ES2329461T3 - Procedimiento para la identificacion de alo-antigenos y su empleo para la terapia del cancer y en el transplante. - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para proporcionar epitopos de variantes alélicas de péptidos o de proteínas antígenos procedentes de una especie específica basada en cambios de uno o de varios aminoácidos relacionados con el polimorfismo que codifica un solo nucleótido, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de: (i) la definición de una proteína o de un péptido de interés o de un subconjunto de los mismos; (ii) el cribado de una base de datos que representa al menos dos o más librerías de ADN de dichas especies para dicho péptido o proteína definidos o un subconjunto de los mismos, (iii) la identificación y la selección de cambios de aminoácido de variantes alélicas de péptido/proteína, un producto de expresión o un fragmento de las mismas que es codificado por una secuencia de ADN que contiene, al menos, polimorfismo de un solo nucleótido en la región codificante, (iv) la creación de epitopos 8meros hasta 25meros, que comprenden el residuo de aminoácido que contiene dicho polimorfismo, y (v) la selección de aquellos epitopos que se enlacen con la proteína MHC.

Description

Procedimiento para la identificación de alo-antígenos y su empleo para la terapia del cáncer y en el transplante.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona un nuevo concepto con respecto a la amplia definición de los alo-antígenos que inducen una reacción de injerto-versus-tumor (GVT) y/o una enfermedad de injerto-versus-huésped (GVHD). El nuevo procedimiento para la identificación de los alo-antígenos, que ha sido hasta el presente un problema técnico no resuelto, exige así mismo nuevas estrategias en inmunoterapia.

Puesto que el análisis de proteínas enlazantes de HLA puede ser realizado ahora con alo-antígenos, cuya secuencia de aminoácidos correspondiente es conocida, la presente invención permite, así mismo, la separación de células T reactivas con el tumor, que únicamente reconocen células tumorales entre aquellas que favorecen la GVHD. Los antígenos, definidos con la nueva tecnología, son especialmente útiles para el diagnóstico y para la vacunación en cáncer y en enfermedades relacionadas con un transplante.

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Fundamento de la invención

En el estado de la técnica se sabe que una amplia porción de tumores expresa niveles elevados de auto-proteína, ocasionalmente alterada, que puede ser considerada como una diana potencial para respuestas inmunes. Así mismo, se ha observado que el ramal celular del sistema inmune (linfocitos T) es capaz de reconocer a las células cancerosas en modelos experimentales y en sujetos humanos, independientemente de que los tumores crezcan de manera progresiva.

Una hipótesis para explicar esta paradoja consiste en que los linfocitos T no funcionan adecuadamente en el huésped que porta el tumor. La otra alternativa consiste en la capacidad que tienen los tumores para reducir la regulación de la maquinaria que presenta el antígeno, de este modo se vuelven invisibles a los linfocitos T. Sin embargo, sigue siendo dudoso si la proteína sobreexpresada o alterada puede estimular a los linfocitos T citotóxicos (CTLs), reactivos con el tumor y contribuye a la inmunovigilancia del crecimiento tumoral. Así mismo, la mayoría de las proteínas tumorales son proteínas expresadas de manera ubicua y son capaces de favorecer la supresión de los CTLs específicos a partir del repertorio de células T autólogas. Las células T autorreactivas son normalmente suprimidas a partir de un estadio inmaduro de su desarrollo por apoptosis antígeno-inducida o selección negativa. Además de la selección antígena, pueden ser modulada una selección negativa por diferentes juegos de señales coestimulantes derivadas de (APC) (MacKinnon et al., Br. J. Haematol. 2000, 110: 12-17), que conducen a la formación de un sistema inmune que es tolerante con los autoantígenos. A pesar de estos descubrimientos desfavorables, existe un gran interés y una gran expectación sobre el hecho de que la vacunación contra los tumores puede ser efectiva y facilitar tratamientos para vencer las deficiencias de los enfoques terapéuticos actuales.

Durante los últimos 20 a 30 años se ha explorado la quimioterapia en combinación con radioterapia y con transplante de médula ósea (BMT) para algunos desórdenes metabólicos y hematopoyéticos, y se ha puesto en evidencia que el efecto terapéutico es provocado, únicamente en parte, por la erradicación de las células leucémicas empleándose quimioterapia e irradiación a altas dosis. Numerosas observaciones clínicas proporcionan una prueba más que convincente de que, así mismo, las respuestas inmunes (células T de donantes) contribuyen substancialmente a la eliminación de las células cancerosas residuales y, especialmente, al éxito subsecuente a largo plazo de las terapias basadas en el BMT. En el pasado, la estrategia terapéutica estándar en el BMT ha sobreestimado el potencial anticáncer de dosis, incluso con dosis muy elevadas, de quimioterapia y de radioterapia y se subestimaba la eficacia de la inmunoterapia favorecida por los linfocitos de donantes alogénicos derivados del BMT.

El éxito clínico observado después del tratamiento de los desórdenes hematopoyéticos (leucemia) con transplantes alogénicos de médula ósea (alo-MBTs) ha cumplido en un amplio margen los fundamentos de una inmunoterapia curativa.

El término alogénico es empleado para describir una situación en la que el donante y el receptor son individuos diferentes, en comparación con el término singénico, en el que el donante y el receptor son gemelos idénticos y tienen tipo tisular idéntico puesto que su carácter genético es el mismo. Los transplantes autólogos se derivan de un individuo que recibe más tarde de nuevo en el proceso sus propias células. Sin embargo, hablando en sentido estricto, esto no es un transplante puesto que no existen barreras inmunológicas al transplante.

Existen dos tipos de donantes alogénicos: donantes emparentados, usualmente fraternales, y no emparentados, usualmente encontrado entre un amplio número de grupo de voluntarios y asociados a un tipo tisular, que es el mismo que el del paciente.

El transplante alogénico, independientemente de que proceda de un donante emparentado o no emparentado, se diferencia del transplante singénico o autólogo en la existencia potencial de rechazo inmune de las células madre, donadas, por parte del receptor (efecto huésped-versus-injerto) y de la reacción inmune por parte de las células inmunes del donante frente a los tejidos del receptor (enfermedad injerto-versus-huésped).

El rechazo inmune se previene, de manera usual, mediante tratamiento intenso del receptor como paso previo al transplante (acondicionamiento) para suprimir el sistema inmune. Los esquemas de acondicionamiento varían de conformidad con el centro de transplante y con el tumor maligno implicado. Por ejemplo, en el tratamiento de la leucemia, el paciente es sometido a un acondicionamiento mieloablativo que comprende una combinación de ciclofosfamidas a dosis elevadas y a una irradiación corporal total como paso previo al BMT. La reacción inmune es combatida después del transplante mediante la administración de fármacos inmunosupresores, con inclusión de metotrexato, de hormonas glucocorticoides (esteroides), de ciclosporinas o de una microemulsión de las mismas (Neoral®), de tacrolimus (Prograf®) y de micofenolato de mofetil (Cellcept®), durante un período de tiempo limitado con objeto de prevenir un ataque agudo y un daño del tejido del paciente. Los avances en el cuidado de mantenimiento además de la inmunosupresión controlada han reducido substancialmente la toxicidad del acondicionamiento y la reacción inmune post-BMT. Sin embargo, todavía se presentan graves complicaciones en la orofaringe, en el tracto gastrointestinal, en el hígado, en el pulmón, en la piel, en los riñones, en el tracto urinario y en el sistema nervioso y, como consecuencia, el alo-MBT está limitado a pacientes jóvenes, adecuados desde el punto de vista médico.

En el arte anterior se acepta, por regla general, que los cánceres hematológicos no pueden ser erradicados siempre solo con elevadas dosis de acondicionamiento por quimioterapia-radiación, sino que se necesita además un alo-MBT. Por este motivo las terapias convencionales basadas en el alo-MBT se han convertido en un procedimiento estándar para el tratamiento de muchos tumores malignos hematológicos humanos y proporcionan el punto de referencia para todas las inmunoterapias - la posibilidad de una "curación".

Los donantes para un alo-MBT son elegidos de conformidad con su expresión de moléculas de complejo de histocompatibilidad principal (MHC): los antígenos leucocitarios humanos (HLA). Los tipos de HLA están genéticamente determinados. De este modo, un tipo individual de HLA es inherente de sus progenitores. Existen tres genes principales en un cluster que parece que son particularmente importantes en el transplante: HLA-A, HLA-B y HLA-DR. Cada individuo porta dos copias de cada uno de los genes en el cluster HLA. Por otra parte, muchas versiones alélicas corresponden a cada uno de los genes HLA.

Para obtener un emparejamiento ideal de 6-sobre-6, dos personas deben portar los mismos alelos y cada uno de ellos dos genes HLA-A, HLA-B y HLA-DR y existe una posibilidad de 1 a 200 de que un progenitor y un descendiente tengan emparejamiento HLA.

Cuando un pariente con emparejamiento HLA no esté disponible y sea la hora de llevar a cabo una investigación, se toma en consideración usualmente un donante no emparentado. La probabilidad de que 2 individuos no emparentados tengan emparejamiento para todos los genes 6 HLA es de 1 a un millón. Debido al polimorfismo del sistema HLA, a la base étnica y a la edad media en el momento de la diagnosis, los transplantes procedentes de donantes emparentados, con emparejamiento HLA, están usualmente disponibles entre un 15 y un 60% de los pacientes que son diagnosticaos por primera vez. Los donantes alternativos incluyen familiares con menores grados de incompatibilidad y voluntarios no emparentados con compatibilidad HLA. La probabilidad de encontrar donantes no emparentados adecuados, emparejados o parcialmente con emparejamiento incorrecto, se ha incrementado con el desarrollo de una red de registros que contienen ahora más de 4,7 millones de donantes en el mundo entero y con acceso a otras fuentes tales como la sangre de cordón fetal.

En la mayoría de los casos un transplante de médula ósea consiste en células madre hematopoyéticas que pueden ser obtenidas de la médula ósea, de la sangre o de la sangre del cordón fetal. Las células madre hematopoyéticas son usualmente aspiradas a partir de la médula ósea. Un procedimiento alternativo comprende un tratamiento entre 3 y 5 días del donante con factor estimulante de las colonias de granulocitos (G-CSF) para inmovilizar las células madre y las células del progenitor procedentes de la médula en la sangre. A continuación se recolectan las células apropiadas a partir del donante mediante leucaféresis.

La sangre contenida en la placenta y en el cordón umbilical de lo bebés recién nacidos está emergiendo como una nueva fuente de células madre. La sangre del cordón contiene un número significativo de células madre; ésta tiene ventajas sobre el BMT o sobre el transplante de células madre de sangre adulta para ciertos pacientes y puede ser considerada cuando no esté disponible un donante de células madre de médula no emparentado, compatible. Una ventaja de la utilización de la sangre del cordón umbilical consiste en que esta no necesita ser un tejido perfecto compatible con el receptor.

Los pacientes preacondicionados tal como se ha descrito precedentemente, reciben la preparación de células madre y al cabo de uno tiempo comprendido entre dos y cinco semanas desde el transplante, se pone de manifiesto el injerto de las células donadas por la aparición de leucocitos normales en la sangre del paciente. Se efectúa una transfusión periódica de de glóbulos rojos y de trombocitos hasta que se haya restaurado la función medular por las células madre transplantadas. El tiempo necesario para la recuperación hematopoyética es más corto con células madre sanguíneas que con células de médula ósea. Algunas de las nuevas células inmunes quiméricas reconocen al huésped como foráneo y producen un efecto injerto-versus-leucemia, que a continuación se denomina como actividad injerto-versus-tumor (GVT), que va acompañada, usualmente, por una enfermedad injerto-versus-huésped (GVHD). La reacción GVHD se produce cuando las células inmunes del donante, especialmente cuando los linfocitos T, reconozcan que las células del huésped son diferentes de estas mismas.

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La GVHD inducida por el alo-MBT es una función inmune que está estrechamente relacionada con la GVT que puede producirse poco después de que las células transplantadas comiencen a aparecer en el receptor. Ambos tipos de respuestas inmunes están favorecidas por las células T que reconocen a aquellas células que no son genéticamente idénticas y esto podría explicar el descubrimiento histórico de que los transplantes entre gemelos idénticos tienen menos éxito que aquellos que se realizan entre hermanos compatibles en el tratamiento de la leucemia mieloide crónica (CML) (Gale et al., Ann. Intern. Med. 1994, 120: 646-652). En el caso del transplante de células madre, las células del donante inspeccionan cuidadosamente las células del tejido del receptor para indicar diferencias y atacarlas si encuentran variaciones significativas. En la fase inicial, después del transplante, por ejemplo, está presente una célula presentadora de antígeno residual, derivada del paciente, y ésta será explorada por las células T derivadas del donante con respecto a las diferencias basadas en los genes polimórficos. Se inicia una respuesta citotóxica si las células T donadas reconocidas por las células del huésped presentan antígenos foráneos, que básicamente son todas las células inmunes. El que la respuesta de las células T lleve a una GVHD temible o a un GVT beneficioso está determinado por el hecho de que las diferencias manifestadas genéticamente estén presentes en el contexto de las células que pertenecen a los tejidos u órganos cancerosos o, lo que es peor, formen parte de los órganos esenciales no enfermos tales como la piel, las articulaciones, el pulmón, el hígado o el riñón. En función de la importancia del órgano afectado, la GVHD varía en cuanto a su severidad desde únicamente un ligero sarpullido hasta enfermedades amenazadoras de la vida. En general el alo-MBT sigue siendo de algún modo un enfoque agresivo, con una significativa morbilidad y mortalidad relacionada con el transplante. Una reciente compilación de artículos sitúa el riesgo de defunción entre un 20 y un 41% y, a pesar de la disponibilidad de potentes fármacos inmunosupresores, hasta el 70% de los pacientes tratados sufre todavía de GVHD. Por lo tanto constituye un aspecto central de la presente invención la amplia identificación de los alo-antígenos que son responsables de un proceso promotor de enfermedades así como la definición de los alo-antígenos que son útiles para la opción para el combate de las enfermedades.

De todos modos, la inmunoterapia basada en el BMT ofrece una supervivencia libre de leucemia hasta un 70% de los pacientes después del transplante (Clift et al. Haematol. 1997, 10: 319-336). Sin embargo, más de un 60% de los pacientes con CML no reciben alo-MBT debido al estado de la enfermedad, a la edad avanzada o a la falta de un donante adecuado.

El BMT y/o el transplante de células madre son opciones de tratamiento aceptadas para leucemia mieloide aguda (AML) en primera remisión o en remisión completa subsecuente, de la primera recaída o del fracaso por inducción de la AML, de la leucemia linfoblástica aguda (ALL) en primera remisión o en remisión completa subsecuente, de la ALL en primera recaída o en fracaso por inducción, la CML, la milodisplasia, la anemia aplástica, la recaída sensible y resistente de la enfermedad de Hodgkin, de la recaída sensible y resistente del linfoma agresivo, y del linfoma de baja intensidad.

Se produce una reacción injerto-versus-huésped cuando las células inmunes del donante, especialmente los linfocitos T, detectan que las células del huésped son diferentes de las suyas propias. Las diferencias pueden comprender un amplio espectro de proteínas que no son detectadas por tipificación HLA, o puede haber finas diferencias en la clasificación HLA que permiten el transplante pero sin engendrar la reacción. Las diferencias reflejan polimorfismo más limitado en codones individuales de las correspondientes moléculas HLA fuera del codón utilizado para la tipificación y el emparejamiento HLA. Se sabe que, con excepción de los gemelos idénticos, existe algún tipo de incompatibilidad incluso cuando el ensayo de HLA indique suficiente similitud como para permitir un transplante con éxito. Los procedimientos para la tipificación de HLA solamente cubren polimorfismos que han sido empíricamente cribados como importantes. Con el crecimiento de la información, que procede de la secuenciación HLA, se descubren continuamente nuevas variantes alélicas que, en parte, pueden ser reconocidas como foráneas. Por lo tanto se ponen de manifiesto variaciones cuando el donante y el receptor son de sexo diferente. En resumen, la severidad de las reacciones inmunes tal como la GVHD depende del tipo y del grado de diferencias proteicas molecularmente definidas entre el paciente y el donante que son presentadas por las células del paciente.

La actividad GVT ha sido estudiada perfectamente en pacientes con CML, mientras que el reconocimiento y la erradicación de células tumorales residuales por las células inmunes del donante (CTLs) parece que son esenciales para inducir una remisión molecular de larga duración. Por otra parte, el discernimiento de los mecanismos de la regulación inmune en la CML se ha conseguido mediante la observación de que existe un riesgo de incremento de recaída como consecuencia del agotamiento de las células T de los injertos. El riesgo de recaída está incrementado así mismo en ausencia de la GVHD (Goldman et al., Ann. Intern. Med. 1988, 108: 806-814; Horowitz et al., Blood 1990, 75: 555-562.). Por otra parte, el BMT de gemelo singénico es mucho menos efectivo que el BMT fraterno emparejado. En conjunto, estos descubrimientos indican que el reconocimiento por parte de las células T de las células tumorales es un requisito previo esencial para el efecto terapéutico.

Cuando reaparece la enfermedad tras un transplante aparentemente realizado con éxito, puede conseguirse una remisión completa por eliminación de los fármacos inmunosupresores o, lo que es más impresionante, por la infusión adicional de linfocitos T el donante. De este modo, el efecto del GVT relacionado con el alo-MBT representa la evidencia más concluyente de que el sistema inmune puede curar el cáncer en humanos y debe reseñarse que el poderoso efecto antileucémico está generado por las células T citotóxicas transferidas al receptor.

Los linfocitos T del donante destruyen las células de leucemia recurrentes por el efecto del GVT y, presumiblemente, las células T tanto de la subpoblación CD4^{+} como de la subpoblación CD8^{+} contribuyen en el injerto alogénico a este fenómeno. Las células CD4^{+} T tienen frecuentemente una función auxiliar para las respuestas inmunes favorecidas por anticuerpos o por células y están restringidas por MCH clase II. Las células CD8^{+} T tienen frecuentemente una función citotóxica y están restringidas usualmente al MCH clase I. Los antígenos relevantes (antígenos expresados por el tumor, los antígenos histocompatibles del receptor, o ambos) no han sido identificados hasta ahora y constituye el objeto de la presente invención la identificación y la definición de los antígenos participantes.

Es sorprendente que los injertos empobrecidos en células T están asociados con un riesgo acrecentado de recaída en caso de la CML (Goldman et al., Ann. Intern. Med. 1988, 108: 806-814; Horowitz et al., Blood 1990, 75: 555-562). Tal como se ha descrito precedentemente, pueden ser generados efectos anti-leucemia por medio de un alo-MBT, cuando se lleva a cabo la infusión de linfocitos del donante (DLI). En esta realización, la DLI puede reinstaurar una remisión molecular duradera en hasta un 70% de los casos. Sin embargo, la DLI puede estar también asociada con una toxicidad significativa provocada por las respuestas injerto-versus-huésped, que frecuentemente acompañan a un efecto injerto-versus-leucemia, con una mortalidad significativa provocada por una aplasia de médula y/o por una GVHD sistémica que se presenta entre en entre un 50 y un 90% de los casos (S. MacKinnon, Br. J. Haematol. 2000, 110: 12-17).

Para paliar las carencias relacionadas con la toxicidad del protocolo "tradicional" del alo-MBT, ha sido sugerido un modelo de acondicionamiento que comprende la inmunosupresión con micofenolato de mofetil (Cellcept®) y con ciclosporina en combinación con una irradiación total del cuerpo de baja dosificación, con una toxicidad mínima. Sin embargo, como consecuencia del acondicionamiento menos riguroso, ha sido observada una respuesta pronunciada injerto-versus-huésped. Las células T empobrecidas, procedentes del transplante como paso previo a la infusión, pueden prevenir en esta situación una GVHD. En la actualidad se ha desarrollado un tipo modificado de procedimiento de transplante, denominado algunas veces "minitransplante", basado en estas observaciones. Pueden evitarse los peligros del rechazo del injerto y de una elevada tasa de recaídas si se mantiene únicamente una porción de las células T en el injerto. La selección positiva de las células CD34^{+} a partir de preparaciones de sangre periférica proporciona una reducción de aproximadamente 1.000 veces de las células T. Estas células CD34^{+} purificadas, que contienen células madre comprometidas y pluripotentes, son adecuadas para el transplante alogénico. En el caso de la CML, se ha utilizado la administración de células T, acrecentada por incrementos, para obviar parcialmente el problema de la GVHD (MacKinnon et al., Blood 1995, 86: 1261-1268) y para incrementar el efecto GVT al mismo
tiempo.

En resumen, los enfoques futuros del injerto alogénico comprenderán minitransplantes empobrecidos en células T en combinación con una moderada inmunosupresión post-injerto para controlar el rechazo del injerto y la GVHD. Se espera que esto reduzca considerablemente las toxicidades agudas del injerto alogénico y que este modo, el alo-MBT pueda ser llevado a cabo en pacientes que no podían ser seleccionados con anterioridad, ampliamente con pacientes ambulantes. Se espera que este desarrollo futuro facilite estrategias basadas en inmunoterapia alogénica para el tratamiento de una variedad de tumores malignos humanos.

La mayoría de las actividades de investigación relacionadas con la discriminación inmunológica entre auto y no auto están focalizadas en las moléculas MHC altamente polimórficas, en particular en las moléculas HLA en humanos y en antígenos H-2 en ratones. Sin embargo, debe tenerse en consideración que en la mayoría de los casos del BMT, el donante ha sido seleccionado por el criterio de que su tipo de HLA está estrechamente o perfectamente emparejado con los HLA del receptor. En los donantes con emparejamiento HLA, el origen de la GVHD y del GVT se ha supuesto que está relacionado con las moléculas polimórficas diferentes de los HLA. Investigaciones recientes tratan de desenmarañar el origen molecular de la GVHD y, por lo tanto, las respuestas inmunes GVT en el BMT han adquirido ventajas sobre las reacciones específicas impulsadas por los linfocitos T, cuando los CTLs reconocen péptidos derivados de antígenos presentados por los HLA de la clase I del receptor. Estas células T han sido aisladas y utilizadas para la identificación de alo-antígenos. Se ha observado que las disparidades en los antígenos polimórficos diferentes de los HLA, entre el donante y el receptor parece ser relevante para el desarrollo del GVT inducido por los linfocitos T y de la GVHD. De este modo, la llave para entender la respuesta inmune a la GVHD y al GVT consiste en la compresión de los antígenos participantes. Investigaciones en el campo de las respuestas inmunes alogénicas han considerado los aspectos que han sido citados precedentemente y han conducido a la identificación de otras moléculas importantes: los antígenos de histocompatibilidad denominados "menores" (mHAgs). El amplio número de estas proteínas altamente diversas en combinación con la función biológica complicada y diversa de los antígenos ha frustrado hasta el presente los intentos de una caracterización completa.

Por definición, los mHAgs son capaces de producir una respuesta inmune (Lewalle et al, Br. J. Haematol. 1996, 92: 587-594) y éstos son presentados al sistema inmune de células T como péptidos enlazados con moléculas de HLA específicas. De este modo, únicamente las células T pueden reconocerlas fácilmente y se ha supuesto que los mHAgs juegan un papel importante en la inducción de la reactividad de los CTL frente a la leucemia y los autoantígenos tras un alo-MBT. Infelizmente, la mayoría del reducido número de los mHAgs que han sido identificados hasta ahora no son específicos de la leucemia y así mismo son expresados por tejidos normales. La expresión tisular relativa de los mHAgs conocidos no ha sido determinada debido a la carencia de la disponibilidad de reactivos. Sin embargo, los análisis funcionales utilizando los CTLs sugieren un gran número de mHAgs tiene una distribución restringida tisular y, de este modo, sólo algunos tejidos pueden tener el riesgo del rechazo. Así mismo es interesante la observación de que, en el BMT, el cuadro clínico de las GVHD inducidas por los mHAg se parece a un gran número de enfermedades autoinmunes, tales como el lupus sistémico eritematoso y el escleroderma, lo que sugiere que los síntomas de la GVHD crónica son de carácter autoinmune.

