JP2019509265A - 二重標的化によるアデノウイルスの皮下送達 - Google Patents
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Abstract
MHC−I及び/又はMHC−II提示系を標的とし、更に1種以上の組換えペプチドを提供してT細胞活性化の刺激とチェックポイント阻害の妨害を行うアデノウイルス発現系を介して樹状細胞にネオエピトープ及び/又は腫瘍関連抗原を送達する免疫療法方法及び組成物が企図される。NK細胞の注入によって治療が更に支持されるが、NK細胞を改変して高親和性CD16受容体、及び/又は1種以上のネオエピトープ及び/又は腫瘍関連抗原に結合するキメラ抗原受容体を持つようにすることができる。
【選択図】なし
【選択図】なし
Description
本願は、2016年2月11日出願の米国特許仮出願第62/294251号の優先権を主張し、更に2016年2月12日出願の米国特許仮出願第62/294987号の優先権を主張するものであり、これら両方の出願は参照によって本明細書に組み込まれる。
本発明の分野は免疫療法組成物及び方法であり、特に、MHC−I及び/又はMHC−II提示経路を標的とし、特に同時にチェックポイント阻害を調節する癌ワクチン製剤に関する。
背景の説明には本発明を理解するのに有用となり得る情報が含まれる。本明細書に記載の情報がいずれも本願で特許請求される発明の先行技術であるか又はこれに関連するものであること、或いは具体的又は黙示的に参照される任意の刊行物が先行技術であることを認めるものではない。
本明細書に記載の刊行物及び特許出願はいずれも、各々の刊行物又は特許出願が具体的且つ個別的に参照によって組み込まれることが示された場合と同程度に、参照によって組み込まれる。組み込まれる参考文献における用語の定義又は使用法が、本明細書に記載の用語の定義と一致しないか、これに反する場合、本明細書に記載のその用語の定義が適用され、参考文献中でのその用語の定義は適用されない。
癌ワクチンはかなり有望とされているが、様々な要因、例えば、ウイルス媒体の免疫原性及び/又は組換え抗原の不十分な提示に起因して実際には制限されることが多い。注目すべきことに、不十分な提示は、抗原それ自体に起因するだけでなく、患者の特定のHLA型との適合性が低いことにも起因することがある。また、特に組換えウイルスを用いて治療抗原を得る場合、患者によるウイルスのクリアランスと共に全身送達と低感染性によって、患者の免疫系の各種成分(例えば、樹状細胞やCD8+T細胞、CD4+ヘルパーT細胞、B細胞)の有効且つ広範囲な養成が妨げられる傾向にあり、このような養成が全くなされないか、なされても不十分に過ぎない。更に、抗原提示が少なくともある程度なされた場合でも、様々な調節機序、特に免疫チェックポイント阻害によって、有効な治療への更なるハードルが示されることが多い。
例えば、米国特許第7,118,738号には、癌関連抗原としてのMUC1をコードする組換えDNAを保有するポックスウイルスの使用が教示されており、アジュバントとしてのB7.1及び/又はB7.2を用いて免疫反応を増強できることが報告されている。しかし、このようなウイルスが、治療上有効な免疫応答を常に誘発することは証明されていない。同様に、CEA/TRICOMが組換えポックスウイルスから発現された(例えば、Clin Cancer Res 2005,Vol.11,2416−2426参照)。しかし、TRICOMからの免疫刺激は望んだよりも低かった。更に、CEAも癌細胞以外の細胞で発現し、送達系としてのポックスウイルスは初回投与後に免疫原性になることが示された。また、このような系での免疫刺激はCEAに対して最も強くはなく、むしろ抗原カスケードにおける他のタンパク質に対する免疫応答を引き起こした。従って、刺激性アジュバントは少なくとも概念的には有望であるが、その実際の成功は限られることが多かった。
更に知られた方法では、WO2016/172249、US2016/0101170及びUS2016/0339090に記載のように、抗原(例えば、CEAやMUC1、ブラキュリ)の発現用ウイルスベクターをチェックポイント阻害剤と同時投与して免疫応答を増強させた。チェックポイント阻害剤の使用によって、少なくとも一部の癌では顕著な成功が示された。しかし、チェックポイント阻害剤の典型的な全身投与に起因して、望ましくない副作用が重大なリスクとなることが多い。
特定の送達に関係なく、持続的な免疫応答を発生させるには、適切な抗原処理と抗原提示だけでなく、免疫シナプスを適切に形成し、免疫系の各種成分に抗原刺激を伝播させて治療上有効な液性応答と細胞応答を得ることも必要であることが理解されるべきである。現在知られているシステムや方法では、一般にこのような協調的活性は得られない。
従って、免疫応答を発生させる多くの方法と組成物が当技術分野で知られているが、それらの全て又はほぼ全てが様々な不都合に悩まされている。従って、免疫療法、特に癌免疫療法のための改良組成物と改良方法が依然として必要である。
本発明の主題は、抗原提示細胞(例えば、樹状細胞)に感染して癌関連エピトープ(このエピトープはMHC−I及びMHC−II提示経路に対して特異的に向けられて抗原提示を向上させる)の産生、処理及び提示を生じさせる組換えウイルス(好ましくは、非免疫原性ウイルス)の皮下投与によって上述の問題に対処する免疫応答を発生させる方法及び組成物に関する。また、より強い免疫応答を得るために、感染細胞は、免疫コンピテント細胞(特に、T細胞及びNK細胞)のチェックポイント受容体を妨害する様々な共刺激分子とペプチドを更に発現する。必要に応じて、組換えウイルスの投与部位又はその付近でチェックポイント阻害剤を皮下注射することができ、よってチェックポイント阻害剤はウイルス組換え核酸でコードされていなくてもよい。MHC−I及びMHC−II提示経路を用いて標的抗原提示を行うため、免疫応答はそれぞれCD8+T細胞及びCD4+T細胞を経由して伝播するが、これらの細胞は、NK細胞とB細胞に指示を出すと共に、細胞傷害性T細胞を発生させる物質である。後で更に詳述するように、NK細胞(最も好ましくは遺伝子改変NK細胞)をそれ以降に投与して免疫応答を更に増強することができる。
本発明の主題の一態様では、本発明者らは、腫瘍を有する患者を治療する方法を企図する。特に企図される方法は、(a)患者の腫瘍の少なくとも1種の腫瘍関連エピトープと、(b)少なくとも1種の共刺激分子と、(c)チェックポイント受容体に結合するペプチドとをコードする核酸を含む組換えウイルスを皮下投与する段階を含む。最も典型的には、核酸は、核酸によってコードされるペプチド生成物を細胞質、エンドソーム区画及び/又はリソソーム区画へ向かわせる輸送シグナルを更に含む。更に他の段階では、NK細胞を患者に投与する。
必ずというわけではないが、好ましくは、組換えウイルスはアデノウイルスであり、必要に応じて、免疫原性を低下させるためにE2b遺伝子が欠失又は非機能化している。腫瘍関連エピトープがHLA適合の腫瘍関連エピトープであり、このエピトープは癌関連エピトープ、癌特異的エピトープ又は患者及び腫瘍特異的ネオエピトープとすることができることが更に企図される。
共刺激分子に関しては、共刺激分子はB7.1(CD80)、B7.2(CD86)、ICAM−1(CD54)、ICOS−L、LFA−3(CD58)、4−1BBL、CD30L、CD40、CD40L、CD48、CD70、CD112、CD155、GITRL、OX40L又はTL1Aであり、チェックポイント受容体に結合する好ましいペプチドはCTLA−4(CD152)及び/又はPD−1(CD279)に結合することが企図される。
更に企図される方法では、輸送シグナルはペプチド生成物を細胞質、エンドソーム区画及び/又はリソソーム区画へ向かわせる。従って、適切な輸送シグナルは細胞質保持配列、エンドソーム標的配列及び/又はリソソーム標的配列を含む。例えば、核酸は、第1のペプチド生成物を細胞質へ向かわせる第1の輸送シグナルと第2のペプチド生成物をエンドソーム区画又はリソソーム区画へ向かわせる第2の輸送シグナルとを有することができ、第1のペプチド生成物と第2のペプチド生成物は同一であっても異なっていてもよい。更に、ペプチド生成物は、ペプチド生成物の細胞内代謝回転を高める配列部分を更に含み得ることが企図される。
適切なNK細胞に関しては、NK細胞は(1)少なくとも1種のキラー細胞免疫グロブリン様受容体の発現が低下又は消失している、(2)高親和性Fcγ受容体を発現する、(3)キメラT細胞受容体を発現する、及び/又は(4)NKG2Aに欠失を有するように遺伝子改変されていることが一般に企図される。最も典型的には、組換えウイルスを皮下投与してから1〜14日後にNK細胞を投与する。
本発明の主題の他の態様では、本発明者らは、腫瘍を有する患者においてCD8+T細胞応答を刺激する方法を企図し、この方法は典型的には、(a)患者の腫瘍の少なくとも1種の腫瘍関連エピトープであって、細胞質内にこの少なくとも1種の腫瘍関連エピトープを保持する輸送シグナルと作動可能に結合するエピトープと、(b)複数の共刺激分子であって、その内の少なくとも1種はB7.1(CD80)又はB7.2(CD86)である共刺激分子と、(c)PD−1及びCTLA−4の少なくとも1種に結合するペプチドとをコードする核酸を含む組換えウイルスを皮下投与する段階を含む。他の段階では、NK細胞を患者に投与する。
或いは、本発明の主題の更に他の態様では、本発明者らは、腫瘍を有する患者においてCD4+T細胞応答を刺激する方法を企図し、この方法は、(a)患者の腫瘍の少なくとも1種の腫瘍関連エピトープであって、この少なくとも1種の腫瘍関連エピトープを細胞質、エンドソーム区画又はリソソーム区画へ向かわせる輸送シグナルと作動可能に結合するエピトープと、(b)複数の共刺激分子であって、その内の少なくとも1種はB7.1(CD80)又はB7.2(CD86)である共刺激分子と、(c)PD−1及びCTLA−4の少なくとも1種に結合するペプチドとをコードする核酸を含む組換えウイルスを皮下投与する段階を含む。更に他の段階では、NK細胞を患者に投与する。
最も典型的には、このような方法における組換えウイルスはアデノウイルスであり、必要に応じて、免疫原性を低下させるためにE2b遺伝子が欠失又は非機能化している。上述のように、適切な腫瘍関連エピトープは、腫瘍関連エピトープの細胞内代謝回転を高める配列部分を更に含む。例えば、このようなエピトープは、HLA適合の癌関連エピトープ、HLA適合の癌特異的エピトープ又はHLA適合の患者及び腫瘍特異的ネオエピトープとすることができる。
