MX2011012147A

MX2011012147A - Inmunoterapia de vacuna.

Info

Publication number: MX2011012147A
Application number: MX2011012147A
Authority: MX
Inventors: John W Hadden; Paul Naylor; Kathy Signorelli; James Egan
Original assignee: Irx Therapeutics Inc
Priority date: 2009-05-15
Filing date: 2010-05-17
Publication date: 2012-06-19
Also published as: EP2429585A1; CA3017298A1; CA3017298C; US9539320B2; US9566331B2; CA2799081A1; US20130243723A1; EP2429585B1; CA2799081C; EP2429585A4; JP2012526853A; JP5797190B2; WO2010132867A1; JP2015155432A; AU2010248761A1; ES2679043T3; AU2010248761B2; DK2429585T3; US20120064035A1

Abstract

Una composición para tratar cáncer, que incluye cantidades sinergísticas de una sustancia biológica derivada de célula primaria que tiene las citoquinas IL-1, IL-2, IL-6, IL-8, TNF-a, e IFN-y y una vacuna de cáncer que tiene por lo menos un antígeno. Una composición que comprende cantidades sinergísticas de la sustancia biológica derivada de célula primaria en combinación con por lo menos un adyuvante. Un método para tratar cáncer al administrar la composición. Un método para revertir la supresión inmune y ganar inmunidad al cáncer. Un método para producir una respuesta inmune a un antígeno exógeno. Un método para aumentar una respuesta inmune en un paciente al administrar la sustancia biológica derivada de célula primaria en combinación con por lo menos un adyuvante, y aumentar la respuesta inmune en el paciente mediante una interacción sinergística de la sustancia biológica derivada de célula primaria y el adyuvante. Un método para incrementar la función de un sistema inmune.

Description

INMUNOTERAPIA DE VACUNA ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN 1. CAMPO TÉCNICO La presente invención se relaciona a la inraunoterapia de vacuna. Más específicamente, la presente invención se relaciona a composiciones y métodos para inducir y aumentar en potencia una respuesta inmune a antígenos endógenos o exógenos en pacientes que tienen cáncer u otros estados de enfermedad o lesiones que producen antígeno y para inducir y aumentar en potencia una respuesta inmune a los adyuvantes . 2. TÉCNICA ANTECEDENTE Ha llegado a ser cada vez más evidente que los cánceres humanos poseen antígenos, que, si actúan en el sistema inmune del hospedero, pueden dar por resultado la regresión del tumor. Estos antígenos se han definido por procedimientos tanto serológicos como inmunes celulares, que han conducido a la definición de epítopes de 'célula tanto B como T (Sahin, 1997; Van der Eynde, 1997; ang, 1999). Basado en estos resultados, ha llegado a ser un objetivo de los inmunoterapistas de cáncer inducir la regresión de tumores. Sin embargo, históricamente, los esfuerzos exitosos han sido esporádicos y generalmente menores en frecuencia y magnitud.

Un problema fundamental en el esfuerzo para inmunizar pacientes con cáncer, es decir, contra antígenos de tumor, es que el estado que lleva tumor está asociado con mecanismos inmunosupresors derivados de tanto el tumor como el sistema inmune alterado del hospedero (Kavanaugh, 1996) , haciendo de esta manera la inmunización difícil y hasta ahora imposible en una base consistente. La supresión o agotamiento inmune involucra una capacidad reducida del sistema inmune a responder. Tal supresión puede ser inducida por fármaco, es decir, mediante tratamiento con fármaco, inducida por virus, por ejemplo, como en SIDA, o inducida por un estado de enfermedad tal como cáncer. El sistema inmune en esta condición es efectivamente desactivado. En el caso de un estado de enfermedad tal como cáncer, el cuerpo no es capaz de protegerse por sí mismo contra los antígenos de tumor, permitiendo de esta manera que un tumor crezca y posiblemente se metastasise.

Se ha desarrollado una variedad de estrategias de inmunización de tumor. Todas estas estrategias son complejas y se desvían significantemente de las estrategias de inmunización convencionales utilizadas para enfermedades infecciosas (ver, por ejemplo, Weber, 2000). Una estrategia de inmunización de tumor de tal clase involucra THERATOPE® (Biomira) , un antígeno de mucina de polisacárido Tn de sialilo conjugado con hemocianina de lapa de punta (KLH) y administrado con el adyuvante de micobacteria DETOX® y baja dosis de ciclofosfamida (Maclean, 1996) . El uso de esta vacuna en pacientes con cáncer de seno y ovárico metastático ha producido respuestas clínicas mayores (es decir, mayor que 50% de reducción de tumor) en solamente un bajo porcentaje de pacientes .

La terapia génica también se ha intentado utilizando constructos virales como vectores de expresión para genes que expresan antígenos de tumor. Por ejemplo, un constructo de virus de vacinia recombinante que codifica formas modificadas de virus de papiloma humano (HPV) de las secuencias de proteína E6 y E7 se ha utilizado para la inmunización de pacientes con cáncer cervical. La vacunación con este constructo produjo respuestas clínicas cuestionables (Borysiewickz, 1996) . Ver también, Sanda, 1999 en donde un constructo de vacinia recombinante-PSA (antígeno específico de próstata) se utilizó como una vacuna en pacientes con cáncer de próstata.

Otro procedimiento ha sido la terapia mediada por célula dendrítica, por ejemplo, en donde las células dendríticas se pulsaron con fragmentos de oligopéptido de antígenos de membrana específicos de próstata (PSMA) . Las células dendríticas (con o sin el cebado de antígenos PSMA) luego se administraron a pacientes con cáncer de próstata metastático. Respuestas clínicas mayores se obtuvieron en solamente un bajo porcentaje de pacientes (Murphy, 1999; ver también, Tjoa, 2000) .

Adicionalmente , los tumores autólogos se han utilizado con baja dosis de ciclofosfamida y BCG (Bacillus Calmette-Guerin) para inmunizar pacientes con cáncer con melanoma maligno. Sin embargo, pocas respuestas clínicas se reportaron (Mastrangelo, 1996) . Otra estrategia incluyó la utilización de antígenos MAGE con una variedad de adyuvantes de vacuna. Nuevamente, esto ha producido pocas, si las hay, respuestas en pacientes con melanoma maligno (personal communication, Thierry Boon) .

Varias patentes de Doyle y colaboradores, (patentes norteamericanas Nos. 5,503,841; 5,800,810; 6,060,068; 5,643,565; y 5,100,664) divulgan métodos para aumentar la respuesta inmune en pacientes usando interleucina 2 (IL-2). Este método se divulga para el uso en respuesta a enfermedades infecciosas y principalmente funciona utilizando antígenos conocidos que son inmunogénicos . Se demostró aplicabilidad limitada. Como es divulgado en lo anterior, el tratamiento de cáncer se sabe que requiere procedimientos diferentes, hasta la fecha, el tratamiento con IL-2 ha mostrado efectos menores en dos cánceres, melanoma de célula renal y maligno (velocidades de respuesta menor que 20%). Generalmente se considera ineficaz en el cáncer cervical y de cabeza y cuello de célula escamosa y en el cáncer de próstata. Por consiguiente, no se aprueba para estos usos.

Es importante contrastar las vacunas profilácticas usando antigenos "clásicos"- conocidos de estructura compleja y altos pesos moleculares en pacientes sanos contra vacunas terapéuticas (generalmente sin éxito) con antigenos de tumor o péptidos (generalmente sin éxito) en pacientes inmunosuprimidos (generalmente sin éxito) . El primero es fácil y las vacunas virales actuales de los inventores atestiguan su eficacia. Esto último es casi imposible en una base de rutina a pesar de treinta años de esfuerzo intenso.

Las vacunas de cáncer efectivas requieren estimulación de la inmunidad mediada por célula, quizás aun en preferencia a la producción de anticuerpo. Como es observado, a pesar de numerosos estudios con varios antigenos, adyuvantes y constructos de vacuna, los datos de experimentos clínicos hasta la fecha han estado en desacuerdo. Los eventos críticos para una respuesta inmune anti-cáncer mediada por célula T son la presentación de antígeno a las células T, principalmente en los ganglios que drenan el sitio del tumor de inmunización, seguido por la activación de la célula T y la migración a los sitios periféricos. De hecho, la captación del antígeno por los macrófagos de tejido, neutrófilos y/o células dendríticas y la presentación de péptidos procesados en combinación con antígenos MHC clase I y clase II a las células T en el ganglio linfático son cruciales a una respuesta inmune completa. La clave para una activación inmune de célula T exitosa es la generación del ambiente de citoquina apropiado para inducir la respuesta inmune a una vacuna, en tanto el sitio de inmunización como en el drenado de los ganglios linfáticos. El hecho de que el mecanismo de acción del sistema inmune hasta ahora no ha sido completamente entendido impide a las vacunas de cáncer actualmente disponibles de lograr su potencial completo.

La cinética de la respuesta inmune incluye dos fases. La primera es el drenado del antígeno y las proteínas solubles a los ganglios linfáticos, donde ocurre una activación inmune inicial. Veinticuatro a cuarenta y ocho horas después, las células que presentan antígeno (APCs), más particularmente las células dendríticas, migran del sitio de inmunización por la vía de los conductos linfáticos de drenado al ganglio linfático, donde una segunda onda de presentación de antígeno y activación ocurre. Más específicamente, las APCs interactúan en el ganglio linfático con las células ayudantes T precursoras por la vía del acoplamiento de los receptores co-estimuladores así como los receptores de célula T para producir células T ayudantes 1 (Thl) y/o células T ayudantes 2 (Th2) . La relación de estos subconjuntos controla el desarrollo subsecuente de ya sea las respuestas inmunes mediadas por células o humorales (anticuerpo) (TH1 que se desvía hacia DTH/citotoxicidad, mientras que TH2 se desvía hacia la producción de anticuerpo) . Después de la inducción de estas células T activadas, la respuesta inmune subsiste, dejando células T de memoria predominantemente, que son capaces de responder en la re-exposición al antigeno.

Los eventos críticos en esta ruta son mediados por las citoquinas que desvían la respuesta y la dirección de inmunidad humoral o celular. Las citoquinas localmente producidas, tales como IL-1, IL-2, IFN-?, GM-CSF, IL-6, TNF-OÍ, IL-I2 e IL-8, están asociadas con el reclutamiento de células del sistema inmune, captación de antígeno, maduración de la célula dendrítica, amortiguamiento de la actividad de célula reguladora T, educación y proliferación de la célula T, y el desarrollo de células Thl (Naylor, 2003) . La interdependencia de la respuesta significa que la actividad de cualquier citoquina rara depende de la ocurrencia de eventos precursores tal que la presencia simultánea de múltiples citoquinas puede tener diferentes efectos en tanto el sitio de inyección como en los ganglios linfáticos de drenado, dependiendo de la cinética de las respuestas celulares a diferentes citoquinas.

La falla para evocar una respuesta inmune suficiente con vacunas tradicionales ha permanecido como un reto para el desarrollo de vacuna. Así se han desarrollado adyuvantes para acelerar, aumentar y prolongar la respuesta inmune a la vacunación y reducir la cantidad de antígeno necesario por dosis. Los adyuvantes se han utilizado por casi 100 años. Le oignic y Pinoy primero reconocieron que Salmonella typhimurium suspendido en aceite mineral aumenta en potencia las respuestas inmunes en 1916. En 1926, Ramón demostró que una respuesta de antitoxina podría ser aumentada por un gran intervalo de sustancias tal como agar, tapioca, lecitina, aceite de almidón, saponina y migajas, y Glenny utilizó la sal de aluminio para precipitar el toxoide de difteria mejorando la inmunogenicidad, que conduce a los alumbres utilizados actualmente. Quil A se determinó que tiene propiedades en 1936 por Thibaud y Richou. Quil A es una saponina triterpenoide extraída de la corteza del árbol de jabón Quillaja saponaria de Molina de América del Sur. En 1937, Freund también desarrolló adyuvantes de emulsiones. El poco progreso se ha hecho desde entonces. Como los inventores comienzan a entender el sistema inmune como es descrito en lo anterior, más progreso está siendo hecho con los adyuvantes. Varios adyuvantes se han desarrollado para vacunas, incluyendo vacunas de cáncer, pero todavía solamente el alumbre ha sido realmente de éxito mundialmente . El alumbre es un adyuvante TH2; sin embargo, los adyuvantes que proporcionan una respuesta TH1 también son deseados. Los adyuvantes son especialmente necesarios para grupos de población que no responden lo suficiente a vacunas convencionales debido a la respuesta inmune deteriorada, tales como pacientes de edad avanzada inmunosuprimidos . Los adyuvantes tienen el potencial para superar la inmunotolerancia ; sin embargo, nada ha sido hecho exitoso hasta la fecha. Por lo tanto, aun permanece una necesidad para un adyuvante efectivo para varias enfermedades que incluyen cáncer.

La presente invención utiliza el IRX-2 biológico derivado de célula primaria, también previamente conocido como mezcla de citoquinas naturales (NCM) , como es divulgado en las patentes norteamericanas 5,632,983 y 5,698,194, expedidas al solicitante, para inmunizar pacientes y/o aumentar en potencia la inmunización, tales como pacientes de cáncer u otros pacientes con lesiones o estados de enfermedad que producen antigeno. Más específicamente, IRX-2 se ha mostrado previamente en la patente norteamericana No. 5,698,194 que es efectivo en promover el desarrollo de célula T y funcionar en ratones inmunosuprimidos, envejecidos. IRX-2 se mostró que disminuye la proporción de células T inmaduras e incrementan la proporción de células T maduras en el timo. El IRX-2 incluyó IL-1, IL-2, IL-6, IL-8, IL-12, IFN-?, TNF-a, GM-CSF, G-CSF, e IL-3, IL-4, IL-7 en cantidades menores.

Será evidente en la descripción detallada presente que las composiciones de citoquina de la invención y los métodos que las utilizan son aplicables a la estimulación de una respuesta inmune a cualquier antígeno de interés, por ejemplo, antígenos de cáncer o de tumor, así como antigenos producidos por otros estados de enfermedad o lesiones persistentes. Como es detallado en la presente, la mezcla de citoquina de la invención actúa como un adyuvante de preferencia para estimular la inmunidad de célula T in vivo.

Por otra parte, la presente invención se relaciona a, pero no exclusivamente a, inducir una respuesta inmune a ya sea los antígenos endógenos, es decir, proteínas o péptidos que se localizan in vivo y se procesan y se presentan por APCs (tales como células dendríticas) in vivo o antígenos exógenos, es decir, proteínas o péptidos que se han aislado o generado in vitro y luego administrado in vivo a un ambiente (por ejemplo, un ganglio linfático) donde las células dendríticas están presentes y efectivamente pueden presentar los antígenos, por ejemplo, células T. En particular se relacionan antígenos de péptido, este objetivo se considera por muchos inmunologos que es irremontable . Los péptidos generalmente se consideran que son demasiado pequeños para ser inmunógenos efectivos, su vida media es corta, y frecuentemente son autoantígenos no mutados al cual el paciente es inmunológicamente tolerante. Así, ganando una respuesta inmune a tales antígenos se puede inducir la autoinmunidad.

Como es descrito en la presente, la presente invención es útil para desarrollar un método consistente y efectivo de inmunoterapia de vacuna, en donde las respuestas inmunes son inducidas en pacientes, tales como pacientes con cáncer, usando las composiciones de citoquina de la presente invención en combinación con antigenos asociados con enfermedad endógenos y/o exógenos, incluyendo antigenos y péptidos de tumor, asi como con otros adyuvantes.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona una composición para tratar cáncer, que incluye cantidades sinergisticas de una sustancia biológica derivada de célula primaria que incluye las citoquinas IL-1, IL-2, IL-6, IL-8, TN F-a, e I FN -?, y una vacuna que tiene por lo menos un antigeno.

La presente invención proporciona una composición para aumentar una respuesta inmune en un paciente, que incluye cantidades sinergisticas de una sustancia biológica derivada de célula primaria que tiene las citoquinas IL-1, IL-2, IL-6, IL-8, TN F-OÍ, e I FN-?, en combinación con por lo menos un adyuvante.

La presente invención además proporciona un método para tratar cáncer, que incluye la etapa de administrar una composición que incluye cantidades sinergisticas de una sustancia biológica derivada de célula primaria que incluye las citoquinas IL-1, IL-2, IL-6, IL-8, TNF-a, e IFN-?, y una vacuna que incluye por lo menos un antigeno.

La presente invención proporciona un método para revertir la supresión inmune y ganar inmunidad al cáncer, que incluye las etapas de administrar una composición que incluye cantidades sinergisticas de una sustancia biológica derivada de célula primaria que incluye las citoquinas IL-1, IL-2, IL-6, IL-8, TNF-OÍ, e IFN-?, y una vacuna que incluye por lo menos un antigeno, que estimula la producción de células T na'Lve, que Madura las células dendriticas inmaduras, y que permite la presentación por las células dendriticas maduras resultantes del antigeno a las células T nal've, revirtiendo de esta manera la supresión inmune y ganando inmunidad al cáncer .

La presente invención también proporciona un método para producir una respuesta inmune a un antigeno exógeno en un paciente, que incluye las etapas de administrar un adyuvante de una sustancia biológica derivada de célula primaria que incluye las citoquinas IL-1, IL-2, IL-6, IL-8, TNF-o¡, e IFN-?, y por lo menos un antigeno exógeno, en donde el antigeno exógeno normalmente no produce una respuesta inmune, y producir una respuesta inmune en el paciente.

La presente invención proporciona un método para aumentar una respuesta inmune en un paciente, que incluye las etapas de administrar una sustancia biológica derivada de célula primaria que incluye las citoquinas IL-1, IL-2, IL-6, IL-8, TNF-OÍ, e IFN-?, en combinación con por lo menos un adyuvante, y aumentar la respuesta inmune del paciente por una interacción sinergistica de la sustancia biológica derivada de célula primaria y el adyuvante.

La presente invención además proporciona un método para incrementar la función de un sistema inmune, que incluye las etapas de administrar una sustancia biológica derivada de célula primaria que incluye las citoquinas IL-1, IL-2, IL-6, IL-8, TNF-OÍ, e IFN-?, en combinación con por lo menos un adyuvante, en donde el adyuvante tiene un mecanismo de acción que es diferente que el mecanismo de acción de la sustancia biológica derivada de célula primaria, e incrementar la función de la respuesta inmune.

La presente invención además proporciona un método para incrementar la función de un sistema inmune al administrar un sistema adyuvante de sustancia biológica de célula primaria.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Otras ventajas de la presente invención se aprecian fácilmente ya que la misma llega a ser mejor entendida por referencia a la siguiente descripción detallada cuando se considera en relación con los dibujos acompañantes en donde: La Figura 1 es una gráfica de barras que muestra el tamaño del ganglio linfático en controles normales, controles de cáncer o poblaciones tratadas con IRX-2 con H&NSCC; La Figura 2A es una gráfica de barras que muestra el área de célula T y la Figura 2B muestra la densidad en controles normales, controles de H&NSCC y pacientes de H&NSCC tratados con IRX-2; La Figura 3A es una gráfica de barras que compara el área de célula B y la Figura 3B es una gráfica de barras que compara los folículos en tres grupos de tratamiento; La Figura 4A muestra una comparación de otras células y la Figura 4B muestra una comparación de la histiocitosis de seno (SH) en tres grupos de tratamiento; La Figura 5 es una gráfica que muestra un diagrama de ajuste de B&T de Nodo (célula B y célula T) y B&T de Tumor; La Figura 6 es una gráfica que ilustra el porcentaje de supervivencia de pacientes tratados en cuarenta y ocho meses; La Figura 7 es una gráfica que ilustra la supervivencia de respondedores completes y parciales comparados con respondedores menores y no respondedores; La Figura 8 es una gráfica que ilustra la relación del índice de patología a la supervivencia; La Figura 9 es una gráfica que muestra la relación de infiltración de linfocito a la supervivencia; La Figura 10 es una gráfica que ilustra el porcentaje de supervivencia (respuesta de dosis) de pacientes tratados en veinticuatro meses, en donde "x" es igual a aproximadamente 100 IU/ml de IL-2; La Figura 11A es una gráfica de barras que ilustra la acumulación de células dendriticas CD83+ (DCs) parcialmente maduras en los ganglios linfáticos de pacientes con cáncer SH+; La Figura 11B es una gráfica de barras que muestra un incremento en el número de DC activadas CD86+ en el tratamiento con IRX-2 (IRX-2); La Figura 12 es una gráfica que muestra que IRX-2 (IRX-2) induce la maduración de DC como es detectado por la expresión CD83 incrementada sobre las DCs; Las Figuras 13A-B representan el efecto de IRX-2 en la morfología de las DCs derivadas de monocito en preparaciones de citospina. Las células tratadas con IRX-2 (Figura 13B) exhibieron las características morfológicas de las DCs maduras tales como proyecciones celulares y núcleos de forma irregular grandes; La Figura 14 contiene histogramas que muestra la regulación hacia abajo del antígeno CDla y la regulación hacia debajo de la expresión de antígeno MHCII, CD86, CD40, y CD54 (ICAM-1) por las células mononucleares de sangre periférica (PB Cs) incubadas con IRX-2 (IRX-2) . Estos cambios indican que IRX-2 estimula la maduración de DCs.

La Figura 15 es una gráfica que muestra que IRX-2 (IRX-2) reduce la actividad endocítica de DCs inmaduras, la actividad reducida que es indicativa de la maduración de DC; La Figura 16 es una gráfica que muestra que IRX-2 (IRX-2) aumenta la capacidad estimuladora de célula T de las DCs, el aumento que es indicativo de la maduración de activación de DC; La Figura 17A es una gráfica de barras que muestra que IRX-2 (IRX-2) incrementa el número de DCs que producen IL-12 intracelularmente . IL-12 es una citoquina producida por la DCs activadas maduras; La Figura 17B es una gráfica de barras que muestra que IRX-2 (IRX-2) incrementa la cantidad total de IL-12 bioactiva secretada por las DCs; La Figura 18 es una gráfica de barras que muestra que IRX-2 (IRX-2) disminuye la apoptosis mediada por VEGF en DCs, indicando un efecto protector de IRX-2 en la supervivencia de DC; La Figura 19A contiene dos gráficas de barras que representan el incremento del porcentaje de monocitos/macrófagos de manchado positivo para la combinación de marcadores de activación, CD86, HLA-DR, CD80 y CD40, después del tratamiento de PBMCs adherentes con IRX-2, como es determinado por la citometría de flujo; La Figura 19B es una serie de gráficas de barras que representan el incremento en la intensidad de fluorescencia media (MFI) para los marcadores de activación CD86, HLA-DR, CD80 y CD40, después del tratamiento de las PBMCs adherentes con IRX-2, como es determinado por la citometria de flujo; La Figura 19C muestra dos gráficas de barras que muestran el efecto de IRX-2 en CD40 y CD80 de monocitos/macrófagos .

La Figura 20 contiene gráficas de barras que demuestran que el IRX-2 de la invención activa los monocitos/macrófagos , es decir, induce la expresión de marcadores de activación CD86, HLA-DR, CD80 y CD40, a un grado más grande que TNF-a; La Figura 21 contiene gráficas de barras que demuestran que el IRX-2 de la invención activa los monocitos/macrófagos , es decir, induce los marcadores de activación HLA-DR, CD86 y CD40, aun en la presencia de la citoquina de inmunosupresión IL-10. El IRX-2 es mejor en activar monocitos/macrófagos que LPS, tanto en la presencia como en la ausencia de IL-10.

La Figura 22 es una gráfica de barras que demuestra que el IRX-2 de la invención estimula la producción de TNF-a de monocitos/macrófagos activados y supera los efectos inmunosupresores de IL-10, el IRX-2 estimuló la producción de TNF-a a un grado más grande que LPS; La Figura 23 es una gráfica que ilustra la respuesta DTH especifica de péptido de antigeno de membrana especifico de próstata (PSMA) de ratones inmunizados con varios conjugados y adyuvantes, incluyendo el IRX-2 de la invención (IRX), en donde la respuesta es indicada como hinchamiento en mm para ratones individuales (punto) y para el promedio (barra), el adyuvante es listado en el eje x, natve indica ratones no inmunizados, y todos los otros ratones son inmunizados con conjugados de Ovalbúmina-péptido PSMA excepto donde es indicado (KLH) ; La Figura 24A representa la respuesta inmune DTH específica de péptido aumentada en ratones inmunizados con IRX-2 de la invención (IRX-2) en combinación con ya sea un conjugado de OVA-PSMA o KLH-PSMA y luego estimulado con los péptidos PSMA (utilizados para generar el conjugado) en un ensayo DTH: el incremento en el hinchamiento para ratones individuales es representado por los puntos de datos, con el incremento promedio en el hinchamiento que es representado por los cuadros sombreados, y la Figura 24B representa la respuesta DTH a la estimulación con solamente el portador utilizado en la inmunización con conjugado; La Figura 25 representa la influencia del tratamiento de ciclofosfamida sobre la respuesta DTH específica de péptido en ratones inmunizados con el conjugado OVA-PSMA y el tratamiento con IRX-2 : ciclofosfamida no tuvo efectos sobre la respuesta DTH; La Figura 26 representa una comparación de los efectos de varios adyuvantes, incluyendo el IRX-2 de la invención (IRX), sobre la respuesta DTH especifica de péptido en ratones inmunizados con un conjugado de PSMA en combinación con los adyuvantes respectivos: el efecto de adyuvante de IRX-2 fue más grande que los otros adyuvantes probados, y los ratones na'ive, es decir, ratones no inmunizados, representan un control negativo; La Figura 27A representa la respuesta DTH especifica de péptido de ratones viejos contra jóvenes inmunizados con un conjugado de OVA-PSMA en combinación con ya sea IRX-2 (IRX) o alumbre como adyuvante: el IRX-2 estimuló una respuesta DTH especifica de péptido más grande en ratones tanto viejos como jóvenes como es comparado con el alumbre, y la Figura 27B representa la respuesta a DTH especifica de portador de los ratones viejos contra jóvenes inmunizados con un conjugado PSMA en combinación con ya sea IRX-2 (IRX) o alumbre como adyuvante: el IRX-2 de la invención restauró la respuesta DTH especifica de portador de los ratones viejos a aquella observada en los ratones j óvenes ; La Figura 28 representa la respuesta de célula T aumentada en la forma de IFN-? secretada por células del vaso de ratones inmunizados con un conjugado KLH-PSMA y el IRX-2 de la invención (IRX-2), los resultados se expresan para ratones individuales (marcadores de puntos de datos) asi como las respuestas promedio (barras sombreadas) : todos los incrementos en IFN-? secretada fueron estadísticamente significantes comparados con los controles na'íve; Las Figuras 29A-C representan las respuestas de anticuerpo de suero observadas en ratones inmunizados con los conjugados PSMA en combinación con el IRX-2 de la invención comparado con otros adyuvantes, es decir, alumbre y CpG, la Figura 29A representa la respuesta de anticuerpo de suero al portador OVA en ratones inmunizados con el conjugado OVA-PSMA e IRX-2 (IRX), alumbre o CpG, los datos se presentan como la media y error estándar de la media para 5-10 ratones por grupo, la Figura 29B representa la respuesta de anticuerpo de suero a los péptidos PSMA en ratones inmunizados con el conjugado OVA-PSMA e IRX-2 (IRX), alumbre o CpG, y la Figura 29C representa la respuesta de anticuerpo de suero de los péptidos PSMA en ratones inmunizados con el conjugado KLH-PSMA en combinación con IRX-2 (IRX), alumbre o PBS, los resultados se determinado mediante el ensayo de ELISA y se presentan como densidad óptica; La Figura 30 representa la estabilización de niveles de PSA durante un período de 6 meses en tres pacientes con cáncer de próstata tratados con IRX-2 de la invención en combinación con antígenos de péptido PSMA.

La Figura 31 es una gráfica de barras de la respuesta DTH específicas de péptido de ratones inmunizados con PSMA irradiado que expresa las células 3T3; La Figura 32 es una gráfica de barras que muestra DTH especifico de péptido en PSMA-KLH contra sin portador; La Figura 33A es una gráfica que muestra que IRX-2 incrementa la respuesta a antigeno de una manera dependiente de la dosis, y la Figura 33B es una gráfica de barras del efecto de inyecciones adicional de IRX-2 en la respuesta inmune al antigeno; La Figura 34 es una gráfica de barras que muestra el ensayo DTH del péptido de ratones inmunizados con el péptido PMSA inyectados con IRX-2 contra otros adyuvantes: La Figura 35 es una gráfica de barras de la producción de IFN-? en respuesta al antigeno de péptido; La Figura 36 es una gráfica de la respuesta de anticuerpo de suero; La Figura 37 es una gráfica de la respuesta de anticuerpo de suero de IRX-2 contra otros adyuvantes; La Figura 38A es una gráfica de número de células T que producen IFN-? en respuesta al antigeno de péptido; la Figura 38B es una gráfica que compara el número de células que producen IFN-? contra la producción total de IFN-? en respuesta al antigeno de péptido; La Figura 39 es una gráfica de la cinética de producción de IFN-? en respuesta a la vacunación de péptido; La Figura 40A es una gráfica de la producción de IFN-? de respuesta de dosis en respuesta a la vacunación de péptido; la Figura 40B es una gráfica del número de células que producen IFN-? después de diferentes administraciones ' de IRX-2; La Figura 41A es una gráfica de la producción de IFN-? después de la vacunación con IRX-2 contra otros adyuvantes; la Figura 41B es una gráfica de la respuesta de anticuerpo después de la vacunación con IRX-2 contra otros adyuvantes ; La Figura 42A es una gráfica de crecimiento de tumor después de la inmunización con IRX-2 y una vacuna de célula completa; la Figura 42B es una gráfica de crecimiento de tumor después de la inmunización previa con IRX-2 y una vacuna de péptido-conj ugado; la Figura 42C es una gráfica de crecimiento de tumor después de la inmunización previa con IRX-2 y el conjugado solo.

