KR20180102707A - 듀얼 타겟팅을 통한 아데노바이러스의 피하 전달 - Google Patents
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Abstract
MHC-I 및/또는 MHC-II 제시 시스템을 타겟팅하며 그리고 T 세포 활성화를 자극하고 체크포인트 억제를 방해하기 위한 하나 이상의 재조합 펩타이드들을 추가로 제공하는 아데노바이러스 발현 시스템(adenoviral expression system)을 통해 네오에피토프(neoepitope)들 및/또는 종양 관련 항원들이 수지상 세포들에 전달되는 면역치료 방법들 및 조성물들이 고려된다. 하나 이상의 네오에피토프들 및/또는 종양 연관 항원들에 결합하는 키메라성 항원 수용체 및/또는 고친화성 CD16 수용체를 가지도록 변형될 수 있는 NK 세포들의 주입(transfusion)에 의해 치료가 추가로 지원된다.
Description
본 발명의 분야는 면역치료 조성물들 및 방법들로서, 특히 MHC-I 및/또는 MHC-II 제시(presentation) 경로들을 특히, 체크포인트 저해의 동시 조절과 함께 타겟팅하는 암 백신 제제들에 관한 것이다.
배경 설명은 본 발명을 이해하는데 유용할 수 있는 정보를 포함한다. 본원에 제공된 정보 중 임의의 것이 선행 기술이거나 현재 청구된 발명과 관련이 있거나 또는 구체적으로 또는 암시적으로 참조된 임의의 간행물이 선행 기술임을 인정하는 것은 아니다.
본원의 모든 간행물들 및 특허 출원들은 각각의 개별 간행물 또는 특허 출원이 구체적으로 그리고 개별적으로 참조로 포함되는 것으로 지시된 것과 같이 동일한 정도로 참조로 본원에 포함된다. 포함된 참조에서의 용어의 정의 또는 사용이 일관성이 없거나 본원에 제공된 상기 용어의 정의와 상반되는 경우, 본원에 제공된 상기 용어의 정의가 적용되며, 참조에서의 상기 용어의 정의는 적용되지 않는다.
암 백신은 많은 가능성을 보였지만, 바이러스성 비히클(vehicle)의 면역성 및/또는 재조합 항원의 빈약한 제시(presentation)를 포함하는, 다양한 인자들로 인하여 실제적으로는 종종 제한된다. 특히, 빈약한 제시는 항원 그 자체로부터 뿐만 아니라 환자의 특정 HLA 유형에의 빈약한 정합으로부터 유래할 수 있다. 또한, 그리고 특히 재조합 바이러스들이 치료 항원을 생성하는데 사용되는 경우, 환자의 면역 시스템의 다양한 성분들(예컨대, 수지상 세포들, CD8+ 세포들, CD4+ 헬퍼(helper) T 세포들, B-세포들)의 효과적이고 보편적인 트레이닝(training)을 방지하는 경향이 있는 환자의 바이러스 제거와 함께 전신 전달 및 낮은 감염력은 종종 달성되지 못하거나 빈약하게만 달성된다. 또한, 항원 제시가 적어도 어느 정도 달성된다고 하더라도, 다양한 조절 메커니즘들, 그리고, 특히 면역 체크포인트(checkpoint) 억제는 종종 효과적인 치료에 추가적인 장애물을 제공한다.
예를 들어, 미국 특허 제7118738호는 암 연관 항원으로서 MUC1을 인코딩하는 재조합 DNA를 보유하는 수두 바이러스의 사용을 교지하고, 면역 반응이 보조제로서 B7.1 및/또는 B7.2를 사용하여 증가될 수 있음을 보고한다. 그러나, 그러한 바이러스들이 치료학적으로 유효한 면역 반응을 일관되게 도출하는 것은 입증되지 않았다. 유사하게는, CEA/TRICOM은 재조합 수두 바이러스로부터 발현되었다(예컨대, Clin Cancer Res 2005, 11권, 2416-2426 참조). 그러나, TRICOM으로부터의 면역 자극은 소기의 것보다 적었다. 또한, CEA는 또한 암 세포들 이외의 세포들 상에서 발현되었으며, 전달 시스템으로서의 수두 바이러스는 제 1 투여 후에 면역원성인 것으로 나타났다. 또한, 그러한 시스템에서의 면역 자극은 CEA에 대하여 가장 강하지 않았지만, 오히려 항원 캐스케이드(cascade)에서 다른 단백질들에 대한 면역 반응을 촉진시켰다. 따라서, 자극 보조제는 적어도 개념적으로 가능성이 있는 반면에, 이들의 실제적인 성공은 종종 제한된다.
또 다른 알려진 방법들에 있어서, 항원(예컨대, CEA, MUC1, 브라큐리(brachyury))의 발현용 바이러스성 벡터는 WO 2016/172249, US 2016/0101170 및 US 2016/0339090에 기재된 바와 같이 면역 반응을 증가시키기 위해 체크포인트 억제제와 함께 병용 투여되었다. 체크포인트 억제제들의 사용은 적어도 일부 암들에서 현저한 성공을 보였다. 그러나, 체크포인트 억제제들의 통상적인 전신 투여로 인하여, 바람직하지 않은 부작용들이 종종 상당한 위험이 된다.
특정 전달에 관계없이 내구성 면역 반응의 발생은 적절한 항원 처리 및 제시뿐 아니라 면역 시냅스의 적합한 형성 및 면역 시스템의 다양한 성분들을 통한 항원 자극의 전파를 필요로 하여 치료학적으로 유효한 체액성 및 세포성 반응을 생성한다는 것을 알아야 한다. 현재 알려진 시스템들 및 방법들은 일반적으로 그러한 조정된 활동들을 제공하지 못한다.
그러므로, 면역 반응을 발생하기 위해 수많은 방법들 및 조성물들이 업계에 알려져 있더라도, 이들 모두 또는 거의 모두가 다양한 단점들을 갖는다. 따라서, 면역 치료, 그리고, 특히 암 면역 치료를 위한 개선된 조성물들 및 방법들에 대한 요구가 여전히 존재한다.
본 발명의 주제는 암-관련 에피토프들의 생성, 처리 및 제시를 유도하기 위하여 항원 제시 세포들(예컨대, 수지상 세포들)을 감염시키는 재조합 및 바람직하게는 비면역원성 바이러스의 피하 투여에 의해 상기 문제들을 해결하는 면역 반응을 발생시키는 조성물들 및 방법들에 관한 것으로, 상기 에피토프들은 항원 제시를 향상시키기 위해 MHC-I 및 MHC-II 제시 경로들을 향해 특이적으로 지향된 조성물들 및 방법들에 관한 것이다. 또한, 훨씬 더 견고한 면역 반응을 달성하기 위해, 감염된 세포들은 면역 수용성 세포들 (그리고 특히 T 세포들 및 NK-세포들 상에서)의 체크포인트 수용체들을 간섭하는 펩타이드들뿐만 아니라 다양한 공동자극 분자들을 추가로 발현할 것이다. 원한다면, 체크포인트 억제제들은 재조합 바이러스의 투여 부위에 또는 투여 부위 근처에 피하 주사될 수도 있으며, 바이러스성 재조합 핵산에 인코딩되지 않을 수 있다. MHC-1 및 MHC-II 제시 경로들을 사용하는 타겟팅된 항원 제시 때문에, 면역 반응은 각각 NK 및 B 세포들을 지시하는데 중요할 뿐만 아니라 세포독성 T 세포들의 발생에 중요한 CD8+ 및 CD4+ T 세포들을 통해 전파된다. 면역 반응은 NK 세포들, 및 가장 바람직하게는 유전적으로 조작된 NK 세포들의 후속 또는 이후 투여에 의해 추가로 증가될 수 있으며, 이에 대해서는 보다 상세히 후술된다.
본 발명의 주제의 하나의 양태에 있어서, 본 발명자들은 종양을 갖는 환자의 치료 방법을 고려한다. 특히 고려되는 방법들은 (a) 환자의 종양의 적어도 하나의 종양-관련 에피토프; (b) 적어도 하나의 공동자극 분자; 및 (c) 체크포인트 수용체에 결합하는 펩타이드를 인코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 바이러스를 피하 투여하는 단계를 포함할 것이다. 가장 통상적으로, 상기 핵산은 상기 핵산에 의해 인코딩된 펩타이드 생성물을 세포질, 엔도솜 구역 및/또는 리소좀 구역으로 유도하기 위하여 트래피킹(trafficking) 신호를 더 포함한다. 또 다른 단계에서, NK 세포들은 상기 환자에게 투여된다.
바람직하지만, 필연적이지는 않게는, 상기 재조합 바이러스는 선택적으로는 면역원성을 감소시키기 위하여 결실되거나(deleted) 비-기능성인 E2b 유전자를 가지는 아데노바이러스(adenovirus)이다. 상기 종양-관련 에피토프는 암 연관 에피토프(cancer associated epitope), 암-특이적 에피토프(cancer-specific epitope) 또는 환자 및 종양-특이적 네오에피토프(patient- and tumor-specific neoepitope)일 수 있는 HLA-정합된(HLA-matched) 종양-관련 에피토프임이 더 고려된다.
상기 공동자극 분자에 대하여, 상기 공동자극 분자는 B7.1 (CD80), B7.2 (CD86), ICAM-1 (CD54), ICOS-L, LFA-3 (CD58), 4-1BBL, CD30L, CD40, CD40L, CD48, CD70, CD112, CD155, GITRL, OX40L, 또는 TL1A이며, 상기 체크포인트 수용체에 결합하는 바람직한 펩타이드들은 CTLA-4 (CD152) 및/또는 PD-1 (CD 279)에 결합할 것이 고려된다.
다른 고려된 방법들에 있어서, 상기 트래피킹 신호는 상기 펩타이드 생성물을 상기 세포질, 상기 엔도솜 구역 및/또는 상기 리소좀 구역으로 유도한다. 그러므로, 적당한 트래피킹 신호들은 세포질 보유 서열들(cytoplasmic retention sequences), 엔도솜 표적 서열들(endosomal targeting sequences), 및/또는 리소좀 표적 서열들(lysosomal targeting sequences)을 포함한다. 예를 들어, 상기 핵산은 제1 펩타이드 생성물을 세포질로 유도하는 제 1 트래피킹 신호 및 제 2 펩타이드 생성물을 엔도솜 또는 리소좀 구역으로 유도하는 제 2 트래피킹 신호를 가질 수 있으며, 제 1 및 제 2 펩타이드 생성물들은 동일하거나 상이하다. 추가적으로, 상기 펩타이드 생성물(들)은 상기 펩타이드 생성물의 세포내 턴오버(intracellular turnover)를 증가시키는 서열 부분을 더 포함할 수 있음이 고려된다.
적당한 NK 세포들에 대하여, 상기 NK 세포들은 (1) 적어도 하나의 킬러 세포 면역글로블린-유사 수용체(killer cell immunoglobulin-like receptor)의 발현을 감소시키거나 중단시키고(abolish), (2) 고-친화성 Fcγ 수용체를 발현시키고 (3) 키메라성 T 세포 수용체를 발현시키고, 그리고/또는 (4) NKG2A에서 결실(deletion)을 가지도록 상기 NK 세포들이 유전적으로 변형되는 것이 일반적으로 고려된다. 가장 통상적으로, 상기 NK 세포들은 상기 재조합 바이러스를 피하 투여한 후 1일 내지 14일 사이에 투여된다.
본 발명의 주제의 다른 양태에 있어서, 본 발명자들은 (a) 세포질에서 적어도 하나의 종양-관련 에피토프를 보유하는 트래피킹 신호에 작동 가능하게 결합되는 환자의 종양의 적어도 하나의 종양-관련 에피토프; (b) 적어도 하나는 B7.1 (CD80) 또는 B7.2 (CD86)인 복수의 공동자극 분자들; 및 (c) PD-1 및 CTLA-4 중 적어도 하나에 결합하는 펩타이드;를 인코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 바이러스를 피하 투여하는 단계를 통상적으로 포함하는, 종양을 갖는 환자에서 CD8+ T 세포 반응을 자극하는 방법을 고려한다. 다른 단계에서, NK 세포들은 상기 환자에게 투여된다.