更に、複数の共刺激分子が、ICAM−1(CD54)、ICOS−L、LFA−3(CD58)、4−1BBL、CD30L、CD40、CD40L、CD48、CD70、CD112、CD155、GITRL、OX40L及びTL1Aから成る群から選択される少なくとも1種の更なる共刺激分子を更に含み得ること、及び/又は、PD−1及びCTLA−4の少なくとも1種に結合するペプチドが膜結合型抗体断片であることが企図される。また、NK細胞は、(1)少なくとも1種のキラー細胞免疫グロブリン様受容体の発現が低下又は消失している、(2)高親和性Fcγ受容体を発現する、(3)キメラT細胞受容体を発現する、及び/又は(4)NKG2Aに欠失を有する遺伝子改変NK細胞であることが企図される。
更に、本発明者らは、本明細書に記載の全ての方法は、腫瘍の細胞上でNKG2Dリガンドの発現を誘発又は発現を増大させるのに有効なプロトコルの下で低用量の化学療法及び/又は低線量の放射線療法を患者に施す段階を更に含み得ることも企図する。必要に応じて、企図される方法は、残留腫瘍細胞中の新しいネオエピトープを特定し、新しいネオエピトープの内の少なくとも1種を含むように組換えウイルスを改変する段階を更に含むことができる。
従って、異なる観点から見ると、本発明者らは、(a)患者の腫瘍の少なくとも1種の腫瘍関連エピトープと、(b)少なくとも1種の共刺激分子と、(c)チェックポイント受容体に結合するペプチドとをコードする核酸を含むウイルスベクター(例えば、必要に応じてE2b遺伝子が欠失又は非機能化している組換えアデノウイルスゲノム)も企図する。最も典型的には、核酸は、核酸によってコードされるペプチド生成物を細胞質、エンドソーム区画又はリソソーム区画へ向かわせる輸送シグナルを更に含み、ペプチド生成物は、ペプチド生成物の細胞内代謝回転を高める配列部分を更に含む。上述のように、腫瘍関連エピトープは、HLA適合の腫瘍関連エピトープ(例えば、癌関連エピトープ、癌特異的エピトープ又は患者及び腫瘍特異的ネオエピトープ)であることが好ましい。同様に、共刺激分子はB7.1(CD80)、B7.2(CD86)、ICAM−1(CD54)、ICOS−L、LFA−3(CD58)、4−1BBL、CD30L、CD40、CD40L、CD48、CD70、CD112、CD155、GITRL、OX40L又はTL1Aであること、及び/又は、チェックポイント受容体に結合するペプチドはCTLA−4(CD152)又はPD−1(CD279)に結合し、必要に応じて膜結合型抗体断片を含むことが好ましい。
従って、本発明者らは、上述のウイルスベクターを含む組換えウイルスも企図する。同様に、本発明者らは、本明細書に記載の組換えウイルスを含む医薬組成物も企図する。
以下の好ましい実施形態の詳細な説明から本発明の主題の様々な目的、特徴、態様及び利点が更に明らかになるであろう。
本発明者らは新たに、好ましくは皮下投与される組換えウイルスと免疫調節薬をNK細胞ベース療法と併用することによって癌免疫療法を著しく改善できることを発見した。
より具体的には、本明細書に記載の企図される方法と組成物を用い、1種以上の腫瘍関連エピトープを1種以上のMHC提示経路に対して標的化することによって、CD8+T細胞集団とCD4+T細胞集団の両方を経由して免疫応答を伝播させることができ、これが液性及び細胞ベースの適応免疫応答の発生に役立つことが企図される。また、後でより詳細に説明するように、企図される方法ではNK細胞(好ましくは、遺伝子改変NK細胞)を用いて自然免疫応答を増強する。皮下投与の場合、樹状細胞を感染させるのにウイルス送達が特に有効であることが企図され、ウイルス注射部位又はその付近でのチェックポイント阻害剤の皮下投与(例えば、ウイルス感染細胞からの発現経由又は注射経由)によって、正のサイトカインフィードバックループ(即ち、サイトカインストーム)のリスクを実質的に低下させながら、免疫応答を更に増強させることが企図される。
抗原、共刺激分子及びチェックポイント阻害剤の同時発現/協調的存在は、T細胞(特にCD8+T細胞及びCD4+T細胞)の活性化に十分な期間に亘って免疫シナプスの形成を促進すると考えられる。特に好ましい態様では、これらの実体の存在は、抗原提示細胞(特に樹状細胞)に感染するウイルスからの抗原と共刺激分子の同時発現によって保証され、後で更に詳述するように、CTLA−4及び/又はPD−1に結合する1種以上の分子も同時発現し得る。或いは、又は更には、ウイルス送達部位又はその付近で1種以上のチェックポイント阻害剤(イピリムマブ、ニボリムマブ等)を注射することができる。最も典型的には、このような送達は皮下注射を介する。抗原処理と抗原提示を更に向上させるため、発現抗原が発現タンパク質を所望の区画(例えば、MHC−I提示用の細胞質区画、又はMHC−II提示用のエンドソーム区画又はリソソーム区画)に意図的に向かわせる輸送配列を含むことが企図される。更に、抗原処理を向上させるため、1個以上のユビキチン化部位を含むか、又は切断不可能なユビキチンを含むことが一般に好ましい。
このような免疫療法は、特定の発現抗原に対する強い適応免疫応答を誘発すると考えられるため、この免疫応答が抗原カスケードと新たに提示された抗原に対する更なる免疫応答にも寄与し得ることが更に期待される。適応免疫応答を更に補完するため、自然免疫応答の構成要素(特に、遺伝子改変NK細胞)を患者に投与し得ることが一般に好ましい。例えば、後で更に詳述するように、NK細胞は、液性応答を向上させるCD16の高親和性変異体による遺伝子改変NK92細胞、及び/又は、1種以上の腫瘍関連抗原に特異的な結合ドメインを有するキメラ抗原受容体による遺伝子改変NK92細胞とすることができる。
企図される腫瘍関連エピトープに関しては、癌に関連し、特定の種類の癌に特異的なエピトープ、又は患者及び腫瘍に特異的なエピトープ(ネオエピトープ)のいずれも本明細書での使用に適しており、特にエピトープが発現し(好ましくは、同じ患者の健康な組織の発現レベルを超えて)且つ患者のHLA系に対して望ましい親和性を有する場合に適していることが理解されるべきである。本文脈では、「腫瘍関連エピトープ」という用語は、短ペプチド(例えば、8〜30個のアミノ酸)と共にタンパク質断片を包含し、更にはタンパク質全体も包含する。
例えば、癌に関連する多くの抗原が知られており、これらの全て(例えば、CEA、MUC−1、EphA3、CYPB1、及びその一部)が本明細書での使用に適していると考えられる。同様に、多くの癌特異的抗原が当技術分野で知られており(例えば、Her−2、PSA、ブラキュリ等)、これらの全て及びその一部が本明細書での使用に適していると考えられる。しかし、特に好ましい態様では、腫瘍関連エピトープには患者及び腫瘍特異的ネオエピトープが含まれる。従って、組換えウイルス又はウイルス核酸構築物(又は宿主細胞での発現用核酸構築物)には、少なくとも1種(例えば、少なくとも2種、3種、4種等)の腫瘍関連エピトープと少なくとも1種の共刺激分子及び好ましくは(必ずというわけではない)チェックポイントシグナル伝達を妨害するタンパク質をコードする組換えセグメントが含まれることが理解されるべきである。当然のことながら、腫瘍関連エピトープ、共刺激分子及び他のタンパク質の配列の長さが組換え核酸のウイルス容量を超える場合には、複数の異なる組換えウイルスを使用できることが理解されるべきである。
企図される腫瘍関連エピトープの配列情報は、様々な公知の情報源(例えば、TCGA、COSMIC等)から入手することができ、或いは、例えば、標準的な組織処理プロトコルと配列決定プロトコル後の生検試料を用いて患者から入手することができる。本発明の主題を限定するわけではないが、配列データは患者及び腫瘍特異的ネオエピトープに関しする患者対応の腫瘍データ(例えば、同じ患者の正常データに対する腫瘍データ)であること、及びデータフォーマットはSAM、BAM、GAR又はVCFフォーマットであることが典型的には好ましい。しかし、他の参照データ(例えば、同じ患者の以前の正常データ又は同じ患者の以前の腫瘍データ、又はhomo statisticus)に対する非対応又は対応データも本明細書での使用に適していると考えられる。従って、オミクスデータは、「新しい」オミクスデータであってもよく、又は以前の手順(又は異なる患者)から入手したオミクスデータであってもよい。
ネオエピトープは、特有な腫瘍特異的抗原を産生した腫瘍細胞で発現したランダム変異として特徴づけることができる。従って、異なる観点から見ると、ネオエピトープは、変異の種類(例えば、欠失、挿入、トランスバージョン、遷移、転位)と変異(例えば、ナンセンス、ミスセンス、フレームシフト等)の影響を考慮して特定することができ、よって、サイレント変異や他の無関係の(例えば、非発現の)変異を排除する第1のコンテンツフィルターとして機能することができる。ネオエピトープ配列は、比較的長さの短い配列伸長(例えば、7〜11量体)として定義することができ、このような伸長にはアミノ酸配列の変化が含まれることが更に理解されるべきである。最も典型的には、変化したアミノ酸はアミノ酸の中心位置又はその付近にある。例えば、典型的なネオエピトープは、A4−N−A4、又はA3−N−A5、又はA2−N−A7、又はA5−N−A3、又はA7−N−A2の構造を有することができ、ここでAはタンパク質原性のアミノ酸であり、Nは(野生型又は対応する正常型に対して)変化したアミノ酸である。しかし、変化したアミノ酸はネオエピトープ配列の末端に位置することもある。例えば、本明細書で企図されるネオエピトープ配列には、比較的長さの短い配列伸長(例えば、5〜30量体、より典型的には7〜11量体又は12〜25量体)が含まれるが、このような伸長にはアミノ酸配列の変化が含まれる。