La Figura 43 es una gráfica de la producción de IFN-? de células T después de la vacunación con IRX-2 y otros adyuvantes ; La Figura 44 es una gráfica de células especificas de antigeno después de la vacunación con IRX-2 y otros adyuvantes ; La Figura 45 es una gráfica de la citotoxicidad in vivo después de la vacunación con IRX-2 y otros adyuvantes; La Figura 46 es una gráfica de respuesta de anticuerpo de suero después de la vacunación con una vacuna de base viral e IRX-2; La Figura 47 es una gráfica de las respuestas de IFN-? de las células T después de la vacunación con una vacuna de base viral e IRX-2; La Figura 48 es una gráfica de las respuestas de IFN-? de las células T después de la vacunación con una vacuna de base viral que expresa TRICOM e IRX-2; La Figura 49 es una gráfica de las respuestas de IFN-? de las células T después de la vacunación con una vacuna de base viral IRX-2; La Figura 50 es una gráfica de las respuestas de IgM después de la vacunación con una vacuna de base viral e IRX-2; y La Figura 51 es una gráfica de las respuestas de IgGi e IgG2¾ después de la vacunación con una vacuna de base viral e IRX-2.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona a composiciones y métodos de inmunoterapia y tratamiento de cáncer u otras lesiones o estados de enfermedad que producen antigeno. Más específicamente, la invención se relaciona a composiciones y métodos para inducir una respuesta inmune a antígenos asociados con un cáncer u otra enfermedad o lesión que produce antígeno, en donde una sustancia biológica derivada de célula primaria que comprende IL-1, IL-2, IL-6, IL-8, IFN-?, y TNF-a, así como una vacuna de cáncer que incluye por lo menos un antígeno se administra a un paciente en una cantidad efectiva para estimular una respuesta inmune al antígeno en el paciente. De acuerdo con la presente invención, el antígeno es de preferencia un antígeno exógeno y la sustancia biológica derivada de célula primaria actúa como un adyuvante con el antígeno para estimular una respuesta inmune al antígeno en un paciente. La sustancia biológica derivada de célula primaria también se puede utilizar en combinación con otros adyuvantes como es descrito en la presente.

Definiciones Como se utiliza en la presente, el término "adyuvante" denota una composición con la habilidad para aumentar la respuesta inmune a un antígeno particular. Tal habilidad se manifiesta por un incremento significante en la protección mediada inmune. Para ser efectivo, un adyuvante debe ser suministrado en o cerca del sitio del antígeno. El aumento de la inmunidad se manifiesta típicamente por ya sea un incremento significante (usualmente mayor que 10 veces) en el título de anticuerpo creado con el antígeno y/o aumento de la inmunidad celular, que se puede medir mediante una prueba de piel positiva, ensayo de célula T citotóxica, ensayo ELISPOT para IFN-? o IL-2, o infiltración de célula T en el tumor. Las composiciones de citoquina de la presente invención son particularmente adecuadas para aumentar las respuestas inmunes mediadas por la célula T. Los efectos del adyuvante de las composiciones de citoquina de la invención incluyen la generación de células T na'fve, la promoción de la diferenciación y maduración de célula dendritica, la estimulación de monocitos y macrófagos, y en el caso de pacientes con cáncer, la infiltración de linfocito incrementada en tumores, fragmentación de tumor, regresión de tumor y reducción de histiocitosis de seno en los ganglios linfáticos-.

"Sistema adyuvante" como se utiliza en la presente denota la combinación de adyuvantes para trabajar conjuntamente para obtener una formulación óptimamente efectiva y segura en la cual cada parte de la vacuna, el antigeno y adyuvante ( s ) , trabaja conjuntamente para producir una respuesta inmune. Ejemplos de tales sistemas adyuvantes son las vacunas formuladas AS02, 3 y 4 hechas por Glaxo Smith Kline (GSK) .

"Vacuna" como se utiliza en la presente, se refiere a una vacuna que incluye por lo menos un antigeno, y de preferencia más de un antigeno, que se administra a un paciente para crear una respuesta inmune y de preferencia la respuesta de célula T al antigeno (s) suministrado. La vacuna puede incluir otros diversos componentes tal como un portador u otras moléculas estimuladoras. Las vacunas pueden ser vacunas basadas en DNA, vacunas basadas en péptido, o vacunas basadas en proteina codificadas en varios vectores virales/bacterianos o células.

Como se utiliza en la presente, "cantidad efectiva" se refiere a una cantidad de sustancia biológica derivada de célula primaria que es necesaria para lograr el resultado deseado en la presente invención, específicamente, la producción de una respuesta inmune a un antígeno mediante una manera sinergística . Un experto en la técnica puede determinar la cantidad efectiva de la sustancia biológica derivada de célula primaria que debe ser dada a un paciente particular .

"IRX-2", también conocido como "citopluriquina" , es una sustancia biológica derivada de célula primaria natural, derivada de leucocito producida por los glóbulos blancos humanos purificados (células mononucleares ) estimuladas por fitohemaglutinina (PHA) y ciprofloxacina (CIPRO) . Por definición, IRX-2 es un sistema adyuvante. Los componentes actives mayores son interleucina 1ß (IL-?ß, también referida en la presente como IL-1), interleucina 2 (IL-2), interleucina 6 (IL-6), interleucina 8 (IL-8), factor de necrosis tumoral (TNF-a) , y ?-interferona (IFN-?). De preferencia, el IRX-2 utilizado en la presente invención incluye estas seis citoquinas .críticas. IRX-2 también se ha referido previamente como una "NCM", una mezcla de citoquina natural, definida y expuesta en las patentes norteamericanas Nos. 6,977,072 y 7,153,499. Los términos IRX-2, sustancia biológica derivada de célula primaria y NCM se utilizan intercambiablemente en la presente.

Brevemente, IRX-2 se prepara en la presencia continua de un antibiótico de 4-aminoquinolona y con la presencia continua o pulsada de un mitógeno, que en la modalidad preferida es PHA. Sin embargo, otros mitógenos también se pueden utilizar. El IRX-2 producido para la administración a pacientes contiene una concentración de IL-1ß que varia de 60 - 6, 000 pcg/mL, más de preferencia de 150 - 1,800 pcg/mL; una concentración de IL-2 que varia de 600-60,000 pcg/mL, más de preferencia de 3,000-12,000 pcg/mL, y concentraciones de IFN-? y TNF- que varían de 200-20,000 pcg/mL, más de preferencia 1,000-4,000 pcg/mL.

IRX-2 también puede contener una concentración de IL-6 que varía de 60-6,000 pcg/mL, más de preferencia, de 300-2,000 pcg/mL; una concentración de IL-8 que varia de 6000-600,000 pcg/mL, más de preferencia de 20,000-180,000 pcg/mL; una concentración de TNF-a que varía de 200-20,000 peg/ml, más de preferencia, de 1,000-4,000 pcg/mL. Se pueden utilizar citoquinas recombinantes , naturales o pegiladas, o IRX-2 puede incluir una mezcla de citoquinas recombinantes, naturales o pegiladas. IRX-2 puede contener solamente las citoquinas anteriores; sin embargo, también se pueden incluir otras citoquinas. El IRX-2 de la presenta invención además puede incluir otras citoquinas recombinantes , naturales o pegiladas tales como IL-7, IL-12, IL-15, GM-CSF (en una concentración que varia de 100-10,000 pcg/mL, más de preferencia de 500-2,000 pcg/mL) , y G-CSF. El método para hacer IRX-2 se divulga en las patentes citadas en lo anterior asi como en la solicitud de patente provisional norteamericana No. 61/044,674.

También abarcado por la presente invención están derivados, fragmentos y péptidos relacionados con las citoquinas divulgadas en la presente, en donde tales derivados, fragmentos y péptidos requieren actividad biológica de sus citoquinas respectivas.

Otros compuestos también se pueden administrar junto con IRX-2, tales como composiciones para promover la supresión inmune, tales como inhibidores químicos; fármacos antiinflamatorios no esferoidales (NSAIDS) ; zinc y combinaciones de los mismos. El inhibidor químico puede ser cualquier agente quimioterapéutico que no es inmunosupresor (de preferencia utilizado en bajas dosis) y que tiene efectos inmunomoduladores para incrementar la inmunidad y/o una respuesta inmune, por ejemplo, al inhibir la supresión inmune o mecanismos supresores en el cuerpo. De acuerdo con una modalidad preferida, el inhibidor químico es un agente antineoplásico, que incluye pero no limitado a agentes alquilantes, antimetabolitos y antibióticos. El inhibidor químico también puede ser un agente de inmunomodulación tal como talidomida. El inhibidor químico también puede estar en una sal u otra forma compleja. De preferencia, el inhibidor químico es el agente alquilante ciclofosfamida (CY) . El NSAID es de preferencia indometacina (INDO), que es tanto un inhibidor de Coxl como de CoxII. El NSAID también puede ser ibuprofen o inhibidor de CoxII tal como celecosib y rofecoxib, o combinaciones de los mismos. Los cuatro componentes utilizados conjuntamente (es decir, inhibidor químico, NSAID, sustancia biológica derivada de célula primaria y zinc] son capaces de dirigirse al ambiente supresor creado por el objetivo inmune y restaurar la respuesta inmune celular del paciente. Más específicamente, el inhibidor químico inhibe las células reguladoras T; el NSAID revierte la supresión inmune local por las prostaglandinas ; la sustancia biológica derivada de célula primaria activa las células dendríticas, estimula las células T y protege las células T de la apoptosis; y el zinc proporciona nutrientes claves para la función de la célula T como se muestra en la FIGURA 2. La acción combinada favorece la respuesta inmune a los antígenos tanto endógenos como exógenos .

Como se utiliza en la presente, el término "antígeno endógeno" denota un antígeno que se produce y se sitúa in vivo, es decir, dentro de un organismo tal como un paciente, tal que, después de la administración de la composición de citoquina de la invención in vivo, las citoquinas actúan como un adyuvante con el antigeno dentro del paciente para estimular una respuesta inmune al antigeno.

Como se utiliza en la presente, el término "antigeno exógeno" denota un antigeno que se produce, es decir, se aisla o se genera, in vitro, es decir, fuera de un organismo que es tratado, y se administra al organismo (es decir, un paciente) in vivo tal que, después de la administración de la composición de citoquina de la invención in vivo, las citoquinas actúan como un adyuvante con el antigeno dentro del paciente para estimular una respuesta inmune al antigeno. El antigeno exógeno puede ser un compuesto químicamente sintetizado o genéticamente diseñado o molécula o puede ser un antígeno endógeno que se ha extraído de su ambiente in vivo y aislado in vitro. El antígeno extraído puede ser procesado o de otra manera modificado para la introducción in vivo. El antígeno exógeno puede ser administrado ya sea en una preparación farmacológica separada de la composición de citoquina de la invención o en la misma preparación. Como es demostrado por los datos de los Ejemplos 11 y 12 enseguida, la composición de IRX-2 de la invención es efectiva en combinación con los antígenos de membrana específicos de próstata exógenos (PSMA) en promover respuestas inmunes en tanto ratones como en humanos. Otros antigenos exógenos pueden ser combinados con IRX-2 como es descrito adicionalmente enseguida.

Como se utiliza en la presente, el término "antigeno asociado con tumor" denota una proteina o péptido u otra molécula capaz de inducir una respuesta inmune a un tumor. Esto puede incluir, pero no está limitado, a péptidos PSMA, péptidos MAGE (Sahin, 1997; Wang, 1999), péptidos de virus de Papiloma (E6 y E7 ) , fragmentos MAGE, NY ESO-1 u otros antigenos similares. Previamente, estos antigenos no se consideraron que sean efectivos en tratar pacientes basados en ya sea su tamaño, es decir, ellos se consideraron demasiado pequeños o se pensaron previamente que carecen de propiedades inmunogénicas (es decir, se consideraron que son auto antigenos).

Los péptidos largos sintéticos se definen como secuencias de péptido entre 22 y 45 aminoácidos. Las vacunas de péptidos largos sintéticos ofrecen varias ventajas sobre las vacunas de secuencia de péptido mínima, que se explican enseguida. Uno de los factores claves en la eficacia de vacuna es el contexto en los cuales los péptidos se presentan al sistema inmune. Los péptidos largos sintéticos no son capaces de enlazar directamente a MHC clase I pero necesitan ser captados y procesados por las células dendríticas y luego presentadas a las células T citotóxicas. En contraste, los péptidos de células T citotóxicos mínimos (8-10 aminoácidos) , se cargan fácilmente de manera exógena en las moléculas MHC clase I y se pueden presentar por tanto el APC profesional (DC) y el APC no profesional (células T y células B) in vivo. La presentación de epítopes de péptido de células T citotóxicos o células B no activadas induce una respuesta de las células T citotóxicas transientes que es seguido por una supresión subsecuente de estas células T CD8+. La liberación lenta y la duración larga de la presentación de antígeno que es inducida por el adyuvante IFA - más de 100 días - en combinación con la presentación mínima de péptidos de células T citotóxicas en ganglios linfáticos no inflamatorios por APC no profesional induce la tolerancia de célula T CD8+ y fraticida cuando las células T CD8+ activadas por vacuna de péptido presentan el péptido de células T citotóxicas mínimas entre sí. En contraste, la carga de péptido de enlace de MHC clase I mínimo directamente sobre DC puede convertir un péptido tolerizante de célula T citotóxica en un péptido que activa la expansión de una respuesta de célula T citotóxica protectora de tumor. De manera similar, la extensión de la secuencia de péptido de células T citotóxicas a un péptido largo sintético, que requiere procesamiento profesional por DC, tiene el mismo beneficio. Los péptidos largos sintéticos principalmente se procesan y se presentan por el APC profesional y por lo tanto estimulan las células T citotóxicas predominantemente dentro del ambiente estimulador fuerte del ganglio de drenado inflamado. Otra ventaja de las vacunas de péptidos largos sintéticos sobre las vacunas de péptido de células T citotóxicas mínimas es la duración incrementada de la presentación de epítope in vivo en el ganglio linfático de drenado de antígeno, que es importante para la expansión clonal y para la producción de IFN-? por las células T efectoras. Esta presentación in vivo mejorada y la inducción concomitante de la expansión de la célula T por un epítope de péptido largo sintético es particularmente evidente si el epítope de células T citotóxicas se relaciona con exhibiciones de enlace de MHC clase I más débiles. Por lo tanto, la conversión de los péptidos de células T citotóxicas mínimos a péptidos largos ofrecen alternativa a los métodos tal como la modificación de péptidos de células T citotóxicas con el fin de incrementar la inmunogenicidad .

Ejemplos de péptidos largos sintéticos para HPV son como sigue: E61-32: MHQKRTAMFQDPQERPRKLPQLCTELQTTIHD (SEQ ID 0:4); E619-50: LPQLCTELQTTI HDI ILECVYCKQQLLRREVY (SEQ ID NO:5); E641-65: KQQLLRREVYDFAFRDLCIVYRDGN (SEQ ID NO:6); E655-80: RDLCIVYRDGNPYAVCDKCLKFYSKI (SEQ ID NO:7); E671-95: DKCLKFYSKISEYRHYCYSLYGTTL (SEQ ID NO:8); E685-109: HYCYSLYGTTLEQQYNKPLCDLLIR (SEQ ID 0:9) ; E691-120: YGTTLEQQYNKPLCDLLIRCINCQKPLCPEEK ( SEQ I D NO : 10 ) ; E6109-140: RCINCQKPLCPEEKQRHLDKKQRFHNIRGRWT (SEQ ID O.ll); E6127-158: DKKQRFHNIRGRWTGRCMSCCRSSRTRRETQL (SEQ ID NO: 12); E71-35: HGDTPTLHEYMLDLQPETTDLYCYEQLNDSVERE (SEQ ID NO:13); E722-56: LYCYEQLNDSVEREDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVT (SEQ ID NO:14); E743-77: GQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIR (SEQ ID NO: 15); E764-98: TLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKP (SEQ ID NO: 16).

Más específicamente, la presente invención se dirige a una composición que incluye cantidades sinergisticas de una sustancia biológica derivada de célula primaria (IRX-2) que tiene las citoquinas IL-1, IL-2, IL-6, IL-8, TNF-a, e IFN-?, y una vacuna de cáncer que incluye por lo menos un antigeno. IRX-2 actúa como un adyuvante solo o en combinación con otros adyuvantes al antígeno(s) exógeno en la vacuna, es decir, estimula una respuesta inmune al antígeno exógeno. En otras palabras, IRX-2 actúa de una manera sinergística con el antígeno exógeno para crear una respuesta inmune más grande que se puede lograr para administrar los antígenos exógenos solos. IRX-2 proporciona ventajas sobre los adyuvantes previos debido a su efecto de completamente "activada" al sistema inmune de un paciente cuyo sistema inmune es de alguna manera suprimido de su función completa. Sin revertir la supresión del sistema inmune, el antígeno no se puede presentar efectivamente para tratar cáncer y otras enfermedades. El mecanismo mediante el cual IRX-2 "activa" el sistema inmune es además descrito enseguida.

La composición se puede utilizar pata tratar muchos tipos diferentes de enfermedades tales como cánceres, tales como, pero no limitados a, carcinoma de célula escamosa de cabeza y cuello (H&NSCC) , cánceres de seno, cáncer colorrectal, cáncer de estómago, cáncer pancreático, cáncer de pulmón, cáncer de cerebro, cáncer de colon, cáncer ovárico, cáncer de lengua, cáncer de faringe, cáncer de próstata y melanoma. Además, las composiciones y métodos de la invención se pueden utilizar para tratar lesiones persistentes no cancerosas tales como lesiones infecciosas que producen antigeno in vivo, por ejemplo, candidiasis cutánea o sistémica, verrugas venéreas asociadas con el virus de papiloma o displasia cervical.

El IRX-2 es esencialmente como es descrito anteriormente en la sección de definiciones y opcionalmente puede incluir citoquinas adicionales diferentes de las seis citoquinas criticas de IL-1, IL-2, IL-6, IL-8, TNF-OÍ, e IFN-?, y la composición además opcionalmente puede incluir los otros diversos componentes que se administran en el régimen de IRX-2 típico, es decir, un inhibidor químico, en NSAID, y zinc también como es descrito en lo anterior.

La vacuna de la presente invención es cualquier vacuna que se utiliza para tratar cáncer al estimular una respuesta inmune a un antígeno particular y generalmente incluye por lo menos un antígeno comúnmente producido en este tipo particular de cáncer. Mientras que los antígenos discutidos en la presente son referidos como que son "una vacuna de cáncer", se debe entender que los antígenos también se pueden utilizar individualmente o en combinación sin estar en una "vacuna" adicional de la misma manera descrita en la presente, tal como en los Ejemplos 11 y 12.

Los antigenos comunes utilizados en vacunas de cáncer incluyen AFP, alfa-actinina- , ARTC1, BAGE , BCR-abl, B-RAF, CA 15-3, CA 19-9, CA-125, CASP-5, CASP-8, beta.-catenina, antigeno carcinoembriónico, antigeno carcinoembriónico modificado, mucinas mutadas asociadas por carcinoma cdc27, CDK4, CDKN2A, CEA, cromogranina A, COA-1, quinasa-4, dependiente de ciclina, proteina de fusión dek-can, EFTUD, factor de alargamiento 2, receptor de factor de crecimiento epidérmico EGFRvIII, producto génico del Virus de Epstein Barr EBNA, ETA, proteina de fusión ETV6-AML1, FLT3-ITD,, FN1, GAGE, gangliósidos , GPNMB, gp75/TRP-l, gplOO, Hl FT, HAGE, HERV-K-MEL, HER2/neu proteina, HIP-55, HIV-1, HIV-2, HLA-A2, HLA-A11, hsp70-2, KIAAO205, quinesina 2, KK-LC-1, KLK- , KM-HN-1 , KSA, LAGE, proteina de fusión de LDLR-fucosiltransferasaAS, MAGE, mamaglobina-A, MART-l/Melan A, MART-2, ME1, proteoglicano de melanoma, miosina clase I, MUC-1, MUM-1, MUM-2, MUM-3, NA-88, NCAM-180, neo-PAP, NFYC, NY-BR, NY-ESO-1, OA1, OGT, OS-9, pl5, p21-ras, p53, pl85 HER2 /neu, virus de papiloma E7, virus de papiloma E6, proteína de fusión de pmi-RARalfa, PRDX5, PTPRK, PSA, PSMA, RAGE, K-ras, N-ras, RAB38, RBAF600, SAGE, SIRT2, SNRPD1, spl7, proteína de fusión SYT-SSXl, proteína de fusión SYT-SSX2, TA 90, TAG, factor anti-apoptótico TGF-ß?, TGF-pRII, tiroglobulina, TRAG-3 , triosefosfato isomerasa, TRP2 , TRP2-INT2, proteína de tumor D52, tirosinasa, WT1, fragmentos de los mismos, derivados de los mismos y combinaciones de los mismos. También se puede utilizar cualquier otro antígeno adecuado.

Los antígenos administrados pueden ser los antígenos por sí mismos en la forma de proteínas que ocurren naturalmente, proteínas recombinantes , proteínas químicamente sintetizadas o combinaciones de las mismas.

Además, los antígenos pueden ser codificados en un vector viral bacteriano, es decir, un vector de ácido nucleico. En este caso, el antígeno es codificado por un material de ácido nucleico, tal como DNA o RNA. Los vectores virales comunes utilizados para codificar ácido nucleico incluyen, pero no están limitados a, retrovirus, adenovirus, adenovifus asociado (AAV) , virus de herpes y poxvirus. Ejemplos de poxvirus incluyen vaccinia, vaccinia modificada Ankara (MA) , NYVAC, avipox, TROVAX, fowlpox, y canarypox.

Ejemplos específicos de canarypox incluyen ALVAC y ALVAC(2).

Un experto en la técnica puede codificar los antígenos en el vector deseado.

La composición además puede incluir moléculas co-estimuladoras para estimular las células T. Las células T requieren dos señales diferentes con el fin de llegar a ser completamente activadas. La primera señal es especifica de antigeno y proviene del receptor de célula T que interactúa con las moléculas de péptido-MHC sobre la membrana de células que presentan antigeno. La segunda señal, que es la señal co-estimuladora, es no especifica de antigeno y se logra por la interacción entre las moléculas co-estimuladoras expresadas sobre la membrana de las células que presentan antigeno y la célula T. Las moléculas co-estimuladoras pueden ser encontradas naturalmente en el cuerpo; sin embargo, en un paciente inmunosuprimido, se pueden administrar moléculas adicionales. Ejemplos de moléculas co-estimuladoras incluyen abatacept, belatacept, CD28-SuperMAB, moléculas co-estimuladoras B7/CD28, moléculas co-estimuladoras de la superfamilia TNF, moléculas co-estimuladoras de la familia SLAM asi como otras.

La composición también puede incluir péptidos largos sintéticos como es descrito en lo anterior. Esta combinación es un ejemplo de combinación de una vacuna que tiene un mecanismo de acción novedoso con la composición de la presente invención para ganar una respuesta sinergistica debido al mecanismo de acción combinado de los dos componentes .

La composición también puede incluir compuestos para bloquear los mecanismos inmunes reguladoras supresores o negativos, tal como anti-CTLA-4, anti-PD-1 o anti-PDL-1. La familia de receptor CTLA-4 (Antigeno de Linfocito T Citotóxico 4), cuando es acoplado, inhibe la activación de las células T, promueve la detención del ciclo celular y disminuye la producción de citoquina. Esto es una función importante en un sistema inmune que funciona normalmente para prevenir las respuestas inmunes excesivas. Sin embargo, la inhibición del receptor CTLA-4 en un paciente inmunosuprimido es deseado con el fin de remover algo de la supresión y estimular la activación de las células T.

La composición además puede incluir una molécula de agotamiento Treg. Los Tregs, o células T reguladoras, se distinguen entre los autoantigenos y no autoantigenos y suprimen activamente la activación inmune. La supresión de Tregs puede reducir la supresión del sistema inmune en un paciente inmunosuprimido. Esta supresión se puede realizar al administrar una molécula de agotamiento Treg tal como, pero no limitada a, denileukin difitox (ONTAK®, Eisai Inc.).

La composición puede incluir antigenos asociados con angiogénesis con el fin de prevenir o inhibir los procesos angiogénicos que ocurren cerca o dentro de los tumores. Los antigenos asociados con angiogénesis pueden incluir, pero no están limitados a, VEGF, receptor de VEGF, EGFR, bFGF, PDGF-B, PD-ECGF, TGFs incluyendo TGF-a, endoglina, proteínas Id, varias proteasas, óxido nítrico sintasa, aminopeptidasa, trombospondinas, k-ras, Wnt, quinasas dependientes de ciclina, microtúbulos , proteínas de choque térmico, factores de enlace de heparina, sintasas, receptores de colágeno, integrinas, y proteoglicano de superficie NG2.

La composición además puede incluir agentes aumentadores de potencia CD80, ICAM-1, y LFA-3, también conocidos como TRICOM, para aumentar en potencia el efecto de la sustancia biológica derivada de célula primaria y la vacuna de cáncer así como los otros componentes descritos en lo anterior. Otras combinaciones de agentes para aumentar la potencia incluyen IL-12 y GM-CSF; IL-12, GM-CSF, y TNF-a; CD80 y IL-12; y CD86, GM-CSF, e IL-12.

La presente invención también abarca el uso de tanto un antígeno endógeno como un antígeno exógeno, es decir, en donde la composición se administra a un paciente que tiene un antígeno endógeno in vivo y en donde las citoquinas actúan como un adyuvante con tanto los antígenos exógenos como endógenos para estimular las respuestas inmunes en el paciente. Por ejemplo, el antígeno endógeno puede estar presente en los ganglios linfáticos regionales o en el sitio del tumor.

La presente invención también se dirige a una composición que incluye la sustancia biológica derivada de célula primaria como es descrito en lo anterior, que por si misma actúa como un adyuvante, y por lo menos otro adyuvante con el fin de estimular el sistema inmune de un paciente. El antigeno (s) exógeno tal como en las vacunas de cáncer y los otros componentes descritos en lo anterior también se puede incluir én la composición. En otras palabras, la composición es una composición multi-adyuvante que además aumenta el efecto de los antigenos. Además, la sustancia biológica derivada de célula primaria no solamente aumenta en potencia el efecto de los antigenos como es descrito en lo anterior, sino también el efecto de los adyuvantes, es decir, la sustancia biológica* derivada de célula primaria actúa sinergísticamente con los adyuvantes.

Hay dos clases diferentes de adyuvantes: independiente de receptor similar a toll (TLR) y dependiente de TLR. Los adyuvantes independientes de TLR actúan como sistemas de suministro y ayudan a concentrar los antigenos, dirigiéndolos a células que presentan antigeno y para colocalizar los antigenos y los potenciadores inmunes. Los adyuvantes dependientes de TLR directamente estimulan el sistema inmune a través de la activación de TLRs . La composición de la presente invención se puede utilizar con un adyuvante independiente de TLR como un adyuvante dependiente de TLR o combinaciones de los mismos. Utilizando cada clase de adyuvante se puede estimular diferentes partes del sistema inmune a la vez. Por ejemplo, un adyuvante independiente de TLR puede traficar el antígeno y los adyuvantes dependientes de TLR a APCs para estimular la captación y estabilidad de antigeno, mientras que el adyuvante dependiente de TLR directamente aumenta la inmunidad a través de la activación de la señalización de TLR y reduce la toxicidad potencial de la administración de adyuvantes dependientes de TLR por si mismos. También, utilizando adyuvantes dependientes de TLR múltiples puede dar por resultado un efecto sinergistico de los adyuvantes.

Los adyuvantes pueden ser, pero no están limitados a, los siguientes adyuvantes. Los adyuvantes independientes de TLR: Alumbre ( fosfato/hidróxido de aluminio) es una sal mineral con varias indicaciones. AS03 (GSK; escualeno (10.68 mg) , DL-alfa-tocoferol (11.86 mg) , y polisorbato 80 (4.85 mg) es una emulsión de aceite en agua que se utiliza para la influenza pandémica. MF59 (Novartis; 4-5% p/v de escualeno, 0.5% p/v de Tween 80, 0.5% Span 85, opcionalmente : cantidades variantes de .muramul tripéptido fosfatidil-etanolamina (MTP-PE) ) es una emulsión de aceite en agua utilizada para influenza. Provax (Biogen Idee; escualeno más pluronic L121) es una emulsión de aceite en agua. Montanide (Seppic SA; Bioven; Cancervax; oleato de manuro y aceite mineral) es una emulsión de agua en aceite que se utiliza en el tratamiento de malaria y cáncer. TiterMax (CytRx; escualeno más CRL-8941) es una emulsión de agua en aceite. Advax (Vaxine Pty; partículas nanocristalinas de inulina) es un biopolímero que se utiliza en vacunas contra Hepatitis B (profilácticas y terapéutias ) , influenza, ántrax, shigella, enefalitis Japanesa, rabia, veneno de abejas, alergia e inmunoterapia de cáncer. QS21 (Antigenics; fracción de Quil A) es una composición derivada de planta que se utiliza en el tratamiento de melanoma, malaria, HIV e influenza. Quil A (Statens Serum Institute; fracción purificada de Quillaia saponaria) es una composición derivada de planta utilizada en varios tratamientos. ISCOM (CSL; Isconova; saponina más esterol más, opcionalmente, fosfolípido) es una composición derivada de planta que se utiliza en varios tratamientos incluyendo la influenza. Los liposomas (Crucell; Nasvax; esferas de fosfolípido sintéticas que consisten de lípidos) se utilizan en el tratamiento de varias enfermedades.