대안적으로, 본 발명의 주제의 또 다른 양태에 있어서, 본 발명자들은 (a) 적어도 하나의 종양-관련 에피토프를 세포질 또는 엔도솜 또는 리소좀 구역으로 유도하는 트래피킹 신호에 작동 가능하게 결합되는, 환자의 종양의 적어도 하나의 종양-관련 에피토프; (b) 적어도 하나는 B7.1 (CD80) 또는 B7.2 (CD86)인 복수의 공동자극 분자들; 및 (c) PD-1 및 CTLA-4 중 적어도 하나에 결합하는 펩타이드;를 인코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 바이러스를 피하 투여하는 단계를 포함하는, 종양을 갖는 환자에서 CD4+ T 세포 반응을 자극하는 방법을 고려한다. 다른 단계에서, NK 세포들은 상기 환자에게 투여된다.
가장 통상적으로, 그러한 방법들에 있어서 상기 재조합 바이러스는 선택적으로는 면역원성을 감소시키기 위하여 결실되거나 비-기능성인 E2b 유전자를 가지는 아데노바이러스이다. 전술한 바와 같이, 적합한 종양-관련 에피토프는 상기 종양-관련 에피토프의 세포내 턴오버를 증가시키는 서열 부분을 더 포함할 것이다. 예를 들어, 그러한 에피토프들은 HLA-정합된 암 연관 에피토프, HLA-정합된 암-특이적 에피토프, 또는 HLA-정합된 환자 및 종양-특이적 네오에피토프일 수 있다.
또한, 상기 복수의 공동자극 분자들은 ICAM-1 (CD54), ICOS-L, LFA-3 (CD58), 4-1BBL, CD30L, CD40, CD40L, CD48, CD70, CD112, CD155, GITRL, OX40L, 및 TL1A로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 추가적인 공동자극 분자를 더 포함할 수 있음이 고려되고, 그리고/또한 PD-1 및 CTLA-4 중 적어도 하나에 결합하는 상기 펩타이드는 막 결합 항체 프래그먼트(membrane bound antibody fragment)임이 고려된다. 또한, 상기 NK 세포들은 (1) 적어도 하나의 킬러 세포 면역글로블린-유사 수용체의 발현을 감소시키거나 중단시키고, (2) 고-친화성 Fcγ 수용체를 발현시키고 (3) 키메라성 T 세포 수용체를 발현시키고, 그리고/또는 (4) NKG2A에서 결실을 가지는 유전적으로 변형된 NK 세포들임이 고려된다.
또한, 본 발명자들은 또한 본원에 제시된 모든 방법들이 상기 종양의 상기 세포들 상에 NKG2D 리간드의 발현을 촉발시키거나 발현을 증가시키는데 유효한 프로토콜 하에서 상기 환자에게 저 용량 화학요법 및/또는 저 용량 방사선 요법을 투여하는 단계를 더 포함할 수 있음을 고려한다. 원하는 경우, 고려된 방법들은 잔류 종양 세포들 내에서 새로운 네오에피토프들을 동정하고 상기 새로운 네오에피토프들 중 적어도 하나를 포함하기 위하여 상기 재조합 바이러스를 변형하는 단계를 더 포함할 수 있다.
그러므로, 그리고 상이한 관점에서 볼 때, 본 발명자들은 또한 (a) 환자의 종양의 적어도 하나의 종양-관련 에피토프; (b) 적어도 하나의 공동자극 분자; 및 (c) 체크포인트 수용체에 결합하는 펩타이드;를 인코딩하는 핵산을 포함하는 바이러스성 벡터(예컨대, 선택적으로는 결실되거나 비-기능성인 E2b 유전자를 가지는 재조합 아데노바이러스 게놈)를 고려한다. 가장 통상적으로, 상기 핵산은 세포질, 엔도솜 구역 또는 리소좀 구역으로 상기 핵산에 의해 인코딩된 펩타이드 생성물을 유도하기 위하여 트래피킹 신호를 더 포함할 것이며, 상기 펩타이드 생성물은 상기 펩타이드 생성물의 세포내 턴오버를 증가시키는 서열 부분을 더 포함할 것이다. 앞서 서술한 바와 같이 상기 종양-관련 에피토프는 바람직하게는 HLA-정합된 종양-관련 에피토프(예컨대, 암 연관 에피토프, 암-특이적 에피토프 또는 환자 및 종양-특이적 네오에피토프)이다. 유사하게는, 상기 공동자극 분자는 B7.1 (CD80), B7.2 (CD86), ICAM-1 (CD54), ICOS-L, LFA-3 (CD58), 4-1BBL, CD30L, CD40, CD40L, CD48, CD70, CD112, CD155, GITRL, OX40L, 또는 TL1A이며, 그리고/또는 상기 체크포인트 수용체에 결합하는 상기 펩타이드는 선택적으로는 막 결합 항체 프래그먼트를 포함하는, CTLA-4 (CD152) 및/또는 PD-1 (CD 279)에 결합하는 것이 바람직하다.
그러므로, 본 발명자들은 또한 상기 기재된 바이러스성 벡터를 포함하는 재조합 바이러스를 고려한다. 마찬가지로, 본 발명자들은 또한 본원에 기재된 바와 같이 재조합 바이러스를 포함하는 약학적 조성물을 고려한다.
본 발명의 주제의 다양한 목적들, 특징들, 양태들 및 장점들은 바람직한 실시형태들의 하기 상세한 기재로부터 더 명백해질 것이다.
본 출원은 2016년 2월 11일에 출원된 미국 가출원 일련 번호 제62/294251호의 우선권을 주장하고, 그리고 2016년 2월 12일에 출원된 미국 가출원 일련 번호 제62/294987호의 우선권을 추가로 주장하며, 이들 모두는 참조로 본원에 포함된다.
본 발명자들은 이제 NK 세포-기반 요법과 병용하여 바람직하게는 피하 투여된 재조합 바이러스 및 면역 조절제들의 사용에 의해 암 면역 요법이 상당히 개선될 수 있음을 발견했다.
더 구체적으로, 본원에 제시된 고려된 방법들 및 조성물들을 사용하여, 하나 이상의 종양-관련 에피토프들을 하나 이상의 MHC 제시 경로들에 타겟팅함으로써, 면역 반응은 CD8+ 및 CD4+ T 세포 집단들을 통해 전파될 수 있으며, 이는 차례로 체액성 및 세포-기반 후천성(adaptive) 면역 반응들을 발생시키는데 보조할 것이라는 것이 고려된다. 또한, 고려된 방법들은 또한 하기에 더 상세히 기재되는 바와 같이 선천성(innate) 면역 반응을 증가시키기 위하여 (바람직하게는 유전적으로 변형된) NK 세포들을 채용한다. 피하 투여되는 경우, 바이러스 전달은 수지상 세포들을 감염시키는데 특히 효과적임이 고려되고, 그리고 바이러스 주사의 부위에 또는 부위 근처에 (예컨대, 바이러스 감염된 세포들로부터 발현을 통해 또는 주사를 통해) 체크포인트 억제제들의 피하 주사는 양성 사이토카인 피드백 루프들(즉, 사이토카인 폭풍(cytokine storm))에 대한 위험을 실질적으로 감소시키면서 면역 반응을 추가로 증가시킬 것이 고려된다.
항원들, 공동자극 분자들, 및 체크포인트 억제제들의 동시-발현(co-expression)/조정된 존재는 T 세포들 및 특히, CD8+ 및 CD4+ T 세포들의 활성화에 충분한 기간 동안 면역 시냅스의 형성을 촉진시키는 것으로 생각된다. 특히 바람직한 양태들에 있어서, 이들 개체들의 존재는 하기에 더 상세히 더 논의되는 바와 같이 CTLA-4 및/또는 PD-1에 결합하는 하나 이상의 분자들을 동시-발현시킬 수도 있는 항원 제시 세포들, 그리고 특히 수지상 세포들을 감염시키는 바이러스로부터 항원들 및 공동자극 분자들의 동시-발현에 의해 보장된다. 대안적으로 또는 추가적으로, 하나 이상의 체크포인트 억제제들(이필리뮤맙(ipilimumab), 니볼리뮤맙(nivolimumab) 등)은 바이러스 전달의 부위에 또는 부위 근처에 주사될 수 있다. 가장 통상적으로는, 그러한 전달은 피하(subcutaneous or subdermal) 주사를 통할 것이다. 항원 처리 및 제시를 추가로 증가시키기 위하여, 발현된 항원들은 소기의 구역(예컨대, MHC-I 제시용 세포질 구역 또는 MHC-II 제시용 엔도솜 또는 리소좀 구역)으로 발현된 단백질을 의도적으로 유도하는 트래피킹 서열들을 포함할 것임이 고려된다. 또한, 항원 처리를 증가시키기 위하여, 하나 이상의 유비퀴틴화(ubiquitination) 부위들을 포함하거나 비절단성 유비퀴틴을 포함하는 것이 일반적으로 바람직하다.
그러한 면역 요법은 특이적인 발현된 항체(들)에 대하여 강한 후천성 면역 반응을 촉발하는 것으로 판단되므로, 상기 면역 반응은 또한 항원 캐스케이딩(cascading)에 기여할 것이고, 추가적인 면역 반응은 새롭게 제시된 항원들에 기여할 것이라고 더 기대된다. 상기 후천성 면역 반응을 더욱 보완하기 위해, 선천성 면역 반응의 성분들, 그리고 특히 유전자 변형된 NK 세포들이 환자에게 투여될 수 있음이 일반적으로 바람직하다. 예를 들어, 그리고, 하기에 더 상세히 추가로 논의되는 바와 같이, NK 세포들은 체액성 반응을 증가시키기 위해 CD16의 고친화성 변이체를 갖는 유전적으로 변형된 NK 92 세포들 및/또는 종양 관련 항체들 하나 이상에 특이적인 결합 도메인을 갖는 키메라성 항원 수용체를 갖는 유전적으로 변형된 NK92 세포들일 수 있다.
고려된 종양 관련 에피토프들에 대하여, 특히 에피토프가 발현되는 경우(바람직하게는, 동일한 환자의 건강한 조직의 발현 수준을 초과하고) 그리고 환자 HLA 시스템에 바람직한 친화성을 갖는 경우, 특정 유형의 암에 특이적인 암과 연관되거나 또는 환자 및 종양(네오에피토프)에 특이적인 임의의 에피토프가 본원에서의 사용에 적합함을 알아야 한다. 본 맥락에서, 종양 관련 에피토프라는 용어는 단백질 프래그먼트들뿐만 아니라 짧은 펩타이드들(예컨대, 8 내지 30 개의 아미노산들) 및 심지어 전체 단백질들을 포함한다.
예를 들어, 암과 연관성이 알려진 수많은 항원들이 있으며, 그리고 CEA, MUC-1, EphA 3 및 CYPB1, 및 이들의 부분들을 포함하는 이들 모두는 본원에서의 사용에 적합한 것으로 간주된다. 유사하게는, Her-2, PSA, 브라큐리 등과 같은, 업계에 알려진 수많은 암 특이적 항원들이 있으며, 이들 모두 및 이들의 부분들은 본원에서의 사용에 적합한 것으로 간주된다. 그러나, 특히 바람직한 양태들에 있어서, 종양 관련 에피토프들은 환자 및 종양-특이적 네오에피토프들을 포함할 것이다. 따라서, 재조합 바이러스 또는 바이러스성 핵산 구조체 (또는 숙주 세포 내 발현용 핵산 구조체)는 적어도 하나의 공동-자극 분자 및 바람직하게는 (그러나 필수적이지는 않게) 체크포인트 시그널링(signaling)을 간섭하는 단백질에 더하여 적어도 하나의 (예컨대, 적어도 2개, 3개, 4개, 등) 종양 관련 에피토프들을 인코딩하는 재조합 세그먼트를 포함할 것이라는 것을 알아야 한다. 물론, 종양 관련 에피토프들, 공동자극 분자들 및 다른 단백질들에 대한 서열들의 길이가 재조합 핵산들에 대한 바이러스성 용량을 초과하는 경우, 다중 및 상이한 재조합 바이러스들이 사용될 수 있음을 알아야 한다.