従って、単一のアミノ酸変化は、変化したアミノ酸を含む多くのネオエピトープ配列において、変化したアミノ酸の位置に応じて提示され得ることが理解されるべきである。好都合なことには、このような配列変異性によって複数のネオエピトープを選択することができるため、1種以上の所望の形質(例えば、患者のHLA型に対する最も高い親和性、最も高い構造安定性等)に基づいて次に選択することができる潜在的に有用な標的の数が増加する。最も典型的には、ネオエピトープは2〜50アミノ酸の長さ、より典型的には5〜30アミノ酸の長さ、最も典型的には9〜15アミノ酸の長さを有するものとして計算され、変化したアミノ酸は好ましくは中央に位置するが、MHCとの結合が保証又は向上されるように位置づけられることもある。例えば、エピトープがMHC−I複合体によって提示される場合、典型的なネオエピトープの長さは約8〜11アミノ酸であるが、MHC−II複合体によって提示される場合の典型的なネオエピトープの長さは、約13〜17アミノ酸の長さである。容易に理解されるように、ネオエピトープ内の変化したアミノ酸の位置は中央以外になることもあるため、ネオエピトープの実際のペプチド配列とその実際の形態は大幅に変わり得る。
当然のことながら、ネオエピトープの特定又は発見は様々な生物物質、例えば、新しい生検体、凍結された又は他の方法で保存された組織又は細胞試料、循環腫瘍細胞、エクソソーム、各種体液(特に血液)等から開始され得ることが理解されるべきである。従って、適切なオミクス解析方法としては、核酸配列決定、特にDNA上で行うNGS方法(例えば、イルミナシーケンシング、イオントレントシーケンシング、454パイロシーケンシング、ナノポアシーケンシング等)、RNA配列決定(例えば、RNAseq、逆転写ベースの配列決定等)、及びタンパク質配列決定又は質量分析ベースの配列決定(例えば、SRM、MRM、CRM等)が挙げられる。
従って、特に核酸ベースの配列決定の場合、腫瘍組織のハイスループットなゲノム配列決定によってネオエピトープが迅速に特定できることが特に認識されるべきである。しかし、こうして得られた配列情報を標準参照と比較した場合、通常生じる患者間の差異(例えば、SNP、短いインデル、反復数の違い等に起因する)と共にヘテロ接合性によって、潜在的な偽陽性ネオエピトープの数が比較的多くなることが理解されるべきである。注目すべきことに、このような不正確さは、患者の腫瘍試料を同じ患者の対応する正常(即ち、非腫瘍)試料と比較すれば排除することができる。
本発明の主題の特に好ましい態様では、腫瘍試料と対応する正常試料の両方について全ゲノム配列決定及び/又はエクソーム配列決定(典型的にはカバレッジ深度が少なくとも10x、より典型的には少なくとも20x)によってDNA解析を行う。或いは、以前の配列決定によって既に確立した配列記録(例えば、SAM、BAM、FASTA、FASTQ又はVCFファイル)からDNAデータを得ることもできる。従って、データセットは、未処理又は処理済みのデータセットを含むことができ、例示的なデータセットとしては、BAMBAMフォーマット、SAMBAMフォーマット、FASTQフォーマット、又はFASTAフォーマットを有するものが挙げられる。しかし、データセットは、BAMBAMフォーマットで、又はBAMBAM diffオブジェクトとして(例えば、US2012/0059670A1及びUS2012/0066001A1参照)提供されることが特に好ましい。更に、データセットは、患者及び腫瘍特異的な情報を取得するために、同じ患者の腫瘍及び対応する正常試料を反映していることに留意すべきである。こうして、腫瘍を引き起こさない遺伝子生殖細胞系の変質(例えば、サイレント変異、SNP等)を排除できる。当然のことながら、腫瘍試料は、初発腫瘍由来、治療開始時の腫瘍由来、再発腫瘍又は転移部位由来等であり得ることが認識されるべきである。殆どの場合、患者の対応する正常試料は、血液、又は腫瘍と同じ組織型に由来する非患部組織とすることができる。
同様に、配列データの計算解析を多くの方法で行うことができる。しかし、最も好ましい方法では、BAMファイルとBAMサーバを使用し、例えば、US2012/0059670A1とUS2012/0066001A1に開示されているように、腫瘍試料と正常試料の位置誘導型同期アライメントによってコンピュータで解析を行う。このような解析によって、偽陽性ネオエピトープが有利に低減し、メモリ資源や計算資源の需要が大幅に抑制される。
コンピュータに関する言葉はいずれも、サーバ、インターフェース、システム、データベース、エージェント、ピア、エンジン、コントローラ、或いは他の個別に又は共同で作動する種類の計算装置を含む、計算装置の任意の適切な組合せを包含するように表示されることに留意すべきである。計算装置は、有形の非一時的なコンピュータ可読記憶媒体(例えば、ハードドライブ、ソリッドステートドライブ、RAM、フラッシュ、ROM等)に格納されているソフトウェア命令を実行するよう設定されたプロセッサを含むことが理解されるべきである。ソフトウェア命令は、後に本開示の装置に関して説明するように、計算装置が役割、責任、又は他の機能を提供するよう設定するのが好ましい。更に、開示された技術は、コンピュータベースのアルゴリズム、プロセス、方法又は他の命令の実行に関連した開示段階をプロセッサに実行させるソフトウェア命令を格納した非一時的なコンピュータ可読媒体を含むコンピュータプログラム製品として具体化することができる。特に好ましい実施形態では、様々なサーバ、システム、データベース又はインターフェースは、HTTP、HTTPS、AES、官民キー交換、ウェブサービスAPI、既知の金融取引プロトコル、又は他の電子情報交換法に基づく可能性のある標準化プロトコル又はアルゴリズムを用いてデータを交換する。装置間でのデータ交換は、パケット交換網、インターネット、LAN、WAN、VPN、又は他のタイプのパケット交換網、回路交換網、セル交換網、又は他の種類のネットワークを通じて実施することができる。
異なる観点から見ると、5〜25アミノ酸の所定長さを有し、少なくとも1種の変化したアミノ酸を含む患者及び癌特異的な配列のコンピュータでのコレクションを確立することができる。このようなコレクションには、典型的には変化したアミノ酸の各々について少なくとも2種、少なくとも3種、少なくとも4種、少なくとも5種又は少なくとも6種のメンバーが含まれており、その中で変化したアミノ酸の位置は同一ではない。後に詳述するように、次にこのようなコレクションを用いて更なるフィルタリング(例えば、細胞内位置、転写/発現レベル、MHC−I及び/又はMHC−II親和性等による)を行うことができる。
癌の種類やステージにもよるが、特定されるネオエピトープの全てが必ずしも患者において治療上同等に有効な反応を引き起こすわけではないことに留意すべきである。実際、ごく一部のネオエピトープしか免疫応答を生じさせないことは当技術分野でよく知られている。治療に望ましい応答の可能性を高めるため、ネオエピトープを更にフィルターにかけることができる。当然のことながら、本明細書に記載の方法の目的のために、下流解析ではサイレント変異を考慮する必要がないことが理解されるべきである。しかし、好ましい変異解析によって、変異の種類(例えば、欠失、挿入、トランスバージョン、遷移、転位)に加えて、変異(例えば、ナンセンス、ミスセンス等)の影響に関する情報も得られるため、このような解析は、サイレント変異を排除する第1のコンテンツフィルターとして機能することができる。例えば、ネオエピトープを選択して、変異がフレームシフト変異、ナンセンス変異及び/又はミスセンス変異であるかどうか更に考慮することができる。
更なるフィルタリングアプローチでは、ネオエピトープを細胞内位置パラメータに関する詳細な解析に付すこともできる。例えば、ネオエピトープ配列を選択して、ネオエピトープが膜結合位置を有する(例えば、細胞の細胞膜の外側に位置する)ことを確認できるかどうか、及び/又は、コンピュータでの構造計算によってネオエピトープが溶媒曝露されやすい、又は構造的に安定なエピトープを提示する(例えば、J Exp Med 2014)等を確認できるかどうか更に考慮することができる。
ネオエピトープのフィルタリングに関しては、オミクス(又は他の)解析によってネオエピトープが実際に発現していることが明らかである場合には、ネオエピトープを本明細書で使用するのが特に適していることが一般に企図される。ネオエピトープの発現と発現レベルの確認は、当技術分野で知られている全ての方法で行うことができ、好ましい方法としては、定量的RNA(hnRNA又はmRNA)解析及び/又は定量的プロテオミクス解析が挙げられる。最も典型的には、ネオエピトープの封入に関する閾値レベルは、発現レベルが対応する正常配列の発現レベルの少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%又は少なくとも50%であり、(ネオ)エピトープが免疫系で少なくとも潜在的に「目に見える」のが確実であるということである。従って、オミクス解析には遺伝子発現解析(トランスクリプトーム解析)も含めて、変異を有する遺伝子の発現レベルを確認するのに役立たせることが一般に好ましい。
当技術分野では多くのトランスクリプトーム解析方法が知られており、全ての既知の方法が本明細書での使用に適していると考えられる。例えば、好ましい物質としてはmRNA及び一次転写物(hnRNA)が挙げられ、RNA配列情報は逆転写のpolyA+−RNAから入手することができ、このpolyA+−RNAは同じ患者の腫瘍試料と対応する正常(健康)試料から得られる。同様に、polyA+−RNAはトランスクリプトームを表すものとして典型的には好ましいが、他の形態のRNA(hn−RNA、非ポリアデニル化RNA、siRNA、miRNA等)も本明細書での使用に適していると考えられることに留意すべきである。好ましい方法としては、定量的RNA(hnRNA又はmRNA)解析及び/又は定量的プロテオミクス解析(特にRNAseqを含む)が挙げられる。他の態様では、RNA−seq、qPCR及び/又はrtPCRに基づく方法を用いてRNA定量化及び配列決定を行うが、他の様々な方法(例えば、固相ハイブリダイゼーションに基づく方法)も適していると考えられる。別の観点から見ると、トランスクリプトーム解析は(単独で行うにしても、ゲノム解析と併用するにしても)、癌及び患者特異的な変異を有する遺伝子を特定、定量するのに適切となり得る。
