JP4970035B2

JP4970035B2 - ｉｎｖｉｖｏにおける樹状細胞の標的化

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Publication number: JP4970035B2
Application number: JP2006523491A
Authority: JP
Inventors: ジョゼフ・アルティン; クリストファー・リチャード・パリッシュ
Original assignee: Lipotek Pty Ltd
Current assignee: Lipotek Pty Ltd
Priority date: 2003-08-21
Filing date: 2004-08-23
Publication date: 2012-07-04
Anticipated expiration: 2024-08-23
Also published as: ES2342606T3; AU2004266034A1; CN102172397B; ATE458472T1; AU2004266034B2; CN102172397A; CN1893925A; US20070026057A1; EP1660040A1; EP1660040B1; WO2005018610A1; DE602004025711D1; JP2007502780A; EP1660040A4; CN1893925B; US20130142864A1

Description

本明細書において記載される本発明は、一般に疾患予防のためまたは治療目的で免疫応答を調節するために樹状細胞（ＤＣ）に対して膜結合抗原（Ａｇ）を標的化するための調製物の組成物に関する。より詳細には、本発明は、Ａｇを含む膜の修飾方法に関し、標的化分子および免疫調節因子の移植および／または取込みを可能にし、ｉｎｖｉｖｏにおいて修飾された膜をＤＣに対して標的化し、そして免疫応答を強力に誘発または抑制することを可能にする。さらにより詳細には、本発明は、リポソームまたは細胞膜小胞（ＰＭＶ）などのＡｇを含む膜構造を修飾することで、ｉｎｖｉｖｏにおいてそれらの膜をＤＣに対して有効に標的化できることによって免疫を調節し、また同膜を免疫療法におけるワクチンもしくはワクチン様作用物質（ｖａｃｃｉｎｅ−ｌｉｋｅａｇｅｎｔ）として用いることでヒトおよび動物における疾患の予防または治療を可能にするのに使用できる組成物に関する。

樹状細胞（ＤＣ）は、一次免疫応答を固有に刺激できる抗原提示細胞（ＡＰＣ）の希少集団であり、癌免疫療法におけるそれらの利用に強い関心が生じている^１。これまで強力な免疫応答に対するＤＣの刺激能を用いる試みでは、主にｅｘｖｉｖｏにおけるＤＣ操作に関する手順に焦点が当てられてきた。このアプローチは、ＤＣにおける患者からの単離、数の増殖、抗原（Ａｇ）による負荷（参考文献２〜５）、次いで患者への再導入を必要とする場合が多い。この手順は原理的には単純であるが、上記希少細胞集団の単離および培養に付随する問題がある^６，７。明らかに、ｉｎｖｉｖｏにおいてＡｇをＤＣに直接送達し、かつ適切な免疫応答を誘発することができる戦略には、非常に大きな臨床的可能性がある。

ＤＣは、骨髄における先祖を起源とし、未熟細胞としてＡｇを内在化しかつ複合体成熟過程を経る末梢組織に移動する。Ａｇは、補体受容体（例えばＣＤ１１ｃ／ＣＤ１８）および細胞内受容体（例えば、ＤＥＣ−２０５、ＤＣ−ＳＩＧＮおよびＴｏｌｌ様受容体）を含む多数の表面受容体を介して内在化される。Ａｇ捕捉の間、未熟ＤＣは、細菌性細胞壁リポ多糖（ＬＰＳ）などの病原体関連分子の形態における「危険シグナル（ｄａｎｇｅｒｓｉｇｎａｌ）」、またはＩＦＮ−γなどのサイトカインを介する炎症性刺激を受けとる場合もある。次いでＤＣは二次リンパ器官に移動し、成熟してコンピテントＡＰＣになる^８。ＣＤ１１ｃ／ＣＤ１８、ＤＥＣ−２０５、ＤＣ−ＳＩＧＮおよびＴｏｌｌ様受容体などの受容体は、Ａｇの捕捉および提示の過程において重大な役割を担い、主としてＤＣ上に発現される。したがって、これらの受容体はｉｎｖｉｖｏにおけるＡｇのＤＣに対する直接的な標的化においても使用できると考えられる。この考えに整合するように、ＤＥＣ−２０５に対してＡｇおよび一本鎖抗体（ＳｃＦｖ）からなる融合タンパク質は、ｉｎｖｉｖｏにおいてＤＣに対して標的化し、抗ＣＤ４０抗体などの炎症性刺激物質と同時投与される際にＴ細胞の活性化を誘発することが判明している^９，１０。これに対し、かかる炎症性刺激物質の非存在下でＳｃＦｖを介してＤＣに対して標的化された抗原は、Ｔ細胞の非応答性を誘発した。

合成リポソームは大量のＡｇをＤＣへ送達する可能性を有するが（参考文献１１）、今日まで特異的なＤＣ表面分子に対するそれらの標的化を実際に達成することは困難であった^{１２，１３}。明らかに、リポソームにおけるＡｇの運搬能力とｉｎｖｉｖｏにおいて「危険シグナル」の有無にかかわらず複数のＡｇをＤＣ対して直接的に標的化する分子認識の特異性を組み合わせる有効な戦略は、特に癌、感染症、および自己免疫疾患に対するＤＣ免疫療法の簡素化において大きな可能性を有していると考えられる。

特許文献１では、修飾された生体膜もしくは合成膜またはリポソームがｉｎｖｉｖｏにおいて投与される際に、免疫を改変する目的でまたは薬物および他の作用物質の特異的な細胞種もしくは組織に対する標的化用に、生体膜もしくは合成膜またはリポソームを修飾する方法が記載される。膜またはリポソームの修飾は金属キレート基の取込みまたは付着によって行われ、それにより金属親和性標識を有する１つまたは複数の標的化分子の移植が可能になる。しかしながら、ＡｇのＤＣに対する標的化によって誘発される免疫応答の性質は、サイトカインまたは「危険」シグナルなどの特異的な免疫調節因子の存在に決定的に依存し、特許文献１にはｉｎｖｉｖｏにおいて適切な免疫応答を誘発するのに必要とされる膜修飾または必要とされる免疫調節因子に関する開示または示唆が全くない。
国際特許出願第ＰＣＴ／ＡＵ００／００３９７号（国際公開第００／６４４７１号パンフレット）

本願明細書における本発明の目的は、適切な免疫調節因子すなわち「危険シグナル」の取込みを介して該膜を修飾することによるｉｎｖｉｖｏにおけるＡｇを含むリポソームおよびＰＭＶのＤＣに対する標的化、およびＤＣ表面上の受容体に対して修飾膜を標的化することで適切な免疫応答を誘発できるリガンドの移植のための組成物を提供することである。組成物をワクチンとしてまたは免疫療法において用いることで、様々な癌および感染症などの疾患の予防または治療のために免疫を増強できるか、あるいは移植拒絶の治療または予防に利用できる方法で特異的な自己Ａｇに対する免疫、またはＩ型糖尿病、関節リウマチ、全身性エリテマトーデスおよび多発性硬化症などの自己免疫疾患の作用が抑制できる。

本発明のさらなる目的は、適切な組成物を調製するための方法、および該組成物を利用する治療方法を提供することである。

本発明の第１の実施形態によると、ｉｎｖｉｖｏにおいて抗原を樹状細胞に対して標的化することによって免疫を調節するための組成物であって、
複数の金属キレート基を表面上に有する上記の抗原を含む膜小胞または抗原を含むリポソームの調製物と、
該樹状細胞上の受容体に対するリガンドであって、該リガンド上の金属親和性標識を介して該金属キレート基に連結される該リガンドと、を含み、上記の抗原を含む小胞またはリポソームが免疫調節因子を含む、該組成物が提供される。

本発明の第２の実施形態によると、ｉｎｖｉｖｏにおいて抗原を樹状細胞に対して標的化することによって、免疫応答を調節するための組成物を調製する方法であって、
ｉ）抗原を含む膜小胞または抗原を含むリポソームを調製する工程；
ｉｉ）少なくとも１つの免疫調節因子の取込みによって上記の抗原を含む膜小胞または抗原を含むリポソームを修飾する工程；
ｉｉｉ）両親媒性分子の取り込みによって前記抗原を含む膜小胞または抗原を含むリポソームを修飾する工程、ここに両親媒性分子は、前記抗原を含む膜小胞または抗原を含むリポソームに取り込まれた場合にそれらの表面上に位置するキレート基を含むものであり；次いで
ｉｖ）該樹状細胞上の受容体に対する、該キレート基に結合するための金属親和性標識を含むリガンドに工程（ｉｉｉ）の前記産物を接触させる工程
を含む、方法が提供される。

本発明の第３の実施形態によると、対象における免疫応答を調節する方法が提供され、該方法は、該対象に第１の実施形態に従う組成物を投与することを含む。

本発明の第４の実施形態によると、対象における腫瘍を予防または治療する方法が提供され、該方法は、該対象に第１の実施形態に従う組成物を投与することを含む。ここで上記の抗原を含む膜小胞または抗原を含むリポソームに含まれる該抗原は腫瘍抗原である。

本発明の第５の実施形態によると、対象における感染症を予防または治療する方法が提供され、該方法は、該対象に第１の実施形態に従う組成物を投与することを含む。ここで上記の抗原を含む膜小胞または抗原を含むリポソームに含まれる該抗原は該感染症を引き起こす作用物質由来の抗原である。

本発明の第６の実施形態によると、対象における免疫応答を調節するための薬物の調製における第１の実施形態に従う組成物の使用が提供される。

本発明の第７の実施形態によると、対象における腫瘍を予防または治療するための薬物の調製における第１の実施形態に従う組成物の使用が提供される。

本発明の第８の実施形態によると、対象における感染症を予防または治療するための薬物の調製における第１の実施形態に従う組成物の使用が提供される。

本発明の他の実施形態は、以下の本発明の詳細な説明を解釈することから明らかになり、その記載においては、以下の簡単に説明された添付の図面が参照されることになろう。

本明細書では以下の略語が用いられる。
Ａｇ抗原
ＡＰＣ抗原提示細胞
ＣＴＬ細胞傷害性Ｔリンパ球
ＤＣ樹状細胞
ＩＦＮ−γ インターフェロン−γ
ＬＰＳリポ多糖
（ＮＴＡ）_３−ＤＴＤＡトリ（ニトリロ三酢酸）ジテトラデシルアミン
ＯＶＡ卵白アルブミン
ＰＭＶ細胞膜小胞
ＳｃＦｖ一本鎖抗体断片
ＳＬステルスリポソーム

「抗原」という用語は、本明細書において免疫系に対する提示のためにＤＣによって取込み、内在化および処理可能な任意の分子を意味するように用いられる。

「リガンド」という用語は、本明細書においてｉｎｖｉｖｏでＤＣの表面上のマーカー／受容体に特異的に結合できる任意の分子を意味するように用いられる。同用語は、全抗体、ならびにＳｃＦｖおよびドメイン抗体などの抗体断片を含む。

「免疫調節因子」という用語は、本明細書において任意の「危険シグナル」、すなわちサイトカインまたは免疫応答の経過または結果を調節できる分子を意味するように用いられる。

「受容体」という用語は、本明細書においてＤＣの表面上の受容体分子を意味するように用いられ、かつリポソームまたは膜小胞に移植されたリガンドが相互作用できる対象であるＤＣ表面上の実体である。