Por definición, los mHAgs son codificados fuera de la región de los HLA del cromosoma humano 6, pero, sin embargo, son capaces de producir una notable respuesta inmune. Independientemente de que el mecanismo de la GVHD no ha sido completamente elucidado, se reconoce perfectamente que los CTLs derivados del donante, específicos para los mHAgs del paciente, juegan un papel importante en la reacción citotóxica impulsada por los linfocitos T contra la mayoría de los órganos diana (con inclusión de la piel, el tubo digestivo, el hígado, el pulmón y las articulaciones) y en la manifestación resultante de la GVHD que, en los casos severos, puede ser fatal. Mientras que el mecanismo de la GVHD parece que ha sido investigado de una manera razonablemente buena, está menos definido el papel de los mHAgs en la inducción del GVT. Esto podría deberse al hecho de que únicamente ha sido identificado y analizado un número muy pequeño de antígenos del espectro completo de los mHAg y que las tecnologías disponibles en la actualidad carecen de un procedimiento efecto para reconocer a los antígenos de una manera comprensiva. Por otro lado, los antígenos son un requisito previo para el aislamiento y la caracterización de los clones de los CTL responsables de la mediación en un efecto curativo o de un efecto adverso. De este modo, el enfoque del BMT curativo sigue siendo una disciplina empírica con relación a la especificidad de la respuesta inmune que interviene.

El paciente y el transplantador están centrados normalmente de manera exclusiva en el resultado de la terapia, que actúa de una manera razonablemente muy buena para una mayoría de pacientes, como se ha descrito precedentemente.

En los seres humanos han sido sugeridos mHAgs relacionados con la inducción de la GVHD, aún cuando son difícilmente identificables, pero sigue siendo incierto su número total y su complejidad. Experimentos genéticos llevados a cabo en ratones indican un gran número de mHAgs, pero únicamente ha sido identificado un reducido número de genes. En los seres humanos han sido aplicados clones de linfocitos T reactivos con mHAgs específicos, en combinación con análisis de enlace genético, para identificar dos locus distintos en un único paciente, codificando cada uno de los locus un antígeno presentado a un clon de célula T por el HLA-B7. Esta técnica ha sido sugerida por una enumeración aproximada del número de los mHAgs en los seres humanos que son capaces de producir respuestas de las células T in vivo. Hasta el presente no es claro que estas respuestas de las células T estén relacionadas con la GVHD clínica. (Gubarev et al., Exp. Hematol. 1998, 10: 976-81).

Para obtener un cuadro más completo de las características que cualifican a una proteína para ser nominada como un mHAg humano, es de gran ayuda complementar la información disponible del sistema humano con los datos recogidos de un sistema murino en el que hayan sido identificadas en el pasado mHAgs adicionales. Se ha descubierto que los homólogos humanos de estas proteínas son reconocidos por los CTLs humanos alo-reactivos y lo mismo es cierto para lo ratones. Por lo tanto se han identificado cada vez un mayor número de mHAgs (tabla 1 A y B) como dianas para una respuesta, por ejemplo mediante el uso de clones de CTL aislados que han sido derivados de pacientes que sufren de una GVHD. Con la ayuda de los clones ha sido posible analizar los componentes péptidos (péptidos enlazantes de HLA) derivados de los correspondientes mHAgs y los clones específicos de las células T que intervienen en su reconocimiento.

El modelo de explante de piel humana es un enfoque que ha sido sugerido como un indicador preciso de una GVHD aguda y puede ser útil para detectar disparidades adicionales de mHAg. El modelo ha sido usado para predecir la GVHD con un resultado en el 77% de los casos. Otros análisis, tales como un análisis de células T auxiliares reactivas del huésped y de frecuencia del precursor de los CTL ayuda a predecir la ocurrencia de una GVHD agua tras un BMT fraternal con HLA idénticos (Dickinson, Transplantation 1998, 66: 857-63).

El análisis de repertorios de la región variable de la cadena alfa del receptor de las células T y de la región variable de la cadena beta del receptor de las células T ha revelado que el receptor de las células T utilizado había sido distorsionado en un período anterior (6 a 7 semanas) tras el BMT, lo que sugiere que las células T pueden haber sido expandidas como respuesta a los alo-antígenos tales como los mHAgs, y que repertorios alterados están eventualmente normalizados por la regeneración de las células T a través de una vía dependiente del timo en los niños (Matsutani et al., Br. J. Haematol. 2000, 109: 759-769).

Uno de los primeros mHAgs identificados fue el antígeno H-Y que codifica el gen SMCY (Meadows et al., Immunity 1997, 6: 273-281; Wang et al., Science 1995, 269: 1588-1590) que puede jugar un papel en la espermatogénesis.

Los antígenos H-Y pueden conducir al rechazo del órgano macho con emparejamiento HLA y de los injertos de médula ósea en el caso de receptores hembra y puede conducir a un índice mayor de GVHD en injertos de hembra-a-macho, en particular si la hembra donante ha estado preñada previamente. Entretanto los genes DFFRY (Vogt et al., Blood 2000, 95: 1100-1105) y UTY han sido identificados como fuentes de otros antígenos H-Y (WO 97/05168, WO0077046).

Antígenos adicionales inductores de la GVHD, concretamente la familia de proteínas HA-1, HA-2, H-4, H-5 y H-8, han sido identificados mediante un estudio retrospectivo en receptores con GVHD severa (Mutis et al., Nat. Med. 1999, 5: 839-842).

El antígeno HA-1 fue identificado con ayuda de los CTLs sometidos a restricción con HLA-A*0201 y se identificó químicamente como un nanopéptido derivado de un alelo del gen KIAA0223. A nivel del ADNc, el locus HA-1 tiene dos alelos, el HA-1 H y el HA-1 R, que se diferencian en dos nucleótidos, que dan por resultado una substitución de un solo aminoácido (den Haan et al., Science 1998, 279: 1054-1057; Arostequi et al., Tissue Antigens 2000, 56: 69-76). El aislamiento y la secuenciación del ADN cósmido, que codifica la secuencia del péptido HA-1, ha revelado que los alelos HA-1 son codificados por dos exones y que ambos juegos contienen secuencias intrónicas. La tipificación genómica del ADN con dos juegos diferentes de cebadores, que consisten en un cebador específico del alelo y un cebador común, ha revelado tres familias que consisten en 24 individuos HLA-A*0201-positivos que están relacionados, en todos los casos, con la clasificación de los mHAg por los CTLs y por la transcriptasa inversa-reacción en cadena de polimerasa RT-RCP. En el futuro, la tipificación genómica prospectiva de los alelos HA-1 puede ayudar a mejorar la selección del donante y a identificar los receptores HLA-A*0201-positivos con un elevado riesgo de GVHD inducida por el HA-1 (Wilke et al., Tissue-Antigens 1998, 52: 312-317; W09905313). El antígeno humano HA-2 es un péptido enlazantes de HLA nonámero derivado de una clase I de miosina (Goulmy et al., US 5770201).

Se ha observado que la expresión de los mHAgs constituidos por el HA-1 y por el HA-2 está restringida principalmente a los tejidos hemopoyéticos, con inclusión de las células de leucemia y los precursores de las células de leucemia (Mutis et al., Blood 1999, 93, 2336-2341). Éstos no han sido expresados en fibroblastos, en queratinocitos o en células hepáticas. Esto puede explicar el porqué los CTLs específicos para los mHAgs HA-1 y HA-2 favorecen de destrucción específica las células hemopoyéticas del donante, restringidas por HLA-A*0201.

Se ha descrito el HB-1 como otro mHAg que produce reactividad CTL derivada del donante en una célula B (B-ALL) de un paciente tratado con un BMT con emparejamiento HLA. El péptido EEKRGSLHVW, codificado por el gen HB-1, fue reconocido por los CTL en asociación con el HLA-B44 (Dolstra et al., J. Exp. Med. 1999, 189: 301-308). Otros análisis han revelado que un polimorfismo en el gen HB-1 genera el cambio de un solo aminoácido de His en Tyr en la posición 8 dentro de este péptido. Esta substitución de aminoácido fue crítica para el reconocimiento por los CTL específicos de HB-1. Se ha propuesto que la expresión restringida del antígeno HB-1 polimorfo por las células B-ALL y la aptitud para generar CTLs específicos de HB-1 in vitro usando células dendríticas cargadas de péptidos puede proporcionar la oportunidad de orientar de manera específica el sistema inmune a las células B-ALL sin el riesgo de provocar una GVHD.

Otro antígeno, que ha sido relacionado con una GVHD, es el CD31. La secuenciación directa de varios ADNc CD31 ha revelado la presencia de un solo aminoácido cambiado en la posición 125 de la proteína. No se ha observado ningún otro polimorfismo además de estos dos alelos (Behar et al., N. Engl. J. Med. 1996, 334: 286-291). Los epitopos correspondientes presentados por los HLA están perfectamente relacionados con un cambio de un solo aminoácido reconocido por los CTLs.

Los descubrimientos que han sido descritos precedentemente con HA-1, HA-2 y con los otros mHAgs sugieren que células T específicas podrían atacar selectivamente células tumorales in vivo y podrían discriminar entre los mHAgs expresados por células madre hemopoyéticas y fibroblastos, destruyendo únicamente a las primeras. De manera interesante, podría inducirse una remisión completa en un paciente tratado con células T donantes que se hayan vuelto "reactivas a la leucemia" in vitro (Falkenburg et al., Blood 1999, 94: 1201-1208). Sin embargo, la base molecular para la discriminación entre los antígenos que inducen la GVHD y el GVT sigue siendo desconocida y en la actualidad no existe un enfoque directo que permita la identificación de los péptidos enlazantes de HLA derivados de mHAg y su relación con las proteínas, cuya estructura bioquímica es conocida. Por otra parte, se sabe poco sobre la función de las proteínas o del número de proteínas que pueden haber sido consideradas como mHAgs. Mediante el estudio de la frecuencia de las mutaciones génicas mHAg y del número de diferencias mHAg entre cadenas de ratón se ha estimado que el número total de los mHAgs podría ser del orden de 430 hasta 720 genes. Sin embargo, debe tenerse en consideración que algunos de estos estudios han sido llevados a cabo con modelos de rechazo de injerto de piel que son extremadamente sensibles como consecuencia de la presentación de los péptidos mHAg por las células dendríticas de la piel. Las células dendríticas, derivadas de otros órganos, tal como del sistema hematopoyético, pueden presentar antígenos diferenciados, por lo que resultaría un número de mHAgs mucho más bajo. Las estimaciones basadas en este tipo de enfoque han dado números del orden de 80 proteínas diferentes.

En un estudio encaminado a la identificación de los antígenos diana para la respuesta GVT a las células de leucemia, los autores Clave et al. (J. Immunother. 1999, 22: 1-6) han detectado polimorfismo de la proteinasa 3, que es una proteína granular primaria sobreexpresada en la leucemia mieloide. El estudio se llevó a cabo con 10 pacientes con enfermedades hematológicas y con sus donantes de médula con HLA idénticos. El enzima es expresado en células de linaje mieloide pero es sobreexpresada en la leucemia mieloide, con inclusión de la CML (Molldrem et al., Blood 1997, 90: 2529-2534; Dengler et al., Brit. J. Haematol. 1995, 89: 250-257), y los CTLs específicos de PR1, un péptido derivado de la proteinasa 3, que produce la lisis eficazmente de las células CML (Molldrem et al., Blood 1997 90: 2529-2534). Se ha detectado la circulación de los CTLs específicos de PR1 en un número de pacientes con CML, con inclusión de aquellos que han sido tratados mediante un alo-MBT, y su presencia está relacionada con un buen pronóstico (Molldrem et al., Nat. Med. 2000, 6: 1018-1023). Con ayuda del ensayo de polimorfismo de conformación de hebra simple por reacción en cadena de polimerasa (RCP) seguido por una secuenciación dirigida de los productos de la RCP, se han encontrado siete polimorfismos de un solo nucleótido. Uno de los cuales codifica una isoleucina o bien una valina en la posición 119 de la secuencia de aminoácidos. Se ha indicado que los péptidos que separan el locus polimórfico, en los aminoácidos 115-124, enlazan in vitro las moléculas de HLA-A2. Se han cribado 23 pacientes con HLA-A2 con leucemia mieloide y sus donantes con HLA idénticos para el polimorfismo. No se encontró recaída en el grupo de 4 pacientes evaluables que tenían al menos un alelo que estaba ausente en su donante, mientras que 7 de los 15 pacientes restantes evaluados sufrieron recaída. Estos datos soportan la posibilidad de que las respuestas de las células T a las diferencias alélicas de la proteinasa 3 podrían ser utilizadas como una base para diseñar una terapia con células T adoptivas específicas de la leucemia en leucemia mieloide aguda y crónica.

En resumen, los enfoques actuales para la identificación de nuevas proteínas candidatas como mHAg están basados principalmente en la identificación de los CTLs aislados y/o de péptidos eluidos de HLA principalmente relacionados con la GVHD y únicamente de manera ocasional estos antígenos han sido definidos a través de las proteínas correspondientes.

En la tabla 1A se ha dado una lista de los mHAgs recogidos en la literatura para ratones y para seres humanos. Hasta el presente no ha sido puesta al día una estrategia bien definida para llevar a cabo la identificación de mHAg más pronosticable y rápida, por lo que únicamente aparecen lentamente genes candidatos de nuevos mHAgs humanos caracterizados a través de los enfoques disponibles. No existe una técnica en el estado de la técnica conocido que permitiese un acceso más fácil a nuevos mHAgs adicionales o a proteínas candidatas. Probablemente existe un grupo diverso y elusivo de fragmentos de moléculas que se derivan de proteínas que participan en varias funciones domésticas celulares y, en general, se desconocen las localizaciones de los locus codificantes. Algunos de los mHAgs parece que son ampliamente expresados en varios tejidos a través del cuerpo, mientras que otros muestran una distribución tisular limitada. Hasta el presente no se ha relacionado su análisis con la reactividad antileucemia pero en la mayoría de los casos se han asociado exclusivamente con la GVHD potencialmente mortal. Esto se debe a que las tecnologías actualmente disponibles están ampliamente basadas en la identificación de los mHAgs relacionados con la GVHD y solo de manera esporádica un mHAg ha sido sugerido para la prevención de una enfermedad, por ejemplo la inducción de respuestas al GVT.

De manera interesante, todos los estudios relacionados con la caracterización de la GVHD y de las respuestas inmunes GVT han dado como resultado la sorprendente observación de que los antígenos relacionados son los mHAgs con un polimorfismo limitado que se produce por medio de raras mutaciones de ADN que conducen a cambios de un aminoácido en la correspondiente secuencia de proteínas. Por lo tanto es evidente que estos cambios de aminoácido deben ser presentados a través de la clase I de los HLA con objeto de provocar respuestas GVT o una GVHD. Algunos clones alogénicos de células T, que intervienen en la GVHD, han sido aislados y se ha mostrado que reconocen de manera específica cambios de un aminoácido de los péptidos presentados por los HLA.

La leucemia, el linfoma y el mieloma son cánceres que se originan en la médula ósea y en los tejidos linfáticos. Las enfermedades resultan de una lesión genética adquirida (no heredada) del ADN de una sola célula que se deriva del sistema hematopoyético, que se convierte en el clon leucémico y que a continuación se multiplica de manera continua. Esta proliferación no restringida interfiere con la producción del cuerpo de glóbulos sanguíneos sanos y hace que el cuerpo sea incapaz de llevar a cabo las funciones fisiológicas esenciales ni su propia protección contra las infecciones.

En los Estados Unidos, aproximadamente 107,900 personas han sido diagnosticadas de leucemia, de linfoma y de mieloma en 1999 y esto corresponde al 11 por ciento de los casos de cáncer que son diagnosticados en los Estados Unidos por año. Una estimación total de 632,000 americanos viven actualmente con leucemia, con linfoma y con mieloma. El número disponible para Europa es muy similar al que se ha observado en los Estados Unidos, en los que la leucemia, el linfoma y el mieloma producirán la defunción estimada de 60,500 personas por año. La leucemia y el linfoma son los cánceres letales principales en mujeres jóvenes y en hombres jóvenes por debajo de 35.

En la fase crónica inicial, la CML se caracteriza por una translocación cromosómica t(9;22) (Philadelphia Chromosome, Ph), que crea el oncogen bcr-abl. El producto del gen quimérico es una tirosina cinasa inespecíficamente activa que es la diana de los inhibidores sintéticos tal como el STI571. En comparación con pacientes afectados por otros tipos de tumores, los pacientes con CML tienen todavía un sistema inmune relativamente intacto en la fase crónica, y es evidente ahora cada vez más que los péptidos bcr-abl, junto con otros antígenos asociados con enfermedades, desconocidos, pueden ser presentados por las moléculas de HLA y pueden ser reconocidos por las células T. Se ha utilizado la inmunización directa de pacientes con proteína de fusión para explorar el potencial del alo-MBT en el ámbito clínico para reforzar la inmunidad que se presenta de manera natural o inducida por el transplante. Un ensayo inicial ha puesto de manifiesto que una vacunación de este tipo es segura; algunos pacientes han presentado respuestas específicas a las células T al antígeno inmunizante (Pinilla-Ibarz et al., Blood 2000, 95: 1781-1787).

La leucemia aguda sigue siendo hasta ahora un reto formidable para la cual los tratamientos (quimioterapia, BMT y radiación) son individualizados de conformidad con los perfiles de riesgo que se deducen del perfil citogenético de los pacientes. El BMT se reserva a pacientes que responden mal sólo con quimioterapia. Con objeto de progresar en términos de curación de estas enfermedades devastadoras, constituye un objetivo fundamental la compresión de la biología de la leucemia a nivel clínico, celular y molecular, y especialmente la definición molecular de los antígenos relacionados con la enfermedad para el diseño de estrategias inmunoterapéuticas, para permitir la erradicación del clon leucémico participante.

El carcinoma celular renal (RCC) representa, aproximadamente, un 5% de todos los fallecimientos producido por el cáncer. En el momento de la presentación, más de un 50% de los pacientes han desarrollado ya enfermedad metastásica localmente avanzada con tasas de supervivencia de 5 años menor que un 20%. Numerosos estudios con un gran número de modalidades diferentes de tratamiento han dado como resultado únicamente pequeños avances. Ningún agente individual o terapia combinada ha mostrado de manera consistente una proporción de respuesta de un 20% o por encima de este valor. Las terapias con interleuquina-2 y basadas en interferon-alfa son las que se usan de una manera más común para el tratamiento de la enfermedad avanzada, que demuestran proporciones de respuesta baja pero reproducible en un intervalo comprendido entre un 10% y un 20%, con respuestas duraderas de un 5% o por debajo de este valor (Nanus, Curr. Onco/. Rep. 2000, 2: 417-22).

Puesto que el RCC es susceptible a la citoquina o a la inmunoterapia basada en el interferon, existen buenas razones para creer que células T específicas intervienen en la eliminación de las células tumorales autólogas (Schendel et al., J. Mol. Med. 1997, 75: 400-413). Recientemente han sido aisladas células T específicas del tumor a partir de linfocitos de RCC humano infiltrante por medio de ensayo de captura IFN-gamma (Becker et al., Nat. Med. 2001, 7: 1159-1162). Sin embargo, debido al conocimiento incompleto de los antígenos del RCC y de sus péptidos correspondientes presentados por la clase I, se comprende poco el papel de las células T en las inmunoterapias con interferon-alfa del RCC.

La identificación de nuevos antígenos que podrían ser útiles para la inmunoterapia del RCC sigue siendo una elevada prioridad. Se han descrito procedimientos para la identificación de antígenos que son relevantes en el RCC al nivel de la transcripción así como al nivel de la expresión proteica. La comparación de las proteasas de riñón no canceroso y del RCC en el electrofóresis de gel bidimensional (2-DE) y patrones de proteína particularmente diferentes revelados por tinción con plata (aproximadamente 800 manchas en los RCC contra aproximadamente 1.400 manchas en el riñón normal). La inmunotransferencia en 2-DE ha revelado cinco manchas específicas del RCC, reactivas de manera reproducible con sueros procedentes de pacientes con RCC pero no con aquellos donantes sanos. Dos de estos antígenos han sido aislados mediante 2-DE preparativa y han sido identificados como proteína del músculo liso 22-alfa (SM22-alfa), una proteína enlazante de actina de función desconocida expresada de manera predominante en las células del músculo liso. La hibridación in situ ha revelado que la SM22-alfa no es expresada en las células malignas pero es expresada en células mesenquimales del estroma tumoral. El segundo antígeno representa anhidrasa carbónica I, una isoforma usualmente no expresada en el riñón. De manera interesante, ha sido identificada previamente una isoforma diferente (CAXII) mediante clonación de expresión serológica como un antígeno sobreexpresado en algunos RCC. Han sido detectados anticuerpos de CAI recombinante o de SM22-alfa en sueros procedentes de 3 de 11 o de 5 de 11 pacientes con RCC, respectivamente, mientras que los sueros procedentes de 13 individuos sanos no producen reacción. En conclusión, los procedimientos serológicos pueden ser una herramienta útil en el análisis del proteoma y pueden contribuir a la identificación de antígenos asociados con el tumor renal. Sin embargo, todavía existe una necesidad de identificar antígenos RCC relevantes y, específicamente, debe ser mostrada la relevancia de estos antígenos para la vacunación contra el cáncer.

Esta situación en RCC refleja el estado de otras enfermedades tumorales sólidas, para las cuales se ha encontrado, entretanto, un número total de 60 antígenos proteicos diferentes que corresponden a 178 epitopos. Se ha utilizado una gran cantidad de estos antígenos y de los correspondientes epitopos de células T en diverso protocolo de vacunación, formulaciones adyuvantes y sistemas de presentación de base celular para mejorar la respuesta inmune. Sin embargo, independientemente del protocolo y del antígeno participante, los resultados obtenidos han sido bastante comparables: la activación de las células T sin respuesta clínica. De este modo las vacunas pueden jugar algún día un papel importante en la terapia, sin embargo las respuestas inmunes observadas en ensayos clínicos no han sido extrapoladas hasta el presente en un beneficio de supervivencia significativo.

El potencial inmunoterapéutico del alo-MBT, tal como se ha descrito precedentemente para la leucemia, ha sido explorado entretanto con otras enfermedades, tales como los desórdenes de deficiencia enzimática, en la anemia de Fanconi, y en la talasemia mayor. Esto ha sido posible principalmente como consecuencia del crecimiento de la experiencia clínica y se ha puesto en evidencia que el enfoque del alo-MBT puede ser utilizado también para la inmunoterapia de tumores sólidos metastásicos tal como el RCC. En un estudio, que ha sido publicado recientemente (Childs et al., N. Engl. J. Med. 2000, 343: 750-758), se ha aplicado un transplante de células madre alogénicas, no mieloablativo, para inducir una regresión sostenida del RCC metastásico en pacientes en los que ha fracaso la terapia convencional con citoquina. Diez de 19 pacientes (53 por ciento) que han intervenido en el estudio han tenido una respuesta mensurable, y 3 pacientes han tenido una respuesta sostenida, completa. Aun cuando estos resultados son prometedores y deben animar estrategias de tratamiento similares para ser usadas contra otros tumores metastásicos, el procedimiento utilizado por los autores Childs et al. no es completamente satisfactorio puesto que la regresión del tumor en algunos pacientes estaba acompañada por una GVHD severa. Dos pacientes fallecieron tras recibir este tratamiento. Aun cuando el procedimiento necesita un mayor ajuste para minimizar las complicaciones y para mejorar su eficacia, la muestra del principio está ya disponible: las células T alogénicas pueden erradicar células cancerosas renales, y los linfocitos donantes pueden sobrevivir en el huésped tras acondicionamiento no mieloablativo. El mensaje más general de este estudio, sin embargo, consiste en que el alo-MBT es extensible al tratamiento de los tumores sólidos. Otros progresos en la terapia de los tumores sólidos, tal como en el caso del RCC, dependerán del establecimiento de una inmunoterapia antitumoral segura y mejor controlada que esté exenta de respuestas GVHD.