고려된 종양 관련 에피토프들에 대한 서열 정보는 다양한 공지된 소스들(예컨대, TCGA, COSMIC 등)로부터 얻을 수 있거나, 예를 들어, 표준 조직 처리 프로토콜 및 시퀀싱 프로토콜들을 따르는 생검 샘플들을 사용하여, 환자로부터 얻을 수 있다. 본 발명의 주제를 제한하지 않으면서, 서열 데이터는 환자 및 종양-특이적 네오에피토프들(예컨대, 종양 대 동일 환자 정상)에 대한 환자 정합된(matched) 종양 데이터인 것이 통상적으로 바람직하며, 데이터 포맷(format)은 SAM, BAM, GAR 또는 VCF 포맷으로 된 것이 통상적으로 바람직하다. 그러나, 다른 참조(예컨대, 이전의 동일한 환자 정상 또는 이전의 동일한 환자 종양 또는 호모 스태티스티커스(homo statisticus))와의 정합되지 않거나 정합된 것이 또한 본원에서의 사용에 적합하다고 간주된다. 그러므로, 오믹스(omics) 데이터는 이전의 절차 (또는 심지어 다른 환자)로부터 얻어졌던 '신선한' 오믹스 데이터 또는 오믹스 데이터일 수 있다.
네오에피토프들은 독특하고 종양 특이적 항원들을 생성하는 종양 세포들 내에서 발현된 무작위 돌연변이로 특성화될 수 있다. 그러므로, 상이한 관점에서 볼 때, 네오에피토프들은 침묵 및 다른 비-관련(예컨대, 비-발현) 돌연변이들이 제거되는 제 1 내용 필터로서 그 자체로 작용할 수 있는 돌연변이(예컨대, 넌센스(non-sense), 미스센스(missense), 프레임(frame), 쉬프트(shift) 등)의 유형(예컨대, 결실, 삽입, 전환, 전이, 전좌) 및 영향을 고려함으로써 동정될 수 있다. 네오에피토프 서열들은 비교적 짧은 길이 (예컨대, 7-11머(mer))의 서열 스트레치(stretches)로서 그러한 스트레치가 아미노산 서열들에서의 변화(들)를 포함하는 것인 서열 스트레치로서 정의될 수 있음을 또한 알아야 한다. 가장 통상적으로, 변화된 아미노산은 중심 아미노산 위치에 또는 중심 아미노산 위치 근처에 있을 것이다. 예를 들어, 통상적인 네오에피토프는 A가 단백질구성 아미노산이고 N이 (야생형에 비해 또는 정합된 정상에 비해) 변화된 아미노산인 A4-N-A4, 또는 A3-N-A5, 또는 A2-N-A7, 또는 A5-N-A3, 또는 A7-N-A2의 구조를 가질 수 있다. 그러나, 변화된 아미노산은 상기 네오에피토프 서열의 말단에 위치될 수도 있다. 예를 들어, 본원에 고려된 바와 같은 네오에피토프 서열들은 비교적 짧은 길이 (예컨대, 5-30 머, 더 통상적으로 7-11 머, 또는 12-25 머)의 서열 스트레치로서 그러한 스트레치가 아미노산 서열들에서의 변화(들)를 포함하는 것인 서열 스트레치를 포함한다.
따라서, 단일 아미노산 변화는 변화된 아미노산의 위치에 따라 상기 변화된 아미노산을 포함하는 수많은 네오에피토프 서열들 내에 제시될 수 있음을 알아야 한다. 유리하게는, 그러한 서열 가변성은 네오에피토프들의 다중 선택을 가능하게 하여 이후 하나 이상의 바람직한 형질(예컨대, 환자 HLA- 유형에 대한 최고 친화도, 최고 구조 안정성 등)에 기초하여 선택될 수 있는 잠재적으로 유용한 표적들의 수를 증가시킨다. 가장 통상적으로, 네오에피토프들은 바람직하게는 중앙에 위치하거나 그렇지 않으면 MHC와의 결합을 보장하거나 개선시키는 방식으로 위치한 변화된 아미노산과 함께 2 내지 50의 아미노산, 보다 통상적으로는 5 내지 30의 아미노산, 및 가장 통상적으로는 9 내지 15의 아미노산의 길이를 가질 것으로 계산될 것이다. 예를 들어, 에피토프가 MHC-I 복합체에 의하여 제시될 수 있는 경우, 통상적인 네오에피토프 길이는 약 8 내지 11의 아미노산일 것인 반면에, MHC-II 복합체를 통한 제시를 위한 통상적인 네오에피토프 길이는 약 13 내지 17의 아미노산 길이를 가질 것이다. 용이하게 알게 될 바와 같이, 네오에피토프 내의 변화된 아미노산의 위치는 중심이 아닐 수 있으므로, 실제 펩타이드 서열 및 이와 함께 네오에피토프의 실제 위상은 상당히 변할 수 있다.
물론, 네오에피토프들의 동정 또는 발견은 신선한 생검들, 동결 또는 그렇지 않으면 보존된 조직 또는 세포 샘플들, 순환하는 종양 세포들, 엑소좀들, 다양한 체액 (및 특히 혈액) 등을 포함하는 다양한 생물학적 물질들로 시작될 수 있다는 것을 알아야 한다. 그러므로, 오믹스 분석의 적당한 방법들은 핵산 시퀀싱, 및 특히 DNA 상에서 작동하는 NGS 방법들(예컨대, 일루미나 시퀀싱(Illumina sequencing), 이온 토런트 시퀀싱(ion torrent sequencing), 454 파이로시퀀싱(pyrosequencing), 나노포어 시퀀싱(nanopore sequencing) 등), RNA 시퀀싱(예컨대, RNAseq, 역전사 기반 시퀀싱 등), 및 단백질 시퀀싱 또는 질량 분광학 기반 시퀀싱(예컨대, SRM, MRM, CRM 등)을 포함한다.
이와 같이, 그리고 특히 핵산 기반 시퀀싱에 대하여, 종양 조직의 높은 스루풋 게놈 시퀀싱은 네오에피토프들의 신속한 동정을 가능하게 할 것이라는 것이 특히 인식되어야 한다. 그러나, 그렇게 획득된 서열 정보가 표준 기준과 비교되는 경우, 이형 접합성뿐만 아니라 통상적으로 발생하는 (예컨대, SNPs, 짧은 인델들(indels), 상이한 반복 횟수 등으로 인한) 환자 간 변동은 상대적으로 많은 수의 잠재적인 거짓 양성(false positive) 네오에피토프들을 초래할 것이라는 것을 알아야 한다. 특히, 환자의 종양 샘플이 동일한 환자의 정합된 정상 (즉, 비-종양) 샘플과 비교되는 경우, 그러한 부정확성이 제거될 수 있다.
본 발명의 주제의 하나의 특히 바람직한 양태에 있어서, DNA 분석은 종양 및 정합된 정상 샘플 양쪽의 (통상적으로, 적어도 10x, 더 통상적으로는 적어도 20x의 커버리지(coverage) 깊이에서) 전체 게놈 시퀀싱 및/또는 엑솜 시퀀싱에 의해 수행된다. 대안적으로, DNA 데이터는 또한 이전의 서열 결정으로부터 이미 수립된 서열 기록(예컨대, SAM, BAM, FASTA, FASTQ, 또는 VCF 파일)으로부터 제공될 수 있다. 그러므로, 데이터 세트들은 미처리 또는 처리된 데이터 세트들을 포함할 수 있으며, 예시적인 데이터 세트들은 BAMBAM 포맷, SAMBAM 포맷, FASTQ 포맷, 또는 FASTA 포맷을 갖는 것들을 포함한다. 그러나, 데이터 세트들은 BAMBAM 포맷 내에 또는 BAMBAM diff 대상들로서 제공되는 것이 특히 바람직하다(예컨대, US 제2012/0059670A1호 및 US 제2012/0066001A1호 참조). 또한, 데이터 세트들은 동일한 환자의 종양 및 정합된 정상 샘플을 반영하여 환자 및 종양 특이적 정보를 얻는다는 것에 유의해야 한다. 따라서, 종양을 발생하지 않는 유전적 생식 세포 계열 변경(예컨대, 침묵 돌연변이, SNP 등)이 배제될 수 있다. 물론, 종양 샘플은 초기 종양, 치료 시작 시 종양, 재발성 종양 또는 전이 사이트 등으로부터 유래될 수 있다는 것이 인식되어야 한다. 대부분의 경우, 환자의 정합된 정상 샘플은 혈액 또는 종양과 동일한 조직 유형으로부터의 비-질병 조직일 수 있다.
마찬가지로, 서열 데이터의 컴퓨터 분석은 수많은 방식으로 수행될 수 있다. 그러나, 가장 바람직한 방법들에 있어서, 분석은 예를 들어, BAM 파일들 및 BAM 서버들을 사용하는 US 제2012/0059670A1호 및 US 제2012/0066001A1호에 개시된 바와 같이 종양 및 정상 샘플들의 위치 유도 동기 정렬에 의해 인실리코(in silico)로 수행된다. 그러한 분석은 거짓 양성 네오에피토프들을 유리하게 감소시키며 메모리 및 컴퓨터 리소스들에 대한 수요를 현저하게 감소시킨다.
컴퓨터로 관한 임의의 언어는 서버, 인터페이스, 시스템, 데이터베이스, 에이전트(agents), 피어(peers), 엔진(engines), 제어기, 또는 개별적으로 또는 집단적으로 동작하는 다른 유형의 컴퓨팅 장치를 포함하는 컴퓨팅 장치의 임의의 적당한 조합을 포함하도록 판독되어야 함을 유의해야 한다. 컴퓨팅 장치가 유형의 비-일시적인 컴퓨터 판독 가능 저장 매체(예컨대, 하드 드라이브, 고체 상태 드라이브, RAM, 플래시, ROM 등) 상에 저장된 소프트웨어 명령을 실행하도록 구성된 프로세서를 포함하는 것을 알아야 한다. 소프트웨어 명령은 바람직하게는 개시된 장치에 대하여 후술되는 바와 같은 역할, 책임 또는 다른 기능성을 제공하도록 컴퓨팅 장치를 구성한다. 또한, 개시된 기술들은 프로세서로 하여금 컴퓨터 기반 알고리즘, 프로세스, 방법 또는 다른 명령의 구현과 관련된 개시된 단계들을 실행하게 하는 소프트웨어 명령들을 저장하는 비-일시적인 컴퓨터 판독 가능 매체를 포함하는 컴퓨터 프로그램 제품으로서 구체화될 수 있다. 특히 바람직한 실시형태들에 있어서, 다양한 서버, 시스템, 데이터베이스 또는 인터페이스는 가능하면 HTTP, HTTPS, AES, 공개-개인 키 교환, 웹 서비스 AIPs, 알려진 금융 거래 프로토콜 또는 다른 전자 정보 교환 방법들에 기초한 표준화된 프로토콜 또는 알고리즘을 사용하여 데이터를 교환한다. 장치들간의 데이터 교환은 패킷-스위치형 네트워크, 인터넷, LAN, WAN, VPN 또는 다른 유형의 패킷 스위치형 네트워크; 회로 스위치형 네트워크; 셀 스위치형 네트워크; 또는 다른 유형의 네트워크 상에서 수행될 수 있다.
상이한 관점에서 볼 때, 5 내지 25의 아미노산의 소정의 길이를 가지며 적어도 하나의 변화된 아미노산을 포함하는 서열들의 환자 및 암 특이적 인실리코 집합이 수립될 수 있다. 그러한 집합은 통상적으로 각각의 변화된 아미노산에 대하여, 변화된 아미노산의 위치가 동일하지 않은, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개 또는 적어도 6개의 요소들을 포함할 것이다. 그러한 집합은 이후 하기에 더 상세히 기재되는 바와 같이 (예컨대, 서브-세포성 위치, 전사/발현 수준, MHC-I 및/또는 II 친화도 등에 의해) 더 필터링하기 위해 사용될 수 있다.
암의 유형 및 단계에 따라, 동정된 네오에피토프들 모두가 반드시 환자에게 치료적으로 동등한 효과의 반응을 일으키는 것은 아니라는 점에 유의해야 한다. 실제로, 네오에피토들 중 일부만이 면역 반응을 발생시킨다는 것은 당 업계에 주지되어 있다. 치료적으로 바람직한 반응의 가능성을 증가시키기 위하여, 네오에피토프들은 더 필터링될 수 있다. 물론, 하류(downstream) 분석은 본원에 제시된 방법들의 목적을 위한 침묵 돌연변이를 고려할 필요가 없다는 것을 알아야 한다. 그러나, 바람직한 돌연변이 분석은 돌연변이 유형(예컨대, 결손, 삽입, 전환, 전이, 전좌)에 더하여 돌연변이의 영향(예컨대, 넌센스, 미스센스 등)의 정보를 제공할 것이며, 침묵 돌연변이들이 제거되는 제1 내용 필터로서 그 자체로 작용할 수 있다. 예를 들어, 네오에피토프들은 상기 돌연변이가 프레임-쉬프트, 넌센스 및/또는 미스센스 돌연변이인 경우 더 고려되기 위하여 선택될 수 있다.
