CN106456724A - 使用新抗原疫苗的联合疗法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于治疗或预防受试者中的瘤形成的、与其他药剂比如检查点阻断抑制剂组合给予的瘤形成疫苗或免疫原性组合物。

Description

使用新抗原疫苗的联合疗法
相关申请和引用参考
本申请要求2013年12月20日提交的美国临时专利申请61/919,576和2014年4月7日提交的美国临时专利申请61/976,274的权益和优先权。
前述申请、以及在其中或在它们的审查程序期间引用的所有文献或(“申请引用文献”)以及在这些申请引用文献中引用或参考的所有文献、以及在此引用或参考的所有文献(“在此引用的文献”)、在此引用的文献中引用或参考的所有文献，连同针对在此提及或通过引用结合在此的任何文献中的任何产品的任何制造商的说明书、说明、产品规格、和产品表，特此通过引用结合在此，并且可以在本发明的实践中采用。更具体地说，所有参考的文献均通过引用结合在此，其程度如同每个单独的文献被确切地并单独地指明通过引用而结合在此。
发明领域
本发明涉及用于治疗瘤形成、且更具体地说肿瘤的方法，这些方法通过向受试者给予包含多种瘤形成/肿瘤特异性新抗原和至少一种检查点抑制剂的肿瘤疫苗进行。
联邦基金代号
本发明是在政府支持下，在NIH/NCI授予的R01CA155010-03下进行的。政府享有本发明的某些权利。
发明背景
每年大约160万美国人被诊断为瘤形成，并且在2013年在美国预期大约580,000人死于该疾病。在过去的几十年里，在检测、诊断和治疗瘤形成方面已经有了显著改善，这已经显著提高了许多类型的瘤形成的存活率。然而，仅有约60％被诊断为瘤形成的人在治疗开始之后5年仍活着，这使得瘤形成在美国成为第二大致死原因。
当前，存在许多不同的现有癌症疗法，包括切除技术(例如，外科手术、低温/热处理、超声、射频、以及放射)以及化学技术(例如，药剂、细胞毒性剂/化学治疗剂、单克隆抗体、以及其不同组合)。不幸的是，此类疗法频繁地与严重的风险、毒副作用和极高的成本、以及不确定的功效相关。
对寻求用患者自己的免疫系统靶向癌性细胞的癌症疗法(例如，癌症疫苗)有越来越大的兴趣，因为此类疗法可以减轻/消除一些在此所述的缺点。癌症疫苗典型地由肿瘤抗原和免疫刺激分子(例如，细胞因子或TLR配体)构成，它们一起工作以诱导靶向并破坏肿瘤细胞的抗原特异性细胞毒性T细胞。当前的癌症疫苗典型地包含共有的肿瘤抗原，它们是在许多个体中发现的肿瘤中被选择性表达或过表达的天然蛋白质(即–由个体体内的所有正常细胞的DNA编码的蛋白质)。虽然此类共有的肿瘤抗原在鉴别特定类型的肿瘤中是有用的，但是它们作为用于靶向针对特定肿瘤类型的T细胞应答的免疫原是不理想的，因为它们易受自身耐受的免疫抑制作用的影响。含有肿瘤特异性和患者特异性新抗原的疫苗能够克服含有共有肿瘤抗原的疫苗的一些缺点。
在本申请中描述用于实现所希望的治疗结果且具体地说用于治疗癌症的联合疗法。
在本申请中引用或标识任何文献并非承认该文献可以作为本发明的现有技术获得。
发明概述
本发明涉及用于治疗或预防受试者中的瘤形成的与一种或多种其他药剂如一种或多种检查点阻断抑制剂组合给予的瘤形成疫苗或免疫原性组合物。
在一方面，本发明的特征是一种治疗或预防有需要的受试者中的瘤形成的方法，该方法可以包括向有需要的受试者给予(a)瘤形成疫苗或免疫原性组合物；以及(b)至少一种检查点抑制剂。该给予可以是连续地或顺序地或在基本上同一时间或基本上同时进行。例如，给予瘤形成疫苗或免疫原性组合物和给予至少一种检查点抑制剂可以在约同一时间或基本上同时进行。可替代地，给予瘤形成疫苗或免疫原性组合物可以按一个时间表，例如每周一次、每两周一次、每三周一次、每月一次、每两月一次、每四分之一年一次(每三个月一次)、每三分之一年一次(每四个月一次)、每五个月一次、每年两次(每六个月一次)、每七个月一次、每八个月一次、每九个月一次、每十个月一次、每十一个月一次、每年一次等，并且给予至少一种检查点阻断抑制剂可以按不同的时间表，对于该检查点阻断抑制剂来说典型的是使得受试者或患者具有同时运行的两个不同的治疗时间表，并且给予瘤形成疫苗或免疫原性组合物和给予至少一种检查点抑制剂可以是顺序地或连续地。该瘤形成疫苗或免疫原性组合物有利地包含至少四种不同的新抗原(并且不同的抗原旨在每种抗原具有不同的新表位)，例如，至少4、或5、或6、或7、或8、或9、或10、或11、或12、或13、或14、或15、或16、或17、或18、或19、或20、或21、或22、或23、或24、或25、或26、或27、或28、或29、或30、或31、或32、或33、或34、或35、或36、或37、或38、或39、或40、或更多种不同的新抗原可以在该瘤形成疫苗或免疫原性组合物中。该瘤形成疫苗或免疫原性组合物可以经由子组合物给予，这些子组合物各自含有一部分这些新抗原，并且子组合物可以给予至受试者或患者上的不同位置；例如，包含20种不同新抗原的组合物可以按四种(4)子组合物给予，这四种子组合物各自含有这20种不同新抗原中的5种，并且可以给予这四种(4)子组合物以便努力将每种子组合物递送在患者的引流淋巴结处或附近，例如至手臂和腿中的每个(例如，患者的每一侧上的大腿或大腿上部或臀部附近或下背部)以便努力将每种子组合物递送在患者或受试者的引流淋巴结处或附近。当然，位置的数目且因此子组合物的数目可以变化，例如，熟练的从业人员能够考虑给予在脾处或附近以便具有第五个给药点，并且熟练的从业人员能够改变这些位置以使得仅使用一个、两个或三个(例如，每只手臂和一条腿、每条腿和一只手臂、每条腿且无手臂或仅两只手臂)。以前述各种时间间隔给予的疫苗或免疫原性组合物可以是不同的配制品，并且在单次给药期间在受试者或患者上的不同位置处给予的这些子组合物可以是不同的组合物。例如，第一给药可以是全抗原疫苗或免疫原性组合物，并且下一次或稍后给药可以是在体内具有一种或多种抗原的表达的载体(例如，病毒载体或质粒)。同样，在将不同子组合物给予至患者或受试者上的不同位置中，这些子组合物中的一些可以包含全抗原并且这些子组合物中的一些可以包含在体内具有一种或多种抗原的表达的载体(例如，病毒载体或质粒)。并且一些组合物和子组合物可以包含在体内具有一种或多种抗原的表达的一种或多种载体(例如，病毒载体或质粒)和全抗原两者。在体内具有一种或多种抗原的表达的一些载体(例如，痘病毒)可以具有免疫刺激或辅助作用，并且因此包含这类载体的组合物或子组合物可以是自身辅助的。此外，通过改变这些抗原被呈递至免疫系统的方式的性质，这些给药可以“初免”并且然后“加强”免疫系统。此外在本文中，当提及“疫苗”时，旨在本发明包括免疫原性组合物，当前当提及患者或受试者时，旨在这种个体是需要在此披露的治疗、给药、组合物、以及通常本发明的患者或受试者。
在一个实施例中，该瘤形成疫苗或免疫原性组合物包含至少两种、至少三种、至少四种或至少五种新抗原肽。在另一个实施例中，该新抗原肽的长度范围是从约5至约50个氨基酸。在另一个相关实施例中，该新抗原肽的长度范围是从约15至约35个氨基酸。典型地，该长度是大于约15或20个氨基酸，例如从15至50或约75个氨基酸。
在一个实施例中，该瘤形成疫苗或免疫原性组合物进一步包含pH调节剂和药学上可接受的载体。
在一个实施例中，该方法进一步包括给予免疫调节剂或佐剂(且因此该疫苗或免疫原性组合物可以包含免疫调节剂或佐剂)。在另一个相关实施例中，该免疫调节剂或佐剂选自下组，该组由以下各项组成：聚-ICLC、1018ISS、铝盐、Amplivax、AS15、BCG、CP-870,893、CpG7909、CyaA、dSLIM、GM-CSF、IC30、IC31、咪喹莫特、ImuFact IMP321、IS Patch、ISS、ISCOMATRIX、JuvImmune、LipoVac、MF59、单磷酰脂质A、蒙塔尼德(Montanide)IMS 1312、蒙塔尼德ISA 206、蒙塔尼德ISA 50V、蒙塔尼德ISA-51、OK-432、OM-174、OM-197-MP-EC、ONTAK、PEPTEL、载体系统、PLGA微颗粒、瑞喹莫德、SRL172、病毒微体和其他病毒样颗粒、YF-17D、VEGF陷阱、R848、β-葡聚糖、Pam3Cys、以及阿奎拉QS21刺激子。在另一个其他实施例中，该免疫调节剂或佐剂是聚-ICLC。
这些聚合物溶解于水中产生中和(优选地至生理pH)的酸溶液，以便得到该疫苗或免疫原性组合物或一种或多种抗原或其一种或多种载体并入其中的佐剂溶液。该聚合物的羧基基团然后部分地在COO—中。
优选地，根据本发明的佐剂、尤其是卡波姆的溶液在蒸馏水中制备，优选地在氯化钠存在下制备，所获得的溶液在酸性pH下。通过将该储备溶液一次性或以若干部分添加至所需量(用于获得所希望的最终浓度)或其一大部分的加入盐(如NaCl，优选生理盐水(NaCl9g/l))的水中、优选地用碱如NaOH伴随或随后中和(pH 7.3至7.4)来稀释该储备溶液。在生理pH下的该溶液按原样用于重构疫苗，尤其以冷冻干燥或冻干形式储存。
最终疫苗组合物中的聚合物浓度是0.01％至2％w/v，更具体地0.06％至1％w/v，优选地0.1％至0.6％w/v。
此外，本发明适用于使用任何类型的表达载体，如病毒表达载体，例如痘病毒(例如，正痘病毒或禽痘病毒如牛痘病毒，包括改良的安卡拉痘苗或MVA、MVA-BN、根据WO-A-92/15672的NYVAC、禽痘(例如TROVAX)、金丝雀痘(例如ALVAC)(WO-A-95/27780和WO-A-92/15672)、鸽痘、猪痘等)、腺病毒、AAV疱疹病毒、以及慢病毒；或质粒或DNA或核酸分子载体。为细胞质的一些载体如痘病毒载体可以是有利的。然而，腺病毒、AAV和慢病毒也可以有利地用于本发明的实践中。
在备用、尤其重构的疫苗或免疫原性组合物中，载体(例如病毒载体)以本披露技术人员范围和本领域中的知识(如在此引用的专利和科技文献)内的量存在。
全抗原或载体，例如重组活疫苗通常以允许其储存的冷冻干燥形式存在并且在使用之前立即在溶剂或赋形剂中重构，该溶剂或赋形剂可以包括如在此讨论的佐剂。
本发明的主题因此还是一种疫苗接种或免疫套组或试剂盒，该套组或试剂盒包括单独包装的冷冻干燥疫苗和溶液，有利地包括如在此针对冷冻干燥疫苗的重构所讨论的佐剂组合物。
本发明的主题还是一种疫苗接种或免疫方法，该疫苗接种或免疫方法包括以一次或多次给药的速率例如通过胃肠外，优选皮下、肌肉内或皮内途径或通过粘膜途径给予根据本发明的疫苗或免疫原性组合物或基本上由其组成或由其组成。任选地，该方法包括在溶液(有利地还包含佐剂)中重构冷冻干燥的疫苗或免疫原性组合物(例如，如果是冻干的全抗原或载体)的初步步骤。
在一个实施例中，该检查点抑制剂是程序性死亡-1(PD-1)途径的抑制剂。在另一个实施例中，PD-1途径的抑制剂是抗PD1抗体。在一个相关实施例中，PD-1途径的抑制剂是尼沃鲁单抗。
在一个实施例中，该检查点抑制剂是抗细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA4)抗体。在一个相关实施例中，该抗CTLA4抗体是伊匹单抗或曲美木单抗。
在一个实施例中，受试者患有选自下组的瘤形成，该组由以下各项组成：非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、透明细胞肾细胞癌(ccRCC)、黑色素瘤、肉瘤、白血病或膀胱癌、结肠癌、脑癌、乳腺癌、头颈癌、子宫内膜癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌或前列腺癌。在另一个实施例中，瘤形成是转移性的。在另一实施例中，受试者患有不可检测的瘤形成，但处于疾病复发的高风险下。在另一相关实施例中，受试者先前经历自体造血干细胞移植(AHSCT)。
在一个实施例中，给予检查点抑制剂在开始给予瘤形成疫苗或免疫原性组合物之前开始。在一个实施例中，给予检查点抑制剂在开始给予瘤形成疫苗或免疫原性组合物之后开始。在一个实施例中，给予检查点抑制剂与开始给予瘤形成疫苗或免疫原性组合物同时开始。
在另一个实施例中，给予检查点抑制剂在第一次给予检查点抑制剂之后每2-8周或更多周继续。在另一实施例中，给予检查点抑制剂在第一次给予检查点抑制剂之后每2、3或4、6或8周继续。在另一个其他实施例中，给予检查点抑制剂在给予瘤形成疫苗或免疫原性组合物之前一周期间停止。在仍然另一个其他实施例中，给予检查点抑制剂在给予瘤形成疫苗或免疫原性组合物期间停止。
在一个实施例中，给予检查点抑制剂在肿瘤切除之后开始。在另一个实施例中，给予瘤形成疫苗或免疫原性组合物在肿瘤切除之后1-15周开始。在另一个其他实施例中，给予瘤形成疫苗或免疫原性组合物在肿瘤切除之后4-12周开始。
在一个实施例中，给予瘤形成疫苗或免疫原性组合物是在初免/加强给药方案中。在另一个实施例中，在第1周、第2周、第3周或第4周给予瘤形成疫苗或免疫原性组合物作为初免。在另一个其他实施例中，在第2个月、第3个月、第4个月或第5个月给予瘤形成疫苗或免疫原性组合物作为增强。
在一个实施例中，以关于每种新抗原肽约10μg-1mg/70kg个体的剂量给予该疫苗或免疫原性组合物。在另一个实施例中，以关于每种新抗原肽约10μg-2000μg/70kg个体的平均每周剂量水平给予该疫苗或免疫原性组合物。在另一个其他实施例中，以约0.1-10mg/kg的剂量给予该检查点抑制剂。在另一个相关实施例中，该给予是静脉内的。
在一个实施例中，以约1mg/kg-3mg/kg的剂量给予该抗CTLA4抗体。
在一个实施例中，静脉内或皮下给予该疫苗或免疫原性组合物。
在另一个实施例中，静脉内或皮下给予该检查点抑制剂。
在另一个实施例中，在该瘤形成疫苗或免疫原性组合物的给药部位的约2cm内皮下给予该检查点抑制剂。
在一个实施例中，以每70kg个体该瘤形成疫苗或免疫原性组合物的每给药部位约0.1-1mg的剂量给予该检查点抑制剂。
在一个实施例中，该方法进一步包括给予一种或多种另外的药剂。在另一个实施例中，这些另外的药剂选自下组，该组由以下各项组成：化学治疗剂、抗血管生成剂、以及降低免疫抑制的药剂。在另一实施例中，该一种或多种另外的药剂是一种或多种抗糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子家族受体(GITR)激动型抗体。
在一个实施例中，该方法可以包括在针对特定癌症的标准护理内给予该联合疗法。在另一个实施例中，在标准护理内给予该联合疗法，其中该联合疗法的添加与标准护理中的步骤是协同的。
本发明包括进行如通过引用结合在此的美国专利申请号20110293637中的方法，例如，一种鉴别多个至少4种受试者特异性肽并且制备受试者特异性免疫原性组合物的方法，该免疫原性组合物在给予时将该多个至少4种受试者特异性肽呈递至受试者的免疫系统，其中该受试者具有肿瘤且该受试者特异性肽对该受试者和该受试者的肿瘤是特异性的，所述方法包括：
(i)包括通过
该受试者的肿瘤样品的核酸测序和
该受试者的非肿瘤样品的核酸测序，
鉴别未存在于该非肿瘤样品中的多个至少4种肿瘤特异性非沉默突变；并且
(ii)从这些鉴别的非沉默突变选择该多个至少4种患者特异性肽，这些患者特异性肽各自具有来自所鉴别的多个肿瘤特异性突变的不同的肿瘤新表位，该新表位是对该受试者的肿瘤特异性的表位，
其中每个新表位是不存在于该非肿瘤样品中的肿瘤特异性非沉默突变的表达产物，每个新表位结合该受试者的HLA蛋白，并且选择包括
测定这些受试者特异性肽与该HLA蛋白的结合，
并且
(iii)配制该受试者特异性免疫原性组合物以用于给予至该受试者，这样使得在给予时该多个至少4种受试者特异性肽被呈递至该受试者的免疫系统，
其中该选择或配制包括以下中的至少一个：
在该受试者特异性免疫原性组合物中包含患者特异性肽，该患者特异性肽包含所鉴别的新ORF的表达产物，其中新ORF是未存在于非肿瘤样品中的产生新的开放阅读框的肿瘤特异性非沉默突变，以及
在该受试者特异性免疫原性组合物中包含受试者特异性肽，该受试者特异性肽包含所鉴别的点突变的表达产物并且具有与该受试者的HLA蛋白的测定的结合，其中IC50小于500nM，
由此，鉴别了该多个至少4种受试者特异性肽，并且制备了在给予时将该多个至少4种受试者特异性肽呈递至该受试者的免疫系统的受试者特异性免疫原性组合物，其中该受试者特异性肽对该受试者和该受试者的肿瘤是特异性的；或一种鉴别新抗原的方法，该方法包括：
a.鉴别患有癌症的受试者的表达的基因中的肿瘤特异性突变；
b.其中当在步骤(a)中鉴别的所述突变是点突变时：
i.鉴别具有在步骤(a)中鉴别的突变的突变型肽，其中所述突变型肽以比野生型肽更大的亲和力结合I类HLA蛋白；并且具有小于500nm的IC50；
c.其中当在步骤(a)中鉴别的所述突变是剪接位点、移码、连读或基因融合突变时：
i.鉴别由在步骤(a)中鉴别的突变编码的突变型多肽，其中所述突变型多肽结合I类HLA蛋白；或一种诱导受试者中的肿瘤特异性免疫应答的方法，该方法包括给予所鉴别的一种或多种肽或多肽以及佐剂；或一种针对癌症疫苗接种或治疗受试者的方法，该方法包括：
a.鉴别该受试者的表达的基因中的多个肿瘤特异性突变，其中当鉴别的所述突变是：
i.点突变时，进一步鉴别具有该点突变的突变型肽；和/或
ii.剪接位点、移码、连读或基因融合突变时，进一步鉴别由该突变编码的突变型多肽；
b.选择在步骤(a)中鉴别的结合I类HLA蛋白的一种或多种突变型肽或多肽；
c.选择在步骤(b)中鉴别的能够活化抗肿瘤CD8T细胞的该一种或多种突变型肽或多肽；并且
d.向该受试者给予在步骤(c)中选择的一种或多种肽或多肽、用该一种或多种肽或多肽脉冲处理的自体树突细胞或抗原呈递细胞；或制备包含一种或多种所鉴别的肽的药用组合物，并且进行如在此讨论的一种或多种方法。因此，在此的瘤形成疫苗或免疫原性组合物可以是如美国专利申请号20110293637中。
因此，本发明的目的在于，在本发明中不涵盖任何先前已知的产品、制造该产品的过程、或使用该产品的方法，使得申请人保留和特此披露放弃任何先前已知的产品、过程、或方法的权利。进一步指出的是，在本发明的范围之内，本发明并不旨在涵盖任何产品、过程、或该产品的制造或使用该产品的方法，其不符合USPTO(35U.S.C.§112，第一段)或EPO(EPC的第83条)的书面说明和可实施性要求，使得申请人保留和特此披露放弃任何先前描述的产品、制造该产品的过程、或使用该产品的方法的权利。
应注意，在本披露并且特别是在权利要求书和/或段落中，术语如“包括(comprise)”、“包括的(comprised)”、“包括了(comprising)”等等可具有在美国专利法中归于它的含义；例如，它们可以表示“包含(includes)”、“包含的(included)”、“包含了(including)”等等；并且这些术语如“基本上由……组成(consisting essentially of)”和“基本上由……组成(consists essentially of)”具有在美国专利法中归于它们的含义，例如，它们允许未被明确叙述的要素，但是排除在现有技术中发现或者影响本发明的基本或新颖特征的要素。
这些和其他实施例披露于以下详细说明中，或者据其显而易见并且由其涵盖。
附图简要说明
本专利或申请文件包括至少一幅彩色绘图。在提出请求并支付必要的费用后，本事务所将提供具有一张或多张彩色附图的本专利或专利申请的副本。
可以结合通过引用结合在此的附图充分地理解以下详细说明，该详细说明是通过举例给出的，但是不旨在将本发明仅仅限于所描述的特定实施例，其中
图1描绘用于制备个性化癌症疫苗或免疫原性组合物的流程。
图2示出用于产生用于黑色素瘤患者的癌症疫苗或免疫原性组合物的预处理步骤的流程。
图3展示根据本发明的一个示例性实施例基于初免加强策略的免疫程序。
图4示出根据本发明的一个示例性方面的一个时间轴，该时间轴指示初级免疫终点。
图5展示根据本发明的一个示例性实施例针对给予用检查点阻断抗体进行的共同疗法的时间轴，以评估局部免疫抑制的解除与新免疫的刺激相结合的组合。如在该方案中所示，作为检查点阻断疗法(例如，如这里所示的抗-PDL1)的适当候选者进入的患者可以进入并且立即用抗体进行治疗，同时正在制备疫苗或免疫原性组合物。然后，可以对患者接种疫苗。当疫苗接种的初免阶段出现时，可以继续或可能推迟检查点阻断抗体给药。
图6示出一个原理图，该原理图描绘根据本发明的一个示例性实施例将单独的新抗原肽药品加工为4个亚组的池。
图7示出用于在使用新抗原配制品刺激小鼠树突细胞之后评定多种关键免疫标志物的诱导水平的定量PCR的结果。
图8是研究1的示意性概要：非何杰金氏淋巴瘤中在AHSCT之后尼沃鲁单抗对比尼沃鲁单抗和NeoVax。
图9是研究2的示意性概要：转移性黑色素瘤和转移性RCC中尼沃鲁单抗和NeoVax。
图10A-图10D是四个研究的原理图。(A)研究3a示出转移性黑色素瘤中强度降低的静脉内伊匹单抗的剂量递增。(B)研究3b示出转移性黑色素瘤中皮下伊匹单抗(局部)的剂量递增。(C)研究3c示出高风险黑色素瘤中强度降低的静脉内伊匹单抗的剂量递增。(D)研究3d示出高风险黑色素瘤中皮下伊匹单抗(局部)的剂量递增。
图11展示组合NeoVax与伊匹单抗以便治疗高风险肾细胞癌的研究方案。
图12展示用于组合NeoVax与伊匹单抗以便治疗高风险肾细胞癌的研究的治疗方案。
发明详细说明
定义
为了有助于理解本发明，在此定义了多个术语和短语：
除非明确规定或从上下文显而易见，否则如在此所使用的，术语“约(about)”被理解为在本领域的正常公差范围内，例如，在平均数的2个标准偏差之内。约可以被理解为在规定值的50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％或0.01％之内。除非另外从上下文清楚可见，否则在此提供的所有数值均被术语约修饰。
除非明确规定或从上下文显而易见，否则如在此所使用的，术语“或”被理解为包括在内。除非明确规定或从上下文显而易见，否则如在此所使用的，术语“一个、一种(a、an)”和“该(the)”被理解为单数的或复数的。
所谓“试剂(agent)”意指任何小分子化学化合物、抗体、核酸分子或多肽或其片段。
免疫检查点是减缓或终止免疫反应并且防止来自不受控制的免疫细胞活性的过度组织损伤的抑制途径。所谓“检查点抑制剂”意指抑制这些抑制途径、从而允许更广泛的免疫活性的任何小分子化学化合物、抗体、核酸分子或多肽或其片段。在某些实施例中，该检查点抑制剂是程序性死亡-1(PD-1)途径的抑制剂，例如抗-PD1抗体，如但不限于尼沃鲁单抗。在其他实施例中，该检查点抑制剂是抗细胞毒性T淋巴细胞相关抗原(CTLA4)抗体。在另外的实施例中，该检查点抑制剂是针对CD28CTLA4Ig超家族的另一成员，如BTLA、LAG3、ICOS、PDL1或KIR(佩奇(Page)等人，医学年鉴(Annual Review of Medicine)65:27(2014))。在其他另外的实施例中，该检查点抑制剂是针对TNFR超家族的成员，如CD40、OX40、CD137、GITR、CD27或TIM-3。在一些情况下，靶向检查点抑制剂是用抑制抗体或类似分子完成的。在其他情况下，它是用靶标的激动剂完成的；此类的实例包括刺激性靶标OX40和GITR。
术语“组合”包括给予瘤形成疫苗或免疫原性组合物(例如瘤形成/肿瘤特异性新抗原的聚池化样品)以及一种或多种检查点抑制剂作为治疗方案的一部分，该治疗方案旨在从这些治疗剂中的一种或多种的共同作用提供有益的(加性或协同)效应。该组合还可以包括一种或多种另外的药剂，例如但不限于化学治疗剂、抗血管生成剂以及降低免疫抑制的药剂。该组合的有益作用包括但不限于由治疗剂的组合引起的药代动力学或药效动力学共同作用。典型地在限定的时间段内(例如数分钟、数小时、数天或数周，取决于所选择的组合)以组合方式给予这些治疗剂。
“联合疗法”旨在包括以顺序方式给予这些治疗剂，也就是说，其中在不同时间给予每种治疗剂，以及以基本上同时的方式给予这些治疗剂或这些治疗剂中的至少两种。可以例如通过向受试者给予具有固定比率的每种治疗剂的单一胶囊或以针对这些治疗剂中的每种的多个单一胶囊来完成基本上同时给予。例如，本发明的一种组合可以包含在同一时间或不同时间给予的肿瘤特异性新抗原的聚池化样品和检查点抑制剂，或它们可以被配制为包含这两种化合物的单一、共同配制的药用组合物。作为另一个实例，本发明的一种组合(例如，肿瘤特异性新抗原的聚池化样品和检查点抑制剂和/或抗CTLA4抗体)可以被配制为可以在同一时间或不同时间给予的分开的药用组合物。如在此所用，术语“同时地”意指在同一时间给予一种或多种药剂。例如，在某些实施例中，同时给予瘤形成疫苗或免疫原性组合物和检查点抑制剂。同时地包括同时发生的给予，即在同一时间段期间。在某些实施例中，在同一小时内同时地或在同一天内同时地给予该一种或多种药剂。顺序或实质上同时给予各治疗剂可以通过包括但不限于经口途径、静脉内途径、皮下途径、肌肉内途径、通过粘膜组织(例如，鼻、口、阴道和直肠)直接吸收、以及经眼途径(例如，玻璃体内、眼内等)的任何适当的途径来实现。可以通过相同途径或通过不同途径给予这些治疗剂。例如，可以通过静脉注射给予特定组合的一种组分，同时可以口服地给予该组合的其他一种或多种组分。可以按任何治疗有效的顺序给予这些组分。短语“组合”包括作为联合疗法的一部分有用的化合物的或非药疗法的组。
术语“新抗原(neoantigen)”或“新抗原的(neoantigenic)”意指一类肿瘤抗原，其产生自改变基因组编码的蛋白质的氨基酸序列的一个或多个肿瘤特异性突变。
所谓“瘤形成(neoplasia)”意指不适当地高水平的细胞分裂、不适当地低水平的凋亡或两者引起的任何疾病。例如，癌症是瘤形成的一个实例。癌症的实例包括但不限于白血病(例如，急性白血病、急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性成髓细胞白血病、急性早幼粒细胞白血病、急性骨髓单核细胞性白血病、急性单核细胞白血病、急性红白血病、慢性白血病、慢性髓细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤(例如，何杰金氏病、非何杰金氏病)、沃尔登斯特伦氏(Waldenstrom's)巨球蛋白血症、重链病和实体瘤例如肉瘤和癌(例如，纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨原性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、成肾细胞瘤、宫颈癌、子宫癌、睾丸癌、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜细胞瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、神经鞘瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、成神经细胞瘤及成视网膜细胞瘤)。淋巴增生性病症也视为增生性疾病。
术语“瘤形成疫苗”意指瘤形成/肿瘤特异性新抗原的聚池化样品，例如至少两种、至少三种、至少四种、至少五种或更多种新抗原肽。“疫苗”应被理解为意指用于产生用于预防和/或治疗疾病(例如，瘤形成/肿瘤)的免疫性的组合物。相应地，疫苗是包含抗原的药剂并且旨在通过疫苗接种而在人或动物中用于产生特异性防御和保护物质。“瘤形成疫苗组合物”可以包含药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂。
术语“药学上可接受的”是指由联邦或州政府的监管机构批准的或可批准的或者美国药典中或其他公认药典中列出的在动物(包括人)中使用的。
“药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂”是指这样一种赋形剂、载体或稀释剂，它们可以与一种药剂一起给予至受试者，并且它们不破坏该药剂的药理学活性并且当以有效递送治疗量的该药剂的剂量给予时是无毒的。
如在此所列举的，聚池化的肿瘤特异性新抗原的“药学上可接受的盐”可以是在本领域中通常认为适于与人类或动物的组织接触而无过多毒性、刺激性、变应性反应或其他问题或并发症的酸盐或碱盐。此类盐包括碱性残基(如胺)的矿物盐和有机酸盐以及酸性残基(如羧酸)的碱盐或有机盐。具体的药用盐包括但不限于酸的盐，这些酸如盐酸、磷酸、氢溴酸、苹果酸、乙醇酸、富马酸、硫酸、氨基磺酸、磺胺酸、甲酸、甲苯磺酸、甲磺酸、苯磺酸、乙烷二磺酸、2-羟乙基磺酸、硝酸、苯甲酸、2-乙酰氧基苯甲酸、柠檬酸、酒石酸、乳酸、硬脂酸、水杨酸、谷氨酸、抗坏血酸、扑酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、丙酸、羟基马来酸、氢碘酸、苯乙酸、链烷酸如乙酸、HOOC-(CH2)n-COOH(其中n是0-4)等。类似地，药学上可接受的阳离子包括但不限于钠、钾、钙、铝、锂以及铵。本领域的普通技术人员应从本披露和本领域中的知识认识到在此提供的聚池化的肿瘤特异性新抗原的另外的药学上可接受的盐包括由雷明顿的药物科学(Remington’s Pharmaceutical Sciences)，第17版，马克出版公司(MackPublishing Company)，伊斯顿，宾夕法尼亚州，第1418页(1985)所列出的那些。通常，药学上可接受的酸盐或碱盐可以通过任何常规化学方法由包含碱性或酸性部分的母体化合物合成。简言之，此类盐可以通过使这些化合物的游离酸或碱形式与化学计算量的适当的碱或酸在适当的溶剂中反应来制备。
所谓“多肽”或“肽”意指已从天然伴随它的组分中分离的多肽。典型地，当该多肽按重量计为至少60％时，将它与它天然关联的蛋白质和天然存在的有机分子分离。优选地，该制剂是按重量计至少75％，更优选是至少90％，并且最优选是至少99％的多肽。分离的多肽可以例如通过从天然源提取、通过表达编码这样一种多肽的重组核酸或通过化学合成该蛋白而获得。可以通过任何适当的方法测量纯度，例如，柱色谱法、聚丙烯酰胺凝胶电泳或通过HPLC分析。
如在此所使用的，术语“预防(prevent，preventing，prevention)”、“预防性治疗(prophylactic treatment)”等是指降低未患疾病或病状但是处于患上疾病或病状的风险之中或易于患上疾病或病状的受试者患上疾病或病状的可能性。
术语“初免/加强”或“初免/加强给药方案”意指连续给予疫苗或免疫原性或免疫组合物。初免给予(初免)是给予第一疫苗或免疫原性或免疫组合物类型并且可以包括一次、两次或更多次给予。加强给予是疫苗或免疫原性或免疫组合物类型的第二给予，并且可以包括一次、两次或更多次给予，并且例如可以包括每年给予或基本上由每年给予组成。在某些实施例中，给予瘤形成疫苗或免疫原性组合物是在初免/加强给药方案中。
在此提供的范围被理解为对该范围内的所有值的简写。例如，1至50的范围被理解为包括来自下组的任何数、数的组合或子范围，该组由以下各项组成：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50，以及在以上提到的整数之间的所有中间的十进制值，例如像1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8以及1.9。关于子范围，确切地考虑了从该范围的任一终点延伸的“嵌套式子范围”。例如，1至50的示例性范围的嵌套式子范围可以包括一个方向上的1至10、1至20、1至30以及1至40，或另一个方向上的50至40、50至30、50至20以及50至10。
“受体”应被理解为意指能够结合配体的生物分子或分子分组。受体可以用于传输细胞、细胞形成或生物体中的信息。受体包含至少一个受体单位并且经常包含两个或更多个受体单位，其中每个受体单位都可以由蛋白质分子、特别是糖蛋白分子组成。受体具有互补于配体的结构的结构并且可以将该配体复合为结合配偶体。信号传导信息可以通过与细胞表面上的配体结合之后受体的构象变化来传输。根据本发明，受体可以指能够与配体形成受体/配体复合物的MHC类别I和II的具体蛋白质，特别是具有合适长度的肽或肽片段。
术语“受试者”是指作为治疗、观察或实验对象的动物。仅通过举例的方式，受试者包括但不限于哺乳动物，包括但不限于人或非人哺乳动物，如非人灵长类动物、牛、马、犬、绵羊或猫。
术语“治疗(treat、treated、treating、treatment等)”意指减少或改善病症(例如，瘤形成或肿瘤)和/或与其相关的症状。“治疗”可以是指在癌症发作或疑似发作之后将联合疗法给予至受试者。“治疗”包括“减轻”的概念，减轻是指降低发生或复发的频率，或降低与癌症相关的任何症状或其他不良作用和/或与癌症疗法相关的副作用的严重程度。术语“治疗”还涵盖“管理”的概念，管理是指降低患者的特定疾病或病症的严重程度或延迟该疾病或病症的复发，例如延长患有该疾病的患者的缓解期。应理解的是，尽管不能排除，治疗病症或病状并不要求完全地消除该病症、病状或与其相关的症状。
术语“治疗作用”是指在一定程度上减轻病症(例如，瘤形成或肿瘤)或其相关病变的一种或多种症状。如在此所使用的“治疗有效量”是指当以单剂量或多剂量给予至细胞或受试者时，在延长患有这样的一种病症的患者的生存力、减少该病症的一种或多种体征或症状、预防或延迟以及超过在不存在这样的治疗情况下预期的情况等方面有效的药剂的量。“治疗有效量”旨在限定达到治疗作用所需的量。具有本领域普通技术的医生或兽医可以容易地确定并且开出所需药用组合物的“治疗有效量”(例如，ED50)。例如，医生或兽医开始以低于达到希望的治疗作用所需的水平给予在药用组合物中所用的本发明的组合物，并且逐渐增加剂量直到达到所希望的作用。
在此的变量的任何定义中，化学基团列表的陈述包括该变量作为任何单一基团或所列基团的组合的定义。针对在此的变量或方面的实施例的陈述包括该实施例作为任何单一实施例或与任何其他实施例或其部分的组合。
在此提供的任何组合物或方法可以与在此提供的一种或多种任何其他组合物和方法进行组合。
在此披露的联合疗法构成一种用于治疗不同类型的癌症的新方法。在此描述的联合疗法还提供一种用于实现临床益处而无不可接受水平的副作用的治疗方法。
本发明涉及用于治疗瘤形成、且更具体地说肿瘤的方法，这些方法通过向受试者给予包含多种瘤形成/肿瘤特异性新抗原和至少一种检查点抑制剂的瘤形成疫苗或免疫原性组合物进行。
如在此更详细地描述，全基因组/外显子组测序可以用于鉴别所有或几乎所有在个体患者的瘤形成/肿瘤中独特存在的突变新抗原，并且可以对这些突变新抗原的集合进行分析，以鉴别用作用于治疗该患者的瘤形成/肿瘤的个性化癌症疫苗或免疫源性组合物的特异性的、优化的新抗原亚群。例如，可以通过对每个患者的瘤形成/肿瘤和正常DNA测序以鉴别肿瘤特异性突变来鉴别瘤形成/肿瘤特异性新抗原群体，并且可以鉴别该患者的HLA同种异型。该瘤形成/肿瘤特异性新抗原及其同源天然抗原群体然后可以经受使用验证的算法进行的生物信息学分析以便预测哪些肿瘤特异性突变产生能够结合患者的HLA同种异型的表位。基于此分析，可以针对每个患者设计并合成多种对应于这些突变的亚群的肽，并且将其聚池化在一起在对该患者进行免疫中用作癌症疫苗或免疫原性组合物。
免疫系统可以被分成两个功能子系统：先天性和获得性免疫系统。先天性免疫系统是针对感染的第一道防线，并且大多数潜在病原体在它们可以引起例如显著感染之前被此系统快速中和。获得性免疫系统与侵入生物体的称为抗原的分子结构反应。存在两类获得性免疫反应，包括体液免疫反应和细胞介导的免疫反应。在体液免疫反应中，由B细胞分泌到体液内的抗体结合病原体衍生的抗原，导致通过多种机制消除病原体，例如补体介导的裂解。在细胞介导的免疫反应中，能够破坏其他细胞的T细胞被激活。例如，如果与疾病相关的蛋白质存在于细胞中，则它们在该细胞内被蛋白水解地裂成肽。特异性细胞蛋白随后将其自身附着至以这种方式形成的抗原或肽，并且将其转运至细胞的表面，在这里它们被呈递给身体的分子防御机制，特别是T细胞。细胞毒性T细胞识别这些抗原并且杀死具有这些抗原的细胞。
转运并且在细胞表面上呈递肽的分子被称为主要组织相容性复合物(MHC)的蛋白质。MHC蛋白被分成两个类型，称为MHC I类和MHC II类。两个MHC类别的蛋白质结构非常相似；然而，它们具有非常不同的功能。MHC I类的蛋白质存在于身体的几乎所有细胞(包括大多数肿瘤细胞)的表面上。MHC I类蛋白装载有抗原，这些抗原通常源于内源蛋白质或源于细胞内存在的病原体，并且随后被呈递给初始或细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。MHC II类蛋白存在于树突细胞、B淋巴细胞、巨噬细胞以及其他抗原呈递细胞上。它们主要将由体外抗原来源(即细胞外)加工的肽呈递给T辅助(Th)细胞。由MHC I类蛋白结合的大多数肽源于在生物体自身的健康宿主细胞中产生的胞质蛋白，并且通常不刺激免疫反应。相应地，识别此类呈递自身肽的I类MHC分子的细胞毒性T淋巴细胞在胸腺中缺失(中枢耐受)，或在其从胸腺中释放后，被缺失或灭活，即耐受(外周耐受)。MHC分子在它们将肽呈递给非耐受T淋巴细胞时能够刺激免疫反应。细胞毒性T淋巴细胞在其表面上具有T细胞受体(TCR)和CD8分子两者。T细胞受体能够识别且结合与MHC I类的分子复合的肽。每种细胞毒性T淋巴细胞表达能够结合特异性MHC/肽复合物的独特T细胞受体。
在它们被呈递在细胞表面上之前，肽抗原通过在内质网内的竞争性亲和力结合将其自身附着至MHC I类分子上。此处，单个肽抗原的亲和力直接与其氨基酸序列和在该氨基酸序列内的限定位置中特异性结合基序的存在联系。如果这样一种肽的序列是已知的，则可以使用例如肽疫苗操纵免疫系统对抗患病细胞。
开发治愈性和肿瘤特异性免疫疗法的关键障碍之一是高度特异性且限制性的肿瘤抗原的鉴别和选择，以避免自身免疫。作为恶性细胞内的遗传变化(例如，倒位、易位、缺失、错义突变、剪接位点突变等)的结果而出现的肿瘤新抗原代表最具肿瘤特异性类别的抗原。新抗原很少被用于癌症疫苗或免疫原性组合物中，因为在鉴别它们、选择优化的新抗原以及产生用于在疫苗或免疫原性组合物中使用的新抗原方面存在技术难点。这些问题可以通过以下方式来解决：
·使用相比于来自每个患者的匹配的种系样品进行的肿瘤的全基因组、全外显子组(例如，仅捕获的外显子)或RNA测序而在DNA水平上在瘤形成/肿瘤中鉴别所有或几乎所有突变；
·用一种或多种肽-MHC结合预测算法分析这些鉴别的突变，以产生多个候选新抗原T细胞表位，这些表位被表达于该瘤形成/肿瘤内并且可以结合患者HLA等位基因；并且
·合成该多个候选新抗原肽，它们选自这些集合的所有新ORF肽和用于在癌症疫苗或免疫源性组合物中使用的预测的结合肽。
如在此所述，在动物和人两者中存在大量证据证明突变表位在诱导免疫应答中是有效的并且自发性肿瘤消退或长期存活的病例与针对突变表位的CD8+T细胞应答相关(巴克沃尔特(Buckwalter)和斯里瓦斯塔瓦PK(Srivastava PK)。来自十多年的人癌症疫苗疗法的“它(们)是抗原，笨蛋”和其他课程("It is the antigen(s),stupid"and otherlessons from over a decade of vaccitherapy of human cancer)免疫学研讨文辑(Seminars in immunology)20:296-300(2008)；卡拉尼卡斯(Karanikas)等人，长期存活的肺癌患者的血液中的高频率的针对可用HLA四聚体检测到的肿瘤特异性突变抗原的细胞溶解T淋巴细胞(High frequency of cytolytic T lymphocytes directed against atumor-specific mutated antigen detectable with HLA tetramers in the blood ofa lung carcinoma patient with long survival)癌症研究(Cancer Res.)61:3718-3724(2001)；伦内尔兹(Lennerz)等人，自体T细胞对人黑色素瘤的应答受突变新抗原左右(Theresponse of autologous T cells to a human melanoma is dominated by mutatedneo-antigens)美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad Sci U S A.)102:16013(2005))并且“免疫编辑(immunoediting)”可以追溯到显性突变抗原在小鼠和人体内的表达的改变(松下(Matsushita)等人，癌症外显子组分析揭示癌症免疫编辑的T细胞依赖性机制(Cancer exome analysis reveals a T-cell-dependent mechanism of cancerimmunoediting)自然(Nature)482:400(2012)；杜佩奇(DuPage)等人，肿瘤特异性抗原的表达是癌症免疫编辑的基础(Expression of tumor-specific antigens underlies cancerimmunoediting)自然482:405(2012)；和桑普森(Sampson)等人，在新近诊断成胶质细胞瘤的患者中在长时间无进展存活之后表皮生长因子受体变体III多肽疫苗接种的免疫逃逸(Immunologic escape after prolonged progression-free survival with epidermalgrowth factor receptor variant III peptide vaccination in patients with newlydiagnosed glioblastoma)临床肿瘤学杂志(J Clin Oncol.)28:4722-4729(2010))。在一个实施例中，测定癌症患者的突变表位。