El transplante de médula ósea comparte muchos aspectos con el transplante de órganos sólidos, tal como el riñón, el corazón, el hígado y el pulmón, mientras que la transferencia orgánica sigue siendo también el tratamiento elegido para diversas condiciones patógenas. Aun cuando recientes progresos relacionados con el desarrollo de mejores fármacos inmunosupresores ha mejorado la supervivencia a corto plazo de los injertos alogénicos, el rechazo inmunológico sigue siendo todavía un obstáculo para la supervivencia a largo plazo. Se ha acumulado una evidencia substancial, que indica que la falta de compatibilidad en el órgano donante y el paciente, concretamente el emparejamiento incorrecto del mHAg, afecta a la supervivencia del órgano sólido y promueve la GVHD. De este modo, los pacientes cuya experiencia de supervivencia de injerto a largo plazo tiene todavía un mal pronóstico, únicamente con un 40% de los riñones, sobreviven más de diez años. Se desconoce, y está sometido a debate, el papel de los emparejamientos incorrecto del mHAg en la pérdida eventual de estos injertos. De este modo, el transplante de órganos y, de manera especial, el transplante renal es otra aplicación que puede beneficiarse del alo-MBT y de la identificación de los alo-antígenos específicos de los alelos.

Los autores Cosimi et al. at the Massachusetts General Hospital han debatido que los riñones transplantados pueden ser implantados una vez que se haya dado a los receptores médula ósea procedente del donante, creándose de este modo un estado de quimerismo de células T en los pacientes (N. Engl. J. Med. 2002, 346:2089-92). En teoría, los linfocitos del donante migrarán hasta el timo, junto con el antígeno procedente del órgano donante, e inducen tolerancia para los nuevos riñones. En un escenario incluso más orientado al futuro, los procesos de la inducción de la tolerancia pueden estar soportados por vacunación con los alo-antígenos renales apropiados que hayan sido identificados, preparados y suministrados de conformidad con la presente invención. Una forma intermedia del tratamiento futuro puede comprender un transplante alo-MBT junto con un transplante renal, derivándose ambos injertos del mismo donante.

Se ha definido el polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) como un emparejamiento incorrecto entre dos secuencias de ADN (Stoneking, Nature 2001, 409: 821-822) y se refiere a una variación en la secuencia de un gen en el genoma de una población que se produzca como resultado del cambio de una sola base, tal como una inserción, una eliminación o, de manera preferente, tal como se usa en este caso, un cambio de una sola base que conduzca a un cambio de aminoácido. Los SNP se manifiestan como alelos mendelianos diferentes para un gen. Un locus es el punto en el que se produce la divergencia.

El cambio de base nucleótido, como se entiende en la presente invención, se refiere a la porción codificante del genoma y da como resultado la incorporación de un aminoácido alternativo en la correspondiente proteína. El cambio de aminoácido puede afectar a modificaciones post-traducción de dicho aminoácido, por ejemplo glicosilación. De este modo, el término SNP se refiere a la ocurrencia de dos o de varias secuencias alternativas genéticamente determinadas o alelos en una población y pueden manifestarse o detectarse como diferencias en las secuencias de ácido nucleico, en la expresión génica (con inclusión, por ejemplo, de la transcripción, del procesamiento, de la traducción, del transporte, del procesamiento proteico, del tráfico), en la síntesis de ADN, en las proteínas expresadas, o en otros productos génicos o productos de vías bioquímicas o modificaciones post-traducción manifestadas entre los miembros de una población.

Los SNPs, tal como se presentan en el arte anterior, han sido debatidos principalmente en relación con la función proteica alterada. Sin embargo, constituye una gran tarea el descubrimiento de SNPs funcionalmente relevantes entre 3 mil millones de bases de ADN y su distinción entre algunos millones de SNPs para los cuales no se conoce una función útil y uno de los retos principales de la investigación post-genoma. Mientras que progresa de manera continua, pero lenta, la generación de información de los SNP funcionalmente relevantes, la información general relativa al número total de SNP humanos y la asignación a los genes individuales está disponible a partir de diversos bancos de datos tales como dbSNP, CGAP, HGBASE, JST y Go!Poly etc. que recogen y que explotan datos de los SNPs establecidos en los Estados Unidos, en los países europeos, en Japón y en China. Compañías tales como Celera están creando y vendiendo herramientas para identificar los SNPs y tendrían un mapa de enlace basado en los SNP del genoma humano creado hacia finales del año 2002. La base de datos de los SNP de la firma Celera está basada en secuencias de ADN procedentes de 40 o 50 individuos y utiliza la información para detectar a los SNPs. El acceso a estos datos permitirá la asignación a un gen específico y permitirá la predicción de los SNPs relevantes para las enfermedades en el futuro.

La presentación de los antígenos está basada en dos vías distintas, una vía exógena de HLA clase II y una vía endógena de HLA clase I. Las moléculas de clase I son codificadas por los locus HLA-A, B y C y se considera que activan principalmente a las células T citotóxicas CD8^{+}. Las moléculas HLA clase II son codificadas por los locus DR, DP y DQ y activan principalmente a las células T CD4^{+}, siendo tanto células auxiliares como células citotóxicas.

Un individuo "normal" tiene seis moléculas HLA clase I, de manera usual dos de ellas proceden de cada uno de los tres grupos A, B y C. De manera correspondiente, todos los individuos tienen su propia selección de moléculas HLA clase II, nuevamente dos de las cuales proceden de cada uno de los tres DP, DQ y DR. Cada uno de los grupos A, B, C y DP, DQ y DR están divididos a su vez en varios subgrupos. Todos los productos génicos son altamente polimórficos. De este modo individuos diferentes expresan molécula HLA distintas, que difieren de las de otros individuos. Esta es la razón de las dificultades que se presentan a la hora de encontrar donantes de órganos con emparejamiento HLA en los transplantes. El significado de la variación genética de las moléculas HLA en inmunobiología está reflejado por su papel en los genes de respuesta inmune. Mediante su capacidad de para el enlace de péptidos, la presencia o la ausencia de ciertas moléculas HLA gobierna la capacidad de un individuo para responder a los epitopos péptidos. Como consecuencia, las moléculas HLA determinan resistencia o susceptibilidad a las enfermedades.

La expresión de HLA clase II está restringida a las APCs. Esto es consistente con las funciones de los linfocitos T auxiliares, que son localmente activados cuando encuentran a las APCs (macrófagos, células dendríticas o células B) que tienen antígenos interiorizados y procesados producidos por organismos patógenos.

Las moléculas MHC (HLA) clase I son expresadas en muchas células nucleadas del cuerpo y constituyen parte del mecanismo de defensa inmunológica principal contra los virus y contra otros patógenos intracelulares. Éstas están ensambladas en forma de heterodímeros de una cadena de clase I (HLA-A, -B, -C) y microglobulina \beta_{2} soluble que enlaza los péptidos generados por el antígeno procesado dentro de la célula y el transporte de estos péptidos hasta la superficie de la célula en la que pueden ser reconocidos por los CTLs a través el receptor de las células T.

Las vías de clase I y clase II no son completamente distintas. Por ejemplo, se sabe que células dendríticas y en alguna extensión los macrófagos, son capaces de provocar la endocitosis (pinocitosis) de proteínas extracelulares y, como consecuencia, las presentan en el contexto del MHC clase I. Se ha demostrado que los antígenos exógenos son capaces también de entrar en la vía de la clase I (Rock, et al., Immunol. Today, 1996, 17:131-137). Esto puede conseguirse mediante el uso especializado de vías de administración, por ejemplo mediante copulación de antígenos con perlas de óxido de hierro y parece ser que es un mecanismo central, debido a la importancia de una expresión concomitante tanto del MHC clase I y clase II en la misma APC para producir un cluster de tipo tricelular. Este cluster de tipo tricelular de interacción ha sido propuesto por los autores Mitchison et al. (Eur. J. Immunol., 1987, 17:1579-83.) y últimamente por otros autores. Éstos han mostrado la importancia de la presentación concomitante de epitopos de clase I y de clase II en la misma APC. De conformidad con el mecanismo recientemente descrito de la activación de los CTL (Lanzavecchia, Nature 1998, 393: 413-414, Matzinger, Nat. Med. 1999: 616-617), los APCs profesionales que presentan antígeno a través del MCH clase II, son reconocidos por las células T auxiliares. Esto da como resultado una activación de la APC (favorecida por la interacción del ligando CD40 sobre la células T auxiliares y CD40 sobre la APC) y permite que la APC estimule directamente a los CTLs que son activados de esta manera.

Se ha demostrado previamente que la inserción de un epitopo foráneo de cálulas T auxiliares, restringidas por el MHC clase II, en un auto-antígeno da como resultado la generación de un antígeno capaz de inducir fuertes respuestas anticuerpo con reactividad cruzada dirigidas contra el auto-antígeno no modificado (véase la publicación de la solicitante WO 95/05849). Se ha mostrado que la inducción auto-anticuerpo es provocada por la cálula T auxiliar específica, inducida por el epitopo foráneo insertado y se espera que el auto-antígeno modificado - con el auxilio de un adyuvante apropiado - sea capaz de inducir una fuerte respuesta CTL contra los auto-epitopos restringidos por el MHC clase I. Por lo tanto, la tecnología que ha sido descrita en la publicación WO 95/05849 puede ser adaptada también para proporcionar estrategias de vacunación contra antígenos intracelulares y otros antígenos asociados con la célula que tienen epitopos presentados en el contexto de MHC.

Se han descrito (Rammensee et al., Immunogenet. 1995; 41: 178-228; Ruppert et al., Cell 1993; 74: 929-937; Kubo et al., J. Immunol. 1994; 152: 3913-3924, Kondo et al., Immunogenet. 1997; 45: 249-258; Southwood et al., J. Immunol. 1998, 160: 3363-3373; Geluk et al., J. Immunol. 1994; 152: 5742-5748) motivos que enlazan al HLA para los alelos de clase I que se encuentran más frecuentemente (HLA-A1, -A2, -A3, -A11, -A24, -B7) así como para aquellos para diversas moléculas de la clase principal II. Un motivo enlazante se caracteriza por la necesidad de aminoácidos para un cierto tipo, por ejemplo aquellos para portar grupos laterales grandes e hidrófobos o cargados de manera positiva, en determinadas posiciones de los péptidos, de tal manera que se consigue un estrecho ajuste con las cavidades de la cisura que enlaza al HLA. El resultado de esto, tomado junto con la restricción longitudinal el péptido de 8 a 10 aminoácidos dentro de la cisura enlazante, consiste en que es prácticamente improbable que un enlace péptido con un tipo de moléculas HLA clase I se enlace, así mismo, con otro tipo. De este modo, por ejemplo, puede ser muy probable que el motivo enlazante con el péptido de los subgrupos HLA-A1 y HLA-A2, perteneciendo ambos al género de la clase I, sean tan diferentes como los motivos de las moléculas HLA-A1 y HLA-B1.

Por las mismas razones, es improbable que esté localizada la misma secuencia de aminoácidos en la cisura enlazante de las moléculas de clase II diferentes. En el caso de las moléculas HLA clase II, las secuencias enlazantes de péptidos pueden ser más largas, y se ha encontrado que usualmente éstas contienen entre 10 y 16 aminoácidos, algunos de los cuales no constituyen parte, en uno o en ambos extremos, de un motivo enlazante de la cisura HLA.

Puede producirse un solapamiento de diferentes motivos enlazantes con los péptidos de varias moléculas HLA clase I y clase II. Los péptidos que tienen un solapamiento en las secuencias enlazantes por al menos dos moléculas HLA diferentes se dice que contienen "epitopos de células T anidados". Los diversos epitopos contenidos en un "péptido de epitopo anidado" pueden ser formados por procesamiento de los péptidos por APCs y, a continuación, pueden ser presentados a las células T a través de diferentes moléculas HLA. La variedad individual de las moléculas HLA en péptidos de procedencia humana, contiene epitopos anidados más útiles como vacunas generales que los péptidos que únicamente son capaces de enlazar un tipo de molécula HLA.

Únicamente puede conseguirse la vacunación efectiva de un individuo si, al menos, un tipo de moléculas HLA clase I y/o clase II en el paciente puede enlazar un péptido de la vacuna bien en toda su longitud o por el APC propio del paciente tras procesamiento.

La utilidad de un péptido como vacuna general para la mayoría de la población incrementa con el número de moléculas HLA diferentes que puede ser enlazado bien en toda su longitud o por los APCs tras procesamiento. Mediante la identificación del juego de péptidos asociados con el antígeno que portan estos motivos y que se enlazan con las diversas moléculas HLA, podría ofrecerse una cobertura a la mayoría de la población humana (> 80%) para desarrollar inmunoterapia de tumores basada en epitopos de células T.

Con objeto de emplear péptidos derivados de una proteína codificada por versiones alélicas de un gen como vacunas o como agentes anticáncer para generar células T antitumor CD4^{+} y/o CD8^{+}, es necesario investigar la proteína mutante en cuestión e identificar péptidos que sean capaces, posiblemente tras procesamiento de péptidos más cortos por el APC, de estimular las células T.

En general, los tumores son muy heterogéneos con respecto a las alteraciones genéticas encontradas en las células tumorales. Esto implica que, tanto el efecto potencialmente terapéutico, como la extensión profiláctica de una vacuna contra el cáncer quedarán aumentados con el número de dianas que la vacuna sea capaz de producir inmunidad contra las células T. Una vacuna con dianas múltiples reducirá por lo tanto el riesgo de una nueva formación tumoral por variantes que escapan al tratamiento, procedentes del tumor primario.

Es evidente que la presentación de epitopos de células T (fragmentos péptidos) a las moléculas HLA clase I no es solamente una característica para el reconocimiento de las células sino así mismo es un requisito previo para examinar y destruir células tumorales y otras células que porten alo-antígenos por células T específicas.

De una manera más detallada, las proteínas que corresponden a la generación epitopo deben ser excindidas por medio de proteasomas en péptidos con aminoácidos C-terminales específicos. Los fragmentos excindidos deben ser transportados por las moléculas denominadas TAP (transportadores asociados con procesamiento antígeno) hasta el retículo endoplásmico en el que se produce el enlace HLA cuando los fragmentos contengan motivos propios enlazantes de HLA. De este modo, constituye un requisito previo el que los péptidos diana candidatos para la inmunoterapia, que contienen motivo propio para el enlace HLA, sean excindidos por el proteasoma en el aminoácido C-terminal derecho. Se han desarrollado ensayos de excinsión in vitro (4-24 horas) con empleo de proteasomas 20S celulares purificados para determinar experimentalmente la excinsión con el proteasoma apropiado de las proteínas candidatas y se han combinado con análisis péptido mediante espectrometría de masas. Los resultados de tales experimentos indican que mediante la combinación de la digestión con proteasoma y los estudios de enlace es adecuada para definir péptidos diana adecuados para la inmunoterapia y el técnico en la materia puede beneficiarse de PAProC (http://www.paproc.de), que es un algoritmo de predicción desarrollado para establecer la capacidad de excinsión general de las proteínas asociadas con la enfermedad.

Han sido identificados numerosos epitopos CTL hasta la fecha y, como se ha indicado precedentemente, éstos tienen motivos comunes con una longitud preferente y una composición de aminoácidos en ciertas posiciones. Los motivos previsibles han sido empleados para diseñar programas de ordenador que traducen la secuencia de los aminoácidos de una proteína dada en epitopos CTL. Para los inmunologistas que trabajan en la predicción de ligandos MCH clase I y epitopos CTL es particularmente útil el empleo de SYFPEITHI en http://syfpeithi.bmi-heidelberg.com) o, de manera alternativa, el empleo de BIMAS en http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla-bind/.

Las investigaciones in-vivo de las respuestas de las células T pueden estar limitadas por la dificultad de identificar a las células C específicas del antígeno entre una plétora de células no específicas. Esta dificultad se debe ampliamente a la pequeña afinidad de las interacciones entre el receptor de las células T (TCR) y su ligando natural, el complejo HLA-péptido. La multimerización de complejos HLA-péptidos, conocida como tecnología tetrámera puede vencer estos problemas técnicos mediante el incremento de la afinidad total de la interacción TCR-HLA en una extensión tal que tales complejos puedan ser utilizados como reactivos para la detección específica de los epitopos de las células T.

La generación de complejos solubles HLA clase II-péptidos no ha sido perfectamente establecida, quizás como consecuencia de la estructura más compleja de la cisura que enlaza al péptido de la clase II. La expresión in vivo y el plegamiento en células de insectos así como el empleo de epitopos péptidos enlazados de manera covalente son enfoques prometedores para vencer estos problemas técnicos.

El teñido tetrámero es altamente específico del epitopo e incluso poblaciones muy pequeñas pueden ser directamente identificadas ex vivo con esta técnica. Además de los análisis de frecuencia precisos, estos reactivos permiten la caracterización detallada desde el punto de vista del fenotipo y funcional de las poblaciones de células T específicas del epitopo a nivel de una sola célula, por ejemplo la expresión de marcadores superficiales, la determinación de perfiles de citoquina y los análisis en serie de TCR. Las cinéticas de enlace de los complejos tetrámeros HLA-péptido parece que son una herramienta útil para la medida de las afinidades relativas de las células T específicas del epitopo para su ligando. Además de las percepciones básicas y de la cuantificación de las respuestas inmune favorecidas por las células T, que se han posibilitado con tetrámeros, la tecnología puede ser empleada en alo-MBT para la eliminación de células T autorreactivas que intervienen en la GVHD.

La predicción teórica de un epitopo CTL con ayuda de los programas de predicción conocidos puede llevarse a cabo, sin embargo, únicamente para antígenos conocidos. De este modo, la identificación de las proteínas que portan a los epitopos reconocidos por las células T protectoras es una solución central desarrollada en las vacunas. Si el péptido reconocido por las células T ha sido generado por elución de las moléculas de la clase I, el desarrollo ulterior a través de vacunas basadas en péptidos puede ser un proyecto que requiera una gran cantidad de tiempo. El objetivo de esta invención consiste en estrechar este intervalo con respecto a la predicción de antígenos proteicos relacionados con el cáncer y con la GVHD.

La publicación WO 00/42181 debate antígenos de histocompatibilidad menor y su utilización en el diagnóstico y el tratamiento de tumores con inclusión de un estuche destinado a la detección de un solo aminoácido de variante alélica con emparejamiento incorrecto con relación a un SNP que comprende cebadores no solapantes.

El objeto especial de esta solicitud de patente consiste en identificar y en caracterizar alo-antígenos, tales como los mHAgs, y en determinar su papel en el GVT, en la GVHD y en el rechazo de injerto de órganos sólidos.

Con esta finalidad, hemos desarrollado nuevos enfoques para identificar y caracterizar alo-antígenos y la respuesta inmune de los mismos. Otros aspectos relevantes incluyen, pero sin carácter limitativo, la identificación de los locus genéticos y los alelos que codifican alo-antígenos y mHAgs y el perfeccionamiento de técnicas destinadas a determinar el número total de antígenos mHAg/locus mHAg y los alelos que intervienen. La identificación de los antígenos inmunodominantes mHAg/mHAgs incluye la evaluación de los péptidos antígenos y su papel en la terapia y en la enfermedad así como su relevancia con respecto a la abundancia relativa, la afinidad del péptido para HLA y la inducción de la acción citotóxica de las células T. De igual modo, podrían ser estudiados los correlatos in vivo de la función inmune péptida in vitro para determinar si los péptidos inmunodominantes identificados in vitro funcionan de manera similar in vivo. De igual modo puede ser estudiada la expresión tisular relativa de varios alo-antígenos o mHAgs y el impacto de su distribución tisular diferencial en el rechazo de transplantes.

Esta amplia información será utilizada para identificar enfoques relacionados con la respuesta GVT reforzada como se observa después de un BMT, para mejorar la supervivencia de un injerto. El alcance de la investigación para soportar esta solicitud de patente incluye, pero sin carácter limitativo, las siguientes áreas amplias de interés y ejemplos específicos de investigaciones. Los ejemplos no tienen carácter instructivo sino ilustrativo de áreas que serán exploradas más adelante.

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Sumario de la invención

La invención comprende el descubrimiento sorprendente de varios genes que codifican un solo polimorfismo nucleótido (SNPs), algunos de los cuales eran conocidos con anterioridad y el resto no era conocido con anterioridad, que son expresados en individuos que tienen cáncer. Un aspecto más general de la presente invención se refiere por primera vez a un procedimiento generalizado para definir un grupo de antígenos proteicos funcionalmente heterogéneos relacionados con la inducción de la GVHD y con las respuestas inmunes GVT, que se han englobado hasta ahora como mHAgs. Tales mHAgs pertenecen a un grupo de alo-antígenos que no era accesible hasta el presente a un esquema generalizado de identificación: de conformidad con la presente invención se ha establecido un procedimiento universal que ayuda a desmembrar el grupo de alo-antígenos en aquellos que son responsables de la generación de una GVHD y aquellos que confieren GVT. Así mismo, se ha reivindicado que variantes alélicas simples de aminoácidos con emparejamiento incorrecto, que proceden de la codificación de los SNPs en genes, son presentadas por las células cancerosas y que dichos antígenos son reconocidos por las células T alo-reactivas (donante) en el contexto de las moléculas HLA que conducen a la destrucción de dichas células.

El SNP codificante es un gen que significa un cambio de un solo aminoácido en una proteína y es heredado y único para un individuo dado. Los pacientes transplantados o aquellos que han sido registrados para transplante de médula ósea o para la transferencia de células madre a partir de un donante no singénico por razones terapéuticas, representa un estatus quimérico con respecto a los productos génicos que presentan el cambio de un solo aminoácido codificado por un SNP y las células T alo-reactivas específicas de dicho epitopo de células T. Como consecuencia, los productos génicos son reconocidos por el sistema inmune derivado del donante (del huésped) y, como resultado de una base para el diagnóstico, la monitorización y la terapia.

En breves palabras, la presente invención proporciona un nuevo concepto con respecto a la definición amplia de alo-antígenos que inducen un GVT y/o una GVHD y un objetivo principal de la invención consiste en la obtención de péptidos que correspondan a fragmentos péptidos de proteínas con cambio de un solo aminoácido producidas y presentadas por las células cancerosas que pueden ser usadas para estimular las células T. Debe indicarse que la base molecular de la substitución de un solo aminoácido en esta invención está basada en una diferencia alélica, que comprende una sola substitución conservadora de aminoácido en una proteína normal, y esto constituye parte de la invención para determinar si un individuo que necesita un BMT o que ha sometido ya a un BMT porta dicho cambio de aminoácido en una proteína dada o no.

Constituye otro aspecto de la presente invención la determinación de si dicha proteína está expresada de manera mayoritaria y/o de manera selectiva en células que presentan tejidos cancerosos o tejidos normales.

Otro objeto de la invención consiste en determinar y, cuando sea necesario, en aislar las células T derivadas del donante que reconozcan dichas diferencias de un solo aminoácido, presentadas en las células diana. Pueden encontrarse que dichas células T son específicas de las células cancerosas y pueden ser empleadas terapéuticamente, o puede encontrarse que son específicas de antígenos proteicos omnipresentes y, por lo tanto, pueden ser identificadas como estimulantes de la GVHD.

