TWI733719B - 改善的組合物及用於新表位之病毒遞送的方法及其應用 - Google Patents

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Abstract

通過癌症相關或腫瘤專一的(新)表位與共激分子及/或其它免疫活化劑的共同表達來增強癌症的免疫治療。若有需要，可以通過施用免疫檢查點抑制劑來增強治療。

Description

改善的組合物及用於新表位之病毒遞送的方法及其應用
本發明的領域是腫瘤疾病的治療，特別是涉及使用重組病毒預防和治療腫瘤疾病。
技術背景的描述包含了對於理解此發明有用的訊息。這並不代表本文提供的任何訊息是現有技術，或與所請發明相關，或者這些訊息也不是指任何指明或隱示的出版物或跟現有技術相關。
本文中所有的出版物以相同程度併入做為參考，如同各別出版物或專利申請的如其所指的特別或者單獨的併入參照。當一術語的使用或定義在併之參考和本文之間不一致或彼此相反，則該術語的定義遵從本文而不遵從參照。
眾所周知的是，大多數腫瘤疾病伴隨有相對大量的突變，包含點突變、插入、缺失和易位。因此，合理的假設腫瘤細胞也應當透過一或多種突變蛋白的存在來表徵。不幸的是，儘管在這樣簡單的前提下，適合於診斷和治療之突變蛋白質的尋找由於不同癌症類型具有不同的突變蛋白質而變得複雜；更糟的是，不同患者之間儘管具有相同的腫瘤類型，患者之間仍儲藏著非常不同的突變蛋白。
最近，許多研究努力的結果顯示，已收集到少量由T細胞所定義的人類腫瘤抗原(參見Cancer Immunity(15 July 2013) Vol. 13, p. 15)，然而，這些抗原並沒有形成單一有效的治療劑。此外，由於這些抗原已存在於被診斷患有癌症的患者中，因此這些抗原在免疫治療中的使用至少在概念上是值得質疑的，因為這些抗原應當產生適當的免疫反應。進一步而言，即使腫瘤專一抗原被鑑定並用於癌症疫苗中，對這種抗原的免疫反應可能不足以引起治療效果。
因此，雖然至少在理論上可以鑑定所有腫瘤抗原，但是鑑定將不能提供有意義且可操作的數據集。因此，不僅需要能對癌症新表位進行快速鑑定、診斷及/或治療應用的新系統和方法，而且需要引起對這些抗原預防及/或治療有效的免疫應答。
發明人發現可以通過組學分析，合理的導正基於新表位的癌症免疫治療，其首先鑑定癌症新表位，再確認患者的HLA型和新表位之間的HLA型匹配，接著使用一表達系統(通常為病毒遞送/表達系統)，其不僅將新表位編碼的核酸遞送至患者的免疫活性細胞，而且提供共激分子(co-stimulatory molecule)。另外，此類治療還可包含施用一種或多種免疫檢查點抑制劑以進一步增強或刺激強健的免疫反應。
在本發明標的的一方面，發明人構思了一種產生重組病毒的方法，其包含鑑定患者的癌症相關新表位的步驟，下一步確定新表位與患者HLA型之間的連結，以及決定新表位的表達水平，接著下一步選擇至少一種共激分子，其後一步基因修飾一病毒使其包含編碼至少一共激分子以及癌症相關新表位的核酸。
關於病毒，通常指的病毒是腺病毒或複製缺陷型病毒。 此外，優選為非免疫原性的病毒。因此，優選的病毒包含腺病毒，特別是Ad5 [E1- E2b- ]。
患者的癌症相關新表位之鑑定，會優先選擇用電腦模擬，對腫瘤和匹配的正常樣品的組學數據，做位置引導的同步比對，並且於所構想的方法中，可以進一步包含在電腦模擬中預測患者的HLA類型的步驟。 雖然未限定本發明標的，但是相比於匹配的正常樣品，新表位的表達水平優選為至少20％以上。
進一步而言，共激分子可選自於由B7.1(CD80)、B7.2(CD86)、CD30L、CD40、CD40L、CD48、CD70、CD112、CD155、ICOS-L、4-1BB、GITR-L、LIGHT、TIM3、TIM4、ICAM-1和LFA3(CD58)所組成的群組。 此外，核酸還可以包含編碼細胞因子(cytokine)的序列(例如IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-15超激動劑(IL-15N72D)及/或IL-15 超級激動劑/ IL-15RαSushi-Fc融合複合物)。或者，或進一步的，核酸還可以包含編碼SMAC的至少一組成的序列(例如CD2、CD4、CD8、CD28、Lck、Fyn、LFA-1、CD43及/或CD45或其各自的結合對應物)。若需要，核酸可另外包含編碼STING途徑的活化劑的序列，例如一嵌合蛋白，其內EBV的LMP1跨膜結構域融合至IPS-1的信息傳遞域。
此外，還考慮將一區段包含在編碼至少第二(或第三或第四等)個不同癌症相關新表位之核酸中。如此所產生的重組病毒可以進一步培養以獲得至少104 個病毒顆粒，或更常見之107 個。
因此，發明人還構思了一重組病毒，其包含一核酸，其編碼一或多種HLA匹配的癌症新表位；以及一或多種共激分子，其功能上耦合於一用以在被重組病毒感染之細胞內表達新表位及共激分子之啟動子。較佳的，病毒為腺病毒，最佳為Ad5 [E1- E2b- ]。
在本發明標的的一些特定方面，共激分子是選自於由B7.1(CD80)、B7.2(CD86)、CD30L、CD40、CD40L、CD48、CD70、CD112、CD155、ICOS-L、4-1BB、GITR-L、LIGHT、TIM3、TIM4、ICAM-1和LFA3(CD58)所組成的群組。另外，設想的病毒中核酸還包含具有編碼細胞因子(cytokine)的序列(例如IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-15超激動劑(IL-15N72D)及/或IL-15 超級激動劑/ IL-15RαSushi-Fc融合複合物)、編碼SMAC的至少一組成的序列(如CD2、CD4、CD8、CD28、Lck、Fyn、LFA-1、CD43及/或CD45或其各自的結合對應物)、及/或編碼一STING途徑的活化劑的序列(例如一嵌合蛋白，其內EBV的LMP1跨膜結構域融合至IPS-1的信息傳遞域)。
在進一步構思的方面，藥物組合物包含一或多種(可能不同的)重組病毒。在其它用途中，通常預期重組病毒是用於治療患者的癌症。
因此，本發明人還考慮了一種治療患者的方法，其步驟包含：從患者獲得腫瘤樣品和匹配的正常樣品；另一步驟包含鑑定患者的HLA類型和鑑定癌症相關新表位；進一步基因修飾一病毒使其包含 (i) 當結合親和力低於預定閾值時，編碼新表位之核酸，和(ii) 編碼至少一共激分子的核酸；以及向患者施用或引起向患者施用基因修飾的病毒(例如，通過皮下或瘤內註射)。
在一些方面，鑑定患者的HLA類型和鑑定癌症相關新表位是使用來自腫瘤樣品和匹配的正常樣品的基因組信息進行電腦模擬。關於合適的共激分子、細胞因子、SMAC的組成和STING途徑的活化劑方面，也適用跟上述相同的思維。同樣的，用於施打的優選病毒包含腺病毒，特別是Ad5 [E1- E2b- ]。 若需要，構想的方法可以進一步包含施用免疫檢查點抑制劑的步驟。
從以下優選實施例的詳細描述中，配合附圖本發明標的的各種標的、特徵、方面和優點將變得更加顯而易見，其中附圖中相同的符號代表相同的元件。
發明人發現可以通過鎖定患者專一之HLA匹配新表位 和優選使用非免疫原性或低免疫原性的病毒遞送載體，進行共激分子的共遞送，可改善免疫治療組合物的功效。優選的，共遞送可以藉由來自單重組遞送系統之新抗原和共激分子，它們的的單、雙或多順反子(multi-cistronic expression)的表達來實現。
為此，提出了免疫治療的各種系統、組合物和方法，其中，病 毒載體或其它表達系統被用來遞送一種或多種患者專一和疾病特專一之抗原(例如，新表位、癌症專一抗原，如PSA、PSMA等，或癌症相關抗原如brachyury、CEACAM等)於受癌症影響的個體以產生治療效果，進一步通過一或多種共激分子在相同細胞內共表達而增強。儘管不希望受特定理論或假設的束縛，發明人設想共激分子的共表達將有助於抗原呈遞細胞和T細胞之間免疫突觸的形成和修護，並維持一段時間使足以活化T細胞。因此，預期治療效果是針對攜帶抗原的癌細胞之保護性免疫應答。