同様に、プロテオミクス解析を多くの方法で行ってネオエピトープのRNAの実際の翻訳を確認することができ、プロテオミクス解析の既知の方法は全て本明細書で企図される。しかし、特に好ましいプロテオミクス方法としては、抗体ベースの方法及び質量分析方法が挙げられる。更に、プロテオミクス解析によってタンパク質自体に関する定性的又は定量的情報が得られるだけでなく、タンパク質が触媒活性又は他の機能活性を有する場合には、プロテオミクス解析にタンパク質の活性データが含まれ得ることに留意すべきである。プロテオミクスアッセイを行うための技法の一例が米国特許第7,473,532号に記載されており、この特許は参照によって本明細書に組み込まれる。タンパク質発現を確認且つ定量化する更に適切な方法としては、様々な質量分光分析(例えば、選択反応モニタリング(SRM)、多重反応モニタリング(MRM)、及び連続反応モニタリング(CRM))が挙げられる。従って、上述の方法によって患者及び腫瘍特異的ネオエピトープが得られ、このネオエピトープを、ネオエピトープを含むタンパク質の細胞内位置(例えば、膜位置)、発現強度(例えば、同じ患者の対応する正常発現と比較しての過剰発現)等によって更にフィルターにかけることができることが理解されるべきである。
フィルタリングの更に他の態様では、ネオエピトープを既知のヒト配列(例えば、患者又は複数の患者のコレクションのヒト配列)を含むデータベースと比較して、ヒト同一配列の使用を避けることができる。更に、患者のSNPが腫瘍とそれに対応する正常配列の両方に存在する場合には、このSNPに起因するネオエピトープ配列の除去をフィルタリングに含めることもできる。例えば、dbSNP(一塩基多型データベース)は、全米バイオテクノロジー情報センター(NCBI)が米国立ヒトゲノム研究所(NHGRI)と共同で開発及び主催する、異なる種内及び種間での遺伝的変異に関する無料の公的アーカイブである。このデータベースの名称は、1種類の多型のコレクションのみを暗示する(一塩基多型(SNP))が、実際には比較的広範囲の分子変異、即ち、(1)SNP、(2)短い欠失及び挿入の多型(インデル/DIP)、(3)マイクロサテライトマーカー又は短いタンデム反復(STR)、(4)多塩基多型(MNP)、(5)ヘテロ接合配列、及び(6)名称付けられた変異体が含まれる。dbSNPは、明らかな中立多型、既知の表現型に対応する多型、及び変異のない領域を受け入れている。このようなデータベースと上述の他のフィルタリング選択肢を用い、患者及び腫瘍特異的ネオエピトープをフィルターにかけて既知の配列を除去し、偽陽性が実質的に低い複数のネオエピトープ配列を有する配列セットを得ることができる。
しかし、フィルタリングにもかかわらず、全てのネオエピトープが免疫系で目に見えるわけではないため、ネオエピトープを患者のMHC複合体上に提示させる必要もあることが認識されるべきである。実際、ごく一部のネオエピトープしか提示に十分な親和性を有しておらず、様々なMHC複合体は、通常のネオエピトープの全てではないが、その殆どの使用を妨げている。従って、免疫療法の背景において、ネオエピトープがMHC複合体に結合し、MHC複合体によって提示される場合には、ネオエピトープが有効となる可能性が高くなることが容易に明らかであろう。別の観点から見ると、チェックポイント阻害剤を用いて治療を成功させるには、複数のネオエピトープをMHC複合体を介して提示させる必要があり、ネオエピトープは患者のHLA型に対して最小限の親和性を有していなければならない。従って、有効な結合と提示は、ネオエピトープの配列と患者の特定のHLA型の複合機能であることが理解されるべきである。最も典型的には、HLA型の確認には、少なくとも3種のMHC−Iサブタイプ(例えば、HLA−A、HLA−B、HLA−C)と少なくとも3種のMHC−IIサブタイプ(例えば、HLA−DP、HLA−DQ、HLA−DR)が含まれ、好ましくは、各サブタイプは少なくとも2桁の深度又は少なくとも4桁の深度まで確認される。しかし、より大きい深度(例えば、6桁、8桁)も本明細書で企図される。HLAの確認は、当技術分野で周知の様々な湿式化学方法を用いて行うことができ、これらの方法は全て本明細書での使用に適していると考えられる。或いは、PCT/US16/48768に示されるように、既知のHLA型及び/又は通常のHLA型の大部分又は全てを含む参照配列を用いたコンピュータでの患者のオミクスデータからHLA型を予測することもできる。
一旦患者のHLA型が(既知の化学的な又はコンピュータでの確認によって)特定されれば、HLA型の構造解を計算又はデータベースから入手した後、それをコンピュータでのドッキングモデルに用いて、HLA構造解に対する(典型的にはフィルターにかけた)ネオエピトープの結合親和性を求める。結合親和性を求めるのに適したシステムとしては、NetMHCプラットフォーム(例えば、Nucleic Acids Res.2008 Jul 1;36(Web Server issue):W509−W512.参照)が挙げられる。次に、予め確認したHLA型に対して高親和性(例えば、100nM未満、75nM未満、50nM未満)を有するネオエピトープを選択し、MHC−I/IIサブタイプに関する知見と併せて療法の創出を行う。
より具体的には、一旦患者及び腫瘍特異的ネオエピトープとHLA型が特定されれば、ネオエピトープをHLAにドッキングさせ、例えば、NetMHCを用いて最良のバインダー(例えば、最小KD値、例えば、500nM未満、又は250nM未満、又は150nM未満、又は50nM未満)を求めることによって計算解析を行うことができる。当然のことながら、NetMHC以外のシステムを用いて患者のHLA型を患者及び癌特異的ネオエピトープにマッチさせることができ、適切なシステムとしては、NetMHCII、NetMHCpan、IEDB Analysis Resource(URL immuneepitope.org)、RankPep、PREDEP、SVMHC、Epipredict、HLABinding及びその他(例えば、J Immunol Methods 2011;374:1−4参照)が挙げられることも理解されるべきである。
最も高い親和性を計算する上で、変化したアミノ酸の位置が移動しているネオエピトープ配列のコレクション(上述参照)を使用できることに留意すべきである。或いは、又は更には、N末端及び/又はC末端の改変を追加してネオエピトープに対する改変を行って、患者のHLA型への発現ネオエピトープの結合を更に高めることができる。従って、ネオエピトープは特定された天然体であってもよく、更に改変して特定のHLA型とより良くマッチさせてもよい。更に、必要に応じて、対応する野生型配列(即ち、アミノ酸変化のないネオエピトープ配列)の結合を計算して高い差異親和性を確保することができる。例えば、ネオエピトープとそれに対応する野生型配列とのMHC結合における特に好ましい高い差異親和性は、少なくとも2倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも100倍、少なくとも500倍、少なくとも1000倍等である)。
このようなアプローチによって患者及び腫瘍に対して真性である特定のネオエピトープが確認されるだけでなく、このようなネオエピトープが細胞上に提示される可能性が最も高く、よって、治療効果を伴う免疫応答を引き起こす可能性が最も高いことも認識されるべきである。当然のことながら、更に後述するように、ペイロードとしてのエピトープをコードする核酸をウイルスに封入する前に、こうして特定されたHLA適合性ネオエピトープをインビトロで生化学的に検証できることも理解されるべきである。更に、ネオエピトープのHLAマッチングによって、MHC−I提示及び/又はMHC−II提示に対してネオエピトープ配列を意図的に標的化することができ、次にCD8+T細胞とCD4+T細胞の活性化に対して免疫応答を制御することができる(液性免疫応答と細胞性免疫応答とのバランスに少なくともある程度の影響を及ぼす)ことが理解されるべきである。例えば、特定のネオエピトープがMHC−I経路による提示を介する有効な免疫応答を引き起こさない場合には、このネオエピトープを代替的(又は追加的に)MHC−II経路による提示に標的化することができる。更に、ネオエピトープの発現を1種の提示系に対して排他的又は支配的(例えば、全ネオエピトープの少なくとも50%、又は60%、又は70%、又は80%)に向けることが企図される。例えば、細胞性免疫応答(例えば、T細胞応答によるADCC)がより望ましい場合には、MHC−I提示に対して提示を行うことができる。一方、液性応答(例えば、抗体/補体応答)がより望ましい場合には、MHC−II提示に対して提示を行うことができる。
こうして特定且つ発現したネオエピトープを所望のMHC系に送ることに関して、MHC−I提示ペプチドは典型的には、小胞体経由のプロテアソーム処理と送達を介して細胞質から生じることが理解されるべきである。従って、後で更に詳述するように、MHC−I提示を対象とするエピトープの発現は一般に細胞質に向けられる。一方、MHC−II提示ペプチドは典型的には、細胞膜への送達前に酸性プロテアーゼ(例えば、レグマイン、カテプシンL及びカテプシンS)による分解と処理を介してエンドソーム区画とリソソーム区画から生じる。従って、後で詳述するように、MHC−II提示を対象とするエピトープの発現は一般にエンドソーム区画とリソソーム区画に向けられる。
好ましい態様では、エンドソーム区画とリソソーム区画への輸送又は細胞質空間内への保持のためにシグナルペプチドを用いることができる。例えば、ペプチドがエンドソーム区画とリソソーム区画に搬出される場合には、選択した標的プレ配列と内部標的ペプチドを用いることができる。標的ペプチドのプレ配列は好ましくはN末端に付加され、典型的には6〜136個の塩基性及び疎水性アミノ酸を含む。ペルオキシソーム標的化の場合、標的配列はC末端に存在することができる。他のシグナル(例えば、シグナルパッチ)を用いることができ、このシグナルには、ペプチド配列では離れており、適切なペプチドフォールディングの際に機能的になる配列要素を含むことができる。また、グリコシル化のようなタンパク質改変によって標的化を誘発することができる。他の適切な標的シグナルの内、本発明者らは、ペルオキシソーム標的シグナル1(PTS1)、C末端トリペプチド、及び、N末端付近に位置するノナペプチドであるペルオキシソーム標的シグナル2(PTS2)を企図する。また、エンドソームとリソソームへのタンパク質の局在化は、典型的には短い直鎖状配列を含むタンパク質の細胞質ドメイン内のシグナルによって媒介することもできる。一部のシグナルはチロシンベースの局在化シグナルと称され、NPXY又はYXXΦコンセンサスモチーフに従う。ジロイシンベースのシグナルとして知られる他のシグナルは、[DE]XXXL[LI]又はDXXLLコンセンサスモチーフに適合する。これらのシグナルは全て、膜の細胞質表面の周囲に結合したタンパク質コートの成分によって認識される。YXXΦシグナルと[DE]XXXL[LI]シグナルは、アダプタータンパク質(AP)複合体AP−1、AP−2、AP−3及びAP−4によって特徴的な細かい特異性で認識され、DXXLLシグナルはGGAとして知られる別のアダプターファミリーによって認識される。液胞タンパク質局在化とエンドソーム機能に関連しているFYVEドメインを付加することもできる。更なる態様では、ヒトCD1尾部配列を用いてエンドソーム区画を標的化することもできる(例えば、Immunology,122,522−531参照)。