다른 필터링 접근법에 있어서, 네오에피토프들은 서브-세포 위치 매개변수들에 대한 상세한 분석의 대상이 될수도 있다. 예를 들어, 네오에피토프 서열들은 상기 네오에피토프들이 막 연관 위치를 갖는 것으로 동정되면 (예컨대, 세포의 세포막 외부에 위치됨) 그리고/또는 인 실리코 구조 계산이 네오에피토프가 용매에 노출되거나 구조적으로 안정한 에피토프를 제시하는(예컨대, J Exp Med 2014) 등의 가능성이 있는 것을 확인하면 더 고려되기 위하여 선택될 수 있다.
네오에피토프들을 필터링하는 것에 대하여, 네오에피토프들이 오믹스 (또는 다른) 분석에 의해 네오에피토프가 실제로 발현되는 것으로 밝혀진 곳인 본원에서의 사용에 특히 적합하다고 일반적으로 고려된다. 네오에피토프의 발현 및 발현 수준의 동정은 당 업계에 알려진 모든 방식으로 수행될 수 있으며, 바람직한 방법들은 정량적 RNA (hnRNA 또는 mRNA) 분석 및/또는 정량적 프로테오믹스 분석을 포함한다. 가장 통상적으로, 네오에피토프들을 포함시키기 위한 임계값 수준은 대응하는 정합된 정상 서열의 발현 수준의 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 또는 적어도 50%의 발현 수준 일 것이며, 따라서 (네오)에피토프가 면역 시스템에 적어도 잠재적으로 '가시적'인 것을 보장한다. 결과적으로, 오믹스 분석은 또한 유전자 발현의 분석 (트랜스크립토믹 분석)을 포함하여 돌연변이가 있는 유전자의 발현 수준을 동정하는 것을 보조하는 것이 일반적으로 바람직하다.
당 업계에 알려진 수많은 트랜스크립토믹 분석 방법들이 존재하며, 알려진 모든 방법들이 본원에서 사용에 적합하다고 간주된다. 예를 들어, 바람직한 물질들은 mRNA 및 1 차 전사체(hnRNA)를 포함하고, RNA 서열 정보는 종양 샘플 및 동일한 환자의 정합된 정상(건강한) 샘플로부터 차례로 획득된 역전사된 폴리 A+-RNA로부터 획득될 수 있다. 마찬가지로, 폴리 A+-RNA가 통상적으로 트랜스크립톰(transcriptome)의 표현으로서 바람직한 반면에, 다른 형태의 RNA (hn-RNA, 비-폴리아데닐화된 RNA, siRNA, miRNA 등)도 또한 본원에서의 사용에 적합하다고 간주됨에 유의해야 된다. 바람직한 방법들은 특히 RNAseq를 포함하여, 정량적 RNA(hnRNA 또는 mRNA) 분석 및/또는 정량적 프로테오믹스 분석을 포함한다. 다른 양태들에 있어서, 다양한 대안적인 방법들(예컨대, 고체상 혼성화 기반 방법들)도 적합하다고 간주됨에도 불구하고, RNA 정량화 및 시퀀싱은 RNA-seq, qPCR 및/또는 rtRCR 기반 방법들을 사용하여 수행된다. 다른 관점에서 볼 때, 트랜스크립토믹 분석은 암 및 환자 특이적 돌연변이를 갖는 유전자들을 동정하고 정량화하는데 (단독 또는 게노믹 분석과 조합하여) 적합할 수 있다.
유사하게는, 프로테오믹스 분석은 네오에피토프의 RNA의 실제 번역을 확인하기 위해 수많은 방식들로 수행될 수 있으며, 프로테오믹스 분석의 모든 알려진 방식들이 본원에서 고려된다. 그러나, 특히 바람직한 프로테오믹스 방법들은 항체 기반 방법들 및 질량 분광학적 방법들을 포함한다. 또한, 프로테오믹스 분석은 단백질 그 자체에 대한 정성적 또는 정량적 정보를 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 단백질이 촉매 작용 또는 다른 기능적 활성을 갖는 단백질 활성 데이터를 포함할 수도 있다는 것에 유의하여야 한다. 프로테오믹스 분석을 수행하기 위한 하나의 예시적인 기법은 본원에 참조로 포함된 US 제7473532호에 기재되어 있다. 단백질 발현의 동정 및 심지어 정량화의 더 적합한 방법들은 다양한 질량 분광학 분석들(예컨대, 선택적 반응 모니터링(SRM), 다중 반응 모니터링(MRM), 및 연속 반응 모니터링 (CRM))을 포함한다. 결과적으로, 상기 방법들은 네오에피토프를 함유하는 단백질의 서브-세포 위치(예컨대, 멤브레인 위치), 발현 길이(예컨대, 동일한 환자의 정합된 정상과 비교하여 과발현됨) 등에 의해 더 필터링될 수 있는 환자 및 종양 특이적 네오에피토프들을 제공할 것이다는 것을 알아야 한다.
필터링의 또 다른 양태에 있어서, 네오에피토프들은 인간-동일 서열의 사용을 회피하기 위해 (예컨대, 환자의 또는 환자들의 집합의) 알려진 인간 서열들을 포함하는 데이터베이스와 비교될 수 있다. 또한, 필터링은 또한 SNP들이 종양 및 정합된 정상 서열 모두에 존재하는 환자의 SNP들로 인한 네오에피토프 서열들의 제거를 포함할 수 있다. 예를 들어, dbSNP(단일 뉴클레오타이드 다형성 데이터베이스(The Single Nucleotide Polymorphism Database))는 국립 인간 게놈 연구소(NHGRI: the National Human Genome Research Institute)와 공동으로 국립 생명 공학 정보 센터(NCBI: National Center for Biotechnology Information)가 개발 및 주최한 종 내 및 상이한 종간 유전 변이에 대한 무료 공개 아카이브이다. 비록 데이터베이스의 명칭이 다형성들만의 일 클래스(단일 뉴클레오타이드 다형성들(SNPs))의 집합을 의미함에도, 데이터베이스의 명칭이 사실상 상대적으로 넓은 범위의 분자 변이: (1) SNPs, (2) 짧은 결실 및 삽입 다형성들(indels/DIPs), (3) 미소부수체 마커들 또는 단연쇄반복들(STRs) (4) 다중 뉴클레오타이드 다형성들(MNPs), (5) 이형 접합 서열들, 및 (6) 네임드 변이체들;을 포함한다. dbSNP는 명백하게 중성 다형성들, 알려진 표현형에 상응하는 다형성들 및 변화가 없는 영역들을 수용한다. 상기 기재된 바와 같이 그러한 데이터베이스 및 다른 필터링 옵션들을 사용하여, 환자 및 종양 특이적 네오에피토프들은 그러한 알려진 서열들을 제거하기 위하여 필터링되어, 실질적으로 감소된 거짓 양성들을 갖는 복수의 네이에피토프 서열들이 있는 서열 세트를 산출할 수 있다.
그러나, 필터링에도 불구하고, 네오에피토프들이 환자의 MHC 복합체 상에 제시될 필요가 있기 때문에, 모든 네오에피토프들이 면역 시스템에 가시적인 것은 아님을 인식해야 한다. 실제로, 네오에피토프들의 일부분 만이 제시에 충분한 친화성을 가질 것이고, MHC 복합체의 큰 다양성은 모든 것이 아니라더라도, 대부분의 공통적인 네오에피토프들의 사용을 배제할 것이다. 결과적으로, 면역 요법의 맥락에서, 네오에피토프들은 상기 네오에피토프들이 MHC 복합체에 결합되고 MHC 복합체에 의해 제시되는 경우 더 효과적일 가능성이 있을 것이라는 것은 따라서 용이하게 명백하여야 한다. 다른 관점에서 볼 때, 체크포인트 억제제들을 이용한 치료 성공은 네오에피토프가 환자의 HLA 유형에 최소한의 친화도를 가져야만 하는 MHC 복합체를 통해 복수의 네오에피토프들이 제시될 것을 요구한다. 결과적으로, 효과적인 결합 및 제시는 네오에피토프의 시퀀스 및 환자의 특정한 HLA-유형의 조합된 기능이라는 것을 알아야 한다. 가장 통상적으로, HLA-유형 결정은 적어도 3개의 MHC-I 서브 유형들(예컨대, HLA-A, HLA-B, HLA-C) 및 적어도 3개의 MHC-II 서브 유형들(예컨대, HLA-DP, HLA-DQ, HLA-DR)을 포함하며, 바람직하게는 각각의 서브 유형이 적어도 2자리 깊이 또는 적어도 4자리 깊이로 결정된다. 그러나, 더 큰 깊이(예컨대, 6자리, 8 자리)도 본원에서 고려된다. HLA 결정은 당업계에 주지된 습식 화학에서의 다양한 방법들을 사용하여 수행될 수 있으며, 이 방법들 모두는 본원에서의 사용에 적합하다고 간주된다. 대안적으로, HLA 유형은 또한 PCT/US16/48768에 도시되는 바와 같이 알려지고/지거나 일반적인 HLA 유형들의 대부분 또는 모두를 포함하는 기준 서열을 사용하여 인실리코 환자 오믹스 데이터로부터 예측될 수 있다.
일단 환자의 HLA 유형이 (알려진 화학 또는 인실리코 결정을 사용하여) 확인되면, HLA 유형에 대한 구조적 해결책이 이후 (통상적으로 필터링된) 네오에피토프의 HLA 구조적 해결책에 대한 결합 친화성을 결정하기 위해 인실리코 도킹 모델(docking model)에서 이용되는 데이터베이스로부터 계산되거나 획득된다. 결합 친화성들을 결정하기 위한 적합한 시스템들은 NetMHC 플랫폼을 포함한다(예컨대, Nucleic Acids Res. 2008년 7월 1일; 36(웹 서버 판): W509-W512 참조). 이전에 결정된 HLA 유형에 대한 고친화성(예컨대, 100 nM 미만, 75 nM 미만, 50 nM 미만)의 네오에피토프들은 이후 MHC-I/II 서브유형의 지식과 함께 요법 생성을 위해 선택된다.
더 구체적으로, 일단 환자 및 종양 특이적 네오에피토프들 및 HLA-유형이 동정되면, 컴퓨터 분석은 네오에피토프들을 상기 HLA에 도킹시키고 예를 들어, NetMHC를 사용하여 최상의 바인더들(예컨대, 최저 KD, 예컨대, 500 nM 미만 또는 250 nM 미만, 또는 150 nM 미만, 또는 50 nM 미만)을 결정함으로써 수행될 수 있다. 물론, 환자의 HLA 유형을 환자 및 암 특이적 네오에피토프에 정합시키는 것이 NetMHC 이외의 시스템들을 사용하여 수행될 수 있으며, 적합한 시스템들은 NetMHC II, NetMHCpan, IEDB 분석 자원 (URL immunepitope.org), RankPep, PREDEP, SVMHC, Epipredict, HLABinding 등을 포함한다는 것을 알아야 한다(예컨대, J Immunol Methods 2011;374:1-4 참조).
최상의 친화성를 계산할 때, 변형된 아미노산의 위치가 이동된 (상기) 네에피토프 서열들의 집합이 사용될 수 있음을 주목해야 한다. 대안적으로 또는 추가적으로, 네오에피토프들의 변형은 N- 및/또는 C-말단 변형을 추가함으로써 발현된 네오에피토프의 환자 HLA-유형에 대한 결합을 더욱 증가시킴으로써 구현될 수 있다. 따라서, 네오에피토프들은 특정 HLA-유형에 보다 잘 정합되도록 동정되거나 더 변형된 바와 같은 천연일 수 있다. 또한, 원하는 경우, 대응하는 야생형 서열들(즉, 아미노산 변화가 없는 네오에피토프 서열)의 결합은 높은 차등 친화성를 보장하기 위해 계산될 수 있다. 예를 들어, 네오에피토프 및 이의 대응하는 야생형 서열 사이의 MHC 결합에서 특히 바람직한 높은 차등 친화성은 적어도 2배, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 100배, 적어도 500배, 적어도 1000배 등 이다).