在本發明標的的一個特別構想的方面中，如同下文中更詳細討論 的，被診斷有癌症的個體之患者及癌症專一新表位，優選的是使用來自患者的腫瘤和匹配正常(即非癌症)組織樣品的核酸序列資訊所決定。在本文中，應當理解的是，當使用腫瘤和匹配的正常樣品鑑定新表位時，患者樣品和參考基因組之間所有或幾乎所有觀察到的非腫瘤相關變化都應當排除。因此，並且從不同的角度來看，同一患者的腫瘤和匹配正常樣品之間的比較將消除所有人和人之間或患者和參考之間的變異，否則這些變異應當有很高的發生頻率，同時這會因此消除大量潛在假陽性新表位。
此外，為了增加正確呈現和識別如此鑑定之患者和癌症專一新 表位的可能性，則需確定患者的特定HLA類型(例如，使用如下文更詳細描述之電腦模擬預測方式)，並且對所確定的新表位之結合親和力以電腦模擬進行測試。最典型的，HLA型測定包含至少三種MHC-I亞型(例如HLA-A、HLA-B、HLA-C)和至少三種MHC-II亞型(例如HLA-DP、HLA-DQ、HLA-DR)，優選的，將每個亞型確定為至少4位精準度。然後將這樣鑑定的高親和力結合物的序列反譯成各自相對的核酸序列，接著在一或多種調節序列控制下將其複製到重組表達系統(例如腺病毒Ad5 [E1-E2b-])中，以在感染病毒後的宿主細胞中表達。更進一步的，應當理解的是，優選的表達系統還將包含與新表位序列結合的一或多個序列元素，其將會使表達的新表位指向具有高親和力之MHC-I及/或MHC-II亞型。
因此，重組病毒或其它表達系統被預期將導致真實的患者專一和 癌症專一新表位的細胞內表達，其不僅適合而且還針對HLA的表達，其被建立為對新表位具有高親和力，其又被預期會產生具有高可預測性的免疫應答，導致對宿主內對腫瘤的有效治療的免疫應答。為了再進一步增加針對腫瘤的有效治療的免疫應答的機會，新表位與組裝活化免疫突觸(例如ICAM-1、B7.1、 CD48和其他SLAM蛋白，例如CD84、CD150、CD229及/或CD244)所需的一多種共激分子共表達，活化性免疫突觸接在抗原呈遞細胞共表達抗原和共激分子和T細胞及/或接用於活化T細胞者(例如， B7.1(CD80)、B7.2(CD86)、ICAM-1(CD54)、ICOS-L 、LFA-3(CD58)、4-1BBL、CD30L、CD40、CD40L、CD48、CD70、CD112、GITRL、OX40L及/或TL1A)。
當然，應當注意，多個新表位和共激分子可以與本文所教示的結 合使用，並且在特別優選的方面，使用至少兩個，至少三個，至少四個或至少五種不同的新表位，和使用至少兩種，至少三種，至少四種或至少五種不同的共激分子(例如，編碼在相同的重組病毒中或在不同的病毒中)。最後，合適的表達系統可以進一步包含編碼蛋白質的附加序列，蛋白質支持於表達新表位的細胞環境內之免疫應答。例如，合適的蛋白質包含免疫刺激性細胞因子(immune stimulatory cytokines)(例如IL-2、IL-7、IL-12、IL-15或IL-15超激動劑等)，及/或檢查點抑制劑( CTLA-4或PD1的信令抑制劑)。
關於重組病毒或其他表達系統，這些系統被預期用於基因設計抗 原呈遞細胞，特別是轉染樹突細胞(transfect a dendritic cell)。或者，如同下文所更詳細描述的，重組病毒或其它表達系統也可以作為DNA疫苗，或通過皮下或瘤內注射施用。相似的，重組病毒或其他表達系統可用於體外轉染各種細胞，然後施用於個體。 新表位的 選擇
新表位可以表徵為在產生獨特和腫瘤專一抗原的腫瘤細胞中 表達的隨機突變。因此，從不同的角度來看，可以通過考慮突變的類型(例如缺失、插入、顛換(transversion)、轉換、易位)和影響(例如，無義，錯義，框移等)來鑑定新表位，其本身可以用作第一內容過濾器(first content filter)，通過該第一內容過濾器消除沉默和其他非相關(例如，非表達)突變。還應當理解的是，新表位序列可以定義為具有相對短長度(例如7至11個單體)的序列段，其中這樣的序列段將包含胺基酸序列中的改變。最典型的，改變的胺基酸在中心胺基酸位置處或附近。例如，典型的新表位可以具有A4 -N-A4 或A3- N-A5 或A2 -N-A7 或A5 -N-A3 或A7 -N-A2 的結構，其中A是蛋白原胺基酸，N是改變的胺基酸(相對於野生型或相對於匹配的正常型)。例如，本文所涵蓋的新表位序列包含具有相對短長度(例如，5-30個單體，更典型的7-11個單體，或12-25單體)的序列段，其中這樣的序列包含胺基酸序列中的改變。
因此，應當理解的是，單個胺基酸改變可以存在於包含改變的胺基酸的許多新表位序列中，取決於改變的胺基酸的位置。有利的，這樣的序列變異性允許新表位的多種選擇，並且因此增加潛在有用的靶標的數目，然後可以基於一或多個期望的性狀選擇 (例如，對HLA型患者的最高親和力、最高的結構穩定性、等等。)。最典型的，經由計算後， 新表位具有2-50個之間的胺基酸，更常見的則是5-30個之間的胺基酸，而最常見的是9-15個之間的胺基酸長度，改變的胺基酸優選的會位於中心位置，或位於一可改善其與MHC結合的位置。例如，當表位由MHC-I複合物呈遞時，典型的新表位長度為約8-11個胺基酸，而經由MHC-II複合物呈遞的典型新表位長度具有約13- 17個胺基酸。如將容易理解的，因為新表位中改變的胺基酸的位置可以不是中心，所以實際的胜肽序列和新表位的實際拓撲結構可以有顯著的變化。
當然，應當理解的是，新表位的鑑定或發現可以以多種生物材料開始，包含新鮮活組織的檢查、冷凍或以其他方式保存的組織或細胞樣品、循環腫瘤細胞、外來體、各種體液(特別是血液)等。因此，合適的組學分析方法包含核酸測序，特別是在DNA上操作的NGS方法(例如Illumina測序、離子流測序、454焦磷酸測序(pyrosequencing)、納米孔測序等) 、RNA測序(例如，RNAseq、基於反轉錄的測序等)，以及基於蛋白質測序或基於質譜的測序(例如，SRM、MRM、CRM等)。
因此，特別是對於基於核酸的測序，應特別認識到腫瘤組織的高通量基因組測序將允許新表位的快速鑑定。然而，必須理解的是，在將所獲得的序列信息與標準參考進行比較時，通常發生的患者間變化(例如，由於SNPs、短插入缺失、不同重複數目等)以及雜合性會導致相對大量的潛在假陽性新表位。因此，許多鑑定的新表位不可能成為成功免疫策略的候選者。值得注意的是，在將患者的腫瘤樣品與同一患者匹配的正常(即，非腫瘤)樣品進行比較時，可以消除這種不準確性。
在本發明標的的一個特別優選的方面，DNA的分析可以通過腫瘤和匹配正常樣品的全基因組測序及/或外顯子組測序(通常在至少10x，更典型的至少20x的覆蓋深度)來進行。或者，也可以從先前序列確定中已經建立的序列記錄(例如，SAM、BAM、FASTA、FASTQ或VCF文件)提供DNA數據。因此，數據集可以包含未處理或處理的數據集，示例性數據集包含具有BAMBAM格式、SAMBAM格式、FASTQ格式或FASTA格式的數據集。然而，特別優選的數據集，是以BAMBAM為格式或作為BAMBAM diff物件(參見例如US2012/0059670A1和US2012 / 0066001A1)。此外應當注意的是，數據集反映了同一患者的腫瘤和匹配的正常樣品，從而獲得患者和腫瘤專一的信息。因此，可以排除不產生腫瘤的遺傳種系改變(例如沉默突變、SNP等)。當然，應當認識到，腫瘤樣品可以來自初始腫瘤、來自治療開始時的腫瘤、來自複發性腫瘤或轉移部位等。在大多數情況下，患者的匹配正常樣品可以是血液，或來自與腫瘤相同組織類型的非患病組織。
同樣的，序列數據的計算分析可以以多種方式執行。然而，在最優選的方法中，數據分析是用電腦模擬對腫瘤的組學數據和匹配的正常樣品(來自相同患者的健康組織)，做位置引導的同步比對，例如在US2012 / 0059670A1和US2012 / 0066001A1中所揭露使用的BAM文件和BAM服務器。這種分析有利的減少假陽性新表位，並顯著降低對存儲器和計算資源的需求。
