BR112015025460B1 - Método para a produção de uma vacina personalizada contra a neoplasia para um indivíduo diagnosticado como tendo uma neoplasia, vacina personalizada e uso da mesma - Google Patents

Abstract

composições e métodos para vacinas para neoplasia personalizadas. a invenção fornece um método de produção de uma vacina para neoplasia personalizada para um indivíduo diagnosticado como tendo neoplasia, o qual inclui identificar uma pluralidade de mutações na neoplasia, analisar a pluralidade de mutações para identificar um subconjunto de pelo menos cinco mutações neo-antigénicas previstas para codificar peptídeos neo-antigénicos, as mutações neo-antigénicas selecionadas a partir do grupo que consiste em mutações missense, mutações neoorf, e qualquer combinação das mesmas, e produzir, baseado no subconjunto identificado, uma vacina para neoplasia personaliza da.

Description

DECLARAÇÃO DE DIREITOS SOBRE INVENTOS REALIZADOS AO ABRIGO DE INVESTIGAÇÃO PROMOVIDA FEDERALMENTE

[001]Este trabalho foi apoiado pelos seguintes financiamentos do National Institutes of Health, Financiamentos N°s: NIH/NCI-1R01CA155010-02 e NHLBI- 5R01HL103532-03. O governo detém certos direitos sobre a invenção.

PEDIDOS RELACIONADOS

[002]Este pedido reivindica o benefício e prioridade ao Pedido de Patente Provisório U.S. No. 61/809,406, depositado a 7 de abril de 2013 e Pedido de Patente Provisório U.S. No. 61/869,721, depositado a 25 de agosto de 2013, cujos conteúdos são aqui incorporados por referência.

ÁREA DA INVENÇÃO

[003]A presente invenção se relaciona com estratégias personalizadas para o tratamento da neoplasia. Mais particularmente, a presente invenção se relaciona com a identificação e uso de um conjunto específico ao paciente de neo-antigênios específicos do tumor em uma vacina personalizada contra tumor para tratamento do paciente.

ANTECEDENTES

[004]Aproximadamente 1,6 milhões de americanos são diagnosticados com neoplasia todos os anos, e estima-se que aproximadamente 580.000 de pessoas nos Estados Unidos morram da doença em 2013. Ao longo das últimas décadas houve melhorias significativas na detecção, diagnóstico e tratamento da neoplasia que aumentaram significativamente a taxa de sobrevivência para muitos tipos de neoplasia. Contudo, apenas cerca de 60% das pessoas diagnosticadas com neoplasia continuam vivas 5 anos após o início do tratamento, o que torna a neoplasia a segunda principal causa de morte nos Estados Unidos.

[005]Atualmente, há várias terias terapias oncológicas diferentes, incluindo técnicas de ablação (por exemplo, intervenções cirúrgicas, tratamento criogênico/térmico, ultrassons, radiofrequência, e radiação) e técnicas químicas (por exemplo, agentes farmacêuticos, agentes citotóxicos/terapêuticos, anticorpos monoclonais e várias combinações destes). Infelizmente, tais terapias são frequentemente associadas a graves riscos, efeitos secundários tóxicos, e custos extremamente elevados, bem como a uma certa ineficácia.

[006] Há um interesse crescente em terapias oncológicas que procuram tratar células cancerígenas através do sistema imunitário próprio do paciente (por exemplo, vacinas contra o cancro) porque tais terapias podem mitigar/ eliminar algumas das desvantagens acima descritas. As vacinas contra o câncer são tipicamente compostas de antigênios de tumores e moléculas imunoestimulantes (por exemplo citocinas ou ligandos TLR) que trabalham em conjunto para induzir celulas T citotóxicas específicas de antigênio que alvejam e destroem células tumorais. As atuais vacinas contra o câncer contêm tipicamente antigênios tumorais partilhados que são proteínas nativas (ou seja, - proteínas codificadas pelo DNA de todas as células normais no indivíduo) que são seletivamente expressas ou sobreexpressas em tumores encontrados em muitos indivíduos. Apesar de antigênios tumorais partilhados serem úteis na identificação de tipos particulares de tumores, eles não são ideais como imunogênios direcionados a uma resposta de célula T para um tipo de tumor particular porque estão sujeitos a efeitos atenuantes imunitários de auto-tolerância. Em conformidade, há a necessidade de métodos de identificar antigênios tumorais mais eficazes que possam ser usados para vacinas contra neoplasias.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[007]A presente invenção se relaciona com uma estratégia para o tratamento personalizado da neoplasia e mais particularmente a identificação e uso de uma vacina personalizada contra o câncer consistindo essencialmente de um conjunto de neo-antigênios específicos de tumor e específicos de paciente para o tratamento de tumores em um paciente. Como descrito em baixo, a presente invenção se baseia, pelo menos em parte, na descoberta de que a sequenciação genoma/exoma pode ser usada para identificar todos, ou quase todos, os neo-antigênios mutados que estão unicamente presentes em uma neoplasia/tumor de um paciente individual, e que esta coleção de neo-antigênios mutados pode ser analisada para identificar um subconjunto específico otimizado de neo-antigênios para uso como uma vacina personalizada contra a neoplasia para o tratamento da neoplasia/tumor do paciente.

[008]Em um aspeto, a invenção providencia um método de produzir uma vacina personalizada contra a neoplasia para um paciente diagnosticado como tendo uma neoplasia, que inclui identificar uma pluralidade de mutações na neoplasia, analisar a pluralidade de mutações para identificar um subconjunto de pelo menos cinco mutações neo-antigênicas que se prevê codificarem peptídeos neo-antigênicos, as mutações neo-antigênicas selecionadas do grupo consistindo de mutações de sentido trocado, mutações neoORF e uma qualquer sua combinação, e produzir, com base no subconjunto identificado, uma vacina personalizada contra a neoplasia.

[009]Em uma forma de realização, a invenção providencia que a etapa de identificação inclui ainda sequenciação do genoma, transcritoma ou proteoma da neoplasia.

[0010] Em outra forma de realização, a etapa de análise pode ainda incluir determinar uma ou mais características associadas ao subconjunto de pelo menos cinco mutações neo-antigênicas previstas como codificando peptídeo neo-antigênicos, as características selecionadas do grupo consistindo de peso molecular, teor de cisteína, hidrofilicidade, hidrofobicidade, carga, e afinidade de ligação; e classificar, com base nas características determinadas, cada uma das mutações neo-antigênicas dentro do subconjunto identificado de pelo menos cinco mutações neo-antigênicas. Em uma forma de realização, as mutações neo-antigênicas classificadas entre as primeiras 5-30 são incluídas na vacina personalizada contra a neoplasia. Em outra forma de realização, as mutações neo-antigênicas são classificadas na ordem mostrada na Fig. 8.

[0011] Em uma forma de realização, a vacina personalizada contra a neoplasia compreende pelo menos cerca de 20 peptídeos neo-antigênicos correspondendo às mutações neo-antigênicas.

[0012] Em outra forma de realização, a vacina personalizada contra a neoplasia compreende uma ou mais moléculas de DNA capazes de expressar pelo menos cerca de 20 peptídeos neo-antigênicos correspondendo às mutações neo- antigênicas. Em outra forma de realização, a vacina personalizada contra a neoplasia compreende uma ou mais moléculas de RNA capazes de expressar pelo menos 20 peptídeos neo-antigênicos correspondendo às mutações neo-antigênicas.

[0013] Em formas de realização, a vacina personalizada contra a neoplasia compreende mutações neoORF que se prevê codificarem um polipeptídeo neoORF possuindo um Kd de < 500 nM.

[0014] Em outra forma de realização, a vacina personalizada contra a neoplasia compreende mutações de sentido trocado que se prevê codificarem um polipeptídeo possuindo um Kd de <150 nM, em que a proteína cognata nativa possui um Kd de ^ 1000 nM ou < 150 nM.

[0015] Em outra forma de realização, os pelo menos cerca de 20 peptídeos neo-antigênicos variam em comprimento entre cerca de 5 a cerca de 50 aminoácidos. Em outra forma de realização, os pelo menos cerca de 20 peptídeos neo- antigênicos variam em comprimento entre cerca de 15 a cerca de 35 aminoácidos. Em outra forma de realização, os pelo menos cerca de 20 peptídeos neo-antigênicos variam em comprimento entre cerca de 18 a cerca de 30 aminoácidos. Em outra forma de realização, os pelo menos cerca de 20 peptídeos neo-antigênicos variam em comprimento entre cerca de 6 a cerca de 15 aminoácidos. Ainda em outra forma de realização, os pelo menos cerca de 20 peptídeos neo- antigênicos possuem um comprimento de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 aminoácidos.

[0016] Em uma forma de realização, a vacina contra a neoplasia personalizada inclui ainda um adjuvante. Em outras formas de realização, o adjuvante é selecionado do grupo consistindo de poli-ICLC, 1018 ISS, sais de alumínio, Amplivax, AS15, BCG, CP-870,893, CpG7909, CyaA, dSLIM, GM- CSF, IC30, IC31, Imiquimod, ImuFact IMP321, IS Patch, ISS, ISCOMATRIX, Juvlmmune, LipoVac, MF59, lípido monofosforila A, Montanide IMS 1312, Montanide ISA 206, Montanide ISA 50V, Montanide ISA-51, OK-432, OM-174, OM-197-MP-EC, ONTAK, PepTel.RTM, sistema vetor, micropartículas PLGA, resiquimod, SRL172, virossomas e outras partículas tipo vírus, YF-17D, armadilha VEGF, R848, betaglucano, Pam3Cys, stimulon QS21 da companhia Aquila, vadimezan e/ou AsA404 (DMXAA). Em uma forma de realização preferencial, o adjuvante é poli-ICLC.

[0017] Em outro aspeto, a invenção inclui um método de tratar um paciente diagnosticado como tendo uma neoplasia com uma vacina personalizada contra a neoplasia, que inclui identificar uma pluralidade de mutações na neoplasia; analisar a pluralidade de mutações para identificar um subconjunto de pelo menos cinco mutações neo-antigênicas que se prevê codificarem peptídeos neo-antigênicos expressos, as mutações neo-antigênicas selecionadas do grupo consistindo de mutações de sentido trocado, mutações neoORF e uma qualquer sua combinação; produzir, com base no subconjunto identificado, uma vacina personalizada contra a neoplasia; e administrar a vacina personalizada contra a neoplasia ao paciente, tratando assim a neoplasia.

[0018] Em outra forma de realização, a etapa de identificação pode ainda incluir sequenciação do genoma, transcritoma ou proteoma da neoplasia.

[0019] Em ainda outra forma de realização, a etapa de análise pode ainda incluir determinar uma ou mais características associadas ao subconjunto de pelo menos cinco mutações neo-antigênicas previstas como codificando peptídeos neo-antigênicos expressos, as características selecionadas do grupo consistindo de peso molecular, teor de cisteína, hidrofilicidade, hidrofobicidade, carga, e afinidade de ligação; e classificar, com base nas características determinadas, cada uma das mutações neo- antigênicas dentro do subconjunto identificado de pelo menos cinco mutações neo-antigênicas.

[0020] Em uma forma de realização, as mutações neo- antigênicas classificadas entre as primeiras 5-30 são incluídas na vacina personalizada contra a neoplasia. Em outra forma de realização, as mutações neo-antigênicas são classificadas na ordem mostrada na Fig. 8.

[0021] Em uma forma de realização, a vacina personalizada contra a neoplasia compreende pelo menos 20 peptídeos neo-antigênicos correspondendo às mutações neo- antigênicas.

[0022] Em outra forma de realização, a vacina personalizada contra a neoplasia compreende uma ou mais moléculas de DNA capazes de expressar pelo menos 20 peptídeos neo-antigênicos correspondendo às mutações neo-antigênicas.

[0023] Em uma forma de realização, a vacina personalizada contra a neoplasia compreende uma ou mais moléculas de RNA capazes de expressar pelo menos 20 peptídeos neo-antigênicos correspondendo às mutações neo-antigênicas.

[0024] Em uma forma de realização, a vacina personalizada contra a neoplasia compreende mutações neoORF que se prevê codificarem um polipeptídeo neoORF possuindo um Kd de < 500 nM.

[0025] Em outra forma de realização, a vacina personalizada contra a neoplasia compreende mutações de sentido trocado que se prevê codificarem um polipeptídeo possuindo um Kd de <150 nM, em que a proteína cognata native possui um Kd de ^ 1000 nM ou < 150 nM.

[0026] Em uma forma de realização, os pelo menos 20 peptídeos neo-antigênicos variam em comprimento entre cerca de 5 a cerca de 50 aminoácidos. Em uma forma de realização, os pelo menos 20 peptídeos neo-antigênicos variam em comprimento entre cerca de 15 a cerca de 35 aminoácidos. Em uma forma de realização, os pelo menos 20 peptídeos neo- antigênicos variam em comprimento entre cerca de 18 a cerca de 30 aminoácidos. Em uma forma de realização, os pelo menos 20 peptídeos neo-antigênicos variam em comprimento entre cerca de 6 a cerca de 15 aminoácidos. Em uma forma de realização, os pelo menos 20 peptídeos neo-antigênicos possuem um comprimento de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 aminoácidos.

[0027] Em uma forma de realização, a administração inclui ainda dividir a vacina produzida em dois ou mais subconjuntos; e injetar cada um dos subconjuntos em um diferente ponto do paciente. Em uma forma de realização, cada um dos subconjuntos injetados em uma localização diferente compreende peptídeos neo-antigênicos de forma que o número de peptídeos individuais no subconjunto direcionado a qualquer HLA de paciente individual é um, ou um número o menos acima de um possível.

[0028] Em uma forma de realização, a etapa de administração inclui ainda dividir a vacina produzida em dois ou mais subconjuntos, em que cada subconjunto compreende pelo menos cinco peptídeos neo-antigênicos selecionados para otimizar interações intra-conjunto.

[0029] Em uma forma de realização, otimizar compreende reduzir a interação negativa entre os peptídeos neo-antigênicos no mesmo conjunto.

[0030] Em outro aspeto, a invenção inclui uma vacina personalizada contra a neoplasia de acordo com os métodos acima descritos.

Definições

[0031] Para facilitar a compreensão da presente invenção, um número de termos e frases são definidos como se segue:

[0032] Salvo indicação em contrário ou que decorra obviamente do contexto, como aqui usado, o termo "cerca de" é entendido como dentro de um intervalo de tolerância normal na técnica, por exemplo dentro de 2 desvios padrão da média. Também pode ser entendido como dentro de 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,1%, 0,05%, ou 0,01% do valor indicado. Exceto indicação clara em contrário pelo contexto, todos os valores numéricos aqui providenciados são modificados pelo termo cerca de.

[0033] Por "agente" entende-se qualquer composto químico de molécula pequena, anticorpo, molécula de ácido nucleico ou polipeptídeo ou seus fragmentos.

[0034] Por "melhorar" entende-se reduzir, suprimir, atenuar, diminuir, parar ou estabilizar o desenvolvimento ou progressão de uma doença (por exemplo, uma neoplasia, tumor, etc.).

[0035] Por "alteração" entende-se uma alteração (aumento ou redução) nos níveis de expressão ou atividade de um gene ou polipeptídeo como detectados por métodos de técnica padrão conhecidos tais como os aqui descritos. Como aqui usado, uma alteração inclui uma alteração de 10% em níveis de expressão, de preferência uma alteração de 25%, mais preferencialmente uma alteração de 40% e muito preferencialmente uma alteração de 50% ou mais em níveis de expressão.

[0036] Por "análogo" entende-se uma molécula que não é idêntica, mas tem propriedades funcionais ou estruturais análogas. Por exemplo, um análogo de polipeptídeo de neo- antigênio específico de tumor retém a atividade biológica de um polipeptídeo de neo-antigênio específico de tumor correspondente ocorrendo naturalmente, ao mesmo tempo que tem certas modificações bioquímicas que potenciam a função análoga relativa a um polipeptídeo ocorrendo naturalmente.Tais modificações bioquímicas poderiam aumentar a resistência de protease do análogo, permeabilidade da membrana, ou semi-vida, sem alterar, por exemplo, a ligação do ligando. Um análogo pode incluir um aminoácido não natural.

[0037] A frase "terapia de combinação" compreende a administração de uma amostra combinada de neo-antigênios específicos de neoplasia/tumor e um ou mais agentes terapêuticos adicionais como parte de um regime de tratamento específico destinado a providenciar um efeito benéfico (aditivo ou sinergístico) pela co-ação destes agentes terapêuticos. O efeito benéfico da combinação inclui, mas não se limita a, co-ação farmacocinética ou farmacodinâmica resultante da combinação de agentes terapêuticos. A administração destes agentes terapêuticos em combinação é realizada tipicamente ao longo de um período de tempo definido (normalmente, minutos, horas, dias ou semanas, dependendo da combinação selecionada). "Terapia de combinação" pretende compreender a administração destes agentes terapêuticos de maneira sequencial, ou seja, em que cada agente terapêutico é administrado em um momento diferente, bem como a administração destes agentes terapêuticos ou pelo menos dois dos agentes terapêuticos, de uma maneira substancialmente simultânea. Administração substancialmente simultânea pode ser alcançada, por exemplo, administrando ao paciente uma cápsula única possuindo uma proporção fixa de cada agente terapêutico ou em múltiplas cápsulas únicas para cada um dos agentes terapêuticos. Por exemplo, uma combinação da presente invenção pode compreender uma amostra combinada de neo-antigênios específicos de tumor e pelo menos um agente terapêutico adicional (por exemplo, um agente quimioterapêutico, um agente anti-angiogênese, um agente imunossupressor, um agente anti-inflamatório e semelhantes) ao mesmo tempo ou em momentos diferentes ou eles podem ser formulados como uma composição farmacêutica única co-formulada compreendendo os dois compostos. Como outro exemplo, podem ser formuladas uma combinação da presente invenção (por exemplo, uma amostra combinada de neo-antigênios específicos de tumor e pelo menos um agente terapêutico adicional) como composições farmacêuticas separadas que podem ser administradas ao mesmo tempo ou em momentos diferentes. A administração sequencial ou substancialmente simultânea de cada agente terapêutico pode ser efetuada por qualquer via apropriada, incluindo, mas não se limitando a, via oral, intravenosa, subcutânea, intramuscular, absorção direta através de tecidos da membrana mucosa (por exemplo, nasal, bucal, vaginal e retal), e via ocular (por exemplo, intravitreal, intraocular, etc.).Os agentes terapêuticos podem ser administrados pela mesma via ou por vias diferentes. Por exemplo, um componente de uma combinação particular pode ser administrado por injeção intravenosa enquanto o ou os outros componentes da combinação podem ser administrados oralmente. Os componentes podem ser administrados em qualquer sequência terapeuticamente eficaz.

[0038] A frase "combinação" compreende grupos de compostos ou terapias sem fármacos úteis como parte de uma terapia de combinação.

[0039] Em esta revelação, "compreende", "compreendendo", "contendo" e "possuindo" e semelhantes podem ter o significado atribuído na Lei de Patentes U.S. e podem significar "inclui", "incluindo" e semelhantes; "consistindo essencialmente de" ou "consiste essencialmente de" têm igualmente o mesmo significado atribuído pela Lei de Patente U.S. e o termo é aberto, permitindo a presença de mais do que é citado desde que características básicas ou novas do que é citado não sejam alteradas pela presença de mais do que aquilo que é citado, mas exclui formas de realização da técnica anterior.

[0040] Por "controle" entende-se uma condição padrão ou de referência.

[0041] Por "doença" entende-se qualquer condição ou distúrbio que danifique ou interfira com a função normal de uma célula, tecido ou órgão.

[0042] Por "quantidade efetiva" entende-se uma quantidade necessária para melhorar os sintomas de uma doença (por exemplo, uma neoplasia/tumor) relativamente a um paciente não tratado. A quantidade eficaz de composto(s) ativo(s) usada para pôr em prática a presente invenção para tratamento terapêutico de uma doença varia dependendo da forma de administração, idade, peso corporal e saúde geral do paciente. Em última análise, será o médico ou veterinário que seguem o doente a decidir a quantidade apropriada e regime de dosagem. Tal quantidade é referida como uma quantidade "eficaz".

[0043] Por "fragmento" entende-se uma porção de um polipeptídeo ou molécula de ácido nucleico. Esta porção contém, de preferência, pelo menos, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, ou 90% de todo o comprimento do polipeptídeo ou molécula de ácido nucleico de referência. Um fragmento pode conter 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, ou 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, ou mais nucleotídeos ou aminoácidos.

[0044] "Hibridação" significa ligação de hidrogênio, que pode ser ligação de hidrogênio de Watson-Crick, Hoogsten ou Hoogsten reversa, entre nucleobases complementares. Por exemplo, adenina e timina são nucleobases complementares que emparelham através da formação de ligações de hidrogênio.

[0045] Por "ácido nucleico inibitório" entende-se um RNA de fita dupla, siRNA, shRNA ou RNA antissentido, ou uma sua porção, ou um seu mimético, que quando administrados a uma célula de mamífero resulta em uma redução (por exemplo, em 10%, 25%, 50%, 75%, ou mesmo 90-100%) na expressão de um gene alvo. Tipicamente, um inibidor de ácido nucleico compreende pelo menos uma porção de uma molécula de ácido nucleico alvo, ou um seu ortólogo, ou compreende pelo menos uma porção da cadeia complementar de uma molécula de ácido nucleico alvo. Por exemplo, uma molécula de ácido nucleico inibitória compreende pelo menos uma porção de qualquer um dos ácidos nucléicos aqui delineados.

[0046] Por "polinucleotídeo isolado" entende-se um ácido nucleico (por exemplo, um DNA) livre de genes dos quais, no genoma ocorrendo naturalmente do organismo - ou no DNA genômico de uma neoplasia/tumor derivado do organismo - a molécula de ácido nucleico da invenção deriva. O termo inclui assim, por exemplo, um DNA recombinantes (por exemplo, DNA codificando um polipeptídeo neoORF, read-through, ou derivado de InDel identificado em um tumor de um paciente) que é incorporado em um vetor; em um plasmídeo ou vírus autonomamente replicante; ou em um DNA genômico de um procariota ou eucariota; ou que existe como uma molécula separada (por exemplo, um cDNA ou um fragmento genômico ou fragmento cDNA produzido por PCR ou digestão de endonuclease de restrição) independente de outras sequências. Além disso, o termo inclui uma molécula RNA que é transcrita de uma molécula DNA, bem como um DNA recombinante que é parte de um gene híbrido codificando sequência de polipeptídeo adicional.

[0047] Por um "polipeptídeo isolado" entende-se um polipeptídeo da invenção que foi separado de componentes que naturalmente o acompanham. Tipicamente, o polipeptídeo é isolado quando é pelo menos 60% em peso, livre de proteínas e de moléculas orgânicas ocorrendo naturalmente às quais está naturalmente associado. De preferência, a preparação é pelo menos 75%, mais preferencialmente pelo menos 90%, e muito preferencialmente pelo menos 99% em peso de um polipeptídeo da invenção. Um polipeptídeo isolado da invenção pode ser obtido, por exemplo, por extração de uma fonte natural, por expressão de um ácido nucléico recombinante tal como um polipeptídeo; ou por síntese química da proteína. A pureza pode ser medida por qualquer método apropriado, por exemplo, cromatografia em coluna, eletroforese de gel poliacrilamida, ou por análise HPLC.

[0048] Um "ligante" deve ser entendido como significando uma molécula que tem uma estrutura complementar à de um receptor e que é capaz de formar um complexo com o receptor. De acordo com a invenção, um ligando deve ser entendido como significando um peptídeo ou fragmento de peptídeo com um comprimento adequado e motivos de ligação adequados na sua sequência de aminoácidos, de forma que o peptídeo ou fragmento de peptídeo seja capaz de formar um complexo com proteínas da classe MHC I ou classe MHC II.

[0049] "Mutação" para os propósitos deste documento significa uma sequência de DNA encontrada na amostra de DNA tumoral de um paciente que não é encontrada na amostra de DNA normal correspondente do mesmo paciente. "Mutação" também se refere a padrões na sequência de RNA de um paciente que não são atribuíveis a variações esperadas com base em informação conhecida de um gene individual e são razoavelmente considerados como sendo variações novas, por exemplo, o padrão de união de um ou mais genes que foi especificamente alterado nas células tumorais do paciente.

[0050] "Neo-antigênio"ou "neo-antigênico" significa uma classe de antigênios tumorais que surge de uma ou mais mutações específicas de tumor que alteram a sequência de aminoácidos das proteínas codificadas no genoma.

[0051] Por "neoplasia" entende-se qualquer doença provocada, por ou resultando em, níveis inapropriadamente elevados de divisão celular, níveis inapropriadamente baixos de apoptose ou ambos. Por exemplo, o câncer é um exemplo de uma neoplasia. Exemplos de cânceres incluem, sem limitação, leucemia (por exemplo, leucemia aguda, leucemia linfóide aguda, leucemia mielóide aguda, leucemia mieloblástica aguda, leucemia promielocítica aguda, leucemia mielomonocítica aguda, leucemia monocítica aguda, eritroleucemia aguda, leucemia crônica, leucemia mielóide crônica, leucemia linfóide crônica), policitemia vera, linfoma (por exemplo, doença de Hodgkin, doença de não Hodgkin), macroglobulinemia de Waldenstrom, doença da cadeia pesada, e tumores sólidos como sarcomas e carcinomas (por exemplo, fibrossarcoma, mixossarcoma, lipossarcoma, condrossarcoma, osteossarcoma, cordoma, angiossarcoma, endoteliossarcoma, linfangiossarcoma, linfangioendoteliossarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiossarcoma, rabdomiossarcoma, carcinoma do cólon, câncer do pâncreas, câncer de mama, câncer dos ovários, câncer da próstata, carcinoma das células escamosas, carcinoma basocelular, adenocarcinoma, carcinomas das glândulas sudoríparas, carcinoma das glândulas sebáceas, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncogênico, carcinoma das células renais, hepatoma, carcinoma do canal biliar, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrional, tumor de Wilm, câncer cervical, câncer do útero, câncer dos testículos, carcinoma pulmonar, carcinoma das células pequenas do pulmão, carcinoma da bexiga, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craniofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodenroglioma, schwanoma, meningioma, melanoma, neuroblastoma, e retinoblastoma). Distúrbios linfoproliferativos são também considerados como doenças proliferativas.

[0052] Salvo indicação específica em contrário ou que resulte óbvio do contexto, como aqui usado, o termo "ou" entende-se como inclusivo. Salvo indicação específica em contrário ou que resulte óbvio do contexto, como aqui usado, os termos "um", "uma" e "o", "a" são entendidos como singular ou plural.

[0053] O termo "paciente" ou "sujeito" refere-se a um animal que é objeto de tratamento, observação ou experimentação. A título de exemplo apenas, um sujeito inclui, mas não se limita a, um mamífero, incluindo, mas não se limitando a, um humano ou mamífero não humano, tal como um primata não humano, bovino, equino, canino, ovino ou felino.

[0054] "Farmaceuticamente aceitável" refere-se a aprovado ou aprovável por uma agência regulatória do governo federal ou estatal ou listado na Farmacopeia Americana ou outra farmacopeia globalmente reconhecida para utilização em animais, incluindo humanos.

[0055] "Excipiente, transportador ou diluente farmaceuticamente aceitável" refere-se a um excipiente, transportador ou diluente que pode ser administrado a um paciente, juntamente com um agente, e que não destrói a sua atividade farmacológica e não é tóxico quando administrado em doses suficientes para aplicar uma quantidade terapêutica do agente.

[0056] Um "sal farmaceuticamente aceitável" de neo- antigênios específicos de tumor agrupados como aqui referido pode ser um ácido ou sal básico geralmente considerado na técnica como adequado para uso em contato com os tecidos de seres humanos ou animais sem excessiva toxicidade, irritação, resposta alérgica ou outro problema ou complicação. Tais sais incluem sais ácidos minerais e orgânicos de resíduos básicos tais como aminas, bem como sais alcalinos ou orgânicos de resíduos acídicos tais como ácidos carboxílicos. Sais farmacêuticos específicos incluem, mas não se limitam a, sais de ácidos como ácido clorídrico, fosfórico, hidrobrômico, málico, glicólico, fumárico, sulfúrico, sulfâmico, sulfanílico, fórmico, toluenossulfônico, metanossulfônico, benzenossulfônico, etanodisulfônico, 2-hidroxietilsulfônico, nítrico, benzóico, 2-acetoxibenzóico, cítrico, tartárico, láctico, esteárico, salicílico, glutâmico, ascórbico, pamóico, succínico, fumárico, maléico, propiônico, hidroximaléico, hidroiódico, fenilacético, alcanóico como acético, HOOC- (CH2)n-COOH onde n é 0-4 e semelhantes. De forma semelhante, cátions farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não se limitam a, sódio, potássio, cálcio, alumínio, lítio e amônio. Os entendidos na arte reconhecerão outro sais farmaceuticamente aceitáveis para os neo-antigênios específicos de tumor agrupados aqui providenciados, incluindo os listados por Remington’s Pharmaceutical Sciences, 17a ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, p. 1418 (1985). Em geral, um ácido ou sal básico farmaceuticamente aceitável pode ser sintetizado a partir de um composto principal que contém uma fração básica ou acídica por meio de qualquer método químico convencional. Resumidamente, tais sais podem ser preparados por reação das formas livre de ácido ou base destes compostos com uma quantidade estequiométrica da base ou ácido apropriado em um solvente apropriado.

[0057] Como aqui usados, os termos "previnem", "prevenindo", "prevenção", "tratamento profilático" e semelhantes, referem-se a reduzir a probabilidade de desenvolvimento de uma doença ou condição em um sujeito que não tem, mas está em risco de ou é suscetível de, desenvolver uma doença ou condição.

[0058] "Conjunto iniciador" significa um conjunto de oligonucleotídeos que podem ser usados, por exemplo, para PCR. Um conjunto iniciador consistiria de pelo menos 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 200, 250, 300, 400, 500, 600 ou mais iniciadores.

[0059] "Proteínas ou moléculas do complexo principal de histocompatibilidade (MHC)", "moléculas MHC", "proteínas MHC" ou "proteínas HLA" devem ser entendidos como significando, em particular, proteínas capazes de ligar peptídeos resultantes da clivagem proteolítica de antigênios de proteína e representando epítopos de célula T potenciais, transportando-os para a superfície da célula e apresentando- os aí a células específicas, em particular a células T ingênuas, linfócitos T citotóxicos ou células adjuvantes T. O complexo principal de histocompatibilidade no genoma compreende a região genética cujos produtos genéticos são expressos na superfície da célula e são importantes para ligar e apresentar antigênios endógenos e/ou estranhos e, assim, para regular processos imunológicos. O complexo principal de histocompatibilidade é classificado em dois grupos genéticos codificando diferentes proteínas: moléculas da classe MHC I e classe MHC II. As moléculas das duas classes MHC são especializadas para diferentes fontes de antigênio. As moléculas da classe MHC I apresentam tipicamente, mas não se restringem a, antigênios sintetizados endogenamente, por exemplo proteínas virais e antigênios tumorais. As moléculas da classe MHC II apresentam antigênios de proteínas originários de fontes exógenas, por exemplo produtos bacterianos. A biologia celular e padrões de expressão das duas classes MHC são adaptadas a estes diferentes papéis.

[0060] Moléculas MHC da classe I consistem de uma cadeia pesada e de uma cadeia leve, e são capazes de ligar um peptídeo de cerca de 8 a 11 aminoácidos, mas normalmente 9 ou 10 aminoácidos, se este peptídeo tiver motivos de ligação adequados, e apresentando-o a linfócitos T citotóxicos. O peptídeo ligado pelas moléculas MHC de classe I tipicamente, mas não exclusivamente, é originário de um antigênio de proteína endógena. A cadeia pesada das moléculas MHC de classe I é preferencialmente um monômero HLA-A, HLA- B ou HLA-C, e a cadeia leve é β-2-microglobulina.

[0061] As moléculas MHC da classe II consistem de uma cadeia α e de uma cadeia β, e são capazes de ligar um peptídeo de cerca de 15 a 24 aminoácidos se este peptídeo tiver motivos de ligação adequados, e apresentando-o a células adjuvantes T. O peptídeo ligado pelas moléculas MHC de classe II normalmente origina de um antigênio de proteína exógena ou extracelular. A cadeia α e a cadeia β são em particular monômeros HLA-DR, HLA-DQ e HLA-DP.

[0062] As gamas providenciadas aqui são entendidas como abrangendo todos os valores dentro da gama. Por exemplo, uma gama de 1 a 50 é entendida como incluindo qualquer número, combinação de números ou sub-gama do grupo consistindo de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, ou 50, bem como todos os valores decimais intervenientes entre os números inteiros anteriormente mencionados como, por exemplo, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, e 1,9. Em relação às sub-gamas, são especificamente contempladas "sub-gamas agrupadas" que se prolongam desde qualquer um dos pontos extremos da gama. Por exemplo, uma sub-gama agrupada de uma gama exemplar de 1 a 50 pode compreender 1 a 10, 1 a 20, 1 a 30, e 1 a 40 em uma direção, ou 50 a 40, 50 a 30, 50 a 20, e 50 a 10 na outra direção.

[0063] Um "receptor" deve ser entendido como significando uma molécula biológica ou um agrupamento de molécula capaz de ligar um ligando. Um receptor pode servir para transmitir informação em uma célula, uma formação de célula ou um organismo. O receptor compreende pelo menos uma unidade de receptor e contém frequentemente duas ou mais unidades receptoras, onde cada unidade receptora pode consistir de uma molécula de proteína, em particular uma molécula de glicoproteína. O receptor tem um estrutura que complementa a estrutura de um ligando e pode complexificar o ligando como um parceiro de ligação. Pode ser transmitida informação de sinalização por alterações conformacionais do receptor a seguir a ligação com o ligando na superfície de uma célula. De acordo com a invenção, um receptor pode referir-se a proteínas particular das classes MHC I e II capazes de formar um complexo de receptor/ligando com um ligando, em particular um peptídeo ou fragmento de peptídeo de comprimento adequado.

[0064] Um "complexo de receptor/ligando" deve ser igualmente entendido como significando um "complexo de receptor/ligando" ou "complexo de receptor/fragmento de peptídeo", em particular uma molécula MHC apresentando um peptídeo ou fragmento de peptídeo da classe I ou classe II.

[0065] Por “reduz” entende-se uma alteração negativa de pelo menos 10%, 25%, 50%, 75%, ou 100%.

[0066] Por "referência" entende-se uma condição padrão ou de controle.

[0067] Uma "sequência de referência" é uma sequência definida usada como uma base para comparação de sequências. Uma sequência de referência pode ser um subconjunto de, ou a totalidade de, uma sequência especificada; por exemplo, um segmento de uma sequência cDNA de comprimento total ou sequência genômica; ou a sequência cDNA ou genômica completa. Para polipeptídeos, o comprimento da sequência de polipeptídeo de referência será geralmente de pelo menos cerca de 10-2000 aminoácidos, 10-1500, 10-1000, 10-500, ou 10-100. De preferência, o comprimento da sequência de polipeptídeo de referência pode ser pelo menos cerca de 1050 aminoácidos, mais preferencialmente pelo menos 10-40 aminoácidos e ainda mais preferencialmente cerca de 10-30 aminoácidos, cerca de 10-20 aminoácidos, cerca de 15-25 aminoácidos ou cerca de 20 aminoácidos. Para ácidos nucléicos, o comprimento da sequência de ácido nucleico de referência será geralmente de pelo menos cerca de 50 nucleotídeos, de preferência pelo menos cerca de 60 nucleotídeos, mais preferencialmente pelo menos cerca de 75 nucleotídeos, e ainda mais preferencialmente cerca de 100 nucleotídeos ou cerca de 300 nucleotídeos ou qualquer número inteiro próximo ou entre eles.

[0068] Por "liga especificamente" entende-se um composto ou anticorpo que reconhece e liga um polipeptídeo da invenção, mas que não reconhece nem liga substancialmente outras moléculas em uma amostra, por exemplo, uma amostra biológica.

[0069] Moléculas de ácido nucleico úteis nos métodos da invenção incluem qualquer molécula de ácido nucleico que codifique um polipeptídeo da invenção ou um seu fragmento. Tais moléculas de ácido nucleico não necessitam de ser 100 % idênticas a uma sequência de ácido nucleico endógena, mas exibirão tipicamente identidade substancial. Polinucleotídeos tendo "identidade substancial" a uma sequência endógena são tipicamente capazes de hibridar com pelo menos uma cadeia de uma molécula de ácido nucleico de fita dupla. Por "hibridar" entende-se emparelhar para formar uma molécula de fita dupla entre sequências de polinucleotídeo complementares (por exemplo, um gene descrito aqui), ou suas porções, sob várias condições de estringência. (Ver, por exemplo, Wahl, G. M. e S. L. Berger (1987) Methods Enzymol. 152:399; Kimmel, A. R. (1987) Methods Enzymol. 152:507).

[0070] Por exemplo, a concentração de sal estringente será normalmente inferior a cerca de 750 mM de NaCl e 75 mM de citrato trissódico, de preferência inferior a cerca de 500 mM de NaCl e 50 mM de citrato trissódico e mais preferencialmente inferior a cerca de 250 mM de NaCl e 25 mM de citrato trissódico. Pode ser obtida hibridação de baixa estringência na ausência de um solvente orgânico, por exemplo formamida, enquanto a hibridação de alta estringência pode ser obtida na presença de pelo menos cerca de 35% de formamida, e mais preferencialmente pelo menos cerca de 50% de formamida. Condições de temperatura estringentes incluirão normalmente temperaturas de pelo menos cerca de 30 °C, mais preferencialmente pelo menos cerca de 37 °C, e muito preferencialmente pelo menos cerca de 42 °C. Parâmetros variáveis adicionais, como o tempo de hibridação, a concentração de detergente, por exemplo, dodecil sulfato de sódio (SDS), e a inclusão ou exclusão de DNA transportador, são bem conhecidos dos entendidos na técnica. São alcançados vários níveis de estringência ao combinar estas várias condições conforme necessário. Em uma forma de realização preferencial, a hibridação ocorrerá a 30 °C em 750 mM de NaCl, 75 mM citrato trissódico e 1% de SDS. Em uma forma de realização mais preferencial, a hibridação ocorrerá a 37 °C em 500 mM de NaCl, 50 mM de citrato trissódico, 1% de SDS, 35% formamida, e 100 μg/ml de DNA de esperma de salmão desnaturado (ssDNA). Em uma forma de realização muito preferencial, a hibridação ocorrerá a 42 °C em 250 mM de NaCl, 25 mM de citrato trissódico, 1% de SDS, 50% formamida, e 200 μg/ml de ssDNA. Variações úteis destas condições serão facilmente aparentes aos entendidos na técnica.

[0071] Para a maior parte das aplicações, as etapas de lavagem que se seguem à hibridação também variarão em estringência. As condições de estringência de lavagem podem ser definidas por concentração de sal e por temperatura. Como acima, a estringência de lavagem pode ser aumentada diminuindo a concentração de sal ou aumentando a temperatura. Por exemplo, a concentração de sal estringente para as etapas de lavagem será de preferência inferior a cerca de 30 mM de NaCl e 3 mM de citrato trissódico e mais preferencialmente inferior a cerca de 15 mM de NaCl e 1,5 mM de citrato trissódico. Condições de temperatura estringentes para as etapas de lavagem incluirão normalmente uma temperatura de pelo menos cerca de 25 °C, mais preferencialmente de pelo menos cerca de 42 °C, e ainda mais preferencialmente de pelo menos cerca de 68 °C. Em uma forma de realização preferencial, as etapas de lavagem ocorrerão a 25 °C em 30 mM de NaCl, 3 mM de citrato trissódico e 0,1% de SDS. Em uma forma de realização mais preferencial, as etapas de lavagem ocorrerão a 42 °C em 15 mM de NaCl, 1,5 mM de citrato trissódico e 0,1% de SDS. Em uma forma de realização mais preferencial, as etapas de lavagem ocorrerão a 68 °C em 15 mM de NaCl, 1,5 mM de citrato trissódico e 0,1% de SDS. Variações adicionais destas condições serão facilmente aparentes aos entendidos na técnica. As técnicas de hibridação são bem conhecidas dos entendidos na técnica e são descritas, por exemplo, em Benton e Davis (Science 196:180, 1977); Grunstein e Hogness (Proc. Natl. Acad. Sci., USA 72:3961, 1975); Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, Nova Iorque, 2001); Berger e Kimmel (Guide to Molecular Cloning Techniques, 1987, Academic Press, Nova Iorque); e Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nova Iorque.

[0072] Por "substancialmente idêntico" entende-se um polipeptídeo ou molécula de ácido nucleico exibindo pelo menos 50% de identidade com uma sequência de aminoácidos de referência (por exemplo, qualquer umas das sequência de aminoácidos aqui descritas) ou sequência de ácido nucleico (por exemplo, qualquer uma das sequências de ácido nucleico aqui descritas). De preferência, uma tal sequência é pelo menos 60%, mais preferencialmente 80% ou 85% e mais preferencialmente 90%, 95% ou mesmo 99% idêntica, ao nível de aminoácidos ou de ácido nucleico, com a sequência usada para comparação.

[0073] A identidade de sequência é tipicamente medida usando software de análise de sequência (por exemplo, Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705, BLAST, BESTFIT, GAP, ou programas PILEUP/PRETTYBOX). Tal software faz corresponder sequências idênticas ou semelhantes atribuindo graus de homologia a várias substituições, deleções e/ou outras modificações. Substituições conservadoras incluem tipicamente substituições dentro dos seguintes grupos: glicina, alanina; valina, isoleucina, leucina; ácido aspártico, ácido glutâmico, asparagina, glutamina; serina, treonina; lisina, arginina; e fenilalanina, tirosina. Em uma abordagem exemplar para determinar o grau de identidade, pode ser usado um programa BLAST com uma pontuação de probabilidade entre e-3 e e-100 indicando uma sequência intimamente relacionada.

[0074] Um "epítopo de célula T" deve ser entendido como significando uma sequência de peptídeo que pode ser ligada por moléculas MHC da classe I ou II sob a forma de uma molécula MHC ou complexa MHC apresentando peptídeo e depois, em esta forma, ser reconhecido e ligado por células T ingênuas, linfócitos T citotóxicos ou células T adjuvantes.

[0075] Como aqui usados, os termos "tratar", "tratado", "tratamento" e semelhantes referem-se a reduzir ou melhorar um distúrbio e/ou sintomas associados a ele (por exemplo, uma neoplasia ou tumor). Será apreciado que, apesar de não excluído, tratar um distúrbio ou problema de saúde não exige que o distúrbio, problema de saúde ou sintomas associados a eles sejam completamente eliminados.

[0076] O termo "efeito terapêutico" refere-se a alguma medida de alívio de um ou mais sintomas de um distúrbio (por exemplo, uma neoplasia ou tumor) ou da sua patologia associada. "Quantidade terapeuticamente eficaz" como aqui usado refere-se a uma quantidade de um agente que é eficaz, após administração única ou em doses múltiplas à célula ou paciente, no prolongamento da sobrevivência do paciente com um tal distúrbio, reduzindo um ou mais sinais ou sintomas do distúrbio, prevenindo ou atrasando a doença e semelhantes para lá do esperado na ausência de um tal tratamento. "Quantidade terapeuticamente eficaz" destina-se a qualificar a quantidade necessária para alcançar um efeito terapêutico. Um médico ou veterinário com perícia ordinária na técnica pode prontamente determinar e prescrever a "quantidade terapeuticamente eficaz" (por exemplo, ED50) da composição farmacêutica necessária. Por exemplo, o médico ou veterinário pode iniciar as doses dos compostos da invenção usados em uma composição farmacêutica a níveis inferiores aos necessários por forma a alcançar o desejado efeito terapêutico e gradualmente aumentar a dosagem até o efeito desejado ser alcançado.

[0077] As composições farmacêuticas tipicamente devem providenciar uma dosagem desde cerca de 0,0001 mg a cerca de 200 mg do composto por quilograma de peso corporal por dia. Por exemplo, doses para administração sistêmica a um paciente humano podem ir desde 0,01-10 μg/kg, 20-80 μg/kg, 5-50 μg/kg, 75-150 μg/kg, 100-500 μg/kg, 250-750 μg/kg, 5001000 μg/kg, 1-10 mg/kg, 5-50 mg/kg, 25-75 mg/kg, 50-100 mg/kg, 100-250 mg/kg, 50-100 mg/kg, 250-500 mg/kg, 500-750 mg/kg, 750-1000 mg/kg, 1000-1500 mg/kg, 1500-2000 mg/kg, 5 mg/kg, 20 mg/kg, 50 mg/kg, 100 mg/kg, ou 200 mg/kg. Formas de unidade de dosagem farmacêutica são preparadas para providenciar desde cerca de 0,001 mg a cerca de 5000 mg, por exemplo desde cerca de 100 a cerca de 2500 mg do composto ou uma combinação de ingredientes essenciais por forma de unidade de dosagem.