Se ha encontrado que algunos de los péptidos, obtenidos por los procedimientos de la invención, tienen una amplia distribución tisular y son inductores de la GVHD, por lo que pueden ser empleados para inducir tolerancia inmunológica, mientras que aquellos definidos como expresados de manera exclusiva estimulan la respuesta GVT y pueden ser empleados para la inmunoterapia específica de enfermedades.

Los procedimientos de conformidad con la invención permiten desarrollar una terapia para los cánceres basados en la inmunidad de las células T, que puede ser inducida en pacientes por medio de un alo-MBT y/o por medio de la estimulación de sus propias células T o de las células T del donante bien in vivo o in vitro con los péptidos de conformidad con la invención con el fin de inducir una respuesta citotóxica de las células T y vencer la tolerancia inmunológica.

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Los procedimientos de la invención permiten el desarrollo de vacunas para prevenir el comienzo de o para erradicar cánceres basados únicamente o parcialmente en péptidos que correspondan a los péptidos de la presente invención, lo cual puede realizarse mediante la generación y la activación de la actividad citotóxica de las células T contra las células que albergan los genes alterados en un solo nucleótido y los péptidos substituidos en un solo aminoácido.

Los procedimientos de la invención permiten diseñar un tratamiento o una profilaxis anticáncer adaptados específicamente a un individuo humano que necesite de dicho tratamiento o de dicha profilaxis, que comprende la administración de, al menos, un péptido o varios péptidos de conformidad con la invención.

La expresión tisular normal de las proteínas substituidas en un solo aminoácido se refiere a la prevención y al tratamiento de la GVHD, mientras que la expresión seleccionada, relacionada específicamente con las células orgánicas y/o cancerosas o con la enfermedad, se refiere a una respuesta terapéutica de las células T. De conformidad con este aspecto de la invención, es particularmente conveniente la determinación de las diferencias correspondientes a la proteína substituida en aminoácido en una muestra derivada del donante en comparación con la muestra derivada del receptor. Las diferencias donante-receptor, analizadas de conformidad con esta invención, y relacionadas con la expresión tisular normal proporciona un indicador potente para la GVHD después de un BMT. Por otro lado, las diferencias donante-receptor analizadas de conformidad con esta invención y relacionadas con la expresión correspondiente a la enfermedad en tejidos cancerosos, órganos y células proporciona un fuerte medio de predicción para la reactividad beneficiosa GVT después de un alo-MBT.

El grupo de péptidos que corresponde a los fragmentos de las proteínas substituidas en un solo aminoácido proceden de genes que codifican SNPs en células cancerosas, obtenidos de conformidad con los procedimientos de la invención, no solamente pueden ser usados para la generación de células T aisladas. Por el contrario, dichos péptidos pueden ser empleados para la inducción de reactividad de las células T en células cancerosas letales para el paciente que alojan un gen con un SNP como se ha descrito precedentemente.

Los péptidos con emparejamiento incorrecto de aminoácido, obtenidos por los procedimientos de la invención, tienen una longitud de, como mínimo, 8 aminoácidos y corresponden bien en toda su longitud o tras procesamiento mediante APCs, a los productos génicos relacionados con SNP, o fragmentos de los mismos, producidos por una célula relacionada con la enfermedad en un paciente humano afectado de cáncer. Un péptido de conformidad con esta invención se caracteriza porque a) tiene, al menos, una longitud de 8 aminoácidos y es un fragmento de una proteína substituida en un solo aminoácido que procede de dicho SNP codificante en un gen o célula cancerosa; b) comprende la substitución de un solo aminoácido como parte de la secuencia proteica codificada por dicho gen; y c) induce bien en toda su longitud o tras procesamiento por APCs, respuestas a las células T.

Los péptidos contienen, de manera preferente, entre 8 y 25, entre 9 y 20, entre 9 y 16, entre 8 y 12 o entre 20 y 25 aminoácidos. Éstos pueden contener, por ejemplo, 9, 12, 13, 16 o 21 aminoácidos.

Es más preferente que los péptidos, obtenidos mediante los procedimientos de la invención, tengan una longitud de, al menos, 9 aminoácidos, por ejemplo entre 9 y 18 aminoácidos, pero, debido a la posibilidad de procesamiento intrínseca del APC, así mismo son adecuados péptidos más largos para crear péptidos acomplejados con HLA. De este modo, toda la secuencia de aminoácidos de una proteína que porte una o varias substituciones de un solo aminoácido puede ser empleada como péptido como proteína de conformidad con la presente invención si comprende 8 aminoácidos o un número mayor de los mismos. Es importante mencionar que una molécula de ADN que codifique dicho polipéptido podrá ser usada igualmente para expresar y presentar el péptido de la invención.

Con objeto de determinar si los péptidos obtenidos por los procedimientos de la invención pueden ser aplicados en las composiciones y en los procedimientos de conformidad con la presente invención, deben llevarse a cabo las etapas siguientes:

1)

La identificación de los genes específicos para la célula cancerosa que son expresados de manera selectiva o sobreexpresados en dicha célula. El análisis para determinar si dichos genes son polimórficos con respecto al nucleótido único, específico del alelo, que codifica un cambio de aminoácido en el producto génico.

\quad

La determinación de acuerdo con el perfil de expresión selectivo o amplio de un gen para determinar si los péptidos identificados de este modo son aprovechables en el tratamiento o en la profilaxis de cáncer o para la prevención de la GVHD.

2)

La determinación de si la parte polimorfa del péptido, que representa el aminoácido único con emparejamiento incorrecto encaja bien con toda su longitud o como fragmentos más cortos en la definición de un epitopo de células T de HLA clase I, requerido para estimular a las células T.

\quad

De manera opcional, puede añadirse una etapa adicional de la manera siguiente:

3)

La determinación de los péptidos que contienen epitopos anidados para diferentes moléculas mayores HLA clase I y/o HLA clase II y la utilización de estos péptidos para la estimulación de la inhibición de las células T.

En resumen, constituye un aspecto esencial de la invención la identificación de los péptidos codificados por SNP que sean fragmentos de proteínas y que sean epitopos de las células T, o derivados de los mismos, que tengan propiedades funcionales o inmunológicas intrínsecamente relacionadas con la reactividad alogénica, determinándose la diferencia inmunológica por uno o varios cambios de un solo aminoácido codificados por un SNP con dicho epitopo de las células T. Así mismo constituye un aspecto de la presente invención el que con procedimientos estándar establecidos, conocidos por el técnico en la materia, es posible ahora identificar nuevos alo-antígenos relevantes que son responsables de la inducción de una respuesta alogénica-inmune asociada con los mHAgs, con los antígenos GVHD, con los antígenos GVT y con los antígenos huésped-versus-injerto. En base a los procedimientos y a los péptidos aquí descritos, pueden producirse sondas genéticas o cebadores que pueden ser empleados para el cribado de los alo-antígenos, especialmente los SNPs, en el gen que codifica la versión alélica de un solo aminoácido de la proteína. Por otra parte, la invención proporciona un procedimiento para la determinación de un estado alélico del sujeto con respecto a un gen polimórfico mediante (a) la obtención de una muestra apropiada de ácido nucleico a partir del sujeto y (b) la determinación de si la muestra de ácido nucleico procedente de la etapa (a) es, o se deriva de, un ácido nucleico que codifica un alo-antígeno definido para SNP de tal manera que de este modo se determine si un sujeto porta una o la otra versión alélica del gen alo-antígeno definido por SNP.

De igual modo, esta invención proporciona oligonucleótidos con, al menos, 15 nucleótidos, capaces de hibridizarse específicamente con una secuencia de nucleótidos que está presente dentro de un ácido nucleico que codifica una versión alélica del SNP que conduce al cambio de un solo aminoácido, y oligonucleótidos de, al menos, 15 nucleótidos, capaces de hibridizarse específicamente con una secuencia de nucleótidos, que está presente dentro del ácido nucleico que codifica (la otra versión alélica) el otro cambio de aminoácido sin hibridizarse con un ácido nucleico que codifica el otro alelo.

Por otra parte, la invención proporciona un procedimiento para la determinación de si un sujeto puede beneficiarse de un alo-MBT para la terapia del cáncer, que comprende (a) la obtención de una muestra apropiada de ácido nucleico a partir del sujeto, y (b) la determinación de si la muestra de ácido nucleico procedente de la etapa (a) es, o se deriva de, un ácido nucleico que codifica una y/o otra versión de proteína alélica con el fin de determinarse de este modo si un sujeto tiene una predisposición para una GVHD o para una respuesta GVT.

Un aspecto específico de la invención se refiere a una expresión tisular selectiva y a una distribución de dicha variante proteica alélica codificada por SNP y a si los péptidos, descritos en este caso, pueden ser empleados para producir agentes terapéuticos selectivos como se requiere para combatir enfermedades tales como el cáncer y/o la GVHD. El reforzamiento de la respuesta inmune del paciente, o incluso del donante, con alo-antígeno identificado de conformidad con esta invención puede contribuir significativamente a mejorar las inmunoterapias. Con objeto de proporcionar inmunidad protectora en un paciente, puede ser necesaria la administración de una cantidad efectiva de uno o varios de los polipéptidos, descritos en la invención, junto con un adyuvante. El técnico en la materia elegirá este amplificador de la respuesta inmune de conformidad con la elección del protocolo de inmunización.

Los procedimientos de la invención permiten, así mismo, proporcionar un procedimiento para el tratamiento de un sujeto que tenga una predisposición a la GVHD o a respuestas GVT bien mediante la introducción del ácido nucleico aislado, que codifica una y/o la otra versión proteica alélica o una cantidad efectiva de una y/u otra versión proteica alélica y un excipiente farmacéuticamente aceptable, para llevar a cabo de este modo el tratamiento del sujeto que es susceptible a la GVHD y/o al cáncer.

Los procedimientos, de conformidad con la invención, permiten proporcionar un procedimiento para la determinación de si un sujeto tiene un cáncer residual después de una transferencia previa de células madre alogénicas o de médula ósea, que comprende (a) la obtención de una muestra de ácido nucleico apropiada procedente de los glóbulos sanguíneos del sujeto enfermo, y (b) la determinación de si la muestra de ácido nucleico procedente de la etapa (a) es, o se deriva de, un ácido nucleico que codifica la versión proteica alélica inherente al propio paciente o la variante alélica del donante de manera que de este modo se determina si un sujeto tiene un cáncer residual.

El procedimiento, de conformidad con la invención, permite, así mismo, proporcionar un procedimiento para la identificación de un compuesto químico que es capaz de suprimir las células que no son capaces de regularse por sí mismas en un sujeto que comprende (a) la puesta en contacto de una y/u otra de las variantes alélicas de la versión proteica con el compuesto químico bajo condiciones que permitan el enlace entre una y/u otra de las variantes alélicas de la proteína y el compuesto químico, (b) la detección del enlace específico del compuesto químico con una y/u otra de las variantes alélicas de la proteína, y (c) la determinación de si el compuesto químico inhibe una y/u otra de las variantes alélicas de la proteína de manera que se identifique un compuesto químico que sea capaz de suprimir las células que no son capaces de regularse por sí mismas.

Estos y otros aspectos de la presente invención se pondrán de manifiesto a continuación con referencia a la descripción detallada que sigue y a los dibujos adjuntos. Todas las referencias aquí indicadas se incorporan en este caso como referencia en su conjunto como si cada una de ellas hubiese sido incorporada individualmente.

Descripción detallada de la invención

Esta invención introduce un nuevo concepto para el uso de alo-antígenos en la terapia del cáncer y en el transplante en general. La definición de alo-antígenos y su reconocimiento por las células T está dado mediante los epitopos de las células T derivados de autoproteínas comunes como péptidos que portan un cambio de un solo aminoácido y dicho cambio se define por un SNP codificante, a condición de que la variante alélica específica del epitopo de las células T definido por SNP no sea expresado en el donante pero que sin embargo sea expresada y presentada en el receptor a partir de una molécula HLA clase I en una célula relacionada con la enfermedad.

La inmunidad de las células T frente a los tumores, como se ha indicado precedentemente, se produce de manera natural y no es inusual el haber encontrado que los CTL, asociados con el tumor, reconozcan auto-antígenos en las células cancerosas. Sin embargo mientras que cada vez mayor número de antígenos y de epitopos de células T son declarados como dianas en todas las categorías de tumores, la respuesta terapéutica de las células T se queda corta, usualmente, en la respuesta máxima posible y requerida y esto se debe a que el repertorio de células T funcional que está disponible para responder a la infección, a la inmunización y a los antígenos tumorales está moldeada por mecanismos que establecen y que mantienen tolerancia inmunológica a través de los auto-antígenos y una vía para vencer este estatus consiste en la utilización del repertorio de células T de un individuo con emparejamiento HLA como se ha propuesto en esta solicitud.

Constituye un conocimiento general que la prevención de un ataque autoinmune contra tejidos normales requiere la eliminación de las células T que expresen elevada afinidad con los receptores de la células T para auto-antígenos durante el proceso de selección, dependiente del timo, del repertorio de células T. Además, se han descrito otros mecanismos para establecer la falta de respuesta a los auto-antígenos que se encuentra exclusivamente fuera del timo y se considera que ambos sistemas en conjunto inducen autotolerancia. Numerosos experimentos demuestran que el encuentro de antígenos tumorales por células T maduras puede resultar con frecuencia en la inducción de tolerancia debido bien a la ignorancia inmunológica, a la energía o a la eliminación física (Pardoll, 1998, Nature Med., 4:525-531, (Staveley et al., 1998). Incluso la inducción de tolerancia puede ser responsable de la evasión inmune tumoral y, finalmente, constituye la razón por la cual las metodologías, actualmente empleadas, para la generación de una respuesta in vitro e in vivo terapéutica de las células T específicas del tumor, se presentan no confiables. Por lo tanto no es sorprendente que la mayoría de los más de sesenta antígenos tumorales que corresponden a varios cientos de epitopos de células T, conocidos en el estado de la técnica, no hayan sido adecuados para inducir en los seres humanos una respuesta inmune antitumoral curativa a largo plazo.

Para vencer la limitación general innata a los autoantígenos es necesario alterar el estado de tolerancia de un paciente, lo cual no es posible usualmente debido al insuficiente conocimiento de los mecanismos que inducen la tolerancia.

En la verdadera invención, este punto débil general de las estrategias para la vacunación actual contra el cáncer se vence mediante la utilización de poblaciones citotóxicas de células T que no han sido eliminadas o no se haya vuelto tolerante debido a la exposición previa a los autoantígenos del paciente. Tales células T son disponibles por medio de donantes con emparejamiento HLA y están presentes ya en un receptor que haya experimentado previamente un alo-MBT o un tratamiento similar, basado en sangre del cordón umbilical o en células madre de sangre movilizada.

Mientras que el alo-MBT es un procedimiento establecido que permite vencer la tolerancia inmunológica, constituye otro descubrimiento que el alo-MBT y/o el transplante alogénico de células madre es la base para una inmunoterapia curativa basada en las células T, terapia que ayuda a las mismas a despejar la enfermedad residual. El fundamento molecular de la respuesta alogénica no está cubierta en parte y uno de los descubrimientos importantes consiste en que los pacientes con experiencia de alo-MBT se encuentran en una posición mucho mejor que aquellos que no tienen acceso a esta terapia. Los resultados y las tasas de curación alcanzadas con este procedimiento, que induce a las células T, se encuentran entre los resultados más impresionantes que se han visto en inmunoterapia del cáncer y la aplicación actual está basada en este mecanismo poderoso.

Obsérvese que, bajo ciertas condiciones, relacionadas con el transplante de órganos, el donante presenta los epitopos polimorfos de las células T con emparejamiento incorrecto del aminoácido con respecto a sus propias células inmunes y que esto ocurre sin un cambio previo del sistema de células madre sanguíneas.

Un procedimiento general para la identificación de alo-antígenos como variantes alélicas de péptidos antígenos o de proteínas de una especie de conformidad con esta invención requiere la detección de cambios de un solo aminoácido, y comprende las etapas:

(i)

la definición de una proteína o de un péptido expresado de manera exclusiva o sobreexpresado en un tejido, un órgano o un subgrupo de los mismos que están relacionados con un desorden;

(ii)

el cribado de una base de datos que contengan una o más librerías de ADN de dichas especies para dicho péptido definido o proteína o subgrupo de los mismos, y

(iii)

la identificación y la selección de cambios de aminoácido de variantes de péptido/proteína alélicos, un producto de expresión o un fragmento del mismo que sea codificado por una secuencia de ADN que contenga, al menos, polimorfismo de un solo nucleico en la región codificante,

(iv)

la creación de epitopos de células T epitopos (9mero - 16mero) que comprenden el residuo de aminoácido que contiene dicho polimorfismo, y

(v)

la identificación de dichos epitopos con enlace con el complejo MHC proteína.

Los péptidos polimórficos con emparejamiento incorrecto de aminoácido expresados de manera exclusiva o sobreexpresados en un tejido, en un órgano o en una célula, que representa el tejido enfermo, se caracterizan por la expresión de un aminoácido o de una pluralidad de emparejamientos de aminoácido, que representan las variantes alélicas de proteínas, cada una de las cuales es específica para una proteína diferente, asociada con la enfermedad, y donde dicha pluralidad es al menos de 2, al menos de 3, al menos de 4, al menos de 5, al menos de 6, al menos de 7, o al menos de 8, o al menos de 9 o al menos de 10 de tales agentes.

Los alo-antígenos con emparejamiento incorrecto de aminoácido, de conformidad con esta invención, son específicos para una pluralidad de enfermedades humanas tales como la AML, la ALL, la CML, la enfermedad de Hodgkin, el linfoma, la mielodisplasia, la anemia aplástica, el carcinoma celular renal, la GVHD y la enfermedad huésped contra injerto.

Los emparejamientos incorrectos de un solo aminoácido de las variantes alélicas de las proteínas expresadas en tejidos no relacionados con la enfermedad y acomplejados con la proteína HLA, son consideradas como antígenos inductores de la GVHD.

La introducción de péptidos en los pacientes en forma de una vacuna conduce a un estado en el que la molécula HLA del receptor así como las APCs, derivadas del donante, presentan el antígeno a las células T derivadas del donante (que se originan en un alo-MBT previo).

Las células T del donante estar, así mismo, expandidas y diferenciadas de las células madre de la sangre del donante o pueden ser tomadas directamente del donante y ser transferidas al receptor; un procedimiento que se conoce generalmente como infusión de linfocitos del donante (DLI).

Estas células T están ya activadas en el paciente al encuentro del antígeno presentado en el contexto de HLA. De manera alternativa, la estimulación ex vivo de las células T y la transferencia en el paciente puede ser una vía alternativa diferente de la vía de las células citotóxicas T activadas generadas. Por otra parte, las condiciones patógenas relacionadas por ejemplo con la inducción de tolerancia requieren la activación apropiada de las células T autólogas del paciente.

La invención proporciona la base molecular de protocolos terapéuticos basados en el alo-MBT y define péptidos antígenos y protocolos inmunoterapéuticos que inducirán una respuesta inmune curativa similar o mejor de la que se ha encontrado con los protocolos aplicados usualmente, sin embargo mejorada de una manera más previsible y menos tóxica que en la actualidad. Constituye un elemento esencial de esta invención el que la tolerancia inmunológica queda obviada mediante la explotación del repertorio de células T del donante con emparejamiento HLA. Tal como se ha mostrado ya con el alo-MBT, las respuestas de las células T están dirigidas contra antígenos diferentes del tipo HLA principal con emparejamiento incorrecto con que forman parte de la respuesta GVHD y GVT.

El análisis del cambio conservador de un solo aminoácido, en una proteína relacionada con la enfermedad, está basado en el principio general de los polimorfismos genéticamente heredados que requiere el ensayo del paciente y del donante con respecto al estado de las proteínas polimórficas. La definición de alo-antígeno que codifica SNP, de conformidad con esta invención, implica que cada individuo porta, de acuerdo con las leyes de Mendel, bien una u otra o ambas variantes que codifican SNP de un gen y puede expresar una u otra o ambas variantes proteicas, polimorfas, con emparejamiento incorrecto de aminoácido caracterizadas por uno u otro aminoácido en una posición dada de una proteína.

El diagnóstico de versiones alélicas de alo-antígenos con emparejamiento incorrecto de aminoácido puede hacerse por: análisis de un producto de expresión con un aminoácido alterado, o de un fragmento de un producto de expresión acomplejado con un HLA y llevándose a cabo la substitución de un solo aminoácido, o mediante la puesta en contacto de muestras biológicas aisladas procedentes de un sujeto con un agente que se enlace de manera específica con la porción de ácido nucleico modificada con SNP, siendo expresada la molécula de ácido nucleico que porta el SNP, de manera preferente o únicamente, en células del tejido o del órgano enfermo. Para llevar a cabo el análisis, técnico en la materia prepara de manera específica agentes que están constituidos por una molécula de ácido nucleico, que comprende la molécula que codifica un solo ácido nucleico, un ácido nucleico complementario, o un fragmento del mismo, y lleva a cabo estudios de hibridación con el gen diana. De manera alternativa puede hacerlo también un anticuerpo que se enlace con una variante alélica substituida por un solo aminoácido en el producto de expresión. De igual modo pueden ser empelados agentes anticuerpos que se enlacen con un complejo de una molécula HLA y un fragmento de la variante alélica con emparejamiento incorrecto de aminoácido. De conformidad con el procedimiento elegido es especialmente adecuado llevar a cabo el análisis de la molécula de ácido nucleico modificada con SNP con muestras derivadas de tejidos o de órganos o con células derivados de la enfermedad. De manera preferente se lleva a cabo simultáneamente el diagnóstico y la selección de la terapia apropiada relacionada con emparejamientos incorrectos de un solo aminoácido en las proteínas para un donante y para un receptor y puede combinarse fácilmente con otros diagnósticos moleculares llevados a cabo tales como una tipificación HLA. Una herramienta poderosa para ensayar los emparejamientos incorrectos puede producirse mediante la disposición del ensayo en el formato de una matriz multigénica (ADN array).

Por otra parte, de conformidad con esta invención, las células inmunes específicas derivadas del donante, concretamente los CTLs específicos procedentes de donantes con emparejamiento incorrecto en dicho aminoácido son capaces de reconocer en el receptor la variante de aminoácido en una posición dada del péptido y son capaces de inducir una respuesta citotóxica a través de dicha diana celular que presenta dicho péptido.

De conformidad con la presente invención, se encuentra en investigación y ha sido descrito un número de nuevos antígenos y no solamente pueden ser utilizados para afinar el alo-MBT y el GVT, sino también para el tratamiento de pacientes. Puesto que se ha encontrado que el repertorio de células T propias de los receptores es tolerante o, respectivamente, es eliminado con respecto a la versión alélica expresada por los homólogos, que representa el aminoácido codificado por SNP, el repertorio del donante con emparejamiento HLA usualmente contiene los CTLs que reconocen de manera específica el epitopo de las células T en el contexto de las moléculas HLA clase I y destruyen a las células presentadoras. El denominado CTL alo-restringido destruye selectivamente las células tumorales, que expresan la versión alélica con emparejamiento incorrecto de un péptido definido por un SNP específico. A condición de que el epitopo de las células T, definido por el SNP, represente proteínas con un modelo de expresión específica restringido al tejido, al órgano o al tumor puede considerarse la aplicación de la invención para la terapia y el tratamiento de tumores de otras condiciones en general. Puesto que se han descrito en la literatura numerosos antígenos tumorales, expresados de manera selectiva, es obvio para los técnicos en la materia la aplicación de las enseñanzas dadas en esta invención a cualquier proteína o secuencia de ADN descrita como tumor o tejido u órgano o célula expresados específicamente.