應當注意的是，針對電腦的任何語言應當被理解為包含電腦元件的任何合適的組合，包含伺服器、介面、系統、資料庫、代理、用戶群、引擎、控制器或其他單獨或集體運作的的計算元件。應當理解的是，計算元件包含配置為執行存在有形的非暫時性電腦可讀存介質(例如，硬盤驅動器、固態驅動器、RAM、閃存、ROM等)上之軟件指令的處理器。軟件指令優選的配置計算元件以提供角色、職責或如下面關於所公開的裝置所討論的其他功能。此外，所公開的技術可以實現為包含存儲軟件指令的非暫時性電腦可讀介質的電腦可程序產品，所述軟件指令使處理器執行公開步驟，所述公開步驟與基於計算機之算法、過程、方法或其他說明的實施有關。在特別優選的實施例中，各種伺服器、系統、資料庫或介面使用可能基於HTTP、HTTPS、AES、公-私鑰交換(public-private key exchanges)、web服務APIs、已知的金融交易協議或其他電子信息交換方法來交換數據。設備之間的數據交換可以通過封包交換網絡、互聯網，LAN、WAN、VPN或其他類型的封包交換網絡來進行;電路交換網絡;電池交換網絡(cell switched network);或其他類型的網絡。
為了進一步促進計算分析並改善基於新表位之治療法的治療結果，新表位序列將被限制為具有MHC-I結合所必需之最小大小(例如，至少5-6個胺基酸)的相對小片段，和具有對於MHC-I結合有利的最大大小(例如，9-11個胺基酸)；或具有MHC-II結合所必需的最小大小(例如，至少12-14個胺基酸)的相對小片段，以及具有對於 MHC-II結合有利的最大大小(例如，19-21個胺基酸)。因此，對於MHC-I結合，新表位通常具有7-12個胺基酸之間的長度，對於MHC-II結合，新表位通常具有14-20個胺基酸之間的長度。例如，合適的新表位可以具有9個胺基酸(其中它們被確定與MHC-1結合)的長度，其包含改變的胺基酸，和20個胺基酸的長度(其中它們被確定為結合MHC-II )，其包含改變的胺基酸。
從不同的觀點來看，可以建立患者和癌症專一的電腦模擬序列集合，其具有5至25個胺基酸的預定長度並且包含至少一個改變的胺基酸。對於每個改變的胺基酸，這種收集通常包含至少兩、三、四、五或六個成員，其中改變的胺基酸的位置不相同。然後這種收集將如下文更詳細描述的，可用於進一步過濾(例如通過亞細胞定位、轉錄/表達水平、MHC-I及/或II親和力等)。
例如，使用對腫瘤和匹配的正常序列數據的同步位置引導分析，發明人先前從多種癌症和患者中鑑定了多種癌症新表位，包含以下癌症類型：BLCA、BRCA、CESC、COAD、DLBC 、GBM、HNSC、KICH、KIRC、KIRP、LAML、LGG、LIHC、LUAD、LUSC、OV、PRAD、READ、SARC、SKCM、STAD、THCA和UCEC。 所有新表位數據可以在國際申請PCT/US16/29244中找到，其通過引用併入本文。
應當注意的是，根據癌症的類型和階段，新表位的數量可能會超過實際用於免疫治療的數量。此外，並非所有如此鑑定的新表位必將導致患者的有效治療反應。實際上，本領域眾所周知的是，只有一部分新表位會產生免疫應答。為了增加治療上期望的應答的可能性，可以進一步過濾新表位。當然，應當理解的是，在本文提出的方法的目的中，下游分析不需要考慮沉默突變。然而，除了突變類型(例如，缺失、插入、顛換、轉換、易位)之外，優選的突變分析還能提供有關突變影響的訊息(例如，無義、錯義等)，並且可以作為消除沉默突變的第一內容過濾器。例如，可以選擇新表位用於進一步考量，而其中突變是框架位移、無義及/或錯義突變。
在進一步的過濾方法中，也可以對新表位進行亞細胞定位參數的詳細分析。例如，如果新表位被鑑定為具有膜相關位置(例如，位於細胞的細胞膜的外部)，及/或如果電腦結構模擬計算確認了所述新表位可能是暴露於溶劑的，或新表位呈現結構穩定的表位(例如，J Exp Med 2014)等，則可以選擇新表位序列用於進一步考量。
關於新表位的過濾，通常預期新表位特別適用於本文，其中組學(或其他)分析揭示新表位實際上是被表達的。新表位的表達和表達水平的鑑定可使用本領域已知的所有方式進行，優選的方法包含定量RNA(hnRNA或mRNA)分析及/或定量蛋白質組學分析。最典型的，用於包含新表位的閾值水平至少是相應匹配的正常序列表達水平的20％，更典型的至少為50％，從而確保(新)表位對於免疫系統至少為潛在「可見的」。在本文中，新表位的表達水平是相對於沒有新表位的相應(「野生型」、匹配的正常型)序列之表達水平。因此，通常優選的是，組學分析還包含基因表達的分析(轉錄組學分析)(transcriptomic analysis)，以幫助鑑定突變基因的表達水平。
本領域存在許多已知轉錄組學的分析方法，並且所有已知的方法都被適用於本文。例如，優選的材料包含mRNA和初級轉錄物(hnRNA)，並且RNA序列信息可以從反轉錄的polyA+ -RNA獲得，其從同一患者的腫瘤樣品和匹配正常(健康)樣品獲得。同樣的，應當注意的是，雖然通常優選polyA+ -RNA作為轉錄組的代表，但是其它形式的RNA(hn-RNA、非聚腺苷酸化的RNA、siRNA、miRNA等)也被認為適用於本文。在其它方面， RNA的定量和測序會使用基於qPCR及/或rtPCR的方法進行，儘管各種替代方法(例如，基於固態雜交的方法)也被認為是合適的。從另一個角度來看，轉錄組分析適於(單獨或與基因組分析一併使用)用以鑑定和定量具有癌症和患者專一的突變基因。
類似的，可以以多種方式進行蛋白質組學分析以確定新表位的RNA實際轉譯，同時本文涵蓋所有已知的蛋白質組學分析方式。然而，特別優選的蛋白質組學方法包含基於抗體的方法和質譜方法。此外，應當注意的是，蛋白質組學分析不僅可以提供關於蛋白質本身的定性或定量信息，而且還可以包含蛋白質具有催化或其他功能活動的蛋白質活性數據。用於進行蛋白質組測定的一種示例性技術被描述於US 7473532中，其通過引用併入本文。進一步合適的鑑定和甚至是蛋白質表達之定量包含各種質譜分析(例如，選擇性反應監測(selective reaction monitoring, SRM)、多反應監測(multiple reaction monitoring, MRM)和連續反應監測(consecutive reaction monitoring, CRM))。
在過濾的另一方面，可以將新表位與含有已知人類序列(例如，患者的序列或患者序列的集合)的資料庫進行比較，以避免使用相同人類的序列。此外，過濾還可以包含去除由於患者中SNP所導致的新表位序列，其中所述SNP存在於腫瘤和匹配正常序列中。例如，dbSNP(單核苷酸多態性資料庫)(The Single Nucleotide Polymorphism Database)是由國家生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)與國家人類基因組研究所(National Human Genome Research Institute, NHGRI)合作開發和託管的不同物種內和之間之遺傳變異的免費公共檔案庫。雖然資料庫的名稱意味著僅有一類多態性的集合(單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphisms, SNP))，但事實上其包含相對較寬範圍的分子變異：(1)SNPs、(2)短缺失和插入多態性(indels / DIPs)、(3​)微衛星標記或短串聯重複(STRs)、(4)多核苷酸多態性(multinucleotide polymorphisms, MNPs)、(5)雜合序列和(6)命名的變體。dbSNP接受明顯中性多態性，以及對應於已知表型的多態性和無變異的區域。使用如上所述的資料庫和其他過濾選項，可以過濾患者和腫瘤專一新表位以去除那些已知序列，以產生實質上擁有較少假陽性的多個新表位序列之序列集。
在較不優選的方面，癌症和患者專一新表位可以被更常見的新表位增強或甚至替代。例如，預期常見的新表位包含各種癌症相關和癌症專一抗原(例如，具有至少0.1％，或至少0.5％，或至少1％，或至少5％的頻率)。或者，合適的新抗原還可以包含那些被鑑定為在至少一種特定MHC亞型中，以預定的最小頻率(例如，具有至少0.1％，或至少0.5％，或至少1％，或至少1％，或至少1％ 至少5％)發生的新抗原。在我們共同擁有的國際申請案PCT/US16/26798和PCT/US16/29244中公開了進一步有關新表位、方法和與其相關的系統的其它方面，兩者通過引用併入本文。 HLA 的決定和匹配