[0078] Uma "vacina" deve ser entendida como significando uma composição para gerar imunidade para a profilaxia e/ou tratamento de doenças (por exemplo, neoplasia/tumor). Em conformidade, as vacinas são medicamentos que compreendem antigênios e destinam-se a ser usadas em humanos ou animais para gerar defesa específica e substância protetora por vacinação.

[0079] A recitação de uma listagem de grupos químicos em qualquer definição de uma variável aqui inclui definições dessa variável como qualquer grupo único ou combinação de grupos listados. A recitação de uma forma de realização para uma variável ou aspeto aqui inclui essa forma de realização como qualquer forma de realização única ou em combinação com quaisquer outras formas de realização ou suas porções.

[0080] Quaisquer composições ou métodos aqui providenciados podem ser combinados com um ou mais de qualquer das outras composições e métodos aqui providenciados.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0081] O acima mencionado e outras características e vantagens da presente revelação serão melhor entendidos ao ler a descrição detalhada que se segue tomada em conjunto com as seguintes figuras, nas quais:

[0082] A Figura 1 representa um fluxograma para fazer uma vacina personalizada contra o câncer de acordo com uma forma de realização exemplar da invenção.

[0083] A Figura 2 mostra um fluxograma para etapas de pré-tratamento para gerar uma vacina contra o câncer para um paciente com melanoma de acordo com uma forma de realização exemplar da invenção.

[0084] A Figura 3 é um fluxograma representando uma abordagem para abordar um estudo inicial de população de pacientes de acordo com uma forma de realização exemplar da invenção. Cinco pacientes podem ser tratados no primeiro grupo com um nível de dose seguro antecipado. Se menos do que dois destes cinco pacientes desenvolverem uma toxicidade limitativa de dose no, ou antes do, primeiro ponto final de segurança primário, então podem ser recrutados mais 10 pacientes a esse nível de dose para expandir a análise da população de pacientes (por exemplo, para avaliar a eficácia, segurança, etc.). Se foram observadas duas ou mais toxicidades limitativas (DLTs), então a dose de poli-ICLC pode ser reduzida em 50% e os cinco pacientes adicionais podem ser tratados. Se menos do que dois destes pacientes desenvolverem uma toxicidade limitativa de dose então podem ser recrutados mais 10 pacientes a esse nível de dose. Contudo, se dois ou mais pacientes no nível reduzido de poli- ICLC desenvolverem uma DLT, então o estudo será interrompido.

[0085] As Figuras 4A e 4B mostram exemplos de diferentes tipos de mutações discretas e neoORFs, respectivamente.

[0086] A Figura 5 ilustra um calendário de imunização com base em uma estratégia de reforço inicial de acordo com uma forma de realização exemplar da invenção. Podem ocorrer múltiplas imunizações ao longo das primeiras ~3 semanas para manter uma exposição a antigênio elevada inicial durante a fase de iniciação da resposta imunitária. Os pacientes podem então descansar por oito semanas para permitir que as células T de memória se desenvolvam e estas células T serão então reforçadas para manter uma forte resposta contínua.

[0087] A Figura 6 mostra uma linha temporal indicando o ponto final imunológico primário de acordo com um aspeto exemplar da invenção.

[0088] A Figura 7 ilustra uma linha temporal para administrar uma co-terapia com anticorpos de bloqueio de ponto de verificação para avaliar a combinação de alívio de supressão imunitária local acoplada com a estimulação de nova imunidade de acordo com uma forma de realização exemplar da invenção. Como mostrado no esquema, os pacientes que entram como candidatos apropriados para terapia de bloqueio de ponto de verificação, por exemplo, anti-PDL1 como aqui mostrado, podem entrar e ser imediatamente tratados com anticorpos, enquanto a vacina está a ser preparada. Os pacientes podem então ser vacinados. A dosagem de anticorpos de bloqueio de ponto de verificação pode ser continuada ou possivelmente adiada enquanto a fase de iniciação da vacinação ocorre.

[0089] A Figura 8 é uma tabela que mostra as atribuições de classificação para diferentes mutações neo- antigênicas de acordo com uma forma de realização exemplar da invenção.

[0090] A Figura 9 mostra um esquema representando processamento de produto farmacêutico de peptídeos neo- antigênicos individuais em conjuntos de 4 subgrupos de acordo com uma forma de realização exemplar da invenção.

[0091] A Figura 10 mostra uma representação esquemática de uma estratégia para descobrir sistematicamente neo-antigênios tumorais de acordo com uma forma de realização exemplar da invenção. Mutações específicas de tumor em amostras de câncer podem ser detectadas usando sequenciação de exoma total (WES) ou de genoma total (WGS) e identificadas através da aplicação de algoritmos propiciadores de mutação (por exemplo, Mutect). Subsequentemente, neoepítopos candidatos podem ser previstos usando algoritmos bem validados (por exemplo, NetMHCpan) e sua identificação pode ser refinada por validação experimental para ligação HLA de peptídeo e por confirmação de expressão de gene no nível RNA. Estes neo-antigênios candidatos podem ser subsequentemente testados quanto à sua capacidade de estimular respostas de célula T específicas de tumor.

[0092] As Figuras 11A-C mostram a frequência de classes de mutações pontuais que têm o potencial de gerar neo-antigênios em leucemia linfóide crônica (CLL). A análise de dados WES e WGS gerados a partir de 91 casos de CLL revela que (A) mutações de sentido trocado são a classe mais frequente de alterações somáticas com o potencial de gerar neo-epítopos, enquanto (B) inserções e deleções de deslocamento de quadro de leitura e (C) mutações de local de união constituem eventos menos comuns.

[0093] As Figuras 12A-D representam a aplicação do algoritmo de previsão NetMHCpan para neoepítopos definidos funcionalmente e casos de CLL. A FIG. 12A mostra a ligação prevista (IC50) aos seus alelos HLA restritivos conhecidos de 33 neoepítopos de câncer funcionalmente identificados reportados na literatura testados por NetMHCpan, ordenados com base na afinidade de ligação prevista. A FIG. 12B mostra a distribuição do número de peptídeos previstos com afinidade de ligação HLA < 150 nM (negro) e 150-500 nM (cinzento) em 31 pacientes de CLL com informação de tipagem de HLA. A FIG. 12C mostra um gráfico comparando a ligação prevista (IC50 < 500 nM por NetMHCpan) de peptídeos de 4 pacientes com a afinidade de ligação determinada experimentalmente para ligação de alelos HLA-A e -B usando um ensaio de ligação de alelos MHC I competitivo com peptídeos sintetizados. É indicada a porcentagem de peptídeos previstos com evidência de ligação experimental (IC50 < 500 nM). A FIG. 12D mostra que de 26 pacientes de CLL para os quais estiveram disponíveis tipagem de HLA e dados de expressão de gene Affymetrix U133 2.0+ a distribuição da expressão de gene foi examinada para todos os genes mutados somaticamente (n=347), e para o subconjunto de neoepítopos codificando mutações de gene com pontuações de ligação de HLA previstas de IC50 < 500 nM (n=180). No-baixo: genes dentro da expressão de quartil mais baixo; médio: genes dentro dos 2 quartis médios de expressão; e elevado: genes dentro do quartil de expressão mais elevado.

[0094] As Figuras 13A-B mostram os mesmo dados da Figura 12D mas separadamente para peptídeos 9-mer (Fig. 13A) e 10-mer (Fig. 13B). Em cada caso, são indicadas as porcentagens de peptídeos com IC50 < 150 nM e 150-500 nM previsto, com evidência de ligação experimental.

[0095] As Figuras 14A-C mostram que as mutações ALMS1 e C6ORF89 em PT 1 geram peptídeos imunogênicos. A FIG. 14A mostra que 25 mutações de sentido trocado foram identificadas em células de CLL do Pt 1, das quais 30 peptídeos de 13 mutações foram previstos para ligar a alelos de classe MHC I do Pt 1. Foram confirmados experimentalmente um total de 14 peptídeos de 9 mutações como de ligação HLA. Células T pós-transplante (7 anos) de Pt 1 foram estimuladas semanalmente ex vivo por 4 semanas com 5 grupos de 6 peptídeos mutados com ligação HLA prevista semelhante, por grupo, e subsequentemente testadas por ensaio IFN-y ELISPOT. A FIG. 14B mostra que secreção aumentada de IFN-Y por células T foi detectada contra peptídeos do Grupo 2. Controle negativo - peptídeo de taxa irrelevante:controle positivo - PHA. A FIG. 14C mostra que dos peptídeos do Grupo 2, as células T do Pt 1 foram reativas a peptídeos mutados ALMS1 e C6ORF89 (painel direito; são apresentados resultados médios de poços duplicados) Painel esquerdo - os resultados IC50 previstos e experimentais (nM) de peptídeos mutados ALMS1 e C6ORF89.

[0096] A Figura 15 ilustra que no contexto de sequência em volta dos locais de mutações e FNDC3B, C6orf89 e ALMS1 falta conservação evolucionária. Os neoepítopos gerados de cada um dos genes encontram-se dentro de caixas. Vermelho - aminoácidos conservados (aa) em todas as 4 espécies; azul- aa conservados em pelo menos 2 de 4 espécies; negro- conservação ausente em todas as espécies.

[0097] A Figura 16 mostra localização de mutações somáticas reportadas em genes FNDC3B, C6orf89 e ALMS1. Mutações de sentido trocado identificadas em FNDC3B, C6orf89 e ALMS1 em Pts 1 e 2 com CLL em comparação com as mutações somáticas anteriormente reportadas em estes genes (base de dados COSMIC) em todos os cânceres.

[0098] A Figura 17 mostra que FNDC3B mutado gera um neoepítopo imunogênico no Pt 2. A FIG. 17A mostra que 26 mutações de sentido trocado foram identificadas em células de CLL do Pt 2 das quais 37 peptídeos de 16 mutações foram previstos para ligar a alelos de classe MHC I do Pt 2. Foi confirmada experimentalmente a ligação de um total de 18 peptídeos de 12 mutações. Células T pós-transplante (~3 anos) do Pt 2 foram estimuladas com DCs autólogas ou células B pulsadas com 3 grupos de peptídeos mutados de ligação validados experimentalmente (total de 18 peptídeos) por 2 semanas ex vivo (ver a tabela S6). A FIG. 17B mostra secreção aumentada de IFN-y detectada por ensaio ELISPOT em células T estimuladas com peptídeos do Grupo 1. A FIG. 17C mostra que dos peptídeos do Grupo 1, foi detectada secreção IFN-Y aumentada contra o peptídeo mut-FNDC3B (painel inferior; são apresentados resultados médios de poços duplicados). Painel superior- resultados previstos e experimentais de IC50 de peptídeos FNDC3B mut- e wt. A FIG. 17D ilustra que as células T reativas a FNDC3B-mut demonstram especificidade ao epítopo mutado mas não ao peptídeo de tipo selvagem correspondente (concentrações: 0,1-10 μg/ml), e são polifuncionais e secretoras de IFN-y, GM-CSF e IL-2 (testes de Tukey post-hoc de modelação ANOVA de duas vias para comparações entre reatividade de célula T contra peptídeo mu vs wt). A FIG. 17E mostra que células T específicas de FNDC3B-Mut são reativas em uma maneira restringida por classe I (esquerda) e reconhecem uma forma endogenamente processada e apresentada de FNDC3B mutado, uma vez que reconhecem APCs de HLA-A2 transfectados com um plasmídeo codificando um minigene de 300bp abrangendo a mutação FNDC3B (direita) (teste t de dois lados). Em cima, à direita - expressão confirmada por análise western blot de minigenes codificando mut- e wt- FNDC3B A FIG. 17F mostra que células T reconhecendo o epítopo mut-FNDC3B como detectado por tetrâmeros HLA-A2+/mut FNDC3B são mais frequentemente detectadas em células T no Pt 2 em comparação com células T de um dador normal. A FIG. 17G mostra expressão de FNDC3B (com base em dados de matriz Affymetrix U133Plus2) no Pt 2 (triângulo), células B de CLL (n=182) e células B CD19+ normais de adultos voluntários saudáveis (n=24).

[0099] A Figura 18 ilustra a cinética da resposta de célula T específica de mut-FNDC3B em relação ao curso do transplante. A FIG. 18 mostra a carga tumoral molecular medida no Pt 2 usando um ensaio Taqman PCR específico de tumor do paciente com base na sequência lgH clonotípica em pontos temporais em série antes e após HSCT (painel superior). Painel intermédio - Detecção de células T reativas a mut-FNDC3B em comparação com wt-FNDC3B ou peptídeos irrelevantes de sangue periférico antes e após alo-HSCT por IFN-y ELISPOT a seguir a estimulação com células B autólogas pulsadas com peptídeos. O número de pontos secretores IFN-y por células a cada ponto temporal foi medido em triplicado (teste t Welch; mut vs. wt). Inserto - secreção IFN-Y de células T a partir de 6 meses após HSCT (roxo) em comparação com 32 meses após HSCT (vermelho) a seguir a exposição a APCs pulsados com 0,1-10 μg/ml (escala logarítmica) de peptídeo mut-FNDC3B. Painel inferior - Detecção de células TCR Vb11 específicas de mut-FNDC3B por CDR3 PCR agrupado específico de clone antes e após HSCT em sangue periférico do Pt 2 (ver métodos suplementares). Triângulos - ponto temporais nos quais uma amostra é testada; NA- sem amplificação; negro: detectada amplificação, onde ‘+’ indica amplificação detectável até 2 vezes e ‘++’ indica mais do que 2 vezes maior amplificação do que o nível mediano de todas as amostras com expressão detectável da sequência Vb11 especifica do clone.

[00100] As Figuras 19A-D mostram o desenho de iniciadores específicos de TCR Vb específicos de mut-FNDC3B em Pt 2. A FIG. 19A mostra células T específicas de mut- FNDC3B detectadas e isoladas de PBMCs do Pt 2 6 meses após HSCT usando um ensaio de captura IFN- Y. A FIG. 19B mostra que RNA de células T FNDC3B-reactivas expressou TCR Vb11, gerando um amplicon de 350bp de comprimento. A FIG. 19C mostra iniciadores de tempo real específicos de Vb11 concebidos com base na sequência do rearranjo de CDR3 específico de clone de mut-FNDC3B de forma que a sonda PCR quantitativa foi posicionada na região de diversidade juncional (laranja). A FIG. 19D mostra que as células T FNDC3B-reativas foram monoclonais para Vb11, como detectadas por espectrotipagem.

[00101] As Figuras 20A-G ilustram a aplicação do pipeline de descobertas de neo-antigênios em todos os cânceres. A FIG. 20A mostra a comparação da taxa de mutação somática global detectada em todos os cânceres por sequenciação paralela massiva. Vermelho-Cll; azul- carcinoma das células renais claras (RCC) e verde- melanoma. LSCC: Carcinoma das células escamosas do pulmão, AdCa pulmonar Adenocarcinoma pulmonar, ESO AdCa: Adenocarcinoma do esófago, DLBCL: Linfoma difuso de grandes células B, GBM: Glioblastoma, RCC papilar: Carcinoma papilar das células renais, RCC de Células Claras: Carcinoma das células renais claras, CLL: Leucemia linfóide crônica, AML: Leucemia mielóide aguda. A distribuição da Fig. 20B mostra o número de mutações de sentido trocado, de deslocamento de quadro de leitura e local de união por caso em melanoma, RCC de células clara e CLL, a Fig. 20C mostra o comprimento médio de neoORF gerado por amostra e a Fig. 20D mostra os neopeptídeos previstos com IC50 < 150 nM (linhas tracejadas) e < 500 nM (linhas sólidas) gerados a partir de mutações de sentido trocado e de deslocamento de quadro de leitura. A FIG. 20E mostra as distribuições (mostradas por box plot (parcela de caixa)) do número de mutações de sentido trocado, de deslocamento de quadro de leitura e local de união, por caso, em 13 cânceres. A FIG. 20F mostra o comprimento somado de neoORF gerado por amostra. A FIG. 20G mostra os neopeptídeos previstos com IC50 < 150 nM e com < 500 nM gerados a partir de mutações de sentido trocado e de deslocamento de quadro de leitura. Para todas as parcelas de caixa, a extremidades esquerda e direita das caixas representam os valores de percentil 25 e 75, respectivamente, enquanto o segmento do meio é a mediana. Os extremos esquerdo e direto das barras prolongam-se para os valores mínimo e máximo.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[00102] A presente invenção se relaciona com estratégias personalizadas de tratamento da neoplasia, e mais particularmente tumores, administrando uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica (por exemplo, uma vacina contra o câncer) compreendendo uma pluralidade de neo-antigênios específicos de neoplasia/tumor a um sujeito (por exemplo, um mamífero como um humano). Como descrito em maior detalhe em baixo, a presente invenção se baseia, pelo menos em parte, na descoberta de que a sequenciação genoma/exoma pode ser usada para identificar todos, ou quase todos, os neo-antigênios mutados que estão singularmente presentes em uma neoplasia/tumor de um paciente individual, e que esta coleção de neo-antigênios mutados pode ser analisada para identificar um subconjunto específico otimizado de neo-antigênios para uso como uma vacina personalizada contra o câncer para o tratamento da neoplasia/tumor do paciente. Por exemplo, como mostrado na FIG. 1, uma população de neo-antigênios específicos de neoplasia/tumor pode ser identificada sequenciando a neoplasia/tumor e DNA normal de cada paciente para identificar mutações específicas do tumor, e determinar o alótipo de HLA do paciente. A população de neo-antigênios específicos de neoplasia/tumor e os seus antigênios nativos cognatos pode então ser submetida a análise bioinformática usando algoritmos validados para prever quais as mutações específicas de tumor que criam epítopos que se poderiam ligar ao alótipo de HLA do paciente, e em particular qais as mutações específicas de turmo que criam epítopos que se poderiam ligar ao alótipo HLA do paciente mais eficazmente do que o o antigênio nativo cognato. Com base em esta análise, pode ser concebida e sintetizada para cada paciente uma pluralidade de peptídeos correspondendo a um subconjunto dessas mutações, e agrupadas para utilização como uma vacina contra o câncer na imunização do paciente. Os peptídeos de neo-antigênios podem ser combinados com um adjuvante (por exemplo, poli-ICLC) ou outro agente anti-neoplásico. Sem estar limitado pela teoria, espera-se que estes neo- antigênios contornem a tolerância central tímica (permitindo assim uma resposta anti-tumoral da célula T mais forte), ao mesmo tempo que reduzem o potencial de autoimunidade (por exemplo, evitando o direcionamento a auto-antigênios normais).

[00103] O sistema imunitário pode ser classificado em dois subsistemas funcionais: o sistema imunitário inato e o adquirido. O sistema imunitário inato é a primeira linha de defesa contra infeções e a maior parte dos potenciais patógenos são rapidamente neutralizados por esse sistema antes que possam causar, por exemplo, uma infeção visível. O sistema imunitário adquirido reage a estruturas moleculares, referidas como antigênios, do organismo intruso. Há dois tipos de reações imunitárias adquiridas que incluem a reação imunitária humoral e a reação imunitária mediada por células. Na reação imunitária humoral, os anticorpos segregados por células B para os fluidos corporais ligam-se a antigênios derivados de patógenos, conduzindo à eliminação do patógeno através de vários mecanismos, por exemplo lise mediada por complemento. Na reação imunitária mediada por células, são ativadas células T capazes de destruir outras células. Por exemplo, se proteínas associadas a uma doença estiverem presentes em uma célula, elas são fragmentadas proteoliticamente em peptídeos dentro da célula. Proteínas celulares específicas ligam-se então ao antigênio ou peptídeo formado deste forma e transportam-nos para a superfície da célula, onde são apresentados aos mecanismos de defesa molecular, em particular as células T, do corpo. As células T citotóxicas reconhecem estes antigênios e matam as células que acolhem os antigênios.

[00104] As moléculas que transportam e apresentam peptídeos na superfície da célula são referidas como proteínas do complexo principal de histocompatibilidade (MHC). Proteínas MHC são classificadas em dois tipos, referidas como classe MHC I e classe MHC II. As estruturas das proteínas das duas classes MHC são muito semelhantes; contudo, elas têm funções muito diferentes. As proteínas da classe MHC I estão presentes na superfície de quase todas as células do corpo, incluindo células tumorais. As proteínas da classe MHC I são carregadas com antigênios que normalmente originam de proteínas endógenas ou de patógenos presentes no interior das células, e são então apresentadas a linfócitos T ingênuos ou citotóxicos (CTLs). As proteínas de classe MHC II estão presentes em células dendríticas, linfócitos B, macrófagos e outras células apresentando antigênios. Elas apresentam sobretudo peptídeos, que são processados a partir de fontes de antigênio externas, ou seja, exteriores às células, a células T adjuvantes (Th). A maior parte dos peptídeos ligados pelas proteínas da classe MHC I são originários de proteínas citoplásmicas produzidas nas células hospedeiras saudáveis de um organismo em si, e normalmente não estimulam uma reação imunitária. Em conformidade, linfócitos T citotóxicos que reconhecem tais moléculas MHC de classe I apresentando auto-peptídeos são deletados no timo (tolerância central) ou, após a sua liberação do timo, são deletados ou inativados, ou seja tolerizados (tolerância periférica). As moléculas MHC são capazes de estimular uma reação imunitária quando apresentam peptídeos a linfócitos T não tolerizados. Os linfócitos T citotóxicos possuem receptores de célula T (TCR) e moléculas CD8 na sua superfície. Os receptores de célula T são capazes de reconhecer e ligar peptídeos complexados com as moléculas da classe MHC I. Cada linfócito T citotóxico expressa um receptor de célula T único que é capaz de ligar complexos MHC/peptídeo específicos.

[00105] Os antigênios de peptídeo ligam-se às moléculas da classe MHC I por ligação de afinidade competitiva dentro do retículo endoplasmático, antes de serem apresentados à superfície da célula. Aqui, a afinidade de um antigênio de peptídeo individual está diretamente ligada à sua sequência de aminoácidos e à presença de motivos de ligação específicos em posições definidas dentro da sequência de aminoácidos. Se a sequência de um tal peptídeo for conhecida, é possível manipular o sistema imunitário contra células doentes usando, por exemplo, vacinas de peptídeos.

[00106] Uma das barreiras críticas ao desenvolvimento de imunoterapias curativas e específicas de tumor é a identificação e seleção de antigênios tumorais limitados e altamente específicos para evitar a autoimunidade. Neo- antigênios tumorais, que surgem como resultado de alteração genética (por exemplo, inversões, translocações, deleções, mutações de sentido trocado, mutações de local de união, etc.) dentro de células malignas, representam a classe de antigênios mais específica de tumor. Os neo-antigênios raramente foram usados em vacinas contra o câncer devido a dificuldades técnicas na sua identificação, na seleção de neo-antigênio otimizados e na produção de neo-antigênios para utilização em uma vacina. De acordo com a presente invenção, estes problemas podem ser resolvidos da seguinte forma:

[00107] • identificar todas, ou quase todas, as mutações na neoplasia/tumor ao nível do DNA usando o genoma completo, exoma completo (por exemplo, apenas éxons capturados) ou sequenciação de RNA de tumor versus amostras de linha germinal correspondidas;

[00108] • analisar as mutações identificadas com um ou mais algoritmos de previsão de ligação peptídeo-MHC para gerar uma pluralidade de epítopos candidatos de célula T de neo-antigênios que são expressos dentro da neoplasia/tumor e se podem ligar a alelos HLA do paciente; e

[00109] • sintetizar a pluralidade de peptídeos candidatos de neo-antigênios selecionados dos conjuntos de todos os peptídeos neoORF e peptídeos de ligação previstos para utilização em uma vacina contra o câncer.

[00110] Por exemplo, traduzir informação de sequenciação para uma vacina terapêutica pode incluir:

[00111] (1) Previsão de peptídeos mutados pessoais que se podem ligar a moléculas HLA do indivíduo. Escolher com eficiência quais as mutações particulares a utilizar como imunogênio requer a identificação do tipo de HLA do paciente e a capacidade de prever que peptídeos mutados se ligariam com eficiência aos alelos HLA do paciente.Recentemente, abordagens de aprendizagem de base em rede neural com peptídeos de ligação e de não ligação validados promoveram avanços na precisão de algoritmos de previsão para os principais alelos HLA-A e -B.

[00112] (2) Formular o fármaco como uma vacina multi- epítopo de peptídeos longos. Tomar como alvo o máximo de epítopos mutados possível aproveita a enorme capacidade do sistema imunitário, evita a oportunidade de escape imunológico por modulação por baixo de um produto genético imunodirecionado em particular e compensa a conhecida imprecisão de abordagens de previsão de epítopos. Peptídeos sintéticos providenciam um meio particularmente útil de preparar eficientemente múltiplos imunogênios e de traduzir rapidamente a identificação de epítopos mutantes em uma vacina eficaz. Os peptídeos podem ser prontamente sintetizados quimicamente e facilmente purificados usando reagentes livres de bactérias contaminantes ou substâncias animais. O tamanho pequeno permite um foco claro na região mutada da proteína e também reduz competição antigênica irrelevante de outros componentes (proteína não mutada ou antigênios de vetor viral).

[00113] (3) Combinação com um adjuvante de vacina forte. As vacinas eficazes requerem um adjuvante forte para iniciar uma resposta imunitária. Como descrito em baixo, poli-ICLC, um agonista de TLR3 e os domínios de helicase de RNA de MDA5 e RIG3 mostraram várias propriedades desejáveis para um adjuvante de vacina. Estas propriedades incluem a indução de ativação local e sistêmica de células imunes in vivo, produção de quimiocinas e citocinas estimulantes e estimulação de apresentação de antigênio por DCs. Além disso, poli-ICLC pode induzir respostas CD4+ e CD8+ duráveis em humanos. De forma importante, foram observadas semelhanças notáveis na regulação para cima de vias transcricionais e de transdução de sinal em sujeitos vacinados com poli-ICLC e em voluntários que tinham recebido a vacina da febre amarela altamente eficaz capaz de replicação. Além disso, >90% dos pacientes com carcinoma dos ovários imunizados com poli-ICLC em combinação com uma vacina de peptídeos NY-ESO-1 (para além de Montanide) mostraram indução de célula T CD4+ e CD8+, bem como respostas de anticorpos ao peptídeo em um recente estudo da fase 1. Ao mesmo tempo, poli-ICLC tem sido amplamente testada em mais de 25 ensaios clínicos realizados até à data e exibiram um perfil de toxicidade relativamente benigno.

[00114] As vantagens acima descritas da invenção são descritas em maior detalhe de seguida.

Identificação de Mutações de Neo-Antigênios Específicos de Tumor

[00115] A presente invenção baseia-se, pelo menos em parte, na capacidade de identificar todas, ou quase todas, as mutações dentro de uma neoplasia/tumor (por exemplo, translocações, inversões, deleções e inserções grandes e pequenas, mutações de sentido trocado, mutações de local de união, etc.). Em particular, estas mutações estão presentes no genoma de células de neoplasia/tumor de um sujeito, mas não no tecido normal do sujeito. Tais mutações são de particular interesse se conduzirem a alterações que resultem em uma proteína com uma sequência de aminoácidos alterada que é única da neoplasia/tumor do paciente (por exemplo, um neo-antigênio). Por exemplo, mutações úteis podem incluir: (1) mutações não sinônimas conduzindo a diferentes aminoácidos na proteína; (2) mutações read-through nas quais um códon de paragem é modificado ou deletado, conduzindo a tradução de uma proteína mais longa com uma nova sequência específica de tumor no terminal C; (3) mutações de local de união que conduzem à inclusão de um íntron no mRNA maduro e assim a uma sequência de proteína específica de tumor única; (4) rearranjos cromossomais que dão azo a uma proteína quimérica com sequências específicas de tumor na junção de 2 proteínas (ou seja, fusão de gene); (5) mutações ou deleções de deslocamento de quadro de leitura que conduzem a um novo quadro de leitura aberta com uma nova sequência de proteína específica de tumor; e semelhantes. Peptídeos com mutações ou polipeptídeos mutados surgindo de, por exemplo, mutações de local de união, de deslocamento de quadro de leitura, read-through ou de fusão de gene em células tumorais podem ser identificados por sequenciação de DNA, RNA ou proteína em células de tumor versus células normais.

[00116] Também dentro do escopo das invenções encontram-se peptídeos neo-antigênios pessoais derivados de genes atuadores de tumor comuns e podem ainda incluir mutações específicas de tumor previamente identificadas. Por exemplo, genes atuadores de tumor comuns conhecidos e mutações de tumor em genes atuadores de tumor comuns podem ser encontrados na world wide web em (www)sanger.ac.uk/cosmic.

[00117] Várias iniciativas estão atualmente a decorrer para obter informação de sequência diretamente de milhões de moléculas individuais de DNA e RNA em paralelo. Tecnologias de sequenciação por síntese de moléculas simples em tempo real assentam na detecção de nucleotídeos fluorescentes à medida que são incorporados em uma cadeia nascente de DNA que é complementar ao modelo a ser sequenciado. Em um método, oligonucleótidos de 30-50 bases de comprimento são covalentemente ancorados na extremidade 5' a lamelas de cobertura de vidro. Estas cadeias ancoradas realizam duas funções. Primeiro, atuam como locais de captura para as cadeias modelo alvo se os modelos estão configurados com caudas de captura complementares aos oligonucleótidos ligados à superfície. Também atuam como iniciadores para a extensão de iniciador dirigida ao modelo que forma a base da leitura da sequência. Os iniciadores de captura funcionam como um local de posição fixa para determinação da sequência usando múltiplos ciclos de síntese, detecção e clivagem química do ligador do corante para remover o corante. Cada ciclo consiste de adicionar a mistura de nucleotídeo polimerase/marcada, enxaguamento, imagiologia e clivagem do corante. Em um método alternativo, a polimerase é modificada com uma molécula dadora fluorescente e imobilizada em uma lamela de vidro, enquanto cada nucleotídeo é codificado por cores com uma fração fluorescente aceitadora ligada a um gama-fosfato. O sistema detecta a interação entre uma polimerase marcada com fluorescente e um nucleotídeo modificado por fluorescência à medida que o nucleotídeo se incorpora na cadeia de novo. Também existem outras tecnologias de sequenciação por síntese.

[00118] De preferência, pode ser usada qualquer plataforma de sequenciação por síntese para identificar mutações. Estão atualmente disponíveis quatro grandes plataformas de sequenciação por síntese: a Genome Sequencers da Roche/454 Life Sciences, a HiSeq Analyzer da Illumina/Solexa, o sistema SOLiD da Applied BioSystems, e o sistema Heliscope da Helicos Biosciences. Plataformas de sequenciação por síntese também foram descritas pela Pacific Biosciences e VisiGen Biotechnologies. Cada uma destas plataformas pode ser usada nos métodos da invenção. Em algumas formas de realização, uma pluralidade de moléculas de ácido nucleico sendo sequenciadas é ligada a um suporte (por exemplo, suporte sólido). Para imobilizar o ácido nucleico em um suporte, uma sequência de captura/ local de iniciação universal podem ser adicionados na extremidade 3' e/ou 5' do modelo. Os ácidos nucléicos podem estar ligados ao suporte hibridando a sequência de captura a uma sequência complementar ligada covalentemente ao suporte. A sequência de captura (também referida como uma sequência de captura universal) é uma sequência de ácido nucleico complementar a uma sequência ligada a um suporte que pode servir dualmente como um iniciador universal.

[00119] Como uma alternativa a uma sequência de captura, um membro de um par de acoplamento (tal como, por exemplo, anticorpo/antigênio, receptor/ligando, ou o par avidina-biotina como descrito, por exemplo, no pedido de Patente U.S. No. 2006/0252077) pode ser ligado a cada fragmento a ser capturado em uma superfície revestida com um respectivo segundo membro desse par de acoplamento. A seguir à captura, a sequência pode ser analisada, por exemplo, por detecção/ sequenciação de molécula simples, por exemplo como descrito nos Exemplos e na Patente U.S. No. 7,283,337, incluindo sequenciação por síntese dependente de modelo. Na sequenciação por síntese, a molécula ligada à superfície é exposta a uma pluralidade de trifosfatos de nucleotídeo marcados na presença de polimerase. A sequência do modelo é determinada pela ordem de nucleotídeos etiquetados incorporados na extremidade 3' da cadeia em crescimento. Isto pode ser feito em tempo real ou em um modo etapa-e- repetição. Para análise em tempo real, podem ser incorporadas diferentes etiquetas para cada nucleotídeo e podem ser usados múltiplos lasers para estimulação de nucleotídeos incorporados.

[00120] Qualquer tipo de célula pode ser usado para obter amostras de ácido nucleico para utilização nos métodos de sequenciação aqui descritos. Em uma forma de realização preferencial, a amostra de DNA ou RNA é obtida a partir de uma neoplasia/tumor ou de um fluido corporal, por exemplo sangue, obtido por meio de técnicas conhecidas (por exemplo, punção venosa) ou saliva. Em alternativa, podem ser realizados testes de ácido nucleico em amostras secas (por exemplo, cabelo ou pele).

[00121] Estão disponíveis vários métodos para detectar a presença de uma mutação particular ou alelo no DNA ou RNA de um indivíduo. Os avanços neste campo providenciaram genotipagem SNP em larga escala econômica, fácil e precisa. Mais recentemente, por exemplo, várias novas técnicas foram descritas incluindo hibridação dinâmica específica de alelo (DASH), eletroforese de gel diagonal de matriz de microplacas (MADGE), pirosequenciação, ligação específica de oligonucleotídeos, o sistema TaqMan, bem como várias tecnologias "chip" de DNA tais como os chips SNP da Affymetrix. Estes métodos requerem amplificação da região genética alvo, tipicamente por PCR. Ainda outros métodos recentemente desenvolvidos, com base na geração de moléculas de sinal pequenas por clivagem invasiva seguida de espectrometria de massa ou sondas cadeado imobilizadas e amplificação de círculo rolante, podem eventualmente eliminar a necessidade de PCR. Muitos dos métodos conhecidos na técnica para detectar polimorfismos de nucleotídeo único específicos são resumidos em baixo. O método da presente invenção é entendido como incluindo todos os métodos disponíveis.

[00122] Meios de detecção de base PCR podem incluir amplificação de uma pluralidade de marcadores simultaneamente. Por exemplo, é bem conhecido na técnica selecionar iniciadores de PCR para gerar produtos PCR que não se sobrepõem em tamanho e podem ser analisados simultaneamente

[00123] Em alternativa, é possível amplificar diferentes marcadores com iniciadores que são marcados diferencialmente e que podem assim ser cada um detectado diferencialmente. Claro, meios de detecção de base hibridação permitem a detecção diferencial de múltiplos produtos PCR em uma amostra. Outras técnicas são conhecidas na técnica para permitir análises multiplex de uma pluralidade de marcadores.

[00124] Foram desenvolvidos vários métodos para facilitar a análise de polimorfismos de nucleotídeos únicos em DNA genômico ou RNA celular. Em uma forma de realização, o polimorfismo de base única pode ser detectado usando um nucleotídeo resistente a exonuclease especializado, como revelado, por exemplo, na Patente U.S. No. 4,656,127. De acordo com o método, um iniciador complementar à sequência alélica imediatamente 3' ao local polimórfico é permitido hibridar com uma molécula alvo obtida de um particular animal ou humano. Se o local polimórfico na molécula alvo contiver um nucleotídeo que seja complementar ao derivado de nucleótido resistente a exonuclease particular presente, então o derivado será incorporado na extremidade do iniciador hibridado. Tal incorporação dá origem ao iniciador resistente a exonuclease, permitindo assim a sua detecção. Uma vez que a identidade do derivado resistente a exonuclease da amostra é conhecida, uma descoberta que o iniciador se tornou resistente a exonucleases revela que o nucleotídeo presente no local polimórfico da molécula alvo foi complementar ao do derivado de nucleotídeo usado na reação. Este método tem a vantagem de não requerer a determinação de grandes quantidades de dados de sequência externos.

[00125] Em outra forma de realização da invenção, é usado um método de base solução para determinar a identidade do nucleotídeo de um local polimórfico. Cohen et al. (Patente francesa No. 2,650,840; Pedido PCT No. WO1991/02087). Tal como no método da Patente U.S. No. 4,656,127, pode ser empregue um iniciador que é complementar a sequências alélicas imediatamente 3' a um local polimórfico. O método determina a identidade do nucleotídeo desse local usando derivados dideoxinucleotídeos marcados que, se complementares ao nucleotídeo do local polimórfico, se incorporarão no terminal do iniciador.

[00126] Um método alternativo conhecido como Genetic Bit Analysis ou GBA® é descrito no Pedido PCT No. WO1992/15712). GBA® usa misturas de terminadores marcados e um iniciador que é complementar à sequência 3' a um local polimórfico. O terminador marcado que é incorporado é assim determinado por, e complementarmente ao, nucleotídeo presente no local polimórfico da molécula alvo sendo avaliada. Em contraste com o método de Cohen et al. (Patente francesa 2,650,840; pedido PCT No. W01991/02087) o método GBA® é de preferência um ensaio de fase heterogênea no qual o iniciador ou a molécula alvo é imobilizado em uma fase sólida.

[00127] Recentemente, foram descritos vários procedimentos de incorporação de nucleotídeo guiados por iniciador para analisar locais polimórficos em DNA (Komher, J. S. et al., Nucl. Acids. Res. 17:7779- 7784 (1989); Sokolov, B. P., Nucl. Acids Res. 18:3671 (1990); Syvanen, A.-C, et al., Genomics 8:684-692 (1990); Kuppuswamy, M. N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88: 1143- 1147 (1991); Prezant, T. R. et al., Hum. Mutat. 1: 159-164 (1992); Ugozzoli, L. et al., GATA 9: 107- 112 (1992); Nyren, P. et al., Anal. Biochem. 208: 171-175 (1993)). Estes métodos diferem de GBA® na medida em que todos assentam na incorporação de deoxinucleotídeos marcados para discriminar entre as bases em um local polimórfico. Em um tal formato, uma vez que o sinal é proporcional ao número de deoxinucleotídeos incorporado, os polimorfismos que ocorrem nos testes do mesmo nucleotídeo podem resultar em sinais que são proporcionais ao comprimento do teste (Syvanen, A.-C, et al., Amer. J. Hum. Genet. 52:46-59 (1993)).

[00128] Um método alternativo para identificar neo- antigênios específicos de tumor é sequenciação de proteína direta. A sequenciação de proteína de digestões enzimáticas usando técnicas MS muldimensionais (MSn), incluindo espectrometria de massa em tandem (MS/MS), pode também ser usada para identificar neo-antigênios da invenção. Tais abordagens proteômicas permitem análise rápida e altamente automatizada (ver, por exemplo, K. Gevaert e J. Vandekerckhove, Electrophoresis 21:1145-1154 (2000)). É ainda contemplado dentro do escopo da invenção que métodos de elevado rendimento para sequenciação de novo de proteínas desconhecidas possam ser usados para analisar o proteoma de um tumor de um paciente para identificar neo-antigênios expressos. Por exemplo, pode ser usada sequenciação de proteína meta shotgun (aleatória) para identificar neo- antigênios expressos (ver, por exemplo, Guthals et al. (2012) Shotgun Protein Sequencing with Meta-contig Assembly, Molecular and Cellular Proteomics 11(10):1084-96).

[00129] Neo-antigênios específicos de tumor podem também ser identificados usando multímeros MHC para identificar respostas de célula T específicas de neo- antigênios. Por exemplo, podem ser realizadas análises de alto rendimento de respostas de célula T específicas de neo- antigênios em amostras de pacientes usando técnicas de rastreio MHC com base em tetrâmeros (ver, por exemplo, Hombrink et al. (2011) High-Throughput Identification of Potential Minor Histocompatibility Antigens by MHC TetramerBased Screening: Feasibility and Limitations 6(8):1-11; Hadrup et al. (2009) Parallel detection of antigen-specific T-cell responses by multidimensional encoding of MHC multimers, Nature Methods, 6(7):520-26; van Rooij et al.(2013) Tumor exome analysis reveals neoantigen-specific T- cell reactivity in an Ipilimumab-responsive melanoma, Journal of Clinical Oncology, 31:1-4; e Heemskerk et al. (2013) The cancer antigenome, EMBO Journal, 32(2):194-203). É contemplado dentro do escopo da invenção que tais técnicas de rastreio com base em tetrâmeros podem ser usadas para a identificação inicial de neo-antigênios específicos de tumor ou, em alternativa, como um protocolo de rastreio secundário para avaliar a que neo-antigênios pode um paciente já ter estado exposto, facilitando assim a seleção de neo- antigênios candidatos às vacinas da invenção.

Desenho de Neo-Antigênios Específicos de Tumor

[00130] A invenção inclui ainda peptídeos isolados (por exemplo, peptídeos neo-antigênicos contendo as mutações específicas de tumor identificadas pelos métodos da invenção, peptídeos que compreendem mutações específicas de tumor conhecidas e polipeptídeos mutantes ou seus fragmentos identificados pelo método da invenção). Estes peptídeos e polipeptídeos são aqui referidos como "peptídeos neo- antigênicos" ou "polipeptídeos neo-antigênicos". O termo "peptídeo" é usado indistintamente como "peptídeo mutante" e "peptídeo neo-antigênico" e "peptídeo de tipo selvagem" na presente especificação para designar uma série de resíduos, tipicamente aminoácidos L, ligados uns aos outros, tipicamente por ligações peptídicas entre os grupos alfa- amino e alfa-carboxila de aminoácidos adjacentes. Os polipeptídeos ou peptídeos podem ter uma variedade de comprimentos e incluirão minimamente a pequena região que se prevê ligar à molécula HLA do paciente (o "epítopo"), bem como aminoácidos adjacentes adicionais que se prolongam em ambas as direções de terminal N e C. Os polipeptídeos ou peptídeos podem estar nas suas formas neutras (não carregadas) ou em formas que são sais, e ou livres de modificações como glicosilação, oxidação de cadeia lateral ou fosforilação ou contendo estas modificações, na condição de que a modificação não destrua a atividade biológica dos polipeptídeos como aqui descrito.

[00131] Em certas formas de realização, o tamanho da pelo menos uma molécula de peptídeo neo-antigênico pode compreender, mas não se limita a, cerca de 8, cerca de 9, cerca de 10, cerca de 11, cerca de 12, cerca de 13, cerca de 14, cerca de 15, cerca de 16, cerca de 17, cerca de 18, cerca de 19, cerca de 20, cerca de 21, cerca de 22, cerca de 23, cerca de 24, cerca de 25, cerca de 26, cerca de 27, cerca de 28, cerca de 29, cerca de 30, cerca de 31, cerca de 32, cerca de 33, cerca de 34, cerca de 35, cerca de 36, cerca de 37, cerca de 38, cerca de 39, cerca de 40, cerca de 41, cerca de 42, cerca de 43, cerca de 44, cerca de 45, cerca de 46, cerca de 47, cerca de 48, cerca de 49, cerca de 50, cerca de 60, cerca de 70, cerca de 80, cerca de 90, cerca de 100, cerca de 110, cerca de 120 ou mais resíduos aminoácidos e qualquer gama dali derivável. Em formas de realização específicas, as moléculas de peptídeos neo-antigênicos são iguais a ou inferiores a 50 aminoácidos. Em uma forma de realização preferencial, as moléculas de peptídeos neo-antigênicos são iguais a cerca de 20 a cerca de 30 aminoácidos.