「腫瘍」という用語は、本明細書において良性および悪性の固形腫瘍ならびに固形癌および非固形癌を意味するように用いられる。

上で定義した第１の実施形態に関しては、抗原を含む膜小胞は、典型的にはＰＭＶであるが任意の生体膜または生物学的構造から形成できる。ＰＭＶは、有利なことに腫瘍由来のＰＭＶである。ＰＭＶは、リンパ球由来のＰＭＶまたは白血球由来のＰＭＶでもありうる。ＰＭＶはさらに、細菌、原虫、ウイルスまたは真菌の膜調製物でありうる。抗原を含むリポソームに関しては、これらは種々の脂質混合物から生成できるステルスリポソーム（ＳＬ）を含む。かかる小胞およびリポソームは、参考文献１４、１６、１７および２８に記載のように調製でき、それらの全含有物は、本明細書において相互参照として援用される。

組成物のＡｇは、任意のＡｇ、またはＡｇをコードするＤＮＡであることが可能であり、それらに対する免疫応答が望ましい。組成物は、同一のもしくは異なる供給元から得られうる複数の異なる抗原を含みうる。すなわち、腫瘍抗原を含む組成物は、異なる腫瘍由来の抗原を含む場合がある。

小胞およびリポソームの表面上の金属キレート基は、小胞およびリポソームを形成するリン脂質および／または脂質の内部に存在する両親媒性分子の頭部として存在する。両親媒性分子は、有利なようにニトリロ三酢酸ジテトラデシルアミン（ＮＴＡ−ＤＴＤＡ）またはニトリロ三酢酸ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ−ＮＴＡ）であるが、組成物は脂質膜内に取込み可能な任意の金属結合またはキレート部分を含む任意の分子を含みうる。さらに組成物は、両親媒性分子の混合物を含みうる。

下記により詳細に説明されるように、好ましい両親媒性分子は、（ＮＴＡ）_３−ＤＴＤＡ（トリ（ニトリロ三酢酸）ジテトラデシルアミン）である。同一のものを含む他の両親媒性分子、小胞およびリポソームとともに関連する分子ＮＴＡ−ＤＴＤＡは、国際特許出願第ＰＣＴ／ＡＵ００／００３９７号明細書（国際公開第００／６４４７１号パンフレット）においてより詳細に記載され、それらの全含有物は本明細書において相互参照として援用される。

膜小胞上およびリポソーム上の金属キレート基に連結されるリガンドは、任意のＤＣ表面マーカーに特異的に結合できる任意の金属親和性標識分子でありうる。好ましい金属親和性標識はヘキサヒスチジンである。下記の例では、ＤＣ表面分子のＣＤ１１ｃおよびＤＥＣ−２０５（ＣＤ２０５）に対するＳｃＦｖのヘキサヒスチジンで標識した形態が用いられる。他の例として、ＤＣ−ＳＩＧＮ（ＣＤ２０９）、ＣＤ２０６およびＣＤ２０７などのＤＣ表面マーカーに結合できる抗体または抗体断片などの任意のヒスチジンで標識したリガンドが挙げられる。

組成物は、ＤＣ上の異なるマーカー／受容体に対する複数のリガンドを含みうる。例えば組成物は、リガンドとしてＤＣ−ＳＩＧＮに対するＳｃＦｖと組み合わせてＤＥＣ−２０５に対するＳｃＦｖを含みうる。

上述したように、リガンドの金属親和性標識は、典型的にはリガンド上の簡便な部位で共有結合するヘキサヒスチジン部分である。例えばヘキサヒスチジンは、タンパク質抗原にそのＮもしくはＣ末端で連結できる。他の金属親和性標識は、金属をキレート化でき、かつリガンド上の簡便な部位に共有結合できる任意の部分またはアミノ酸配列を含む。

第１の実施形態に従う組成物の免疫調節因子は、ＤＣの抗原に対する応答を増強または修飾できる化合物または分子を含む。かかる化合物として、「危険シグナル」（例えば細菌性リポ多糖）、サイトカイン（例えば、インターフェロン−γ、インターロイキン−２、インターロイキン−４、インターロイキン１０−、インターロイキン−１２および形質転換成長因子−β）、ならびにケモカイン、ホルモンおよび成長因子様分子、またはかかる分子をコードするＤＮＡが挙げられる。組成物は２つ以上の免疫調節因子を含みうる。

本発明の第２の実施形態に関し、リガンドが補足された膜小胞またはリポソームの調製のための適切な方法は先に参照された国際出願（ＰＣＴ／ＡＵ００／００３９７号）に記載されている。

第２の実施形態の方法における工程（ｉ）に関しては、膜小胞は典型的にはＰＭＶであるが任意の生体膜または生物学的構造から形成できる。リポソームはＳＬを含む。膜小胞およびリポソームにおけるＡｇは、ＤＣに送達されるものとして、タンパク質、糖タンパク質、ペプチドもしくは多糖類、または抗原をコードするＤＮＡ、またはそれらの組み合わせでありうる。

第２の実施形態の方法における工程（ｉｉ）では、第１の実施形態の組成物と同様に、免疫調節因子は、「危険シグナル」（例えば細菌性リポ多糖）、サイトカイン（例えば、インターフェロン−γ、インターロイキン−２、インターロイキン−４、インターロイキン−１０、インターロイキン−１２および形質転換成長因子−β）、またはかかる因子をコードするＤＮＡでありうる。

第３の実施形態に従う方法における免疫応答調節は、移植拒絶、またはＩ型糖尿病、関節リウマチ、全身性エリテマトーデスおよび多発性硬化症などの自己免疫疾患の作用を含む状態の予防あるいは治療における用途を有する。移植患者の場合、これは移植レシピエントのＤＣに対して標的化されるドナー白血球由来のＰＭＶの投与に関与する。この例における免疫調節因子は、例えばインターロイキン−１０もしくは形質転換成長因子−βなどのサイトカインでありうる。しかしながら、免疫調節因子は免疫寛容誘導性ＤＣの産生能を有する任意の分子でありうる。

第４の実施形態の方法は、メラノーマや、前立腺、腸、乳房および肺における癌を含むがそれらに限定されない任意の腫瘍の治療において利用できる。同方法は、白血病およびリンパ腫の治療においても利用できる。同方法は、任意の哺乳類動物における腫瘍の治療に利用できるが、ヒトにおける腫瘍の治療に特に適している。

対象に送達されるべき修飾されたＡｇを含む膜小胞またはリポソームの量およびその投与法（ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎｒｅｇｉｍｅ）は、臨床医により治療中の腫瘍の観点から対象を評価した後に決定できる。

当業者であれば、第４の実施形態に従う方法が癌免疫療法での利用においてｅｘｖｉｖｏにおけるＤＣの操作に対して有効な代替案を提供することを直ちに認識するであろう。

第５の実施形態に関しては、感染症の原因である作用物質に対する免疫を増強するため、および／または感染症の治療における利用において、本方法を利用することで、細菌、マイコバクテリウム、ウイルスおよび真菌によって引き起こされる感染症を含む任意の感染症が予防または治療できる。移植拒絶の予防のために先に挙げられた例に類似する方法における有効な方法を提供するために必要なことは、病原菌由来の少なくとも１つの抗原を含むＰＭＶまたはリポソームを調製することだけである。同抗原は、例えば、ウイルス（例えば、ＨＩＶ、Ｂ型およびＣ型肝炎）のエンベロープタンパク質または細菌（例えばマイコバクテリア）、真菌（例えばカンジダ）および原虫（例えばマラリア）の細胞壁成分でありうる。

本発明の第３から第５の実施形態に従う対象への組成物の投与は、当業者に既知の方法のいずれかによる可能性がある。組成物は典型的には静脈内または皮下に投与される。

第３から第５の実施形態における方法の対象は、典型的には哺乳類対象である。同方法はヒト対象での利用に特に適する。

当業者であれば、本発明の第６から第８の実施形態に従う薬物が組成物に見合う少なくとも１つの担体も含むことになることを認識するであろう。担体は、ＰＭＶおよびリポソームと互換性をもつ任意の溶液でありうる。典型的な担体は、ＰＢＳなどの生理食塩水および緩衝生理食塩水である。

薬物は、さらに薬物の意図した使用に合致する活性物質を含みうる。例えば、第７の実施形態に従う薬物が他の抗癌剤を含みうる一方で、第８の実施形態に従う薬物は標的感染に適するものとして抗菌、抗原生動物、抗ウイルスまたは抗真菌の活性を有する他の作用物質を含みうる。かかる添加剤は当業者にとっては既知であろう。

試作品の試験
試作品の試験において、本発明者らは、キレーター−脂質（ＮＴＡ）_３−ＤＴＤＡを用いることで、ＤＣの標的化のために腫瘍由来の細胞膜小胞（ＰＭＶ）上もしくは腫瘍抗原を含むステルスリポソーム上にＨｉｓで標識したＳｃＦｖが固着できることを見出している。この方法によるＡｇのＤＣに対する直接的な標的化が強力な抗腫瘍応答を誘発した。

リポソームは、高い治療的可能性を有するものとして認められているが、標的化分子を付着させるための簡単な方法が欠如していることによってそれらの利用が妨げられている^１３。新規のキレーター−脂質である（ＮＴＡ）_３−ＤＴＤＡ（図１Ａ）は、ＳＬ内または腫瘍細胞由来ＰＭＶ（Ｂ１６−ＯＶＡ）内に取込まれる場合に、ＤＣ上の表面分子を標的化するヘキサ−ヒスチジンで標識したＳｃＦｖの安定的移植を可能にする（図１Ｂおよび図１Ｃ）。ＤＣマーカーであるＣＤ１１ｃおよびＤＥＣ−２０５に特異的なＳｃＦｖを移植したＰＭＶおよびＳＬは、ｉｎｖｉｔｒｏにおいてＤＣに特異的に結合し、そしてフローサイトメトリーおよび共焦点顕微鏡による試験に基づき、ｉｎｖｉｖｏにおいて関連するＡｇを直接ＤＣに対して標的化できる（図２および３）。

最初に、ＤＣで開始されるＡｇ提示アッセイにおいて移植されたＰＭＶおよびＳＬの機能的応答に対する刺激能を試験した。発明者らの試験は、ＤＣのＴ細胞増殖に対する刺激を誘発する時点で、ＳｃＦｖを移植したＰＭＶおよびＡｇを含むＳＬが対照ＰＭＶおよびＳＬよりも極めて有効であることを示す（図４Ａ）。ＰＭＶを用いてＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋Ｔ細胞の両方において増殖を刺激した。ＰＭＶは、腫瘍細胞小胞内に存在するエピトープに反応するすべての候補Ｔ細胞クローンによって媒介される応答に対して刺激能を有する。同様に、ＯＶＡタンパク質を含む、ＳｃＦｖを移植したＳＬは、ＯＶＡに特異的なＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋Ｔ細胞の両方を刺激する可能性があるが；ＯＶＡ内の免疫優勢ＣＴＬエピトープであるＳＩＩＮＦＥＫＬを含むＳＬは、ＣＤ８^＋Ｔ細胞応答のみを引き起こすものと考えられる。これに見合うように、発明者らのデータは、移植されたＰＭＶによって標的化されたＤＣがＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋Ｔ細胞をほぼ等しい割合で産生する一方で、ＳＩＩＮＦＥＫＬを含むＳＬによって標的化されるＤＣやより少ない程度にＯＶＡを含むＤＣは、主にＣＤ８^＋Ｔ細胞を産生することを示す（図４Ｂ）。