그러한 접근법은 환자 및 종양에 진정한 특이적인 네오에피토프들뿐만 아니라 세포 상에 제시될 가능성이 가장 높고 따라서 치료 효과가 있는 면역 반응을 도출할 가능성이 가장 높은 그러한 네오에피토프들을 동정할 것임을 알아야 한다. 물론, 그렇게 동정된 HLA-정합된 네오에피토프들은 더 논의되는 바와 같이 페이로드(payload)로서 에피토프를 인코딩하는 핵산을 바이러스에 포함시키기 전에 생체외에서 생화학적으로 유효화될 수 있음도 알아야 한다. 추가적으로, 네오에피토프들의 HLA 정합은 (체액성 및 세포성 면역 반응 사이의 균형에 적어도 어느 정도 영향을 미치게 될) CD8+ 및 CD4+ T 세포들의 활성화에 대하여 면역 반응에 대한 제어가 차례로 이루어지게 할 MHC-I 및/또는 MHC-II 제시를 향한 네오에피토프 서열의 의도적인 타겟팅을 허용하게 될 것이라는 것을 알아야 한다. 예를 들어, 특정 네오에피토프가 상기 MHC-I 경로에 의한 제시를 통해 효과적인 면역 반응을 도출하지 않을 경우, 동일한 네오에피토프는 상기 MHC-II 경로에 의한 제시를 위해 대안적으로 (또는 추가적으로) 타겟팅될 수 있다. 또한, 네오에피토프들의 발현은 하나의 제시 시스템을 향해 배타적으로 또는 우세하게(예컨대, 모든 네오에피토프들의 적어도 50%, 또는 60%, 또는 70%, 또는 80%) 유도될 수 있음이 고려된다. 예를 들어, 보다 세포성의 면역 반응(예컨대, T 세포 반응에 의한 ADCC)이 요구되는 경우, 제시는 MHC-I 제시 쪽으로 유도될 수 있다. 반면에, 보다 체액성의 반응이 요구되는 경우(예컨대, 항체/보체 반응), 제시는 MHC-II 제시 쪽으로 유도될 수 있다.
그렇게 동정되고 발현된 네오에피토프를 목적하는 MHC 시스템으로 라우팅(routing)하는 것에 대하여, MHC-1 제시된 펩타이드들은 통상적으로 소포체를 통한 프로테아좀(proteasome) 처리 및 전달을 통해 세포질로부터 발생할 것이라는 것을 알아야 한다. 따라서, MHC-I 제시를 위한 에피토프들의 발현은 일반적으로 하기에 더 상세히 논의되는 바와 같이 세포질에 관한 것이다. 반면에, MHC-II 제시된 펩타이드들은 통상적으로 세포막으로의 전달 이전에 산성 프로테아제류(예컨대, 레구메인, 카텝신 L 및 카텝신 S)에 의한 분해 및 처리를 통해 엔도솜 및 리소좀 구역으로부터 발생할 것이다. 따라서, MHC-II 제시를 위해 의도된 에피토프들의 발현은 일반적으로 하기에 더 상세히 논의되는 바와 같이 엔도솜 및 리소좀 구역에 관한 것일 것이다.
바람직한 양태들에 있어서, 신호 펩타이드들은 엔도솜 및 리소좀 구역으로의 트래피킹 또는 세포질 공간 내에서의 보유(retention)를 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 펩타이드가 엔도솜 및 리소좀 구역으로 운반되는 경우, 선택된 타겟팅 프리(pre)-서열들 및 내부 타겟팅 펩타이드들이 채용될 수 있다. 상기 타겟팅 펩타이드의 프리-서열들은 바람직하게는 N-말단에 첨가되고 통상적으로 6 내지 136개 사이의 염기성 및 소수성 아미노산들을 포함할 것이다. 퍼옥시좀 타겟팅의 경우, 표적 서열은 C-말단에 있을 수 있다. 다른 신호들(예컨대, 신호 패치들(patches))이 사용될 수 있고 펩타이드 서열 내에서 분리되고 적합한 펩타이드 폴딩(folding) 시에 기능적이 되는 서열 요소들을 포함한다. 또한, 글리코실화와 같은 단백질 변형들은 타겟팅을 유도할 수 있다. 다른 적합한 표적 신호들 중에서, 본 발명자들은 N-말단 근처에 위치한 노나펩타이드(nonapeptide)인 퍼옥시좀 표적 신호 1 (PTS1), C- 말단 트리펩타이드 및 퍼옥시좀 표적 신호 2 (PTS2)를 고려한다. 또한, 단백질을 엔도솜 및 리소좀에 선별하는 것은 또한 통상적으로 짧은 선형 서열들을 포함하는, 단백질의 세포질 도메인 내의 신호들에 의해 매개될 수 있다. 일부 신호들은 티로신-기반 선별 신호들이라고 지칭되며 NPXY 또는 YXXΨ 컨센서스(consensus) 모티프들을 따른다. 디루신(dileucine)-기반 신호들로서 알려진 다른 신호들은 [DE]XXXL[LI] 또는 DXXLL 컨센서스 모티프들에 적합하다. 이들 신호 모두는 막들의 세포질 표면과 연관된 말단 단백질 코트들(coats)의 성분들에 의해 인식된다. YXXΨ 및 [DE]XXXL[LI] 신호들은 어댑터 단백질 (AP) 복합체들 AP-1, AP-2, AP-3 및 AP-4에 의해 특징적인 미세 특이성을 갖는 것으로 인식되는 반면, DXXLL 신호들은 GGA들로 알려진 어댑터들의 다른 패밀리에 의하여 인식된다. 또한, 액상 단백질 선별 및 엔도솜 기능과 연관되어 있는 FYVE 도메인이 첨가될 수 있다. 또 다른 양태들에 있어서, 엔도솜 구역들은 또한 인간 CD1 꼬리 서열들을 사용하여 타겟팅될 수 있다(예컨대, Immunology, 122, 522-531 참조).
세포질 구역으로의 트래피킹 또는 세포질 구역에서의 보유는 반드시 하나 이상의 특이적인 서열 요소를 필요로 하지 않을 수 있다. 그러나, 적어도 일부 양태들에 있어서, 막-앵커된(anchored) 단백질 또는 막- 앵커된 단백질의 막 앵커 도메인을 포함하는 N- 또는 C-말단 세포질 보유 신호들이 첨가될 수 있다. 예를 들어, 막-앵커된 단백질들은 SNAP-25, 신텍신(syntaxin), 시냅토프레빈(synaptoprevin), 시냅토타그민(synaptotagmin), 소포 연관 막 단백질들(VAMPs), 시냅스 소포 당단백질들(SV2), 고친화성 콜린 수송체들, 뉴레신들, 전압-게이트된(gated) 칼슘 채널들, 아세틸콜린에스테라아제, 및 NOTCH를 포함한다.
단백질들의 MHC-I 및/또는 MHC-II 시스템으로의 특이적인 타겟팅에 더하여, 상기 처리 및 제시는 예를 들어, 재조합 항원 또는 네오에피토프의 N-말단 아미노산의 적합한 선택에 의해 세포 내에서 단백질 턴오버를 촉진하는데 보조하는 하나 이상의 신호들에 의해 더 증가될 수 있음을 알아야 한다. 예를 들어, 턴오버를 증가시키기 위해, N-말단 아미노산은 불안정화 아미노산일 수 있음이 고려된다. 따라서, 적합한 N-말단 아미노산들은 특히 Arg, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Trp, 및 Tyr을 포함하며, 어느 정도는 Asn Asp, Gln, 및 Glu도 포함한다. 그러한 아미노산들은 MHC-I 및/또는 MHC-II 제시 경로들에 타겟팅되는 펩타이드들에 첨가될 수 있다. 또한, 단백질 턴오버는 바람직하게는, 비-절단성 링커에 의해 결합된 단백질 말단에서 유비퀴틴을 사용하여 증가될 수도 있다는 것을 알아야 한다.
결과적으로, 적합한 신호 서열들을 갖는 적절한 구역들로 펩타이드들을 어드레싱하고, 불안정한 N-말단 아미노산들로 펩타이드들을 선택적으로 변형시키는 것은 항원 처리 및 제시를 증가시키는데 보조할 것이며, 이는 또한 궁극적으로 항원 캐스케이딩 및 에피토프 확산을 유도할 것이다.
물론, 둘 이상의 종양 관련 항원이 재조합 핵산에서 인코딩될 수 있고, 다중 항원들의 배열이 상당히 변할 수 있다는 것을 알아야 한다. 예를 들어, 고려된 전사 또는 번역 단위들은 통상적으로 단백질 분해 효소 절단 부위들을 추가로 포함할 수 있는 짧은 링커들(예컨대, 4 내지 20개의 아미노산들을 갖는 가요성 링커들)에 의해 분리된 다중 에피토프들의 컨케테메릭(concatemeric) 배열을 가질 수 있다. 특히, 적합한 링커 서열들은 링커 및 종양 연관 항원 사이의 융합 부분뿐만 아니라 링커가 환자 내에서 정상적으로 존재하는 단백질 서열을 형성하지 않도록 설계될 것이다. 그러한 컨케테머들은 (통상적으로 바이러스를 통해 전달될 수 있는 재조합 핵산의 크기에 의해 제한되는) 1 내지 20개 사이의 네오에피토프들을 가질 수 있으며, 상기 컨케테머들은 MHC-I 및 MHC-II 복합체로의 전달에 대해 동일하거나 상이할 수 있음에 유의해야 한다. 그러므로, 다양한 펩타이드들은 특이적인 세포성 구역들에 라우팅되어 MHC-I 및/또한 MHC-II를 통한 우선적 또는 심지어 특이적인 제시를 달성할 수 있음을 알아야 한다. 다른 관점에서 볼 때, 종양 연관 항원들 및 네오에피토프들은 양쪽 제시 경로들을 통해 제시되거나 동시에 또는 후속 치료 라운드에서 하나 또는 다른 경로로 선택적으로 제시될 수 있음을 인식해야 한다.
추가적으로, 바이러스성 재조합 핵산은 또한 감염된 수지상 세포들 및 T 세포들 사이의 상호작용을 증가시키기 위하여 적어도 하나, 더 통상적으로는 적어도 둘, 더욱 더 통상적으로는 적어도 셋 및 가장 통상적으로는 적어도 네개의 공동자극 분자들을 인코딩하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 적합한 공동자극 분자들은 특히 B7.1 (CD80) 및/또는 B7.2 (CD86)과 조합하여, ICAM-1 (CD54), ICOS-L, 및 LFA-3 (CD58)을 포함한다. 추가로 고려되는 공동자극 분자들은 4-1BBL, CD30L, CD40, CD40L, CD48, CD70, CD112, CD155, GITRL, OX40L, 및 TL1A을 포함한다. 또한, 상기 공동자극 분자들의 발현은 상기 항원들 및/또는 네오에피토프들이 하나 이상의 공동자극 분자들의 발현과 함께 제시되도록 바람직하게 조정될 것임을 알아야 한다. 따라서, 공동자극 분자들은 내부 리보솜 진입 부위 또는 2A 서열을 사용하는 단일 전사체로부터, 또는 다중 전사체들로부터 생성되는 것이 통상적으로 고려된다.
면역원성을 증가시키기 위한 자극 인자들의 추가적인 예들은 하기를 포함한다: (a) CD27 및 CD70: 양성 작용제 CD27 및/또는 T 세포상의 CD70과 CD27 상호작용을 모방하는 생물학적 제제(예컨대: 항체, 리간드 등); (b) CD40 및 CD40L: 양성 작용제 CD40 및/또는 T 세포상의 CD40L과 CD40 상호작용을 모방하는 생물학적 제제; (c) OX40L 및 OX40: 양성 작용제 OX40L 및/또는 T 세포상의 OX40과 OX40L 상호작용을 모방하는 생물학적 제제; (d) GITRL 및 GITR: 양성 작용제 GITRL 및/또는 T 세포상의 GITR과 GITRL 상호작용을 모방하는 생물학적 제제; (e) IL-2 및 CD122: 양성 작용제 IL-2 및/또는 T 세포상의 IL-2 수용체와 IL-2 상호작용을 모방하는 생물학적 제제(예컨대, CD122 등); (f) CD137 또는 T 세포에 대하여 CD137 활성을 모방하는 항체; 및 (g) ICOSL 및 ICOS: 양성 작용제 ICOSL 및/또는 T 세포상의 ICOS와 ICOSL 상호작용을 모방하는 생물학적 제제.