人類主要組織相容性複合物(human major histocompatibility complex，MHC)或人類白血球抗原(human leukocyte antigen，HLA)複合物包含許多遺傳基因座(genetic loci)，其包含至少七個基因座，其編碼兩種被共表達的不同類型之高度多態性細胞表面抗原。這些分子將加工的肽結合並呈遞到循環的T細胞淋巴細胞，並且這些分子對細胞和體液的免疫應答都是關鍵的。因此，在本文的免疫治療中，顯而易見的是，當新表位被MHC複合物結合並由其呈遞時，新表位會更為有效。
然而，不幸的是，MHC複合物在不同患者間存在高度多樣性和不同，這使得新表位在結合預測方面變得困難。I類分子HLA-A、HLA-B和HLA-C以及II類分子DR、DQ和DP被編碼在染色體6p21.31的短臂中約3500kbp的區段(示意圖 1A 和 1B )。I類抗原存在於所有的有核細胞上，其中它們作為細胞表面異源二聚體(cell surface heterodimer)，其主要將衍生自細胞溶質(病毒和自身胜肽)的胜肽呈遞至循環的CD8 + T細胞。I類細胞表面異源二聚體具有一個高度多態性α鏈，其中可變殘基聚集在胜肽結合裂口(binding cleft)內，其由基因的外顯子2和3編碼。 HLA I類分子還作為殺手免疫球蛋白受體(killer immunoglobulin receptors，KIR)的配體，其調節自然殺手(natural killer ，NK)細胞的細胞毒性之活性。HLA II類分子被發現在B細胞、巨噬細胞和其它抗原呈遞細胞的表面上，其中α-β異源二聚體主要將外源性衍生胜肽(細菌和化學毒素)呈遞給循環CD4 + T細胞。在II類分子中，β鏈包含高度多態性區域，其被侷限於基因的外顯子2並編碼胜肽結合裂口。
因此，應當理解的是，有效的結合和呈遞是新表位序列和患者特定HLA類型的組合功能。最典型的，HLA型測定包含至少三種MHC-I亞型(例如HLA-A、HLA-B、HLA-C)和至少三種MHC-II亞型(HLA-DP、HLA-DQ、HLA-DR)，優選的將每個亞型確定為至少4位數的深度。然而，本文還預期更高的深度(例如，6位數、8位數)。
一旦確定了患者的HLA類型(使用已知的化學或電腦模擬測定)，就可算出或者從數據庫獲得一HLA類型的結構解決方案，然後將其用於電腦對接模型(docking model)中以確定(通常為已過濾的)新表位與HLA結構解決方案的結合親和力。如下文將進一步所討論者，用於測定結合親和力的合適系統包含NetMHC平台(見例如Nucleic Acids Res.2008 Jul 1; 36(Web Server issue)：W509-W512)。然後選擇先前確定具有高親和力(例如，小於100nM、小於75nM、小於50nM)的HLA型之新表位，搭配對MHC-I/II亞型的知識，以創建治療。
HLA測定可以使用本領域熟知的濕化學中的各種方法進行，並且所有這些方法都被認為適用於本文。然而，在特別優選的方法中，也可使用一參考序列，其包含大多數或所有已知及/或常見的HLA類型，藉以透過電腦模擬來預測HLA類型，如以下文更詳細說明者。
例如，根據本發明標的的一個優選方法中，由資料庫或測序機提供映射到染色體6p21.3(或任何其他發現HLA等位基因位置的附近/該處)的相對大量的患者序列讀數。最典型的，序列讀數具有約100-300個鹼基的長度，並且包含中介數據(metadata)，包含讀取質量、比對信息、取向、位置等。例如，合適的格式包含SAM、BAM、FASTA、GAR等。儘管並非用於限定本發明標的，通常優選患者序列讀數提供至少5x、更常見為至少10x、更為常見是至少20x並且最常見是至少30x的覆蓋深度。
除了患者序列讀取之外，設想的方法還使用一或多個參考序列，其包含多個已知的和不同的HLA等位基因序列。例如，典型的參考序列可以是合成的(無相對的人或其他哺乳動物對應物)序列，其包含至少一具有該HLA類型的多個HLA等位基因的HLA類型的序列區段。例如，合適的參考序列 包含不同HLA-A的至少50個等位基因的已知基因組序列的集合。可替代的或附加的，參考序列還可包含HLA-A的至少50個不同等位基因的已知RNA序列的集合。當然，如下文更詳細所討論者，參考序列不限於HLA-A的50個等位基因，但是可以具有關於HLA類型和等位基因數量/組成的替代組成。最典型的，參考序列是電腦可讀取格式，並且由資料庫或其他數據存儲設備提供。例如，合適的參考序列格式包含FASTA，FASTQ，EMBL，GCG或GenBank格式，並且可以直接從公共數據庫(例如，IMGT、International ImMunoGeneTics information system或The Allele Frequency Net Database、EUROSTAM、www.allelefrequencies.net)。或者，參考序列還可以基於一或多個預定標準，例如等位基因頻率、種族等位基因分佈、常見或罕見等位基因類型等，進而從個體已知的HLA等位基因構建。
現在使用參考序列時，可以將患者序列讀數通過de Bruijn圖以鑑定具有最佳擬合的等位基因。在本文應當注意的是，每個個體對於每種HLA類型攜帶兩個等位基因，並且這些等位基因可以非常相似，或者在一些情況下甚至是相同的。這種高度的相似性對於傳統的對準方式提出了很大的問題。發明人發現HLA等位基因甚至是非常密切相關的等位基因可以使用這樣的方法來解析，其中通過將讀取的序列讀數分解為相對小的k聚體(通常為具有10至20個鹼基之間的長度)來構建de Bruijn圖，並且通過實施加權投票步驟，其中每個患者的序列讀數基於與等位基因序列匹配的序列讀數之k聚體提供投票(「定量讀取支持」)予每個等位基因。然後，累積最高票數的等位基因表示為最可能的預測HLA等位基因。此外，通常優選與等位基因匹配的每個片段也用於計算此等位基因的總覆蓋度和覆蓋深度。
評分方式可以根據需要進一步改良或改進，特別是當許多最佳結果是相似的情況下(例如，當他們大部分的得分來自於高度共享的k聚體集合之情況)。例如，分數的改良可以包含加權方案，其會將與目前最佳結果實質上相似(例如，＞99%或其他預定值的等位基因自未來所考慮的部分中移除。然後，以一倍數(例如，0.5)對目前最佳結果使用的k聚體之計數進行重新加權，並且將這些加權計數加總以重新計算每個HLA等位基因的分數。重複此選擇步驟以找到新的最佳結果。此方法的準確性可以進一步透過使用允許由腫瘤表達的等位基因鑑定的RNA序列數據，甚至可以進一步改進該方法的準確性，所述腫瘤有時可能僅僅存在於DNA中的2個等位基因中的1個。在更有利的方面，所設想的系統和方法，可以加工DNA或RNA或DNA和RNA的組合以進行高度精確的HLA預測，並且可以從腫瘤或血液DNA或RNA獲得。另外，在國際PCT/US16/48768中描述了用於高精確度的電腦模擬HLA分型的合適的方法及考慮，其通過引用將併入本文。
當需要時，可以基於等位基因頻率乘以每百萬數的轉錄物來對新表位進行評分/評級，藉以獲得相似的分數。 然後，可以使用HLA信息進一步增加該評分並計算對患者HLA類型的實際結合親和力。 例如，示例性排序格式可以是：
Figure 02_image001
這裡，文件是FASTA格式的文件，並且條目以「＞」字符開始，其僅報告樣本信息。 下一行是新表位。 在樣品信息行中包含用於索引樣品(例如254)、Refseq基因ID(例如NM_001000.3)、HUGO通用名(例如RPL39)、變體分類(例如，Missense)、蛋白質改變(例如，p.M29K)、鹼基對改變(例如，A-＞T)、正常表位(例如，正常：WIRMKTGNK)、等位基因頻率(例如，AF：0.179104477612)、基因的每百萬轉錄物(例如TPM：1023.96)、作為所有基因的中值表達水平的中位數TPM_MEDIAN(例如，TPM_MEDIAN：7.35)、僅為AF×TPM的LL分數(例如，LL：183.395820896)、netMHC預測結合值 (例如，netMHC：242.96)以及和新表位結合的特異性HLA等位基因(例如，等位基因：HLA-A0301)。 下一行是新表位(例如，WIRKKTGNK)。