証拠は、Ａｇの暴露後、「危険」シグナルがＤＣの成熟および遊走において重要であり、提示されたＡｇに対する耐性の誘発を回避できる^{９，１０，１８}。注目すべきことに、ＤＣは単離される間に「摂動される」ことまたは活性化されることが推定されるために、ｉｎｖｉｖｏにおけるＡｇ提示アッセイでは「危険」シグナルが必要ではなかった（図４）。ＧＭ−ＣＳＦやＩＦＮ−γに類するＬＰＳおよびサイトカインは、Ａｇを取込んで成熟するＤＣの能力に影響を与えることが知られている^{８，１９〜２１}。したがって、動物試験において発明者らはＰＭＶおよびＳＬの内部にＬＰＳ、ＩＦＮ−γまたはＧＭ−ＣＳＦを取込むことにより、Ａｇと危険シグナルの両方をＤＣに同時に送達するための手段を提供した。

Ａｇを含む、ＳｃＦｖを移植したＰＭＶおよびＳＬにおけるＣＴＬ応答を開始させるＤＣに対する誘発能に関する試験により、対照細胞と比べてＳｃＦｖを移植したＰＭＶまたはＡｇを担持するＳＬで免疫された動物由来のＴ細胞が、ｉｎｖｉｔｒｏにおける再刺激後に、ｉｎｖｉｔｒｏにおいてＢ１６−ＯＶＡ標的細胞を分解する能力を亢進させることを示した（図５）。重要なことに、その結果はｉｎｖｉｖｏにおける細胞溶解活性におけるプライミングが最大の応答を刺激するＬＰＳおよびＩＦＮ−γを含む「危険」シグナルの存在に依存することを示す（図５）。異種ＯＶＡタンパク質およびヘキサヒスチジンで標識した形態のＳＩＩＮＦＥＫＬの両方が移植したＳｃＦｖを介する標的化におけるＳＬに関連する可能性があると考えられる。したがって、Ａｇ提示およびＣＴＬにおけるアッセイは、この方法によるＳｃＦｖを移植したＰＭＶおよびＡｇを担持するＳＬのＤＣに対する標的化が抗腫瘍応答の刺激において有効である可能性があり、免疫応答の誘発における「危険」シグナルの重要性を強調することを実証する（図４および５）。さらに、ＳＩＩＮＦＥＫＬ−６Ｈを含む、ＳｃＦｖを移植したＳＬが顕著な細胞傷害性応答を誘発できるという知見は、（ＮＴＡ）_３−ＤＴＤＡを含むＳＬを用いるアプローチがｉｎｖｉｖｏにおける任意のＨｉｓで標識したペプチドＡｇのＤＣに対する標的化において有効な戦略でありうることを実証する。

この業績における極めて重要な知見は、ＣＤ１１ｃ−ＳｃＦｖおよびＤＥＣ−２０５−ＳｃＦｖを移植したＰＭＶで免疫した同系動物では、Ｂ１６−ＯＶＡメラノーマによる負荷後に対照と比較すると、肺における腫瘍転移数が顕著に低下したという発明者らの観察であった。同様に、ＯＶＡを含む、ＳｃＦｖを移植したＳＬおよびＬＰＳかＩＦＮ−γのいずれかで免疫した同系動物が転移数の低下を示した（図６）。さらにそれらの結果は、腫瘍免疫が「危険」シグナル、ＬＰＳおよびＩＦＮ−γの存在に完全に依存したことを示す（図５および図６）。したがって、ＣＤ１１ｃ−ＳｃＦｖおよびＤＥＣ−２０５−ＳｃＦｖを移植したＰＭＶおよびＡｇを担持するＳＬを用いたマウスの免疫により、関連するＡｇをＤＣに対して標的化し、次いでＡｇをＴ細胞に対して処理して提示することでＡｇに特異的なＴ細胞の活性化を誘発し、かつｉｎｖｉｖｏにおいてＢ１６−ＯＶＡ腫瘍の成長および転移における強力な阻害を誘発する。さらに重要な知見は、すべてが重度の肺転移を発現させた対照マウスと異なり、Ｂ１６−ＯＶＡ腫瘍細胞で負荷後にＩＦＮ−γを含む、ＤＥＣ−２０５−ＳｃＦｖを移植したＰＭＶでワクチン接種したマウスは、その後に腫瘍発現のいかなる兆候も示さず、ＤＣを標的化するワクチンが治療的活性を示すことが示唆されたという事実である。

本試験における特に興味深い態様は、Ｂ１６−ＯＶＡメラノーマに対するＣＴＬ活性の明らかな生成が腫瘍の防御に関連しなかった点である。この点は、特にＢ１６−ＯＶＡ腫瘍細胞によって産生したＯＶＡに対してＣＤ８^＋ＣＴＬ応答のみを引き起こす可能性が高いと考えられるＳＩＩＮＦＥＫＬ−ＳＬワクチンによって明らかである。Ｂ１６−ＯＶＡ腫瘍細胞に対する強いｉｎｖｉｔｒｏでのリコール（ｒｅｃａｌｌ）ＣＴＬ応答を誘発するワクチンにもかかわらず、ｉｎｖｉｖｏにおいて免疫によって腫瘍に対する防御が全く得られなかった。Ｂ１６−ＯＶＡメラノーマ系が極めて低レベルのＭＨＣクラスＩを発現し、それに続いて結合活性の高いＣＴＬを用いない場合にＣＴＬ溶解に耐性を示すことは知られている^１４。ＰＭＶまたはＳＬにおけるＤＣの標的化調製物で免疫されたマウス由来の脾細胞がｉｎｖｉｔｒｏにおける腫瘍細胞による再刺激後にＢ１６−ＯＶＡ腫瘍細胞を分解できたという事実は、この腫瘍細胞系に対して結合活性の高いＣＴＬが引き起こされる可能性があることを意味する。推定では、かかるＣＴＬは引き起こされないかまたはｉｎｖｉｖｏにおいて有効ではない。事実、先行試験は、ＣＤ８^＋ではなくＣＤ４^＋Ｔ細胞がＢ１６−ＯＶＡの転移に対して有効であるばかりか、Ｔヘルパー２（Ｔｈ２）細胞の特徴を有するサイトカイン特性を有するＣＤ４^＋Ｔ細胞は特に有効であることを示す^１４。さらに、エオタキシンに依存する好酸球の腫瘍内への動員は、観察される腫瘍退縮にとって必須である^１４。この試験において観察される抗腫瘍作用におけるＣＤ４^＋Ｔ細胞が介在する好酸球動員における考えられる役割を探索するために、ＳｃＦｖを移植したＰＭＶでエオタキシンノックアウトマウスを免疫した。エオタキシンノックアウトマウスは、対照と比較して、Ｂ１６−ＯＶＡ腫瘍の成長および転移に対して顕著に低下した阻害能を示すことを発明者らによる結果は示している（図７Ａ）。エオタキシンは強力な好酸球ケモカインであるが故に、これらの知見は抗腫瘍応答における重要な成分を構成する腫瘍内への好酸球の動員と整合する。

本明細書に記載される修飾したＰＭＶおよびＳＬ系は、腫瘍免疫療法においてＤＣを用いる現行の戦略を上回る多くの利点を提供する。第１に、同系はｉｎｖｉｖｏにおいてＡｇをＤＣへ直接的に送達できることから、患者由来のＤＣを単離し、免疫療法で使用する場合、ｅｘｖｉｖｏにおいて細胞を操作する必要がなくなる。第２に、標的化されるまたは活性のあるリポソームが介在するＡｇのＤＣへの送達は、より多くのＡｇおよび／または数種類のＡｇを送達する可能性を有し、同時に、より有効な免疫応答を潜在的に刺激する。同じアプローチにより、任意のＡｇまたは「危険」シグナルなどの免疫刺激剤、ＲＮＡ、ＤＮＡ、およびサイトカイン、またはそれらの組み合わせをＤＣに潜在的に送達できると考えられる。これはＤＣを標的化するタンパク質と融合されるＡｇを用いて容易に達成できることではない^９，１０。第３に、同アプローチは、用途が広く、ヒスチジン標識を有する任意のＤＣを標的化するタンパク質を修飾したＰＭＶまたはＳＬの上に移植することで、患者における腫瘍免疫を増強するのに特異的な腫瘍Ａｇをはじめとする作用物質が送達できる可能性があるために、臨床利用に都合が良い。

前述の試作品試験において本発明およびその特定の用途について幅広く説明してきたので、以下ではそれにおける材料および方法を詳述した後に特定の実施例が提供されることになる。これらの実施例が単なる図示目的であり、決して本発明の範囲を制限するものでないことが当業者によって理解されるであろう。

材料および方法
試薬
［^３Ｈ］−チミジンおよび^５１Ｃｒ（Ｎａ^５１ＣｒＯ_４）をアマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）（バッキンガムシャー州、英国）から入手した。パルミトイル−オレオイル−ホスファチジル−コリン（ＰＯＰＣ）、ＯＶＡ（ＧｒａｄｅＩＩ、ＦＰＬＣにより精製）、ＬＰＳ（大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）血清型０１１１：Ｂ４由来）、Ｉｓｏｐａｑｕｅ、Ｆｉｃｏｌｌおよびβ−メルカプトエタノールは、シグマ・アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）（キャッスルヒル、ニューサウスウェールズ州、オーストラリア）により供給された。ホスファチジルエタノールアミン−ポリエチレングリコール−２０００（ＰＥ−ＰＥＧ_２０００）をアバンティ・ポーラー・リピッヅ（ＡｖａｎｔｉＰｏｌａｒＬｉｐｉｄｓＩｎｃ．）（アラバスター）から入手した。２−（４，４−ジフルオロ−５オクチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−ペンタノイル）−１−ヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ３−ホスホコリン（ＰＣ−ＢＯＤＩＰＹ）および５−（および−６）−カルボキシフルオレセインジアセテート、サクシニミジルエステル、混合イソマー（ＣＦＳＥ）をモレキュラー・プローブス（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ）（ユージーン、オレゴン州）から購入した。２つのジテトラデシルアミン（ＤＴＤＡ）鎖に共有結合した３つのニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）頭部基からなるキレーター−脂質（ＮＴＡ）_３−ＤＴＤＡを記載^２７のように本質的に合成したが、ＮＴＡ−ＤＴＤＡの各カルボキシル基の上にＮＴＡ基を共有結合させる更なる工程とともに（ＮＴＡ）_３−ＤＴＤＡを生成した。Ｎｉ^２＋の緩衝液へのあらゆる添加にはＮｉＳＯ_４を用いた。