在一个实施例中，通过使用下一代测序技术对来自癌症患者的肿瘤组织和健康组织的基因组和/或外显子组进行测序来测定突变表位。在另一个实施例中，使用下一代测序技术对基于其突变频率和充当新抗原的能力选择的基因进行测序。下一代测序适用于基因组测序、基因组重测序、转录组剖析(RNA-Seq)、DNA-蛋白质相互作用(ChIP测序)、以及表观基因组表征(马加良伊斯(de)JP、芬奇(Finch)CE、让森斯(Janssens)G(2010)“衰老研究中的下一代测序：新兴应用、问题、缺陷以及可能的解决方案(Next-generationsequencing in aging research:emerging applications,problems,pitfalls andpossible solutions)”.衰老研究评论(Ageing Research Reviews)9(3):315–323；霍尔(Hall)N(2007年5月).“先进的测序技术及其在微生物学中的广泛影响(Advancedsequencing technologies and their wider impact in microbiology)”.实验生物学杂志(J.Exp.Biol.)209(Pt 9):1518–1525；丘奇(Church)GM(2006年1月)“所有的基因组(Genomes for all)”.科学美国人(Sci.Am.)294(1):46–54；登堡(ten Bosch)JR，格罗迪(Grody)WW(2008)“跟上下一代(Keeping Up with the Next Generation)”.分子诊断学杂志(The Journal of Molecular Diagnostics)10(6):484–492；塔克(Tucker)T、马拉(Marra)M、弗里德曼(Friedman)JM(2009)“大规模平行测序：遗传医学的下一件大事(Massively Parallel Sequencing:The Next Big Thing in Genetic Medicine)”.美国人类遗传学杂志(The American Journal of Human Genetics)85(2):142–154)。下一代测序现在可以快速揭示离散突变的存在，如单个肿瘤中的编码突变，最常见的是单氨基酸改变(例如，错义突变)和由终止密码子中的移码插入/缺失/基因融合、连读突变和不当剪接内含子的翻译产生的不经常的新颖的氨基酸段(例如，新ORF)。新ORF作为免疫原是特别有价值的，因为它们的序列整体对于免疫系统而言完全是新颖的并且所以类似于病毒或细菌外源抗原。因此，新ORF：(1)对肿瘤是高度特异性的(即在任何正常细胞中没有表达)；(2)可以绕开中枢耐受，从而增加新抗原特异性CTL的前体频率。例如，最近已用衍生自人乳头瘤病毒(HPV)的肽证明了在治疗性抗癌疫苗或免疫原性组合物中利用类似外源序列的功效。19个患有瘤形成前的病毒诱导的疾病、接受3-4次衍生自病毒癌基因E6和E7的HPV肽的混合物的疫苗接种的患者中的约50％维持了≥24个月的完全应答(肯特尔(Kenter)等人，用于外阴上皮内瘤形成的针对HPV-16癌蛋白的疫苗接种(Vaccination against HPV-16Oncoproteins for Vulvar Intraepithelial Neoplasia)NEJM 361:1838(2009))。
测序技术已经揭示到，每个肿瘤都包含多个改变基因的蛋白质编码内容的患者特异性突变。此类突变产生改变的蛋白质，范围从单氨基酸改变(由错义突变引起)到归因于终止密码子的移码、连读或内含子区的翻译的添加长区域的新颖氨基酸序列(新颖开放阅读框突变；新ORF)。这些突变蛋白质对于宿主对肿瘤的免疫应答而言是有价值的靶标，因为不像天然蛋白质，它们不受自身耐受的免疫抑制作用的影响。因此，突变蛋白质更可能具有免疫原性并且与患者的正常细胞相比对肿瘤细胞还更具特异性。
一种用于鉴别肿瘤特异性新抗原的替代性方法是直接蛋白质测序。使用多维MS技术(MSn)(包括串联质谱(MS/MS))的酶消化物的蛋白质测序也可以用于鉴别本发明的新抗原。此类蛋白质组学方法允许快速、高度自动化的分析(参见例如，K.吉华(K.Gevaert)和J.范德克科霍弗(J.Vandekerckhove)，电泳(Electrophoresis)21:1145-1154(2000))。在本发明的范围内进一步考虑到的是用于对未知蛋白质从新测序的高通量方法可以用于分析患者的肿瘤的蛋白质组，以鉴别表达的新抗原。例如，元鸟枪法蛋白质测序可以用于鉴别表达的新抗原(参见例如，谷塔尔斯(Guthals)等人(2012)使用元重叠群组件的鸟枪法蛋白质测序(Shotgun Protein Sequencing with Meta-contig Assembly)，分子与细胞蛋白质组学(Molecular and Cellular Proteomics)11(10):1084-96)。
还可以使用MHC多聚体鉴别肿瘤特异性新抗原，以鉴别新抗原特异性T细胞应答。例如，可以使用基于MHC四聚体的筛选技术进行患者样品中的新抗原特异性T细胞应答的高通量分析(参见例如，霍姆布林克(Hombrink)等人(2011)通过基于MHC四聚体的筛选来高通量鉴别潜在的次要组织相容性抗原：可行性与局限性(High-Throughput Identificationof Potential Minor Histocompatibility Antigens by MHC Tetramer-BasedScreening:Feasibility and Limitations)6(8):1-11；哈德拉普(Hadrup)等人(2009)通过MHC多聚体的多维编码平行检测抗原特异性T细胞应答(Parallel detection ofantigen-specific T-cell responses by multidimensional encoding of MHCmultimers)，自然方法(Nature Methods)，6(7):520-26；范罗伊(van Rooij)等人(2013)肿瘤外显子组分析揭示了易普利姆玛反应性黑色素瘤中的新抗原特异性T细胞反应性(Tumorexome analysis reveals neoantigen-specific T-cell reactivity in anIpilimumab-responsive melanoma)，临床肿瘤学杂志(Journal of Clinical Oncology)，31:1-4；以及亨斯科克(Heemskerk)等人(2013)癌症反基因组(The cancer antigenome)，EMBO杂志,32(2):194-203)。此类基于四聚体的筛选技术可以用于初始鉴别肿瘤特异性新抗原，或可替代地作为二级筛选方案来评估患者可能已经向哪些新抗原暴露了，从而有助于选择用于本发明的候选新抗原。
在一个实施例中，对源自测定癌症患者中突变的存在的测序数据进行分析以便预测能够结合个体的HLA分子的个人突变肽。在一个实施例中，使用计算机来分析该数据。在另一个实施例中，针对新抗原的存在分析序列数据。在一个实施例中，通过新抗原对MHC分子的亲和力来测定这些新抗原。对利用哪些具体突变作为免疫原进行有效地选择需要鉴别患者的HLA类型和预测哪些突变肽将有效地与该患者的HLA等位基因结合的能力。最近，使用验证的结合与非结合肽的基于神经网络的学习方法已经提升了针对主要HLA-A和-B等位基因的预测算法的准确度。利用最近改进的用于预测哪些错义突变产生至患者的同源MHC分子的强结合肽的算法，可以鉴别并优先化一组代表每个患者的最佳突变表位(新ORF和错义两者)的肽(张(Zhang)等人，免疫学中的机器学习竞争–HLA I类结合肽的预测(Machinelearning competition in immunology–Prediction of HLA class I bindingpeptides)免疫学方法杂志(J Immunol Methods)374:1(2011)；伦德戈德(Lundegaard)等人，使用基于神经网络的方法预测表位(Prediction of epitopes using neural networkbased methods)免疫学方法杂志374:26(2011))。
实际地靶向尽可能多的突变表位利用了免疫系统的巨大能力，阻止了通过具体免疫靶向基因产物的下调而免疫逃逸的机会，并且补偿表位预测方法的已知不准确性。合成肽提供一种用于有效制备多种免疫原并且将突变型表位的鉴别快速转换为有效疫苗或免疫源性组合物的特别有用的手段。可以用化学方法容易地合成肽并且利用不含污染菌或动物物质的试剂容易地纯化。小尺寸允许明确侧重于蛋白质的突变区域并且还减少了来自其他组分(未突变蛋白或病毒载体抗原)的无关抗原竞争。
在一个实施例中，药物配制品是长肽的多表位疫苗或免疫源性组合物。此类“长”肽在专职抗原呈递细胞(如树突细胞)中经历有效的内化、加工和交叉呈递，并且已经显示可以在人体内诱导CTL(梅利夫(Melief)和范德伯格(van der Burg)，通过合成的长肽疫苗进行的已形成的(前)恶性疾病的免疫疗法(Immunotherapy of established(pre)malignant disease by synthetic long peptide vaccines)癌症自然评论(Nature RevCancer)8:351(2008))。在一个实施例中，制备至少1种肽以用于免疫。在一个优选实施例中，制备20种或更多种肽以用于免疫。在一个实施例中，该新抗原肽的长度范围是从约5至约50个氨基酸。在另一个实施例中，合成长度为从约15至约35个氨基酸的肽。在优选实施例中，该新抗原肽的长度范围是从约20至约35个氨基酸。
肿瘤特异性新抗原的产生
本发明至少部分地基于为患者的免疫系统提供肿瘤特异性新抗原池的能力。从本披露和本领域中的知识本领域技术人员应认识到存在多种用于产生此类肿瘤特异性新抗原的方式。通常，可以在体外或在体内产生此类肿瘤特异性新抗原。可以在体外将肿瘤特异性新抗原产生为肽或多肽，然后可以将这些肽或多肽配制成个性化瘤形成疫苗或免疫原性组合物并给予至受试者。如在此进一步详述的，这样的体外产生可以通过多种本领域的普通技术人员已知的方法发生，如例如合成肽或在多种细菌、真核或病毒重组表达系统中的任一种中由DNA或RNA分子表达肽/多肽，随后纯化表达的肽/多肽。可替代地，可以通过向受试者体内引入编码肿瘤特异性新抗原的分子(例如，DNA、RNA、病毒表达系统等)，在该受试者体内表达编码的肿瘤特异性新抗原而在体内产生肿瘤特异性新抗原。还在此进一步描述在体外和在体内产生新抗原的方法，因为它与药用组合物和联合疗法的递送方法相关。
体外肽/多肽合成
可以通过本领域的技术人员已知的任何技术制备蛋白质或肽，包括通过标准分子生物技术表达蛋白质、多肽或肽，从天然来源中分离蛋白质或肽，体外翻译或化学合成蛋白质或肽。先前已经披露了对应于不同基因的核苷酸及蛋白质、多肽和肽的序列，并且可以发现于本领域的普通技术人员已知的计算机化数据库中。一个这样的数据库是设于美国国立卫生研究院的网站的国家生物技术信息中心的Genbank和GenPept数据库。可以使用在此披露的或对本领域的普通技术人员而言应是已知的技术扩增和/或表达已知基因的编码区。可替代地，蛋白质、多肽和肽的各种商业制剂是本领域的技术人员已知的。
可以利用不含污染菌或动物物质的试剂用化学方法容易地合成肽(梅里菲尔德RB(Merrifield RB)：固相肽合成(Solid phase peptide synthesis)I.四肽的合成(Thesynthesis of a tetrapeptide)美国化学会志(J.Am.Chem.Soc.)85:2149-54，1963)。在某些实施例中，通过以下来制备新抗原肽：(1)使用均一合成和裂解条件在多通道仪器上的平行固相合成；(2)经RP-HPLC柱纯化，伴随柱汽提；并且在肽之间再洗涤但不置换；接着(3)用有限组的最具信息性的测定进行分析。可以针对个体患者围绕该组肽限定良好制造规范(GMP)足迹，从而在用于不同患者的肽合成之间仅需要套件转换程序。
可替代地，一种编码本发明的新抗原肽的核酸(例如，多核苷酸)可以用于在体外产生该新抗原肽。该多核苷酸可以是例如单链和/或双链的DNA、cDNA、PNA、CNA、RNA，或多核苷酸的天然或稳定形式(如例如具有硫代磷酸骨架的多核苷酸)或其组合并且它可以包含或可以不包含内含子，只要它编码该肽即可。在一个实施例中，体外翻译用于产生该肽。存在本领域的技术人员能够利用的许多示例性系统(例如，Retic Lysate IVT试剂盒，生命技术公司(Life Technologies)，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)。
还可以制备能够表达多肽的表达载体。针对不同细胞类型的表达载体在本领域是熟知的并且可以在无需过度实验的情况下加以选择。通常，以恰当的方向以及在正确的用于表达的阅读框内将DNA插入表达载体(如质粒)中。必要时，可以将DNA连接至被希望的宿主(例如，细菌)识别的适当的转录和翻译调节控制核苷酸序列上，尽管此类控制通常在该表达载体中是可获得的。然后，将该载体引入宿主细菌中，用于使用标准技术进行克隆(参见例如，萨姆布鲁克(Sambrook)等人(1989)分子克隆实验指南(Molecular Cloning,ALaboratory Manual)，冷泉港实验室(Cold Spring Harbor Laboratory)，冷泉港，纽约)。
还考虑了包含分离的多核苷酸的表达载体以及含有表达载体的宿主细胞。这些新抗原肽可以按编码所希望的新抗原肽的RNA或cDNA分子的形式提供。本发明的一种或多种新抗原肽可以由单一表达载体所编码。
术语“编码多肽的多核苷酸”涵盖仅包括针对多肽的编码序列的多核苷酸以及包括另外的编码和/或非编码序列的多核苷酸。多核苷酸可以处于RNA形式或处于DNA形式。DNA包括cDNA、基因组DNA和合成DNA；并且可以是双链的或单链的，并且如果是单链的话，可以是编码链或非编码(反义)链。
在实施例中，这些多核苷酸可以包括针对肿瘤特异性新抗原肽的编码序列，该编码序列与一种多核苷酸融合在相同的阅读框中，该多核苷酸例如辅助由宿主细胞表达和/或分泌多肽(例如，充当用于控制从该细胞中转运多肽的分泌序列的前导子序列)。具有前导序列的多肽是前蛋白质并且该前导序列可以被宿主细胞裂解，以形成该多肽的成熟形式。
在实施例中，这些多核苷酸可以包括针对肿瘤特异性新抗原肽的编码序列，该编码序列与一种标记物序列融合在相同的阅读框中，该标记物序列例如允许纯化编码的多肽，然后可以将该多肽掺入个性化瘤形成疫苗或免疫原性组合物中。例如，在细菌宿主的情况下，该标记物序列可以是一种由pQE-9载体提供的六组氨酸标签，以为纯化融合至该标记物的成熟多肽做准备，或当使用哺乳动物宿主(例如，COS-7细胞)时，该标记物序列可以是一种衍生自流感血球凝集素蛋白的血球凝集素(HA)标签。另外的标签包括但不限于钙调蛋白标签、FLAG标签、Myc标签、S标签、SBP标签、Softag 1、Softag 3、V5标签、Xpress标签、Isopeptag、SpyTag生物素羧基载体蛋白(BCCP)标签、GST标签、荧光蛋白标签(例如，绿色荧光蛋白标签)、麦芽糖结合蛋白标签、Nus标签、Strep-标签、硫氧还蛋白标签、TC标签、Ty标签等。
在实施例中，这些多核苷酸可以包括针对这些肿瘤特异性新抗原肽中的一种或多种的编码序列，该编码序列合在相同阅读框中，以产生能够产生多种新抗原肽的单一多联体化(concatamerized)新抗原肽构建体。
在某些实施例中，可以提供分离的核酸分子，这些核酸分子具有以下核苷酸序列，该核苷酸序列与编码本发明的肿瘤特异性新抗原肽的多核苷酸至少60％一致、至少65％一致、至少70％一致、至少75％一致、至少80％一致、至少85％一致、至少90％一致、至少95％一致或至少96％、97％、98％或99％一致。
所谓具有与参考核苷酸序列至少例如95％“一致(identical)”的核苷酸序列的多核苷酸意指该多核苷酸的核苷酸序列与该参考序列一致，只是在该参考核苷酸序列的每100个核苷酸中，该多核苷酸序列可以包括多达五个点突变。换言之，为了获得具有与参考核苷酸序列至少95％一致的核苷酸序列的多核苷酸，可以将该参考序列中多达5％的核苷酸缺失或用另一种核苷酸取代，或者可以在该参考序列中插入多达该参考序列中的总核苷酸的5％的多个核苷酸。参考序列的这些突变可以发生于参考核苷酸序列的氨基末端位置或羧基末端位置或者那些末端位置之间的任何位置，它们或是单独地散布于参考序列中的核苷酸之间，或是以一个或多个连续组散布于参考序列内。
作为实际问题，可以使用已知的计算机程序常规地确定任何具体核酸分子与参考序列是否至少80％一致、至少85％一致、至少90％一致，并且在一些实施例中，至少95％、96％、97％、98％或99％一致，这些计算机程序是如Bestfit程序(威斯康星序列分析包(Wisconsin Sequence Analysis Package)，基于Unix的版本8，遗传学计算机组(GeneticsComputer Group)，大学研究园(University Research Park)，575Science Drive，麦迪逊，威斯康星州53711)。Bestfit使用局部同源性算法(史密斯(Smith)和沃特曼(Waterman)，应用数学进展(Advances in Applied Mathematics)2：482-489(1981))来发现两个序列之间的最佳同源性区段。当使用Bestfit或任何其他序列比对程序确定具体序列例如是否与根据本发明的参考序列95％一致时，这样设定这些参数以使得在参考核苷酸序列的全长上计算一致性百分比并且允许多达参考序列中的核苷酸总数的5％的同源性空位。
可以通过本领域已知的任何适合的方法在体外(例如，在实验室中)产生在此描述的分离的肿瘤特异性新抗原肽。此类方法范围从直接蛋白合成方法到构建编码分离的多肽序列的DNA序列并且在适合的转化宿主中表达那些序列。在一些实施例中，使用重组技术通过分离或合成编码感兴趣的野生型蛋白质的DNA序列来构建DNA序列。任选地，可以通过位点特异性诱变来诱变处理该序列，以提供其功能类似物。参见，例如，卓勒(Zoeller)等人，美国国家科学院院刊(Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA)81:5662-5066(1984)和美国专利号4,588,585。
在实施例中，使用寡核苷酸合成仪通过化学合成来构建编码感兴趣的多肽的DNA序列。可以基于希望的多肽的氨基酸序列并选择那些在产生感兴趣的重组多肽的宿主细胞中偏好的密码子来设计此类寡核苷酸。标准方法可以用于合成编码感兴趣的分离的多肽的分离的多核苷酸序列。例如，完整的氨基酸序列可以用来构建回译基因。此外，可以合成包含编码具体分离的多肽的核苷酸序列的DNA寡聚体。例如，可以合成若干小的编码希望的多肽的部分的寡核苷酸并且然后将其连接。单独的寡核苷酸典型地包含用于互补组件的5’或3’突出端。
一旦组装(例如，通过合成、定点诱变或另一种方法)，编码感兴趣的具体分离的多肽的多核苷酸序列被插入表达载体中并且任选地被可操作地连接至表达控制序列上，该表达控制序列适于在希望的宿主中表达该蛋白质。可以通过核苷酸测序、限制酶作图和生物活性多肽在适合的宿主体内的表达来确认适当的组装。如本领域所熟知的，为了在宿主中获得转染基因的高表达水平，可以将该基因可操作地连接至转录和翻译表达控制序列上，这些序列在所选的表达宿主中具有功能性。
重组表达载体可以用于扩增和表达编码肿瘤特异性新抗原肽的DNA。重组表达载体是可复制的DNA构建体，它们具有编码肿瘤特异性新抗原肽或生物等价类似物的合成或cDNA衍生的DNA片段，这些DNA片段被可操作地连接至适合的转录或翻译调节元件上，这些调节元件来源于哺乳动物、微生物、病毒或昆虫基因。转录单位通常包括以下项的集合：(1)在基因表达中具有调节作用的一种或多种遗传元件，例如转录启动子或增强子；(2)被转录成mRNA并被翻译成蛋白质的结构或编码序列；以及(3)适当的转录和翻译起始和终止序列，如在此所详述的。此类调控元件可以包括用于控制转录的操纵子序列。可以另外掺入通常赋予在宿主中进行复制的能力的复制起点以及有助于识别转化体的选择基因。当DNA区域在功能上彼此相关时，将它们可操作地连接。例如，将信号肽(分泌性前导子)的DNA可操作地连接至多肽的DNA，如果它被表达为参与多肽的分泌的前体的话；将启动子可操作地连接至编码序列，如果它控制该序列的转录的话；或将核糖体结合位点可操作地连接至编码序列，如果它被定位以便允许翻译的话。通常，可操作地连接意指连续的，并且在分泌性前导子的情况下，意指连续的并且在阅读框中。旨在用于在酵母表达系统中使用的结构元件包括前导序列，它使得宿主细胞可以将翻译的蛋白质分泌到胞外。可替代地，在无需前导或转运序列表达重组蛋白质的情况下，它可以包括N-末端甲硫氨酸残基。随后，此残基可以任选地被从表达的重组蛋白上裂解下来，以提供终产物。
用于真核宿主(尤其是哺乳动物或人)的有用的表达载体包括例如包含来自SV40、牛乳头瘤病毒、腺病毒和巨细胞病毒的表达控制序列的载体。用于细菌宿主的有用的表达载体包括已知的细菌质粒，如来自大肠杆菌的质粒(包括pCR 1、pBR322、pMB9及其衍生物)，更宽的宿主范围质粒如M13和丝状单链DNA噬菌体。
用于表达多肽的合适的宿主细胞包括处于适当的启动子的控制下的原核生物、酵母、昆虫或高等真核细胞。原核生物包括革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如大肠杆菌或芽孢杆菌。高等真核细胞包括建立的哺乳动物来源的细胞系。还可以利用无细胞翻译系统。用于与细菌、真菌、酵母及哺乳动物细胞宿主一起使用的适当的克隆和表达载体在本领域是熟知的(参见布韦尔斯(Pouwels)等人，克隆载体：实验室手册(Cloning Vectors:ALaboratory Manual)，爱思唯尔(Elsevier)，纽约，1985)。
还有利地利用各种哺乳动物或昆虫细胞培养系统表达重组蛋白。可以在哺乳动物细胞中表达重组蛋白，因为此类蛋白质通常被正确折叠，适当修饰并且完全具有功能性。合适的哺乳动物宿主细胞的实例包括由古拉兹曼(Gluzman)(细胞(Cell)23:175，1981)描述的COS-7猴肾细胞系，以及能够表达适当的载体的其他细胞系，包括例如L细胞、C127、3T3、中国仓鼠卵巢(CHO)、293、HeLa以及BHK细胞系。哺乳动物表达载体可以包括非转录元件(如复制起点)、连接至待表达的基因上的合适的启动子和增强子以及其他5’或3’侧翼非转录序列和5’或3’非翻译序列，如必要的核糖体结合位点、聚腺苷酸化位点、剪接供体和受体位点以及转录终止序列。用于在昆虫细胞中产生异源蛋白质的杆状病毒系统由卢科(Luckow)和萨莫斯(Summers)，生物/技术(Bio/Technology)6:47(1988)进行了概述。
可以根据任何合适的方法纯化由转化宿主产生的蛋白质。此类标准方法包括色谱法(例如，离子交换、亲和力和尺寸分级柱色谱法等)、离心、差别溶解度或通过用于蛋白质纯化的任何其他标准技术。亲和标签(如六组氨酸、麦芽糖结合结构域、流感包衣序列、谷胱甘肽-S-转移酶等)可以附着至蛋白质上，以允许通过穿过适当的亲和柱而容易地纯化。还可以使用如蛋白水解、核磁共振和x射线晶体学等技术用物理方法表征分离的蛋白质。
例如，可以使用可商购的蛋白质浓缩过滤器(例如，Amicon或Millipore Pellicon超滤装置)首先浓缩来自将重组蛋白分泌进培养基的系统的上清液。浓缩步骤之后，可以将浓缩物施加至适合的纯化基质上。可替代地，可以利用阴离子交换树脂，例如具有悬垂的二乙氨乙基(DEAE)基团的基质或底物。基质可以是丙烯酰胺、琼脂糖、葡聚糖、纤维素或在蛋白质纯化中常用的其他类型。可替代地，可以利用阳离子交换步骤。合适的阳离子交换剂包括包含磺丙基或羧甲基基团的各种不溶性基质。最后，利用疏水性RP-HPLC介质(例如，具有悬垂的甲基或其他脂肪族基团的硅胶)的一个或多个反相高效液相色谱(RP-HPLC)步骤可以用于进一步纯化癌症干细胞蛋白质-Fc组合物。一些或所有前述纯化步骤以不同组合还可以用于提供均质重组蛋白。
可以例如通过最初从细胞沉淀中提取，随后进行一个或多个浓缩、盐析、水性离子交换或尺寸排阻色谱步骤分离在细菌培养物中产生的重组蛋白。高效液相色谱法(HPLC)可以用于最终的纯化步骤。可以通过任何常规方法破坏在表达重组蛋白中利用的微生物细胞，包括冷冻-解冻循环、超声处理、机械破坏或使用细胞裂解剂。
体外肽/多肽合成
本发明还考虑将核酸分子用作将新抗原肽/多肽以例如DNA/RNA疫苗的形式递送给有需要的受试者的媒介物(参见例如，WO 2012/159643和WO 2012/159754，特此通过引用以其全文结合)。
在一个实施例中，可以通过使用质粒将新抗原给予至有需要的患者。存在以下质粒，这些质粒通常由强病毒启动子组成以便驱动目标基因(或互补DNA)的体内转录和翻译(莫尔(Mor)等人，(1995)免疫性杂志(The Journal of Immunology)155(4):2039–2046)。有时可以包括内含子A以便提高mRNA稳定性且因此增加蛋白质表达(莱特纳(Leitner)等人(1997)免疫性杂志159(12):6112–6119)。质粒还包括强聚腺苷酸化/转录终止信号，如牛生长激素或兔β-球蛋白聚腺苷酸化序列(阿拉孔(Alarcon)等人，(1999)寄生虫学进展(Adv.Parasitol.Advances in Parasitology)42:343–410；罗宾逊(Robinson)等人，(2000)病毒研究进展(Adv.Virus Res.Advances in Virus Research)55:1–74；伯姆等人，(1996)免疫方法杂志(Journal of Immunological Methods)193(1):29–40.)。有时构建多顺反子载体以便表达多于一个免疫原，或表达免疫原和免疫刺激蛋白(路易斯(Lewis)等人，(1999)病毒研究进展(学术出版社)54:129–88)。
因为质粒是自其表达免疫原的“媒介物”，所以针对最大蛋白质表达优化载体设计是必不可少的(路易斯等人(1999)病毒研究进展(学术出版社)54:129–88)。增强蛋白质表达的一种方式是通过针对真核细胞优化病原性mRNA的密码子使用。另一考虑是启动子的选择。此类启动子可以是SV40启动子或劳斯肉瘤病毒(RSV)。
可以通过多种不同的方法将质粒引入动物组织中。两种最普遍的方法是使用标准皮下注射针注射盐水中的DNA，以及基因枪递送。构建DNA疫苗质粒及通过这两种方法将其随后递送至宿主中的示意性概要在科学美国人进行了说明(韦纳(Weiner)等人，(1999)科学美国人281(1):34–41)。盐水注射通常在骨骼肌中肌肉内(IM)进行，或皮内(ID)进行，其中DNA被递送至细胞外空间。这可以通过用肌肉毒素如布比卡因暂时损失肌肉纤维通过电穿孔进行帮助；或通过使用盐水或蔗糖的高渗溶液来进行帮助(阿拉孔等人，(1999)寄生虫学进展42:343–410)。对这种递送方法的免疫应答可以受许多因素影响，包括针类型、针对准、注射速度、注射体积、肌肉类型、以及被注射的动物的年龄、性别和生理状况(阿拉孔等人，(1999)寄生虫学进展42:343–410)。
另一种常用的递送方法基因枪递送使用压缩氦作为加速剂以弹道形式将已被吸附到金或钨微颗粒上的质粒DNA(pDNA)加速到靶细胞中(阿拉孔等人，(1999)寄生虫学进展42:343–410；路易斯等人，(1999)病毒研究进展(学术出版社)54:129–88)。
替代递送方法可以包括将裸DNA气溶胶滴注在粘膜(如鼻或肺粘膜)表面上(路易斯等人，(1999)病毒研究进展(学术出版社)54:129–88)和将pDNA局部给予至眼和阴道粘膜(路易斯等人，(1999)病毒研究进展(学术出版社)54:129–88)。还已使用阳离子脂质体DNA制剂、生物可降解微球、用于口服给予至肠粘膜的减毒志贺氏菌或李斯特氏菌载体、以及重组腺病毒载体实现了粘膜表面递送。
递送方法决定用于提升有效免疫应答所需的DNA的剂量。盐水注射要求从10μg至1mg的可变量的DNA，而基因枪递送要求比用于提升有效免疫应答的肌肉内盐水注射少100至1000倍的DNA。一般来说，要求0.2μg–20μg，但是已报道低至16ng的量。这些量因物种而变化，其中小鼠例如需要比灵长类少大约10倍的DNA。盐水注射要求更多的DNA，因为DNA被递送至靶组织的细胞外空间(通常肌肉)，其中它必须在由细胞摄取之前克服物理屏障(举几个实例，如基膜和大量结缔组织)，同时基因枪将轰击DNA直接递送至细胞中，从而产生更少“浪费”(参见例如，Sedegah等人，(1994)美国国家科学院院刊91(21):9866–9870；Daheshia等人，(1997)免疫学杂志159(4):1945–1952；陈(Chen)等人，(1998)免疫性杂志160(5):2425–2432；西泽莫尔(1995)科学(Science)270(5234):299–302；费南(Fynan)等人，(1993)美国国家科学院院刊90(24):11478–82)。
在一个实施例中，瘤形成疫苗或免疫原性组合物可以包括编码例如一种或多种如在根据本发明中鉴别的新抗原肽/多肽的单独的DNA质粒。如在此所讨论的，表达载体的确切选择可以取决于待表达的肽/多肽，并且完全在普通技术人员的技术之内。预期DNA构建体的预期持久性(例如，在肌细胞中以附加型、非复制、非整合形式)提供增加的保护持续时间。
本发明的一种或多种新抗原肽可以使用基于病毒的系统(例如，腺病毒系统、腺相关病毒(AAV)载体、痘病毒或慢病毒)在体内编码和表达。在一个实施例中，该瘤形成疫苗或免疫原性组合物可以包括用于在有需要的人患者中使用的基于病毒的载体，如例如腺病毒(参见例如，巴登(Baden)等人，首次在人中评估重组腺病毒血清型26HIV-1包膜疫苗(IPCAVD 001)的安全性和免疫原性(First-in-human evaluation of the safety andimmunogenicity of a recombinant adenovirus serotype 26HIV-1Env vaccine(IPCAVD001))传染病杂志(J Infect Dis.)2013年1月15日；207(2):240-7，特此通过引用以其全文结合)。先前已描述了可以用于腺相关病毒、腺病毒和慢病毒递送的质粒(参见例如，美国专利号6,955,808和6,943,019，以及美国专利申请号20080254008，特此通过引用而结合)。
在可以用于实践本发明的载体之中，整合在细胞的宿主基因组中可能是用逆转录病毒基因转移方法，经常产生所插入转基因的长期表达。在一个优选实施例中，该逆转录病毒是慢病毒。另外，已经在许多不同细胞类型和靶组织中观察到高转导效率。可以通过掺入外源包膜蛋白，扩展靶细胞的潜在靶群而改变逆转录病毒的向性。还可以对逆转录病毒进行工程化以便允许所插入转基因的条件性表达，这样使得仅某些细胞类型受慢病毒感染。细胞类型特异性启动子可以用于靶向特定细胞类型中的表达。慢病毒载体是逆转录病毒载体(且因此慢病毒载体和逆转录病毒载体两者均可以用于实践本发明)。此外，慢病毒载体是优选的，因为它们能够转导或感染非分裂细胞并典型地产生高病毒效价。因此，逆转录病毒基因转移系统的选择可以取决于于靶组织。逆转录病毒载体由顺式作用长末端重复组成，这些长末端重复具有包装多达6-10kb的外源序列的能力。最低量的顺式作用LTR对于载体的复制和包装而言是足够的，然后使用这些载体将所希望的核酸整合至靶细胞中，以提供永久表达。可以用于实践本发明的广泛使用的逆转录病毒载体包括基于以下的那些：鼠白血病病毒(MuLV)、长臂猿白血病病毒(GaLV)、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、以及其组合(参见例如，布赫谢尔(Buchscher)等人，(1992)病毒学杂志(J.Virol.)66:2731-2739；约翰(Johann)等人，(1992)病毒学杂志66:1635-1640；佐姆内尔费尔特(Sommnerfelt)等人，(1990)病毒学(Virol.)176:58-59；威尔逊(Wilson)等人，(1998)病毒学杂志63:2374-2378；米勒(Miller)等人，(1991)病毒学杂志65:2220-2224；PCT/US94/05700)。邹(Zou)等人通过鞘内导管给予约10μl的具有1×109个转导单位(TU)/ml的滴度的重组慢病毒。此类剂量可以改编或外推至本发明中的逆转录病毒或慢病毒载体的使用。
还适用于本发明的实践中的是最小非灵长类慢病毒载体，如基于马传染性贫血病毒(EIAV)的慢病毒载体(参见例如，巴鲁谷安(Balagaan)，(2006)基因医学杂志(Journalof Gene Medicine)；8:275-285，2005年11月21日在威利在线期刊(Wiley InterScience)(www.interscience.wiley.com)DOI:10.1002/jgm.845)在线公开。这些载体可以具有驱动靶基因表达的巨细胞病毒(CMV)启动子。因此，本发明考虑适用于本发明的实践的一种或多种载体：病毒载体，包括逆转录病毒载体和慢病毒载体。
还适用于本发明的实践的是腺病毒载体。一个优点是重组腺病毒在体外和在体内在多种哺乳动物细胞和组织中有效转移且表达重组基因的能力，从而产生所转移的核酸的高表达。此外，有成效地感染休眠细胞的能力扩展了重组腺病毒载体的效用。此外，高表达水平确保这些核酸的产物将被表达至足够的水平以便产生免疫应答(参见例如，美国专利号7,029,848，特此通过引用结合)。
在在此的一个实施例中，递送是经由腺病毒进行的，其可以是含有至少1×105个腺病毒载体粒子(也称为粒子单位，pu)的单次加强剂量。在在此的一个实施例中，该剂量优选地是该腺病毒载体的至少约1×106个粒子(例如，约1×106-1×1012个粒子)，更优选至少约1×107个粒子，更优选至少约1×108个粒子(例如，约1×108-1×1011个粒子或约1×108-1×1012个粒子)，并且最优选至少约1×109个粒子(例如，约1×109-1×1010个粒子或约1×109-1×1012个粒子)，或者甚至至少约1×1010个粒子(例如，约1×1010-1×1012个粒子)。可替代地，该剂量包含不多于约1×1014个粒子，优选不多于约1×1013个粒子，甚至更优选不多于约1×1012个粒子，甚至更优选不多于约1×1011个粒子，并且最优选不多于约1×1010个粒子(例如，不多于约1×109个粒子)。因此，该剂量可以含有单剂量的腺病毒载体，其具有例如，约1×106粒子单位(pu)，约2×106pu、约4×106pu、约1×107pu、约2×107pu、约4×107pu、约1×108pu、约2×108pu、约4×108pu、约1×109pu、约2×109pu、约4×109pu、约1×1010pu、约2×1010pu、约4×1010pu、约1×1011pu、约2×1011pu、约4×1011pu、约1×1012pu、约2×1012pu、或约4×1012pu的腺病毒载体。参见，例如，在2013年6月4日授权的纳贝尔(Nabel)等人的美国专利号8,454,972B2中的腺病毒载体(通过引用结合在此)以及在其第29栏第36-58行的剂型。在在此的一个实施例中，该腺病毒是经由多剂量递送的。
就体内递送而言，AAV由于低毒性和引起插入诱变的低可能性而优于其他病毒载体，因为它不会整合至宿主基因组中。AAV具有4.5或4.75Kb的包装限制。大于4.5或4.75Kb的构建体导致显著降低的病毒产生。存在可以用于驱动核酸分子表达的许多启动子。AAVITR可以用作启动子并且对于消除另外的启动子元件的需要来说是有利的。对于遍在表达，可以使用以下启动子：CMV、CAG、CBh、PGK、SV40、铁蛋白重链或轻链。对于脑表达，可以使用以下启动子：突触蛋白I用于所有神经元，CaMKIIα用于兴奋性神经元，GAD67或GAD65或VGAT用于γ-氨基丁酸能神经元等。用于驱动RNA合成的启动子可以包括：Pol III启动子如U6或H1。使用Pol II启动子和内含子盒可以用于表达引导RNA(gRNA)。
关于AAV，AAV可以是AAV1、AAV2、AAV5或任何其组合。可以相对于有待被靶向的细胞而选择AAV；例如，可以选择用于靶向脑或神经元细胞的AAV血清型1、2、5或杂合衣壳AAV1、AAV2、AAV5或其任何组合；并且可以选择用于靶向心脏组织的AAV4。AAV8可用于递送到肝脏。以上启动子和载体是单独优选的。
在在此的一个实施例中，该递送是经由AAV进行的。用于针对人的AAV的体内递送的治疗有效剂量被认为处于含有从约1×1010到约1×1050个功能AAV/ml溶液的从约20到约50ml的盐水溶液的范围内。该剂量可以调整以便使治疗益处相对于任何副作用的平衡。在在此的一个实施例中，AAV剂量大致处于从约1×105到1×1050个基因组AAV、从约1×108到1×1020个基因组AAV、从约1×1010到约1×1016个基因组、或约1×1011到约1×1016个基因组AAV的浓度范围内。人剂量可以是约1×1013个基因组AAV。这样的浓度可以按从约0.001ml到约100ml、约0.05到约50ml、或约10到约25ml的载体溶液进行递送。在一个优选实施例中，AAV以约2×1013个病毒基因组/毫升的滴度使用，并且小鼠的每个纹状体半球接受一个500纳升注射。通过建立剂量反应曲线的常规试验，本领域普通技术人员能够容易地确立其他有效剂量。参见，例如，2013年3月26日授权的哈加(Hajjar)等人的美国专利号8,404,658B2，在第27栏第45-60行。
在另一个实施例中，有效地活化瘤形成疫苗或免疫原性组合物的细胞免疫应答可以通过在非病原性微生物中表达疫苗或免疫原性组合物中的相关新抗原来实现。此类微生物的熟知实例是牛分枝杆菌BCG、沙门氏菌和假单胞菌(参见美国专利号6,991,797，特此通过引用以其全文结合)。
在另一个实施例中，痘病毒用于该瘤形成疫苗或免疫原性组合物中。这些包括正痘病毒、禽痘病毒、牛痘、MVA、NYVAC、金丝雀痘、ALVAC、禽痘、TROVAC等。(参见例如，韦拉尔迪(Verardi)等人，人类疫苗免疫疗法(Hum Vaccin Immunother.)2012年7月；8(7):961-70；和莫斯(Moss)，疫苗(Vaccine.)2013；31(39):4220–4222)。痘病毒表达载体在1982年进行了描述并且很快变得广泛用于疫苗开发以及多种领域的研究中。这些载体的优点包括简单构建，能够容纳大量外源DNA和高表达水平。
在另一个实施例中，牛痘病毒用于该瘤形成疫苗或免疫原性组合物中以便表达新抗原。(罗尔夫(Rolph)等人，重组病毒作为疫苗和免疫工具(Recombinant viruses asvaccines and immunological tools.)当前免疫学观点(Curr Opin Immunol)9:517-524，1997)。重组牛痘病毒能够在受感染宿主细胞的细胞质内复制并且所感兴趣的多肽因此能够诱导免疫应答。此外，痘病毒已经广泛用作疫苗或免疫原性组合物载体，这是由于它们靶向编码的抗原以用于通过直接感染免疫细胞(特别是抗原呈递细胞)来由I类主要组织相容性复合物加工的能力，而且还由于它们自佐剂的能力。
在另一个实施例中，ALVAC用作瘤形成疫苗或免疫原性组合物中的载体。ALVAC是可以被修饰以表达外源转基因且已经用作一种针对原核抗原和真核抗原两者疫苗接种的方法的金丝雀痘病毒(Horig H、李(Lee)DS、康克莱特(Conkright)W等人，表达人癌胚抗原和B7.1共刺激分子的重组金丝雀痘病毒(ALVAC)的I期临床试验(Phase I clinical trialof a recombinant canarypoxvirus(ALVAC)vaccine expressing humancarcinoembryonic antigen and the B7.1co-stimulatory molecule.)癌症免疫学与免疫疗法(Cancer Immunol Immunother)2000；49:504–14；冯梅伦M(von Mehren M)、阿伦(Arlen)P、曾(Tsang)KY等人，患有复发性表达CEA的腺癌的患者中含有癌胚抗原(CEA)和B7.1转基因的双基因重组禽痘疫苗的试点研究(Pilot study of a dual generecombinant avipox vaccine containing both carcinoembryonic antigen(CEA)andB7.1transgenes in patients with recurrent CEA-expressing adenocarcinomas.)临床癌症研究(Clin Cancer Res)2000；6:2219–28；米塞(Musey)L、丁(Ding)Y、埃利萨加(Elizaga)M等人，肌肉内给予的HIV-1疫苗接种可以诱导未感染HIV-1个体中的全身性和粘膜T细胞免疫性(HIV-1vaccination administered intramuscularly can induce bothsystemic and mucosal T cell immunity in HIV-1-uninfected individuals.)免疫学杂志2003；171:1094–101；保莱蒂(Paoletti)E.痘病毒载体应用于疫苗接种：一种更新(Applications of pox virus vectors to vaccination:an update.)美国国家科学院院刊1996；93:11349–53；美国专利号7,255,862)。在I期临床试验中，表达肿瘤抗原CEA的ALVAC病毒在选定患者中显示优异安全性特征并且产生增加的CEA特异性T细胞应答；然而，未观察到客观临床应答(马歇尔(Marshall)JL、霍金斯(Hawkins)MJ、曾(Tsang)KY等人，癌症患者中表达人癌胚抗原的复制缺陷型禽痘病毒重组疫苗的I期研究(Phase I study incancer patients of a replication-defective avipox recombinant vaccine thatexpresses human carcinoembryonic antigen.)临床肿瘤学杂志(J Clin Oncol)1999；17:332–7)。
在另一个实例中，修饰的安卡拉痘苗(MVA)病毒可以用作新抗原疫苗或免疫原性组合物的病毒载体。MVA是正痘病毒家族的成员并且已经由牛痘病毒的安卡拉菌株(CVA)的鸡胚成纤维细胞上的约570次连续传代产生(关于综述，参见迈尔(Mayr)A.等人，传染(Infection)3，6-14，1975)。由于这些传代，所得到的MVA病毒包含相较于CVA少31千碱基的基因组信息，并且是高度宿主细胞限制性的(迈耶(Meyer)H.等人，普通病毒学杂志(J.Gen.Virol.)72，1031-1038，1991)。MVA特征在于其极端减毒作用，即特征在于减弱的毒力或感染能力，但是仍然拥有优异免疫原性。当在多种动物模型中进行测试时，MVA被证明是无毒力的，即使在免疫抑制的个体中。此外，是被设计用于治疗HER-2阳性乳腺癌的候选免疫疗法并且当前处于临床试验中。(曼德尔(Mandl)等人，癌症免疫学与免疫疗法(Cancer Immunol Immunother.)2012年1月；61(1):19–29)。已经描述了用于制备和使用重组MVA的方法(例如参见美国专利号8,309,098和5,185,146，特此以其全文结合)。