[00132] Pode ser concebido um peptídeo mais longo de várias formas. Por exemplo, quando as regiões de ligação de HLA (por exemplo, os "epítopos") são previstas ou conhecidas, um peptídeo mais longo pode consistir de: peptídeos de ligação individuais com uma extensão de 0-10 aminoácidos para o terminal N e C de cada produto genético correspondente. Um peptídeo mais longo pode também consistir de uma concatenação de alguns ou todos os peptídeos de ligação com sequências prolongadas para cada. Em outro caso, quando a sequenciação revela uma sequência de neo-epítopo longa (> 10 resíduos) presente no tumor (por exemplo, devido a deslocamento de quadro de leitura, read throuh ou inclusão de íntrons que conduzem a uma nova sequência de peptídeos), um peptídeo mais longo pode consistir de toda a gama de novos aminoácidos específicos de tumor. Em ambos os casos, a utilização de um peptídeo mais longo requer processamento endógeno por células profissionais apresentando antigênio tais como células dendríticas e podem conduzir a maior eficácia na apresentação de antigênio e na indução de respostas de célula T. Em alguns casos, é desejável ou preferível alterar a sequência prolongada para melhorar as propriedades bioquímicas do polipeptídeo (propriedades como a solubilidade ou estabilidade) ou para melhorar a probabilidade de processamento proteossomal eficiente do peptídeo (Zhang et al (2012) Aminopeptidase substrate preference affects HIV epitope presentation and predicts immune escape patterns in HIV-infected individuals. J. Immunol 188:5924-34; Hearn et al (2010) Characterizing the specificity and co-operation of aminopeptidases in the cytosol and ER during MHC Class I antigen presentation. J. Immunol 184(9):4725-32; Wiemerhaus et al (2012) Peptidases trimming MHC Class I ligands. Curr Opin Immunol 25:1-7).

[00133] Os peptídeos e polipeptídeos neo-antigênicos podem ligar uma proteína HLA. Em aspetos preferenciais, os peptídeos e polipeptídeos neo-antigênicos podem ligar uma proteína HLA com maior afinidade do que peptídeos nativos/de tipo selvagem correspondentes. O peptídeo ou polipeptídeo neo-antigênico pode ter um IC50 de cerca de menos de 1000 nM, cerca de menos de 500 nM, cerca de menos de 250 nM, cerca de menos de 200 nM, cerca de menos de 150 nM, cerca de menos de 100 nM, ou cerca de menos de 50 nM.

[00134] Em uma forma de realização preferencial, os peptídeos e polipeptídeos neo-antigênicos da invenção não induzem uma resposta auto-imunitária e ou invocam tolerância imunológica quando administrados a um paciente.

[00135] A invenção também providencia composições compreendendo vários peptídeos neo-antigênicos. Em algumas formas de realização, a composição compreende pelo menos 5 ou mais peptídeos neo-antigênicos. Em algumas formas de realização, a composição contém pelo menos cerca de 6, cerca de 8, cerca de 10, cerca de 12, cerca de 14, cerca de 16, cerca de 18 ou cerca de 20 diferentes peptídeos. Em algumas formas de realização, a composição compreende pelo menos 20 diferentes peptídeos. De acordo com a invenção, 2 ou mais dos peptídeos diferentes podem ser derivados do mesmo polipeptídeo. Por exemplo, se uma mutação neo-antigênica preferencial codificar um polipeptídeo neoORF, dois ou mais dos peptídeos neo-antigênicos podem ser derivados do polipeptídeo neoORF. Em uma forma de realização, os dois ou mais peptídeos neo-antigênicos derivados do polipeptídeo neoORF podem compreender uma matriz em mosaico que cobre o polipeptídeo (por exemplo, os peptídeos neo-antigênicos podem compreender uma série de peptídeos neo-antigênicos sobrepostos que cobrem uma porção, ou todo, o polipeptídeo neoORF). Sem ficar limitado pela teoria, acredita-se que cada peptídeo tem o seu próprio epítopo; em conformidade, uma matriz em mosaico que cobre um peptídeo neoORF pode dar origem a polipeptídeos que se dirigem a diferentes moléculas HLA. Peptídeos neo-antigênicos podem ser derivados de qualquer gene codificador de proteína. Polipeptídeos exemplares de onde os peptídeos neo-antigênicos podem ser derivados podem ser encontrados por exemplo no banco de dados COSMIC (na worldwide web em (www)sanger.ac.uk/cosmic). COSMIC apresenta uma seleção de informação abrangente sobre mutações somáticas no câncer humano. O peptídeo pode conter a mutação específica de tumor. Em alguns aspetos, a mutação específica de tumor está em um gene atuador comum ou é uma mutação atuadora comum para um tipo de câncer particular. Por exemplo, peptídeos de mutação atuadores comuns podem incluir, mas não se limitam a, os seguintes: um polipeptídeo SF3B1, um polipeptídeo MYD88, um polipeptídeo TP53, um polipeptídeo ATM, um polipeptídeo Abl, um polipeptídeo FBXW7, um polipeptídeo DDX3X, um polipeptídeo MAPK1, ou um polipeptídeo GNB1.

[00136] Os peptídeos neo-antigênicos, polipeptídeos e análogos podem ser adicionalmente modificados para conter frações químicas adicionais que não fazem normalmente parte da proteína. Essas frações derivadas podem melhorar a solubilidade, a semi-vida biológica, absorção da proteína ou afinidade de ligação. As frações podem também reduzir ou eliminar quaisquer efeitos secundários desejáveis das proteínas e semelhantes. Uma visão global dessas frações pode ser encontrada em Remington’s Pharmaceutical Sciences, 20° ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (2000).

[00137] Por exemplo, peptídeos e polipeptídeos neo- antigênicos possuindo a atividade desejada podem ser modificados conforme necessário para providenciar certos atributos desejados, por exemplo características farmacológicas melhoradas, ao mesmo tempo que aumentam ou pelo menos retêm substancialmente toda a atividade biológica do peptídeo não modificado para ligar a molécula MHC desejada e ativar a célula T apropriada. Por exemplo, os peptídeos e polipeptídeos neo-antigênicos podem ser submetidos a várias alterações, tais como substituições, quer conservadoras ou não conservadoras, onde tais alterações podem providenciar certas vantagens na sua utilização, tal como ligação MHC melhorada. Tais substituições conservadoras podem compreender substituir um resíduo aminoácido por outro resíduo aminoácido que seja biologicamente e/ou quimicamente semelhante, por exemplo um resíduo hidrofóbico por outro, ou um resíduo polar por outro. O efeito de substituições de aminoácidos únicos pode também ser analisado usando aminoácidos D. Tais modificações podem ser feitas usando procedimentos de síntese de peptídeos bem conhecidos, como descrito por exemplo em, Merrifield, Science 232:341-347 (1986), Barany & Merrifield, The Peptides, Gross & Meienhofer, eds. (N.I., Academic Press), págs. 1-284 (1979); e Stewart & Young, Solid Phase Peptide Synthesis, (Rockford, III., Pierce), 2a Ed. (1984).

[00138] Os peptídeos e polipeptídeos neo-antigênicos podem também ser modificados prolongando ou diminuindo a sequência de aminoácidos do composto, por exemplo por adição ou deleção de aminoácidos. Os peptídeos neo-antigênicos, polipeptídeos ou análogos também podem ser modificados alterando a ordem ou composição de certos resíduos. Será apreciado pelos entendidos na técnica que certos resíduos aminoácidos essenciais para a atividade biológica, por exemplo aqueles em locais de contato críticos ou resíduos conservados, não podem geralmente ser alterados sem um efeito adverso na atividade biológica. Os aminoácidos não críticos não precisam de ser limitados aos ocorrendo naturalmente em proteína, tais como aminoácidos L- ou seus isômeros D, mas podem incluir também aminoácidos não naturais, tais como aminoácidos β-Y-δ, bem como muitos derivados de aminoácidos L-a.

[00139] Tipicamente, um polipeptídeo ou peptídeo neo- antigênico pode ser otimizado usando uma série de peptídeos com substituições de aminoácidos únicas para determinar o efeito de carga eletrostática, hidrofobicidade, etc. na ligação MHC. Por exemplo, uma série de substituições de aminoácidos positivamente carregados (por exemplo, Lys ou Arg) ou negativamente carregados (por exemplo, Glu) podem ser feitas ao longo do comprimento do peptídeo revelando diferentes padrões de sensibilidade em relação a várias moléculas MHC e receptores de células T. Além disso, podem ser empregues múltiplas substituições usando pequenas frações relativamente neutras como Ala, Gly, Pro ou resíduos semelhantes. As substituições podem ser homo-oligômeros ou hetero-oligômeros. O número e tipos de resíduos que são substituídos ou adicionados depende do espaçamento necessário entre pontos de contato essenciais e certos atributos funcionais que são procurados (por exemplo, hidrofobicidade versus hidrofilicidade). Afinidade de ligação aumentada para uma molécula MHC ou receptor de célula T pode também ser alcançada por tais substituições, em comparação com a afinidade do peptídeo principal. Em qualquer caso, tais substituições devem empregar resíduos aminoácidos ou outros fragmentos moleculares escolhidos para evitar, por exemplo, interferência estérica e de carga que poderia interromper a ligação.

[00140] Substituições aminoácidas são tipicamente resíduos únicos. Substituições, deleções, inserções ou qualquer sua combinação podem ser combinadas para chegar a um peptídeo final. Variantes substitucionais são aquelas nas quais pelo menos um resíduo de um peptídeo foi removido e um resíduo diferente foi inserido no seu lugar.

[00141] Os peptídeos e polipeptídeos neo-antigênicos podem ser modificados para providenciar os atributos desejados. Por exemplo, a capacidade dos peptídeos de induzir atividade CTL pode ser potenciada por ligação a uma sequência que contém pelo menos um epítopo capaz de induzir uma resposta de células T adjuvantes. Conjugados particularmente preferenciais de peptídeos imunogênicos/adjuvantes T são ligados por uma molécula espaçadora. O espaçador é tipicamente constituído de moléculas neutras relativamente pequenas, tais como aminoácidos ou miméticos de aminoácidos, que são substancialmente não carregados sob condições fisiológicas. Os espaçadores são tipicamente selecionados de, por exemplo, Ala, Gly, ou outros espaçadores de aminoácidos não polares ou aminoácidos polares neutros. Será entendido que o espaçador opcionalmente presente não necessita de ser constituído dos mesmos resíduos e assim pode ser um hetero- ou homo-oligômero. Quando presente, o espaçador será normalmente pelo menos um ou dois resíduos, mais normalmente três a seis resíduos. Em alternativa, o peptídeo pode estar ligado ao peptídeo de adjuvante T sem um espaçador.

[00142] O peptídeo neo-antigênico pode estar ligado ao peptídeo de adjuvante T ou diretamente ou por meio de um espaçador no terminal amino ou carboxi do peptídeo. O terminal amino do peptídeo neo-antigênico ou do peptídeo de adjuvante T pode ser acilado. Peptídeos de adjuvante T exemplares incluem toxóide tetânico 830-843, gripe 307-319, malária circumsporozoite 382-398 e 378- 389.

Produção de Neo-Antigênios Específicos de Tumor

[00143] A presente invenção baseia-se, pelo menos em parte, na capacidade de apresentar ao sistema imunitário do paciente um grupo de neo-antigênios específicos de tumor. Um entendido na técnica apreciará que há várias maneiras de produzir tais neo-antigênios específicos de tumor. Em geral, tais neo-antigênios específicos de tumor podem ser produzidos in vitro ou in vivo. Neo-antigênios específicos de tumor podem ser produzidos in vitro como peptídeos ou polipeptídeos, que podem então ser formulados em uma vacina personalizada contra a neoplasia e administrados a um paciente. Como descrito em maior detalhe em baixo, uma tal produção in vitro pode ocorrer através de vários métodos conhecidos dos entendidos na técnica tal como, por exemplo, síntese de peptídeos ou expressão de um peptídeo/polipeptídeo de uma molécula de DNA ou RNA em qualquer um de uma variedade de sistemas de expressão recombinantes bacterianos, eucarióticos ou virais, seguido de purificação do peptídeo/polipeptídeo expresso. Em alternativa, neo-antigênios específicos de tumor podem ser produzidos in vivo introduzindo moléculas (por exemplo, DNA, RNA, sistemas de expressão virais e semelhantes) que codificam neo-antigênios específicos de tumor em um paciente, pelo que neo-antigênios específicos de tumor codificados são expressos.

Síntese de Peptídeos/Polipeptídeos In Vitro

[00144] Proteínas ou peptídeos podem ser feitos através de qualquer técnica conhecida dos entendidos na técnica, incluindo expressão de proteínas, polipeptídeos ou peptídeos através de técnicas biológicas moleculares padrão, do isolamento de proteínas ou peptídeos de fontes naturais, ou da síntese química de proteínas ou peptídeos. O nucleotídeo e sequências de proteína, polipeptídeo e peptídeo correspondendo a vários genes foram previamente revelados e podem ser encontrados em bancos de dados computorizados conhecidos dos entendidos na técnica. Um tal banco de dados é o Genbank do National Center for Biotechnology Information e os bancos de dados GenPept localizados no site do National Institutes of Health. As regiões codificantes para genes conhecidos podem ser amplificadas e/ou expressas usando as técnicas reveladas aqui ou como seria conhecido dos entendidos na técnica. Em alternativa, são conhecidas pelos entendidos na técnica várias preparações comerciais de proteínas, polipeptídeos e peptídeos.

[00145] Os peptídeos podem ser prontamente sintetizados quimicamente usando reagentes livres de bactérias contaminantes ou substâncias animais (Merrifield RB: Solid phase peptide synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide. J. Am. Chem. Soc. 85:2149-54, 1963).

[00146] Um outro aspeto da invenção providencia um ácido nucleico (por exemplo, um polinucleotídeo) codificando um peptídeo neo-antigênico da invenção, que pode ser usado para produzir o peptídeo neo-antigênico in vitro. O polinucleotídeo pode ser, por exemplo, DNA, cDNA, PNA, CNA, RNA, quer de cadeia única ou dupla, ou formas nativas ou estabilizadas de polinucleotídeos, tais como polinucleotídeos com uma estrutura de fosforotiato ou suas combinações e pode ou não conter íntrons desde que codifique o peptídeo. Um outro aspeto adicional da invenção providencia um vetor de expressão capaz de expressar um polipeptídeo de acordo com a invenção. Os vetores de expressão para diferentes tipos de células são bem conhecidos na técnica e podem ser selecionados sem experimentação desnecessária. Geralmente, o DNA é inserido em um vetor de expressão, tal como um plasmídeo, em orientação adequada e quadro de leitura correto para expressão. Se necessário, o DNA pode ser ligado às sequências de nucleotídeo de controle regulatório transcricional e translacional apropriadas reconhecidas pelo hospedeiro desejado (por exemplo, bactérias), apesar de tais controles estarem geralmente disponíveis no vetor de expressão. O vetor é então introduzido na bactéria hospedeira para clonagem usando técnicas padronizadas (ver, por exemplo, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.I.).

[00147] A invenção compreende ainda variantes e equivalentes que são substancialmente homólogos aos neo- antigênios específicos de tumor aqui descritos. Estes podem conter, por exemplo, mutações de substituição conservadoras, ou seja, a substituição de um ou mais aminoácidos por aminoácidos semelhantes. Por exemplo, a substituição conservadora refere-se à substituição de um aminoácido por outro dentro da mesma classe geral tal como, por exemplo, um aminoácido acídico por outro aminoácido acídico, um aminoácido básico por outro aminoácido básico ou um aminoácido neutro por outro aminoácido neutro. O que se entende por uma substituição de aminoácido conservadora é bem conhecido na técnica.

[00148] A invenção também inclui vetores de expressão compreendendo os polinucleotídeos isolados, bem como células hospedeiras contendo os vetores de expressão. Também é contemplado dentro do escopo da invenção que os peptídeos neo-antigênicos podem ser providenciados sob a forma de moléculas de RNA ou cDNA codificando os peptídeos neo- antigênicos desejados. A invenção também providencia que o um ou mais peptídeos neo-antigênicos da invenção podem ser codificados por um vetor de expressão único. A invenção também providencia que o um ou mais peptídeos neo-antigênicos da invenção podem ser codificados e expressos in vivo usando um sistema de base viral (por exemplo, sistema adenovírus).

[00149] O termo "polinucleotídeo codificando um polipeptídeo" abrange um polinucleotídeo que inclui apenas sequência de codificação para o polipeptídeo bem como um polinucleotídeo que inclui sequências codificantes e/ou não codificantes adicionais. Os polinucleotídeos da invenção podem ser na forma de RNA ou na forma de DNA. O DNA inclui cDNA, DNA genômico e DNA sintético; e pode ser de fita dupla ou fita única, e se de fita única pode ser a fita de codificação ou fita de não codificação (anti-sentido).

[00150] Em formas de realização, os polinucleotídeos podem compreender a sequência de codificação para o peptídeo neo-antigênico específico de tumor fundido no mesmo quadro de leitura a um polinucleotídeo que ajuda, por exemplo, na expressão e/ou secreção de um polipeptídeo de uma célula hospedeira (por exemplo, uma sequência líder que funciona como uma sequência secretória para controlar o transporte de um polipeptídeo da célula). O polipeptídeo tendo uma sequência líder é uma pré-proteína e pode ter a sequência líder clivada pela célula hospedeira para formar a forma madura do polipeptídeo.

[00151] Em formas de realização, os polinucleotídeos podem compreender a sequência de codificação para o peptídeo neo-antigênico específico de tumor fundido no mesmo quadro de leitura com uma sequência de marcador que permite, por exemplo, a purificação do polipeptídeo codificado, que pode então ser incorporado na vacina personalizada contra a neoplasia. Por exemplo, a sequência marcadora pode ser um marcador de hexa-histidina fornecido por um vetor pQE-9 para providenciar a purificação do polipeptídeo maduro fundido com o marcador no caso de um hospedeiro bacteriano ou a sequência de marcador pode ser um marcador de hemaglutinina (HA) derivado da proteína hemaglutinina da gripe quando é usado um hospedeiro mamífero (por exemplo, células COS-7). Marcadores adicionais incluem, mas não se limitam a, marcadores Calmodulin, marcadores FLAG, marcadores Myc, marcadores S, marcadores SBP, Softag 1, Softag 3, marcador V5, marcador Xpress, Isopeptag, SpyTag, marcadores Proteína Transportadora de Carboxila Biotina (BCCP), marcadores GST, marcadores de proteína fluorescente (por exemplo, marcadores de proteína fluorescente verde), marcadores de proteína de ligação de maltose, marcadores Nus, marcador Strep, marcador tioredoxina, marcador TC, marcador Ty, e semelhantes.

[00152] Em formas de realização, os polinucleotídeos pode compreender a sequência de codificação para um ou mais peptídeos neo-antigênicos específicos de tumor fundidos no mesmo quadro de leitura para criar um único constructo de peptídeo neo-antigênico concatamerizado capaz de produzir múltiplos peptídeos neo-antigênicos.

[00153] Em formas de realização, a presente invenção providencia moléculas de ácido nucleico isolado com uma sequência de nucleotídeo pelo menos 60% idêntica, pelo menos 65% idêntica, pelo menos 70% idêntica, pelo menos 75% idêntica, pelo menos 80% idêntica, pelo menos 85% idêntica, pelo menos 90% idêntica, pelo menos 95% idêntica, ou pelo menos 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a um polinucleotídeo codificando um peptídeo neo-antigênico específico de tumor da presente invenção.

[00154] Por um polinucleotídeo com uma sequência de nucleotídeo pelo menos, por exemplo, 95% idêntica a uma sequência de nucleotídeo de referência entende-se que a sequência de nucleotídeo do polinucleotídeo é idêntica à sequência de referência exceto que a sequência de polinucleotídeo pode incluir até cinco mutações de ponto por cada 100 nucleotídeos da sequência de nucleotídeo de referência. Por outras palavras, para obter um polinucleotídeo com uma sequência de nucleotídeo pelo menos 95% idêntica a uma sequência de nucleotídeo de referência, até 5% dos nucleotídeos na sequência de referência podem ser deletados ou substituídos por outro nucleotídeo, ou um número de nucleotídeos até 5% dos nucleotídeos totais na sequência de referência podem ser inseridos na sequência de referência. Estas mutações da sequência de referência podem ocorrer nas posições de terminal amino ou carboxi da sequência de nucleotídeo de referência ou em qualquer lugar entre essas posições terminais, intercaladas individualmente entre nucleotídeos na sequência de referência ou em um ou mais grupos contíguos dentro da sequência de referência.

[00155] Como matéria prática, se qualquer molécula de ácido nucleico particular é pelo menos 80% idêntica, pelo menos 85% idêntica, pelo menos 90% idêntica,e em algumas formas de realização, pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica a uma sequência de referência pode ser determinado convencionalmente usando programas de computador conhecidos como o programa Bestfit (Wisconsin Sequence Analysis Package, Versão 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711). Bestfit usa o algoritmo de homologia local de Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981), para encontrar o melhor segmento de homologia entre duas sequências. Ao usar Bestfit ou qualquer outro programa de alinhamento de sequência para determinar se uma sequência particular é, por exemplo, 95% idêntica a uma sequência de referência de acordo com a presente invenção, os parâmetros são definidos de forma a que a porcentagem de identidade seja calculada ao longo de todo o comprimento da sequência de nucleotídeo de referência e a serem permitidos intervalos em homologia até 5% de número total de nucleotídeos na sequência de referência.

[00156] Os peptídeos neo-antigênicos específicos de tumor isolados aqui descritos podem ser produzidos in vitro (por exemplo, no laboratório) por qualquer método adequado conhecido na técnica. Tais métodos variam desde métodos sintéticos de proteína diretos até construção de uma sequência de DNA codificando sequências de polipeptídeo isolado e expressando essas sequências em um hospedeiro transformado adequado. Em algumas formas de realização, uma sequência de DNA é construída usando tecnologia recombinante isolando ou sintetizando uma sequência de DNA codificando uma proteína de tipo selvagem de interesse. Opcionalmente, a sequência pode ser mutagenizada por mutagênese específica de local para providenciar seus análogos funcionais. Ver, por exemplo, Zoeller et al., Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 81:5662-5066 (1984) e Patente U.S. No. 4,588,585.

[00157] Em formas de realização, uma sequência de DNA codificando um polipeptídeo de interesse seria construído por síntese química usando um sintetizador de oligonucleotídeos. Tais oligonucleotídios podem ser concebidos com base na sequência de aminoácidos do polipeptídeo desejado e selecionando os códons que são favorecidos na célula hospedeira nos quais o polipeptídeo recombinante de interesse será produzido. Podem ser aplicados métodos padronizados para sintetizar uma sequência de polinucleotídeo isolado codificando um polipeptídeo isolado de interesse. Por exemplo, pode ser usada uma sequência de aminoácidos completa para construir um gene retro-traduzido. Além disso, pode ser sintetizado um oligômero de DNA contendo uma sequência de nucleotídeo codificando o polipeptídeo isolado particular. Por exemplo, vários pequenos oligonucleótidos codificando porções do polipeptídeo desejado podem ser sintetizados e depois ligados. Os oligonucleótidos individuais tipicamente contêm saliências 5' ou 3' para montagem complementar.

[00158] Uma vez montadas (por exemplo, por síntese, mutagênese direcionada ao local ou outro método), as sequências de polinucleotídeo codificando um polipeptídeo isolado particular de interesse serão inseridas em um vetor de expressão e opcionalmente operativamente ligadas a uma sequência de controle de expressão apropriada para expressão da proteína em um hospedeiro desejado. A montagem adequada pode ser confirmada por sequenciação de nucleotídeo, mapeamento de restrição, e expressão de um polipeptídeo biologicamente ativo em um hospedeiro adequado. Como é bem conhecido na técnica, de forma a obter elevados níveis de expressão de um gene transfectado em um hospedeiro, o gene pode ser operativamente ligado a sequência de controle de expressão transcricional e translacional que são funcionais no hospedeiro de expressão escolhido.

[00159] Vetores de expressão recombinantes podem ser usados para amplificar e expressar DNA codificando os peptídeos neo-antigênicos específicos de tumor. Vetores de expressão recombinantes são constructos de DNA replicáveis que possuem fragmentos de DNA sintéticos ou derivados de cDNA codificando um peptídeo neo-antigênico específico de tumor ou um análogo bioequivalente operativamente ligado a elementos transcricionais ou translacionais adequados derivados de genes de mamíferos, microbianos, virais ou de insetos. Uma unidade transcricional compreende geralmente uma montagem de (1) um elemento ou elementos genéticos possuindo um papel regulador na expressão de genes, por exemplo, promotores ou potencializadores transcricionais, (2) uma sequência estrutural ou de codificação que é transcrita para mRNA e traduzida em proteína, e (3) iniciação de transcrição e tradução apropriadas e sequências de terminação, como descrito em detalhe de seguida. Tais elementos regulatórios podem incluir uma sequência de operador para controlar a transcrição. A capacidade de replicar em um hospedeiro, normalmente conferida por uma origem de replicação, e um gele de seleção para facilitar o reconhecimento de transformantes podem ser adicionalmente incorporados. Regiões de DNA são operativamente ligadas quando estão funcionalmente relacionadas umas às outras. Por exemplo, DNA para um peptídeo de sinal (líder secretor) está operativamente ligado a DNA para um polipeptídeo se for expresso como um precursor que participa na secreção do polipeptídeo; um promotor está operativamente ligado a uma sequência de codificação se controlar a transcrição da sequência; ou um local de ligação de ribossoma está operativamente ligado a uma sequência de codificação se estiver posicionado de forma a permitir tradução. Geralmente, operativamente ligado significa contíguo, e no caso de líderes secretores, significa contíguo e em quadro de leitura. Elementos estruturais destinados a uso em sistemas de expressão de levedura incluem uma sequência líder permitindo secreção extracelular de proteína traduzida por uma célula hospedeira. Em alternativa, quando a proteína recombinante é expressa sem uma sequência líder ou de transporte, pode incluir um resíduo de metionina de terminal N. Este resíduo pode opcionalmente ser subsequentemente clivado da proteína recombinante expressa para providenciar um produto final.

[00160] A escolha da sequência de controle de expressão e do vetor de expressão dependerá da escolha do hospedeiro. Pode ser empregue uma grande variedade de combinações de expressão hospedeiro/vetor. Vetores de expressão úteis para hospedeiros eucarióticos incluem, por exemplo, vetores compreendendo sequência de controle de expressão de SV40, vírus do papiloma bovino, adenovírus e citomegalovírus. Vetores de expressão úteis para hospedeiros bacterianos incluem plasmídeos bacterianos conhecidos, tais como plasmídeos de Escherichia coli, incluindo pCR 1, pBR322, pMB9 e seus derivados, plasmídeos com maior gama de hospedeiros, tais como M13 e fagos DNA de cadeia única filamentosa.

[00161] Células hospedeiras adequadas para expressão de um polipeptídeo incluem células de procariotas, levedura, insectos ou eucarióticas superiores sob o controle de promotores apropriados. Procariotas incluem organismos gram negativos ou gram positivos, por exemplo E. coli ou bacilli. Células eucarióticas superiores incluem linhas celulares estabelecidas originando de mamífero. Podem também ser empregues sistemas de tradução sem células. Vetores de clonagem e de expressão adequados para uso com hospedeiros celulares bacterianos, fúngicos, de levedura e de mamíferos são bem conhecidos na técnica (ver Pouwels et al., Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, N.I., 1985).

[00162] Vários sistemas de cultura celular de mamíferos ou insetos são também vantajosamente empregues para expressar proteína recombinante. A expressão de proteínas recombinantes em células de mamíferos pode ser realizada porque tais proteínas são geralmente corretamente dobradas, apropriadamente modificadas e completamente funcionais. Exemplos de linhas celulares de hospedeiro mamífero incluem as linhas COS-7 de células de rins de macaco, descritas por Gluzman (Cell 23:175, 1981), e outras linhas celulares capazes de expressar um vetor apropriado incluindo, por exemplo, células L, C127, 3T3, linhas celulares de ovários de hamster chinês (CHO), HeLa e BHK. Vetores de expressão de mamíferos podem compreender elementos não transcritos tais como uma origem de replicação, um promotor e potencializador adequados ligados ao gene a ser expresso, e outras sequências não transcritas flanqueadoras 5' ou 3', e sequências não traduzidas 5' ou 3', tais como locais de ligação de ribossomas necessários, um local de poliadenilação, locais de união de dador e de aceitador e sequências de terminação transcricional. Sistemas de baculovirus para produção de proteínas heterólogas em células de insetos são revistas por Luckow and Summers, Bio/Technology 6:47 (1988).

[00163] As proteínas produzidas por um hospedeiro transformado podem ser purificadas de acordo com qualquer método adequado. Tais métodos padronizados incluem cromatografia (por exemplo, troca iônica, cromatografia em coluna de afinidade e dimensionamento e semelhantes), centrifugação, solubilidade diferencial ou por qualquer outra técnica padrão para purificação de proteína. Marcadores de afinidade como hexahistidina, domínios de ligação de maltose, sequência de revestimento de gripe, glutationa-S-transferase e semelhantes podem ser ligados à proteína para permitir purificação fácil pela passagem por uma coluna de afinidade apropriada. Proteínas isoladas podem também ser fisicamente caracterizadas usando técnicas como proteólise, ressonância magnética nuclear e cristalografia por raios X.

[00164] Por exemplo, sobrenadantes de sistemas que segregam proteína recombinante em meios de cultura podem ser primeiro concentrados usando um filtro de concentração de proteínas disponível comercialmente, por exemplo, uma unidade de ultrafiltração Amicon ou Millipore Pellico. A seguir à etapa de concentração, o concentrado pode ser aplicado a uma matriz de purificação adequada. Em alternativa, pode ser empregue uma resina de troca de aniões, por exemplo, uma matriz ou substrato com grupos dietilaminoetila (DEAE) pendentes. As matrizes podem ser acrilamida, agarose, dextrano, celulose ou outros tipos comummente empregues na purificação de proteínas. Em alternativa, pode ser empregue uma etapa de troca catiônica. Permutadores de cátions adequados incluem várias matrizes insolúveis compreendendo grupos sulfopropila ou carboximetila. Finalmente, uma ou mais etapas de cromatografia líquida de alto desempenho de fase reversa (RP-HPLC) empregando meios RP-HPLC hidrofóbicos, por exemplo sílica gel com grupos metila pendentes ou outros grupos alifáticos, podem ser empregues para purificar adicionalmente uma composição de proteína-Fc de células estaminais de câncer. Algumas ou todas as etapas de purificação anteriores, em várias combinações, podem também ser empregues para providenciar uma proteína recombinante homogênea.

[00165] Uma proteína recombinante produzida em cultura bacteriana pode ser isolada, por exemplo, por extração inicial de agregadas de células, seguido de uma ou mais etapas de concentração, precipitação por salificação, troca iônica aquosa ou cromatografia de exclusão por tamanho. Pode ser empregue cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) para as etapas de purificação finais. Células microbianas empregues na expressão de uma proteína recombinante podem ser interrompidas por qualquer método conveniente, incluindo ciclos de congelamento e descongelamento, sonicação, disrupção mecânica ou utilização de agentes de lise celular.

[00166] Síntese de Peptídeo/Polipeptídeo In Vivo

[00167] A presente invenção também contempla a utilização de moléculas de ácido nucleico como veículos para aplicação de peptídeos/polipeptídeos neo-antigênicos ao paciente in vivo na forma de, por exemplo, vacinas DNA/RNA (ver, por exemplo, WO2012/159643, e WO2012/159754, aqui incorporadas por referência na sua totalidade).

[00168] Em uma forma de realização, a vacina contra a neoplasia personalizada pode incluir plasmídeos de DNA separados codificando, por exemplo, um ou mais peptídeos/polipeptídeos neo-antigênicos como identificado de acordo com a invenção. Como discutido acima, a escolha exata dos vetores de expressão dependerá dos peptídeos/polipeptídeos a serem expressos, e está bem dentro da perícia do perito comum. Espera-se que a persistência esperada dos constructos de DNA (por exemplo, em uma forma epissomal, não replicante, não integrada nas células musculares) providencie uma maior duração da proteção.

[00169] Em outra forma de realização, a vacina personalizada contra a neoplasia pode incluir moléculas separadas de RNA ou cDNA codificando os peptídeos/polipeptídeos neo-antigênicos da invenção.

[00170] Em outra forma de realização, a vacina personalizada contra a neoplasia pode incluir um vetor de base viral para utilização em um paciente humano tal como, por exemplo, um sistema de adenovírus (ver, por exemplo, Baden et al. First-in-human evaluation of the safety and immunogenicity of a recombinant adenovirus serotype 26 HIV- 1 Env vaccine (IPCAVD 001). J Infect Dis. 2013 Jan 15;207(2):240-7, aqui incorporado por referência na sua totalidade).

[00171] Composições Farmacêuticas/Métodos de Aplicação

[00172] A presente invenção também se dirige a composições farmacêuticas compreendendo uma quantidade eficaz de um ou mais compostos de acordo com a presente invenção (incluindo um seu sal farmaceuticamente aceitável), opcionalmente em combinação com um transportador, excipiente ou aditivo farmaceuticamente aceitável.

[00173] "Um "derivado ou pró-fármaco farmaceuticamente aceitável" significa qualquer sal, éster, sal de um éster farmaceuticamente aceitável ou outro derivado de um composto desta invenção que, após administração a um recipiente, seja capaz de providenciar (direta ou indiretamente) um composto desta invenção. Derivados e pró- fármacos particularmente preferidos são os que aumentam a biodisponibilidade dos compostos desta invenção quando tais compostos são administrados a um mamífero (por exemplo, permitindo que um composto administrado oralmente ou ocularmente seja mais prontamente absorvido pelo sangue) ou que potenciam a aplicação do composto principal a um compartimento biológico (por exemplo, a retina) em relação à espécie principal.

[00174] Apesar dos peptídeos neo-antigênicos específicos de tumor da invenção poderem ser administrados como o único agente farmacêutico ativo, eles também podem ser usados em combinação com um ou mais agentes e/ou adjuvantes. Quando administrados como uma combinação, os agentes terapêuticos podem ser formulados como composições separadas que são dadas ao mesmo tempo ou em tempos diferentes, ou os agentes terapêuticos podem ser dados como uma composição única.

[00175] Os peptídeos neo-antigênicos específicos de tumor da presente invenção podem ser administrados por injeção, parenteralmente, por pulverização por inalação, retalmente, vaginalmente ou topicamente em formulações de unidade de dosagem contendo transportadores, adjuvantes e veículos convencionais farmaceuticamente aceitáveis. O termo parenteral como aqui usado inclui administração, em um linfonodo ou linfonodos, subcutânea, intravenosa, intramuscular, intraesternal, técnicas de infusão, intraperitonealmente, no olho ou ocular, intravitreal, intrabucal, transdérmica, intranasal, no cérebro, incluindo intracranial e intradural, nas articulações, incluindo tornozelos, joelhos, ancas, ombros, cotovelos, pulsos, diretamente nos tumores e semelhante, e em forma de supositório.

[00176] Os compostos farmaceuticamente ativos desta invenção podem ser processados de acordo com métodos convencionais da farmácia para produzir agentes medicinais para administração a pacientes, incluindo humanos e outros mamíferos.

[00177] Modificações do compostos ativos podem afetar a solubilidade, biodisponibilidade e taxa de metabolismo das espécies ativas, providenciando assim controle sobre a aplicação das espécies ativas. Isto pode facilmente ser avaliado preparando o derivado e testando a sua atividade de acordo com métodos conhecidos bem dentro do perito rotinado na técnica.

[00178] Composições farmacêuticas baseadas em estes compostos químicos compreendem os peptídeos neo-antigênicos específicos de tumor acima descritos em uma quantidade terapeuticamente eficaz para tratamento de doenças e problemas de saúde (por exemplo, uma neoplasia/tumor), que foram aqui descritos, opcionalmente em combinação com um aditivo, transportador e/ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Um perito na técnica reconhecerá que uma quantidade terapeuticamente eficaz de um ou mais compostos de acordo com a presente invenção variará com a infeção ou problema de saúde a ser tratado, a sua gravidade, o regime de tratamento a ser empregue, a farmacocinética do agente usado, bem como do paciente (animal ou humano) a ser tratado.

[00179] Para preparar as composições farmacêuticas de acordo com a presente invenção, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um ou mais compostos de acordo com a presente invenção é de preferência intimamente misturada com um transportador farmaceuticamente aceitável de acordo com técnicas de composição farmacêutica convencionais para produzir a dose. Um transportador pode assumir uma ampla variedade de formas dependendo da forma de preparação desejada para administração, por exemplo ocular, oral, tópica ou parenteral, incluindo géis, cremes, pomadas, loções e preparações implantáveis liberadas ao longo do tempo, entre muitas outras. Na preparação de composições farmacêuticas na forma de dosagem oral, pode ser usado qualquer um dos meios farmacêuticos usuais. Assim, para preparações orais líquidas, tais como suspensões, elixires e soluções, podem ser usados transportadores e aditivos adequados incluindo água, glicois, óleos, alcoóis, agentes aromatizantes, conservantes, agentes corantes e semelhantes. Para preparações orais sólidas como pós, comprimidos, cápsulas, e para preparações sólidas como supositórios, podem ser usados transportadores e aditivos adequados incluindo amidos, transportadores de açúcar, como dextrose, manitol, lactose e transportadores relacionados, diluentes, agentes de granulação, lubrificantes, aglutinantes, agentes de desintegração e semelhantes. Se desejado, os comprimidos ou cápsulas podem ser revestidos entericamente ou sustentadamente liberados por técnicas padronizadas.

[00180] O composto ativo é incluído no transportador ou diluente farmaceuticamente aceitável em uma quantidade terapeuticamente eficaz para aplicar a um paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz para a indicação desejada, sem provocar efeitos tóxicos graves no paciente tratado.

[00181] Composições orais incluirão geralmente um diluente inerte ou um transportador comestível. Podem estar inclusas em cápsulas de gelatina ou compressos em comprimidos. Para o propósito de administração terapêutica oral, o composto ativo ou o seu derivado pró-fármaco pode ser incorporado com excipientes e usado sob a forma de comprimidos, pastilhas ou cápsulas. Aglutinantes farmaceuticamente compatíveis e/ou materiais adjuvantes podem ser incluídos como parte da composição.

[00182] Os comprimidos, pílulas, cápsulas, pastilhas e semelhantes podem conter qualquer um dos seguintes ingredientes ou compostos de uma natureza semelhante: um aglutinante como celulose microcristalina, goma adragante ou gelatina; um excipiente como amido ou lactose, um agente dispersante como ácido algínico ou amido de milho; um lubrificante como estearato de magnésio; um glidante como dióxido de silício coloidal; um agente adoçante como sacarose ou sacarina; ou um agente aromatizante como menta, salicilato de metila ou aroma de laranja. Quando a forma de unidade de dosagem é uma cápsula pode conter, para além de material do tipo acima, um transportador líquido como um óleo graxo. Além disso, formas de unidade de dosagem podem conter vários outros materiais que modificam a forma física da unidade de dosagem, por exemplo, revestimentos de açúcar, goma-laca ou agentes entéricos.

[00183] Formulações da presente invenção adequadas para administração oral podem ser apresentadas como unidades discretas tais como cápsulas, hóstias ou comprimidos cada um contendo uma quantidade predeterminada do ingrediente ativo; como um pó ou grânulos; como uma solução ou uma suspensão em um líquido aquoso ou um líquido não aquoso; ou como uma emulsão líquida óleo-na-água ou uma emulsão água-em-óleo e como um bólus, etc.

[00184] Um comprimido pode ser feito por compressão ou moldagem, opcionalmente com um ou mais ingredientes acessórios. Comprimidos compressos podem ser preparados comprimindo em uma máquina adequada o ingrediente ativo de escoamento livre tal como um pó ou grânulo, opcionalmente misturado com um aglutinante, lubrificante, diluente inerte, conservante, tensoativo ou agente dispersante. Comprimidos moldados podem ser feitos moldando em uma máquina adequada uma mistura de composto em pó umidificado com um diluente líquido inerte. Os comprimidos podem ser opcionalmente revestidos ou com ranhura e podem ser formulados de forma a providenciar a liberação lenta ou controlada do ingrediente ativo nele contido.

[00185] Métodos de formulação de tais composições de liberação lenta ou controlada de ingredientes farmaceuticamente ativos são conhecidos na técnica e descritos em várias patentes americanas publicadas, algumas das quais incluem, mas não se limitam a, Patente U.S. Nos. 3,870,790; 4,226,859; 4,369,172; 4,842,866 e 5,705,190, cujas revelações são incorporadas aqui por referência na sua totalidade. Podem ser usados revestimentos para aplicação de compostos ao intestino (ver, por exemplo, as Patentes U.S.Nos. 6,638,534, 5,541,171, 5,217,720, e 6,569,457 e referências ali citadas).

[00186] O composto ativo ou seu sal farmaceuticamente aceitável podem também ser administrados como um componente de um elixir, suspensão, xarope, pastilha, chiclete ou semelhante. Um xarope pode conter, para além dos compostos ativos, sacarose ou frutose como um agente adoçante e certos conservantes, corantes e aromatizantes.

[00187] Soluções ou suspensões usadas para aplicação ocular, parenteral, intradérmica, subcutânea ou tópica podem incluir os seguintes componentes: um diluente esterilizado como água para injeção, solução salina, óleos fixos, polietilenoglicois, glicerina, propilenoglicol ou outros solventes sintéticos; agentes antibacterianos como álcool benzílico ou metilparabenos; antioxidantes como ácido ascórbico ou bissulfito de sódio; agentes quelantes como ácido etilenodiaminotetracético; tampões como acetatos, citratos ou fosfatos e agentes para o ajuste de tonicidade como cloreto de sódio ou dextrose.

[00188] Em uma forma de realização, os compostos ativos são preparados com transportadores que protegerão o composto contra a eliminação rápida do corpo, como uma formulação de liberação controlada, incluindo implantes e sistemas de aplicação microencapsulada. Podem ser usados polímeros biodegradáveis e biocompatíveis, tal como etileno acetato de vinilo, polianidridos, ácido poliglicólico, colagênio, poliortoésteres, ácido poliláctico e ácido poliláctico-co-glicólico (PLGA). Métodos para a preparação de tais formulações serão aparentes aos entendidos na técnica.

[00189] Um perito na área reconhecerá que para além de comprimidos, outras formulações de dosagem podem ser formuladas para providenciar liberação lenta ou controlada do ingrediente ativo. Tais formas de dosagem incluem, mas não se limitam a, cápsulas, granulações e cápsulas de gel.

[00190] Suspensões lipossomais podem também ser transportadores farmaceuticamente aceitáveis. Estes podem ser preparados de acordo com os métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, formulações lipossomais podem ser preparadas pela dissolução de lípido(s) apropriados em um solvente inorgânico que é então evaporado, deixando atrás uma película fina de lípido seco na superfície do contentor. Uma solução aquosa do composto ativo é então introduzida no contentor. O contentor é então rodado manualmente para liberar material lípido dos lados do contentor e para dispersar agregados lípidos, formando assim a suspensão lipossomal. Outros métodos de preparação bem conhecidos dos ordinariamente entendidos na técnica podem também ser usados em este aspeto da presente invenção.

[00191] As formulações podem convenientemente ser apresentadas em forma de dosagem unitária e podem ser preparadas por técnicas farmacêuticas convencionais. Tais técnicas incluem a etapa de associar o ingrediente ativo ao(s) transportador(es) farmacêutico(s) ou excipiente(s). Em geral, as formulações são preparadas ao associar uniformemente e intimamente o ingrediente ativo com transportadores líquidos ou transportadores sólidos divididos finamente ou ambos, e depois, se necessário, dar forma ao produto.

[00192] Formulações e composições adequadas para administração tópica na boca incluem pastilhas compreendendo os ingredientes em uma base aromatizada, normalmente sacarose e acácia ou adragante; pastilhas compreendendo o ingrediente ativo em uma base inerte como gelatina e glicerina ou sacarose e acácia; e colutórios compreendendo o ingrediente a ser administrado em um transportador líquido adequado.

[00193] Formulações adequadas para administração tópica na pele podem ser apresentadas como pomadas, cremes, géis e pastas compreendendo o ingrediente a ser administrado em um transportador farmaceuticamente aceitável. Um sistema de aplicação tópica preferencial é um penso transdérmico contendo o ingrediente a ser administrado.

[00194] Formulações para administração retal podem ser apresentadas como um supositório com uma base adequada compreendendo, por exemplo, manteiga de cacau ou um salicilato.

[00195] Formulações adequadas para administração nasal, em que o transportador é um sólido, incluem um pó grosso com um tamanho de partículas, por exemplo, compreendido entre 20 a 500 mícrons que é administrado da maneira em que o rapé é administrado, ou seja por inalação rápida através da passagem nasal a partir de um contentor de pó mantido perto do nariz. Formulações adequadas, em que o transportador é um líquido, para administração, como por exemplo, uma pulverização nasal ou como gotas nasais, incluem soluções aquosas ou oleosas do ingrediente ativo.