Adyuvantes dependientes de TLR: Ampligen (Hemispherx; RNA de doble hebra específicamente configurado sintético que contiene regiones que ocurren regularmente de desigualación) trabaja mediante la activación de TLR3 y se utiliza como una vacuna contra la gripe pandémica. AS01 (GSK MPL, liposomas, y QS-21) trabaja mediante la activación de MPL de TLR4 , los liposomas proporcionan suministro de antígeno aumentado a APCs, QS-21 proporciona aumento en la presentación de antígeno a APCs y la inducción de células T citotóxicas, y este se utiliza como una vacuna contra malaria y tuberculosis. AS02 (GSK; MPL, emulsión o/w y QS-21) trabaja mediante la activación de MPL de TLR , la emulsión o/w proporciona respuestas inflamatorias innatas, reclutamiento y activación de APC, aumento de la persistencia de antigeno en el sitio de inyección, presentación a las células inmunocompetentes , inducción de diferentes patrones de citoquinas, y el QS-21 proporciona aumento de presentación de antigeno a APCs e inducción de células T citotóxicas, y este se utiliza como una vacuna contra malaria, tuberculosis, HBV y HIV. AS04 (GSK; MPL, hidróxido de aluminio/fosfato de aluminio) trabaja mediante la activación de MPL de TLR4, el alumbre proporciona un efecto de depósito, inflamación local y el incremento de captación de antigeno por las APCs, y este se utiliza como una vacuna para HBV, HPV, HSV, RSV, y EBV. MPL RC-529 (Dynavax; MPL) trabaja mediante la activación de TLR4 y se utiliza como una vacuna contra HBV. E6020 (Eisa/Sanofi Pasteur; dimero de fosfolipidos sintéticos) trabaja mediante la activación de TLR4. TLR-technology (Vaxinnate; antigeno y flagelina) trabaja mediante la activación de TLR5 y se utiliza en vacunas contra influenza. PF-3512676 (CpG 7909) (Coley/Pfizer/Novartis; oligonucleótidos sintéticos de inmunomodulación) trabaja mediante la activación de TLR9 y se utiliza en vacunas contra HBV, influenza, malaria y ántrax. ISS (Dynavax; secuencia de DNA corta) trabaja mediante la activación de TLR9 y se utiliza en vacunas contra HBV e influenza. IC31 (Intercell; péptido y oligonucleótido) y trabaja mediante la activación de TLR9, la formación de un depósito de sitio de inyección y el aumento de captación de antigeno en APCs y se utiliza como una vacuna contra influenza, tuberculosis, malaria, meningitis, alergia e indicaciones de cáncer.

También se debe entender que la sustancia biológica derivada de célula primaria y combinaciones de adyuvante se puede utilizar para otras indicaciones que aquellas actualmente recomendadas para los adyuvantes anteriores, y especialmente se pueden utilizar para indicaciones para el cáncer como es descrito en la presente. Asi, la combinación de sustancias biológicas derivadas de célula primaria y adyuvante se puede utilizar para aumentar el sistema inmune y tratar cualquiera de las enfermedades indicadas específicamente para los adyuvantes o para cualquier otra enfermedad descrita en la presente.

Además, la presente invención puede incluir la sustancia biológica derivada de célula primaria y otro adyuvante como es descrito en lo anterior que tiene un mecanismo de acción diferente que aquel de la sustancia biológica derivada de célula primaria. La sustancia biológica derivada de célula primaria actúa para efectivamente "activar" el sistema inmune al madurar las células dendriticas inmaduras, estimular la producción de células T nal've, y presentar efectivamente el antigeno a las células T nal've. El mecanismo de acción es además descrito enseguida. Cuando se combina con un adyuvante que actúa sobre otra área del sistema inmune, la sustancia biológica derivada de célula primaria y el adyuvante puede producir una respuesta sinergistica en el sistema inmune al estimular múltiples áreas del sistema inmune a la vez.

La presente invención proporciona un método para tratar cáncer, al administrar la composición descrita en lo anterior que incluye cantidades sinergisticas de la sustancia biológica derivada de célula primaria que incluye las citoquinas IL-1, IL-2, IL-6, IL-8, TNF-a, e IFN-?, y una vacuna de cáncer que comprende por lo menos un antigeno. La composición es efectiva en tratar cáncer debido a que la sustancia biológica derivada de célula primaria y los antigenos interactúan de una manera sinergistica para presentar los antigenos a las células T y activar el sistema inmune. En general, la sustancia biológica derivada de célula primaria actúa para estimular la producción de células T nal've, células dendriticas inmaduras maduras y permite la presentación a las células dendriticas maduras resultantes de los antigenos exógenos en la vacuna de cáncer a las células T naive. El mecanismo de acción es además descrito enseguida. En otras palabras, sin la acción de la sustancia biológica derivada de célula primaria, la vacuna de cáncer no seria tan efectiva en generar inmunidad al cáncer en el paciente debido a que el sistema inmune permanecería suprimido. La etapa de administración se puede lograr como es descrito adicionalmente enseguida, y de preferencia mediante inyección perilinfática una vez al día.

Las células T en el paciente también se pueden coestimular al administrar moléculas co-estimuladoras como es descrito en lo anterior para generar señales no específicas de antígeno a las células T. La inhibición de células T se puede prohibir al administrar anti-CTLA-4 como es descrito en lo anterior con el fin de estimulár adicionalmente las células T como es descrito en lo anterior. Los Tregs se pueden agotar al administrar moléculas agotadoras de Tregs con el fin de reducir adicionalmente la supresión del sistema inmune como es descrito en lo anterior. La inducción y desarrollo continuo de vasos sanguíneos en los tumores se puede prevenir al administrar antígenos asociados con angiogénesis como es descrito en lo anterior. Los agentes que aumentan la potencia se pueden administrar de modo que aumentan en potencia el efecto de los componentes de la composición como es descrito en lo anterior.

El método para tratar cáncer además puede incluir realizar una terapia tal como quimioterapia, radiación, terapia anti-angiogénica y combinaciones de los mismos. Cada una de estas terapias es más efectiva cuando se realiza en combinación con la composición de la presente invención que cuando se realiza sola.

La presente invención también proporciona un método para revertir la supresión inmune y ganar inmunidad al cáncer al administrar la composición descrita en lo anterior que incluye cantidades sinergisticas de la sustancia biológica derivada de célula primaria que incluye las citoquinas IL-I, IL-2, IL-6, IL-8, TNF- , e IFN-?, y una vacuna de cáncer que comprende por lo menos un antígeno, estimular la producción de células T na'i've, madurar las células dendriticas inmaduras y permitir la presentación por las células dendriticas maduras resultantes de los antigenos exógenos en la vacuna de cáncer a las células T na'ive, para de esta manera revertir la supresión inmune y ganar inmunidad al cáncer. En otras palabras, la sustancia biológica derivada de célula primaria y la vacuna de cáncer trabajan conjuntamente con el fin de activar efectivamente el sistema inmune del paciente inmunosuprimido y estimular la inmunidad al cáncer basado en los antigenos exógenos.

Como en el método anterior, las células T en el paciente también pueden ser co-estimuladas al administrar moléculas co-estimuladoras como es descrito en lo anterior para generar señales no especificas de antigeno a las células T. La inhibición de células T se puede prohibir al administrar anti-CTLA-4 como es descrito en lo anterior con el fin de estimular adicionalmente las células T como es descrito en lo anterior. Los Tregs se pueden agotar al administrar moléculas agotadoras de Tregs con el fin de reducir adicionalmente la supresión del sistema inmune como es descrito en lo anterior. La inducción de desarrollo continuo de vasos sanguíneos en tumores se puede prevenir al administrar antígenos asociados con angiogénesis como es descrito en lo anterior. Los agentes que aumentan la potencia se pueden administrar de modo que aumenten la potencia el efecto de los componentes de la composición como es descrito en lo anterior.

El método para revertir la supresión inmune y ganar inmunidad al cáncer además puede incluir realizar una terapia tal como quimioterapia, radiación, terapia anti-angiogénica y combinaciones de los mismos. Cada una de estas terapias es más efectiva cuando se realiza en combinación con la composición de la presente invención que cuando se realiza sola .

La presente invención también proporciona un método para producir una respuesta inmune a un antígeno exógeno en un .paciente, al administrar un adyuvante de una sustancia biológica derivada de célula primaria que incluye las citoquinas IL-1, IL-2, IL-ß, IL-8, TNF- , e IFN-?, y por lo menos ' un antígeno exógeno, en donde el antígeno exógeno normalmente no produce una respuesta inmune, y producir una respuesta inmune en el paciente. Los antigenos exógenos pueden ser cualquiera de aquellos descritos en lo anterior que normalmente no producen una respuesta inmune en un paciente. El Ejemplo 12 muestra que IRX-2 es efectivo en reducir una respuesta inmune con péptidos PSMA que son no normalmente efectivos. Este método además se puede combinar con cualquiera de las etapas o compuestos como es descrito en lo anterior.

La presente invención proporciona un método para aumentar una respuesta inmune en un paciente, al administrar la sustancia biológica derivada de célula primaria que incluye las citoquinas IL-1, IL-2, IL-6, IL-8, TNF-a, e IFN-?, en combinación con por lo menos un adyuvante. La sustancia biológica derivada de célula primaria es descrita en lo anterior. El adyuvante (s) puede ser un adyuvante independiente de TLR, un adyuvante dependiente de TLR, o combinaciones de los mismos. El método luego puede incluir la etapa de suministrar y concentrar antigenos, dirigir los antigenos a las células que presentan antigeno, y colocalizar los antigenos y potenciadores inmunes al administrar un adyuvante independiente de TLR. El método también puede incluir la etapa de estimular directamente el sistema inmune al activar TLRs al administrar un adyuvante dependiente de TLR. Como es descrito en lo anterior, la sustancia biológica derivada de célula primaria actúa sinergisticamente con los otros adyuvantes para estimular más efectivamente el sistema inmune en respuesta a los antigenos. De preferencia, los antigenos exógenos también se administran como es descrito en lo anterior tal como en una vacuna de cáncer. Este método además puede ser combinado o cualquiera de las etapas o compuestos como es descrito en lo anterior. El adyuvante puede tener un mecanismo de acción diferente que la sustancia biológica derivada de célula primaria como es descrito en lo anterior.

La presente invención además proporciona un método para incrementar la función de un sistema inmune al administrar la sustancia biológica derivada de célula primaria que incluye las citoquinas IL-1, IL-2, IL-6, IL-8, TNF-OÍ, e IFN-?, en combinación con por lo menos un adyuvante, en donde el adyuvante tiene un mecanismo de acción que es diferente que el mecanismo de acción de la sustancia biológica derivada de célula primaria, y al incrementar la función de la respuesta inmune. En otras palabras, la sustancia biológica derivada de célula primaria y el adyuvante interactúan sinergisticamente para incrementar la función inmune más allá de lo que resultaría de la sustancia biológica derivada de célula primaria o adyuvante solo debido a que cada componente está "activando" un área diferente del sistema inmune, para producir una respuesta inmune más grande. Este método además se puede combinar con cualquiera de las etapas o compuestos como es descrito en lo anterior. El Mecanismo de Acción de IRX-2 Como se definió en lo anterior, la sustancia biológica derivada de célula primaria de la invención actúa como un adyuvante, es decir, estimula o aumenta la respuesta inmune de un paciente a un antígeno particular. Por otra parte, las composiciones de IRX-2 y métodos de la invención son particularmente adecuados para estimular respuestas inmunes mediadas por célula T. Las respuestas inmunes promovidas por las composiciones y métodos de la invención incluyen la inducción o generación de células T naive, la diferenciación y maduración de células dendriticas, la permisión para la presentación apropiada en el antigeno en las células T (por ejemplo, en los ganglios linfáticos) y la activación de monocitos y macrófagos. Específicamente, en pacientes con cáncer, las respuestas inmunes promovidas por las composiciones y métodos de la invención incluyen la infiltración de tumor por los linfocitos, fragmentación y regresión del tumor así como una reducción en la histiocitosis de seno (cuando está presente) . Esencialmente, la sustancia biológica derivada de célula primaria induce la producción inmune y bloquea la destrucción inmune. El mecanismo de acción de la sustancia biológica derivada de célula primaria es además descrito en la solicitud de patente norteamericana No. 12/323,595 de los solicitantes.

Más específicamente, las composiciones y métodos de la presente invención ayudan a superar la depresión/supresión inmune en pacientes al inducir la producción de células T nal' e. El término células T "na'íve", como se define en la presente, denota células T recientemente producidas, las células T que no se han expuesto al antigeno. Tales células T son no específicas, pero son capaces de llegar a ser específicas en la presentación del antígeno por una célula dendrítrica madura que tiene antígeno, tales como péptidos de tumor, expuestos sobre la misma. Así, las composiciones y métodos de la invención renuevan o generan nuevas células T (ver los Ejemplos 2 y 8 enseguida) .

Además, particularmente en pacientes con cáncer que tienen tumores, las presentes composiciones y métodos permiten la infiltración de linfocito de los tumores con fragmentación y regresión del tumor significante. Ver, por ejemplo, Ejemplos 2-7 enseguida. Tal infiltración es importante con el fin de maximizar la respuesta clínica y para el incremento más grande de la velocidad de supervivencia. Por ejemplo, la infiltración de linfocito : granulocito de linfocito : granulocito o macrófago en una relación de 90:10 es óptima y la infiltración de célula T y/o B es de preferencia difusa e intensa y no periférica. La reducción y fragmentación de tumor en las muestras histológicas refleja una buena respuesta inmune y es indicativa de un efecto de adyuvante por las composiciones de la invención.

Por otra parte, los cambios del ganglio linfático especifico también indican una respuesta inmune efectiva, tal como el agrandamiento de ganglio linfático, es decir, no son la reversión de la reducción de tamaño inducida del tumor sino el incremento total en el tamaño comparado con el tamaño de nodo normal, asi como áreas de célula T y B incrementada. Además, los ganglios linfáticos de pacientes con cáncer frecuentemente contienen una acumulación intrasinusoidal de histiocitosis grande, también llamada histiocitosis de seno (SH) . La SH se cree que es la acumulación de células dendriticas inmaduras, que han ingerido y procesado antigenos de tumor pero son incapaces de madurar y presentar estos péptidos de tumor a las células T naive. Sin la presentación apropiada de antigeno a las células T, estas células T son incapaces de estimular las células efectoras Thl y Th2, la estimulación que normalmente conduce a una inmunidad mediada por la célula y mediada por anticuerpo, respectivamente, en el cuerpo. Como es indicado en los Ejemplos 2-7 enseguida, las composiciones de citoquina y métodos de esta invención redujeron SH en los ganglios linfáticos de los pacientes con cáncer y produjeron los diversos cambios linfáticos descritos en lo anterior, nuevamente indicando un efecto adyuvante por las composiciones de la invención.

Debido a que las células dendriticas se conocen que desempeñan una función clave en la presentación de antigeno en la producción de una respuesta inmune apropiada in vivo, un agente que tiene un efecto estimulador sobre la maduración de células dendriticas actuará como un adyuvante en inducir una buena respuesta inmune a un antigeno. Como es demostrado en el Ejemplo 9 enseguida, las composiciones de citoquina de la presente invención promueven la maduración de célula dendrítica. Además, los datos del Ejemplo 2 demuestran que las composiciones de citoquina de la invención también desbloquean el efecto de célula dendrítica que conduce a SH, es decir, al promover la maduración de DC, y así específicamente, en pacientes con cáncer, las composiciones de la invención proporcionan múltiples efectos adyuvantes, es decir, en desbloquear DCs en SH en los ganglios linfáticos y en promover la maduración de DC generalmente.

Las composiciones de citoquina de la invención también proporcionan un efecto adyuvante adicional al actuar como potentes activadores de monocitos/macrófagos . Los monocitos son precursores a tanto las DCs y macrófagos en el cuerpo y así un agente que promueve la activación de monocito/macrófago tiene un efecto adyuvante sobre las respuestas inmunes in vivo. Ver el Ejemplo 10 enseguida.

La sustancia biológica derivada de célula primaria también bloquea la destrucción inmune al proteger a las células T activadas de la apoptosis. Uno de los mecanismos de escape de tumor involucran la eliminación dirigida de las células T efectoras CD8+ a través de la apoptosis mediada por microvesiculas derivadas de tumor ( V) . La MV inmunosupresora se ha encontrado en lesiones neoplásicas, sueros, ascitis y efusiones pleurales obtenidos de pacientes con cáncer y se han ligado a la apoptosis y las alteraciones de TCR en células T efectoras en estos pacientes. La eliminación inducida por MV de las células T efectoras, que son necesarias para la defensa del hospedero anti-tumoral , contribuye al escape de un tumor y progresión de cáncer. Por lo tanto, la protección de células efectoras antitumorales de deterioros funcionales y la muerte es un objetivo mayor de la terapia inmune. Los datos clínicos y experimentales muestran que ciertas citoquinas, especialmente citoquinas de supervivencia que usan la cadena alfa de receptor común, son capaces de proteger las células T activadas de la muerte inducida por tumor y aumentar su actividad antitumoral.

Más específicamente, hay varias maneras en las cuales la sustancia biológica derivada de célula primaria protege a las células T de la apoptosis. La expresión de las moléculas de señalización anti-apoptótica (es decir, JAK-3 y fosfor-Akt) es regulada hacia arriba y la expresión de moléculas pro-apoptóticas (es decir, SOCS-2) es regulada hacia abajo. La activación de caspasas en linfocitos T CD8+ y CD4+ es disminuida y se incrementa la expresión de cFLIP. La inhibición de las rutas de supervivencia de PI3K/Akt es contrarrestada por IRX-2. Las células T se protegen de tanto la apoptosis extrínseca (apoptosis inducida por MV inducida por FasL) como la apotosis mitocóndrica intrínseca.

La protección de la apoptosis inducida por MV extrínseca es además acompañada al prevenir la regulación hacia debajo de JAK3, 0?3-?, y STAT5; la inhibición de la desfosforilación de Akt-1/2; y el mantenimiento de relaciones balanceadas de Bax/BcI-2, Bax-Bcl-xL, y Bim/McI-1. La protección de la apoptosis inducida por MV también es realizada al prevenir la inducción de actividad de caspasa-3 y caspasa-7. Más específicamente, la inducción de la forma segmentada activa de caspasa-3 bloqueada, como es la* pérdida del potencial de membrana mitocóndrica. Se inhibe la fragmentación de DNA nuclear. La protección de la apoptosis intrínseca de la sustancia biológica derivada de célula primaria se muestra por su protección de las células T activadas de la apoptosis inducida por estaurosporina .

De manera importante, las citoquinas de la sustancia biológica derivada de célula primaria protegen las células T activadas de la apoptosis de una manera sinergística . En otras palabras, la combinación de las citoquinas en la sustancia biológica derivada de célula primaria produce un efecto más grande que se observa al administrar citoquinas individuales solas.

En vista de lo anterior, las composiciones y métodos de la presente invención estimulan el sistema inmune por la vía de múltiples efectos, incluyendo la maduración in vivo de células dendriticas que dan por resultado la presentación de antigeno de péptido efectiva asi como la activación de monocitos y macrófagos y la producción de células T no comprometidas na'ive. La presentación apropiada del antigeno conduce a la expansión clonal de célula T y B, creando inmunidad en el paciente. En el caso de pacientes con cáncer, los efectos notados en lo anterior dan por resultado la infiltración, por ejemplo, de linfocitos, en tumores (por ejemplo por la vía de la dispersión hematógena) y reducción y/o destrucción del tumor. El resultado, como es indicado por los datos enseguida, es la supervivencia incrementada debido a la memoria inmunológica (ver, por ejemplo, Ejemplo 3 enseguida) .

Para cualquiera de las modalidades anteriores, lo siguiente detalla la administración y/o protocolos para el tratamiento que son utilizados: De preferencia, la composición de citoquina de la presente invención se inyecta alrededor del sistema linfático que drena en los ganglios linfáticos regionales a una lesión, tal como un tumor u otras lesiones persistentes que son tratadas. Más específicamente, las inyecciones perilinfáticas locales u otras inyecciones que son conocidas para aquellos de habilidad en la técnica se administran para proporcionar localización suficiente de la preparación de inmunoterapia . En el caso de cáncer de cabeza y cuello, las inyecciones serán en el cuello, pero se pueden aplicar en otras localizaciones como sea requerido por la enfermedad que es tratada. Tal tratamiento indujo regresiones clínicas en un alto porcentaje de pacientes de cáncer de cabeza y cuello, quienes también mostraron supervivencia libre de recurrencia mejorada (Hadden, 1994; Meneses, 1998; Barrera, 2000; Whiteside, 1993) . En contraste, la inyección intratumoral de interleucina-2 recombinante en pacientes de cáncer de cabeza y cuello (Whiteside, y colaboradores, (Cáncer Res. 53:5654- 5662, 1993) ) produjo un infiltrado de linfocito de célula T, pero nada de .respuestas clínicas dignificantes. De manera similar, la inyección peritumoral de Multikine (Celsci Website) en combinación con la inyección perilinfática dio ¦ por resultado respuestas de tumor significante (es decir, mayor que 50% de reducción de tumor) en solamente 11 pacientes, haciendo su velocidad de respuesta menor que 10%. Además, la inyección peritumoral e intratumoral puede ser asociado con la progresión de la enfermedad, aun en pacientes quienes inicialmente han tenido una respuesta positiva al protocolo de citoquina, así sin hacer su beneficio. La inyección peritumoral o intratumoral es de esta manera contraindicada .

Un esquema de inyección de diez (10) días para la administración de las composiciones de la invención es preferido, pero un protocolo de inyección de veinte (20) días se puede utilizar. Las inyecciones bilaterales son efectivas. Donde ha ocurrido disección del cuello radical, la inyección contralateral es efectiva.

En la modalidad en donde un antigeno exógeno va a ser utilizado, los antigenos sintéticos o extraídos exogenamente proporcionados tal como el antígeno de tumor y péptido (ver Bellone, 1998) se puede administrar en el ganglio linfático regional o distal pre-cebado o co-cebado, ya sea en una preparación separada o como parte de la composición de citoquina de la invención.

La supresión endógena de células T, que puede ser causada por, por ejemplo, cáncer u otras enfermedades inmunosupresoras, se puede bloquear mediante la coadministración de baja dosis de ciclofosfamida (CY) y un fármaco antiinflamatorio no esferoidal (NSAID) (es decir, en combinación con las composiciones de citoquina de la invención) . El NSAID es de preferencia indometacina (INDO) pero ibuprofen o inhibidores de CoxII tales como celecoxib (CELEBREX®) o rofecoxib (VIOXX®) o combinaciones de los mismos también se pueden utilizar. Los efectos secundarios de los NSAIDS se pueden tratar agresivamente con inhibidores de protón y análogos de prostaglandina E. El zinc y multivitaminas , posiblemente incluyendo la adición de selenio, también se pueden adicionar como agentes para ayudar a restaurar la inmunidad de la célula T. De preferencia, la dosis de zinc es de 15 a 75 mg. Una multivitamina estándar se puede administrar. El zinc puede ser un gluconato disponible.

Las composiciones de citoquina de la invención se pueden administrar antes de o después de la cirugía, radioterapia, quimioterapia o combinaciones de las mismas. Las composiciones de la invención se pueden administrar durante la recurrencia de tumores, es decir, durante un periodo durante el crecimiento de tumor está ocurriendo nuevamente después de un período donde los tumores se cree que han desaparecido o estuvieron en remisión.

Las composiciones de citoquina de la presente invención se administran y se dosifican para promover la inmunización óptima ya sea al antígeno exógeno o endógeno, tomando en cuenta la condición clínica del paciente individual, el sitio y método de administración, programación de administración, edad del paciente, sexo y peso corporal. La "cantidad farmacéuticamente efectiva" para propósitos en la presente así es determinada por tales consideraciones como son conocidas en la técnica. La cantidad debe ser efectiva para promover la inmunización, conduciendo a, por ejemplo, la reducción de tumor, fragmentación de tumor e infiltración de leucocito, recurrencia retardada o velocidad de supervivencia mejorada, o mejora o eliminación de los síntomas, incluyendo conteos de células T incrementados.

En los métodos de la presente invención, las composiciones de la presente invención se pueden administrar de varias maneras. Se debe observar que las citoquinas o antígenos exógenos utilizados en las composiciones de la invención se pueden administrar en sus formas estándares o como derivados farmacéuticamente aceptables y se pueden administrar solos o como ingredientes activos en combinación con portadores, diluyentes, adyuvantes y vehículos farmacéuticamente aceptables. Además, las composiciones de la invención se pueden administrar intra- o subcutáneamente, o peri- o intralinfáticamente, intranodalmente o intrasplénicamente o intramuscularmente , intraperitonealmente e intratorásicamente . El paciente que es tratado es un animal de sangre caliente y, en particular, mamíferos incluyendo el hombre. Los portadores, diluyentes, adyuvantes y vehículos farmacéuticamente aceptables así como portadores de implante generalmente se refieren a rellenadores sólidos o líquidos no tóxicos, inertes, diluyentes o material encapsulante que no reacciona con los ingredientes activos de la invención.

La dosis pueden ser dosis individuales o dosis múltiples durante un período de varios días. Cuando se administran las composiciones de la presente invención, ellas generalmente se formulan en una forma inyectable de dosificación unitaria (por ejemplo, solución, suspensión o emulsión) . Las formulaciones farmacéuticas adecuadas para inyección incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para las reconstituciones, soluciones o dispersiones inyectables estériles. El portador puede ser un solvente o medio dispersante que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, polietilenglicol liquido y los similares), mezclas adecuadas de los mismos, o aceites vegetales.

La fluidez apropiada puede ser mantenida, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y mediante el uso de surfactantes . Los vehículos no acuosos tales como un aceite de semilla de algodón, aceite de ajonjolí, aceite de olivo, aceite de soja, aceite de maíz, aceite de girasol o aceite de cacahuate y ésteres, tal como miristato de isopropilo, también se pueden utilizar como sistemas de solvente para las composiciones de la invención. Adicionalmente, varios aditivos que aumentan la estabilidad, esterilidad e isotonicidad de las composiciones, incluyendo conservadores antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes y soluciones reguladoras se pueden adicional. La prevención de la acción de los microorganismos se puede asegurar mediante varios agentes antibacterianos y antifungales , por ejemplo, parabenos, clorobutanol , fenol, ácido sórbico y los similares. En muchos casos, es deseable incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, cloruro de sodio y los similares. La absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable se puede originar mediante el uso de agentes que retardan la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina. De acuerdo con la presente invención, sin embargo, cualquier vehículo, diluyente o aditivo utilizado tendría que ser compatible con las citoquinas o antígenos exógenos de la invención.

Las soluciones inyectables estériles se pueden preparar al incorporar las citoquinas o antígenos exógenos utilizados en la práctica de la presente invención en la cantidad requerida del solvente apropiado con varios de los otros ingredientes, como sea deseado.

Una formulación farmacológica de la presente invención se puede administrar al paciente en una formulación inyectable que contiene cualquier portador compatible, tales como varios vehículos, aditivos y diluyentes; o las citoquinas y/o antígenos exógenos utilizados en la presente invención se pueden administrar parenteralmente al paciente en la forma de implante subcutáneo de liberación lenta o sistemas de suministro dirigido tales como anticuerpos monoclonales, suministro vectorizado, iontoforético, matrices poliméricas, liposomas y microesferas . Ejemplos de sistemas de suministro útiles en la presente invención incluyen aquellos divulgados en las patentes norteamericanas Nos. 5,225,182; 5,169,383; 5,167,616; 4,959,217; 4,925,678; 4,487,603; 4,486,194; 4,447,233; 4,447,224; 4,439,196; y 4,475,196. Muchos de otros de tales implantes, sistemas de suministro y módulos son bien conocidos para aquellos expertos en la técnica.

Debe ser evidente que las composiciones y métodos de la invención son útiles para el tratamiento de enfermedades que producen antigeno tal como cáncer, enfermedades infecciosas o lesiones persistentes, como es discutido en lo anterior. Las composiciones y métodos promueven la inmunización contra los antigenos producidos por estas enfermedades al estimular respuestas inmunes en pacientes in vivo, las respuestas inmunes que ayudan a aliviar o eliminar los síntomas y efectos de la enfermedad en el paciente.

La discusión anterior proporciona una base real para el uso de la presente invención. Las composiciones y métodos de la invención para uso en las utilidades divulgadas en la presente se pueden mostrar mediante los siguientes ejemplos no limitantes y figuras acompañantes.

Los ejemplos expuestos enseguida describen la preparación de IRX-2, una mezcla de citoquina de acuerdo con esta invención, datos de experimentos clínicos que demuestran el uso de IRX-2 como un adyuvante con antígenos de tumor endógenos para estimular las respuestas inmunes en pacientes con cáncer así como experimentos en ratones y humanos que demuestran el uso de la mezcla de citoquina de la invención con antígenos exógenos para estimular respuestas inmunes in vivo .

Más específicamente, el Ejemplo 1 enseguida describe la producción de IRX-2, una composición de citoquina de acuerdo con la presente invención. La producción de IRX-2 se divulga completamente en las patentes norteamericanas Nos. 5,632,983 y 5,698,194, que son incorporadas en la presente por referencia.

El Ejemplo 2 enseguida divulga los datos del experimento clínico en donde los pacientes H&N SCC tratados con IRX-2 (en combinad 'n con baja dosis de ciclofosfamida (CY) , indometacina (INDO) y zinc) exhibieron respuestas clínicas patológica significantes incluyendo cambios nodales que indican la inmunización (por ejemplo, incrementos en el tamaño del nodo y disminución de histiocitosis de seno) , infiltración de tumor con linfocitos, y reducción y fragmentación del tumor. Los Ejemplos 4-7 se relaciona a pacientes de cáncer adicional, es decir, con linfoma, cáncer cervical, cáncer de hígado y carcinoma de célula escamosa del pene (virus de papiloma humano asociado), todos los cuales se trataron con el IRX-2 de la invención y quienes mostraron respuestas clínicas significantes al tratamiento. El Ejemplo 3 proporciona datos que consideraron la supervivencia incrementada (hasta 2 años) de los pacientes de cáncer de estos estudios.