一旦鑑定了患者和腫瘤專一新表位和HLA類型，可以通過將新表位與HLA接合以及決定最佳結合劑(例如，最低KD ，例如小於500nM、或小於250nM、或小於150nM、或小於50nM)來進行計算分析，例如使用NetMHC。應當理解的是，此方法不僅鑑定對於患者和腫瘤是真實的特定新表位，而且還鑑定最可能存在於細胞上並因此最有可能引起具有治療效果的免疫應答的新表位。當然，還應當理解的是，如下文進一步討論的，由此鑑定的HLA匹配的新表位可以在將編碼表位的核酸作為有效負載而包含在病毒內之前在體外進行生物化學驗證。
當然，應當理解的是，可以使用除了NetMHC之外的系統來進行患者的HLA型與患者和癌症專一的新表位的匹配，而合適的系統包含NetMHC II、NetMHCpan、IEDB分析資源(IEDB Analysis Resource)(URL immunipitope.org)、RankPep、PREDEP、SVMHC、Epipredict，HLABinding和其他 (見例如J Immunol Methods 2011; 374：1-4)。在計算最高親和力時，應當注意的是，可以使用新表位序列的集合，其中改變的胺基酸的位置被移動(同上)。可替代的或附加的，可通過添加N-及/或C-末端修飾以進一步增加表達的新表位以及患者的HLA型的結合來實施新表位的修飾。因此，新表位可以是如鑑定的為天然者，或者進一步修飾以更好的匹配特定的HLA類型。
此外，若需要，可以計算相對的野生型序列(即，無胺基酸變化的新表位序列)的結合以確保高差別親和力。例如，在新表位及其相對的野生型序列之間的MHC結合中，特別優選的高差別親和力為至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少100倍、至少500倍、至少1000倍等。
圖 2 示例性的表達了一系列過濾步驟的典型結果。這裡針對匹配的正常(即，相較於同一患者的非患病組織)的三陰性乳腺癌樣品的全基因組測序分析在同步位置導引比對中顯示腫瘤中相對大數目(〜18,000)的新表位樣品。值得注意的是，第一過濾步驟基於表達強度除去超過所有鑑定的新表位的50％。本處，相較於匹配的正常樣品，去除表達小於20％的表達水平的新表位序列。剩下的序列進行電腦模擬分析以確定這些序列會與單一專一的HLA型相同的樣品結合(例如，小於500nM親和力)的那些序列。應當注意的是，當移除了大部分的新表位，最終只發現所有新表位中少於1.3%是適合使用的。
應當注意的是，此分析對於從DNA及/或RNA測序信息的HLA測定是特別有利的，因為每種HLA類型具有許多通常非常相似的等位基因，並且由於傳統的比對方法在具有高度的相似性時通常不具有顯著的分化能力。此外，應當理解的是，此分析有利的是從已經自患者獲得的測序組學數據進行，而不需要專用的實驗室設備。從不同的角度來看，新表位發現、過濾、HLA型測定，甚至所鑑別的新表位與患者的特定HLA類型的結合都可以透過電腦模擬進行。 共激分子 的選擇
關於合適的共激分子，通常認為所有共激分子被認為是合適的，只要分子在抗原呈遞細胞中表達時具有關於T細胞活化的上調作用。例如，圖 3 示例性的示出樹突細胞上的共激分子及其在T細胞上的受體。
預期的上調作用可能是由於抑制了共抑制(例如，由CTLA4、PD1、CD160或BTLA介導的)及/或由於在T細胞的共刺激受體的活化(例如通過CD28、CD40L、ICOS、CD27、OX40、4-1BB、GITR、HVEM、Galectin9、TIM1、LFA、CD2等)。因此，合適的共激分子包含B7.1(CD80) 、B7.2(CD86)、CD40、ICOSL CD70、OX40L、4-1BB、GITRL、LIGHT、TIM3、TIM4、ICAM1和LFA3。可替代的或附加的，預期的共激分子也可以通過它們在活化中的特定功能來選擇。例如，共激分子可以由於它們在免疫突觸的形成及/或維持中的作用及/或由於它們在下游活化事件中的作用而被選擇。因此，合適的共激分子包含超分子活化簇(supramolecular activation cluster，SMAC)的一或多個組分，包含cSMAC(例如CD2、CD4、CD8、CD28、Lck及/或Fyn或其結合對應物)、pSMAC(例如LFA1或其結合對應物)和d-SMAC(例如，CD43、CD45或其結合對應物)。例如，當使用多於一種共激分子時，可能特別需要ICAM-1、CD60、CD80、CD86及/或CD48中的至少兩種。
最典型的，預期用於轉染細胞(以及特別是抗原呈遞細胞，例如樹突細胞)的重組核酸優選的除了一或多個新表位序列之外還包含如上所述之多於一個編碼共激分子的序列元素。實際上，通常預期合適的重組核酸包含編碼共激分子的至少二、或至少三、或至少四個序列元素。最典型的，當存在多種共激分子時，預期共激分子提供關於T細胞活化/活性的協同效應。因此，應當理解的是，重組核酸是用以使共激分子和新表位同時表達(其可以使用例如單個啟動子或多個誘導型啟動子實現)。另外，還應當理解的是，共激分子可以與合適的配體或受體一起在單個多肽鏈上或作為兩個不同的分子來表達。例如，當表達的受體是OX40時，受體可以與OX40L共表達。同樣的，當表達的配體是4-1BBL時，配體可以與4-1BB共表達。此外，雖然通常優選共激分子與它們各自的膜結構域表達以令膜錨定在表達共激分子的細胞中，但是應當注意，編碼共激分子的核酸分子可以被修飾，以使配體(和在一些情況下的受體)可以以可溶形式來表達。
另外，應當理解的是，重組核酸還可以編碼一或多種細胞因子，特別優選的細胞因子包含IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-15超激動劑，(例如IL15N72D)和IL-15超激動劑/IL-15RαSushi-Fc融合複合物(例如ALT803)。這種細胞因子通常與新表位和共激分子共表達以進一步增強免疫活化。進一步而言，共激分子還包含各種額外的免疫刺激組分，並且預期額外的組分包含各種信號傳導淋巴細胞活化分子(signaling lymphocyte activation molecules，SLAM)蛋白，例如CD84、CD150、CD229及/或CD244，較佳的，其與所選的新表位及/或共激分子共表達。
同樣的，進一步而言，所述附加的組分也可以是先天免疫應答途徑的正調節物，特別是干擾素基因刺激物(Stimulator of Interferon Gene ，STING)途徑。其他合適的正調節劑，特別優選的陽性調節劑包含嵌合蛋白，其內EBV的LMP1跨膜結構域融合至與STING途徑相關的信號蛋白的信號域，特別是IPS-1的信息傳遞域，例如，在WO 2014/039961。SEQ ID NO:1 提供了一示例性嵌合分子，其內EBV的LMP1跨膜結構域融合至IPS-1的信息傳遞域。
在這樣的嵌合蛋白中，通常優選具有至少一個、更通常為至少二、更通常為至少三而最通常為至少六LMP1蛋白的跨膜結構域，其融合至至少一、或至少二或至少三個IPS信號域。當然，應當注意的是，儘管IPS1的信令域是優選的，其它活化劑也被認為適用於本文，特別是包含腫瘤壞死因子受體超家族(Tumor Necrosis Factor Receptor Super Family，TNFRSF)中的各種蛋白質受體。
潛伏膜蛋白-1(Latent membrane protein-1，LMP1)是Epstein-Barr病毒(Epstein-Barr Virus，EBV)中的基因。 N-末端包含六個將蛋白質錨定到膜中的連續的跨膜結構域。LMP1的細胞質內結構域(intracytoplasmic domain)類似於CD40受體的信號傳導結構域TNFRSF，並且可以被一個或多個IPS1信號傳導結構域替換。值得注意的是，LMP1不需要配體或抗體在其細胞質結構域啟動信號傳導，因為其N-末端跨膜結構域在細胞膜中自發形成簇，從而簇集胞質內信號傳導結構域。通過用IPS1信號結構域取代LMP1的細胞質內結構域，實現了STING途徑的組成型活化。當然，應當認識到，此嵌合蛋白可以與其它共激分子及/或新表位共表達，從而提供增強的免疫刺激。在這種情況下，預期共激分子和嵌合免疫活化劑的組合可以通過兩種不同途徑的T細胞活化而協同作用：STING相關基因的表達以及活化免疫突觸的形成。 病毒構建