[00196] Formulações adequadas para administração vaginal podem ser apresentadas como pessários, tampões, cremes, géis, pastas, espumas ou formulações de pulverização contendo para além do ingrediente ativo transportadores conhecidos na técnica como sendo apropriados.

[00197] A preparação parenteral pode ser encerrada em ampolas, seringas descartáveis ou frascos de dose múltipla feitos de vidro ou plástico. Se administrados intravenosamente, transportadores preferidos incluem, por exemplo, soro fisiológico ou solução salina tamponada com fosfato (PBS).

[00198] Para formulações parenterais, o transportador compreenderá normalmente água esterilizada ou solução aquosa de cloreto de sódio, apesar de poderem ser incluídos outros ingredientes incluindo os que ajudam a dispersão. Claro, quando for usada água esterilizada e mantida esterilizada, as composições e transportadores serão também esterilizados. Suspensões injetáveis podem também ser preparadas, caso no qual também podem ser empregues transportadores líquidos apropriados, agentes de suspensão e semelhantes.

[00199] Formulações adequadas para administração parenteral incluem soluções de injeção esterilizadas aquosas e não aquosas que podem conter antioxidantes, tampões, bacteriostáticos e solutos que tornam a formulação isotônica com o sangue do recipiente pretendido; e suspensões esterilizadas aquosas e não aquosas que podem incluir agentes de suspensão e agentes espessantes. As formulações podem ser apresentadas em contentores de dose unitária ou multi-dose, por exemplo, ampolas e frascos selados e podem ser armazenadas em uma condição seca a frio (liofilizado) requerendo apenas a adição do transportador líquido esterilizado, por exemplo, água para injeções, imediatamente antes da utilização. Podem ser preparadas soluções e suspensões de injeção extemporâneas a partir de pós esterilizados, grânulos e comprimidos do gênero previamente descritos.

[00200] A administração do composto ativo pode variar entre contínua (gotejamento intravenoso) a várias administrações orais por dia (por exemplo, Q.I.D.) e pode incluir administrações oral, tópica, no olho ou ocular, parenteral, intramuscular, intravenosa, subcutânea, transdérmica (que pode incluir um agente de potenciamento da penetração), bucal e por supositório, entre outras vias de administração, incluindo através de um olho ou via ocular.

[00201] A aplicação da terapêutica em causa pode ser local, de forma a ser administrada no local de interesse. Várias técnicas podem ser usadas para providenciar as composições em causa no local de interesse, tal como injeção, utilização de catéteres, trocartes, projéteis, gel plutônico, stents, polímeros de liberação de fármacos contínua ou outro dispositivo que providencie acesso interno. Quando um órgão ou tecido é acessível por causa de remoção do paciente, tal órgão ou tecido pode ser banhado em um meio contendo as composições em causa, as composições em causa podem ser aplicadas no órgão, ou podem ser aplicadas de forma conveniente.

[00202] Os peptídeos neo-antigênicos específicos de tumor podem ser administrados através de um dispositivo adequado para a liberação controlada e sustentada de uma composição eficaz na obtenção de um efeito local ou fisiologicamente sistêmico ou farmacológico desejados. O método inclui posicionar o sistema de aplicação sustentada de fármaco liberado em uma área em que a liberação do agente é desejada e permitir que o agente passe através do dispositivo para a área de tratamento desejada.

[00203] Os peptídeos neo-antigênicos específicos de tumor podem ser utilizados em combinação com pelo menos um agente terapêutico conhecido, ou um sal farmaceuticamente aceitável do referido agente. Exemplos de agentes terapêuticos conhecidos que podem ser usados para terapia de combinação incluem, mas não se limitam a, corticóides (por exemplo, cortisona, prednisona, dexametasona), fármacos anti-inflamatórios não-esteróides (NSAIDS) (por exemplo, ibuprofeno, celecoxib, aspirina, indometicina, naproxeno), agentes alquilantes como bussulfano, cis-platina, mitomicina C, e carboplatina; agentes antimitóticos como colchicina, vimblastina, paclitaxel, e docetaxel; inibidores de topo I como camptotecina e topotecano; inibidores de topo II como doxorubicina e etopósido; e/ou antimetabólitos de RNA/DNA como 5-azacitidina, 5-fluorouracil e metotrexato; antimetabólitos de DNA como 5-fluoro-2‘-deoxi-uridina, ara-C, hidroxiureia e tiioguanina; anticorpos como Herceptin® e Rituxan®.

[00204] Deve ser entendido que para além dos ingredientes particularmente mencionados em cima, as formulações da presente invenção podem incluir outros agentes convencionais na técnica em relação ao tipo de formulação em questão, por exemplo, os adequados para administração oral podem incluir agentes aromatizantes.

[00205] Em certas formas de dosagem farmacêutica, pode ser preferencial a forma de pró-fármaco dos compostos. Um ordinariamente entendido na técnica reconhecerá como modificar prontamente os presentes compostos para formas de pró-fármaco para facilitar a aplicação de compostos ativos a um local alvejado dentro do organismo hospedeiro ou paciente. O técnico rotinado também retirará vantagem de parâmetros farmacocinéticos favoráveis das formas de pró- fármacos, onde aplicável, na aplicação dos presentes compostos a um local alvejado dento do organismo hospedeiro ou paciente para maximizar o efeito desejado do composto.

[00206] Pró-fármacos preferenciais incluem derivados onde um grupo que potencia a solubilidade aquosa ou transporte ativo através da membrana do intestino é anexado à estrutura de fórmulas aqui descritas. Ver, por exemplo, Alexander, J. et al. Journal of Medicinal Chemistry 1988, 31, 318-322; Bundgaard, H. Design of Prodrugs; Elsevier: Amesterdão, 1985; págs. 1-92; Bundgaard, H.; Nielsen, N. M. Journal of Medicinal Chemistry 1987, 30, 451-454; Bundgaard, H. A Textbook of Drug Design and Development; Harwood Academic Publ.: Suíça, 1991; págs. 113-191; Digenis, G. A. et al. Handbook of Experimental Pharmacology 1975, 28, 86112; Friis, G. J.; Bundgaard, H. A Textbook of Drug Design and Development; 2a ed.; Overseas Publ.: Amesterdão, 1996; págs. 351-385; Pitman, I. H. Medicinal Research Reviews 1981, 1, 189-214. As formas de pró-fármacos podem ser elas próprias ativas, ou podem ser do tipo que quando metabolizadas após administração providenciam o agente terapêutico ativo in vivo.

[00207] Formas de sal farmaceuticamente aceitável podem ser a forma química preferida de compostos de acordo com a presente invenção para inclusão em composições farmacêuticas de acordo com a presente invenção.

[00208] Os presentes compostos ou seus derivados, incluindo formas de pró-fármacos destes agentes, podem ser providenciados sob a forma de sais farmaceuticamente aceitáveis. Como aqui usado, o termo sais ou complexos farmaceuticamente aceitáveis refere-se a sais ou complexos apropriados de compostos ativos de acordo com a presente invenção que retêm a atividade biológica desejada do composto principal e apresentam efeitos toxicológicos limitados sobre células normais. Exemplos não limitativos de tais sais são (a) sais de adição de ácido formados com ácidos inorgânicos (por exemplo, ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido nítrico e semelhantes), e sais formados com ácidos orgânicos como ácido acético, ácido oxálico, ácido tartárico, ácido succínico, ácido málico, ácido ascórbico, ácido benzóico, ácido tânico, ácido pamóico, ácido algínico, e ácido poliglutâmico, entre outros; (b) sais de adição base formados com cátions de metal como zinco, cálcio, sódio, potássio e semelhantes, entre vários outros.

[00209] Os compostos aqui referidos encontram-se disponíveis comercialmente ou podem ser sintetizados. Como pode ser apreciado pelo entendido na matéria, outros métodos de sintetizar os compostos das fórmulas aqui referidas serão evidentes aos ordinariamente entendidos na técnica. Adicionalmente, as várias etapas sintéticas podem ser realizadas em uma sequência ou ordem alternada para prover os compostos desejados. Transformações químicas sintéticas e metodologias de grupo de proteção (proteção e desproteção) úteis na sintetização dos compostos aqui descritos são conhecidas na técnica e incluem, por exemplo, as descritas em R. Larock, Comprehensive Organic Transformations, 2a. Ed., Wiley-VCH Publishers (1999); T.W. Greene e P.G.M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3a. Ed., John Wiley and Sons (1999); L. Fieser e M. Fieser, Fieser and Fieser’s Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1999); e L. Paquette, ed., Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1995), e suas edições subsequentes.

[00210] Os agentes adicionais que podem ser incluídos com os peptídeos neo-antigênicos específicos de tumor desta invenção podem conter um ou mais centros assimétricos e ocorrem assim como racêmicos e misturas racêmicas, enantiômeros únicos, diastereômeros individuais e misturas diastereoméricas. Todas as formas isoméricas destes compostos são expressamente incluídas na presente invenção. Os compostos desta invenção podem também ser representados em múltiplas formas tautoméricas, onde a invenção em tais casos inclui expressamente todas as formas tautoméricas dos compostos aqui descritos (por exemplo, a alquilação de um sistema de anel pode resultar em alquilação de múltiplos locais, a invenção expressamente inclui todos esses produtos de reação). Todas as formas isoméricas de tais compostos são expressamente incluídas na presente invenção. Todas as formas dos compostos aqui descritos são expressamente incluídas na presente invenção.

[00211] As formulações de dosagem unitária preferidas são as contendo uma dose diária ou unitária, sub-dose diária, como acima referido, ou uma sua fração apropriada, do ingrediente administrado.

[00212] O regime de dosagem para tratar um distúrbio ou uma doença com os peptídeos neo-antigênicos específicos de tumor desta invenção e/ou composições desta invenção baseia-se em uma variedade de fatores, incluindo o tipo de doença, a idade, peso, sexo, estado de saúde do paciente, a gravidade do problema de saúde, a via de administração e o composto particular empregue. Assim, o regime de dosagem pode variar muito, mas pode ser determinado rotineiramente usando métodos padronizados.

[00213] As quantidades e regimes de dosagem administrados a um paciente dependerão de vários fatores, como o modo de administração, a natureza do problema de saúde a ser tratado, o peso corporal do paciente a ser tratado e a avaliação do médico que faz a prescrição.

[00214] A quantidade do composto incluído dentro de formulações terapeuticamente ativas de acordo com a presente invenção é uma quantidade eficaz para tratar a doença ou problema de saúde. Em geral, uma quantidade terapeuticamente eficaz do composto presentemente referido em forma de dosagem normalmente fica compreendida entre ligeiramente menos de cerca de 0,025 mg/kg/dia a cerca de 2,5 g/kg/dia, de preferência cerca de 0,1 mg/kg/dia a cerca de 100 mg/kg/dia do paciente ou consideravelmente mais, dependendo do composto usado, o problema de saúde ou infeção tratados e a via de administração, apesar de poderem ser contempladas pela presente invenção exceções a este intervalo de dosagem. Na sua forma mais preferencial, são administrados compostos de acordo com a presente invenção em quantidades entre cerca de 1 mg/kg/dia a cerca de 100 mg/kg/dia. A dosagem do composto dependerá do problema de saúde a ser tratado, o composto particular e outros fatores clínicos como peso e problema de saúde do paciente e via de administração do composto. Deve ser entendido que a presente invenção tem aplicação para uso humano e veterinário.

[00215] Para administração oral a humanos, é geralmente suficiente uma dosagem entre aproximadamente 0,1 a 100 mg/kg/dia, de preferência entre aproximadamente 1 e 100 mg/kg/dia.

[00216] Quando a aplicação do fármaco for sistêmica em vez de tópica, este intervalo de dosagem geralmente produz concentrações de nível de sangue eficazes de composto ativo que oscilam entre menos de cerca de 0,04 a cerca de 400 microgramas/cc ou mais de sangue no paciente.

[00217] O composto é administrado convenientemente em qualquer forma de dosagem de unidade adequada, incluindo mas não se limitando, a uma contendo 0,001 a 3000 mg, de preferência 0,05 a 500 mg de ingrediente ativo por forma de dosagem unitária. Uma dosagem oral de 10-250 mg é normalmente conveniente.

[00218] A concentração de composto ativo na composição de fármaco dependerá das taxas de absorção, distribuição, inativação e excreção do fármaco bem como de outros fatores conhecidos dos entendidos na técnica. Deve ser notado que os valores de dosagem também variarão com a gravidade do problema de saúde a ser aliviado. Deve ser ainda entendido que para qualquer paciente particular, devem ser ajustados regimes de dosagem específicos ao longo do tempo de acordo com a necessidade individual e a avaliação profissional da pessoa que administra ou supervisiona a administração das composições, e que os intervalos de concentração aqui avançados são apenas exemplares e não se destinam a limitar o escopo ou prática da composição reivindicada. O ingrediente ativo pode ser administrado de uma só vez, ou pode ser dividido em várias doses menores a serem administradas em intervalos de tempo variados.

[00219] Em certas formas de realização, o composto é administrado uma vez ao dia; em outras formas de realização, o composto é administrado duas vezes ao dia; em ainda outras formas de realização, o composto é administrado uma vez a cada dois dias, uma vez a cada três dias, uma vez a cada quatro dias, uma vez a cada cinco dias, uma vez a cada seis dias, uma vez a cada sete dias, uma vez a cada duas semanas, uma vez a cada três semanas, uma vez a cada quatro semanas, uma vez a cada dois meses, uma vez a cada seis meses ou uma vez por ano. O intervalo de doseamento pode ser ajustado de acordo com as necessidades dos pacientes individuais. Para intervalos de administração mais longos, pode ser usada liberação prolongada ou formulações de depósito.

[00220] Os compostos da invenção podem ser usados para tratar doenças e problemas de saúde que são graves e podem também ser usados para tratamento de problemas de saúde crônicos. Em certas formas de realização, os compostos da invenção são administrados por períodos de tempo superiores a duas semanas, três semanas, um mês, dois meses, três meses, quatro meses, cinco meses, seis meses, um ano, dois anos, três anos, quatro anos, ou cinco anos, dez anos, ou quinze anos; ou, por exemplo, qualquer intervalo de período de tempo em dias, meses ou anos no qual a extremidade mais baixa do intervalo é qualquer período de tempo entre 14 dias e 15 anos e a extremidade superior do intervalo é entre 15 dias e 20 anos (por exemplo, 4 semanas e 15 anos, 6 meses e 20 anos). Em alguns casos, poderá ser vantajoso para os compostos da invenção ser administrados pelo resto da vida do paciente. Em formas de realização preferenciais, o paciente é monitorizado para verificar a progressão da doença ou distúrbio e a dose é ajustada em conformidade. Em formas de realização preferenciais, o tratamento de acordo com a invenção é eficaz por pelo menos duas semanas, três semanas, um mês, dois meses, três meses, quatro meses, cinco meses, seis meses, um ano, dois anos, três anos, quatro anos, ou cinco anos, dez anos, quinze anos, vinte anos ou para o resto da vida do paciente.

[00221] A invenção providencia composições farmacêuticas contendo pelo menos um neo-antigênio específico de tumor aqui descrito. Em formas de realização, as composições farmacêuticas contêm um transportador, excipiente ou diluente farmaceuticamente aceitável que inclui qualquer agente farmacêutico que não induz ele próprio a produção de uma resposta imunitária prejudicial a um paciente recebendo a composição e que pode ser administrado sem toxicidade indevida. Como aqui usado, o termo "farmaceuticamente aceitável" significa ser aprovado por uma agência regulatória do governo federal ou estatal ou listado na Farmacopeia Americana, Farmacopeia Europeia ou outra farmacopeia geralmente reconhecida para utilização em mamíferos, e mais particularmente em humanos. Estas composições podem ser úteis para tratar e/ou prevenir infeção viral e/ou doença autoimune.

[00222] Uma discussão completa de transportadores, diluentes e outros excipientes farmaceuticamente aceitáveis é apresentada em Remington’s Pharmaceutical Sciences (17a ed., Mack Publishing Company) e Remington: The Science and Practice of Pharmacy (21a ed., Lippincott Williams & Wilkins), que são aqui incorporados por referência. A formulação da composição farmacêutica deve ser adequada ao modo de administração. Em formas de realização, a composição farmacêutica é adequada para administração a humanos e pode ser esterilizada, não particulada e/ou não pirogênica.

[00223] Transportadores, excipientes ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não se limitam a, solução salina, solução salina tamponada, dextrose, água, glicerol, etanol, tampão aquoso isotônico esterilizado e suas combinações.

[00224] Agentes umectantes, emulsificadores e lubrificantes, tais como laurilsulfato de sódio e estearato de magnésio, bem como agentes corantes, agentes de liberação, agentes de revestimento, agentes adoçantes, aromatizantes e odoríferos, conservantes e antioxidantes podem também estar presentes nas composições.

[00225] Exemplos de antioxidantes farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não se limitam a: (1) antioxidantes solúveis em água, tais como ácido ascórbico, cloridrato de cisteína, bissulfito de sódio, metabissulfito de sódio, sulfito de sódio e semelhantes; (2) antioxidantes solúveis em água tais como palmitato de ascorbila, hidroxianisolo butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, propil galato, alfa-tocoferol, e semelhantes; e (3) agentes quelantes de metal, como ácido cítrico, ácido etilenodiamino tetraacético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico e semelhantes.

[00226] Em formas de realização, a composição farmacêutica é providenciada em uma forma sólida, tal como pó liofilizado adequado para reconstituição, uma solução líquida, suspensão, emulsão, comprimido, pílula, cápsula, formulação de liberação sustentada ou pó.

[00227] Em formas de realização, a composição farmacêutica é fornecida em forma líquida, por exemplo, em um contentor selado indicando a quantidade e concentração do ingrediente ativo na composição farmacêutica. Em formas de realização, a forma líquida da composição farmacêutica é fornecida em um contentor hermeticamente selado.

[00228] Métodos de formular as composições farmacêuticas da presente invenção são convencionais e bem conhecidos na técnica (ver Remington and Remington’s). Um entendido na técnica pode prontamente formular uma composição farmacêutica possuindo as características desejadas (por exemplo, via de administração, biossegurança, e perfil de liberação).

[00229] Métodos para preparar as composições farmacêuticas incluem a etapa de associar o ingrediente ativo a um transportador farmaceuticamente aceitável e, opcionalmente, um ou mais ingredientes acessórios. As composições farmacêuticas podem ser preparadas associando uniformemente e intimamente o ingrediente ativo com transportadores líquidos ou transportadores sólidos divididos finamente ou ambos, e depois, se necessário, dar forma ao produto. Metodologia adicional para preparar as composições farmacêuticas, incluindo a preparação de formas de dosagem multicamada, são descritas em Ansel’s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (9a ed., Lippincott Williams & Wilkins), que é aqui incorporada por referência.

[00230] Composições farmacêuticas adequadas para administração oral podem ser na forma de cápsulas, pílulas, comprimidos, pastilhas (usando uma base aromatizada, normalmente sacarose e acácia ou adragante), pós, grânulos ou como uma solução ou uma suspensão em um líquido aquoso ou não aquoso, ou como uma emulsão líquida óleo-em-água ou água- em-óleo, ou como um elixir ou xarope, ou como pastilhas (usando uma base inerte, tal como gelatina e glicerina, ou sacarose e acácia) e/ou como colutórios e semelhantes, cada um contendo uma quantidade predeterminada de um ou mais compostos aqui descritos, um seu derivado ou um seu sal farmaceuticamente aceitável ou pró-fármaco como o ou os ingredientes ativos. O ingrediente ativo também pode ser administrado como um bólus, electuário ou pasta.

[00231] Em formas de dosagem sólida para administração oral (por exemplo, cápsulas, comprimidos, pílulas, drageias, pós, grânulos e semelhantes), o ingrediente ativo é misturado com um ou mais transportadores, excipientes ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis como citrato de sódio ou fosfato dicálcico e/ou qualquer um dos seguintes: (1) agente de carga ou de extensão, tais como amidos, lactose, sacarose glicose, manitol e/ou ácido silícico; (2) aglutinante como, por exemplo, carboximetilcelulose, alginatos, gelatina, pirrolidona polivinílica, sacarose e/ou acácia; (3) umectantes, como glicerol; (4) agentes desintegrantes, como ágar-ágar, carbonato de cálcio, amido de batata ou tapioca, ácido algínico, certos silicatos e carbonato de sódio; (5) agentes de retardamento de solução, como parafina; (6) aceleradores de absorção como compostos de amônio quaternário; (7) agentes umectantes como, por exemplo, álcool acetílico e monoestearato de glicerina; (8) absorventes, como caulim e argila bentonítica; (9) lubrificantes, como um talco, estearato de cálcio, estearato de magnésio, glicois de polietileno sólidos, laurilsulfato de sódio, e suas misturas; e (10) agentes corantes. No caso de cápsulas, comprimidos e pílulas, as composições farmacêuticas podem também compreender agentes de tamponamento. Composições sólidas de um tipo semelhante podem também ser preparadas usando agente de carga em cápsulas de gelatina moles e duras, e excipientes tais como lactose ou açúcares lácteos, bem como glicois de polietileno de elevado peso molecular e semelhantes.

[00232] Um comprimido pode ser feito por compressão ou moldagem, opcionalmente com um ou mais ingredientes acessórios. Comprimidos compressos podem ser preparados usando aglutinantes (por exemplo, gelatina ou hidroxipropilmetil celulose), lubrificantes, diluentes inertes, conservantes, desintegrantes (por exemplo, glicolato de amido de sódio ou carboximetil celulose de sódio reticulado), tensoativos e/ou agentes dispersantes. Comprimidos moldados podem ser feitos moldando em uma máquina adequada uma mistura de ingrediente ativo em pó umidificado com um diluente líquido inerte.

[00233] Os comprimidos e outras formas de dosagem sólida, como drageias, cápsulas, pílulas e grânulos, podem opcionalmente ser estriados ou preparados com revestimentos e escudos, como revestimentos entéricos e outros revestimentos bem conhecidos na técnica.

[00234] Em algumas formas de realização, por forma a prolongar o efeito de um ingrediente ativo, é desejável abrandar a absorção do composto de injeção subcutânea ou intramuscular. Isto pode ser alcançado pela utilização de uma suspensão líquida de material cristalino ou amorfo com fraca solubilidade em água. A taxa de absorção do ingrediente ativo depende então da sua taxa de dissolução que, por sua vez, pode depender do tamanho do cristal e forma cristalina. Em alternativa, absorção retardada de um ingrediente ativo administrado parenteralmente é alcançada dissolvendo ou suspendendo o composto em um veículo de óleo. Além disso, a absorção prolongada da forma farmacêutica injetável pode ser provocada pela inclusão de agentes que retardam a absorção como monoestearato de alumínio e gelatina.

[00235] Composições parenterais de liberação controlada podem ser na forma de suspensões aquosas, microsferas, microcápsulas, microsferas magnéticas, soluções oleosas, emulsões ou o ingrediente ativo pode ser incorporado em um transportador ou transportadores biocompatíveis, lipossomas, nanopartículas, implantes ou dispositivos de infusão.

[00236] Materiais para utilização na preparação de microsferas e/ou microcápsulas incluem polímeros biodegradáveis/bioerudíveis como poliglactina, poli- (isobutil cianoacrilato), poli(2-hidroxiethil-L-glutamina) e poli(ácido láctico).

[00237] Transportadores biocompatíveis que podem ser usados ao formular uma formulação parenteral de liberação controlada incluem carboidratos como dextranos, proteínas como albumina, lipoproteínas ou anticorpos.

[00238] Materiais para utilização em implantes podem ser não biodegradáveis, por exemplo, polidimetilsiloxano, ou biodegradáveis como, por exemplo, poli(caprolactona), poli(ácido láctico), poli(ácido glicólico) ou poli(orto ésteres).

[00239] Em formas de realização, o ou os ingredientes ativos são administrados por aerossol. Isto é alcançado preparando um aerossol aquoso, preparação lipossomal ou partículas sólidas contendo o composto. Pode ser usada uma suspensão não aquosa (por exemplo, propulsor de fluorocarbono). A composição farmacêutica pode também ser administrada usando um nebulizador sônico, que minimizaria exposição do agente a cisalhamento, que pode resultar na degradação do composto.

[00240] Ordinariamente, um aerossol é feito formulando uma solução ou suspensão aquosa do ou dos ingredientes ativos juntamente com transportadores e estabilizadores farmaceuticamente aceitáveis convencionais. Os transportadores e estabilizadores variam conforme os requisitos do composto particular, mas tipicamente incluem surfactantes não iônicos (Tweens, Pluronics, ou polietileno glicol), proteínas inócuas como soro-albumina, ésteres de sorbitano, ácido oléico, lecitina, aminoácidos como glicina, tampões, sais, açúcares ou alcoóis de açúcar. Aerossóis são geralmente preparados a partir de soluções isotônicas.

[00241] Formas de dosagem para administração tópica ou transdérmica de um ou mais ingrediente ativo incluem pós, pulverizações, unguentos, pastas, cremes, loções, géis, soluções, pensos e inalantes. O ou os ingredientes ativos podem ser misturados sob condições de esterilização com um transportador farmaceuticamente aceitável e com os conservantes, tampões ou propulsores, conforme apropriado.

[00242] Pensos transdérmicos adequados para utilização na presente invenção são revelados em Transdermal Drug Delivery: Developmental Issues and Research Initiatives (Marcel Dekker Inc., 1989) e Patentes U.S. Nos. 4,743,249, 4,906,169, 5,198,223, 4,816,540, 5,422,119, 5,023,084, que são aqui incorporadas por referência. O penso transdérmico pode ser também qualquer penso transdérmico bem conhecido na técnica, incluindo pensos transescrotais. Composições farmacêuticas em tais pensos transdérmicos podem conter um ou mais potencializadores de absorção ou potencializadores de permeação da pele bem conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Patentes U.S. Nos. 4,379,454 e 4,973,468, que são aqui incorporadas por referência). Sistemas terapêuticos transdérmicos para utilização na presente invenção podem ser baseados em iontoforese, difusão ou uma combinação destes dois efeitos.

[00243] Os pensos transdérmicos têm a vantagem adicional de providenciar aplicação controlada de ingrediente(s) ativo(s) ao corpo. Tais formas de dosagem podem ser feitas dissolvendo ou dispersando o ou os ingredientes ativos em um meio adequado. Potencializadores de absorção podem também ser usados para aumentar o fluxo de ingrediente ativo ao longo da pele. A taxa de tal fluxo pode ser controlada providenciando uma membrana de controle de taxa ou dispersando o ou os ingredientes ativos em uma matriz polimérica ou gel.

[00244] Tais composições farmacêuticas podem ser na forma de cremes, unguentos, loções, linimentos, géis, hidrogéis, soluções, suspensões, bastões, pulverizações, pastas, emplastros e outros tipos de sistemas de aplicação de fármacos transdérmicos. As composições podem também incluir transportadores ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis como agentes emulsificantes, antioxidantes, agentes de tamponamento, conservantes, umectantes, potencializadores de penetração, agentes quelantes, agentes formadores de gel, bases de unguentos, perfumes, e agentes protetores de pele.

[00245] Exemplos de agentes emulsificantes incluem, mas não se limitam a, gomas ocorrendo naturalmente, por exemplo, goma acácia ou goma adragante, fosfatídeos ocorrendo naturalmente, por exemplo, lecitina de soja e derivados de monooleato de sorbitano.

[00246] Exemplos de antioxidantes incluem, mas não se limitam a, anisol hidroxi butilado (BHA), ácido ascórbico e seus derivados, tocoferol e seus derivados e cisteína.

[00247] Exemplos de conservantes incluem, mas não se limitam a, parabenos, tais como metil ou propil p- hidroxibenzoato e cloreto de benzalcônio.

[00248] Exemplos de umectantes incluem, mas não se limitam a, glicerina, propileno, glicol, sorbitol e ureia.

[00249] Exemplos de potencializadores de penetração incluem, mas não se limitam a, propileno glicol, DMSO, trietanolamina, N,N-dimetilacetamida, N,N-dimetilformamida, 2-pirrolidona e seus derivados, álcool tetrahidrofurfurílico, propileno glicol, dietileno glicol éter monoetílico ou monometílico com propileno glicol monolaurato ou metil laurato, eucaliptol, lecitina, Transcutol®, e Azone®.

[00250] Exemplos de agentes quelantes incluem, mas não se limitam a, EDTA de sódio, ácido cítrico e ácido fosfórico.

[00251] Exemplos de agentes de formação de gel incluem, mas não se limitam a, Carbopol, derivados de celulose, bentonita, alginatos, gelatina e polivinilpirrolidona.

[00252] Para além do ou dos ingredientes ativos, os unguentos, pastas, cremes e géis da presente invenção podem conter excipientes como gorduras animais e vegetais, óleos, ceras, parafinas, amido, adragante, derivados de celulose, polietilenoglicóis, silicones, bentonitas, ácido silícico, talco e óxido de zinco ou suas misturas.

[00253] Pós e pulverizações podem conter excipientes como lactose, talco, ácido silícico, hidróxido de alumínio, silicatos de cálcio e pó de poliamida ou misturas destas substâncias. As pulverizações podem adicionalmente conter propulsores habituais, como clorofluorohidrocarbonetos e hidrocarbonetos voláteis não substituídos, como butano e propano.

[00254] Formas de depósito injetáveis são feitas formando matrizes microencapsuladas de composto(s) da invenção em polímeros biodegradáveis como polilactida- poliglicolida. Dependendo do rácio de composto para polímero e a natureza do polímero particular empregue, a taxa de liberação de composto pode ser controlada. Exemplos de outros polímeros biodegradáveis incluem poli(ortoésteres) e poli(anidridos). Formulações injetáveis de depósito são também preparadas capturando o fármaco em lipossomas ou microemulsões que são compatíveis com tecido corporal.

[00255] Implantes subcutâneos são bem conhecidos na técnica e são adequados para utilização na presente invenção. Métodos de implantação subcutânea são preferencialmente não irritantes e mecanicamente resilientes. Os implantes podem ser de tipo matriz, de tipo reservatório ou seus híbridos. Em dispositivos de tipo matriz, o material transportador pode ser poroso ou não poroso, sólido ou semi-sólido e permeável ou impermeável ao composto ou compostos ativos. O material transportador pode ser biodegradável ou pode lentamente erodir após administração. Em alguns casos, a matriz é não degradável, assentando em vez disso na difusão do composto ativo através da matriz para o material transportador se degradar. Métodos de implante subcutâneo alternativos utilizam dispositivos de reservatório onde o ou os compostos ativos são rodeados por uma membrana de controle de taxa, por exemplo uma membrana independente da concentração de componente (possuindo cinética de ordem zero). Dispositivos consistindo de uma matriz rodeada por uma membrana de controle de taxa são também adequados para utilização.

[00256] Tanto os dispositivos de tipo reservatório como matriz podem conter materiais como polidimetilsiloxano, como Silastic™, ou outras borrachas de silicone. Materiais de matriz podem ser polipropileno, polietileno, cloreto polivinílico, acetato etilvinílico, poliestireno e polimetacrilato insolúveis, bem como ésteres de glicerol do tipo palmitoestearato de glicerol, estearato de glicerol e behenato de glicerol. Materiais podem ser polímeros hidrofóbicos ou hidrofílicos e opcionalmente conter agentes solubilizantes.

[00257] Dispositivos de implante subcutâneo podem ser cápsulas de liberação lenta feitas com qualquer polímero adequado, por exemplo, como descrito nas Patentes U.S. Nos. 5,035,891 e 4,210,644, que são aqui incorporadas por referência.

[00258] Em geral, pelo menos quatro diferentes abordagens são aplicáveis para providenciar controle de taxa sobre a liberação e permeação transdérmica de um composto fármaco. Estas abordagens são: sistemas moderados por membrana, sistemas controlados por difusão adesiva, sistemas de tipo dispersão de matriz e sistemas de microrreservatório. É apreciado que uma composição percutânea e/ou tópica de liberação controlada pode ser obtida usando uma mistura adequada dessas abordagens.

[00259] Em um sistema moderado por membrana, o ingrediente ativo está presente em um reservatório que está totalmente encapsulado em um compartimento raso moldado a partir de um laminado impermeável a fármacos, tal como um laminado plástico metálico, e uma membrana polimérica controlando a taxa como uma membrana polimérica microporosa ou não porosa, por exemplo, copolímero de etileno acetato de vinilo. O ingrediente ativo é liberado através da membrana polimérica de controle da taxa. No reservatório de fármaco, o ingrediente ativo pode ser disperso em uma matriz polimérica sólida ou suspenso em um meio líquido viscoso não lixiviável como fluido de silicone. Na superfície externa da membrana polimérica, é aplicada uma camada fina de um polímero adesivo para alcançar um contato íntimo do sistema transdérmico com a superfície da pele. O polímero adesivo é preferencialmente um polímero que é hipoalergênico e compatível com a substância de fármaco ativo.

[00260] Em um sistema controlado por difusão adesiva, um reservatório do ingrediente ativo é formado por dispersão direta do ingrediente ativo em um polímero adesivo e depois, por exemplo, por fusão do solvente, espalhando o adesivo contendo o ingrediente ativo em um suporte de folha plana de plástico metálico substancialmente impermeável ao fármaco para formar uma camada de reservatório de fármaco fina.

[00261] Um sistema de tipo dispersão de matriz é caracterizado por um reservatório do ingrediente ativo ser formado dispersando de forma substancialmente homogênea o ingrediente ativo em uma matriz polimérica hidrofílica ou lipofílica. O polímero contendo fármaco é então moldado em um disco com uma área de superfície substancialmente bem definida e espessura controlada. O polímero adesivo é espalhado ao longo da circunferência para formar uma tira de adesivo em volta do disco.

[00262] Um sistema de microrreservatório pode ser considerado como uma combinação dos sistemas de tipo reservatório e dispersão de matriz. Em este caso, o reservatório da substância ativa é formado suspendendo primeiro os sólidos de fármaco em uma solução aquosa de polímero solúvel em água e depois dispersando a suspensão do fármaco em um polímero lipofílico para formar uma multiplicidade de esferas microscópicas não lixiviáveis de reservatórios de fármaco.

[00263] Qualquer uma das acima descritas composições de liberação controlada, liberação prolongada e liberação sustentada podem ser formuladas para liberar o ingrediente ativo em cerca de 30 minutos a cerca de 1 semana, em cerca de 30 minutos a cerca de 72 horas, em cerca de 30 minutos a cerca de 24 horas, em cerca de 30 minutos a 12 horas, em cerca de 30 minutos a 6 horas, em cerca de 30 minutos a 4 horas e em cerca de 3 horas a 10 horas. Em formas de realização, uma concentração eficaz do ou dos ingredientes ativos é mantida em um paciente por 4 horas, 6 horas, 8 horas, 10 horas, 12 horas, 16 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, ou mais após administração das composições farmacêuticas ao paciente.

Dosagens

[00264] Quando os agentes aqui descritos são administrados como fármacos a humanos ou animais, eles podem ser dados per se ou como composição farmacêutica contendo o ingrediente ativo em combinação com um transportador, excipiente ou diluente farmaceuticamente aceitável.

[00265] Os níveis de dosagem atuais e o curso de tempo de administração dos ingredientes ativos nas composições farmacêuticas da invenção podem variar de forma a obter uma quantidade do ingrediente ativo que é eficaz para alcançar a resposta terapêutica desejada para um paciente, composição e modo de administração particulares, sem serem tóxicos para o paciente. Geralmente, agentes ou composições farmacêuticas da invenção são administrados em uma quantidade suficiente para reduzir ou eliminar sintomas associados a infeção viral e/ou doença autoimune.

[00266] Intervalos de doses exemplares incluem 0,01 mg a 250 mg por dia, 0,01 mg a 100 mg por dia, 1 mg a 100 mg por dia, 10 mg a 100 mg por dia, 1 mg a 10 mg por dia, e 0,01 mg a 10 mg por dia. Uma dose preferencial de um agente é o máximo que um paciente pode tolerar sem desenvolver efeitos secundários graves ou inaceitáveis. Em formas de realização, o agente é administrado em uma concentração de cerca 10 mg a cerca de 100 mg por quilograma de peso corporal por dia, cerca de 0,1 a cerca de 10 mg/kg por dia, ou cerca de 1,0 mg a cerca de 10 mg/kg de peso corporal por dia.

[00267] Em formas de realização, a composição farmacêutica compreende um agente em uma quantidade oscilando entre 1 e 10 mg, como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 mg.

[00268] Em formas de realização, a dosagem terapeuticamente eficaz produz uma concentração sérica de um agente de cerca de 0,1 ng/ml a cerca de 50-100 μg/ml. As composições farmacêuticas tipicamente devem providenciar uma dosagem desde cerca de 0,001 mg a cerca de 2000 mg do composto por quilograma de peso corporal por dia. Por exemplo, doses para administração sistêmica a um paciente humano podem ir desde 1-10 μg/kg, 20-80 μg/kg, 5-50 μg/kg, 75-150 μg/kg, 100-500 μg/kg, 250-750 μg/kg, 500-1000 μg/kg, 1-10 mg/kg, 550 mg/kg, 25-75 mg/kg, 50-100 mg/kg, 100-250 mg/kg, 50-100 mg/kg, 250-500 mg/kg, 500-750 mg/kg, 750-1000 mg/kg, 10001500 mg/kg, 1500-2000 mg/kg, 5 mg/kg, 20 mg/kg, 50 mg/kg, 100 mg/kg, 500 mg/kg, 1000 mg/kg, 1500 mg/kg, ou 2000 mg/kg. Formas de unidade de dosagem farmacêutica são preparadas para providenciar desde cerca de 1 mg a cerca de 5000 mg, por exemplo desde cerca de 100 a cerca de 2500 mg do composto ou uma combinação de ingredientes essenciais por forma de unidade de dosagem.

[00269] Em formas de realização, cerca de 50 nM a cerca de 1μM de um agente são administrados a um paciente. Em formas de realização relacionadas, cerca de 50-100 nM, 50-250 nM, 100-500 nM, 250-500 nM, 250-750 nM, 500-750 nM, 500 nM a 1 μM, ou 750 nM a 1μM de um agente são administrados a um paciente.

[00270] A determinação de uma quantidade eficaz está bem dentro da capacidade dos entendidos na técnica, especialmente à luz da revelação detalhada aqui providenciada. Geralmente, uma quantidade efetiva ou eficaz de um agente é determinada administrando primeiro uma dose baixa do ou dos agentes e depois aumentando gradualmente a dose ou dosagens administradas até ser observado um efeito desejado (por exemplo, reduzir ou eliminar sintomas associados a infeção viral ou doença autoimune) no paciente tratado, com efeitos secundários tóxicos mínimos ou aceitáveis. Métodos aplicáveis para determinar uma dose apropriada e calendário de doseamento para administração de uma composição farmacêutica da presente invenção são descritos por exemplo, em Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics, Goodman et al., eds., 11a edição, McGraw-Hill 2005, e Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20a e 2∑a edições, Gennaro and University of the Sciences in Philadelphia, Eds., Lippencott Williams & Wilkins (2003 e 2005), cada um dos quais é aqui incorporado por referência.

Terapias de Combinação

[00271] Os peptídeos neo-antigênicos específicos de tumor e composições farmacêuticas aqui descritas podem também ser administrados em combinação com outra molécula terapêutica. A molécula terapêutica pode ser qualquer composto usado para mitigar neoplasia ou seus sintomas. Exemplos de tais compostos incluem, mas não se limitam a, agentes quimioterapêuticos, agentes anti-angiogênese, anticorpos de bloqueio de ponto de verificação ou outras moléculas que reduzem imunossupressão e semelhantes.

[00272] Os peptídeos neo-antigênicos específicos de tumor podem ser administrados antes, durante ou após administração do agente terapêutico adicional. Em formas de realização, os peptídeos neo-antigênicos específicos de tumor são administrados antes da primeira administração do agente terapêutico adicional. Em formas de realização, os peptídeos neo-antigênicos específicos de tumor são administrados após a primeira administração do agente terapêutico adicional (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 dias ou mais). Em formas de realização, os peptídeos neo-antigênicos específicos de tumor são administrados simultaneamente com a primeira administração do agente terapêutico adicional.

Vacinas

[00273] Em uma forma de realização exemplar, a presente invenção é dirigida a uma composição imunogênica, por exemplo uma composição de vacina capaz de suscitar uma resposta específica de célula T. A composição de vacina compreende peptídeos neo-antigênicos mutantes e polipeptídeos neo-antigênicos mutantes correspondendo a neo- antigênios específicos de tumor identificados pelos métodos aqui descritos.

[00274] Uma vacina adequada conterá de preferência vários peptídeos neo-antigênicos específicos de tumor. Em uma forma de realização, a vacina incluirá entre 1 e 100 conjuntos de peptídeos, mais preferencialmente entre 1 e 50 de tais peptídeos, ainda mais preferencialmente entre 10 e 30 conjuntos de peptídeos, ainda mais preferencialmente entre 15 e 25 peptídeos. De acordo com outra forma de realização preferencial, a vacina incluirá aproximadamente 20 peptídeos, mais preferencialmente 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, ou 30 diferentes peptídeos, mais preferencial 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ou 25 diferentes peptídeos e mais preferencialmente 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ou 25 diferentes peptídeos.

[00275] Em uma forma de realização da presente invenção, os peptídeos e/ou polipeptídeos neo-antigênicos específicos de tumor são selecionados para utilização na vacina contra a neoplasia de forma a maximizar a probabilidade de gerar um ataque imunitário contra a neoplasia/tumor do paciente. Sem estar preso à teoria, acredita-se que a inclusão de uma diversidade de peptídeos neo-antigênicos específicos de tumor gerará um ataque imunitário de larga escala contra uma neoplasia/tumor. Em uma forma de realização, os peptídeos/polipeptídeos neo- antigênicos específicos de tumor selecionados são codificados por mutações de sentido trocado. Em uma segunda forma de realização, os peptídeos/polipeptídeos neo- antigênicos específicos de tumor selecionados são codificados por uma combinação de mutações de sentido trocado e mutações neoORF. Em uma terceira forma de realização, os peptídeos/polipeptídeos neo-antigênicos específicos de tumor selecionados são codificados por mutações neoORF.

[00276] Em uma forma de realização na qual os peptídeos/polipeptídeos neo-antigênicos específicos de tumor selecionados são codificados por mutações de sentido trocado, os peptídeos/polipeptídeos são escolhidos com base na sua capacidade de se associar com as moléculas MHC particulares do paciente. Peptídeos/polipeptídeos derivados de mutações neoORF podem também ser selecionados com base na sua capacidade de se associarem com as moléculas MHC particulares do paciente, mas podem também ser selecionadas mesmo se não forem previstas como passíveis de se associarem com moléculas MHC particulares do paciente.

[00277] A composição de vacina é capaz de suscitar uma resposta de células T citotóxicas específica e/ou uma resposta de célula T adjuvante específica.

[00278] A composição de vacina pode ainda compreender um adjuvante e/ou um transportador. Exemplos de adjuvantes e transportadores úteis são dados em baixo. Os peptídeos e/ou polipeptídeos na composição podem ser associados com um transportador como, por exemplo, uma proteína ou uma célula apresentando antigênio como, por exemplo, uma célula dendrítica (DC) capaz de apresentar o peptídeo a uma célula T.

[00279] Adjuvantes são qualquer substância cuja mistura na composição de vacina aumenta ou de outro modo modifica a resposta imunitária ao peptídeo mutante. Os transportadores são estruturas em plataforma, por exemplo, um polipeptídeo ou um polissacarídeo, às quais os peptídeos neo-antigênicos são capazes de serem associados. Opcionalmente, adjuvantes são conjugados covalentemente ou não covalentemente aos peptídeos ou polipeptídeos da invenção.

[00280] A capacidade de um adjuvante para aumentar a resposta imunitária a um antigênio é tipicamente manifestada por um aumento significativo em reação imunomediada, ou redução em sintomas de doenças. Por exemplo, um aumento da imunidade humoral é tipicamente manifestado por um aumento significativo no título de anticorpos subidos ao antigênio, e um aumento na atividade de célula T é tipicamente manifestado em proliferação celular aumentada, ou citotoxicidade celular ou secreção de citocinas. Um adjuvante pode também alterar uma resposta imunitária, por exemplo, alterando uma resposta primariamente humoral ou Th2 em uma resposta primariamente celular ou Th1.