モノクローナル抗体およびタンパク質
マウスＣＤ５６（クローン４２．１８、ラットＩｇＧ２ａ）ｍＡｂは、６^ｔｈＨｕｍａｎＮＫＣｅｌｌＷｏｒｋｓｈｏｐから、およびマウスＣＤ３ｍＡｂ（クローン１４５−２Ｃ１１、ＡｒｍｅｎｉａｎハムスターＩｇＧ）はファーミンゲン（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）（サンディエゴ、カリフォルニア州）から購入した。組換えマウスのＩＦＮ−γおよびＧＭ−ＣＳＦは、ペプロテック（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈＩｎｃ）（ロッキーヒル、ニュージャージー州）によって供給された。組換えＳｃＦｖ抗体Ｎ４１８（抗ＣＤ１１ｃ）およびＮＬＤＣ１４５（抗ＤＥＣ−２０５）は、それぞれカルボキシ末端にヘキサヒスチジン（６Ｈ）標識を有し、それぞれＣＤ１１ｃ−ＳｃＦｖおよびＤＥＣ−２０５−ＳｃＦｖを示し、これらをバキュロウイルスタンパク質発現系を用いて産生し、記載^{１６，２８}のように精製した。ペプチドをＢｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒＲｅｓｏｕｒｃｅＦａｃｉｌｉｔｙ、ＪｏｈｎＣｕｒｔｉｎＳｃｈｏｏｌｏｆＭｅｄｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈ（ＪＣＳＭＲ）、ＡＮＵ、キャンベラによって合成した。血漿タンパク質のヒスチジンに富む糖タンパク質内に認められる１０個のアミノ酸配列であるＬ２ペプチド（ＧＨＨＰＨＧＨＨＰＨ）は、高い結合活性を有するＮｉ−（ＮＴＡ）_３−ＤＴＤＡと結合しその細胞に対する非特異的結合を遮断できることから、これを通常用いて対照のＰＭＶおよびＳＬを移植した。ペプチドＡｇをＤＣへ送達するのに、Ｈ−２^ｂマウス内のＯＶＡの免疫優勢ＣＴＬエピトープ（ＯＶＡ残基２５７〜２６４）を示すペプチドＳＩＩＮＦＥＫＬ−６Ｈを付着させたヘキサヒスチジン標識とともに用いた。

マウスおよび細胞系
６〜８週齢の雌または雄のＣ５７ＢＬ６マウス（Ｈ−２^ｂ）はＡｎｉｍａｌＢｒｅｅｄｉｎｇＥｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ（ＪＣＳＭＲ、ＡＮＵ）から供給され、かつＣ５７ＢＬ６エオタキシンノックアウトマウス（Ｈ−２^ｂ）（エオタキシン^−／−）はＤｒポール・フォスター（ＰａｕｌＦｏｓｔｅｒ）、ＤｉｖｉｓｉｏｎｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（ＪＣＳＭＲ）からの贈呈であり、そして同マウスを用いることでｉｎｖｉｔｒｏにおけるアッセイおよびｉｎｖｉｖｏにおける腫瘍成長試験においてリンパ球様細胞を得た。１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ、トレースバイオサイエンシーズ（ＴｒａｃｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ノーブルパーク、ビクトリア州、オーストラリア）および０．５ｍｇ／ｍＬＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を含有するＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ、インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、メルボルン、オーストラリア）内で、ＯＶＡを分泌する腫瘍細胞系である高転移性を有するマウスＢ１６−ＯＶＡメラノーマ［Ｃ５７ＢＬ６（Ｈ−２^ｂ）］を５％ＣＯ_２の大気中で３７℃で培養した。マウス胎児皮膚樹状細胞（ＭｕｒｉｎｅＦｏｅｔａｌＳｋｉｎＤｅｎｄｒｉｔｉｃＣｅｌｌｓ）（ＦＳＤＣ）［Ｃ５７ＢＬ６−ＤＢＡ／２ＪＦ１（Ｈ−２^ｂ／ｄ）］を同じ培地内で培養したが、ジェネチシンを含まなかった。記載^２９のように単離して培養したマウス長期培養樹状細胞（ＭｕｒｉｎｅＬｏｎｇＴｅｒｍｃｕｌｔｕｒｅＤｅｎｄｒｉｔｉｃＣｅｌｌｓ）（ＬＴＣ−ＤＣ）［Ｂ１０．Ａ（２Ｒ）（Ｈ−２^ｋ／ｂ）］は、ＤｒＨ．オニール（ＤｒＨ．Ｏ’Ｎｅｉｌｌ）（ＳｃｈｏｏｌｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、ＡＮＵ）からの贈呈であった。

樹状細胞およびＴ細胞の単離
マウスのＤＣおよびＴ細胞をＣ５７ＢＬ／６マウスの脾臓から単離した。つまり、脾細胞をコラゲナーゼＩＶ（ベーリンガー・マンハイム（ＢｏｅｒｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ））を用いた消化によって単離してから、Ｉｓｏｐａｑｕｅ−Ｆｉｃｏｌｌ勾配を用いて密度勾配遠心分離によって低密度の脾細胞を単離した。ＤＣを記載^３１のようにプラスチック付着によって単離し、次いで１０％ＦＣＳ、５×１０^−５Ｍのβ−メルカプトエタノール、１００ＩＵ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのネオマイシン、および１０ｍＭのＨＥＰＥＳを含有する完全ＲＰＭＩ１６４０成長培地内で懸濁した。Ｔ細胞の単離のために、脾臓を単一細胞懸濁液中に溶解し、低張による溶解（ｈｙｐｏｔｏｎｉｃｌｙｓｉｓ）によって赤血球を取り出した後、ナイロンウールカラムを用いてＴ細胞を単離した^３２。

細胞膜小胞およびステルスリポソーム
培養細胞由来のＰＭＶをショ糖勾配遠心分離によって調製し^３０、本質的には概説したように修飾した^{１６，１７}。ＰＭＶの修飾に用いるリポソームを以下のように調製した。すなわち、ＰＯＰＣ、（ＮＴＡ）_３−ＤＴＤＡ、ＬＰＳおよびＰＣ−ＢＯＤＩＰＹ（モル比９４：２：２：２）；またはＰＯＰＣ、（ＮＴＡ）_３−ＤＴＤＡおよびＰＣ−ＢＯＤＩＰＹ（モル比９６：２：２）のエタノール溶液を混合し、Ｎ_２の流れの下で乾燥させ、次いで６０μＭのＮｉ^２＋を含有するＰＢＳ１００μｌ中で再水和した。ＬＰＳの代わりとして必要な場合、ＩＦＮ−γもしくはＧＭ−ＣＳＦ（５０ｎｇ）を再水和用緩衝液中に含有させた。ＴＯＳＣＯ１００Ｗの超音波破砕機（メジャリング・アンド・サイエンティフィック（ＭｅａｓｕｒｉｎｇａｎｄＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＬｔｄ．）、ロンドン、英国）を最大振幅で用いて水和混合物を超音波で破砕した（３回、１５秒バースト）。１５％ＰＥＧ_４００を添加してＰＢＳで１０倍に希釈する前に、リポソーム（１００μｌ）をＢ１６−ＯＶＡ細胞由来のＰＭＶ（１×１０^８細胞当量）１００μｌと混合させた。適切なＳｃＦｖを移植する前に、サイズ排除クロマトグラフィーにより（ＮＴＡ）_３−ＤＴＤＡおよびサイトカインを含むＰＭＶを精製した^１７。

ステルスリポソーム（ＳＬ）を以下のように調製した。すなわち、エタノール中で溶解したＰＯＰＣ、（ＮＴＡ）_３−ＤＴＤＡ、ＰＥ−ＰＥＧ_２０００、ＬＰＳおよびＰＣ−ＢＯＤＩＰＹ（モル比９６：１：１：１：１）；またはＰＯＰＣ、（ＮＴＡ）_３−ＤＴＤＡ、ＰＥ−ＰＥＧ_２０００およびＰＣ−ＢＯＤＩＰＹ（モル比９７：１：１：１）をＮ_２の流れの下で乾燥させ、次いで３０μＭのＮｉ^２＋（総脂質１ｍＭ）を含有するＰＢＳ１００μｌ中で再水和した。欠けているＬＰＳ、ＩＦＮ−γまたはＧＭ−ＣＳＦ（５０ｎｇ）をＰＢＳ中に含ませて混合物とした。脂質混合物を超音波で破砕し、ＳＬを精製した（上記）。機能的試験において、すべての脂質混合物からＰＣ−ＢＯＤＩＰＹを除外した。

ＯＶＡタンパク質ＳＩＩＮＦＥＫＬの免疫優勢エピトープのＳＬ内へのカプセル化を試みたが、ＳＬの生成およびヒスチジンで標識したＳｃＦｖの移植に用いられるｐＨ（ｐＨ７．４）でこのペプチドの溶解度が低いことから困難であることが判明した。しかしながら、ヘキサヒスチジンで標識した形態のペプチドであるＳＩＩＮＦＥＫＬ−６Ｈは、ペプチドの（ＮＴＡ）_３−ＤＴＤＡを含むＳＬ上への効率的なカプセル化および／または移植を可能にした。ＦＡＣＳ解析を用いた結合試験は、ＳＩＩＮＦＥＫＬ−６Ｈを含む、ＣＤ１１ｃ−ＳｃＦｖまたはＤＥＣ−２０５−ＳｃＦｖを移植したＳＬがｉｎｖｉｔｒｏにおいてＤＣ上の受容体を有効に標的化できることを示した（図示せず）。したがって、必要な場合、ＳｃＦｖの同時移植に対してＳＩＩＮＦＥＫＬ−６Ｈ（２μＭ）を含めた。０．１ｍｇのＯＶＡ（１ｍｇ／ｍｌ）を含有するＰＢＳ中で乾燥した脂質混合物の再水和とそれに続く短時間の超音波破砕を介し、ＯＶＡのＰＯＰＣ、（ＮＴＡ）_３−ＤＴＤＡおよびＰＥ−ＰＥＧ_２０００を含むＳＬ内への効率的カプセル化を実現した。適切なＳｃＦｖ（２００μｇ／ｍｌ）とともに室温で１時間インキュベートすることにより、（ＮＴＡ）_３−ＤＴＤＡを含むＰＭＶおよびＳＬに移植した。すでに記載^１７されているように移植したＰＭＶおよびＳＬのＤＣに対する結合をフローサイトメトリーによって評価した。

ｉｎｖｉｖｏにおけるＤＣの標的化
試験の追跡において高度に蛍光性のＰＭＶを得るために、ＰＭＶをフルオレセイン−イソチオシアネート（ＦＩＴＣ、モレキュラー・プローブス（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ））と反応させ、ＰＭＶにＬ２もしくはＳｃＦｖを移植し、次いでマウスの後足蹠（ｈｉｎｄｆｏｏｔｐａｄ）内にＰＭＶを注射した。１６時間後、各動物の流出鼡径リンパ節（ｄｒａｉｎｉｎｇｌｙｍｐｈｎｏｄｅ）を採取し、いずれかをビオチン化ＣＤ１１ｃｍＡｂおよびストレプトアビジン−フィコエリトリン（ストレプトアビジン−ＰＥ）による染色後の２色フローサイトメトリー分析または共焦点蛍光イメージングのためのリンパ節細胞の単離用に用いた。イメージング用にリンパ節を１０％のホルマリンに固定し、次いでパラフィン包埋し、そして切片に切断した。次いで同切片をスライドに付着させ、脱ワックスした。ＰＢＳ−ヤギ血清中でＣＤ１１ｃに対するｍＡｂＮ４１８とともに室温で１時間インキュベートする前に、室温で３０分間のＰＢＳ＋２０％ヤギ血清（ＰＢＳ−ヤギ血清）を用いたインキュベーションによってスライドをブロッキングした。次いでスライドを水中で広範に洗浄し、ＰＢＳ−ヤギ血清中でストレプトアビジン−ローダミンで染色した。さらに洗浄した後、Ｒａｄｉａｎｃｅ２０００蛍光共焦点顕微鏡（バイオ・ラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、リッチモンド、カリフォルニア州）を用いてフルオレセインおよびローダミン蛍光についてスライドを分析した。３０回連続するレーザー走査を平均化するＫａｌｍａｎを介して画像を取得し、Ｂｉｏ−Ｒａｄ画像ソフトウェアを用いて画像処理を行った。