在另一个实施例中，牛痘病毒的修饰的哥本哈根(Copenhagen)菌株NYVAC和NYVAC变种用作载体(参见美国专利号7,255,862；PCT WO 95/30018；美国专利号5,364,773和5,494,807，特此通过引用以其全文结合)。
在一个实施例中，该疫苗或免疫原性组合物的的重组病毒粒子被给予至有需要的患者。所表达的新抗原的剂量范围可以是从数微克至数百微克，例如，5至500.mu.g。该疫苗或免疫原性组合物可以按任何适合的量给予以便在这些剂量水平实现表达。这些病毒粒子可以以约至少103.5pfu的量给予至有需要的患者或转染至细胞中；因此，这些病毒粒子优选地以至少约104pfu至约106pfu的量给予至有需要的患者或感染或转染至细胞中；然而，有需要的患者可以被给予至少约108pfu，这样使得用于给予的更优选的量可以是至少约107pfu至约109pfu。关于NYVAC的剂量关于ALVAC、MVA、MVA-BN和正痘病毒如金丝雀痘和禽痘是适用的。
疫苗或免疫原性组合物佐剂
有效的疫苗或免疫原性组合物有利地包含强佐剂以便启动免疫应答。如在此所述，聚-ICLC已经显示出疫苗或免疫原性组合物佐剂的若干令人希望的特性，聚-ICLC是TLR3和RNA解旋酶–MDA5和RIG3的结构域的激动剂。这些特性包括在体内诱导免疫细胞的局部和全身性激活，产生刺激性趋化因子和细胞因子以及通过DC刺激抗原呈递。此外，聚-ICLC可以在人体内诱导持久的CD4+和CD8+应答。重要的是，在用聚-ICLC接种的受试者体内和在已经接受高效具复制能力的黄热病疫苗的志愿者体内，在转录和信号转导途径的上调中观察到惊人的相似性。此外，在最近的1期研究中，>90％用与NY-ESO-1肽疫苗(除蒙塔尼德之外)组合的聚-ICLC免疫的卵巢癌患者显示出CD4+和CD8+T细胞的诱导，以及对该肽的抗体应答。同时，迄今已经在超过25个临床试验中广泛地测试了聚-ICLC并且展示出相对良性的毒性特征。除强大且特异性的免疫原之外，这些新抗原肽还可以与佐剂(例如，聚-ICLC)或另一种抗肿瘤剂组合。不受理论束缚，预期这些新抗原绕开中枢胸腺耐受(从而允许较强的抗肿瘤T细胞应答)，同时降低自体免疫性的可能(例如，通过避免靶向正常的自身抗原)。有效的免疫应答有利地包括强佐剂来激活免疫系统(斯派泽(Speiser)和罗梅罗(Romero)，用于癌症免疫疗法的分子水平上定义的疫苗，以及保护性T细胞免疫(Molecularly defined vaccines for cancer immunotherapy,and protective T cellimmunity)免疫学研讨文辑(Seminars in Immunol)22:144(2010))。例如，Toll样受体(TLR)已经作为微生物和病毒病原体“危险信号”的强大传感物，有效地诱导先天免疫系统，并且进而有效地诱导适应性免疫系统(巴德瓦杰(Bhardwaj)和戈恩加特克(Gnjatic)，TLR激动剂：它们是好的佐剂吗？(TLR AGONISTS:Are They Good Adjuvants？)癌症杂志(Cancer J.)16:382-391(2010))。在TLR激动剂之中，聚-ICLC(一种合成双链RNA模拟物)是骨髓衍生的树突细胞的最有效激活剂之一。在一项人类志愿者研究中，已经显示聚-ICLC是安全的并且可在外周血细胞中诱导与通过最有效的减毒活病毒疫苗之一黄热病疫苗YF-17D诱导的基因表达谱可比的基因表达谱(卡斯基(Caskey)等人，合成双链RNA在人体内诱导与活病毒疫苗类似的先天性免疫应答(Synthetic double-stranded RNA inducesinnate immune responses similar to a live viral vaccine in humans)实验医学杂志(J Exp Med)208:2357(2011))。在一个优选实施例中，(一种由Oncovir公司制备的聚-ICLC的GMP制剂)被用作佐剂。在其他实施例中，设想了在此描述的其他佐剂。例如，水包油、油包水或多相W/O/W；参见例如，US 7,608,279和奥库蒂里耶(Aucouturier)等人，疫苗(Vaccine)19(2001)，2666-2672，以及在此引用的文献。
检查点抑制剂
本发明的特征是治疗或预防瘤形成的方法，这些方法包括向受试者给予如在此所述的瘤形成疫苗或免疫原性组合物以及至少一种检查点抑制剂的步骤。因此，可以给予1、2、3、4、5或更多种检查点抑制剂。在某些示例性实施例中，给予一种检查点抑制剂。在其他示例性实施例中，给予2种检查点抑制剂。
佩奇等人(医学年鉴2014.65)总结了在实体肿瘤中研究检查点调节剂的公开的试验。穆拉德(Mullard)A.(药物发现自然评论(Nature Reviews,Drug Discovery.)第12卷，2013年7月)提供了检查点抑制剂的综述。在此提供示例性检查点抑制剂的总结表。
抗CTLA4抗体
细胞毒性T淋巴细胞相关抗原(CTLA-4)(还称为CD152)是用于调控T细胞活化的共抑制分子。
CTLA4最初被鉴别为T细胞表面上的负调控因子，其在起始从头免疫应答或刺激现有应答之后很快上调以便抑制随后免疫T细胞应答且防止自身免疫或不受控制的炎症。因此，发展免疫应答的幅度一直与CTLA4作用密切相关。在某些实施例中，该抗CTLA4抗体是伊匹单抗或曲美木单抗。
检查点抑制剂通过调节T细胞调控的免疫系统内源性机制来起作用。伊匹单抗(YERVOY，百时美施贵宝，纽约，NY)-是单克隆抗体并且是待由美国食品与药品管理局(FDA)批准的第一这种检查点抑制剂-已成为转移性黑色素瘤的标准治疗(霍迪(Hodi)等人，新英格兰医学杂志(N.Engl.J.Med.)363:711–23.2010；罗伯特(Robert)等人，新英格兰医学杂志364:2517–26.2011)。伊匹单抗结合且阻断由T细胞表面共抑制分子细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA-4)介导的抑制性信号传导。因为该作用机制不是对一种肿瘤类型特异性的，并且因为大量临床前数据支持肿瘤免疫监视在多种恶性肿瘤中的作用(安德烈(Andre)等人，临床癌症研究(Clin.Cancer Res.)19:28–33.2013；梅(May)等人，临床癌症研究17:5233–38.2011)，伊匹单抗正作为患有前列腺癌、肺癌、肾癌和乳腺癌以及其他肿瘤类型的患者的一种治疗进行研究。伊匹单抗通过经由靶向CTLA-4激活免疫系统来起作用。
另一种CTLA-4阻断抗体曲美木单抗继续在临床试验中进行研究并且也展示在患有黑色素瘤患者中的持久应答(柯克伍德(Kirkwood)等人，临床癌症研究16:1042–48.2010；里巴斯(Ribas)等人，临床肿瘤学杂志(J.Clin.Oncol.)31:616–22，2013)。
因此，在示例性实施例中，本发明的特征是瘤形成疫苗或免疫原性组合物与一种或多种抗CTLA4抗体的新颖组合。在其他示例性实施例中，本发明的特征还是瘤形成疫苗或免疫原性组合物、伊匹单抗和/或尼沃鲁单抗与一种或多种抗CTLA4抗体的新颖组合。
程序性细胞死亡-1途径的抑制剂
CTLA-4用于调控早期T细胞活化，而程序性死亡-1(PD-1)信号传导部分地用于调控周围组织中的T细胞活化。PD-1受体是指属于CD28家族的免疫抑制性受体。PD-1在包括T调控细胞、活化的B细胞和自然杀伤(NK)细胞的多种细胞类型上表达且主要在体内在先前活化的T细胞上表达，并且结合两种配体PD-L1和PD-L2。PD1的内源性配体PD-L1和PD-L2在活化的免疫细胞以及非造血细胞(包括肿瘤细胞)中表达。如在此使用的PD-1意指包括人PD-1(hPD-1)、hPD-1的变体、同种型和物种同源物、以及与hPD-1具有至少一个共同表位的类似物。完整hPD-1序列可以在GENBANK登录号U64863下找到。程序性死亡配体-1(PD-L1)是在结合PD-1时下调T细胞活化和细胞因子分泌的PD-1的两种细胞表面糖蛋白配体之一(另一者是PD-L2)。如在此使用的PD-L1包括人PD-L1(hPD-L1)、hPD-L1的变体、同种型和物种同源物、以及与hPD-L1具有至少一个共同表位的类似物。完整hPD-L1序列可以在GENBANK登录号Q9NZQ7下找到。肿瘤一直展示通过表达PD-L1/L2逃避免疫监视，从而经由PD-1/PD-L1,2相互作用抑制肿瘤浸润淋巴细胞(董(Dong)等人，自然医学(Nat.Med.)8:793–800.2002)。抑制与治疗性抗体的这些相互作用已经显示增强T细胞应答且刺激抗肿瘤活性(弗里曼(Freeman)等人，实验医学杂志(J.Exp.Med.)192:1027–34.2000)。
本发明的Ab包括但不限于分别在美国专利号8,008,449和7,943,743中披露的所有抗PD-1和抗PD-L1Ab。其他抗PD-1mAb已描述于例如美国专利号7,488,802和8,168,757中，并且抗PD-L1mAb已描述于例如美国专利号7,635,757和8,217,149、以及美国工号2009/0317368中。美国专利号8,008,449例示了七种抗PD-1HuMAb：17D8、2D3、4H1、5C4(在此还称为尼沃鲁单抗或BMS-936558)、4A11、7D3、以及5F4。
在一些实施例中，该抗PD-1抗体是尼沃鲁单抗。尼沃鲁单抗的替代名称包括MDX-1106、MDX-1 106-04、ONO-4538、BMS-936558。在一些实施例中，该抗PD-1抗体是尼沃鲁单抗(CAS登记号：946414-94-4)。
尼沃鲁单抗是针对PD-1的完全人IgG4阻断单克隆抗体(托帕利姆(Topaliam)等人，新英格兰医学杂志366:2443–54.2012)。尼沃鲁单抗特异性地阻断PD-1，其能够克服免疫抵抗力。PD-1的配体已被鉴别为PD-L1(B7-H1)，其在所有造血细胞和许多非造血组织上表达；和PD-L2(B7-DC)，其表达主要限于树突细胞和巨噬细胞(董H.等人1999.自然医学5:1365；弗里曼G.J.等人2000.实验医学杂志192:1027；拉齐曼(Latchman)Y.等人2001.自然免疫学(Nat.Immunol.)2:261；茨奥(Tseng)S.Y.等人2001.实验医学杂志193:839)。PD-L1在许多癌症中过度表达并且通常与不良预后相关(冈崎(Okazaki)T等人，国际免疫学(Intern.Immun.)200719(7):813)(汤普森(Thompson)RH等人，癌症研究2006,66(7):3381)。令人感兴趣地，相较于正常组织中的T淋巴细胞和外周血T淋巴细胞，大多数肿瘤浸润T淋巴细胞主要表达PD-1，从而指示上调肿瘤反应性T细胞上的PD-1能够促成受损的抗肿瘤免疫应答(血液(Blood)2009 1 14(8):1537)。确切的说，因为肿瘤细胞表达PD-L1(一种免疫抑制性PD-1配体)，所以抑制PD-1与PD-L1之间的相互作用能够增强体外T细胞应答并且介导临床前抗肿瘤活性。
涉及尼沃鲁单抗的多个临床试验(I期、II期和III期)已经进行或正在进行(参见clinicaltrials.gov/ct2/results？term＝nivolumab&pg＝1，在2013年12月20日存取)。例如，在I期剂量递增试验中，尼沃鲁单抗是安全的，并且客观应答在肿瘤类型之间是16％–31％，其中最多应答是持久>1年(托帕利姆等人，在美国临床肿瘤学会年会(Annu.Meet.Am.Soc.Clin.Oncol.)上提出，芝加哥，2013年5月31日–6月4日)。在另一研究中，研究了尼沃鲁单抗(抗PD-1，BMS-936558，ONO-4538)与伊匹单抗的组合在患有晚期黑色素瘤患者中的安全性和临床活性(沃夏克(Wolchok)，临床肿瘤学杂志31，2013(增刊；文摘9012 2013ASCO年会))。
两种抗PD-L1抑制性抗体MPDL3280A(基因技术公司(Genentech)，南旧金山，加利福尼亚州)和BMS-936559(百时美施贵宝，纽约，NY)经历了临床研究。与尼沃鲁单抗和MK-3475一样，这些抗体被认为主要通过阻断PD-1/PD-L1信号传导来起作用。不同于PD-1抗体，PD-L1抗体不损害PD-L2与PD-1之间的潜在相互作用，但另外阻断PD-L1与CD80之间的相互作用(帕克(Park)等人，2010.血液116:1291–98)。已在多种肿瘤类型中评价了MPDL3280A，其中在黑色素瘤、肾细胞癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、以及结肠直肠癌、胃癌和头/颈鳞状细胞癌中鉴别了安全性和初步功效(赫布斯特(Herbst)等人美国临床肿瘤学会年会提出，芝加哥，2013年5月31日–6月4日)。类似地，BMS-936559在I期试验中在多种肿瘤类型内显示是安全且临床上活性的。MEDI-4736是当前在临床发展中的另一种PD-L1阻断抗体(NCT01693562)。
除了CTLA-4和PD-1/PD-L1之外，已经在临床前鉴别了多种其他免疫调节性靶标，许多具有正在临床试验中研究的相应治疗性抗体。佩奇等人(医学年评(Annu.Rev.Med.)2014.65)在图1中详述了抗体免疫调节因子的靶标，其通过引用结合在此。
在示例性方面，本发明的特征是瘤形成疫苗或免疫原性组合物与一种或多种PD-1途径抑制剂的新颖组合。在优选的实施例中，PD-1途径的抑制剂是抗PD1抗体，例如尼沃鲁单抗。
在其他示例性方面，本发明的特征还是瘤形成疫苗或免疫原性组合物与尼沃鲁单抗和/或一种或多种抗CTLA4抗体的新颖组合。
适应症
可以用本文献的联合疗法治疗的癌症和癌症病状的实例包括但不限于已被诊断为患有癌症或处于发展癌症的风险的有需要的患者。受试者可能患有实体肿瘤，如乳腺肿瘤、卵巢肿瘤、前列腺肿瘤、肺肿瘤、肾肿瘤、胃肿瘤、结肠肿瘤、睾丸肿瘤、头颈肿瘤、胰腺肿瘤、脑肿瘤、黑色素瘤、以及其他组织器官肿瘤；和血液肿瘤，如淋巴瘤和白血病，包括急性髓性白血病、慢性髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、T细胞淋巴细胞性白血病、以及B细胞淋巴瘤；脑和中枢神经系统的肿瘤(例如，脑脊膜、脑、脊髓、脑神经以及CNS的其他部分的肿瘤，如成胶质细胞瘤或髓质胚细胞瘤)；头和/或颈癌、乳腺肿瘤、循环系统的肿瘤(例如，心脏、纵隔膜和胸膜，以及其他胸内器官、血管肿瘤和肿瘤相关血管组织)；血液和淋巴系统的肿瘤(例如，何杰金氏病、非何杰金氏病淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、AIDS相关淋巴瘤、恶性免疫增生性疾病、多发性骨髓瘤、以及恶性浆细胞肿瘤、淋巴性白血病、骨髓性白血病、畸形或慢性淋巴细胞性白血病、单核细胞性白血病、其他特定细胞类型的白血病、未指明细胞类型的白血病、淋巴的未指明恶性肿瘤，造血和相关组织，如弥漫性大细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤或皮肤T细胞淋巴瘤)；排泄系统(例如，肾、肾盂、输尿管、膀胱、以及其他泌尿器官)的肿瘤；胃肠道(例如，食道、胃、小肠、结肠、结肠直肠、直肠乙状结肠接点、直肠、肛门、以及肛管)的肿瘤；涉及肝和肝内胆管、胆囊、和胆道的其他部分、胰腺、以及其他消化器官的肿瘤；口腔(例如，唇、舌、牙龈、口底、腭、腮腺、唾液腺、扁桃体、口咽、鼻咽、脓样窦、下咽、以及口腔的其他部位)的肿瘤；生殖系统(例如，外阴、阴道、宫颈、子宫、卵巢、以及与女性生殖器官相关的其他部位、胎盘、阴茎、前列腺、睾丸、以及与男性生殖器官相关的其他部位)的肿瘤；呼吸道的肿瘤(例如，鼻腔、中耳、副窦、喉、气管、支气管和肺，如小细胞肺癌和非小细胞肺癌)；骨骼系统(例如，骨和四肢关节软骨、骨关节软骨和其他部位)的肿瘤；皮肤肿瘤(例如，皮肤恶性黑色素瘤、非黑色素瘤皮肤癌、皮肤基底细胞癌、皮肤鳞状细胞癌、间皮瘤、卡波济氏肉瘤)；以及涉及其他组织的肿瘤，包括外周神经和自主神经系统、结缔组织和软组织、腹膜后腔和腹膜、眼、甲状腺、肾上腺、以及其他内分泌腺和相关结构、淋巴结的继发性和未指明的恶性肿瘤、呼吸系统和消化系统的继发性恶性肿瘤、以及其他部位的继发性恶性肿瘤。
具有特殊兴趣的是非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、透明细胞肾细胞癌(ccRCC)、转移性黑色素瘤、肉瘤、白血病或膀胱癌、结肠癌、脑癌、乳腺癌、头颈癌、子宫内膜癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌或前列腺癌的治疗。在某些实施例中，黑色素瘤是高风险黑色素瘤。
可以使用此联合疗法治疗的癌症可以包括用其他化学治疗剂治疗难治的其他病例。如在此使用的术语“难治”是指癌症(和/或其转移)，该癌症在用另一种化学治疗剂治疗之后不显示或仅显示微弱抗增生性应答(例如，无肿瘤生长抑制或仅微弱肿瘤生长抑制)。这些是不能用其他化学治疗剂令人满意地治疗的癌症。难治性癌症不仅涵盖(i)其中一种或多种化学治疗剂已在患者的治疗期间失败的癌症，而且涵盖(ii)可以通过其他方式例如活组织检查和在化学治疗剂存在下培养显示为难治的癌症。
在此描述的联合疗法还适用于治疗先前尚未治疗的有需要的患者。
在受试者不具有可检测的瘤形成但处于疾病复发的高风险的情况下，在此描述的联合疗法也是适用的。
还具有特殊兴趣的是治疗已经历自体造血干细胞移植(AHSCT)的有需要的患者，且特别是在经历AHSCT之后展示残余疾病的患者。AHSCT后背景特征在于较低体积的残余疾病、免疫细胞输注至稳态扩增的状态、以及不存在任何标准延迟复发的疗法。这些特征提供使用所要求保护的瘤形成疫苗或免疫原性组合物和检查点抑制剂组合物来延迟疾病复发的独特机会。
药用组合物/递送方法
本发明还针对以下药用组合物，这些药用组合物包含任选地与药学上可接受的的载体、赋形剂或添加剂组合的有效量的一种或多种根据本发明的化合物(包括其药学上可接受的盐)。
当作为组合给予时，这些治疗剂(即瘤形成疫苗或免疫原性组合物和一种或多种检查点抑制剂)可以被配制成分开的组合物，它们被同时或在不同时间给药，或者这些治疗剂可以作为单一组合物给药。
这些组合物可以每天一次给予、每天两次给予、每两天给予一次、每三天给予一次、每四天给予一次、每五天给予一次、每六天给予一次、每七天给予一次、每两周给予一次、每三周给予一次、每四周给予一次、每两个月给予一次、每六个月给予一次或每年给予一次。可以根据个体患者的需要来调整给药间隔。对于较长间隔的给药，可以使用延长释放或长效配制品。
本发明的组合物可以用来治疗急性的疾病和疾病病状，并且也可以用于治疗慢性病状。具体地说，本发明的组合物在用于治疗或预防瘤形成的方法中使用。
在某些实施例中，给予本发明的化合物持续超过两周、三周、一个月、两个月、三个月、四个月、五个月、六个月、一年、两年、三年、四年、或五年、十年或十五年的时间段；或例如，以天、月或年计的任何时间段范围，其中该范围的下限是14天与15年之间的任何时间段并且该范围的上限在15天与20年之间(例如，4周与15年之间，6个月与20年之间)。在一些情况下，可以有利的是在患者的余生中给予本发明的化合物。在优选实施例中，监测该患者，以检查疾病或病症的进展，并且据此调整剂量。在优选实施例中，根据本发明的治疗有效地持续至少两周、三周、一个月、两个月、三个月、四个月、五个月、六个月、一年、两年、三年、四年、或五年、十年、十五年、二十年或持续受试者的余生。
如在此所描述，在某些实施例中，给予检查点抑制剂在开始给予瘤形成疫苗或免疫原性组合物之前开始。在其他实施例中，给予检查点抑制剂在开始给予瘤形成疫苗或免疫原性组合物之后开始。在仍然其他实施例中，给予检查点抑制剂与开始给予瘤形成疫苗或免疫原性组合物同时开始。
给予检查点抑制剂可以在第一次给予该检查点抑制剂之后每2、3、4、5、6、7、8或更多周继续。应了解第1周意指包括第1-7天，第2周意指包括第8-14天，第3周意指包括第15-21天且第4周意指包括第22-28天。当给药被描述为按每周间隔进行时，其意指大约7天间隔，但是在任何给定周中，该天可以是在计划的天之前或之后的一天或多天。
在某些实施例中，给予检查点抑制剂在给予瘤形成疫苗或免疫原性组合物之前一周期间停止。在其他实施例中，给予检查点抑制剂在给予瘤形成疫苗或免疫原性组合物期间停止。
手术切除使用外科手术来除去癌症中的异常组织，如纵隔、神经性或生殖细胞肿瘤或胸腺瘤。在某些实施例中，给予检查点抑制剂在肿瘤切除之后开始。在其他实施例中，给予瘤形成疫苗或免疫原性组合物在肿瘤切除之后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多周开始。优选地，给予瘤形成疫苗或免疫原性组合物在肿瘤切除之后4、5、6、7、8、9、10、11、或12周开始。
初免/加强方案是指连续给予疫苗或免疫原性或免疫组合物。在某些实施例中，给予瘤形成疫苗或免疫原性组合物是在初免/加强给药方案中，例如给予瘤形成疫苗或免疫原性组合物在第1、2、3或4周作为初免并且给予瘤形成疫苗或免疫原性组合物在在第2、3或4个月作为加强。在另一实施例中，异源初免-加强策略用于引发更大细胞毒性T细胞应答(参见施耐德(Schneider)等人，使用异源初免-加强免疫策略诱导CD8+T细胞(Inductionof CD8+T cells using heterologous prime-boost immunisation strategies)，免疫学评论(Immunological Reviews)第170卷，第1期，第29–38页，1999年8月)。在另一实施例中，编码DNA的新抗原用于初免，接着蛋白质加强。在另一实施例中，蛋白质用于初免，接着用编码新抗原的病毒加强。在另一实施例中，编码新抗原的病毒用于初免，并且另一种病毒用于加强。在另一实施例中，蛋白质用于初免，并且DNA用于加强。在一个优选的实施例中，DNA疫苗或免疫原性组合物用于起动T细胞应答，并且重组病毒疫苗或免疫原性组合物用于增强该应答。在另一个优选的实施例中，病毒疫苗或免疫原性组合物与蛋白质或DNA疫苗或免疫原性组合物共同给予以便充当该蛋白质或DNA疫苗或免疫原性组合物的佐剂。患者然后可以用病毒疫苗或免疫原性组合物、蛋白质、或DNA疫苗或免疫原性组合物加强(参见哈钦斯(Hutchings)等人，蛋白质疫苗与病毒疫苗的组合诱导强效细胞和体液免疫应答和针对鼠疟疾激发的增强的保护(Combination of protein and viral vaccines induces potentcellular and humoral immune responses and enhanced protection from murinemalaria challenge.)传染与免疫(Infect Immun.)2007年12月；75(12):5819-26.电子出版2007年10月1日)。
可以根据药剂学的常规方法加工药用组合物，以产生用于向有需要的患者(包括人和其他哺乳动物)给予的药剂。
新抗原肽的修饰可以影响这些肽的溶解性、生物利用度和代谢率，从而对这些活性种类的递送提供控制。可以通过根据完全在本领域常规从业者的技术内的已知方法制备新抗原肽并测试来评定溶解性。
已发现包含琥珀酸或其药学上可接受的盐(琥珀酸盐)的药用组合物能够提供这些新抗原肽的改进的溶解性。因此，在一方面，本发明提供一种药用组合物，其包含：至少一种新抗原肽或其医药学上可接受的盐；pH调节剂(如碱，如二羧酸盐或三羧酸盐，例如，琥珀酸或柠檬酸的药学上可接受的盐)；以及药学上可接受的载体。此类药用组合物可以通过将包含至少一种新抗原肽的溶液与碱如二羧酸盐或三羧酸盐，如琥珀酸或柠檬酸的药学上可接受的盐(如琥珀酸钠)组合，或通过将包含至少一种新抗原肽的溶液与包含碱如二羧酸盐或三羧酸盐，如琥珀酸或柠檬酸的药学上可接受的盐的溶液(包括例如，琥珀酸盐缓冲溶液)组合来制备。在某些实施例中，该药用组合物包含琥珀酸钠。在某些实施例中，pH调节剂(如柠檬酸盐或琥珀酸盐)以从约1mM至约10mM的浓度，且在某些实施例中以从约1.5mM至约7.5mM、或约2.0至约6.0mM、或约3.75至约5.0mM的浓度存在于该组合物中。
在该药用组合物的某些实施例中，该药学上可接受的载体包含水。在某些实施例中，该药学上可接受的载体进一步包含右旋糖。在某些实施例中，该药学上可接受的载体进一步包含二甲亚砜。在某些实施例中，该药用组合物进一步包含免疫调节剂或佐剂。在某些实施例中，该免疫调节剂或佐剂选自下组，该组由以下各项组成：聚-ICLC、1018ISS、铝盐、Amplivax、AS15、BCG、CP-870,893、CpG7909、CyaA、dSLIM、GM-CSF、IC30、IC31、咪喹莫特、ImuFact IMP321、IS Patch、ISS、ISCOMATRIX、JuvImmune、LipoVac、MF59、单磷酰脂质A、蒙塔尼德(Montanide)IMS 1312、蒙塔尼德ISA 206、蒙塔尼德ISA 50V、蒙塔尼德ISA-51、OK-432、OM-174、OM-197-MP-EC、ONTAK、PEPTEL、载体系统、PLGA微颗粒、瑞喹莫德、SRL172、病毒微体和其他病毒样颗粒、YF-17D、VEGF陷阱、R848、β-葡聚糖、Pam3Cys、以及阿奎拉QS21刺激子。在某些实施例中，该免疫调节剂或佐剂包含聚-ICLC。
咕吨酮衍生物(如例如，Vadimezan或AsA404(亦称5,6-二甲基咕吨酮-4-乙酸(DMXAA)))也可以用作根据本发明的实施例的佐剂。可替代地，此类衍生物还可以例如经由全身性或瘤内递送与本发明的疫苗或免疫原性组合物平行给予，以刺激肿瘤部位处的免疫。不受理论束缚，据信此类咕吨酮衍生物经由IFN基因刺激因子(ISTING)受体通过刺激干扰素(IFN)而起作用(参见例如，康伦(Conlon)等人(2013)小鼠而非人类STING响应于血管阻断剂5,6-二甲基咕吨酮-4-乙酸而结合并进行信号转导(Mouse,but not Human STING,Binds and Signals in Response to the Vascular Disrupting Agent 5,6-Dimethylxanthenone-4-Acetic Acid)，免疫学杂志(Journal of Immunology)，190:5216-25以及金姆(Kim)等人(2013)抗癌黄酮类化合物是小鼠选择性STING激动剂(AnticancerFlavonoids are Mouse-Selective STING Agonists)，8:1396-1401)。
该疫苗或免疫原性组合物还可以包含选自丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物以及马来酸酐与烯基衍生物的共聚物的佐剂化合物。具体地说，它是与糖或多元醇的聚烯基醚交联的、具体地说与烯丙基蔗糖或与烯丙基季戊四醇交联的丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物(卡波姆)。它还可以是例如与二乙烯醚交联的马来酸酐和乙烯的共聚物(参见美国专利号6,713,068，其特此通过引用以其全文结合)。
在某些实施例中，pH调节剂可以使如在此所述的佐剂或免疫调节剂稳定。
在某些实施例中，一种药用组合物包含：一至五种肽、二甲亚砜(DMSO)、右旋糖、水、琥珀酸盐、聚I:聚C、聚-L-赖氨酸、羧甲基纤维素、以及氯化物。在某些实施例中，该一至五种肽各自以300μg/ml的浓度存在。在某些实施例中，该药用组合物包含按体积计≤3％DMSO。在某些实施例中，该药用组合物包含水中的3.6％–3.7％右旋糖。在某些实施例中，该药用组合物包含3.6–3.7mM琥珀酸盐(例如，如琥珀酸钠)。在某些实施例中，该药用组合物包含0.5mg/ml聚I:聚C。在某些实施例中，该药用组合物包含0.375mg/ml聚-L-赖氨酸。在某些实施例中，该药用组合物包含1.25mg/ml羧甲基纤维素钠。在某些实施例中，该药用组合物包含0.225％氯化钠。
药用组合物包含任选地与药学上可接受的添加剂、载体和/或赋形剂组合的处于治疗已经在此描述的疾病和病状(例如，瘤形成/肿瘤)的治疗有效量的在此描述的肿瘤特异性新抗原肽。从本披露和本领域中的知识本领域的普通技术人员应认识到，根据本发明的一种或多种化合物的治疗有效量可以随待治疗的病状、其严重性，待利用的治疗方案、所使用的药剂的药代动力学、以及所治疗的患者(动物或人)而变化。
为了制备根据本发明的药用组合物，优选地根据常规药物配合技术将治疗有效量的一种或多种根据本发明的化合物与药学上可接受的载体密切混合以产生一种剂量。载体可以采取多种多样的形式，取决于希望给予(例如，经眼、口服、局部或胃肠外)的制剂形式，在众多其他形式之间包括凝胶、乳膏、软膏、洗剂以及延时释放可植入制剂。在以口服剂型制备药用组合物中，可以使用一般的药物介质中的任一种。因此，对于液体口服制剂(如悬浮液、酏剂和溶液)，可以使用适合的载体和添加剂，包括水、甘油、油类、醇类、调味剂、防腐剂、着色剂等。对于固体口服制剂(如粉剂、片剂、胶囊剂)以及对于固体制剂(如栓剂)，可以使用适合的载体和添加剂，包括淀粉、糖载体(如葡萄糖、甘露醇、乳糖)和相关载体、稀释剂、造粒剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂等。希望的话，片剂或胶囊剂可以通过标准技术被肠溶包衣或缓释。
活性化合物以足以向患者递送用于希望的适应症的治疗有效量而不在所治疗的患者体内引起严重毒性作用的量被包括在药学上可接受的载体或稀释剂中。
经口组合物通常包含惰性稀释剂或可食用载体。它们可以被封装在明胶胶囊中或被压成片剂。出于口服治疗性给予的目的，可以将活性化合物或其前药衍生物随赋形剂一起掺入并且以片剂、锭剂或胶囊剂的形式使用。可以包括药学上相容的粘合剂和/或佐剂材料作为组合物的一部分。
片剂、丸剂、胶囊剂、锭剂等可以包含以下成分或具有类似性质的化合物中的任一种：粘合剂，如微晶纤维素、黄芪胶或明胶；赋形剂，如淀粉或乳糖；分散剂，如海藻酸或玉米淀粉；润滑剂，如硬脂酸镁；助流剂，如胶体二氧化硅；甜味剂，如蔗糖或糖精；或调味剂，如薄荷、水杨酸甲酯或橙味调味品。当该单位剂型是胶囊剂时，除在此论述的材料之外，它还可以含有液体载体如脂肪油。另外，单位剂型可以包含修饰剂量单位的物理形式的多种其他材料，例如糖、虫胶或肠溶剂的包衣。
适于口服给予的本发明的配制品能以离散单位形式呈现，如各自含有预定量的活性成分的胶囊剂、扁囊剂或片剂；以粉剂或颗粒剂呈现；以水性液体或非水性液体中的溶液或悬浮液呈现；或以水包油液体乳剂或油包水液体乳剂呈现以及以大丸剂呈现等。
片剂可以通过任选地与一种或多种辅助成分压制或模制而制备。压制型片剂可以通过在合适的机器中压制自由流动形式(如粉末或颗粒)的活性成分来制备，任选地与粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、表面活性剂或分散剂混合。模制型片剂可以通过在适合的机器中模制用惰性液体稀释剂润湿的粉状化合物的混合物而制备。片剂任选地可以被包衣或刻痕，并且可以配制以便提供缓慢或控制释放其中的活性成分。
配制药物活性成分的此类缓慢或控制释放组合物的方法在本领域是已知的并且描述于若干公布的美国专利中，其中的一些包括但不限于美国专利号3,870,790；4,226,859；4,369,172；4,842,866以及5,705,190，将其披露以其全文通过引用结合在此。包衣可以用于将化合物递送至肠(参见例如，美国专利号6,638,534、5,541,171、5,217,720和6,569,457，以及其中引用的参考文献)。
活性化合物或其药学上可接受的盐也可以作为酏剂、悬浮液、糖浆剂、薄片(wafer)、口香糖等的组分给予。除活性化合物之外，糖浆剂还可以包含蔗糖或果糖作为甜味剂以及某些防腐剂、染料及着色剂和调味剂。
用于经眼、胃肠外、皮内、皮下或局部应用的溶液或悬浮液可以包括以下组分：无菌稀释剂，如注射用水、盐水溶液、非挥发油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗菌剂，如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，如乙二胺四乙酸；缓冲剂，如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以及用于调节张力的试剂，如氯化钠或葡萄糖。
在某些实施例中，该药学上可接受的载体是水性溶剂，即包含水的溶剂，任选地具有另外的共溶剂。示例性药学上可接受的载体包括水、水中的缓冲溶液(如磷酸盐缓冲盐水(PBS))、以及水中的5％右旋糖(D5W)。在某些实施例中，该水性溶剂进一步包含处于约1％-4％或1％-3％的量的二甲亚砜(DMSO)。在某些实施例中，该药学上可接受的载体是等渗的(即，与体液如血浆具有基本上相同的渗透压)。
在一个实施例中，活性化合物是用保护化合物免于从身体迅速消除的载体制备，如控制释放制剂，包括植入物和微囊化递送系统。可以使用可生物降解的生物相容的聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐类、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯类、聚乳酸以及聚乳酸-共-乙醇酸(PLGA)。鉴于本披露和本领域中的知识，用于制备此类配制品的方法在熟练的技术人员的范围内。
从本披露和本领域中的知识熟练的技术人员应认识到，除片剂之外，还可以配制其他剂型，以提供活性成分的缓慢或控制释放。此类剂型包括但不限于胶囊剂、颗粒剂和软胶囊(gel-cap)。
脂质体悬浮液也可以作为药学上可接受的载体。这些可以根据本领域的普通技术人员已知的方法制备。例如，可以通过将一种或多种适当的脂质溶解在无机溶剂中，然后蒸发该溶剂，从而在容器的表面上留下干燥脂质的薄膜而制备脂质体配制品。然后可以向容器中引入活性化合物的水溶液。然后用手旋动容器，以将脂质材料从容器的侧面释放并且以分散脂质聚集体，从而形成脂质体悬浮液。普通技术人员熟知的其他制备方法也可以在本发明的此方面中使用。
这些配制品可以便利地以单位剂型呈现并且可以通过常规制药技术制备。此类技术包括使活性成分与一种或多种药物载体或赋形剂结合的步骤。通常，通过使活性成分与液体载体或精细分散的固体载体或两者均匀且紧密地结合，并且然后，必要的话，使产品成形，以制备配制品。
适于在口中局部给予的配制品和组合物包括在调味基质(通常是蔗糖和阿拉伯胶或黄芪胶)中包含这些成分的糖锭剂；在惰性基质(如明胶和甘油，或蔗糖和阿拉伯胶)中包含活性成分的软锭剂；以及在适合的液体载体中包含待给予的成分的漱口剂。
适于局部给予至皮肤的配制品可以作为在药学上可接受的载体中包含待给予的成分的软膏、乳膏、凝胶和糊剂呈现。优选的局部递送系统是含有待给予的成分的经皮贴剂。
用于直肠给药的配制品可以作为具有适合的基质(包括例如，可可脂或水杨酸酯)的栓剂呈现。
适于鼻腔给药的配制品(其中载体是一种固体)包括具有例如处于20至500微米范围内的粒度的粗粉，该粗粉以给予嗅剂(即，通过快速吸入)的方式从保持靠近鼻子的粉末容器通过鼻通道而给药。适于例如作为喷鼻剂或作为滴鼻剂而给予的适合的配制品(其中载体是一种液体)包括活性成分的水性或油性溶液。
适于阴道给药的配制品可以作为阴道栓剂、卫生棉条、乳膏、凝胶、糊剂、泡沫或喷雾配制品呈现，其除了活性成分之外还含有例如本领域已知的适当的载体。
胃肠外制剂可以被封装在由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。如果静脉内给予，优选的载体包括例如生理盐水或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。
对于胃肠外配制品，载体通常包括无菌水或氯化钠水溶液，但还可以包括其他成分，这些成分包括协助分散的那些。当然，当要使用无菌水并保持为无菌时，这些组合物和载体也被灭菌。还可以制备可注射悬浮液，在此情况下，可以利用适当的液体载体、悬浮剂等。
适于胃肠外给药的配制品包括水性和非水性无菌注射液，它们可以包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使配制品与预期的受者的血液等渗的溶质；以及水性和非水性无菌悬浮液,它们可以包括悬浮剂和增稠剂。可以使配制品呈现于单位剂量或多剂量容器(例如密封安瓿和小瓶)中，并且可以在冷冻干燥(冻干)条件下储存，仅需要在使用之前即刻添加无菌液体载体(例如注射用水)。临时注射溶液和悬浮液可以由前述种类的无菌粉剂、颗粒剂和片剂制备。
活性化合物的给予范围可以从连续的(静脉滴注)至每天若干口服给药(例如，Q.I.D.)，并且在其他给药途径之中可以包括口服、局部、眼睛或经眼、胃肠外、肌内、静脉内、皮下、经皮(它可以包括渗透增强剂)、经颊和栓剂给予，包括通过眼睛或经眼途径。
可以通过注射、口服、胃肠外、通过吸入喷雾、经直肠、经阴道或局部地在含有常规药学上可接受的载体、佐剂和媒介物的单位剂量配制品中给予该瘤形成疫苗或免疫原性组合物和该至少一种检查点抑制剂、以及任何另外的药剂。如在此所使用的术语胃肠外包括进入一个或多个淋巴结、皮下的、静脉内的、肌内的、胸骨内的、输注技术、腹膜内地、眼睛或经眼的、玻璃体内的、颊内的、经皮的、鼻内的、进入脑(包括颅内的和硬膜内的)、进入关节(包括脚踝、膝盖、臀部、肩、肘、腕)、直接进入肿瘤等，以及处于栓剂形式。
在某些实施例中，静脉内或皮下给予该疫苗或免疫原性组合物或该一种或多种检查点抑制剂。
主题治疗剂的应用可以是局部的，以便在感兴趣的部位给药。在某些实施例中，在该瘤形成疫苗或免疫原性组合物的给药部位附近皮下给予该检查点抑制剂，例如在该疫苗或免疫原性组合物给药部位的约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10cm内，且优选地在该瘤形成疫苗或免疫原性组合物的给药部位的5cm内。给予这些组合物的本领域的技术人员应了解给予至受试者的检查点抑制剂的浓度可以基于给药位置而改变。例如，如果在该瘤形成疫苗或免疫原性组合物的给药部位附近给予检查点抑制剂，则可以降低该检查点抑制剂的浓度。
各种技术可以用于在感兴趣的部位提供主题组合物，如注射、使用导管、套管针、抛射体(projectile)、普朗尼克(pluronic)凝胶、支架、缓释药物释放聚合物或提供用于内部进入的其他装置。当由于从患者体内切除而可以得到一个器官或组织时，可以将这样的器官或组织浸泡在包含主题组合物的培养基中，可以将主题组合物涂在该器官上，或可以按任何便利的方式来应用。
可以通过以下装置给予肿瘤特异性新抗原肽，该装置适于以有效获得希望的局部或全身性生理或药理作用的方式控制释放且持续释放组合物。该方法包括将缓释药物递送系统放置在希望释放药剂的区域并且允许该药剂穿过该装置到达希望的治疗区域。
可以将这些肿瘤特异性新抗原肽与至少一种已知的其他治疗剂或所述药剂的药学上可接受的盐组合利用。可以用于联合疗法的已知治疗剂的实例包括但不限于皮质甾类(例如，可的松、泼尼松、地塞米松)，非甾体抗炎药(NSAIDS)(例如，布洛芬、塞来昔布、阿司匹林、吲哚美辛、萘普生)，烷基化剂(如白消安、顺铂、丝裂霉素C及卡铂)；抗有丝分裂剂，如秋水仙碱、长春碱、紫杉醇及多西他赛；拓扑异构酶I抑制剂，如喜树碱和托泊替康；拓扑异构酶II抑制剂，如多柔比星和依托泊苷；和/或RNA/DNA抗代谢物，如5-氮杂胞苷、5-氟尿嘧啶和甲氨蝶呤；DNA抗代谢物，如5-氟-2′-脱氧-尿苷、阿糖胞苷、羟基脲及硫鸟嘌呤；抗体，如HERCEPTIN和RITUXAN。
应当理解的是，关于正在讨论的配制品的类型，除在此具体提及的成分之外，本发明的配制品还可以包括在本领域中常规的其他试剂，例如，适于口服给药的那些还可以包括调味剂。
药学上可接受的盐形式可以是用于包含在根据本发明的药用组合物中的根据本发明的化合物的优选化学形式。
本发明化合物或其衍生物(包括这些药剂的前药形式)可以按药学上可接受的盐形式提供。如在此所使用的，术语药学上可接受的盐或复合物是指保留本发明化合物的希望的生物活性并且对正常细胞展示出有限的毒理学作用的根据本发明的活性化合物的适当的盐或复合物。此类盐的非限制性实例是(a)与无机酸(例如，盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、硝酸等)形成的酸加成盐，和与有机酸形成的盐，这些有机酸尤其是如乙酸、草酸、酒石酸、琥珀酸、苹果酸、抗坏血酸、苯甲酸、鞣酸、扑酸、海藻酸及聚谷氨酸；(b)与金属阳离子形成的碱加成盐，在众多其他阳离子之间这些金属阳离子是如锌、钙、钠、钾等。
在此的化合物是可商购的或可以合成。如本领域技术人员可理解的，对于本领域的普通技术人员而言合成具有在此的化学式的化合物的另外的方法是明显的。另外，各种合成步骤可以按交替顺序或次序进行，以得到希望的化合物。在合成在此描述的化合物中有用的合成化学转化和保护基团方法论(保护和脱保护)在本领域是已知的并且包括例如如描述于以下文献中的那些：R.拉罗克(R.Larock)，综合有机转化(ComprehensiveOrganic Transformations)，第2版，威利-VCH出版商(Wiley-VCH Publishers)(1999)；T.W.格林(Greene)、P.G.M.伍兹(Wuts)，有机合成中的保护基(Protective Groups inOrganic Synthesis)，第3版，约翰·威利父子公司(John Wiley and Sons)(1999)；L.菲泽(L.Fieser)和M.菲泽(M.Fieser)，用于有机合成的双菲泽试剂(Fieser and Fieser’sReagents for Organic Synthesis)，约翰·威利父子公司(1999)；以及L.帕克特(L.Paquette)编辑，有机合成试剂百科全书(Encyclopedia of Reagents for OrganicSynthesis)，约翰·威利父子公司(1995)，及其后续版本。
剂量