[00281] Adjuvantes adequados incluem, mas não se limitam a, 1018 ISS, sais de alumínio, Amplivax, AS15, BCG, CP-870,893, CpG7909, CyaA, dSLIM, GM-CSF, IC30, IC31, Imiquimod, ImuFact IMP321, IS Patch, ISS, ISCOMATRIX, Juvlmmune, LipoVac, MF59, lípido monofosforila A, Montanide IMS 1312, Montanide ISA 206, Montanide ISA 50V, Montanide ISA-51, OK-432, OM-174, OM-197-MP-EC, ONTAK, PepTel.RTM, sistema vetor, micropartículas PLG, resiquimod, SRL172, virossomas e outras partículas tipo vírus, YF-17D, armadilha VEGF, R848, betaglucano, Pam3Cys, stimulon QS21 da Aquila (Aquila Biotech, Worcester, Mass., USA) que é derivado de saponina, extratos micobacterianos e análogos de parede da célula bacteriana sintética, e outros adjuvantes proprietários como Ribi's Detox. Quil ou Superfos. Vários adjuvantes imunológicos (por exemplo, MF59) específicos para células dendríticas e a sua preparação foram descritos previamente (Dupuis M, et al., Cell Immunol. 1998; 186(1): 18-27; Allison A C; Dev Biol Stand. 1998; 92:3-11). Também podem ser usadas citocinas. Várias citocinas foram diretamente associadas à influência sobre a migração de células dendríticas para tecidos linfóides (por exemplo, TNF-alfa), acelerando a maturação de células dendríticas em células apresentando antigênio eficientes para linfócitos T (por exemplo, GM-CSF, IL-1 e IL-4) (Patente U.S. No. 5,849,589, especificamente aqui incorporada por referência na sua totalidade) e atuando como imunoadjuvantes (por exemplo, IL-12) (Gabrilovich D I, et al., J Immunother Emphasis Tumor Immunol. 1996 (6):414-418).

[00282] Receptores tipo Toll (TLRs) também podem ser usados como adjuvantes e são membros importantes da família de receptores de reconhecimento de padrão (PRRs) que reconhecem motivos conservados partilhados por muitos microrganismos, denominados "padrões moleculares associados a patógeno" (PAMPS). O reconhecimento destes "sinais de perigo" ativa múltiplos elementos do sistema imunitário inato e adaptativo. TLRs são expressos por células dos sistema imunitário inato e adaptativo tais como células dendríticas (DCs), macrófagos, células T e B, mastócitos e granulócitos e localizam-se em diferentes compartimentos celulares, tais como a membrana plasmática, lisossomas, endossomas e endolisossomas. Diferentes TLRs reconhecem distintos PAMPS. Por exemplo, TLR4 é ativado por LPS contido em paredes de células bacterianas, TLR9 é ativado por CpG DNA bacteriano ou viral não metilado e TLR3 é ativado por RNA de fita dupla. A ligação de ligando TLR conduz à ativação de uma ou mais vias de sinalização intracelular, resultando por fim na produção de muitas moléculas-chave associadas a inflamação e imunidade (particularmente o fator de transcrição NF-KB e interferões de tipo I). Ativação mediada por TLR conduz a ativação de DC aumentada, fagocitose, regulação para cima de marcadores de ativação e co- estimulação como CD80, CD83, e CD86, expressão de CCCR7 permitindo migração de DC para drenar nodos linfáticos e facilitando a apresentação de antigênio a células T, bem como secreção aumentada de citosinas como interferões de tipo I, IL-12, e IL-6. Todos estes eventos a jusante são críticos para a indução de uma resposta imunitária adaptativa.

[00283] Entre os adjuvantes de vacina contra o câncer mais promissores atualmente em desenvolvimento clínico encontram-se o agonista de TLR9 CpG e o poli-ICLC ligando de TLR3 de RNA de fita dupla (dsRNA) sintético. Em estudos pré- clínicos, poli-ICLC parece ser o adjuvante de TLR mais potente quando comparado com LPS e CpG devido à sua indução de citocinas pro-inflamatórias e falta de estimulação de IL- 10, bem como manutenção de elevados níveis de moléculas co- estimulatórias em DCs. Além disso, poli-ICLC foi recentemente comparado diretamente com CpG em primatas não humanos (macacos Rhesus) como adjuvante de uma vacina de proteína consistindo de capsômeros do vírus do papiloma humano (HPV)16 (Stahl-Hennig C, Eisenblatter M, Jasny E, et al. Synthetic double-stranded RNAs are adjuvants for the induction of T helper 1 and humoral immune responses to human papillomavirus in rhesus macaques. PLoS pathogens. Abril de 2009;5(4)).

[00284] Oligonucleótidos imunoestimulantes de CpG também foram reportados como potencializadores dos efeitos de adjuvantes em um cenário de vacina. Sem estar preso à teoria, oligonucleótidos de CpG atuam ativando o sistema imunitário inato (não adaptativo) através de receptores tipo Tol (TLR), principalmente TLR9. A ativação de TLR9 despoletado por CpG potencia respostas humorais e celulares específicas de antigênio para vários antigênios, incluindo antigênios de peptídeos e proteínas, vírus vivos ou mortos, vacinas de células dendríticas, vacinas celulares autólogas e conjugados polissacarídeos em vacinas profiláticas e terapêuticas. Mais importantemente, potencia a maturação e diferenciação de células dendríticas, resultando em ativação potenciada de células Thl e forte geração de linfócitos T citotóxicos (CTL), mesmo na ausência de adjuvante de célula T CD4. A tendência para Thl induzida por estimulação TLR9 é mantida mesmo na presença de adjuvantes de vacina como alúmen ou adjuvante de Freund incompleto (IFA) que normalmente promovem uma tendência Th2. Oligonucleótidos de CpG mostram ainda maior atividade adjuvante quando formulados ou co- administrados com outros adjuvantes ou em formulações como micropartículas, nanopartículas, emulsões lipídicas ou formulações semelhantes, que são especialmente necessárias para induzir uma resposta forte quando o antigênio é relativamente fraco. Eles também aceleram a resposta imunitária e permitiram que as doses de antigênio fossem reduzidas em aproximadamente duas ordens de magnitude, com respostas imunitárias de anticorpos comparáveis à vacina de dose total sem CpG em algumas experiências (Arthur M. Krieg, Nature Reviews, Drug Discovery, 5, Jun. 2006, 471-484). A Patente U.S. No. 6,406,705 Bl descreve a utilização combinada de oligonucleótidos CpG, adjuvantes de ácido não nucleico e um antigênio para induzir uma resposta imunitária específica de antigênio. Um antagonista de TLR9 CpG disponível comercialmente é dSLIM (double Stem Loop Immunomodulator) da Mologen (Berlim, ALEMANHA), que é um componente preferencial da composição farmacêutica da presente invenção. Outras moléculas de ligação de TLR como TLR 7, TLR 8 e/ou TLR 9 de ligação de RNA podem também ser usadas.

[00285] Derivados de xantenona como, por exemplo, Vadimezan ou AsA404 (também conhecido como ácido 5,6- dimetilaxantenona-4-acético (DMXAA)), podem também ser usados como adjuvantes de acordo com formas de realização da invenção. Em alternativa, tais derivados podem também ser administrados em paralelo com a vacina da invenção, por exemplo através de aplicação sistêmica ou intra-tumoral, para estimular imunidade no local do tumor. Sem estar preso à teoria, acredita-se que tais derivados de xantenona atuam estimulando a produção de interferon (IFN) através do estimulador do receptor do gene de IFN ISTING (ver, por exemplo, Conlon et al. (2013) Mouse, but not Human STING, Binds and Signals in Response to the Vascular Disrupting Agent 5,6-Dimethylxanthenone-4-Acetic Acid, Journal of Immunology, 190:5216-25 e Kim et al. (2013) Anticancer Flavonoids are Mouse-Selective STING Agonists, 8:1396-1401).

[00286] Outros exemplos de adjuvantes úteis incluem, mas não se limitam a, CpGs quimicamente modificado (por exemplo, CpR, Idera), Poli(I:C)(por exemplo, polii:CI2U), DNA ou RNA bacteriano não-CpG bem como pequenas moléculas imunoativas e anticorpos como ciclofosfamida, sunitinib, bevacizumab, celebrex, NCX-4016, sildenafil, tadalafil, vardenafil, sorafinib, XL-999, CP- 547632, pazopanib, ZD2171, AZD2171, ipilimumab, tremelimumab, e SC58175, que podem atuar terapeuticamente e/ou como um adjuvante. As quantidades e concentrações de adjuvantes e aditivos úteis no contexto da presente invenção podem prontamente ser determinadas pelo técnico da área sem experimentação desnecessária. Adjuvantes adicionais incluem fatores de estimulação de colônia, como Fator Estimulador de Colônias de Macrófagos-Granulócitos (GM-CSF, sargramostim).

[00287] Poli-ICLC é um RNA de fita dupla preparado sinteticamente consistindo de fitas poliI e poliC de comprimento médio de cerca de 5000 nucleotídeos, que foi estabilizado para desnaturação térmica e hidrólise por nucleases séricas por adição de polilisina e carboximetilcelulose. O composto ativa TLR3 e o domínio de helicase de RNA de MDA5, ambos membros da família PAMP, conduzindo a ativação de DC e de células assassinas naturais (NK) e produção de uma "mistura natural" de interferons de tipo I, citocinas e quimiocinas. Além disso, poli-ICLC exerce um efeito mais direto anti-infecioso amplo direcionado ao hospedeiro e possivelmente antitumor mediado pelos dois sistemas de enzimas nucleares induzíveis por IFN, o 2’5’-OAS e a quinase P1/eIF2a, também conhecida como PKR (4-6), bem como helicase RIG-I e MDA5.

[00288] Em roedores e primatas não humanos, foi mostrado que poli-ICLC potencia respostas de célula T a antigênios virais, iniciação transversal, e a indução de células T CD8+ específicas de tumor, vírus e auto- antigênicas. Em um estudo recente em primatas não humanos, foi descoberto que poli-ICLC é essencial para a geração de respostas de anticorpos e imunidade de célula T para proteína p24 Gag de HIV direcionada ou não direcionada a DC, enfatizando a sua eficácia como adjuvante de vacina.

[00289] Em participantes humanos, a análise transcricional de amostras de sangue total em série revelou perfis de expressão de genes semelhantes entre os 8 voluntários humanos saudáveis recebendo uma administração subcutânea única de poli-ICLC e expressão diferencial de até 212 genes entre estes 8 participantes versus 4 participantes recebendo placebo. De forma notável, a comparação dos dados de expressão de gene poli-ICLC com dados prévios de voluntários imunizados com a vacina da febre amarela altamente eficaz YF17D mostrou que um grande número de vias canônicas de transdução transcricional e de sinal, incluindo as do sistema imunitário inato, foram reguladas para cima de forma semelhantes em pontos de tempo de pico.

[00290] Mais recentemente, uma análise imunológica foi reportada em pacientes com câncer dos ovários, das trompas de Falópio e peritoneal primário em segunda ou terceira remissão clínica completa que foram tratadas em um estudo de fase 1 de vacinação subcutânea com peptídeos longos sobrepostos sintéticos (OLP) do antigênio NY-ESO-1 de câncer dos testículos sozinho ou com Montanide-ISA-51, ou com 1,4 mg de poli-ICLC e Montanide. A geração de células T CD4+ e CD8+ específicas de NY-ESO-1 e respostas de anticorpos foram acentuadamente potenciadas com a adição de poli-ICLC e Montanide em comparação com OLP isolado ou OLP com Montanide.

[00291] Uma composição de vacina de acordo com a presente invenção pode compreender mais do que um adjuvante diferente. Além disso, a invenção abrange uma composição terapêutica compreendendo qualquer substância adjuvante incluindo qualquer uma das indicadas acima ou suas combinações. Também é contemplado que o peptídeo ou polipeptídeo, e o adjuvante podem ser administrados separadamente em qualquer sequência apropriada.

[00292] Um transportador pode estar presente independentemente de um adjuvante. A função de um transportador pode, por exemplo, conferir estabilidade, para aumentar a atividade biológica ou para aumentar a semi-vida sérica. Além disso, um transportador pode ajudar a apresentar peptídeos a células T. O transportador pode ser qualquer transportador adequado conhecido dos entendidos na técnica, por exemplo uma proteína ou uma célula apresentado antigênio. Uma proteína transportadora pode ser, mas não se limita a, hemocianina de lapa californiana, proteínas séricas como transferrina, albumina sérica de bovino, albumina sérica humana, tiroglobulina ou ovalbumina, imunoglobulinas, ou hormonas como insulina ou ácido palmítico. Para imunização de humanos, o transportador pode ser um transportador fisiologicamente aceitável aceitável por humanos e seguro. Contudo, toxóide tetânico e/ou toxóide diftérico são transportadores adequados em uma forma de realização da invenção. Em alternativa, o transportador podem ser dextranos, por exemplo sefarose.

[00293] Células T citotóxicas (CTLs) reconhecem um antigênio sob a forma de um peptídeo ligado a uma molécula MHC em vez do antigênio estranho intacto ele próprio. A molécula MHC em si encontra-se localizada na superfície da célula de uma célula apresentando antigênio. Assim, uma ativação de CTLs apenas é possível se estiver presente um complexo trimérico de antigênio de peptídeo, molécula MHC e APC. Correspondentemente, poder-se-á potenciar a resposta imunitária se não for usado apenas o peptídeo para ativação de CTLs, mas se forem acrescentados adicionalmente APCs com a respectiva molécula MHC. Como tal, em algumas formas de realização, a composição de vacina de acordo com a presente invenção contém adicionalmente pelo menos uma célula apresentando antigênio.

[00294] A célula apresentando antigênio (ou célula estimuladora) tipicamente tem uma molécula MHC de classe I ou II na sua superfície, e em uma forma de realização é substancialmente incapaz de carregar ela própria a molécula MHC de classe I ou II com o antigênio selecionado. Como é descrito em maior detalhe em baixo, a molécula MHC de classe I ou II pode prontamente ser carregada com o antigênio selecionado in vitro.

[00295] De preferência, as células apresentando antigênio são células dendríticas. De forma adequada, as células dendríticas são células dendríticas autólogas que são pulsadas com o peptídeo neo-antigênico. O peptídeo pode ser qualquer peptídeo adequado que suscite uma resposta de célula T apropriada. A terapia de célula T usando células dendríticas autólogas pulsadas com peptídeos de um antigênio associado a um tumor é revelada em Murphy et al. (1996) The Prostate 29, 371-380 e Tjua et al. (1997) The Prostate 32, 272-278.

[00296] Assim, em uma forma de realização da presente invenção, a composição de vacina contendo pelo menos uma célula apresentando antigênio é pulsada ou carregada com um ou mais peptídeos da presente invenção. Em alternativa, células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) isoladas de um paciente podem ser carregadas com peptídeos ex vivo e injetadas novamente no paciente. Como alternativa, a célula apresentando antigênio compreende um constructo de expressão codificando um peptídeo da presente invenção. O polinucleotídeo pode ser qualquer polinucleotídeo adequado e é preferencial que seja capaz de transduzir a célula dendrítica, resultando assim na apresentação de um peptídeo e indução de imunidade.

Métodos Terapêuticos

[00297] A invenção providencia ainda um método de induzir uma resposta imunitária específica de neoplasia/tumor em um paciente, vacinando contra uma neoplasia/tumor, tratando e/ou aliviando um sintoma de câncer em um paciente administrando ao paciente um peptídeo neo-antigênico ou composição de vacina da invenção.

[00298] De acordo com a invenção, a vacina contra o câncer acima descrita pode ser usada para um paciente que foi diagnosticado como tendo câncer, ou em risco de desenvolver câncer. Em uma forma de realização, o paciente pode ter um tumor sólido tal como um tumor dos ovários, próstata, pulmão, rim, gástrico, cólon, testicular, da cabela e pescoço, pâncreas, cérebro, melanoma e outros tumores de órgãos de tecidos e tumores hematológicos, tais como linfomas e leucemias, incluindo leucemia mielóide aguda, leucemia mielóide crônica, leucemia linfóide crônica, leucemia linfóide de célula T e linfomas de célula B.

[00299] O peptídeo ou composição da invenção é administrado em uma quantidade suficiente para induzir uma resposta CTL.

[00300] O peptídeo neo-antigênico, polipeptídeo ou composição de vacina da invenção podem ser administrados isoladamente ou em combinação com outros agentes terapêuticos. O agente terapêutico é, por exemplo, um agente quimioterapêutico ou bioterapêutico, radiação ou imunoterapia. Pode ser administrado qualquer tratamento terapêutico adequado para um câncer particular. Exemplos de agentes quimioterapêuticos e bioterapêuticos incluem, mas não se limitam a, aldesleuquina, altretamina, amifostina, asparaginase, bleomicina, capecitabina, carboplatina, carmustina, cladribina, cisaprida, cisplatina, ciclofosfamida, citarabina, dacarbazina (DTIC), dactinomicina, docetaxel, doxorubicina, dronabinol, epoetina alfa, etopósido, filgrastima, fludarabina, fluorouracil, gemcitabina, granisetrona, hidroxiureia, idarubicina, ifosfamida, interferon alfa, irinotecano, lansoprazole, levamisole, leucovorina, megestrol, mesna, metotrexato, metoclopramida, mitomicina, mitotano, mitoxantrona, omeprazole, ondansetrona, paclitaxel (Taxol®), pilocarpina, procloroperazina, rituximab, tamoxifeno, taxol, hidrocloreto de topotecano, trastuzumab, vimblastina, vincristina e tartrato de vinorelbina. Para tratamento do câncer da próstata, um agente quimioterapêutico preferencial com o qual pode ser combinado anti- CTLA-4 é paclitaxel (Taxol®).

[00301] Além disso, pode ser ainda administrado ao paciente um agente imunossupressor ou imunoestimulante. Por exemplo, é ainda administrado ao paciente um anticorpo anti- CTLA ou anti-PD-1 ou anti-PD-Ll. O bloqueio de CTLA-4 ou PD- 1/PD-L1 por anticorpos pode potenciar a resposta imunitária a células cancerígenas no paciente. Em particular, o bloqueio de CTLA-4 demonstrou ser eficaz quando é seguido um protocolo de vacinação (Hodi et al 2005).

[00302] A quantidade ótima de cada peptídeo a ser incluído na composição de vacina e o regime de dosagem ótimo podem ser determinados por um entendido na técnica sem experimentação desnecessária. Por exemplo, o peptídeo ou sua variante podem ser preparados por injeção intravenosa (i.v.), injeção subcutânea (s.c.), injeção intradérmica (i.d.), injeção intraperitoneal (i.p.), injeção intramuscular (i.m.). Métodos preferenciais de injeção de peptídeos incluem s.c, i.d., i.p., i.m., e i.v. Métodos preferenciais de injeção de DNA incluem i.d., i.m., s.c, i.p. e i.v. Por exemplo, podem ser dados entre 1 e 500 mg, 50 μg e 1,5 mg, de preferência 10 μg a 500 μg, de peptídeo ou DNA e dependerão do respectivo peptídeo ou DNA. Doses desta gama foram sucessivamente usadas em ensaios anteriores (Brunsvig P F, et al., Cancer Immunol Immunother. 2006; 55(12): 1553- 1564; M. Staehler, et al., Convenção ASCO de 2007; Abstract No 3017). Outros métodos de administração da composição de vacina são conhecidos dos entendidos na técnica.

[00303] A composição farmacêutica inventiva pode ser compilada de forma que a seleção, número e/ou quantidade de peptídeos presentes na composição seja/sejam específicas do tecido, câncer e/ou do paciente. Por exemplo, a seleção exata de peptídeos pode ser guiada por padrões de expressão das proteínas principais em um dado tecido para evitar efeitos secundários. A seleção pode estar dependente do tipo específico de câncer, o estado da doença, anteriores regimes de tratamento, o estado de imunidade do paciente, e, claro, do halótipo HLA do paciente. Além disso, a vacina de acordo com a invenção pode conter componentes individualizados, de acordo com necessidades pessoais do paciente particular. Exemplos incluem variar as quantidades de peptídeos de acordo com a expressão do neo-antigênio relacionado no paciente particular, efeitos secundários indesejados devido a alergias pessoais ou outros tratamentos, e ajustes para tratamentos secundários a seguir a uma primeira ronda ou esquema de tratamento.

[00304] Composições farmacêuticas compreendendo o peptídeo da invenção podem ser administradas a um indivíduo já sofrendo de câncer. Em aplicações terapêuticas, são administradas composições a um paciente em uma quantidade suficiente para obter uma resposta CTL eficaz ao antigênios tumorais e a curar ou pelo menos parcialmente deter sintomas e/ou complicações. Uma quantidade adequada para alcançar isto é definida como "dose terapeuticamente eficaz". Quantidades eficazes para esta utilização dependerão, por exemplo, da composição peptídica, da forma de administração, estágio e gravidade da doença a ser tratada, o peso e estado geral do paciente, e avaliação do médico que faz a prescrição, mas geralmente variam para a imunização inicial (ou seja, para administração terapêutica ou profilática) entre cerca de 1,0 μg a cerca de 50.000 μg de peptídeo para um paciente de 70 kg, seguido de dosagens de reforço ou de cerca de 1,0 μg a cerca de 10.000 μg de peptídeo no seguimento de um regime de reforço ao longo de semanas ou meses dependendo da resposta e estado de saúde do paciente e possivelmente medindo a atividade CTL específica no sangue do paciente. Deve ser tido em mente que o peptídeo e composições da presente invenção podem geralmente ser empregues em estados de doença grave, ou seja, situações nas quais se corre perigo de vida ou nas quais se poderá correr perigo de vida, especialmente quando o câncer tem metástases. Para utilização terapêutica, a administração deve começar o mais cedo possível após a detecção ou remoção cirúrgica de tumores. A isto seguem-se de doses de reforço até pelo menos os sintomas serem substancialmente reduzidos e por um período subsequente.

[00305] As composições farmacêuticas (por exemplo, composições de vacina) para tratamento terapêutico destinam- se a administração parenteral, tópica, nasal, oral ou local. De preferência, as composições farmacêuticas são administradas parenteralmente, por exemplo, de forma intravenosa, subcutânea, intradérmica ou intramuscular. As composições podem ser administradas no local da excisão cirúrgica para induzir uma resposta imunitária local ao tumor. A invenção providencia composições para administração parenteral que compreendem que uma solução de peptídeos e composições de vacina sejam dissolvidas ou suspensas em um transportador aceitável, de preferência um transportador aquoso. Pode ser usada uma variedade de transportadores aquosos, por exemplo água, água tamponada, 0,9% de solução salina, 0,3% de glicina, ácido hialurônico e semelhantes. Estas composições podem ser esterilizadas por técnicas de esterilização convencionais bem conhecidas, ou podem ser esterilizadas por filtração. As soluções aquosas resultante podem ser embaladas para utilização como estão, ou liofilizadas, a preparação liofilizada sendo combinada com uma solução esterilizada antes da administração. As composições podem conter substâncias auxiliares farmaceuticamente aceitáveis como requerido para aproximar as condições fisiológicas, tais como ajuste de pH e agentes de tamponamento, agentes de ajuste de tonicidade, agentes umectantes e semelhantes, por exemplo, acetato de sódio, lactato de sódio, cloreto de sódio, cloreto de potássio, cloreto de cálcio, monolaurato de sorbitano, oleato de trietanolamina, etc.

[00306] A concentração de peptídeos da invenção nas formulações farmacêuticas pode variar amplamente, ou seja, de normalmente menos de cerca de 0,1% a pelo menos cerca de 2% até 20% a 50% ou mais em peso, e será selecionada primariamente por volumes de fluido, viscosidade, etc., de acordo com o modo particular de administração selecionado.

[00307] Uma suspensão de lipossomas contendo um peptídeo pode ser administrada de forma intravenosa, local, tópica, etc. em uma dose que varia de acordo com, entre outros, a forma de administração, o peptídeo a aplicar, e o estágio da doença a ser tratada. Para alvejar células imunitárias, pode ser incorporado no lipossoma um ligando, tal como, por exemplo, anticorpos ou seus fragmentos específicos para determinantes de superfície da célula das desejadas células do sistema imunitário.

[00308] Para composições sólidas, podem ser usados transportadores sólidos não tóxicos convencionais ou de nanopartículas que incluem, por exemplo, graus farmacêuticos de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina de sódio, talco, celulose, glicose, sacarose, carbonato de magnésio e semelhantes. Para administração oral, uma composição não tóxica farmaceuticamente aceitável é formada incorporando qualquer um dos excipientes normalmente empregues, tais como os transportadores previamente listados, e geralmente 10-95% de ingrediente ativo, ou seja, um ou mais peptídeos da invenção, e mais preferencialmente em uma concentração de 25%-75%.

[00309] Para administração por aerossol, os peptídeos imunogênicos são preferencialmente fornecidos em forma dividida finamente juntamente com um surfactante e propulsor. Porcentagens de peptídeos típicas são 0,01 %-20% em peso, de preferência 1%-10%. O surfactante será, claro, não tóxico e preferencialmente solúvel no propulsor. Representativos de tais agentes são os ésteres de ou ésteres parciais de ácidos graxos contendo de 6 a 22 átomos de carbono, como ácidos capróico, octanóico, láurico, palmítico, esteárico, linoleico, linolênico, olestérico e oleico com um álcool poli-hídrico alifático ou o seu anidrido cíclico. Podem ser empregues ésteres misturados, como glicerídeos misturados ou naturais. O surfactante pode constituir 0,1%-20% em peso da composição, de preferência 0,25-5%. O equilíbrio da composição é ordinariamente propulsor. Também pode ser incluído um transportador como desejado, por exemplo com lecitina para aplicação intranasal.

[00310] Os peptídeos e polipeptídeos da invenção podem ser prontamente sintetizados quimicamente usando reagentes livres de bactérias contaminantes ou substâncias animais (Merrifield RB: Solid phase peptide synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide. J. Am. Chem. Soc. 85:214954, 1963).

[00311] Para propósitos terapêuticos ou de imunização, também podem ser administrados ao paciente ácidos nucléicos codificando o peptídeo da invenção e opcionalmente um ou mais dos peptídeos aqui descritos. Vários métodos são convenientemente usados para entregar os ácidos nucléicos ao paciente. Por exemplo, o ácido nucleico pode ser entregue diretamente, como "DNA nu". Esta abordagem é descrita, por exemplo, em Wolff et al., Science 247: 14651468 (1990) bem como nas Patentes U.S. Nos. 5,580,859 e 5,589,466. Os ácidos nucléicos também podem ser administrados usando entrega balística como descrito por exemplo, na Patente U.S. No. 5,204,253. Podem ser administradas partículas consistindo apenas de DNA. Em alternativa, pode ser aderido DNA às partículas, tais como partículas de ouro.

[00312] Os ácidos nucléicos também podem ser fornecidos complexados a compostos catiônicos, tais como lipídeos catiônicos. Métodos de fornecimento de genes mediado por lipídeos são descritos, por exemplo, em WO1996/18372; WO 1993/24640; Mannino & Gould-Fogerite, BioTechniques 6(7): 682-691 (1988); Patente U.S. No. 5,279,833; WO 1991/06309; e Feigner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413-7414 (1987).

[00313] RNA codificando o peptídeo de interesse também pode ser usado para fornecimento (ver, por exemplo, Kiken et al, 2011; Su et al, 2011).

[00314] Os peptídeos e polipeptídeos da invenção também podem ser expressos por hospedeiros virais atenuados, tais como vaccinia ou bouba aviária. Esta abordagem envolve a utilização do vírus vaccinia como um vetor para expressar sequências de nucleotídeo que codificam o peptídeo da invenção. Após introdução em um hospedeiro infetado de forma aguda ou crônica ou em um hospedeiro não infetado, o vírus vaccinia recombinante expressa o peptídeo imunogênico e obtém assim uma resposta CTL do hospedeiro. Vetores vaccinia e métodos úteis em protocolos de imunização são descritos por exemplo, na Patente U.S. No. 4,722,848,. Outro vetor é BCG (Bacilos Calmette Guerin). Vetores BCG são descritos em Stover et al. (Nature 351:456-460 (1991)). Uma grande variedade de outros vetores úteis para administração terapêutica ou imunização dos peptídeos da invenção, por exemplo vetores de Salmonella typhi e semelhantes, serão aparentes aos entendidos na técnica a partir desta descrição.

[00315] Um meio preferencial de administrar ácidos nucléicos codificando o peptídeo da invenção usa constructos de minigene codificando múltiplos epítopos. Para criar uma sequência de DNA codificando os epítopos CTL selecionados (minigene) para expressão em células humanas, as sequências de aminoácidos dos epítopos são traduzidas reversamente. Uma tabela de utilização de códons humanos é usada para guiar a escolha de códons para cada aminoácido. Estas sequências de DNA codificando epítopos são diretamente unidas, criando uma sequência de polipeptídeos contínua. Para otimizar expressão e/ou imunogenicidade, podem ser incorporados elementos adicionais no desenho do minigene. Exemplos de sequência de aminoácidos que poderiam ser traduzidos reversamente e incluídos na sequência de minigene incluem: linfócito T adjuvante, epítopos, uma sequência líder (sinal) e um sinal de retenção de retículo endoplasmático. Além disso, a apresentação MHC de epítopos CTL pode ser melhorada pela inclusão de sequências flanqueadoras sintéticas (por exemplo, poli-alanina) ou ocorrendo naturalmente adjacentes aos epítopos CTL.

[00316] A sequência de minigene é convertida para DNA montando oligonucleótidos que codificam as cadeias mais e menos do minigene. Oligonucleótidos sobrepostos (30-100 bases de comprimento) são sintetizados, fosforilados, purificados e anelados sob condições apropriadas usando técnicas bem conhecidas. As extremidades dos oligonucleótidos são unidas usando ligase de DNA T4. Este minigene sintético, codificando o polipeptídeo de epítopo CTL, pode então ser clonado em um vetor de expressão desejado.

[00317] Sequências reguladoras padrão bem conhecidas dos entendidos na técnica são incluídas no vetor para assegurar expressão nas células alvo. São requeridos vários elementos de vetor: um promotor com um local de clonagem a jusante para inserção de minigene; um sinal de poliadenilação para terminação de transcrição eficiente; uma origem de replicação E. coli; e um marcador selecionável E. coli (por exemplo, resistência à ampicilina ou canamicina). Podem ser usados numerosos promotores para este propósito, por exemplo, o promotor de citomegalovírus (hCMV). Ver as Patentes U.S. Nos. 5,580,859 e 5,589,466 para outras sequências de promotores adequados.

[00318] Podem ser desejadas modificações de vetor adicionais para otimizar a expressão de minigene e a imunogenicidade. Em alguns casos, são necessários íntrons para expressão de gene eficiente, e podem ser incorporados um ou mais íntrons sintéticos ou ocorrendo naturalmente na região transcrita do minigene. A inclusão de sequências de estabilização de mRNA também pode ser considerada para aumentar a expressão de minigene. Foi recentemente proposto que sequências imunoestimulantes (ISSs ou CpGs) desempenham um papel na imunogenicidade das vacinas de DNA. Estas sequências poderiam ser incluídas no vetor, fora da sequência de codificação do minigene, se determinadas como potencializadoras da imunogenicidade.

[00319] Em algumas formas de realização, podem ser usados um vetor de expressão bicistrônico para permitir a produção dos epítopos codificados por minigene e uma segunda proteína incluída para potenciar ou reduzir a imunogenicidade. Exemplos de proteínas ou polipeptídeos que poderiam potenciar beneficamente a resposta imunitária se co-expressos incluem citocinas (por exemplo, IL2, IL12, GM- CSF), moléculas indutoras de citocina (por exemplo, LeIF) ou moléculas co-estimulantes. Epítopos adjuvantes (HTL) poderiam ser unidos a sinais de direcionamento intracelular e expressos separadamente dos epítopos CTL. Isto permitiria direcionamento dos epítopos HTL para um compartimento celular diferente dos epítopos CTL. Se desejado, isto poderia facilitar a entrada mais eficiente de epítopos HTL na via de classe MHC II, melhorando assim a indução CTL. Em contraste com a indução CTL, diminuir especificamente a resposta imunitária por co-expressão de moléculas imunossupressoras (por exemplo, TGF- β) pode ser benéfico em certas doenças.

[00320] Uma vez selecionado um vetor de expressão, o minigene é clonado na região poliligadora a jusante do promotor. O plasmídeo é transformado em uma estirpe E-coli apropriada e é preparado DNA usando técnicas padronizadas. A orientação e sequência de DNA do minigene, bem como todos os outros elementos incluídos no vetor são confirmados usando mapeamento de restrição e análise de sequência de DNA. Células bacterianas abrigando o plasmídeo correto podem ser armazenadas como um banco de células principal e um banco de células de trabalho.

[00321] Pode ser preparado DNA plasmídico purificado para injeção usando várias formulações. A mais simples destas é reconstituição de DNA liofilizado em solução salina tamponada com fosfato (PBS) esterilizada. Vários métodos foram descritos, e novas técnicas podem ficar disponíveis. Como indicado em cima, ácidos nucléicos são convenientemente formulados com lipídeos catiônicos. Além disso, glicolipídeos, lipossomas fusogênicos, peptídeos e compostos referidos coletivamente como protetores, interativos, não condensadores (PINC) poderiam também ser complexados para DNA plasmídico purificado para influenciar variáveis como a estabilidade, dispersão intramuscular ou tráfego para órgãos ou tipos de células específicos.

[00322] Pode ser usada sensibilização de célula alvo como ensaio funcional para expressão e apresentação de classe MHC I de epítopos CTL codificados por minigene. O DNA plasmídico é introduzido em uma linha celular de mamífero adequada como alvo para ensaios de liberação de crômio CTL padrão. O método de transfecção usado será dependente da formulação final. Pode ser usada eletroporação para DNA "nu", enquanto lipídeos catiônicos permitem direcionar a transfecção in vitro. Uma proteína verde fluorescente expressando plasmídeo (GFP) pode ser transfectada para permitir enriquecimento de células transfectadas usando separação de células ativada por fluorescência (FACS). Estas células são então marcadas com crômio-51 e usadas como células alvo para linhas CTL específicas de epítopo. Citólise, detectada por liberação de 51 Cr, indica produção de apresentação MHC de epítopos CTL codificados por minigene.

[00323] A imunogenicidade in vivo é uma segunda abordagem para teste funcional de formulações de DNA de minigene. Camundongos transgênicos expressando moléculas MHC humanas apropriadas são imunizados com o produto de DNA. A dose e via de administração são dependentes da formulação (por exemplo, IM para DNA em PBS, IP para DNA complexado por lípido). Vinte e um dias após imunização, são colhidos esplenócitos e re-estimulados durante 1 semana na presença de peptídeos codificando cada epítopo sendo testado. Estas células efetoras (CTLs) são testadas quanto a citólise de células alvo marcadas com crômio-51 carregadas com peptídeos usando técnicas padronizadas. A lise de células alvo sensibilizadas por carga MHC de peptídeos correspondendo a epítopos codificados por minigene demonstra função de vacina de DNA para a indução in vivo de CTLs.

[00324] Podem também ser usados peptídeos para obter CTL ex vivo. O CTL resultante pode ser usado para tratar tumores crônicos em pacientes que não respondem a outras formas convencionais de terapia, ou que não respondam a uma abordagem de terapia de vacina de peptídeos. As respostas CTL ex vivo a um antigênio tumoral particular são induzidas incubando em cultura de tecido as células precursoras de CTL do paciente (CTLp) juntamente com uma fonte de células apresentando antigênio (APC) e o peptídeo apropriado. Após um tempo de incubação apropriado (tipicamente 1-4 semanas), no qual as CTLp são ativadas e maturam e expandem para CTL efetoras, as células são infundidas de volta no paciente, onde destruirão a sua célula alvo específica (ou seja, uma célula tumoral). De forma a otimizar as condições in vitro para a geração de células T citotóxicas específicas, a cultura de células estimulantes é mantida em um meio sem soro apropriado.

[00325] Antes da incubação das células estimulantes com as células a serem ativadas, por exemplo, células CD8+ precursoras, uma quantidade de peptídeo antigênico é adicionada à cultura de células estimulantes, em uma quantidade suficiente para se tornar carregado nas moléculas humanas de classe I a serem expressas na superfície das células estimulantes. Na presente invenção, uma quantidade de peptídeo suficiente é uma quantidade que permitirá que 200, e preferencialmente 200 ou mais moléculas MHC humanas de classe I carregadas com o peptídeo sejam expressas na superfície de cada célula estimulante. De preferência, as células estimulantes são incubadas com >2μg/ml de peptídeo. Por exemplo, as células estimulantes são incubadas com > 3, 4, 5, 10, 15, ou mais μg/ml de peptídeo.

[00326] Células CD8+ de repouso ou precursoras são então incubadas em cultura com as células estimulantes apropriadas por um período de tempo suficiente para ativar as células CD8+. De preferência, as células CD8+ são ativadas de forma específica ao antigênio. O rácio de células CD8+ (efetoras) de repouso ou precursoras para células estimulantes pode variar de indivíduo para indivíduo e pode ainda depender de variáveis como a receptividade dos linfócitos de um indivíduo a condições de cultura e a natureza e gravidade da doença ou outro problema de saúde para o qual a modalidade de tratamento nela descrita seja usada. De preferência, contudo, o rácio linfócitos:células estimulantes fica compreendido no intervalo de cerca de 30: 1 a 300: 1. A cultura efetor/estimulante pode ser mantida durante o tempo necessário para estimular um número terapeuticamente utilizável ou eficaz de células CD8+.

[00327] A indução de CTL in vitro requer o reconhecimento específico de peptídeos que estão ligados a moléculas MHC de classe I específicas de alelos em APC. O número de complexos específicos de MHC/peptídeo por APC é crucial para a estimulação de CTL, particularmente em respostas imunitárias primárias. Apesar de pequenas quantidade de complexos de peptídeo/MHC por célula serem suficientes para tornar uma célula suscetível a lise por CTL, ou para estimular uma resposta CTL secundária, a ativação bem-sucedida de um precursor de CTL (pCTL) durante resposta primária exige um número de complexos MHC/peptídeo significativamente superior. A carga de peptídeos de moléculas vazias de complexo principal de histocompatibilidade em células permite a indução de respostas primárias de linfócitos T citotóxicos.

[00328] Uma vez que não existem linhas celulares mutantes para cada alelo MHC humano, é vantajoso usar uma técnica para remover peptídeos associados a MHC endógenos da superfície de APC, seguido de carga das moléculas MHC vazias resultantes com peptídeos imunogênicos de interesse. A utilização de células não infetadas, não transformadas (não tumorigênicas) e de preferência, células autólogas de paciente como APC é desejável para o desenho de protocolos de indução de CTL dirigido para o desenvolvimento de terapias de CTL ex vivo. Este pedido revela métodos para remover os peptídeos associados a MHC endógenos da superfície de APC seguido de carga dos peptídeos desejados.

[00329] Uma molécula MHC de classe I estável é um complexo trimérico formado pelos seguintes elementos: 1) um peptídeo normalmente de 8-10 resíduos, 2) uma cadeia de proteína polimórfica pesada transmembrana que suporta o local de ligação de peptídeo nos seus domínios a1 e a2, e 3) uma cadeia leve não polimórfica não covalentemente associada, p2microglobulina. Remover os peptídeos ligados e/ou dissociar a p2microglobulina do complexo torna as moléculas MHC de classe I não funcionais e instáveis, resultando em degradação rápida. Todas as moléculas MHC de classe I isoladas de PBMCs possuem peptídeos endógenos ligados a elas. Como tal, a primeira etapa é remover todos os peptídeos endógenos ligados a moléculas MHC de classe I no APC sem provocar a sua degradação antes de peptídeos exógenos poderem ser adicionados a eles.

[00330] Duas possíveis formas de liberar moléculas MHC de classe I de peptídeos ligados incluem baixar a temperatura de cultura de 37 °C para 26 °C durante a noite para desestabilizar a p2microglobulina e remover peptídeos endógenos da célula usando um tratamento ácido suave. Os métodos liberam peptídeos anteriormente ligados para o ambiente extracelular, permitindo que novos peptídeos exógenos se liguem às moléculas de classe I vazias. O método de incubação de temperatura fria permite que peptídeos exógenos se liguem eficazmente ao complexo MHC, mas exige uma incubação durante a noite a 26 °C, o que poderá tornar mais lenta a taxa metabólica da célula. Também é provável que células que não sintetizem ativamente moléculas MHC (por exemplo, PBMC de repouso) não produzam elevadas quantidades de moléculas MHC de superfície vazia pelo procedimento de temperatura fria.

[00331] A remoção de ácido duro envolve a extração de peptídeos com ácido trifluoracético, pH 2 ou desnaturação acídica dos complexos de peptídeos de classe I purificados por imunoafinidade. Estes métodos não são exequíveis para indução CTL, uma vez que é importante remover os peptídeos endógenos ao mesmo tempo que se preserva a viabilidade APC e um estado metabólico ótimo que é crítico para apresentação de antigênios. Soluções de ácido suave de pH 3 como glicina ou tampões de citrato-fosfato têm sido usadas para identificar peptídeos endógenos e para identificar epítopos de célula T associados a tumor. O tratamento é especialmente eficaz na medida em que apenas as moléculas MHC de classe I são desestabilizadas (e os peptídeos associadas liberados), enquanto outros antigênios de superfície permanecem intactos, incluindo moléculas MHC de classe II. Mais importante ainda, o tratamento de células com soluções de ácido suave não afetam a viabilidade da célula ou o estado metabólico. O tratamento de ácido suave é rápido, uma vez que a remoção dos peptídeos endógenos ocorre em dois minutos a 4°C e o APC está pronto a realizar a sua função após os peptídeos apropriados serem carregados. A técnica é utilizada aqui para fazer APCs específicos de peptídeos para geração de CTL primário específico de antigênio. O APC resultante é eficiente na indução de CTL CD8+ específico de peptídeo.

[00332] Células CD8+ ativadas podem ser eficazmente separadas das células estimulantes usando um de vários métodos conhecidos. Por exemplo, anticorpos monoclonais específicos para as células estimulantes, para os peptídeos carregados nas células estimulantes, ou para as células CD8+ (ou um seu segmento) podem ser utilizados para ligar o seu ligando complementar. Moléculas marcadas com anticorpos podem então ser extraídas da mistura de células estimulantes- efetoras através dos meios apropriados, por exemplo através de métodos de imunoprecipitação ou imunoensaios bem conhecidos.

[00333] Quantidades citotóxicas eficazes das células CD8+ ativadas podem variar entre utilizações in vitro e in vivo, bem como com a quantidade e tipo de células que são o alvo final destas células assassinas. A quantidade também variará dependendo do problema de saúde do paciente e deve ser determinada através da consideração de todos os fatores apropriados pelo médico. Preferencialmente, contudo, cerca de 1 X 106 a cerca de 1 X 1012, mais preferencialmente cerca de1 X 108 a cerca de 1 X 1011, e ainda mais preferencialmente, cerca de 1 X 109 a cerca de 1 X 1010 de células CD8+ ativadas foram utilizadas para humanos adultos em comparação com cerca de 5 X 106 - 5 X 107 células usadas em camundongos.

[00334] De preferência, como acima discutido, as células CD8+ ativadas são colhidas da cultura celular antes de administração das células CD8+ ao indivíduo a ser tratado. É importante notar, contudo, que ao contrário de outras modalidades de tratamento presentes e propostas, o presente método usa um sistema de cultura celular que é não tumorigênico. Como tal, se não for alcançada separação completa de células estimulantes e células CD8+ ativadas, não se conhece qualquer perigo inerente associado à administração de um pequeno número de células estimulantes, enquanto a administração de células promotoras de tumor de mamíferos pode ser extremamente perigosa.

[00335] Métodos de reintroduzir componentes celulares são conhecidos na técnica e incluem procedimentos como os exemplificados na Patente U.S. No. 4,844,893 de Honsik, et al. e Patente U.S. No. 4,690,915 de Rosenberg. Por exemplo, é apropriada a administração de células CD8+ por meio de infusão intravenosa.