El origen hematopoyético de la leucemia, del linfoma y del mieloma, el origen clonal de las células enfermas y el modelo de expresión restringida de las proteínas dotadas con un cluster diferenciador (CD) son especialmente ventajosos para demostrar el nuevo concepto. Tanto las células de la sangre leucémica así como también las proteínas conocidas como proteínas dotadas con un cluster diferenciador proceden del sistema que forma la sangre, por ejemplo células madre sanguíneas. Esto hace que la leucemia, el linfoma y el mieloma sean enfermedades particularmente adecuadas para ser evaluadas y curadas con ayuda de la presente invención.

Otro aspecto que hace especialmente prometedor el tratamiento de la leucemia, del linfoma y del mieloma está dado por el hecho de que por medio del alo-MBT el sistema hematopoyético completo del paciente transmitido por las células madre de la médula va a ser reemplazado por las células madre o por las células madre de la médula ósea, derivadas de la sangre del donante, que van a constituir todos los glóbulos de la sangre futuros con inclusión de los linfocitos relacionados.

Entre las enfermedades con un origen canceroso, la leucemia es un grupo preferido de enfermedades a ser tratado de conformidad con esta invención, y con este grupo de pacientes con CML se espera tener el máximo beneficio cuando sean tratados mientras que la terapia de la AML y de la ALL constituyen la segunda elección, sin embargo preferida sobre el linfoma. Entre ninguna de las enfermedades hematológicas, el RCC es la diana principal para la terapia y el melanoma es otra enfermedad que debe ser tratada de conformidad con esta invención.

De conformidad con esta invención, empleamos la variabilidad molecular intrínseca, que no ha sido explorada hasta ahora, de antígenos para enseñar un nuevo esquema de caracterización generalizado para los alo-antígenos, definimos nuevos alo-antígenos y subdividimos la respuesta inmune relacionada con los alo-antígenos con relación a evitar la GVHD y, al mismo tiempo, también el refuerzo de la respuesta GVT. Esta invención satisface la necesidad y es un requisito previo para el desarrollo de vacunas anticáncer efectivas y proporciona ventajas relacionadas tales como una supervivencia de injerto a largo plazo de la médula ósea y del transplante de órganos sólidos en receptores y el diagnóstico del cáncer.

Realizaciones específicas de la presente invención se refieren a la identificación de variantes alélicas de genes que codifican el cambio de un solo aminoácido y, de manera más general, alo-antígenos, cuyo procedimiento comprende:

a)

El cribado de genes relevantes y las proteínas correspondientes, que son expresadas de manera selectiva o sobreexpresadas en un tejido dado, en un órgano dado o en un tipo de célula dado, causante de la enfermedad, y de manera típica son expresados en una menor extensión o no son expresados en absoluto en tejidos u órganos normales, no relacionados con la enfermedad.

b)

Los genes previamente seleccionados, de conformidad con a) son cribados para los SNPs conocidos con anterioridad, pudiendo ser obtenidos los cambios de un solo nucleótido codificante de los genes individuales directamente a través de una o de varias bases de datos SNP que son accesibles actualmente al público o que están disponibles en el comercio.

c)

Se criban los genes previamente seleccionados de acuerdo con a) con una relación no conocida de antemano con los SNPs en las bases de datos de ADN mediante comparación de secuencias de ADN homólogas y la detección de las posiciones variables representativas de polimorfismo génico y proteico con un programa de alineación tal como el BLAST.

d)

La identificación de los genes polimórficos que portan SNPs desconocidos mediante la realización de procedimientos indirectos tal como la alineación de secuencias EST/secuencias proteicas que cubren a los genes deseados, proporcionando diversas bases de datos de EST redundancia de la información secuencial con respecto a una extensión secuencial idéntica, a un solapamiento o a una extensión idéntica parcial de secuencias de ADN que permiten la identificación de los SNPs a través de técnicas de alineación de las secuencias y anotación del gen correspondiente.

e)

La validación de los SNPs relevantes para la enfermedad que portan genes y/o proteínas previamente cribados de conformidad con los procedimientos a) - d) con ayuda de la medida de su distribución en los órganos o en los tejidos.

f)

La determinación de si los péptidos identificados, son capaces, en toda su longitud o como fragmentos más cortos de los péptidos, de estimular a las células T, a los péptidos localizados, que contienen epitopos de células T o a los epitopos anidados para diferentes moléculas principales HLA clase I y/o HLA clase II y la utilización de los péptidos correspondientes para la estimulación o la inhibición de las células T.

Las aplicaciones para diagnóstico que son consideradas en esta invención incluyen, pero sin carácter limitativo, el cáncer y/o el BMT, el transplante de células madre y de órganos.

Pueden ser utilizadas diversas técnicas que permitan la detección de donantes o de receptores adecuados, basadas en la amplificación de las secuencias específicas de ácido nucleico o basadas en la proteína o en los péptidos como se indica más adelante.

De conformidad con una realización, la presente invención se refiere a un procedimiento para la tipificación de alelos de antígenos CD-cluster en una muestra que comprende la detección de los nucleótidos polimórficos en el ADNc o en los ácidos nucleicos genómicos de dichos alelos, de una manera más particular los alelos del gen individual.

En una realización preferente, dicho procedimiento de tipificación será un procedimiento de tipificación de ADN genómico. De manera alternativa, dicho procedimiento puede ser así mismo un procedimiento de tipificación de ADNc.

a)

La puesta en contacto de los ácidos polinucleicos genómicos en la muestra con, al menos, un par de cebadores, hibridizando dicho par de cebadores específicamente las regiones laterales que comprenden el nucleótido polimórfico en dichos alelos, y la realización de una reacción de amplificación;

b)

La detección para cada uno de dichos pares de cebadores, al menos único, si se ha formado en la etapa a) un producto de amplificación o no;

c)

La deducción, a partir del resultado de la etapa b), qué alelo del SNP está presente en dicha muestra.

De conformidad con una realización preferente, la presente invención se refiere a un procedimiento, tal como se ha descrito precedentemente, caracterizado además porque dichos alelos de los alo-antígenos definidos del SNP son diferentes en el alelo del donante y en el alelo del receptor.

De conformidad con la variabilidad del SNP del genoma humano, un individuo determinado porta dos copias de un gen determinado heredado de sus progenitores. Las copias pueden representar un par de alelos diferente o un par de alelos similar al heredado, sin embargo el técnico en la materia entiende que puede ser empleada una RT-RCP mediante el empleo de ARNm como matriz o RCP estándar empleándose ADN genómico como matriz, de manera rutinaria para el diagnóstico de las variantes de aminoácido alélico codificado por SNP de la presente invención.

Los glóbulos de la sangre con un programa genético normal o con un modelo de expresión aberrante, tal como se presenta en células cancerosas de la sangre, portan en su totalidad las colecciones típicas expresadas en leucocitos normales de moléculas en la superficie de sus células. Los marcadores de linaje y el marcador adicional de diferenciación sobre la superficie celular de los leucocitos son detectados de manera rutinaria con anticuerpos monoclonales anti-leucocitos y los antígenos son denominados sistemáticamente asignándoles un antígeno con cluster de diferenciación (CD). Están disponibles diversas fuentes de información, relativas a este sistema, en internet y en un sitio web preferido para los interesados podría ser: http://www.vetmed.wsu.edu/tkp/Search.asp

La norma ampliamente aceptada para la designación formal de las moléculas superficiales de los leucocitos y el hecho de que las células madre de la sangre forman un origen común para todos los glóbulos de la sangre con inclusión de las células del cáncer de la sangre hace que los antígenos CD sean antígenos candidatos ideales de conformidad con la presente invención. Por otra parte, en pacientes que necesiten un transplante de células madre alogénicas, todas las células que representan el sistema de los glóbulos sanguíneos patológico serán finalmente reemplazadas por un sistema de células madre derivadas de un donante a través del curso del restablecimiento de un nuevo sistema hematopoyético, lo cual tiene como consecuencia que debe ser eliminado todo el sistema inmune original y todo el sistema de los glóbulos sanguíneos del receptor. A este respecto, los antígenos CD representan un "órgano" único y son extremadamente valiosos para reducir en la práctica el concepto inventivo en esta invención.

La presente invención enseña como llevar a cabo la selección entre varios cientos de proteínas de leucocitos conocidos disponibles en el sistema CD actual, aquellas que sean más representativas para ciertos tipos de cáncer por transmisión sanguínea. En los ejemplos se han indicado antígenos CD específicos y su relación con la enfermedad y son reconocidos y utilizados por el técnico en la materia en este campo. El análisis de las proteínas CD definidas previamente procedentes de las bases actuales para el diagnóstico y el establecimiento de leucemia y de linfomas. Sin embargo es importante entender que, principalmente, la invención no está limitada a la selección previa de antígenos leucocitarios dada en esta solicitud, por el contrario, de igual modo puede ser considerado cualquier tejido o cualquier proteína o grupos de proteínas, expresadas selectivamente de otra manera.

A este respecto la invención proporciona proteínas CD que comprende un cambio de aminoácido inmunógeno que caracteriza la porción polimórfica de un alo-antígeno soluble y que está definido a un nivel molecular por un SNP codificante. Dichas proteínas CD representativas de la enfermedad y cualificadas como alo-antígenos que portan un cambio de aminoácido se han reunido en la tabla 2. La enseñanza general dada por esta solicitud permite a los técnicos en la materia definir alo-antígenos ya conocidos en el estado de la técnica o adicionalmente nuevos alo-antígenos que no hayan sido debatidos hasta ahora en el estado de la técnica o no hayan sido mencionados el mismo, por lo tanto, la invención no está limitada a la selección de alo-antígenos y de epitopos de células T dados en las tablas 2-5.

En una realización, el alo-antígeno soluble definido por la invención induce una respuesta inmune en pacientes que han sido transplantados alogénicamente como paso previo. En una segunda realización, los antígenos inducen actividad citolítica a su presentación en el contexto de la molécula HLA. Las secuencias de aminoácidos especialmente adecuadas para la inmunización y para la inducción de citolisis pueden ser seleccionadas entre un grupo que está constituido por secuencias enumeradas en las tablas 3-5, y variantes de las mismas. Sin embargo, como se ha indicado precedentemente, el procesamiento de los alo-antígenos puede ser ampliamente variable in vivo y la extensión N-terminal o la extensión C-terminal del aminoácido que representa el cambio pueden variar considerablemente entre las secuencias enumeradas. El técnico en la materia sabe como analizar la variabilidad HLA y cómo relacionar la variabilidad en un nivel péptido enlazante de HLA así como en un nivel de predicción de péptido enlazante de HLA.

En otra realización, el alo-antígeno soluble definido por la invención induce una respuesta inmune en pacientes esencial para la inducción de la tolerancia inmunológica. La inducción de la tolerancia inmunológica es particularmente útil para el antígeno relacionado con la GVHD, que se ha definido como polimórfico y expresado ampliamente en varios tejidos y órganos tales como el pulmón, el hígado, el intestino, las articulaciones, etc. Las secuencias de aminoácidos especialmente adecuadas para la inmunización y para la inducción de tolerancia pueden ser seleccionadas entre el grupo constituido por las secuencias de mHAg que han sido citadas en la tabla 1 A, B y las secuencias HLA enumeradas en la tabla 6, y variantes de las mismas. Los antígenos HLA son conocidos en el estado de la técnica y están definidos como el antígeno principal que induce la reacción inmune alogénica. Por otra parte, las extensiones antígenas dentro de las moléculas están perfectamente documentadas y se encuentran a disposición varios tipos de agentes de detección. Sin embargo, las moléculas HLA han sido incluidas en esta invención debido a que los epitopos, que están enumerados en la tabla 6, han sido elegidos a partir de regiones proteicas situadas fuera de las regiones antígenas hipervariables, que son utilizadas de manera típica para el emparejamiento de la molécula de HLA. De este modo estos antígenos han sido considerados como cambios de aminoácido codificados por SNP como se ha definido en esta invención. Los epitopos de las células T serán usados de manera típica para prevenir la GVHD relacionada con el transplante de células madre y de órganos.

En otra realización, el alo-antígeno, que comprende un cambio de aminoácido inmunógeno, se caracteriza por las secuencias de ADN que codifican los polipéptidos de conformidad con la invención, entre otros, las moléculas de ácido nucleico aisladas, la expresión de vectores que contienen aquellas moléculas y las células huésped transformadas o transfectadas con estas moléculas.

La invención proporciona, así mismo, proteínas aisladas, péptidos y anticuerpos de dichas proteínas y péptidos y CTLs, que reconocen las proteínas y los péptidos. Así mismo se proporcionan fragmentos que incluyen fragmentos funcionales y variantes de los anteriores. De manera adicional se proporcionan estuches (kits) que contienen las moléculas precedentemente indicadas. Lo que antecede puede ser empleado para la diagnosis, la monitorización, la investigación o para el tratamiento de condiciones caracterizadas por la expresión de uno o más alo-antígenos asociados con el cáncer. Con anterioridad a la presente invención, únicamente había sido identificado hasta entonces un puñado de genes alo-antígenos tales como los genes asociados con los mHAgs.

En otro aspecto, la presente invención proporciona proteínas de fusión que comprenden un primer epitopo y/o un segundo epitopo de las células T de conformidad con la invención o, de manera alternativa, un polipéptido de conformidad con la invención y un antígeno tumoral conocido, o un epitopo foráneo que vuelve inmunógeno al epitopo de conformidad con la invención.

La invención comprende la utilización de un material simple, de una pluralidad de materiales diferentes e incluso amplios paneles y combinaciones de materiales. Por ejemplo, un gen individual que porta el SNP, una proteína individual que codifica dicho gen, un fragmento funcional individual del mismo, un anticuerpo individual del mismo, etc. puede ser utilizado en los procedimientos y en los productos de la invención. De igual manera, pueden ser utilizados pares, grupos e incluso paneles de estos materiales y, de manera opcional, otros genes alo-antígenos asociados con el cáncer y/o productos génicos o antígenos tumorales convencionales, para el diagnóstico, la monitorización y la terapia. Los pares, los grupos o los paneles pueden comprende 2, 3, 4, 5 o un número mayor de genes, de productos génicos, de fragmentos de los mismos o de agentes que reconozcan a tales materiales. Una pluralidad de tales materiales no solamente es adecuada para la monitorización, la tipificación, la caracterización y el diagnóstico de células que expresan productos génicos modificados codificados por SNP, sino que una pluralidad de tales materiales puede ser empleada en terapéutica.

Un ejemplo de lo que antecede consiste en el empleo de una pluralidad de tales materiales de manera profiláctica o aguda para la prevención, para retrasar la aparición, para la mejora, etc. de cáncer en células, que expresan o que expresarán dichos genes. Cualquier combinación y todas las combinaciones de los genes, de los productos génicos, y de los materiales, que reconocen a los genes o a los productos génicos, pueden ser ensayadas e identificadas para su utilización de conformidad con la invención. Sería muy largo describir todas estas combinaciones; los técnicos en la materia, particularmente a la vista de las enseñanzas contenidas aquí, serán capaces de determinar que combinaciones son más apropiadas para las circunstancias del caso.

Como será evidente por el debate que sigue, la invención tiene utilizaciones in vivo e in vitro, con inclusión de los fines terapéuticos, de diagnóstico, de monitorización y de investigación. Un aspecto de la invención consiste en la adecuación para tomar la huella genética de una célula que expresa un número de genes identificados de conformidad con la invención por ejemplo, mediante cuantificación de la expresión de tales productos génicos. Tales huellas genéticas serán características, por ejemplo, para predecir el efecto GVT y GVHD en modelos animales para una terapia de un cáncer. De igual modo las células pueden ser cribadas para determinar si dichas células expresan los genes modificados por SNP, identificados de conformidad con la invención.

La invención, en un aspecto, está constituida por un procedimiento para el diagnóstico de un alo-antígeno y asociado al cáncer, relevante desde el punto de vista terapéutico, codificado por una molécula de ácido nucleico, que porta un SNP codificante. El procedimiento comprende las etapas de poner en contacto una muestra biológica aislada procedente de un sujeto enfermo con un agente que se enlace específicamente con la molécula de ácido nucleico que porta un SNP codificante, un producto de expresión del mismo, o un fragmento de un producto de expresión del mismo acomplejado con una molécula de MHC, preferentemente con una molécula de HLA, en el que la molécula definida por un SNP codificante puede ser elegida entre una lista de alo-antígenos de conformidad con la tabla 1-6 en forma de la molécula de ácido nucleico, y empleada para la determinación de la interacción entre el agente y la molécula de ácido nucleico que porta un SNP codificante, el producto de expresión o fragmento del producto de expresión del mismo.

Otro aspecto se refiere a un procedimiento de diagnóstico de un alo-antígeno terapéuticamente relevante y asociado con el cáncer, codificado por una molécula de ácido nucleico que porta un SNP codificante. El procedimiento comprende las etapas de poner en contacto una muestra biológica, aislada de un sujeto considerado como donante adecuado para BMT con un agente que se enlace específicamente con la molécula de ácido nucleico que porta un SNP codificante, un producto de expresión del mismo, o un fragmento de un producto de expresión del mismo acomplejado con una molécula de MHC, de manera preferente con una molécula de HLA, en el que la molécula de ácido nucleico, que porta un SNP codificante se elige entre una lista de alo-antígenos de conformidad con la tabla 1-6 en forma de la molécula de ácido nucleico, y la determinación de la interacción entre el agente y la molécula de ácido nucleico, que porta un SNP codificante, el producto de expresión o fragmento del producto de expresión. En otra realización, la molécula de ácido nucleico, que porta un SNP codificante, o un fragmento péptido del mismo puede ser detectada con un anticuerpo. Un fragmento del producto de expresión, modificado en un solo aminoácido, acomplejado con una molécula de MHC, preferentemente con una molécula de HLA que puede ser detectado con un anticuerpo o, de manera alternativa, el péptido acomplejado con HLA puede ser usado directamente para el diagnóstico y la activación o la inhibición de las células. Los desórdenes pueden ser caracterizados mediante la expresión de una pluralidad de precursores antígenos asociados con el cáncer, que portan genes modificados con SNP codificante. De este modo, los procedimientos de diagnosis pueden incluir la utilización de una pluralidad de agentes, cada uno de los cuales sea específico para un precursor antígeno que porta SNP asociado con el cáncer humano (con inclusión, al menos, de uno de los precursores de los antígenos asociados con el cáncer que han sido aquí debatidos), y siendo dicha pluralidad de agentes como mínimo de 2, como mínimo de 3, como mínimo de 4, como mínimo de 5, como mínimo de 6, como mínimo 7, como mínimo de 8, como mínimo de 9 o como mínimo de 10 de tales agentes. En cada una de las realizaciones precedentemente indicadas el agente puede ser específico para una enfermedad humana, de manera preferente un precursor de antígeno asociado con el cáncer, con inclusión de los precursores antígenos asociados con el cáncer renal y con el cáncer por transmisión sanguínea aquí debatidos.

El fragmento, seleccionado a partir de las tablas 2 a 6, ha sido medido con al menos: 8 nucleótidos, 10 nucleótidos, 12 nucleótidos, 14 nucleótidos, 16 nucleótidos, 18 nucleótidos, 20, nucleótidos, 22 nucleótidos, 24 nucleótidos, 26 nucleótidos, 28 nucleótidos, nucleótidos, 50 nucleótidos, 75 nucleótidos, 100 nucleótidos, 200 nucleótidos, 1.000 nucleótidos y cualquier longitud entera comprendida entre las mismas. La molécula codifica un polipéptido o un fragmento del mismo, se enlace con un receptor de HLA humano o con un anticuerpo humano. Un vector de expresión, que comprende una molécula de ácido nucleico aislada como se ha descrito precedentemente, se enlaza de una manera operativa con un promotor. De conformidad con la invención un vector de expresión comprende un ácido nucleico, enlazado de manera operativa con un promotor, en el que el ácido nucleico es una molécula modificada con SNP. En otro aspecto, un vector de expresión comprende una molécula modificada con SNP y un ácido nucleico, que codifica una molécula de MHC, preferentemente una molécula de HLA.

De igual modo la invención incluye un fragmento de los polipéptidos elegidos entre las moléculas enumeradas en las tablas 1-6, que es inmunógeno. En una realización, el fragmento, o una porción del fragmento, se enlaza con el HLA o con un anticuerpo humano. La invención incluye, en otro aspecto, un fragmento aislado de un precursor antígeno asociado con un cáncer humano que, o una porción del cual, se enlaza con el HLA o con un anticuerpo humano, en el que el precursor es codificado por una molécula de ácido nucleico que porta un SNP codificante que se elige entre una molécula enumerada de manera compendiada en las tablas 1-6. En una realización, el fragmento constituye parte de un complejo con HLA. En otra realización, el fragmento tiene una longitud comprendida entre 8 y 12 aminoácidos.

En otro enfoque, las células inmunes, consideradas en la invención, pueden ser generadas en vitro mediante cultivo de linfocitos con péptidos seleccionados de las moléculas enumeradas, elegidas entre las tablas 2 a 5, que representan el cambio de aminoácido inmunógeno del alo-antígeno y en las que la versión alélica corresponde a la versión expresada por las células tumorales del paciente. Cuando se utilizan los alo-antígenos de conformidad con dicho procedimiento, las células T citotóxicas del donante y auxiliares, que reconocen antígenos individuales con cambios de un solo aminoácido, pueden ser generadas en vitro de conformidad con un procedimiento que prevenga la reactividad de las células T de los futuros antígenos de histocompatibilidad del huésped, dejando una población de células T específicas del tumor alo-reactivas. Otro enfoque, que puede ser empleado en pacientes con o sin pariente fraternal histocompatible, comprende regímenes de acondicionamiento perfectamente tolerados que provocan inmunosupresión con respecto a los alo-antígenos que inducen la GVHD definidos de conformidad con esta invención sin producir la ablación de la médula ósea.

Estos procedimientos podrían mejorar de manera significativa los estudios clínicos que han sido publicados recientemente, que han utilizado el transplante de células madre no mieloablativo para otras indicaciones, con inclusión de los tumores sólidos y del transplante de órganos sólidos. Cuando el enfoque es utilizado, por ejemplo, para el tratamiento del cáncer, el receptor recibe células madre hematopoyéticas empobrecidas en células T, que no serán rechazadas por el receptor, después de la administración de un número progresivamente amplio de células T del donante (o células T específicas del tumor), que han sido estimuladas cuidadosamente con respecto al reconocimiento del alo-antígeno. De conformidad con este enfoque, es especialmente adecuado expandir las células T del donante con la ayuda de péptidos que se enlazan con el HLA, que representan el cambio de aminoácido inmunógeno del alo-antígeno con péptidos tomados de las tablas 2 a 5 bien ex vivo o bien in situ con objeto de promover reactividad antitumoral de las células T. Puede obtenerse un número suficiente de CTLs para fines de inmunoterapia adoptiva y, en conclusión, esto permite una nueva terapia para el tratamiento de la leucemia recurrente tras un BMT con un mínimo de riesgo de inducción de una GVHD.

Por lo tanto, es posible manipular los linfocitos del donante específicos del alo-antígeno (que reconoce una modificación de un solo aminoácido) in vitro mediante la inserción de un gen suicida conocido en el estado de la técnica, tal como el gen de timidina cinasa del virus del herpes simplex. Esto proporciona al médico la posibilidad de destruir los linfocitos infundidos en pacientes con enfermedad injerto-versus-huésped no controlada.

Otro enfoque que es posible con ayuda de los procedimientos de la invención, comprende la inmunización previa al transplante de donantes de alo-MBT con una vacuna antigen alogénica contra el cáncer modificada en un solo aminoácido definida para el receptor, que incrementa la actividad GVT sin exacerbar la GVHD debido a la estimulación previa de las células T del donante contra los antígenos supuestamente modificados en un solo aminoácido únicamente en las células tumorales. En resumen, la invención ayuda a evitar la toxicidad y la mortalidad relacionada con el BMT y con otros procedimientos relacionados con el transplante.

