ES2342606T3

ES2342606T3 - Blanco in vivo de celulas dentriticas.

Info

Publication number: ES2342606T3
Application number: ES04761162T
Authority: ES
Inventors: Joseph Altin; Christopher Richard Parish
Original assignee: Lipotek Pty Ltd
Current assignee: Lipotek Pty Ltd
Priority date: 2003-08-21
Filing date: 2004-08-23
Publication date: 2010-07-09
Anticipated expiration: 2024-08-23
Also published as: US20070026057A1; JP2007502780A; EP1660040B1; CN1893925A; EP1660040A1; JP4970035B2; AU2004266034A1; CN102172397A; AU2004266034B2; CN1893925B; DE602004025711D1; WO2005018610A1; EP1660040A4; CN102172397B; ATE458472T1; US20130142864A1

Abstract

Una composición para modular la inmunidad mediante el apuntamiento in vivo de un antígeno a las células dendríticas, la composición comprende: Una preparación de vesículas de membrana que contienen antígeno o liposomas que contienen antígeno que tienen sobre la superficie de ésta una pluralidad de grupos quelantes de metal, en donde los grupos quelantes de metal son grupos de cabeza de moléculas anfifílicas presentes dentro de los fosfolípidos y/o lípidos que comprenden las vesículas o liposomas; y un ligando, seleccionado del grupo que consiste de un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo o un anticuerpo de dominio, que puede unirse específicamente a un receptor sobre dichas células dendríticas, dicho ligando está ligado a dicho grupo quelante metálico por vía de una etiqueta de afinidad de metal sobre dicho ligando; en donde, Dichas vesículas que contienen antígeno o liposomas incluyen un factor inmunomodulador seleccionado de un lipopolisacárido bacteriano y un interferón-γ.

Description

Blanco in vivo de células dendríticas.

Campo técnico

La invención descrita aquí se relaciona de manera general con la composición de preparaciones para el blanco de antígeno asociado a membrana (Ag) a células dendríticas (DC) con el fin de modular respuestas inmunes, o para prevención de enfermedades o para propósitos terapéuticos. Más particularmente, la invención se relaciona con un método para modificar membranas que contienen Ag, para permitir el injerto y/o incorporación de moléculas blanco y factores inmunomoduladores, permitiéndole a las membranas modificadas ser el blanco a los DC in vivo e inducir potencialmente, o suprimir, respuestas inmunes. Aún más particularmente, la invención se relaciona con una composición que se puede utilizar para modificar estructuras de membrana que contienen Ag, tal como liposomas o vesículas de membrana de plasma (PMV), para permitir que las membranas sean blanco efectivamente a los DC in vivo, modulando de esta manera inmunidad, y posibilitarles ser utilizadas como vacunas o agentes similares a vacuna en inmunoterapias para evitar o tratar enfermedad en humanos y animales.

Técnica anterior

Las células dendríticas (DC) son una rara población de células que presentan antígeno (APC) únicamente capaces de estimular respuestas inmunes primarias, y se ha desarrollado un fuerte interés en su uso en inmunoterapias de cáncer^{1}. Intentos para aprovechar la capacidad de los DC para estimular respuestas potentes inmunes se han enfocado hasta ahora principalmente en los procedimientos que involucran la manipulación de los DC ex vivo. Esta aproximación requiere a menudo de que los DC se aíslen de un paciente, se expandan en números, cargados con antígeno (Ag) (ref's 2-5), y luego se reintroduzcan en el paciente. Mientras este procedimiento es simple en principio, existen dificultades asociadas con el aislamiento y cultivo de tal población de célula rara. ^{6,7} Claramente, las estrategias que suministran los Ag directamente a los DC in vivo, y que pueden provocar una respuesta inmune apropiada, tiene enorme potencial clínico.

Los DC se originan de progenitores en la médula ósea y migran como células inmaduras a los tejidos periféricos donde ellas internalizan Ag y sufren un proceso de maduración complejo. El Ag se internaliza por vía de un número de receptores de superficie, que incluyen los receptores de complemento (por ejemplo, CDIIc/CD18) y los receptores endocíticos (por ejemplo, DEC-205, DC-SIGN y los receptores similares a Toll). Durante la adquisición Ag, los DC inmaduros también pueden recibir "señales de peligro", en la forma de moléculas relacionadas con patógeno tales como lipopolisacáridos de la pared de células bacterianas (LPS), o estímulos inflamatorios por vía de citoquinas tales como IFN-\gamma. Los DC migran entonces a los órganos linfoides secundarios, madurando para volverse los APC competentes.^{8} Los receptores tales como el CD11c/CD18, DEC-205, DEC-SIGN y los receptores similares a Toll juegan un papel crucial en el proceso de captura de Ag y la presentación, y se expresan principalmente sobre los DC. Es concebible, por lo tanto, que estos receptores también se puedan utilizar para blanco de Ag directamente al DC in vivo. Consistente con esta noción, las proteínas de fusión compuestas de Ag y anticuerpos de cadena simple (ScFvs) a DEC-205 han mostrado apuntar a los DC in vivo, incluyendo la activación de la célula T cuando se co-administra con estimuladores inflamatorios tales como el anticuerpo anti-CD40.^{9,10} En contraste, en la ausencia de tales estimuladores inflamatorios, el antígeno blanco a los DC por vía del ScFvs no indujo respuestas a la célula T.

Los liposomas sintéticos tienen el potencial de suministrar grandes cantidades de Ags a los DC (Ref. 11), pero hasta la fecha su blanco a moléculas de superficie DC específicas ha sido difícil de lograr en la práctica.^{12,13} De manera clara, una estrategia efectiva que combina la capacidad de llevar Ag de liposomas y la especificidad del reconocimiento molecular a los Ag de múltiple blanco con o sin "señales de peligro" directamente a los DC in vivo, tendría un enorme potencial en simplificar las inmunoterapias DC, particularmente para cáncer, infecciones, y enfermedades auto-inmunes.

La Solicitud Internacional No. PCT/AU00/00397 (Publicación No. WO 00/64471) describe un método de modificar membranas biológicas o sintéticas o liposomas con el propósito de alterar la inmunidad, o para apuntar a fármacos u otros agentes a un tipo de célula o tejido específico cuando las membranas biológicas o sintéticas modificadas o los liposomas se administran in vivo. La modificación de las membranas o liposomas se logra mediante la incorporación o la unión de grupos quelantes de metal, permitiendo de esta manera el injerto de una o más moléculas blanco que poseen una etiqueta de afinidad del metal. Sin embargo, la naturaleza de la respuesta inmune inducida al apuntar Ag a los DC es críticamente dependiente de la presencia de factores inmunomoduladores específicos tal como citoquinas o señales de "peligro", y no hay descripción o sugerencia en la PCT/AU00/00397 de la modificación de membrana que se requiere, o los factores inmunomoduladores que se necesitan, para provocar una respuesta inmune apropiada in vivo.

Resumen de la invención

Un objeto de la invención el objeto de esta solicitud, es suministrar una composición para el blanco in vivo a los DC, de liposomas que contienen Ag y PMV, al modificar las dichas membranas a través de la incorporación de un factor inmunomodulador apropiado, o la "señal de peligro", y el injerto de un ligando, que puede apuntar las membranas modificadas a los receptores sobre la superficie de los DC, y provocar de esta manera una respuesta inmune apropiada. La composición se puede utilizar como vacunas o inmunoterapias, o para potenciar la inmunidad para evitar o tratar enfermedades tales como varios cánceres e infecciones, o suprimir la inmunidad a un auto Ag específico de una manera que se pueda utilizar para tratar o evitar rechazo de transplante, o los efectos de las enfermedades autoinmunes tales como la diabetes tipo I, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico y esclerosis múltiple.

Objetos adicionales de la invención son suministrar un proceso para preparar composiciones adecuadas, y métodos de tratamiento que utiliza las composiciones.

De acuerdo con una primera realización de la invención, se suministra una composición para modular la inmunidad mediante el blanco in vivo de un antígeno a células dendríticas, la composición comprende:

: una preparación de las vesículas de membrana que contienen antígeno o los liposomas que contienen antígeno que tienen sobre la superficie de ésta una pluralidad de grupos quelantes de metal; y

: un ligando para un receptor sobre dichas células dendríticas, dicho ligando está ligado a dicho grupo quelante de metal por vía de una etiqueta de afinidad de metal sobre dicho ligando; en donde,

: dichas vesículas que contienen antígeno o liposomas incluyen un factor inmunomodulador.

De acuerdo con una segunda realización de la invención, se suministra un proceso para preparar una composición para modular una respuesta inmune mediante el blanco in vivo de un antígeno a células dendríticas, el proceso comprende las etapas de:

i): preparar las vesículas de membrana que contienen antígeno o los liposomas que contienen antígeno;

ii): modificar dichas vesículas de membrana que contienen antígeno o los liposomas que contienen antígeno mediante la incorporación de al menos un factor inmunomodulador;

iii): modificar adicionalmente dichas vesículas de membrana que contienen antígeno o los liposomas que contienen antígeno mediante la incorporación de moléculas anfifílicas, en donde dichas moléculas anfifílicas incluyen un grupo quelador que descansa sobre la superficie de dichas de membrana que contienen antígeno o liposomas que contienen antígeno cuando se incorporan en éste; y

iv): poner en contacto el producto de la etapa (iii) con un ligando para un receptor sobre dichas células dendríticas, en donde dicho ligando incluye una etiqueta de afinidad de metal para unirse a dicho grupo quelador.

De acuerdo con una tercera realización de la invención, se suministra un método para modular una respuesta inmune en un sujeto, el método comprende administrar a dicho sujeto una composición de acuerdo con la primera realización.

De acuerdo con una cuarta realización de la invención, se suministra un método para evitar o tratar un tumor en un sujeto, el método comprende administrar al sujeto una composición de acuerdo con una primera realización, en donde dicho antígeno incluido en dichas vesículas de membrana que contienen antígeno o liposomas que contienen antígeno es un antígeno de tumor.