抗原提示アッセイ
完全培地内でＤＣを修飾したＰＭＶまたはＳＬとともに３７℃で４時間インキュベートし、次いで洗浄することで結合していないＰＭＶまたはＳＬを除去し、γ照射（５０００ｒａｄ）し、そして成長培地（２×１０^４細胞／２００μｌ／ウェル）内で９６ウェル平底プレートに分注した。［^３Ｈ］−チミジンの取込みの測定によって増殖を評価する前に、同系Ｔ細胞を添加し（２×１０^４／ウェル）、同細胞を４日間共培養した^１４。記載^３３のようにＤＣとの共培養に先立ってＴ細胞をＣＦＳＥ（５μＭ）で標識することにより、Ａｇ提示アッセイにおける増殖ＣＤ４^＋とＣＤ８^＋Ｔ細胞の割合を評価した。４日後、共培養細胞を洗浄し、抗マウスＣＤ４（クローンＬ３Ｔ４）−Ｃｙ−クロム（１０μｇ／ｍｌ）、および抗マウスＣＤ８（クローンＬｙ−２）−ＰＥ（１０μｇ／ｍｌ）で染色し、そしてフローサイトメトリーによってＣＦＳＥ−、Ｃｙ−クロム−、およびＰＥ−蛍光について分析した。

細胞傷害性アッセイ
記載^３４のアッセイと同様に、Ａｇに特異的なＣＴＬアッセイを実施した。同系Ｃ５７ＢＬ６マウスをＰＢＳ（対照）、またはＳｃＦｖを移植したＢ１６−ＯＶＡ細胞由来のＰＭＶもしくはＡｇを担持するＳＬ（上記）で静脈内（ｉ．ｖ．）に免疫した。免疫の１４日目に、脾臓を摘出し、Ｔリンパ球（エフェクターＴ細胞）を上記の如く単離した。次いで完全な成長培地でＴ細胞を懸濁し、１×１０^５細胞／ウェルの濃度で２４ウェル平板プレートに分注し（アイシーエヌ・バイオメディカルズ（ＩＣＮＢｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ））、１×１０^５のγ照射（５０００ｒａｄ）されたＢ１６−ＯＶＡ細胞と共培養した。記載^１６のように、共培養の５日後、標準^５１Ｃｒ−放出アッセイにおいてＴ細胞の細胞溶解活性を評価した。

動物の免疫およびｉｎｖｉｖｏにおける腫瘍負荷
週単位に行う３回のｉ．ｖ．尾静脈注射によってＰＢＳ（対照）、またはＳｃＦｖを移植したＢ１６−ＯＶＡ細胞由来のＰＭＶ（２×１０^５細胞当量）、もしくは関連Ａｇ（〜０．２μｇのＯＶＡもしくは〜０．８ｎｇのＳＩＩＮＦＥＫＬ−６Ｈ）を担持するＳＬ（〜０．１６μｇの総脂質）でマウスを免疫し、それぞれを容量２００μｌのＰＢＳで懸濁した。最終回の注射の２週間後、３×１０^５のＢ１６−ＯＶＡ細胞のｉ．ｖ．注射を介してマウスに負荷した。１６日目に両肺を摘出し、解剖顕微鏡下で腫瘍病巣数を視覚的に計数した。あるいは、１．５×１０^５のＢ１６−ＯＶＡ細胞をｉ．ｖ．注射した３、６および９日後に、マウスをＳｃＦｖを移植したＢ１６−ＯＶＡＰＭＶで免疫した。

実施例１
リポソームを用いることでｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏの両方においてＤＣに対して腫瘍抗原を標的化できる。
２種類のリポソーム調製物を用いることで腫瘍ＡｇをＤＣに対して標的化した（下記図１参照）。第１はＤＣを標的化するＳｃＦｖの移植によって修飾された腫瘍細胞由来ＰＭＶの粗調製物の使用を伴うものであり、第２はＡｇを含み、ＤＣを標的化するＳｃＦｖも移植したステルスリポソームの調製物であった。ステルスリポソーム（ＳＬ）は、ＰＥ−ＰＥＧ_２０００などの脂質を含むことによって立体的に安定化されている合成脂質構造であり、細網内皮系による非特異的除去を回避する能力によって、その静脈内投与後の数日間、血液循環内に残存できる^１４。Ｔ細胞共刺激分子の移植において腫瘍細胞および腫瘍細胞由来ＰＭＶを修飾するためのキレーター脂質であるＮＴＡ−ＤＴＤＡの使用について記載している^{１５，１６}。発明者らは最近、ＮＴＡ−ＤＴＤＡに関与する新規脂質の（ＮＴＡ）_３−ＤＴＤＡを得ているが（図１Ａ）、より高い局部密度のＮＴＡ頭部を得ることによって両ＰＭＶ上およびＳＬ上でのヒスチジンで標識したタンパク質のより安定した固着が可能になる（図示せず）。ゆえに、ＣＤ１１ｃおよびＤＥＣ−２０５などのＤＣマーカーに対する、ヒスチジンで標識したＳｃＦｖにおける（ＮＴＡ）_３−ＤＴＤＡを介したリポソームの付着は、リポソームのＤＣに対する有効な標的化を可能にする（図１Ｂ）。

この方法で調製したリポソームを用いることでＤＣに対して腫瘍抗原を標的化できるか否かを判定するために、発明者らは最初にｉｎｖｉｔｒｏにおけるこの系のＡｇをＤＣに対して標的化する能力について検討した。この試験で発明者らは、転移性の高いメラノーマ細胞系であるＢ１６−ＯＶＡを用いた。これはこの系が代わりに分泌される腫瘍特異的なＡｇとして利用できる低レベルのＯＶＡを分泌するためであり（参考文献１７）、ＯＶＡに特異的な免疫応答の評価が可能になる。Ｂ１６−ＯＶＡ腫瘍系は、結合活性が高いＣＴＬが用いられない場合、主にＯＶＡに特異的なＣＴＬに耐性を有する^１７。ＰＯＰＣ、（ＮＴＡ）_３−ＤＴＤＡ、およびＰＣ−ＢＯＤＩＰＹ（モル比９６：２：２）からなる合成リポソームとの融合によって取込まれる（ＮＴＡ）_３−ＤＴＤＡを含むようにＰＭＶ（Ｂ１６−ＯＶＡ由来）を修飾することができた。さらに、脂質：ＰＯＰＣ、ＰＥ−ＰＥＧ_２０００、（ＮＴＡ）_３−ＤＴＤＡ、およびＰＣ−ＢＯＤＩＰＹ（モル比９６：２：１：１）の適切な混合物から（ＮＴＡ）_３−ＤＴＤＡを含むＳＬを生成した。ＯＶＡ、またはＯＶＡＣＴＬエピトープであるＳＩＩＮＦＥＫＬを含むようにＳＬ調製物を作製することができた。（ＮＴＡ）_３−ＤＴＤＡを含むＰＭＶおよびＳＬに、ＣＤ１１ｃもしくはＤＥＣ−２０５に対する対照のヘキサヒスチジンを含む分子（Ｌ２ペプチド）もしくはヘキサヒスチジンで標識したＳｃＦｖを移植した。修飾膜は蛍光トレーサーとしてＰＣ−ＢＯＤＩＰＹも含むことから、同膜のＤＣに対する標的化がフローサイトメトリーによって評価できる。

対照で修飾したＰＭＶ（ＰＭＶ−Ｌ２）との長期培養ＤＣ（ＬＴＣ−ＤＣ）のインキュベーションによって細胞における蛍光強度がやや上昇したが（バックグラウンドを〜２倍上回る）、ＣＤ１１ｃ−ＳｃＦｖ（ＰＭＶ−ＣＤ１１ｃ）もしくはＤＥＣ−２０５−ＳｃＦｖ（ＰＭＶ−ＤＥＣ−２０５）を移植したＰＭＶとともにインキュベーションした後、それらの蛍光は対照細胞よりも４〜８倍亢進した（図２Ａ）。ＣＤ１１ｃ−ＳｃＦｖ（ＳＬ−ＣＤ１１ｃ）およびＤＥＣ−２０５−ＳｃＦｖ（ＳＬ−ＤＥＣ−２０５）を移植したＳＬとともにインキュベートされたＬＴＣ−ＤＣもまた、対照細胞（ＳＬ−Ｌ２）を上回る（３〜６倍）結合において顕著な亢進を示した（図２Ｂ）。同様に、ＣＤ１１ｃを発現する胎児皮膚ＤＣ（ＦＳＤＣ）のＣＤ１１ｃ−ＳｃＦｖを移植したＰＭＶまたはＳＬとのインキュベーションにより、対照細胞の場合を実質的に上回る蛍光の上昇がもたらされた（図示せず）。移植されたＰＭＶおよびＳＬのＤＣに対する結合特異性は、ブロッキング用ｍＡｂを用いて試験できた。したがって、アイソタイプを適合させた対照ｍＡｂとＤＣとの予備インキュベーションにより、ＣＤ１１ｃ−ＳｃＦｖもしくはＤＥＣ−２０５−ＳｃＦｖを移植したＰＭＶまたはＳＬのＤＣに対する結合が顕著には低下しなかったが、ＤＣの抗ＣＤ１１ｃｍＡｂＮ４１８もしくは抗ＤＥＣ−２０５ｍＡｂＮＬＤＣ１４５との予備インキュベーションにより、ＳｃＦｖを移植したＳＬもしくはＰＭＶの個々の結合が約９０％阻害された（図示せず）。これは同結合が移植したＳｃＦｖに特異的であることを実証する。

ｉｎｖｉｖｏにおいてＳｃＦｖを移植したＰＭＶがＤＣを標的化できたことを立証するために、発明者らはマウスの後足蹠内にＳｃＦｖを移植したフルオレセインで標識されたＰＭＶを皮下注射し、次いでフローサイトメトリーによってフルオレセイン蛍光について流出鼡径リンパ節（ｄｒａｉｎｉｎｇｐｏｐｌｉｔｅａｌｌｙｍｐｈｎｏｄｅ）から単離した細胞、または共焦点走査レーザー顕微鏡によって流出リンパ節切片について、それぞれＤＣマーカーとしてＣＤ１１ｃｍＡｂでＰＥ染色した後に試験した。これらの結果は、マウスへのＬ２、ＣＤ１１ｃ−ＳｃＦｖもしくはＤＥＣ−２０５−ＳｃＦｖを移植したＰＭＶの注射がリンパ節細胞の比較的小さい集団（２〜２．５％）において高レベルのＣＤ１１ｃに特異的な蛍光をもたらすことからＦＡＣＳ解析および蛍光顕微鏡の両方を介してＤＣとしてそれらが同定されることを示す（図３ＡおよびＢ、パネルｉ、ｉｉｉおよびｖ）。重要なことに、ＣＤ１１ｃ−陽性細胞に関し、ＳｃＦｖを移植したＰＭＶ（〜１．７％）を注射したマウスのリンパ節では（図３ＡおよびＢ、パネルｉｖおよびｖｉ）、Ｌ２を移植した（対照）ＰＭＶ（０．４％）を注射したマウスと比べると（図３ＡおよびＢ、対応するパネルｉおよびｉｉ）、より大きな割合でフルオレセインで標識した細胞を認めた。それらの知見は、ｉｎｖｉｖｏにおいてＳｃＦｖを移植したＰＭＶがＤＣを標的化できることを示す。