在選擇優選的患者和癌症專一的HLA匹配的新表位以及合適的共激分子/嵌合活化劑後，可以構建用於細胞內表達和隨後在細胞上呈遞新表位的重組核酸。重組核酸包含編碼一或多種患者和癌症專一新表位的序列部分，其將已知具有高親和力的新表位導至MHC-I及/或MHC-II呈遞途徑和MHC亞型。此外，重組核酸還將包含編碼合適的共激分子/嵌合活化劑的序列部分。MHC靶向和基於理性的呈遞產生更強的免疫應答被認為會產生更強的免疫應答，其通過一或多種共激分子及/或嵌合活化劑的共表達而進一步增強。
當然，應當理解的是，所有傳遞重組核酸的方式被認為是合適的，並且重組核酸可以被配製為DNA疫苗、重組病毒基因組或可在轉染組合物中遞送的DNA或RNA。因此，應當注意的是，本領域所有已知的表達系統都被認為適用於本文(例如細菌表達系統、酵母表達系統、「裸」DNA和RNA表達系統)。
類似的，並且取決於特定的重組核酸製劑，轉染細胞的類型可以有顯著的變化。然而，通常優選者為細胞是免疫感受態細胞，特別是抗原呈遞細胞(樹突狀細胞、巨噬細胞等)。這些細胞優選為對接受重組細胞的患者或個體是自體的，並且自體細胞可以是富集的或培養的細胞。例如，樹突細胞可以通過全血的初始B細胞和單核細胞消耗來分離(例如透過CD14/19標記物)，並且之後使用合適的樹突細胞標記物以磁性分離樹突細胞(例如CD304、CD141和CD1c)。或者，樹突細胞也可以從幹細胞培養(見例如World J Stem Cells 2014 Jan 26; 6(1): 1–10)。更進一步而言，特別是當重組核酸是病毒表達載體時，患者可能感染了病毒(例如使用皮下或瘤內注射)，特別是當病毒是腺病毒。
例如，特別優選使用已經在基因治療中建立的病毒，包含腺病毒、腺相關病毒(adeno-associated viruses)、甲病毒屬(alphaviruses)、皰疹病毒、慢病毒等(lentiviruses)。然而，在其它合適的選擇中，腺病毒是特別優選的。此外，通常優選的病毒是複制缺陷型和非免疫原性病毒，其通常通過選擇的病毒蛋白(例如E1、E3蛋白)的靶向缺失來實現。本文所用的術語「非免疫原性」是指病毒可以重複施用於個體而不引起消除病毒的免疫反應。可以通過刪除E2b基因功能以進一步增強這種期望的特性，並且可以使用最近報導的基因修飾的人類293細胞實現重組病毒的高力價(high titer)(例如，J Virol 1998 Feb; 72(2)：926-933)。最典型的，所需的核酸序列(用於從病毒感染細胞的表達)是以本領域公知的適當調控元素控制。
關於編碼新表位和共激分子及/或嵌合活化劑的序列部分的整合，應當注意的是，各種序列元素可以以多種方式排列。例如，轉錄或轉譯單元可具有多個表位的多聯排列，其通常由短接頭(例如，具有4至20個胺基酸的柔性接頭)分開，其可進一步包含蛋白酶切割位點。這種多聯體可以包含1至20個新表位(通常由可以通過病毒遞送的重組核酸的尺寸限制)，並且應當注意，多聯體可以是相同用於遞送至MHC-I和MHC-II複合體，或者是不同的。因此，如下所述，應當理解的是，各種胜肽可以被送到特定的細胞區室，以通過MHC-I及/或MHC-II實現優先或甚至專一的呈遞。另一方面而言，應當認識到腫瘤相關抗原和新表位可以通過兩種呈遞途徑呈遞，或者在同一時間選擇其中一個，或是在治療的後續輪次。共激分子及/或嵌合活化劑優選表達為分離的胜肽單元，如以下所進一步討論者。此外，編碼共激分子及/或嵌合活化劑的重組核酸通常還包含將重組蛋白質導向細胞膜以將蛋白質錨定在膜上的序列元素。
關於經基因修飾的病毒的「有效負載」，多於一個新表位的表達是優選的，例如兩個、三個、四個、五個，甚至更多個，其可以使用多個不同的修飾病毒或具有多於一個新表位序列的病毒(例如，作為串聯或嵌合序列）來完成。雖然並非用以限於本發明標的，但通常優選將新表位序列構建為串聯小基因(例如aa12-neoepitope12-aa12)或作為單一轉錄單位，其可以或不可以轉譯成嵌合蛋白。因此，應當理解的是，表位可以作為單體、多聚體、單獨或多聯體，或作為與N-及/或C-末端胜肽的雜交序列呈現。最典型的，核酸序列優選使用合適的密碼子容納病毒及/或宿主密碼子偏好來反轉譯。然而，替代密碼子使用的使用或不匹配的密碼子的使用也被認為是適當的。關於其它合適的構型和表達盒，參考共同未決的於2016年3月2日提交的序列號62/302168的美國臨時申請案以及於2016年3月28日提交的序列號為62/314366的美國臨時申請案，其透過引用併入本文。
應進一步理解的是，新表位序列(例如表達為單一新表位或作為多表位)可使用合適的序列元素配置並導向一個或兩個MHC呈遞途徑。關於將此表達的新表位導向所需的MHC系統，注意到MHC-I呈遞胜肽通常通過蛋白酶體加工和通過內質網的遞送而從細胞質產生。因此，如以下所進一步所討論的，用於MHC-I呈遞的表位的表達通常是導至細胞質。另一方面，MHC-II呈遞的胜肽通常通過由酸性蛋白酶(例如legumain、組織蛋白酶L和組織蛋白酶S)降解和加工而從核內體和溶酶體區室產生，而後傳遞至細胞膜。因此，如以下所進一步所討論的，用於MHC-II呈遞的表位的表達通常是導至核內體和溶酶體區室。
在最優選的方面，信號胜肽可以用於將新表位運輸到核內體和溶酶體區室(並且將新表位導向MHC-II遞呈)或保留在細胞質空間中(並且將新表位導向向MHC-I)。例如，胜肽被輸出到靶向前序列的核內體和溶酶體區室，並且可以使用內部靶向胜肽。靶向胜肽的前序列優選為加到N末端並包含6-136個鹼性和疏水性的胺基酸。在過氧化物酶靶向的情況下，靶向序列可以是在C末端。可以使用其他信號(例如，信號片(signal patches))，並且包含序列元素，其在胜肽序列中分開並且在正確的肽折疊後變成是有功能的。此外，如醣化的蛋白質修飾可以誘導靶向。在其它合適的靶向信號中，本發明人考慮了過氧化物酶靶向信號1(peroxisome targeting signal 1，PTS1)、C-末端三肽和過氧化物酶靶向信號2(peroxisome targeting signal 2，PTS2)，其是位於N-末端附近的九肽。此外，蛋白質向核內體和溶酶體的分選也可以由蛋白質的胞質結構域內的信號介導，通常包含短的線性序列。一些信號被稱作基於酪氨酸的分選信號並符合NPXY或YXXØ共有基序(consensus motifs)。其他已知的信號例如基於二亮氨酸的信號適合[DE] XXXL [L1]或DXXLL共有基序。所有這些信號被膜的胞質表面相關的蛋白質外被的組分識別。通過銜接蛋白(adaptor protein，AP)複合物AP-1、AP-2、AP-3和AP-4以特徵精細專一性識別YXXXX和[DE] XXXL [L1]信號，而DXXLL信號被另一稱為GGAs的銜接蛋白(adaptor)家族識別。還可以添加至FYVE結構域，其已經與液泡蛋白質分選以及核內體功能相關。進一步而言，核內體區室也可以使用人CD1尾序列來靶向 (見例如Immunology ，122,522-531)。
向細胞溶質區室(cytosolic compartment)中的轉運或保留可能不一定需要一或多個特定的序列元素。然而，在至少一些方面，可以加入N-或C-末端細胞質保留信號(cytoplasmic retention signals)，包含膜錨定蛋白(membrane-anchored protein)或膜錨定蛋白的膜錨定結構域。例如，膜錨定蛋白包含SNAP-25、突觸融合蛋白(syntaxin)、突觸泡蛋白(synaptoprevin)、突觸結合蛋白(synaptotagmin)、囊泡相關膜蛋白(vesicle associated membrane proteins，VAMPs)、突觸小泡糖蛋白(synaptic vesicle glycoproteins，SV2)、高親和力膽鹼轉運蛋白、神經刺激素、電壓門控鈣通道(voltage-gated calcium channels)、乙酰膽鹼酯酶和NOTCH。