De acuerdo con una quinta realización de la invención, se suministra un método para evitar o tratar una infección en un sujeto, el método comprende administrar al sujeto una composición de acuerdo con una primera realización, en donde dicho antígeno incluido en dichas vesículas de membrana que contienen antígeno o liposomas que contienen antígeno es un antígeno proveniente de un agente que causa la infección.

De acuerdo con una sexta realización de la invención, se suministra el uso de una composición de acuerdo con una primera realización en la preparación de un medicamento para modular una respuesta inmune en un sujeto.

De acuerdo con una séptima realización de la invención, se suministra el uso de una composición de acuerdo con una primera realización en la preparación de un medicamento para evitar o tratar un tumor en un sujeto.

De acuerdo con una octava realización de la invención, se suministra el uso de una composición de acuerdo con una primera realización en la preparación de un medicamento para evitar o tratar una infección en un sujeto.

Otras realizaciones de la invención serán evidentes de una lectura de la siguiente descripción detallada de la invención, en cuya descripción se hará referencia a los dibujos que acompañan brevemente descritos posteriormente.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra la estructura de un lípido quelador novedoso (NTA)_{3}-DTDA. La Figura 1B es una representación esquemática del lípido (NTA)_{3}-DTDA incorporado en el antígeno (Ag) que contiene liposomas furtivos (SL) compuestos de palmitoil-oleoil-fpsfatidilcolina (POPC) y fosfatidil-etanolamina-(polietilen)glicol_{2000} (PE-PEG_{2000}). La Figura 1C es similarmente una representación esquemática de liposomas de composición similar a aquellas de la Figura 1B pero sin PE-PEG_{2000} que se pueda fusionar con las vesículas de membrana de plasma derivadas de células de tumor que llevan antígeno (PMV). En ambos casos, el SL (B) y el PMV modificado (C), el trazador de lípido PC-BODIPY (no mostrado) también se puede incluir para facilitar el seguimiento de los liposomas o de los PMV modificados. El (NTA)_{3}-DTDA permite el injerto de los ScFv Abs etiquetados con histidina contra el DEC-205 y el CD11c sobre el liposoma o la superficie PMV modificada, y consecuentemente, el blanco de éstos a los marcadores de superficie tal como DEC-205 y CD11c sobre los DC.

La Figura 2 muestra que el PMV y el SL injertados con el CD11c-ScFv y el DEC-205-ScFv se une a los DC. Con relación a la Figura 2A, el PMV derivado de las células B16-OVA se fusionó con los liposomas compuestos de POPC, (NTA)_{3}-DTDA, y PC-BODIPY. Los PMV se injertaron entonces con un péptido de control (PMV-L2), CD11c-ScFv (PMV-CD11c), o DEC-205-ScFv (PMV-DEC-205), antes de que se incuben con LTC-DC y la célula unida a BODIPY fluorescencia cuantificada mediante citometría de flujo. La Figura 2B muestra la unión al LTC-DC del SL similarmente injertado compuesto de POPC, (NTA)_{3}-DTDA, PE-PEG_{2000} y PC-BODIPY. Cada perfil es representativo de aquel obtenido de los tres experimentos separados.

La Figura 3 muestra que el PMV injertado con ScFv apunta a los DC en el nodo linfático de drenaje. Los ratones se inyectaron en la almohadilla de la pata trasera con un PMV marcado con fluoresceína que se había injertado con proteína de control (PMV-L2), o con ScFv al CD11c (PMV-CD11c) y al DEC-205 (PMV-DEC-205). A. Después de la inyección los ganglios linfáticos poplíteos de drenaje se removieron par teñir las células del ganglio linfático aislado con un anti-CD11c mAb y PE-estreptavidina biotinilada. Las gráficas de punto de la citomatría de flujo muestran doble teñido que describe la PE-fluorescencia (paneles, i, iii y v), y la correspondiente FITC-fluorescencia (paneles, ii, iv y vi) de las células del ganglio linfático, según se indicó. B. Los resultados de experimentos similares en los cuales las secciones del ganglio linfático se tiñeron con un anti-CD11c mAb biotinilado y estreptavidina-Rhodamina para identificar los DC con las imágenes de fluorescencia de los campos correspondientes que describe la Rhodamina-fluorescencia (imágenes, i, iii y v) y la fluorescencia de fluorescidina PMV (imágenes ii, iv y vi).

La Figura 4 muestra que el PMV y SL injertado blanco a los DC estimula la proliferación de célula T. A. Las células T esplénicas C57BL6 singenéricas se incubaron con los DC no pulsados, o con DC que se habían pulsado con B16-OVA PMV injertado con L2, CD11c-ScFv, o DEC-205-ScFv (panel izquierdo); el SL que lleva el SIINFEKL-6H injertado con L2, CD11c-ScFv, o DEC-205-ScFv (panel medio); y el SL que contiene OVA injertado con L2, CD11c-ScFv, o DEC-205-ScFv (panel derecho). Las células se cultivaron durante 4 días antes de evaluar la incorporación de [^{3}H]-timidina; los resultados son cpm \pm SEM. B. Estimulación de la proliferación de célula T CD4^{+} y CD8^{+}. Las células T esplénicas C57BL6 singenéricas marcadas con CFSE se incubaron con los DC pulsados con PMV injertado con DEC-205-ScFv (PMV), el SL injertado con DEC-205-ScFv y SIINFEKL-6H (SIINFEKL-SL), y el SL que contiene OVA injertado con DEC-205-ScFv (OVA-SL). Las células se cultivaron durante 4 días y la proporción relativa de proliferar células T CD4^{+} y CD8^{+}, con base en la dilución de CFSE, se evaluó por citometría de flujo.

La Figura 5 comprende los resultados de la vacunación de ratones con PMV y SL y muestra la estimulación de la actividad CTL contra las células tumorales. A. La actividad CTL de los esplenocitos estimulados durante 4 días con células B16-OVA irradiadas con \gamma y derivadas de ratones inyectados i.v. con PBS solo (PBS), B16-OVA PMV injertado con el péptido L2 (PMV-L2), el PMV injertado con DEC-205-ScFv solo (PMV-DEC-205), o en combinación con LPS (PMV-LPS-DEC-205), IFN-\gamma(PMV-IFN-\gamma-DEC-205), o GM-CSF(PMV-GM-CSF-DEC-205). B. La actividad CTL de los esplenocitos (proporción 25:1 E:T) de ratones que siguió la inmunización con PMV, SL que contiene SIINFEKL, y SL que contiene OVA, cada uno injertado con L2, CD11cScFv o DEC-205-ScFv, como se indicó. Los resultados para las condiciones en las cuales el LPS, IFN-\gamma y el GM-SCF se incorporaron con el PMV y el SL injertados, como se indicó, también se muestra. Los asteriscos indican que la actividad CTL es significativamente mayor (n=6*, P<0.05;**, P<0.01 y **, P<0.001) que los ratones inmunizados con la preparación Ag correspondiente injertada con el péptido L2. En los paneles A y B la lisis específica a las proporciones E:T indicada, se evaluó en un ensayo de liberación de ^{51}Cr estándar. Los resultados se expresan como lisis específica porcentual \pm SEM.

La Figura 6 muestra que la vacunación con el PMV y el SL modificado elicita inmunidad tumoral. Los grupos separados de ratones C57BL6 singenéricos se inmunizaron (tres veces a intervalos semanales) con PMV injertado con L2, CD11c-ScFv, o DEC-205-ScFv; el SL injertado con SIINFEKL-6H y L2, CD11c-ScFv o DEC-205-ScFv; y SL que contiene OVA injertado con L2, CD11c-ScFv, o DEC-205-ScFv, con cada preparación de vacuna que se inyecta sola o en combinación con el LPS o IFN-\gamma, como se indicó. Los ratones se inocularon i.v. con células B16-OVA, y después de 16 días los pulmones se removieron y se examinaron para metástasis en pulmón. El resultado muestra el número medio de foco de tumor para cada grupo de ratones \pm SEM. La línea punteada se refiere al número de metástasis de tumor en los ratones de control que se inyectaron con PBS.

La Figura 7 describe respuestas anti-tumorales en ratones knockout eotaxin. A. Los ratones C57BL6 singenéricos (Eotaxin^{+/+}) p los ratones knockout eotaxin (Eotaxin^{-/-}) sobre un antecedente de C57BL6, se inmunizaron con PBS, o con PMV que contiene IFN-\gamma injertado con L2 (PMV-L2) o DEC-205-ScFv (PMV-DEC-205), como se indicó. Los esplenocitos se aislaron de los ratones, y se co-cultivaron con células B16-OVA nativas irradiadas con \gamma. La lisis específica en las proporciones E:T indicadas, se evaluó en un ensayo de liberación ^{51}Cr estándar. Los resultados se expresan como la lisis específica porcentual \pm SEM. B. Los ratones se inmunizaron como anteriormente y luego se inocularon i.v. con células B16-OVA, siendo removidos y examinados los pulmones después de 16 días para metástasis tumoral. Los resultados muestran el número medio de focos tumorales para cada grupo de ratones \pm SEAM.

La Figura 8 muestra que las vesículas de la membrana de la micobacteria BCG injertada con CD11c-ScFv y DEC-205-ScFv se une a los DC. El Ni (NTA)_{3}-DTDA se combinó con el PMV derivado de la micobacteria BCG y se marcó con succinimidil éster de ácido 6-(fluorescein-5(y-6)-carboxamido)hexanóico. Los PMV se injertaron entonces con un péptido de control (BCG-Lipo+L2), CD11c-ScFv (BCG-Lipo+CD11c), o DEC-205-ScFv (BCG-Lipo+DEC205), antes de incubarse con los JAWS-11 DC después de lo cual se cuantificó la fluorescencia unida a célula mediante citometría de flujo. El panel superior muestra los resultados para el BCG-Lipo+CD11c aunque el panel inferior comprende los resultados del BCG-Lipo+DEC205. En cada panel, la traza a mano izquierda es para las células JAWS-11 solas, el trazo medio es para el control BCG-Lipo+L2, mientras que el trazo a mano derecha es para BCG-Lipo+CD11c o BCG-Lipo+DEC205.