추가적으로, 임의의 공동자극 분자의 발현은 체크포인트 억제를 간섭하는 임의의 다른 단백질의 발현과 쌍을 이룰 수 있다는 것을 인식해야 한다. 예를 들어, 공동자극 단백질 CD28의 발현은 CTLA-4의 억제제의 발현과 짝을 이룰 수 있다. 본 출원인들은 추가적인 자극 또는 억제 인자들은 바이러스의 페이로드를 통해 영향을 받을 수 있음을 더 고려한다. 바이러스들은 천연 면역 반응들을 모방하기 위해 재단될 수 있는 페이로드들을 포함할 수 있다. 예를 들어, T 세포들을 자극하는데 보조하는 작용제(예컨대, CD28의 자극)를 갖는 제 1 바이러스는 환자에게 투여될 수 있다. 길항제(예컨대, CTLA-4의 억제제)를 갖는 제 2 바이러스는 나중에 환자에게 투여되어, 억제 반응을 방지할 수 있게 된다. 상기 전달의 순서는 변할 수 있음이 또한 고려된다. 또한, 자극 및 억제 인자들을 지원하기 위하여 단일 바이러스가 구축될 수 있다. 대안적으로, 체크포인트 억제제들이 (피하로) 주사될 수 있으면서, 공동자극 분자들은 종양 관련 항원들과 동시-발현될 수 있다.
그러므로, 상기 재조합 바이러스는 체크포인트 수용체에 결합하는 하나 이상의 펩타이드 리간드들을 인코딩하는 서열 부분을 추가로 포함할 수 있음도 고려된다. 가장 통상적으로, 결합은 상기 수용체를 통해 시그널링을 억제하거나 적어도 감소시킬 것이며, 특히 고려되는 수용체들은 (특히 CD8+ 세포들에 대한) CTLA-4 및 (특히 CD4+ 세포들에 대한) PD-1을 포함한다. 예를 들어, 펩타이드 바인더들은 항체 프래그먼트들 및 특히 scFv 뿐만 아니라, 상기 수용체들과 특이적으로 결합하는 소분자 펩타이드 리간드들도 포함할 수 있다. 또한, 상기 펩타이드 분자들의 발현은 상기 항원들 및/또는 네오에피토프들이 하나 이상의 펩타이드 분자들과 함께 제시되도록 바람직하게 조정될 것임을 알아야 한다. 따라서, 펩타이드 분자들은 내부 리보솜 진입 부위 또는 2A 서열을 사용하는 단일 전사체로부터, 또는 다중 전사체들로부터 생성되는 것이 통상적으로 고려된다.
적당히 구축된 바이러스들을 통해 증가될 수 있는 억제 인자들의 추가적인 예시들은 하기를 포함하는 것으로 간주된다: (a) T 세포 활성화의 CD276/B7-H3 억제를 억제하는 자연 발생 또는 조작된 리간드들; (b) T 세포 활성화의 B7-H4/VTCN1 억제를 억제하는 자연 발생 도는 조작된 리간드들; (c) T 세포 활성화의 CD272/HVEM 억제를 억제하는 자연 발생 또는 조작된 리간드들; (d) T 세포 활성화의 LAG3 억제를 억제하는 자연 발생 또는 조작된 리간드들(예컨대, MHC-II 등); (e) T 세포 활성화의 PD-1 억제를 억제하는 자연 발생 또는 조작된 리간드들(예컨대, PD-L1); (f) T 세포 활성화의 CTLA-4 억제를 억제하는 자연 발생 또는 조작된 리간드들(예컨대, 생물학적 제제, 가용성 CD28 등); (g) T 세포 활성화의 TIM-3 억제를 억제하는 자연 발생 또는 조작된 리간드들(예컨대, 갈렉틴(galectin)-9, 생물학적 제제, 항체 등); (h) T 세포 활성화의 VISTA 억제를 억제하는 자연 발생 또는 조작된 리간드들(예컨대, 항체 등); 및 (i) NK 세포들의 MIC 억제를 억제하는 자연 발생 또는 조작된 리간드들(예컨대, 항체, 생물학적 제제 등).
가장 통상적으로, 재조합 유전자의 발현은 구성적으로 활성인 조절 서열들로부터 유도된다. 그러나, 본 발명의 주제의 다른 양태들에 있어서, 상기 조절 서열들은 바람직하게는 암성 조직 또는 합성 유도제들에 대한 내인성인 하나 이상의 조절 신호들을 사용하여 선택적 방식으로 유도성일 수 있다. 예를 들어, 유도성 발현은 적절한 반응 요소들과 함께 합성 유도제들 또는 자연 발생 유도제들을 사용하여 수행될 수 있다. 대부분의 경우들에 있어서, 전사체는 종양 관련 항원들, 공동자극 분자들 및/또는 체크포인트 억제제들의 조정된 발현을 다시 허용하기 위해 IRES(내부 리보솜 진입 부위) 또는 2A 서열(절단성 2A-유사 펩타이드 서열)을 포함할 것이 더 바람직하다.
결과적으로, 고려된 시스템들 및 방법들을 사용하여 면역 요법이 항원 제시 세포들 및 특히 수지상 세포들에서 하나 이상의 종양 관련 항원들 및 공동자극 분자들의 발현에 의해 수행될 수 있는데, (항원 제시 세포에서 동일하게 발현될 수 있는) 체크포인트 억제의 억제제들의 존재 하에 더 수행됨을 알아야 한다. 특히, 특이적인 MHC 제시 쪽으로 지향되는 경우의 그러한 조정된 사건은 세포성 성분들, 및 특히 NK 세포들의 투여에 의해 추가로 보완될 수 있는 향상된 후천성 면역 반응을 생성하는 것으로 여겨진다.
쉽게 이해할 수 있는 바와 같이, 종양 관련 항원들, 공동자극 분자들 및/또는 체크포인트 억제제들은 DNA 백신 또는 RNA로서 투여될 수 있는 재조합 핵산들 상에 인코딩될 것이지만, 재조합 핵산은 바이러스성 게놈의 일부임이 일반적으로 바람직하다. 그렇게 유전적으로 변형된 바이러스는 이후 유전자 요법에서 주지된 바와 같이 사용될 수 있다. 따라서, 재조합 바이러스들에 대하여, 재조합 바이러스들을 제조하는 모든 알려진 방식들이 본원에서의 사용에 적합하다고 간주되지만, 특히 바람직한 바이러스들은 아데노바이러스들, 아데노-연관 바이러스들, 알파 바이러스들, 헤르페스 바이러스들, 렌티바이러스들 등을 포함하여, 요법에 이미 확립된 것들이다. 다른 적절한 선택들 중에서, 아데노바이러스들이 특히 바람직하다.
또한, 상기 바이러스는 통상적으로 선택된 바이러스 단백질들(예컨대, E1, E3 단백질들)의 타겟팅된 결실에 의해 달성되는 복제 결핍 및 비면역원성 바이러스인 것이 일반적으로 더 바람직하다. 그러한 바람직한 성질들은 E2b 유전자 기능을 결실시킴으로써 더 향상될 수 있으며, 재조합 바이러스들의 높은 역가들은 최근 보고된 바와 같이 유전적으로 변형된 인간 293개 세포들을 사용하여 달성될 수 있다(예컨대, J Virol. 1998 Feb; 72(2): 926-933). 이전에 유의한 바와 같이, (바이러스 감염된 세포들로부터의 발현을 위한) 원하는 핵산 서열들은 당업계에 주지된 적절한 조절 요소들의 제어 하에 있다. 상기를 고려하여, 제시된 조성물들 및 방법들은 바이러스성으로 발현된 항원들을 하나 또는 다른 (또는 양쪽 모두) MHC 시스템들에 특이적으로 유도하기에 적합할 뿐만 아니라 다양한 공동자극 분자들(예컨대, ICAM-1 (CD54), ICOS-L, LFA-3 (CD58), 그리고 B7.1 (CD80) 및 B7.2 (CD86) 중 적어도 하나)의 포함을 통해, 그리고 체크포인트 억제제들의 분비 또는 막 결합 제시를 통해 CD8+ 및/또는 CD4+ 세포들에 증가된 자극 효과를 또한 제공할 것임을 그러므로 알아야 한다.
그렇게 생성된 재조합 바이러스들은 투여 단위당 104-1011 바이러스 입자들의 바이러스 역가를 갖는 멸균 주사용 조성물로서 통상적으로 제형화된 약학적 조성물에서 치료 백신으로서 개별적으로 또는 병용하여 사용될 수 있다. 그러나, 대안적인 제제도 본원에 사용하기에 적합한 것으로 간주되며, 모든 알려진 경로들 및 투여 방식들이 본원에서 고려된다. 본원에 사용된 약학적 조성물 또는 약물을 "투여하기"라는 용어는 상기 약학적 조성물 또는 약물의 직접 및 간접 투여로서, 상기 약학적 조성물 또는 약물의 직접 투여는 통상적으로 건강 관리 전문가(예컨대, 외과의사, 간호사 등)에 의해 수행되고, 간접 투여는 간접 투여(예컨대, 주사, 주입, 경구 전달, 국소 전달 등을 통해)를 위해 상기 약학적 조성물 또는 약물을 상기 건강 관리 전문가에게 제공하거나 이용가능하게 하는 단계를 포함하는 직접 투여 및 간접 투여를 지칭한다. 가장 바람직하게는, 상기 재조합 바이러스는 피하 주사를 통해 투여된다. 그러나, 다른 고려된 양태들에 있어서, 투여는 정맥내 주사일 수도 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 항원 제시 세포들은 환자의 세포들로부터 단리 또는 성장되고, 체외로 감염된 이후에 환자에게 주입될 수 있다.
또한, 재조합 바이러스의 예방적 또는 치료적 투여는 특히, 상기 재조합 바이러스가 체크포인트 수용체들을 타겟팅으로 하는 펩티드들을 인코딩하는 핵산 서열들을 포함하지 않는 경우, 하나 이상의 체크포인트 억제제들과 동시-투여에 의해 수반될 수 있음이 고려된다. 예를 들어, 특히 바람직한 체크포인트 억제제들은 바이러스성 벡터의 피하 투여의 부위에서 또는 부위 근처에서 (가장 바람직하게는) 피하로 투여되는 현재 이용가능한 억제제들(예컨대, 펨브롤리주맙(pembrolizumab), 니볼루맙(nivolumab), 이필리뮤맙)을 포함한다.
결과적으로, 재조합 바이러스가 진피층의 수지상 및 다른 항원 제시 세포들에 전달되고 MHC-I 및/또는 MHC-II 경로들을 통해 제시될 때, 면역 시스템을 통한 처리는 CD8+ 및 CD4+ 세포들의 자극이 일어날 것이고, 이는 IgG1의 형성을 위한 트레이닝된(trained) B-세포들, T 세포들뿐만 아니라 및 트레이닝된 NK 세포들 및 대응하는 기억 세포들의 형성에 이르게 될 것이라는 것을 인식해야 한다. 또한, IgG1 분자들은 또한 NK 세포들에 의해 종양 특이적 행동을 가능하게 할 수 있다는 것에 유의해야 한다.
그러므로, 치료는 바람직하게는 환자에게 자가 또는 이종 NK 세포들, 및 특히 억제를 덜 나타내도록 유전적으로 변형된 NK 세포들의 환자에게의 주입도 포함한다는 것이 고려된다. 예를 들어, 상기 유전적으로 변형된 NK 세포는 그러한 세포들을 구성적으로 활성화되도록 할 적어도 하나의 킬러 세포 면역글로블린-유사 수용체(KIR)의 발현을 감소시키거나 중단시키도록 변형된 NK-92 유도체일 수 있다. 물론, 하나 이상의 KIR들은 결실될 수 있거나, 이들의 발현은 KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DL4, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS4, KIR2DS5, KIR3DL1, KIR3DL2, KIR3DL3, 및 KIR3DS1을 포함하여, (예컨대, miRNA, siRNA 등을 통해) 저해될 수 있음을 유의해야 한다. 이러한 변형된 세포들은 당업계에 주지된 프로토콜을 사용하여 제조될 수 있다. 대안적으로, 이러한 세포들 aNK 세포들('활성화된 자연 킬러 세포들)로서 NantKwest에서 상업적으로 수득할 수도 있다. 이러한 세포들은 이후 하기에 더 토의되는 바와 같이 공동자극 분자들을 발현하도록 더 변형될 수 있다. 또한, 본원에서의 사용에 적합한 고려된 NK 세포들은 또한 Tregs 및 MDSCs에 활성화 신호인 NKG2A의 중단 또는 침묵 발현을 갖는 것들을 포함한다.