Las situaciones que requieren la vacunación con alo-antígenos se caracterizan de manera preferente por una baja carga tumoral y por la transferencia adoptiva con células T específicas del tumor en casos de elevada carga tumoral. Sin embargo, el resultado de la inmunización con vacunas que contienen epitopos CTL tumorales depende en gran medida del modo en que se suministran los epitopos. De manera sorprendente, la vacunación con péptidos que enlazan al MHC clase I pueden provocar tolerancia CTL asociada con el refuerzo del crecimiento tumoral más que la inmunidad. Estos resultados indican la posibilidad de utilizar la vacuna para inducir tolerancia con respecto a los alo-antígenos que inducen una GVHD. Por otra parte, para prevenir la inducción de la tolerancia, la modulación de los APCs es una estrategia prometedora para reforzar las respuestas a la inmunización (Sotomayor, 1999). Se ha descrito una descripción detallada de los protocolos de inmunización adecuados con alo-antígenos en la parte experimental de esta invención.

Con respecto a los receptores de transplantes con HLA idéntico al genotipo, las disparidades en alo-antígenos son definidas, de conformidad con esta invención, mediante la realización de un cambio de aminoácido codificado por SNP. La identificación genómica del locus del alo-antígeno definido por SNP puede llevarse a cabo mediante procedimientos de RCP específicos del alelo. Las diferencias entre el donante y el receptor son generalmente analizadas por dos juegos de cebadores diferentes. Cada juego cebador está constituido por cebadores específicos del alelo y por cebadores comunes, y ambos juegos de cebadores pueden contener secuencias intrónicas.

Los productos específicos del alelo, que han sido pronosticados, pueden estar relación en todos los casos con el cambio de aminoácido codificado por SNP detectado por procedimientos bioquímicos, por anticuerpos, por CTLs o por RT-RCP. Como se ha demostrado por medio de esta invención, la identificación de nuevos alo-antígenos adicionales codificados por SNP puede ser empleada para la tipificación genómica prospectiva para los alelos de alo-antígenos codificados por SNP y mejorará la selección del donante e identificará receptores de BMT con respecto a un bajo riesgo o a un elevado riesgo de una GVHD y con GVT mejorado. Los SNPs, de conformidad con este objetivo, pueden ser detectados en una vía específica de la secuencia, mediante la utilización de un enfoque de hibridación, de extensión del cebador o de enlace del ADN. Los técnicos en la materia elegirán un enfoque adecuado tal como se enumera a continuación y llevarán a cabo el análisis antígeno de conformidad con los procedimientos de operación estándar específicos para el enfoque individual.

1.

El enfoque de hibridación está basado en dos sondas específicas del alelo que se hibridizan con la secuencia diana únicamente cuando éstas estén perfectamente emparejadas. Bajo condiciones de ensayo optimizado, el emparejamiento incorrecto de una base desestabiliza suficientemente la hibridación de modo que se evita que la muestra alélica se hibridice con la secuencia diana. Cuando las muestras específicas del alelo están inmovilizadas en un soporte sólido, se capturan muestras de ADN diana marcadas y el episodio de hibridación es visualizado mediante la detección de la marca una vez que las dianas no enlazadas han sido eliminadas por lavado.

2.

La extensión del cebador es otro mecanismo de discriminación alélico muy robusto. Es altamente flexible y requiere el menor número posible de cebadores/sondas. El diseño de la sonda y la optimización del ensayo son fácilmente realizables de manera usual. Existen numerosas variaciones en el enfoque de la extensión del cebador que están basadas en la capacidad que tiene la ADN polimerasa para incorporar específicamente desoxirribonucleósidos complementarios de la secuencia del ADN matriz, sin embargo éstas pueden ser agrupadas en dos categorías.

De una manera más detallada, la identidad de la base polimórfica en el ADN diana es determinada mediante la incorporación de nucleótidos específicos del alelo seguido por una secuenciación. Cuando se utiliza un enfoque de RCP específica del alelo, la ADN polimerasa es utilizada para amplificar el ADN diana únicamente si los cebadores de la RCP son perfectamente complementarios con la secuencia de ADN diana. Se ha ideado un número de vías ingeniosas para el análisis del producto de la extensión del cebador en ensayos homogéneos. La mayoría de estos enfoques combinan nuevos análogos de ácido nucleico y la monitorización de diferencias interesantes en las propiedades físicas entre los reactivos de partida y los productos de la extensión del cebador. En el caso del enfoque de la RCP específica del alelo, únicamente se intenta extender un cebador sobre la ADN polimerasa cuando su extremo 3' sea perfectamente complementario con la matriz. Cuando se cumpla esta condición, es producido un producto de la RCP. Mediante la determinación de si un producto de la RCP es producido o no, puede deducirse el alelo encontrado sobre el ADN diana. Se han utilizado diversos enfoques innovadores para detectar la formación de productos de la RCP específicos en ensayos homogéneos. Algunos de ellos están basados en el análisis de la curva de fusión, y algunos están basados en la hibridación de sondas específicas de la diana. Una variante de este enfoque consiste en la extensión del cebador específico del alelo. En este caso, el producto de la RCP que contiene el locus polimórfico sirve como matriz, y el extremo 3' de la sonda de extensión del cebador está constituida por la base alélica. El cebador es extendido únicamente si la base 3' complementa al alelo presente en el ADN diana. Por lo tanto, la monitorización del acontecimiento de la extensión del cebador permite deducir el o los alelos encontrados en la muestra de ADN.

La ADN ligasa es altamente específica para la reparación de roturas en la molécula de ADN. Cuando dos oligonucleótidos adyacentes están hibridizados con una matriz de ADN, éstos están enlazados conjuntamente únicamente si los oligonucleótidos están perfectamente emparejados con la matriz en el punto de unión. Por lo tanto, los oligonucleótidos específicos de los alelos pueden interrogar la naturaleza de la base en el locus polimórfico. El o los alelos presentes en el ADN diana pueden ser deducidos mediante la determinación de si ha ocurrido el enlace. Aun cuando el enlace es el nivel más alto de especificidad y es el más fácil optimizable entre todos los mecanismos de discriminación alélica, éste es la reacción más lenta y requiere el mayor número de sondas modificadas. Sin embargo, el enlace, como mecanismo, tiene el potencial del genotipo sin amplificación previa de la diana mediante una RCP.

Se lleva a cabo la detección de un producto de reacción alélica positiva mediante la monitorización de la luz emitida, o mediante la medición de la masa de los productos o mediante la detección de un cambio en la propiedad eléctrica cuando se hayan formado los productos.

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Glosario

Las definiciones siguientes están dadas para facilitar la comprensión de ciertos términos empleados frecuentemente en lo que precede.

Reactivo alogénico es el término utilizado para describir epitopos de células T polimorfos diferentes entre individuos que son reconocidos específicamente por las células T.

"Anticuerpos" tal como se usa en este caso, incluye los anticuerpos policlonales y los anticuerpos monoclonales, los anticuerpos quiméricos, de cadena simple y los anticuerpos humanizados, así como los fragmentos Fab, con inclusión de los productos de un Fab o de otra librería de expresión de inmunoglobulina.

"Proteínas CD" son marcadores de la superficie celular específicos del linaje, que son producidos por el programa genético normal de las células o mediante modelos de expresión aberrante, que son patológicos. Las proteínas CD están asignadas típicamente a las células derivadas de origen hematopoyético. Los marcadores celulares se distinguen de conformidad con una nomenclatura estándar que define clusters de diferenciación (CD) por consenso científico. Las proteínas CD son detectadas mediante un proceso que combina el marcaje fluorescente, los reactivos inmunológicos monoespecíficos y un citómetro de flujo para contar y analizar las poblaciones celulares. A continuación las células son clasificadas por tamaño, reactividad con el marcador, aptitud a la clonación y proporción. El procedimiento es ampliamente usado clínicamente para el diagnóstico, el pronóstico, la evaluación de la enfermedad residual, la monitorización terapéutica y en el caso de la gestión de la leucemia, linfomas y condiciones relacionadas y es perfectamente conocido por los técnicos en la materia. Puede analizarse una variedad de tejidos y de fluidos corporales. Para asegurar la calidad y la utilidad clínica de las interpretaciones, todos los datos citométricos son interpretados en el contexto de una revisión microscópica de la muestra.

"Inmunofenotipificación" de marcadores de cáncer normalmente incluye un procedimiento de tinción de dos etapas. En la primera etapa se añaden a las células mAbs murinos específicos del antígeno, como se han enumerado precedentemente. Se evalúa el enlace de los mAbs mediante técnica de inmunofluorescencia empleándose antisueros Ig anti-ratón conjugados con FITC. La distribución de los antígenos es analizada mediante citometría de flujo y/o microscopía óptica. Los resultados de la inmunotipificación están disponibles, de manera típica, en el transcurso de 24 horas desde la recepción de la muestra; y proporciona porcentajes de marcador citométrico. Así pues pueden ser evaluados y descritos, cuando sean relevantes, los niveles (la intensidad) de expresión morfológica y de marcaje. La intensidad de la expresión antígena puede variar entre pasajes y puede quedar influenciada por las condiciones del cultivo celular.

"Aislado" significa alterado "por la mano del hombre" a partir de su estado natural, por ejemplo si esto ocurre en la naturaleza, ha sido cambiado o removido desde su medio ambiente original, o las dos cosas. Por ejemplo, un polinucleótido o un polipéptido presente en la naturaleza en un organismo vivo no está "aislado", pero el mismo polinucleótido o el mismo polipéptido separado de los materiales coexistentes de su estado natural, está "aislado", tal como el término es aquí empleado. Por otra parte un polinucleótido o un polipéptido que es introducido en un organismo mediante transformación, manipulación genética o mediante cualquier otro procedimiento recombinante está "aislado" aun cuando esté aún presente en dicho organismo, cuyo organismo puede estar vivo o puede no estar vivo.

"Polinucleótido" se refiere en general a cualquier polirribonucleótido (ARN) o polideoxirribonucleótido (ADN), que puede ser ARN o ADN no modificado o modificado. "Polinucleótidos" incluye, sin limitación, ADN de una sola hebra y de doble hebra, ADN que es una mezcla de regiones con una sola hebra y con doble hebra, ARN de una sola hebra y de doble hebra, y ARN que es una mezcla de regiones de una sola hebra y de doble hebra, moléculas híbridas que comprenden ADN y ARN que pueden ser de una sola hebra o, lo que es más típico, de doble hebra o una mezcla de regiones con una sola hebra o de doble hebra. Además, "polinucleótido" se refiere a regiones de triple hebra que comprenden ARN o ADN o tanto ARN como ADN. El término "polinucleótido" incluye, así mismo, los ADN o los ARN que contienen una o varias bases modificadas y a los AND o a los ARN con cadenas principales modificadas para la estabilidad o por otras razones. Las bases "modificadas" incluyen, por ejemplo, las bases tritiladas y las bases no usuales tal como la inosina. En el ADN y en el ARN puede llevarse a cabo una variedad de modificaciones; de este modo, "polinucleótido" abarca formas modificadas desde el punto de vista químico, enzimático o metabólico de polinucleótidos como las que se encuentran, de manera típica, en la naturaleza, así como las formas químicas de ADN y de ARN características de los virus y de las células. "Polinucleótido" abarca así mismo polinucleótidos relativamente cortos, frecuentemente denominados oligonucleótidos.

"Polipéptido" se refiere a cualquier polipéptido que comprenda dos o más aminoácidos unidos entre sí por enlaces péptidos o por enlaces péptidos modificados, por ejemplo isoésteres péptidos. "Polipéptido" se refiere tanto a las cadenas cortas, que comúnmente se denominan péptidos, oligopéptidos u oligómeros, y también a las cadenas largas, denominadas frecuentemente proteínas. Los polipéptidos pueden contener aminoácidos diferentes de los 20 aminoácidos codificados génicamente. "Polipéptidos" incluye secuencias de aminoácidos modificadas bien por procesos naturales, tales como un proceso de post-traducción, o bien mediante técnicas de modificación química que son perfectamente conocidas en el estado de la técnica. Tales modificaciones están perfectamente descritas en los textos básicos y en monografías más detalladas, así como en una voluminosa literatura de investigación. Las modificaciones pueden producirse en cualquier punto en un polipéptido, con inclusión de la cadena principal péptida, en el aminoácido de las cadenas laterales y en los extremos amino o carboxilo. Se observará que el mismo tipo de modificación puede estar presente en el mismo grado o en grados diferentes en diversos locus en un polipéptido dado. Así mismo, un polipéptido dado puede contener diversos tipos de modificaciones. Los polipéptidos pueden estar ramificados como resultado de la ubiquitinación, y pueden ser cíclicos, con o sin ramificación. Los polipéptidos cíclicos, ramificados y cíclicos ramificados pueden ser el resultado de procesos naturales de post-traducción o pueden obtenerse por procedimientos sintéticos. Las modificaciones incluyen la acetilación, la acilación, la ADP-ribosilación, la amidación, la biotinilación, el enlace covalente de flavina, el enlace covalente de una mitad heme, el enlace covalente de un nucleótido o de un derivado de nucleótido, el enlace covalente de un lípido o de un derivado lípido, el enlace covalente de fosfotidilinositol, la reticulación, la ciclación, la formación de enlace de disulfuro, la desmetilación, la formación de reticulaciones covalentes, la formación de cistina, la formación de piroglutamato, la formilación, la gama-carboxilación, la glicosilación, la formación de un anclaje GPI, la hidroxilación, la yodación, la metilación, la miristoilación, la oxidación, el proceso proteolítico, la fosforilación, la prenilación, la racemización, la selenoilación, la sulfatación, la adición, favorecida por el ARN de transferencia, de aminoácidos a proteínas tal como la arginilación, y la ubiquitinación (véanse, por ejemplo, las publicaciones Proteins - Structure and Molecular Properties, 2nd Ed., T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, New York, 1993; Wold, F., Post-translational Protein Modifications: Perspectives and Prospects, 1-12, in Post-translational Covalent Modification of Proteins, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, 1983; Seifter et al., "Analysis for protein modifications and no protein cofactors", Meth Enzymol, 182, 626-646, 1990, and Rattan et al., "Protein Synthesis: Post-translational Modifications and Aging", Ann NY Acad Sci, 663, 48-62, 1992).

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"Fragmento" de una secuencia polipéptida se refiere a una secuencia polipéptida que es más corta que la secuencia de referencia pero que retiene esencialmente la misma función o actividad biológica que el polipéptido de referencia. "Fragmento" de una secuencia polinucleótida se refiere a una secuencia polinucleótida que es más corta que la secuencia del gen de referencia.

"Variante" se refiere un polinucleótido o a un polipéptida que se diferencia de un polinucleótido o de un polipéptido de referencia, pero que retiene las propiedades esenciales del mismo. Una variante típica de un polinucleótido se diferencia en la secuencia nucleótida del polinucleótido de referencia. Los cambios en la secuencia nucleótida de la variante pueden alterar o no la secuencia de aminoácidos de un polipéptido codificado por el polinucleótido de referencia. Los cambios nucleótidos pueden dar como resultado substituidos, adiciones, eliminaciones, fusiones y truncamientos de aminoácidos en el polipéptido codificado por la secuencia de referencia, como se ha debatido más adelante. Una variante típica de un polipéptido se diferencia en la secuencia de aminoácidos del polipéptido de referencia. Por regla general, las alteraciones están limitadas de tal manera que las secuencias del polipéptido de referencia y de la variante son muy similares en conjunto y, en muchas regiones, son idénticas. Una variante y un polipéptido de referencia pueden diferenciarse en la secuencia de aminoácidos por uno o varias substituciones, inserciones y eliminaciones en cualquier combinación. Un residuo de aminoácido substituido o insertado puede ser uno de los que son codificados por el código genético, o no. Las substituciones conservadoras típicas incluyen Gly, Ala; Val, Ile, Leu; Asp, Glu; Asn, Gln; Ser, Thr; Lys, Arg; y Phe y Tyr. Una variante de un polinucleótido o de un polipéptido puede producirse de manera natural tal como un alelo, o puede ser una variante cuya existencia natural no sea conocida. Las variantes que se producen de manera no natural de los polinucleótidos y de los polipéptidos pueden obtenerse por medio de técnicas de mutagénesis o mediante síntesis directa. De igual modo están incluidos como variantes los polipéptidos que tengan una o varias modificaciones post-traducción, por ejemplo una glicosilación, una fosforilación, una metilación, una ADP ribosilación y similares. Las realizaciones incluyen la metilación del aminoácido N-terminal, las fosforilaciones de serinas y de treoninas y la modificación de las glicinas C-terminales.

"Alelo" se refiere a una de las dos o más formas alternativas de un gen que se presentan en un locus dado en el genoma. Puesto que los mamíferos son organismos diploides, el gen está representado dos veces y tenemos pares de cromosomas. Dos genes de un locus particular, en cromosomas hermanos emparejados, controlan un rasgo de característica particular y se denominan alelos. En los seres humanos los cromosomas pareados pueden portar alelos diferentes. Si cada gen es expresado, en una situación heterocigótica, se denominan codominantes y se producen dos productos génicos diferentes, o alo-antígenos. Si es expresado cada gen, en una situación homocigótica, únicamente existe un producto génico, que es producido.

Se dice que dos o más individuos (o estirpes) son alogénicos entre sí cuando los genes en uno o varios locus no son idénticos en secuencia en cada uno de los organismos. De manera usual alogénico es utilizado usualmente con referencia al locus o a los locus que intervienen.

Los individuos de una especie considerada alogénica representan una diferencia antigénica que provoca una respuesta inmune al injerto alogénico. Los antígenos que entran en consideración se denominan frecuentemente alo-antígenos.

Los "alo-antígenos" están representados por dos grupos de productos génicos con histocompatibilidad. Éstos son considerados como antígenos con histocompatibilidad mayor y con histocompatibilidad menor. Los antígenos con histocompatibilidad mayor estimulan las formas agudas, rápidas, intensas del rechazo al injerto y están representados por las proteínas HLA clase I y II. Los antígenos con histocompatibilidad menor estimulan reacciones crónicas, lentas, menos intensas y representan un grupo de proteínas funcionalmente heterogéneas. Pueden ser producidos anticuerpos monoclonales por un epitopo único y se ha desarrollado un panel de anticuerpo monoclonales diferentes, específicos de varios antígenos HLA, que permiten la tipificación del tejido serológico.

"Polimorfismo" se refiere a una variación en la secuencia de nucleótidos (y en la secuencia de péptidos codificada, si es relevante) en una posición dada en el genoma dentro de una población.

"Polimorfismo de un solo nucleótido" (SNP) se refiere a la aparición de variabilidad nucleótida en una posición nucleótida individual en el genoma, dentro de una población. Un SNP puede aparecer dentro de un gen o dentro de regiones intergénicas del genoma.

Se han empleado muchos procedimientos para la detección de los SNPs introducidos por mutaciones. Por ejemplo se ha descrito un ensayo altamente sensible para los genes ras mutantes y su aplicación al estudio de la aparición y de la recaída de genotipos en leucemia aguda (Oncogene 9, 1994, 553-563). Los dos procedimientos, que son ampliamente utilizados, son amplificaciones alelo-específicas (ASA) y la RCP enriquecida en mutante (ME-RCP). Para el proceso ASA se requieren al menos 3 cebadores. Se utiliza un cebador común en complemento inverso del polimorfismo que está siendo ensayado. Este cebador común puede encontrarse entre 50 y 1.500 bps desde la base polimórfica. Los otros dos (o más) cebadores son idénticos entre sí con excepción de que la base 3' final vacila en el emparejamiento de uno o dos (o más) alelos que forman al polimorfismo. Entonces se llevan a cabo dos (o más) reacciones RCP en ADN de muestra, cada una de las cuales utiliza el cebador común y uno de los cebadores específico del alelo. Para la detección de los SNPs codificantes heredados relacionados especialmente con la leucemia no existe limitación típica con respecto a un pequeño porcentaje de células que portan SNP en una amplia base de células normales como ocurre en el caso de las células cancerosas en general. Por otro lado, cuando se detecte en el análisis de los glóbulos sanguíneos un alelo SNP en una base de 10^{4}-10^{6} células tipo con emparejamiento incorrecto puede ser de ayuda llevar a cabo el análisis de pacientes post-transplante con respecto a la recurrencia de la enfermedad. Se han descrito ensayos altamente sensibles y específicos para la detección de los SNPs (Sidransky, Science 278, 1997, 1054-1058, Ahrendt et al., J. Natl. Cancer. Inst. 91, 1999, 332-339).

Un aspecto importante con relación a esta invención puede ser la necesidad de llevar a cabo dichos análisis de una manera automatizada y ultrarrápida para permitir el cribado a gran escala (Dong et al., J. Natl. Cancer Inst. 93, 2001, 858-865, Ahlquist et al., Gastroenterology 119, 2000, 1219-1227, Ahrendt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 1999, 7382-7387).

La "variante de empalme", tal como se utiliza en este caso, se refiere a moléculas de ADNc producidas a partir de moléculas de ARN transcritas inicialmente a partir de la misma secuencia de ADN genómica, pero que ha sido sometida alternativamente a un empalme de ARN. El empalme alternativo de ARN se produce cuando un transcrito de ARN primario sufre un empalme, generalmente para la retirada de intrones, que da por resultado la producción de más de una molécula de ARNm, cada una de las cuales puede codificar diferentes secuencias de aminoácidos. El término de variante de empalme se refiere así mismo a las proteínas codificadas por las moléculas de ADNc precedentes.

"Identidad" y "similitud" refleja una relación entre dos o más secuencias de polipéptidos o entre dos o más secuencias de polinucleótidos, determinada por la comparación de las secuencias de longitud muy similar, o de longitudes definidas, incluso más cortas (denominada alineación local), que es más adecuada para secuencias de longitud desigual.

Los procedimientos para llevar a cabo la comparación de la identidad y de la similitud de dos o más secuencias son perfectamente conocidos en el estado de la técnica. Tales como, por ejemplo, los programas disponibles en el paquete de análisis de secuencias Wisconsin (Wisconsin Sequence Analysis Package), versión 9.1 (Devereux J et al, Nucleic Acids Res, 12, 387-395.

De manera preferente, se utiliza la matriz de substitución de aminoácidos BLOSUM62 (Henikoff S y Henikoff J G, Proc. Nat. Acad Sci. USA, 89, 10915-10919, 1992) para la comparación de secuencias de polipéptidos que incluyen el caso en el que las secuencias de nucleótidos hayan sido traducidas en primer lugar en secuencias de aminoácidos como paso previo a la comparación.

La secuencia de polinucleótido que tenga un índice de identidad de 0,95 en comparación con una secuencia de polinucleótido de referencia, en promedio 5 de cada 100 de los nucleótidos de la secuencia de referencia, puede ser eliminada, substituida o insertada, o cualquier combinación de lo anterior, como se ha descrito precedentemente. Lo mismo puede aplicarse, mutatis mutandis, para otros valores del índice de identidad, por ejemplo de 0,96, de 0,97, de 0,98 y de 0,99.

La "proteína de fusión" se refiere a una proteína codificada por dos genes fusionados, no emparentados, o fragmentos de los mismos. En el sentido de más general, de conformidad con esta invención, pueden ser fusionados en un polipéptido individual, al menos dos alo-antígenos o fragmentos que porten la versión con dos aminoácidos. En un ejemplo más específico, dichos alo-antígenos, respectivamente dichos fragmentos de los mismos, se fusionarán con el fragmento Fc de una inmunoglobulina. En las publicaciones US 5541087, 5726044 se han debatido ejemplos. En el caso del alo-antígeno Fc, es ventajoso el empleo de una región Fc de la inmunoglobulina como parte de la proteína de fusión para llevar a cabo la expresión funcional del antígeno alógeno Fc o de fragmentos del alo-antígeno, para mejorar las propiedades farmacocinéticas y para mejorar las propiedades inmunológicas de dicha proteína de fusión cuando es utilizada con fines terapéuticos. En algunos casos, puede ser especialmente beneficiosa la generación de un alo-antígeno Fc dimerizado. El constructo Fc-ADN comprende en el sentido 5' hacia 3', una caja de secreción, es decir una secuencia de señal que desencadena la exportación desde una célula mamífera, un ADN que codifica un fragmento de región Fc de inmunoglobulina, como un participante en la fusión, y un ADN que codifica el alo-antígeno o fragmentos del mismo. En algunas utilizaciones sería deseable poder alterar las propiedades funcionales intrínsecas (enlace de complemento, enlace de receptor Fc) mediante mutación de los locus Fc funcionales dejándose el resto de la proteína de fusión inalterado o eliminar tras expresión la parte Fc por completo.