La Figura 9 describe los resultados de un análisis Elispot de células T esplénicas de ratones C57/BL6 que se han vacunado intravenosamente con preparaciones BCG injertadas. Los injertos fueron: péptido L2 como un control (sonicado BCG+L2); CD11c-ScFv (sonicado BCG+CD11c); o DEC-205-ScFv (sonicado BCG+DEC205). Los ratones de control se vacunaron con PBS utilizado como un portador para las preparaciones.

Descripción detallada de la invención

Las siguientes abreviaturas se utilizan aquí:

1

El término "antígeno" se utiliza aquí para denotar cualquier molécula que se pueda tomar, internalizar y procesar mediante los DC, para la presentación al sistema inmune.

El término "ligando" se utiliza aquí para denotar cualquier molécula que se pueda unir específicamente in vivo a marcadores/receptores sobre la superficie de los DC. El término incluye anticuerpos completos, y fragmentos de anticuerpo tales como los ScFv y los anticuerpos de dominio.

El término "factor inmunomodulador" se utiliza aquí para denotar cualquier "señal de peligro", citoquina o molécula que pueda modular el curso o resultado de una respuesta inmune.

El término "receptor" se utiliza aquí para denotar una molécula receptora sobre la superficie de un DC, y es la entidad sobre la superficie DC con la cual puede interactuar un liposoma o ligando injertado con vesícula de membrana.

El término "tumor" se utiliza aquí para denotar tumores sólidos benignos y malignos así como también cánceres sólidos y no sólidos.

Con relación a la primera realización definida anteriormente, las vesículas de membrana que contienen antígeno son típicamente los PMV pero se pueden formar de cualquier membrana biológica o estructura biológica. Los PMV son PMV ventajosamente derivados de tumor. Los PMV también pueden ser PMV derivados de linfocito o PMV derivados de leucocito. Los PMV pueden ser adicionalmente preparaciones de membrana de bacteria, protozoos, virus u hongos. Con relación a los liposomas que contienen antígeno, éstos incluyen liposomas furtivos (SL) que se puede producir de diferentes mezclas de lípidos. Tales vesículas y liposomas se pueden preparar como se describe en las referencias 14, 16, 17 y 28.

El Ag de las composiciones puede ser cualquier Ag, o el ADN que codifica un Ag, contra el cual se desea una respuesta inmune. Una composición puede comprender una pluralidad de diferentes antígenos que puede ser de la misma o de diferente fuente. Esto es, una composición que comprende antígenos tumorales puede incluir antígenos de diferentes tumores.

Los grupos quelantes de metal sobre la superficie de las vesículas y los liposomas existen como grupos de cabeza de moléculas de ampicilina presentes dentro de los fosfolípidos y/o lípidos que comprenden las vesículas y liposomas. La molécula amfifílica es ventajosamente ácido nitrilotriacético ditetradecilamina (NTA-DTDA) o fosfatidiletanolamina de ácido nitrilotriacético (PE-NTA), pero las composiciones pueden incluir cualquier molécula que contenga cualquier grupo funcional de unión o quelante de metal que se pueda incorporar en las membranas de lípido. Las composiciones pueden comprender además mezclas de moléculas anfifílicas.

Como se explicará con mayor detalle adelante, una molécula anfifílica preferida es la (NTA)_{3}-DTDA (tri(ácido nitrilotriacético)ditetradecilamina). La molécula relacionada NTA-DTDA, junto con otras moléculas anfifílicas y vesículas y liposomas que contienen el mismo, se describen con mayor detalle en la Solicitud Internacional No. PCT/AU00/00397 (Publicación No. WO 00/64471).

El ligando ligado a los grupos quelantes de metal sobre las vesículas de membrana y los liposomas puede ser cualquier molécula etiquetada con afinidad de metal que se pueda unir específicamente a cualquier marcador de superficie DC. Una etiqueta de afinidad de metal preferida es la hexahistidina. En ejemplos adelante, se utilizan formas etiquetadas con hexahistidina de ScFv contra las moléculas de superficie DC CD11c y DEC-205 (CD205). Otros ejemplos incluyen cualquier ligando etiquetado con histidina tal como un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo que se puede unir a los marcadores de superficie DC tales como DC-SIGN (CD209), CD206 y CD207.

Las composiciones pueden incluir una pluralidad de ligandos de diferentes marcadores/receptores sobre los DC. Por ejemplo, una composición puede comprender como ligandos un ScFv contra el DEC-205 en combinación con el ScFv contra el DEC-SIGN.

Como se indicó anteriormente, la etiqueta de afinidad de metal de un ligando es típicamente un grupo funcional hexahistidina covalentemente ligado a un sitio conveniente sobre el ligando. Por ejemplo, la hexahistidina se puede ligar a un antígeno de proteína en el terminal N o C de éste. Otras etiquetas de afinidad incluyen cualquier grupo funcional o secuencia de amino ácido que pueda quelar metales y que se pueda unir covalentemente a un sitio conveniente sobre el ligando.

Los factores inmunomoduladores de las composiciones de acuerdo con la primera realización incluyen compuestos o moléculas que pueden mejorar o modificar la respuesta de los DC a los antígenos. Tales compuestos incluyen "señales de peligro" (por ejemplo, lipopolisacárido bacteriano), citoquinas (por ejemplo, interferón-\gamma, interleuquina-2, interleuquina-4, interleuquina-10, interleuquina-12 y transformar el factor de crecimiento-\beta), así como también quimioquina, moléculas similares al factor hormonal y de crecimiento, o ADN que codifica tales moléculas. Una composición puede incluir más de un factor inmunomodulador.

Con relación a la segunda realización de la invención, los procesos adecuados para la preparación de las vesículas de membrana o liposomas con ligandos atrapados sobre éste se describen en la solicitud internacional (No. PCT/AU00/00397) referida anteriormente.

Con relación a la etapa (i) del proceso de la segunda realización, las vesículas de membrana son típicamente PMV pero se pueden formar de cualquier membrana biológica o estructura biológica. Los liposomas incluyen los SL. El Ag de las vesículas de membrana y los liposomas pueden ser proteínas, glicoproteína, péptido o polisacárido, o un ADN que codifica un antígeno, o combinaciones de éstas, para ser suministradas a los DC.

En la etapa (ii) del proceso de la segunda realización, como con la composición de la primera realización, el factor inmunomodulador puede ser una "señal de peligro" (por ejemplo, un lipopolisacárido bacteriano), una citoquina (por ejemplo, interferón-\gamma, interleuquina-2, interleuquina-4, interleuquina-10, interleuquina-12 y transformar el factor de crecimiento-\beta), o un ADN que codifica tales factores.

La modulación de la respuesta inmune del método de acuerdo con la tercera realización tiene aplicación en la prevención o tratamiento de condiciones que incluyen rechazo de transplante o los efectos de enfermedades auto-inmunes tales como diabetes tipo I, artritis reumatoide, lupus sistémico eritematoso y esclerosis múltiple. En el caso de pacientes de transplante, esto involucra la administración de los PMV de leucocitos donadores que apuntan a los DC del receptor de transplante. El factor inmunomodulador en este caso puede ser, por ejemplo, una citoquina tal como una interleuquina-10 o un factor-\beta de crecimiento transformante. Sin embargo, el factor inmunomodulador puede ser cualquier molécula que tenga la capacidad de generar los DC tolerogénicos.

El método de la cuarta realización se puede utilizar en el tratamiento de cualquier tumor que incluye, pero no se limita a, melanoma, y cánceres de próstata, intestino, mama y pulmón. El método también se puede utilizar en el tratamiento de leucemia y linfomas. El método se puede utilizar para tratar tumores en cualquier animal mamífero pero es particularmente adecuado para tratar tumores en humanos.

La cantidad de vesículas de membrana que contienen Ag modificado o liposomas que se van a suministrar a un sujeto y el régimen de administración se puede establecer por el médico después de la evaluación del sujeto a la luz del tumor bajo tratamiento.

Aquellos expertos en la técnica reconocerán de manera inmediata que el método de acuerdo con la cuarta realización suministra una alternativa efectiva a la manipulación ex vivo de los DC para uso en inmunoterapia de cáncer.

Con relación a la quinta realización, el método se puede utilizar para evitar o tratar cualquier infección que incluya infecciones por bacterias, micobacterias, virus y hongos con el fin de mejorar la inmunidad al agente responsable por la infección y/o por el uso en el tratamiento de una infección. De manera particular al ejemplo dado anteriormente para la prevención de un rechazo de transplante, todo lo que se requiere para suministrar un método eficaz es preparar los PMV o liposomas que incluyen al menos un antígeno del agente infeccioso. Ese antígeno puede ser, por ejemplo, proteína de cubierta o virus (por ejemplo, VIH, hepatitis B y C) o componentes de la pared celular o bacteria (por ejemplo, Micobacteria), hongos (por ejemplo, Candida) y protozoos (por ejemplo, Malaria).

La administración de composiciones a un sujeto de acuerdo con una tercera a quinta realización de la invención puede ser cualquiera de los métodos conocidos por aquellos expertos en la técnica. Las composiciones se administran típicamente intravenosa o subcutáneamente.

El sujeto de los métodos de la tercera a quinta realización es típicamente un sujeto mamífero. Los métodos son particularmente adecuados para uso con un sujeto humano.

Aquellos expertos en la técnica apreciarán que un medicamento de acuerdo con la sexta a octava realización de la invención también incluirá al menos un portador par la composición. El portador puede ser cualquier solución en la cual los PMV y los liposomas sean compatibles. Los portadores típicos son soluciones salinas y soluciones salinas amortiguadas tales como PBS.