当将在此描述的这些药剂作为药物给予人或动物时，可以将它们以其本身给予或作为包含与药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂组合的活性成分的组合物给予。
本发明的药用组合物中的活性成分的给予的实际剂量水平和时程可以变化，以便获得以下量的活性成分，该量对于具体患者、组合物和给药方式而言可有效地达到希望的治疗应答，而对该患者没有毒性。通常，以足以减少或消除与病毒感染和/或自身免疫性疾病相关的症状的量给予本发明的药剂或药用组合物。
药剂的优选剂量是患者可承受的并且不产生严重或不可接受的副作用的最大量。
有效量的确定是完全在本领域的普通技术人员的能力之内，尤其是根据于此提供的具体披露。通常，通过以下方式确定药剂的有功效量或有效量：首先给予低剂量的这种或这些药剂并且然后递增地增加给予的剂量或剂量值直到在具有最少的或可接受的有毒副作用的情况下在所治疗的受试者体内观察到希望的效果(例如，减少或消除与病毒感染或自身免疫性疾病相关的症状)。用于确定本发明的药用组合物的给予的适当剂量与给药方案的适用方法描述于例如古德曼和吉尔曼氏疗法药理基础(Goodman and Gilman’s ThePharmacological Basis of Therapeutics)，古德曼(Goodman)等人编辑，第11版，麦格劳希尔(McGraw-Hill)2005，以及雷明顿：药剂学科学与实践(Remington:The Science andPractice of Pharmacy)，第20和21版，热纳罗(Gennaro)与费城科技大学(University ofthe Sciences in Philadelphia)编辑，利平科特·威廉斯&威尔金斯出版社(2003和2005)，将其各自通过引用而特此结合。
优选的单位剂量配制品是含有给予成分的如在此论述的每日剂量或单位、每日亚剂量、或其适当部分的那些。
用本发明的肿瘤特异性新抗原肽和/或本发明的组合物治疗病症或疾病的给药方案基于多种因素，包括疾病的类型，患者的年龄、体重、性别、医学病症，病症的严重性，给药途径以及利用的具体化合物。因此，给药方案可以广泛地变化，但是可以使用标准方法常规地确定。
向受试者给予的量和给药方案可以取决于多种因素，如给药方式、正在治疗的病状的性质、正在被治疗的受试者的体重、以及开处方医生的判断；从本披露和本领域中的知识所有此类因素在熟练的技术人员的范围内。
包括在根据本发明的治疗活性配制品内的化合物的量是用于治疗疾病或病状的有效量。
通常，对患者而言，剂型中的本发明优选化合物的治疗有效量的范围通常是从稍微小于约0.025mg/kg/天至约2.5g/kg/天，优选约0.1mg/kg/天至约100mg/kg/天或多得多，这取决于使用的化合物、治疗的病状或感染和给药途径，但是本发明也考虑到了此剂量范围的例外情况。以其最优选的形式，按范围从约1mg/kg/天至约100mg/kg/天的量给予根据本发明的化合物。化合物的剂量可以取决于正在治疗的病症、具体化合物和其他临床因素，如患者的体重和状况和化合物的给药途径。应当理解的是，本发明可用于人用和兽用两者。
根据某些示例性实施例，以约10μg-1mg/新抗原肽的剂量给予该疫苗或免疫原性组合物。根据某些示例性实施例，以约10μg-2000μg/新抗原肽的平均每周剂量水平给予该疫苗或免疫原性组合物。根据某些示例性实施例，以约0.1-10mg/kg的剂量给予该检查点抑制剂。根据某些示例性实施例，以约1mg/kg-3mg/kg的剂量给予该抗CTLA4抗体。例如，在某些示例性实施例中，尼沃鲁单抗以3mg/kg的标准单一药剂给药水平给药。当该一种或多种检查点抑制剂被给予在该疫苗或免疫原性组合物的给药部位时，优选地以约0.1-1mg/该瘤形成疫苗或免疫原性组合物的给药部位的剂量给予该抑制剂。
优选的实施例使用在检查点抑制剂的临床试验中使用的浓度和定时，单独地或与新抗原疫苗或免疫原性组合物组合。托帕利安等人，新英格兰医学杂志2012；366:2443-2454描述了评定BMS-936558在患有选定晚期实体肿瘤的有需要的患者中的安全性、抗肿瘤活性和药代动力学的I期研究，BMS-936558是针对PD-1的一种完全人IgG4阻断单克隆抗体。在每个8周治疗循环的每2周作为静脉内输注给予该抗体。在每个治疗循环之后评定应答。患者接受治疗持续达2年(12个循环)。募集了患有晚期黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾细胞癌、去势抗性前列腺癌或结肠直肠癌的患者。随后以1.0、3.0或10.0mg/千克体重的剂量募集了每剂量水平三至六名患者的组。初始地，对于黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾细胞癌、去势抗性前列腺癌、以及结肠直肠癌，以10.0mg/千克的剂量募集了各自大约16名患者的五个扩展组。基于初始活性信号，对于黑色素瘤(以1.0或3.0mg/千克的剂量，接着组随机分配至0.1、0.3或1.0mg/千克)、肺癌(具有鳞状或非鳞状亚型的患者，随机分配至1.0、3.0或10.0mg/千克的剂量)、以及肾细胞癌(以1.0mg/千克的剂量)募集了各自大约16名患者的另外扩展组。
沃夏克等人，新英格兰医学杂志2013；369:122-133描述了在晚期黑色素瘤中使用尼沃鲁单抗加伊匹单抗的临床试验。在该研究中，患者每3周给予静脉内剂量的尼沃鲁单抗和伊匹单抗持续4个剂量，接着每3周单独尼沃鲁单抗持续4个剂量。随后每12周给予联合治疗持续达8个剂量。在后续方案中，先前用伊匹单抗治疗的患者每2周接受尼沃鲁单抗持续达48个剂量。与可接受水平的不良事件相关的最大剂量是1mg/千克体重的剂量的尼沃鲁单抗和3mg/千克剂量的伊匹单抗。
沃夏克等人，临床癌症研究15,7412；2009描述了使用伊匹单抗的II期临床试验项目。将患者用诱导疗法(伊匹单抗10mg/kg每3wk×4)、接着在合适患者中维持疗法(伊匹单抗10mg/kg每12wk，在第24周开始)治疗。
哈米德(Hamid)等人，新英格兰医学杂志2013；369:134-144描述了在黑色素瘤中使用兰布罗利珠单抗(抗PD-1)的安全性和肿瘤应答。以10mg/千克体重每2或3周或2mg/千克每3周的剂量向患有晚期黑色素瘤的患者静脉内给予兰布罗利珠单抗。患者包括已接受了使用免疫检查点抑制剂伊匹单抗的先前治疗的那些和未曾接受该治疗的那些。
斯皮吉尔(Spigel)等人，临床肿瘤学杂志31,2013(增刊；abstr 8008)描述了靶向PD-L1的MPDL3280A的I期试验，MPDL3280A是一种含有被设计用于优化功效和安全性的工程化的Fc结构域的人单克隆Ab。患有鳞状或非鳞状NSCLC的患者通过静脉内接受1-20mg/kg之间剂量的MPDL3280A持续达1年。
活性化合物在药物组合物中的浓度将取决于该药物的吸收、分布、失活和排泄速率以及本领域的普通技术人员已知的其他因素。应当指出的是，剂量值还随待缓解病症的严重性而变化。应该进一步理解的是针对任何具体受试者，特定的给药方案应该根据个体需要和给予组合物的或监督组合物给药的人的专业判断而随时间进行调整，并且在此列出的浓度范围仅仅是示例性的，并不旨在限制所要求的组合物的范围或实践。活性成分可以一次给予，或可以分成有待以不同时间间隔给予的许多较小剂量。
本发明提供含有至少一种在此描述的肿瘤特异性新抗原的药用组合物。在实施例中，这些药用组合物包含药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂，该载体、赋形剂或稀释剂包括任何药剂，该药剂本身对接受该组合物的受试者不引起有害的免疫应答的产生，并且可以给予而无异常毒性。如在此所使用的，术语“药学上可接受的”意指由联邦或州政府的监管机构批准的或者美国药典、欧洲药典或其他公认药典中列出的在哺乳动物中，并且更具体是在人中使用的。这些组合物可以适用于治疗和/或预防病毒感染和/或自身免疫性疾病。
对药学上可接受的载体、稀释剂以及其他赋形剂的全面讨论呈现于雷明顿的药物科学(Remington’s Pharmaceutical Sciences)(第17版，马克出版公司)和雷明顿：药剂学科学与实践(Remington:The Science and Practice of Pharmacy)(第21版，利平科特·威廉斯&威尔金斯出版社(Lippincott Williams&Wilkins))中，将其通过引用而特此结合。该药用组合物的配制应该适合于给药方式。在实施例中，该药用组合物适于给予至人，并且可以是无菌的、非微粒的和/或无热源的。
药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂包括但不限于生理盐水、缓冲生理盐水、葡萄糖、水、甘油、乙醇、无菌等渗水性缓冲液及其组合。
这些组合物中还可以存在湿润剂、乳化剂和润滑剂(如月桂基硫酸钠与硬脂酸镁)以及着色剂、脱模剂、包衣剂、甜味剂、调味剂以及芳香剂、防腐剂和抗氧化剂。
药学上可接受的抗氧化剂的实例包括但不限于：(1)水溶性抗氧化剂，如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基羟基茴香醚(BHA)、丁基羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；以及(3)金属螯合剂，如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。
在实施例中，该药用组合物是以固体形式(如适于复水的冻干粉)、液体溶液、悬浮液、乳剂、片剂、丸剂、胶囊剂、缓释配制品或粉剂提供。
在实施例中，该药用组合物是以液体形式提供，例如，在指示该药用组合物中的活性成分的量和浓度的密封容器内。在相关实施例中，该药用组合物的液体形式是在熔封容器中提供。
用于配制本发明的药用组合物的方法是常规的并且在本领域是熟知的(参见雷明顿和雷明顿氏)。本领域的普通技术人员可以容易地配制具有所希望特征(例如，给药途径、生物安全性和释放谱)的药用组合物。
用于制备这些药用组合物的方法包括将活性成分与药学上可接受的载体以及任选地一种或多种辅助成分结合的步骤。可以通过使活性成分与液体载体或精细分散的固体载体或两者均匀且紧密地结合，并且然后，必要的话，使产品成形，以制备药用组合物。用于制备药用组合物(包括制备多层剂)的另外的方法描述于安塞尔氏药物剂型和药物递送系统(Ansel’s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems)(第9版，利平科特·威廉斯&威尔金斯出版社)中，将其通过引用而特此结合。
适于口服给予的药用组合物可以呈胶囊剂、扁囊剂、丸剂、片剂、糖锭剂(使用调味基质，通常是蔗糖和阿拉伯胶或黄芪胶)、粉剂、颗粒剂的形式，或作为水性或非水性液体中的溶液或悬浮液，或作为水包油或油包水液体乳剂，或作为酏剂或糖浆剂，或作为软锭剂(使用惰性基质，如明胶和甘油，或蔗糖和阿拉伯胶)和/或作为漱口剂等，各自包含预定量的在此描述的一种或多种化合物、其衍生物，其药学上可接受的盐或前药作为一种或多种活性成分。该活性成分还可以作为大丸剂、药糖剂或糊剂给予。
在用于口服给予的固体剂型(例如，胶囊剂、片剂、丸剂、糖衣丸、粉剂、颗粒剂等)中，该活性成分与一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂(如柠檬酸钠或磷酸二钙)和/或任何以下项混合：(1)填充剂或增充剂，如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇、和/或硅酸；(2)粘合剂，如例如羧甲基纤维素、海藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和/或阿拉伯胶；(3)湿润剂，如甘油；(4)崩解剂，如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠；(5)溶解阻滞剂，如石蜡；(6)吸收促进剂，如季铵化合物；(7)湿润剂，如例如乙酰醇和单硬脂酸甘油酯；(8)吸附剂，如高岭土和膨润土；(9)润滑剂，如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、月桂基硫酸钠及其混合物；以及(10)着色剂。在胶囊剂、片剂和丸剂的情况下，这些药用组合物还可以包含缓冲剂。类似类型的固体组合物还可以使用填充剂和赋形剂(如乳糖(lactose)或乳糖(milk sugar))以及高分子量聚乙二醇等在软填充和硬填充的明胶胶囊中制备。
片剂可以通过任选地与一种或多种辅助成分压制或模制而制备。压制型片剂可以使用粘合剂(例如，明胶或羟丙基甲基纤维素)、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、崩解剂(例如，淀粉乙醇酸钠或交联的羧甲基纤维素钠)、表面活性剂和/或分散剂而制备。模制型片剂可以通过在适合的机器中模制用惰性液体稀释剂润湿的粉状活性成分的混合物而制备。
这些片剂以及其他固体剂型(如糖衣丸、胶囊剂、丸剂及颗粒剂)可以任选地被刻痕或用包衣和壳来制备，如肠溶包衣以及本领域熟知的其他包衣。
在一些实施例中，为了延长活性成分的效果，希望的是减缓皮下或肌内注射的化合物的吸收。这可以通过使用晶体的液体悬浮液或水溶性差的非晶体材料来达成。这样，活性成分的吸收速率取决于其溶解速率，而溶解速率又可以取决于晶体尺寸和晶型。可替代地，通过将胃肠外给予的活性成分溶解或悬浮于油载体中来实现该化合物的延迟吸收。另外，可以通过包含延迟吸收的试剂(如单硬脂酸铝和明胶)来实现可注射的药物形式的延长吸收。
控释的胃肠外组合物可以呈水性悬浮液、微球、微胶囊、磁性微球、油溶液、油悬浮液、乳液的形式，或者该活性成分可以被掺入一种或多种生物相容性载体、脂质体、纳米颗粒、植入物或灌输装置。
用于在制备微球和/或微胶囊中使用的材料包括可生物降解的/生物可蚀解的聚合物，如羟乙酸乳酸聚酯、聚-(氰基丙烯酸异丁酯)、聚(2-羟基乙基-L-谷氨酰胺)以及聚(乳酸)。
当配制控释的胃肠外配制品时，可以使用的生物相容载体包括碳水化合物(如葡聚糖)、蛋白质(如白蛋白)、脂蛋白或抗体。
用于在植入物中使用的材料可以是不可生物降解的(例如聚二甲基硅氧烷)或可生物降解的(例如聚(己内酯)、聚(乳酸)、聚(乙醇酸)或聚(原酸酯))。
在实施例中，这种或这些活性成分是通过气溶胶给予的。这是通过制备湿气溶胶、脂质体制剂或含有该化合物的固体颗粒来实现的。可以使用非水性(例如，氟碳推进剂)悬浮液。该药用组合物还可以使用声波喷雾器来给予，该声波喷雾器将使该试剂对剪切的暴露最小化，这种剪切可以导致该化合物的降解。
通常，湿气溶胶是通过将这种或这些活性成分与常规的药学上可接受的载体和稳定剂一起配制水性溶液或悬浮液来制备的。这些载体和稳定剂随具体化合物的要求而变化，但是典型地包括非离子表面活性剂(吐温类(Tweens)、普朗尼克类(Pluronics)或聚乙二醇)、无毒蛋白质(像血清白蛋白)、脱水山梨糖醇酯、油酸、卵磷脂、氨基酸(如甘氨酸)、缓冲液、盐类、糖类或糖醇类。气溶胶通常从等渗溶液制备。
用于局部或经皮给予一种或多种活性成分的剂型包括粉剂、喷雾剂、软膏、糊剂、乳膏、洗剂、凝胶、溶液、贴剂以及吸入剂。这种或这些活性成分可以在无菌条件下与药学上可接受的载体，以及与任何适当的防腐剂、缓冲剂或推进剂混合。
适于在本发明中使用的经皮贴剂披露于经皮药物递送：研发问题与研究倡议(Transdermal Drug Delivery:Developmental Issues and Research Initiatives)(马塞尔·德克尔公司(Marcel Dekker Inc.)，1989)和美国专利号4,743,249、4,906,169、5,198,223、4,816,540、5,422,119、5,023,084中，将其通过引用而特此结合。该经皮贴剂还可以是本领域熟知的任何经皮贴剂，包括经阴囊贴剂。处于此类经皮贴剂形式的药用组合物可以包含本领域熟知的一种或多种吸收促进剂或皮肤渗透促进剂(参见例如，美国专利号4,379,454和4,973,468，其特此通过引用而结合)。用于在本发明中使用的经皮治疗系统可以基于离子导入法、扩散或这两种作用的组合。
经皮贴剂具有另外的优点,即提供一种或多种活性成分至身体的受控递送。此类剂型可以通过将这种或这些活性成分溶解或分散于适当介质中来制备。吸收促进剂还可以用来增加该活性成分穿过皮肤的流量。此流量速率可以通过提供一种速率控制膜或将这种或这些活性成分分散在聚合物基质或凝胶中来进行控制。
此类药用组合物可以呈以下形式：乳膏、软膏、洗剂、搽剂、凝胶、水凝胶、溶液、悬浮液、粘贴剂、喷雾剂、糊剂、硬膏剂以及其他种类的经皮药物递送系统。这些组合物还可以包含药学上可接受的载体或赋形剂，如乳化剂、抗氧化剂、缓冲剂、防腐剂、致湿剂、渗透促进剂、螯合剂、胶凝剂、软膏基质、香料以及皮肤保护剂。
乳化剂的实例包括但不限于天然存在的树胶(例如阿拉伯树胶或黄芪树胶)、天然存在的磷脂(例如大豆卵磷脂)以及脱水山梨糖醇单油酸酯衍生物。
抗氧化剂的实例包括但不限于丁基羟基茴香醚(BHA)、抗坏血酸及其衍生物、生育酚及其衍生物以及半胱氨酸。
防腐剂的实例包括但不限于对羟基苯甲酸酯(如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯)以及氯化苄烷铵。
致湿剂的实例包括但不限于甘油、丙二醇、山梨糖醇以及脲。
渗透促进剂的实例包括但不限于丙二醇、DMSO、三乙醇胺、N,N-二甲基乙酰胺、N,N-二甲基甲酰胺、2-吡咯烷酮及其衍生物、四氢糠醇、丙二醇、二甘醇单乙基醚或单甲基醚连同单月桂酸丙二醇酯或月桂酸甲酯、桉油精、卵磷脂、TRANSCUTOL、以及AZONE。
螯合剂的实例包括但不限于EDTA钠、柠檬酸以及磷酸。
胶凝剂的实例包括但不限于卡波姆、纤维素衍生物、膨润土、海藻酸盐、明胶以及聚乙烯吡咯烷酮。
除这种或这些活性成分之外，本发明的这些软膏、糊剂、乳膏以及凝胶还可以包含赋形剂(如动物和植物脂肪)、油类、蜡类、石蜡、淀粉、黄芪胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨润土、硅酸、滑石以及氧化锌或其混合物。
粉剂和喷雾剂可以包含赋形剂，如乳糖、滑石、硅酸、氢氧化铝、硅酸钙以及聚酰胺粉末或这些物质的混合物。喷雾剂可以另外包含通常的推进剂，如氯氟烃，以及挥发性未经取代的烃类，如丁烷和丙烷。
可注射长效形式是通过在可生物降解聚合物(如聚丙交酯-聚乙交酯)中形成一种或多种化合物的微胶囊基质来制备的。根据化合物与聚合物的比率以及所利用的具体聚合物的性质，可以控制化合物的释放速率。其他可生物降解的聚合物的实例包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)。还通过将药物包埋在与身体组织相容的脂质体或微乳液中来制备长效可注射配制品。
皮下植入物在本领域是熟知的并且适于在本发明中使用。皮下植入方法优选是非刺激性的并且是具机械弹性的。这些植入物可以是基质型(matrix type)、贮存型(reservoir type)，或其杂合体。在基质型装置中，该载体材料可以是多孔的或无孔的、固体的或半固体的、以及对这种或这些活性化合物是可透过的或不可透过的。该载体材料可以是可生物降解的或可以在给予后缓慢腐蚀。在一些情况下，该基质是不可降解的，而是依赖于该活性化合物扩散通过该基质来使该载体材料降解。可替代的皮下植入方法利用贮存装置，其中这种或这些活性化合物被一种速率控制膜包围，例如一种独立于组分浓度的膜(具有零级动力学)。由被一种速率控制膜包围的基质组成的装置也适合使用。
贮存型和基质型两种装置都可以包含多种材料，如聚二甲基硅氧烷(如SILASTIC)或其他硅酮橡胶。基质材料可以是不溶性聚丙烯、聚乙烯、聚氯乙烯、乙酸乙基乙烯酯、聚苯乙烯与聚甲基丙烯酸酯，以及硬脂酸棕榈酸甘油酯、硬脂酸甘油酯和山萮酸甘油酯类型的甘油酯。材料可以是疏水性或亲水性聚合物并且任选地包含增溶剂。
皮下植入装置可以是用任何合适的聚合物制造的缓释胶囊，例如如描述于美国专利号5,035,891和4,210,644中，将其通过引用而特此结合。
通常，为了提供对药物化合物的释放以及经皮透过的速率控制，至少四种不同方法是适用的。这些方法是：缓调膜系统(membrane-moderated system)、受控粘合扩散系统(adhesive diffusion-controlled system)、基质分散类型系统(matrix dispersion-type system)以及微贮存室系统(microreservoir system)。应理解的是，通过使用这些方法的合适混合可以获得受控释放的经皮和/或局部组合物。
在缓调膜系统中，该活性成分存在于一种贮存室中，该贮存室完全囊化在一种浅隔间中，该浅隔间从一种药物不可透过的层压板(如金属塑料层压板)以及一种速率控制聚合膜(如微孔或无孔聚合膜，例如乙烯-乙酸乙烯酯共聚物)模制而来。该活性成分通过该速率控制聚合膜而得以释放。在该药物贮存室中，该活性成分可以被分散在固体聚合物基质中或悬浮于不可浸出的粘稠液体基质(如硅酮液)中。在该聚合膜的外表面上，施加一种粘合聚合物薄层以实现该经皮系统与皮肤表面紧密接触。该粘合聚合物优选是一种低变应原性的并且与该活性药物物质相容的聚合物。
在受控粘合扩散系统中，该活性成分的贮存室是通过以下来形成：直接将该活性成分分散在粘合聚合物中并且然后通过例如溶剂浇铸，将该含有该活性成分的粘合聚合物散布在药物基本上不可透过的金属塑料衬背平板上以形成一种薄的药物贮存室层。
基质分散类型系统的特征在于：该活性成分的贮存室是通过基本上均相地将该活性成分分散在亲水性或亲脂性聚合物基质中来形成。然后将该含药物聚合物模制成盘，该盘具有基本上良好界定的表面区域以及受控的厚度。该粘合聚合物沿圆周伸展以形成围绕该盘的一条粘性物。
微贮存室系统可以被认为是贮存室与基质分散类型系统的组合。在此情况下，该活性物质的贮存室是通过以下来形成：首先将药物固体悬浮在水溶性聚合物的水溶液中并且然后将该药物悬浮液分散在亲脂性聚合物中以形成大量不可浸出的药物贮存室微小球。
可以配制任何在此描述的受控释放、延长释放以及持续释放组合物来在约30分钟至约1周内、在约30分钟至约72小时内、在约30分钟至24小时内、在约30分钟至12小时内、在约30分钟至6小时内、在约30分钟至4小时内以及在约3小时至10小时内释放该活性成分。在实施例中，这种或这些活性成分的有效浓度在将这些药用组合物给予受试者之后在该受试者体内持续4小时、6小时、8小时、10小时、12小时、16小时、24小时、48小时、72小时或更长时间。
疫苗或免疫原性组合物
本发明涉及联合治疗的方法。该联合治疗包括至少一种免疫原性组合物，例如能够引起特异性T细胞应答的瘤形成疫苗或免疫原性组合物。该瘤形成疫苗或免疫原性组合物包含对应于通过在此所述的方法鉴别的肿瘤特异性新抗原的新抗原肽和/或新抗原多肽。该组合治疗还包括至少一种检查点抑制剂。具体地说，本发明涉及治疗或预防瘤形成的方法，这些方法包括向受试者给予(a)瘤形成疫苗或免疫原性组合物以及(b)至少一种检查点抑制剂的步骤。
适合的瘤形成疫苗或免疫原性组合物可以优选地包含多种肿瘤特异性新抗原肽。在一个实施例中，该疫苗或免疫原性组合物可以包含1与100组之间的肽，更优选1与50种这样的肽，甚至更优选10与30组之间的肽，甚至更优选15与25种之间的肽。根据另一个优选的实施例，该疫苗或免疫原性组合物可以包含至少一种肽，更优选2、3、4或5种肽。在某些实施例中，该疫苗或免疫原性组合物可以包含5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30种不同的肽。
本领域技术人员可以在无需过度实验的情况下确定有待包含在疫苗或免疫原性组合物中的每种肽的最佳量和最佳给药方案。例如，该肽或其变体可以制备用于静脉内(i.v.)注射、皮下(s.c.)注射、皮内(i.d.)注射、腹膜内(i.p.)注射、肌内(i.m.)注射。注射肽的优选方法包括皮下、皮内、腹膜内、肌内、以及静脉内。注射DNA的优选方法包括皮内、肌内、皮下、腹膜内、以及静脉内。例如，可以给予1与500mg之间、50μg与1.5mg之间，优选10μg至500μg的肽或DNA的剂量并且可以取决于相应的肽或DNA。此范围的剂量成功地用于先前试验(Brunsvig P F等人，癌症免疫学与免疫疗法2006；55(12):1553-1564；M.施特勒尔(Staehler)等人，ASCO会议2007；文摘号3017)。给予疫苗或免疫原性组合物的其他方法是本领域普通技术人员已知的。
在本发明的一个实施例中，这些不同的肿瘤特异性新抗原肽和/或多肽被选择用于在瘤形成疫苗或免疫原性组合物中使用，以便将产生对抗患者的瘤形成/肿瘤的免疫攻击的可能性最大化。不受理论束缚，据信包含多种多样的肿瘤特异性新抗原肽可以产生对抗瘤形成/肿瘤的大规模免疫攻击。在一个实施例中，这些选择的肿瘤特异性新抗原肽/多肽由错义突变编码。在第二实施例中，这些选择的肿瘤特异性新抗原肽/多肽由错义突变和新ORF突变的组合编码。在第三实施例中，这些选择的肿瘤特异性新抗原肽/多肽由新ORF突变编码。
在这些选择的肿瘤特异性新抗原肽/多肽由错义突变编码的一个实施例中，基于其与患者的特定MHC分子缔合的能力选择这些肽和/或多肽。衍生自新ORF突变的肽/多肽也可以在其与患者的特定MHC分子缔合的能力的基础上进行选择，但是即使未预测到与患者的特定MHC分子缔合也可以被选择。
该疫苗或免疫原性组合物能够引起特异性细胞毒性T-细胞应答和/或特异性辅助T细胞应答。
该疫苗或免疫原性组合物可以进一步包括佐剂和/或载体。在此给出了有用的佐剂和载体的实例。该组合物中的肽和/或多肽可以与载体(如例如，蛋白质)或抗原呈递细胞(如例如能够将肽呈递给T细胞的树突细胞(DC))缔合。
佐剂是任何物质，它们掺合进该疫苗或免疫原性组合物中增加或以其他方式改变针对突变型肽的免疫应答。载体是这些新抗原肽能够向其缔合的支架结构，例如多肽或多糖。任选地，佐剂被共价地或非共价地轭合至本发明的肽或多肽。
佐剂增加针对抗原的免疫应答的能力典型地通过免疫介导的反应的显著增加或疾病症状的减少来表现。例如，体液免疫的增加典型地通过针对抗原产生的抗体的效价的显著升高来表现，并且T细胞活性的增加典型地在细胞增殖或细胞毒性或细胞因子分泌方面的增加中来表现。佐剂还可以例如通过将初次体液或Th2应答变为初次细胞或Th1应答而改变免疫应答。
适合的佐剂包括但不限于，1018ISS、铝盐、Amplivax、AS15、BCG、CP-870,893、CpG7909、CyaA、dSLIM、GM-CSF、IC30、IC31、咪喹莫特、ImuFact IMP321、IS Patch、ISS、ISCOMATRIX、Juvlmmune、LipoVac、MF59、单磷酰脂质A、蒙塔尼德IMS 1312、蒙塔尼德ISA206、蒙塔尼德ISA 50V、蒙塔尼德ISA-51、OK-432、OM-174、OM-197-MP-EC、ONTAK、PEPTEL。载体系统、PLGA微颗粒、瑞喹莫德、SRL172、病毒微体和其他病毒样颗粒、YF-17D、VEGF陷阱、R848、β-葡聚糖、Pam3Cys、源自皂素、分支杆菌提取物和合成细菌细胞壁模拟物的阿奎拉QS21刺激子(亚奎拉生物技术公司(Aquila Biotech)，伍斯特(Worcester)，马萨诸塞州，美国)、以及其他专有佐剂如Ribi’s Detox、Quil或Superfos。先前已经描述了若干特异性针对树突细胞的免疫佐剂(例如，MF59)及其制备(杜普伊斯M(Dupuis M)等人，细胞免疫学(Cell Immunol.)1998；186(1):18-27；阿利森A C(Allison A C)；生物标准化进展(DevBiol Stand.)1998；92:3-11)。还可以使用细胞因子。若干细胞因子一直与影响树突细胞迁移至淋巴组织中(例如，TNF-α)直接相关，从而加速树突细胞成熟为用于T淋巴细胞的有效抗原呈递细胞(例如，GM-CSF、IL-1和IL-4)(美国专利号5,849,589，具体地通过引用以其全文结合在此)并充当免疫佐剂(例如，IL-12)(加布里洛维奇(Gabrilovich)D I等人，着重于肿瘤免疫学的免疫治疗杂志(J Immunother Emphasis Tumor Immunol.)1996(6):414-418)。
Toll样受体(TLR)也可以用作佐剂，并且是模式识别受体(PRR)家族的重要成员，模式识别受体识别由许多微生物共享的保守基序，称为“病原体相关分子模式(PAMPS)”。识别这些“危险信号”激活先天性和适应性免疫系统的多个元件。TLR由先天性和适应性免疫系统的细胞表达，如树突细胞(DC)、巨噬细胞、T细胞和B细胞、肥大细胞以及粒细胞，并且位于不同的细胞区室中，如质膜、溶酶体、内涵体以及内吞溶酶体。不同TLR识别不同PAMPS。例如，TLR4被包含在细菌细胞壁中的LPS激活，TLR9被未甲基化的细菌或病毒CpG DNA激活，并且TLR3被双链RNA激活。TLR配体结合导致激活一种或多种细胞内信号转导途径，从而最终导致产生许多与炎症和免疫相关的关键分子(特别是转录因子NF-κB和I型干扰素)。TLR介导的DC激活导致DC激活增强，吞噬作用，激活和共刺激标记物(如CD80、CD83和CD86)上调，表达CCR7，从而允许DC迁移至引流淋巴结并且有助于将抗原呈递给T细胞，以及细胞因子(如I型干扰素、IL-12和IL-6)的分泌增加。所有这些下游事件对于诱导适应性免疫应答而言是关键的。
当前在临床研发中最具前景的癌症疫苗或免疫原性组合物佐剂是TLR9激动剂CpG和合成双链RNA(dsRNA)TLR3配体聚-ICLC。在临床前研究中，当与LPS和CpG相比时，聚-ICLC似乎是最有效力的TLR佐剂，因为它诱导促炎细胞因子并且没有IL-10刺激并且在DC中维持高水平的共刺激分子1。此外，作为一种蛋白质疫苗或免疫原性组合物的佐剂，最近在非人类灵长类动物(恒河猴)体内将聚-ICLC与CpG进行了直接比较，该蛋白质疫苗由人乳头瘤病毒(HPV)16衣壳体组成(斯塔尔-亨尼格C(Stahl-Hennig C)，艾森布拉特尔M(EisenblatterM)，翟斯尼E(Jasny E)等人，在恒河猴体内合成双链RNA是用于诱导针对人乳头瘤病毒的T辅助细胞1和体液免疫应答的佐剂(Synthetic double-stranded RNAs are adjuvantsfor the induction of T helper 1and humoral immune responses to humanpapillomavirus in rhesus macaques)PLoS病原体(PLoS pathogens)2009年4月；5(4))。
还已经报道，CpG免疫刺激寡核苷酸可以增强佐剂在疫苗或免疫原性组合物环境中的作用。不受理论束缚，CpG寡核苷酸经由Toll样受体(TLR)(主要是TLR9)通过激活先天性(非适应性)免疫系统而起作用。CpG触发的TLR9激活增强针对多种多样的抗原的抗原特异性体液和细胞应答，包括预防性和治疗性疫苗两者中的肽或蛋白质抗原、活病毒或死病毒、树突细胞疫苗、自体细胞疫苗以及多糖轭合物。更重要的是，它增强树突细胞成熟和分化，从而导致Thl细胞的激活增强和较强的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)产生，即使在不存在CD4T细胞帮助下。由TLR9刺激诱导的Thl偏向性(bias)即使在疫苗佐剂(如明矾或不完全弗氏佐剂(IFA))的存在下也得以维持，这些疫苗佐剂通常促进Th2偏向性。当与其他佐剂一起配制或共给药或在如微颗粒、纳米颗粒、脂质乳剂或类似配制品的配制品中时，CpG寡核苷酸显示出甚至更大的佐剂活性，当抗原相对较弱时，这些对于诱导较强应答而言是尤其必要的。它们还促进免疫应答并且使得抗原剂量可以降低大约两个数量级，同时在一些实验中在没有CpG的情况下对全剂量疫苗产生可比的抗体应答(亚瑟M.克里格(ArthurM.Krieg)，自然评论(Nature Reviews)，药物发现(Drug Discovery)，5，2006年6月，471-484)。美国专利号6,406,705Bl描述了组合使用CpG寡核苷酸、非核酸佐剂和抗原来诱导抗原特异性免疫应答。一种可商购的CpG TLR9拮抗剂是Mologen公司(柏林，德国)的dSLIM(双茎环免疫调节剂)，它是本发明的药用组合物的优选组分。也可以使用其他TLR结合分子，如结合RNA的TLR 7、TLR 8和/或TLR 9。
有用佐剂的其他实例包括但不限于化学改性的CpG(例如CpR，Idera)、聚(I:C)(例如聚i:CI2U)、非CpG细菌DNA或RNA和免疫活性小分子以及可以在治疗上起作用和/或作为佐剂起作用的抗体，如环磷酰胺、舒尼替尼、贝伐单抗、西乐葆、NCX-4016、西地那非、他达拉非、伐地那非、索拉非尼、XL-999、CP-547632、帕唑帕尼、ZD2171、AZD2171、伊匹单抗、曲美木单抗(tremelimumab)及SC58175。本领域技术人员可以在无需过度实验的情况下容易地确定在本发明的背景下有用的佐剂和添加剂的量和浓度。另外的佐剂包括集落刺激因子，如粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF，沙格司亭)。
聚-ICLC是一种合成地制备的双链RNA，它由平均长度约5000个核苷酸的聚I和聚C链组成，已经通过加入聚赖氨酸和羧甲基纤维素而使得它对热变性和血清核酸酶的水解稳定。该化合物激活TLR3和MDA5的RNA解旋酶-结构域(PAMP家族的两个成员)，从而导致激活DC和自然杀伤细胞(NK)并产生I型干扰素、细胞因子和趋化因子的“天然混合物(naturalmix)”。此外，聚-ICLC发挥由两种IFN诱导型核酶系统介导的更直接的靶向广泛宿主的抗感染以及可能抗肿瘤作用，这两种系统是2’5’-OAS和P1/eIF2a激酶(亦称PKR(4-6))以及RIG-I解旋酶和MDA5。
在啮齿类动物和非人灵长类动物中，显示聚-ICLC可增强针对病毒抗原的T细胞应答、交叉致敏以及肿瘤-、病毒-和自身抗原-特异性CD8+T细胞的诱导。在非人灵长类动物的一项最近研究中，发现聚-ICLC为产生针对DC靶向或非靶向的HIV Gag p24蛋白的抗体应答和T细胞免疫所必需，从而强调了它作为疫苗佐剂的有效性。
在人受试者中，系列全血样品的转录分析揭示了接受一个单次s.c.给予聚-ICLC的8个健康人志愿者之间的类似的基因表达谱和在这8个受试者与4个接受安慰剂的受试者之间多达212个基因的差异表达。值得注意的是，聚-ICLC基因表达数据与来自用高效黄热病疫苗YF17D免疫的志愿者的先前数据的比较显示，在峰值时间点大量的转录和信号转导经典途径(包括先天性免疫系统的那些)被类似地上调。
最近，报告了关于处于二期或三期完全临床缓解的患有卵巢癌、输卵管癌和原发性腹膜癌的患者的免疫分析，这些患者在一期皮下疫苗接种研究中用来自睾丸癌抗原NY-ESO-1的合成重叠长肽(OLP)单独地或与蒙塔尼德-ISA-51一起或与1.4mg聚-ICLC和蒙塔尼德一起进行治疗。与单独的OLP或OLP和蒙塔尼德相比，在加入聚-ICLC和蒙塔尼德情况下的NY-ESO-1特异性CD4+和CD8+T细胞和抗体应答的产生明显增强。
根据本发明的疫苗或免疫原性组合物可以包含多于一种不同佐剂。此外，本发明涵盖一种治疗性组合物，其包含任何佐剂物质，包括在此论述的任何佐剂。还考虑的是该肽或多肽和该佐剂可以按任何适当的顺序进行给予。
载体可以独立于佐剂而存在。载体可以被共价连接至抗原。还可以通过将编码载体的DNA与编码抗原的DNA一起框内插入来将该载体添加至该抗原。载体的功能可以例如是赋予稳定性、增加生物活性或增加血清半衰期。半衰期的延长可以有助于减少施加次数并且降低剂量，因此不仅对治疗是有益的，而且对于经济原因而言也是有益的。此外，载体可以辅助将肽呈递给T细胞。该载体可以是本领域的普通技术人员已知的任何适合的载体，例如蛋白质或抗原呈递细胞。载体蛋白可以是但不限于钥孔虫戚血蓝蛋白、血清蛋白(如转铁蛋白、牛血清白蛋白、人血清白蛋白、甲状腺球蛋白或卵清蛋白)、免疫球蛋白或激素(如胰岛素或棕榈酸)。用于对人免疫，该载体可以是为人的生理上可接受的并且安全的。然而，破伤风类毒素和/或白喉类毒素在本发明的一个实施例中是适合的载体。可替代地，该载体可以是葡聚糖，例如琼脂糖。
细胞毒性T细胞(CTL)识别处于结合至MHC分子上的肽的形式的抗原而非完整的外源抗原本身。该MHC分子本身位于抗原递呈细胞的细胞表面。因此，只有当存在肽抗原、MHC分子和APC的三聚复合物时才可能激活CTL。相应地，不仅如果该肽用于CTL激活，并且如果另外加入具有对应的MHC分子的APC的话，这可以增强免疫应答。因此，在一些实施例中，根据本发明的疫苗或免疫原性组合物另外包含至少一种抗原递呈细胞。
该抗原呈递细胞(或刺激细胞)在其表面上典型地具有MHC I类或II类分子，并且在一个实施例中自身基本上不能装载具有选择的抗原的MHC I类或II类分子。如在此更详细地描述的，该MHC I类或II类分子可以在体外容易地装载有选择的抗原。
可以通过使用CD4+细胞增加CD8+细胞活性。针对肿瘤抗原鉴别CD4T+细胞表位已经吸引了兴趣，因为如果CD8+和CD4+T淋巴细胞两者均被用来靶向患者的肿瘤，许多基于免疫的抗癌疗法可以更有效。CD4+细胞能够增强CD8T细胞应答。许多动物模型研究已经清楚地证明当CD4+和CD8+T细胞两者均参与抗肿瘤应答时的结果更好(参见例如，西村(Nishimura)等人(1999)抗原特异性T辅助类型1(TH1)和Th2细胞在体内肿瘤根除中的不同作用(Distinct role of antigen-specific T helper type 1(TH1)and Th2cells intumor eradication in vivo)实验医学杂志(J Ex Med)190:617-27)。已经鉴别了可适用于开发对抗不同类型的癌症的疗法的通用CD4+T细胞表位(参见例如，小林(Kobayashi)等人(2008)免疫学当前观点(Current Opinion in Immunology)20:221-27)。例如，将来自破伤风类毒素的HLA-DR限制性辅助肽在黑色素瘤疫苗中用于非特异性地激活CD4+T细胞(参见例如，思林格拉芙(Slingluff)等人(2007)两种针对黑色素瘤的多肽疫苗在辅助情况下的随机II期试验的免疫与临床结果(Immunologic and Clinical Outcomes of aRandomized Phase II Trial of Two Multipeptide Vaccines for Melanoma in theAdjuvant Setting)，临床癌症研究(Clinical Cancer Research)13(21):6386-95)。在本发明的范围内考虑到的是此类CD4+细胞可以在随其肿瘤特异性而变的三个水平上可适用：1)广泛水平，其中通用CD4+表位(例如，破伤风类毒素)可以用来增加CD8+细胞；2)中间水平，其中天然的肿瘤相关CD4+表位可以用来增加CD8+细胞；以及3)患者特异性水平，其中新抗原CD4+表位可以按患者特异性方式用来增加CD8+细胞。
还可以用新抗原装载的树突细胞(DC)疫苗产生CD8+细胞免疫。DC是启动T细胞免疫的有效力的抗原呈递细胞并且当例如通过直接肽注射而装载有一种或多种感兴趣的肽时可以用作癌症疫苗。例如，显示新近被诊断为转移性黑色素瘤的患者可经由产生IL-12p70的患者DC疫苗针对3种HLA-A*0201限制性gp100黑色素瘤抗原衍生的肽用自体肽脉冲处理的CD40L/IFN-g-激活的成熟DC进行免疫(参见例如，卡雷尼奥(Carreno)等人(2013)产生L-12p70的患者DC疫苗引起Tc1-极化的免疫性(L-12p70-producing patient DCvaccine elicits Tc1-polarized immunity)，临床研究杂志(Journal of ClinicalInvestigation)，123(8):3383-94以及阿里(Ali)等人(2009)DC亚群和T细胞的原位调节在小鼠体内介导肿瘤消退(In situ regulation of DC subsets and T cells mediatestumor regression in mice)，癌症免疫疗法(Cancer Immunotherapy)，1(8):1-10)。在本发明的范围内考虑到的是可以使用刺激DC的合成TLR 3激动剂聚肌苷酸-聚胞苷酸-聚-L-赖氨酸羧甲基纤维素(聚-ICLC)制备新抗原装载的DC。聚-ICLC对于人类DC而言是一种有效力的个体成熟刺激物，如通过上调CD83和CD86，诱导白介素-12(IL-12)、肿瘤坏死因子(TNF)、干扰素γ诱导蛋白10(IP-10)、白介素1(IL-1)及I型干扰素(IFN)并且产生最少白介素10(IL-10)所评估的。DC可以分化自通过白细胞分离术获得的冷冻外周血单核细胞(PBMC)，而PBMC可以通过聚蔗糖梯度离心分离并以等分部分冷冻。
说明性地，可以使用以下7天激活方案。第1天—将PBMC解冻并铺在组织培养烧瓶上，以在组织培养孵育器中在37℃下孵育1-2hr之后选择粘附至塑料表面的单核细胞。孵育之后，将淋巴细胞洗掉并且将粘附单核细胞在白介素-4(IL-4)和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的存在下培养5天，以分化成未成熟的DC。在第6天，用钥孔虫戚血蓝蛋白(KLH)脉冲处理未成熟的DC，该蛋白作为疫苗质量的对照并且可以增强疫苗的免疫原性。将这些DC刺激至成熟，用肽抗原装载，并孵育过夜。在第7天，将细胞洗涤，并且使用控速冷冻机以含有4-20×10(6)个细胞的1ml等分部分冷冻。可以针对这些批次的DC进行批释放测试，以在将这些DC注射进患者体内之前满足最低规格(参见例如，萨巴多(Sabado)等人(2013)用于免疫疗法的肿瘤抗原装载的成熟树突细胞的制备(Preparation of tumorantigen-loaded mature dendritic cells for immunotherapy)，可视化实验杂志(J.VisExp.)8月1日；(78).doi:10.3791/50085)。