[00336] A atividade de células CD8+ pode ser aumentada através da utilização de células CD4+. A identificação de epítopos de célula CD4 T+ para antigênios tumorais atraiu o interesse porque muitas terapias de base imunitária contra o câncer podem ser ser mais eficazes se forem usados linfócitos T CD8+ e CD4+ para tratar um tumor de um paciente. As células CD4+ são capazes de potenciar respostas de célula T CD8. Muitos estudos em modelos animais demonstraram claramente melhores resultados quando ambas as células T CD4+ e CD8+ participam em respostas anti-tumorais (ver, por exemplo, Nishimura et al. (1999) Distinct role of antigen-specific T helper type 1 (TH1) and Th2 cells in tumor eradication in vivo. J Ex Med 190:617-27). Foram identificados epítopos de células T CD4+ universais que são aplicáveis a terapias em desenvolvimento contra diferentes tipos de câncer (ver, por exemplo, Kobayashi et al. (2008) Current Opinion in Immunology 20:221-27). Por exemplo, um peptídeo adjuvante limitado em HLA-DR de toxóide tetânico foi usado em vacinas contra melanoma para ativar células T CD4+ não especificamente (ver, por exemplo, Slingluff et al. (2007) Immunologic and Clinical Outcomes of a Randomized Phase II Trial of Two Multipeptide Vaccines for Melanoma in the Adjuvant Setting, Clinical Cancer Research 13(21):6386- 95). È contemplado dentro do escopo da invenção que tais células CD4+ possam ser aplicáveis a três níveis que variam na sua especificidade tumoral: 1) um nível amplo no qual podem ser usados epítopos CD4+ (por exemplo, toxóide tetânico) para aumentar células CD8+; 2) um nível intermediário no qual epítopos CD4+ nativos associados a tumor podem ser usados para aumentar células CD8+; e 3) um nível específico do paciente no qual epítopos CD4+ podem ser usados para aumentar células CD8+ de forma específica do paciente.

[00337] Também pode ser gerada imunidade de células CD8+ com vacina de célula dendrítica (DC) carregada com neo- antigênio. As DCs são células apresentando antigênio que iniciam imunidade de célula T e podem ser usadas como vacinas contra o câncer quando carregadas com um ou mais peptídeos de interesse, por exemplo, por injeção direta de peptídeo. Por exemplo, pacientes que foram recém-diagnosticados com melanoma metastático mostraram ficar imunizados contra peptídeos derivados de antigênio gp 100 limitados por 3 HLA- A*0201 com DCs maturas ativadas por CD40L/IFN-g- pulsadas com peptídeo autólogo através de uma vacina DC de paciente produtora de IL-12p70 (ver, por exemplo, Carreno et al (2013) L-12p70-producing patient DC vaccine elicits Tc1-polarized immunity, Journal of Clinical Investigation, 123(8):3383-94 e Ali et al. (2009) In situ regulation of DC subsets and T cells mediates tumor regression in mice, Cancer Immunotherapy, 1(8):1-10). É contemplado dentro do escopo da invenção que DCs carregadas com neo-antigênios podem ser preparadas usando o agonista de TLR3 sintético ácido poliinosinic-policitidílico-poli-L-lisina Carboximetilcelulose (Poli-ICLC) para estimular as DCs. Poli-ICLC é um estímulo de maturação individual potente para DCs humanas como avaliado por uma regulação para cima de CD83 e CD86, indução de produção de interleucina-12 (IL-12), fator de necrose tumoral (TNF), proteína interferon gama- induzida 10 (IP-10), interleucina 1 (IL-1), e interferons de tipo I (IFN), e interleucina minimal 10 (IL-10) As DCs podem ser diferenciadas de células mononucleares do sangue periférico congelado (PBMCs) obtidas por leucaferese, enquanto PBMCs podem ser isoladas por centrifugação gradiente de Ficoll e congeladas em alíquotas.

[00338] Ilustrativamente, pode ser usado o seguinte protocolo de ativação de 7 dias. Dia 1 - PBMCs são descongeladas e plaqueadas em balões de cultura de tecido para selecionar monócitos que aderem à superfície de plástico após incubação de 1-2 horas a 37 °C na incubadora de cultura de tecido. Após incubação, os linfócitos são lavados e os monócitos aderentes são cultivados por 5 dias na presença de interleucina-4 (IL-4) e fator de estimulação de colônia de macrófagos-granulócitos (GM-CSF) para diferenciar de DCs imaturas. No Dia 6, as DCs imaturas são pulsadas com a proteína de hemocianina de lapa californiana (KLH) que serve como controle de qualidade da vacina e que pode reforçar a imunogenicidade da vacina. As DCs são estimuladas com antigênios maduros carregados com peptídeos e incubadas de um dia para o outro. No Dia 7, as células são lavadas e congeladas em alíquotas de 1 ml contendo células 4-20 x 10(6) usando um congelador de taxa controlada. Podem ser realizados teste de liberação de lote para os lotes de DCs para cumprir as especificações mínimas antes das DCs serem injetadas em pacientes (ver, por exemplo, Sabado et al. (2013) Preparation of tumor antigen-loaded mature dendritic cells for immunotherapy, J. Vis Exp. 1 de agosto;(78). doi: 10.3791/50085).

[00339] Pode ser incorporada uma vacina DC em um sistema de molde para facilitar a aplicação a um paciente. O tratamento terapêutico de uma neoplasia de paciente com uma vacina DC pode utilizar um sistema biomaterial que libera fatores que recrutam células dendríticas hospedeiras para o dispositivo, diferencia as DCs residentes imaturas ao apresentar localmente adjuvantes (por exemplo, sinais de perigo) ao mesmo tempo que libera antigênio, e promove a liberação de DCs ativas carregadas com antigênio para os linfonodos (ou local de ação desejado) onde as DCs podem interagir com células T para gerar uma resposta de linfócitos T citotóxicos aos neo-antigênios do câncer. Biomateriais implantáveis podem ser usados para gerar uma resposta potente de linfócitos T citotóxicos contra uma neoplasia em uma forma específica ao paciente. As células dendríticas residentes no biomaterial podem então ser ativadas,expondo-as a sinais de perigo imitando infeção, em conjugação com liberação de antigênio do biomaterial. As células dendríticas ativadas migram então dos biomateriais para os linfonodos para induzir uma resposta efetora T citotóxica. Foi previamente demonstrado, em estudos pré-clínicos usando um lisado preparado a partir de biopsias de tumor, que esta abordagem conduz a regressão de melanoma estabelecido (ver, por exemplo, Ali et al. (2209) In situ regulation of DC subsets and T cells mediates tumor regression in mice, Cancer Immunotherapy 1(8):1-10; Ali et al. (2009) Infectionmimicking materials to program dendritic cells in situ. Nat Mater 8:151-8), e uma tal vacina está atualmente a ser testada em um ensaio clínico de Fase I recentemente iniciado no Dana-Farber Cancer Institute. Também foi demonstrado que esta abordagem conduz a regressão de glioblastoma, bem como a indução de uma resposta de memória potente para evitar recaídas, usando o modelo.24 de glioma de rato C6 Na atual proposta. A capacidade de um tal molde implantável de aplicação de vacina em biomatriz para amplificar e manter ativação de célula dendrítica específica de tumor pode conduzir a uma imunosensibilização anti-tumoral mais robusta que pode ser alcançada por administrações tradicionais de vacina subcutânea ou intra-nodal.

[00340] A prática da presente invenção emprega, salvo indicação em contrário, técnicas convencionais de biologia molecular (incluindo técnicas recombinantes), microbiologia, biologia celular, bioquímica e imunologia, que estão bem dentro da competência do perito na área. Tais técnicas são explicadas totalmente na literatura, tais como "Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, segunda edição (Sambrook, 1989); “Oligonucleotide Synthesis” (Gait, 1984); “Animal Cell Culture” (Freshney, 1987); “Methods in Enzymology” “Handbook of Experimental Immunology” (Wei, 1996); “Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells” (Miller e Calos, 1987); “Current Protocols in Molecular Biology” (Ausubel, 1987); “PCR: The Polymerase Chain Reaction”, (Mullis, 1994); “Current Protocols in Immunology” (Coligan, 1991). Estas técnicas são aplicáveis à produção dos polinucleotídeos e polipeptídeos da invenção e, como tal, podem ser consideradas na efetivação e prática desta invenção. Técnicas particularmente úteis para formas de realização particulares serão discutidas nas seções que se seguem.

EXEMPLOS

[00341] Os exemplos que se seguem são avançados de forma a providenciar os ordinariamente entendidos na técnica com uma revelação e descrição completas de como fazer e usar os métodos de ensaio, rastreio e de terapia da invenção e não se destinam a limitar o escopo daquilo que os inventores encaram como a sua invenção.

Exemplo 1: Protocolo de Testes de Vacina Contra o Câncer

[00342] As composições e métodos acima descritos podem ser testados em 15 pacientes com melanoma de risco elevado (estágios totalmente ressectados IIIB, IIIC e IVM1a,b) de acordo com o processo de fluxo geral mostrado na FIG. 2. Os pacientes podem receber uma série de vacinações de iniciação com uma mistura de peptídeos e poli-ICLC específicos de tumor personalizados ao longo de um período de 4 semanas seguido de dois reforços durante a fase de manutenção. Todas as vacinações serão administradas subcutaneamente. A vacina será avaliada quanto a segurança, tolerabilidade, resposta imunitária e efeito clínico nos pacientes e quanto a exequibilidade de produzir a vacina e iniciar vacinação com sucesso dentro de um período de tempo apropriado. O grupo consistirá de 5 pacientes e após ser demonstrada adequadamente a segurança, pode ser integrado um grupo adicional de 10 pacientes (ver, por exemplo, a FIG. 3 representando uma abordagem para um estudo de população inicial). O sangue periférico será amplamente monitorizado quanto a respostas de célula T específicas de peptídeos e os pacientes serão seguidos durante até dois anos para avaliar a recorrência da doença.

[00343] Como acima descrito, há um grande conjunto de evidências em animais e humanos que apontam para os epítopos serem eficazes na indução de uma resposta imunitária e que casos de regressão de tumor espontânea ou sobrevivência de longo prazo se correlacionam com respostas de célula T CD8+ a epítopos mutados (Buckwalter e Srivastava PK. "It is the antigen(s), stupid" and other lessons from over a decade of vaccitherapy of human cancer. Seminars in immunology 20:296300 (2008); Karanikas et al, High frequency of cytolytic T lymphocytes directed against a tumor-specific mutated antigen detectable with HLA tetramers in the blood of a lung carcinoma patient with long survival. Cancer Res. 61:37183724 (2001); Lennerz et al, The response of autologous T cells to a human melanoma is dominated by mutated neoantigens. Proc Natl Acad Sci U S A.102:16013 (2005)) e que a “imunoedição” pode ser atribuída a alterações na expressão de antigênios mutados dominantes em camundongos e homens (Matsushita et al, Cancer exome analysis reveals a T-cell- dependent mechanism of cancer immunoediting Nature 482:400 (2012); DuPage et al, Expression of tumor-specific antigens underlies cancer immunoediting Nature 482:405 (2012); e Sampson et al, Immunologic escape after prolonged progression-free survival with epidermal growth factor receptor variant III peptide vaccination in patients with newly diagnosed glioblastoma J Clin Oncol. 28:4722-4729 (2010)).

[00344] A sequenciação de próxima geração pode agora rapidamente revelar a presença de mutações discretas tais como mutações de codificação em tumores individuais, mais comummente alterações de aminoácidos únicas (por exemplo, mutações de sentido trocado; FIG. 4A) e menos frequentemente novos trechos de aminoácidos gerados por inserções de deslocamento de quadro de leitura/deleções/fusões de genes, mutações read-through em códons de paragem e tradução de íntrons impropriamente unidos (por exemplo, neoORFs; FIG. 4B). NeoORFs são particularmente valiosos como imunogênios porque toda a sua sequência é completamente nova para o sistema imunitário sendo assim análogos para um antigênio estranho viral ou bacteriano. Assim, os neoORFs: (1) são altamente específicos ao tumor (ou seja, não há expressão em células normais); (2) podem contornar a tolerância central, aumentando assim a frequência de precursor de CTLs específicos de neoantigênios. Por exemplo, o poder de utilizar sequências estranhas análogas em uma vacina anticancerígena terapêutica foi recentemente demonstrado com peptídeos derivados do vírus do papiloma humano (HPV). ~50% dos 19 pacientes com doença pré-neoplásica viralmente induzida que receberam 3 - 4 vacinação de uma mistura de peptídeos HPV derivados dos oncogenes virais E6 e E7 mantiveram uma resposta completa por >24 meses (Kenter et al, Vaccination against HPV-16 Oncoproteins for Vulvar Intraepithelial Neoplasia NEJM 361:1838 (2009)).

[00345] A tecnologia de sequenciação revelou que cada tumor contém múltiplas mutações específicas do paciente que alteram o teor de codificação de proteína de um gene. Tais mutações criam proteínas alteradas, que vão desde alterações de aminoácidos únicos (provocadas por mutações de sentido trocado) até adição de regiões longas de nova sequência de aminoácidos devido a deslocamentos de quadro de leitura, read-through de códons de terminação ou tradução de regiões de íntrons (novas mutações de quadro de leitura aberta; neoORFs). Estas proteínas mutadas são alvos valiosos para a resposta imunitária do hospedeiro ao tumor, uma vez que, ao contrário de proteínas nativas, elas não estão sujeitas a efeitos atenuantes imunitários de auto-tolerância. Assim, é mais provável que proteínas mutadas sejam imunogênicas e são também mais específicas para as células tumorais em comparação com as células normais do paciente.

[00346] Utilizando algoritmos recentemente melhorados para prever que mutações de sentido trocado criam peptídeos de ligação fortes para as moléculas MHC cognatas do paciente, será identificado e priorizado um conjunto de peptídeos representativos de epítopos otimamente mutados (tanto neoORF como de sentido trocado) para cada paciente e serão preparados até 20 ou mais peptídeos para imunização (Zhang et al, Machine learning competition in immunology - Prediction of HLA class I binding peptides J Immunol Methods 374:1 (2011); Lundegaard et al Prediction of epitopes using neural network based methods J Immunol Methods 374:26 (2011)). Peptídeos com ~20-35 aminoácidos de comprimento serão sintetizados porque tais peptídeos "longos" sofrem internalização, processamento e apresentação cruzada eficazes em células profissionais apresentando antigênio tais como células dendríticas, tendo sido demonstrado que induzem CTLs em humanos (Melief e van der Burg, Immunotherapy of established (pre) malignant disease by synthetic long peptide vaccines Nature Rev Cancer 8:351 (2008)).

[00347] Além de um imunogênio potente e específico, uma resposta imunitária eficaz requer um adjuvante forte para ativar o sistema imunitário (Speiser e Romero, Molecularly defined vaccines for cancer immunotherapy, and protective T cell immunity Seminars in Immunol 22:144(2010)). Por exemplo, receptores tipo Tol (TLRs) provaram ser sensores potentes de "sinais de perigo" de patógenos microbianos e virais, induzindo eficazmente o sistema imunitário inato, e, por sua vez, o sistema imunitário adaptativo (Bhardwaj e Gnjatic, TLR AGONISTS: Are They Good Adjuvants? Cancer J. 16:382-391 (2010)). Entre os agonistas de TLR, poli-ICLC (um análogo de RNA de fita dupla sintético) é um dos ativadores mais potentes de células dendríticas derivadas de mielóide. Em um estudo com voluntários humanos, foi demonstrado que poli-ICLC é seguro e que induz um perfil de expressão de genes em células de sangue periférico comparável ao induzido por uma das mais potentes vacinas virais atenuadas vivas, a vacina da febre amarela YF-17D (Caskey et al, Synthetic double-stranded RNA induces innate immune responses similar to a live viral vaccine in humans J Exp Med 208:2357 (2011)). Hiltonol®, uma preparação GMP de poli-ICLC preparada por Oncovir, Inc, será utilizada como o adjuvante.

Exemplo 2: População de Pacientes Alvo

[00348] Pacientes com melanoma de estágio IIIB, IIIC and IVM1a,b, possuem um risco significativo de recorrência de doença e morte, mesmo com ressecção cirúrgica completa da doença (Balch et al, Final Version of 2009 AJCC Melanoma Staging and Classification J Clin Oncol 27:6199 - 6206 (2009)). Uma terapia de adjuvante sistêmico disponível para esta população de pacientes é interferon-α (IFNα) que providencia um benefício mensurável, mas marginal, e está associado a toxicidade significativa frequentemente limitativa de dose (Kirkwood et al, Interferon alfa-2b Adjuvant Therapy of High-Risk Resected Cutaneous Melanoma: The Eastern Cooperative Oncology Group Trial EST 1684 J Clin Oncol 14:7-17 (1996); Kirkwood et al, High- and Low-dose Interferon Alpha-2b in High-Risk Melanoma: First Analysis of Intergroup Trial E1690/S9111/C9190 J Clin Oncol 18:2444 - 2458 (2000)). Estes pacientes não estão imunocomprometidos por anterior terapia direcionada a câncer ou por câncer ativo e representam assim um excelente população de pacientes na qual avaliar a segurança e impacto imunológico da vacina. Por fim, o atual padrão de cuidados para estes pacientes não impõe qualquer tratamento a seguir à cirurgia, permitindo assim a janela de 8 - 10 semanas para a preparação da vacina.

[00349] A população alvo serão pacientes de melanoma cutâneo com metástases nodais (locais ou distantes) ou em trânsito histologicamente confirmadas e clinicamente detectáveis que foram totalmente ressectados e estão livres de doença (a maior parte de estágio IIIB (por causa da necessidade de ter tecido tumoral adequado para sequenciação e desenvolvimento de linha celular, os pacientes com tumor primário ulcerado, mas linfonodos micrometastáticos (T1-4b, N1a ou N2a). serão excluídos.), todos de estágio IIIC, e estágio IVM1a, b. Estes poderão ser pacientes com primeiro diagnóstico ou em recorrência de doenças após diagnóstico prévio de um melanoma de estágio mais precoce.

[00350] Colheita do tumor: Os pacientes serão submetidos a ressecção completa do seu melanoma primário (se já não tiver sido removido) e de toda a doença metastática regional com a intenção de os tornar livres de melanoma. Após o tumor adequado para avaliação patológica ter sido colhido, o restante tecido tumoral será colocado em meio esterilizado em um recipiente esterilizado e preparado para desagregação. Porções do tecido tumoral serão usadas para sequenciação de exoma completo e transcriptoma e geração de linhas celulares e o restante tumor será congelado.

[00351] Colheita de tecido normal: Será recolhida uma amostra de tecido normal (amostra de sangue ou expetoração) para sequenciação de exoma completo.

[00352] Pacientes com doença metastática locorregional evidente ou doença metastática nodal, cutânea ou pulmonar distante totalmente ressectável (mas ausência de doença metastática distante ou visceral não ressectável) serão identificados e integrados no estudo. A entrada de pacientes antes da cirurgia é necessária de forma a adquirir tecido tumoral fresco para desenvolvimento de linhas celulares de melanoma (para gerar células alvo para ensaios de citotoxicidade in vitro como parte do plano de monitorização imunitária).

Exemplo 3: Dose e Calendário

[00353] Para pacientes que satisfazem todos os critérios de pré-tratamento, a administração da vacina começará assim que possível após o fármaco de estudo ter chegado e ter cumprido as especificações recebidas. Para cada paciente, haverá quatro fármacos de estudo separados, cada um contendo 5 a 20 peptídeos específicos de paciente. As imunizações irão desenvolver-se geralmente de acordo com o calendário mostrado na FIG. 5.

[00354] Os pacientes serão tratados em um serviço de ambulatório. A imunização em cada dia de tratamento consistirá de quatro injeções subcutâneas de 1 ml, cada uma em uma extremidade separada por forma a ter como alvo diferentes regiões do sistema linfático para reduzir a competição antigênica. Se o paciente tiver sido submetido a dissecção total dos linfonodos axilares e inguinais, as vacinas serão administradas em alternativa na zona direita ou esquerda do ventre. Cada injeção consistirá de 1 a 4 fármacos de estudo para cada paciente e o mesmo fármaco de estudo será injetado na mesma extremidade para cada ciclo. A composição de cada injeção de 1 ml é:

[00355] 0,75 ml de fármaco de estudo contendo 300 μg cada de 5 peptídeos específicos do paciente

[00356] 0,25 ml (0,5 mg) de 2 mg/ml de poli-ICLC (Hiltonol®)

[00357] Durante a fase de indução/iniciação, os pacientes serão imunizados nos dias 1, 4, 8, 15 e 22. Na fase de manutenção, os pacientes receberão doses de reforço nas semanas 12 e 24.

[00358] Amostras de sangue podem ser obtidas em múltiplos pontos temporais: pré- (linha de base; duas amostras em diferentes dias); dia 15 durante a vacinação de iniciação; quatro semanas após a vacinação de indução/iniciação (semana 8); pré- (semana 12) e pós- (semana 16) primeiro reforço; pré- (semana 24) e pós-(semana 28) segundo reforço 50 - 150 ml de sangue serão colhidos para cada amostra (exceto semana 16). O ponto final imunológico primário será na semana 16, e como tal os pacientes serão submetidos a leucaférese (salvo indicação em contrário com base na avaliação do paciente e do médico).

Exemplo 4: Monitorização Imunitária

[00359] A estratégia de imunização é uma abordagem de "reforço inicial", envolvendo uma série inicial de imunizações pouco espaçadas para induzir uma resposta imunitária seguida de um período de repouso para permitir que sejam estabelecidas células T de memória. A isto seguir- se-á uma imunização de reforço, e espera-se que a resposta de célula T 4 semanas após este reforço gere a resposta mais forte e será o ponto final imunológico primário. A resposta imunológica global será inicialmente monitorizada usando células mononucleares de sangue periférico deste ponto temporal em um ensaio ELISPOT ex vivo de 18 horas, estimulando com um grupo de peptídeos 15 mer sobrepostos (sobreposição de 11 aa) compreendendo todos os epítopos imunizantes. Amostras pré-vacinação serão avaliadas para estabelecer a resposta de linha de base a este conjunto de peptídeos. Caso se justifique, serão avaliadas amostras de PBMC adicionais para examinar a cinética da resposta imunitária à mistura de peptídeos total. Em pacientes que demonstrem respostas significativamente acima da linha de base, o conjunto de todos os 15mers será desconvolucionado para determinar que peptídeo(s) imunizante(s) particular(es) foi/foram imunogênico(s). Além disso, serão conduzido vários ensaios adicionais em uma base caso-a-caso para amostras apropriadas: • Todos o conjunto ou subconjuntos 15 mer serão usados como peptídeos estimulantes para ensaios de coloração de citocina intracelular para identificar e quantificar populações CD4+, CD8+ específicos de antigênio, de memória central e de memória efetora. • Igualmente, estes conjuntos serão usados para avaliar o padrão de citocinas segregadas por estas células para determinar o fenótipo TH1 vs TH2 • Coloração de citocinas extracelulares e citometria de fluxo de células não estimuladas serão usadas para quantificar células supressoras Treg e derivadas de mielóide (MDSC). • Se uma linha celular de melanoma for estabelecida com sucesso de um paciente respondedor e o epítopo ativador puder ser identificado, os ensaios de citotoxicidade de célula T serão conduzidos usando o peptídeo de tipo selvagem mutante e correspondente • PBMC do ponto final imunológico primário será avaliado quanto a "distribuição de epítopos" usando antigênios tumorais associados a melanoma como estimulantes e usando vários epítopos mutados identificados adicionais que não foram selecionados como estando entre os imunogênios, como mostrado na FIG. 6.

[00360] Será conduzida imuno-histoquímica da amostra tumoral para quantificar populações infiltrantes CD4+, CD8+, MDSC, e Treg.

Exemplo 5: Eficácia Clínica em Pacientes com Doença Metastática

[00361] O tratamento com vacina de pacientes com doença metastática é complicado pela sua necessidade de uma terapia eficaz para o câncer ativo e a consequente ausência de uma janela temporal fora do tratamento para a preparação da vacina. Além disso, estes tratamentos de câncer podem comprometer o sistema imunitário do paciente, possivelmente impedindo a indução de uma resposta imunitária. Com estas considerações em mente, podem ser escolhidos parâmetros onde o momento da preparação da vacina se enquadre temporalmente com outras abordagens de cuidados padrão para a população de pacientes em particular e/ou onde tais cuidados padronizados são comprovadamente compatíveis com uma abordagem imunoterapêutica. Há dois tipos de parâmetros que podem ser seguidos:

[00362] 1. Combinação com bloqueio de ponto de verificação: Anticorpos de bloqueio de ponto de verificação surgiram como uma imunoterapia eficaz para melanoma metastático (Hodi et al, Improved Survival with Ipilimumab in Patients with Metastatic Melanoma NEJM 363:711 - 723 (2010)) e estão a ser ativamente seguidos em outras configurações de doença, incluindo câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC) e carcinoma de células renais (Topalian et al, Safety, Activity, and Immune Correlates of Anti-PD-1 Antibody in Cancer NEJM 366:2443-2454 (2012); Brahmer et al, Safety and Activity of Anti-PD-L1 Antibody in Patients with Advanced Cancer NEJM 366:2455-2465(2012)). Apesar do mecanismo de ação não estar provado, tanto reversão de alívio de imunossupressão local como potencialização de uma resposta imunitária são possíveis explicações. Integrar uma vacina potente para iniciar uma resposta imunitária com anticorpos de bloqueio de ponto de verificação pode providenciar sinergias, como observado em múltiplos estudos com animais (van Elsas et al Combination immunotherapy of B16 melanoma using anti-cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4 (CTLA-4)and granulocyte/macrophage colonystimulating factor (GM-CSF)-producing vaccines induces rejection of subcutaneous and metastatic tumors accompanied by autoimmune depigmentation J Exp Med 190:35- 366 (1999); Li et al, Anti-programmed death-1 synergizes with granulocyte macrophage colony-stimulating factor -secreting tumor cell immunotherapy providing therapeutic benefit to mice with established tumors Clin Cancer Res 15:1623 – 1634 (2009); Pardoll, D. M. The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy Nature Reviews Cancer 12:252 - 264 (2012); Curran et al. PD-1 and CTLA-4 combination blockade expands infiltrating T cells and reduces regulatory T and myeloid cells within B16 melanoma tumors. Proc Natl Acad Sci USA. 2 de março de 2010;107(9):4275-80; Curran et al. Tumor vaccines expressing flt3 ligand synergize with ctla-4 blockade to reject preimplanted tumors. Cancer Res. 1 de outubro de 2009;69(19):7747-55). Os pacientes podem ser imediatamente iniciados em terapia de bloqueio de ponto de verificação enquanto a vacina está a ser preparada e uma vez preparada, o doseamento da vacina pode ser integrado com terapia de anticorpos, como ilustrado na FIG. 7; e

[00363] 2. Combinação com regimes de tratamento padronizados exibindo propriedades imunitárias benéficas.

[00364] a) Pacientes com carcinoma de células renais (RCC) que apresentam doença metastática tipicamente são submetidos a citoredução seguida de tratamento sistêmico, que acontece comummente com um dos inibidores de quinase tirosina aprovados (TKI) tais como sunitinib, pazopanib e sorafenib. Dos TKIs aprovados, foi demonstrado que sunitib aumenta a responsividade de TH1 e reduz células supressoras de Treg e derivadas de mielóide (Finke et al, Sunitinib reverses Type-1 immune suppression and decreases T- regulatory cells in renal cell carcinoma patients Clin Can Res 14:6674 - 6682 (2008); Terme et al, VEGFA-VEGFR pathway blockade inhibits tumor-induced regulatory T cell proliferation in colorectal cancer (Manuscrito de Autor de Investigação sobre o Câncer publicado em linha (2102)). A capacidade de tratar imediatamente pacientes com uma terapia aprovada que não compromete o sistema imunitário providencia a janela necessária para preparar a vacina e poderia providenciar sinergia com uma terapia de vacina. Além disso, ciclofosfamida (CTX) foi referenciada em múltiplos estudos com animais e humanos como tendo um efeito inibidor em células Treg e foi recentemente demonstrado que uma dose única de CTX antes de uma vacina melhora a sobrevivência em pacientes RCC que responderam à vacina (Walter et al, Multipeptide immune response to a cancer vaccine IMA901 after single-dose cyclophosphamide associates with longer patient survival Nature Medicine 18:1254-1260 (2012)). Ambas estas abordagens imuno-sinergísticas foram utilizadas em um estudo de fase 3 recentemente concluído de uma vacina de peptídeos nativos em RCC (ClinicalTrials.gov, NCT01265901 IMA901 in Patients Receiving Sunitinib for Advanced/Metastatic Renal Cell Carcinoma);

[00365] b) Em alternativa, tratamento padronizado de glioblastoma (GBM) envolve cirurgia, recuperação e radiação de seguimento e dose baixa de temozolomida (TMZ) seguido de um período de descanso de quatro semanas ante de iniciar dose padrão de TMZ. Este tratamento padronizado providencia uma janela para preparação de vacina seguido de iniciação de vacinação antes de iniciar dose padrão de TMZ. Interessantemente, em um estudo de melanoma metastático, a vacinação de peptídeos durante tratamento de dose padrão de TMZ aumentou a responsividade imunitária medida em comparação com vacinação isolada, sugerindo benefícios sinergísticos adicionais (Kyte et al, Telomerase peptide vaccination combined with temozolomide: a clinical trial in stage IV melanoma patients Clin Cancer Res 17:4568 (2011)).

Exemplo 6: Preparação da Vacina

[00366] Tecido tumoral do paciente será ressectado cirurgicamente e tecido tumoral será desagregado e porções separadas usadas para extração de DNA e RNA e para desenvolvimento de linha celular de melanoma específico de paciente. O DNA e/ou RNA extraído do tecido tumoral será usado para sequenciação de exoma completo (por exemplo, usando plataforma Illumina HiSeq) e para determinar informação de tipagem de HLA. É contemplado dentro do escopo da invenção que peptídeos neo-antigênicos de sentido trocado ou neoORF podem ser diretamente identificados por técnicas de base proteína (por exemplo, espectrometria de massa).

[00367] Pode ser conduzida análise bioinformática da seguinte forma: Análise de sequência dos ficheiros fastQ de Exoma e RNA - SEQ alavancará pipelines bioinformáticos existentes que foram usados e amplamente validados em projetos de larga escala como o TCGA para muitas amostras de pacientes (por exemplo, Chapman et al, 2011, Stransky et al, 2011, Berger et al, 2012). Há duas categorias sequenciais de análises: processamento de dados e análise de genoma de câncer.

[00368] Pipeline de processamento de dados: O pipeline de processamento de dados Picard (picard.sourceforge.net/) foi desenvolvido pela Plataforma de Sequenciação. Dados brutos extraídos de sequenciadores (por exemplo, Illumina) para cada tumor e amostra normal são submetidos aos seguintes processos usando vários módulos no pipeline Picard:

[00369] (i). Recalibragem de qualidade: Os resultados de qualidade de base original reportados pelo pipeline Illumina serão recalibrados com base no ciclo de leitura, a banda, o mosaico de célula de fluxo, a base em questão e a base precedente.

[00370] (ii). Alinhamento: BWA (Li e Durbin, 2009) será usado para alinhar pares de leitura com o genoma humano (hg19).

[00371] (iii). Duplicados de marca: PCR e duplicados óticos serão identificados com base nas posições de mapeamento de par de leitura e marcados no ficheiro bam final.

[00372] O produto final de Picard é um ficheiro bam (Li et al, 2009) (samtools.sourceforge.net/SAM1.pdf) que armazena as sequências de base, classificações de qualidade e detalhes de alinhamento pra todas as leituras para a amostra em causa.

[00373] Pipeline de Detecção de Mutação de Câncer: O tumor e ficheiros bam normais correspondidos do pipeline de Picard serão analisados como descrito em baixo:

1. Controle de Qualidade

[00374] (i). A mistura de amostra durante a sequenciação será feita por comparação de impressão digital SNP inicial feita em uma amostra em uma dúzia de locais com pileups de sequenciação de exoma em esses locais.

[00375] (ii). Mistura intra-amostra tumor/normal será verificada comparando primeiro a distribuição de tamanho de inserto de bandas que correspondem à mesma biblioteca para amostras tumorais e normais, e descartar as bandas que têm uma distribuição diferente. Será aplicada análise bioinformática a tumor e amostras de exoma normal correspondido para obter os perfis de número de cópia de DNA. Amostras de tumor também deveriam ter mais variações de número de cópia do que os normais correspondentes. As bandas correspondendo a amostras normais que não têm perfis planos serão descartadas, tal como bandas de tumor que não têm perfis consistentes com outras bandas da mesma amostra de tumor serão descartadas.

[00376] (iii). A pureza e ploidia do tumor serão estimadas com base nos perfis de número de cópia geradas bioinformaticamente.

[00377] (iv). ContEst (Cibulskis et al, 2011) será usado para determinar o nível de contaminação transversalmente às amostras nas amostras.

2. Realinhamento local em volta de indels putativos

[00378] Pequenos indels verdadeiros somáticos e de linha germinal em relação ao genoma de referência muitas vezes resultam em desalinhamento e previsão errónea de mutações de sentido trocado e indels. Isto será corrigido fazendo um realinhamento local usando o módulo GATK IndelRealigner (na worldwide web em (www)broadinstitute.org/gatk) (McKenna et al, 2010, Depristo et al, 2011) de todas as leituras que mapeiam na proximidade de indels putativos e avaliando-os de forma abrangente para assegurar a consistência e correção das previsões indel.

3. Identificação de variações de nucleotídeos únicos (SSNVs)

[00379] Substituições de par de base somáticas serão identificadas analisando amostras de tumor e amostras normais correspondidas de um paciente usando um enquadramento estatístico Bayesiano denominado muTect (Cibulskis et al, 201 3). Na etapa de pré-processamento, as leituras com uma preponderância de bases ou não correspondências de baixa qualidade com o genoma são removidas por filtração. Mutect computa então dois resultados log odds (LOD) que encapsulam confiança na presença e ausência da variante nas amostras de tumor e amostras normais, respectivamente. Na etapa de pós- processamento, as mutações candidatas são empiricamente filtradas por vários critérios para explicar artefatos de captura, sequenciação e alinhamento. Um tal filtro, por exemplo, testa a inconsistência entre distribuições de orientações de leituras que abrigam a mutação e a distribuição de orientação geral de leituras que mapeiam para o local para assegurar que não há tendência de fita. O conjunto final de mutações será então anotado com a ferramenta Oncotator em vários campos incluindo alterações de região genômica, códon, cDNA e de proteína.

4. Identificação de pequenas inserções e deleções somáticas

[00380] O produto de saída de realinhamento local da seção 2.2 será usado para prever indel somáticos e de linha germinal candidatos com base na avaliação de leituras suportando a variante exclusivamente no tumor ou em bams de tumor e normais, respectivamente. Será feita subsequente filtragem com base no número e distribuição de não correspondências e resultados de qualidade de base (McKenna et al, 2010, DePristo et al, 2011). Todos os indels serão manualmente inspecionados usando Integrated Genomics Viewer (Robinson et al, 2011) (na worldwide web em (www)broadinstitute.org/igv) para assegurar previsões de elevada fidelidade.

5. Detecção de fusão de genes

[00381] A primeira etapa no pipeline de detecção de fusão de genes é o alinhamento de leituras tumorais RNA-Seq com uma biblioteca de sequências genéticas conhecidas seguida de mapeamento deste alinhamento para coordenadas genômicas. O mapeamento genômico ajuda a colapsar pares de leitura múltiplos que mapeiam para diferentes variantes de transcritos que partilham éxons para localizações genômicas comuns. O ficheiro bam de DNA alinhado será interrogado quanto a pares de leitura onde as duas conjugações mapeiam para diferentes regiões de codificação que ou estão em diferentes cromossomas ou pelo menos 1 MB separadas se estiverem no mesmo cromossoma. Também será requerido que as extremidades do par alinhadas nos seus genes respectivos estejam na direção consistente com a direção codificação-- >codificação 5'-> 3' do transcrito de mRNA de fusão(putativo). Será enumerada uma lista de pares de genes onde pelo menos dois tais pares de leitura 'quiméricos' como a lista de eventos putativa inicial sujeito a posterior refinamento. A seguir, todas as leituras não alinhadas serão extraídas do ficheiro bam original, com o constrangimento adicional de que as suas conjugações estavam originalmente alinhadas e mapeiam para um dos genes nos pares de genes obtidos como acima descrito. Uma tentativa será então feita para alinhar todas as leituras originalmente não alinhadas para a "referência" personalizada feita de todas as possíveis junções éxon-éxon (comprimento total, limite-a-limite, direção de codificação 5'-> 3') entre os pares de genes descobertos. Se uma tal leitura originalmente não alinhada mapeia (unicamente) para uma junção entre um éxon de gene X e um éxon de gene Y, e a sua conjugação foi efetivamente mapeada para um dos genes X ou Y, então uma tal leitura será marcada como uma leitura de "fusão". Os eventos de fusão de genes serão chamados em casos onde há pelo menos uma leitura e fusão em orientação relativa correta com a sua conjugação, sem número excessivo de não correspondências em volta da junção éxon:éxon e com uma cobertura de pelo menos 10 bp em cada gene. Fusões de genes entre genes altamente homólogos (ex. família HLA) são provavelmente falsas e serão eliminadas por filtração.

6. Estimativa de clonalidade

[00382] Pode ser usada análise bioinformática para estimar a clonalidade de mutações. Por exemplo, o algoritmo ABSOLUTE (Carter et al, 2012, Landau et al, 2013) pode ser usado para estimar pureza de tumor, ploidia, números de cópia absolutos e clonalidade de mutações. Distribuições da densidade da probabilidade de frações alélicas de cada mutação serão geradas seguidas de conversão para frações de células de câncer (CCFs) das mutações. As mutações serão classificadas como clonais ou subclonais com base em se a probabilidade posterior do seu CCF excede 0,95 é maior ou menos do que 0,5 respectivamente.

7. Quantificação da expressão

[00383] A TopHat suite (Langmead et al, 2009) será usada para alinhar leituras RNA-Seq dos bam de tumor e normal correspondido para o genoma hg19. A qualidade dos dados RNA- Seq será avaliada pelo pacote RNA-SeQC (DeLuca et al, 2012). A ferramenta RSEM (Li et al, 2011) será então usada para estimar níveis de expressão de genes e isoformas. As leituras geradas por quilobase por milhão e estimativas tau serão usadas para priorizar neo-antigênios identificados em cada paciente como descrito em outros lugares.

8. Validações de mutações em RNA-Seq

[00384] As mutações que serão identificadas por análise de dados de exoma total (seção 2.3) serão avaliadas quanto à presença no correspondente ficheiro bam de tumor RNA-Seq do paciente. Para cada local variante, será realizado um cálculo de potência com base na distribuição beta-binomial para assegurar que há pelo menos 80% de potência para o detectar nos dados RNA-Seq. Uma mutação identificada de captura será considerada validada se houver pelo menos 2 leituras abrigando a mutação para locais adequadamente potenciados.

[00385] Seleção de Epítopos Contendo Mutação Específicos de Tumor: Todas as mutações de sentido trocado e neoORFs serão analisadas quanto à presença de epítopos contendo mutação usando o algoritmo netMHC de base rede neural e mantidos pelo Center for Biological Sequence Analysis, Technical University of Denmark, Países Baixos. Esta família de algoritmos foi classificada como algoritmos de previsão de epítopos de topo com base em uma competição recentemente concluída entre uma série de abordagens relacionadas (ref). Os algoritmos foram treinados usando uma abordagem de base rede neural artificial em múltiplos diferentes alelos HLA A e B humanos utilizando mais de 100.000 interações medidas de ligação e não ligação.

[00386] A precisão dos algoritmos foi avaliada realizando previsões de mutações encontradas em pacientes CLL para os quais eram conhecidos os alótipos HLA. Os alótipos incluídos foram A0101, A0201, A0310, A1101, A2402, A6801, B0702, B0801, B1501. Foram feitas previsões para todos os peptídeos 9 mer e 10 mer cobrindo cada mutação usando netMHCpan em meados de 2011. Com base em estas previsões, foram sintetizados setenta e quatro (74) peptídeos 9 mer e sessenta e três (63) peptídeos 10 mer, a maior parte com afinidades previstas abaixo de 500 nM, e a afinidade de ligação foi medida usando um ensaio de ligação competitivo (Sette).

[00387] As previsões para estes peptídeos foram repetidas em março de 2013 usando cada uma das versões mais atualizadas dos servidores netMHC (netMHCpan, netMHC e netMHCcons). Estes três algoritmos foram os algoritmos melhor classificados entre um grupo de 20 usado em uma competição em 2012 (Zhang et al). As afinidades de ligação observadas foram então avaliadas em relação a cada uma das novas previsões. Para cada conjunto de valores previstos e observados, é dada a % de previsões corretas para cada gama, bem como o número de amostras. A definição para cada gama é a seguinte: 0 - 150 Previsto como tendo uma afinidade igual ou inferior a 150 nM e medido como tendo uma afinidade igual ou inferior a 150 nM. 0 - 150*: Previsto como tendo uma afinidade igual ou inferior a 150 nM e medido como tendo uma afinidade igual ou inferior a 500 nM. 151 - 500 nM: Previsto como tendo uma afinidade superior a 150 nM mas igual ou inferior a 500 nM e medido como tendo uma afinidade igual ou inferior a 500 nM. FN (> 500 nM): Falsos Negativos - Previsto ter uma afinidade superior a 500 nM mas medido como tendo uma afinidade igual ou inferior a 500 nM.

[00388] Para os peptídeos 9 mer (Tabela 1), houve pouca diferença entre os algoritmos, com o valor ligeiramente superior para a gama 151-500 nM para netMHCcons avaliado como não sendo significativo por causa do baixo número de amostras.Tabela 1

[00389] Para peptídeos 10 mer (Tabela 2), houve novamente pouca diferença entre os algoritmos exceto que netMHC produziu significativamente mais falsos positivos do que netMHCpan ou netMMHCcons. Contudo, a precisão das previsões 10 mer é ligeiramente inferior nas gamas 0 - 150 nM e 0 - 150* nM e significativamente inferior na gama 151500 nM em comparação com os 9mers.Tabela 2

[00390] Para 10mers, apenas serão utilizadas as previsões na gama 0 - 150 nM devido à precisão inferior a 50% para aglutinantes na gama 151-500 nM.

[00391] O número de amostras para qualquer alelo HLA individual foi demasiado pequeno para retirar quaisquer conclusões em relação à precisão do algoritmo de previsão para diferentes alelos. Dados do maior subconjunto disponível (0 - 150* nM; 9mer) são mostrados na Tabela 3 como exemplo.Tabela 3

[00392] Apenas serão utilizadas as previsões para os alelos HLA a e B, uma vez que há poucos dados disponíveis sobre os quais julgar a precisão das previsões dos alelos HLA C (Zhang et al).

[00393] Uma avaliação da informação de sequência de melanoma e previsões de ligação de peptídeos foi realizada usando informação do banco de dados TCGA. Informação de 220 melanomas de diferentes pacientes revelou que em média houve aproximadamente 450 de sentido trocado e 5 neoORFs por paciente. Foram selecionados aleatoriamente 20 pacientes e as afinidades de ligação previstas foram calculadas para todas as mutações de sentido trocado usando netMHC (Lundegaard et al Prediction of epitopes using neural network based methods J Immunol Methods 374:26 (2011)). Como os alótipos HLA eram desconhecidos para estes pacientes, o número de peptídeos de ligação previstas por alótipo foi ajustado com base na frequência desse alótipo (conjunto de dados Bone Marrow Registry [Registro de Medula Óssea] para a população dominante afetada esperada na área geográfica [caucasiana para melanoma] para gerar um número previsto de epítopos mutantes ativáveis por paciente. Também foi prevista, para cada um destes epítopos mutantes (MUT), a correspondente ligação de epítopo nativo (WT). Utilizando um peptídeo único para aglutinantes de sentido trocado previstos com Kd < 500 nM e um rácio WT/MUT Kd de >5X e peptídeos sobrepostos cobrindo o comprimento total de cada neoORF, 80% (16 de 20) dos pacientes foram previstos como tendo pelo menos 20 peptídeos apropriados para vacinação. Para um quarto dos pacientes, peptídeos neoORF puderam constituir quase metade à totalidade dos 20 peptídeos. Assim, há uma carga mutacional adequada no melanoma para esperar uma proporção elevada de pacientes para gerar um número adequado de peptídeos imunogênicos.

Exemplo 7: Priorização de Peptídeos Imunizantes

[00394] Peptídeos para imunização podem ser priorizados com base em vários critérios: neoORF vs de sentido trocado, Kd previsto para o peptídeo mutado, a comparabilidade de afinidade prevista para o peptídeo nativo comparado com o peptídeo mutada, se a mutação ocorre em um gene atuador oncogênico ou via relacionada, e # de leituras RNA-Seq (ver, por exemplo, a FIG. 8).

[00395] Como mostrado na FIG. 8, aos peptídeos derivados de segmentos de mutações neoORF que se prevê irão ligar-se (Kd < 500 nM) poderá ser dada a maior prioridade com base na ausência de tolerância para estas sequências inteiramente novas e a sua especificidade tumoral refinada.

