage. Ce taux d'IL-2 eεt amplifié par la présence de liposomes ou d'immunosomes.
TABLEAU IV
Potentialisation de la protection par injection d'IL-2
Protection (%) après injection d'IL-2 (Ul/inj)
100 10 1 0
Jours d'injection de l'IL-2
7 100 100 50 -
9 100 50 75 -
14 50 75 50 - sans IL-2 - - - 30 TABLEAU V
Nature et quantité Jour d'injection Protection AcN IL-2 d'antigène injecté IL-2 : 10 Ul/inj. % Ul/ml (Ul/ml) ng/inj.
0 - 0 < 0,4 0
IMS 10 - 100 13 5,,6
IMS 10 0 75 80 8
IMS 10 7 75 38 3,6
IMS 10 0 + 7 100 42 5,1
IMS 2 - 12 6 1,2
IMS 2 0 0 8 5,5
IMS 2 7 40 3 5,9
IMS 2 0 + 7 60 3 6,8
Vaccin 1,5 - 0 - -
Vaccin 1,5 0 50 - -
Vaccin 1,5 7 33 - -
Vaccin 1,5 10 33 - -
Vaccin 1,5 14 0 - -
Vaccin 1,5 0 + 7 16 - -
Vaccin + Liposomes 40 - -
Le tableau V ci-dessus montre que, dans le cadre du test du NIH, des souris ont été vaccinées aux jourε 0 et 7 puis éprouvées au jour 21. Certaines d'entre elles ont reçu une ou plusieurs injections d'IL-2 humaine recombinante. La protection eεt exprimée par le rapport du nombre d'animaux survivants sur le nombre d'animaux éprouvés. De plus, pour certains d'entre eux le taux d'anticorps neutralisantε (AcN) et le taux d'IL-2 ont été déterminés le jour de l'épreuve après simple stimulation par le milieu de culture en absence d'antigène. Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasεe au contraire toute les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée de la présente invention.

Claims

REVENDICATIONS
1 ) Composition présentant des propriétés immunostimulantes, caractérisée en ce qu'elle comprend un support lipidique, de l'mterleukme-2 (IL-2) ou une autre lymphokine exerçant une action similaire à celle de l'lL-2, ainsi qu'éventuellement un agent présentant des propriétés immunisantes.
2 ) Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend en combinaison des liposomes préformés et de l'ιnterleukme-2 (IL-2) ou une autre lymphokine exerçant une action similaire à celle de l'IL-2, laquelle composition présente des propriétés d'amplification de l'activité de l'IL-2.
3 ) Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend en combinaison des liposomes préformés, de l'IL-2 et un agent immunogène, notamment un antigène, laquelle composition présente des propriétés d'amplification de l'activité de l'IL-2.
4 ) Composition selon la revendication 3, caractérisée en ce que l'antigène est choisi de manière à ce qu'il présente des propriétés vaccinantes.
5') Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que les liposomes sont unilamellaires et constitués par une seule couche externe d'une phase mterfaciale en bicouche entourant une phase polaire aqueuse, la couche interfaciale contenant au moins un phospholipide.
6 ) Composition selon la revendication 5, caractérisée en ce que le phospholipide eεt cnoisi dans le groupe qui comprend notamment la phosphatidylcholme et le cholestérol.
7 ) Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend une composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 6.
8 ) Composition selon la revendication 7, caractérisés en ce qu'elle est administrée seule ou en com binaison avec des supports inertes acceptables du point de vue pharmaceutique.
9 ) Applications de la composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, chez l'homme ou l'animal, notamment à la prévention et au traitement, des infections virales, en tant qu'adjuvant de vaccination prophylactique ou thérapeutique, notamment antirabique ou comme immunostimulant, notamment dans le traitement des cancers.
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