可以将DC疫苗掺入支架系统中，以有助于递送至患者。用DC疫苗治疗性处理患者的瘤形成可以利用以下生物材料系统，该系统释放将宿主树突细胞募集进该装置中的因子，通过局部呈递佐剂(例如危险信号)同时释放抗原而使驻留型未成熟的DC分化，并且促进使激活的抗原装载的DC释放至淋巴结(或希望的作用点)，在这里这些DC可以与T细胞相互作用，以产生针对癌症新抗原的有效力的细胞毒性T淋巴细胞应答。可植入生物材料可以用于以患者特异性方式产生对抗瘤形成的有效力的细胞毒性T淋巴细胞应答。然后，可以通过将这些生物材料驻留型树突细胞暴露于危险信号模拟感染而将它们激活，与从该生物材料中释放抗原一致。然后，这些激活的树突细胞从生物材料迁移至淋巴结，以诱导细胞毒性T效应应答。此方法先前已经被证明在使用制备自肿瘤活检的溶解产物的临床前研究中可导致已形成的黑色素瘤消退(参见例如，阿里(Ali)等人(2209)DC亚群和T细胞的原位调节在小鼠体内介导肿瘤消退(In situ regulation of DC subsets and T cells mediatestumor regression in mice)，癌症免疫疗法(Cancer Immunotherapy)1(8):1-10；阿里等人(2009)用于原位编程树突细胞的感染模拟材料(Infection-mimicking materials toprogram dendritic cells in situ)自然材料(Nat Mater)8:151-8)，并且这样一种疫苗当前正在达纳法博癌症研究所(Dana-Farber Cancer Institute)在最近启动的I期临床试验中进行测试。还已经显示，使用当前提案中的C6大鼠神经胶质瘤模型24，此方法可导致成胶质细胞瘤消退，并且诱导有效力的记忆应答以防止复发。这样一种可植入生物基质疫苗递送支架放大并维持肿瘤特异性树突细胞激活的能力可以产生比通过传统皮下或结内疫苗给予可以达到的更鲁棒性的抗肿瘤免疫致敏。
优选地，这些抗原呈递细胞是树突细胞。适当地，这些树突细胞是用该新抗原肽脉冲处理的自体树突细胞。该肽可以是引起适当的T细胞应答的任何适合的肽。使用用来自肿瘤相关抗原的肽脉冲处理的自体树突细胞进行T细胞疗法披露于墨菲(Murphy)等人(1996)前列腺(The Prostate)29，371-380以及特朱瓦(Tjua)等人(1997)前列腺32，272-278中。
因此，在本发明的一个实施例中，用本发明的一种或多种肽脉冲处理或装载含有至少一种抗原呈递细胞的疫苗或免疫原性组合物。可替代地，分离自患者的外周血单核细胞(PBMC)可以离体装载有肽并且将其注射回该患者体内。作为一个替代方案，该抗原呈递细胞包括编码本发明的肽的表达构建体。该多核苷酸可以是任何适合的多核苷酸并且优选的是它能够转导树突细胞，从而呈递肽并诱导免疫性。
可以编制本发明的药用组合物，这样使得存在于该组合物中的肽的选择、数目和/或量是组织、癌症和/或患者特异性的。例如，可以通过母体蛋白在给定组织中的表达谱指导肽的精确选择，以避免副作用。选择可以依赖于癌症的具体类型、疾病的状态、早先的治疗方案、患者的免疫状态以及当然患者的HLA-单体型。此外，根据具体患者的个人需求，根据本发明的疫苗或免疫原性组合物可以包含个性化组分。实例包括根据相关新抗原在具体患者体内的表达、由于个人变态反应或其他治疗引起的不想要的副作用来改变肽的量，以及在第一轮治疗或治疗的第一方案之后调整二次治疗。
可以向已罹患癌症的个体给予包含本发明的肽的药用组合物。在治疗性应用中，以足引起针对肿瘤抗原的有效CTL应答和足以治愈或至少部分阻止症状和/或并发症的量向患者给予组合物。足以实现该目的的量被定义为“治疗有效剂量”。对于此用途有效的量可以取决于例如肽组合物、给药方式、正在治疗的疾病的阶段和严重性、患者的体重和一般健康状况以及开处方医生的判断，但是通常用于70kg患者的首次免疫范围(这是用于治疗性或预防性给予)是从约1.0μg至约50,000μg的肽，随后提高剂量，或依照加强方案从约1.0μg至约10,000μg的肽持续数周至数月，这取决于患者的反应和情况并且可能通过测量患者血液中的特异性CTL活性。应当记住的是，本发明的肽和组合物通常可以用于严重疾病状态，即危及生命或可能危及生命的情况，尤其是当癌症已经转移时。对于治疗性用途，应该在检测或手术切除肿瘤之后尽早开始给药。这之后提高剂量，直到至少症状被基本上减轻并且之后持续一段时间。
用于治疗性治疗的药用组合物(例如，疫苗组合物)旨在用于胃肠外、局部(topical)、鼻腔、口服或局部(local)给药。优选地，胃肠外(例如，静脉内、皮下、皮内或肌内)给予这些药用组合物。可以在手术切除部位给予这些组合物，以诱导针对肿瘤的局部免疫应答。本发明提供了用于胃肠外给药的组合物，它们包括溶解或悬浮于可接受的载体(优选水性载体)中的肽和疫苗或免疫原性组合物溶液。可以使用多种水性载体，例如，水、缓冲水、0.9％盐水、0.3％甘氨酸、透明质酸等。这些组合物可以通过常规的熟知灭菌技术灭菌，或者可以是无菌过滤的。所得水溶液可以被包装以按原样使用，或者被冻干，在给药前将该冻干制剂与无菌溶液组合。这些组合物可以包含如接近生理条件所需的药学上可接受的辅助物质，如pH调节剂和缓冲剂、张力调节剂、湿润剂等，例如乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、脱水山梨糖醇单月桂酸酯、油酸三乙醇胺等。
可以按以下剂量静脉内、局部(locally，topically)等给予包含肽的脂质体悬浮液，该剂量尤其根据给药方式、正在递送的肽和正在治疗的疾病的阶段变化。用于靶向免疫细胞，可以将配体(如例如，特异性针对希望的免疫系统细胞的细胞表面决定簇的抗体或其片段)掺入脂质体中。
对于固体组合物，可以使用常规或纳米颗粒无毒固体载体，包括例如药物级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等。用于口服给药，通过掺入任何通常使用的赋形剂(如先前列出的那些载体)和通常10％-95％的活性成分(即，本发明的一种或多种肽)并且更优选地处于25％-75％的浓度而形成药学上可接受的无毒组合物。
用于气溶胶给药，优选以精细分散形式连同表面活性剂和推进剂提供免疫原性肽。肽的典型百分比是按重量计0.01％-20％，优选1％-10％。当然，该表面活性剂可以是无毒的，并且优选可溶于该推进剂。此类试剂的代表是含有从6至22个碳原子的脂肪酸与脂肪族多元醇或其环酐的酯或偏酯，这些脂肪酸是如己酸、辛酸、月桂酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、油硬脂酸以及油酸。可以使用混合酯，例如混合的或天然的甘油酯。按该组合物的重量计，该表面活性剂可以占0.1％-20％，优选0.25％-5％。组合物的余量通常是推进剂。如所希望的，也可以包括载体，正如例如用卵磷脂用于鼻内递送。
可以利用不含污染菌或动物物质的试剂用化学方法容易地合成本发明的肽和多肽(梅里菲尔德RB(Merrifield RB)：固相肽合成(Solid phase peptide synthesis)I.四肽的合成(The synthesis of a tetrapeptide)美国化学会志(J.Am.Chem.Soc.)85:2149-54，1963)。
本发明的肽和多肽还可以由载体表达，例如，如在此论述的核酸分子，例如RNA或DNA质粒、病毒载体如痘病毒(例如正痘病毒、禽痘病毒)或腺病毒、AAV或慢病毒。此方法涉及使用一种载体来表达编码本发明的肽的核苷酸序列。在引入急性或慢性感染宿主或引入未感染宿主中之后，该载体表达免疫原性肽，并且从而引起宿主CTL应答。
用于治疗或免疫接种目的，还可以向患者给予编码本发明的肽以及任选地在此描述的一种或多种肽的核酸。许多方法方便地用来将这些核酸递送至患者。例如，核酸可以作为“裸DNA”而直接递送。此途径描述于例如沃尔夫(Wolff)等人，科学(Science)247:1465-1468(1990)以及美国专利号5,580,859和5,589,466中。还可以使用弹道递送给予核酸，如描述于例如美国专利号5,204,253中。可以给予仅仅由DNA构成的颗粒。可替代地，可以将DNA粘附到颗粒(如金颗粒)上。一般来说，用于疫苗或免疫原性组合物的质粒可以包含可操作地连接至调控序列的编码抗原(例如，一种或多种新抗原)的DNA，这些调控序列控制来自宿主细胞(例如，哺乳动物细胞)的抗原的表达或表达和分泌；例如，从上游至下游，启动子如哺乳动物病毒启动子(例如，CMV启动子如hCMV或mCMV启动子，例如早期中间启动子，或SV40启动子--参见在此针对有用的启动子引用或结合的文献)的DNA、用于分泌的真核前导肽的DNA(例如，组织纤溶酶原激活物)、一种或多种新抗原的DNA、以及编码终止子的DNA(例如，来自编码牛生长激素或bGH聚A的3'UTR转录终止子)。组合物可以包含多于一种质粒或载体，其中每种载体包含且表达不同的新抗原。还提及瓦斯莫恩(Wasmoen)美国专利号5,849,303和戴尔(Dale)美国专利号5,811,104，其文本可以是有用的。DNA或DNA质粒配制品可以与阳离子脂质一起或在阳离子脂质内部配制；并且关于阳离子脂质以及佐剂，还提及卢斯莫尔(Loosmore)美国专利申请2003/0104008。此外，奧多奈特(Audonnet)美国专利号6,228,846和6,159,477中的传授内容可以针对可用于构建且使用体内包含且表达的DNA质粒的DNA质粒传授内容而依赖。
还可以通过与阳离子化合物(如阳离子脂质)复合来递送核酸。脂质介导的基因递送方法描述于例如WO 1996/18372；WO 1993/24640；曼尼诺(Mannino)&古尔德-弗格里特(Gould-Fogerite)，生物技术(BioTechniques)6(7):682-691(1988)；美国专利号5,279,833；WO 1991/06309；以及法伊格尼尔(Feigner)等人，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)84:7413-7414(1987)中。
编码感兴趣的肽的RNA(例如mRNA)也可以用于递送(参见例如，葵轩(Kiken)等人，2011；苏(Su)等人，2011；还参见US 8278036；哈拉比(Halabi)等人,临床肿瘤学杂志(2003)21:21:1232-1237；佩奇(Petsch)等人，自然生物技术(Nature Biotechnology)2012年12月7；30(12):1210-6)。
关于可以用于实践本发明的痘病毒的信息，这些痘病毒如脊椎动物痘病毒(Chordopoxvirinae)亚科痘病毒(脊椎动物的痘病毒)，例如正痘病毒和禽痘病毒，例如牛痘病毒(例如，惠氏(Wyeth)菌株、WR菌株(例如，VR-1354)、根本哈根菌株、NYVAC、NYVAC.1、NYVAC.2、MVA、MVA-BN)、金丝雀痘病毒(例如，惠特莉(Wheatley)C93菌株、ALVAC)、鸡痘病毒(例如，FP9菌株、韦伯斯特(Webster)菌株、TROVAC)、鸠痘(dovepox)、鸽痘、鹌鹑痘、以及浣熊痘和其他，其合成或非天然存在的重组体、其用途以及用于制备且使用此类重组体的方法可以在科技和专利文献中找到，如：
美国专利号4,603,112、4,769,330、5,110,587、5,174,993、5,364,773、5,762,938、5,494,807、5,766,597、7,767,449、6,780,407、6,537,594、6,265,189、6,214,353、6,130,066、6,004,777、5,990,091、5,942,235、5,833,975、5,766,597、5,756,101、7,045,313、6,780,417、8,470,598、8,372,622、8,268,329、8,268,325、8,236,560、8,163,293、7,964,398、7,964,396、7,964,395、7,939,086、7,923,017、7,897,156、7,892,533、7,628,980、7,459,270、7,445,924、7,384,644、7,335,364、7,189,536、7,097,842、6,913,752、6,761,893、6,682,743、5,770,212、5,766,882、以及5,989,562，以及
帕尼卡利(Panicali)D.国家科学院院刊1982；79；4927-493；帕尼卡利D.国家科学院院刊1983；80(17):5364-8；马吉特(Mackett)M.国家科学院院刊1982；79:7415-7419；史密斯(Smith)GL.国家科学院院刊1983；80(23):7155-9；史密斯GL.自然1983；302:490-5；沙利文(Sullivan)VJ.普通病毒学(Gen.Vir.)1987；68:2587-98；柏克斯(Perkus)M白细胞生物学杂志(Journal of Leukocyte Biology)1995；58:1-13；伊尔马(Yilma)TD.疫苗1989；7:484-485；布罗谢尔(Brochier)B.自然1991；354:520-22；维克托(Wiktor)TJ.国家科学院院刊1984；81:7194-8；鲁普雷希特(Rupprecht)CE.国家科学院院刊1986；83:7947-50；波利特(Poulet)H疫苗2007；25(7月):5606-12；韦耶(Weyer)J.疫苗2009；27(11月):7198-201；布勒(Buller)RM自然1985；317(6040):813-5；布勒RM.病毒学杂志(J.Virol.)1988；62(3):866-74；弗莱克斯纳(Flexner)C.自然1987；330(6145):259-62；施田(Shida)H.病毒学杂志1988；62(12):4474-80；科特瓦尔(Kotwal)GJ.病毒学杂志1989；63(2):600-6；蔡尔德(Child)SJ.病毒学1990；174(2):625-9；迈尔A.细菌性文摘(ZentralblBakteriol)1978；167(5,6):375-9；安托万(Antoine)G.病毒学1998；244(2):365-96；怀亚特9Wyatt)LS.病毒学1998；251(2):334-42；桑乔(Sancho)MC.病毒学杂志2002；76(16)；8313-34；加列戈-戈麦斯(Gallego-Gomez)JC.病毒学杂志2003；77(19)；10606-22)；戈贝尔(Goebel)SJ.病毒学1990；(a，b)179:247-66；塔尔塔利亚(Tartaglia)J.病毒学1992；188(1):217-32；纳赫拉(Najera)JL.病毒学杂志2006；80(12):6033-47；纳赫拉JL.病毒学杂志2006；80:6033-6047；戈麦斯(Gomez)CE.普通病毒学杂志2007；88:2473-78；莫伊(Mooij)P.病毒学杂志2008；82:2975-2988；戈麦斯CE.当今基因疗法(Curr.Gene Ther.)2011；11:189-217；考克斯(Cox)W.病毒学1993；195:845-50；柏克斯(Perkus)M.白细胞生物学杂志1995；58:1-13；布兰卡德(Blanchard)TJ.普通病毒学杂志1998；79(5):1159-67；阿玛拉(Amara)R.科学2001；292:69-74；赫尔(Hel)Z.，免疫学杂志2001；167:7180-9；盖拉尔迪(Gherardi)MM.病毒学杂志2003；77:7048-57；迪迪埃劳伦特(Didierlaurent)A.疫苗2004；22:3395-3403；比斯特(Bissht)H.国家科学院院刊2004；101:6641-46；麦柯迪(McCurdy)LH.临床传染病(Clin.Inf.Dis)2004；38:1749-53；厄尔(Earl)PL.自然2004；428:182-85；陈(Chen)Z.病毒学杂志2005；79:2678-2688；纳赫拉JL.病毒学杂志2006；80(12):6033-47；纳姆(Nam)JH.病毒学报(Acta.Virol.)2007；51:125-30；安东尼斯(Antonis)AF.疫苗2007；25:4818-4827；B韦耶J.疫苗2007；25:4213-22；)费里埃-朗贝尔(Ferrier-Rembert)A.疫苗2008；26(14):1794-804；科比特(Corbett)M.国家科学院院刊2008；105(6):2046-51；考夫曼(Kaufman)HL.，临床肿瘤学杂志2004；22:2122-32；阿马托(Amato)RJ.临床癌症研究2008；14(22):7504-10；德莱塞(Dreicer)R.实验性新药物(Invest New Drugs)2009；27(4):379-86；坎托夫(Kantoff)PW.临床肿瘤学杂志2010，28，1099-1105；阿马托RJ.临床癌症研究杂志2010；16(22):5539-47；金姆(Kim)DW.人类疫苗(Hum.Vaccine.)2010；6:784-791；乌达尔(Oudard)S.癌症免疫学与免疫疗法2011；60:261-71；怀亚特LS.艾滋病研究和人逆转录酶病毒(Aids Res.Hum.Retroviruses.)2004；20:645-53；戈麦斯CE.病毒研究(Virus Research)2004；105:11-22；韦伯斯特(Webster)DP.国家科学院刊2005；102:4836-4；黄(Huang)X.疫苗2007；25:8874-84；戈麦斯CE.疫苗2007a；25:2863-85；埃斯特班(Esteban)M.人类疫苗2009；5:867-871；戈麦斯CE.当今基因疗法2008；8(2):97-120；惠兰(Whelan)KT.公共科学图书馆·综合(Plos one)2009；4(6):5934；斯克里巴(Scriba)TJ.欧洲免疫学杂志(Eur.Jour.Immuno.)2010；40(1):279-90；科比特M.国家科学院院刊2008；105:2046-2051；米奇利(Midgley)CM.普通病毒学杂志2008；89:2992-97；冯·克伦佩尔胡贝尔(Von Krempelhuber)A.疫苗2010；28:1209-16；佩罗(Perreau)M.病毒学杂志2011；十月:9854-62；潘塔莱奥(Pantaleo)G.HIV-AIDS当今视点(Curr Opin HIV-AIDS.)2010；5:391–396，
其各自通过引用结合在此。
关于适用于本发明的实践中的腺病毒载体，提及美国专利号6,955,808。所使用的腺病毒载体可以选自下组，该组由以下各项组成：Ad5、Ad35、Ad11、C6、以及C7载体。已经公开了腺病毒5(“Ad5”)基因组的序列。(施罗博泽克(Chroboczek)J.、比伯(Bieber)F.、以及Jacrot,B.(1992)5型腺病毒的基因组的序列及其与2型腺病毒的基因组的比较(TheSequence of the Genome of Adenovirus Type 5and Its Comparison with the Genomeof Adenovirus Type 2)，病毒学186，280-285；其内容特此通过引用而结合)。Ad35载体描述于美国专利号6,974,695、6,913,922、以及6,869,794中。Ad11载体描述于美国专利号6,913,922中。C6腺病毒载体描述于美国专利号6,780,407；6,537,594；6,309,647；6,265,189；6,156,567；6,090,393；5,942,235、以及5,833,975中。C7载体描述于美国专利号6,277,558中。还可以使用E1缺陷型或缺失的、E3缺陷型或缺失的、和/或E4缺陷型或缺失的腺病毒载体。具有E1区中的突变的某些腺病毒具有提高的安全界限，因为E1缺陷型腺病毒突变体在非受纳细胞中是复制缺陷型的，或至少是高度减毒的。具有E3区中的突变的腺病毒可以通过破坏腺病毒下调MHC I类分子的机制来增强免疫原性。具有E4突变的腺病毒可以具有降低的腺病毒载体免疫原性，这是由于晚期基因表达的抑制。当希望利用同一载体的重复重新疫苗接种时，此类载体可以是特别有用的。可以根据本发明使用在E1、E3、E4、E1和E3、以及E1和E4中缺失或突变的腺病毒载体。此外，还可以根据本发明使用所有病毒基因缺失的“无肠”腺病毒载体。此类载体需要用于其复制的辅助病毒并且需要表达E1a和Cre两者的特殊人293细胞系，其是在天然环境中不存在的条件。此类“无肠”载体是非免疫原性的并且因此这些载体可以被接种多次以用于重新疫苗接种。这些“无肠”腺病毒载体可以用于插入异源插入物/基因如本发明的转基因，并且甚至可以用于共递送大量异源插入物/基因。
关于适用于实践本发明的慢病毒载体，提及美国专利号6428953、6165782、6013516、5994136、6312682、、以及7,198,784，以及其中引用的文献。
关于适用于实践本发明的AAV载体，提及美国专利号5658785、7115391、7172893、6953690、6936466、6924128、6893865、6793926、6537540、6475769、以及6258595，以及其中引用的文献。
另一种载体是BCG(卡介苗)。BCG载体描述于斯托韦(Stover)等人(自然351:456-460(1991))中。有用于本发明的肽的治疗性给予或免疫的多种多样的其他载体(例如，伤寒沙门菌载体等)通过在此的描述对本领域的普通技术人员而言是显而易见的。
可以给予载体以便具有类似于通过抗原给予引发的剂量和/或应答的体内表达和应答。
给予编码本发明的肽的核酸的一种优选手段使用编码多个表位的微基因构建体。为了产生编码用于在人类细胞中表达的选择的CTL表位(微基因)的DNA序列，反向翻译这些表位的氨基酸序列。将人类密码子选择表用来指导每种氨基酸的密码子选择。这些编码表位的DNA序列被直接邻接，从而产连续的多肽序列。为了优化表达和/或免疫原性，可以将另外的元件掺入微基因设计中。可以被反向翻译并包括在微基因序列中的氨基酸序列的实例包括：辅助T淋巴细胞、表位、前导子(信号)序列以及内质网滞留信号。另外，可以通过包括与CTL表位相邻的合成(例如聚丙氨酸)的或天然存在的侧翼序列来改善MHC对这些CTL表位的呈递。
通过组装编码微基因的正链和负链的寡核苷酸而将微基因序列转化成DNA。使用熟知的技术在适当条件下合成重叠寡核苷酸(30-100个碱基长)，将其磷酸化、纯化并退火。使用T4DNA连接酶连接这些寡核苷酸的末端。然后可以将编码CTL表位多肽的该合成微基因克隆进希望的表达载体中。
在该载体中包括本领域的普通技术人员熟知的标准调节序列，以保证在靶细胞中进行表达。需要若干载体元件：具有用于插入微基因的下游克隆位点的启动子；用于有效终止转录的聚腺苷酸化信号；大肠杆菌复制起点；以及大肠杆菌选择性标记(例如氨苄西林或卡那霉素耐受性)。众多启动子可以用于此目的，例如人疱疹病毒(hCMV)启动子。对于其他适合的启动子序列，参见美国专利号5,580,859和5,589,466。
可能需要另外的载体修饰来优化微基因表达和免疫原性。在一些情况下，需要内含子用于有效的基因表达，并且可以将一个或多个合成的或天然存在的内含子掺入微基因的转录区域中。包含mRNA稳定序列也可以被考虑用于增加微基因表达。最近已经提出，免疫刺激序列(ISS或CpG)在DNA疫苗的免疫原性中发挥一定作用。如果发现可增强免疫原性，可以将这些序列包括在该载体中，位于微基因编码序列之外。
在一些实施例中，可以使用双顺反子表达载体，以允许产生微基因编码的表位和第二蛋白，该第二蛋白被包括以增强或降低免疫原性。如果被共表达，可以有益地增强免疫应答的蛋白质或多肽的实例包括细胞因子(例如，IL2、IL12、GM-CSF)、细胞因子诱导分子(例如LeIF)或共刺激分子。辅助(HTL)表位可以被连接至细胞内靶向信号上并且独立于CTL表位进行表达。这允许将HTL表位指向不同于CTL表位的细胞区室。如果需要，这可以促进HTL表位更有效地进入MHC II类途径中，从而改善CTL诱导。与CTL诱导相反，通过共表达免疫抑制分子(例如TGF-β)而特异性降低免疫应答在某些疾病中可能是有益的。
选择表达载体之后，便将微基因克隆进启动子下游的多接头区中。将此质粒转化进适当的大肠杆菌菌株中，并且使用标准技术制备DNA。使用限制酶作图和DNA序列分析确认微基因的取向和DNA序列以及被包括在该载体中的所有其他元件。可以将携带正确质粒的细菌细胞作为主细胞库和工作细胞库存储。
可以使用多种配制品制备注射用纯化的质粒DNA。这些中最简单的是在无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)中使冻干的DNA复水。已经描述了多种方法，并且新技术可以变得可用。如在此所指出，便利地用阳离子脂质配制核酸。另外，糖脂、促融合脂质体、肽以及统称为保护性、相互作用、非缩合(PINC)的化合物还可以与纯化的质粒DNA复合，以影响如稳定性、肌内分散度或到特定器官或细胞类型的输送等变量。
靶细胞致敏可以用作微基因编码的CTL表位的表达和MHC I类呈递的功能测定。将该质粒DNA引入哺乳动物细胞系中，该细胞系适于作为标准CTL铬释放测定的靶标。所使用的转染方法取决于最终配制品。电穿孔可以用于“裸”DNA，而阳离子脂质允许直接体外转染。可以共转染表达绿色荧光蛋白(GFP)的质粒，以允许使用荧光激活细胞分选术(FACS)富集转染的细胞。然后将这些细胞用铬-51标记并且用作表位特异性CTL系的靶细胞。通过51Cr释放而检测到细胞溶解指示产生MHC对微基因编码的CTL表位的呈递。
体内免疫原性是用于功能性测试微基因DNA配制品的第二途径。用DNA产物对表达适当人类MHC分子的转基因小鼠进行免疫。给药剂量和途径是配制品依赖性的(例如，对于PBS中的DNA而言是IM，对于脂质复合的DNA而言是IP)。免疫之后二十一天，收获脾细胞并且在编码待测试的各种表位的肽的存在下再刺激1周。使用标准技术，针对装载肽的铬-51标记的靶细胞的细胞溶解，对这些效应细胞(CTL)进行测定。通过对应于微基因编码的表位的肽的MHC装载而致敏的靶细胞溶解证明DNA疫苗的功能是在体内诱导CTL。
肽也可以用来在离体引起CTL。所得CTL可以用来治疗有需要患者的慢性肿瘤，这些患者不响应于其他常规形式的疗法，或不会响应于肽疫苗疗法途径。通过在组织培养中孵育患者的CTL前体细胞(CTLp)连同抗原呈递细胞(APC)源和适当的肽而诱导针对具体肿瘤抗原的离体CTL应答。适当的孵育时间(典型地是1-4周)之后，期间CTLp被激活并且成熟和发展成效应CTL，将这些细胞回注到患者体内，在这里它们破坏它们的特异性靶细胞(即，肿瘤细胞)。为了优化用于产生特异性细胞毒性T细胞的体外条件，将刺激细胞的培养物维持在适当的无血清培养基中。
在将这些刺激细胞与待激活细胞(例如，前体CD8+细胞)一起孵育之前，向刺激细胞培养物中加入一定量的抗原肽，其数量足以被装载到有待在这些刺激细胞的表面上表达的人I类分子上。在本发明中，肽的足够量是允许约200，并且优选200或更多个装载有肽的人I类MHC分子在每个刺激细胞的表面上表达的量。优选地，用>2μg/ml肽孵育这些刺激细胞。例如，用>3、4、5、10、15或更多μg/ml肽孵育这些刺激细胞。
然后将静止或前体CD8+细胞在培养物中与适当的刺激细胞一起孵育一段足以激活这些CD8+细胞的时间。优选地，以抗原特异性方式激活这些CD8+细胞。静止或前体CD8+(效应)细胞与刺激细胞的比率可能因人而异并且可以进一步取决于如个体的淋巴细胞对培养条件的顺应性以及疾病病症或使用描述中的治疗方式的其他病症的性质和严重性等变量。然而，优选地，淋巴细胞:刺激细胞比率在约30:1至300:1的范围内。可以将效应/刺激培养物维持尽可能长的时间，以刺激治疗上可用的或有效的数目的CD8+细胞。
在体外诱导CTL需要特异性识别与在APC上的等位基因特异性MHC I类分子相结合的肽。每个APC的特异性MHC/肽复合物的数目对于刺激CTL，特别是在初次免疫应答中是关键的。虽然每个细胞少量的肽/MHC复合物足以使得细胞易于被CTL溶解或足以刺激再次CTL应答，但是在初次应答过程中成功激活CTL前体(pCTL)需要显著更高数目的MHC/肽复合物。细胞上的空载主要组织相容性复合物分子的肽装载允许诱导初次细胞毒性T淋巴细胞应答。
由于不是每个人类MHC等位基因都存在突变型细胞系，所以有利的是使用一种技术将内源MHC相关肽从APC的表面去除，随后用感兴趣的免疫原性肽装载所得空载MHC分子。将患者的未转化(非致瘤性)、未感染细胞，并且优选自体细胞用作APC对于设计针对离体CTL疗法的开发的CTL诱导方案而言是令人希望的。本申请披露了用于从APC的表面剥离内源MHC相关肽，随后装载希望的肽的方法。
一种稳定的MHC I类分子是由以下元件形成的三聚复合物：1)通常具有8-10个残基的肽，2)在其al和a2结构域中带有肽结合位点的跨膜多态蛋白质重链和3)非共价缔合的非多态轻链p2微球蛋白。从该复合物中去除结合的肽和/或分离出p2微球蛋白使得MHC I类分子丧失功能并且不稳定，从而导致快速降解。所有分离自PBMC的MHC I类分子都具有与其结合的内源肽。因此，在可以向它们加入外源肽之前，第一步是去除APC上结合至MHC I类分子的所有内源肽而不引起它们降解。
使MHC I类分子从结合肽中挪出的两种可能方式包括将培养温度从37℃降至26℃过夜以使p2微球蛋白不稳定，以及使用温和酸处理而从细胞上剥离内源肽。这些方法将先前结合的肽释放进细胞外环境中，从而允许新的外源肽结合至空载I类分子。该冷温孵育方法使得外源肽可以有效地结合至MHC复合物，但需要在26℃下孵育过夜，这可以减缓细胞的代谢率。还有可能的是，不主动合成MHC分子的细胞(例如，静止PBMC)通过该冷温程序将不产生大量的空载表面MHC分子。
生硬的酸剥离涉及用三氟乙酸(pH 2)提取肽，或者使免疫亲和纯化的I类-肽复合物酸变性。这些方法对CTL诱导是不可行的，因为重要的是去除内源肽，同时保持APC活力和最佳代谢状态，这对于抗原呈递是关键的。pH 3的温和酸溶液(如甘氨酸或柠檬酸盐-磷酸盐缓沖液)已被用来鉴别内源肽并被用来鉴别肿瘤相关T细胞表位。该处理是特别有效的，因为仅仅使MHC I类分子不稳定(并释放缔合的肽)，而其他表面抗原(包括MHC II类分子)仍保持完整。最重要的是，用温和酸溶液处理细胞不影响细胞的活力或代谢状态。温和酸处理是快速的，因为在4℃下两分钟内便发生了内源肽的剥离，并且在装载适当的肽之后，APC可立即执行其功能。在此利用该技术来制备用于产生一级抗原特异性CTL的肽特异性APC。所得APC在诱导肽特异性CD8+CTL中是有效的。
可以使用多种已知方法之一将激活的CD8+细胞有效地与这些刺激细胞分离。例如，特异性针对刺激细胞、针对装载到刺激细胞上的肽或针对CD8+细胞(或其区段)的单克隆抗体可以用来结合适当的互补配体。然后可以经由适当的手段(例如，经由熟知的免疫沉淀或免疫测定方法)从刺激-效应细胞掺合物中提取出抗体标记的分子。
激活的CD8+细胞的有效、细胞毒性量可以在体外与体内使用之间变化，并且随作为这些杀伤细胞的最终靶标的细胞的量和类型变化。该量还可以取决于患者的病状而变化并且应该由从业者通过考虑所有适当因素加以确定。然而，优选地，与在小鼠中使用的约5×106-5×107和细胞相比，约1×106至约1×1012，更优选约1×108至约1×1011，并且甚至更优选约1×109至约1×1010个激活的CD8+细胞用于成年人。
优选地，如在此所讨论的，在将CD8+细胞向正在治疗的个体给予之前，从细胞培养物中收获激活的CD8+细胞。然而，重要的是要注意不像其他存在和提出的治疗形式，本方法使用非致瘤性的细胞培养系统。因此，如果未实现完全分离刺激细胞与激活的CD8+细胞，不存在已知与给予少量的刺激细胞相关的固有危险，而给予哺乳动物肿瘤促进细胞可能是极其危险的。
重新引入细胞组分的方法在本领域是已知的并且包括如示例于洪希克(Honsik)等人的美国专利号4,844,893和罗森伯格(Rosenberg)的美国专利号4,690,915中的那些程序。例如，经由静脉输注给予激活的CD8+细胞是适当的。
除非另外指明，本发明的实施采用完全处于本领域技术人员的见识范围之内的分子生物学(包含重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术。此类技术在以下文献中进行了充分解释：如“分子克隆实验手册(Molecular Cloning:ALaboratory Manual)”，第二板(萨姆布鲁克(Sambrook)，1989)；“寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)”(盖特(Gait)，1984)；“动物细胞培养(Animal CellCulture)”(弗雷谢尼(Freshney)，1987)；“酶学方法(Methods in Enzymology)”“实验免疫学手册(Handbook of Experimental Immunology)”(魏(Wei)，1996)；“用于哺乳动物细胞的基因转移载体(Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells)”(米勒(Miller)和卡洛斯(Calos)，1987)；“分子生物学现代方法(Current Protocols in Molecular Biology)”(奥苏贝尔(Ausubel)，1987)；“PCR：聚合酶链式反应(PCR:The Polymerase ChainReaction)”，(穆利斯(Mullis)，1994)；“免疫学现代方法(Current Protocols inImmunology)”(科利根(Coligan)，1991)。这些技术适用于本发明的多核苷酸和多肽的产生，并且按照这样，可以被考虑用于制备和实施本发明。对具体实施例特别有用的技术将在下面的部分进行讨论。
治疗方法
本发明提供在受试者体内诱导瘤形成/肿瘤特异性免疫应答、针对瘤形成/肿瘤进行免疫接种、治疗受试者的癌症和或缓解受试者的癌症症状的方法，该方法是通过给予该受试者本发明的瘤形成疫苗或新抗原肽或组合物以及至少一种检查点抑制剂。
具体地说，本发明涉及治疗或预防瘤形成的方法，这些方法包括向受试者给予(a)瘤形成疫苗或免疫原性组合物以及(b)至少一种检查点抑制剂的步骤。
根据本发明，在此描述的瘤形成疫苗或免疫原性组合物可以用于已经被诊断患有癌症或处于患上癌症的风险的患者。
按足以诱导CTL应答的量给予本发明的所描述的组合。
另外的疗法
还可以将在此描述的肿瘤特异性新抗原肽和药用组合物以与另一种药剂(例如治疗剂)的另外组合给予。在某些实施例中，这些另外的药剂可以是但不限于：化学治疗剂、抗血管生成剂、以及降低免疫抑制的药剂。
可以在给予该另外的药剂之前、期间或之后给予该瘤形成疫苗或免疫原性组合物以及一种或多种检查点抑制剂。在实施例中，在首次给予该另外的药剂之前给予该瘤形成疫苗或免疫原性组合物和/或一种或多种检查点抑制剂。在其他实施例中，在首次给予另外的治疗剂之后(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14天或更久)给予该瘤形成疫苗或免疫原性组合物和/或一种或多种检查点抑制剂。在实施例中，与首次给予另外的治疗剂同时给予该瘤形成疫苗或免疫原性组合物以及一种或多种检查点抑制剂。
该治疗剂是例如化学治疗剂或生物治疗剂、放射或免疫疗法。可以针对具体癌症给予任何适合的治疗性处理。化学治疗剂和生物治疗剂的实例包括但不限于，血管生成抑制剂，如羟基血管抑素K1-3、DL-α-二氟甲基-鸟氨酸、内皮抑素、烟曲霉素、染料木黄酮、米诺环素、星孢菌素、以及沙利度胺；DNA嵌入剂/交联剂，如博来霉素、卡铂、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、顺式-二氨铂(II)二氯化物(顺铂)、美法仑、米托蒽醌、以及奥沙利铂；DNA合成抑制剂，如(±)-氨甲蝶呤(甲氨蝶呤)、3-氨基-1,2,4-苯并三嗪1,4-二氧化物、氨喋呤、胞嘧啶β-D-阿拉伯呋喃糖苷、5-氟-5'-脱氧尿苷、5-氟尿嘧啶、更昔洛韦、羟基脲、以及丝裂霉素C；DNA-RNA转录调节剂，如放线菌素D、道诺霉素、阿霉素、高三尖杉酯碱、以及伊达比星；酶抑制剂，如S(+)-喜树碱、姜黄素、(-)-鱼藤素、5,6-二氯苯并咪唑1-β-D-呋喃核糖苷、依托泊苷、福美司坦、福司曲星、硬毛素(Hispidin)、2-亚氨基-1-咪唑烷乙酸(环肌酸)、洛伐他汀、曲古抑菌素A、曲古抑菌素AG 34、以及曲古抑菌素AG 879；基因调节剂，如5-氮杂-2'-脱氧胞苷、5-氮杂胞苷、胆钙化醇(维生素D3)、4-羟基他莫昔芬、褪黑素、米非司酮、雷洛昔芬、全反式视黄醛(维生素A醛)、全反式视黄酸(维生素A酸)、9-顺式-视黄酸、13-顺式-视黄酸、视黄醇(维生素A)、他莫昔芬、以及曲格列酮；微管抑制剂，如秋水仙碱、多西他赛、尾海兔素15、诺考达唑、紫杉醇、鬼臼毒素、根霉素、长春花碱、长春新碱、长春地辛、以及长春瑞滨(诺维本)；以及未分类的治疗剂，如17-(烯丙基氨基)-17-脱甲氧基格尔德霉素、4-氨基-1,8-萘二甲酰亚胺、芹黄素、布雷菲德菌素A、甲腈咪胺、二氯亚甲基-二膦酸、亮丙瑞林(Leuprolide/Leuprorelin)、促黄体生成激素释放激素、Pifithrin-α、雷帕霉素、性激素结合球蛋白、毒胡萝卜素、以及尿胰蛋白酶抑制剂片段(二库宁(Bikunin))。该治疗剂可以是六甲蜜胺、氨磷汀、天冬酰胺酶、卡培他滨、克拉屈滨、西沙必利、阿糖胞苷、达卡巴嗪(DTIC)、更生霉素、屈大麻酚、依泊汀α、非格司亭、氟达拉滨、吉西他滨、格拉司琼、异环磷酰胺、伊立替康、兰索拉唑、左旋咪唑、亚叶酸、甲地孕酮、美司钠、胃复安、米托坦、奥美拉唑、昂丹司琼、匹鲁卡品、普鲁氯嗪或盐酸拓扑替康。该治疗剂可以是单克隆抗体，如利妥昔单抗阿仑单抗贝伐单抗西妥昔单抗帕尼单抗和曲妥珠单抗威罗菲尼甲磺酸伊马替尼埃罗替尼吉非替尼维莫德吉(ErivedgeTM)、90Y-替伊莫单抗、131I-托西莫单抗、阿多-曲妥珠单抗恩他新、拉帕替尼帕妥株单抗(PerjetaTM)、阿多-曲妥珠单抗恩他新(KadcylaTM)、瑞格非尼舒尼替尼地诺单抗索拉非尼帕唑帕尼阿西替尼达沙替尼尼罗替尼博舒替尼奥法木单抗阿托珠单抗(GazyvaTM)、依鲁替尼(ImbruvicaTM)、艾代拉里斯克唑替尼埃罗替尼二马来酸阿法替尼色瑞替尼(LDK378/Zykadia)、托西莫单抗和131I-托西莫单抗替伊莫单抗贝伦妥单抗-维多汀(brentuximab vedotin)硼替佐米斯图希单抗(SylvantTM)、曲美替尼达拉菲尼潘布陆利珠单抗(pembrolizumab)卡非佐米雷莫芦单抗(CyramzaTM)、卡博替尼(CometriqTM)、凡德他尼任选地，该治疗剂是新抗原。该治疗剂可以是细胞因子，如干扰素(INF)、白细胞介素(IL)或造血生长因子。该治疗剂可以是INF-α、IL-2、阿地白介素、IL-2、红细胞生成素、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)或粒细胞集落刺激因子。该治疗剂可以是靶向疗法，如托瑞米芬氟维司群阿那曲唑依西美坦来曲唑阿柏西普阿利维甲酸西罗莫司维甲酸地尼白介素-毒素连接物伏立诺他罗米地辛贝沙罗汀普拉曲沙来那度胺贝林斯他(BeleodaqTM)、来那度胺泊马度胺卡巴他赛恩杂鲁胺乙酸阿比特龙氯化镭223或依维莫司另外，该治疗剂可以是表观遗传靶向药物如HDAC抑制剂、激酶抑制剂、DNA甲基转移酶抑制剂、组蛋白去甲基酶抑制剂、或组蛋白甲基化抑制剂。表观遗传药物可以是阿扎胞苷(维达扎)、地西他滨(达克金)、伏立诺他(Zolinza)、罗米地辛(Istodax)、或鲁索替尼(Jakafi)。用于前列腺癌治疗，可以与抗CTLA-4组合的优选化学治疗剂是紫杉醇(TAXOL)。
在某些实施例中，该一种或多种另外的药剂是一种或多种抗糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子家族受体(GITR)激动型抗体。GITR是T淋巴细胞的共刺激分子、调节先天性和适应性免疫系统并且已经发现参与多种免疫应答和炎症过程。GITR在从地塞米松处理的鼠T细胞杂交瘤克隆之后最初由诺森蒂尼(Nocentini)等人描述(诺森蒂尼等人，美国国家科学院院刊94:6216–6221.1997)。不同于CD28和CTLA-4，GITR在天然CD4+和CD8+T细胞上具有非常低的基础表达(龙凯蒂(Ronchetti)等人，欧洲免疫学杂志34:613–622.2004)。GITR刺激在体外具有免疫抑制作用并且在体内诱导自身免疫性的观察结果推进了触发此途径的抗肿瘤效力的研究。用于癌症免疫疗法的Ctla 4和Gitr的调节的综述可以在癌症免疫学与免疫疗法中找到(阿沃加德里(阿沃加德里)等人，微生物学和免疫学的当前主题344.2011)。可以有助于释放免疫抑制的其他药剂包括针对CD28/CTLA4Ig超家族的另一成员的检查点抑制剂是，如BTLA、LAG3、ICOS、PDL1或KIR(佩奇等人，医学年鉴65:27(2014))。在其他另外的实施例中，该检查点抑制剂是针对TNFR超家族的成员，如CD40、OX40、CD137、GITR、CD27或TIM-3。在一些情况下，靶向检查点抑制剂是用抑制抗体或类似分子完成的。在其他情况下，它是用靶标的激动剂完成的；此类的实例包括刺激性靶标OX40和GITR。