[00396] À classe similar de mutações de sentido trocado na qual o peptídeo nativo não se prevê ligar (Kd > 1000 nM) e o peptídeo mutado se prevê ligar com afinidade forte/moderada (Kd < 150 nM) pode ser dada a próxima prioridade mais elevada. Esta classe (grupo I discutido acima) representa aproximadamente 20% das respostas de célula T observadas naturalmente.

[00397] A terceira prioridade mais elevada pode ser dada ao subconjunto de ligação mais estreita (< 150 nM) da classe do Grupo II acima discutido. Esta classe é responsável por aproximadamente quase 2/3 das respostas de célula T observadas naturalmente.

[00398] A todos os restantes peptídeos restantes derivado de mutações neoORF podem ser dada a quarta prioridade. Apesar de não se prever que se liguem, estes são incluídos com base na taxa de falsos negativos, ligação potencial a HLA-C, potencial para presença de epítopos de Classe II e elevado valor de utilização de antigênios estranhos.

[00399] A quinta prioridade pode ser dada ao subconjunto do Grupo II com afinidades de ligação previstas menores (150 - 500 nM). Esta classe é responsável por aproximadamente 10% das respostas de célula T observadas naturalmente.

[00400] À medida que a afinidade prevista diminui, pode ser aplicada estringência mais elevada a níveis de expressão. Dentro de cada agrupamento, os peptídeos podem ser classificados com base na afinidade de ligação (por exemplo, o Kd mais baixo pode ter a prioridade mais elevada). Dentro de um determinado agrupamento de mutações de sentido trocado, pode ser dada prioridade mais elevada a mutações de atuador oncogênico. Foi criada uma biblioteca de peptidomas humanos normais de ~12,6 milhões de 9 e 10 mers únicos curados de todas as sequências de proteína humana conhecidas (HG19). Antes da seleção final, quaisquer potenciais epítopos previstos derivados de uma mutação de sentido trocado e todas as regiões neoORF podem ser rastreadas contra esta biblioteca e podem ser excluídas correspondências perfeitas. Como discutido em baixo, peptídeos particulares previstos como tendo propriedades bioquímicas prejudiciais podem ser eliminados ou modificados.

[00401] De acordo com as técnicas aqui expostas, os níveis de RNA podem ser analisados para avaliar a expressão de neoantigênios. Por exemplo, a contagem de leitura de RAN- Seq pode ser usada como aproximação para estimar expressão de neoantigênios. Contudo, não há informação atualmente disponível para avaliar o nível de expressão de RNA mínimo requerido em uma célula tumoral necessário para iniciar citólise. Mesmo o nível de expressão de tradução "pioneira" de mensagens destinadas a degradação mediada por não sentido pode ser suficiente para geração de alvos. Em conformidade, as técnicas aqui definem inicialmente limites de aceitação amplos para níveis de RNA que podem variar inversamente com o grupo de prioridade. À medida que a afinidade prevista diminui, pode ser aplicada estringência mais elevada a níveis de expressão. Um entendido na técnica irá apreciar que à medida que informação adicional é disponibilizada tais limites poderão ser ajustados.

[00402] Por causa do elevado valor de neoORFs como alvos devido à sua novidade e especificidade tumoral refinada, os neoORFs com epítopos de ligação previstos (Kd < 500 nM) podem ser utilizados mesmo se não houver moléculas de mRNA detectáveis por RNA-Seq (Classe 1). Regiões de neoORFs sem epítopos de ligação previstos (> 500 nM), podem geralmente ser utilizadas apenas se for detectada algum nível de expressão de RNA (Classe 4). Todas as mutações de sentido trocado com afinidade de ligação MHC prevista forte a intermédia (<150 nM) podem geralmente ser utilizadas a menos que não houvessem leituras RNA-Seq (Classes 2 e 3). Para mutações de sentido trocado com menor afinidade de ligação prevista (150 - < 500 nM), estas serão provavelmente utilizadas apenas se for detectado um nível ligeiramente superior de expressão de RNA (Classe 5).

[00403] Atuadores oncogênicos podem representar um grupo de prioridade elevada. Por exemplo, dentro de um determinado agrupamento de mutações de sentido trocado, mutações de atuadores oncogênicos podem ser de prioridade mais elevada. Esta abordagem baseia-se na regulação para baixo observada em genes que são alvo de pressão imunitária (por exemplo, imunoedição). Em contraste com outros alvos imunes onde a regulação para baixo pode não ter um efeito prejudicial no crescimento de células cancerígenas, a expressão continuada de genes atuadores oncogênicos pode ser crucial para a sobrevivência de células cancerígenas, encerrando assim uma via de escape imunitário. Atuadores oncogênicos exemplares são listados na Tabela 3-1 (ver, por exemplo, Vogelstein et al; GOTERM_BP Assignment of genes to Gene Ontology Term - Biological Function na worldwide web em (www)geneontology.org; BIOCARTA Assignment of genes to signaling pathways, na worldwide web em (www)biocarta.com; KEGG Assignment of genes to pathways according to KEGG pathway database, na worldwide web em (www)genome.jp/krgg/pathway.html; REACTOME Assignment of genes to pathways according to REACTOME pathways and gene interactions, na worldwide web em (www)reactome.org).Tabela 3-1 genes Atuadores Oncogênicos Exemplares

Exemplo 8: Produção e Formulação de Peptídeos

[00404] Serão preparados peptídeos neo-antigênicos GMP para imunização por meio de síntese química de Merrifield RB: Solid phase peptide synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide. J. Am. Chem. Soc. 85:2149-54, 1963) de acordo com as normas da FDA. Foram conduzidos três testes de desenvolvimento com 20 ~20-30 mer peptídeos cada. Cada teste foi conduzido na mesma instalação e utilizado o mesmo equipamento como será usado para os testes GMP, utilizando registros de lote GMP preliminares. Cada teste produziu com sucesso > 50 mg de cada peptídeo, que foram testados por todos os testes de liberação atualmente planeados (por exemplo, Aparência, Identificação por MS; Pureza por RP- HPLC, Teor por Nitrogênio Elementar e teor TFA por RP-HPLC) e cumpriram a especificação almejada onde apropriado. Os produtos foram também produzidos dentro do espaço de tempo antecipado para esta parte do processo (aproximadamente 4 semanas). Os peptídeos a granel liofilizados foram colocados em um estudo de estabilidade de longo prazo e serão avaliados em vários pontos do tempo até 12 meses.

[00405] O material destes testes foi usado para testar a abordagem planeada de dissolução e mistura. Resumidamente, cada peptídeo será dissolvido em uma concentração elevada (50 mg/ml) em 100 % de DMSO e diluído para 2 mg/ml em um solvente aquoso. Inicialmente, foi antecipado que PBS deveria ser usado como um diluente, contudo, uma dessalinização de um pequeno número de peptídeos provocou uma turvação visível. Foi demonstrado que D5W (5 % de dextrose em água) é muito mais eficaz; 37 de 40 peptídeos foram diluídos com sucesso em uma solução clara. Os únicos peptídeos problemáticos são peptídeos muito hidrofóbicos. As propriedades bioquímicas previstas de peptídeos imunizantes planeados serão avaliadas e os planos de síntese poderão ser alterados em conformidade (usando um peptídeo mais curto, deslocando a região a ser sintetizada na direção do terminal N ou C em volta do epítopo previsto, ou potencialmente utilizando um peptídeo alternativo). Dez peptídeos separados em DMSO/D5W fora submetidos a ciclos de congelação/descongelação e mostraram recuperação completa. Dois peptídeos individuais foram dissolvidos em DMSO/D5W e colocados em estabilidade a duas temperaturas (-20 oC e -80 oC). Estes peptídeos serão avaliados (RP-HPLC, MS e pH) durante até 6 meses. Até à data, ambos os peptídeos são estáveis no ponto temporal das 12 semanas com pontos temporais adicionais nas 24 semanas a serem avaliados.

[00406] Como mostrado na FIG. 9, a configuração do processo da forma de doseamento é preparar 4 conjuntos de peptídeos específicos do paciente consistindo de 5 peptídeos cada. Foi preparado um ensaio RP-HPLC e qualificado para avaliar estas misturas de peptídeos. Este ensaio alcança boa resolução de múltiplos peptídeos dentro de uma mistura única e pode também ser usado para quantificar peptídeos individuais.

[00407] Filtração de membrana (0,2 μm de tamanho de poro) será usada para reduzir a biocarga e conduzir esterilização de filtro final. Quatro diferentes tipos de filtro apropriadamente dimensionados foram inicialmente avaliados e o filtro Pall, PES (# 4612) foi selecionado. Até à data, foram preparadas 4 diferentes mistura de 5 diferentes peptídeos e individualmente filtradas sequencialmente através de dos filtros PES. A recuperação de cada peptídeo individual foi avaliada utilizando o ensaio RP-HPLC. Para 18 dos 20 peptídeos, a recuperação após as duas filtrações foi >90%. Para dois peptídeos altamente hidrofóbicos, a recuperação foi inferior a 60% quando avaliados a pequena escala mas foram quase totalmente recuperados (87 e 97%) à escala. Como referido acima, serão desenvolvidas abordagens para limitar a natureza hidrofóbica das sequências selecionadas.

[00408] Serão preparados peptídeos neo-antigênicos GMP para imunização por meio de síntese química de Merrifield RB: Solid phase peptide synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide. J. Am. Chem. Soc. 85:2149-54, 1963) de acordo com as normas da FDA.

Exemplo 9: Avaliação de Ponto Final

[00409] O ponto final imunológico primário deste estudo será a avaliação da resposta de célula T medida por IFN-Y ELISPOT ex vivo. A secreção de IFN-Y ocorre em resultado do reconhecimento de peptídeos cognatos ou estímulos mitogênicos por células T CD4+ e/ou CD8+. São provavelmente apresentados vários diferentes determinantes CD4+ e CD8+ às células T in vivo, uma vez que os peptídeos 20-30 mer usados para vacinação deviam ser submetidos a processamento para se tornarem peptídeos mais pequenos por meio de células apresentando antigênio. Sem estar limitado pela teoria, acredita-seque a combinação de peptídeos de neo-antigênios personalizados que são novos para o sistema imunitário e assim não estão sujeitos aos efeitos atenuantes imunitários de auto-tolerância e o potente adjuvante imunitário poli-ICLC induzirá fortes respostas CD4+ e/ou CD8+. A expetativa é, como tal, que as respostas de células T sejam detetáveis ex vivo, ou seja, sem a necessidade de expansão in vitro de células específicas de epítopo através de cultura de curto prazo. Os pacientes serão inicialmente avaliados usando o conjunto total de imunogênios de peptídeo como estimulante no ensaio ELISPOT. Para pacientes demonstrando uma resposta positiva robusta, o ou os peptídeos imunogênicos exatos serão determinados em uma análise de seguimento. O IFN-Y ELISPOT é geralmente aceite como um ensaio robusto e reproduzível para detectar atividade de células T ex vivo e determinar a especificidade. Para além da análise da magnitude e mapeamento determinante da resposta de células T em monócitos de sangue periférico, outros aspetos da resposta imunitária induzida pela vacina são críticos e serão avaliados. Estas avaliações serão realizadas em pacientes que exibem uma resposta IFN-Y ELISPOT ex vivo no ensaio de rastreio. Elas incluirão a avaliação de subconjuntos de células T (células Th 1 versus Th2, efetoras versus memória), análise da presença e abundância de células regulatórias como células regulatórias T ou células supressoras derivadas de mielóide, e ensaios de citotoxicidade se foram estabelecidas com sucesso linhas celulares de melanoma específicas do paciente.

Exemplo 10: Síntese de peptídeos

[00410] Os peptídeos GMP serão sintetizados por química padrão de peptídeos sintéticos de fase sólida e purificados por RP-HPLC. Cada peptídeo individual será analisado por uma variedade de ensaios qualificados para avaliar aparência (visual), pureza (RP-HPLC), identidade (por espectrometria de massa), quantidade (nitrogênio Elementar) e contraíon de trifluoroacetato (RP-HPLC) e liberado.

[00411] Os peptídeos de neoantigênio personalizados podem ser consistir de até 20 distintos peptídeos únicos para cada paciente. Cada peptídeo pode ser um polímero linear de ~20 - ~30 aminoácidos L unidos por ligações peptídicas padronizadas. O terminal amino pode ser uma amina primária (NH2-) e o terminal carboxi é um grupo carbonila (-COOH). São utilizados os 20 aminoácidos padrão comummente encontrados em células de mamíferos (alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutâmico, glicine, histidina, isoleucina, leucina lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina, valina). O peso molecular de cada peptídeo varia com base no seu comprimento e sequência e é calculado para cada peptídeo.

[00412] Peptídeos de neoantigênio personalizados podem ser fornecidos como uma caixa contendo frascos criogênicos de 2 ml da Nunc com tampas codificadas por cores, cada frasco contendo aproximadamente 1,5 ml de uma solução congelada de DMSO/D5W contendo até 5 peptídeos a uma concentração de 400 ug/ml. Poderá haver 10 - 15 frascos para cada um dos quatro grupos de peptídeos. Os frascos devem ser armazenados a -80 oC até utilização. Estudos de estabilidade em curso confirmam a temperatura e tempo de armazenamento.

[00413] Armazenamento e Estabilidade: Os peptídeos de neoantigênios personalizados são armazenados congelados a - 80 oC. Os intermediários de processo descongelados e filtrados por esterilização e a mistura final de peptídeos de neoantigênios personalizados e poli-ICLC podem ser mantidos à temperatura ambiente, mas devem ser usados no espaço de 4 horas.

[00414] Compatibilidade: Os peptídeos de neoantigênios personalizados serão misturados com 1/3 de volume de poli-ICLC imediatamente antes da utilização.

Exemplo 11: Administração

[00415] A seguir à mistura com os peptídeos/polipeptídeos neo-antigênicos personalizados, a vacina (por exemplo, peptídeos + poli-ICLC) deve ser administrada subcutaneamente.

[00416] Preparação de conjuntos de peptídeos/polipeptídeos neo-antigênicos personalizados: peptídeos serão misturados uns com os outros em 4 conjuntos de até 5 peptídeos cada. Os critérios de seleção para cada conjunto serão baseados no alelo MHC particular ao qual o peptídeo se prevê ligar.

[00417] Composição de Conjunto: A composição dos conjuntos será selecionada com base no alelo HLA particular ao qual o peptídeo se prevê ligar. Os quatros conjuntos serão injetados em locais anatômicos que drenam para tinas de linfonodos separadas. Esta abordagem foi escolhida de forma a potencialmente reduzir o mais possível a competição antigênica entre peptídeos que se ligam ao mesmo alelo HLA e envolver um amplo subconjunto do sistema imunitário do paciente no desenvolvimento de uma resposta imunitária. Para cada paciente, serão identificados os peptídeos que se prevê ligarem-se a até quatro diferentes alelos HLA A e B. Alguns peptídeos neoORF não serão associados a qualquer alelo HLA particular. A abordagem da distribuição de peptídeos a diferentes conjuntos será espalhar cada conjunto de peptídeos associados a um alelo HLA particular por o maior número possível dos quatro conjuntos. É altamente provável que haja situações onde haverá mais do que 4 peptídeos previstos para um dado alelo, e em esses casos será necessário alocar mais do que um peptídeo associado a um alelo particular ao mesmo conjunto. Esses peptídeos neoORF não associados com nenhum alelo em particular serão aleatoriamente atribuídos aos restantes compartimentos. De seguida é mostrado um exemplo:

[00418] Sempre que possível, peptídeos que se prevêligarem ao mesmo alelo MHC serão colocados em conjuntos separados. Alguns dos peptídeos neoORF podem não ser previstos como ligando-se a nenhum alelo MHC do paciente. Estes peptídeos continuarão contudo a ser utilizados, principalmente porque são completamente novos e como tal não estão sujeitos a efeitos imuno-atenuantes de tolerância central e como tal têm uma elevada probabilidade de ser imunogênicos. Os peptídeos neoORF podem também conter um potencial de autoimunidade dramaticamente reduzido, uma vez que não há qualquer molécula equivalente em qualquer célula normal. Além disso, poderão surgir falsos negativos do algoritmo de previsão e é possível que o peptídeo contenha um epítopo de classe HLA II (os epítopos de classe HLA II não são fiavelmente previstos com base nos atuais algoritmos). Todos os peptídeos não identificados com um alelo HLA em particular serão aleatoriamente atribuídos aos conjuntos individuais. As quantidades de cada peptídeo são baseadas em uma dose final de 300 μg de cada peptídeo por injeção.

[00419] Para cada paciente, quatro conjuntos distintos (marcados “A”, “B”, “C” e “D”) de 5 peptídeos sintéticos cada serão preparados, fabricados e armazenados a -80 oC. No dia de imunização, a vacina completa consistindo do ou dos componentes de peptídeos e poli-ICLC será preparada em uma câmara de biossegurança de escoamento laminar na farmácia de investigação. Um frasco de cada (A, B, C e D) será descongelado à temperatura ambiente em colocado e uma câmara de biossegurança para as restantes etapas. 0,75 ml de cada conjunto de peptídeos serão retirados do frasco para seringas separadas. Separadamente, quatro alíquotas de 0,25 ml (0,5 mg) de poli-ICLC serão retiradas para seringas separadas. O conteúdo da cada seringa contendo conjunto de peptídeos será então cuidadosamente misturado com uma alíquota de 0,25 ml de poli-ICLC por transferência seringa- a-seringa. Todo o 1 ml da mistura será usado para injeção. Estas 4 preparações serão marcadas "fármaco de estudo A", "fármaco de estudo B", "fármaco de estudo C", e "fármaco de estudo D".

[00420] Injeções: A cada imunização, cada um dos 4 fármacos de estudo será injetado subcutaneamente em uma extremidade. Cada fármaco de estudo individual será administrado à mesma extremidade a cada imunização durante toda a duração do tratamento (ou seja, o fármaco de estudo A será injetado no braço esquerdo nos dias 1, 4, 8, etc, o fármaco de estudo B será injetado no braço direito nos dias 1, 4, 8, etc.). Localizações anatômicas alternativas para paciente de estado pós- dissecção completa de linfonodos axilares ou inguinais são as zonas esquerda e direita do ventre, respectivamente.

[00421] A vacina será administrada seguindo a um calendário iniciador/reforço. As doses iniciais de vacina serão administradas nos dias 1, 4, 8, 15, e 22 como mostrado acima. Na fase de reforço, a vacina será administrada nos dias 85 (semana 13) e 169 (semana 25).

[00422] Todos os pacientes recebendo pelo menos uma dose da vacina serão avaliados quanto a toxicidade. Os pacientes serão avaliáveis quanto a atividade imunológica se tiverem recebido todas as vacinações durante a fase de indução e a primeira vacinação (reforço) durante a fase de manutenção.

Exemplo 12: Estudos Farmacodinâmicos

[00423] A estratégia de imunização é uma abordagem de "reforço inicial", envolvendo uma série inicial de imunizações pouco espaçadas para induzir uma resposta imunitária seguida de um período de repouso para permitir que sejam estabelecidas células T de memória. A isto seguir- se-á uma imunização de reforço, e espera-se que a resposta de célula T 4 semanas após este reforço (16 semanas após a primeira vacinação) gere a resposta mais forte e será o ponto final imunológico primário. Será realizada monitorização imunitária de forma gradual como definido de seguida para caracterizar a intensidade e qualidade das respostas imunitárias obtidas. Sangue periférico será colhido e PBMC será congelado em dois pontos temporais separados antes da primeira vacinação (linha de base) e em diferentes ponto temporais após isso, como ilustrado no Esquema B e especificado no calendário de estudo. Monitorização imunitária em um determinado paciente será realizada após ter sido colhido todo o conjunto de amostras da fase de indução e da fase de manutenção, respectivamente. Se estiver disponível suficiente tecido tumoral, uma porção de tumor será usado para desenvolver linhas celulares de melanoma autólogo para utilização em ensaios de célula T citotóxica.

Exemplo 13: Rastreio IFN-Y ELISPOT ex vivo

[00424] Para cada paciente, será sintetizado um conjunto de peptídeos de rastreio. Os peptídeos de rastreio terão 15 aminoácidos de comprimento (ocasionalmente será usado um 16 mer ou 17 mer), sobreposição por 11 aminoácidos e cobrindo todo o comprimento de cada peptídeo ou todo o comprimento do neoORF para peptídeos derivados de neoORF. Todo o conjunto de peptídeos de rastreio específicos do paciente serão agrupados em uma concentração aproximadamente igual e será também armazenada individualmente uma porção de cada peptídeo. A pureza do conjunto de peptídeos será determinada testando o PBMC de 5 dadores saudáveis que estabeleceram um fundo baixo em IFN-Y ELISPOTs ex vivo. Inicialmente, o PBMC obtido na linha de base e na semana 16 (o ponto final imunológico primário) será estimulado por 18 horas com o conjunto completo de peptídeos 15 mer sobrepostos (sobreposição de 11 aminoácidos) para examinar a resposta global à vacina de peptídeos. Ensaios subsequentes podem utilizar PBMC colhido em outros pontos temporais como indicado. Se não for identificada qualquer resposta no ponto final imunológico primário usando o ensaio IFN-Y ELISPOT ex vivo, o PBMC será estimulado com o conjunto de peptídeos por um período de tempo mais longo (até 10 dias) e re-analisado.

Exemplo 14: Desconvolução de epítopos em ensaios de seguimento IFN-Y ELISPOT ex vivo.

[00425] Assim que for observada uma resposta IFN-Y ELISPOT ex vivo obtida por um conjunto de peptídeos sobrepostos (definida como pelo menos 55 unidades formadores de mancha / 106 PBMC ou aumentada em pelo menos 3 vezes em relação à linha de base), o peptídeo imunogênico que obtém esta resposta será identificado por desconvolução do conjunto de peptídeos com base em subconjuntos baseados nos peptídeos imunizantes e repetindo os ensaios IFN-Y ELISPOT ex vivo. Para algumas respostas, será feita uma tentativa de caracterizar com precisão o epítopo estimulante utilizando peptídeos 8-10 mer sobrepostos derivados de peptídeos estimulantes confirmado em ensaios IFN-Y ELISPOT. Serão conduzidos ensaios adicionais em uma base caso-a-caso para amostras apropriadas: Por exemplo, 1 Todos o conjunto ou subconjuntos 15 mer serão usados como peptídeos estimulantes para ensaios de coloração de citocina intracelular para identificar e quantificar populações CD4+, CD8+ específicos de antigênio, de memória central e de memória efetora. 2 Igualmente, estes conjuntos serão usados para avaliar o padrão de citocinas segregadas por estas células para determinar o fenótipo TH1 vs TH2 3 Coloração de citocinas extracelulares e citometria de fluxo de células não estimuladas serão usadas para quantificar células supressoras Treg e derivadas de mielóide (MDSC). 4 Se uma linha celular de melanoma for estabelecida com sucesso de um paciente respondedor e o epítopo ativador puder ser identificado, os ensaios de citotoxicidade de célula T serão conduzidos usando o peptídeo de tipo selvagem mutante e correspondente 5 PBMC do ponto final imunológico primário será avaliado quanto a "distribuição de epítopos" usando antigênios tumorais associados a melanoma como estimulantes e usando vários epítopos mutados identificados adicionais que não foram selecionados como estando entre os imunogênios

[00426] Será conduzida imuno-histoquímica de amostras tumorais para quantificar populações infiltrantes CD4+, CD8+, MDSC, e Treg.

Exemplo 15: Pipeline para a identificação sistemática de neoantigênios de tumor

[00427] Recentes avanços nas tecnologias de sequenciação e previsões de epítopo de peptídeos foram alavancadas para gerar um pipeline de duas etapas para descobrir sistematicamente neoantigênios candidatos ligados a HLA específicos de tumor. Como representado na FIG. 10, esta abordagem começa com a sequenciação de DNA de tumores (por exemplo, por sequenciação de exoma completo (WES) ou sequenciação de genoma completo (WGS)) em paralelo com DNA normal correspondido para identificar de forma abrangente mutações somáticas não sinônimas (ver, por exemplo, Lawrence et al. 2013; Cibulski et al. 2012). A seguir, peptídeos candidatos mutados específicos de tumor gerados por mutações tumorais com o potencial de se ligarem a proteínas pessoais HLA de classe I, e portanto apresentados a células T CD8+, podem ser previstos usando algoritmos de previsão como, por exemplo, NetMHCpan (ver, por exemplo, Lin 2008; Zhang 2011). Antigênios de peptídeos candidatos foram adicionalmente avaliados com base em validação experimental da sua ligação a HLA e mRNAs cognatos de expressão em células de leukemia autólogas.

[00428] Este pipeline foi aplicado a um grande conjunto de dados de amostras de CLL sequenciadas (ver, por exemplo, Wang et al. 2011). De 91 casos que foram sequenciados por WES ou WGS, foram descobertos um total de 1838 mutações não sinônimas em regiões codificadoras de proteína, correspondendo a uma taxa de mutação somática média de 0,72 (±0,36 s.d.) por megabase (gama, 0,08 a 2,70), e uma média de 20 mutações não sinônimas por paciente (gama, 2 a 76) (ver, por exemplo, Wang et al. 2011). Foram identificadas três classes gerais de mutações que se esperariam ser geradoras de regiões de alterações de aminoácidos e desta forma potencialmente ser imunologicamente reconhecidas. A classe mais abundante incluía mutação de sentido trocado que provoca alterações de aminoácidos únicos (aa), representando 90% de mutações somáticas por CLL. De 91 amostras, 99% abrigaram mutações de sentido trocado e 69% tinham entre 10 e 25 mutações de sentido trocado (ver, por exemplo, a FIG. 2A). As outras duas classes de mutações, deslocamentos de quadro de leitura e mutações de local de união (mutações em junções éxon-íntron) têm o potencial de gerar trechos mais longos de sequências de aminoácidos novas inteiramente específicas do tumor (novos quadros de leitura aberta, ou neoORF), com um número superior de peptídeos de neoantigênios por alteração indicada (em comparação com mutações de sentido trocado). Contudo, consistentemente com dados de outros tipos de câncer, as mutações geradoras de neoORF foram aproximadamente 10 vezes menos abundantes do que as mutações de sentido trocado em CLL (ver, por exemplo as FIGs. 2B-C). Dada a prevalência de mutações de sentido trocado, os estudos experimentais subsequentes focaram-se na análise de neoepítopos gerados por mutações de sentido trocado.

Exemplo 16: Mutações de sentido trocado somáticas geram neopeptídeos que se prevê ligarem-se a alelos de classe HLA I pessoais

[00429] O reconhecimento de célula T de epítopos de peptídeos pelo receptor de células T (TCR) exige a apresentação de peptídeos ligados dentro da fenda de ligação de moléculas HLA na superfície das células apresentando antigênio. Recente estudos comparativos em todos os >30 algoritmos de previsão de classe I disponíveis mostraram que NetMHCpan têm um desempenho consistente com elevada sensibilidade e especificidade em todos os alelos HLA (ver, por exemplo, Zhang et al. 2011).

[00430] O algoritmo NetMHCpan foi testado contra um conjunto de 33 epítopos mutados conhecido que foram originalmente identificados na literatura com base na sua atividade funcional (ou seja, capacidade de estimular respostas de célula T citolíticas anti-tumorais) ou foram caracterizadas como antigênios de histocompatibilidade menor imunogênicos para determinar se o algoritmo preveria corretamente a ligação dos 33 epítopos mutados conhecidos (ver, por exemplo, as Tabelas 4 e 5). As Tabelas 4 e 5 mostram afinidades de ligação de peptídeo HLA de epítopos mutados imunogênicos derivados funcionalmente em cânceres humanos usando NetMHCpan. A Tabela 4 mostra epítopos de mutações de sentido trocado (NSCLC: câncer do pulmão de células não pequenas; MEL: melanoma; CLL: leucemia linfóide crônica; RCC: carcinoma das células renais claras; BLD: câncer da bexiga; NR: não reportado;). Amarelo: IC50 < 150 nM, verde: IC50 150-500 nM e cinzento IC50 > 500 nM.

[00431] A Tabela 5 mostra epítopos de antigênios de histocompatibilidade menor (MM: mieloma múltiplo; HM: malignidade hematológica; B-ALL: leucemia linfóide aguda de célula B).Tabela 5

[00432] Entre todas as possibilidades 9 mer e 10 mer apresentadas em mosaico, NetMHCpan identificou todos os 33 epítopos mutados validados funcionalmente como o melhor peptídeo de ligação entre as escolhas possíveis para a mutação em causa. A afinidade de ligação prevista média (IC50) para os elementos restritivos de HLA reportados conhecidos de cada um dos 33 epítopos mutados foi 32 nM (gama, 3-11, 192 nM). Ao definir os cortes IC50 para 150 e 500 nM, foram capturados, respectivamente, 82 e 91% dos peptídeos validados funcionalmente (ver, por exemplo, as Tabelas 4 e 5 e a FIG. 12A).

[00433] Na base do seu elevado grau de sensibilidade e especificidade, NetMHCpan foi então aplicado aos 31 de 91 casos de CLL para os quais estava disponível informação de tipagem HLA. Por convenção, peptídeos com IC50 < 150 nM foram considerados como aglutinantes fortes a intermédios, IC50 150-500 nM como aglutinantes fracos, e IC50 > 500 nM como não aglutinantes, respectivamente (ver, por exemplo, Cai et al. 2012). Para todos os 91 casos de CLL, foi encontrada uma mediana de 10 peptídeos de ligação fortes (gama, 2-40) e 12 peptídeos de ligação intermédios a fracos (gama, 2-41). No total, foi prevista uma mediana de 22 (gama, 6-81) peptídeos por caso com IC50 < 500 nM (ver, por exemplo, FIG. 12B e Tabela 6). Em particular, a Tabela 6 mostra os números e distribuições de afinidade de peptídeos previstos para os 31 casos de CLL com tipagem HLA disponível. Os pacientes expressando os 8 alelos HLA -A, -B mais comuns na população caucasiana encontram-se marcados a cinzento. Tabela 6

Exemplo 17: Mais do que metade dos neopeptídeos de ligação HLA previstos mostrou ligação direta a proteínas HLA in vitro

[00434] Como mostrado na Tabela 7, os resultados de IC50 nM gerados por previsões de ligação de peptídeo HLA foram validados usando um ensaio de ligação competitivo de alelos MHC I e focaram-se nos alelos de classe I A e B. Para esta finalidade, foram sintetizados 112 peptídeos mutados (peptídeos mutados 9 ou 10-mer) com resultados IC50 inferiores a 500 nM que foram identificados de 4 casos de CLL (Pt 1-4). Os resultados experimentais correlacionaram- se com as previsões de ligação. Ligação experimental (definida como IC 50 < 500 NM) foi confirmada em 76,5% e 36% de peptídeos previstos com IC50 de < 150 nM ou 150-500 nM, respectivamente (ver, por exemplo, FIG. 12C). No total, ~54,5% (61/112) de peptídeos previstos foram experimentalmente validados como aglutinantes com alelos HLA pessoais. No geral, as previsões para peptídeos 9-mer foram mais sensíveis do que para peptídeos 10-mer, dado que 60% vs 44,5% de peptídeos previstos (IC50 < 500 nM) puderam ser experimentalmente validados, respectivamente, como mostrado (FIG. 13).Tabela 7: Resultados de ligação HLA previstos e experimentais de neoepítopos candidatos gerados de 4 casos CLL. * Não estava disponível um ensaio de ligação experimental para A*68:12. Uma vez que A*68:12 e A*68:01 possuem estruturas primárias idênticas nas bolsas de ligação de peptídeo principal B e F e foram previstos como tendo especificidade de ligação semelhante (Sidney e Sette, 2007), ligação experimental para peptídeos previstos como ligando A*68:12 foi testada contra A*68:01.

Exemplo 18: Neoantigênios são expressos em tumores CLL

[00435] As respostas CTL contra um epítopo apenas seriam úteis se o gene codificando o epítopo for expresso nas células alvo. Das 31 amostras de pacientes sequenciadas e tipadas quanto a HLA, 26 foram submetidas a perfilação de expressão pangenômica (ver, por exemplo, Brown et al. 2012). O nível de expressão de 347 genes com mutações em amostras de CLL foi classificado como possuindo expressão baixa/ausente (quartil inferior); média (dois quartis médios) ou elevada (quartil superior). Como mostrado na FIG. 12D, 80% dos 347 genes mutados (ou 79% das 180 mutações com ligação HLA prevista) foram expressos em níveis de expressão média ou elevada. Foi observada uma frequência de expressão elevada semelhante entre o subconjunto de 221 genes mutados (88,6%) com epítopos de ligação de classe I previstos.

[00436] Os níveis de RNA podem ser determinado com base no número de leituras por produto genético e classificados por quartis. “H” - Quartil superior; “M” - Dois quartis intermédios; “L” - Quartil inferior (excluindo genes sem leituras; “-“ - leituras não detectáveis. À medida que a afinidade prevista diminui, pode ser aplicada estringência mais elevada a níveis de expressão. Foram utilizados neoORFs com aglutinantes previstos, mesmo que não houvesse moléculas de mRNA detectáveis por RNA-Seq. Não há dados presentemente disponíveis para avaliar qual seria, se é que existe, o nível de expressão mínimo exigido em uma célula tumoral para um neoORF ser útil como um alvo para células T ativadas. Mesmo o nível de expressão de tradução "pioneira" de mensagens destinadas a degradação mediada por não sentido pode ser suficiente para geração de alvos ((Chang YF, Imam JS, Wilkinson MF: The nonsense-mediated decay RNA surveillance pathway. Annu Rev Biochem 76:51-74, 2007). Como tal, por via do elevado valor de neoORFs como alvos devido à sua novidade e especificidade tumoral refinada, neoORFs podem ser utilizados como imunogênios mesmo se a expressão ao nível RNA for baixa ou indetectável.

Exemplo 19: Foram detectados neoepítopos candidatos direcionados a células T no Paciente de CLL 1 após HSCT

[00437] A configuração de transplante pós-alogênico de células-tronco hematopoiéticas (HCT) em CLL foi analisada para determinar se uma resposta imunitária contra os peptídeos mutados previstos se poderia desenvolver em pacientes. Reconstituição de células T de de um dador saudável após HSCT pode ultrapassar defeitos imunitários endógenos do hospedeiro, e também permitir iniciação contra células de leucemia no hospedeiro in vivo. A análise focou- se em dois pacientes que tinham ambos sido submetidos a condicionamento alo-HSCT não relacionado de intensidade reduzida para CLL avançado e que tinham alcançado remissão contínua por mais de 4 anos após HSCT (ver, por exemplo, a Tabela 8). Células T pós-transplante foram colhidas 7 anos (Paciente 1) e 4 anos (Paciente 2) após o transplante.

[00438] A Tabela 8 mostra as características clínicas de pacientes (Pts) de CLL 1 e 2. Ambos os pacientes alcançaram remissão contínua em curso após HSCT superior a 7 (PT 1) e 4 anos (Pt 2). M: macho; HSCT: transplante de células tronco hematopoiéticas; RIC: condicionamento de intensidade reduzida; Flu/Bu: Fludarabina/Bussulfano; GvHD: doença do enxerto vs hospedeiro; URD: dador não relacionado; Mis: de sentido trocado; FS: deslocamento de quadro de leitura.Tabela 8

[00439] Para o Paciente (PT1), foram identificadas por WES 25 mutações de sentido trocado. No total, foram previstos 30 peptídeos de 13 mutações como ligando-se a HLA pessoal (13 peptídeos com IC50 < 150; 17 peptídeos com IC50 150-500 nM). Como mostrado na FIG. 14A, validação experimental de previsões de peptídeo confirmou ligação HLA para 14 peptídeos derivados de 9 mutações. Todos os 30 peptídeos de ligação HLA foram selecionados para estudos de iniciação de célula T, e foram organizados em 5 conjuntos de 6 peptídeos/conjunto (ver, por exemplo, a Tabela 9). Peptídeos com resultados de ligação previstos semelhantes foram reunidos dentro do mesmo conjunto.

[00440] A Tabela 9 providencia um sumário de peptídeos de mutações de sentido trocado do Pt 1 que foram incluídos em conjuntos de peptídeos para estudos de estimulação de célula T. No Pt 1, foram usados todos os peptídeos previstos com ligação IC50 < 500 nM a HLA -A e - B. 5 conjuntos de peptídeos mutados com 6 peptídeos/conjunto listados em ordem decrescente de afinidades de ligação previstas para alelos de classe MHC I. As afinidades de ligação de peptídeo HLA experimentais correspondentes, peptídeos de tipo selvagem e os seus resultados IC50 previstos são incluídos nas colunas da extrema direita.Tabela 9

[00441] Foram testadas células T quanto a reatividade de neoantigênios expandindo-os usando células apresentando antigênio autólogas (APCs) pulsadas com conjuntos de peptídeos de neoantigênios candidatos (uma vez por semana X 4 semanas). Como mostrado na FIG. 14B, foi detectada reatividade em um ensaio IFN-g ELISPOT contra o Conjunto 2, mas não contra um peptídeo irrelevante (peptídeo de taxa). Desconvolução do conjunto revelou que os peptídeos mutados (mut) ALMS1 e C6orf89 dentro do Conjunto 2 eram imunogênicos. ALMS1 desempenha um papel na função ciliar, quiescência celular e transporte intracelular, e mutações em este gene foram associadas com diabetes de tipo II. C6orf89 codifica uma proteína que interage com receptor de bombesina subtipo- 3 que está envolvida na progressão de ciclo celular e reparação de feridas de células do epitélio brônquico. Ambos os locais mutados não estavam em regiões conservadas do gene, e não estavam dentro de genes previamente reportados como sendo mutados em câncer. Ambos os peptídeos alvo estavam entre o subconjunto de 14 peptídeos previstos que podiam ser experimentalmente confirmadas como ligando alelos HLA do PT1. Os resultados de ligação experimental de mut e tipo selvagem (wt) ALMS1 foram 91 e 666 nM, respectivamente; e de mut- e wt-C6ORF89, 131 e 1,7 nM, respectivamente (ver, por exemplo, FIG. 14C e Tabela 9). Ambos os genes mutados localizaram-se em regiões mal conservadas e não se localizaram em locais de mutação reportados anteriormente em cânceres (ver, por exemplo, FIGS. 15-16).

Exemplo 20: Paciente de CLL 2 exibiu imunidade contra um peptídeo FNDC3B mutado que é naturalmente processado

[00442] No Paciente 2, foi testada a capacidade de neoantigênios pessoais de contribuir para respostas T de memória na definição de remissão de longa duração. Em este indivíduo, foram identificadas 26 mutações de sentido trocado não sinônimas. No total, foram previstos 37 peptídeos de 16 mutações como ligando-se a alelos HLA pessoais, dos quais 18 peptídeos de 12 mutações poderiam ser experimentalmente validados (15 com IC50 < 150; 3 com IC50 150-500 nM) (ver, por exemplo, a FIG. 17A). No Pt 2, foram estudados todos os 18 peptídeos de ligação HLA experimentalmente validados. Foram realizadas estimulações de célula T usando 3 conjuntos de 6 peptídeos/conjunto (ver, por exemplo, a Tabela 10). A Tabela 10 mostra um resumo de peptídeos de mutações de sentido trocado do Pt 2 que foram incluídos em conjuntos de peptídeos para estudos de estimulação de célula T. No Pt 2, foram usados todos os peptídeos que foram experimentalmente confirmados como ligando-se a alelos HLA -A e -B. 3 conjuntos de peptídeos com 6 peptídeos/conjunto listados em ordem decrescente de afinidade de ligação experimental de peptídeos mutados. Os peptídeos de tipo selvagem correspondentes e os seus resultados IC50 previstos são incluídos nas colunas da extrema direita.

[00443] Peptídeos com resultados de ligação experimentais semelhantes foram combinados dentro do mesmo conjunto. As respostas foram avaliadas após 2 rondas de estímulos semanais de células T contra APCs autólogos pulsados por conjunto de peptídeos mutados e descobriu-se que as células T são reativas contra o Conjunto 1, como mostrado na FIG. 17B. Desconvolução do conjunto revelou mut- FNDC3B como sendo o peptídeo imunogênico dominante entre outros dentro deste conjunto (IC50 experimental de mut- e wt-FNDC3B foram 6,2 e 2,7 nM, respectivamente; ver, por exemplo, a FIG. 17C). A função de FNDC3B em malignidades do sangue não é clara, apesar da regulação para baixo da expressão de FNDC3B ser conhecida como regulando para cima a expressão de miR-143, o que foi demonstrado que diferencia células-tronco do câncer da próstata e promove a metástase do câncer da próstata. De forma semelhante a ALMS1 e C6orf89, a mutação em FNDC3B nem se localizou em regiões conservadas evolucionárias nem foi previamente reportada em outros cânceres (ver, por exemplo, as FIGS. 15 e 16).

[00444] A reatividade de célula T contra mut-FNDC3B foi polifuncional (segregando GM-CSF, IFN-g e IL-2), e específica do peptídeo mut-FNDC3B mas não do seu homólogo de tipo selvagem. Testar a reatividade de célula T contra diferentes concentrações de peptídeos mut- e wt-FNDC3B revelou uma elevada avidez e especificidade de células T reativas a mut-FNDC3B. A reatividade de célula T foi anulada pela presença de anticorpos de bloqueio de classe I (W6/32), indicando que a reatividade de célula T foi limitada a classe I (ver, por exemplo, FIGS. 17D-E). Além disso, o peptídeo mut-FNDC3B pareceu ser um peptídeo naturalmente processado e apresentado uma vez que a reatividade de célula T foi detectada contra APCs expressando HLA-A2 que foram transfectadas com um minigene de 300 pares de base abrangendo a região de mutação de genes, mas não o minigene de tipo selvagem, como mostrado na FIG. 17E, painel direito.

[00445] Usando um tetrâmero específico de mut- FNDC3B/A2+, foi detectada uma população discreta de células T CD8+ reativas a mut-FNDC3B dentro de células T estimuladas pelo Conjunto 1 (2,42% da população) em comparação com PBMCs de controle de um voluntário adulto saudável com HLA-A2+ (0,38%), como mostrado na FIG. 17F. Análise de expressão de genes de FNDC3B em um grande conjunto de dados de 182 casos de CLL (incluindo Pt 2) e 24 células B CD19+ colhidas de voluntários normais revelou que este gene é relativamente sobreexpressado no Paciente 2 em comparação com outros CLLs e células B normais, como mostrado na FIG. 17G. Em conformidade, é claro que células T específicas de neoantigênio de longa vida puderam ser rastreadas no Paciente 2 com CLL.

[00446] Para definir a cinética de células T específicas de mut-FNDC3B em relação ao curso pós-HSCT, as células T do Pt2 isoladas de diferentes pontos temporais antes e após HSCT foram estimuladas por 2 semas e depois testadas quanto a reatividade de IFN-g em ELISPOT. O surgimento de células T específicas de mut-FNDC3B coincidiu com remissão molecular e foi mantido ao longo do tempo com remissão contínua. Como mostrado na FIG. 18 (painel superior e intermédio), não foram detectadas respostas de células T mut-FNDC3B antes ou até 3 meses após HSCT. Remissão molecular foi primeiro alcançada 4 meses a seguir a HSCT, e células T específicas de mut-FNDC3B foram então detectadas primeiro 6 meses após HSCT. A reatividade específica de antigênio diminuiu subsequentemente (entre 12 e 20 meses após HSCT), mas foi novamente fortemente detectada 32 meses após HSCT. Com base na análise molecular do TCR das células T específicas de mut-FNDC3B, Vb11 foi identificado como a subfamília CDR3 Vb predominante usada pelas células T reativas, como mostrado na FIG. 19 e Tabela 11). A Tabela 11 mostra iniciadores usados para amplificação da subfamília de TCR Vβ.Tabela 11

[00447] Esta informação molecular foi usada para desenvolver um ensaio PCR agrupado específico de clone. Ao aplicar este ensaio, foi observado que células T com a mesma especificidade para mut-FNDC3B não foram detectadas em PBMCs (n=3) e células T CD8+ de voluntários saudáveis normais (ver, por exemplo, a Tabela 12), mas puderam ser detectadas com cinética semelhante como detecção de secreção de IFN-g após HSCT no paciente, como mostrado na FIG. 18, painel inferior. Apesar dos números relativos de células T específicas de clone terem declinado ao longo do tempo, concentrações inferiores de antigênio de peptídeo puderam estimular reatividade de célula T aos 32 meses em comparação com 6 meses pós HSCT, indicando o surgimento de células T de memória potencialmente mais sensíveis a antigênio ao longo do tempo (ver, por exemplo, FIG. 18, inserto).