実施例２
腫瘍抗原の樹状細胞に対するリポソーム介在性標的化がｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏの両方において強力な腫瘍特異的免疫を誘発する
ＤＣに対して標的化されたＡｇを担持するＰＭＶおよびＳＬが機能的ＡｇのＴ細胞への提示を誘発できるか否かを判定するために、発明者らはまず、Ａｇ提示アッセイにおいてＳｃＦｖを移植したＰＭＶおよびＳＬのＴ細胞増殖に対する刺激能について試験した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスから単離した脾臓ＤＣに、いずれかの対照のヒスチジンで標識したペプチド（Ｌ２）もしくはＣＤ１１ｃおよびＤＥＣ−２０５に対してＳｃＦｖを移植した、Ｂ１６−ＯＶＡ−ＰＭＶ、ＳＩＩＮＦＥＫＬ−６Ｈを担持するＳＬ、またはＯＶＡを担持するＳＬで別々にパルスした。インキュベーション後、同細胞を精製した同系Ｔ細胞と共培養し、次いで［^３Ｈ］−チミジンでパルスすることでＴ細胞増殖の速度を評価した。対照培養物と比較し、ＣＤ１１ｃ−ＳｃＦｖを移植したＰＭＶまたはＳＬ（ＳＩＩＮＦＥＫＬ−６ＨもしくはＯＶＡを担持）に暴露したＤＣは、実質的により高レベルのＴ細胞増殖を誘発した。Ｔ細胞をＤＥＣ−２０５ＳｃＦｖを移植したＰＭＶまたはＳＬに暴露したＤＣと共培養すると、さらにより高い増殖速度を認めた（図４Ａ）。したがって、ＳｃＦｖを移植した、Ａｇを担持するＰＭＶおよびＳＬは、ＡｇをＤＣに有効に送達してＴ細胞増殖を刺激することができる。

興味深いことに、ＣＦＳＥで標識したＴ細胞を用いる試験は、増殖Ｔ細胞であるＣＤ４^＋のＣＤ８^＋に対する割合が用いられるＡｇに依存することを示した。ゆえに、Ｔ細胞とＤＥＣ−２０５に対して移植されたＰＭＶでパルスしたＤＣとの共培養物は、〜６０％のＣＤ８^＋Ｔ細胞および〜４０％のＣＤ４^＋Ｔ細胞からなった（図４Ｂ）。これに対し、Ｔ細胞とＯＶＡペプチドＳＩＩＮＦＥＫＬ−６Ｈを担持する、ＤＥＣ−２０５に対して移植されたＳＬでパルスしたＤＣとの共培養物は〜８０％のＣＤ８^＋Ｔ細胞および〜２０％のＣＤ４^＋Ｔ細胞を含んだが、これはＳＩＩＮＦＥＫＬがＣＤ８^＋Ｔ細胞エピトープであることと矛盾しない。注目すべきことに、無傷のＯＶＡをカプセル化するＤＥＣ−２０５に対して移植されたＳＬでパルスしたＤＣとともに培養したＴ細胞は、ＳＩＩＮＦＥＫＬ培養物と比べてより少ない増殖ＣＤ８^＋Ｔ細胞（〜７０％）および〜３０％の実質的により高い割合のＣＤ４^＋Ｔ細胞を含んだが、これはＯＶＡがＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋Ｔ細胞エピトープの両方を含んでいたことと矛盾しない（図４Ｂ）。ＣＤ１１ｃ−ＳｃＦｖによって標的化されたＡｇでパルスしたＤＣとの共培養における増殖ＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋Ｔ細胞の相対的割合は、ＤＥＣ−２０５−ＳｃＦｖによって標的化されたＡｇでパルスしたＤＣの場合に類似するパターンを示した（図示せず）。

最近の試験では、Ａｇの暴露およびＤＣの成熟の期間にＤＣによって引き起こされる免疫応答の種類を判定する際の危険シグナルの重要性が実証されている^９，１０。数々の試験がｉｎｖｉｔｒｏにおいてリポソームがＡｇをＤＣに対して標的化してＴ細胞応答を誘発できることを示したが、ｉｎｖｉｖｏにおける先行試験は、ｉｎｖｉｖｏにおける一連のこのアプローチにおいてＤＣへの危険シグナルの同時送達が必要であることを示唆する。ゆえに、Ａｇと炎症性刺激の両方をＤＣへ同時送達するために、発明者らは、Ａｇを担持する、取込んたＬＰＳ、ＩＦＮ−γまたはＧＭ−ＣＳＦを含む修飾したＰＭＶおよびＳＬを作製した。発明者らは、フローサイトメトリーを用いる結合試験による評価として、ｉｎｖｉｔｒｏにおけるＳｃＦｖを移植したＳＬのＤＣを標的化する能力に顕著に干渉することなく、脂質混合物中に最大１％のＬＰＳを含めることができ、かつＰＭＶおよびＳＬを作製することでサイトカインのＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮ−γを高い効率で取込めることを見出した。さらに、ＧＭ−ＣＳＦが無血清培地内でＦＳＤＣの増殖を誘発し、ＩＦＮ−γが完全培地内で同増殖を阻害することから^１７、ＦＳＤＣの増殖アッセイを用いることで、取込みとして見出される＞８５％のＧＭ−ＣＳＦおよび＞７５％のＩＦＮ−γを含むＳＬにおいてサイトカイン捕捉を監視した（図示せず）。

ＤＣを標的化するＰＭＶまたはＡｇを含むＳＬがｉｎｖｉｖｏにおいてＣＴＬ応答をもたらすことができたか否かを判定するために、発明者らはＬＰＳ、ＩＦＮ−γもしくはＧＭ−ＣＳＦなどの危険シグナルを含まないかまたは含む調製物でＣ５７ＢＬ６マウスを免疫した。次いで発明者らは脾臓Ｔ細胞を単離し、ｉｎｖｉｔｒｏにおいて同細胞をγ照射したＢ１６−ＯＶＡ腫瘍細胞で再刺激し、そして標準^５１Ｃｒ−放出アッセイにおいてそれらのＢ１６−ＯＶＡ細胞に関する細胞溶解活性を評価した。ＤＥＣ−２０５−ＳｃＦｖを移植した様々なＰＭＶ調製物で免疫した動物における代表的な溶解曲線を図５Ａに示す。危険シグナルの非存在下でマウスをＬ２ペプチドまたはＤＥＣ−２０５−ＳｃＦｖを移植したＰＭＶで予備免疫した際、わずかなＣＴＬ活性を検出した（図５Ａ）。しかしながら、ＤＥＣ−２０５−ＳｃＦｖを移植したＰＭＶにおけるＬＰＳもしくはＩＦＮ−γの取込みは、標的細胞において１：１のエフェクター対標的比で発生し続ける５０％の特異的溶解を伴う高レベルの細胞溶解活性の誘発をもたらした（図５Ａ）。それに対し、ＧＭ−ＣＳＦはＣＴＬ活性において極めて有効性が低下した誘発物質であった。

比較しやすくするために、図５Ｂでは様々なＰＭＶおよびＳＬの免疫条件における細胞溶解活性を２５：１のエフェクター対標的比で示す。危険分子としてＩＦＮ−γもしくはＬＰＳを含むＰＭＶまたはＳＬ（ＳＩＩＮＦＥＫＬまたはＯＶＡを担持）で免疫したマウス由来の脾細胞で最大のＣＴＬ活性を観察した。ＣＤ１１ｃ−ＳｃＦｖを移植したＰＭＶおよびＳＬは、概してＩＦＮ−γもしくはＬＰＳよりも有効性が低下した危険シグナルのＧＭ−ＣＳＦによってやや低下した免疫原性を示したが、ＰＭＶ、およびＯＶＡを含むＳＬと関連する場合に顕著なＣＴＬ活性を誘発した。興味深いことに、関連の「危険」シグナルを含まないＳｃＦｖを移植したＰＭＶまたはＳＬで注射した動物由来のＴ細胞を含む培養物は、バックグラウンドレベルに近い溶解を生じた（図５ＡおよびＢ）。

実施例３
ＤＣを標的化するリポソームに基づくワクチンは腫瘍に対する防御免疫を誘発する
様々なＢ１６−ＯＶＡ調製物で免疫したマウスのＢ１６−ＯＶＡ腫瘍細胞のｉ．ｖ．負荷に対する耐性能について試験し、それに伴い腫瘍細胞への注射の１６日後に肺転移を定量した。ＳｃＦｖを移植し、ＬＰＳもしくはＩＦＮ−γを含むＰＭＶまたはＯＶＡを担持するＳＬで免疫したマウスでは、対照マウスと比較して転移数の著しい低下を観察した（図６）。ＰＭＶまたはＯＶＡを担持するＳＬにＳｃＦｖを移植ぜずにＬＰＳもしくはＩＦＮ−γを含まなかった場合、腫瘍細胞への負荷に対する防御はほとんど検出されなかった。それとは全く対照的に、一部のワクチンが強力なＣＴＬ活性の誘発を構築するにもかかわらず（図５）、ＳＬを含むＳＩＩＮＦＥＫＬは腫瘍負荷に対してマウスを防御できなかった（図６Ｂ）。これらのデータは、ＣＤ８^＋ＣＴＬによるクリアランスに耐性を示すＢ１６−ＯＶＡメラノーマに一致する（参考文献１４）。

ワクチン注射の既存の腫瘍に対する効果について探索するために、発明者らは、１群のマウス６匹に１．５×１０^５のＢ１６−ＯＶＡ腫瘍細胞による負荷の３日後にＩＦＮ−γを含む、ＤＥＣ−２０５−ＳｃＦｖを移植したＰＭＶを注射した。興味深いことに、引き続きワクチン接種したマウスは腫瘍発現のいかなる兆候も示さなかった一方、２２日目には平均２５０±３７ずつの腫瘍病巣を含む両肺における腫瘍負荷の上昇に起因して１群の対照動物６匹が安楽死しなければならなかった。

Ａｇ提示アッセイで認められる高割合の増殖ＣＤ４^＋Ｔ細胞は（図４Ｂ）、ＣＤ８^＋Ｔ細胞ではないこれらの細胞が、観察される抗腫瘍応答における役割を果たすか否かに関する問題を提起した。ＣＤ４^＋Ｔ細胞は、最近、好酸球ケモカインエオタキシンに関与する機構を介してＢ１６−ＯＶＡメラノーマの肺転移におけるクリアランスに関与している^１４。発明者らがエオタキシンノックアウトマウスをＰＭＶ−ＤＥＣ−２０５−ＳｃＦｖで免疫した試験において、好酸球がＡｇのＤＣに対する標的化によって誘発される抗腫瘍応答に関与する可能性を探索した。それらの結果は、正常マウスおよびエオタキシンノックアウトマウス由来Ｔ細胞の細胞溶解活性が本質的に同一であるのに対し（図７Ａ）、ＰＭＶ−ＤＥＣ−２０５で免疫したエオタキシンノックアウトマウスは、それらの腫瘍の成長および転移に対する阻害能が顕著に不足することを示す（図７Ｂ）。