細胞質区画への輸送又は細胞質区画内での保持に1種以上の特定の配列要素が必ずしも必要というわけではない。しかし、少なくとも一部の態様では、膜アンカータンパク質又は膜アンカータンパク質の膜アンカードメインを含むN末端又はC末端細胞質保持シグナルを付加することができる。例えば、膜アンカータンパク質としては、SNAP−25、シンタキシン、シナプトプレビン、シナプトタグミン、小胞結合膜タンパク質(VAMP)、シナプス小胞糖タンパク質(SV2)、高親和性コリン輸送体、ニューレキシン、電位開口型カルシウムチャネル、アセチルコリンエステラーゼ及びNOTCHが挙げられる。
MHC−I系及び/又はMHC−II系へのタンパク質の特異的な標的化に加え、処理と提示の更なる向上は、細胞内でタンパク質代謝回転を促進するのに役立つ1種以上のシグナルによって、例えば、組換え抗原又はネオエピトープのN末端アミノ酸の適切な選択によって行うことができることが理解されるべきである。例えば、代謝回転を高めるため、N末端アミノ酸が不安定化アミノ酸であり得ることが企図される。従って、適切なN末端アミノ酸としては特にArg、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Trp及びTyrが挙げられ、ある程度にはAsn、Asp、Gln及びGluも挙げられる。MHC−I及び/又はMHC−II提示経路を標的とするペプチドにこのようなアミノ酸を付加することができる。また、タンパク質末端のユビキチン(好ましくは切断不可能なリンカーに結合している)を用いてタンパク質代謝回転を高めることもできることが理解されるべきである。
従って、適切なシグナル配列でペプチドを適切な区画へ向かわせ、必要に応じて不安定化N末端アミノ酸でペプチドを改変することは、抗原の処理と提示を高めるのに役立ち、これによって、最終的には抗原カスケードとエピトープ伝播が引き起こされることにもなる。
当然のことながら、1種を超える腫瘍関連抗原が組換え核酸にコードされ得ること、また、複数の抗原の配置が大幅に変わり得ることが認識されるべきである。例えば、企図される転写又は翻訳ユニットは複数のエピトープのコンカテマー状の配置を有することができ、典型的には短いリンカー(例えば、4〜20個のアミノ酸を有する可動性リンカー)で分離されており、プロテアーゼ切断部位を更に含むことができる。特に適切なリンカー配列の設計は、リンカー並びにリンカーと腫瘍関連抗原との間の融合部分が患者内に通常存在するタンパク質配列を形成しないように行う。このようなコンカテマーは、1〜20個のネオエピトープ(典型的には、ウイルスを介して送達することができる組換え核酸のサイズによって制限される)を有することができ、コンカテマーは、MHC−I及びMHC−II複合体への送達に関して同一であってもよく、異なっていてもよいことに留意すべきである。従って、様々なペプチドを特定の細胞区画へ送って、MHC−I及び/又はMHC−IIを介した優先的又は特異的な提示を得ることができることが理解されるべきである。別の観点から見ると、腫瘍関連抗原とネオエピトープの提示は、両方の提示経路を介して又はいずれかの経路に対して選択的に行われ、同時に又は以降の複数回の治療で行われ得ることが認識されるべきである。
更に、ウイルス組換え核酸が少なくとも1種、より典型的には少なくとも2種、更に典型的には少なくとも3種、最も典型的には少なくとも4種の共刺激分子もコードし、感染樹状細胞とT細胞との相互作用を高めることが好ましい。例えば、適切な共刺激分子としては、ICAM−1(CD54)、ICOS−L及びLFA−3(CD58)が挙げられ、特にB7.1(CD80)及び/又はB7.2(CD86)との組み合わせが挙げられる。更に企図される共刺激分子としては、4−1BBL、CD30L、CD40、CD40L、CD48、CD70、CD112、CD155、GITRL、OX40L及びTL1Aが挙げられる。更に、共刺激分子の発現を協調させて、抗原及び/又はネオエピトープが1種以上の共刺激分子の発現と共に提示されるようにするのが好ましいことが理解されるべきである。従って、配列内リボソーム進入部位又は2A配列を用いて単一の転写物から共刺激分子を作出するか、又は複数の転写物から共刺激分子を作出することが典型的には企図される。
免疫原性を高める刺激因子の更なる例としては以下のものが挙げられる。(a)CD27及びCD70:陽性アゴニストCD27及び/又はT細胞上でのCD27のCD70との相互作用を模倣する生体内因子(例えば、抗体、リガンド等)、(b)CD40及びCD40L:陽性アゴニストCD40及び/又はT細胞上でのCD40のCD40Lとの相互作用を模倣する生体内因子、(c)OX40L及びOX40:陽性アゴニストOX40L及び/又はT細胞上でのOX40LのOX40との相互作用を模倣する生体内因子、(d)GITRL及びGITR:陽性アゴニストGITRL及び/又はT細胞上でのGITRLのGITRとの相互作用を模倣する生体内因子、(e)IL−2及びCD122:陽性アゴニストIL−2及び/又はT細胞上でのIL−2のIL−2受容体との相互作用を模倣する生体内因子(例えば、CD122等)、(f)CD137又はT細胞に対するCD137活性を模倣する抗体、及び(g)ICOSL及びICOS:陽性アゴニストICOSL及び/又はT細胞上でのICOSLのICOSとの相互作用を模倣する生体内因子。
更に、どの共刺激分子の発現もチェックポイント阻害を妨害する他のどのタンパク質の発現とも組み合わせることができることは認識されるべきである。例えば、共刺激タンパク質CD28の発現をCTLA−4の阻害剤の発現と組み合わせることができる。本出願人は、更なる刺激因子又は阻害因子がウイルスのペイロードによって影響され得ることを更に企図する。ウイルスは、自然免疫応答を模倣するように調整できるペイロードを含むことができる。例えば、T細胞を刺激するのに役立つアゴニスト(例えば、CD28の模倣)を有する第1のウイルスを患者に投与することができる。アンタゴニスト(例えば、CTLA−4の阻害剤)を有する第2のウイルスをその後に患者に投与することができ、これによって阻害応答を防ぐ。送達の順序を変えることができることも企図される。更に、刺激因子と阻害因子の両方を支持するように単一ウイルスを構築することができる。或いは、共刺激分子を腫瘍関連抗原と同時発現させることができる一方、チェックポイント阻害剤を(皮下に)注射することができる。
従って、組換えウイルスが、チェックポイント受容体に結合する1種以上のペプチドリガンドをコードする配列部分を更に含むことも企図される。最も典型的には、受容体を介したシグナル伝達が結合によって阻害又は少なくとも抑制され、特に企図される受容体としては、CTLA−4(特にCD8+細胞に対する)及びPD−1(特にCD4+細胞に対する)が挙げられる。例えば、ペプチドバインダーは抗体断片(特にscFv)を含むことができるが、受容体に特異的に結合する小分子ペプチドリガンドを含むこともできる。もう一度繰り返すと、ペプチド分子の発現を協調させて、抗原及び/又はネオエピトープが1種以上のペプチド分子と共に提示されるようにするのが好ましいことが理解されるべきである。従って、配列内リボソーム進入部位又は2A配列を用いて単一の転写物からペプチド分子を作出するか、又は複数の転写物からペプチド分子を作出することが典型的には企図される。
適切に構築したウイルスによって増強され得る阻害因子の更なる例としては、以下のものが挙げられると考えられる。(a)T細胞活性化のCD276/B7−H3阻害を阻害する天然由来又は改変リガンド、(b)T細胞活性化のB7−H4/VTCN1阻害を阻害する天然由来又は改変リガンド、(c)T細胞活性化のCD272/HVEM阻害を阻害する天然由来又は改変リガンド、(d)T細胞活性化のLAG3阻害を阻害する天然由来又は改変リガンド(例えば、MHC−II等)、(e)T細胞活性化のPD−1阻害を阻害する天然由来又は改変リガンド(例えば、PD−L1)、(f)T細胞活性化のCTLA−4阻害を阻害する天然由来又は改変リガンド(例えば、生体内因子、可溶CD28等)、(g)T細胞活性化のTIM−3阻害を阻害する天然由来又は改変リガンド(例えば、ガレクチン−9、生体内因子、抗体等)、(h)T細胞活性化のVISTA阻害を阻害する天然由来又は改変リガンド(例えば、抗体等)、及び(i)NK細胞のMIC阻害を阻害する天然由来又は改変リガンド(例えば、抗体、生体内因子等)。
最も典型的には、組換え遺伝子の発現は恒常的活性型調節配列から生じる。しかし、本発明の主題の他の態様では、調節配列は誘導可能であり、好ましくは癌性組織又は合成誘導因子に対して内因性の1種以上の調節シグナルを用いて選択的に誘導可能である。例えば、合成誘導因子又は天然由来の誘導因子を適切な応答要素と共に用いて誘導可能な発現を行うことができる。殆どの場合、転写物がIRES(配列内リボソーム進入部位)又は2A配列(切断可能な2A様ペプチド配列)を含み、腫瘍関連抗原、共刺激分子及び/又はチェックポイント阻害剤の協調的発現を再び可能にさせることが更に好ましい。
従って、企図されるシステムと方法を用い、抗原提示細胞(特に樹状細胞)内で1種以上の腫瘍関連抗原と共刺激分子を発現させて免疫療法を行うことができ、チェックポイント阻害の阻害剤(抗原提示細胞内で同等に発現し得る)の存在下で更に行われることが理解されるべきである。このような協調事象は、特に特定のMHC提示を対象とする場合に適応免疫応答を高めると考えられており、この応答は細胞成分(特にNK細胞)の投与によって更に補完することができる。
容易に理解されるように、腫瘍関連抗原、共刺激分子及び/又はチェックポイント阻害剤は、DNAワクチン又はRNAとして投与可能な組換え核酸にコードされるが、組換え核酸がウイルスゲノムの一部であることが一般に好ましい。次にこうして遺伝子改変したウイルスを遺伝子療法で周知なように用いることができる。従って、組換えウイルスに関しては、組換えウイルスを作出する既知の方法は全て本明細書での使用に適していると考えられるが、特に好ましいウイルスは既に療法で確立されているものであり、例えば、アデノウイルスやアデノ随伴ウイルス、アルファウイルス、ヘルペスウイルス、レンチウイルス等であることが企図される。他の適切な選択肢の内、アデノウイルスが特に好ましい。