Los medicamentos pueden incluir adicionalmente agentes activos consistentes con el uso pretendido del medicamento. Por ejemplo, un medicamento de acuerdo a con la séptima realización puede incluir otros agentes anti-tumorales aunque un medicamento de acuerdo con la octava realización puede incluir otros agentes con actividad anti-bacteriana, anti-protozoaria, anti-viral, o anti-fungosa según sea apropiado para la infección objetivo. Tales agentes adicionales serán conocidos por los expertos en la técnica.

Estudios Prototipo

En un estudio prototipo, los inventores han encontrado que el quelador-lípido (NTA)_{3}-DTDA se puede utilizar para anclar los ScFv etiquetados con His sobre las vesículas de membrana de plasma derivados de tumor (PMV) o los liposomas furtivos que contienen antígeno tumoral para apuntar a los DC. El apuntamiento del Ag directamente a los DC de esta manera elicitó una fuerte respuesta antitumoral.

Los liposomas han sido llamados por tener alto potencial terapéutico, pero su uso se ha impedido por la falta de un método simple para unir las moléculas objetivo. ^{13} El quelador-lípido novedoso (NTA)_{3}-DTDA (Fig. 1A), cuando se incorpora en los SL o en el PMV derivado de célula tumoral (B16-OVA), posibilita el injerto estable de ScFv etiquetado con hexa-histidina que apunta a moléculas de superficie sobre los DC (Fig. 1B y Fig. 1C). Los PMV y los SL injertados con ScFv específico para los marcadores DC CD11c y DEC-205 se unen específicamente a los DC in vivo y, con base en estudios de citometría de flujo y microscopia confocal, pueden apuntar a los Ag asociados directamente a los DC in vivo (Figs. 2 y 3).

Inicialmente, se estudió la capacidad del PMV y el SL injertados para estimular las respuestas funcionales en ensayos de presentación de Ag iniciado con DC. Nuestros estudios muestran que los PMV injertados con ScFv y el SL que contiene Ag son significativamente más efectivos que los PMV y SL de control en inducir los DC para estimular la proliferación de célula T (Fig. 4A). Con el PMV, se estimuló la proliferación tanto en las células T CD4^{+} como CD8^{+}. Los PMV tienen el potencial para estimular respuestas mediadas por todos los posibles clones de célula T reactivos a los epítopos presentes en las vesículas de célula tumoral. De manera similar, los SL injertados con ScFv que contienen la proteína OVA pueden estimular tanto las células T CD4^{+} como CD8^{+} específicas de OVA; pero el SL que contiene SIINFEKL, el epítopo CTL inmunodominante en OVA, se esperaría que generara solamente respuestas a células T CD8^{+}. Consistente con esto, nuestros datos muestran que los DC apuntados por los PMV injertados generan aproximadamente proporciones iguales de células T CD4^{+} como CD8^{+}, mientras que los DC apuntados por SL que contienen SIINFEKL, y en una mayor proporción a aquellos que contienen OVA, generan células T predominantemente CD8^{+} (Fig. 4B).

La evidencia sugiere que las señales de "peligro" son importantes en la maduración y migración de los DC después de exposición de Ag, y pueden evitar la inducción de tolerancia al Ag presentado.^{9,10,18} De manera notoria, las señales de "peligro" no se requirieron en los ensayos de presentación Ag in vivo (Fig. 4), presumiblemente desde que los DC son "perturbados" o activados durante su aislamiento. Los LPS y las citoquinas similares a GM-CSF e IFN-\gamma se conocen por influenciar la capacidad de los DC para tomar Ag y para madurar. ^{8,19,21} Para los estudios en animales por lo tanto, incorporamos LPS, IFN-\gamma o GM-CSF, dentro del PMV y el SL, suministrando de esta manera los medios para suministrar simultáneamente tanto Ag como la señal de peligro a los DC.

Un examen de la capacidad del PMV y el SL injertado a ScFv que contiene Ag para inducir los DC para iniciar las respuestas CTL reveló que, comparado con las células de control, las células T de los animales inmunizados con PMV injertado con ScFv o SL que lleva Ag exhibe una capacidad creciente, siguiendo la estimulación in vitro, para lisar las células blanco B16-OVA in vitro (Fig. 5). De manera importante, los resultados muestran que el cebado in vivo para la actividad citolítica es dependiente de la presencia de las señales de "peligro", con LPS e IFN-\gamma que estimula la respuesta más grande (Fig. 5). Tanto la proteína OVA xenogenéica, como la forma etiquetada con hexahistidina de SIINFEKL, se podría asociar con los SL para apuntar por vía del ScFv injertado. La presentación del Ag y los ensayos CTL demuestran así que apuntar el PMV injertado con ScFv y el Ag que lleva los SL a los DC de esta forma pueden ser efectivos en respuestas anti-tumor estimulantes, y pone de relieve la importancia de las señales de "peligro" en la inducción de las respuestas inmunes (Figs. 4 & 5). Más aún, el hallazgo de que el SL injertado con ScFv que contiene SIINFEKL-6H puede inducir una respuesta citotóxica significativa, demuestra que la aproximación que utilizan los SL que contienen (NTA)_{3}-DTDA pueden ser una estrategia efectiva para apuntar al Ag péptido etiquetado con His a los DC in vivo.

Un hallazgo de importancia capital en este trabajo fue nuestra observación de que los animales singenéricos inmunizados con PMV injertado con CD11c-ScFv- y DEC-205-ScFv tienen un número significativamente menor de metástasis tumorales en los pulmones comparados con los controles, después de inocularlos con el melanoma B16-OVA. De manera similar, los animales singenéricos inmunizados con SL injertado con ScFv que contiene OVA y LPS o INF-\gamma tuvieron un número inferior de metástasis (Fig. 6). Los resultados muestran además que la inmunidad tumoral era completamente dependiente de la presencia de las señales de "peligro", los LPS e IFN-\gamma (Figs. 5 y 6). La inmunización de los ratones con PMV injertado con CD11c-ScFv- y DEC-205-ScFv y el Ag que lleva SL, por lo tanto, apuntó al Ag(s) asociado a los DC, que entonces procesan y presentan los Ag a las células T que inducen activación de célula T específica con Ag, y provocan una fuerte inhibición en el crecimiento y metástasis de los tumores B16-OVA in vivo. Un hallazgo significativo adicional fue el hecho de que, a diferencia de los ratones de control que desarrollaron todos severas metástasis de pulmón, los ratones que se habían vacunado con PMV injertado con DEC-205-ScFv que contienen lFN-\gamma después de inoculación con las células tumorales B16-OVA posteriormente no mostraron ningunos signos de desarrollo de tumor, indicando que la vacuna que apunta al DC tiene actividad terapéutica.

Un aspecto particularmente intrigante de este estudio es que la generación aparente de la actividad CTL contra melanoma B16-OVA no estuvo asociada con la protección tumoral. Este punto es particularmente evidente con la vacuna SIINFEKL-SL que se esperaría que generara solamente respuestas CTL CD8^{+} contra OVA producido por las células tumorales B16-OVA. A pesar de la vacuna que induce una fuerte respuesta CTL de recuerdo in vitro contra las células tumorales B16-OVA, no se logró ninguna protección in vivo contra el tumor mediante inmunización. Se conoce que la línea del melanoma B16-OVA expresa niveles muy bajos de MHC clase I, y consecuentemente es resistente a lisis de CTL a menos que se utilicen CTL de alta avidez.^{14} El hecho de que los esplenocitos provenientes de ratones inmunizados con preparaciones que apuntan a los DC de los PMV o SL podrían lizar las células tumorales B16-OVA después de la reestimulación con células tumorales in vitro implica que los CTL de alta avidez se puedan generar contra esta línea de célula tumoral. Presumiblemente, tales CTL no se generan, o no son efectivos in vivo. De hecho, estudios previos indican que las células T CD4^{+} son más efectivas en lugar de las células CD8^{+} contra la metástasis de B16-OVA, con células T CD4^{+} con unas características de perfil de citoquina de células T ayudante 2 (Th2) que son particularmente efectivas.^{14} Adicionalmente, el reclutamiento dependiente de eotaxina de eosinofilo en los tumores fue esencial para que se observara la regresión tumoral. ^{14} Para explorar un posible papel del reclutamiento de eosinófilo mediado por células T CD4^{+} en los efectos anti-tumorales observados en este estudio, los ratones knockout eotaxina se inmunizaron con PMV injertado con ScFv. Nuestros resultados muestran que comparado con los controles, los ratones knockout eotaxina exhiben una capacidad marcadamente reducida a inhibir el crecimiento y la metástasis del tumor B16-OVA (Fig. 7A). La eotaxina es una quimioquina de eosinófilo potente y por lo tanto, los hallazgos son consistentes con el reclutamiento de los eosinófilos en el tumor que constituyen un componente importante de la respuesta anti-tumoral.

El sistema de PMV y SL modificado descrito aquí ofrece un número de ventajas sobre las estrategias corrientes que utilizan los DC para inmunoterapia tumoral. Primeramente, el sistema puede suministrar los Ag directamente a los DC in vivo, eliminando así la necesidad de aislar los DC de los pacientes y manipular las células ex vivo para uso en inmunoterapias. Segundo, un suministro mediado por liposoma blanco o activo de los Ag a los DC tiene el potencial de suministrar más Ag, y/o varios diferentes Ag, simultáneamente, estimulando potencialmente una respuesta inmune más efectiva. La misma aproximación podría suministrar potencialmente a los DC cualquier Ag o agente inmunoestimulatorio, tal como las señales de "peligro", ARN, ADN, y citoquinas, o combinaciones de éstas, que no se pueden lograr fácilmente utilizando los Ag fusionados a las proteínas blanco DC.^{9,10} Tercero, la aproximación es versátil y sería conveniente de utilizar clínicamente en razón a que potencialmente cualquiera de las proteínas que apuntan a los DC que poseen una etiqueta de histidina se pueden injertar sobre los PMV o SL modificados para suministrar los Ag tumorales específicos u otros agentes para mejorar la inmunidad tumoral en los pacientes.