본 발명의 주제의 또 다른 바람직한 양태에서, 유전적으로 조작된 NK 세포는 또한 고-친화성 Fcγ 수용체 (CD16)를 발현하도록 변형된 NK-92 유도체일 수 있다. Fcγ 수용체의 고-친화성 변이체들에 대한 서열은 당 업계에 주지되어 있으며, 발생 및 발현의 모든 방식이 본원에서의 사용에 적합하다고 간주된다. 이러한 수용체의 발현은 본원에서 고려되는 치료에 반응하여 환자에 의해 생성된 항체들을 또는 치료용 항체들로서 공급되는 항체들을 사용하여 종양 세포들의 특이적 타겟팅을 허용하는 것으로 여겨지며, 이들 항체는 환자의 종양 세포들(예컨대, 네오에피토프들), 특정 종양 유형(예컨대: her2neu, PSA, PSMA 등) 또는 암과 연관된 항원들(예컨대: CEA-CAM)에 특이적이다. 유리하게는, 이러한 세포들은 haNK 세포들('고-친화성 천연 킬러 세포들')로서 NantKwest로부터 상업적으로 수득될 수 있고, 이후 (예컨대, 상기 토의된 바와 같은 공동자극 분자들을 발현시키기 위해) 추가로 변형될 수 있다.
대안적으로, 유전적으로 조작된 NK 세포는 키메라성 T 세포 수용체를 발현하기 위해 유전적으로 조작될 수도 있다. 특히 바람직한 양태들에서, 키메라성 T-세포 수용체는 scFv 부분 또는 종양 연관 항원, 종양 특이적 항원 및/또는 네오에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 다른 세포외영역을 가질 것이다. 앞에서와 같이, 이러한 세포들은 taNK 세포들('표적-활성화된 천연 킬러 세포들')로서 NantKwest로부터 상업적으로 수득될 수 있고 원하는 바와 같이 더 변형될 수 있다. 상기 세포들이 암 연관 항원 또는 네오에피토프에 대해 친화성을 갖도록 조작된 키메라성 T 세포 수용체를 갖는 경우, 모든 알려진 암 연관 항원들 및 네오에피토프들이 사용에 적절한 것으로 간주되는 것이 고려된다. 예를 들어, 종양 연관 항원들은 CEA, MUC-1, CYPB1, PSA, Her-2, PSA, 브라큐리 등을 포함한다.
또한, 본원에서 고려되는 조성물들 및 방법들은 또한 NK 세포들 이외의 (또는 이에 추가하여) 세포들과의 세포 기반 치료를 포함함에 유의해야 한다. 예를 들어, 적합한 세포 기반 치료들은 T 세포 기반 치료들을 포함한다. 다른 옵션들 중에서, T 세포들(예컨대, CD4+ T 세포들, CD8+ T 세포들 등)과 연관된 하나 이상의 특징들이 검출될 수 있음이 고려된다. 보다 구체적으로, GPS 암 테스트들은 네오에피토프들/MHC 단백질 복합체들에 대한 특이적인 T 세포 수용체를 보유하는 네오에피토프 반응성 T 세포들의 동정을 위해 사용될 수 있는 특이적인 네오에피토프들(예컨대, MHC I에 대한 8머(mers) 내지 12머, MHC II에 대한 12머 내지 25머 등)을 제공할 수 있다. 따라서, 상기 방법은 네오에피토프 반응성 T 세포들을 수확하는 단계를 포함할 수 있다. 수확된 T 세포들은 환자에의 재도입을 위한 제조에서 체외로 성장되거나 확장될 수 있다. 대안적으로, 수확된 T 세포들 중의 T 세포 수용체 유전자들은 단리되고 바이러스들 또는 다른 채용된 세포 치료 시스템들(예컨대, CAR-T, CAR-TANK 등)로 전달될 수 있다. 네오에피토프들 이외에, GPS 암 테스트는 또한 하나 이상의 종양 연관 항원들(TAAs)을 제공할 수 있다. 그러므로, 테스트로부터 동정된 TAA들에 민감한 수용체들을 갖는 T 세포들을 수확할 수 있다. 이들은 또한 생체 외에서 성장 또는 배양되며, 상기 논의된 바와 유사한 치료 방법으로 사용될 수 있다. T 세포들은 합성 버전의 펩타이드들을 생성하고 이를 상업적으로 제조된 MHC 또는 MHC-유사 단백질들과 결합시킨 다음 표적 T 세포들에 결합하기 위해 이들 생체 외 복합체들을 사용하여 동정될 수 있다. 수확된 T 세포들은 질병, 소모된 T 세포들, 또는 논의된 특징들에 반응하는 다른 T 세포들에 대한 환자의 면역 반응에 의해 활성화된 T 세포들을 포함할 수 있음을 알아야 한다.
소모된 T 세포들은 몇몇 상이한 루트들을 통해 재활성화될 수 있다. 하나의 루트는 세포들을 소생시키기 위해 수확된 소모된 T 세포들에 외인성으로 사이토카인들(예컨대, IL-2, IL-12, IL-15 등)을 첨가하는 단계를 사용하는 것을 포함한다. 상기 소생한 T 세포들은 이후 가능하면 체크포인트 억제제들(예컨대, 이필리무맙 등)과 함께 환자에게 다시 재도입될 수 있다. 다른 루트는 표적 네오에피토프들을 갖는 맞춤형 바이러스의 투여를 통해 그리고 적절한 억제제(예컨대, LAG3 등)와 함께 달성될 수 있는 차단 체크포인트 억제를 통한 소모를 방지하는 것이다.
본 출원인들은 환자의 벌크 백혈구들(WBCs)이 GPS 암 테스트들로부터 발견 된 펩타이드들(예컨대, TAA, 네오에피토프들 등)과 함께 배양될 수 있음을 또한 알게 되었다. 그러한 접근법은 벌크 백혈구들에서 항원 제시 세포들에 의해 목적하는 MHC/네오에피토프 복합체들의 생성을 야기할 것으로 기대된다. 따라서, 환자의 대식세포들, 수지상 세포들 및 B 세포들은 NK 세포들 및 T 세포들에 명령을 제공하여 그들이 질병 조직을 타겟팅하기 위해 원하는 성질을 갖도록 한다.
환자의 면역 반응에서 장내 바이옴(biome)이 갖는 영향과 관련된 또 다른 흥미로운 고려 사항. 고려된 본 발명의 주제는 또한 조절 또는 면역억제 면역 반응을 도출하는 것으로 예측되는 마이크로-바이옴 생성된 에피토프들을 동정하는 방법들을 포함한다. 동정된 에피토프들의 세트는 GPS 암 테스팅을 통해 발견된 네오에피토프들의 세트로부터 제거될 수 있다. 환자의 신체가 그러한 유사한 펩타이드들에 이미 내성이 있을 것이기 때문에 마이크로-바이옴으로부터 에피토프들과 유사한 네오에피토프들은 질병 조직을 타겟팅하는데 덜 유용할 것이라고 여겨진다.
장 바이옴이 질병에 대한 환자의 면역 반응에 영향을 미칠 수 있다는 관점에서, 본 출원인들은 항생제들이 장 마이크로-바이옴을 타겟팅 하는 환자에게 항생제들을 투여함으로써 환자를 치료하는 방법을 추가로 고려한다. 예를 들어, 항생제들은 상기 논의된 바와 같이 면역 요법으로의 도입과 동시에 억제 T 세포들(예컨대, Th2, Th17 및 조절 T 세포들을 상향 조절)을 도출하는 마이크로-바이옴의 요소들을 억제 또는 저해하도록 환자에게 제공될 수 있다. 다른 실시형태들에 있어서, 환자는 마이크로- 바이옴의 요소들을 억제 또는 저해하는 식이가 처방될 수 있다.
또 다른 고려사항은 본 출원인들이 GPS CancerTM 테스트 또는 동반 진단으로 참조되는 단일 테스트로서 포괄적인 "오믹스(omics)" 테스팅을 개척한 것이다. 이 단일 테스트는 하기 유형의 정보를 포함한 환자의 질병 조직의 상태에 관한 수많은 통찰력들을 제공한다: 다른 것들 중에서, 전체 게놈 서열들, RNA, RNAseq, 프로테오믹스, 발현 수준들 및 네오에피토프들. 이러한 결과들은 질병-특이적일 뿐만 아니라 환자-특이적이라는 것을 알아야 한다. 또한, 이들 결과는 질병을 타겟팅 하는 광범위한 치료법에 대한 환자-특이적 및 질병-특이적인 안내(guidance)를 제공한다. 예를 들어, 상기 결과들은 고도로 맞춤형인 치료를 생성하기 위해 하기 요법들 중 하나 이상에 영향을 줄 수 있다: 화학 요법, 단일클론성 항체 요법, 항체 요법, 소분자 요법, 면역 요법, 종양 연관 항원들에 대한 요법들, 또는 요법들의 임의의 조합. 보다 구체적으로, 게놈 서열은 어떤 유형의 화학 요법이 가장 관련이 있는지를 알려줄 수 있는 반면에, 네오에피토프들은 환자에게 투여 될 때 이전에 논의된 바와 같이 질병에 대한 환자의 면역 반응을 증가시키는 하나 이상의 바이러스들의 구성을 알려준다. 일부 실시형태들에 있어서, 단일 GPS Cancer 테스트는 시간이 지남에 따라 반복적으로 수행될 수 있다. 각 테스트의 결과들은 이후 환자의 질병에 더 잘 부합하도록 맞춤형 요법을 개질 시키는데 사용될 수 있다.
본원의 설명 및 후속하는 청구범위 전체에 걸쳐 사용된 바와 같이, 단수 형태("a", "an", 그리고 "the")의 의미는 문맥이 달리 명시하지 않는 한 복수 대상을 포함한다. 또한, 본원의 설명에서 사용된 바와 같이, "내(in)"의 의미는 문맥이 달리 명시하지 않으면 "내" 및 "상(on)"을 포함한다. 또한 본원에 사용된 바와 같이, 그리고 문맥이 달리 지시하지 않는 한, "에 결합된(coupled to)"이란 용어는 (서로 결합된 두 개의 요소가 서로 접촉하는) 직접 커플링 및 (적어도 하나의 추가 요소가 두 요소 사이에 위치되는) 간접 커플링을 모두 포함하려는 것이다. 그러므로, "에 결합된" 및 "와 결합된(coupled with)"이라는 용어는 동의어로 사용된다. 마지막으로, 그리고 문맥이 반대를 지시하지 않는 한, 본원에 기재된 모든 범위들은 종점을 포함하는 것으로 해석되어야 하고 제한이 없는 범위들은 상업적으로 실용적인 가치들을 포함하도록 해석되어야 한다. 유사하게는, 문맥이 반대를 지시하지 않는 한, 값의 모든 리스트들은 중간값들을 포함하는 것으로 간주되어야 한다.
본원에서 본 발명의 개념으로부터 벗어나지 않고 이미 기재된 것들 이외의 더 많은 수정이 가능하다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 그러므로, 본 발명의 주제는 첨부된 청구범위의 범위를 제외하고는 제한되지 않는다. 또한, 명세서 및 청구범위 모두를 해석함에 있어서, 모든 용어는 문맥과 일치하는 가능한 가장 넓은 방식으로 해석되어야 한다. 특히, "포함한다" 및 "포함하는"이라는 용어는 참조된 구성 요소, 성분 또는 단계가 존재할 수 있거나 활용될 수 있거나 명시적으로 참조되지 않은 다른 구성 요소, 성분 또는 단계와 조합될 수 있다는 것을 나타내는 비-배타적인 방식으로 구성 요소, 성분 또는 단계를 언급하는 것으로 해석되어야 한다. 명세서의 청구범위가 A, B, C ... 및 N으로 구성된 그룹으로부터 선택된 것의 적어도 하나를 언급하는 경우. 텍스트(text)는 A와 N 또는 B와 N, 등이 아닌 그룹으로부터의 구성 요소 하나만 필요로 하는 것으로 해석되어야 한다.