また、ウイルスが複製欠損性の非免疫原性ウイルスであることが更に一般に好ましいが、これは典型的には、選択したウイルスタンパク質(例えば、E1タンパク質、E3タンパク質)の標的欠失によって得られる。このような望ましい特性はE2b遺伝子機能を欠失させて更に向上させることができ、既に報告されているように(例えば、J Virol.1998 Feb;72(2):926−933)、遺伝子改変ヒト293細胞を用いて組換えウイルスの高い力価を得ることができる。上述のように、所望の核酸配列(ウイルス感染細胞からの発現用)は当技術分野で周知の適切な調節要素の制御下にある。従って、上述に鑑みて、本明細書に記載の組成物と方法がウイルス発現抗原をMHC系のいずれか(又は両方)に特異的に向かわせるのに適しているだけではなく、この組成物と方法によって、様々な共刺激分子(例えば、ICAM−1(CD54)、ICOS−L、LFA−3(CD58)、及びB7.1(CD80)及びB7.2(CD86)の少なくとも1種)の封入を介し、また、チェックポイント阻害剤の分泌又は膜結合提示を介してCD8+細胞及び/又はCD4+細胞への刺激作用が高まることも理解されるべきである。
次にこうして作出した組換えウイルスを個別に又は組み合わせて医薬組成物中の治療ワクチンとして用いることができるが、典型的には、投与単位当たり104〜1011個のウイルス粒子のウイルス力価を有する滅菌注射用組成物として処方する。しかし、別の処方も本明細書での使用に適していると考えられ、既知の投与経路及び投与方法の全てが本明細書に企図される。本明細書で使用される、医薬組成物又は薬物を「投与する」という用語は、医薬組成物又は薬物の直接投与と間接投与の両方を意味し、医薬組成物又は薬物の直接投与は医療専門家(例えば、医師や看護師等)によって典型的に行われ、間接投与には、医薬組成物又は薬物を医療専門家に用意又は提供して直接投与(例えば、注射、点滴、経口送達、局所送達等を介する)に備える段階が含まれる。最も好ましくは、組換えウイルスを皮下注射によって投与する。しかし、他の企図される態様では、投与は静脈内注射であってもよい。或いは、又は更には、抗原提示細胞を患者の細胞から単離又は増殖させ、インビトロで感染させた後、患者に注入することができる。
また、特に組換えウイルスがチェックポイント受容体を標的にするペプチドをコードする核酸配列を含まない場合には、組換えウイルスの予防的又は治療的投与は1種以上のチェックポイント阻害剤との同時投与を伴うことができることが企図される。例えば、特に好ましいチェックポイント阻害剤としては、現在入手可能な阻害剤(例えば、ペンブロリズマブ、ニボルマブ、イピリムマブ)が挙げられ、これらの阻害剤はウイルスベクターの皮下投与部位又はその付近に(最も好ましくは)皮下投与される。
従って、組換えウイルスは皮層中の樹状細胞と他の抗原提示細胞に送達され、MHC−I及び/又はMHC−II経路を介して提示されるため、免疫系による処理によってCD8+細胞とCD4+細胞の両方が刺激され、その結果、IgG1形成用の養成B細胞、T細胞が形成されると共に、養成NK細胞とそれに対応する免疫記憶細胞が形成されることが認識されるべきである。また、IgG1分子はNK細胞による腫瘍特異的作用も可能にすることに留意すべきである。
従って、自己NK細胞又は異種NK細胞(特に、阻害をあまり示さないように遺伝子改変されたNK細胞)の患者への注入も治療に含まれることが好ましいことが企図される。例えば、遺伝子改変NK細胞は、少なくとも1種のキラー細胞免疫グロブリン様受容体(KIR)の発現が低下又は消失するように改変されたNK−92誘導体とすることができ、これによってこのような細胞が恒常的に活性化される。当然のことながら、1種以上のKIR(例えば、KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR2DL4、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS3、KIR2DS4、KIR2DS5、KIR3DL1、KIR3DL2、KIR3DL3及びKIR3DS1)を欠失させることができ、又はその発現を抑制することができる(例えば、miRNA、siRNA等を介して)ことに留意すべきである。このような改変細胞は当技術分野で周知のプロトコルを用いて調製することができる。或いは、このような細胞はNantKwestからaNK細胞(活性化ナチュラルキラー細胞)として商業的に入手することもできる。更に後述するように、次にこのような細胞を更に改変させて共刺激分子を発現させることができる。また、本明細書での使用に適した企図されるNK細胞としては、TregやMDSCに対する活性化シグナルであるNKG2Aの発現が消失又は停止したものも挙げられる。
本発明の主題の他の好ましい態様では、遺伝子改変NK細胞は高親和性Fcγ受容体(CD16)を発現するように改変されたNK−92誘導体とすることもできる。Fcγ受容体の高親和性変異体の配列は当技術分野で周知であり、発生及び発現の方法は全て本明細書での使用に適していると考えられる。本明細書で企図される治療に反応して患者によって生じる抗体、又は治療用抗体として供給される抗体が患者の腫瘍細胞(例えば、ネオエピトープ)、特定の腫瘍型(例えば、her2neu、PSA、PSMA等)又は癌に関連する抗原(例えば、CEA−CAM)に対して特異的な場合には、上述の受容体の発現によって、これらの抗体を用いた腫瘍細胞の特異的な標的化が可能になると考えられる。好都合なことに、このような細胞はNantKwestからhaNK細胞(高親和性ナチュラルキラー細胞)として商業的に入手することができ、その後更に改変する(例えば、上述の共刺激分子を発現させる)ことができる。
或いは、遺伝子改変NK細胞はキメラT細胞受容体を発現させるように遺伝子改変することもできる。特に好ましい態様では、キメラT細胞受容体は、腫瘍関連抗原、腫瘍特異的抗原及び/又はネオエピトープに対して結合特異性を有するscFv部分又は他の外部ドメインを有する。上述のように、このような細胞はNantKwestからtaNK細胞(標的活性化ナチュラルキラー細胞)として商業的に入手することができ、必要に応じて更に改変することができる。このような細胞が癌関連抗原又はネオエピトープに対して親和性を有するように改変されたキメラT細胞受容体を有する場合には、既知の癌関連抗原及びネオエピトープの全てが使用に適すると考えられることが企図される。例えば、腫瘍関連抗原としては、CEA、MUC−1、CYPB1、PSA、Her−2、PSA、ブラキュリ等が挙げられる。
更に、本明細書で企図される組成物と方法には、NK細胞以外の(又はNK細胞に追加される)細胞を用いた細胞ベースの治療も含まれることに留意すべきである。例えば、適切な細胞ベースの治療としてはT細胞ベースの治療が挙げられる。他の選択肢の内、T細胞(例えば、CD4+T細胞、CD8+T細胞等)に関連する1個以上の特徴が検出できることが企図される。より具体的には、GPS Cancer試験によって特定のネオエピトープ(例えば、MHC Iに対する8量体〜12量体、MHC IIに対する12量体〜25量体等)を得ることができ、このネオエピトープを用いて、ネオエピトープ/MHCタンパク質複合体に対して特異的なT細胞受容体を有するネオエピトープ反応性T細胞を特定することができる。従って、企図される方法はネオエピトープ反応性T細胞を回収することを含むことができる。回収したT細胞をエクスビボで増殖又は伸長させて患者への再導入に備えることができる。或いは、回収したT細胞中のT細胞受容体遺伝子を単離し、ウイルス又は他の養子細胞療法系(例えば、CAR−T、CAR−TANK等)に導入することができる。ネオエピトープの他に、GPS Cancer試験によって1種以上の腫瘍関連抗原(TAA)も得ることができる。従って、この試験で特定されるTAAに対して高感度な受容体を有するT細胞を回収することもできる。これらをエクスビボで増殖又は培養して上述同様の治療方法に用いることもできる。T細胞の特定は、ペプチドの合成版を作出し、それを商業的に作出したMHCタンパク質又はMHC様タンパク質に結合させた後、このエクスビボ複合体を標的T細胞に結合させて行うことができる。回収したT細胞には、疾患に対する患者の免疫応答によって活性化されたT細胞、疲弊T細胞、又は上述の特徴に反応する他のT細胞が含まれ得ることを理解すべきである。
疲弊T細胞は幾つかの異なる方法で再活性化することができる。1つの方法では、回収した疲弊T細胞にサイトカイン(例えば、IL−2、IL−12、IL−15等)を外部から添加して細胞を再活性化させる。次に再活性化したT細胞を患者に再導入することができ、チェックポイント阻害剤(例えば、イピリムマブ等)と併せて再導入してもよい。別の方法は、チェックポイント阻害を遮断して疲弊を防ぐことであり、これは、標的ネオエピトープと共に適切な阻害剤(例えば、LAG3等)を有する調整済ウイルスを投与することによって行うことができる。
本出願人は、患者のバルク白血球(WBC)をGPS Cancer試験から発見されたペプチド(例えば、TAA、ネオエピトープ等)と共に培養できることを更に理解している。このようなアプローチによって、バルクWBC中の抗原提示細胞による所望のMHC/ネオエピトープ複合体の産生が期待される。従って、患者のマクロファージ、樹状細胞及びB細胞がNK細胞とT細胞に指示を与え、これらの細胞は患部組織を標的にする所望の特性を獲得するようになる。
更に他の興味深い考察は、患者の免疫応答において腸バイオームが持つ影響に関する。企図される本発明の主題はマイクロバイオーム産生エピトープを特定する方法も含み、このエピトープは調節性又は免疫抑制性免疫応答を引き起こすことが予測される。特定されたエピトープのセットは、GPS Cancer試験によって発見されたネオエピトープのセットから除去することができる。マイクロバイオーム由来のエピトープと類似したネオエピトープは患部組織を標的にする上であまり有用でないと考えられるが、その理由としては、患者の体がこのような類似ペプチドに対して既に耐性を持っている可能性があると思われるためである。