Los marcadores de expresión "específicos del tejido" (tales como las proteínas CD) se aplican de manera rutinaria en el diagnóstico de la leucemia y del linfoma y, además, han demostrado ser valiosos en el diagnóstico de los tumores sólidos cuando la citología convencional por sí sola no proporcione un resultado claro. Se sabe en el estado de la técnica que las células derivadas de un origen hematopoyético se encuentran entre los tipos de células que expresan el máximo número de genes específicos del tejido, en general se denominan como marcadores de linaje (proteínas CD). Las poblaciones de células de linaje incluyen monocitos, células NK, granulocitos (neutrófilos, basófilos, eosinófilos), linfocitos (células T y B), células dendríticas y sus precursores. La mayoría de las líneas celulares de referencia para el cáncer humano y, especialmente, aquellas que están relacionadas con la leucemia y con el linfoma, están disponibles en la DSMZ. Por consiguiente, el ensayo de rutina para la expresión de marcadores tisulares en todas las líneas celulares de cáncer humano realizados con un panel de anticuerpos monoclonales perfectamente caracterizados (mAbs) es una técnica común. En general, el modelo de expresión de estos antígenos refleja el del tipo celular original. Sin embargo, la expresión de proteínas detectada por un mAbs individual, no es siempre estable durante un largo período de tiempo. Por consiguiente, no todos los marcadores indicados con una línea celular dada son expresados necesariamente en los clones de referencia de la DSMZ. Además, algunos Abs no se enlazan siempre contra el mismo antígeno en la misma extensión conduciendo a intensidades de tinción comparables. Por consiguiente, pueden producirse diferencias entre los resultados indicados y no ponen en duda automáticamente la identidad de la línea celular.

La especificidad con el tejido o con el tumor es una nomenclatura que puede ser usada en diferentes formas y puede referirse a un agente o a una molécula sobreexpresada en ciertos tejidos en comparación con otros tejidos o con genes o moléculas únicas del tejido que son expresados en 1 tejido pero no en otros. De conformidad con esta invención deben
considerarse ambas categorías de genes como antígenos diana si éstas portan polimorfismos codificados por SNP.

Otros ejemplos Ejemplo 1 Condiciones que deben cumplir las muestras para el análisis de marcadores de cáncer

Las proteínas CD y los marcadores de cáncer son detectados de manera rutinaria mediante un proceso de diagnóstico que combina reactivos inmunológicos monoespecíficos, marcados con fluorescencia (anticuerpo) y un citómetro de flujo para contar y analizar las poblaciones celulares. Las células son clasificadas entonces por su tamaño, su reactividad marcadora, la aptitud a la clonación y por su proporción. Los anticuerpos anti-CD individuales y las líneas celulares de referencia de leucemia/linfoma están ya disponibles a partir de colecciones de células de referencia tales como ATCC o DSMZ. Se elige un panel de anticuerpos anti-CD deseado para caracterizar y para seleccionar el inmuno fenotipo de la enfermedad leucemia/linfoma deseado y, si es necesario, se compara dicho fenotipo con líneas celulares de referencia estandarizadas de leucemia/linfoma disponibles en la DSMZ. El procedimiento es ampliamente utilizado clínicamente para el diagnóstico, el pronóstico, la evaluación de la enfermedad residual, la monitorización terapéutica y en caso de la gestión de condiciones de leucemia, de linfoma y de condiciones emparentadas, y es perfectamente conocido por los técnicos en la materia. Los anticuerpos de referencia anti-CD y respectivamente las líneas celulares de referencia de leucemia/linfoma con perfiles de expresión de proteína CD caracterizados están disponibles, por ejemplo, en la DSMZ - Deutsche Sammlung von Microorganism und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig, ALEMANIA. Puede analizarse una variedad de tejidos y de fluidos corporales. Para asegurar la calidad y la utilidad clínica de las interpretaciones, todos los datos citométricos son interpretados en el contexto de una revisión microscópica de la muestra.

Sangre

Entre 5 y 7 ml de sangre en un tubo tratado con heparina sódica (tapón verde) y entre 5 y 7 ml de sangre en un tubo EDTA (tapón rojo). Mezclar perfectamente por inversión. Para asegurar resultados ópticos, las muestras deben ser recibidas en el plazo de 24 horas. Si las muestras no son recibidas en el plazo de 24 horas, la muestra puede conservarse a temperatura ambiente, sin embargo, debe llevarse a cabo un frotis sanguíneo con la sangre del EDTA y extenderse con la muestra. Alternativamente, puede someterse un tubo ACD de 7 a 10 ml (tapón amarillo) acompañado por un recuento de leucocitos y una fórmula leucocitaria, obtenido al mismo tiempo que el tubo ACD fue extraído (deben proporcionarse conteos de un tubo independiente para evitar efectos de dilución de ACD).

Médula ósea

Entre 1 y 2 ml de médula ósea extraída en una jeringuilla tratada con heparina sódica (aproximadamente 500 USP de heparina sódica por ml de muestra). Mezclar perfectamente. Transferir la muestra a un tubo tratado con heparina sódica. Pueden ser necesarias otras muestras si la médula es hipocelular. Las muestras deben ser recibidas en un período de 24 horas. Si las muestras no pueden ser enviadas para que lleguen en un plazo de 24 horas, la muestra debe ser colo-
cada en un medio de transporte (aún sigue siendo necesaria una jeringuilla heparinizada para la extracción inicial).

Tejido

Colocar la biopsia tisular en un recipiente estéril con medio para el cultivo tisular. Las muestras deben ser recibidas en el plazo de 24 horas para asegurar un óptimo de viabilidad. Se lleva a cabo una verificación de viabilidad como paso previo al análisis de las células aisladas del tejido.

Ejemplo 2 Selección de los marcadores tisulares relacionados con la leucemia

La inmunofenotipificación de la leucemia y de los linfomas es el proceso utilizado para identificar y cuantificar los glóbulos de la sangre, la médula ósea y los tejidos linfáticos de conformidad con su linaje biológico y estado de diferenciación. Los marcadores celulares utilizados son designados de conformidad con una nomenclatura estándar que define las proteínas CD. Las proteínas marcadoras CD constituyen una excelente elección debido a su expresión por células de origen hematopoyético, para iniciar un análisis SNP de conformidad con esta invención. En la tabla 2 se ha dado una lista de marcadores de la superficie celular relevantes para el diagnóstico de las enfermedades hematológicas, tales como la leucemia y los linfomas. El objetivo final consisten en identificar polimorfismos con estas proteínas CD que expliquen los cambios de aminoácidos en las proteínas correspondientes.

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La clasificación de las células de leucemia indiferenciadas de origen linfoide o mieloide, que pueden pertenecer, por ejemplo, al linaje de las células B o de las células T, es una primera etapa en el análisis y a continuación puede efectuarse una subclasificación de las células de leucemia dentro de los tipos de linaje. La recogida de información detallada sobre la expresión del marcador de la superficie celular es conocida en el estado de la técnica y empleada para planificar el inicio experimental. Puesto que muchos marcadores, especialmente los marcadores de cáncer en general han sido explicados mediante la formación del perfil de expresión, se incrementa gradualmente el número de cánceres que puede ser aplicado al enfoque actual. Los marcadores más importantes, que pueden ser utilizados para definir los perfiles de la leucemia, han sido ensayados en esta invención y en la tabla 2 se ha dado una lista de los mismos. El experto en la materia podrá elegir fácilmente aquellos marcadores CD que sean los más adecuados para el diagnóstico y el tratamiento de una enfermedad de transmisión sanguínea específica.

Los párrafos siguientes resumen los perfiles de proteína CD relevantes que se refieren a enfermedades específicas. Las enfermedades específicas incluyen, pero sin carácter limitativo, la leucemia mieloide aguda (AML), la leucemia linfoblástica aguda (ALL), el síndrome mielodisplásico (MDS) y otros síndromes mieloproliferantes crónicos, la leucemia mieloide crónica (CML), la leucemia linfoblástica crónica (CLL), el mieloma múltiple, el linfoma (de Hodgkin o de no Hodgkin) con inclusión del linfoma folicular, el linfoma de grado intermedio, el linfoma B de alto grado con células pequeñas no excindidas o linfoma linfoblástico de las células T, el linfoma anaplástico de las células grandes, el linfoma de las células del manto, el linfoma periférico de las células T, el linfoma de Hodgkin con enfermedad extranodal o síntomas B, o tumor voluminoso y anemia aplástica severa.

Una combinación de varios SNPs, que represente proteínas diferentes de un perfil, será especialmente beneficiosa cuando se aplique la presente invención para la terapia y para el diagnóstico de enfermedades.

Los perfiles de leucemia aguda de poblaciones de células leucémicas putativas o conocidas están basadas en el análisis de los marcadores de las células (CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, y CD8), siendo preferentes los marcadores de las células B CD10, CD19, CD20, CD21, CD22 y CD24 y los marcadores mieloide/monocíticos (CD13, CD14, CD15, y CD33). En caso en que sea útil, pueden ser incluidos marcadores adicionales de las células B tales como CD23, 37, 38, 39, 40, 72, 73, 74, CDw75, CDw76, CD77, CDw78, CD79, CD80, CD81, CD82, CD83, CDw84, CD85, CD86. La leucemia megacarioblástica aguda puede ser demostrada mediante el empleo de los marcadores CD61, CD42 y CD41. El estado de maduración (no linaje) es evaluado con CD34, con HLA-DR, y con CD10 (CALLA). Así mismo puede ser requerida la transferasa terminal (TdT) como un ensayo independiente o agregado por el médico cuando esté justificado.

Los perfiles de leucemia crónica y los perfiles de linfoma son evaluados mediante el análisis de la población total de las células T con respecto a la presencia de marcadores de las células T pan: CD2, CD3, CD7, CD5; de manera rutinaria se incluyen los análisis de las subpoblaciones CD4 (T auxiliar) y CD8 (T citotóxico/supresor). Los marcadores mieloide/monocíticos incluyen CD14 y CD15. La población total de células B puede ser acotada mediante la determinación de la expresión de los marcadores de las células B CD19 y CD20. Frecuentemente la coexpresión de CD5 y de CD20 está asociada con la proliferación neoplástica. Pueden incluirse la CD41 y la CD42 para la diferenciación de CML en crisis blástica. En el perfil estándar están incluidos los CD10 (CALLA), CD22, CD23, CD38, CD45, FMC-1 y HLA-DR. Otros marcadores pueden ser agregados para evaluar los desórdenes de las células T (CD1, CD30), la enfermedad de Hodgkin (CD15, CD30), o el linfoma anaplástico (Ki-1) (CD30).

La leucemia de las células pilosas, la leucemia prolinfocítica, o el linfoma de las células del manto y la leucemia son enfermedades de las células B que se caracterizan por un perfil de leucemia crónica y por un perfil de linfoma (véase más arriba) más expresión de los marcadores de las células pilosas CD11c (receptor complemento), CD 25 (receptor IL-2), CD103, y el marcador prolinfocítico de las células pilosas FMC-7. El marcador linfoide B CD23 es evaluado en relación con la expresión de CD5 para los diversos diagnósticos de la leucemia crónica frente al linfoma de las células del manto. El CD23 es parte del perfil fundamental del linfoma.

La enfermedad de linfoma anaplástico (Ki-1) y de Hodgkins es evaluada mediante los marcadores CD1, CD15, y CD30 (Ki-1).

Ejemplo 3 Nuevos SNPs identificados mediante cribado de bases de datos de ADN

Los SNPs son identificados por cribado de las bases de datos de ADN que representan la variación alélica del genoma humano, en el que la secuencia del ADN se deriva de diversos individuos. El cribado puede ser llevado a cabo a varios niveles con inclusión de los datos EST, SNP o ADN genómico. Sin embargo, esto conducirá finalmente al mismo resultado. Las bases de datos útiles para el cribado directo de SNP pueden ser elegidas entre un grupo de bases de datos que comprende:

http://www.jbic.or.jp

http://snp.ims.u-tokyo.ac.jp

http://www.celera.com

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/

Para ilustrar la identificación de los SNPs en proteínas CD-cluster, han sido aplicadas varias frecuencias de aminoácidos, que representan diversas proteínas CD relacionadas con el cáncer para una investigación tblastn, empleándose el modo por defecto (secuencia proteica frente a la base de datos traducida de ADN) del programa. Las secuencias proteicas, son particularmente útiles para el cribado, más que las secuencias nucleótidas, puesto que pueden ser excluidos los SNPs que no tengan efecto sobre el cambio de un aminoácido (mutaciones silentes). La investigación del banco de datos se llevó a cabo mediante la utilización de una o varias bases de datos de SNP de dominio público, precedentemente indicadas.

Por otra parte se procesaron la alineacións resultantes, que representan discrepancias de la secuencia de ADNc (SNPs putativos) entre diferentes clones de una secuencia particular de proteína CD, de conformidad con los siguientes criterios rígidos:

(i)

Alineación del ADN genómico o del EST (marcador de secuencia expresado) y la secuencia CD que contiene un X es un error de secuenciación y debe ser ignorado.

(ii)

Alineación de los clones de ADN genómicos y una secuencia CD con emparejamientos incorrecto adyacentes al extremo 5' o al 3', son indicadores de los límites exon/intrón y, así mismo, deben ser ignorados.

(iii)

Una diferencia de una sola base en la alineación entre el ADN genómico o las secuencias EST y la secuencia CD rodeada por un ADN perfectamente emparejado es un indicador riguroso del SNP putativo.

Los SNPs identificados a nivel del AND han sido analizados además por comparación de su secuencia proteica disponible por medio el código de acceso. La investigación tblastn conduce a la alineación tal como está dada en el ejemplo CD42 más adelante y ha dado por resultado la identificación de los SNPs putativos que están presentes en el clon genómico correspondiente. En la tabla 2 se muestra una lista de proteínas relevantes que han sido aplicadas para análisis de SNP.

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Ejemplo 4 Análisis de las variantes SNP CD42

Para ilustrar el procedimiento descrito en el ejemplo 3 con mayor detalle, se ha seleccionado la proteína CD42b a título de ejemplo. Se ha aplicado la secuencia proteica, que está disponible con el código de acceso No. P07359 para el cribado de los SNPs putativos en la proteína CD42b:

\quad

la investigación tblastn conduce a la alineación mostrada más adelante y a la identificación de dos SNPs putativos presentes en el clon genómico con el número de acceso AC032038.2. >gi|121531|sp|P07359|GPBA_HUMAN PLATELET GLYCOPROTEIN IB ALPHA CHAIN PRECURSOR (GP-IB ALPHA) (GPIBA) (CD42B-ALPHA) (CD42B) [CONTIENE: GLICOCALICINA]

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Secuencia de aminoácidos de CD42b

1

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Alineación del fragmento CD42b

Se han marcado en negrita las secuencias que representan variantes alélicas y que comprenden cambios de aminoácido en la proteína CD42b.

\quad

>ss523802 allelePos=201 total len = 401 SC_JCM|AC032038.2_49155|taxid 9606|mol = Genomic|subsnpClass = 1 Length = 401

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Hebra no codificante HSPs

Baremo = 736 (264.1 bitios), esperado = 7.0e-71, P = 7.0 identidades = 131/133 (98%), positivas = 132/133 (99%), marco = -1

2

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Ejemplo 5 Ensayo de líneas de células cancerosas por HLA y por SNP

Se encuentran disponibles líneas celulares de leucemia/linfoma transformadas por el virus de Epstein Barr con perfiles de expresión proteína CD caracterizada, por ejemplo, en la DSMZ o pueden ser aislados de los pacientes. Las células se ensayaron en cuanto a la expresión de la HLA-A2 (u otra expresión deseada de clase I) mediante inmunofluorescencia utilizándose el mAb BB7.2 (u otros anticuerpos disponibles en la American Type Culture Collection, Manassas, VA). Se ensayaron la expresión y el estado SNP de la célula hematopoyética y/o de la célula cancerosa mediante RCP genómica. Se aisló a poli (A)+ ARN con el estuche de purificación de ARNm QickPrep Micro (Amersham Pharmacia Biotech, Piscatawa, NJ). Para la expresión específica de la célula o del tejido y la detección del polimorfismo de, por ejemplo, el gen CD42 (Acc. No J02940), cebadores de RCP (5'-CAAGAGAACTCGCTGTATACA-3' y 5'-AAGGGGTGGTTTCGGGTATGT-3') se utilizaron la correspondiente posición de las bases 586 hasta 607 y la posición de las bases 939 hasta 960, respectivamente del ADNc del CD42 y proporcionó un producto de la RCP con 374 bp. La detección del SNP se llevó a cabo mediante secuenciación subsiguiente del producto de la RCP mediante la utilización de un secuenciador capilar ABI.310.

Ejemplo 6 Identificación de péptidos enlazantes de HLA codificados por SNP en CD42b

Además de la investigación para los SNPs codificantes en el ADN y las secuencias proteicas, la selección de un motivo enlazante apropiado de HLA clase I es otra etapa importante para definir un SNP relevante.

Se han elegido varias de las moléculas más representativas de la presentación HLA clase I. La utilización del algoritmo SYVPEITHI ha ayudado a la generación de predicciones de péptidos enlazante de HLA y los baremos están dados en la tabla 4. Los baremos que se encuentran desde 8 hasta 27 indican una elevada afinidad del péptido individual para enlazarse con las moléculas HLA clase I.

El resultado de este análisis son secuencias humanas que están emparejadas en 8 de los 9 residuos del péptido. Los dos péptidos humanos son sintetizados y ensayados con respecto a la actividad sensibilizante. En raras ocasiones puede ser observado más de un emparejamiento incorrecto de aminoácido dentro de los 9 residuos del epitopo de la célula T.

Ejemplo 7 Selección de péptidos enlazante de HLA para el ensayo in vitro

Para el ensayo in vitro del cambio de aminoácido derivado de SNP, deben ser identificados los péptidos nonámeros que tengan, de manera preferente, los motivos enlazante conocidos para la HLA-A2 (HLA-A*02 o HLA-B51 o HLA-B62) en la secuencia de proteína madura tal como se ha descrito precedentemente por el alo-antígeno CD42.

En general, la selección de epitopos de células T que enlazan a la HLA-A2 ofrece ventajas sobre otras debido a que estas líneas celulares existen en el arte previo, que pueden ser utilizadas para el estudio de la presentación de antígenos in vitro. Dicha línea celular es, entre otras, la LCL.174 (una línea celular mutante deficiente en TAP) que porta la HLA-A2 en la superficie.

Ejemplo 8 Aislamiento de los péptidos enlazante HLA-A2

Se aislaron péptidos enlazante HLA-A2 y se secuenciaron de conformidad con los protocolos estándar (Seeger et al., Immunogenetics, 49: 571-576, 1999, Falk et al., Nature, 351: 290-296, 1991) empleándose el anticuerpo BB7.2 específico de HLA-A2, tratamiento ácido, ultrafiltración y fraccionamiento mediante HPLC. Las fracciones de la HPLC que contienen péptidos se reunieron y se analizaron alícuotas correspondientes a los extractos péptidos a partir de aproximadamente 10^{10} células mediante HPLC ESI MS nanocapilar (Schirle et al., Eur. J. Immunol., 30: 2216-2225, 2000)

Ejemplo 9 Síntesis de los péptidos

Se sintetizaron los péptidos mediante la química de los F-moc. La química de los F-moc está descrita en la publicación G. A. Grant Synthetic Peptides: A User's Guide, W. H. Freeman and Co. (1992). Se confirmaron las identidades de los péptidos mediante análisis de aminoácidos y por espectrometría de masas de desorción/ionización asistida por matriz. Los péptidos liofilizados se disolvieron en DMSO hasta 20 mM, se distribuyeron en alícuotas y se almacenaron a -80ºC. Los péptidos se diluyeron hasta 4 mM con medio de cultivo exento de suero y se utilizaron a las concentraciones finales deseadas.

Ejemplo 10 Ensayo in vitro de los péptidos sintéticos que enlazan con HLA

Se identificaron los péptidos con variaciones de un solo aminoácido inducidas por SNP, que pueden enlazarse con las moléculas de HLA-A2 por medio de su aptitud para incrementar la expresión de HLA-A2 en la superficie de células mutantes deficientes en TAP de la línea LCL.174. En resumen, se cultivaron células LCL.174 en una placa de 96 pocillos de fondo redondo con 2 x 10^{6} células/pocillo en 200 \mul de RPMI junto con 50 \muM de péptido y se incubaron durante la noche a 37ºC. A continuación se trataron las células con mAb específico de HLA-A2, BB7.2 (ATCC, Rockville, Md.), efectuándose a continuación la tinción con conjugado de FITC de IgG de cabra anti-ratón. Se analizó la intensidad de la fluorescencia mediante citometría de flujo. El péptido de la proteína M1 de la matriz del virus de la gripe, FluMP58, es un epitopo de CTL restringido por HLA-A2 conocido y se utilizó como control positivo. El antígeno de la cápside del virus de la hepatitis B, el péptido HBenvAg125, no se enlaza con la HLA-A2 y se utilizó como control negativo.

Ejemplo 11 Tecnología tetrámera para la identificación de células reactivas con el antígeno

Por regla general se generan complejos multiméricos MHC clase I/péptido mediante la expresión de macroglobulina \beta2 recombinante y moléculas de HLA de cadena pesada en bacterias. La cadena pesada es mutada para eliminar la región transmembranal y para añadir una secuencia de biotinilación específica en el extremo C. Las proteínas purificadas pueden ser plegadas in vitro en presencia de elevadas concentraciones de péptido/epitopo para formar complejos estables y solubles de HLA-péptido. Tras la biotinilación enzimática, estos complejos son multimerizados con streptavidina que enlaza cuatro moléculas de biotina. La utilización del conjugado fluorescente de streptavidina permite la visualización de las células teñidas mediante citometría de flujo.

En el caso en que sean utilizados complejos de MHC clase I/péptido para activar a las células T, puede ser conveniente combinar la tecnología tetrámera con el análisis de secreción de citoquina, para estudiar la respuesta inmune con mayor detalle.

Ejemplo 12 Estimulación in vitro de los CTLs

Se prepararon células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) a partir de 30 ml de sangre periférica heparinizada procedente de sujetos humanos HLA-A2^{+} mediante centrifugación sobre Ficoll-Hypaque (Sigma, St. Louis, Mo.). Se seleccionaron positivamente las células CD8^{+} a partir del aislado fresco de las PBMCs, o a veces a partir de PBMCs congeladas en nitrógeno líquido, empleándose microperlas magnéticas revestidas con anticuerpos anti-CD8 de conformidad con las instrucciones del fabricante (Milteny Biotec, Auburn, Calif.).