Habiendo descrito ampliamente la invención y la aplicación particular de éstos en los estudios de prototipo precedentes, serán dados ahora ejemplos específicos después de detallar los materiales y métodos utilizados aquí. Se entenderá por aquellos expertos en la técnica que estos ejemplos son con propósitos solamente ilustrativos y de ninguna manera limitan el alcance de la invención.

Materiales y Métodos Reactivos

Se obtuvieron [^{3}H]-Timidina y ^{51}Cr (Na^{51}CrO_{4}) de Amersham (Buckingham-shire, Reino Unido). Palmitoil-oleoil-fosfatidil-colina (POPC), OVA (Grado II, purificada por FPLC), LPS (proveniente del serotipo de Escherichia coli 0111:B4), Isopaque, Ficoll y \beta-mercaptoetanol se suministraron por Sigma-Aldrich (Castle Hill, Nueva Gales del Sur, Australia). Se obtuvo fosfotidiletanolamina-polietilenglicol-2000 (PE-PEG_{2000}) de Avanti Polar Lipids Inc. (Alabaster). Se compraron 2-(4,4-difluoro-5octyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno-3-pentanoil)-1-hexadecanoil-sn-glicero 3-fosfocolina (PC-BODIPY) y 5-(y-6)-carboxifluoresceín diacetato, succinimidil éster, isómeros mezclados (CFSE) de Molecular Probes (Eugene, Oregon). El quelador-lípido (NTA)_{3}-DTDA, consistente de tres grupos de cabeza de ácido nitrilo-triacético (NTA) covalentemente ligado a dos cadenas de ditetradecilamina (DTDA) se sintetizó esencialmente como se describió, ^{27} pero con etapas adicionales para acoplar covalentemente un grupo NTA sobre cada grupo carboxilo del NTA-DTDA, para producir (NTA)_{3}-DTDA. Se utilizó NiSO_{4} para todas las adiciones de Ni^{2+} a los amortiguadores.

Anticuerpos y proteínas monoclonales

El CD56 de Murino (clon 42.18, rata IgG2a) mAb era proveniente del 6º Workshop de célula NK Humana y el mAb CD3 de murino (clon 145-2C11, de IgG de hamster de Armenia) se compró de PharMingen (San Diego, California). El IFN-\gamma y los GM-CSF de Murino recombinante se suministraron por Pepro Tech Inc (Rockey Hill, New Jersey). Los anticuerpos ScFv recombinantes N418 (anti-CD11c) y NLDC145 (anti-DEC-205), cada uno con una etiqueta de histidina (6H) en el terminal carboxi y denotados CD11c-ScFv y DEC-205-ScFv, respectivamente, se produjeron utilizando el sistema de expresión de proteína de vaculovirus y purificado como se describió. ^{16,28} Los péptidos se sintetizaron por Biomolecular Resource Facility, John Curtin School of MedicaI Research (JCSMR), ANU, Canberra. El péptido L2 (GHHPHGHHPH), una secuencia de los diez amino ácidos encontrados en la glicoproteína rica en histidina de la proteína del plasma, se utilizó rutinariamente para injertar los PMV y SL de control en razón a que éstos se unen al Ni-(NTA)_{3}-DTDA con alta avidez y pueden bloquear su unión no específica a las células. El péptido SIINFEKL-6H, que representa el epítopo CTL inmunodominante de OVA en los ratones H-2^{b} (residuos OVA 257-264), con una etiqueta de hexahistidina unida se utilizó para suministro Ag del péptido a los DC.

Ratones y Estirpes Celulares

Los ratones C57BL6 hembra o macho (H-2^{b}) de 6-8 semanas de edad se suministraron por Animal Breeding Establishment, (JCSMR, ANU), y los ratones knockout eotaxin C57BL6 (H-2^{b}) (eotaxin^{-l-}) fueron un regalo del Doctor Paul Foster, División de Bioquímica y Biología Molecular (JCSMR), y se utilizaron para obtener células linfoides en ensayos in vitro, y en estudios de crecimiento tumoral in vivo. El melanoma B16-OVA de murino altamente metastático [C57BL6 (H-2^{b})], se cultivó una línea celular de tumor que secreta OVA a 37ºC en una atmósfera de 5% de CO_{2} en un medio RPMI 1640 (Gibco-BRL, Invitrogen, Melbourne, Australia) que contiene 10% de suero bovino fetal (FCS, Trace Biosciences, Noble Park, Victoria, Australia) y 0.5 mg/mL de Geneticina (Invitrogen). Las Células Dendríticas de Piel Fetal de Murino (FSDC) [C57BL6-DBA/2J F1 (H-2^{b/d})], se cultivaron en el mismo medio pero sin geneticina. Las Células Dendríticas de Cultivo de Largo Plazo de Murino (LTC-DC) [B10.A(2R) (H-2^{k/b})], aisladas y cultivadas como se describió, ^{29} fueron un regalo del Dr. H. O'Neill (School of Biochemistry and Molecular Biology, ANU).

Aislamiento de células dendríticas y células T

Las células DC y T de murino se aislaron de vasos de ratones C57BL/6. En resumen, los esplenocitos se aislaron por digestión con Colagenasa IV (Boerhringer Mannheim), seguido por aislamiento de esplenocitos de baja densidad por centrifugación con gradiente de densidad utilizando un gradiente Isopaque-Ficoll. Los DC se aislaron mediante adherencia plástica como se describió^{31} y entonces se suspendieron en medio de crecimiento RPMI 1640 completo que contiene 10% de FCS, 5 x 10^{-5} M de \beta-mercaptoetanol, 100 IU/ml de penicilina, 100 \mug/ml de neomicina, y 10 mM de HEPES. Para aislamiento de las células T, los vasos se disociaron en suspensiones de células únicas, y después de remover las células rojas mediante lisis hipotónica, las células T se aislaron utilizando una columna de lana de nylon.^{32}

Vesículas de membrana de plasma y liposomas en cautela

Se prepararon células cultivadas de PMV mediante centrifugación con gradiente de sacarosa,^{30} y se modificó esencialmente como se subrayó.^{16,17} Los liposomas utilizados para modificar el PMV se prepararon como sigue: soluciones etanólicas de POPC, (NTA)_{3}-DTDA, LPS y PC-BODIPY (proporción molar 94:2:2:2); o POPC, (NTA)_{3}-DTDA y PC-BODIPY (proporción molar 96:2:2), se mezclaron, se secaron bajo una corriente de N_{2}, luego se re-hidrataron en 100 \mul de PBS que contiene 60 \muM de Ni^{2+}. Donde se indicó, como una alternativa al LPS, se incluyó INF-\gamma o GM-CSF (50 ng) en el amortiguador de rehidratación. Las mezclas hidratadas se sonicaron (tres veces, ráfagas de 15 seg) utilizando un desintegrador ultrasónico TOSCO 100W (Measuring and Scientific Ltd., Londres, RU) a una amplitud máxima. Los liposomas (100 \mul) se mezclaron con 100 \mul de PMV derivado de célula B16-OVA (1x10^{8} equivalentes de célula), antes de agregar 15% de PEG_{4000} y diluir 10 veces con PBS. Los PMV que contienen citoquina y (NTA)_{3}-DTDA se purificaron mediante cromatografía de exclusión de tamaño,^{17} antes de injertarlos con los ScFv apropiados.

Se prepararon Liposomas en cautela como sigue: POPC, (NTA)_{3}-DTDA, PE-PEG_{2000}, LPS y PC-BODIPY (proporción molar 96:1:1:1:1); o POPC, (NTA)_{3}-DTDA, PE-PEG_{2000} y PC-BODIPY (proporción molar 97:1:1:1) disueltos en etanol se secaron bajo una corriente de N_{2}, luego se re-hidrataron en 100 \mul de PBS que contiene 30 \muM de Ni^{2+} (lípido total 1 mM). Para las mezclas que les faltan LPS, INF-\gamma o GM-CSF (50 ng) se incluyó en el PBS. Las mezclas de lípido se sonicaron con SL purificado (como anteriormente). Para estudios funcionales el PC-BODIPY se omitió de todas las mezclas de lípido.

La encapsulación del epítopo inmunodominante de la proteína OVA, SIINFEKL, en el SL se intentó pero se probó difícil en razón a que este péptido tiene baja solubilidad en el pH utilizado para producir el SL y para injertar ScFv marcado con histidina (pH 7.4). Sin embargo, una forma etiquetada de hexahistidina del péptido SIINFEKL-6H, permitió la encapsulación y/o injerto eficiente del péptido en el SL que contiene (NTA)_{3}-DTDA. Estudios de unión que utilizan los análisis FACS mostraron que el SL injertado con CD11c-ScFv o DEC-205-ScFv que contiene SIINFEKL-6H podría efectivamente apuntar a los receptores sobre los DC in vitro (no mostrados). Así, donde se indicó, el SIINFEKL-6H (2 \muM) se incluyó para injertarse simultáneamente con el ScFv. La encapsulación eficiente del OVA en el SL que contiene POPC, (NTA)_{3}-DTDA y PE-PEG_{2000}, se logró al re-hidratar la mezcla de lípido disecada en PBS que contiene 0.1 mg de OVA (1 mg/mL), seguido por una sonicación breve. Los PMV y los SL que contienen (NTA)_{3}-DTDA se injertaron por incubación con los ScFv apropiados (200 \mug/ml) durante 1 hr a temperatura ambiente. La unión del PMV y SL injertado a los DC se evaluó mediante citometría de flujo como se describió previamente.^{17}

Apuntamiento del DC in vivo

Con el fin de obtener PMV altamente fluorescente para estudios de seguimiento PMV se sometieron a reacción con fluorescina-isotiocianato (FITC, Molecular Probes), injertado con L2 o ScFv, y luego inyectados en la almohadilla de la pata trasera de ratones. Después de 16 hrs el ganglio linfático poplíteo de drenaje de cada animal se cosechó y utilizó para aislamiento de las células del ganglio linfático para dos análisis de citometría de flujo de color después de teñir con CD11c mAb biotinilado y estreptavidina-ficoeritrina (estreptavidina-PE), o para imágenes de fluorescencia confocal. Para las imágenes, los ganglios linfáticos se fijaron en formalina al 10%, luego embebidos en parafina, y cortados en secciones; las secciones se adhirieron entonces sobre tajadas y desengrasadas. Las tajadas se bloquearon mediante incubación con PBS más 20% de suero de cabra (suero de cabra PBS) durante 30 minutos a temperatura ambiente, antes de incubar con el mAb N418 al CD11c en suero de cabra PBS durante 1 hr a temperatura ambiente. Las tajadas se lavaron entonces extensamente en agua y teñidas con estreptavidina-Rhodamina en suero de cabra PBS. Después de lavado adicional, las tajadas se analizaron mediante fluorescencia con fluorescina y Rhodamina utilizando microscopia confocal fluorescente Radiance 2000 (Bio-Rad California). Las imágenes se adquirieron por Kalman que promediaron 30 exploraciones de láser sucesivas, y procesadas utilizando un software de imágenes
Bio-Rad.