Como se demostró en el Ejemplo 2, el tratamiento con IRX-2 también produjo incrementos marcados en los conteos e linfocito T en pacientes linfocitopénicos y un incremento correspondiente a las células T naive (células T recientemente producidas no expuestas al antígeno) . Además, como es indicado por los datos del Ejemplo 8 enseguida, los incrementos en las células T observados en estos estudios fue específicamente debido al tratamiento con la composición de citoquina de la invención. Más específicamente, el Ejemplo 8 proporciona datos del tratamiento de los pacientes de cáncer H&N SCC linfocitopénicos con solamente IRX-2 (sin la administración acompañante de CY y/o INDO) , en donde incrementos significantes en los conteos de linfocitos totales así como su población de subconjuntos de célula T CD3+ y CD4+ específicos se obtuvieron.

De manera similar, los datos del Ejemplo 9 demuestran que IRX-2 promueven la diferenciación y maduración de células dendríticas como es medido por los criterios morfológicos, fenotípicos y funcionales. Como es mencionado en lo anterior, las células dendriticas (DCs) se conocen que desempeñan una función critica en la inmunización de pacientes a antigenos, es decir, al presentar el antigeno a la célula T apropiada. Más específicamente, el Ejemplo 9 demuestra que IRX-2 promueve los cambios morfológicos en DCs indicativo de maduración. IRX-2 también se mostró que regula hacia abajo la expresión de antígeno CD1 sobre la superficie de la célula DC, para regular hacia arriba CD83 y la expresión de antígeno MHCII sobre la superficie de célula DC, y para incrementar la expresión de las moléculas co-estimuladoras y de adhesión de célula T, por ejemplo CD86, D40, y CD54 (ICAM-1), sobre la superficie de célula DC. Además, IRX-2 se mostró que regula hacia abajo la actividad endocítica de la DCs (que es consistente con la maduración de las DCs), para aumentar la actividad estimuladora de célula T de las DCs (como es demostrado por la actividad de MLR incrementada) y para incrementar la producción de IL-12 de las DCs, IL-12 por si misma que es un factor esencial en la diferenciación de las células T ayudantes CD4 + nal' e (células Thl) y la activación y proliferación de componentes celulares y fagocíticos del sistema inmune. Finalmente, IRX-2 se mostró que reduce la apoptosis inducida por VEGF de las DCs. Este efecto antiapoptótico de IRX-2 puede desempeñar una función crucial en mantener la supervivencia de las DCs maduras dentro de una instalación de tumor, permitiendo la presentación y activación de antigeno prolongada de los linfocitos T citotóxicos específicos de antígeno de tumor.

Los datos del Ejemplo 10 enseguida demuestran además que IRX-2 es un potente activador de monocitos y macrófagos. Por ejemplo, IRX-2 significativamente incrementa los marcadores de activación de monocitos/macrófagos, es decir, HLA-DR, CD86, CD40 y CD80. Además, el IRX-2 se mostró que es un activador más fuerte de monocitos/macrófagos que TNF- o LPS y el IRX-2 fue capaz de continuar activando las células aun en la presencia de la citoquina inmunosupresora IL-10.

El Ejemplo 11 enseguida demuestra la habilidad de IRX-2 para inducir respuestas inmunes, es decir, en la forma de las respuestas DTH así como respuestas de anticuerpo, en ratones después de la administración de la composición de citoquina en combinación con conjugados de antígeno de péptido de membrana específicos de próstata exógena (PSMA) . El IRX-2 también fue efectivo en estimular la respuesta DTH a los péptidos PSMA no conjugados en humanos con cáncer de próstata avanzado.

El Ejemplo 12 enseguida además demuestra la efectividad de IRX-2 en combinación con el antígeno exógeno PSMA. Además, IRX-2 se administró en combinación con una vacuna de base celular que expresa PSMA irradiada o una vacuna de conjugado de péptido sintética fue capaz de aumentar las respuestas inmunes de célula T in vivo a estos antígenos .

El Ejemplo 13 enseguida además demuestra la efectividad de IRX-2 en combinación con péptidos e el adyuvante de Fruend Incompleto en aumentar las respuestas inmunes de célula T in vivo a estos antigenos. Los resultados de los experimentos muestran que "IRX-2 se pueden combinar efectivamente con vacunas de cáncer de multi-antiagente asi como vacunas basadas en células.

El Ejemplo 14 enseguida además demuestra la efectividad de IRX-2 en combinación con otros adyuvantes que incluyen CpG's, Poly I:C, IFN-? y el adyuvante de Fruend Incompleto. Además, IRX-2, en combinación con estos otros adyuvantes, fue capaz de aumentar la respuesta de célula T específica de antígeno in vivo y la actividad citotóxica de las células T especificas de antígeno. IRX-2, cuando se incluyó como parte de una vacuna que incluyó CpG's, Poly I:C, IFN-? y adyuvante de Fruend Incompleto fue efectivo cuando se da como un solo disparo en aumentar las respuestas de célula T específicas de antígeno.

El Ejemplo 15 enseguida además demuestra la efectividad de IRX-2 en aumentar las respuestas de célula B y de célula T en combinación con una vacuna de base viral. Además, IRX-2 aumenta la respuesta de célula B y de célula T cuando se utiliza en combinación con una vacuna de base viral que expresa el trivalente TRICO de moléculas coestimuladoras .

EJEMPLOS Todas las etapas relacionadas con el cultivo de células se realizan bajo condiciones estériles. Los métodos generales de inmunología celular no descritos en la presente se realizan como es descrito en referencias generales para técnicas de inmunología celular tal como Mishell y Shiigi (Selected Met ods in Cellular Immunology, 1981) y son bien conocidos para aquellos de habilidad en la técnica.

Ejemplo 1 Preparación de la Sustancia Biológica Derivada de Célula Primaria (IRX-2) El método para hacer la sustancia biológica derivada de célula primaria es generalmente descrito en la solicitud de patente provisional norteamericana No. 61/044,674. Las células mononucleares (MNCs) se purifican para remover las células contaminantes al cargar leucocitos sobre el medio de separación de linfocito (LSM) y al centrifugar el medio para obtener MNCs purificadas con un sistema de procesamiento y lavado de células automatizado. Las MNCs luego se almacenan durante la noche en una bolsa de almacenamiento de linfocito FEP. Una mezcla de inducción de las MNCs se estimula con un mitógeno, de preferencia fitohemaglutinina (PHA), y ciprofloxacina en un dispositivo de cultivo de célula desechable y una sustancia biológica derivada de célula primaria se produce de las MNCs. El mitógeno se remueve de la mezcla de inducción al filtrar y en modo de filtración y flujo tangencial, y luego se incuba la mezcla de inducción. La mezcla de inducción se clarifica mediante filtración para obtener un sobrenadante biológico derivado de célula primaria. Finalmente, el sobrenadante biológico derivado de célula primaria se clarifica del DNA y los agentes adventicios al aplicar la cromatografía de intercambio aniónico y la filtración de 15 nanómetros y opcionalmente además la inactivación mediante ultravioleta-C (UVC) . El producto final luego puede ser colocado en frasquitos y almacenado para la administración futura a un paciente .

Ejemplo 2 Las inyecciones perilinfáticas locales en el cuello con IRX-2 además del tratamiento con baja dosis de CY (300 mg/m2) , INDO (25 mg oralmente tres veces al día) y zinc (65 mg de zinc elemental como el sulfato oralmente una vez al día) han inducido regresiones clínicas en un alto porcentaje de pacientes con cáncer de cabeza y cuello de célula escamosa (H&NSCC) (Hadden, 1994; Meneses, 1998; Barrera, 2000; Hadden, 2003; Menesis, 20C3) con la evidencia de supervivencia libre de recurrencia mejorada. En conjunto, incluyendo las respuestas menores (25%-50%), la contracción del tumor y reducción del tumor en muestras patológicas, arriba de 90% respondieron y la mayoría tuvo mayor que 50% de reducción de tumor .

Estas respuestas se especula que son mediadas por la regresión inmune puesto que ambos linfocitos B y T se observaron que infiltran los tumores. La terapia no fue asociada con toxicidad significante. El tratamiento de pacientes de cáncer linfocitopénico con la combinación de IRX-2 ha dado por resultado la movilización de linfocito marcada; donde se analizó, estos pacientes mostraron incrementos en las células T positivas de CD45RA (es decir, células T na'íve (ver la Tabla I enseguida) ) . Además, la inyección intratumoral o peritumoral de IRX-2 en pacientes con H&NSCC dio por resultado la regresión del tumor inducida por la inmunoterapia de reversión, o la progresión del tumor. El tumor de esta manera no el sitio de inmunización. Más bien, el análisis de los ganglios linfáticos regionales reveló que el ganglio linfático regional es el sitio de inmunización a los antígenos de tumor postulados (Meneses, 2003; ver las Figuras 1-5) . Ninguno de estos pacientes tratados con IRX-2 desarrolló metástasis que habría sido esperada en 15% de los pacientes clínicamente y hasta 50% patológicamente. Estos resultados indican que la inmunidad sistémica más bien inmunidad meramente local se ha inducido. Los pacientes se pre-probaron con una prueba de piel de 0.1 mi de IRX-2 antes del tratamiento y más de 90% de esos con una prueba de piel positiva (>0.3 mm en 24 horas) tuvieron respuestas clínicas y patológicas robustas. Los pacientes con pruebas de piel negativas tuvieron débiles o nada de respuestas. Así, 'la prueba de piel selecciona buenos respondedores .

Los incrementos mayores se observaron en los conteos de linfocito T (CD3) 752->1020 en estos pacientes linfocitopénicos T (conteos de célula T 752 vs . 1600 (normal) ) . De manera importante, hubo un incremento correspondiente en las células T positivas CD45RA "nai've" (532->782). Como se mencionó previamente, estos incrementos generalmente no se cree que ocurran en adultos particularmente con una terapia farmacológica similares IRX-2. Estas células presumiblemente son emigrados químicos recientes y podrían ser considerados una nueva capacidad mayor para responder a nuevos antígenos similares a antígenos de tumor. Las células positivas CD45RA persistentes no estuvieron respondiendo a los antígenos de tumor y pueden ser incapaces de hacerlo así debido a la supresión inmune inducida por tumor (anergia) .

Tabla I : Tratamiento de pacientes Linfocitopénicos con H&NSCC con IRX-2 se Incrementa en Células T Na'i e en la Sangre (#/mm) MARCADOR DE CÉLULA T NAIVE MARCADOR DE CÉLULA T PAN PATIENT # PRE POST INCREMENTO PRE POST INCREMENTO 1 479 778 +299 704 1171 +467 2 938 1309 +371 1364 1249 -115 3 98 139 +41 146 178 +32 4 341 438 +97 655 590 -65 5 567 652 +97 453 643 +190 6 658 1058 +400 1118 1714 +569 7 642 1101 +459 822 1601 +779 MEDIA 532 782 +250 752 1020 +269 La literatura (Hadden JW, Int' 1 J Immunopharmacol 11/12:629-644, 1997; Hadden JW, Int'l J Immunopharmacol 21:79-101, 1999) indica que tanto para SCC y adenocarcinomas , los dos tipos mayores de cáncer, los ganglios linfáticos regionales reflejan anormalidades relacionadas con el tumor, incluyendo histiocitosis de seno, agotamiento linfoide y frecuentemente la presencia de linfocitos asociados con tumor capaces de reaccionar con las células de tumor (con IL-2). Con la metástasis, ocurre la función de agotamiento de linfoide y disminuida. Un análisis no publicado de ganglios linfáticos cervicales no involucrados en 10 pacientes H&NSCC mostró reducción en el tamaño del ganglio linfático promedio y un incremento en la histiocitosis de seno asociada con H&NSCC (ver los controles de las Figuras 1-4A y B de la presente solicitud) .

Después del tratamiento con un ciclo del protocolo de IRX-2 (Hadden, 1994; Meneses, 1998; Barrera, 2000), los ganglios linfáticos cervicales no involucrados mostraron los cambios indicados en las Figuras 1-4. Comparado con los ganglios linfáticos regionales de pacientes con H&NSCC no tratados con IRX-2, estos ganglios mostraron un incremento significante en el tamaño, área de célula T y densidad, y disminuciones en la histiocitosis de seno y la congestión. Los ganglios linfáticos de pacientes tratados todos se estimularon en formas grandes que los ganglios de control con área de célula T incrementada y densidad. Estos ganglios asi no solamente se restauraron anormales sino mostraron evidencia de predominancia de célula T, una correlación positiva conocida con una supervivencia en H&NSCC (Hadden, 1997) . ' De manera importante, cuando el ganglio linfático cambia las áreas de célula B y T relacionadas se correlacionaron con los cambios en sus tumores reflejando la infiltración de célula T y B, un alto grado de correlación se obtuvo para las células T (p.<0.01) y células B (<0.01) y la presencia linfoide total (p.<0.001) (Figura 5). A su vez, estos cambios' se correlacionaron con la reducción de tumor por criterios patológicos y clínicos. Estos descubrimientos indican que las reacciones de tumor son directamente y positivamente relacionadas con los cambios de ganglio linfático y que la reacción de tumor refleja los cambios de ganglio linfático como la variable dependiente. Estos descubrimientos, tomados en conjunción con el conocimiento de acerca de cómo el sistema inmune trabaja en general (Roitt, 1989) , y después de la transfección de tumor con un gen de histoquina (Maass, 1995) , indican que el protocolo de IRX-2 inmuniza a estos pacientes a antigenos de tumor endógenos a nivel de los ganglios linfáticos. Nadie ha presentado previamente evidencia de que los cambios de ganglio linfático decretan la inmunización con antigenos de tumor autólogos. Esto confirma que la presente invención puede inducir inmunización con antigenos de tumor previamente ineficaz y probablemente efectivos en un efecto para producir regresión de metástasis distante.

Ejemplo 3 El análisis adicional de los datos clínicos, patológicos y de supervivencia del estudio de experimento clínico mencionado en lo anterior, ofrece más discernimiento en la naturaleza de la invención como se relaciona la inmunización de pacientes de cáncer a sus propios antígenos de tumor autólogos y la regresión inmune resultante de estos tumores. La Figura 6 muestra que el tratamiento con el protocolo de IRX-2 está asociado con la supervivencia incrementada en 48 meses (p<0.01) . La Figura 7 muestra que las respuestas clínicas positivas se correlacionan con la supervivencia, es decir, a pacientes con respuestas completas (CR) o respuestas parciales (PR) (> 50% de reducción de tumor) tiene una mejor supervivencia que aquellos con respuestas menores (MR) (<50%, pero >25% de reducción de tumor) o nada de respuestas (NR) (<25%) (p<0.01). La Figura 8 muestra que los pacientes con respuestas patológicas más fuertes (índice de 6-9) tiene una mejor supervivencia que aquellos con respuestas patológicas más débiles (<6) (p<0.02). La Figura 9 muestra que la infiltración linfoide en el tumor como una sola variable predice la supervivencia (p<0.01). El análisis Chi Cuadrado de la relación de la respuesta clínica a la respuesta patológica muestra una relación altamente significante (p<0.01) implicando que los dos se correlacionan entre sí así como con la supervivencia, proporcionando de esta manera una triangulación estadística de los datos que interrelacionan las respuestas clínicas, parámetros de regresión inmunes y supervivencia. Tales relaciones nunca se han mostrado para la inmunoterapia de un cáncer humano.

Finalmente, la Figura 10 presenta una cuerva de dosis respuesta para el IRX-2 de la presente invención, relacionada con la dosis a la supervivencia total en veinticuatro meses. El tratamiento de IRX-2 tiene un impacto óptimo en la supervivencia de aproximadamente 100-233 unidades internacionales de equivalencia de IL-2.

Ejemplo 4 Dos pacientes con linfoma de la cabeza y cuello se trataron de acuerdo con el protocolo como es descrito en lo anterior. El siguiente esquema fue seguido.

Antes del tratamiento, los paciente se probaron en la piel con IRX-2 en 0.1 mi inyectado subcutáneamente en el antebrazo, la región se marcó, y 24 horas después, la prueba se leyó. La prueba se consideró positiva si la inducción de eritema fue igual o más grande que 3 ram.

Caso 1: El paciente fue un masculino de 23 años quien se presentó con una historia previa de una presencia de tres meses de un tumor sobre la región submaxilar izquierda, sin otros síntomas. En el cuarto de emergencia, él se encontró que tiene adenopatia linfática del triángulo submaxilar izquierdo de aproximadamente 6.5 cm en diámetro de una consistencia dura, parcialmente fijado en niveles profundos. El resto del examen físico fue normal. La biopsia incisional mostró linfoma de Hodgkin. La lesión se planteó en etapa de ECHA. Un tratamiento de un ciclo de IRX-2 se dio, obteniendo una respuesta menor, ya que la adenopatia se redujo en tamaño por 1 cm en diámetro. El reporte de biopsia obtenido después del tratamiento de IRX-2 mostró 60% de la lesión que mostró infiltración linfocítica normal, y el resto de la neoplasia (40%) mostró necrosis. No se encontraron células de tumor fiables .

Después de esto, el paciente recibió tratamiento de radiación en el cuello de 3600 rads . El paciente estuvo lire de enfermedad en dos años.

Caso 2: El paciente es un masculino de 82 años, quien se presentó con una historia de dos meses de una masa de tumor del cuello medio dolorosa, asi como una pérdida de peso de 10 kg. En el examen físico, el paciente se presentó con tumor en la amígdala de la palatina izquierda que se agrandó a aproximadamente 4 X 3 cm, con una úlcera en el centro de la amígdala. En el cuello, un ganglio linfático submaxilar derecho medía aproximadamente 2 X 2 cm y una masa de ganglio linfático en el nivel II y III de aproximadamente 5 X 5 cm. El resto del examen fue normal. La biopsia incisional de la amígdala y uno de los ganglios linfáticos del cuello demostró linfoma no de Hodgkin definido mezclado, de grado intermedio.

El paciente se sometió a dos ciclos de IRX-2 al final del cual con una reducción de 1 cm en el diámetro de la amígdala y la adenopatía del cuello se observó. El reporte patológico del tratamiento de post-IRX-2 mostró 20% de tumor vivo, 30% de fragmentación de tumor y necrosis, y 50% infiltración de linfocito normal.

Al paciente se le dio quimioterapia (CHOP) durante 6 ciclos y después de la radioterapia externa (RT) en una dosis total de 4600 rads. El recurrió en ocho meses de post RT con adenomegalia en el nivel occipital. El paciente murió tres meses después con evidencia de enfermedad del cuello.

Ejemplo 5 Diez pacientes con cáncer cervical de etapa temprana no tratado, clínicamente en etapa de 1B1, IB2 y IIA, se trataron con inyecciones perilinfáticas locales de IRX-2 (10 inyecciones diarias) seguido por la histerectomía radical en el día 21. Un día antes de iniciar el tratamiento con IRX-2, los pacientes recibieron una sola dosis IV de CY en 300 mg/m. INDO oral o ibuprofen y sulfato de zinc se administraron de los días 1 a 21. La respuesta clínica y patológica, toxicidad y supervivencia libre de enfermedad se evaluaron .

Todos los pacientes completaron el tratamiento de IRX-2 y se evaluaron para la respuesta y toxicidad. La respuesta clínica se observó en 50% de pacientes (3 respuesta parcial (PR), 2 respuestas menores (MR) (>25% <50% de reducción)) . Siete pacientes se sometieron a cirugía. Patológicamente, la reducción del tumor asociado con la fragmentación del tumor se encontró en cinco casos. Hubo un patrón heterogéneo de tipos de células que infiltran el tumor, que incluyó linfocitos, células de plasma, neutrófilos, macrófagos y eosinófilos. El tratamiento fue bien tolerado excepto para el dolor leve y menor sangrado durante la inyección y la intolerancia gástrica de INDO. En 24 meses de seguimiento, nueve pacientes estuvieron libres de enfermedad .

Este estudio muestra que el" tratamiento de IRX-2 induce la respuesta de tumor inmunomediada en el carcinoma cervical no tratado de etapa temprana.

Ejemplo 6 Dos pacientes con metástasis de hígado de carcinoma hepatocelular primario se trataron con IRX-2 intraesplénico (1 o 3 inyecciones) . El protocolo fue como es previamente descrito para los casos H&NSCC, cervical o de linforna. Un paciente con carcinoma hepatocelular avanzado tuvo una respuesta parcial confirmada por la tomografía. El otro tuvo una respuesta parcial confirmada por cirugía. El examen histológico de reducción del tumor, fragmentación e infiltración linfoide.

Ejemplo 7 Cuatro pacientes con carcinoma de célula escamosa del pene (virus de papiloma humano asociado) se trataron con el protocolo de IRX-2 como es descrito en lo anterior; todos los cuatro tuvieron respuestas parciales clínicamente y las muestras quirúrgicas mostraron reducción de tumor y fragmentación e infiltración linfoide característico de los pacientes de cáncer H&N SCC Ejemplo 8 Corrección mediante IRX-2 de T linfocitopenia El objetivo del siguiente experimento fue estimar el efecto del tratamiento de inyección de 10 días de IRX-2 que contiene las seis citoquinas de IL-1, IL-2, IL-6, IL-8, IFN-? y TNF-a (115 unidades de equivalencia de IL-2/dia) sobre los conteos de linfocito (LC) de pacientes linfocitopénicos . Estos pacientes se han recuperado de la cirugía previa y la radioterapia para el cáncer de cabeza y cuello, y tuvieron linfocitopenia persistente con conteos medios de 441 células/mm3. Niveles normales de LC son 2000 células/mm3. Los pacientes estuvieron libres de cáncer en el momento del tratamiento. LC se obtuvieron en el día 0 y día 13. Los linfocitos T (CD3+) y subconjuntos de célula T (CD4+ o CD8+ ) se estimaron mediante citofluorometría . La Tabla II presente los datos para cinco pacientes respondientes . Los incrementos significantes se observaron para las células T LC, CD3+ , y CD4 + .

Tabla II Número Pt . TLC* CD3* CD4* CD8* 1 100 83 28 40 2 136 62 52 55 3 100 63 24 3 4 100 74 331 -20 5 100 166 173 -16 Media ± SEM 107 ± 7 90 ± 19 122 ± 59 12 ± 15 * Cambios en el número de células por mm3 del día 0 a día Estos cambios se comparan favorablemente a aquellos logrados por dosis mucho más altas de interleucina pegilada 2 (3 x 106 unidades de IL-2 recombinante) en pacientes de SIDA linfocitopénicos (T. Merigan, personal communication) pero con menos toxicidad. Ellos son menores que aquellos logrados con infusiones de 8 dias de > 10 x 106 unidades/día de IL-2 en pacientes con SIDA; sin embargo, el último gran costo requerido, inconveniencia y tuvo toxicidad insignificante (Kovaks, 1997). Estos resultados con IRX-2 se obtuvieron en la ausencia de INDO y CY y asi muestran que el efecto del régimen sobre LC es aquel de la composición de IRX-2 de la invención .

Ejemplo 9 IRX-2 Estimula la Maduración y Activación de Célula Dendritica : En experimentos previos, los ganglios linfáticos de cinco pacientes H&NSCC tratados con IRX-2 y cinco pacientes de control H&NSCC no tratados se aislaron y los constituyentes celulares se analizaron mediante citometria de flujo utilizando un panel de marcadores de superficie celular para células dendriticas (es decir, CD83+, CD86+, y CD68+) . Como es mencionado en lo anterior, la histiocitosis de seno es una patología de ganglio linfático observada en algunos pacientes de cáncer que se caracterizan por la acumulación en los ganglios linfáticos de histiocitos grandes que representan células dendriticas inmaduras. Como es demostrado en la Figura 11A, los pacientes con SH (SH+) tienen una acumulación de CD68+, CD83+, CD86- DCs en sus ganglios linfáticos, mientras que aquellos sin SH notable tienen pocas células CD83+. Sin embargo, el tratamiento de IRX-2 dio por resultado cinco veces el incremento en el número de CD86+ (concomitante con CD68+, CD83+) DCs comparados con los controles de cáncer no tratados, indicando una conversión o un fenotipo de DC "activado". Los controles son pacientes H&NSCC no tratados comparados con pacientes de cáncer tratados con IRX-2 (ver la Figura 11 B) .

Puesto que la histiocitosis de seno representa una acumulación de DCs parcialmente maduradas que se presume que son llevadas por los péptidos de tumor endógenos, la maduración y la activación completa, con la expresión del receptor co-estimulador CD86 refleja el uso de IRX-2 de la presente invención para corregir este defecto en la maduración y para permitir la presentación de antigeno efectiva a las células T. El IRX-2 de la presente invención asi revierte la histiocitosis de seno y conduce a la inmunización efectiva de las células T nal- ve.

Los datos descritos en lo anterior y los datos subsecuentes contenidos en Meneses y colaboradores, (2003) mostraron que el tratamiento de pacientes con H&NSCC utilizando IRX-2 perilinfático, baja dosis de CY, e INDO revirtieron la histiocitosis de seno frecuentemente evidente en los ganglios linfáticos en este y otros cánceres. Sin embargo, no fue evidente de estos datos que de los agentes anteriores, IRX-2, CY, y/o INDO, corrigieron este defecto.

Los siguientes datos presentan evidencia de que IRX-2 que contiene las seis citoquinas de IL-1, IL-2, IL-6, IL-8, IFN-?, y TNF-OÍ induce la maduración de DC y la activación en la ausencia de CY y/o INDO. El IRX-2 utilizado en estos experimentos contiene las seis citoquinas listadas en lo anterior o como se muestra en la Tabla III enseguida. Para el propósito de estos experimentos, las concentraciones de IRX-2 se expresan como la concentración de TNF-a contenida en IRX-2. La concentración de citoquina en IRX-2, incluyendo TNF- , se midió mediante ELISA y la pureza de TNF-OÍ recombinante es >95%. Para todos los experimentos, excepto las titulaciones, IRX-2 se utilizó en una concentración de 1 ng/ml .

Tabla III : Niveles de citoquina en la formulación de IRX-2 Lote 041304 (ng/ml) F |SF El medio utilizado fue RPMI 1640, suplementado con 2 mM de L-glutamina, 50 pg/ml de estreptomicina, 50 U/ml de penicilina y FBS al 10% (todos los reactivos comprados de Cellgro, Herndon, VA) . GM-CSF, TNF-a y VEGF165 se compraron de Peprotech (Rocky Hill, NJ) . X-VIVO 10 se compró de BioWhittaker ( alkersville, MD) . LPS se compró de Sigma (St.

Louis, ?) . Tocos los reactivos se probaron para la contaminación de endotoxina con el ensayo de lisado de amebocito de Limulus sensible (ensayo LAL; BioWhittaker ) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se encontraron que son negativos. Todas las soluciones se encontraron que contienen menos de 0.06 EU/ml, el limite de detección más bajo. Adicionalmente, todos los utensilios de plástico estuvieron libres de pirógeno.

Las PBMCs utilizadas en este experimento se obtuvieron de 30 mi de linfa cuajada enriquecida de leucocito de donadores sanos mediante centrifugación con la centrifugación de Ficoll-Hypaque (Cellgro, Herndon, VA) , y la fracción de densidad ligera de la interfase de 42.5-50% se recuperó. Las células se resuspendieron en el medio cultivo y se dejaron adherir a placas de 6 cavidades (Costar, Cambridge, MA) . Después de 2 horas a 370°C, las células no adherentes se removieron mediante lavado y las células adherentes (~90% células CD14+, es decir, monocitos) se cultivaron en 3 mi del medio suplementado con 50 ng/ml de GM-CSF (500 U/ml) y 50 ng/ml de IL-4 (500 U/ml) .

Para el análisis de marcador de superficie, los siguientes mAbs conjugados con fluorocromo (todos de BD Pharmingen, San Diego, CA) se utilizaron: CD86-PE, CD80-FITC, CD54-APC, CD83-PE, HLA-DR-FITC, CDI a-APC, CD40-FITC y los controles de isotipo apropiados. El análisis inmunofenotipico se realizó usando FACS. Las células (0.25x106) se lavaron en PBS suplementado con FBS al 2% y NaN3 al 0.1% (solución reguladora de lavado FACS) y se incubaron durante 30 min a temperatura ambiente con mAbs conjugados con APC-, PE-, o FITC o con el mAb igualado en isotipo correspondiente. El mAb en exceso se removió mediante lavado en solución reguladora de lavado FACS. Los resultados se expresaron ya sea como la intensidad de fluorescencia media o el porcentaje de células que expresan el antigeno especificado. El análisis de fluorescencia se realizó en un citómetro de flujo FACSCalibur (BD Biosciences, Rockville, MD) después de la adquisición de 10,000 eventos y se analizó con el software BD Biosciences CellQuest (Rockville, MD)'.

Como es demostrado en la Figura 12, la composición de IRX-2 de la invención incrementó el número de DCs que llevan el antigeno CD83, un marcador clave de la maduración de DC. Más específicamente, las PBMCs adherentes se cultivaron durante 7 días en la presencia de GM-CSF e IL-4 como es descrito en lo anterior y luego se estimularon con cantidades incrementadas de ya sea TNF-a recombinante (PeproTech) o IRX-2. Después de 48 hrs, las células se lavaron y se analizaron para la expresión de CD83 mediante la citometría de flujo. La Figura 12 indica que IRX-2 es activo en inducir la maduración de DC, como es evidenciado por un incremento en la célula CD83+. Por otra parte, IRX-2 fue más activo en inducir la maduración de DC que una dosis equivalente de TNF-a sola. Los datos en la Figura 12 se representan como la media de 5 experimentos individuales -/+ SEM (p<0.0001, por ANOVA) .