在某些实施例中,该一种或多种另外的药剂是协同的,在于它们在治疗之后提高免疫源性。在一个实施例中，该另外的药剂允许较低毒性和/或较低不适，这是由于在此描述的联合疗法的这些另外的治疗剂或任何组分的剂量较低。在另一实施例中，该另外的药剂产生更长寿命，这是由于在此所述的联合疗法的有效性增加。已经综述了增强患者中的免疫应答的化学治疗剂(齐沃格尔(Zitvogel)等人，癌症化学疗法的免疫方面(Immunological aspects of cancer chemotherapy.)免疫学自然评论2008Jan；8(1):59-73)。另外，化学治疗剂可以与免疫疗法一起安全给予而无需抑制疫苗特异性T细胞应答(佩雷斯(Perez)等人，抗癌肽疫苗的新时代(A new era in anticancer peptide vaccines.)癌症(Cancer)2010年5月)。在一个实施例中，给予该另外的药剂以便增加在此所述的联合疗法的功效。在一个实施例中，该另外的药剂是化学疗法治疗。在一个实施例中，低剂量的化学疗法加强迟发超敏(DTH)反应。在一个实施例中，该化学治疗剂靶向调控性T细胞。在一个实施例中，环磷酰胺是该治疗剂。在一个实施例中，在疫苗接种之前给予环磷酰胺。在一个实施例中，在疫苗接种之前作为单一剂量给予环磷酰胺(瓦尔特(Walter)等人，在单剂量环磷酰胺之后对癌症疫苗IMA901的多肽免疫应答与更长患者存活期相关(Multipeptideimmune response to cancer vaccine after single-dose cyclophosphamideassociates with longer patient survival.)自然医学(Nature Medicine)；18:82012)。在另一实施例中，根据节律式程序给予环磷酰胺，其中给予每日剂量持续一个月(基林格利(Ghiringhelli)等人，节律式环磷酰胺方案选择性地消减CD4+CD25+调控性T细胞并且恢复终末期癌症患者中的T和NK效应子功能(Metronomic cyclophosphamide regimenselectively depletes CD4+CD25+regulatory T cells and restores T and NKeffector functions in end stage cancer patients.)癌症免疫学与免疫疗法2007 56:641–648)。在另一个实施例中，在疫苗接种之前给予紫杉烷以便增强T细胞和NK细胞功能(齐沃格尔等人，2008)。在另一个实施例中，与在此描述的联合疗法一起给予低剂量的化学治疗剂。在一个实施例中，该化学治疗剂是雌莫司汀。在一个实施例中，该癌症是激素抗性前列腺癌。在8.7％的通过单独个性化疫苗接种治疗的晚期激素难治性前列腺癌患者中观察到血清前列腺特异性抗原(PSA)的≥50％减少，而当该个性化疫苗接种与低剂量的雌莫司汀组合时在54％的患者中观察到这种减少(伊藤(Itoh)等人，个性化的肽疫苗：一种用于癌症的新治疗方法(Personalized peptide vaccines:A new therapeutic modality forcancer.)癌症Sci 2006；97:970–976)。在一个实施例中，不与在此描述的联合疗法一起给予糖皮质激素或在在此描述的联合疗法之前给予糖皮质激素(齐沃格尔等人，2008)。在另一个实施例中，在在此所述的联合疗法之后给予糖皮质激素。在另一个实施例中，在在此所述的联合疗法之前、同时或之后给予吉西他滨以便增强肿瘤特异性CTL前体的频率(齐沃格尔等人，2008)。在另一个实施例中，5-氟尿嘧啶与在此所述的联合疗法一起给予，因为在基于肽的疫苗情况下观察到协同作用(齐沃格尔等人，2008)。在另一个实施例中，Braf的抑制剂如威罗菲尼用作另外的药剂。Braf抑制已显示与黑色素瘤抗原表达和T细胞浸润增加以及所治疗患者的肿瘤中的免疫抑制细胞因子减少相关(弗雷德里克(Frederick)等人，BRAF抑制与患有转移性黑色素瘤的患者中增强的黑色素瘤抗原表达和更有利的肿瘤微环境相关(BRAF inhibition is associated with enhanced melanoma antigen expressionand a more favorable tumor microenvironment in patients with metastaticmelanoma.)临床癌症研究2013；19:1225-1231)。在另一个实施例中，酪氨酸激酶的抑制剂用作另外的药剂。在一个实施例中，在用在此描述的联合疗法免疫接种之前使用该酪氨酸激酶抑制剂。在一个实施例中，与在此描述的联合疗法同时使用该酪氨酸激酶抑制剂。在另一个实施例中，酪氨酸激酶抑制剂用于产生更宽容的免疫环境。在另一个实施例中，该酪氨酸激酶抑制剂是舒尼替尼或甲磺酸伊马替尼。先前已表明有利的结果可以用顺序给予舒尼替尼和重组疫苗的连续每日给药来实现(Farsaci等人，舒尼替尼的剂量时程对宿主免疫应答元件和疫苗联合疗法的重要性(Consequence of dose scheduling of sunitinib onhost immune response elements and vaccine combination therapy.)国际癌症杂志(Int J Cancer)；130:1948-1959)。舒尼替尼还已经显示使用50mg/天的每日剂量逆转1型免疫抑制(芬克(Finke)等人，舒尼替尼逆转1型免疫抑制且减少肾细胞癌患者的T调控细胞(Sunitinib Reverses Type-1Immune Suppression and Decreases T-Regulatory Cellsin Renal Cell Carcinoma Patients.)临床癌症研究2008；14(20))。在另一个实施例中，与在此描述的联合疗法组合给予靶向疗法。先前已描述了靶向疗法的剂量(阿尔瓦雷斯(Alvarez)，晚期乳腺癌疗法的现在和未来发展(Present and future evolution ofadvanced breast cancer therapy.)乳腺癌研究(Breast Cancer Research)2010，12(增刊2):S1)。在另一个实施例中，与在此所述的联合疗法一起给予替莫唑胺。在一个实施例中，与在此描述的联合疗法一起每四周联合疗法以200mg/天持续5天给予替莫唑胺。类似策略的结果已显示具有低毒性(凯特(Kyte)等人，端粒酶肽疫苗接种与替莫唑胺的组合：在IV期黑色素瘤患者中的临床试验(Telomerase Peptide Vaccination Combined withTemozolomide:A Clinical Trial in Stage IV Melanoma Patients.)临床癌症研究；17(13)2011)。在另一个实施例中，与导致淋巴细胞减少的另外的治疗剂一起给予联合疗法。在一个实施例中，该另外的药剂是替莫唑胺。在这些条件下仍然能够诱导免疫应答(桑普森(Sampson)等人，更大的化学疗法诱导的淋巴细胞减少增强消除患有成胶质细胞瘤的患者中表达EGFRvIII的肿瘤细胞的肿瘤特异性免疫应答(Greater chemotherapy-inducedlymphopenia enhances tumor-specific immune responses that eliminate EGFRvIII-expressing tumor cells in patients with glioblastoma.)神经肿瘤学(Neuro-Oncology)13(3):324–333，2011)。
在此描述的组合物和方法可以根据图2中所示的通用流程在患有任何癌症的有需要的患者上使用。有需要的患者可以接受使用个性化肿瘤特异性肽的混合物的一系列初免疫苗接种。另外，在4周时间段内，初免之后可以是在维持阶段期间的两次增强。皮下递送所有疫苗接种。评价该疫苗或免疫原性组合物在患者体内的安全性、耐受性、免疫应答和临床效果以及产生疫苗或免疫原性组合物和在适当的时间框内成功地启动疫苗接种的可行性。第一组可以包括5名患者，并且在充分地展示安全性之后，可以募集10名患者的另外组。广泛地监测外周血的肽特异性T-细胞应答并且对患者随访长达两年，以评估疾病复发。
给予联合疗法与标准护理一致
在另一方面，在此描述的联合疗法提供针对有需要的患者的正治疗的癌症关于且在标准护理内给予联合疗法的适当点。在此描述的研究表明该联合疗法即使在包括外科手术、放射或化学疗法的标准护理内也能够有效地给予。针对大多数常见癌症的护理标准可以在美国国家癌症研究所的网站(http://www.cancer.gov/cancertopics)上找到。标准护理是由医疗专家接受作为用于某一类型的疾病的正确治疗且由医疗保健专业人士广泛使用的当前治疗。标准护理还被称为最优做法、标准医疗护理以及标准疗法。用于癌症的标准护理通常包括外科手术、淋巴结去除、放射、化学疗法、靶向疗法、靶向肿瘤的抗体、以及免疫疗法。免疫疗法可以包括检查点阻断剂(CBP)、嵌合抗原受体(CAR)、以及过继性T细胞疗法。在此所述的联合疗法可以结合在标准护理之内。在此所述的联合疗法还可以在由于医学的进展而改变护理标准的情况下给予。
结合在此所述的联合疗法可以取决于标准护理中可以产生免疫系统的活化的治疗步骤。已经在此描述了可以活化且与联合疗法协同作用的治疗步骤。该疗法可以有利地在活化免疫系统的治疗同时或之后给予。
结合在此所述的联合疗法可以取决于标准护理中引起免疫系统受抑制的治疗步骤。此类治疗步骤可以包括照射、高剂量的烷化剂和/或甲氨蝶呤、类固醇如糖皮质激素、外科手术(如以便除去淋巴结)、甲磺酸伊马替尼、高剂量的TNF、以及紫杉烷(齐沃格尔等人，2008)。该联合疗法可以在此类步骤之前给予或可以在此类步骤之后给予。
在一个实施例中，该联合疗法可以在骨髓移植和外周血干细胞移植之后给予。骨髓移植和外周血干细胞移植是恢复被高剂量的化学疗法和/或放射疗法破坏的干细胞的程序。在用高剂量抗癌药物和/或放射治疗之后，患者接受收获的干细胞，这些干细胞行进至骨髓并且开始产生新的血细胞。“微移植”使用更少、更低毒性剂量的化学疗法和/或放射来使患者准备好移植。“二次移植”涉及高剂量化学疗法和干细胞移植的两个连续过程。在自体移植中，患者接受他们自己的干细胞。在同系移植中，患者接受来自他们的同卵双生的干细胞。在同种异体移植中，患者接受来自他们的兄弟、姐妹或父母的干细胞。还可以使用与患者不相关的人(无血缘供体)。在一些类型的白血病中，在同种异体BMT和PBSCT之后发生的移植物抗肿瘤(GVT)效应对于治疗的有效性来说是关键的。GVT在来自供体(移植物)的白血细胞将在化学疗法和/或放射疗法之后保留在患者的体内的癌细胞(肿瘤)鉴别为外源且攻击它们时发生。使用在此描述的联合疗法的免疫疗法可以通过在移植之后免疫接种来利用这一点。另外，可以在移植之前用在此描述的联合疗法的新抗原呈递这些转移的细胞。
在一个实施例中，向患有需要外科手术的癌症的有需要的患者给予该联合疗法。在一个实施例中，向有需要的患者给予在此描述的联合疗法，其中标准护理主要是外科手术，接着治疗以去除可能的微小转移，如乳腺癌。乳腺癌通常基于癌症的分期和分级通过外科手术、放射疗法、化学疗法以及激素疗法的各种组合进行治疗。用于乳腺癌的辅助疗法是在初始疗法之后给予的任何治疗以便增加长期存活的机会。新辅助疗法是在初始疗法之前给予的治疗。用于乳腺癌的辅助疗法是在初始疗法之后给予的任何治疗以便增加长期无疾病存活的机会。初始疗法是用于减少或消除癌症的主要治疗。用于乳腺癌的初始疗法通常包括外科手术、乳房切除术(去除乳房)或乳房肿瘤切除术(用于去除肿瘤和该肿瘤周围的少量正常组织的外科手术)。在任一类型的外科手术期间，还去除一个或多个附近淋巴结以便观察癌细胞是否已经扩散至淋巴系统中。当女性具有乳房保留手术时，初始疗法几乎总是包括放射疗法。即使在早期乳腺癌中，细胞也可能脱离主要肿瘤并且扩散至身体的其他部位(转移)。因此，医生给出辅助疗法以便杀死可能已经扩散的任何癌细胞，即使它们不能通过成像或实验室测试检测到。
在一个实施例中，与用于导管原位癌(DCIS)的护理标准一致给予联合疗法。用于这种乳腺癌类型的护理标准是：
1.乳房保留手术和放射疗法，用或不用他莫昔芬。
2.全乳房切除术，用或不用他莫昔芬。
3.乳房保留手术，无放射疗法。
可以在乳房保留手术或全乳房切除术之前给予联合疗法以便使肿瘤在外科手术之前缩小。在另一个实施例中，可以给予联合疗法作为辅助疗法以便去除任何剩余的癌细胞。
在另一个实施例中，用如在此描述的联合疗法治疗被诊断为患有I期、II期、IIIA期、以及可手术IIIC乳腺癌的患者。用于这种乳腺癌类型的护理标准是：
1.局部-区域治疗：
·乳房保留疗法(乳房肿瘤切除术、乳房放射、以及腋窝的手术分期)。
·乳房改良根治术(除去整个乳房，伴随I–II级腋窝解剖)，有或无乳房重建。
·前哨淋巴结活检。
2.腋淋巴结阳性肿瘤中的乳房切除术后辅助放射疗法：
·对于一至三个淋巴结：区域放射的作用不清楚(锁骨下/锁骨上淋巴结、内乳淋巴结、腋窝淋巴结、以及胸壁)。
·对于多于四个淋巴结或结外侵犯：建议区域放射。
3.辅助型全身疗法。
在一个实施例中，作为新辅助疗法给予该联合疗法以便使肿瘤缩小。在另一个实施例中，作为辅助性全身疗法给予该组合。
在另一个实施例中，用如在此描述的联合疗法治疗被诊断为患有可手术IIIB或IIIC期或炎性乳腺癌的患者。用于这种乳腺癌类型的护理标准是：
1.以根治性目的递送的多模态疗法是用于患有临床IIIB期疾病的患者的标准护理。
2.初始外科手术通常限于活组织检查以便允许测定组织学、雌激素受体(ER)和孕激素受体(PR)水平、以及人表皮生长因子受体2(HER2/neu)过度表达。使用基于蒽环类的化学疗法和/或基于紫杉烷的疗法的初始治疗是标准。对于对新辅助化学疗法有反应的患者，局部疗法可以包括全乳房切除术，伴随腋窝淋巴结切除，接着对胸壁和区域淋巴管进行手术后放射疗法。可以在对新辅助化学疗法具有良好部分或完全反应的患者中考虑乳房保留疗法。随后全身疗法可以包括另外的化学疗法。激素疗法应被给予至肿瘤为ER阳性或未知的患者。所有患者应被视为临床试验的候选者以便评价给予多模态方案的各种组分的最适当方式。
在一个实施例中，作为多模态方案的各种组分的一部分给予该联合疗法。在另一个实施例中，在多模态方案之前、同时或之后给予该联合疗法。在另一个实施例中，基于这些模态之间的协同作用给予该联合疗法。在另一个实施例中，在用基于蒽环类的化学疗法和/或基于紫杉烷的疗法治疗之后给予该联合疗法(齐沃格尔等人，2008)。在给予该联合疗法之后治疗可能不利地影响分裂效应性T细胞。还可以在放射之后给予该联合疗法。
在另一个实施例中，在此描述的联合疗法用于治疗其中标准护理主要不是外科手术并且主要是基于全身性治疗的癌症，如慢性淋巴细胞性白血病(CLL)。
在另一个实施例中，用如在此描述的联合疗法治疗被诊断为患有I期、II期、III期、以及IV期慢性淋巴细胞系白血病的患者。用于这种癌症类型的护理标准是：
1.在无症状或受最小影响的患者中观察。
2.利妥昔单抗
3.奥法木单抗
4.口服烷化剂，有或无皮质类固醇
5.氟达拉滨，2-氯脱氧腺苷或喷司他丁
6.苯达莫司汀
7.来那度胺
8.联合化学疗法。
联合化学疗法方案包括以下：
ο氟达拉滨加环磷酰胺加利妥昔单抗。
ο氟达拉滨加利妥昔单抗，如在CLB-9712和CLB-9011试验中所观察。
ο氟达拉滨加环磷酰胺对比氟达拉滨加环磷酰胺加利妥昔单抗。
ο喷司他丁加环磷酰胺加利妥昔单抗，例如，如在MAYO-MC0183试验中所观察。
ο奥法木单抗加氟达拉滨加环磷酰胺。
οCVP：环磷酰胺加长春新碱加泼尼松。
οCHOP：环磷酰胺加阿霉素加长春新碱加泼尼松。
ο氟达拉滨加环磷酰胺对比氟达拉滨，例如，如在E2997试验[NCT00003764]和LRF-CLL4试验中所观察。
ο氟达拉滨加苯丁酸氮芥，例如，如在CLB-9011试验中所观察。
9.累及野放射疗法。
10.阿仑单抗
11.骨髓和外周血干细胞移植处于临床评价下。
12.依鲁替尼
在一个实施例中，在用利妥昔单抗或奥法木单抗治疗之前、同时或之后给予该联合疗法。因为这些是靶向B细胞的单克隆抗体，所以用联合疗法治疗可以是协同的。在另一实施例中，在有或无皮质类固醇的情况下用口服烷化剂、和氟达拉滨、2-氯脱氧腺苷或喷司他丁治疗之后给予该联合疗法，因为如果在之前给予，这些治疗可能不利地影响免疫系统。在一个实施例中，基于在此所述的前列腺癌的结果，以低剂量与该联合疗法一起给予苯达莫司汀。在一个实施例中，在用苯达莫司汀治疗之后给予该联合疗法。
疫苗或免疫原性组合物试剂盒和共同封装
在一个方面，本发明提供以下试剂盒，这些试剂盒含有在此讨论的元件中的任何一个或多个以便允许给予该联合疗法。元件可以单独地或组合地提供，并且可以被提供于任何适合的容器中，如小瓶、瓶子或管。在一些实施例中，该试剂盒包括一种或多种语言，例如多于一种语言的说明书。在一些实施例中，试剂盒包括一种或多种用于在利用在此描述的元件中的一种或多种的方法中使用的试剂。试剂可以被提供于任何适合的容器中。例如，试剂盒可以提供一种或多种递送或储存缓冲液。可以按在具体方法中可用的形式或按在使用之前需要添加一种或多种其他组分的形式(例如按浓缩或冻干形式)提供试剂。缓冲液可以是任何缓冲液，包括但不限于碳酸钠缓冲液、碳酸氢钠缓冲液、硼酸盐缓冲液、Tris缓冲液、MOPS缓冲液、HEPES缓冲液及其组合。在一些实施例中，该缓冲液是碱性的。在一些实施例中，该缓冲液具有从约7至约10的pH。在一些实施例中，该试剂盒包括在此描述的载体、蛋白质中的一个或多个和/或在此描述的多核苷酸中的一个或多个。该试剂盒可以有利地允许提供本发明的系统的所有元件。试剂盒可以涉及待给予至动物、哺乳动物、灵长类动物、啮齿类动物等的含有或编码1-50或更多种新抗原突变的一种或多种RNA的一种或多种载体和/或一种或多种粒子和/或一种或多种纳米粒子，其中这样一种试剂盒包括用于给予至这种真核细胞的说明书；并且这样一种试剂盒可以任选地包括在此描述的任何抗癌剂。该试剂盒可以包括任何上述组分(例如含有或编码1-50或更多种新抗原突变的一种或多种RNA的一种或多种载体和/或一种或多种粒子和/或一种或多种纳米粒子、新抗原蛋白质或肽、检查点抑制剂)以及用于与本发明的任何方法一起使用的说明书。
在一个实施例中，该试剂盒包含具有免疫原性组合物或疫苗的至少一个小瓶以及具有抗癌剂的至少一个小瓶。在一个实施例中，试剂盒可以包括混合且准备好给予的即用型组分。在一个方面，试剂盒包含即用型免疫原性或疫苗组合物以及即用型抗癌剂。该即用型免疫原性或疫苗组合物可以包括含有免疫原性组合物的不同池的单独小瓶。这些免疫原性组合物可以包括含有病毒载体或DNA质粒的一个小瓶，并且另一个小瓶可以包括免疫原性蛋白质。该即用型抗癌剂可以包括抗癌剂的混合物或单一抗癌剂。单独的小瓶可以包含不同的抗癌剂。在另一个实施例中，试剂盒可以包括即用型抗癌剂和处于准备用于重构形式的免疫原性组合物或疫苗。该免疫原性或疫苗组合物可以是冷冻干燥的或冻干的。该试剂盒可以包括具有可以添加至该冻干组合物以使得它准备好用于给予的重构缓冲剂的单独小瓶。该缓冲剂可以有利地包含根据本发明的佐剂或乳剂。在另一个实施例中，该试剂盒可以包括准备用于重构的抗癌剂以及准备用于重构的免疫原性组合物或疫苗。在此方面，两者均可以是冻干的。在此方面，用于每种的单独重构缓冲剂可以包括在该试剂盒中。该缓冲剂可以有利地包含根据本发明的佐剂或乳剂。在另一个实施例中，该试剂盒可以包括含有一起给予的一定剂量的免疫原性组合物和抗癌剂的单一小瓶。在另一个方面，包括多个小瓶，以使得根据治疗时间轴给予一个小瓶。一个小瓶可以仅包括用于一个治疗剂量的抗癌剂，另一个可以包括用于另一治疗剂量的抗癌剂和免疫原性组合物两者，并且一个小瓶可以仅包括用于又另一剂量的免疫原性组合物。在另一方面，将小瓶进行标记以用于其正确给予至有需要的患者。任何实施例的免疫原或抗癌剂可以处于如在此描述的冻干形式、干燥形式或处于水溶液中。免疫原可以是如在此描述的减毒活病毒、蛋白质或核酸。
在一个实施例中，该抗癌剂是增强免疫系统以便增强免疫原性组合物或疫苗的有效性的抗癌剂。在一个优选的实施例中，该抗癌剂是检查点抑制剂。在另一实施例中，该试剂盒包括沿治疗计划待在不同时间间隔给予的免疫原性组合物和抗癌剂的多个小瓶。在另一个实施例中，该试剂盒可以包括用于引发免疫应答的免疫原性组合物以及待用于增强的另一免疫原性组合物的单独小瓶。在一个方面，初免免疫原性组合物可以是DNA或病毒载体，并且加强免疫原性组合物可以是蛋白质。任一组合物均可以是冻干的或准备用于给予的。在另一个实施例中，含有至少一种抗癌剂的抗癌剂混合物包括在不同的小瓶中以用于按治疗计划给予。
虽然已经详细描述了本发明及其优点，但是应理解的是，在此可以做出各种改变、替换和变化而不脱离附加的权利要求书中定义的本发明的精神和范围。
本发明在以下实例中进一步说明，这些实施例仅为了说明目的并且无论如何都不意图限制本发明。
实例
实例1
癌症疫苗测试方案
根据示于图2中的通用流程，可以在患有高危黑色素瘤(完全切除阶段IIIB、IIIC和IVM1a,b)的15名患者身上测试在此描述的组合物和方法。患者在4周时间内可以接受一系列用个性化肿瘤特异性肽和聚-ICLC的混合物进行的初免疫苗接种，随后在维持阶段接受两次加强。皮下递送所有疫苗接种。评价该疫苗或免疫原性组合物在患者体内的安全性、耐受性、免疫应答和临床效果以及产生疫苗或免疫原性组合物和在适当的时间框内成功地启动疫苗接种的可行性。第一组可以包括5名患者，并且在充分地展示安全性之后，可以募集10名患者的另外组。广泛地监测外周血的肽特异性T-细胞应答并且对患者随访长达两年，以评估疾病复发。
如在此所述，在动物和人两者中存在大量证据证明突变表位在诱导免疫应答中是有效的并且自发性肿瘤消退或长期存活的病例与针对突变表位的CD8+T细胞应答相关(巴克沃尔特(Buckwalter)和斯里瓦斯塔瓦PK(Srivastava PK)。来自十多年的人癌症疫苗疗法的“它(们)是抗原，笨蛋”和其他课程("It is the antigen(s),stupid"and otherlessons from over a decade of vaccitherapy of human cancer)免疫学研讨文辑(Seminars in immunology)20:296-300(2008)；卡拉尼卡斯(Karanikas)等人，长期存活的肺癌患者的血液中的高频率的针对可用HLA四聚体检测到的肿瘤特异性突变抗原的细胞溶解T淋巴细胞(High frequency of cytolytic T lymphocytes directed against atumor-specific mutated antigen detectable with HLA tetramers in the blood ofa lung carcinoma patient with long survival)癌症研究(Cancer Res.)61:3718-3724(2001)；伦内尔兹(Lennerz)等人，自体T细胞对人黑色素瘤的应答受突变新抗原左右(Theresponse of autologous T cells to a human melanoma is dominated by mutatedneo-antigens)美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad Sci U S A.)102:16013(2005))并且“免疫编辑(immunoediting)”可以追溯到显性突变抗原在小鼠和人体内的表达的改变(Matsushita(Matsushita)等人，癌症外显子组分析揭示了癌症免疫编辑的T细胞依赖性机制(Cancer exome analysis reveals a T-cell-dependent mechanism of cancerimmunoediting)自然(Nature)482:400(2012)；杜佩奇(DuPage)等人，肿瘤特异性抗原的表达是癌症免疫编辑的基础(Expression of tumor-specific antigens underlies cancerimmunoediting)自然482:405(2012)；和桑普森(Sampson)等人，在新近诊断成胶质细胞瘤的患者中在长时间无进展存活之后表皮生长因子受体变体III多肽疫苗接种的免疫逃逸(Immunologic escape after prolonged progression-free survival with epidermalgrowth factor receptor variant III peptide vaccination in patients with newlydiagnosed glioblastoma)临床肿瘤学杂志(J Clin Oncol.)28:4722-4729(2010))。
下一代测序现在可以快速揭示离散突变的存在，如单个肿瘤中的编码突变，最常见的是单氨基酸改变(例如，错义突变)和由终止密码子中的移码插入/缺失/基因融合、连读突变和不当剪接内含子的翻译产生的不经常的新颖的氨基酸段(例如，新ORF)。新ORF作为免疫原是特别有价值的，因为它们的序列整体对于免疫系统而言完全是新颖的并且所以类似于病毒或细菌外源抗原。因此，新ORF：(1)对肿瘤是高度特异性的(即在任何正常细胞中没有表达)；(2)可以绕开中枢耐受，从而增加新抗原特异性CTL的前体频率。例如，最近已用衍生自人乳头瘤病毒(HPV)的肽证明了在治疗性抗癌疫苗中利用类似外源序列的功效。19个患有瘤形成前的病毒诱导的疾病、接受3-4次衍生自病毒癌基因E6和E7的HPV肽的混合物的疫苗接种的患者中的约50％维持了≥24个月的完全应答(肯特尔(Kenter)等人，用于外阴上皮内瘤形成的针对HPV-16癌蛋白的疫苗接种(Vaccination against HPV-16Oncoproteins for Vulvar Intraepithelial Neoplasia)NEJM 361:1838(2009))。
测序技术已经揭示，每个肿瘤都包含多个改变基因的蛋白质编码内容的患者特异性突变。此类突变产生改变的蛋白质，范围从单氨基酸改变(由错义突变引起)到归因于终止密码子的移码、连读或内含子区的翻译的添加长区域的新颖氨基酸序列(新颖开放阅读框突变；新ORF)。这些突变蛋白质对于宿主对肿瘤的免疫应答而言是有价值的靶标，因为不像天然蛋白质，它们不受自身耐受的免疫抑制作用的影响。因此，突变蛋白质更可能具有免疫原性并且与患者的正常细胞相比对肿瘤细胞还更具特异性。
利用最近改进的用于预测哪些错义突变产生至患者的同源MHC分子的强结合肽的算法，鉴别并优先化一组代表每个患者的最佳突变表位(新ORF和错译两者)的肽并且制备多达20或更多种肽供免疫用(张(Zhang)等人，免疫学中的机器学习竞争–HLA I类结合肽的预测(Machine learning competition in immunology–Prediction of HLA class Ibinding peptides)免疫学方法杂志(J Immunol Methods)374:1(2011)；伦德戈德(Lundegaard)等人，使用基于神经网络的方法预测表位(Prediction of epitopes usingneural network based methods)免疫学方法杂志374:26(2011))。合成长度约20-35个氨基酸的肽，因为此类“长”肽在专职抗原呈递细胞(如树突细胞)中经历有效的内化、加工和交叉呈递，并且已经显示可在人类体内诱导CTL(梅利夫(Melief)和范德伯格(van derBurg)，通过合成的长肽疫苗进行的已形成的(前)恶性疾病的免疫疗法(Immunotherapy ofestablished(pre)malignant disease by synthetic long peptide vaccines)癌症自然评论(Nature Rev Cancer)8:351(2008))。
除强大且特异性的免疫原之外，有效的免疫应答还有利地包括强佐剂来激活免疫系统(斯派泽(Speiser)和罗梅罗(Romero)，用于癌症免疫疗法的分子水平上定义的疫苗，以及保护性T细胞免疫(Molecularly defined vaccines for cancer immunotherapy,andprotective T cell immunity)免疫学研讨文辑(Seminars in Immunol)22:144(2010))。例如，Toll样受体(TLR)已经作为微生物和病毒病原体“危险信号”的强大传感物，有效地诱导先天免疫系统，并且进而有效地诱导适应性免疫系统(巴德瓦杰(Bhardwaj)和戈恩加特克(Gnjatic)，TLR激动剂：它们是好的佐剂吗？(TLR AGONISTS:Are They Good Adjuvants？)癌症杂志(Cancer J.)16:382-391(2010))。在TLR激动剂之中，聚-ICLC(一种合成双链RNA模拟物)是骨髓衍生的树突细胞的最有效激活剂之一。在一项人类志愿者研究中，已经显示聚-ICLC是安全的并且可在外周血细胞中诱导与通过最有效的减毒活病毒疫苗之一黄热病疫苗YF-17D诱导的基因表达谱可比的基因表达谱(卡斯基(Caskey)等人，合成双链RNA在人体内诱导与活病毒疫苗类似的先天性免疫应答(Synthetic double-stranded RNA induces innate immuneresponses similar to a live viral vaccine in humans)实验医学杂志(J Exp Med)208:2357(2011))。(一种由Oncovir公司制备的聚-ICLC的GMP制剂)被用作佐剂。
实例2
目标患者群体
即使在完全手术切除疾病的情况下，患有IIIB、IIIC和IVM1a,b期黑色素瘤的患者仍有显著的疾病复发和死亡风险(巴尔奇(Balch)等人，最终版本的2009AJCC黑色素瘤分期与分类(Final Version of 2009AJCC Melanoma Staging and Classification)临床肿瘤学杂志(J Clin Oncol)27:6199–6206(2009))。用于此患者群体的一种可用的全身性佐剂疗法是干扰素-α(IFNα)，它提供可测量的但是边际的益处并且与显著的频繁的剂量限制性毒性相关(柯克伍德(Kirkwood)等人，高风险切除皮肤黑色素瘤的干扰素α-2b辅助疗法：东部肿瘤协作组试验EST 1684(Interferon alfa-2b Adjuvant Therapy of High-RiskResected Cutaneous Melanoma:The Eastern Cooperative Oncology Group Trial EST1684)临床肿瘤学杂志(J Clin Oncol)14:7-17(1996)；柯克伍德等人，高风险的黑色素瘤中的高剂量和低剂量干扰素α-2b：组间试验E1690/S9111/C9190的首次分析(High-andLow-dose Interferon Alpha-2b in High-Risk Melanoma:First Analysis ofIntergroup Trial E1690/S9111/C9190)临床肿瘤学杂志18:2444–2458(2000))。这些患者的免疫未被先前的癌症定向疗法或被活动性癌症(active cancer)损及并且因此代表用于评估疫苗的安全性和免疫影响的极佳的患者群体。最后，这些患者的当前护理标准在手术之后不要求任何治疗，因此允许8–10周的窗口期来制备疫苗。
该目标群体是具有可临床检测的、组织学上确认的淋巴结(局部或远处)转移或过渡态转移，已经完全切除且摆脱疾病的皮肤黑色素瘤患者(IIIB期的大部分(由于需要充足肿瘤组织用于测序和细胞系发育，患有溃疡型原发性肿瘤但具有微转移淋巴结(T1-4b、N1a或N2a)的患者被排除，IIIC期和IVM1a,b期的全部)。这些可以是初次诊断或在先前诊断出前期黑色素瘤之后处于疾病复发的患者。
肿瘤收获：患者可以经历完全切除他们的原发性黑色素瘤(如果尚未去除的话)以及所有区域转移性疾病，其意图是使他们摆脱黑色素瘤。在已经收集用于病理评估的足够肿瘤之后，将剩余的肿瘤组织放置在无菌容器的无菌培养基中并准备进行解聚。将部分肿瘤组织用于全外显子组和转录组测序和细胞系建立并且将任何剩余肿瘤冷冻。
正常组织收获：对正常组织样品(血液或痰液样品)进行全外显子组测序。
鉴别具有临床上明显的局部区域转移性疾病或完全可切除的远处淋巴结、皮肤或肺转移性疾病(但不存在不可切除的远处或内脏转移性疾病)的患者并将其募集在该项研究中。患者在手术之前进入是必需的，以便获取供黑色素瘤细胞系发育用的新鲜的肿瘤组织(以产生用于作为免疫监测计划的一部分的体外细胞毒性测定的靶细胞)。
实例3
剂量和时程
对于已经满足所有预处理标准的患者，可以在研究药物已经到达且已经满足进入规格之后，尽快开始疫苗给予。对于每个患者，存在四种单独的研究药物，每种包含20种患者特异性肽中的5种。可以大致根据示于图3中的方案进行免疫。
在门诊部对患者进行治疗。每个处理日的免疫可以由四个1ml皮下注射剂组成，每个注射进单独的一肢，以便靶向淋巴系统的不同区域，以减少抗原竞争。如果患者已经经历了完整的腋窝或腹股沟淋巴结清除术，则将疫苗给予至右膈或左膈作为一个替代方案。每个注射剂可以由用于该患者的4种研究药物中的1种组成并且对于每个循环，将相同的研究药物注入同一肢。每个1ml注射剂的组成是：
0.75ml含有各自300μg的5种患者特异性肽的研究药物
0.25ml(0.5mg)的2mg/ml聚-ICLC
在诱导/初免阶段过程中，在第1、4、8、15及22天对患者免疫。在维持阶段中，患者可以在第12和24周接受加强剂量。
可以在多个时间点获得血液样品：初免疫苗接种之前(基线；在不同天两个样品)；初免疫苗接种期间第15天；在诱导/初免疫苗接种之后四周(第8周)；第一次加强之前(第12周)和之后(第16周)；第二次加强之前(第24周)和之后(第28周)针对每个样品收集50–150ml血液(除了第16周)。初级免疫终点在第16周，并且因而患者可以经历白细胞分离术(除非另外指明，基于患者和医生评估)。
实例4
免疫监测
该免疫策略是“初免-加强”方法，涉及初始一系列紧密间隔的免疫来诱导免疫应答，随后休息一段时间以允许产生记忆T细胞。这之后是加强免疫，并且预期此次加强之后4周T细胞应答产生最强应答并且是初级免疫终点。在18小时离体ELISPOT测定中，最初使用来自此时间点的外周血单核细胞监测整体免疫应答，用包含所有免疫表位的重叠15mer肽(11个aa重叠)池进行刺激。评估疫苗接种之前的样品，以建立对此肽池的基线应答。如保证那样，评估另外的PBMC样品，以检查对总肽混合物的免疫应答的动力学。对于展现出显著高于基线的应答的患者，将所有15mer肽的池解卷积，以确定哪种或哪些具体免疫肽是具免疫原性的。另外，视情况而定针对适当的样品进行多个另外的测定：
·将整个15mer池或亚池用作细胞内细胞因子染色测定的刺激肽，以鉴别并定量抗原特异性CD4+、CD8+、中枢记忆和效应记忆群体
·类似地，这些池被用来评估由这些细胞分泌的细胞因子的模式，以确定TH1与TH2表型
·未刺激细胞的细胞外细胞因子染色和流式细胞术被用来定量Treg和髓源性抑制细胞(MDSC)。
·如果从应答患者成功地建立了黑色素瘤细胞系并且可以鉴别激活表位，则使用突变型和对应的野生型肽进行T细胞细胞毒性测定
·通过使用已知的黑色素瘤肿瘤相关抗原作为刺激剂并且通过使用若干另外的不是在免疫原之间选择的经鉴别的突变表位评估来自初级免疫终点的PBMC的“表位扩展”，如图4所示。
进行该肿瘤样品的免疫组织化学，以定量CD4+、CD8+、MDSC及Treg浸润性群体。
实例5
患有转移性疾病的患者中的临床功效
患有转移性疾病的患者的疫苗治疗被他们对活动性癌症的有效疗法的需求和随之发生的缺乏用于疫苗制备的停止治疗(off treatment)时间窗而复杂化。此外，这些癌症治疗可能损及患者的免疫系统，从而可能妨碍免疫应答的诱导。牢记这些考虑事项，可以对以下情形进行选择：其中疫苗制备的时机暂时符合特定患者群体的其他标准护理方法和/或其中这样的标准护理明确地与免疫治疗方法可兼容。存在两种类型的可以寻求的情形：
1.与检查点阻断组合：检查点阻断抗体已经作为转移性黑色素瘤的有效免疫疗法(霍迪(Hodi)等人，用伊匹单抗改善患有转移性黑色素瘤的患者的存活(ImprovedSurvival with Ipilimumab in Patients with Metastatic Melanoma)NEJM 363:711–723(2010))并且正在被积极寻求用于其他疾病情形，包括非小细胞肺癌(NSCLC)和肾细胞癌(托帕利安(Topalian)等人，抗-PD-1抗体在癌症中的安全性、活性与免疫相关因素(Safety,Activity,and Immune Correlates of Anti-PD-1Antibody in Cancer)NEJM366:2443-2454(2012)；布拉汉姆(Brahmer)等人，抗-PD-L1抗体在患有晚期癌症的患者体内的安全性与活性(Safety and Activity of Anti-PD-L1Antibody in Patients withAdvanced Cancer)NEJM 366:2455-2465(2012))。尽管未证实作用机制，但是局部免疫抑制解除的逆转和免疫应答的增强两者是可能的解释。整合强大的疫苗以用检查点阻断抗体启动免疫应答可以提供协同作用，如在多项动物研究中所观察到的(范埃尔莎(van Elsas)等人，使用抗细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)和粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)产生疫苗联合免疫治疗B16黑色素瘤诱导伴随自身免疫性色素脱失的皮下和转移性肿瘤的排异反应(Combination immunotherapy of B16melanoma using anti-cytotoxic Tlymphocyte-associated antigen 4(CTLA-4)and granulocyte/macrophage colony-stimulating factor(GM-CSF)-producing vaccines induces rejection ofsubcutaneous and metastatic tumors accompanied by autoimmune depigmentation)实验医学杂志(J Exp Med)190:35-366(1999)；李(Li)等人，抗程序性死亡1与粒细胞巨噬细胞集落刺激因子–分泌肿瘤细胞免疫疗法协同为患有已确立的肿瘤的小鼠提供治疗益处(Anti-programmed death-1synergizes with granulocyte macrophage colony-stimulating factor–secreting tumor cell immunotherapy providing therapeuticbenefit to mice with established tumors)临床癌症研究(Clin Cancer Res)15:1623–1634(2009)；帕多尔，D.M.(Pardoll,D.M.)癌症免疫疗法中的免疫检查点阻断(The blockadeof immune checkpoints in cancer immunotherapy)癌症自然评论(Nature ReviewsCancer)12:252–264(2012)；库兰(Curran)等人，PD-1和CTLA-4组合阻断在B16黑色素瘤肿瘤内扩增浸润性T细胞并减少调节性T和骨髓细胞(PD-1and CTLA-4combination blockadeexpands infiltrating T cells and reduces regulatory T and myeloid cells withinB16melanoma tumors)美国国家科学院院刊2010年3月2日；107(9):4275-80；库兰等人，表达flt3配体的肿瘤疫苗与ctla-4阻断协同以排斥着床前肿瘤(Tumor vaccines expressingflt3ligand synergize with ctla-4blockade to reject preimplanted tumors)癌症研究(Cancer Res.)2009年10月1日；69(19):7747-55)。患者可以立即开始检查点阻断疗法同时疫苗正在制备之中并且制备之后，可以将疫苗给药与抗体疗法整合，如图5所示；和
2.与展示出有益的免疫特性的标准治疗方案组合。
a)呈现有转移性疾病的肾细胞癌(RCC)患者典型地经历手术减瘤，随后是全身性治疗，它通常是与批准的酪氨酸激酶抑制剂(TKI)之一一起，如舒尼替尼、帕唑帕尼和索拉非尼。在批准的TKI之中，已经显示舒尼替尼可增加TH1反应性并减少Treg和髓源性抑制细胞(芬克(Finke)等人，舒尼替尼在肾细胞癌患者中逆转1型免疫抑制并减少T调节细胞(Sunitinib reverses Type-1immune suppression and decreases T-regulatory cellsin renal cell carcinoma patients)临床癌症研究(Clin Can Res)14:6674-6682(2008)；泰尔梅(Terme)等人，VEGFA-VEGFR途径阻断在结肠直肠癌中抑制肿瘤诱导的调节T细胞增殖(VEGFA-VEGFR pathway blockade inhibits tumor-induced regulatory Tcell proliferation in colorectal cancer)(在线公开的癌症研究作者手稿(CancerResearch Author Manuscript))(2102))。用不损及免疫系统的批准的疗法立即治疗患者的能力提供了所需的时间窗来制备疫苗并可以与疫苗疗法提供协同作用。另外，环磷酰胺(CTX)已经牵涉于多项动物和人类研究中对Treg细胞具有抑制作用，并且最近已经显示在疫苗之前的单剂量CTX可改善响应于该疫苗的RCC患者的存活(沃尔特(Walter)等人，在单次剂量环磷酰胺之后对癌症疫苗IMA901的多肽免疫应答与更长的患者存活相关(Multipeptide immune response to a cancer vaccine IMA901after single-dosecyclophosphamide associates with longer patient survival)自然医学(NatureMedicine)18:1254-1260(2012))。这些免疫协同方法两者都已经被用于RCC中的天然肽疫苗的最近完成的3期研究中(ClinicalTrials.gov，在接受用于晚期/移性肾细胞癌的舒尼替尼的患者(Patients Receiving Sunitinib for Advanced/Metastatic Renal CellCarcinoma)中的NCT01265901IMA901)；
b)可替代地，成胶质细胞瘤(GBM)的标准治疗涉及手术、康复和后续放射以及低剂量替莫唑胺(TMZ)，随后是开始标准剂量TMZ之前的四周休息期。此标准治疗提供了时间窗用于疫苗制备，随后在开始标准剂量TMZ之前启动疫苗接种。有趣的是，在一项转移性黑色素瘤研究中，在标准剂量TMZ治疗过程中进行肽疫苗接种与单独的疫苗接种相比而言增加测量的免疫反应性，从而表明了另外的协同益处(凯特(Kyte)等人，与替莫唑胺组合的端粒酶肽疫苗接种：一项IV期黑色素瘤患者临床试验(Telomerase peptide vaccinationcombined with temozolomide:a clinical trial in stage IV melanoma patients)临床癌症研究(Clin Cancer Res)17:4568(2011))。