另外，預期病毒載體還編碼至少一、更通常為至少二、更通常為至少三、最通常為至少四個共激分子以增強感染的樹突細胞和T細胞之間的相互作用。例如，合適的共激分子包含ICAM-1 (CD54)、ICOS-L和LFA-3 (CD58)，特別是與B7.1 (CD80) 及/或 B7.2(CD86)結合。進一步而言，共激分子包含4-1BBL、CD30L、CD40、CD40L、CD48、CD70、CD112、CD155、GITRL、OX40L及TL1A。此外，應當理解的是，共激分子的表達將優選的被協調，以使抗原及/或新表位與一或多種共激分子呈遞。因此，通常預期共激分子從單一轉錄物產生，例如使用內部核醣體進入位點或2A序列，或者從多個轉錄物產生。
相同的，預期病毒載體進一步包含編碼一或多個與檢查點受體結合的胜肽配體的序列部分。最典型的，此結合會抑制或至少減少通過受體的信號傳導，而特別考慮的受體包含CTLA-4(特別是CD8+細胞)PD-1(特別是CD4+細胞)。例如，肽肽結合物可以包含抗體片段，特別是scFv，但也包含專一結合至受體的小分子胜肽配體。再一次的，應當理解的是，胜肽分子的表達將優選的被協調，以使抗原及/或新表位與一或多個胜肽分子一起呈遞。因此，通常預期胜肽分子從單一轉錄物產生，例如使用內部核醣體進入位點或2A序列，或者從多個轉錄物產生。
病毒可以單獨的或組合的用作藥物組合物中的治療性疫苗，典型的配製為無菌可注射組合物，其具有每劑量單位104 -1011 個病毒顆粒的病毒滴度(virus titer)。或者，病毒可以用於體外感染患者(或其他HLA匹配的)細胞，然後將這樣感染的細胞輸注給患者。在進一步的實例中，以病毒治療患者還可以伴隨有裸露形式或攜帶嵌合抗原受體的同種異體移植或自體的自然殺傷細胞或T細胞，其表達靶向新表位的抗體、新表位、腫瘤相關抗原或與病毒相同的有效載荷。
最後，應當注意的是，當病毒包含編碼多個新表位的核酸有效載荷(payload)時，預期多個新表位是至少可以附加或協同的增強宿主免疫應答。類似的，當使用多種病毒，而每種病毒具有不同的新表位，則預期多種新表位是至少可以附加或協同的增強宿主免疫應答。這種附加或協同效應可以是對於特定腫瘤或階段是真實的，或者對特定患者參數是專一的
在部分實施例中，用於描述和主張本發明特定實施例的數字應被理解為在某些情況下以術語「約」修飾，其用以表示成分、性質的量，例如濃度、反應條件等。據此，在部分實施例中，書面描述和申請專利範圍中闡述的數值參數是近似值，其可以根據特定實施例所欲獲得的性質而改變。在部分實施例中，數字參數應根據所報告的數字的有效數字並且運用普通四捨五入(rounding)的技術來解釋。
除非本文另有說明，於本文說明書及申請專利範圍中，一(a、an、the)中包含了複數引用。並且，除非另有說明，用語「在」(in)包含了「在之內」(in)以及「在之上」(on)。除非有相反的說明，本文所闡述的所有範圍應解釋為包含其端點，並且開放式範圍應解釋為包含商業上實用的數值。類似的，除非有相反的說明，所有數值的列表應被認為包含中間值。
除非本文另有說明或與上下文明顯矛盾，本文所述的所有方法可以以任何合適的順序進行。除非另有說明，關於本文的某些實施例提供的任何以及所有範例或者示例性的語言(例如「例如」)，僅是為了更清楚的描述本發明，而非用以限制本發明的範圍。關於說明書中所使用的任何語言，其不應被解讀成表示任何未被請求的元素對於實施本發明是必要的。
對於本領域技術人員來說，顯而易見的是，除了已描述之外的許多修改是可能的，且並不脫離本文的發明構思。因此，本發明標的除了在所附的申請專利範圍之外並不做限制。此外，在解釋說明書和申請專利範圍時，所有術語應當以與上下文一致的最寬廣的可能方式來解釋。特別是，「包含」、「包含」應當解讀成非排他的元件、組成或步驟，這表示所引用的元件、組成或步驟可以和其他元件、組成或步驟存在、利用或結合。當說明書主張是選自於A、B、C…和N所組成的群組，其應解讀成只需所述群組的一元素，而非A加N或者B加N…等。   序列表 ＜110＞  Nant Holdings IP, LLC   ＜120＞  Improved Compositions And Methods For Viral Delivery Of        Neoepitopes And Uses Thereof   ＜130＞  102650.0019PCT   ＜150＞  US 62/263812 ＜151＞  2015-12-07   ＜160＞  1       ＜170＞  PatentIn version 3.5   ＜210＞  1 ＜211＞  2082 ＜212＞  DNA ＜213＞  artificial   ＜220＞ ＜223＞  Chimeric protein between EBV LMP1 transmembrane domain and murine        IPS1 signaling domain     ＜220＞ ＜221＞  misc_feature ＜222＞  (1)..(578) ＜223＞  EBV LMP1 transmembrane domain   ＜220＞ ＜221＞  misc_feature ＜222＞  (579)..(2630) ＜223＞  Murine IPS1 signaling domain   ＜400＞  1 atggaacacg accttgagag gggcccaccg ggcccgcgac ggccccctcg aggacccccc       60   ctctcctctt ccataggcct tgctctcctt ctcctgctct tggcgctact gttttggctg      120   tacatcatta tgagtaactg gactggagga gccctccttg tcctctatgc ctttgctctc      180   atgcttgtga ttatcatttt gatcatcttt atcttcagaa gagaccttct ctgtccactt      240   ggagcccttt gtctactcct actgatgatc accctcctgc tcatcgctct ctggaatttg      300   cacggacagg cattgtacct tggaattgtg ctgttcatct tcgggtgctt acttgtctta      360   ggtctctgga tctacttatt ggagattctc tggcgacttg gtgccaccat ctggcagctt      420   ttggccttct tcctagcctt cttcctagac atcatcctgc tcattattgc tctctatcta      480   caacaaaact ggtggactct attggttgat ctcctttggc tcctcctgtt tctggcgatt      540   ttaatctgga tgtattacca tggacaacga atgacatttg ctgaggacaa gacctataag      600   tatatccgag acaaccacag caagttttgc tgtgttgacg ttctggagat cctgccttac      660   ctgtcctgcc tcacagctag tgaccaggat cgactgcggg cttcctacag gcagatcggg      720   aaccgggaca cactctgggg actcttcaat aatctccagc gccggcctgg ctgggtggag      780   gtcttcatcc gggcactgca gatctgtgag ctgcctgggc tggctgatca agtgactcga      840   gtttatcaga gctacctgcc tccggggacc tcactccgct ccctagagcc