腸バイオームが疾患に対する患者の免疫応答に影響を及ぼし得ることに鑑み、本出願人は、抗生物質が腸マイクロバイオームを標的にする場合に、その抗生物質を患者に投与して患者を治療する方法を更に企図する。例えば、抗生物質を患者に投与して抑制性T細胞(例えば、アップレギュレートTh2、Th17及び調節性T細胞)を引き起こすマイクロバイオームの要素を阻害又は抑制すると共に上述の免疫療法へ導入することができる。他の実施形態では、マイクロバイオームの要素を阻害又は抑制する食事を患者に処方することができる。
更に他の考察は、GPS Cancer(商標)試験又はコンパニオン診断として参照された単一試験としての包括的な「オミクス」試験を本出願人が開発したことである。この単一試験によって、患者の患部組織の状態に関する多くの洞察が得られるが、その例としては以下の種類の情報、特に全ゲノム配列、RNA、RNAseq、プロテオミクス、発現レベル、及びネオエピトープが挙げられる。これらの結果は患者特異的であると共に疾患特異的であることが理解されるべきである。更に、これらの結果によって、疾患を標的にする様々な療法に関する患者特異的及び疾患特異的なガイダンスが得られる。例えば、この結果は、高度な個別化治療を創出する以下の療法、即ち、化学療法、モノクローナル抗体療法、抗体療法、小分子療法、免疫療法、腫瘍関連抗原を対象とした療法、又は任意の療法の組み合わせの一種以上に影響を及ぼし得る。より具体的には、ゲノム配列によって最適となり得る化学療法の種類に関する情報を得ることができ、ネオエピトープによって、患者に投与した際に上述の疾患に対する患者の免疫応答を増強する1種以上のウイルスの構築に関する情報が得られる。ある実施形態では、単一GPS Cancer試験を経時的に反復して行うことができる。次に各試験の結果を個別化療法の変更に反映させて患者の疾患により合わせることができる。
本明細書の説明、及び以下の特許請求の範囲全体を通して使用される「a」、「an」及び「the」の意味は、文脈上明らかに他の意味に解すべき場合を除き、複数の指示対象を包含する。また、本明細書の説明で使用される「in」の意味は、文脈上明らかに他の意味に解すべき場合を除き、「in」及び「on」を包含する。更に本明細書では、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、用語「coupled to」は、直接結合(互いに結合される2個の要素が互いに接触する)と間接結合(少なくとも1個の追加的要素がその2個の要素の間に位置している)の両方を包含することを意図する。従って、用語「coupled to」と「coupled with」は同意語として使用される。最後に、文脈が反対であることを示さない限り、本明細書中に記載の範囲は全て、その範囲の端点を含んでいると解釈されるべきであり、またオープンエンドの範囲は商業上実用的な値を含むように解釈されるべきである。同様に、値の一覧は全て、文脈が反対であることを示さない限り、中間の値を含んでいるとみなされるべきである。
既に記載されたもの以外の多くの更なる変更が本明細書中の発明概念から逸脱することなく可能であることは、当業者には明白なはずである。従って、本発明の主題は、添付の特許請求の範囲の範囲内であることを除いて制限されるべきではない。更に、明細書と特許請求の範囲の両方を解釈する上で、全ての用語は文脈と矛盾せず可能な限り広くなるように解釈されるべきである。特に用語「comprises」と「comprising」は、要素、成分又は段階に対して非排他的に言及していると解釈されるべきであり、このことは、参照された要素、成分又は段階が、明確には参照されていない他の要素、成分又は段階と共に存在しても、利用されても、又は組み合わされてもよいことを示している。本明細書の特許請求の範囲で、A、B、C・・・・及びNから成る群から選択されるものの少なくとも1個に言及される場合、その文章は、Aに加えてN、又はBに加えてN等ではなく、その群から1個の要素のみが必要とされていると解釈されるべきである。
Claims (72)
- 腫瘍を有する患者を治療する方法であって、
(a)患者の腫瘍の少なくとも1種の腫瘍関連エピトープと、
(b)少なくとも1種の共刺激分子と、
(c)チェックポイント受容体に結合するペプチドとをコードする核酸を含む組換えウイルスを皮下投与する段階であって、核酸は、核酸によってコードされるペプチド生成物を細胞質、エンドソーム区画又はリソソーム区画へ向かわせる輸送シグナルを更に含む段階と、
NK細胞を患者に投与する段階を含む、方法。 - 組換えウイルスは、アデノウイルスであり、必要に応じてE2b遺伝子が欠失又は非機能化している、請求項1に記載の方法。
- 腫瘍関連エピトープは、HLA適合の腫瘍関連エピトープである、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 腫瘍関連エピトープは、癌関連エピトープ、癌特異的エピトープ又は患者及び腫瘍特異的ネオエピトープである、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 共刺激分子は、B7.1(CD80)、B7.2(CD86)、ICAM−1(CD54)、ICOS−L、LFA−3(CD58)、4−1BBL、CD30L、CD40、CD40L、CD48、CD70、CD112、CD155、GITRL、OX40L又はTL1Aである、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
- チェックポイント受容体に結合するペプチドは、CTLA−4(CD152)又はPD−1(CD279)に結合する、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 輸送シグナルは、ペプチド生成物を細胞質へ向かわせる、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 輸送シグナルは、ペプチド生成物をエンドソーム区画又はリソソーム区画へ向かわせる、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 輸送シグナルは、細胞質保持配列、エンドソーム標的配列又はリソソーム標的配列を含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 核酸は、第1のペプチド生成物を細胞質へ向かわせる第1の輸送シグナルと、第2のペプチド生成物をエンドソーム区画又はリソソーム区画へ向かわせる第2の輸送シグナルとを有する、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
- ペプチド生成物は、ペプチド生成物の細胞内代謝回転を高める配列部分を更に含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
- NK細胞は、(1)少なくとも1種のキラー細胞免疫グロブリン様受容体の発現が低下又は消失している、(2)高親和性Fcγ受容体を発現する、(3)キメラT細胞受容体を発現する、及び/又は(4)NKG2Aに欠失を有する遺伝子改変NK細胞である、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 組換えウイルスを皮下投与してから1〜14日後にNK細胞を投与する段階を行う、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 腫瘍関連エピトープは、HLA適合の腫瘍関連エピトープである、請求項1に記載の方法。
- 腫瘍関連エピトープは、癌関連エピトープ、癌特異的エピトープ又は患者及び腫瘍特異的ネオエピトープである、請求項1に記載の方法。
- 共刺激分子は、B7.1(CD80)、B7.2(CD86)、ICAM−1(CD54)、ICOS−L、LFA−3(CD58)、4−1BBL、CD30L、CD40、CD40L、CD48、CD70、CD112、CD155、GITRL、OX40L又はTL1Aである、請求項1に記載の方法。
- チェックポイント受容体に結合するペプチドは、CTLA−4(CD152)又はPD−1(CD279)に結合する、請求項1に記載の方法。
- 輸送シグナルは、ペプチド生成物を細胞質へ向かわせる、請求項1に記載の方法。
- 輸送シグナルは、ペプチド生成物をエンドソーム区画又はリソソーム区画へ向かわせる、請求項1に記載の方法。
- 輸送シグナルは、細胞質保持配列、エンドソーム標的配列又はリソソーム標的配列を含む、請求項1に記載の方法。
- 核酸は、第1のペプチド生成物を細胞質へ向かわせる第1の輸送シグナルと、第2のペプチド生成物をエンドソーム区画又はリソソーム区画へ向かわせる第2の輸送シグナルとを有する、請求項1に記載の方法。
- ペプチド生成物は、ペプチド生成物の細胞内代謝回転を高める配列部分を更に含む、請求項1に記載の方法。
- NK細胞は、(1)少なくとも1種のキラー細胞免疫グロブリン様受容体の発現が低下又は消失している、(2)高親和性Fcγ受容体を発現する、(3)キメラT細胞受容体を発現する、及び/又は(4)NKG2Aに欠失を有する遺伝子改変NK細胞である、請求項1に記載の方法。
- 組換えウイルスを皮下投与してから1〜14日後にNK細胞を投与する段階を行う、請求項1に記載の方法。
- 腫瘍を有する患者においてCD8+T細胞応答を刺激する方法であって、
(a)患者の腫瘍の少なくとも1種の腫瘍関連エピトープであって、細胞質内にこの少なくとも1種の腫瘍関連エピトープを保持する輸送シグナルと作動可能に結合するエピトープと、
(b)複数の共刺激分子であって、その内の少なくとも1種はB7.1(CD80)又はB7.2(CD86)である共刺激分子と、
(c)PD−1及びCTLA−4の少なくとも1種に結合するペプチドとをコードする核酸を含む組換えウイルスを皮下投与する段階と、
NK細胞を患者に投与する段階を含む、方法。 - 組換えウイルスは、アデノウイルスであり、必要に応じてE2b遺伝子が欠失又は非機能化している、請求項25に記載の方法。
- 腫瘍関連エピトープは、腫瘍関連エピトープの細胞内代謝回転を高める配列部分を更に含む、請求項25〜26のいずれか一項に記載の方法。
- 腫瘍関連エピトープは、HLA適合の癌関連エピトープ、HLA適合の癌特異的エピトープ又はHLA適合の患者及び腫瘍特異的ネオエピトープである、請求項25〜27のいずれか一項に記載の方法。