Estos datos indican que IRX-2 promueve la maduración de DCs y lo hace de una manera que no puede ser tomada en cuenta para cualquier citoquina individual contenida en la mezcla de IRX-2 que se conoce que actúa en la maduración de DC. Por ejemplo, la diferenciación in vitro normal de PBMCs requiere la presencia de 100-500 U/ml de GM-CS F (aproximadamente 10-50 ng/ml) y 500-1000 U/ml de I L-4 (50-100 ng/ml) . Esto genera una población de células comprometidas con el linaje DC pero en un estado relativamente inmaduro (CD86 ba o/moderado, CD40, expresión HLA-DR, nulo para CD83) . IRX-2 no diluido tiene cantidades indetectables de I L-4 y contiene concentraciones menores de 10 a 50 veces de GM-CSF (aproximadamente 1.1 ng/ml) que se requiere para la diferenciación in vitro de DCs. Asi, las citoquinas individuales IL-4 y GM-CSF en el IRX-2 no se pueden tener en cuenta para las células CD83+ producidas en los cultivos de la Figura .12.

TN F-OÍ puede inducir tales células pero en concentraciones muy por arriba de aquellas contenidas en el IRX-2 de la invención (ver la Figura 12). Por ejemplo, después del sometimiento inicial al linaje de célula dendritica (por varios días de GM-CSF + IL-4 in vitro) , la adición subsecuente de una "señal de peligro" tal como aquella derivada de un patógeno (por ejemplo, LPS) induce un fenotipo de célula dendritica completamente madura que incluye alta/fuerte expresión de CD86, CD40, HLA-DR, y la presencia de CD83. TNF-a en el intervalo de 20-50 ng/ml puede imitar grandemente la señal de peligro derivada de patógeno dando por resultado la regulación hacia arriba de los mismos marcadores.- Sin embargo, la mezcla de IRX-2 no diluida tiene solamente 2.8 ng/ml de TNF-a en promedio, muy por abajo de la concentración de TNF-a requeridas para la maduración de DC complete. Asi, los resultados representados en la Figura 12 claramente demuestran que, en las concentraciones equivalentes de TNF-a utilizadas en este experimento, la inducción del marcador CD83 por I RX-2 no podría ser debido solamente a la presencia del TNF-a en la mezcla de I RX-2.

Puesto que es conocido que las DCs se someten a distintos cambios morfológicos a medida que progresa de células inmaduras a maduras, las DCs inmaduras se trataron con I RX-2 para determinar si el tratamiento de IRX-2 cambió la morfología de las células. Más específicamente, las PBMCs adherentes se cultivaron en la presencia de GM-CSF (500U/ml) y IL-4 (500 U/ml) durante 4 días como es descrito en lo anterior (el tratamiento que es conocido que produce DCs inmadura) y luego se trató con ya sea I RX-2 o se dejó sin tratar como controles. Después de 3 días, las células se visualizaron mediante el manchado de Wright y la microscopía. Como se muestra en la Figura 13, las células tratadas con IRX-2 (Figura 13B) exhibieron las proyecciones celulares características y motilidad de las DCs maduras, y continuamente se extendieron y se retrajeron sus procesos celulares y velos. Estas células tuvieron núcleos de forma irregular grandes, numerosas vesículas, relativamente pocos gránulos citoplásmicos , y proyecciones celulares notables y abundantes como es comparado con los controles no tratados (Figura 13A) . Así, el tratamiento de IRX-2 dio por resultado DCs que presentaron morfología de DC Madura típica.

Además, es conocido que la transición prototípica de las DCs inmaduras a maduras da por resultado incrementos y disminuciones bien caracterizados en ciertos antígenos de superficie de célula. Por ejemplo, las DCs inmaduras expresan altos niveles de CDla, y en el encuentro con estímulos tales como citoquinas o productos bacterianos, este marcador se regula hacia abajo. Así, para determinar si el tratamiento de IRX-2 dio por resultado la ganancia o pérdida de marcadores de superficie de célula asociados con la activación y maduración de DCs, las PBMCs (monocitos) adherentes tratados con GM-CSF e IL-4 (como es descrito en lo anterior) se cultivaron durante 7 días y luego se incubaron durante 48 hrs con o sin IRX-2. La expresión de CDla, HLA-DR, CD86, CD40 y CD54 se examinó mediante citometría de flujo y se expresó como la intensidad de fluorescencia media.

Como es demostrado por los histogramas de la Figura 14, el tratamiento de IRX-2 de las DCs inmaduras (indicado por lineas sólidas en los histogramas) dio por resultado la regulación hacia debajo de la expresión CDla (147 vs . 62) asi como la regulación hacia arriba de la expresión MHCII (455 vs . 662) . Además, el tratamiento de IRX-2 condujo un incremento en el tamaño de célula y una disminución en la granularidad (datos no mostrados) . Los controles no tratados se indican por lineas de guiones en cada histograma. Los valores medios para las DCs no tratadas se muestran en la esquina superior izquierda de los paneles; los ' valores respectivos para DCs tratadas con IRX-2 se muestran en la esquina superior derecha. Los histogramas mostrados son de un experimento representativo y los valores representan resultados medios de por lo menos 10 experimentos individuales (*=p<0.05, **=p<0.002, ***=p<0.00005, prueba t del Estudiante emparejada) . Como es indicado además por la Figura 14, el tratamiento de IRX-2 aumentó la expresión de las moléculas de superficie co-estimuladoras CD86 (también conocida como B7-2) (193 vs . 390) , CD40 (46 vs. 75), y CD54 (también conocida como molécula de adhesión intracelular 1 o ICAM-1) (1840 vs . 3779) . Todos estos cambios en la expresión de marcador de superficie indican que el IRX-2 de la invención es un potente efector de la activación de DC.

Consistente con su función como células que presentan antigeno, las DCs inmaduras tienen una alta actividad endocitica y activamente captan antigenos. En la maduración, esta actividad regulada hacia abajo, después de lo cual el DC es acoplado en el procesamiento y presentación de antigeno. Bajo condiciones fisiológicas, la regulación hacia abajo de la endocitosis de APC está asociada con un incremento en los complejos de péptido/MHC sobre la superficie conduciendo a estimulación aumentada de las células T. Para probar la influencia de IRX-2 sobre la endocitosis, las DCs se incubaron con cantidades incrementadas de IRX-2 y la capacidad para internalizar FITC dextrano se determinó. Más específicamente, las PBMCs (monocitos) adherentes se trataron con G -CSF e IL-4 (como es descrito en lo anterior) durante cuatro días y luego se estimularon con TNF-a (1 µg/ml) o con concentraciones incrementadas de IRX-2 (IRX-2) hasta el equivalente de 1 ng/ml de TNF-a. Después de 18 hrs, las células se incubaron con FITC-Dextrano (Sigma, St . Louis, MO) , que se adicionó a una concentración final de 1 mg/ml. Las células se cultivaron durante 30 min a 370°C. Después de la incubación, las células se lavaron cuatro veces con PBS enfriado con hielo y se analizaron mediante la citometría de flujo como es descrito en lo anterior.

Como se muestra en la Figura 15, las DCs inmaduras incubadas con IRX-2 (circulo cerrado) regularon hacia abajo la endocitosis de una manera dependiente de la dosis. El tratamiento de TNF-a (circuios abiertos) en la dosis correspondiente encontrada en el IRX-2 tuvo efectos mínimos. El tratamiento de las DCs inmaduras con cantidades más altas de TNF-a (10-25 ng/ml) dio por resultado la regulación hacia abajo de la actividad endocítica como es esperado (datos no mostrados) . Los datos de la Figura 15 se muestran como el porcentaje de intensidad de fluorescencia media de las DCs estimuladas contra las no estimuladas y son la media de 4 experimentos independientes -/+ SEM (p<0.00001, por ANOVA) . Estos experimentos indican que el IRX-2 de la invención regulan hacia abajo la actividad endocítica de las DCs, una indicación de maduración de DC.

Enseguida, se evaluó la habilidad de IRX-2 para aumentar la capacidad estimuladora de célula T de las DCs. Las DCs maduras, activadas, son estimuladores potentes de células T nal've. Con el fin de mostrar de que el tratamiento de IRX-2 se tradujo en efectos funcionales así como los cambios fenotípicos y morfológicos mencionados en lo anterior, la influencia de IRX-2 sobre la capacidad estimuladora de célula T de las DCs se estimó en un ensayo de proliferación de reacción de linfocito mezclado (MLR) .

Más específicamente, las PBMCs (monocitos) adherentes primero se trataron con GM-CSF e IL-4 (como es descrito en lo anterior) durante siete dias y luego se estimularon con o, sin IRX-2. Después de 48 hrs, las DCs tratadas con IRX-2 o no tratadas se recolectaron y se analizaron en un MLR como sigue: las DCs purificadas se co-cultivaron con 1 x 105 células T de un donador no relacionado en relaciones de células DC:T de 1:5, 1:10, 1:30, y 1:100. Las células Talogenéicas se prepararon al correr PBMCs purificados de linfas cuajadas mediante la centrifugación de gradiente de Ficoll-Hypaque sobre una columna de lana de nylon. Los ensayos se realizaron por triplicado en placas de 96 cavidades de fondo redondo. Nada de IRX-2 estuvo presente durante el ensayo de MLR. Después de 5 días del co-cultivo de DC-célula T, las cavidades se pulsaron durante 18 horas con BrDU. La incorporación de BrDU se midió utilizando un ensayo de incorporación de BrDU colorimétrico (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) .

Como se muestra en la Figura 16, las DCs expuestas a IRX-2 (cuadros cerrados) dos días antes del co-cultivo fueron más potentes en inducir una respuesta de proliferación de célula T que la DCs no tratada (círculos abiertos), confirmando que las DCs tratadas con IRX-2 son funcionalmente competentes. Los datos en la Figura 16 se expresan como índice de estimulación que se define como ((o.d. de célula T estimulada de DC-o.d. de DC sola) /o.d. de célula T en reposo) -/+ SEM y son el resultado medio de 4 experimentos individuales (p<0.05, por ANOVA) .

Es importante observar que no hubo IRX-2 en los co-cultivos y el incremento observado en la estimulación de célula T fue debido a los' efectos estimuladores de IRX-2 sobre las DCs, antes que un efecto directo de IRX-2 sobre las células T. Asi, el IRX-2 de la invención aumentan la actividad estimuladora de célula T de las DCs como es mostrado por la proliferación aumentada en reacciones MLR alogénicas. Por otra parte, IRX-2 se mostró anteriormente que incrementa la expresión de ICAM-1 (CD54). Este ligando de accesorio de superficie de célula se ha mostrado que está involucrado en la señalización a través de LFA-1 y da por resultado una desviación hacia un fenotipo Thl (Rogers, 2000) . En una instalación de cáncer, la consecuencia funcional de estos efectos es que las DCs tratadas con IRX-2 polarizarían la respuesta de célula T hacia un fenotipo Thl y favorecería la activación de la actividad de CTL específica de tumor, promoviendo de esta manera el rechazo de tumor.

Los datos de los inventores también demuestran que IRX-2 estimula la producción de IL-12 de las DCs. IL-12 es una citoquina polarizante Thl potente secretada por las DCs en respuesta a patógenos durante la infección. Sin embargo, una de las funciones más importantes de las DCs es mediar el rechazo de tumor es estimular de manera efectiva y eficientemente las respuestas de célula T anti-tumor desviadas de Thl y una de las citoquinas criticas en dirigir estas respuesta es IL-12. IL-12 se produce mediante las DCs activadas y son factor esencial involucrado en la diferenciación de células T ayudantes CD4+ nal' ve en células TH1. Las células Thl secretan IFN-? e IL-2 y estas citoquinas junto con IL-12 median la activación y proliferación de componentes celulares y fagociticos del sistema inmune, tales como linfocitos T citotóxicos CD8+ ( (CTL) .

Para determinar si IRX-2 puede inducir la producción de IL-12 en DCs, monocitos cultivados con G -CSF/IL-4 se estimularon con IRX-2 durante 18 horas y .se ensayaron para la producción de IL-12 p70 intracelular . Más específicamente, las PBMCs adherentes se cultivaron durante 4 días en GM-CSF e IL-4 (como es descrito en lo anterior) y luego se trataron con o sin IRX-2 o LPS durante 18 horas. Brefeldin A (BFA; 10 µ?/p??; Sigma, St . Louis, MO) se adicionó durante las últimas 4 horas para acumular la mayoría de las citoquinas del complejo de Golgi . Las células se fijaron y se permeabilizaron utilizando Fix y Perm (Caltag, Burlingame, CA) , de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y luego se marcaron con mAb marcado con FITC contra IL-12 p70 (BD Pharmingen, San Diego, CA) o el control de isotipo apropiado (BD Pharmingen, San Diego, CA) . Las células se analizaron mediante la citometría de flujo.

Como se muestra en la Figura 17A, IRX-2 incrementó el porcentaje de DCs que produce IL-12 de 4.5% positive a 22.5% en promedio. LPS, un estimulador de producción de IL-12 en DCs, se utilizó como un control positivo y dio niveles similares de inducción con relación a IRX-2 (27% ± 11) . Los datos de la Figura 17A son la media de 4 experimentos independientes y se expresan como el porcentaje de células que manchan positivamente para IL-12 -/+ SEM (prueba t del Estudiante p< 0.05). Para confirmar que la producción intracelular incrementada de IL-12 correspondió a la secreción incrementada de IL-12 bioactiva, la concentración de IL-12 bioactiva en el sobrenadante de DCs tratadas con IRX-2 (cultivadas inicialmente durante 4 días con GM-CSF e IL-4 como es descrito en lo anterior e incubadas con IRX-2 durante 48 hrs) se midió utilizando un equipo de ELISA comercial (R&D Systems, Minneapolis, MN) que detecta el heterodimero p70 bioactivo. Asi, como se muestra en la Figura 17B, 48 horas después de la exposición a IRX-2, los sobrenadantes de DC contuvieron significativamente más IL-12 bioactiva que las DCs tratadas de control. Los datos de la Figura 17B son la media (-/+ SEM) de 6 experimentos independientes (p<0.05, prueba t del Estudiante).

Finalmente, los datos de los inventores indicaron que IRX-2 reduce la apoptosis inducida por VEGF en DCs. VEGF es un inhibidor de maduración de DC y se ha mostrado que incrementa los niveles de apoptosis en DCs de maduración. Para determinar si IRX-2 fue capaz de mitigar los efectos de VEGF, las DCs se trataron como VEGF con o sin IRX-2 y el nivel de apoptosis se determinó mediante el enlace de Annexina-FITC V. Más específicamente, las PBMCs adherentes se trataron con GM-CSF e IL-4 durante 7 días y luego se incubaron en la presencia o ausencia de VEGF (100 ng/ml) con o sin IRX-2 (1:3) durante 2 días adicionales. Las células se recolectaron y levaron 2 veces en PBS enfriado con hielo y se resuspendieron en solución reguladora de enlace de Annexina (BD Pharmingen, San Diego, CA) . Annexina-V FITC (BD Pharmingen, San Diego, CA) y yoduro de propidio se adicionó y las células se incubaron a 4°C durante 30 minutos. Las células se analizaron mediante la citometria de flujo.

Como se muestra en la Figura 18, los niveles de apoptosis incrementados en las células tratadas con VEGF como es comparado con los controles; sin embargo, IRX-2 redujo el nivel de apoptosis en las células tratadas con VEGF. Los datos de la Figura 18 son el resultado de 4 experimentos independientes y se expresa como el porcentaje de células que manchan positivamente para Annexina V-FITC (-/+ SEM) . Los datos sugieren que, además de su capacidad estimuladora, IRX-2 también tiene un efecto protector sobre las DCs maduras. Por otra parte, la función de DC defectuosa y en número se puede mediar en parte por la expresión de VEGF aberrante por el tumor (Gabrilovich, 1996b; Saito, 1999; Takahashi, 2004). La producción de VEGF por los tumors se mostró que es un predictor para la pobre prognosis en varios cánceres que incluyen H&NSCC, cáncer de pulmón, cáncer gástrico, y osteosarcoma (Gallo, 2001; Kaya, 2000; Miyake, 1992; Saito, 1998; Smith, 2000) . Los datos contenidos en la presente indican que IRX-2 puede revertir la apoptosis mediada por VEG F de las DC s , promoviendo de esta manera la supervivencia de DCs maduras con un ambiente de tumor y permitiendo, la presentación de antigeno prolongada y activación de linfocitos T citotóxicos específicos de antígeno de tumor.

Los estudios previos con DCs han empleado muestras de citoquina naturales tales como el medio acondicionado de monocito ( MCM ) o mezclas de citoquinas inflamatorias recombinantes que contienen TNF- , IL-?ß, IL-6, y PGE2 para madurar DCs para el uso en vacunas de cáncer basadas en DC generadas ex vivo (Romani, 1996; Bender, 1996; Sorg, 2003). Una diferencia crítica entre IRX-2 y las mezclas de citoquina utilizadas en otros estudios es que el nivel de citoquinas utilizadas en este estudio fueron 10-100 veces menores, sugiriendo un sinergismo significante entre los componentes de citoquina únicos de IRX-2. Además, hay problemas significantes involucrados en el uso de DCs madurados por estas y otras mezclas. Por ejemplo, las DCs maduradas en la presencia de TNF-a, IL-1 ß, IL-6, y PGE2 tienen baja o ausente producción de IL-12 y si se activan inadecuadamente, pueden ser tolerogénicas (Steinman, 2002; Langenkamp, 2000). Adicionalmente, hay una preocupación de que las DCs completamente maduras generadas in vivo podrían ser "agotadas" e incapaces de cebar eficientemente una respuesta de célula T efectiva (Kalinski, 2001). Los niveles bajos de respuestas clínicas observados en los pacientes tratados con DCs maduradas por el método ex vivo conduce al soporte de estas preocupaciones (HoltI, 2002; Schuler-Thurner, 2002; Thurner, 1999) .

La evidencia presentada en la presente confirma que IRX-2 es un potente activador de células dendríticas. Estos datos combinados con los efectos conocidos de IRX-2 sobre células T (Hadden, 1995b) sugiere que IRX-2 es capaz de superar los defectos de APC y de célula T encontrados en pacientes de cáncer y proporciona una explicación mecanistica para los efectos clínicos exitosos observados en los experimentos clínicos del solicitante. Mientras que las DCs ahora se reconocen como desempeñadores centrales en la inmunoterapia dirigida al cáncer, está llegando a ser cada vez más claro que la manipulación de elementos individuales del sistema inmune individualmente, por ejemplo, la estrategia de vacunación de célula T específicas de tumor o la reintroducción de DCs pulsadas de antígeno de tumor solas, no logra producir mejoras clínicas significantes para pacientes (Ridgway, 2003; Rosenberg, 2004) . Un plan de tratamiento más benéfico puede ser aumentado actividades de varios tipos de células de coordinación concomitantemente, por ejemplo, células T y DCs, permitiendo interacciones de refuerzo y una mejor probabilidad de que las cascadas funcionales se perpetúen antes que se bloqueen por las estrategias inmunosupresoras de varios tumores. En esta instalación, el IRX-2 de la invención puede estar actuando para estimular tanto las DCs endógenas cargadas con antigenos de tumor como las células T citotóxicas especificas de antigeno de tumor, dando por resultado una respuesta inmune efectiva y el rechazo de tumor. Tomados conjuntamente, estos resultados indican que la composición de citoquina de la presente invención puede ser una herramienta clínica poderosa para inducir una respuesta inmune contra los antígenos de tumor endógenos o podría ser utilizada en conjunción con antígenos de tumor exógenamente adicionados en una instalación de vacuna de cáncer.

Ejemplo 10 IRX-2 Estimula la Activación de Monocito/Macrófago El IRX-2 de la invención que contiene las citoquinas IL-1, IL-2, IL-6, IL-8, IFN-?, y TNF-OÍ también es un potente activador de monocitos/macrófagos . Más específicamente, las PBMCs adherentes (-90% monocitos) se cultivaron durante la noche en el medio X-VIVO 10 (BioWhittaker Bioproducts ) , se estimularon durante 24 hr con IRX-2 (en una concentración final de 1:3) y se ensayaron para la expresión de varios marcadores de activación típicamente encontrados en macrófagos activados mediante citometría de flujo. Como un control, las células se incubaron durante 24 hr en el medio que carece de IRX-2. Como es demostrado en la Figura 19, el tratamiento de las células con IRX-2 contra citoquinas no adicionadas produjo un incremento estadístico en el porcentaje de células que manchan positivamente (Figura 19A) y un incremento en el índice de fluorescencia media ( FI) (Figura 19B) para HLA-CR, CD86, CD40 y CD80, todos los marcadores de activación de monocitos/macrófagos (p<.03). Los datos mostrados en la Figura 19 representan el valor medio +/- SEM para tres experimentos/donadores independientes.

Además, se encontró que IRX-2 de la invención activa los monocitos a un grado más grande que TNF- . Más específicamente, las PBMCs adherentes se estimularon con ya sea IRX-2 (IRX-2) (a una concentración final de 1:3, aproximadamente 1 ng/ml de TNF-OÍ) O TNF-a (10 ng/ml) y se ensayaron para la expresión de marcadores de activación mediante la citometría de flujo. Como es mostrado en la Figura 20, IRX-2 indujo la expresión estadísticamente más grande de HLA-DR, CD86, CD40 y CD80 que TNF-a (p<.03). Los datos mostrados en la Figura 20 representan el valor medio +/- SEM para tres experimentos/donadores independientes.

De manera similar, los estudios realizados utilizando LPS en dosis moderadas (activación pero no máxima) también indicó que IRX-2 fue una señal de activación comparativamente más fuerte. Más específicamente, las PBMCs adherentes se estimularon en la ausencia o presencia de IL-10 (5 ng/ml) con ya sea IRX-2 (IRX-2) (a una concentración final de 1:3) o LPS (10 ng/ml) y se ensayaron para la expresión de marcadores de activación mediante citometría de flujo. Como se muestra en la Figura 21, IRX-2 causó un incremento más grande en la expresión de los marcadores de maduración de monocito/macrófago HLA-DR, CD86, y CD40 que LPS. Por otra parte, en la presencia de la citoquina inmunosupresora como IL-10, el IRX-2 fue todavía capaz de estimular los monocitos, mientras que LPS no logró hacerlo (p<.02) . Los datos mostrados en la Figura 21 representa el valor medio +/- SEM para tres experimentos/donadores independientes.

Finalmente, es conocido que los monocitos secretan TNF-OÍ en respuesta a señales de activación, la secreción que está asociada con la actividad de exterminación específica de los monocitos/macrófagos . Los datos mostrados en la Figura 22 demuestran que el IRX-2 de la invención estimula la producción de TNF-a de los monocitos y supera los efectos inmunosupresores de IL-10. Más específicamente, las PBMCs adherentes se estimularon en la ausencia o presencia de IL-10 (5 ng/ml) con ya sea IRX-2 (IRX-2) (a una concentración final de 1:3) o LPS (10 ng/ml) y se ensayaron para la producción de TN F-OÍ mediante el manchado intracelular y la citometria de flujo. Como se muestra en la Figura 22, IRX-2 causó un incremento más grande en la producción de TNF- que LPS o los controles. En la presencia de IL-10, el IRX-2 fue todavía capaz de estimular los monocitos para producir TN F-a, mientras que LPS no fue por más tiempo capaz de hacerlo (p<.05). Los datos mostrados en la Figura 22 representa el valor medio +/- SEM de cinco experimentos/donadores independientes.

Ejemplo 11 Los experimentos detallados enseguida demuestran la habilidad de la composición de IRX-2 de la invención para actuar en combinación con antígenos exógenos para inducir una respuesta inmune mejorada (tanto celular como basada en anticuerpos) contra el antígeno en ratones.

Administración de antígenos de tumor exógenos Ratones : El procedimiento fue inmunizar ratones con los péptidos de antígéno de membrana específicos de próstata (PSMA) basados en epítopes de célula T predichos de PSMA (LLH &ALF) (100 g@) se conjugaron a ya sea ovalbúmina (OVA) o Hemocianina de Lapa de Punta (KLH) . Varios intentos con péptidos no conjugados aislados no fueron exitosos en ratones. IRX-2 (0.1 mi) se dio como una sola inmunización con ambos antígenos conjugados, producidos por baja dosis de CY (400 g/ratón) y seguido por 9 inyecciones diarias de IRX-2 (0.1 mi) sin antigenos, mientras que CpG, alumbre, o adyuvantes de RIBI-Corixa fueron una sola inmunización primaria con el conjugado OVA. Dos inmunizaciones de refuerzo (conjugado más adyuvante como en lo anterior) se dieron en el dia 21 y 28 a cada grupo de ratones. La reacción de DTH a los péptidos de célula T se midió 9 días después del refuerzo final y el suero se tomó en el sacrificio en los días 15-21.

La Figura 23 muestra los resultados de DTH a la prueba de piel de ratones, usando los péptidos individuales ALF y LLH (10 ug@) , es decir, sin conjugado, como la estimulación de antigeno. Como es indicado por la Figura, IRX-2 induce respuestas de DTH significantes a los antigenos después de la inmunización con ambos conjugados y también cuando se da con alumbre para el conjugado OVA. Alumbre, RIBI-Corixa, y CpG mostraron actividad insignificante.

Resultados de Anticuerpo de Suero El suero se diluyó como es indicado y se adicionaron a las cavidades de una microplaca recubierta con ya sea péptidos (ALF o LLH) u ovalbúmina. Los resultados se expresan como la OD promedio en 405 para 5 grupos de ratones. Los datos se presentan en la Tabla IV enseguida.

Nás específicamente, los ratones inmunizados con el conjugado KLH en combinación con IRX-2 fueron negativos para anticuerpos de ovalbumina, pero positivos para los péptidos. Los ratones inmunizados con los conjugados OVA e IRX-2 fueron positives para los anticuerpos para tanto OVA como los péptidos, mientras que aquellos inmunizados con el conjugado OVA + CpG fueron positivos para OVA solamente. Estos resultados indican que IRX-2 actúa como un adyuvante en aumentar la habilidad de los péptidos PSMA conjugados para estimular ambas de las respuestas DTH e IgG especificas para los péptidos, mientras que los otros adyuvantes similares a alumbre, RIBI-Corixa, y CpG fueron inactivos o pobremente activos .

Tabla IVA : IgG de Suero al Péptido ALF Dilución IRX-2 OVA-PSMA IRX-: 2 KLH-PSMA-IRX-2 OVA-PSMA-CpG 1/200 0.929 0.692 0 .241 1/400 0.989 0.518 0 .208 1/800 0.695 0.351 0 .144 1/1600 0.309 0.191 0 .120 Tabla IVB : IgG de Suero al Péptido LLH 1/200 0.950 0.720 0 .277 1/400 1.013 0.502 0 .200 1/800 0.607 0.327 0 .157 1/1600 0.316 0.201 0 .125 Tabla IVC : IgG de Suero a Ovalbumina 1/500 0.920 0.269 1 .050 1/1500 0.632 0.185 0.955 1/3000 0.457 · 0.146 0.813 1/6000 0.259 0.104 0.537 Experimentos adicionales se realizaron para confirmar los resultados anteriores y para demostrar que la composición de IRX-2 de la invención aumenta las respuestas inmunes especificas de célula T en ratones tanto jóvenes como viejos. En los experimentos descritos enseguida, se utilizaron los siguientes métodos y materiales: Reactivos: Péptidos de Antigeno de Membrana Específicos de Próstata (Péptido 1: Leu-Leu-His-Glu-Thr-Asp-Ser-Ala-Val (SEQ ID N0:1)); Péptido 2: Ala-Leu-Phe-Asp-Ile-Glu-Ser-Lys-Val (SEQ ID NO:2)) se sintetizaron mediante BioSynthesis Inc. (Lewisville, Tx) . Ovalbúmina y ciclofosfamida se obtuvieron de Sigma y KLH de Pierce Biochemicals . El sistema de adyuvante RIBI (R-700), también llamado RAS, se compró de Corixa y el alumbre (40 mg/ml cada uno de hidróxido de aluminio e hidróxido de magnesio) se compraron de Pierce Chemicals. RAS consistió de Monofosforil Lipido A (0.5 mg) y Trehalosa Dicorinomicolato sintético (0.5 mg) , y 44 µ? de Escualeno y Tween-80. Los oligonucleótidos de CpG (secuencia específica de ratón) se sintetizaron mediante BioSynthesis. La secuencia de CpG fue TCCATGACGTTCCTGACGTT (SEQ ID NO: 3) y fue el derivado de fosfot ionato . La bioactividad de CpG en el ratón se confirmó al medir la proliferación de las células de bazo de ratón y la producción de TNF-a mediante las células adherentes de ratón (datos no mostrados).

IRX-2 (también referido en la presente como IRX-2) es una mezcla definida de citoquinas producidas durante un periodo de 24 hr después de la estimulación de las células mononucleares de sangre periférica humana por PHA y ciprofloxacina . El PHA se remueve antes de la recolección del sobrenadante que contiene las citoquinas. Dos etapas de remoción de virus incluyen el procesamiento subsecuente (intercambio iónico y nanofiltración doble) . La prueba de QC severa que incluye tanto el bioensayo y la determinación de ELISA de los niveles de citoquina aseguran la consistencia del IRX-2 (IRX-2). La prueba de seguridad con respecto a la esterilidad, DNA, micoplasma, endotoxina y la prueba de virus para CMV y EBV también son parte del proceso. Varios lotes de IRX-2 se utilizaron durante el curso de estos estudios. El nivel de un número de citoquinas contenidas en los lotes IRX-2 (IRX-2) se listan en la Tabla V enseguida. En la Tabla, * representa el nivel de citoquina medio para los 5 lotes de IRX-2 utilizados en estos studios y ** representan niveles no medidos en todos los lotes pero el lote más reciente solamente. Las citoquinas adicionales presentes en intervalos de pg/ml incluyen G-CSF, IL-12, e IL-10. No se presentan citoquinas de desviación de Th2 típicas tales como IL-3, IL- 4, IL-5, IL-7 e IFN-a. Cuando dos lotes se probaron en el mismo experimento, ellos fueron siempre similares en actividad (datos no mostrados).