实例6
新抗原制备
在手术切除肿瘤之后，将一部分肿瘤组织和血液样品立即转移至设备，在该设备中其被分配独特识别码以用于进一步追踪。将该肿瘤组织用胶原酶解聚并且单独的部分被冷冻以用于核酸(DNA和RNA)提取。将该血液样品立即转移至设备以用于核酸提取。提取自肿瘤组织的DNA和/或RNA被用于全外显子组测序(例如，通过使用亿明达(Illumina)HiSeq平台)并且用来确定HLA分型信息。在本发明的范围内考虑到的是可以通过基于蛋白质的技术(例如，质谱法)直接鉴别错义或新ORF新抗原肽。
如下进行生物信息学分析。外显子组和RNA–SEQ fast Q文件的序列分析利用已经在大规模项目中得到广泛使用和验证的现有生物信息渠道，如针对许多患者样品的TCGA(例如，查普曼(Chapman)等人，2011；斯特兰斯基(Stransky)等人，2011；伯杰(Berger)等人，2012)。存在两种顺序分析类别：数据处理与癌症基因组分析。
数据处理渠道：由测序平台公司(Sequencing Platform)开发的皮卡德(Picard)数据处理渠道(picard.sourceforge.net/)。使用皮卡德渠道中的不同模块，使提取自(例如，亿明达)序列仪的每个肿瘤和正常样品的原始数据经受以下过程：
(i)数据转换：将原始亿明达数据转换成标准BAM格式，并且产生关于超过不同质量阈值的碱基的分布的基本QC量度。
(ii)比对：使用巴罗斯-惠勒比对工具(Burrows-Wheeler Alignment Tool)(BWA)将阅读对(read pair)与人基因组(hg19)进行比对。
(iii)标记重复(Mark duplicate)：基于阅读对图位来鉴别PCR和光学重复并标记在最终BAM文件中。
(iv)插入缺失(Indel)重新比对：检查与基因组中的已知插入和缺失多态位点比对的读数并且校正其中在重新比对时针对改进的log优势(log-odds)(LOD)为至少0.4的那些位点。
(v)质量重新校准：基于读取循环、泳道、流动池瓦(flow cell tile)、所讨论的碱基以及前述碱基来重新校准由亿明达渠道报告的原始碱基质量得分。重新校准假定非dbSNP位置中的所有错配是由于误差，其使得能够将感兴趣的每种类别中的误差概率重新校准为在观察结果总数中的错配的分数。
(vi)质量控制：对最终BAM文件进行处理以产生广泛QC量度，包括循环读取质量、质量得分分布、比对的总结、以及插入物大小分布。将质量QC失败的数据列入黑名单。
(vii)身份验证：将在大约100个已知的SNP位置处正交收集的样品基因型数据针对序列数据进行检查以便确认样品的身份。LOD得分≥10用作身份确认的阈值。将身份QC失败的数据列入黑名单。
(viii)数据聚合：将来自同一样品的所有数据合并且重复标记重复步骤。鉴别含有推定短插入和缺失区域的新颖靶区域斌企鹅在这些基因座处进行插入缺失重新比对步骤。
(ix)在聚合的数据中的推定插入缺失周围局部重新比对：鉴别含有推定短插入和缺失的新颖靶区域并且在这些基因座处进行局部重新比对步骤(例如，使用GATKRealignerTargetCreator和IndelRealigner模块)以便确保插入缺失调用的一致性和正确性。
(x)对聚合的数据的质量控制：重新计算QC量度如比对总结和插入物大小分布。此外，产生一组量度，该组量度评估在来自提取过程的反应性污染物存在下由DNA的声剪切引起的文库构建过程的早期步骤中的氧化损伤率。
皮卡德的输出是一份bam文件(李(Li)等人，2009)(参见例如，http://samtools.sourceforge.net/SAM1.pdf)，该文件存储了给定样品的所有读数的碱基序列、质量得分和比对细节。
癌症突变检测渠道：如在此所述对来自皮卡德渠道的肿瘤和匹配的正常bam文件进行分析：
1.质量控制
(i).Capseg程序应用于肿瘤和匹配的正常外显子组样品，以得到DNA拷贝数曲线。拷贝数QC工具然后可以用于手动检查所产生的曲线并且评估肿瘤/正常样品混合物。标记具有杂乱曲线的正常样品以及其中肿瘤样品具有比相应正常值更低的拷贝数变化的情况并且通过数据产生和分析渠道追踪以便检查混合物。
(ii).基于Capseg产生的拷贝数曲线，通过ABSOLUTE工具15评价肿瘤纯度和倍性。非常杂乱的曲线可能由高度降解的样品的测序产生。在此类情况下肿瘤纯度和倍性估计将是不可能的并且标记相应样品。
(iii).ContEst(斯布尔斯基(Cibulskis)等人，2011)被用来确定样品中交叉样品污染的水平。丢弃具有大于4％污染的样品。
2.体细胞单核苷酸变异(SSNV)的鉴别
通过使用称为muTect的贝叶斯统计框架(斯布尔斯基(Cibulskis)等人，2013)分析来自患者的肿瘤和匹配的正常bam而鉴别体细胞碱基对取代。在该预处理步骤中，滤掉具有占优势的低质量碱基的读数或与基因组的错配。然后，Mutect计算两个log优势(log-odds)(LOD)得分，这两个得分分别概括了在肿瘤和正常样品中存在和不存在变体情况下的置信度。在处理后阶段中，通过六个滤波器过滤候选突变，以便将捕获、测序和比对的假象考虑在内；
(i)邻近空位：除去由于在事件附近未对准的插入缺失的存在产生的假阳性。在候选突变周围的11-bp窗中具有插入或缺失、读数≥3的样品被丢弃。
(ii)不良映射：丢弃由于基因组中的读数的模糊布置产生的假阳性。如果肿瘤样品和正常样品中≥50％读数具有映射质量零或如果不存在具有映射质量≥20的突变等位基因的读数，则丢弃候选物。
(iii)三等位基因位点：丢弃在正常中杂合的位点，因为这些具有产生许多假阳性的倾向。
(iv)链偏向性：除去由背景特异性测序误差造成的假阳性，其中具有突变的一大部分读数具有相同取向。在链特异性LOD<2的情况下，在通过该阈值的灵敏度≥90％的情况下丢弃候选物。
(v)聚簇的位置：丢弃由于特征在于在距离读数比对的起点或终点固定距离处出现的交替等位基因的比对误差所致的假阳性。如果与读数的起点和终点的中值距离≤10(这意味着突变在比对的起点或终点处)或如果这些距离的中值绝对偏差≤3(这意味着这些突变是聚簇的)，则丢弃。
(vi)在对照中观察：丢弃肿瘤中的假阳性，其中存在正常样品中出现超出通过随机测序误差所预期的交替等位基因的证据。如果存在含有正常样品中的交替等位基因的≥2个读数或如果它们在这些读数≥3％内且如果其质量得分的和>20，则丢弃。
除了这6个滤波器之外，将候选物针对一组正常样品进行比较，并且据发现作为两种或更多种样品中的生殖细胞变体存在的那些被丢弃。然后，可以将最终一组突变用Oncotator工具由若干字段进行注释，包括基因组区、密码子、cDNA以及蛋白质变化。
3.体细胞小插入和缺失的鉴别
在此描述(参见“在聚合的数据中的推定插入缺失周围局部重新比对”，同上)的局部重新比对输出被用来基于支持变体排外地存在于肿瘤或存在于肿瘤和正常bam两者中的读数的评估来分别预测候选体细胞和生殖细胞插入缺失。基于错配的数目和分布以及碱基质量得分进行进一步过滤(麦克纳(McKenna)等人，2010；德普里斯托(DePristo)等人，2011)。使用整合基因组学查看器(Integrated Genomics Viewer)(罗宾逊(Robinson)等人，2011)(www.broadinstitute.org/igv)手动检查所有插入缺失，以保证高保真调用。
4.基因融合检测
基因融合检测渠道中的第一步是将肿瘤RNA-Seq读数与已知基因序列的文库比对，随后将此比对标绘至基因组坐标上。基因组作图有助于压缩映射至不同转录物变体的多个阅读对，这些变体与常见基因组位置共享外显子。针对阅读对来查询DNA比对bam文件，其中这两个配偶体映射至两个不同编码区，这两个不同编码区在不同染色体上或如果在同一染色体上相隔至少1MB。还可以要求在其相应基因中比对的对末端处在与(推定)融合mRNA转录物的编码-->编码5'->3'方向一致的方向上。基因对(其中存在至少两个这样的‘嵌合’阅读对)的列表被枚举为经受进一步细化的初始推定事件列表。接下来，从原始bam文件中提取所有未比对读数，其中附加约束是其配偶体起初已经被比对并标绘进如上所述获得的基因对的基因之一中。然后，可以尝试将所有此类起初未比对的读数与发现的基因对之间的所有可能外显子-外显子连接(全长，边界到边界，处于编码5'->3'方向)的定制“参考”构建进行比对。如果一个这样起初未比对的读数(唯一地)映射在基因X的外显子与基因Y的外显子之间的连接上，并且其配偶体的确被映射至基因X或Y之一，则这样的一个读数被标记为“融合”读数。以下情况被称为基因融合事件：在与其配偶体正确的相对取向上存在至少一个融合读数，在显子:外显子连接周围没有数量过多的错配并且覆盖任一基因的至少10bp。高度同源基因(例如HLA家族)之间的基因融合可能是假性的并且被过滤掉。
5.克隆性的估计
生物信息学分析可以被用来估计突变的克隆性。例如，ABSOLUTE算法(卡特(Carter)等人，2012；兰道(Landau)等人，2013)可以被用来估计肿瘤纯度、倍性、绝对拷贝数以及突变的克隆性。生成每个突变的等位基因分数的概率密度分布，随后将其转化为这些突变的癌症细胞分数(CCF)。基于其CCF超过0.95的后验概率是大于还是小于0.5而将突变分别分类为克隆的或亚克隆的。
6.表达的定量
TopHat套件(兰米德(Langmead)等人，2009)被用来对肿瘤和匹配的正常bam的RNA-Seq读数与hg19基因组进行比对。通过RNA-SeQC(德卢卡(DeLuca)等人，2012)包评估RNA-Seq数据的质量。然后，RSEM工具(李(Li)等人2011)被用来估计基因和同种型表达水平。产生的读数/千碱基/百万和τ估计值被用来对如别处所述的每个患者体内鉴别的新抗原进行排列次序。
7.RNA-Seq中的突变验证
8.通过检查患者的相应RNA-Seq肿瘤BAM文件来评估通过如在此描述的全外显子组数据的分析鉴别的体细胞突变的确认。对于每个变体基因座，进行基于β-二项分布的概率计算，以保证存在至少95％概率在RNA-Seq数据中检测到它。如果对于具充足概率的位点存在至少2个具有捕获的鉴别的突变的读数，则认为该突变是经过验证的。
包含肿瘤特异性突变的表位的选择：使用基于神经网络的算法MHC分析所有错义突变和新ORF中包含突变的表位的存在，上述算法是由荷兰的丹麦技术大学(TechnicalUniversity of Denmark)的生物序列分析中心(Center for Biological SequenceAnalysis)提供并维护的。基于最近完成的一系列相关方法之间的竞争(ref)，此算法家族被评为顶级表位预测算法。使用基于人工神经网络的方法对覆盖在高加索人群体(局部地区中的目标患者群体的主要族群)中发现的99％的HLA-A等位基因和87％的HLA-B等位基因的69种不同的人HLA A和B等位基因训练这些算法。使用最新的版本(v2.4)。
通过对来自HLA同种异型已知的CLL患者体内发现的突变进行预测而评估这些算法的准确度。被包括的同种异型是A0101、A0201、A0310、A1101、A2402、A6801、B0702、B0801、B1501。在2011年中期使用netMHCpan跨每个突变对所有9mer和10mer肽进行了预测。基于这些预测，合成了七十四种(74)9mer肽和六十三种(63)10mer肽，大多数的预测亲和力低于500nM，并且使用竞争性结合测定(塞特(Sette))测量结合亲和力。
使用netMHCC服务器的最新版本中的每种(netMHCpan、netMHC和netMHCcons)在2013年3月对这些肽进行重复预测。这三种算法是在2012年在竞争中使用的一组20种算法之中最受好评的算法(张(Zhang)等人)。然后，相对于这些新预测中的每者评估观察到的结合亲和力。对于每组预测值和观察值而言，给出每个范围的正确预测％以及样品的数目。每个范围的定义如下：
0–150：预测亲和力等于或低于150nM并且测量亲和力等于或低于150nM。
0–150*：预测亲和力等于或低于150nM并且测量亲和力等于或低于500nM。
151–500nM：预测亲和力大于150nM但是等于或低于500nM并且测量亲和力等于或低于500nM。
FN(>500nM)：假阴性–预测亲和力大于500nM但是测量亲和力等于或低于500nM。
对于9mer肽(表1)而言，在这些算法之间几乎没有差异，其中netMHC cons的151-500nM范围的略高值未被判断为显著，因为样品的数目少。
表1
对于10mer肽(表2)而言，在这些算法之间再次几乎没有差异，除netMHC产生了比netMHCpan或netMMHCcons显著更多的假阳性之外。然而，与9mer相比，10mer预测的精度在0–150nM和0–150*nM范围内稍微更低并且在151-500nM范围内显著更低。
表2
对于10mer而言，仅0–150nM范围内的预测被利用，因为在151-500nM范围内对结合物而言的精度低于50％。
针对任何单独HLA等位基因，样品数目太少，以至于不能得出任何关于预测算法针对不同等位基因的准确度的结论。来自最大可用亚群(0–150*nM；9mer)的数据在表3中作为实例示出。
表3
仅仅利用HLA A和B等位基因的预测，因为几乎没有可用于判断对于HLA C等位基因的预测的准确度的数据(张(Zhang)等人)。
使用来自TCGA数据库的信息对黑色素瘤序列信息和肽结合预测进行评估。来自不同患者的220个黑色素瘤的信息揭示：平均起来，每个患者具有大约450个错义和5个新ORF。随机选择20个患者并且使用netMHC针对所有错义突变计算预测的结合结合亲和力(伦德戈德(Lundegaard)等人，使用基于神经网络的方法预测表位(Prediction of epitopes usingneural network based methods)免疫学方法杂志(J Immunol Methods)374:26(2011))。因为这些患者的HLA同种异型是未知的，所以基于该同种异型的频率调整每个同种异型的预测的结合肽的数目(针对在地理区域预期影响的主导群体的骨髓登记(Bone MarrowRegistry)数据集[白种人的黑色素瘤])，以产生每个患者的随时备用的突变型表位的预测数目。对于这些突变型表位(MUT)中的每者而言，还预测了对应的天然(NAT)表位结合。
利用在此描述的优先级：
·90％(20名中的18名)的患者被预测具有适用于疫苗接种的20种肽；
·对于接近四分之一的患者而言，新ORF肽可以构成几乎所有20种肽的一半。
·对于仅超过一半的患者，将仅使用类别1和2中的肽；
·对于80％的患者来说，将仅使用类别1、2和3中的肽。
因此，在黑色素瘤中存在足够数目的突变，从而预期高比例的患者可产生足够数目的免疫原性肽。
实例7
肽产生与配制
根据FDA法规，通过化学合成(梅里菲尔德(Merrifield)RB：固相肽合成肽.I.四肽的合成.美国化学会志(J.Am.Chem.Soc.)85:2149-54,1963)来制备用于疫苗接种的GMP新抗原肽。已经进行三轮开发，各轮20种约20-30mer肽。每轮都在相同设施中进行并且利用用于GMP运行相同的设备，利用草拟GMP批次记录。每轮都成功地产生>50mg的每种肽，通过所有当前计划的释放测试(例如，通过MS鉴别外观，通过RP-HPLC鉴别纯度，通过元素氮鉴别含量以及通过RP-HPLC鉴别TFA含量)来测试这些肽并且适当时满足针对性规范。在针对该过程的此部分预期的时间段内(大约4周)也产生了这些产物。将冻干的整批肽放置在长期稳定性研究中并且在不同时间点对其进行评估长达12个月。
来自这些运行的材料已经被用来测试计划的溶解与混合方法。简言之，把每种肽以高浓度(50mg/ml)溶解于100％DMSO中并在水性溶剂中稀释至2mg/ml。最初，预期的是PBS将被用作稀释剂，然而，小数目的肽的盐析产生了可见混浊。显示D5W(5％葡萄糖水溶液)有效得多；40种肽中的37种被成功稀释为澄清溶液。仅有问题的肽是非常疏水性的肽。
表4示出基于所计算的疏水性氨基酸的分数分选的60种潜在新抗原肽的溶解性评估的结果。如所示，几乎所有疏水性分数低于0.4的肽都可溶于DMSO/D5W中，但疏水性分数大于或等于0.4的许多肽不溶于DMSO/D5W中(由标记“DMSO/D5W中的溶解性”的列中的红色高亮显示指示)。许多这些可以通过添加琥珀酸盐溶解(由列“在DMSO/D5W/琥珀酸盐中的溶解性”中的绿色高亮显示指示)。这些肽中的4种中的3种具有0.4与0.43之间的疏水性分数。四种肽在添加琥珀酸盐之后变得溶解性降低；这些肽中的4种中的3种具有大于或等于0.45的疏水性分数。
表4
评估计划的免疫肽的预测生物化学特性并且可以相应地改变合成计划(使用较短的肽，在预测表位周围的N-末端或C-末端方向上改变待合成区域，或潜在地利用替代肽)以便限制具有高疏水性分数的肽的数目。
使DMSO/D5W中的十种分开的肽经受两个冻/融循环并显示完全回收。将两种单独的肽溶解于DMSO/D5W中并在两个温度(-20℃和-80℃)下评定稳定性。对这些肽进行评估(RP-HPLC和pH和视觉检查)持续达24周。两种肽均稳定持续达24周；当在-20℃或-80℃下储存时，对于任一肽，通过RP-HPLC测定检测的杂质百分比不会显著变化。任何较小变化似乎是由于测定可变性所致，因为未注意到待评估的倾向。
如图6所示，剂型过程的设计是制备4个患者特异性肽池，每个由5种肽组成。已经准备且准予了RP-HPL测定来评估这些肽混合物。此测定实现了单一混合物内的多种肽的良好分辨并且还可以被用来定量单独的肽。
膜过滤(0.2μm孔径)被用来减少生物负载并进行最终的过滤灭菌。最初评估了四种不同的具适当尺寸的过滤器类型并且选择了帕尔(Pall)的PES过滤器(#4612)。迄今为止，已经制备了4种不同的混合物(各自具有5种不同的肽)并且顺序地通过两个PES过滤器单独过滤。利用RP-HPLC测定评估每种单独的肽的回收。对于这20种肽中的18种而言，两次过滤后的回收>90％。对于两种高度疏水肽而言，当小规模评估时回收低于60％，但是当大规模评估时几乎被完全回收(87％和97％)。如在此所述，方法试图限制选择的序列的疏水性。
通过溶解于DMSO中，用D5W/琥珀酸盐(5mM)稀释至2mg/ml并且聚池化至400μg/ml的最终肽浓度和4％的最终DMSO浓度来制备由五种肽组成的肽池(池4)。在制备之后，将肽用25mm Pall PES过滤器(目录号4612)进行过滤且以1ml等分部分分配至Nunc Cryo小瓶(#375418)中。到目前为止在时间零点且在第2周和第4周对样品进行分析。在第8周和第24周对另外的样品进行分析。在-80℃下，在四周时间点未观察到肽池4的HPLC曲线或杂质曲线的显著变化。在4周时间点中，该肽池的视觉观察结果和pH未变化。
实例8
肽合成
通过标准固相合成肽化学(例如，使用CS 536XT肽合成仪)合成GMP肽且通过RP-HPLC进行纯化。通过多种被准予的测定来分析每种单独的肽，以评估外观(可视的)、纯度(RP-HPLC)、身份(通过质谱法)、数量(元素氮)以及三氟乙酸盐抗衡离子(RP-HPLC)，并且释放。
这些个性化新抗原肽可以由多达20种对每个患者而言独特的不同肽构成。每种肽都可以是由标准肽键连接的约20-约30个L-氨基酸的线性聚合物。氨基末端可以是伯胺(NH2-)并且羧基末端是羰基(-COOH)。利用在哺乳动物细胞中常见的20种标准氨基酸(丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸)。每种肽的分子量基于其长度和序列而变化并且计算每种肽的分子量。
Fmoc(9-芴基甲氧基羰基)-N-末端保护的氨基酸用于所有合成反应。在适当的情况下，这些氨基酸的侧链受2,2,4,6,7-五甲基-二氢苯并呋喃-5-磺酰基(Pbf)、三苯基甲基(Trt)、叔丁氧羰基(Boc)或叔丁基醚(tBu)基团保护。所有散装氨基酸均溶解于二甲基甲酰胺(DMF)中。缩合利用在单独反应中的以下两种催化剂组合：
二异丙基碳二亚胺/1-羟基苯并三唑(DIC/HOBT)
二异丙基乙胺/2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯(DIEA/HBTU)
每种氨基酸偶联两次以便确保高水平并入。第一次偶联利用DIC/HOBT持续2-6小时，且第二次偶联利用DIEA/HBTU持续1-2小时。这两个偶联中的每个通过UV吸光度进行监测并且在偶联循环之间用DMF深度洗涤树脂以提高效率。在两个偶联循环之后，计算的偶联效率必须是至少95％以便继续至下一循环。终止不符合最低偶联效率的任何肽的进一步合成。
在所有氨基酸都已偶联之后，将树脂用DMF洗涤两次并且随后用甲醇洗涤三次。然后将树脂仍在反应容器中时简单地真空干燥，且然后转移至新的配衡的小瓶以用于真空干燥(大于12小时)直到它自由地流动。通过称重含有干燥的树脂的容器，减去配衡的容器的质量且针对树脂质量进行调整来测定所合成的粗肽的质量。预期质量产率在60％–90％的范围内。终止未能产生至少200mg粗肽的任何合成。在开始裂解之前可以将干燥的树脂储存在4℃下持续达28天。
在单一室中进行裂解反应。在将该组患者特异性干燥的树脂从合成室转移至裂解室之前，使裂解室通过QA证明完全合格用于合成新的GMP产物。合格证明包括生成线间隙检查、GMP套件清洁的验证、所有所需材料和玻璃器皿的核查、设备适用性和标记的验证、以及验证所有所需人员得到适当培训且证明有资格进行工作并正确穿手术衣且无明显疾病。
室准备操作启动与待使用的设备(旋转蒸发器、真空泵、天平)的验证以及指示该设备已正确清洁且校准(在适当的情况下)的文件的检查一起开始。通过QA发布所需的所有原材料(TFA、三异丙基硅烷(TIS)和1,2-乙二硫醇)的完整列表，并且制造鉴别待使用的批号、重新测试或截止日期以及被分配用于每天反应的材料的量。
从树脂裂解肽链和裂解侧链保护基团是在作为酸产生的自由基的清除剂的2％三异丙基硅烷(TIS)和1％1,2-乙二硫醇存在下在酸性条件(95％TFA)下在室温下持续3至4小时完成的。
通过过滤使树脂与游离粗肽分离。所释放且脱保护的肽的最终溶液经历用乙醚沉淀并且将沉淀物冷冻干燥12小时。通过称重冷冻干燥的粉末并计算所释放的粗肽/树脂结合的肽的比率来测定所释放的粗肽的产率。粗肽的预期产率是200mg至1000mg。终止未能产生至少200mg粗肽的任何裂解反应。然后将粗肽转移至纯化套件。
在单一室中进行纯化。在将该组干燥的粗肽从裂解室转移至纯化室之前，使纯化室通过质量保证证明完全合格用于合成新的GMP产物。合格证明包括生成线间隙检查、GMP套件清洁的验证、所有所需材料和玻璃器皿的核查、设备适用性和标记的验证、以及验证所有所需人员得到适当培训且证明有资格进行工作并正确穿手术衣且无明显疾病。
室准备操作启动与待使用的设备(制备型逆相高效液相色谱[RP-HPLC]、天平、分析型液相色谱/质谱仪(LC/MS)、冻干器、天平)的验证以及指示该设备已正确清洁且校准(在适当的情况下)的文件的检查一起开始。通过QA发布所需的所有原材料(三氟乙酸[TFA]、乙腈[ACN]、水)的完整列表，并且制造鉴别待使用的批号、重新测试或截止日期以及被分配用于每天反应的材料的量。
通过将不超过200mg的冷冻干燥的释放的肽溶解于ACN中来开始纯化。然后将样品用水进一步稀释至5％-10％ACN。添加TFA至0.1％的最终浓度。在开始每组患者特异性肽之前新鲜封装一个C-18RP-HPLC柱(10cm×250cm)。在负载患者肽之前将柱用含有0.1％TFA的5％乙腈深度洗涤。负载至单个柱上的肽的最大量是200mg。通过在220nm处的UV吸光度来监测柱。在负载单一肽之后，使样品进入柱并且将柱用5％乙腈/0.1％TFA洗涤。具有0.1％TFA的10％-50％乙腈梯度用于洗脱肽。在UV观察高于基线20％的点处开始收集级分(各自50ml)。继续收集级分直到无进一步UV吸收材料从该柱洗脱或梯度完成。典型地，主要的洗脱峰被分离成4至8个级分。
每个单独的级分通过分析型LC/MS进行评估。所选的分析条件是基于与峰洗脱产物相关的乙腈百分比。具有预期质量且纯度大于或等于95％的级分被聚池化为肽产物。典型地，2至4个级分满足此聚池化要求。将聚池化的肽置于用于冷冻干燥的配衡的罐子中并冷冻干燥24至72小时。通过测定含有冷冻干燥的肽的罐子的质量且减去配衡的罐子的质量来测定冻干的肽的质量。
将一部分冷冻干燥的肽转移至质量控制以用于分析和处置。在进一步加工之前将剩余肽储存在-20℃下。
丢弃没有级分满足95％纯度的要求的任何肽。不可发生RP-HPLC级分的重新加工。如果可获得足够的未纯化的冷冻干燥的和裂解的肽，可以在该柱上纯化第二肽样品，调整梯度条件以提高所洗脱的肽的纯度。
然后可以通过用4柱体积的100％ACN/0.1％TFA深度洗涤来使该柱除去任何剩余的肽，且然后在负载下一肽之前用5％ACN/0.1％TFA再平衡。
个体患者的肽在同一柱上顺序地加工。在单个柱上加工不超过25种肽。
用于药物制造的单元操作因此包括：
合成：
对于每种氨基酸，缩合，洗涤和再缩合
树脂洗涤和真空干燥
转移至裂解套件
裂解：
从树脂酸裂解
使所释放的肽与树脂分离和肽沉淀
转移至纯化套件
纯化：
溶解于乙腈中和RP-HPLC纯化
峰级分冷冻干燥24至72小时
除去等分部分用于QC测试和储存剩余的冻干产物。
个性化新抗原肽可以被提供为包含2ml带有颜色编码帽的Nunc Cry小瓶的盒，每个小瓶包含大约1.5ml的冷冻DMSO/D5W溶液，该溶液包含浓度为400ug/ml的多达5种肽。四个肽组中的每者可以有10–15个小瓶。这些小瓶被储存在-80℃下直到使用。持续稳定性研究支持存储温度和时间。
存储与稳定性：将这些个性化新抗原肽冷冻储存在-80℃下。个性化新抗原肽和聚-ICLC的解冻、无菌过滤、过程中中间物和最终混合物可以保持在室温下但是应该在4小时内使用。
相容性：就在使用之前将这些个性化新抗原肽与1/3体积的聚-ICLC混合。
实例9
NeoVax(一种瘤形成疫苗)和尼沃鲁单抗预防非何杰金氏淋巴瘤(NHL)中自体干细 胞移植之后的复发
在此提供了三种示例性给药方案。前两种集中于通过评价新颖的个性化新抗原疫苗(在此还称为“NeoVax”，并且在美国临时申请61/869,721、61/809,406和61/913,127中进行了披露，这些临时申请通过引用以其全文结合在此)与尼沃鲁单抗的组合来改进尼沃鲁单抗的活性，尼沃鲁单抗是被研发用于治疗癌症的通过阻断活化的T细胞上的程序性细胞死亡1(PCD1)受体的配体活化而起作用的一种完全人IgG4单克隆抗体。第三给药方案集中于通过减少伊匹单抗总体暴露来改进单独地或与尼沃鲁单抗组合的伊匹单抗(针对细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4(CTLA4)的单克隆抗体)的安全性和活性特征，这是通过使伊匹单抗共疗法集中至发展对NeoVax的免疫应答的时间框而实现的。这种减少的暴露是通过与有效疫苗组合而实现的，并且可以通过减少伊匹单抗的剂量或延长剂量之间的周期或通过靠近疫苗接种部位皮下递送伊匹单抗且在时间上与疫苗接种重合来实现。每种在此更详细地解释。
自体造血干细胞移植(AHSCT)是在用于在初始诱导疗法之后遭受复发的患者的有效选择，但很少观察到长期缓解和治愈。最近，基于所观察到的弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)和原发纵隔大B细胞淋巴瘤(PMLBCL)表面上的程序性细胞死亡1配体(PDL1)的表达，进行了对AHSCT之后的抗-PD1抗体(皮地利珠单抗)治疗的研究(阿曼德(Armand)等人，临床肿瘤学杂志31:4199(2013))；通过引用以其全文结合在此)。该研究显示具有有益活性的令人振奋的适应症，包括相较于其他最近临床试验抗PD1治疗的患者中改进的无进展存活、与PD-1介导的抑制的有效逆转一致的免疫细胞群体的变化、以及CD4+、CD54RO+记忆细胞存活的增加。然而，需要改进的疗法，特别是对于在AHSCT之后展示残留疾病的患者而言。
虽然抗PD1疗法可以帮助解除局部免疫抑制且克服T细胞耗竭或无反应性，但是对现有T细胞群体的数目和特异性的限制可能防止此作用的最大影响。因此，将抗PD1疗法与免疫刺激方法如癌症疫苗组合可以允许抗PD1展示最大临床益处。
NeoVax(一种瘤形成疫苗)是利用由在每个患者的肿瘤中发现的个人突变产生的灵敏肿瘤特异性新抗原的新颖个性化癌症疫苗(哈科恩(Hacohen)等人，癌症免疫学研究(Cancer Immunology Research)1:11(2013)；海姆斯凯克(Heemskerk)等人，EMBO杂志32:194(2013)；两者均通过引用结合在此)。因为这些突变产生与“自身”肽不同的肽，所以这些突变产生预期逃避中枢耐受的免疫抑制作用的表位。正在研发产生比多天然抗原(“肿瘤相关抗原；TAA)的那些特征更强且更持久应答的NeoVax疫苗疗法，这些特征迄今为止已在临床上被证明单独或与检查点阻断抑制组合是无效的。NeoVax产物披露于美国临时申请61/869,721、61/809,406和61/913,127中，这些申请通过引用以其全文结合在此；并且利用多个(约20)个长肽作为免疫原(各自表示单独的靶表位)，以及聚-ICLC作为佐剂。长肽和聚ICLC分别表示“最佳”递送系统和免疫佐剂。使用NeoVax的首次人类临床研究在ClinicalTrials.gov(NCT 01970358)上描述。
将有效免疫刺激剂与解除免疫抑制组合将预期改进临床结果。AHSCT后背景特征在于较低体积的残余疾病、免疫细胞输注至稳态扩增的状态、以及不存在任何标准延迟复发的疗法。这些特征提供独特的机会来测试检查点抑制剂(如尼沃鲁单抗)加NeoVax疗法延迟疾病复发的效果。
进行探索性双组研究来在一小部分患者中单独使用尼沃鲁单抗的治疗与尼沃鲁单抗和NeoVax以便评价安全性且监测治疗对无进展存活(PFS)以及对于在确证筛选时具有可测量的疾病的任何患者、对于客观反应率(ORR)的影响。患者在开始移植前调理之前同意以便收集且测序用于疫苗制备的肿瘤组织，并且在确证CT筛选(在开始疗法之前大约4周)时随机化。十五名患者包括于每种药剂组中。将这些结果与不在此机构接受另外AHSCT后的可比较的患者进行比较。图8中示出该研究的概要。
疗法可以在AHSCT之后开始4周。用于个体组的方案是如下：
·尼沃鲁单抗lhi1
·尼沃鲁单抗：在第1、4、8、15、22天Vx(第1、2、3和4周；“初免”)并且在第11和19周加强。尼沃鲁单抗(3mg/kg)在第5周开始并且之后每3周继续，最后一个剂量在第23周。
具有进行性疾病的单独疫苗组患者根据研究者和PI的决断可以在约3周开始接受尼沃鲁单抗以尝试挽救。
CT扫描在开始疗法之后每4个月进行(其中确证PET扫描是根据治疗医师的决断)，其中最终CT扫描在开始疗法之后16个月时。针对对免疫肽的免疫应答评价所有接受NeoVax的患者。
此研究可以提供在此环境中的另外安全性信息，但更重要地用NeoVax扩展且改进已经在此环境下用皮地利珠单抗观察到的令人振奋的结果。
实例10
NeoVax和尼沃鲁单抗在转移性透明细胞肾细胞癌和黑色素瘤中。
透明细胞肾细胞癌(ccRCC)和转移性黑色素瘤是已经显示对免疫调节疗法(包括细胞因子、疫苗和检查点阻断的抑制)有反应的两种肿瘤类型。多种免疫调节疗法已被批准用于两种疾病，包括用于转移性黑色素瘤的伊匹单抗。尼沃鲁单抗已在非盲、非随机化I/II期试验中作为单一药剂被评价为在两种疾病中具有令人振奋的结果，并且多个关键研究目前正在进行中，利用单独尼沃鲁单抗或尼沃鲁单抗和伊匹单抗组合。
尽管具有检查点阻断的这种成功，仍然存在许多患者无反应或无稳健反应，并且用有效疫苗同时靶向的免疫刺激的缺乏可能阻止此疗法的最大效果。单独检查点阻断疗法可以帮助解除局部免疫抑制且克服T细胞耗竭或无反应性，但可能受现有T细胞群体——由发展肿瘤正常生理呈递至宿主免疫系统产生的那些T细胞的数目和特异性限制。确实，在许多动物研究(包括支持伊匹单抗的初始研发的研究中)，单独抗CTLA4治疗仅轻度有效，但当与疫苗组合时相当更有效。
将有效疫苗与解除免疫抑制组合可以定性地扩大T细胞靶标的谱系以及增强现存和新诱导的T细胞的活性，并且因此能够显著改进临床结果。
在先前未治疗的转移性黑色素瘤患者(具有手术可及的肿瘤用于序列分析)且在适当位置具有可切除的原发性肿瘤的先前未治疗的转移性透明细胞肾细胞癌患者中进行组合NeoVax与尼沃鲁单抗的单独研究。图9中示出这些研究的概要。每个研究是将单独尼沃鲁单抗与尼沃鲁单抗+NeoVax进行比较的双组研究。患者在手术之前同意。将患者针对客观反应率(ORR)、无进展存活率(PFS)和总体存活率(OS)进行评价。在手术肿瘤去除之后可接受就尽快以3mg/kg的标准单一药剂给药水平给予尼沃鲁单抗，并且每2周继续直到记载的进展，由于毒性或撤销同意而中止。NeoVax疗法可以在肿瘤切除之后大约8周开始，在第1、4、8、15、以及22天(第1、2、3、以及4周；“初免阶段”)以及在第11和19周(“加强”)给予。在初免疫苗接种期间停止尼沃鲁单抗。15名患者包括于每个组中。
在进行性疾病的初始适应症时，患者可以根据研究者的决断继续该疗法或该方案直到确认疾病进展或不继续(其必须在初始适应症的6周内决定)。
CT扫描在开始疗法之后每4个月进行(其中确证PET扫描是根据治疗医师的决断)，其中最终CT扫描在开始疗法之后24个月时。针对对免疫肽的免疫应答评价所有接受NeoVax的患者。
有效疫苗提供通过增加T细胞应答的幅度而显著改进尼沃鲁单抗疗法的临床结果的机会，并且NeoVax是集中于新抗原的最佳疫苗，其是不经受自身耐受的免疫抑制作用的一类高度个人肿瘤特异性表位。相反地，在疫苗接种期间的检查点阻断抑制可以增加NeoVax的幅度和免疫应答水平。这些探索性研究是在与正在进行的关键研究不同的疾病环境下进行的(在针对黑色素瘤使用伊匹单抗失败之前且在针对RCC的全身性抗VEGF靶向疗法之前)，从而允许收集在这些环境中单独尼沃鲁单抗的安全性和功效数据。
实例11
在高风险黑色素瘤(无尼沃鲁单抗)和转移性黑色素瘤(具有全身性尼沃鲁单抗) 中伊匹单抗与NeoVax的组合的减少的剂量/时程
CTLA4最初被鉴别为T细胞表面上的负调控因子，其在起始从头免疫应答或刺激现有应答之后很快上调以便抑制随后免疫T细胞应答且防止自身免疫或不受控制的炎症。因此，发展免疫应答的幅度一直与CTLA4作用密切相关。使用抗CTLA4抗体如伊匹单抗的疗法预期通过阻断负调节信号且允许更广泛的T细胞增殖来增加抗癌症应答。虽然许多动物和人相关研究已经提出了其他可能的作用机制，但使用伊匹单抗所观察到的临床应答与这种假设一致并且最近显示，用伊匹单抗治疗的患者中针对个人新抗原的抗原特异性T细胞在伊匹单抗疗法之前观察到并且在疗法之后增加(范罗伊(van Rooij)等人，临床肿瘤学杂志31:e439(2013))。
在动物中的许多研究已表明将抗CTLA4治疗与疫苗组合有时显著增强抗癌作用，并且在人中的轶事信息表面相同作用(霍迪等人，美国国家科学院院刊(PNAS USA)105:3005-3010，2008；霍迪等人，美国国家科学院院刊100:4712-7；勒(Le)等人，免疫疗法杂志(J Immunother)36:382-9，2013)。这可能关键取决于抗原，因为在动物中该组的最显著作用和在人中的作用典型地是在复杂疫苗如自体细胞疫苗情况下观察到的并且在标准个体肿瘤相关抗原(如针对黑色素瘤的gp100)情况下未观察到。自体肿瘤细胞疫苗包含新抗原和肿瘤相关抗原两者(霍迪等人，2008和2003)。在勒等人(2013)的研究中，两种胰腺同种异体肿瘤细胞系的混合物用作免疫抗原。虽然不可能存在这些细胞系与患者之间的几乎所有新抗原的任何重叠，但胰腺癌特征在于在位置12处的频繁K-ras突变，其对于多种HLA类型可以是可以是免疫原性的(韦登(Weden)等人，国际癌症杂志(Int J Cancer)128:1120-8，2011)。
尼沃鲁单抗(一种抗程序性死亡受体1(PD1)抗体可以具有独特作用机制。PD1的配体PDL1经常在天然肿瘤微环境中在肿瘤细胞上过度表达并且是抑制性配体，从而引起肿瘤浸润淋巴细胞的T细胞无反应性/耗竭。因此似乎有可能抗CTLA4抗体与抗PD1抗体的组合可以产生更大的阳性结果，因为它们具有不同的作用机制并且这已经在动物中(杜赖斯瓦米(Duraiswamy)等人，癌症研究；73(12))且可能在人中(沃夏克JD等人，新英格兰医学杂志，2013)观察到。不幸的是，该联合疗法似乎在初始报道和在正在进行的临床评价中是更毒性的(沃夏克，2013)。
用于降低表观毒性同时维持或增加该联合疗法的功效的一种方法将是将有效疫苗添加至该治疗方案(以便直接产生针对另外抗原的有效从头T细胞应答)且同时减少对检查点阻断抗体的总暴露。虽然两种CPB Ab尚未进行并行比较，但一般来说抗CTLA4似乎产生比抗PD1更高的毒性概况，这与在敲除小鼠中观察到的作用一致。鉴于CTLA4在从头免疫应答中具有明确作用，这将表明将抗CTLA4暴露限制于抗原暴露的时间框可以实现毒性降低和维持功效两者。
在此描述在黑色素瘤患者中的四个探索性研究。在图10A和图10B中概述的研究3A和3B是在转移性疾病中并且利用伊匹单抗和尼沃鲁单抗两者。在图10C和图10D中概述的研究3C和3D类似3A和3B，除了环境是高风险疾病且不利用尼沃鲁单抗。
第一研究(3A)是在转移性黑色素瘤患者中的3组剂量递增(仅对于伊匹单抗剂量递增)。患者在手术之前同意。五名患者可以初始地包括在每个组中。在每个组中，患者可以就在手术切除(用于肿瘤测序)之后开始以3mg/kg(该剂量在所有单独尼沃鲁单抗3期研究中进行评价)每2周接受尼沃鲁单抗直到已经制备NeoVax。在初免疫苗接种期期间且在给予伊匹单抗之前的数周期间或增强期间停止尼沃鲁单抗。NeoVax疗法可以在肿瘤切除之后大约8周开始，并且在第1、4、8、15、以及22天(第1、2、3、以及4周；“初免阶段”)以及在第11和19周(“加强”)给予。尼沃鲁单抗在最后一次初免剂量之后的周和在每次加强之后的周恢复。在第一组中，患者可以在初免循环开始时接受伊匹单抗，在第5初免剂量之后且在每次加强2之前一周，全部以1mg/kg的剂量。下一组可以将与初免疫苗接种的开始相关的剂量增加至3mg/kg(治疗上批准的水平)并且与初免结束和增强相关的剂量可以保持在1mg/kg。对于第三组，初免开始剂量和与每次增强相关的剂量是3mg/kg。(参见在此的时间表的图形视图)。对伊匹单抗的最大暴露因此可以是在19个周内分布的三个3mg/kg剂量和一个1mg/kg剂量，低于所批准的方案(在10周内分布的四个3mg/kg剂量)。两个扩展组(各自五名患者)以所判断的最高剂量水平添加以便具有可比得上在单独尼沃鲁单抗情况下观察到的毒性概况并且以次最高剂量水平添加(如果总体毒性概况是可接受的)。对于每个组，评价对这些新抗原的免疫应答的定量特征和定性特征。将患者针对客观反应率(ORR)、无进展存活率(PFS)和总体存活率(OS)进行随访。
第二研究(3B)具有与研究3A类似的设计，除了伊匹单抗经由皮下注射与每次疫苗接种一起在每个疫苗接种部位附近(2cm内)递送，以便将抗CTLA4活性集中于疫苗引流淋巴结且限制全身性作用。如在此所描述递送尼沃鲁单抗。存在三个剂量递增组。第一组可以与每次疫苗接种在每个疫苗接种部位注射0.2ml的5mg/ml伊匹单抗。第二组可以将体积增加至0.5ml并且第三组至1.0ml。对伊匹单抗的最大暴露是在19个周内140mg(低于所批准的方案的在10个周内分布的840mg[对于70kg患者]约11倍)。两个扩展组(各自五名患者)以所判断的最高剂量水平添加以便具有可比得上在单独尼沃鲁单抗情况下观察到的毒性概况并且以次最高剂量水平添加(如果存在一个且总体毒性概况是可接受的)。如在此所描述对患者进行评价。
在此描述的第三和第四研究基本上类似第1和第2研究，除了各自是在高风险疾病中且不使用尼沃鲁单抗。
第三研究(3C)是在高风险(IIIB期、IIIC期和完全切除的IV期)黑色素瘤或手术切除ccRCC患者中的3组剂量递增(仅伊匹单抗)研究。患者在手术之前同意。五名患者可以初始地包括在每个组中。NeoVax疗法可以在肿瘤切除之后大约8周开始，并且在第1、4、8、15、以及22天(第1、2、3、以及4周；“初免阶段”)以及在第11和19周(“加强”)给予。在第一组中，患者可以在初免循环开始时接受伊匹单抗，在第5初免剂量之后且在每次加强2之前一周，全部以1mg/kg的剂量。下一组可以将与初免疫苗接种的开始相关的剂量增加至3mg/kg(治疗上批准的水平)并且与初免结束和增强相关的剂量可以保持在1mg/kg。对于第三组，初免开始剂量和与每次增强相关的剂量是3mg/kg。(参见在此的时间表的图形视图)。对伊匹单抗的最大暴露因此可以是在19个周内分布的三个3mg/kg剂量和一个1mg/kg剂量，低于所批准的方案(在10周内分布的四个3mg/kg剂量)。一个扩展组(十名患者)以所判断的最高剂量水平添加以便具有与佐剂疗法一致的可接受的毒性概况和复发风险概况。对于每个组，评价对这些新抗原的免疫应答的定量特征和定性特征。如在方案13-240中将患者针对无复发存活率(RFS)随访达两年。
第四研究(3D)具有与研究3B类似的设计，除了伊匹单抗经由皮下注射与每次疫苗接种一起在每个疫苗接种部位附近(1cm内)递送，以便将抗CTLA4活性集中于疫苗引流淋巴结且限制全身性作用。存在三个剂量递增组。第一组可以与每次疫苗接种在每个疫苗接种部位注射0.2ml的5mg/ml伊匹单抗。第二组可以将体积增加至0.5ml并且第三组至1.0ml。对伊匹单抗的最大暴露是在19个周内140mg(低于所批准的方案的在10个周内分布的840mg[对于70kg患者]约11倍)。一个扩展组(十名患者)以所判断的最高剂量水平添加以便具有与佐剂疗法一致的可接受的毒性概况和复发风险概况。对于每个组，评价对这些新抗原的免疫应答的定量特征和定性特征。如在方案13-240中将患者针对无复发存活率(RFS)随访达两年。
伊匹单抗与尼沃鲁单抗的组合的现有结果受增加的毒性制约。虽然潜在地可通过适当监测和应答(待在更大研究中确认)管理，但分子的潜在生物学和已从动物研究和一些人研究积累的观察结果将表明将有效疫苗与伊匹单抗偶联可以允许减少的伊匹单抗总体暴露，同时维持或增加功效。NeoVax是具有用于产生显著更强且更特异性的免疫应答和与伊匹单抗协同作用的潜力的范式转变疫苗。这些研究提供维持或增加功效同时降低毒性的机会。此外，延伸降低的强度概念可以允许将伊匹单抗有效且环境适当扩展至高风险疾病。