Ensayos de presentación de antígeno

Los DC se incubaron con PMV o SL modificado a 37ºC en un medio completo durante 4 hrs, y luego lavados para remover los PMV o SL no unidos, irradiados con \gamma (5000 rad), y puestos en alícuota de medios de crecimiento (2x10^{4} células/200 \mu/pozo) en una placa de fondo plano de 96 pozos. Las células T singenéricas se agregaron (2x10^{4}/pozo) y las células co-cultivadas durante 4 días, antes de evaluar la proliferación al medir la incorporación de [^{3}H]-timidina.^{14} La proporción de células T CD4^{+} y CD8^{+} proliferantes en ensayos de presentación Ag se evaluó al marcar las células T con CFSE (5 \muM) antes de co-cultivo con los DC como se describió.^{33} Después de 4 días las células de co-cultivo se lavaron, se tiñeron con CD4 anti-ratón (clon L3T4)-Cy-Cromo (10 \mug/ml), y CD8 anti-ratón (clon Ly-12)-PE (10 \mug/ml), y analizadas para fluorescencia CFSE, Cy-Cromo y PE mediante citometría de flujo.

Ensayos de Citotoxicidad

Los ensayos CTL específicos de Ag se efectuaron de manera similar a aquellos descritos.^{34} Los ratones C57BL6 singenéricos se inmunizaron intravenosamente (i.v.) con PBS (control), o PMV o SL derivado de célula B16-OVA injertados con ScFv que llevan Ag (como se indicó). El día 14 después de la inmunización, se removieron los vasos y los linfocitos T (células T efectuadoras) se aislaron como anteriormente. Las células T se suspendieron entonces en un medio de crecimiento completo y puestas en alícuotas en placas de fondo plano con 24 pozos (ICN Biomedicals) a una concentración de 1x10^{5} células/pozo y co-cultivadas con 1x10^{5} células B16-OVA irradiadas con \gamma (5000 rad). Después de 5 días de co-cultivo, la actividad citolítica de las células T se evaluó en un ensayo de liberación de ^{51}Cr estándar, como se describió.^{16}

Inmunización de animales e inoculación tumoral in vivo

Los ratones se inmunizaron mediante tres inyecciones en la vena de la cola i.v., dadas semanalmente, con PBS (control), o PMV (2X10^{5} células equivalentes), o SL (\sim0.16 \mug lípido total) derivados de célula B16-OVA injertadas con ScFv que llevan asociados Ag (\sim0.2 \mug de OVA o \sim0.8 ng de SIINFEKL-6H), cada una suspendida en un volumen de PBS de 200 \mul. Dos semanas después de la última inyección, los ratones se inocularon mediante inyección i.v. de 3x10^{5} células B16-OVA. En el día 16 los pulmones se removieron y el número de focus tumorales se contó visualmente bajo un microscopio de disección. Alternativamente, los ratones se inmunizaron con PMV B16-OVA injertado con ScFv 3.6 y 9 días después de la inyección i.v. de 1.5x10^{5} células B16-OVA.

Ejemplo 1 Los liposomas se utilizaron para apuntar los antígenos tumorales a los DC tanto in vitro como in vivo

Dos tipos de preparaciones de liposoma se utilizaron para apuntar a los Ag tumorales a los DC (ver Figura 1 adelante). El primero implicó el uso de una preparación cruda de PMV derivado de célula tumoral odificdo mediante injerto de ScFv que apunta al DC, y el segundo fue una preparación de liposomas cautela que contienen Ag también injertados con DC que apunta a ScFv. Los liposomas cautela (SL) son estructuras de lípido sintético que se han estabilizado estéricamente mediante la inclusión de lípidos tales como PE-PEG_{2000}, y, en virtud de su capacidad a escapar a la eliminación no específica mediante el sistema de retículo-endotelial, pueden permanecer en la circulación sanguínea durante días luego de su administración intravenosa.^{14} El uso de un NTA-DTDA de lípido quelador para modificar las células tumorales y los PMV derivados de célula tumoral para injerto de moléculas coestimulatorias de célula T se han descrito.^{15,16} Hemos producido recientemente un lípido novedoso, (NTA)_{3}-DTDA (Fig. 1A), que está relacionado con el NTA-DTDA, pero al lograr una densidad local mayor de los grupos de cabeza NTA, puede permitir un anclamiento más estable de las proteínas marcadas con histidina tanto en los PMV como en los SL (no mostrados). Así, la unión al liposoma, por vía (NTA)_{3}-DTDA, de ScFv marcado con histidina contra los marcadores DC tales como CD11c y DEC-205 permite el apuntamiento efectivo de los liposomas a los DC (Fig. 1B).

Para determinar si los liposomas preparados de esta manera se pueden utilizar para apuntar los antígenos tumorales a los DC, primero exploramos la capacidad de este sistema para apuntar Ag a los DC in vitro. En este estudio utilizamos la línea celular de melanoma altamente metastásica, B16-OVA, en razón a que esta línea secreta bajos niveles de OVA que se pueden utilizar como un Ag específico de tumor secretado subrogado (Ref. 17), posibilitando que las respuestas inmunes específicas de OVA sean evaluadas. La línea tumoral B16-OVA es altamente resistente a los CTL específicos de OVA a menos que se utilice la alta avidez de los CTL.^{17} PMV (derivado de B16-OVA) se podría modificar para contener (NTA)_{3}-DTDA incorporados mediante fusión con liposomas sintéticos compuestos de POPC, (NTA)_{3}-DTDA y PC-BODIPY (proporción molar 96:2:2). También, los SL que contienen (NTA)_{3}-DTDA se produjeron de una mezcla apropiada de lípidos: POPC, PE-PEG_{2000}, (NTA)_{3}-DTDA, y PC-BODIPY (proporción molar 96:2:1:1). Las preparaciones SL se podrían hacer para contener OVA, o el epítopo OVA CTL, SIINFEKL. Los PMV y los SL que contienen (NTA)_{3}-DTDA se injertaron con una molécula que contiene histidina de control (péptido L2) o un ScFv marcado con hexahistidina contra los CD11c o DEC-205. En razón a que las membranas modificadas también contienen PC-BODIPY como trazador fluorescente, su apuntamiento a los DC se puede evaluar mediante citometría de flujo.

La incubación de cultivos de largo plazo DC (LTC-DC) con PMV modificado de control (PMV-L2) incrementó la intensidad de fluorescencia de células ligeramente (\sim2 veces por encima del antecedente), pero su fluorescencia después de incubación con PMV injertado con CD11c-ScFv (PMV-CD11c), o con DEC-205-ScFv (PMV-DEC-205), fue 4 a 8 veces mayor que las células de control (Fig. 2A). El LTC-DC incubado con SL injertado con CD11c-ScFv (SL-CD11c) y DEC-205-ScFv (SL-DEC-205), también exhibió incrementos significativos en la unión (3-6 veces) por encima de las células de control (SL-L2) (Fig. 2B). De manera similar, la incubación de DC con piel fetal (FSDC) que expresa CD11c, con PMV o SL injertados con CD11c-ScFv, dio como resultado un incremento de fluorescencia sustancialmente por encima que las células de control (no mostrado). La especificidad de unión de los PMV y los SL injertados a los DC se podría probar utilizando bloquear los mAb. Así. La preincubación de los DC con el control de cace del isotipo mAb no reduce significativamente la unión de los PMV o SL injertados con CD11c-ScFv o DEC-2005-ScFv a los DC, pero su preincubación con los anti-CD11c mAb N418 o los anti-DEC-205 mAb NLDC145, inhibió la unión de los SL o PMV injertados con ScFv respectivos en aproximadamente 90% (no mostrado). Esto demuestra que la unión es específica para el ScFv injertado.

Para establecer que el PMV injertado con ScFv podría apuntar a los DC in vivo, inyectamos ratones subcutáneamente en la almohadilla de la pata trasera con PMV marcado con fluoresceína injertado con ScFv, y luego las células examinadas aisladas del ganglio linfático poplíteo de drenaje para fluorescencia de fluoresceína mediante citometría de flujo, o secciones del ganglio linfático de drenaje mediante microscopia láser de exploración confocal, después de teñido PE con cada CD11c mAb como un marcador DC. Los resultados muestran que la inyección de ratones con PMV injertado con L2, CD11c-ScFv o DEC-205-ScFv dio como resultado un alto nivel de fluorescencia específica de CD11c en una población relativamente pequeña(2-2.5%) de células de ganglio linfático, identificando así éstos como DC, tanto mediante análisis FACS como con microscopia de fluorescencia (Fig. 3A y B, paneles i, iii y v). De manera importante, las células positivas CD11c, una proporción mayor de las células marcadas con fluoresceína fueron vistas en el ganglio linfático de los ratones inyectados con PMV injertado con ScFv (\sim1.7%) (Fig. 3A y B, paneles iv y vi), comparados con los ratones inyectados con PMV injertado con L2 (control) (0.4%) (Fig. 3A y B, que corresponde a los paneles i, y ii). Los hallazgos muestran que los PMV injertados con ScFv pueden apuntar a los DC
in vivo.