Tabla V: Niveles de Citoquina en IRX-2 ¦ Conjugación De Péptidos de Antigeno: Los péptidos 1 y 2 descritos en lo anterior se conjugaron con una molécula portadora tal como los portadores de ovalbúmina o KLH como es descrito en lo anterior. Ambos péptidos se conjugaron con cada portador, es decir, como un solo agente. Por ejemplo, el conjugado OVA-PSMA o conjugado KLH-PSMA utilizados en estos estudios contuvieron- ambos péptidos enlazados a la molécula portadora. Los péptidos se conjugaron a los portadores respectivos utilizando el método de carbodiimida (ODC; equipo de Pierce EDC 77502, Rockford, III). En estudios anteriores, glutaraldehído (Sigma, St. Louis, Mo) se utilizó pero no hubo diferencia en la inmunogenicidad entre los dos métodos (datos no mostrados), así el acoplamiento de carbodiimida se seleccionó para estudios subsecuentes como el método más controlado. La conjugación se caracterizó al medir OD 280 y 215 en fracciones de una columna de purificación de Sephadex. El pico de 280 OD de las columnas representa el conjugado de ovalbúmina o KLH y se recolectó como el conjugado. La dosificación se basó en la concentración del portador como es recuperado de la columna. El monitoreo en 215 mostró un pico de cola que representa los péptidos libres y proporciona la confirmación de que el péptido en exceso estuvo presente durante el procedimiento de conjugación.

Inmunización : Ratones Balb/c se compraron de ya sea Charles River o Harían y estuvieron bajo el cuidado de la instalación de Animales Cold Spring Harbor (CSHL) . Todos los procedimientos fueron aprobados por el comité ALAC del CSHL. En varios experimentos, ciclofosfamida (400 o 2000 g/100 µ?, IP) se inyectó tres días antes del tratamiento de IRX-2. Estudios subsecuentes demostraron que la ciclofosfamida no tuvo efectos estadísticamente significantes sobre la mejora de IRX-2 (IRX-2) de la respuesta en ratones (datos no mostrados). Las inmunizaciones se realizaron como sigue: 200 µ?/ratón que contiene 100 pg de conjugado de PSMA con 100 µ? de adyuvante, por ejemplo, IRX-2 o alumbre, o PBS se inyectaron subcutáneamente en la base de la cola para proporcionar el drenado rápido a los ganglios linfáticos regionales. Nueve inyecciones adicionales de IRX-2 (100 µ? = 6-8 IU de equivalencia de IL-2) siempre seguido por la inmunización primaria (en los días 2, 3, 4, 5, 8, 9, 10, 11, y 12) . Distinto al alumbre o RIBI, aun inyecciones repetidas de IRX-2 (IRX-2) en el mismo sitio no dio por resultado inflamación significante en el sitio (observación no publicada) . Dos inmunizaciones de refuerzo con conjugado más adyuvante (en el día 14 y 28) se realizaron antes de estimar la actividad de DTH. IRX-2 adicional no se dio en las inmunizaciones de refuerzo.

En los estudios de adyuvante comparativo en ratones jóvenes, el RAS (R-700= PL+TDM en escualeno/Tween 80) se reconstituyó con 1 mi de PBS (según el protocolo recomendado) y luego se mezcló con 1 mi de conjugado (1 mg/ml) . El alumbre se mezcló 1:1 con antigeno. Los oligonucleótidos CpG se mezclaron con el conjugado según los protocolos publicados para ratones (100 g de conjugado con 20 iq de CpG por ratón) .

Ensayo de DTH: La estimulación de antigeno in vivo para el ensayo de DTH fue con ya sea una mezcla de los dos péptidos PSMA (sin portador) (100 yg en 20 µ?) o portador solo ( (ovalbúmina o KLH) (50-100 µ? en 20 µ?) . Los ratones recibieron inyecciones subcutáneas del antigeno de estimulación en la planta de pata izquierda y PBS en la planta de la pata derecha en 9 días después de la inmunización de refuerzo. Después de 24 hrs, los espesores de la planta de la pata derecha e izquierda se midieron utilizando un calibrador de lectura digital (Preisser DIGI-MET odel 18314, Stofiting Co., Wooddale, IL) . La respuesta al hinchamiento se calculó al sustraer el espesor de la planta de la pata derecha (linea de base) del espesor de la planta de la pata izquierda (respuesta experimental) . Los datos se expresaron como el hinchamiento de ratones individuales asi como la media +/-error estándar de la media. El análisis estadístico fue por la vía de la prueba t del Estudiante o ANOVA.

Producción y Medición de Citoquina inducida por Antígeno/Mitógeno : Para estos estudios, los bazos se recolectaron 14-21 días después de la inmunización de refuerzo y se aislaron por la vía de la dispersión a través de una criba de alambre. Las células adherentes se obtuvieron al tomar células de bazo y al dejarlas adherirse al plástico durante 90 minutos. Las células adherentes aisladas se acumularon antes de la adición a los cultivos para proporcionar células que presentan antígeno adicionales. Aproximadamente 6 x 105 linfocitos por cavidad se suplementaron con 2 x 104 células adherentes.

La liberación de citoquina del antígeno o la activación inducida por mitógeno de linfocitos se midió en sobrenadantes utilizando reactivos Duo-Sets ELISA de los Sistemas R y D (Minn. , MN) . El día óptimo para la recolección de los sobrenadantes de las células estimuladas con antigeno fue el día 6 (para IFN-?) , mientras que la producción de IL-2 estimulada con PHA fue óptima en el día 3 (datos no mostrados) .

Anticuerpos de Suero a Ovalbúmina y Péptidos: El suero en el sacrificio se congeló para el uso posterior en ensayos de ELISA. Las placas de ELISA ( Immunolon-4 , Nunc, Dinamarca) se recubrió con el antigeno de interés (ovalbúmina, KLH, conjugado o péptidos individuales) durante la noche. Las diluciones del suero se adicionaron a las células bloqueadas y lavadas y se incubaron durante la noche. Biotina anti-ratón y fosfatasa .alcalina de biotina (Southern BioTech, Birmingham, AL) se adicionaron secuencialmente y después de la adición del sustrato pNPP, la OD se midió y se gráfico contra la dilución de suero.

Los resultados de estos estudios como se detallan enseguida demuestran que el IRX-2 de la invención estimula las respuestas inmunes especificas de antigeno de tumor en ratones tanto jóvenes como viejos in vivo. Más específicamente, en los experimentos descritos enseguida, el ensayo de DTH in vivo (hipersensibilidad de tipo retardada) se utilizó como un indicador de la activación de célula T. La respuesta de DTH a antigenos de cáncer se correlaciona bien con la eliminación de tumor en modelos animales y experimentos clínicos, y así proporciona una correlación in vivo útil de las respuestas inmunes de célula T (ver, por ejemplo, Stuart, 1987; Sweat, 1998). Como es demostrado por los presentes experimentos, la composición de IRX-2 de la invención actúa como un adyuvante con los antígenos de tumor específicos de próstata en estimular las respuestas inmunes de célula T en ratones jóvenes in vivo. Por otra parte, los presentes experimentos demuestran que IRX-2 no solamente incrementa la respuesta inmune a los péptidos de célula % en ratones jóvenes sino también restaura las respuestas inmunes de célula T en ratones viejos deteriorados de célula T. Así, en los experimentos detallados enseguida, los ratones viejos se utilizaron como un modelo de disfunción inmune, una declinación relacionada con la edad en la función inmune que ocurre en tanto en ratones como en hombres. Además, se cree que esta disfunción inmune es una razón mayor para la incidencia de cáncer incrementada que ocurre con la edad incrementada en humanos.

Aumento de IRX-2 de la Respuesta de DTH Específica de Péptido en Ratones Jóvenes: Los ratones jóvenes se inmunizaron con ya sea IRX-2 (o PBS como un control negativo) en combinación con un conjugado OVA-PSMA o KLH-PSMA como es descrito en lo anterior (por ejemplo, 200 µ?/ratón, que contiene 100 de conjugado con 100 µ? IRX-2 o PBS) . Las inmunizaciones se administraron como ' inyecciones subcutáneas en la base de la cola para proporcionar el drenado rápido a un ganglio linfático regional. Los -ratones se estimularon después en un ensayo de DTH como es descrito en lo anterior, usando ya sea los péptidos PSMA (Figura 24A) o el portador utilizado en las inmunizaciones de conjugado respectivas (Figura 24B) como el antigeno de estimulación.

Como es demostrado en la Figura 24A, la inmunización de ratones jóvenes (6-8 semanas de edad) con IRX-2 (IRX-2) en combinación con un conjugado OVA-PSMA o KLH-PSMA aumentó la respuesta de DTH especifica de péptido, sin considerar el portador. Cuando los péptidos se co-administraron con IRX-2 pero sin conjugación, no se midió la respuesta de DTH especifica de péptido (datos no mostrados). La respuesta de DTH a los portadores (ya sea ovalbúmina o KLH) fue más fuerte que al péptido, y la administración con IRX-2 no aumentó la actividad de DTH (Figura 24B) . La adición del alumbre a la inmunización del conjugado de péptido IRX-2 no modificó la respuesta de DTH especifica de péptido positiva (datos no mostrados) .

Los estudios iniciales utilizados en IRX-2 (IRX-2) en combinación con un solo pretratamiento con ciclofosfamida tres días antes de la inmunización. Más específicamente, los ratones se inmunizaron con el conjugado OVA-PSMA e IRX-2 (IRX-2) ya sea con o sin administración de ciclofosfamida (ya sea 400 µ9/^??? o 2 mg/ratón) 3 días antes de la inmunización primaria. Después de dos refuerzos (en el día 14 y 28), un ensayo de DTH se realizó como es descrito en lo anterio .

Como se muestra en la Figura 25, el pretratamiento con ciclofosfamida no fue requerido para respuesta especifica de péptido y no se utilizó en experimentos subsecuentes. Por otra parte, este experimento confirmó que el tratamiento de IRX-2 en combinación con el conjugado .de péptido aumentó la respuesta de DTH especifica de péptido a un grado significantemente más grande (p<0.05) que el uso de alumbre o PBS, sin considerar si los ratones se pretrataron con ciclofosfamida o no se trataron. Los resultados de este ensayo se expresaron como el hinchamiento promedio (barras en la Figura 25) y como el hinchamiento para el ratón individual (puntos de datos de diamante en la Figura 25) . Además, todos los resultados de estos estudios de ratón utilizaron 9 días de inyecciones de IRX-2 (IRX-2) adicionales después de la inmunización primaria, aunque 4 tratamientos adicionales no fueron estadísticamente significantes de 9 (datos no mostrados) .

Además, la habilidad de IRX-2 para estimular una respuesta inmune especifica de péptido a los conjugados PSMA se compararon con aquella de tres de otros adyuvantes: alumbre, el Sistema de Adyuvante RIBI (o RAS), y CpG. Más específicamente, los ratones se inmunizaron con el conjugado de OVA-péptido en combinación con estos diferentes adyuvantes. Después de refuerzos (el día 14 y 28), un ensayo de DTH se realizó como es descrito en lo anterior (en el día 9 post-refuerzo) . Los resultados de este estudio se indican en la Figura 26 y se expresan como el hinchamiento promedio (barras) como el hinchamiento para ratones individuales (puntos de datos de diamante) .

Como es representado en la Figura 26, el efecto adyuvante de IRX-2 (IRX-2) fue más grande que aquellos de los otros adyuvantes probados (p<0.001) . Aunque todos los adyuvantes aumentaron la respuesta a la proteína portadora comparada con los ratones na'i've (datos no mostrados), solamente IRX-2 (IRX-2) aumentó la respuesta inmune específica de péptido de tumor.

Aumento de IRX-2 de la Respuesta Inmune Específica de Péptido en Ratones Envejecidos.

Los inventores primero confirmaron que la respuesta inmune a célula T en ratones viejos (>18 meses de edad) fue deficiente como es comparado con la respuesta en ratones jóvenes (8-16 semanas de edad) al demostrar que las células de bazo de ratones viejos estimulados con mitógeno (PHA) se deterioraron con respecto a la secreción de dos citoquinas de célula T primarias, IL-2 y IFN-?, como es comparado con la respuesta de ratones jóvenes (IL-2: 285 vs 75 pg/ml e IFN-?: 1535 vs 128 pg/ml) .

Los inventores luego probaron la respuesta de DTH en ratones viejos contra jóvenes que se han inmunizado con conjugados de PSMA y ya sea IRX-2 o alumbre como adyuvante, seguido por la estimulación de antigeno utilizando el ensayo DTH descrito en lo anterior. Más específicamente, los ratones viejos (18-20 meses en el inicio del estudio) y los ratones jóvenes (6-8 semanas en el inicio del estudio) se inmunizaron con el conjugado de PSMA, OVA-PSMA, en combinación con IRX-2 o alumbre como adyuvante, como es descrito en lo anterior. Los ratones luego se estimularon con antígeno de acuerdo con el ensayo de DTH descrito en lo anterior.

Como es indicado por la Figura 27A, IRX-2 (IRX-2) restauró la actividad inmune de los ratones viejos a aquella de los ratones jóvenes con respecto a la respuesta del DTH específica de péptido. Los resultados se expresan como la diferencia del hinchamiento entre una pata inyectada con PBS y una pata inyectada con antígeno para la media de 9-15 ratones por grupo. El hinchamiento promedio para los grupos viejos y jóvenes tratados con IRX-2 no fue estadísticamente diferente con respecto a la respuesta específica de péptido. Sin embargo, la respuesta de DTH de ambos de los grupos IRX-2-jóvenes y IRX-2-viejos fueron significativamente más grandes que aquellas observadas de los ratones tratados con alumbre (* p< 0.005, prueba t del Estudiante).

Con respecto a la respuesta de DTH específica de portador OVA, la Figura 27B demuestra que los ratones viejos fueron deficientes comparados a los ratones jóvenes para esta respuesta (t p<0.05) pero el tratamiento de IRX-2 restauró la respuesta de DTH específica de ovalbúmina en los ratones viejos (Figura 27B) . La respuesta a los ratones jóvenes a la ovalbúmina fue óptima en el alumbre y por lo tanto no se mejoró mediante IRX-2.

Estos experimentos demostraron que el efecto adyuvante de la composición de IRX-2 de la invención en estimular las respuestas inmunes de célula T de antígeno anti-tumor específicas en ratones tanto viejos como jóvenes in vivo. De hecho, el IRX-2 de la invención proporcionó una respuesta inmune de célula T específica de antígeno de tumor más grande comparada con otros adyuvantes probados.

Experimentos adicionales, como es descrito enseguida, se llevaron a cabo para medir el efecto del tratamiento de IRX-2 en la producción de la citoquina de célula T, e IFN-?, la producción que es otro indicador de la estimulación inmune.

Efecto de IRX-2 en la Respuesta Ex vivo de Célula T de Bazo Así, el efecto adyuvante del tratamiento de IRX-2 en ratones inmunizados con IRX-2 y un conjugado de PSMA se determina al medir la secreción de IFN-? mediante las células del bazo de los ratones inmunizados. Más específicamente, las células de bazo de los ratones inmunizados con el conjugado KLH-PSMA (como es descrito en lo anterior) e IRX-2 (IRX-2) se recolectaron y se incubaron ex vivo con el conjugado (KLH-PSMA), el portador' (KLH) o los péptidos (PSMA). Los sobrenadantes de las células del bazo se recolectaron después de 6 días de cultivo y se midieron para la secreción de IFN-? como es descrito en la sección de métodos y materiales anteriores. Como se muestra en la Figura 28, la respuesta de célula T, en la forma de producción de IFN-? (en pg/ml), para más grande para todos los tres antígenos en ratones inmunizados con el conjugado IRX-2 como es comparado con los ratones nal've.

Efecto de Adyuvantes en el Título de Anticuerpo de Suero Además, se realizaron experimentos para determinar si el tratamiento de IRX-2 tuvo un efecto adyuvante en la producción de anticuerpo in vivo. Más específicamente, los ratones se inmunizaron con los conjugados de PSMA como es descrito en lo anterior y los siguientes adyuvantes: IRX-2, alumbre o CpG. El PBS se utilizó como un control negativo para adyuvante. El suero de los ratones se obtuvo en el sacrificio, ya sea en 15 días después de la tercera inmunización (datos presentados en la Figura' 29A y B) o en 8 y 15 días después del tercer refuerzo (datos de la Figura 29C) ) . El suero se ensayó para anticuerpos por ELISA y los resultados se expresaron como dilución contra densidad óptica (Figura 29A y B) o como densidad óptica en la dilución óptima, 1/400 (Figura 29C) .

Los títulos de anticuerpo de suero al portador (ya sea ovalbúmina o KLH) se midieron e indicaron que I RX-2 ( I RX-2), alumbre y CpG indujeron títulos similares a ovalbúmina, con la respuesta que es: CpG>alumbre> IRX-2 ( I RX-2) (Figura 29A y datos no mostrados) . Los ratones inmunizados con el conj ugado KLH, como es predicho, no generó títulos a ovalbúmina, confirmando la especificidad del ensayo de ELISA (ver, por ejemplo, la Figura 29A) . Sin embargo, en cuanto a la respuesta de anticuerpo específico de péptido como es representado en la Figura 29B, IRX-2 en combinación con el conjugado de OVA-péptido de PSMA indujo anticuerpos de suero a ambos péptidos, en contraste al alumbre y CpG. Los datos en la Figura 29B son para el péptido ALF con un p<0.05 por ANOVA para IRX-2 vs . alumbre y CpG. Respuestas similares se midieron para el péptido LLH (datos no mostrados). Como es representado en la Figura 29C, cuando KLH se utilizó en el conjugado como el portador para los péptidos, IRX-2 (IRX-2) indujo una respuesta de anticuerpo de péptido más alta que sin adyuvante (PBS) o alumbre (p<0.001 para IRX-2 vs . alumbre y PBS) . Los marcadores en la Figura 29C indican ratones individuales. La respuesta de anticuerpo se midió en una placa de ELISA recubierta con ambos péptidos en el método de ensayo como es descrito en lo anterior.

Los estudios descritos en lo anterior inician que el IRX-2 de la invención aumenta la respuesta de DTH específica de péptido de célula T in vivo y la respuesta de célula T de células del bazo ex vivo en un modelo de vacuna de péptido de próstata prototipo. La naturaleza crítica de la mezcla de citoquinas (como es opuesto a la actividad de solamente unas cuantas) se confirma por la observación de que las preparaciones hechas de cultivo de células que carecen de monocitos y por lo tanto- deficientes en citoquinas derivadas de monocito no logran aumentar la respuesta de DTH específica de péptido, con la respuesta de célula T in vitro de células del bazo. La naturaleza novedosa de IRX-2 además se mostró al compararlo con otros adyuvantes seleccionados para representar varios mecanismos de acción. Por ejemplo, CpG es un agonista de TLR para APCs y es representativo de adyuvantes de activación de TLR, mientras que el sistema RAS es representativo de adyuvantes con componentes de aceite bacterianos y una alternativa más segura al adyuvante de Freund en modelos de ratón. El alumbre es el adyuvante utilizado en la mayoría de vacunas aprobadas por la FDA. En los presentes estudios, IRX-2 aumentó la respuesta de DTH específica de péptido pero el alumbre, CpG y RAS no lo hizo. Por otra parte, el aumento de IRX-2 de la respuesta de DTH específica de péptido de célula T in vivo se correlacionó con una respuesta de célula T aumentada por la célula del bazo ex vivo como es definido por la secreción específica de antígeno de IFN-?. Finalmente, mientras que todos los adyuvantes aumentaron la respuesta de anticuerpo al portador (como es comparado con PBS) , solamente IRX-2 aumentó la respuesta de anticuerpo a los péptidos conjugados con el portador.

El mecanismo (s) a través del cual las citoquinas en IRX-2 actúan para aumentar la respuesta inmune específica de péptido como es definido por el ensayo de DTH y más probablemente complejo puesto que el reclutamiento, engutamiento, proliferación, activación, maduración y migración de APCs y el reclutamiento, proliferación, diferenciación y maduración de células T todos son influenciadas por citoquinas. Sin embargo, la naturaleza específica de péptido de la respuesta de DTH observada en estos estudios se cree que es un resultado de influencia de IRX-2 en la presentación de antígeno así como la proliferación de célula T subsecuente y la migración a la periferia. También se cree que la citoquina del desplazamiento e IRX-2 desplaza la tolerancia de DC o el balance regulador de T hacia la activación de la respuesta a los epítopes de célula T. IRX-2 también puede estar aumentando los epitopes ayudantes de célula T en el portador proporcionando estimulación adicional del desarrollo de una respuesta inmune de célula T efectiva. Como es demostrado' en la presente (ver los Ejemplos 9 y 10) , el IRX-2 de la invención estimula la maduración y activación de células dendriticas, lo cual promueve la presentación de antígeno y la secreción de IRX-2 (por las células dendriticas) , IL-12 que es una citoquina polarizante Thl potente. El IRX-2 también es un potente activador de monocitos y macrófagos.

El IRX-2 tiene efectos adicionales en las células T basado en la influencia conocida de las citoquinas presentes en el IRX-2. Como es demostrado en los Ejemplos 2 y 8 anteriores. IRX-2 de la invención incrementa los conteos de linfocito T en pacientes linfocitopénicos , incluyendo la producción de células T nal've. Además, es conocido que IL-1 (presente en IRX-2) es un quimioatrayente para linfocitos asi como un estimulador para la producción de otras citoquinas. Las actividades conocidas incluyen el incremento en la proliferación y activación de células T en reposo al inducir la secreción de IL-2 y, más importantemente para la actividad de IRX-2, la regulación hacia arriba del receptor de IL-2. Además, · TNF-a (también presente en IRX-2) aumenta la actividad de IL-1 como lo hacen otras citoquinas tal como IL-8 y los CSFs. IL-8 también actúa como un quimioatrayente para múltiples células incluyendo células T, basófilos y neutrófilos. IL-2 actúa para aumentar la proliferación de células activadas al no solo estimularlas a través del receptor sino también al regular hacia arriba receptores de IL-2 adicionales asi como receptores para citoquinas adicionales. Asi, las citoquinas de las composiciones de IRX-2 de la invención son pleotrópicas, influenciando monocitos, células dendriticas y células T.

El sitio de actividad para las citoquinas, presentes en niveles fisiológicos en el IRX-2 de la invención, es local e incluye tanto el sitio de inyección asi como los ganglios linfáticos asociados con el sitio de inyección. Puesto que el IRX-2 se puede administrar diariamente, niveles locales elevados de todas las citoquinas se pueden mantener. La naturaleza especifica de péptido de la respuesta de DTH utilizando el IRX-2 de la invención como un adyuvante argumenta el uso de IRX-2 en vacunas de células T futuras .

Además, los presentes estudios indican que el IRX-2 de la invención corrige un déficit de citoquina de célula T en ratones envejecidos. Es importante notar que el cáncer más frecuentemente ocurre en individuos más viejos que son conocidos que tienen un sistema inmune declinante. Por otra parte, muchas de las terapias actuales para tumores (irradiación y quimioterapia) pueden ser por si mismas inmunosupresoras, reduciendo además la competencia inmune del paciente. Así, una vacuna de cáncer para muchos pacientes puede beneficiarse de un agente con el potencial para restaurar la deficiencia inmune asociada con envejecimiento, tratamientos de cáncer y mecanismos de defensa de cáncer. Dato este obstáculo potencial para el uso de una vacuna en gente de más edad, IRX-2 se evaluó en los presentes estudios para la eficacia en enve ecimiento así como en ratones inmunocompetentes jóvenes. Las células del bazo de ratones viejos primero se averiguaron para ser eficientes en la producción de citoquina de tanto IRX-2 e IFN-? cuando se comparan con ratones jóvenes. La respuesta de DTH también se deterioró con respecto a la ovalbúmina. No solamente fue la composición de IRX-2 de la invención capaz de restaurar la respuesta débil al portador, esta también fue efectiva y restaurar la respuesta específica de péptido a niveles similares a aquel de ratones jóvenes.

El protocolo para el uso de IRX-2 en un modelo de vacuna se basa en estudios clínicos de fase I/II utilizando el IRX-2 (IRX-2) en pacientes con- cáncer de cabeza y cuello y la cinética conocida de la respuesta inmune (ver, por ejemplo, Meneses, 2003; Hiliman, 1995) . En experimentos clínicos, la dirección del ganglio linfático del drenado de tumor combinado con una preinyección de baja dosis de ciclofosfamida y en una administración de IRX-2 (IRX-2) de 10 días da por resultado el aumento de infiltración de linfocito del tumor, fragmentación de la arquitectura del tumor y reducción en el tamaño del tumor (ver los Ejemplos 2-7 anteriores) . Como es descrito en lo anterior, en el modelo de vacuna en ratones, estudios iniciales utilizaron una pre-inyección con ciclofosfamida pero estudios subsecuentes confirmaron que esto no fue necesario en ratones que no llevan tumores sanos (Figura 25) . Por otra parte, la administración diaria de IRX-2 después de la inmunización primaria (durante 4-9 días) aparece que es importante debido a que asegura que el sitio de la inyección y subsecuentemente los ganglios linfáticos de drenado tienen suficientes niveles de citoquina para la estimulación óptima de la respuesta inmune de célula T durante la activación al periodo de transición de memoria. Puesto que los niveles de la citoquina son bajos, no hay respuesta sobre inflamación en el sitio de inyección. Esto está en contraste a tanto el alumbre y el Sistema de Adyuvante RIBI donde el hinchamiento y la inflamación se notaron en el sitio de inyección (observaciones no publicadas) .

La vacuna de péptido-portador propuesta descrita en la presente tiene promesa clínica significante como una vacuna terapéutica basada en los datos reportados para los estudios de Fase I/II utilizando los péptidos PSMA sin conjugación a un portador (Toja, 2000; O'Hagan, 2001; Katsuyuki, 2000; y Naylor, 1991) . Los dos péptidos son epítopes de célula T basado en tanto la moderación de computadoras y la respuesta de linfocitos de los pacientes de cáncer de próstata. Cuando los pacientes se trataron con péptidos solos o con células dendriticas pulsadas con péptido, respuestas clínicas y de célula T mejoradas se observaron · en los experimentos de Fase I/II. En los experimentos de fase I, sin embargo, los péptidos sin un adyuvante fueron menos efectivos que las células dendriticas pulsadas con péptido. Dada la respuesta específica de péptido aumentada observada cuando IRX-2 se administró por el conjugado de péptido y la seguridad de los conjugados de KLH en una amplia variedad de experimentos clínicos, se garantizan los experimentos clínicos con los péptidos IRX-2 (IRX-2) .

Los estudi.os presentados en la presente utilizando un modelo de ratón de vacuna de péptido de cáncer y los datos clínicos humanos que muestra una respuesta anti-tumor vigorosa a antígenos endógenos usando el IRX-2 de la invención, sustentan el uso de la composición de IRX-2 de la invención en una vacuna de tumor para la generación de una respuesta inmune suficiente para medir la destrucción específica de tumor. Además, puesto que IRX-2 actúa para aumentar las respuestas específicas de célula T en ratones tanto jóvenes como viejos, IRX-2 es un candidato para la inclusión en cualquier vacuna de cáncer, especialmente para pacientes de cáncer de edad avanzada, que tiene como su objetivo el aumento de respuestas inmunes de célula T.

Humanos : Tres pacientes con cáncer de próstata avanzado recibieron los péptidos ALF & LLH no conjugados (100 µ? @) con IRX-2 (1 ml-100 unidades de equivalencia de IL-2) precedido por baja dosis de CY (300 mg/m2) e INDO diario (25 mg tid) más 9 inyecciones adicionales de IRX-2 (1 mi) . En el dia 15, se dio un refuerzo de IRX-2 más péptidos. Un paciente adicional (#4) recibió péptidos conjugados con OVA en este régimen. Las reacciones de hipersensibilidad retardada (DTH) se midieron con IRX-2 (0.1 mi), ALF o LLH (10 xq) mediante la lectura de prueba de piel intradérmica en 24 horas en centímetros de eritema y en duración. Los resultados se presentan en la Tabla VI .

Tabla VI: DTH a los péptidos PSMA e IRX-2 Tiempo 0 1 mes IRX-2 1 ) o 0 .5 2) 1.0 1 .0 3) 0.5 1 .0 4) 0..3 0 .3 Péptido ALF 1) 0 0 .5 2) 0 0 .1 3) 1.0 1 .0 4) 0 0 .4 Péptido LHH 1) 0 0.5 2) 0 0.3 3) 1.5 2.0 4) 0 0.5 Estos datos indican que el régimen de IRX-2 es efectivo en inducir las reacciones de DTH a péptidos PS A no conjugados y conjugados en humanos con cáncer de próstata avanzado. Este resultado es diferente de los resultados de intentos más previos que han fallado con péptidos aislados.

Experimentos adicionales demostraron la habilidad del IRX-2 de la invención para actuar como un adyuvante con antigenos de péptido PSMA, dando por resultado la estabilización de la enfermedad. Más específicamente, tres masculinos positivos de HLA-A2 con cáncer de próstata avanzado se trataron con IRX-2 (IRX-2) (115 unidades de equivalencia IL-2) ¦ y los dos péptidos PSMA descritos en lo anterior (100 cada uno) . La inmunización inicial fue por la vía de inyección en el cuello, seguido por nueve inyecciones de IRX-2 (IRX-2) (más baja dosis de ciclofosfamida, indometacina y zinc como en el protocolo del Ejemplo 2 anterior), y luego seguido por cinco refuerzos mensuales de IRX-2 más los dos péptidos.