実施例４
病原菌に関連する抗原の樹状細胞に対する標的化による病原菌に対する免疫の増強
本実施例では、発明者らは本発明を用いることでＤＣに対して病原菌の抗原を標的化できることを実証する。ＢＣＧは、ヒトにおける結核の原因である病原体Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｉにも存在する多数の抗原を含むマイコバクテリウムである。本明細書において記載される実施例では、ＢＣＧマイコバクテリアをＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｉの代わりに用いた。修飾を行ってＤＣに対する標的化を可能にする前に、ＢＣＧマイコバクテリアを培養物中で成長させ、熱殺菌し、そして［トレーサー６（フルオレセイン−５（および−６）−カルボキシアミド）ヘキサン酸サクシニミジルエステルとの反応を介して］標識することで、追跡できるようにした。したがって、熱殺菌したＢＣＧを適切な量のＮｉ−（ＮＴＡ）_３−ＤＴＤＡと混合し、そして短時間、超音波破砕することでＢＣＧ抗原を含むＢＣＧ膜小胞内へのキレーター脂質の取込みが可能になった。次いで、ＢＣＧ膜内へのＮｉ−（ＮＴＡ）_３−ＤＴＤＡの取込みにより、ＣＤ１１ｃもしくはＤＥＣ−２０５に対するＳｃＦｖの移植によってそれぞれのＤＣ上のＣＤ１１ｃおよびＤＥＣ−２０５マーカーに対する特異的標的化が可能になった。

特異的標的化は、図８を含むグラフから明らかである。マウスのＤＣを標的化するＳｃＦｖを移植したＢＣＧ調製物だけがマウスのＤＣ細胞系であるＪＡＷＳ−ＩＩに対して結合性を示すことを蛍光特性は示す。非標的化対照タンパク質Ｌ２を移植した対照ＢＣＧ調製物は全く結合性を示さない。これは、本発明における修飾されたＰＭＶおよびリポソームを用いることで、ｉｎｖｉｔｒｏにおいてＢＣＧに関連する抗原をＤＣに対して標的化できることを示唆する。

移植したＤＣを標的化するＳｃＦｖを含むＢＣＧ調製物が動物におけるワクチンとして用いられる場合にＢＣＧ抗原に対する免疫応答も増強することを検証するため、更なる実験を行った。上記実施例１のように本質的に同一のワクチン接種法を用い、Ｃ５７／ＢＬ６マウスに移植されたＢＣＧ調製物を用いて静脈内にワクチン接種した。２〜４週間後、マウスを犠牲にし、Ｔ細胞の単離およびＢＣＧに特異的なインターフェロン−γ−産生に対するアッセイのためにそれらの脾臓を摘出した。インターフェロン−γ−産生細胞における培養物をアッセイする前に３日間にわたって熱殺菌したＢＣＧの存在下で、マウス脾臓から単離したＴ細胞を培養することによってインターフェロン−γ−産生に関するエリスポットアッセイ（Ｅｌｉｓｐｏｔａｓｓａｙ）の結果を得た。これらの実験結果を図９に示す。

（図示の如く）ＤＣを標的化する２つのＳｃＦｖのいずれかを移植したＢＣＧ調製物でワクチン接種したマウス由来の脾臓では、対照タンパク質Ｌ２を移植したＢＣＧ調製物でワクチン接種した同脾臓と比較し、より多数のインターフェロン−γ産生Ｔ細胞（すなわちエリスポット）が認められることが図９から理解できる。最も適切な種類の免疫応答を誘発するために、標的化されたＢＣＧ膜調製物とともに免疫調節因子（例えば、インターフェロン−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−１０）も含めることができる。したがって、それらの結果は、（先の例示の如く）腫瘍免疫を増強するのに抗原のＤＣに対する標的化と同様に、本発明における修飾されたＰＭＶおよびリポソームを用いることで、さらにｉｎｖｉｖｏにおいて病原菌由来の抗原をＤＣに対して標的化し病原菌に対する免疫を誘発または増強できることを示す。

本発明の幅広い範囲から逸脱することなく先に例示された方法および組成物に対して多くの変更を施すことができることが当業者によって認識されることになる。

文脈または使用法において用語の限定的解釈が必要でない場合には、記載された１または複数の整数分の包含を意味しても任意の他の１または複数の整数を除外しないように、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの用語の変形が本明細書において用いられる。

本明細書において言及される発行物に対するいかなる参照も様々な開示がオーストラリアにおいて共通の一般知識を構成するということを認めるものではない。

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新規キレーター脂質（ＮＴＡ）_３−ＤＴＤＡの構造を示す。図１Ｂは、パルミトイル−オレオイル−ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）およびホスファチジル−エタノールアミン−（ポリエチレン）グリコール_２０００（ＰＥ−ＰＥＧ_２０００）からなる、抗原（Ａｇ）を含むステルスリポソーム（ＳＬ）内に取込まれる（ＮＴＡ）_３−ＤＴＤＡ脂質の略図である。同様に図１Ｃは、図１Ｂの同リポソームに類似する組成物であるがＰＥ−ＰＥＧ_２０００を含まないリポソームの略図であり、抗原を担持する腫瘍細胞由来の細胞膜小胞（ＰＭＶ）と融合できる。ＳＬ（Ｂ）および修飾したＰＭＶ（Ｃ）といった両方の例において、リポソームまたは修飾したＰＭＶのいずれかの追跡を促進するために、脂質トレーサーＰＣ−ＢＯＤＩＰＹ（図示せず）を含めることもできる。（ＮＴＡ）_３−ＤＴＤＡは、ＤＥＣ−２０５およびＣＤ１１ｃに対する、ヒスチジンで標識したＳｃＦｖＡｂｓのリポソームまたは修飾したＰＭＶの表面上への移植や、その結果としてそれらのＤＣ上のＤＥＣ−２０５およびＣＤ１１ｃなどの表面マーカーに対する標的化を可能にする。ＣＤ１１ｃ−ＳｃＦｖおよびＤＥＣ−２０５−ＳｃＦｖを移植したＰＭＶおよびＳＬがＤＣに結合することを示す。図２Ａに関しては、Ｂ１６−ＯＶＡ細胞由来のＰＭＶをＰＯＰＣ、（ＮＴＡ）_３−ＤＴＤＡ、およびＰＣ−ＢＯＤＩＰＹからなるリポソームと融合させた。次いで、フローサイトメトリーを介して定量したＬＴＣ−ＤＣおよび細胞結合性ＢＯＤＩＰＹ−蛍光とともにインキュベートする前に、ＰＭＶに対照ペプチド（ＰＭＶ−Ｌ２）、ＣＤ１１ｃ−ＳｃＦｖ（ＰＭＶ−ＣＤ１１ｃ）、もしくはＤＥＣ−２０５−ＳｃＦｖ（ＰＭＶ−ＤＥＣ−２０５）を移植した。図２Ｂは、ＰＯＰＣ、（ＮＴＡ）_３−ＤＴＤＡ、ＰＥ−ＰＥＧ２０００およびＰＣ−ＢＯＤＩＰＹからなる、同様に移植したＳＬのＬＴＣ−ＤＣに対する結合を示す。各特性は、３つの別々の実験から得られる特性を代表する。ＳｃＦｖを移植したＰＭＶが流出リンパ節においてＤＣを標的化することを示す。マウスの後足蹠に、ＣＤ１１ｃ（ＰＭＶ−ＣＤ１１ｃ）およびＤＥＣ−２０５（ＰＭＶ−ＤＥＣ−２０５）に対して対照タンパク質（ＰＭＶ−Ｌ２）、もしくはＳｃＦｖを移植した、フルオレセインで標識したＰＭＶを注射した。Ａ．注射後、ビオチン化抗ＣＤ１１ｃｍＡｂおよびＰＥ−ストレプトアビジンを含む単離したリンパ節細胞の染色のために流出鼡径リンパ節を摘出した。フローサイトメトリーのドットプロットは、図のようにＰＥ−蛍光（パネルｉ、ｉｉｉおよびｖ）、およびリンパ節細胞の対応するＦＩＴＣ−蛍光（パネルｉｉ、ｉｖおよびｖｉ）を呈する二重染色を示す。Ｂ．リンパ節切片をビオチン化抗ＣＤ１１ｃｍＡｂおよびストレプトアビジン−ローダミンで染色し、ローダミン−蛍光（画像ｉ、ｉｉｉおよびｖ）、およびＰＭＶフルオレセイン蛍光（画像ｉｉ、ｉｖおよびｖｉ）を示す対応する領域の蛍光画像によってＤＣを同定した同様の実験の結果。移植したＰＭＶおよびＳＬのＤＣに対する標的化がＴ細胞増殖を刺激することを示す。Ａ．パルスしていないＤＣ、またはＬ２、ＣＤ１１ｃ−ＳｃＦｖ、またはＤＥＣ−２０５−ＳｃＦｖを移植したＢ１６−ＯＶＡＰＭＶでパルスしたＤＣ（左パネル）；またはＬ２、ＣＤ１１ｃ−ＳｃＦｖまたはＤＥＣ−２０５−ＳｃＦｖを移植したＳＩＩＮＦＥＫＬ−６Ｈを担持するＳＬ（中間パネル）；およびＬ２、ＣＤ１１ｃ−ＳｃＦｖまたはＤＥＣ−２０５−ＳｃＦｖを有するＯＶＡを含むＳＬ（右パネル）で同系Ｃ５７ＢＬ６脾臓Ｔ細胞をインキュベートした。［^３Ｈ］−チミジン取込みを評価する前に同細胞を４日間培養した。その結果はｃｐｍ±ＳＥＭである。Ｂ．ＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋Ｔ細胞増殖の刺激。ＤＥＣ−２０５−ＳｃＦｖ（ＰＭＶ）を移植したＰＭＶでパルスしたＤＣ、ＤＥＣ−２０５−ＳｃＦｖおよびＳＩＩＮＦＥＫＬ−６Ｈ（ＳＩＩＮＦＥＫＬ−ＳＬ）を移植したＳＬ、およびＤＥＣ−２０５−ＳｃＦｖ（ＯＶＡ−ＳＬ）を移植したＯＶＡを含むＳＬでＣＦＳＥで染色した同系Ｃ５７ＢＬ６脾臓Ｔ細胞をインキュベートした。４日間細胞を培養し、そしてＣＦＳＥ希釈に基づいた増殖ＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋Ｔ細胞の相対割合をフローサイトメトリーを介して評価した。マウスにＰＭＶおよびＳＬをワクチン接種した結果を含み、腫瘍細胞にＣＴＬ活性の刺激を示す。Ａ．γ照射されたＢ１６−ＯＶＡ細胞で４日間にわたって刺激し、ＰＢＳ単独（ＰＢＳ）、Ｌ２ペプチドを移植したＢ１６−ＯＶＡＰＭＶ（ＰＭＶ−Ｌ２）、ＤＥＣ−２０５−ＳｃＦｖ単独を移植したＰＭＶ（ＰＭＶ−ＤＥＣ−２０５）を、またはＬＰＳ（ＰＭＶ−ＬＰＳ−ＤＥＣ−２０５）、ＩＦＮ−γ（ＰＭＶ−ＩＦＮ−γ−ＤＥＣ−２０５）、もしくはＧＭ−ＣＳＦ（ＰＭＶ−ＧＭ−ＣＳＦ−ＤＥＣ−２０５）と組み合わせてｉ．ｖ．で注射したマウスを由来とする、脾細胞のＣＴＬ活性。Ｂ．ＰＭＶ、ＳＩＩＮＦＥＫＬを含むＳＬ、およびＯＶＡを含むＳＬ（図示の如くそれぞれにＬ２、ＣＤ１１ｃＳｃＦｖまたはＤＥＣ−２０５−ＳｃＦｖを移植）で免疫後のマウスを由来とする脾細胞のＣＴＬ活性（２５：１Ｅ：Ｔ比）。図示の如く、移植したＰＭＶおよびＳＬにＬＰＳ、ＩＦＮ−γおよびＧＭ−ＣＳＦを取込ませた条件に対する結果も示す。星印はＬ２ペプチドを移植した対応するＡｇ調製で免疫したマウスに比べてＣＴＬ活性が顕著に高いことを示す（ｎ=６．＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．０１および＊＊、Ｐ＜０．００１）。パネルのＡとＢでは、示されるＥ：Ｔ比での特異的溶解を標準^５１Ｃｒ放出アッセイにおいて評価した。特異的溶解±ＳＥＭのパーセンテージとして結果を示す。修飾したＰＭＶおよびＳＬのワクチン注射が腫瘍免疫を誘発することを示す。図示の如く、同系Ｃ５７ＢＬ６マウスの別々の群に、Ｌ２、ＣＤ１１ｃ−ＳｃＦｖ、またはＤＥＣ−２０５−ＳｃＦｖを移植したＰＭＶ；ＳＩＩＮＦＥＫＬ−６ＨおよびＬ２、ＣＤ１１ｃ−ＳｃＦｖまたはＤＥＣ−２０５−ＳｃＦｖを移植したＳＬ；およびＬ２、ＣＤ１１ｃ−ＳｃＦｖ、またはＤＥＣ−２０５−ＳｃＦｖを移植したＯＶＡを含むＳＬで（１週間隔で３回）免疫した。ここで各ワクチン調製を単独またはＬＰＳもしくはＩＦＮ−γと組み合わせて注射した。マウスにＢ１６−ＯＶＡ細胞でｉ．ｖ．に負荷し、１６日後両肺を摘出し、肺への転移について試験した。結果はマウスの各群における腫瘍病変の平均数±ＳＥＭを示す。点線はＰＢＳを注射した対照マウスにおける腫瘍転移数を参照する。エオタキシンノックアウトマウスにおける抗腫瘍応答を示す。Ａ．図示の如く、Ｃ５７ＢＬ６バックグラウンドに関しては、ＰＢＳ、またはＩＦＮ−γを含む、Ｌ２（ＰＭＶ−Ｌ２）もしくはＤＥＣ−２０５−ＳｃＦＶ（ＰＭＶ−ＤＥＣ−２０５）を移植したＰＭＶで、同系Ｃ５７ＢＬ６マウス（エオタキシン^＋／＋）またはエオタキシンノックアウトマウス（エオタキシン^−／−）を免疫した。脾細胞をマウスから単離し、γ照射した天然Ｂ１６−ＯＶＡ細胞と共培養した。標準^５１Ｃｒ放出アッセイにおいて図示されたＥ：Ｔ比での特異的溶解を評価した。特異的溶解±ＳＥＭのパーセンテージとして結果を示す。Ｂ．上記のようにマウスを免疫し、次いでＢ１６−ＯＶＡ細胞でｉ．ｖ．に負荷し、それに伴って両肺を摘出し、１６日後に腫瘍転移について試験した。結果はマウスの各群における腫瘍病変の平均数±ＳＥＭを示す。ＣＤ１１ｃ−ＳｃＦｖおよびＤＥＣ−２０５−ＳｃＦｖを移植したＢＣＧマイコバクテリアの膜小胞がＤＣに結合することを示す。Ｎｉ−（ＮＴＡ）３−ＤＴＤＡをＢＣＧマイコバクテリア由来のＰＭＶと結合させ、６−（フルオレセイン−５（および−６）−カルボキシアミド）ヘキサン酸サクシニミジルエステルで標識した。次いで、ＪＡＷＳ−ＩＩＤＣとともにインキュベートする前に対照ペプチド（ＢＣＧ−Ｌｉｐｏ＋Ｌ２）、ＣＤ１１ｃ−ＳｃＦｖ（ＢＣＧ−Ｌｉｐｏ＋ＣＤ１１ｃ）、またはＤＥＣ−２０５−ＳｃＦｖ（ＢＣＧ−Ｌｉｐｏ＋ＤＥＣ２０５）をＰＭＶに移植し、その後で細胞に結合した蛍光をフローサイトメトリーによって定量した。上部パネルがＢＣＧ−Ｌｉｐｏ＋ＣＤ１１ｃにおける結果を示す一方で、下部パネルはＢＣＧ−Ｌｉｐｏ＋ＤＥＣ２０５における結果を含む。各パネルでは、左のトレースが上記ＪＡＷＳ−ＩＩ細胞に、中間のトレースがＢＣＧ−Ｌｉｐｏ＋Ｌ２対照に対応する一方で、右のトレースはＢＣＧ−Ｌｉｐｏ＋ＣＤ１１ｃまたはＢＣＧ−Ｌｉｐｏ＋ＤＥＣ２０５に対応する。静脈内にＢＣＧ調製物を移植したＣ５７／ＢＬ６マウス由来の脾臓Ｔ細胞におけるエリスポット（Ｅｌｉｓｐｏｔ）解析の結果を示す。移植物は、対照（ＢＣＧ超音波破砕＋Ｌ２）；ＣＤ１１ｃ−ＳｃＦｖ（ＢＣＧ超音波破砕＋ＣＤ１１ｃ）；またはＤＥＣ−２０５−ＳｃＦｖ（ＢＣＧ超音波破砕＋ＤＥＣ２０５）としてのＬ２ペプチドであった。対照マウスに調製物用担体として用いられるＰＢＳを接種した。