Claims (39)
- 암 치료를 위해 NK 세포들과 함께 투여(co-administration)하기 위한 용도를 가지는 재조합 바이러스(recombinant virus)로서,
상기 재조합 바이러스는 피하 투여(subcutaneous administration)를 위해 배합되며(formulated), 그리고
상기 재조합 바이러스는:
(a) 환자의 종양의 적어도 하나의 종양-관련 에피토프(epitope);
(b) 적어도 하나의 공동자극(co-stimulatory) 분자; 및
(c) 체크포인트 수용체(checkpoint receptor)에 결합하는 펩타이드(peptide)
를 인코딩(encode)하는 핵산을 포함하는,
재조합 바이러스. - 제 1 항에 있어서,
상기 재조합 바이러스는 결실되거나(deleted) 비-기능성인 E2b 유전자를 가지는 아데노바이러스(adenovirus)인,
재조합 바이러스. - 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 종양-관련 에피토프는 HLA-정합된(HLA-matched) 종양-관련 에피토프인,
재조합 바이러스. - 제 1 항에 있어서,
상기 종양-관련 에피토프는 암 연관 에피토프(cancer associated epitope), 암-특이적 에피토프(cancer-specific epitope) 또는 환자 및 종양-특이적 네오에피토프(patient- and tumor-specific neoepitope)인,
재조합 바이러스. - 제 1 항에 있어서,
상기 공동자극 분자는 B7.1 (CD80), B7.2 (CD86), ICAM-1 (CD54), ICOS-L, LFA-3 (CD58), 4-1BBL, CD30L, CD40, CD40L, CD48, CD70, CD112, CD155, GITRL, OX40L 또는 TL1A인,
재조합 바이러스. - 제 1 항에 있어서,
상기 체크포인트 수용체에 결합하는 상기 펩타이드는 CTLA-4 (CD152) 또는 PD-1 (CD 279)에 결합하는,
재조합 바이러스. - 제 1 항에 있어서,
트래피킹(trafficking) 신호는 펩타이드 생성물을 세포질로 유도하는,
재조합 바이러스. - 제 1 항에 있어서,
트래피킹 신호는 펩타이드 생성물을 엔도솜 구역(endosomal compartment) 또는 리소좀 구역(lysosomal compartment)으로 유도하는,
재조합 바이러스. - 제 1 항에 있어서,
트래피킹 신호는 세포질 보유 서열(cytoplasmic retention sequence), 엔도솜 표적 서열(endosomal targeting sequence), 또는 리소좀 표적 서열(lysosomal targeting sequence)을 포함하는,
재조합 바이러스. - 제 1 항에 있어서,
상기 핵산은 제 1 펩타이드 생성물을 세포질로 유도하는 제 1 트래피킹 신호 및 제 2 펩타이드 생성물을 엔도솜 또는 리소좀 구역으로 유도하는 제 2 트래피킹 신호를 가지는,
재조합 바이러스. - 제 1 항에 있어서,
펩타이드 생성물은 상기 펩타이드 생성물의 세포내 턴오버(intracellular turnover)를 증가시키는 서열 부분을 더 포함하는,
재조합 바이러스. - 제 1 항에 있어서,
상기 NK 세포들은 (1) 적어도 하나의 킬러 세포 면역글로블린-유사 수용체(killer cell immunoglobulin-like receptor)의 발현을 감소시키거나 중단시키고(abolish), (2) 고-친화성 Fcγ 수용체를 발현시키고 (3) 키메라성 T 세포 수용체(chimeric T cell receptor)를 발현시키고, 그리고/또는 (4) NKG2A에서 결실(deletion)을 가지는,
재조합 바이러스. - 제 1 항에 있어서,
상기 NK 세포는 상기 재조합 바이러스를 피하 투여한 후 1일 내지 14일 사이에 투여되는,
재조합 바이러스. - CD8+ T 세포 반응을 자극하기 위하여 NK 세포들과 함께 투여하기 위한 용도를 가지는 재조합 바이러스로서,
상기 재조합 바이러스는 피하 투여를 위해 배합되며, 그리고
상기 재조합 바이러스는:
(a) 세포질에서 적어도 하나의 종양-관련 에피토프를 보유하는 트래피킹 신호에 작동 가능하게 결합되는 환자의 종양의 적어도 하나의 종양-관련 에피토프;
(b) 적어도 하나는 B7.1 (CD80) 또는 B7.2 (CD86)인 복수의 공동자극 분자들; 및
(c) PD-1 및 CTLA-4 중 적어도 하나에 결합하는 펩타이드;
를 인코딩하는 핵산을 포함하는,
재조합 바이러스. - 제 14 항에 있어서,
상기 재조합 바이러스는 결실되거나 비-기능성인 E2b 유전자를 가지는 아데노바이러스인,
재조합 바이러스. - 제 14 항 또는 제 15 항에 있어서,
상기 종양-관련 에피토프는 상기 종양-관련 에피토프의 세포내 턴오버를 증가시키는 서열 부분을 더 포함하는,
재조합 바이러스. - 제 14 항에 있어서,
상기 종양-관련 에피토프는 HLA-정합된 암 연관 에피토프, HLA-정합된 암-특이적 에피토프, 또는 HLA-정합된 환자 및 종양-특이적 네오에피토프인,
재조합 바이러스. - 제 14 항에 있어서,
상기 복수의 공동자극 분자들은 ICAM-1 (CD54), ICOS-L, LFA-3 (CD58), 4-1BBL, CD30L, CD40, CD40L, CD48, CD70, CD112, CD155, GITRL, OX40L, 및 TL1A로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 추가적인 공동자극 분자를 더 포함하는,
재조합 바이러스. - 제 14 항에 있어서,
PD-1 및 CTLA-4 중 적어도 하나에 결합하는 상기 펩타이드는 막 결합 항체 프래그먼트(membrane bound antibody fragment)인,
재조합 바이러스. - 제 14 항에 있어서,
상기 NK 세포들은 (1) 적어도 하나의 킬러 세포 면역글로블린-유사 수용체의 발현을 감소시키거나 중단시키고, (2) 고-친화성 Fcγ 수용체를 발현시키고, (3) 키메라성 T 세포 수용체를 발현시키고, 그리고/또는 (4) NKG2A에서 결실을 가지는 유전적으로 변형된 NK 세포들인,
재조합 바이러스. - CD4+ T 세포 반응을 자극하기 위하여 NK 세포들과 함께 투여하기 위한 용도를 가지는 재조합 바이러스로서,
상기 재조합 바이러스는 피하 투여를 위해 배합되며, 그리고
상기 재조합 바이러스는:
(a) 적어도 하나의 종양-관련 에피토프를 엔도좀 또는 리소좀 구역으로 유도하는 트래피킹 신호에 작동 가능하게 결합되는, 환자의 종양의 적어도 하나 이상의 종양-관련 에피토프;;
(b) 적어도 하나는 B7.1 (CD80) 또는 B7.2 (CD86)인 복수의 공동자극 분자들; 및
(c) PD-1 및 CTLA-4 중 적어도 하나에 결합하는 펩타이드;
를 인코딩하는 핵산을 포함하는,
재조합 바이러스. - 제 21 항에 있어서,
상기 재조합 바이러스는 결실되거나 비-기능성인 E2b 유전자를 가지는 아데노바이러스인,
재조합 바이러스. - 제 21 항 또는 제 22 항에 있어서,
상기 종양-관련 에피토프는 상기 종양-관련 에피토프의 세포내 턴오버를 증가시키는 서열 부분을 더 포함하는,
재조합 바이러스. - 제 21 항에 있어서,
상기 종양-관련 에피토프는 HLA-정합된 암 연관 에피토프, HLA-정합된 암-특이적 에피토프, 또는 HLA-정합된 환자 및 종양-특이적 네오에피토프인,
재조합 바이러스. - 제 21 항에 있어서,
상기 복수의 공동자극 분자는 ICAM-1 (CD54), ICOS-L, LFA-3 (CD58), 4-1BBL, CD30L, CD40, CD40L, CD48, CD70, CD112, CD155, GITRL, OX40L, 및 TL1A로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 추가적인 공동자극 분자를 더 포함하는
재조합 바이러스. - 제 21 항에 있어서,
PD-1 및 CTLA-4 중 적어도 하나에 결합하는 상기 펩타이드는 막 결합 항체 프래그먼트인,
재조합 바이러스. - 제 21 항에 있어서,
상기 NK 세포들은 (1) 적어도 하나의 킬러 세포 면역글로블린-유사 수용체의 발현을 감소시키거나 중단시키고, (2) 고-친화성 Fcγ 수용체를 발현시키고, (3) 키메라성 T 세포 수용체를 발현시키고, 그리고/또는 (4) NKG2A에서 결실을 가지는 유전적으로 변형된 NK 세포들인,
재조합 바이러스. - 바이러스성 벡터(viral vector)로서,
(a) 환자의 종양의 적어도 하나의 종양-관련 에피토프;
(b) 적어도 하나의 공동자극 분자; 및
(c) 체크포인트 수용체에 결합하는 펩타이드(peptide);
를 인코딩하는 핵산을 포함하고,
상기 핵산은 (i) MHC-I 제시(presentation)를 위한 세포질, 또는 (ii) MHC-II 제시를 위한 리소좀 구역 또는 엔도솜 구역으로 상기 핵산에 의해 인코딩된 펩타이드 생성물(peptide product)을 유도하는 트래피킹 신호를 더 포함하고;
상기 펩타이드 생성물은 상기 펩타이드 생성물의 세포내 턴오버를 증가시키는 서열 부분을 더 포함하고; 그리고
(a), (b) 및 (c)를 인코딩하는 상기 핵산은 감염된 세포에서 (a), (b) 및 (c)의 동시-발현(co-expression)을 허용하는 적어도 하나의 조절 서열(regulatory sequence)의 제어 하에 있는,
바이러스성 벡터. - 제 28 항에 있어서,
상기 바이러스성 벡터는 결실되거나 비-기능성인 E2b 유전자를 가지는 재조합 아데노바이러스인,
바이러스성 벡터. - 제 28 항 또는 제 29 항에 있어서,
상기 종양-관련 에피토프는 HLA-정합된 종양-관련 에피토프인,
바이러스성 벡터. - 제 28 항에 있어서,
상기 종양-관련 에피토프는 암 연관 에피토프, 암-특이적 에피토프, 또는 환자 및 종양-특이 적 네오에피토프인,
바이러스성 벡터. - 제 28 항에 있어서,
상기 공동자극 분자는 B7.1 (CD80), B7.2 (CD86), ICAM-1 (CD54), ICOS-L, LFA-3 (CD58), 4-1BBL, CD30L, CD40, CD40L, CD48, CD70, CD112, CD155, GITRL, OX40L 또는 TL1A인,
바이러스성 벡터. - 제 28 항에 있어서,
상기 체크포인트 수용체에 결합하는 상기 펩타이드는 막 결합 항체 프래그먼트를 포함하는 CTLA-4 (CD152) 또는 PD-1 (CD279)에 결합하는,
바이러스성 벡터. - 제 28 항에 따른 바이러스성 벡터를 포함하는 재조합 바이러스.
- 제 34 항의 재조합 바이러스를 포함하는 약학 조성물(pharmaceutical composition).
- 제 28 항에 있어서,
상기 트래피킹 신호는 상기 펩타이드 생성물을 상기 세포질로 유도하는,
바이러스성 벡터. - 제 28 항에 있어서,
상기 트래피킹 신호는 상기 펩타이드 생성물을 상기 엔도솜 구역 또는 상기 리소좀 구역으로 유도하는,
바이러스성 벡터. - 제 28 항에 있어서,
상기 트래피킹 신호는 세포질 보유 서열, 엔도솜 표적 서열 또는 리소좀 표적 서열을 포함하는,
바이러스성 벡터. - 제 28 항에 있어서,
상기 핵산은 제 1 펩타이드 생성물을 상기 세포질로 유도하는 제 1 트래피킹 신호 및 제 2 펩타이드 생성물을 상기 엔도솜 또는 리소좀 구역으로 유도하는 제 2 트래피킹 신호를 가지는,
바이러스성 벡터.
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