La Tabla VII resume brevemente la historia clínica (Hx) y las respuestas a la terapia (Rx) . Todos los tres pacientes han recibido prostatectomía y orquiectomia 4 a 10 años antes . (además de otras medicinas) y ha recaído. Todos estuvieron en fase de duplicamiento de la elevación en PSA que varia de 4 a un estimado de 6 meses. Dos fueron sintomáticos con dolor de huesos. La inmunización con IRX-2 más péptidos y el seguimiento de inyecciones de refuerzo no indujo los síntomas.

Los dos pacientes con dolor de hueso tuvieron una eliminación de dolor. Todos los tres pacientes fueron estables clínicamente (excepto que el paciente #2 sufrió una fractura del fémur con una exacerbación transiente) . Todos los tres desarrollaron reactividad dérmica transiente a las pruebas de piel con los péptidos PSMA aislados (A y B; 10 cada uno) . Todos los tres mostraron reactividad incrementada a las pruebas de piel con IRX-2 o PHA. Estos resultados indican que el IRX-2 de la invención inmunizó estos pacientes a los péptidos PSMA y estabilizó la enfermedad durante el período de inmunización y refuerzo. Ver también la Figura 30, que representa la estabilización de niveles de antígeno de PSA en estos tres pacientes durante un período de seis meses. El paciente #4 adicional descrito en lo anterior mostró PSa transiente y estabilización clínica pero la información clínica es incompleta. Un paciente adicional además con una recurrencia temprana de nivel de PSA (7) mostró reversión al nivel normal que ha persistido durante dos años de seguimiento sin terapia adicional (una respuesta completa) .

Tabla VII Péptido B 0-0.5 cm Dolor disminuido Estable clínicamente 6 meses Ejemplo 12 En el siguiente estudio, IRX-2 se mostró que amplifica la respuesta de célula T a dos péptidos específicos de célula T del antígeno de membrana específico de próstata (PSMA) . IRX-2 aumentó la respuesta de "DTH" de hipersensibilidad de tipo retardada específico de péptido PSMA de ratones inmunizados con células eT3 irradiadas que expresan PSMA (vacuna basada en célula) así como una vacuna de conjugado de péptido-portador . Esto estuvo en contraste a los adyuvantes tal como alumbre, Sistema de Adyuvante RIBI (RAS®, RIBI ImmunoChem Research, Inc.) y CpG que no fueron activos en generar respuesta de célula T a los péptidos PSMA. La actividad in vivo específica de célula T se confirmó al demostrar los incrementos específicos de péptido en la secreción de IFN-? mediante las células del bazo recolectadas de ratones inmunizados. IRX-2 en contraste a otros adyuvantes también aumentó respuestas de célula T a los péptidos.

Materiales y Métodos Reactivos y Células Péptidos de Antígeno de Membrana Específicos de Próstata (Péptido 1 = Leu-Leu-His-Glu-Thr-Asp-Ser-Ala-Val (SEQ ID N0:1); Péptido 2 = Ala-Leu-Phe-Asp-Ile-Glu-Ser-Lys-Val (SEQ ID NO: 2)) se sintetizaron mediante Biosynthesis Inc. (Lewisville, TX) . Ovalbúmina, ciclofosfamida y sistema adyuvante y RIBI (RAS; R-700) se compraron de Sigma (St Louis, MO) . KLH y alumbre (40 mg/ml cada uno de hidróxido de aluminio e hidróxido de magnesio) fueron de Pierce Biotechnology (Rockford, II) . El RAS consistió de Monofosforil Lipido A (MPL; 0.5 mg) y Trehalosa Dimicolato sintético (TDM; 0.5 mg) , y 44 ul de escualeno y Tween-80. Los oligonucleótidos CpG (secuencia especifica de ratón) se sintetizaron mediante BioSynthesis (Lewisville, TX) . La secuencia de CpG fue TCCATGACGTTCCTGACGTT (SEQ ID NO: 3) y fue derivado de fosfotionato . La bioactividad de CpG en el ratón se confirmó al medir la proliferación de células de bazo de ratón y la producción de TNF- mediante las células adherentes de ratón (datos no mostrados).

Las células 3T3 NIH se transíectaron establemente con un inserto de PSMA que se cultivaron con FBS al 10% suplementado de MEM. La expresión del inserto se confirmó al demostrar la resistencia a geneticina y la expresión de PSMA mediante inmunohistoquimica y citometria de flujo. Las células se irradiaron con 800 Gy utilizando una fuente de Cesio y se congeló a -20 °C hasta el uso como una vacuna basada en célula.

IRX-2 es una sustancia biológica derivada de célula primaria que consiste de múltiples citoquinas activas como es descrito en lo anterior. La dosificación de IRX-2 está basada en el contenido de IL-2. Cuando dos lotes se probaron en contenido de IL-2 equivalente en el mismo experimento ellos fueron siempre iguales en actividad (datos no mostrados) . Varios lotes de IRX-2 se utilizaron durante el curso de estos estudios. Los niveles promedios de las citoquinas aumentadoras inmunes potenciales en los lotes de IRX-2 utilizados en estos estudios fueron IL-2 (5.5 ng/ml) , IL-1 (0.5 ng/ml), IFN-? (1.5 ng/ml), TNF-a (2.7 ng/ml), IL-6 (1 ng/ml) y IL-8 (46.2 ng/ml).

Conjugación Los péptidos se conjugaron a ovalbúmina o KLH utilizando el método de carbodiimida (ODC; equipo Pierce EDC 77502, Rockford, III) . La conjugación se caracterizó ala medir la densidad óptica en 280 nm y 215 nm en fracciones de una columna de purificación Sephadex. El pico de 280 nm de las columnas, se identifica al portador y fue recolectado como el conjugado. El monitoreo de la densidad óptica en 215 nm mostró un pico de cola que representa los péptidos libres y proporcionó confirmación de que péptido en exceso estuvo presente durante el procedimiento de conjugación. La dosificación se basó en la concentración de portador como recuperado de la columna.

Inmunización Ratones hembras Balb/c (6-8 semanas de edad) se adquiriron de ya sea Charles River Laboratories (Wilmington, MA) o Harían Laboratories ( Indianapolis, IN) y se alojaron bajo el cuidado de la instalación de animales de Laboratorio Cóld Spring Harbor Laboratory (CSHL) (aseguramiento del bienestar animal del número certificado A3280-01). Todos los procedimientos fueron aprobados por el comité ALAC del CSHL. Las inmunizaciones (200 ul/ratón que contienen 100 ug del conjugado con 100 ul de adyuvante o PBS) se dieron subcutáneamente en la base de la cola para proporcionar el drenado rápido a los ganglios linfáticos regionales. Nueve inyecciones adicionales de IRX-2 seguido por la inmunización primaria (Días 2,3,4,5,8,9,10,11,12). Distinto al alumbre o RIBI donde una sola inyección causó inflamación en el sitio, inyecciones repetidas de IRX-2 en el mismo sitio no dieron por resultado inflamación significante en el sitio (observaciones no publicadas) . Las inmunizaciones de refuerzo con el conjugado más adyuvante (Días 14 y 28) se realizaron antes de estimar la actividad de DTH. Inyecciones diarias adicionales de IRX-2 no se dieron después de las inmunizaciones de refuerzo. Cuando las células irradiadas se utilizaron como la vacuna, las células se suspendieron en ya sea PBS o IRX-2 y se inyectaron subcutáneamente utilizando dosis entre 103 y 105 células/ratón. El programa de inmunización fue idéntico a aquel utilizado para la vacuna de conjugado de péptido.

En los estudios de adyuvante comparativo en ratones, el RAS (R 700 = MPL+TDM en escualeno/Tween 80) se reconstituyó con 1 mi de PBS (según el protocolo recomendado) y luego se mezcló con 1 mi de conjugado (1 mg/ml) . El alumbre se mezcló 1:1 con antigeno. Los oligonucleótidos CpG se mezclaron con el conjugado de péptido siguiendo los protocolos publicados para los ratones (100 ug de conjugado con 20 ug CpG por ratón) .

Ensayo de DTH La estimulación de antigeno in vivo para el ensayo de DTH se estimó 9 días después de la inmunización de refuerzo. Los ratones recibieron inyecciones subcutáneas del antigeno de estimulación en la planta de la pata izquierda y PBS en la planta de la pata derecha. El antigeno de estimulación fue ya sea el péptido (100 pg en 20 yl) o el portador (ovalbúmina o KLH) (50 yg en 20 µ?) . Después de 24 horas, el espesor de la planta de la pata derecha e izquierda se midieron utilizando un calibrador de lectura digital (Preisser DIGI-MET Model 18314, Stofiting Co, Wooddale, IL) . La respuesta de hinchamiento se calculó al sustraer el espesor de la planta de la pata derecha (linea de base) del espesor de la planta de la pata izquierda (respuesta experimental). Los datos se expresan como media +/- error estándar de la media. El análisis estadístico fue por la vía de lá prueba t del Estudiante.

Ensayo de IFN-? estimulado con antigeno Los bazos se recolectaron 7-14 días después de la segunda inmunización de refuerzo y se aislaron al dispersar a través de una criba de malla de alambre. Las células adherentes se obtuvieron al tomar las células del bazo y al dejarlas adherirse al plástico durante 90 minutos. Las células adherentes aisladas se adicionaron a los cultivos para proporcionar células que presentan antigeno adicionales (6 x 105 linfocitos por cavidad se suplementaron con 2 x 104 células adherentes) . La liberación de IFN-? mediante la activación inducida en el antigeno de los linfocitos se midió en sobrenadante recolectados en el día seis utilizando reactivos Duo-Sets ELISA del R & D Systems (Minneapolis , N) .

Anticuerpos de suero al portador y péptidos El" suero se obtuvo entre 7 y 21 días después de la tercera inmunización de refuerzo y se congelaron para el uso posterior en ensayos de ELISA. Las placas de ELISA ( Immunolon-4 , Nunc, Dinamarca) se recubrieron con el antigeno de interés (ovalbúmina, KLH, conjugado o péptidos) durante la noche. Las diluciones de suero se adicionaron a las cavidades bloqueadas y lavadas y se incubaron durante la noche. IgG anti-ratón marcado con biotina y avidina-fosfatasa alcalina (Southern BioTech, Birmingham, AL) se adicionaron secuencialmente y después de la adición del sustrato pNPP, el OD se midió y se gráfico contra la dilución de suero.

Resultados IRX-2 Incrementa la Respuesta Inmune a una Vacuna Basada en Célula Completa Las células 3T3 transfectadas con PSMA se utilizaron para inmunizar ratones y confirmar el procesamiento y presentación de los péptidos PSMA. La respuesta inmune a los péptidos se estimó mediante el ensayo de Hipersensibilidad de tipo Retardado (DTH) . Como se muestra en la Figura 21, las células que expresan PSMA irradiadas generaron una respuesta DTH en ratones cuando se estimularon con los dos péptidos PSMA. Los ratones se vacunaron con dosis de células 3T3 que expresan PSMA irradiadas y ya sea IRX-2 (azul) o sin adyuvante (PBS, magenta) y la respuesta DTH después de la estimulación de péptido se midió 9 días después de la segunda inmunización de refuerzo. Los resultados se expresan como el promedio ( +/- SEM) para los grupos de 5-15 ratones. El incremento en el hinchamiento de la planta de la pata fue una función de la dosis de las células irradiadas IRX-2 administrado como es comparado a los ratones sin adyuvante (PBS) . La determinación de la diferencia estadística entre el IRX y los grupos sin adyuvante (PBS) se estimó mediante la prueba t del Estudiante. La significancia de dos colas fue = p<0.001 para 104 y 105 célula/ratón y la significancia de una cola fue p<0.05 para 103. La respuesta fue relacionada con la dosis y aumentada cuando la vacuna se administró con IRX-2 como es comparada sin adyuvante.

Aumento de IRX-2 de la DTH Especifica de Péptido en Ratones Inmunizados con PSMA-Conj ugado : Dosificación de Conjugado e IRX-2 Los ratones se inmunizaron con dosis variantes de los péptidos solos o péptidos conjugados con el portador de Hemocianina de Lapa de Punta (KLH) y sin IRX-2. La respuesta de la célula T después de la estimulación del péptido o conjugado se estimó para definir la dosis óptima de antigeno. Hubo una respuesta dependiente de la dosis para la respuesta DTH especifica de péptido pero la respuesta al portador no fue influenciada por la dosis del conjugado (Figura 32) . La Figura 32 presenta la respuesta DTH de los ratones inmunizados al péptido (lado izquierdo) o KLH (portador; lado derecho) . La respuesta se expresa como la media +/- el SEM para 5-10 ratones por grupo. No Adj indica que la respuesta se midió en ratones inmunizados con dosis óptima de conjugado y PBS. La respuesta de péptido fue relacionada con la dosis pero la respuesta al portador no fue relacionada. Las diferencias de sin adyuvante para la respuesta especifica de péptido a dosis del conjugado de PSMA-KLH de 100 ug y 25 ug fueron significantemente diferentes de sin adyuvante en p<0.05 para la prueba t del Estudiante. La dosis más alta del conjugado probado sin adyuvante no fue activa en el ensayo especifico de péptido como es comparado con la respuesta KLH, que fue similar a la respuesta con IRX-2. Cuando los péptidos sin conjugación se co-administraron con IRX-2, no se observó respuesta DTH especifica de péptido (datos no mostrados) .

IRX-2 Incrementa la Respuesta a Antigeno en una Manera Dependiente de Dosis La dosis de IRX-2 requerida para generar la respuesta DTH especifica de péptido óptima se evaluó (Figuras 33A y 33B) . Los ratones se inmunizaron con la vacuna de conjugado óptima (100 ug/ratón) y varias dosis de IRX-2. Puesto que IRX-2 contiene múltiples citoquinas, la dosis de IRX-2 se gráfica como la concentración de IL-2 en IRX-2 por ratón. La concentración de IL-2 se representa por ya sea dos mediciones interconvertibles (IU = unidades internacionales o pg/ml basado en un estándar recombinante puro) . La respuesta de péptido es especifica de célula T se estimó mediante el ensayo DTH y es representada como el incremento en el hinchamiento (+/- error estándar de la media) debido a' la estimulación de péptido. La diferencia entre las respuestas para la dosis óptima (entre 200 y 800 pg/ratón; 4-16 IU/ratón) fue estadísticamente significante (p<0.05 mediante la prueba t del Estudiante) de no IRX-2 (0) así como la dosis más baja (70 pg/ml) y la dosis más alta (2100 pg/ml) probada en el ensayo. La dosificación de IRX-2 se definió por los niveles de IL-2 como es medido por ELISA. Las dosis entre 200 y 800 pg de equivalentes de IL-2 por ratón fueron efectivas en aumentar la respuesta de célula T en el ensayo DTH.

Múltiples Inyecciones de IRX-2 Mejoran la Respuesta Inmune al Antigeno Ya sea 4 o 9 inyecciones adicionales de IRX-2 fueron similares con respecto al aumento de la DTH especifica de péptido pero una sola administración sin las inyecciones subsecuentes de IRX-2 solo no aumento las respuestas especificas de célula T al antigeno (Figuras 33A y 33B y datos no mostrados) .

IRX-2 es Superior a Otros Adyuvantes en Mediar una Respuesta de Célula T al Antigeno.

Tres adyuvantes con diferentes mecanismos de acción se seleccionan para la comparación a IRX-2. Alumbre (el adyuvante utilizado en la mayoría de vacunas aprobadas por la FDA) , Sistema de Adyuvante RIBI (representativo de adyuvantes con componentes de aceite y bacterianos) y CpG (representativo de adyuvantes que activan el receptor similar a Toll (TLR) se administraron según los protocolos publicados. El aumento de IRX-2 de la respuesta específica de péptido de célula T fue superior a ya sea los adyuvantes de alumbre, Ribi® o CpG (Figura 34). Los ratones se inmunizaron con el conjugado de péptido PSMA y los adyuvantes indicados. Después de dos refuerzos (Día 14 y Día 28), el ensayo DTH se realizó 9 días después del refuerzo final. Los resultados se expresan como el incremento promedio en el hinchamiento para la pata inyectada con péptido contra el control (+/- SEM) . La respuesta de IRX-2 fue más grande que todas las otras en p<0.001 (prueba t del Estudiante).

IRX-2 Incrementa la Producción de IFN-? en Respuesta al Antigeno de Péptido Los ratones se inmunizaron con varias dosis del conjugado de KLH-PSMA e IRX-2. Las células del bazo de ratones inmunizados se evaluaron ex vivo para la respuesta a la estimulación por los péptidos al medir la secreción de IFN-?. IRX-2 incrementó la secreción especifica de péptido de IFN-? por las células del bazo y la respuesta fue dependiente de la dosis con respecto a la concentración de conjugado utilizado para la inmunización y el aumento fue significantemente diferente de los ratones tratados sin adyuvante ((PBS) Figura 35). IFN-? se midió en los sobrenadantes después de 6 días de cultivo y los resultados expresados como el promedio (=/- SEM) para los ratones en una dosis dada de la vacuna de conjugado. Los incrementos para 25 y 100 ug de conjugado fueron estadísticamente significantes (P<0.05) vs . el control sin adyuvante (PBS). Para propósitos comparativos el panel inferior representa la respuesta DTH específica de péptido para dosis similares de conjugado.

IRX-2 Aumenta la Respuesta de Anticuerpo al Antigeno de Péptido Loa ratones inmunizados con la vacuna basada en célula irradiada muestran anticuerpos de suero a los péptidos y la respuesta al anticuerpo de ratones inmunizados se aumentó por I RX-2 en la dosis inferior de la vacuna (Figura 36) . Los anticuerpos de suero específicos de péptido de ratones inmunizados con la vacuna de célula irradiada. Las respuestas del anticuerpo de suero se midieron como densidad óptica en diluciones de suero utilizando un anticuerpo específico de IgG de ratón en el ensayo de ELISA como es descrito en los métodos. Los ratones inmunizados con la vacuna KLH más IRX-2 por una respuesta específica de péptido aumentada cuando la dosis de vacuna fue subóptima sin el adyuvante. La respuesta también fue significantemente diferente con I RX-2 para dilución de sueros inferiores en las dosis de vacuna más altas. Cuando se evaluó la vacuna de conjugado de KLH-péptido, I RX-2 también aumentó la respuesta específica de péptido comparada a tanto el alumbre como al sin adyuvante (datos no mostrados) .

I RX-2 es Superior a Otros Adyuvantes En Estimular una Respuesta al Anticuerpo a Péptidos Conjugados IRX-2 dada con conjugados de péptido de ovalbúmina dio por resultado anticuerpos a los péptidos con no CpG ni alumbre dado con el conjugado dio por resultado anticuerpos a los péptidos (Figura 37) . El dato es para el péptido con la secuencia que inicia con ALF y la significancia fue p<0.05 por ANOVA para IRX-2 contra alumbre y CpG. Estos resultados son consistentes con el estudio de comparación adyuvante de célula T donde solamente IRX-2 se dio con la vacuna de conjugado que dio por resultado la respuesta DTH especifica de péptido (ver la Figura 34 para comparación.

Ejemplo 13 En el siguiente estudio, IRX-2 se mostró que amplifica la respuesta de célula T a un epitope de ratón dominante de PSMA en una vacuna que incluye adyuvante de Freund incompleto. IRX-2 aumentó la respuesta de IFN-? especifica de péptido PSMA de los ratones inmunizados con un péptido PSMA en adyuvante de Freund incompleto. La actividad in vivo especifica de célula T se confirmó al demostrar los incrementos totales en la secreción de IFN-? especifica de péptido por las células del bazo recolectado de ratones inmunizados asi como el número de células T especificas de antigeno. IRX-2 en contraste a otros adyuvantes también aumentó las respuestas a la célula B a los péptidos.

Materiales y Métodos Reactivos y Células El péptido NFT utilizado en estos estudios se sintetizó mediante Biosynthesis Inc (Lewisville Tx) . La secuencia de péptido NFT fue NFTQIPHLAGTEQNF que es de la proteina humana. El PSMA de ratón tiene una secuencia similar (NFTRTPHLAGTQNNF) pero la no identidad como es indicado por los aminoácidos no en negritas, significa que esos estudios no son específicamente diseñados para demostrar el rompimiento de la tolerancia. El péptido de inmunización de control negativo para estos estudios fue un epítope de influenza clase II para ratones C57bl/6 (NGSLQCRICI) . La ovalbúmina, el Adyuvante de Friends Incompleto (IFA) y el adyuvante de combinación (MPL + TDM en escualeno/Tween 80, también llamado Sistema Adyuvante a Ribi o Sistema Adyuvante Sigma Número de Catálogo S6322) se compraron de Sigma (St Louis, MO) . El adyuvante de combinación consistió de Monofosforil Lipido A (MPL; 0.5 mg) y Trehalose Dimycolato sintético (TDM; 0.5 mg) , y 44 ul de escualeno y 200 ul de Tween-80 en un volumen final de 1 mi de PBS (es decir, aceite en agua) . El Adyuvante Incompleto de Freund consiste de aceite de parafina combinado con monooleato de manuro (0.85 mL de aceite de parafina y 0.15 mL de monooleato de manuro). El adyuvante se seleccionó debido a que es comercialmente disponible y es similar al adyuvante completo de Freund pero sin la toxicidad.

Inmunización Ratones hembra Balb/c (6-8 semanas de edad) se compraron de ya sea Charles River Laboratories (Wilmington, MA) o Harían Laboratories ( Indianapolis , IN) y se alojaron bajo el cuidado de la instalación de Animales de Laboratorio de Cold Spring Harbor (CSHL) (certificado de Aseguramiento de Cuidado de Animales número A3280-01). Todos los procedimientos fueron aprobados por el comité ALAC del CSHL. Las inmunizaciones (200 ul/ratón típicamente que contiene 100 ug de antígeno con 100 ul de adyuvante, PBS o X-Vivo 10 media) se dieron subcutáneamente en la base de la cola para proporcionar el drenado rápido a los ganglios linfáticos regionales. Excepto donde es mencionado, nueve inyecciones adicionales de IRX-2 también en la base de la cola seguido por la inmunización primaria (designado como Día 0) así IRX-2 sin antígeno se administró en los días 1, 2 , 3 , 4 , 7 , 8 , 9, 10 , 11. Los ratones que no recibieron el IRX-2, recibieron ya sea PBS o X-Vivo 10 media en' los días 1,2,3,4,7,8,9,10,11 para controlar el estrés potencial del manejo de los ratones. Tanto PBS como X-vivo, cuando se administran con antígeno, fueron no estimuladores comparados con IRX-2. En el texto y las figuras, los ratones que reciben antígeno más PBS o X-Vivo son referidos como ratones de "control" o sin adyuvante. La dosificación se define basado en los niveles de IL-12 en IRX-2 y a menos que se indique de otra manera fue 700 pg/ratón (15 IU/ratón) . Las inmunizaciones de refuerzo con antígeno más adyuvante que se dieron el día 14 y para el ensayo DTH se repitieron en el día 28. Inyecciones diarias adicionales de I RX-2 no se dieron después de las inmunizaciones de refuerzo. Cuando las células irradiadas se utilizaron como la vacuna, las células se suspendieron en ya sea PBS o IRX-2 y se inyectaron subcutáneamente utilizando dosis entre 103 y 106 células/ratón .

El IFA se mezcló como 1 parte de péptido (1 mg/ml), 1 parte de IFA y 1 parte de ya sea IRX-2 o PBS/X-VIVO. Después de la emulsificación mediante el pasaje a través de un leur-lok hembra : hembra que conecta dos jeringas, cada ratón recibió 300 ul subcutáneamente. El adyuvante de combinación ( PL+TDM en escualeno/Tween 80 se reconstituyó con 2 mi de PBS (según el protocolo recomendado) y luego se mezcló con 2 mi de conjugado (1 mg/ml) y 2 mis de ya sea el IRX-2 o control. El adyuvante de combinación se mezcló con IRX-2 al someter a vórtice y cada ratón recibió 300 ul subcutáneamente teniendo en cuenta en volumen adicional de IFA.

Ensayo de IFN-? estimulado con antigeno Ganglios linfáticos y bazos se recolectaron en los tiempos indicados (3-24 días después de la primera inmunización de refuerzo) y las células se aislaron al dispersar a través de una criba de malla del alambre. Las células rojas en los bazos se lisaron utilizando solución reguladora de lisado de cloruro de amonio (Quality Biological Inc. Gaithersburg, D) ) . Las células adherentes para la adición a los cultivos de célula de ganglios linfáticos se obtuvieron al colocar las células del bazo y al dejarlas adherir al plástico durante 90 minutos. Las células adherentes aisladas se adicionaron a los cultivos para proporcionar células que presentan antigeno adicional (2-6 x 105 linfocitos por cavidad se suplementaron con 2-4 x 104 células adherentes) . La liberación de IFN-? mediante la activación inducida por antigeno de linfocitos se midió en sobrenadantes recolectados en el dia seis utilizando reactivos Duo-Sets de ELISA de R&D Systems (Minneapolis , MN) .

Ensayo de ELISpot Las células de colocaron en ya sea 2 x 105 linfocitos por cavidad para las células del bazo o 3 x 105 linfocitos por cavidad para células de ganglio linfático. Las placas ELISpot (Millipore, Billerica, MA) se recubrieron con anticuerpo de captura (MAB-18 de MabTech (Mariemont, OH) en PBS durante la noche. Las placas se lavaron, el antigeno y las células se adicionaron y luego se incubaron durante 18 hrs a 37 °C. Las cavidades se lavaron vigorosamente con PBS para remover las células y el segundo anticuerpo biotinilado (MabTech) se adicionó durante 18 hr adicionales de incubación. Las placas se desarrollaron utilizando el sustrato secuencial biotina-AP y DAB. Las placas se leyeron utilizando un microscopio con el software de conversión digital por ZellNet (Fort Lee, New Jersey) .

Resultados Inmunización de Péptido de célula T en IFA para definir la actividad de IRX-2 Las respuestas de la célula T a los epitopes de péptido dominante de antigenos de proteina se evalúan típicamente al administrar los péptidos en el Adyuvante de Freund Incompleto (IFA) . IFA es efectivo como un resultado de su efecto de depósito y su potencial para generar reacciones inflamatorias en el sitio. Los ratones inmunizados con el péptido NFT dominante en IFA, montaron una respuesta inmune que se aumentó mediante el tratamiento con IRX-2 como es medido por el ensayo de ELISpot para el ganglio linfático y las células del bazo (Figura 38A) . El péptido sin IFA con o sin IRX-2 no fue significantemente diferente de los ratones naive (datos no mostrados ) . La Figura 38B confirma que el incremento inducido por IRX-2 en la respuesta ELISpot de la célula del bazo también se reflejó en el ensayo de secreción de IFN-?. La Figura 39A y 39B presenta el desarrollo temporal de la respuesta de células T como es definido por el ensayo de ELIspot de células recolectadas de ratones a través del tiempo después de la inmunización de refuerzo. IRX-2 incrementa la respuesta inmune comparada al antígeno solamente en el control en el ganglio linfático en todos los puntos del tiempo. En las células del bazo, la respuesta se aumentó solamente en los días 17-19. El ensayo de ELISpot con NFT en IFA también se utilizó para medir la dosificación óptima de IRX-2. Como se muestra en la Figura 40A la dosis óptima de IRX-2 fue 700 pg de equivalentes de IL-2/ratón administrado diariamente durante 10 días. Utilizando la dosis óptima ambas dosis de 9 y 4 dosis adicionales de IRX-2 se encontraron que son similares (figura 40B) . Una sola administración de IRX-2 no es suficiente para aumentar la respuesta de célula T (Figura 40B) . Resultados similares se obtuvieron utilizando los conjugados de péptido como el inmunógeno en ambos de los ensayos de ELISpot y DTH (datos no mostrados) .

IRX-2 preferencialmente aumenta las respuestas de célula T IRX-2 se comparó con un adyuvante de combinación comercialmente disponible (MPL + TDM + escualeno + Tween 80) usando conjugados de péptido NFT y se evalúan mediante la respuesta de célula T a NFT y la respuesta de célula B a ovalbúmina o KLH, que se utilizaron como los portadores. El adyuvante basado en MPL+TDM es comercialmente disponible de SIMA y es similar al adyuvante RIBI previamente disponible de RIBI Adjuvant Company y subsecuentemente vendido por Sigma Chemical Company. El adyuvante se considera que es el ejemplo prototipico de un adyuvante fuerte puesto que es equivalente al adyuvante de Freund clásico pero sin los efectos secundarios tóxicos. El titulo de anticuerpo a KLH en la dosis de 100 ug/ml utilizado con el conjugado no se incrementó por el adyuvante debido a la actividad poderosa de KLH (datos no mostrados) . Para estos estudios, la respuesta a ovalbúmina se utilizó para estimar la actividad de célula B de los adyuvantes. El incremento a la respuesta de célula T para el conjugado de NFT en el día 3 de inmunización de post refuerzo fue positiva para IRX-2 y el adyuvante de combinación (Figura 41A) aunque IRX-2 fue superior al adyuvante de combinación. ? la inversa, IRX aumentó la respuesta de célula B pero no fue tan efectiva como el adyuvante de combinación con respecto a los títulos de anticuerpo en el suero (Figura 41B) .