- 複数の共刺激分子は、ICAM−1(CD54)、ICOS−L、LFA−3(CD58)、4−1BBL、CD30L、CD40、CD40L、CD48、CD70、CD112、CD155、GITRL、OX40L及びTL1Aから成る群から選択される少なくとも1種の更なる共刺激分子を更に含む、請求項25〜28のいずれか一項に記載の方法。
- PD−1及びCTLA−4の少なくとも1種に結合するペプチドは、膜結合型抗体断片である、請求項25〜29のいずれか一項に記載の方法。
- NK細胞は、(1)少なくとも1種のキラー細胞免疫グロブリン様受容体の発現が低下又は消失している、(2)高親和性Fcγ受容体を発現する、(3)キメラT細胞受容体を発現する、及び/又は(4)NKG2Aに欠失を有する遺伝子改変NK細胞である、請求項25〜30のいずれか一項に記載の方法。
- 腫瘍関連エピトープは、腫瘍関連エピトープの細胞内代謝回転を高める配列部分を更に含む、請求項25に記載の方法。
- 腫瘍関連エピトープは、HLA適合の癌関連エピトープ、HLA適合の癌特異的エピトープ又はHLA適合の患者及び腫瘍特異的ネオエピトープである、請求項25に記載の方法。
- 複数の共刺激分子は、ICAM−1(CD54)、ICOS−L、LFA−3(CD58)、4−1BBL、CD30L、CD40、CD40L、CD48、CD70、CD112、CD155、GITRL、OX40L及びTL1Aから成る群から選択される少なくとも1種の更なる共刺激分子を更に含む、請求項25に記載の方法。
- PD−1及びCTLA−4の少なくとも1種に結合するペプチドは、膜結合型抗体断片である、請求項25に記載の方法。
- NK細胞は、(1)少なくとも1種のキラー細胞免疫グロブリン様受容体の発現が低下又は消失している、(2)高親和性Fcγ受容体を発現する、(3)キメラT細胞受容体を発現する、及び/又は(4)NKG2Aに欠失を有する遺伝子改変NK細胞である、請求項25に記載の方法。
- 腫瘍を有する患者においてCD4+T細胞応答を刺激する方法であって、
(a)患者の腫瘍の少なくとも1種の腫瘍関連エピトープであって、この少なくとも1種の腫瘍関連エピトープを細胞質、エンドソーム区画又はリソソーム区画へ向かわせる輸送シグナルと作動可能に結合するエピトープと、
(b)複数の共刺激分子であって、その内の少なくとも1種はB7.1(CD80)又はB7.2(CD86)である共刺激分子と、
(c)PD−1及びCTLA−4の少なくとも1種に結合するペプチドとをコードする核酸を含む組換えウイルスを皮下投与する段階と、
NK細胞を患者に投与する段階を含む、方法。 - 組換えウイルスは、アデノウイルスであり、必要に応じてE2b遺伝子が欠失又は非機能化している、請求項37に記載の方法。
- 腫瘍関連エピトープは、腫瘍関連エピトープの細胞内代謝回転を高める配列部分を更に含む、請求項37〜38のいずれか一項に記載の方法。
- 腫瘍関連エピトープは、HLA適合の癌関連エピトープ、HLA適合の癌特異的エピトープ又はHLA適合の患者及び腫瘍特異的ネオエピトープである、請求項37〜39のいずれか一項に記載の方法。
- 複数の共刺激分子は、ICAM−1(CD54)、ICOS−L、LFA−3(CD58)、4−1BBL、CD30L、CD40、CD40L、CD48、CD70、CD112、CD155、GITRL、OX40L及びTL1Aから成る群から選択される少なくとも1種の更なる共刺激分子を更に含む、請求項37〜40のいずれか一項に記載の方法。
- PD−1及びCTLA−4の少なくとも1種に結合するペプチドは、膜結合型抗体断片である、請求項37〜41のいずれか一項に記載の方法。
- NK細胞は、(1)少なくとも1種のキラー細胞免疫グロブリン様受容体の発現が低下又は消失している、(2)高親和性Fcγ受容体を発現する、(3)キメラT細胞受容体を発現する、及び/又は(4)NKG2Aに欠失を有する遺伝子改変NK細胞である、請求項37〜42のいずれか一項に記載の方法。
- 腫瘍関連エピトープは、腫瘍関連エピトープの細胞内代謝回転を高める配列部分を更に含む、請求項37に記載の方法。
- 腫瘍関連エピトープは、HLA適合の癌関連エピトープ、HLA適合の癌特異的エピトープ又はHLA適合の患者及び腫瘍特異的ネオエピトープである、請求項37に記載の方法。
- 複数の共刺激分子は、ICAM−1(CD54)、ICOS−L、LFA−3(CD58)、4−1BBL、CD30L、CD40、CD40L、CD48、CD70、CD112、CD155、GITRL、OX40L及びTL1Aから成る群から選択される少なくとも1種の更なる共刺激分子を更に含む、請求項37に記載の方法。
- PD−1及びCTLA−4の少なくとも1種に結合するペプチドは、膜結合型抗体断片である、請求項37に記載の方法。
- NK細胞は、(1)少なくとも1種のキラー細胞免疫グロブリン様受容体の発現が低下又は消失している、(2)高親和性Fcγ受容体を発現する、(3)キメラT細胞受容体を発現する、及び/又は(4)NKG2Aに欠失を有する遺伝子改変NK細胞である、請求項37に記載の方法。
- 腫瘍の細胞上でNKG2Dリガンドの発現を誘発又は発現を増大させるのに有効なプロトコルの下で低用量の化学療法を患者に施す段階を更に含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 腫瘍の細胞上でNKG2Dリガンドの発現を誘発又は発現を増大させるのに有効なプロトコルの下で低用量の化学療法を患者に施す段階を更に含む、請求項1、25又は37のいずれか一項に記載の方法。
- 腫瘍の細胞上でNKG2Dリガンドの発現を誘発又は発現を増大させるのに有効なプロトコルの下で放射線療法を患者に施す段階を更に含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 腫瘍の細胞上でNKG2Dリガンドの発現を誘発又は発現を増大させるのに有効なプロトコルの下で放射線療法を患者に施す段階を更に含む、請求項1、25又は37のいずれか一項に記載の方法。
- 残留腫瘍細胞中の新しいネオエピトープを特定し、新しいネオエピトープの内の少なくとも1種を含むようにウイルスベクターの核酸を改変する段階を更に含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 残留腫瘍細胞中の新しいネオエピトープを特定し、新しいネオエピトープの内の少なくとも1種を含むようにウイルスベクターの核酸を改変する段階を更に含む、請求項1、25又は37のいずれか一項に記載の方法。
- (a)患者の腫瘍の少なくとも1種の腫瘍関連エピトープと、
(b)少なくとも1種の共刺激分子と、
(c)チェックポイント受容体に結合するペプチドとをコードする核酸を含むウイルスベクターであって、
核酸は、核酸によってコードされるペプチド生成物を(i)MHC−I提示用細胞質又は(ii)MHC−II提示用エンドソーム区画又はリソソーム区画へ向かわせる輸送シグナルを更に含み、
ペプチド生成物は、ペプチド生成物の細胞内代謝回転を高める配列部分を更に含む、ウイルスベクター。 - ウイルスベクターは、組換えアデノウイルスゲノムであり、必要に応じてE2b遺伝子が欠失又は非機能化している、請求項55に記載のウイルスベクター。
- 腫瘍関連エピトープは、HLA適合の腫瘍関連エピトープである、請求項55〜56のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
- 腫瘍関連エピトープは、癌関連エピトープ、癌特異的エピトープ又は患者及び腫瘍特異的ネオエピトープである、請求項55〜57のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
- 共刺激分子は、B7.1(CD80)、B7.2(CD86)、ICAM−1(CD54)、ICOS−L、LFA−3(CD58)、4−1BBL、CD30L、CD40、CD40L、CD48、CD70、CD112、CD155、GITRL、OX40L又はTL1Aである、請求項55〜58のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
- チェックポイント受容体に結合するペプチドは、CTLA−4(CD152)又はPD−1(CD279)に結合し、必要に応じて膜結合型抗体断片を含む、請求項55〜59のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
- 腫瘍関連エピトープは、HLA適合の腫瘍関連エピトープである、請求項55に記載のウイルスベクター。
- 腫瘍関連エピトープは、癌関連エピトープ、癌特異的エピトープ又は患者及び腫瘍特異的ネオエピトープである、請求項55に記載のウイルスベクター。
- 共刺激分子は、B7.1(CD80)、B7.2(CD86)、ICAM−1(CD54)、ICOS−L、LFA−3(CD58)、4−1BBL、CD30L、CD40、CD40L、CD48、CD70、CD112、CD155、GITRL、OX40L又はTL1Aである、請求項55に記載のウイルスベクター。
- チェックポイント受容体に結合するペプチドは、CTLA−4(CD152)又はPD−1(CD279)に結合し、必要に応じて膜結合型抗体断片を含む、請求項55に記載のウイルスベクター。
- 請求項55〜60のいずれか一項に記載のウイルスベクターを含む、組換えウイルス。
- 請求項61〜64のいずれか一項に記載のウイルスベクターを含む、組換えウイルス。
- 請求項65に記載の組換えウイルスを含む、医薬組成物。
- 請求項66に記載の組換えウイルスを含む、医薬組成物。
- 輸送シグナルは、ペプチド生成物を細胞質へ向かわせる、請求項55に記載のウイルスベクター。
- 輸送シグナルは、ペプチド生成物をエンドソーム区画又はリソソーム区画へ向かわせる、請求項55に記載のウイルスベクター。
- 輸送シグナルは、細胞質保持配列、エンドソーム標的配列又はリソソーム標的配列を含む、請求項55に記載のウイルスベクター。
- 核酸は、第1のペプチド生成物を細胞質へ向かわせる第1の輸送シグナルと、第2のペプチド生成物をエンドソーム区画又はリソソーム区画へ向かわせる第2の輸送シグナルとを有する、請求項55に記載のウイルスベクター。
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