[00448] A Tabela 12 mostra detecção de TCR Vb11 específico de mut-FNDC3B, usando iniciadores específicos de receptor de célula T no Pt 2. Um ensaio PCR de tempo real foi concebido para detectar o clone TCR Vb11 específico de mut-FNDC3B. Este clone não foi detectado em PBMCs (n=3) ou células T CD8 de dador saudável, mas foi claramente detectável em cDNA de células T reativas a mut-FNDC3B de Pt 2 (6 meses após HSCT). Os produtos PCR foram normalizados por RNA ribossômico 18S. -, negativo: sem amplificação; +, positivo: amplificação detectada; ++, duplo positivo: amplificação detectada e nível de amplificação é mais do que o nível mediano de todas as amostras positivas.Tabela 12

Exemplo 21: Foi previsto um grande número de neoantigênios candidatos em diversos cânceres

[00449] A taxa de mutação somática global de CLL é semelhante a outras malignidades do sangue, mas baixa em comparação com malignidades tumorais sólidas (ver, por exemplo, a FIG. 20A). Para examinar como o tipo de tumor e taxa de mutação impacta a abundância e qualidade de neoantigênios candidatos, o pipeline foi aplicado a dados WES disponíveis publicamente de 13 malignidades - incluindo cânceres elevados (melanoma (MEL)), carcinoma das células escamosas (LUSC) e adenocarcinoma (LUAD), câncer da cabeça e pescoço (HNC), câncer da bexiga, adenocarcinoma do cólon e reto, médios (glioblastoma (GBM(, dos ovários, carcinoma das células renais claras (RCC de células claras), e câncer da mama) e baixos (CLL e leucemia mielóide aguda (AML). Para realizar esta análise, um algoritmo recentemente descrito que permite inferência de tipagem de HLA dos dados WES foi também implementado (Liu et al. 2013).

[00450] A taxa de mutação global em estas malignidades sólidas foi de uma ordem de magnitude maior do que CLL e foi associada com um número mediano aumentado de mutações de sentido trocado. Por exemplo, o melanoma apresentou uma mediana de 300 (gama, 34-4276) mutações de sentido trocado por caso, enquanto RCC teve 41 (gama, 10101), respectivamente. Mutações de deslocamento de quadro de leitura e de local de união em RCC e melanoma foram aumentadas em apenas 2-3 vezes em frequência em comparação com CLL e o comprimento somado de neoORF por amostra foi aumentado apenas moderadamente (em 5-13 vezes). No global, o número mediano de neopeptídeos previstos com IC50 < 500 nM gerados de eventos de sentido trocado e de deslocamento de quadro de leitura por amosta foi proporcional à taxa de mutação; esta foi aproximadamente 20- e 4- vezes superior para melanoma (488; gama, 18-5811) e RCC (80; gama, 6-407)), respectivamente, em comparação com CLL (24; gama 2-124). Com um limiar mais estringente de IC50 < 150 nM, os números correspondentes de neopeptídeos previstos foram 212, 35 e 10 para o melanoma, RCC e CLL, respectivamente, como mostrado na FIG. 20B e Tabela 13).

[00451] A Tabela 13 mostra a distribuição de classes de mutação, tamanhos somados de neoORF e número de peptídeos de ligação previstos em 13 cânceres. MEL:melanoma, LUSC: carcinoma das células escamosas do pulmão, LUAD: adenocarcinoma pulmonar, BLCA: câncer da bexiga, HNSC: câncer da cabeça e pescoço, COAD: adenocarcinoma do cólon, READ: adenocarcinoma renal, GBM: glioblastoma, OV: ovários, RCC: carcinoma das células renais claras, BRCA: mama, CLL: leucemia linfóide crônica, AML: leucemia mielóide aguda. *- número previsto de peptídeos com base em mutações de sentido trocado e por deslocamento de quadro de leitura.Tabela 13 * Refere-se apenas a epítopos previstos surgindo de mutações de sentido trocado.

Exemplo 22: Estratégias clínicas para tratar mutações clonais

[00452] Mutações "clonais" são aquelas encontradas em todas as células cancerígenas dentro de um tumor, enquanto mutações "subclonais" são aquelas que estatisticamente não estão em todas as células cancerígenas e como tal derivam de uma subpopulação dentro do tumor.

[00453] De acordo com as técnicas aqui apresentadas, pode ser usada análise bioinformática para estimar a clonalidade de mutações. Por exemplo, o algoritmo ABSOLUTE (Carter et al, 2012, Landau et al, 2013) pode ser usado para estimar pureza de tumor, ploidia, números de cópia absolutos e clonalidade de mutações. Distribuições da densidade da probabilidade de frações alélicas de cada mutação poderão ser geradas seguidas de conversão para frações de células de câncer (CCFs) das mutações. As mutações poderão ser classificadas como clonais ou subclonais com base em se a probabilidade posterior do seu CCF exceder 0,95 é maior ou menor do que 0,5, respectivamente.

[00454] É contemplado dentro do escopo da revelação que uma vacina de neoantigênios pode incluir peptídeos para mutações clonais, subclonais ou ambos os tipos de mutações. A decisão pode depender do estágio da doença do paciente e da ou das amostras de tumor sequenciadas. Para um estudo clínico inicial na configuração de adjuvante, poderá não ser necessário distinguir entre os dois tipos de mutações durante a seleção de peptídeos; contudo, um perito na técnica apreciará que tal informação poderá ser útil na orientação de futuros estudos por várias razões.

[00455] Primeiro, células tumorais do paciente podem ser geneticamente heterogêneas. Múltiplos estudos foram publicados nos quais tumores representando diferentes estágios da progressão da doença foram avaliados quanto a heterogeneidade. Estes incluem examinar a evolução de uma doença pré-maligna (síndroma mielodisplásico) para leucemia (leucemia mielóide aguda secundária [AML]) (Walter et al 2012), recaída após remissão induzida por terapia de AML (Ding et al 2012), evolução de câncer de mama e meduloblastomas de primários a metastáticos (Ding et al 2012; Wu et al Nature 2012), e evolução de cânceres do pâncreas e dos rins de primários a altamente metastáticos (Yachida et al 2012; Gerlinger et al 2012). A maior parte dos estudos utilizou sequenciação de genoma ou exoma, mas um estudo também avaliou variações do número de cópias e variações de padrão de metilação CpG. Estes estudos mostraram que os eventos genéticos são adquiridos durante crescimento celular do câncer que altera o perfil de mutações. Muitas, e normalmente a maior parte (40% - 90%) das mutações mais precocemente detectáveis ("mutações fundadoras") persistem em todas as variantes evoluídas, mas surgem novas mutações únicas para clones evoluídos e estas podem ser distintas entre diferentes clones evoluídos. Estas alterações podem ser motivadas por pressões "ambientais" de célula hospedeiro/câncer e/ou intervenção terapêutica e assim, doença metastática mais elevada ou intervenção terapêutica anterior geralmente conduzem a heterogeneidade mais significativa.

[00456] Segundo, é contemplado que um tumor único para cada paciente pode ser inicialmente sequenciado, o que pode providenciar um retrato do perfil de variação genética para esse ponto temporal particular. O tumor sequenciado pode ser derivado de um linfonodo clinicamente evidente, metástase em trânsito/satélite ou metástase visceral ressectável. Nenhum dos pacientes inicialmente testados terá doença que tenha progredido clinicamente para locais múltiplos; contudo, é contemplado que as técnicas aqui descritas serão amplamente aplicáveis a pacientes com câncer que progrediu para locais múltiplos. Dentro desta população de células tumorais, "mutações clonais" podem consistir de mutações fundadoras e quaisquer novas mutações presentes na célula que semeou o tumor ressectado e mutações subclonais representam as que evoluíram durante o crescimento do tumor ressectado.

[00457] Terceiro, as células tumorais clinicamente importantes para as células T induzidas por vacina selecionarem como alvo são frequentemente não as células de tumor ressectadas mas sim outras células de tumor indetectáveis dentro de um determinado paciente. Estas células podem ter-se disseminado diretamente desde o tumor primário ou desde o tumor ressectado, podem ter derivado de uma população dominante ou subdominante dentro do tumor de inoculação e podem ter evoluído geneticamente adicionalmente no local ressectado cirurgicamente. Estes eventos são atualmente imprevisíveis.

[00458] Assim, para a configuração do adjuvante ressectado cirurgicamente não há maneira a priori para decidir se as mutações encontradas no tumor ressectado que são clonais ou subclonais representam a escolha ótima para tratar outras células cancerígenas não ressectadas. Por exemplo, mutações que são subclonais dentro do tumor ressectado podem ser clonais em outros locais se esses outros locais foram semeados de uma subpopulação de células contendo a mutação subclonal dentro do tumor ressectado.

[00459] Em outras configurações de doenças, contudo, tais como configurações nas quais pacientes possuem lesões múltiplas e metastáticas, sequenciação de mais do que uma lesão (ou partes de lesão) ou lesões de diferentes pontos temporais podem providenciar mais informação relativa a seleção de peptídeos eficaz. Mutações clonais podem tipicamente ser priorizadas no desenho de epítopos de neo- antigênios para a vacina. Em alguns casos, especialmente à medida que o tumor evolui e detalhes de sequenciação de lesões metastáticas são avaliados para um paciente individual, certas mutações subclonais podem ser priorizadas para consideração como parte da seleção de peptídeo.

Exemplo 23: Vacinas personalizadas contra câncer estimulam imunidade contra neoantigênios tumorais

[00460] A integração detalhada acima descrita de bioinformática abrangente com dados funcionais em CLL e outros cânceres providencia várias novas percepções biológicas. Primeiro, apesar de CLL ser um câncer de taxa de mutação relativamente baixa, foi não obstante possível identificar epítopos gerados por mutações somáticas que obtêm respostas de células T de longo prazo. Dados de sequenciação de exoma completo de 31 amostras de CLL revelou que, por caso, uma mediana de 22 peptídeos (gama, 6-81) foram previstos ligarem-se a alelos pessoais HLA A e B com IC50 < 500 nM originando de uma mediana de 16 (gama, 2-75) mutações de sentido trocado. Aproximadamente 75% e metade (54,5%) de peptídeos previstos com IC50 < 150 nM e 500 nM, respectivamente, foram experimentalmente validados para ligar aos alelos HLA do paciente. Análise de expressão RNA mostrou que aproximadamente 90% dos genes cognatos correspondendo aos peptídeos mutados previstos foram confirmados como sendo expressos em células CLL e expressão de um transcrito dos alelos mutados foi detectada em cada um dos três exemplos testados (dados não apresentados). Apenas uma fração de todos os neoepítopos geraram uma resposta de célula T espontânea, apesar de esta resposta ainda ter sido detectável anos após o transplante; ~6% (3/48) de todos os peptídeos mutados previstos e testados ou 9% (3/32) de peptídeos mutados experimentalmente validados e testados estimularam respostas de secreção de IFN-Y em células T de pacientes. Esta taxa de descoberta de neoepítopo em CLL, um tumor de baixa taxa de mutação, é notavelmente semelhante às taxas recentemente reportadas no melanoma (4,5%, ou 11/247 peptídeos; Robbins PF, Lu YC, El-Gamil M, et al: Mining exomic sequencing data to identify mutated antigens recognized by adoptively transferred tumor-reactive T cells. Nat Med, 2013), um câncer de alta taxa de mutação. Como tal, neoepítopos funcionais podem ser sistematicamente descobertos em todas a ampla gama de cânceres, incluindo tumores de baixa taxa de mutação.

[00461] Uma segunda descoberta-chave é que as respostas de célula t contra neoepítopos CLL foram de vida longa (na ordem de vários anos), associadas a remissão contínua de doença e foram geradas durante estimulação in vitro em um espaço de tempo consistente com respostas de célula T de memória. Estes estudos reforçam a ideia crescente na literatura de que as respostas contra neoantigênios tumorais contribuem para respostas imunitárias eficazes. Assim, apesar de aproximadamente 5% de peptídeos previstos gerados de mutações de sentido trocado originarem respostas de célula T detectáveis, a cinética da resposta sugere um possível papel em funções continuadas de vigilância antileucemia. O impacto funcional de respostas de célula T direcionadas a neoantigênios é suportado por um recente estudo de Castle et al. (Castle JC, Kreiter S, Diekmann J, et al: Exploiting the mutanome for tumor vaccination. Cancer Res 72:1081-1091, 2012) que identificou neoepítopos candidatos por WES de melanoma de murino B16 e previsão de aglutinantes de alelo peptídeo-HLA. Um subconjunto destes epítopos previstos não apenas obteve respostas imunitárias que eram específicas do peptídeo mutado e não do homólogo de tipo selvagem, como também conseguiu controlar a doença terapêutica e profilaticamente. Apesar de ter sido difícil comparar diretamente as contribuições relativas de neoantigênios tumorais versus outros tipos de antigênios CLL como antigênios nativos sobreexpressos partilhados (em contraste com o melanoma, os antigênios tumorais de CLL não estão bem caracterizados) ou com a resposta GvL, uma caracterização anterior de repostas de célula T específicas de antigênio de um paciente com melanoma com sobrevivência prolongada sugere que a imunidade anti-neoantigênica é mais prolongada e sustentada ao longo do tempo do que a de antigênios tumorais sobreexpressos partilhados.

[00462] Terceiro, estes resultados destacam o conceito de que tomar como alvo mutações "trunk" específicas de tumor pode ter impacto do ponto de vista imunológico. Todos os três neoantigênios imunogênicos (FND3CB, ALMS1, C6orf89 mutados) nos dois pacientes pareceram ser mutações passageiras, não diretamente contribuindo para o processo oncogênico, e foram clonais, afetando grande parte da massa cancerígena. Várias características destas mutações imunogênicas sugerem que são mutações passageiras: falta de conservação de sequência em volta da mutação e falta de mutações reportadas anteriormente em outros cânceres nos locais observados. Uma vez que a evolução clonal é uma característica fundamental do câncer, foi postulado que o direcionamento imunológico de atuadores de câncer teria a vantagem de uma deriva antigênica mínima, dada a sua essencialidade na função tumoral que exigiria que fossem mantidos face a pressão seletiva. Apesar de uma tal vantagem ser possível, não é aparentemente um requisito. Adicionalmente, as mutações de atuador podem não gerar necessariamente peptídeos imunogênicos. Por exemplo, a mutação TP53-S83R no Paciente 2 não gerou um epítopo previsto de < 500 nM contra qualquer um dos seus alelos HLA-A ou -B de classe I.

[00463] Por fim, a análise das características de ligação dos dados de neoantigênios da literatura (Tabela 4), bem como dos neoepítopos candidatos dos dados em CLL revelou percepções conceptuais quanto aos tipos de mutação pontual mais prováveis de criar eficazmente uma resposta de célula T. Foi descoberto que uma característica consistente de neoepítopos imunogênicos foi uma afinidade de ligação prevista < 500 nM (3 de 3 de peptídeos CLL imunogênicos e 30 de 33 [91%] dos neoepítopos funcionais históricos) e a maioria destes (92%) apresentou afinidades previstas < 150 nM. Contudo, inesperadamente, na maior parte dos casos (3 de 3 peptídeos CLL imunogênicos e 27 de 33 [82%] epítopos funcionais históricos), os epítopos de tipo selvagem correspondentes foram também previstos ligarem-se com afinidade comparável forte/intermédia (< 150 nM, Grupo 1 na Tabela 4) ou fraca (150 - 500 nM, Grupo 2 na Tabela 4). Os dados corroboram a ideia de que dois tipos de mutações são comummente observados entre respostas de célula T ocorrendo naturalmente a neoantigênios: (1) mutações nas posições que conduzem a ligação substancialmente melhor ao alelo MHC (ALMS1 mutado bem como 6 de 33 (18%) dos neoepítopos históricos identificados funcionalmente [‘Grupo 3’, Tabela 4]), presumivelmente devido a interação melhorada com MHC, ou (2) mutação em posições que não interagem significativamente com MHC mas em vez disso presumivelmente alteram a ligação do receptor de célula T ((2 de 3 epítopos CLL [FNDC3B e C6orf89] e 24 de 33 (73%) neoepítopos naturalmente imunogênicos [‘Grupo 1’ e ‘Grupo 2’, Tabela 4]). A distinção entre estes dois tipos de mutações enquadra- se no conceito de que o peptídeo pode ser considerado uma "chave" que deve encaixar tanto nos "cadeados" MHC como TCR de forma a estimular citólise, permitindo que as mutações variem independentemente a ligação a MHC ou a TCR. Excetuando a contribuição de antigênios de histocompatibilidade menor para doença do enxerto vs hospedeiro, não há relatos de sequelas auto-imunitárias ligadas a neoantigênios em estes pacientes, mesmo nos pacientes onde ocorre uma reação a um peptídeo mutado e o peptídeo nativo cognato é previsto como sendo um aglutinante firme. Este resultado é consistente com a ideia de que peptídeos de ligação MHC estão normalmente envolvidos no processo de seleção negativa no qual TCRs possuindo células T reativas a estes peptídeos nativos são timicamente deletados ou tornados anérgicos, e contudo o repertório de célula T pode acomodar o desenvolvimento de uma resposta imunitária específica a um peptídeo de neoepítopo devido a uma apresentação alterada do peptídeo mutado ao receptor de célula T. É claro que cada tumor individual em um paciente pode abrigar um amplo espectro de alterações genéticas partilhadas e pessoais que podem continuar a evoluir em resposta ao ambiente, e que esta progressão pode frequentemente conduzir a resistência à terapia. Dada a singularidade e plasticidade dos tumores, uma terapia ideal pode ter de ser personalizada com base nas mutações exatas presentes em cada tumor e pode ter de ter como alvo múltiplos nodos para evitar resistência. O vasto repertório de CTLs humanos tem o potencial de criar uma tal terapia que toma como alvo múltiplos antigênios tumorais personalizados. Como discutido acima, a presente revelação mostra que é possível identificar sistematicamente antigênio alvo CTL abrigando mutações específicas de tumor através da utilização de sequenciação paralela em massa em combinação com algoritmos que prevêem eficazmente peptídeos de ligação HLA. De forma vantajosa, a presente revelação permite que neoantigênios tumorais de uma variedade de cânceres de taxas de mutação alta e baixa sejam previstos e identifica experimentalmente CTLs de vida longa que tomam como alvo neoantigênios de leucemia em pacientes com CLL. A presente revelação corrobora a existência de neoantigênios tumorais direcionados a imunidade protetora e providencia um método para selecionar neoantigênios para vacinas personalizadas contra tumor.

[00464] Como discutido em detalhe em cima, as técnicas aqui descritas foram aplicadas a um grupo único de pacientes CLL que desenvolveram remissão durável clinicamente evidente associada a respostas imunitárias anti-tumorais após HSCT alogênico. Estas respostas enxerto versus leucemia têm sido tipicamente atribuídas a respostas imunitárias alo-reativas direcionadas a células hematopoiéticas. Contudo, os resultados acima descritos indicam que a resposta GvL também está associada a CTLs que reconhecem neoantigênios de leucemia pessoais. Estes resultados são consistentes com dados indicando a existência de CTLs associados a GvL com especificidade para tumor, em vez de alo-antigênios. Foi postulado que CTLs reativos a neoantigênios são importantes na vigilância de câncer dado que o estudo de um sobrevivente de melanoma de longo prazo descobriu que neoantigênicos direcionados a CTLs são significativamente mais abundantes e sustentados do que os contra antigênios tumorais sobreexpressos não mutados (Lennerz V, Fatho M, Gentilini C, et al: The response of autologous T cells to a human melanoma is dominated by mutated neoantigens. Proc Natl Acad Sci USA 102, 16013-8 (2005). Os dados apresentados acima são consistentes com este estudo de melanoma porque se descobriu que as respostas de célula T específicas de neoantigênios em pacientes com CLL são células de memória de vida longa (na ordem de vários anos) (com base na sua cinética de estimulação rápida in vitro) e associadas a remissão contínua de doença. Em conformidade, CTLs reativos a neoantigênios desempenham potencialmente um papel ativo no controle de leucemia em pacientes de CLL transplantados.

[00465] Mais geralmente, a abundância de neoantigênios em muitos tumores foi estimada e descoberta como sendo ~1,5 peptídeos de ligação HLA com IC50<500 nM por mutação pontual e ~4 peptídeos de ligação por mutação por deslocamento de quadro de leitura. Como esperado, a taxa de peptídeos de ligação HLA previstos espelhou a taxa de mutação somática por tipo de tumor (ver, por exemplo, a FIG. 20). Foram usadas duas abordagens para estudar a relação entre afinidade de ligação prevista e neoantigênios imunogênicos que induzem CTLs. As técnicas acima descritas foram aplicadas a neoantigênios tumorais imunogênicos publicados (ou seja, nos quais CTLs reativos foram observados em pacientes) e demonstraram que a vasta maioria (91%) de neoantigênios funcionais são previstos como ligando HLA com IC50<500 nM (com ~70% de epítopos homólogos de tipo selvagem previstos como ligando a uma afinidade semelhante) (ver, por exemplo, Tabela 4). Este teste usou um conjunto de neoantigênios de padrão de ouro e confirmou que as técnicas aqui descritas classificam corretamente positivos verdadeiros. Uma previsão prospetiva de neoepítopos seguida de validação funcional mostrou que 6% (3/48) de epítopos previstos foram associados com respostas de células T específicas de neoantigênios em pacientes -- comparável à taxa de 4,8% descoberta recentemente para melanoma. A baixa proporção não implica necessariamente baixa precisão de previsão para o algoritmo. Em vez disso, o número de verdadeiros neoantigênios é grandemente subestimado porque: (i) alo-HSCT é uma terapia celular geral que provavelmente induz apenas um pequeno número de clones de memória de células T específicas de neoantigênio; e (ii) métodos de expansão celular de célula T padronizados não são suficientemente sensíveis para detectar células T ingênuas que representam uma parte muito maior do repertório mas com frequências de precursor muito inferiores. Apesar da frequência de CTLs que têm como alvo neoORFs ainda ter de ser medida, é especificamente contemplado dentro do escopo da invenção que esta classe de neoantigênios pode ser um excelente neoepítopo candidato porque é provável que seja mais específico (por falta de um homólogo de tipo selvagem) e imunogênico (em virtude de ultrapassar a tolerância tímica).

[00466] Com o desenvolvimento contínuo de reagentes de vacinação altamente potente, a presente revelação providencia técnicas que tornam possível a geração de vacinas personalizadas contra o câncer que efetivamente estimulam imunidade contra neoantigênios tumorais.

MATERIAIS E MÉTODOS

[00467] Amostras de paciente: Sangue heparinizado foi obtido de pacientes envolvidos em protocolos de investigação clínica no Dana-Farber Cancer Institute (DFCI). Todos os protocolos clínicos foram aprovados pelo Human Subjects Protection Committee da DFCI (Comité de Proteção de Participantes Humanos). Células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) de amostras de doentes foram isoladas por centrifugação de gradiente de densidade Ficoll/Hypaque, criopreservadas com 10% de DMSO e armazenadas em nitrogênio líquido de fase vapor até ao momento de análise. Para um subconjunto de pacientes, foi realizada tipagem HLA por tipagem molecular ou serológica (Tissue Typing Laboratory, Brigham and Women's Hospital, Boston, MA).

[00468] Dados de sequenciação de exoma total para CLL e outros cânceres: A lista para melanoma foi obtida de um banco de dados dbGaP (phs000452.v1.p1) e para os outros 11 cânceres, através de TCGA (disponível através de recursos Sage Bionetworks' Synapse (na worldwide web em (www)synapse.org/#!Synapse:syn1729383)). As amostras de locais HLA-A, HLA-B e HLA-C em 2488 amostras em estes 13 tipos de tumor foram sequenciadas usando uma abordagem com base na probabilidade de duas etapas e os primeiros dados são resumidos na Tabela 14. Resumidamente, foi construída uma biblioteca de sequências dedicada consistindo de todos os alelos HLA conhecidos (6597 entradas únicas), com base na base da dados IMGT. A partir deste recurso, foi gerada uma segunda biblioteca de 38-mers, e foram extraídas leituras putativas emanando do local HLA das leituras de sequências totais com base em correspondências perfeitas contra elas. As leituras extraídas foram então alinhadas com a biblioteca de sequências HLA de base IMT usando o software Novoalign (na worldwide web em (www)novocraft.com), e alelos HLA foram inferidos através de um cálculo de probabilidade de duas etapas. Na primeira etapa, foram usadas frequências com base na população como a priori para cada alelo e as probabilidades posteriores foram calculadas com base na qualidade e distribuições de tamanho de inserto de leituras alinhadas. Alelos com as maiores probabilidades para cada um dos genes HLA-A, B e C foram identificados como o primeiro conjunto de alelos. Uma estratégia de ponderação heurística das probabilidades computadas em conjunto com primeiro conjunto de vencedores foram então usados para identificar o segundo conjunto de alelos.

[00469] A Tabela 14 mostra IDs de paciente de TGGA para estimativas de carga neoantigênica em cânceres. LUSC (carcinoma das células escamosas do pulmão), LUAD (adenocarcinoma pulmonar), BLCA (bexiga), HNSC (cabeça e pescoço), COAD (cólon) e READ (reto), GBM (glioblastoma), OV (ovários), RCC (carcinoma das células renais claras), AML (leucemia mielóide aguda) e BRCA (mama),Tabela 14

[00470] Pipeline para previsão de peptídeos derivados de mutações de genes com ligação a alelos HLA pessoais: Foi prevista afinidade de ligação MHC em todos os peptídeos 9- mer e 10-mer possíveis gerados a partir de cada mutação somática e do correspondente peptídeo de tipo selvagem usando NetMHCpan (versão 2.4). Estes peptídeos em mosaico foram analisados quanto às suas afinidades de ligação (IC50 nM) para cada alelo de classe I nos pacientes de perfil HLA. Um valor IC50 inferior a 150 nM foi considerado um aglutinante previsto como forte a intermédio, um IC50 de 150-500 nM foi considerado um aglutinante previsto como fraco, enquanto IC50 > 500 nM foi considerado um não aglutinante. Foi realizada confirmação experimental de peptídeos previstos ligando a moléculas HLA (IC50 < 500 nM) usando um ensaio de ligação de alelos MHC de classe I e foi descrito em detalhe em outro local (Cai et al. 28 e Sidney et al. 2001).

[00471] Fontes de antigênio: Foram sintetizados peptídeos até >95% de pureza (confirmada por cromatografia líquida de alto desempenho) da New England Peptide (Gardner, MA); ou RS Synthesis, (Louisville, KY). Foram reconstituídos peptídeos em DMSO (10 mg/ml) e armazenados a -80 °C até utilização. Minigenes consistindo de uma sequência de 300 bp abrangendo mut ou wt FNDC3B foram clonados por PCR do tumor do Pt 2 no vetor de expressão pcDNA3.1 usando os seguintes iniciadores: iniciador 5’: GACGTCGGATCCCACCATGGGTCCCGGAATTAAGAAAACAGAG; iniciador 3’: CCCGGGGCGGCCGCCTAATGGTGATGGTGATGGTGACATTCTAA TTCTTCTCCACTGTAAA. Minigenes foram expressos em células alvo apresentando antigênio introduzindo 20 μg do plasmídeo em 2 milhões de células K562 (ATCC) transfectadas estavelmente com HLA-A2 por nucleofecção Amaxa (Solution V, Program T16, Lonza Inc; Walkersville, MD). Foram incubadas células em meio RPMI (Cellgro; Manassas, VA), suplementadas com 10% de soro fetal de bovino (Cellgro), 1% de tampão HEPES (Cellgro), e 1% de L-glutamina (Cellgro). As células foram colhidas 2 dias a seguir a nucleofecção para ensaios imunitários.

[00472] Análise de expressão de gene casos CLL: foram reanalisados dados de microarranjo anteriormente relatados (Gene Expression Omnibus da NCI número de acesso GSE37168). Ficheiros CEL da Affimetriz fora processados usando o pacote affy em R. Foi usado o algoritmo Robust Multichip Analysis (RMA) como correção de fundo que modela as intensidades observadas como uma mistura de sinal exponencialmente distribuído e ruído normalmente distribuído. A isto seguiu- se normalização quantil nos arranjos para facilitar a comparação de expressão de gene sob diferentes condições. O nível de sonda individual foi finalmente resumido usando a abordagem median polish para obter valores de nível de conjunto de sondas robustos. Valores de nível de genes foram obtidos selecionando a sonda com a expressão média máxima para cada gene. Efeitos de lote nos dados foram removidos usando o programa Combat.

[00473] Geração e detecção de células T específicas de antigênio de PBMCs de paciente: Células dendríticas autólogas (DCs) foram geradas a partir de células CD14+ imunomagneticamente isoladas (Miltenyi, Auburn CA) que foram cultivadas em RPMI (Cellgro) suplementadas com 3% de soro fetal de bovino, 1% de penicilina-estreptomicina (Cellgro), 1% de L-glutamina e 1% de tampão HEPES na presença de 120 ng/ml de GM-CSF e 70 ng/ml de IL-4 (R&D Systems, Minneapolis, MN). Nos dias três e cinco, foram adicionados GM-CSF e IL-4 adicionais. No dia seis, as células foram expostas a 30μg/ml Poli I:C (Sigma Aldrich, St Louis, MO) para serem submetidas a maturação (por 48 horas), para além de adicionar IL-4 e GM-CSF. Células B CD19+ foram isoladas de PBMCs de paciente por seleção imunomagnética (microsferas CD19+; Miltenyi, Auburn, CA), e semeadas a 1x106 células/poço em uma placa de 24 poços. Células B foram cultivadas em meio de célula B (meio Dulbecco modificado por Iscoves) (IMDM; Life Technologies, Woburn, MA), suplementadas com 10% de soro humano AB (GemCell, Sacramento, CA), 5μg/mL de insulina (Sigma Chemical, St Louis, MO), 15 μg/mL de gentamicina, IL- 4 (2ng/ml, R&D Systems, Minneapolis, MN) e CD40L-Tri (1μg/ml). CD40L-Tri foi reabastecido a cada 3-4 dias. Para algumas experiências, foram usadas como APCs células B CD19+ ativadas e expandidas por CD40L-Tri.

[00474] Geração de células T específicas de antigênio de PBMCs de paciente: Para gerar células T reativas a peptídeos de pacientes CLL, células T CD8+ imunomagneticamente selecionadas (5x106/poço) de PBMCs pré- e pós-transplante (microsferas CD8+, Miltenyi, Auburn, CA) foram cultivadas com DCs pulsados com conjuntos de peptídeos autólogos (a um rácio de 40:1) ou células B irradiadas ativadas com CD40L-Tri (a um rácio de 4:1) respectivamente, em meio completo suplementado com 10% de FBS e 5-10 ng/mL de IL-7, IL-12 e IL-15. APCs foram pulsados por 3 horas com conjuntos de peptídeos (10 μM/ peptídeo/conjunto). Células T CD8+ foram novamente estimuladas semanalmente (por 1-3 semanas, começando no dia 7) com APCs.

[00475] Detecção de células T específicas de antigênio: A especificidade de célula T contra conjuntos de peptídeos foi testada por ensaio IFN-g ELISPOT, 10 dias após a segunda e quarta estimulações Foi detectada liberação de IFN-g usando células de teste e controle ativadas com CD40L pulsadas com peptídeos B (50,000 células/poço) co-incubadas com 50.000 células T CD8+/poço (Millipore, Billerica, MA) durante 24 horas em placa ELISPOT. Foi detectado IFN-Y usando anticorpos de captura e detecção, como indicado (Mabtech AB, Mariemont, OH), e fotografado (ImmunoSpot Series Analyzer; Cellular Technology, Cleveland, OH). Para testar a dependência de reatividade de células T na classe MHC I, placas ELISPOT foram primeiro revestidas com APCs co- incubadas com anticorpos de bloqueio de classe I (W6/32) por 2 horas a 37 oC, antes da introdução de células T nos poços. Foi usado tetrâmero de classe MHC I para testar a especificidade de células T onde indicado (Emory University, Atlanta GA). Para coloração do tetrâmero, foram incubadas células 5x105 por 60 minutos a 4 oC com 1μg/mL de tetrâmero marcado com PE e depois incubadas com a adição de anticorpos anti-CD3-FITC e anti-CD8-APC (BD Biosciences, San Diego CA) por mais 30 minutos a 4 oC. Foram adquiridos um mínimo de 100.000 eventos por amostra. A secreção de GM-CSF e IL-2 de células T CD8+ cultivadas foi detectada por análise de sobrenadante de cultura usando uma tecnologia Luminex multiplex de base esferas, de acordo com as recomendações do fabricante (EMD Millipore, Billerica, MA). Resumindo, microsferas marcadas com fluorescente foram revestidas com anticorpos específicos de captura de citocina. Após incubação com a amostra de sobrenadante de cultura, foram detectadas citocinas capturadas por um anticorpo de detecção biotinilado seguido de um conjugado de estreptavidina-PE e intensidade de fluorescência média (Luminex 200 Bead Array instrument; Luminex Corporation, Austin TX). Com base em uma curva padrão, os níveis de citocina foram calculados no programa Bead View Software (Upstate, EMD Millipore, Billerica, MA). Para detecção e quantificação de clonótipos TCR Vb, células T específicas de mut-FNDC3B foram enriquecidas de linhas celulares T do Pt 2 usando o ensaio de secreção de IFN-Y (Miltenyi, Auburn, CA) de acordo com as instruções do fabricante e como previamente descrito.

[00476] Considerações estatísticas: Modelos ANOVA de duas vias foram construídos para reatividade de células T contra peptídeo mut vs wt na forma de liberação de IFN-gama, GM-CSF, e IL-2 e incluíram estado de concentração e estado mutacional como efeitos fixos juntamente com um termo de interação como apropriado. Valores P para estes modelos foram ajustados para comparações múltiplas post-hoc usando o método de Tukey. Para comparações normalizadas de IFN- gama, foi realizado um teste t para testar a hipótese de que o rácio normalizado é igual a um. Para outras comparações de medições contínuas entre grupos, foi usado um teste t de Welch. Todos os valores P reportados são bilaterais e considerados significativos no nível 0,05 com ajuste apropriado para comparações múltiplas. Foi realizada análise em SAS v9.2.

[00477] Detecção e quantificação de clonótipos TCR Vβ Para detectar TCR Vβ específico de mut-FNDC3B, foi realizado um PCR agrupado de duas etapas de populações de células T enriquecidas com IFN-Y específicas de peptídeos. Em suma, a família Vβ dominante foi identificada entre as 24 subfamílias Vβ conhecidas. Primeiro, foram gerados 5 conjuntos de iniciadores diretos de Vβ (conjunto 1: Vβ 1-5,1; conjunto 2: Vβ 5,2-9; conjunto 3: Vβ 10-13,2; conjunto 4: Vβ 14-19; e conjunto 5: Vβ 20, 22-25). RNA extraído dos clones de célula T (QIAamp RNA Blood Mini-kit; Qiagen, Valencia, CA), foi reversamente transcrito para cDNA (Superscript, GIBCO BRL, Gaithersburg, MD) usando hexâmeros aleatórios e amplificado por PCR em cinco reações separadas de volume de 20 μl. Segundo, cDNA derivado de clone de célula T foi re- amplificado, com cada um dos 5 iniciadores individuais contidos dentro de um conjunto positivo juntamente com um iniciador Cβ reverso (interno) conjugado com FAM. Subsequentemente, 4 μl deste produto PCR foram amplificados com 1 μl do iniciador específico de região CDR3 do clone e sonda e 10 μl de Taqman Fast Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA) em um volume total de 20 μl. As condições de amplificação de PCR foram: 95°C por 20 minutos x 1 ciclo, e 40 ciclos de 95°C por 3 segundos seguido de 60°C por 30 segundos (ciclador PCR 7500 Fast Realtime; Applied Biosystems, Foster City, CA). Os transcritos de teste foram quantificados relativamente a transcritos de RNA ribossômicos S18 calculando 2A(S18 rRNA CT-alvo CT) como anteriormente descrito.

[00478] Detecção de carga tumoral molecular: A sequência lgH clonotípica de Pt 2 foi identificada usando um painel de iniciadores de PCR específicos de VH, como anteriormente descrito. Com base em esta sequência, foi concebido um ensaio de PCR Taqman quantitativo de forma a ser localizada uma sonda específica de sequência na região de diversidade juncional (Applied Biosystems; Foster City, CA). Este ensaio Taqman foi aplicado a cDNA de tumor. Todas as reações PCR consistiram de: 50°C por 1 minuto x1 ciclo, 95°C por 10 minutos x1 ciclo, e 40 ciclos de 95°C por 15 segundos seguido de 60°C por 1 minuto. Todas as reações foram realizadas usando um ciclador de PCR 7500 Fast Real-time (Applied Biosystems, Foster City, CA). Os transcritos de teste foram quantificados relativamente a GAPDH. REFERÊNCIAS Zhang GL, Ansari HR, Bradley P, et al. Machine learning competition in immunology - Prediction of HLA class I binding peptides. J Immunol Methods. 30 de novembro 2011;374(1-2):1- 4. 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Outras Formas de Realização

[00479] Da descrição anterior, será aparente que variações e modificações podem ser feitas à invenção aqui descrita para a adotar para várias utilizações e problemas de saúde. Tais formas de realização encontram-se também dentro do escopo das reivindicações que se seguem.

[00480] A recitação de uma listagem de elementos em qualquer definição de uma variável aqui inclui definições dessa variável como qualquer elemento ou combinação (ou sub- combinação) de elementos listados. A recitação de uma forma de realização aqui inclui essa forma de realização como qualquer forma de realização única ou em combinação com quaisquer outras formas de realização ou suas porções.

Incorporação por Referência

[00481] Todas as patentes e publicações mencionadas em esta especificação são aqui incorporadas por referência na mesma extensão como se cada patente e publicação independente fosse específica e individualmente indicada como estando incorporada por referência.

Claims (14)

1. Método para a produção de uma vacina personalizada contra a neoplasia para um indivíduo diagnosticado como tendo uma neoplasia, caracterizado pelo fato de que compreende: identificar uma pluralidade de mutações na neoplasia; analisar a pluralidade de mutações para identificar um subconjunto de pelo menos cinco mutações neo-antigênicas previstas para codificar peptídeos neo-antigênicos, as mutações neo-antigênicas selecionadas a partir do grupo consistindo de mutações de sentido trocado, mutações neoORF, ou qualquer combinação das mesmas; a referida análise compreendendo identificar mutações neo-antigênicas a partir da pluralidade de mutações identificadas na neoplasia e classificar as mutações neo-antigênicas previstas para codificar peptídeos neo-antigênicos em uma ordem decrescente de prioridade, a ordem compreendendo: i. mutações neoORF previstas para codificar um polipeptídeo neoORF que se liga ao HLA do individuo com um Kd de < 500 nM; ii. mutações de sentido trocado previstas para codificar um polipeptídeo que se liga ao HLA do individuo com um Kd de < 150 nM, em que a proteína cognata nativa tem um Kd de > 1000 nM; iii. mutações de sentido trocado previstas para codificar um polipeptídeo que se liga ao HLA do individuo com um Kd de < 150 nM, em que a proteína cognata nativa tem um Kd de < 150 nM; iv. mutações neoORF previstas para codificar um polipeptídeo que se liga ao HLA do individuo com um Kd de > 500 nM; v. mutações de sentido trocado previstas para codificar um polipeptídeo que se liga ao HLA do individuo com um Kd de 150 nM a < 500 nM, em que a proteína cognata nativa tem um Kd de 150 a < 500 nM; e produzir, com base no subconjunto selecionado, uma vacina personalizada contra neoplasia.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que identificar uma pluralidade de mutações na neoplasia compreende sequenciamento do genoma ou transcriptoma da neoplasia.

3. Método, de acordo com qualquer umas das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a vacina personalizada contra neoplasia compreende pelo menos 10 peptídeos neo- antigênicos correspondendo às mutações neo-antigênicas, ou a vacina personalizada contra neoplasia compreende uma ou mais moléculas de DNA capazes de expressar pelo menos 10 peptídeos neo-antigênicos correspondendo às mutações neo-antigênicas, ou a vacina personalizada contra neoplasia compreende uma ou mais moléculas de RNA capazes de expressar pelo menos 10 peptídeos neo-antigênicos correspondendo às mutações neo-antigênicas.

4. Método, de acordo com qualquer umas das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que:a vacina personalizada contra neoplasia compreende pelo menos 20 peptídeos neo-antigênicos correspondendo às mutações neo-antigênicas, ou a vacina personalizada contra neoplasia compreende uma ou mais moléculas de DNA capazes de expressar pelo menos 20 peptídeos neo-antigênicos correspondendo às mutações neo-antigênicas, ou a vacina personalizada contra neoplasia compreende uma ou mais moléculas de RNA capazes de expressar pelo menos 20 peptídeos neo-antigênicos correspondendo às mutações neo-antigênicas.

5. Método, de acordo com qualquer umas das reivindicações 3 ou 4, caracterizado pelo fato de que a vacina personalizada contra neoplasia compreende pelo menos 20 peptídeos neo- antigênicos correspondendo às mutações neo-antigênicas, e em que: os pelo menos 20 peptídeos neo-antigênicos variam de 5 a 50 aminoácidos de comprimento, ou os pelo menos 20 peptídeos neo-antigênicos variam de 15 a 35 aminoácidos de comprimento, ou os pelo menos 20 peptídeos neo-antigênicos variam de 18 a 30 aminoácidos de comprimento, ou os pelo menos 20 peptídeos neo-antigênicos variam de 6 a 15 aminoácidos de comprimento, ou os pelo menos 20 peptídeos neo-antigênicos são de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ou 25 aminoácidos de comprimento.

6. Método, de acordo com qualquer umas das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a vacina personalizada contra neoplasia compreende um adjuvante.

7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o adjuvante é selecionado do grupo que consiste em poli-ICLC, 1018 ISS, sais de alumínio, Amplivax, AS15, BCG, CP-870, 893, CpG7909, CyaA, dSLIM, GM-CSF, IC30, IC31, Imiquimod, ImuFact IMP321, IS Patch, ISS, ISCOMATRIX, Juvlmmune, LipoVac, MF59, monofosforil lipídio A, Montanide IMS 1312, Montanide ISA 206, Montanide ISA 50V, Montanide ISA- 51, OK-432, OM-174, OM-197-MP-EC, ONTAK, PepTel.RTM, sistema vetor, micropartículas PLGA, resiquimod, SRL172, Virossomas e outras partículas semelhantes a vírus, YF-17D, armadilha de VEGF, R848, beta-glucano, Pam3Cys, QS21 stimulon de Alquila, vadimezan, e AsA404 (DMXAA).

8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato que o adjuvante é poli-ICLC.

9. Uso da vacina personalizada contra neoplasia preparada pelo método conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, o referido uso caracterizado pelo fato de que é para a fabricação de uma vacina personalizada para tratar neoplasia.

10. Uso, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a fabricação compreende: dividir a vacina produzida em dois ou mais subconjuntos;e opcionalmente: em que cada um dos subconjuntos compreende peptídeos neo- antigênicos de modo que um número de peptídeos individuais no subconjunto que alveja um único HLA de paciente seja um, ou o menor número possível acima de um.

11. Uso, de acordo com qualquer um das reivindicações 9 ou 10, caracterizado pelo fato de que a vacina personalizada contra neoplasia compreende pelo menos 20 peptídeos neo- antigênicos correspondendo às mutações neo-antigênicas, em que os pelo menos 20 peptídeos neo-antigênicos variam de 18 a 30 aminoácidos de comprimento, em que a fabricação compreende dividir a vacina produzida em dois ou mais subconjuntos, em que cada subconjunto compreende pelo menos cinco peptídeos neo- antigênicos selecionados para otimizar interações intra- conjuntos; e opcionalmente: em que a otimização compreende a redução de interações negativas entre peptídeos neo-antigênicos no mesmo conjunto.

12. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 11, caracterizado pelo fato de que a fabricação compreende fornecer uma vacina de célula dendrítica (DC), em que a DC é carregada com uma ou mais das pelo menos 5 mutações neo- antigênicas previstas para codificar peptídeos neo-antigênicos expressos.

13. Vacina personalizada contra neoplasia caracterizada pelo fato de é preparada por método conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8.

14. Vacina personalizada contra neoplasia, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que é para uso conforme definido em qualquer uma das reivindicações 9 a 12.