actgcagtta      900   ccagactttc ctgctgcggt ttctggaccc tctgcatttg cgccaggtca caacatccct      960   gaccatggct tacgagagac accaagttgc cccaagcctg tccaggacac ccagccacca     1020   gagtccccag tagagaattc agagcaactc ctccagacca actccggggc cgtcgcgagg     1080   atgtctggtg gctctttgat accctctcct aaccagcagg ctctcagccc tcagccctcc     1140   agagagcatc aagagcaaga accagaactg ggtggcgccc acgcagcaaa tgttgcctct     1200   gttcccatag caacctatgg acctgtgtct ccaaccgttt ccttccagcc ccttccacgt     1260   actgccctga ggacaaacct cttgtctggg gtcacagtat cagccctatc tgctgatacc     1320   tctttgtcct cctcgtccac tggatcagct tttgcaaagg gagctggtga ccaggccaaa     1380   gctgccacct gtttcagtac tacactcacc aattctgtga ctaccagctc agtgccttct     1440   cccagattgg tcccagtaaa aaccatgtct tccaagttgc ccctcagttc aaagtccact     1500   gctgcgatga cgtctactgt gctcaccaat acagcgccat caaaattacc cagcaactca     1560   gtgtatgcgg gcacagtgcc atccagagtg cctgctagtg tggccaaagc acctgccaac     1620   acaataccac ctgagaggaa cagcaagcaa gccaaggaga ccccggaggg tccagcaacc     1680   aaagtcacca ctggaggcaa ccagactgga ccaaatagca gtatcaggag cttgcactct     1740   ggaccagaga tgagcaagcc aggtgtgctg gtatcccagt tggacgagcc attctcagcc     1800   tgctctgtgg accttgccat tagccctagc agctccttgg tctcagaacc caaccatggt     1860   ccagaggaga atgagtattc gtcctttaga atccaggtag acgaaagccc cagtgctgat     1920   ctattaggaa gccctgagcc actagccacc cagcagcccc aagaagagga agaacattgt     1980   gccagttcaa tgccctgggc taagtggctt ggggccacca gtgcactctt ggctgtattc     2040   ctggcagtga tgctgtaccg tagtaggcgc ctggcccagt ga                        2082
圖1A和1B是HLA類型在人類染色體上的位置、等位基因多樣性(圖1A)和表達以及膜位置(圖1B)的示意圖。
圖2是描述用於過濾計算新表位結果的示例圖表。
圖3是在T細胞活化期間，共激受體和配體相互作用的示例說明。
<110> 美商河谷控股IP有限責任公司
<120> 改善的組合物及用於新表位之病毒遞送的方法及其應用
<130>
<150> US 62/263812
<151> 2015-12-07
<160> 1
<170> PATENTIN VERSION 3.5
<210> 1
<211> 2082
<212> DNA
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> CHIMERIC PROTEIN BETWEEN EBV LMP1 TRANSMEMBRANE DOMAIN AND MURINE IPS1 SIGNALING DOMAIN
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(578)
<223> EBV LMP1 TRANSMEMBRANE DOMAIN
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (579)..(2630)
<223> MURINE IPS1 SIGNALING DOMAIN
<400> 1
Figure 105140301-A0305-02-0031-1
Figure 105140301-A0305-02-0032-2
Figure 105140301-A0305-02-0033-3

Claims (12)

  1. 一種產生重組病毒的方法，包含：於活體外鑑定一患者之患者專一且癌症相關的新表位，其係透過對腫瘤和匹配的正常樣品的組學數據做位置引導的同步比對；其中該組學數據包含DNA序列數據、RNA序列數據、及蛋白質序列數據；選擇至少一種共激分子(co-stimulatory molecule)；以及基因修飾一病毒使其包含編碼該至少一共激分子以及該患者專一癌症相關新表位的核酸。
  2. 根據請求項1所述之方法，其中該病毒是腺病毒、複製缺陷型病毒或非免疫原性病毒。
  3. 根據請求項1所述之方法，其中患者的該癌症相關新表位，是藉由電腦模擬，對腫瘤和匹配的正常樣品的組學數據，做位置引導的同步比對。
  4. 根據請求項1所述之方法，還包含在電腦模擬中預測患者的HLA類型的步驟。
  5. 根據請求項1所述之方法，其中該表達水平相比於匹配的正常樣品，至少為百分之二十。
  6. 根據請求項1所述之方法，其中該共激分子是選自於由B7.1(CD80)、B7.2(CD86)、CD30L、CD40、CD40L、CD48、CD70、CD112、CD155、ICOS-L、4-1BB、GITR-L、LIGHT、TIM3、TIM4、ICAM-1和LFA3(CD58)所組成的群組。
  7. 根據請求項1所述之方法，其中該核酸還包含具有編碼細胞因子(cytokine)的序列。
  8. 根據請求項7所述之方法，其中該細胞因子是選自於由IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-15超激動劑(IL-15N72D)及/或IL-15超級激動劑/IL-15RαSushi-Fc融合複合物所組成的群組。
  9. 根據請求項1所述之方法，其中該核酸還包含編碼超大活化分子團(Supramolecular Activation Cluster，SMAC)的至少一組成的序列。
  10. 根據請求項9所述之方法，其中該SMAC的至少一組成是選自於由CD2、CD4、CD8、CD28、Lck、Fyn、LFA-1、CD43及/或CD45或其各自的結合對應物所組成的群組。
  11. 根據請求項1所述之方法，其中該核酸還包含編碼一干擾素基因之刺激物(Stimulator of Interferon Gene，STING)途徑的活化劑的序列。
  12. 根據請求項11所述之方法，其中該STING途徑的活化劑包含一嵌合蛋白，其內EBV的LMP1跨膜結構域融合至IPS-1的信息傳遞域。
TW105140301A 2015-12-07 2016-12-06 改善的組合物及用於新表位之病毒遞送的方法及其應用 TWI733719B (zh)

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