Estudios de vacuna de tumor profilácticos Estudios previos demostraron que los ratones inmunizados con una dosis más alta de células 3T3 que expresan hPSMA irradiada (P-3T3) que se utilizaron los estudios de los inventores se protegieron de la estimulación de tumor con células RENCa que expresan PSMA (P-RENCA) como es comparado con ratones inmunizados con células 3T3 que contienen el neo-vector únicamente. Los inventores confirmaron y extendieron sus estudios utilizando células 3T3 que expresan hPSMA con o sin el tratamiento IRX-2 y subsecuentemente estimulando con células P-RENCA. Como es reportado previamente, los ratones que se inmunizaron con una alta dosis de células (>106 células/ratón) se protegieron completamente aun sin adyuvante (datos no mostrados). Los ratones inmunizados con una dosis inferior de 105 células/ratón tuvieron crecimiento de tumor tardado e IRX-2 aumentó la protección (Figura 42). Hubo supervivencia mejorada con IRX-2 pero solamente unos cuantos ratones no lograron desarrollar tumores en el grupo IRX-2. Para determinar si el epitope dominante fue protector, los ratones se inmunizaron con el conjugado de NFT-KLH (con o sin IRX-2) . Un conjunto de ratones de control se inmunizó con KLH únicamente (con o sin IRX-2). Como se muestra en la Figura 42A-C, los ratones inmunizados con NFT-KLH más IRX-2 tuvieron retardo temprano en el crecimiento de tumor como es comparado con los otros tres grupos (NFT-KLH sin adyuvante KLH con o sin IRX-2. Ninguno de los ratones completamente rechazaron el tumor y la protección temprana como es definida por el crecimiento de tumor, no se tradujo a la supervivencia incrementada .

IRX-2 es superior a otros adyuvantes en un sistema de vacuna conjugado con péptido.

Ratones de 8-10 semanas de edad (5-8 por grupo) se inmunizaron con el conjugado de NFT-KLH y ya sea IRX-2, una combinación de adyuvante Monofosforil lipido A (MPL) + trehalosa dicornimicolato (TDM) en escualeno/Tween 8 o control. La respuesta de ELISpot especifica de NFT se midió utilizando células del ganglio linfático obtenida 3 días después de la inmunización de refuerzo. Como se muestra en la Figura 43 fue superior a el MPL y la vacuna TDM en aumentar la respuesta de célula T especifica de antigeno in vivo, como es medido por las células que secretan IFN-?. El dato se expresa como el incremento en ELISpots especificas de NFT (media +/- SEM) .

Ejemplo 14 El desarrollo de las vacunas subunitarias que consisten de antigenos definidos de varios organismos infecciosos o tumores se ha obstaculizado grandemente por la carencia de célula T CD8 efectiva y adyuvantes que inducen Thl. Estas respuestas colaboran a mediar la inmunidad mediada por célula efectiva, dando por resultado la eliminación de células hospederas infectadas o malignas. En realidad, la mayoría de las vacunas en uso actual todavía consisten de organismos atenuados vivos, que pueden difíciles de manufacturar y tienen problemas de seguridad y de almacenamiento potenciales. Los adyuvantes tales como aceite mineral, ' micobacteria y alumbres son frecuentemente requeridos para amplificar la inmunidad adquirida. El más efectivo se considera generalmente que es CFA, que solamente pueden ser utilizados en animales y pueden causar inflamación de la piel dañante. Estos estudios descritos enseguida, demuestran que IRX-2 adicionado a una vacuna de multi-adyuvante que consiste de adyuvantes dependiente e independiente de TLR induce niveles extremadamente altos de inmunidad de célula T especifica de antigeno.

El siguiente ejemplo demuestra que I RX-2 aumenta las vacunas ' de péptido en combinación con otros adyuvantes que trabajan mediante ambos mecanismos dependientes e independientes de TLR. Además I RX-2 aumentó el número de células T especificas de antigeno in vivo después de la vacunación con una vacuna multicomponente asi como la actividad citotóxica de las células T especificas de antigeno .

Materiales y Métodos Combinaciones de adyuvante y procedimientos de vacunación Ratones C57BL/6 o BALB/c (Harían) se inmunizaron intradérmicamente (i.d.) con combinaciones de los siguientes reactivos en PBS (por ratón) : OVA257-264 (SIINFEKL) péptido (100 pg; Prolmmune) , IFN-? (100 ng, Peprotech) , monofosforil lipido A (MPL) más trehalosa 6, 6' -dimicolato (TDM) emulsión (adyuvante Ribi, utilizado según las instrucciones del fabricante; Sigma-Aldrich) , CG 1826 (25 pg; VH Bio) , ácido poliinosinico: policitidilico (polil:C; 50 pg; Sigma- Aldrich), MPL (50pg; InvivoGen) . Los volúmenes de vacuna finales fueron 200 µ? (100 µ?/flanco) ; las vacunas se calentaron a 37°C y se agitaron vigorosamente antes de la inyección. Los ratones se iniciaron en el día 0 y se reforzaron en los días 9-11 con las mismas dosis de Ag/adyuvante a menos que se indique de otra manera. Los adyuvantes combinados que contienen MPL más TDM, un agonista de TLR adicional, IFN-? y ya sea anti-CD40, péptido clase II, o proteina completa son referidos como el adyuvante combinado para la activación sinergistica de la inmunidad celular (CASAC) . Muestras de sangre se tomaron para el análisis de pentámero en los días 19-21 a menos que se indique de otra manera. Los ensayos de CTL in vivo se realizaron en los días 20-22, a menos que se indique de otra manera.

Ensayos de citotoxicidad in vivo Los esplenocitos de ratón C57BL/6 no iniciados se pulsaron con 10 pg/ml de péptido antigénico en cultivos durante 1 h. Estas células luego se lavaron dos veces en PBS y se marcaron con 0.3 µ? de CFSE durante 10 min. Las células de control se cultivaron en el medio solas y se marcaron con 3 µ? de CFSE. Las células de control objetivo (107 cada una) se mezclaron y se transfirieron i.v. en recipientes inmunizados o de control. Dieciocho horas después se recolectaron los bazos y se analizaron mediante CFSE mediante citometria de flujo. Los números de células objetivo (CFSEIow) contra control (CFSEhigh) recuperadas se utilizaron para calcular el porcentaje de exterminio con la siguiente fórmula: exterminio (%) = 1 -[(no. de objetivos/no. de células de control en el animal inmunizado) / (no . de objetivos/no. de células de control en el animal de control) ] x 100.

Resultados IRX-2 sinergiza con otros adyuvantes en vacunas de péptido Como se muestra en la figura 44, IRX-2 en combinación con una preparación multi-adyuvante (CpG, poli I:C, IFN-g en y emulsión de aceite) es superior a la combinación de adyuvante sola en crear células T especificas de antigeno. El porcentaje de células T especificas de antigeno después de la vacunación como se muestra en la Figura 44A se incremento cuando IRX-2 se adicionó a la vacuna. Además, el número de moléculas MHC especificas de antigeno por célula T se incrementó cuando IRX-2 se adicionó a la vacuna como se muestra en la Figura 44B.

IRX-2 incrementa la citotoxicidad de las células T especificas de antigeno cuando se adiciona a una vacuna de péptidó que contiene adyuvante dependientes o independientes de TLR .

Como se muestra en la Figura 45, IRX-2 en combinación con una preparación de multi-adyuvante (CpG, poli I:C, IFN-? en y emulsión de aceite) es superior a la combinación de adyuvante sola en aumentar la actividad citotóxica de las células T especificas de antigeno que se crearon mediante la vacunación con la vacuna. Además, se mostró en la Figura 45 que cuando IRX-2 se adicionó a la vacuna de multi-adyuvante solamente fue necesaria una sola inyección .

Ejemplo 15 Aumento de IRX-2 de la Respuesta Inmune a Ovalbúmina expresada por un vector viral canary pox (ALVAC) El siguiente ejemplo demuestra la habilidad de IRX- 2 para aumentar las respuestas de célula T al antigeno expresado en una vacuna de base viral. Además, IRX-2 se mostró que aumenta la respuesta de célula T a una base viral que además aumentó con TRICOM, un sinnúmero de moléculas estimulatorias .

OVA-ALVAC es un virus canary pox que se ha "diseñado" para expresar la proteina de ovalbúmina. Una ventaja putativa del constructo es que el virus debe generar una "respuesta inflamatoria" que elimina la necesidad para un adyuvante TLR.. OVA-ALVAC infecta en las células en el sitio, incluyendo las células que presentan antigeno (DC's) que proporciona presentación del antigeno procesado sin un requerimiento de presentación cruzada. Los ganglios ' linfáticos que drenan el sitio reciben tanto la ovalbúmina secretada por las células infectadas y las DC's que han migrado del sitio de inflamación. La APC que entra al ganglio son el activador primario de las células T (T ayudante y T citotóxica) y la ovalbúmina que drena del sitio al ganglio es requerida para generar las células que producen anticuerpo.

Dos constructos que expresan ovalbúmina diferente estuvieron disponibles para la evaluación: OVA-ALVAC y OVA-TriCom-ALVAC . El constructo TriCora se diseñó para expresar LFA-1, ICAM-1 y B7.1 además de la ovalbúmina. Estas tres proteínas se plantean como hipótesis que aumentan la respuesta inmune al proporcionar sobreexpresión de proteínas ' co-estimuladoras importantes .

Materiales y Métodos El modelo para evaluar la respuesta inmune fue la inmunización primaria seguida por una inmunización de refuerzo en el día 14. IRX-2 se suministró con los constructos ALVAC en ambos días. IRX-2 adicional se administró durante 9 días después de la inmunización primaria. Los ratones se sacrificaron o se sangraron en los días indicados en las figuras que acompañan este reporte. Tres dosis de OVA-ALVAC se utilizaron en el estudio (3 xlO7 (dosis estándar), 3 xlO6, 3 xlO5, PFU por ratón). Dos dosis de OVA-TriCom-A ALVAC- también se evaluaron en el estudio (3 xlO6 (dosis estándar) y 3xl05 PFU por ratón) . La respuesta de célula T en los ganglios linfáticos y los vasos se midió mediante ELISpot utilizando el epítope dominante de ratón (SIINFEKL) . La respuesta de célula B se midió mediante ELISA utilizando places recubiertas de ovalbúmina y el suero de ratones inmunizados.

Resultados IRX-2 incrementa la respuesta de anticuerpo después de la vacunación con una vacuna de base viral Como se muestra en la figura 46, la respuesta de anticuerpo después de la vacunación con una vacuna viral se aumentó mediante la adición de IRX-2. IRX-2 consistentemente incrementó la respuesta de célula T especifica de péptido comparada con el control en todos los puntos del tiempo.

IRX-2 incrementa la respuesta de célula T después de la vacunación con una vacuna de base viral Como se muestra en la figura 47, IRX-2 aumentó la respuesta de célula T especifica de antigeno después e la vacunación con una vacuna de base viral.

IRX-2 aumenta la respuesta de célula T después de la vacunación con una vacuna de base viral que expresa TRICOM.

IRX-2 aumentó la respuesta de célula T a ratones inmunizados con las dosis inferiores del constructo OVA-TriCom-ALVAC . La respuesta de célula T fue dependiente de la dosis puesto que la dosis inferior de OVA-TriCom-ALVAC dio una respuesta de célula T inferior. Como se muestra en la figura 48, IRX-2 aumentó la respuesta de célula T comparada con el control para ratones inmunizados con 3 xlO5 pfu por ratón pero no ratones inmunizados con una dosis más alta de OVA-TriCom-ALVAC (3 xlO6 pfu por ratón) .

IRX-2 aumenta la expansión de las células T de memoria especifica de antigeno después de la vacunación con una vacuna de base viral.

Como se muestra en la figura 49, IRX-2 aumentó las células T de memoria positiva de péptido comparadas con el control. Ambos de los ratones inmunizados con 106 PFU y 105 PFU tuvieron una respuesta más fuerte cuando IRX-2 se incluyó en la vacuna. La diferencia entre la respuesta primaria y la respuesta de expansión para la dosis más alta de vacuna puede ser debido a que la respuesta primaria mide las células T activas mientras que la respuesta de expansión se enfoca sobre las células de memoria.

IRX-2 aumenta la respuesta de anticuerpo IgM después de la vacunación con una vacuna de base viral.

Como se muestra en la Figura 50. IRX-2 aumenta la respuesta para el anticuerpo IgM especifico de ovalbúmina en todos los tiempos y dosis de OVA-ALVAC.

IRX-2 aumenta la respuesta de anticuerpo IgGi e IgG2ñ después de la vacunación con una vacuna de base viral.

Como se muestra en la figura 51 la respuesta de IgGi y la respuesta de IgG2A fueron más grandes en ratones inmunizados con IRX-2 comparados con el control cuando se gráfica como dilución del suero contra OD.

Discusión Los resultados de este estudio apuntan a que IRX-2 como una terapia poderosa que puede ser utilizado para iniciar una respuesta inmune celular contra antigenos de tumor exógenamente administrados en una vacuna de cáncer o enfermedad infecciosa. IRX-2 administrado con una vacuna basada en célula que expresa PSMA irradiada o una vacuna de conjugado de péptido sintético fue capaz de aumentar las respuestas inmunes de célula T in vivo a estos antigenos. La naturaleza novedosa de la actividad de IRX-2 se confirmó al comparar IRX-2 a otros adyuvantes, que se seleccionaron para representar varios mecanismos de acción. El alumbre se evaluó debido a que es un adyuvante aprobado por la FDA ampliamente utilizado, CpG debido a que es un agonista de TLR que dirige las células que presentan antigeno' y el Sistema de Adyuvante RIBI (RAS) debido a que contiene múltiples actividades y es una alternativa más segura de adyuvante de Freund en modelos de ratón. IRX-2 aumentó la respuesta de DTH especifica de péptido a la vacuna de conjugado pero el alumbre, CpG o RAS no lo hizo. El aumento de IRX-2 y la respuesta DTH especifica de péptido de célula T in vivo fue acompañada por las respuestas de célula T aumentada de las células del bazo ex vivo al antigeno especifico como es medido por la secreción de IFN-?. Estos resultados también están en paralelo a la respuesta de anticuerpo a los péptidos. Mientras que todos los adyuvantes aumentaron la respuesta del anticuerpo asi como la respuesta a DTH del portador de proteina (como es comparado con PBS) , solamente IRX-2 aumentó la respuesta de anticuerpo a los péptidos que se conjugaron en el portador. IRX-2 también aumentó la respuesta de anticuerpo especifica de péptido cuando las células que expresan PSMA irradiada se utilizaron como el inmunógeno. Estas observaciones son importantes debido a que hay un 80% de homología entre la proteína humana y ratón y muestra que la tolerancia del paciente se puede superar mediante IRX-2 como es comparado con otros adyuvantes.

Los estudios reportados aquí proporcionan datos preclínicos importantes que muestran que IRX-2 aumenta la respuesta inmune de célula T a los antígenos exógenos y se pueden utilizar en combinación con múltiples tipos de antígeno en vacunas de cáncer terapéuticas. La naturaleza única de la respuesta específica de péptido de célula T a tanto la vacuna de célula irradiada y de conjugado es un resultado de un modo de acción multi objetivo de IRX-2 y la sinergia entre las citoquinas. IRX-2 proporciona plataforma de adyuvante de célula T que dan por resultado en una vacuna con múltiples actividades que incluyen no solamente la presentación de antígeno incrementada sino también la estimulación de la diferenciación de célula T subsecuente, proliferación y migración a la periferia. Las citoquinas también desplazan la tolerancia de DC o el balance de célula T reguladora hacia la activación de la respuesta a los epítopes de célula T y aumenta la producción de células T de memoria. IRX-2 también aumenta los epítopes ayudantes de célula T en el portador o células irradiadas que proporcionan estimulación adicional del desarrollo de una respuesta de célula T efectiva.

Por toda esta solicitud, varias publicaciones, incluyendo patentes norteamericanas, son referenciadas por autor y año y las patentes por número. Las citas completas para las publicaciones se listan enseguida. Descripciones de estas publicaciones y patentes en sus totalidades se encontraron en la presente por referencia en esta solicitud con el fin de describir más completamente el estado de la técnica a la cual esta invención pertenece.

La invención se ha descrito en una manera ilustrativa, y se va a entender que la terminología que se ha utilizado se propone para estar en la naturaleza de palabras de descripción antes que de limitación.

Obviamente, muchas modificaciones y variaciones de la presente invención son posibles en vista de las enseñanzas anteriores. Por lo tanto, se va a entender que dentro del alcance de la invención descrita, la invención se puede practicar de otra manera que como se describe específicamente .

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición, caracterizada porque comprende cantidades sinergisticas de una sustancia biológica derivada de célula primaria que comprende las citoquinas IL-1, IL-2, IL-6, IL-8, TNF-a, e IFN-?, y una vacuna de cáncer que comprende por lo menos un antigeno.

2. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la composición para tratar cáncer se selecciona del grupo que consiste de cáncer de seno, cáncer colorrectal, cáncer de estómago, cáncer pancreático, cáncer de pulmón, cáncer de cerebro, cáncer de colon, cáncer ovárico, cáncer de lengua, cáncer de faringe, cáncer de próstata y melanoma.

3. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el antigeno se selecciona de proteínas que ocurren naturalmente, proteínas recombinantes , proteínas químicamente sintetizadas o combinaciones de las mismas.

. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el antígeno se selecciona del grupo que consiste de AFP, alfa-actinina-4 , ARTC1, BAGE, BCR-abI, B-RAF, CA 15-3, CA 19-9, CA-125, CASP-5, CASP-8, beta . -catenina, antígeno carcinoembriónico, antígeno carcinoembriónico modificado, mucinas mutadas asociadas a carcinoma, cdc27, CDK4, CDKN2A, CEA, cromogranina A, COA-1, quinasa dependiente' de ciclina 4, proteina de fusión dek-can, EFTUD, factor de alargamiento 2, receptor de factor de crecimiento epidérmico EGFRvIII, producto génico EBNA de Virus de Epstein Barr, ETA, proteina de fusión ETV6-A L1, FLT3-ITD, FN1, GAGE, gangliósidos, GPNMB, gp75/TRP-l, gplOO, H1FT, HAGE, HERV-K-MEL, proteina HER2 /neu, HIP-55, HIV-1, HIV-2, HLA-A2, HLA-A11, hsp70-2, KIAAO205, quinesina 2, KK-LC-1, KLK-4, KM-HN-1, KSA, LAGE, proteina de fusión LDLR-fucosiltransferasaAS, MAGE, mammaglobina-A, ART-l/ elan A, MART-2, ME1, proteoglicano de melanoma, miosina clase I, MUC-1, MUM-1, MUM-2, UM-3, NA-88, NCAM-180, neo-PAP, NFYC, NY-BR, NY-ESO-1, 0A1, OGT, OS-9, pl5, p21-ras, p53, pl85 HER2/neu, virus de papiloma E7 , virus de papiloma E6, proteina de fusión pmi-RARalfa, PRDX5, PTPRK, PSA, PSMA, RAGE, K-ras, N-ras, RAB38, RBAF600 , SAGE, SIRT2, SNRPD1, spl7, proteina de fusión SYT-SSX1, proteina de fusión SYT-SSX2, TA 90, TAG, factor antiapoptótico de TGF-ß? , TGF-pRII, tiroglobulina, TRAG-3 , triosefosfato isomerasa, TRP2, TRP2-INT2, proteina de tumor D52, tirosinasa, WY-1, fragmentos de los mismos, derivados de los mismos y combinaciones de los mismos .

5. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la vacuna además se define como que incluye por lo menos un antigeno codificado en un vector viral.

6. La composición de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque el vector viral se selecciona del grupo que consiste de retrovirus, adenovirus, virus adenoasociado (AAV) , virus de herpes y poxvirus.

7. La composición de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque el vector viral es un poxvirus seleccionado del grupo que consiste de vaccinia, Ankara de vaccinia modificada (MA) , NYVAC, avipox, TROVAX, fowlpox, y canarypox.

8. La composición de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque el canarypox se selecciona del grupo que consiste de ALVAC y ALVAC (2).

9. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada ^porque además incluye moléculas coestimuladoras seleccionadas del grupo que I consiste de abatacept, belatacept, CD28-SuperMAB, moléculas co-estimuladoras , B7/CD28, moléculas coestimuladoras de la superfamilia TNF, moléculas coestimuladoras de la familia SLAM y combinaciones de los mismos.

10. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque además incluye anti-CTLA- .

11. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque además incluye una molécula de agotamiento Treg.

12. La composición de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque la molécula de agotamiento Treg es denileucina diftitox.

13. La composición de conformidad con ,1a reivindicación 1, caracterizada porque además incluye antigenos asociados a angiogénesis .

14. La composición de conformidad con la. reivindicación 1, caracterizada porque además incluye agentes que aumentan la potencia seleccionados del grupo que consiste de (1) CD80, ICAM-1, y LFA-3; (2) IL-12 y GM-CSF; (3) IL-12, GM-CSF, y TNF-OÍ; (4) CD80 e IL-12; y (5) CD86, GM-CSF, e IL-12.

15. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque además está en combinación con un tratamiento seleccionado del grupo que consiste de quimioterapia, radiación, terapia anti-angiogénica y combinaciones de los mismos.

16. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la composición se administra mediante inyección perilinfática bilateral una vez al día.

17. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la sustancia biológica derivada de célula primaria además comprende las citoquinas IL-12, GM-CSF y G-CSF.

18. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada aporque además incluye un antigeno endógeno.

19. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque además incluye una cantidad efectiva de un inhibidor químico y un fármaco antiinflamatorio no esteroidal (NSAID) seleccionado del grupo que consiste de indometacina (INDO), Ibuprofen, celecoxib, rofecoxib, inhibidores de CoxII y combinaciones de los mismos.

20. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque IL-1 está presente en una concentración de 60 - 6,000 pcg/mL, IL-2 está presente en una concentración de 600-60,000 pcg/mL, IL-6 está presente en una concentración de 60-6,000 pcg/mL, IL-8 está presente en una concentración de 6000-600,000 pcg/mL, e IFN-? y TNF-a están presentes en una concentración de 200-20,000 pcg/ml.

21. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque además incluye un adyuvante seleccionado del grupo que consiste de adyuvantes independientes de receptor similar a toll, adyuvantes dependientes del receptor similar a toll, y combinaciones de los mismos.

22. Una composición para aumentar una respuesta inmune en un paciente, caracterizada porque comprende cantidades sinergisticas de una sustancia biológica derivada de célula primaria que comprende las citoquinas IL-1, IL-2, IL-6, IL-8, TNF-a, e IFN-?, en combinación con por lo menos un adyuvante.

23. La composición de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada porque el por lo menos un adyuvante se selecciona del grupo que consiste de adyuvantes independientes de receptor similar a toll, adyuvantes dependientes del receptor similar a toll y combinaciones de los mismos.

24. La composición de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada porque el adyuvante tiene un mecanismo de acción que es diferente que el mecanismo de acción de la sustancia biológica derivada de célula primaria.

25. Un método de vacunación, caracterizado porque incluye la etapa ce: administrar una composición que incluye cantidades sinergisticas de una sustancia biológica derivada de célula primaria que comprende las citoquinas IL-1, IL-2, IL-6, IL-8, TNF-o¡, e IFN-?, y una vacuna que comprende por lo menos un antigeno .

26. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el antigeno se selecciona del grupo que consiste de AFP, alfa-actinina-4 , ARTC1, BAGE, BCR-abI, B-RAF, CA 15-3, CA 19-9, CA-125, CASP-5, CASP-8, beta.-catenina, antigeno carcinoerabriónico, antigeno carcinoembriónico modificado, mucinas mutadas asociadas a carcinoma cdc27, CDK4, CDKN2A, CEA, cromogranina A, COA-1, quinasa dependiente de ciclina 4, proteina de fusión dek-can, EFTUD, factor de alargamiento 2, receptor de factor de crecimiento epidérmico EGFRvIII, producto génico EBNA de Virus de Epstein Barr, ETA, proteina de fusión ETV6-AML1, FLT3-ITD, FN1, GAGE, gangliósidos , GPNMB, gp75/TRP-l, gplOO, H1FT, HAGE, HERV-K-MEL, proteina HER2/neu, HIP-55, HIV-1, HIV-2, HLA-A2, HLA-A11, hsp70-2, KIAAO205, quinesina 2, KK-LC-1, KLK-4, KM-HN-1, KSA, LAGE, proteina de fusión LDLR-fucosiltransferasaAS, AGE, mamaglobina-A, MART-l/Melan A, MART-2, ME1, proteoglicano de melanoma, miosina clase I, MUC-1, MUM-1, MUM-2, MUM-3, NA-88, NCAM-180, neo-PAP, N FYC , NY-BR, NY-ESO-1, 0A1 , OGT, OS-9, pl5, p21-ras, p53, pl85 HER2/neu, virus de papiloma E7, virus de papiloma E6, proteina de fusión pmi-RARalfa, PRDX5 , PTPRK, PSA, PSMA, RAGE, K-ras, N-ras, RAB38, RBAF600 , SAGE, SIRT2, SNRPD1, spl7, proteina de fusión SYT-SSX1, proteina de fusión SYT -SSX2, TA 90, TAG, factor antiapoptótico de TGF-ß?, TGF- RII, tiroglobulina, TRAG-3, triosefosfato isomerasa, TRP2, TRP2-INT2, proteina de tumor D52, tirosinasa, WY-1, fragmentos de los mismos, derivados de los mismos y combinaciones de los mismos .

27. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque además incluye la etapa de coestimular las células T al administrar moléculas co-estimuladoras .

28. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque además incluye la etapa de prohibir la inhibición de las células T al administrar anti-CTLA-4.

29. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque además incluye la etapa de agotar los Tregs al administrar una molécula de agotamiento de Treg.

30. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque además incluye la etapa de prevenir la inducción del desarrollo continuo de vasos sanguíneos en tumores al administrar antígenos asociados a angiogénesis .

31. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque además incluye la etapa de administrar agentes que aumentan la potencia.

32. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque además incluye la etapa de realizar un tratamiento seleccionado del grupo que consiste de quimioterapia, irradiación, terapia angiogénica y combinaciones de las mismas.

33. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque la etapa de administración además se define como la administración de la composición mediante inyección perilinfática una vez al día.

34. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque la sustancia biológica derivada de célula primaria además comprende las citoquinas IL-12, G -CSF y G-CSF.

35. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque la composición además incluye un antigeno endógeno.

36. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque la composición además incluye una cantidad efectiva de un inhibidor químico y un fármaco antiinflamatorio no esferoidal (NSAID) seleccionado del grupo que consiste de indometacina (INDO), Ibuprofen, celecoxib, rofecoxib, inhibidor de Coxll y combinaciones de los mismos.

37. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque IL-1 está presente en una concentración de 60-6,000 pcg/mL, IL-2 está presente en una concentración de 600-60,000 pcg/mL, IL-6 está presente en una concentración de 60-6,000 pcg/mL, IL-8 está presente en una concentración de 6000-600,000 pcg/mL, e IFN-? y TNF- están presentes en una concentración de 200-20,000 pcg/mL.

38. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque además incluye las etapas de estimular la producción de células T na'i've, madurar células dendríticas inmaduras y permitir la presentación por las células dendríticas maduras resultantes del antígeno a las células T naive.

39. El método de conformidad con' la reivindicación 25, caracterizado porque además incluye la etapa de administrar por lo menos un adyuvante seleccionado del grupo que consiste de adyuvantes y dependientes del receptor similar a toll, adyuvante dependiente del receptor similar a toll y combinaciones de los mismos.

40. Un método para revertir la supresión inmune y ganar inmunidad al cáncer, caracterizado porque incluye las etapas de: administrar una composición que incluye cantidades sinergisticas de una sustancia biológica derivada de célula primaria que comprende las citoquinas IL-1, IL-2, IL-ß, IL-8, TNF-a, e IFN-?, y una vacuna de cáncer que comprende por lo menos un antigeno; estimular la producción de células T naive; maduras las células dendriticas inmaduras; y permitir la presentación por la célula dendriticas maduras resultantes del antigeno a las células naive, para de esta manera revertir la supresión inmune y ganar inmunidad al cáncer .

41. Un método para producir una respuesta inmune a un antigeno exógeno en un paciente, caracterizado porque incluye las etapas de: administrar un adyuvante de una sustancia biológica derivada de célula primaria que comprende las citoquinas IL-1, IL-2, IL-6, IL-8, TNF- , e IFN-?, y por lo menos un antigeno exógeno, en donde el antigeno exógeno normalmente no produce una respuesta inmune; y producir una respuesta inmune en el paciente.

42. Un método para aumentar una respuesta inmune en un paciente, caracterizado porque incluye las etapas de administrar una sustancia biológica derivada de célula primaria que comprende las citoquinas IL-1, IL-2, IL-6, IL-8, TNF-a, e IFN-?, en combinación con por lo menos un adyuvante; y aumentar la respuesta inmune del paciente mediante una interacción sinergistica de la sustancia biológica derivada de célula primaria y el adyuvante.

43. El método de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado porque el por lo menos un adyuvante se selecciona del grupo que consiste de un adyuvante independiente de TLR, un adyuvante dependiente de TLR y combinaciones de los mismos.

44. El método de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado porque además incluye la etapa de suministrar y concentrar antigenos, dirigir los antigenos a células que presentan antigeno, y colocalizar antigenos y potenciadores inmunes al administrar un adyuvante independiente de TLR.

45. El método de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado porque además incluye la etapa de estimular directamente el sistema inmune del paciente al activar TLRs al administrar un adyuvante dependiente de TLR.

46. El método de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado porque además incluye la etapa de administrar por lo menos un antigeno exógeno.

47. .El método de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado porque el adyuvante tiene un mecanismo de acción que es diferente del mecanismo de acción de la sustancia biológica derivada de célula primaria.

48. Un método para incrementar la función de un sistema inmune, caracterizado porque incluye las etapas de: administrar una sustancia biológica derivada de célula primaria que comprende las citoquinas IL-1, IL-2, IL-6, IL-8, TNF-a, e IFN-?, en combinación con por lo menos un adyuvante, en donde el adyuvante tiene un mecanismo de acción que es diferente que el mecanismo de acción de la sustancia biológica derivada de célula primaria; e incrementar la función de la respuesta inmune.