TABLA 1 Liposoma y preparaciones de vesícula de membrana de plasma modificado

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Ejemplo 2 Liposoma mediado blanco de antígenos tumorales a células dendríticas induce una potente inmunidad específica de tumor tanto in vitro como in vivo

Para determinar si los PMV y los SL que llevan Ag apuntados a los DC pueden inducir una presentación Ag funcional a las células T, inicialmente examinamos la capacidad de los PMV y los SL injertados con ScFv para estimular la proliferación de la célula T en un ensayo de presentación Ag. Los DC esplénicos aislados de los ratones C57BL/6 se pulsaron separadamente con SIINFEKL-6H que lleva B16-OVA-PMV, SL u OVA que lleva SL, injertado con un péptido marcado con histidina de control (L2) o con ScFv contra CD11c y DEC-205. Después de la incubación, las células se co-cultivaron con células T singenéicas purificadas y luego pulsadas con [^{3}H]-timidina para evaluar la tasa de proliferación de célula T. Comparado con los cultivos de control, los DC expuestos a PMV o SL (que llevan SIINFEKL-6H u OVA) injertados con CD11c-ScFv indujeron sustancialmente altos niveles de proliferación de célula T. Aún mayores tasas de proliferación fueron vistas cuando las células T fueron co-cultivadas con DC expuesto a PMV o SL injertados con DEC-205 ScFv (Fig. 4A). Los PMV y SL que llevan Ag injertado con ScFv, por lo tanto, pueden suministrar efectivamente Ag a los DC y estimular la proliferación de célula T.

De manera interesante, los estudios que utilizan las células T marcadas con CFSE revelaron que la proporción de células T CD4^{+} y CD8^{+} proliferantes era dependiente del Ag utilizado. Así, los co-cultivos de células T con los DC que se han pulsados con PMV injertados con DEC-205 consistieron de \sim60% de células T CD8^{+} y \sim40% de células T CD4^{+} (Fig. 4B). En contraste los co-cultivos de células T y los DC pulsados con SL injertado con DEC-205 que llevan los SIINFEKL-6H de péptido OVA, contenían \sim80% de células T CD8^{+} y \sim20% de células T CD4^{+}, consistentes con el SIINFEKL que es un epítopo de célula T CD8^{+}. Notoriamente, las células T cultivadas con los DC pulsados con los SL injertados con DEC-205 encapsulando OVA intacto contuvieron células T CD8^{+} más poco proliferantes (\sim70%) y significativamente mayor proporción \sim30% de células T CD4^{+}, comparadas con los cultivos SIINFEKL (Fig. 4B), consistentes con los epítopos de células T CD4^{+} y CD8^{+} que contienen ambos OVA. Las proporciones relativas de las células CD4^{+} y CD8^{+} proliferantes en co-cultivos con los DC pulsados con los AG que apuntan al CD11c-ScFv revelaron un patrón similar al DC pulsado con Ag blanco de DEC-205-ScFv (no mostrado).

Estudios recientes han demostrado la importancia de las señales de peligro durante la exposición Ag y la maduración DC ^{9,10} en determinar el tipo de respuesta inmune iniciado por los DC. Aunque los estudios mostraron que los liposomas pueden apuntar el Ag a los DC in vitro inducen e inducen las respuestas de células T, los estudios previos in vivos sugieren que para que esta aproximación tenga éxito in vivo, se requiere el suministro de señales de peligro de los DC. Así, con el fin de suministrar tanto Ag como estímulos inflamatorios a los DC simultáneamente, produjimos PMV y SL modificado que lleva a Ag que contenía LPS e IFN\sim\gamma o GM-CSF incorporado. Encontramos que hasta el 1% del LPS se podía incluir en la mezcla de lípido, y que el PMV y el SL se podría hacer para incorporar las citoquinas GM-CFS IFN\sim\gamma con alta eficiencia. Sin interferir significativamente con la capacidad del ScFv injertado al SL para apuntar a los DC in vitro, evaluado mediante estudios de unión utilizando fluos citometría. Más aún, en razón a que el GM-CFS induce la proliferación de FSDC en el medio libre de suelo, el IFN\sim\gamma inhibe su proliferación en medio completo, ^{17}los ensayos de proliferación FSDC fueron utilizados para monitorear el atrapamiento de citoquina en el SL > 85% del GM-CSF y 75% del IFN\sim\gamma que se encontró por estar incorporado (no mostrado).

Para determinar si el PMV apuntado con DC o el SL que contiene Ag podría generar respuestas CTL in vivo, inmunizamos ratones C57BL6 con preparaciones que contenían señales de peligro tales como LPS, IFN\sim\gamma, o GM-CSF. Nosotros entonces aislamos células T splénicas, reestimulamos las células in vitro con células tumorales B16-OVA irradiadas con \gamma, y evaluamos su actividad citotóxica hacia las células B16-OVA en un ensayo de liberación ^{51}Cr estándar. Las curvas líticas representativas se muestran en la Figura 5A, para animales que fueron inmunizados con varias preparaciones PMV injertadas con el DEC-205-ScFv. Poca actividad CTL fue detectada cuando los ratones fueron preinmunizados con PMV ingeridos con el péptido L2 o con DEC-205-ScFv en ausencia de señal de peligro (Figura 5A). La incorporación de los LPS o IFN\sim\gamma en los PMV injertados con DEC-205-ScFv, sin embargo, resultó en la inducción de altos niveles de actividad citolítica, con 50% de lisis específica de células blanco ocurriendo aún una proporción efector a blanco 1:1 (Figura 5A). En contraste, el GM-CSF fue el inductor mucho menos efectivo de la actividad CTL.

Para facilidad de comparación, la actividad citolítica de las varias condiciones de inmunización PMV y SL se presentan en la proporción efector a blanco 25:1 en la Figura 5B. La actividad CTL máxima se observó con splenocitos provenientes de ratones inmunizados con PMV o SL (que llevan SIINFEKL u OVA) que contienen IFN\sim\gamma o LPS como a molécula peligro. Los PMV y SL injertados con CF11c-ScFv fueron un poco menos inmunogénicos, con los GM-CSF siendo generalmente una señal de peligro menos efectiva que los IFN\sim\gamma o LPS pero, sin embargo, induciendo una actividad CTL significativa cuando se asocio con el PMV, y el SL que contiene OVA. De manera interesante, los cultivos que contienen células T provenientes de animales inyectados con los PMV SL injertados con ScFv a los que les falta una señal de "peligro" asociada, dieron aproximadamente los niveles de lisis de trasfondo (Figura 5A y B).

Ejemplo 3 Vacunas a base de liposoma que apuntan a DC inducen a inmunidad protectora contra tumores

Los ratones inmunizados con varias preparaciones B16-OVA fueron examinados por su capacidad a resistir una inoculación i.v. de células tumorales B16-OVA con metástasis de pulmón que son cuantificados 16 días luego de la inyección de la célula tumoral. Comparados con las células de control, un número mucho más pequeño de metástasis se observó en ratones inmunizados con PMV o SL que lleva OVA injertados con ScFv y que contienen LPS o o IFN\sim\gamma (Figura 6). Si el PMV o los SL que llevan OVA no fueron injertados con un ScFv y no contienen LPS o o IFN\sim\gamma no se detectó ninguna protección a la inoculación de célula tumoral. En contraste stark, los SIINFEKL que inducen potente actividad CTL (Figura 5). Estos datos son consistentes con el melanoma B16-OVA que es resistente a la limpieza de los CTL CD8^{+} (Ref.14).

Para explorar el efecto de la vacunación sobre los tumores pre-existentes, inyectamos un grupo de 6 ratones con PMV injertados con DEC-205-ScFv que contienen IFN\sim\gamma a los tres días después de la inoculación con 1,5 x 10^{5} B16-OVA. De manera interesante, los ratones vacunados posteriormente no muestran ningunos signos de desarrollo tumoral, mientras que el grupo de seis animales de control que se había sugerido eutanasia en el día 22 debido a una carga de tumor creciente en los pulmones que contenía un promedio de 250\pm37 focus de tumor cada uno.

La alta proporción de células T CD4^{+} proliferantes en los ensayos de presentación Ag (Figura 4B), elevó la cuestión de estas células en lugar de las células T CD8^{+}, juegan un papel en las respuestas antitumorales observadas. Las células T CD4^{+} recientemente han estado implicadas en la limpieza de las metástasis de pulmón de melanoma B16-OVA a través de un mecanismo que involucra la eotaxina quimioquina eosinofilo. ^{14} la posibilidad de que los eosinófilos estén involucrados en la respuesta antitumoral inducida por el apuntamiento de Ag a los DC se exploró en estudio en los cuales inmunizamos los ratones no knockout eotaxina con PMV-DEC-205-ScFv. Los resultados muestran que mientras que la actividad citolìtica de las células T proveniente de ratones knockout normal eotaxina son esencialmente idénticos (Figura 7A) los ratones knockout eotaxina inmunizados con PMV-DEC-205 exhibieron una eficiencia marcada en su capacidad a exhibir crecimiento y metástasis tumoral (Figura 7B).