实例12
组合NeoVax(一种个性化新抗原癌症疫苗)与伊匹单抗来治疗高风险肾细胞癌的I 期研究设计
测序技术已经揭示到，每个肿瘤都包含多个改变基因的蛋白质编码内容的患者特异性突变。1此类突变产生改变的蛋白质，范围从单氨基酸改变(由错义突变引起)到归因于终止密码子的移码、连读或内含子区的翻译的添加长区域的新颖氨基酸序列(新颖开放阅读框突变；新ORF)。这些突变蛋白质对于宿主对肿瘤的免疫应答而言是有价值的靶标，因为不像天然蛋白质，它们不受自身耐受的免疫抑制作用的影响。因此，突变蛋白质更可能具有免疫原性并且与患者的正常细胞相比对肿瘤细胞还更具特异性。2
已经存在多个报道指示动物肿瘤中的错义突变或新ORF诱导强CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应，在一些情况下导致疾病的预防或根除。3-6最近，松下(Matsushita)和同事证明正常鼠结构蛋(血影蛋白-β2)中的单一氨基酸变化是针对甲基胆蒽诱导诱导的可移植肿瘤的免疫攻击的主导目标，从而限定该肿瘤在移植之后是否存活。7此外，血影蛋白-β2表达还在逃逸变体中显著减少，从而提供免疫编辑假设的明确机理实例。同时，杜佩奇和同事使用小鼠中的小免疫原性新ORF(卵白蛋白肽)得到的类似的观察结果。8这些研究均指示免疫编辑的新抗原因此足以作为有效抗肿瘤应答的靶标。
相应地，自发性消退和长期存活的许多人类研究已经表明，针对突变表位的强大CD8+T细胞应答与良好临床应答相关9这些研究以人免疫原性新抗原的首次鉴别10,11和伦内尔兹(Lennerz)的开创新研究(其相较于天然蛋白质应答展示新抗原应答的强度和持久性)开始，12并且现在包括以下观察结果：对抗CTLA-4疗法有反应的患者中新抗原特异性CD8+T细胞的增加13以及在输注高度富含针对CD4+T细胞的新抗原的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群体之后的肿瘤消退。14这些观察结果是针对多种HLA等位基因在多种癌症类型中获得的并且已经在肿瘤浸润T细胞群体中广泛观察到15,16。大多数CD8+T细胞应答显示相较于天然表位针对突变错义表位的高度特异性，表示高比例的循环T细胞，并且产生比在相同患者中针对过度表达的天然抗原的CD8+T细胞应答更丰富且活性更高的细胞。
因此，在动物和人中，对离散的突变抗原(如错义突变)和扩展性新颖抗原(新ORF)的免疫应答根据观察与消退和长期缓解相关。在于癌症基因组Atlas(TCGA)数据库中发现的一大组(n＝468)患者中扩展该相关性，对六种肿瘤类型的最近元分析揭示，相较于不具有预测的免疫源性表位的患者，针对具有至少一种预测的免疫原性新表位的患者的显著存活优点(风险比＝0.53；p＝0.002)。17
人中的三个研究已经直接地评估了突变抗原的免疫治疗潜力。第一，滤泡性淋巴瘤特征在于表达重新排列的免疫球蛋白的B细胞的不受控制的生长。纯化该重新排列的免疫球蛋白并且用作疫苗可以提高无疾病存活率。18诱导的CD8+T细胞显示对该免疫球蛋白分子的重新排列的突变部分(个体基因型)而不是对种系框架的反应性。19第二，对应于HPV的致癌蛋白质的肽的混合物(对于人，新ORF)已经显示产生由HPV诱导的癌前病变的显著缓解。20-22最后，在成胶质细胞瘤患者(已知频繁地包含此突变的群体)中的两个研究中用合成型式的表皮生长因子受体框内连接缺失(EGFRviii)提供令人振奋的2期结果。23,24重要地，在两个研究中，评价具有肿瘤复发的患者中的肿瘤显示复发肿瘤几乎一致地(23个中的20个)丧失EGFRviii的表达。这被解释为由于针对人中的免疫原性新抗原的免疫压力所致的免疫编辑的明确证据。
采用肽作为免疫原的大多数癌症疫苗利用“短”肽。这些肽的长度典型地是9-10个氨基酸并且能够直接结合表达HLA的细胞表面上的HLA分子。长度为约20-30个氨基酸的“长”肽最近已经显示产生更稳健的且更持久的免疫应答20,21。长肽需要内化、加工和交叉呈递以便结合HLA分子；这些功能仅在专职性抗原呈递细胞(如树突细胞)中发生，这些细胞能够诱导强T细胞应答。
人中的许多研究已经展示了肽疫苗的安全性。这些包括使用多种短肽25以及多种长肽(包括新ORF)的研究。具体地说，已经使用源自p53的10种重叠长肽的混合物进行了四个研究26-30，并且用源自HPV的致癌蛋白的13种长肽的混合物进行了五个单独研究。20-22,31,32在这些研究中，未观察到高于2级的毒性并且大多数不良事件具有有限的持续时间和严重性。另外，已经在人中对许多异源抗原制剂进行了测试。此类制剂包括照射细胞疫苗、33,34肿瘤细胞溶解产物35以及脱落的肿瘤细胞系抗原。36这些异源疫苗包含呈完整蛋白质、部分降解的细胞内蛋白质形式的突变抗原，以及在结合至MHC I的表面上发现的肽。此外，它们包含过度表达的分子和选择性表达的分子以及许多另外的天然蛋白质。此外，纯化的热休克蛋白质(HSP)96肽复合物一直用作抗原；此类复合物还包含许多突变肽。37这些研究都未报道直接归因于这些疫苗的免疫原的显著安全性问题。
Toll样受体(TLR)是模式识别受体(PRR)家族的重要成员，模式识别受体识别由许多微生物共享的保守基序，称为“病原体相关分子模式”(PAMPS)。识别这些“危险信号”激活先天性和适应性免疫系统的多个元件。TLR由先天性和适应性免疫系统的细胞表达，如树突细胞(DC)、巨噬细胞、T细胞和B细胞、肥大细胞以及粒细胞，并且位于不同的细胞区室中，如质膜、溶酶体、内涵体以及内吞溶酶体38。不同TLR识别不同PAMPS。例如，TLR4被包含在细菌细胞壁中的LPS激活，TLR9被未甲基化的细菌或病毒CpG DNA激活，并且TLR3被双链RNA激活39。TLR配体结合导致激活一种或多种细胞内信号转导途径，从而最终导致产生许多与炎症和免疫相关的关键分子(特别是转录因子NF-κB和I型干扰素)。
TLR介导的DC激活导致DC激活增强，吞噬作用，激活和共刺激标记物(如CD80、CD83和CD86)上调，表达CCR7，从而允许DC迁移至引流淋巴结并且有助于将抗原呈递给T细胞，以及细胞因子(如I型干扰素、IL-12和IL-6)的分泌增加。所有这些下游事件对于诱导适应性免疫应答而言是关键的。
当前在临床研发中最具前景的癌症疫苗佐剂是TLR9激动剂CpG和合成双链RNA(dsRNA)TLR3配体聚-ICLC。在临床前研究中，当与LPS和CpG相比时，聚-ICLC似乎是最有效力的TLR佐剂，因为它诱导促炎细胞因子并且没有IL-10刺激并且在DC中维持高水平的共刺激分子40。此外，最近在非人灵长类(恒河猴)中将聚-ICLC与CpG作为用于由人乳头瘤病毒(HPV)16衣壳体组成的蛋白质疫苗的佐剂进行了直接比较。聚-ICLC据发现在诱导HPV特异性Th1免疫应答中更有效41。
聚-ICLC是一种合成地制备的双链RNA，它由平均长度约5000个核苷酸的聚I和聚C链组成，已经通过加入聚赖氨酸和羧甲基纤维素而使得它对热变性和血清核酸酶的水解稳定。该化合物激活TLR3以及MDA5和RIG3的RNA解旋酶-结构域(PAMP家族的两个成员)，从而导致激活DC和自然杀伤细胞(NK)并产生I型干扰素、细胞因子和趋化因子的“天然混合物(natural mix)”。此外，聚-ICLC发挥由两种IFN诱导型核酶系统介导的更直接的靶向广泛宿主的抗感染以及可能抗肿瘤作用，这两种系统是2’5’-OAS和P1/eIF2a激酶(亦称PKR(4-6))以及RIG-I解旋酶和MDA5。
在啮齿类动物和非人灵长类动物中，显示聚-ICLC可增强针对病毒抗原的T细胞应答42-45、交叉致敏以及肿瘤-、病毒-和自身抗原-特异性CD8+T细胞的诱导46-48。在非人灵长类动物的一项最近研究中，发现聚-ICLC为产生针对DC靶向或非靶向的HIV Gag p24蛋白的抗体应答和T细胞免疫所必需，从而强调了它作为疫苗佐剂的有效性。
在人类受试者中，系列全血样品的转录分析揭示了接受一个单次皮下给予聚-ICLC的8个健康人类志愿者之间的类似的基因表达谱和在这8个受试者与4个接受安慰剂的受试者之间多达212个基因的差异表达49。值得注意的是，聚-ICLC基因表达数据与来自用高效黄热病疫苗YF17D50免疫的志愿者的先前数据的比较显示，在峰值时间点大量的转录和信号转导经典途径(包括先天性免疫系统的那些)被类似地上调。
已经公布了聚-ICLC结合长肽的两个研究。报告了关于处于二期或三期完全临床缓解的患有卵巢癌、输卵管癌和原发性腹膜癌的患者的免疫分析，这些患者在一期皮下疫苗接种研究中用来自睾丸癌抗原NY-ESO-1的合成重叠长肽(OLP)单独地或与蒙塔尼德-ISA-51一起或与1.4mg聚-ICLC和蒙塔尼德一起进行治疗。与单独的OLP或OLP和蒙塔尼德相比，在加入聚-ICLC和蒙塔尼德情况下的NY-ESO-1特异性CD4+和CD8+T细胞和抗体应答的产生明显增强。51在第二人研究中，在患有癌前腺瘤的患者中将聚-ICLC与MUC1合成长肽组合。在几乎一半的患者中检测到稳健的抗体应答，这与预先存在的循环髓源抑制性细胞水平负相关。52
聚-ICLC还一直用作用于使用负载最小表位的患者源性树突细胞免疫的佐剂。在大多数患者中观察到对多种肽的CD4+和CD8+T细胞应答。53
聚-ICLC是在患有感染性疾病的患者和具有各种不同肿瘤类型的受试者中最广泛测试的TLR3激动剂配制品。在重组干扰素的可用性之前，聚-ICLC在临床上以≥6mg/m2(约170μg/kg)的高剂量用于患有各种实体肿瘤和白血病的患者中。53通常高于40℃的发热是常见不良事件和主要剂量限制因素。其他常见不良事件是类似感冒的症状(恶心、呕吐、关节痛、肌痛和疲劳)和低血压、血小板减少症以及白细胞减少症。一旦重组干扰素变得临床上可用，就消除对寻求高剂量聚-ICLC的需要，并且变得认识到低剂量(10–50μg/kg)在刺激宿主防御且作为免疫佐剂方面是高度有效的。
到目前为止，患有恶性胶质瘤的400名患者已经进入使用低剂量(1-2mg总剂量)聚-ICLC作为单一疗法或与化学疗法、放射或疫苗结合的7个临床试验(表5)。此外，除了患有HIV/AIDS和多发性硬化的患者之外，患有各种其他实体肿瘤(前列腺癌、结肠直肠癌、胰腺癌、肝细胞癌、乳腺癌、以及卵巢癌)的患者也一直根据多于10个另外的临床I期和II期研究进行了治疗。总的来说，该药物在所有研究和一系列疾病内一直是良好耐受的。
透明细胞肾细胞癌(ccRCC)是十种最常见的癌症之一并且发病率正在提高。20％与30％之间的患者目前患有转移性疾病(该疾病通常是不可治愈的)，而30％的经受根治性肾切除术的患者经历伴随远处转移的复发。靶向全身性药剂如血管内皮生长因子(VEGF)或雷帕霉素的哺乳动物靶标(mTOR)的抑制剂已经为患有转移性疾病的患者提供显著临床益处，但肿瘤应答不是持久性的并且大多数患者复发且最终死于该疾病54。现有治疗方法的组合正在这些环境中进行研究，但与显著毒性和适度增加的活动性相关。缺乏患有可能微转移(如果存在)疾病负担的切除的高风险患者的有效辅助治疗。因此需要新型方法来实现显著改进。
可能超过任何其他治疗方法，免疫疗法通过捕获免疫系统的多样性和持久记忆及其破坏恶性肿瘤细胞的能力具有治愈结果的潜力且预防复发。高剂量白细胞介素-2(HD-IL2)基于7％的持久性完全缓解率用于患有转移性ccRCC的患者，但这种疗法由于其显著毒性而仅在所选择的中心提供，并且不存在建立的生物标志物来预测应答55。然而，使用HD-IL2的结果提供“第一代”免疫疗法尝试可以在ccRCC中起作用的证据。
两种免疫治疗方法正在ccRCC和其他疾病中积极评价-抗原特异性免疫(疫苗接种)以及最近经由用检查点阻断抗体(CPB)治疗的非特异性免疫刺激56-58。迄今为止ccRCC中的疫苗已提供了功效暗示，但肿瘤应答率和肿瘤应答的持久性保持较低，59,60这最可能是由于缺乏用这些方法诱导的有效肿瘤特异性免疫应答。历史上，大多数癌症疫苗利用肿瘤相关抗原(TAA)(一类天然蛋白质)，这些抗原优先地或选择性地在肿瘤细胞上表达，但也可以在一些正常细胞中发现。天然蛋白由于中枢耐受而产生相对弱的免疫应答(防止免疫系统识别自身抗原且由此产生自身免疫性的天然存在的现象)。尽管迄今为止使用TAA疫苗接种实现的相对微弱的结果，利用此类天然抗原的数个关键临床研究正在ccRCC中进行，从而指向对于更多有效治疗的需求。
DNA测序、特别是下一代测序技术已经揭示了癌症的遗传景观，其包含在个体患者的肿瘤中独特发现的许多蛋白质编码突变。这些突变包括通过在长度上从1至100个氨基酸变化的移码或连读突变产生的单一氨基酸错义突变(主要类型)和新颖开放阅读框(新ORF)。在动物和人中存在证据证明此类突变表位在诱导免疫应答方面是有效的。重要地，针对突变表位的强CD8+T细胞应答已经在患有多种肿瘤类型的患者中发现，这些患者在过继性T细胞转移之后具有自发消退或显著应答，从而表明可能存在与CD8+T细胞活性和良好临床应答的关联9。大多数这些CD8+T细胞应答显示相较于天然表位针对突变表位的非常良好的特异性，表示高比例的循环T细胞，并且包括比在相同患者中针对过度表达的天然抗原的CD8+T细胞更丰富且活性更高的细胞。
人中的三个研究已经直接地评估了突变抗原的免疫治疗潜力。由滤泡性淋巴瘤的恶性B细胞表达的纯化的重排的免疫球蛋白已被用作疫苗并且已在一些2期和3期研究中产生良好的临床结果(可能取决于残余疾病的量)61。最近，对应于HPV的致癌蛋白质的肽的混合物(直接类似于新ORF类型的突变)已经显示产生由HPV诱导的癌前病变的显著缓解20-22。最后，通常在成胶质细胞瘤患者中发现的表皮生长因子受体(EGFR)的突变形式已被用作多种早期临床试验中的免疫原。62令人感兴趣的是，已经发现针对此突变基因的下调的证据，从而表明由于由疫苗诱导的免疫压力所致的免疫编辑。24因此，在动物和人中，对离散的突变抗原(如错义突变)和扩展性新颖抗原(新ORF)的免疫应答根据观察与消退和长期缓解相关，并且在三个临床研究中已经显示在治疗性疫苗接种之后控制疾病。在癌症基因组中发现的许多突变表位的直接和全面鉴别产生使用此类免疫原改进癌症疫苗的免疫应答和功效的机会。
伊匹单抗(一种抗CTLA4特异性IgG1单克隆抗体)阻断在抗原激活之后抑制从头和记忆T细胞应答的关键调控途径，并且已经证明在患有晚期黑色素瘤的患者中作为单一疗法提高总体存活率56。此外，靶向PD-1(另一个免疫检查点)途径的抗体已经在多种癌症类型中展示深刻抗肿瘤活性57,58,63-65，并且CTLA-4与PD-1途径阻断的组合在晚期黑色素瘤63,64且最近在ccRCC中显示明显协同作用(哈默斯(Hammers)等人，ASCO 2014文摘#4504)。尽管这种成功,但用有效疫苗同时免疫刺激的缺乏可能限制此疗法的最大效果。
在动物中的许多研究已经表明将抗CTLA4治疗与疫苗组合能够显著增强功效66-68并且轶事信息表明在人中的类似作用69,70。这种潜在协同作用可能关键取决于抗原，因为在动物中该组合的最显著作用和在人中的作用典型地已经在复杂疫苗如自体细胞疫苗情况下观察到并且在标准个体肿瘤相关抗原(如针对黑色素瘤的gp100)情况下未观察到。自体肿瘤细胞疫苗69包含新抗原和肿瘤相关抗原两者。通过将免疫系统集中于新抗原(可能是可能的抗原的免疫原性最高的亚群)，NeoVax预期加强免疫应答且将免疫应答集中至肿瘤，从而产生更稳健的临床活性。相反地，在疫苗接种期间检查点阻断可以增加对NeoVax的应答的宽度和幅度并且增加记忆细胞形成。最近，在治疗开始之前在伊匹单抗治疗的患者中观察到新抗原特异性T细胞且在疗法之后增加71。
该研究的新颖方面是伊匹单抗的递送途径。存在关于静脉内递送的伊匹单抗(用于转移性疾病的批准的递送途径)的毒性概况的真正关注。为此，研究设计包括在每种疫苗给药期间靠近疫苗接种部位通过皮下注射“局部”递送伊匹单抗。大蛋白质像伊匹单抗在皮下注射之后通过淋巴管和引流淋巴结运送进入循环72。因此，预期此方法能够使伊匹单抗靶向与疫苗相同的引流淋巴结并且减少全身性暴露，从而使有效性最大化且限制伊匹单抗的全身毒性。多个动物研究已经表明抗CTLA4的局部化给药是有效的。局部化给药模式包括：(i)从照射的肿瘤细胞局部产生抗CTLA4用作疫苗73，(ii)在肿瘤(抗原来源)与局部引流淋巴结之间“过渡态”递送抗CTLA474，以及(iii)引导抗CTLA4的瘤内注射75。在来自照射的表达抗CTLA4的肿瘤细胞的局部化给予情况下的抗肿瘤活性相较于全身给予降低，但它与“过渡态”递送且与直接瘤内注射相等或更好。值得注意，观察到异位效应，其中将抗CTLA4抗体注射在动物一侧上的肿瘤附近或其中产生相对侧上的肿瘤的消除74,75，从而指示全身治疗作用。
在此描述将个性化新抗原癌症疫苗与伊匹单抗组合以治疗高风险肾细胞癌的研究设计(参见图11)。该研究是开放标签I期试验，其中患有透明ccRCC的患者(完全切除但高风险患者以及患有较低或中等风险转移性疾病的患者)用达20种肽免疫，这些肽对参与者的肿瘤细胞(即–未在其正常细胞中发现)和参与者独有的(即–“个人”)两者均是特异性的；且同时接近疫苗部位接受伊匹单抗。这些肽由错义突变、框内基因融合和新颖开放阅读框突变(统称为“新抗原”)编码，这些突变在该参与者的肿瘤细胞中出现且通过DNA和RNA测序进行鉴别。达20种长度至少约20个氨基酸的肽被制备用于每个参与者并且与免疫佐剂用聚-L-赖氨酸和羧甲基纤维素(聚-ICLC)稳定的聚肌苷酸-聚胞苷酸(聚-IC)一起给予。因此，个性化的新抗原癌症疫苗由肽+聚-ICLC组成并且被称为“NeoVax”。伊匹单抗是针对CTLA4(一种在T细胞的表面上限制T细胞增殖的分子)的抗体，并且已被批准用于治疗转移性黑色素瘤靠近每个疫苗接种部位经由皮下注射递送伊匹单抗以便1)将抗CTLA4活性引导至疫苗引流淋巴结，且2)限制全身毒性作用。此方法是在动物肿瘤模型中有效的并且预期相较于晚期黑色素瘤的所批准的剂量/方案(3mg/kg/3周持续四个剂量)产生显著降低的全身伊匹单抗水平。
符合条件的患者进入试验以经历意图切除原发性肾肿瘤或转移部位的外科手术。已经历外科手术的患者满足适任标准，并且获得足够组织以制备用于测序的核酸的患者可以继续到该试验的治疗期。
该研究是以两个部分进行的。在第一部分(10名患者)中，从三个可能的剂量水平鉴别最大耐受剂量(MTD)。在第二部分，10名另外的患者募集在MTD以便扩展与局部给予的伊匹单抗组合给出的NeoVax癌症疫苗的安全性和活性分析。
五名患者进入初始安全性评价(组1)。如果没有或仅1名患者在组1的前7周治疗期间经历DLT，则5名患者都进入组2。如果组1中的两名或更多名患者在前7周治疗期间经历剂量限制性毒性(DLT)，则5名患者进入组-1。
如果没有或仅1名患者在组2经历DLT，则剂量水平2是最大耐受剂量(MTD)并且另外10名患者以该剂量进入以便提高检测严重毒性的可能性、完成生物学相关终点且获得临床肿瘤活性的初步经验。如果组2中的两名或更多名患者经历剂量限制性毒性(DLT)，则剂量水平1是MTD，并且另外的10名患者在此剂量下进行治疗。
如果没有或仅1名患者在组-1经历DLT，则剂量水平-1是最大耐受剂量(MTD)，并且另外的10名患者以该剂量水平进入。如果组2中的两名或更多名患者经历剂量限制性毒性(DLT)，则终止该研究。
GMP肽是通过合成化学制备，通过逆相高效液相色谱法(RP-HPLC)纯化，在较小组中混合，并且与免疫佐剂聚-ICLC(一种稳定的双链RNA)组合。肽与聚-ICLC的混合物以诱导针对这些患者/肿瘤特异性突变的细胞免疫应答的意图用于疫苗接种。每个参与者可以在每次免疫接受肽的完全补体。
通过IFN-γELISPOT和/或四聚体分析来评估在用NeoVax疫苗接种之后诱导新抗原特异性T细胞应答且同时用局部递送的伊匹单抗治疗。在最后一次初免剂量之后4周开始，在疫苗给予之前和疫苗接种之后取得的样品之间进行比较。仅对扩展组中的所有10名患者进行测定。
IFN-γ分泌作为CD4+和/或CD8+T细胞识别同源肽或促有丝分裂刺激物的结果而出现。众多的不同CD4+和CD8+决定簇可以在体内呈递给T细胞，因为用于疫苗接种的20-30-mer肽应该经历被抗原呈递细胞加工成更小的肽。使用预测的表位短肽以及更长肽评价患者，这些肽需要在IFN-γELISPOT测定中蛋白酶体加工为刺激物。如果批准，则在随访分析中测定一种或多种准确免疫原性肽。
当可行时，HLA-四聚体被制备用于一个或多个表位且用于细胞染色和流式细胞术分析以便独立地评价应答T细胞的水平。
除分析T细胞应答在外周血中的幅值和决定簇作图之外，由疫苗诱导的免疫应答的其他方面也是关键的并且被评估。在筛选测定中在展现出离体IFN-γELISPOT或四聚体应答的患者中进行这些评估。它们包括评价T细胞亚群(Th1与Th2，T效应与记忆细胞)，分析调控细胞(如T调控细胞或髓源性抑制细胞)的存在与丰度，以及患者特异性肿瘤识别。最后，通过在疫苗接种之前或之后或在TIL群体中收集的外周血样品中的T细胞受体的Vβ亚家族的靶向深度测序，测定TCR谱系的全局变化以及个体T细胞克隆的丰度的变化。
在已经收获用于病理评估的足够肿瘤之后，将剩余的肿瘤组织放置在无菌容器的无菌培养基中并转移用于立即冷冻或用于解聚。肿瘤组织的部分用于全外显子组和转录组测序。如果制备单一细胞，则可以开始细胞系。另外，从单一细胞悬浮液制备肿瘤浸润淋巴细胞。在序列分析不产生结果或次优结果的情况下，肿瘤细胞系细胞可以用于制备另外的核酸以用于测序。对于正常组织样品，利用来自血液抽取的外周血单核细胞。
从这些组织样品提取核酸并且在布罗德研究所(Broad Institute)的CLIA合格实验室进行测序。对于肿瘤和正常DNA样品，在亿明达HiSeq上测序之前进行全外显子组捕获。对于肿瘤RNA，在亿明达HiSeq上测序之前，根据聚-A选择的RNA制备cDNA文库。如果从组织样品分离的DNA或RNA的量或质量对于外显子组或cDNA文库制备和测序来说是不适当的，则可以从患者特异性肿瘤细胞系(如果产生)提取DNA或RNA。
来自患者的肿瘤样品和正常组织样品的全外显子组DNA序列用于鉴别已经在该参与者的肿瘤中出现的特异性编码序列突变。这些突变包括在长度上从1至100个氨基酸变化的单一氨基酸错义突变(主要突变类型)和新颖开放阅读框(新ORF)。完善确立的算法(netMHCpan)用于鉴别预测结合每个参与者的MHC I类分析的含突变表位。76从该候选突变列表，选择20–40种突变且优先用于基于包括以下的一组预先定义的标准进行肽制备：
·突变类型(错义对比新ORF)
·由突变区域编码的肽与特定个体的MHC I类等位基因的预测结合潜力
·相应天然肽的预测结合潜力
·该突变与致瘤性表型直接或间接相关的可能性(即，“致癌驱动”突变或相关生物化学途径中的突变)
·RNA表达
·完整肽的生物化学特性(即从属于疏水性氨基酸数目或分布和/或半胱氨酸含量的预测的较差溶解性)
每个参与者的二十至四十个突变用于设计肽，这些肽各自长度为大约20-30个氨基酸。对突变的分析限于比较每个参与者的正常和肿瘤序列信息。
通过标准固相合成肽化学合成GMP肽并通过RP-HPLC纯化。通过多种被准予的测定来分析每种单独的肽，以评估外观(可视的)、纯度(RP-HPLC)、身份(通过质谱法)、数量(元素氮)以及三氟乙酸盐抗衡离子(RP-HPLC)，并且释放。此工作由加利福尼亚州门洛帕克的CS Bio进行。如果可能以达25种肽开始合成，以使得如果需要另外的肽立即可供用于替代不溶性肽。
意图用尽可能多(最多20)的肽免疫患者。将肽在各自达5种肽的4个池中混合在一起。每个池的选择标准基于被预测肽与之结合的具体MHC等位基因。只要可能，就将被预测结合同一MHC等位基因的肽置于单独的池中以便限制抗原竞争。一些新ORF肽可能被预测不与患者的任何MHC等位基因结合。然而，这些肽仍可以被利用，主要是因为它们是完全新颖的并且因此不受中枢耐受的免疫抑制作用的影响，从而具有免疫原性的概率较高。新ORF肽还携带显著降低的自体免疫潜力，因为在任何正常细胞中不存在等效分子。另外，可能存在由预测算法产生的假阴性并且可能的是该肽可以包含HLA II类表位(基于当前算法，HLAII类表位未被可靠地预测)。未被具体HLA等位基因鉴别到的所有肽被随机指定给单独的池。
制备肽池。每种肽的量以每个注射剂每种肽的最终剂量为300μg为基础。通过将适当量的每种肽单独地以高浓度(大约50mg/ml)溶解于二甲亚砜(DMSO)中并且用水中的5％右旋糖(D5W)/5mM琥珀酸盐稀释至2mg/ml的最终浓度来制备肽池。在稀释之后未展示澄清溶液的任何肽被丢弃且用另一肽(如果可用)替代；如果无另外的肽可用，则将使用D5W/琥珀酸盐。然后可以掺混各自相等量的5种肽，从而将每种肽有效地稀释至400μg/ml的浓度。通过经由0.2μm灭菌过滤器过滤来减少聚池化的肽中的生物负载。在层流生物安全柜中过滤灭菌聚池化且过滤的整批且等分至2ml Nunc cryo单独给药小瓶中以用于储存。通过RP-HPLC针对身份、残余溶剂(通过气相色谱法)、无菌性和内毒素对每个池进行测试。将单独给药小瓶冷冻储存在-80℃下。
标准和批准的10ml小瓶(5mg伊匹单抗/ml)被用于该临床研究。不需要另外制备。
制备最终NeoVax产物和含有伊匹单抗的注射器在确认患者在医学上被核准用于经历疫苗给予(确认到达诊所，温稳定生命特征，无潜在干扰疫苗给予的新的急性医学问题或实验室异常)之后开始。
制备NeoVax(与聚-ICLC混合)中的最终步骤在计划的疫苗给予当天进行。对于每名患者，可以在GMP制造厂制备各自达5种合成肽的四个不同池(标记“A”、“B”、“C”和“D”)并且如所详细描述过滤灭菌且储存在-80℃下。
在免疫当天，在层流生物安全柜中制备由这种或这些肽组分和聚-ICLC组成的完整疫苗。一个小瓶各自(A、B、C和D)在室温下在生物安全柜中解冻。0.75ml的每个肽池被从小瓶抽入分开的注射器中。分开地，聚-ICLC的四个0.25ml(0.5mg)等分部分被抽入分开的注射器中。然后，包含每个肽池的注射器的内容物可以通过注射器到注射器转移与0.25ml等分部分的聚-ICLC轻轻混合。整个1ml的混合物用于注射。
这四种制剂被标记为“NeoVax A”、“NeoVax B”、“NeoVax C”、“NeoVax D”。NeoVax的总剂量可以由各自含有1ml的肽池+聚-ICLC混合物的1ml注射器组成。
在每个给药日，含有5mg/ml伊匹单抗的单个10ml小瓶用于制备4个注射器，各自含有0.25ml(组-1)、0.5ml(组1)或1ml(组2)。
遵循初免/加强方案给予疫苗。如在此和(图12)所示，在第1、4、8、15和22天给予疫苗的初免剂量。在加强阶段中，在第78天(第12周)和第162天(第20周)给予疫苗。
4个NeoVax和伊匹单抗注射器中的每个被分配至四肢之一。在每次免疫，将每个NeoVax注射器皮下给予至所指定的一肢(即，NeoVax A在第1、4、8天等被注射至左臂中，NeoVax B在第1、4、8天等被注射至右臂中)。处于完整的腋窝或腹股沟淋巴结清除术的病后状态或阻止注射至特定一肢的其他禁忌症的患者的替代性解剖位置分别是左膈和右膈。
在对应一肢(或替代性解剖位置)给予NeoVax之后，立即将伊匹单抗注射在每个NeoVax给予的1cm内。
NeoVax和伊匹单抗可以在所计划的给药日期的1天内给予持续4天和8天，在所计划的给药日期的3天内给予持续15天和22天(但可以间隔至少5天)，以及在7天内给予持续78天和162天。
五名患者进入初始安全性评价(组1)。如果没有或仅1名患者在组1的前7周治疗期间经历DLT，则5名患者都进入组2。如果组1中的两名或更多名患者在前7周治疗期间经历剂量限制性毒性(DLT)，则5名患者进入组-1。
如果没有或仅1名患者在组2经历DLT，则剂量水平2是最大耐受剂量(MTD)并且另外10名患者以该剂量进入以便提高检测严重毒性的可能性、完成生物学相关终点且获得临床肿瘤活性的初步经验。如果组2中的两名或更多名患者经历剂量限制性毒性(DLT)，则剂量水平1是MTD，并且另外的10名患者在此剂量下进行治疗。
如果没有或仅1名患者在组-1经历DLT，则剂量水平-1是最大耐受剂量(MTD)，并且另外的10名患者以该剂量水平进入。
如果组2中的两名或更多名患者经历剂量限制性毒性(DLT)，则终止该研究。
疗法的持续时间可以取决于免疫的耐受性和疾病复发的证据。在不存在由于不良事件所致的治疗延迟的情况下，给出治疗直到第134天疫苗接种(第2增强疫苗接种)或直到以下标准之一适用：
·疾病复发，如果由治疗研究者认为中止研究治疗符合患者的最佳利益
·阻止进一步给予治疗的并发疾病
·一种或多种不可接受的不良事件
·患者展示不能或不愿遵守方案要求
·患者决定退出研究，或
·患者的病状的在治疗研究者看来使患者对于进一步治疗而言不可接受的一般或特定变化。
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30.兹斯特雷顿EC(Zeestraten EC)、斯皮特基恩斯FM、威尔特斯MJ等人.将干扰素-α添加至p53-SLP(R)疫苗导致疫苗接种的结直肠癌患者中增加的干扰素-γ产生：I/II期临床试验(Addition of interferon-alpha to the p53-SLP(R)vaccine results inincreased production of interferon-gamma in vaccinated colorectal cancerpatients:a phase I/II clinical trial)国际癌症杂志.2013年4月1日；132(7):1581-1591。
31.范普尔海斯特MI(van Poelgeest MI)、威尔特斯MJ、范艾斯科EM(van EschEM)等人.患有晚期或复发HPV16诱导的妇科肿瘤患者的HPV16合成长肽(HPV16-SLP)疫苗接种疗法，II期试验(HPV16synthetic long peptide(HPV16-SLP)vaccination therapy ofpatients with advanced or recurrent HPV16-induced gynecological carcinoma,aphase II trial)转化医学杂志(J Transl Med)2013；11:88。
32.威尔特斯MJ、肯特GG、德沃斯范斯滕韦克PJ(de Vos van Steenwijk PJ等人.HPV16阳性外阴病变的疫苗接种的成功或失败与诱导的T细胞应答的动力学和表型相关(Success or failure of vaccination for HPV16-positive vulvar lesionscorrelates with kinetics and phenotype of induced T-cell responses)美国国家科学院院刊2010年6月29日；107(26):11895-11899。
33.索伊费尔R(Soiffer R)、霍迪FS(Hodi FS)、哈鲁斯卡F(Haluska F)等人.用通过腺病毒介导的基因转移工程化为分泌粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的照射的自体黑色素瘤细胞免疫接种增强转移性黑色素瘤患者中的抗肿瘤免疫性(Vaccination withirradiated,autologous melanoma cells engineered to secrete granulocyte-macrophage colony-stimulating factor by adenoviral-mediated gene transferaugments antitumor immunity in patients with metastatic melanoma)临床肿瘤学杂志：美国临床肿瘤学会官方杂志.2003年9月1日；21(17):3343-3350。
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36.比斯特林JC(Bystryn JC)、泽列内乌奇-贾寇黛A(Zeleniuch-Jacquotte A)、奥拉兹R(Oratz R)、夏皮罗RL(Shapiro RL)、哈里斯MN(Harris MN)、罗塞斯DF(Roses DF)多价脱落抗原黑色素瘤疫苗的双盲试验(Double-blind trial of a polyvalent,shed-antigen,melanoma vaccine)临床癌症研究.2001年7月；7(7):1882-1887。
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38.川井T(Kawai T)、章S(Akira S)TLR信号传导(TLR signaling)免疫学研讨文辑(Seminars in immunology)2007年2月；19(1):24-32。
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72.里克特WFB，S.G.(Richter WFB,S.G.)；莫里斯，M.E(Morris,M.E.)在SC给予之后生物治疗剂吸收的机制决定因素(Mechanistic Determinants of BiotherapeuticsAbsorption Following SC Administration)美国药学科学家协会官方杂志(The AAPSJournal)2012年9月；15(3):559-568。
73.西蒙斯AD(Simmons AD)、莫斯卡伦科M(Moskalenko M)、克雷森J(Creson J)等人.抗CTLA-4的局部分泌增强癌症免疫疗法的治疗功效，伴随全身自身免疫性降低的证据(Local secretion of anti-CTLA-4enhances the therapeutic efficacy of a cancerimmunotherapy with reduced evidence of systemic autoimmunity)癌症免疫学与免疫疗法(Cancer Immunol Immunother)2008年8月；57(8):1263-1270。
74.弗朗桑MF(Fransen MF)、范德斯勒伊斯TC(van der Sluis TC)、奥森多普F(Ossendorp F)、阿伦斯R(Arens R)、梅列夫CJ(Melief CJ)CTLA-4阻断抗体的受控局部递送诱导CD8+T细胞依赖性肿瘤根除且降低毒性副作用的风险(Controlled local deliveryof CTLA-4blocking antibody induces CD8+T-cell-dependent tumor eradication anddecreases risk of toxic side effects)临床癌症研究.2013年10月1日；19(19):5381-5389。
75.马拉贝尔A(Marabelle A)、科尔特H(Kohrt H)、沙吉夫-巴菲I(Sagiv-BarfiI)等人.消减单一位点处的肿瘤特异性Treg根除散播性肿瘤(Depleting tumor-specificTregs at a single site eradicates disseminated tumors)临床研究杂志.2013年11月1日；123(11):4980。
76.伦德戈德C(Lundegaard C)、隆德O(Lund O)、尼尔森M(Nielsen M)使用基于神经网络的方法预测表位(Prediction of epitopes using neural network basedmethods)免疫学方法杂志(J Immunol Methods)2011年11月30日；374(1-2):26-34。
***
至此已经详细描述了本发明的优选实施例，应理解上文定义的本发明不应被限制在以上说明书中提出的特定细节，因为在不脱离本发明的精神或范畴下许多显而易见的对本发明的变型是可能的。

Claims (47)

1.一种治疗或预防有需要的受试者中的瘤形成的方法，该方法包括向有需要的受试者给予：
(a)瘤形成疫苗或免疫原性组合物；和
(b)至少一种检查点抑制剂。
2.如权利要求1所述的方法，其中该瘤形成疫苗包含至少两种、至少三种、至少四种或至少五种新抗原肽。
3.如权利要求1-2中任一项所述的方法，其中该新抗原肽的长度范围是从约5至约50个氨基酸。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中该新抗原肽的长度范围是从约15至约35个氨基酸。
5.如权利要求1所述的方法，其中该瘤形成疫苗组合物进一步包含pH调节剂和药学上可接受的载体。
6.如权利要求1所述的方法，进一步包括给予免疫调节剂或佐剂。
7.如权利要求6所述的方法，其中该免疫调节剂或佐剂选自下组，该组由以下各项组成：聚-ICLC、1018ISS、铝盐、Amplivax、AS15、BCG、CP-870,893、CpG7909、CyaA、dSLIM、GM-CSF、IC30、IC31、咪喹莫特、ImuFact IMP321、IS Patch、ISS、ISCOMATRIX、JuvImmune、LipoVac、MF59、单磷酰脂质A、蒙塔尼德IMS 1312、蒙塔尼德ISA 206、蒙塔尼德ISA 50V、蒙塔尼德ISA-51、OK-432、OM-174、OM-197-MP-EC、ONTAK、PEPTEL、载体系统、PLGA微颗粒、瑞喹莫德、SRL172、病毒微体和其他病毒样颗粒、YF-17D、VEGF陷阱、R848、β-葡聚糖、Pam3Cys、丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物、马来酸酐的共聚物、以及阿奎拉QS21刺激子。
8.如权利要求7所述的方法，其中该免疫调节剂或佐剂是聚-ICLC。
9.如权利要求1所述的方法，其中该检查点抑制剂是程序性死亡-1(PD-1)途径的抑制剂。
10.如权利要求9所述的方法，其中该PD-1途径的该抑制剂是抗PD1抗体。
11.如权利要求10所述的方法，其中该PD-1途径的该抑制剂是尼沃鲁单抗。
12.如权利要求1所述的方法，其中该检查点抑制剂是抗细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA4)抗体。
13.根据权利要求12所述的方法，其中该抗CTLA4抗体是伊匹单抗或曲美木单抗。
14.如权利要求1所述的方法，其中该受试者患有选自下组的瘤形成，该组由以下各项组成：非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、透明细胞肾细胞癌(ccRCC)、黑色素瘤、肉瘤、白血病或膀胱癌、结肠癌、脑癌、乳腺癌、头颈癌、子宫内膜癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌或前列腺癌。
15.如权利要求14所述的方法，其中该瘤形成是转移性的。
16.如权利要求1所述的方法，其中该受试者患有不可检测的瘤形成，但处于疾病复发的高风险下。
17.如权利要求1所述的方法，其中该受试者先前已经历自体造血干细胞移植(AHSCT)。
18.如权利要求1所述的方法，其中在开始给予该瘤形成疫苗之前开始给予该检查点抑制剂。
19.如权利要求1所述的方法，其中在开始给予该瘤形成疫苗之后开始给予该检查点抑制剂。
20.如权利要求1所述的方法，其中与开始给予该瘤形成疫苗同时开始给予该检查点抑制剂。
21.如权利要求18-20中任一项所述的方法，其中在第一次给予该检查点抑制剂之后每2-8周或更多周继续给予该检查点抑制剂。
22.如权利要求21所述的方法，其中在第一次给予该检查点抑制剂之后每2周、每3周或每4周、每6周或每8周继续给予该检查点抑制剂。
23.如权利要求18所述的方法，其中在给予该瘤形成疫苗之前一周期间停止给予该检查点抑制剂。
24.如权利要求18所述的方法，其中在给予该瘤形成疫苗期间停止给予该检查点抑制剂。
25.如权利要求18-20中任一项所述的方法，其中在肿瘤切除之后开始给予该检查点抑制剂。
26.如权利要求18-20中任一项所述的方法，其中在肿瘤切除之后1-15周开始给予该瘤形成疫苗。
27.如权利要求18-20中任一项所述的方法，其中在肿瘤切除之后4-12周开始给予该瘤形成疫苗。
28.如权利要求1所述的方法，其中在初免/加强给药方案中给予该瘤形成疫苗。
29.如权利要求28所述的方法，其中在第1周、第2周、第3周或第4周给予该瘤形成疫苗作为初免。
30.如权利要求28所述的方法，其中在第2个月、第3个月、第4个月或第5个月给予该瘤形成疫苗作为加强。
31.如权利要求2-30中任一项所述的方法，其中以约10μg-1mg/新抗原肽的剂量给予该疫苗。
32.如权利要求2-30中任一项所述的方法，其中以约10μg-2000μg/新抗原肽的平均每周剂量水平给予该疫苗。
33.如权利要求1-30中任一项所述的方法，其中以约0.1mg/kg-10mg/kg的剂量给予该检查点抑制剂。
34.如权利要求33所述的方法，其中该给予是静脉内的。
35.如权利要求12所述的方法，其中以约1mg/kg-3mg/kg的剂量给予该抗CTLA4抗体。
36.如权利要求1-32中任一项所述的方法，其中静脉内或皮下给予该疫苗。
37.如权利要求1-35中任一项所述的方法，其中静脉内或皮下给予该检查点抑制剂。
38.如权利要求1-35中任一项所述的方法，其中在该瘤形成疫苗的给药部位的约2cm之内皮下给予该检查点抑制剂。
39.如权利要求38所述的方法，其中以约0.1-1mg/该瘤形成疫苗给药部位的剂量给予该检查点抑制剂。
40.如权利要求1所述的方法，进一步包括给予一种或多种另外的药剂。
41.如权利要求40所述的方法，其中这些另外的药剂选自下组，该组由以下各项组成：化学治疗剂、抗血管生成剂、以及降低免疫抑制的药剂。
42.如权利要求40所述的方法，其中该一种或多种另外的药剂是抗糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子家族受体(GITR)的一种或多种激动型抗体。
43.一种疫苗接种或免疫试剂盒，包括：
(a)被配置用于引发对至少一种新抗原的免疫应答的、分开封装的冷冻干燥的免疫原性组合物；和
(b)用于重构该冷冻干燥的疫苗的溶液。
44.如权利要求43所述的疫苗接种或免疫试剂盒，其中该溶液包含佐剂。
45.如权利要求43所述的疫苗接种或免疫试剂盒，其中该免疫原性组合物是抗原。
46.如权利要求43所述的疫苗接种或免疫试剂盒，其中该免疫原性组合物是病毒载体。
47.如权利要求43所述的试剂盒，进一步包括检查点抑制剂。
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