Claims

ｉｎｖｉｖｏにおいて抗原を樹状細胞に対して標的化することによって免疫を調節するための組成物であって、
複数の金属キレート基を表面上に有する、抗原を含む膜小胞または抗原を含むリポソームの調製物であって、金属キレート基は、小胞またはリポソームを形成するリン脂質および／または脂質の内部に存在する両親媒性分子の頭部である調製物；および
前記樹状細胞上の受容体に特異的に結合することができる、抗体、抗体断片およびドメイン抗体からなる群から選択されるリガンドであって、前記受容体が、ＣＤ１１ｃ、ＤＥＣ−２０５（ＣＤ２０５）、ＤＣ−ＳＩＧＮ（ＣＤ２０９）、ＣＤ２０６およびＣＤ２０７からなる群から選択され、前記リガンド上の金属親和性標識を介して前記金属キレート基に連結されるリガンド
を含み、前記抗原を含む小胞またはリポソームが細菌性リポ多糖およびインターフェロン−γから選択される免疫調節因子を含む、組成物。
前記抗原を含む膜小胞が、腫瘍由来の細胞膜小胞、リンパ球由来の細胞膜小胞、白血球由来の細胞膜小胞、および細菌、原虫、ウイルスまたは真菌の膜調製物からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
前記抗原を含むリポソームがステルスリポソームである、請求項１に記載の組成物。
前記抗原を含む膜小胞または抗原を含むリポソームの前記抗原が、タンパク質、糖タンパク質、ペプチド、多糖、および前記のいずれかをコードするＤＮＡからなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
前記抗原を含む膜小胞またはリポソームの抗原が複数の異なる抗原を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
前記抗体断片が一本鎖抗体断片である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
前記リガンドが、ＣＤ１１−ＳｃＦｖまたはＤＥＣ−２０５−ＳｃＦｖである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
前記リガンド上の前記金属親和性標識がヘキサヒスチジンである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
前記両親媒性分子が、ニトリロ三酢酸ジテトラデシルアミン、トリ（ニトリロ三酢酸）ジテトラデシルアミン、またはニトリロ三酢酸ホスファチジルエタノールアミンからなる群から選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
ｉｎｖｉｖｏにおいて抗原を樹状細胞に対して標的化することによって免疫応答を調節するための組成物を調製するための方法であって、
ｉ）抗原を含む膜小胞または抗原を含むリポソームを調製する工程；
ｉｉ）細菌性リポ多糖およびインターフェロン−γから選択される少なくとも１つの免疫調節因子の取込みによって前記抗原を含む膜小胞または抗原を含むリポソームを修飾する工程；
ｉｉｉ）両親媒性分子の取り込みによって前記抗原を含む膜小胞または抗原を含むリポソームをさらに修飾する工程、ここに前記両親媒性分子は、前記抗原を含む膜小胞または抗原を含むリポソームに取り込まれた場合にそれらの表面上に位置する金属キレート基を頭部として含むものであり；次いで
ｉｖ）前記樹状細胞上の受容体に特異的に結合することができる、抗体、抗体断片およびドメイン抗体からなる群から選択され、前記受容体が、ＣＤ１１ｃ、ＤＥＣ−２０５（ＣＤ２０５）、ＤＣ−ＳＩＧＮ（ＣＤ２０９）、ＣＤ２０６およびＣＤ２０７からなる群から選択される、前記キレート基に結合するための金属親和性標識を含むリガンドに工程（ｉｉｉ）の産物を接触させる工程
を含む、方法。
工程（ｉ）において調製される前記抗原を含む膜小胞、工程（ｉ）において調製される前記抗原を含むリポソーム、前記抗原を含む膜小胞および抗原を含むリポソームの前記抗原、工程（ｉｉｉ）において取込まれる前記両親媒性分子、工程（ｉｉｉ）の産物と接触する前記リガンド、または前記リガンド上の前記金属親和性標識が、請求項２〜９のいずれか一項の記載によって定義される、請求項１０に記載の方法。
対象における免疫応答を調節するための、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物。
前記免疫応答の調節が移植拒絶もしくは自己免疫疾患の予防または処置を目的とする、請求項１２に記載の組成物。
前記自己免疫疾患が、Ｉ型糖尿病、関節リウマチ、全身性エリテマトーデスまたは多発性硬化症である、請求項１３に記載の組成物。
対象における腫瘍を予防または処置するための請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物であって、前記抗原を含む膜小胞または抗原を含むリポソームに含まれる前記抗原が腫瘍抗原である、組成物。
前記腫瘍が、メラノーマ、または前立腺、腸、乳房または肺における癌である、請求項１５に記載の組成物。
対象における感染症を予防または処置するための請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物であって、前記抗原を含む膜小胞または抗原を含むリポソームに含まれる前記抗原が感染症を引き起こす作用物質由来の抗原である、組成物。
前記感染症の原因物質が細菌、マイコバクテリウム、ウイルス、または菌類である、請求項１７に記載の組成物。
前記対象がヒト対象である、請求項１２〜１８のいずれか一項に記載の組成物。