Ejemplo 4 Mejoramiento de la inmunidad a un agente infeccioso al apuntar sus antígenos asociados a las células dendríticas

En este ejemplo demostramos que la invención se puede utilizar para apuntar antígenos de un agente infeccioso a los DC. El BCG es una microbacteria que contiene muchos de los antígenos también presentes en el patógeno Mycobacterium tuberculi que es la causa de la tuberculosis en humanos. En el ejemplo de ha descrito aquí que las la microbacterias BCG fueron utilizadas en lugar de Microbacterium tuberculi. La microbacteria BCG creció en cultivo, se mató con calor, y se marcó (al hacerla reaccionar con un trazador de succinimidil éster de ácido 6-(fluoresein-5 (y-6)-carboxamido)hexanoico] para permitir el seguimiento antes de modificar para permitir el apuntamiento a los DC. Así, el BCG muerto con calor se mezcló con una cantidad apropiada de Ni-(NTA)_{3}-DTDA, y se sonicó brevemente para permitir la incorporación de un lípido quelador en las vesículas de membrana BCG que contiene los antígenos BCG. La incorporación del Ni-(NTA)_{3}-DTDA en las membranas BCG posibilitó entonces el injerto de ScFv a el CD11c o DEC-205- para permitir el apuntamiento específico de Los marcadores XD11c y DEC-205, respectivamente, sobre los DC.

El apuntamiento específico es evidente de las gráficas que comprende la Figura 8. Los perfiles de fluorescencia muestran que solamente las preparaciones BCG injertadas con un ScFv que apuntan a los DC murino exhibe unión a la línea señal de DC murino JAWS-II. No hay unión de las preparaciones BCG de control injertadas con la proteína de control ni blanco L2 esto indica que los PMV modificados y los liposomas de la invención se pueden utilizar para apuntar a los antígenos asociados con los BCG a los DC in vitro.

Experimentos adicionales fueron conducidos para verificar que las preparaciones BCG que contienen los ScFv apuntados con DC injertados también mejoran la respuesta inmune a los antígenos BCG cuando se utilizaron como vacunas en animales. Los ratones C57/BL6 fueron vacunados intravenosamente con preparaciones BCG injertadas utilizando esencialmente el mismo régimen de vacunación que en el Ejemplo 1 anterior, Después de 2-4 semanas los ratones fueron sacrificados, sus vasos removidos para aislamiento de las células T y para ensayar para la producción de interferón -\gamma específico de BCG. Los resultados de un ensayo Elispot de producción de interferón \gamma fueron obtenidos al cultivas las células T aisladas de los vasos de ratones en la presencia de BCG muerto con el calor durante un periodo de 3 días antes de ensayar los cultivos para células que producen interferón \gamma. Los resultados de estos experimentos se presentan en la Figura 9.

Se puede ver desde la Figura 9 que los vasos provenientes de los ratones vacunados con preparaciones de BCG que se habían injertado con los dos DC que apuntan a los ScFv, muestran un número mayor de células T que producen interferón \gamma (es decir Elispot) comparados con aquellos vacunados con las preparaciones BCG que se han injertado con la proteína de control L2, (como se indicó). Los factores inmunomoduladores (por ejemplo interferón \gamma), IL-4 IL-10) también se pueden incluir en las preparaciones de membrana BCG blanco con el fin de provocar el tipo más apropiado de respuesta inmune. Los resultados así muestran que así como los antígenos de apuntamiento a los DC para mejorar la inmunidad tumoral (como se ejemplificó anteriormente), los PMV modificados y los liposomas de la invención también se pueden utilizar para apuntar a los antígenos de un agente infeccioso a los DC in vivo, para inducir o mejorar la inmunidad al agente.

El término "comprende" y las variantes e términos tales "como comprende" o "que comprende" son utilizados aquí para denotar la inclusión de un entero establecido o de enteros establecidos pero no excluir ninguno de los otros enteros, a menos que en el contexto o uso se requiera la interpretación exclusiva del término.

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Claims

1. Una composición para modular la inmunidad mediante el apuntamiento in vivo de un antígeno a las células dendríticas, la composición comprende:

Una preparación de vesículas de membrana que contienen antígeno o liposomas que contienen antígeno que tienen sobre la superficie de ésta una pluralidad de grupos quelantes de metal, en donde los grupos quelantes de metal son grupos de cabeza de moléculas anfifílicas presentes dentro de los fosfolípidos y/o lípidos que comprenden las vesículas o liposomas; y un ligando, seleccionado del grupo que consiste de un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo o un anticuerpo de dominio, que puede unirse específicamente a un receptor sobre dichas células dendríticas, dicho ligando está ligado a dicho grupo quelante metálico por vía de una etiqueta de afinidad de metal sobre dicho ligando; en donde,

Dichas vesículas que contienen antígeno o liposomas incluyen un factor inmunomodulador seleccionado de un lipopolisacárido bacteriano y un interferón-\gamma.

2. La composición de acuerdo a la reivindicación 1, en donde dichas vesículas de membranas que contienen antígeno se seleccionan del grupo que consiste de vesículas de membrana de plasmas derivados de tumor, vesículas de membrana de plasma derivados de linfocito, vesículas de membrana de plasma derivados de leucocito y reparaciones membranosas de bacterias, protozoos, virus, u hongos.

3. La composición de acuerdo a la reivindicación 1, en donde dichos liposomas que contienen antígeno son liposomas cautela.

4. La composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicho antígeno de dichas vesículas de membrana que contienen antígeno y liposomas que contienen antígeno se seleccionan del grupo que consiste de proteínas, glicoproteínas, péptidos, polisacáridos, y ADN que codifica cualquiera de los anteriores.

5. La composición de acuerdo a una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el antígeno de dichas vesículas o liposomas de membrana que contienen antígeno comprende una pluralidad de diferentes antígenos.

6. La composición de acuerdo a una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde un fragmento de anticuerpo es un fragmento de anticuerpo de cadena única.

7. La composición de acuerdo a una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en donde dicho ligando es para un receptor seleccionado de un grupo que consiste de CD 11c, DEC-205 (CD205)DC-SIGN (CD209), CD206 y CD207.

8. La composición de acuerdo a la reivindicación 7, en donde el ligando es CD 11 -ScFv o DEC-205-ScFv.

9. En donde dicha etiqueta de afinidad con metal sobre dicho ligando es hexahistidina.

10. La composición de acuerdo a una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde dichas moléculas anfifílicas se seleccionan de grupo que consiste de dietradecilamina de ácido nitrilotriacético, tri(ácido nitrilotriacético) ditetradecilamina, o fosfatidiletanolamina de ácido nitrilotriacético.

11. Una composición que comprende una preparación de vesículas de membrana que contienen antígeno o de liposomas que contienen antígeno que tienen sobre la superficie de este una pluralidad de grupos quelantes metálicos, en donde los grupos quelantes metálicos son grupos de cabeza de moléculas anfifílicas presentes dentro de los fosfolípidos y/o los lípidos que comprenden las vesículas o liposomas; y

Un ligando seleccionado del grupo que consiste de un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo y un anticuerpo de dominio que se puede unir específicamente a un receptor sobre dichas células dendríticas, dicho ligando está ligado a dicho grupo quelante metálico por vía de una etiqueta de afinidad de metal sobre dicho ligando, en donde

Dichas vesículas que contienen antígeno o liposomas incluyen un factor de inmunoterapia seleccionado de un lipopolisacárido bacteriano y un interferón-\gamma.

12. Una composición como se reivindicó en la reivindicación 11 como se define adicionalmente en una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 10.

13. Una composición como se reivindicó en la reivindicación 11 o reivindicación 12 en donde dicha composición es adecuada para modular la inmunidad mediante apuntamiento in vivo de un antígeno a las células dendríticas.

14. Un método para reparar una composición para modular una respuesta inmune mediante el apuntamiento in vivo de un antígeno a las células dendríticas, el proceso comprende las etapas de:

ii): modificar dichas vesículas de membrana que contienen antígeno o liposomas que contienen antígeno mediante la incorporación de al menos

\quad: un factor inmunomodulador seleccionado de un lipopolisacárido bacteriano interferón-\gamma;

iii): modificar además dichas vesículas de membrana que contienen antígeno o liposomas que contienen antígeno mediante la incorporación de moléculas anfifílicas, en donde dichas moléculas anfifílicas incluyen los grupos de cabeza de un grupo quelador de metal que descansa sobre la superficie de dichas vesículas de membrana que contienen antígeno o liposomas que contienen antígeno cuando se incorporan en estos;

iv): poner en contacto el producto de la etapa (iii) con un ligando, seleccionado del grupo que consiste de un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo y un anticuerpo de dominio que se puede unir específicamente a un receptor sobre dichas células dendríticas, en donde dicho ligando incluye una etiqueta de afinidad de metal para unirse a dicho grupo quelador.

15. El método de acuerdo a la reivindicación 14, en donde dichas vesículas de membrana que contienen antígeno preparadas en la etapa (1), dichos liposomas que contienen antígeno preparados en la etapa (i) dicho antígeno de dichas vesícula de membrana que contienen antígeno y los liposomas que contienen antígeno, dichas moléculas anfifílicas incorporadas en la etapa (iii), dicho ligando contactado con el producto de la etapa (iii) o dicha etiqueta de afinidad de metal sobre dichos ligandos es como se definió en una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 10.

16. La composición como se definió en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 para modular la respuesta inmune en un sujeto.

17. La composición de acuerdo a la reivindicación 16, en donde dicha modulación de la respuesta inmune es para la prevención o el tratamiento de un rechazo de trasplante o de una enfermedad autoinmune.

18. La composición de acuerdo a la reivindicación 17, en donde dicha enfermedad autoinmune es diabetes tipo 1, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico o esclerosis múltiple.

19. La composición como se definió en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 para evitar o tratar un tumor en un sujeto, en donde dicho antígeno incluido en dichas vesículas de membrana que contienen antígeno o liposomas que contienen antígeno es un antígeno tumoral.

20. La composición de acuerdo a la reivindicación 19, en donde dicho tumor es un melanoma, a un cáncer de próstata, intestino, mama o pulmón.

21. Composición como se definió en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 para evitar o tratar la infección en un sujeto, en donde dicho antígeno incluido en dichas vesículas de membrana que contienen antígeno o liposomas que contienen antígeno es un antígeno proveniente de un agente que causa la infección.

22. La composición de acuerdo a la reivindicación 21, en donde el agente causante de dicha infección es una bacteria, una microbacteria, un virus, o un hongo.

23. La composición de acuerdo a una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 22, en donde dicho sujeto es un sujeto humano.