Las células CD8^{+} se volvieron a suspender en DMEM exento de suero y se cultivaron en alícuotas de 500 \mul en placas con 48 pocillos con 3 x 10^{6} células/pocillo. Al cabo de 2 horas a 37ºC, se retiraron las células no adherentes con un 5% de CO_{2} mediante lavado repetido y se incubaron los monocitos adherentes durante 4 horas con 50 \muM de péptido y 5 \mug/ml de macroglobulina \beta2 humana (Sigma, St. Louis, Mo.). Tras lavado con DMEM exento de suero, cada pocillo fue suplementado con 1,5 x 10^{6} células CD8^{+} (> 90% de pureza por citometría de flujo) en 500 \mul de DMEM que contenían un 10% de suplemento de suero humano con rhlL-7 (0,5 ng/ml; R&D Systems, Minneapolis, Minn.). Se añadió rhIL-2 a 25 U/ml al cabo de 2 días y dos veces por semana una vez reemplazada la mitad del medio de cultivo. El décimo día se estimularon de nuevo los cultivos CTL en un agente de respuesta a una tasa de estimulador de 5 con LCLs autólogos irradiados (5.000 rad). Alternativamente, se utilizaron células LCL.174, que han sido incubados con 50 \muM de péptido enlazante de HLA, definido de conformidad con esta invención, para estimular de nuevo cultivos de CTL obtenidos a partir de sujetos HLA-A2^{+}. Se llevaron a cabo ensayos CTL una semana después de la nueva estimulación como se ha descrito más adelante.

Tras caracterización, los CTLs estimulados con los péptidos pudieron ser congelados y almacenados en medio constituido por un 30% de suero humano, un 10% de DMSO y un 60% de DMEM, y pudieron ser descongelados y estimulados de nuevo para análisis ulteriores. Se utilizó el péptido FluMP58 (derivado de la proteína M1 de la matriz del virus de la gripe), como control positivo para la estimulación in vitro de los CTLs específicos del péptido.

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Ejemplo 13 Generación ex vivo de CTLs específicos del alo-antígeno

Pueden ser utilizados péptidos enlazantes de HLA, que representan versiones alélicas de un alo-antígeno preferido y, a continuación, pueden ser caracterizados mediante aislamiento de los CTLs específicos. Se ha demostrado la posibilidad de poder realizar este enfoque mediante generación ex vivo de CTLs específicos del alo-antígeno a partir de donantes de sangre sanos alelo-negativos con emparejamiento incorrecto de aminoácido, no sensibilizada. Pueden usarse como APC células de dendríticas péptido-pulsadas sintéticas para estimular autólogos o células T CD8^{+} alogénicas no sensibilizadas. Los CTLs específicos, generados ex vivo, con emparejamiento incorrecto de aminoácido, pueden emplearse entonces para efectuar eficientemente la lisis de las células leucémicas derivadas de pacientes con leucemia mieloide aguda (AML) y con leucemia linfoide aguda (ALL). Debería detectarse la reactividad no lítica frente a células no hematopoyéticas. Pueden obtenerse CTLs en un número suficiente para fines de inmunoterapia adoptiva. Es importante señalar que esta técnica es aplicable, sin limitación, a cualquier alo-antígeno definido por SNP descubierto mediante la invención.

Ejemplo 14 Ensayo de citotoxicidad con liberación de ^{51}Cr

La actividad citolítica de estas células efectoras se mide mediante la liberación del isotopo a partir de las células diana marcadas. Con frecuencia se ensaya la actividad citolítica en un ensayo con liberación de cromo pero igualmente pueden ser considerados otros procedimientos. En los ensayos con liberación de cromo las células diana, marcadas con cromo reactivo (^{51}Cr), se mezclan con los CTLs activados. El cromo radioactivo en forma de Na_{2} ^{51}CrO_{4} es absorbido por las células vivas reduciéndose el cromo dentro de las células. Cuando el cromo reducido es desprendido por las células lisadas, éste no puede ser reutilizado para otras células, por lo que la cantidad de cromo desprendido es una buena medida de la actividad citolítica de las células efectoras. En principio puede ser usado cualquier tipo de célula como diana para medir la actividad de los CTLs aun cuando las células activadas, tales como los linfoblastos, las células de cultivo tisular, o las células tumorales, han demostrado ser las mejores. Se mide la actividad destructora natural por medio de la lisis de una línea celular de referencia denominada K562. En este caso el ensayo es utilizado para medir la actividad de las células LAK derivadas del donante o del receptor o de los clones de las células T citotóxicos (efector). Las células LAK o los clones de las células T destruyen a las células diana que expresan la combinación adecuada de HLA y de péptido antigénico alogénico.

Una línea de células diana preferente pulsada con un epitopo de células alo-T seleccionado es la línea celular EBV-LCL, HLA-A2-positiva, humana. De manera adicional está disponible en la DSMZ una fuente rica de líneas celulares de leucemia. En un tubo Falcon de 5 ml se colocan 1 x 10^{6} células que representan una diana. Las células son centrifugadas y se suspenden de nuevo mediante la adición de 10 \mul de Na_{2} ^{52}CrO_{4} (elevada actividad), se mezclan y se incuban durante 45 minutos a 37ºC. Las células marcadas se lavan tres veces con PBS/FBS y se vuelven a suspender en 1 ml de medio y se recuentan. Las células marcadas se mantienen en hielo hasta que deban ser utilizadas. Para el ensayo se necesita un volumen total de 5 ml procedente de cada tipo celular diana, a una concentración comprendida entre 5 y 104 células/ml y se ajusta la concentración.

Los linfocitos T citotóxicos (CTLs) pueden ser generados a partir de linfocitos T precursores mediante: 1) la estimulación específica mediante antígenos efectuada en células "estimuladoras" en presencia de células T accesorias y auxiliares, o 2) activación policlonal inducida durante cuatro o cinco días mediante incubación con interleuquina-2 y que se denominan células LAK. Las células efectoras preferentes se transfieren a un tubo Falcon de 50 ml. Las células son lavadas y suspendidas de nuevo y son ajustadas a una concentración de 2,5 x 10^{6} células/ml. Las células efectoras y diana deben ser mezcladas en 4 relaciones diferentes efecto:diana (50:1, 25:1, 12,5:1, 6:1). Cada relación efecto:diana debe ser ensayada por triplicado. Se prepara una dilución en serie de las células efectoras en la placa de tal manera que el volumen total de las células efectoras es de 100 \mul tras dilución. A continuación se añaden 100 \mul de suspensión de célula diana. El número de células diana por pocillo debe ser de 5.000. Los pocillos para la liberación espontánea y máxima incluyen 100 \mul de medio que contiene únicamente células diana. Las placas son incubadas a 37ºC, con un 5% de CO_{2} durante 4 horas. Al cabo de 4 horas se recolecta y se cuenta en ensayo de citotoxicidad en la máquina gamma contadora.

Ejemplo 14 Protocolo de vacuna A

Se utilizan alo-antígenos codificados por SNP, seleccionados, en forma de la proteína polifórmica completa o, al menos, en forma de la porción péptida polimórfica de la misma. Algunas proteínas y algunos péptidos son inmunógenos, mientras que otros carecen de inmunogenicidad. Esta carencia se vence fácilmente en la mayoría de los casos mediante la copulación de la proteína o del péptido con un soporte. Los soportes usuales incluyen la hemocianina del molusco Megathura crenulata (KLH), la albúmina del suero bovino (BSA), el Mycobacterium bovis BCG o el derivado proteico purificado de tuberculina, o la subunidad B de la toxina del cólera. La copulación puede llevarse a cabo con cualquier reticulante bifuncional. Puede ser utilizado un reactivo homobifuncional tal como el suberato de bis(sulfosuccinimidilo), el suberato de disuccimidilo o el glutaraldehído. En aquellos casos en los que se sepa que la proteína o que los péptidos no muestran grupos accesibles para la reticulación, puede ser ventajosa la utilización de reactivos heterobifuncionales. En el estado de la técnica se conocen reactivos heterobifuncionales tales como la m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida o la sulfo-m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida, entre otros, y éstos pueden ser elegidos de conformidad con las propiedades bioquímicas de los compuestos que deben ser conjugados. El conjugado soporte de los antígenos elegidos en el ejemplo preferente es un conjugado de antígeno KLH y puede ser empleado de manera preferente junto con el adyuvante inmune QS-21. Formulaciones antígenas adicionales comprenden ISCOMs, MDP, Mycobacterium bovis BCG, o hidróxido de aluminio. Las saponinas o los oligonucleótidos CpG son capaces de reforzar las respuestas inmunes y pueden ser adecuados para las secuencias seleccionadas o para los conjugados antígenos. Los procedimientos alternativos incluyen la vacunación repetitiva con el antígeno seleccionado.

Tras agitación cuidadosa, se efectúa la administración a un sujeto humano por vía intravenosa, intratumoral, intradérmica, subcutánea o por vía oral. La administración debería efectuarse preferentemente los días 0, 7 y 14. De manera opcional, igualmente pueden ser incluidos péptidos epitopos de las células B, puesto que pueden reforzar las aplicaciones.

Protocolo de vacuna B

El agente de vacuna propuesto es una hebra atenuada de la bacteria Salmonella typhimurium, que porta un plásmido replicante en el que ha sido insertada la secuencia de ADN apropiada, que es capaz de expresar in vivo los péptidos alo-antígenos, que codifican SNP, de interés. Como vector proponemos la hebra X 4072 atenuada de la Salmonella typhimurium (Schödel et al., Infect. Immun. 1994, 62: 1669-1676) que tiene mutaciones \Delta crp-1 y \Delta cya que le hacen avirulento y una mutación \Delta asdA-1 que le hace inviable a menos que esté presente un gen asdA normal en un plásmido permanente. Sin embargo, también pueden ser empleadas en su lugar otras hebras bacterianas seguras.

El plásmido pYAN es una forma de pYA292 que está modificado para tener un locus Nco I. (Schödel et al., supra). La presencia de un locus Nco I permite inserciones dentro del marco del AUG de la proteína foránea o del péptido de interés en el plásmido. El pYAN carece de genes con resistencia a los antibióticos, al permitirse la utilización de antibióticos deberían aparecer síntomas que sugerirían la patología por Salmonella. El pYAN porta un gen asda normal, que mantiene viabilidad únicamente para aquellas bacterias que retengan el plásmido. Se sintetiza una secuencia de ADN por codificación de un AUG seguido por las secuencias que codifican el péptido. La dosis sugerida es de 5 x 10^{4} unidades que forman colonia para un niño pequeño y de 5 x 10^{5} unidades que forman colonia para los adultos.

Para los adultos, la bacteria es administrada con bicarbonato de sodio (2 g de NaHCO_{3} en 150 ml de agua destilada). Como paso previo deberían beberse 120 ml de la solución para neutralizar el ácido gástrico. Al cabo de un minuto, se beben los otros 30 ml de la solución de bicarbonato, que contiene ahora la bacteria. No se permite comer ni beber durante 90 minutos antes o después de la vacunación.

Protocolo de vacuna C

De manera alternativa, el ADN puede ser suministrado por medio de otras técnicas para el suministro de ADN tales como las análogas al protocolo de vacunación descrito por D. Zhang et al. (J. Infect. Dis. 1997,176: 1035-1040).

Mientras que las realizaciones preferidas han sido descritas precedentemente, los técnicos en la materia apreciarán que pueden realizarse otras modificaciones dentro del alcance de la invención. Por ejemplo, en lugar de efectuar la expresión del ADN en E. coli, podría optimizarse el ADN para otros huéspedes y expresarse en dichos huéspedes.

Por otra parte, aun cuando han sido identificadas secuencias específicas, se supone que las técnicas de la presente invención pueden ser utilizadas para insertar péptidos más largos que los 8-10 meros deseados que tienen características de activación CTL deseables. De este modo, las reivindicaciones deben ser entendidas de la manera más amplia posible con objeto de juzgar todo el alcance de la invención.

Protocolo de vacuna D

Las células dendríticas (DC) son consideradas vectores vivos para la vacunación contra el cáncer y son especialmente útiles para suministrar los antígenos de esta intervención.

La mayoría de los estudios clínicos más recientes han sido llevados a cabo mediante la utilización de DC generadas ex vivo a partir de precursores de CD14+ (5,6) (las denominadas DC derivadas de monocitos o Mo-DC) que son considerados ahora como un estándar de oro (Thurner B et al. J Exp Med. 190: 1669, 1999; Schuler-Thurner B et al. J Exp Med. 195: 1279, 2002). Las Mo-DC pueden ser generadas de manera reproducible en un gran número en el transcurso de un reducido número de días (entre 300 y 500 millones de DC maduras por afaeresis) a partir de precursores en la sangre (Feuerstein B et al. J Immunol Methods. 245: 15-29, 2000). En el caso de las Mo-DC es crítica la elección de los estímulos de maduración para el éxito y la especificidad, con el fin de obtener Mo-DC que expresen CCR7 el PEG2 debe formar parte del estímulo de maduración para migrar hasta la respuesta del CCL19 y del CCL21 que conducen a las DC en los órganos linfoides (Luft T et al. Blood. 100: 1362, 2002; Scandella E et al. Blood. 100: 1354, 2002). Se encuentran disponibles procedimientos para la preparación de las DCs que permiten la producción clínica de GMP de una vacuna péptida basada en DC contra tumores. Pueden ser empleados péptidos seleccionados que portan alo-antígenos codificados por SNP para la carga péptida de las DCs. Otro enfoque para la carga de las DC con antígenos puede llevarse a cabo mediante la incorporación de ARN desnudo que codifica el antígeno deseado mediante el protocolo de transfección o de electroporación (Van Tendeloo VF et al. Blood. 98: 49, 2001) e inducción subsecuente en células T específicas del antígeno in vitro así como in vivo en pacientes.

Las DCs pueden ser cargadas con hasta 20 epitopos de células T restringidos por HLA clase I y con hasta 10 epitopos de células T restringidos por HLA clase II y actúan a modo de un adyuvante natural para la inducción de las respuestas CTL específicas del antígeno.

Además de la tecnología tetrámera y de la determinación de la frecuencia CTL, puede emplearse el análisis ELISPOT (procedimiento descrito en el ejemplo 15) para monitorizar la respuesta inmune.

Ejemplo 15 Evaluación de la inmunogenicidad y de la eficacia de la vacunación

El primer objetivo en los ensayos clínicos con antígenos de cáncer constituye en determinar su inmunogenicidad. Esto se hace usualmente con ayuda de la medida de marcadores indirecto para la activación de los linfocitos tales como las citoquinas y los interferones o puntos finales de la reacción inmune tales como la respuesta de anticuerpos.

Un ensayo estándar conocido por el técnico en la materia determina si existe inducción de una respuesta de anticuerpos específica del antígeno (alogénico). Esto se lleva a cabo con un ensayo inmunoabsorbente enlazado con un enzima (ELISA) de base celular o antígena con utilización de suero obtenido de los pacientes antes y después de la administración de la vacuna. Los autólogos de las células de leucemia, u otras células causantes de enfermedades, o antígenos aislados, especialmente sus alo-antígenos que portan cambio de aminoácido, son dianas perfectamente adecuadas para la preparación de un ELISA.

Otro procedimiento consiste en la evaluación de la inmunogenicidad por ensayo de hipersensibilidad de la piel (DTH) de tipo retardado. Todos los pacientes reciben inyecciones intradérmicas de antígeno, de alo-antígeno o de células de cáncer autólogas irradiadas, antes y después de la administración de la vacuna. Se mide el grado de induración y del eritema que se presenta al cabo de 48 horas después de la inyección. Por otra parte, el ensayo DTH puede incluir la recogida de muestras para biopsia que son sometidas a análisis inmunohistoquímico para determinar si existe una afluencia de células del sistema inmune.

Otra vía para identificar células efectoras específicas del cáncer está basada en un ensayo, que ha sido desarrollado recientemente, que ha sido útil para la determinación de células T activadas de manera específica, generadas al encuentro del antígeno. Las células activadas, que responden por liberación de citoquinas y de anticuerpos anti-citoquinas, son usadas para medir las mismas, una técnica conocida como ensayo de inmunomancha ligado a un enzima (ELISPOT). ELISPOT permite la realización y la medición de la nueva estimulación in vitro de los linfocitos del donante o del paciente con un elevado grado de sensibilidad.

Las citoquinas secretadas por las células efectoras son cuantificadas y puede llevarse a cabo un análisis adicional por citometría de flujo para medir la frecuencia de las células T. Pueden utilizarse péptidos de referencia o proteínas del virus de la gripe (FLU), citomegalovirus (CMV) o toxoide tetánico (TT) con objeto de estandarizar el sistema. La detección de la secreción de IL-4 o la secreción de IFN-gama es un indicador de las células T CD4^{+} específicas del antígeno así como CD8^{+} con PBMC normal.

Las células de tipo memoria expresan la CD27 y la CD28 pero no lo hacen con la CD57. Las células recogidas después de aislamiento y expansión con IL-2, muestran citotoxicidad específica del antígeno. Las frecuencias de las células T específicas del antígeno es menor para los antígenos que se encuentran infrecuentemente y solamente es moderada para los antígenos inmunógenos tal como el TT (1 en 10.000 hasta 1.000.000), pero es mucho más elevada para el virus persistente CMV (1 en 100 hasta 10.000 PBMC de donantes seropositivos). Estas técnicas son una herramienta útil en el análisis y en el aislamiento de las células T específicas del cáncer y de los alo-antígenos, de conformidad con la presente invención.

Ejemplo 16 Medición de la alo-activación

Un procedimiento para enumerar y medir clínicamente la potencia de las células T alo-activadas puede comprender la distinción de las células activadas de las células inactivas.

En ensayo de reducción XTT Formazan es conveniente para comparar la actividad de las células alo-activadas con el control no estimulado. El ensayo está basado en la capacidad de las células vivas para reducir XTT para dar tinte rojo anaranjado de Formazan, y por lo tanto es de gran ayuda para distinguir las células inactivadas de las células activadas. Este ensayo puede ser utilizado prácticamente para cualquier célula, en prácticamente cualquier medio. El ámbito celular útil está comprendido entre 10^{5} y 5 x 10^{6} por ml. Los reactivos son: placas de 96 pocillos, de fondo plano (placas no aplicables en el ELISA), 1 mg/mL de MTT (sal de 5-carboxanilinida de 2,3-bis(2-metoxi-4-nitro-5-sulfo-fenil-2H-tetrasolio, Sigma) en PBS (fresco), 1,53 mg/mL de PMS (fluoruro de fenilmetanosulfonilo, Sigma) en PBS (congelado, protegido contra la luz ambiente). El ensayo se lleva a cabo colocándose 100 \mul de medio de cultivo con células en una placa de 96 pocillos, por duplicado o por triplicado. Para los controles se utilizan únicamente 100 \mul de medio. La primera columna se deja en blanco. Para el desarrollo se efectúa una mezcla previa de PMS con XTT inmediatamente antes de su utilización (5 \mug por ml de XTT) y se añaden 50 \mul de XTT a cada pocillo. Se agita la placa para efectuar la mezcla. Se cubre la placa y se incuba a 37ºC durante 4 horas. La placa se recuenta a 470 nm (referencia 650 nm).

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Ejemplo 17 Citometría de flujo para el análisis de la expresión de CD3/CD69 o de CD3/FDA

Este es un ensayo para el análisis de la activación de los linfocitos T tras estimulación alogénica de los linfocitos mezclados. La expresión de CD69 o la actividad esterasa está relacionada con la secreción de citoquina y pueden ser utilizadas como indicadores indirectos de la activación de los linfocitos T. Los linfocitos no estimulados no expresan la CD69 en su superficie y únicamente tienen bajos niveles de esterasas inespecíficas. Una vez que los mitógenos han sido activados por alo-antígenos o activados de una manera inespecífica, la expresión de la CD69 aparece en el transcurso de 48 horas (pico a las 24 horas). La actividad de la esterasa incrementa poco después de la estimulación y continúa durante varios días. No todas las reacciones de los linfocitos alo-estimulados actúan con la misma cinética, y es preferible medir la activación los días 1, 2 y 3 del cultivo.

Las muestras de las células del donante y del paciente se mezclan en cultivos pequeños de 0,5 x 10^{6} células/ml en FCS-RPMI al 2%. Estos cultivos se mantienen a 37ºC en incubador con un 5% de CO_{2} hasta que se lleve a cabo el ensayo.

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Ejemplo 18 Ensayo de proliferación celular

Se mide la incorporación de [^{3}H]-timidina en el ADN de la manera siguiente: se suspenden linfocitos del agente de respuesta hasta 1 millón de células/ml en RPMI1640 que contiene un 10% de suero bovino fetal, antibióticos (estreptomicina/penicilina) y 2-mercaptoetanol 5 x 10^{-5} M. Se siembran cien \mul de estas células por triplicado en pocillos de una placa de microtitulación de fondo redondo (Costar). A continuación se preparan células del agente estimulante, que portan alo-antígeno, en una vía equivalente a la de la preparación de las células del agente de respuesta, pero que están irradiadas con 3000 R (fuente de ^{137}Cs) como paso previo a su utilización. Se añaden cien \mul de células del agente estimulante a las células del agente de respuesta y se incuba el cultivo de linfocitos mezclado a 37ºC, con un 5% de CO_{2}, durante 7 días. A continuación se añaden 10 \mul de [^{3}H]-timidina (0,5 mCi/ml, ICN Pharmaceuticals, Costa Mesa, Calif.) a cada pocillo durante 6 horas. La placa de microtitulación se somete a continuación a recolección, con utilización de una máquina cosechadora MASH, y se determina la cantidad de timidina incorporada por recuento de los pocillos recolectados en un dispositivo de recuento de escintilación líquida. El índice de estimulación (SI) se determina a continuación mediante el cálculo de la tasa cpm de la [^{3}H]-timidina incorporada en el cultivo de linfocitos mixto dividido por el cpm de la [^{3}H]-timidina incorporada en el cultivo de control (no estimulado). Puede utilizarse incorporación de anaranjado de acridina en lugar de la incorporación de la [^{3}H]-timidina.

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Ejemplo 19 Técnica para la identificación de los antígenos tumorales

Puede llevarse a cabo un SEREX, que es un enfoque de clonación serológico (análisis serológico de antígenos tumorales mediante clonación recombinante de expresión del ADNc), como se ha descrito por los autores Salim et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1995, 92: 11810-11813). Así mismo, puede verse la patente norteamericana U.S. No. 5,698,396, incorporada aquí como referencia. De conformidad con esta solicitud, se utiliza antisuero procedente de pacientes que han experimentado recientemente un alo-MBT para identificar los antígenos proteicos inmunógenos expresados en las células cancerosas mediante cribado de librerías de expresión construidas a partir de ADNc de células de leucemia de los pacientes. Se ha encontrado que los clones, que codifican el antígeno, identificados de este modo, son producidos con una respuesta inmune con elevado título humoral en el paciente, del cual han sido obtenidos los antisueros. Tal respuesta IgG de título elevado implica el reconocimiento por parte de las células T auxiliares del antígeno detectado y puede ser especialmente útil para evaluar los pacientes después de un alo-MBT. Los antígenos tumorales expresados pueden ser cribados entonces con respecto a la presencia de motivos de HLA clase I y clase II y con respecto a la reactividad con los CTLs. Se ha aplicado el SEREX a un rango de tipos tumorales y se ha clonado un número de nuevos productos génicos, inmunógenos, asociados con el cáncer (Tiireci et al., Mol. Med. Today 1997, 3: 342-349; Sahin et al., Curr. Opin. Immunol. 1997, 9: 709-716; Old et al., J. Exp. Med. 1998, 187: 1163-1167). De conformidad con esta solicitud, los antígenos detectados están específicamente relacionados con los alo-antígenos, que normalmente no son accesibles por este procedimiento, debido a la falta de respuestas anticuerpo dirigidas a los mismos.

TABLA 1A Antígenos con menor histocompatibilidad procedentes de humanos y de ratones caracterizados por variantes alélicas múltiples

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TABLA 1B Colección de antígenos humanos de menor histocompatibilidad caracterizados por los epitopos de las células T

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TABLA 2 Marcadores de la superficie celular en enfermedades hematológicas

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TABLA 3 Cambio de aminoácido en antígenos definidos por SNPs codificantes

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TABLA 4 Péptidos enlazantes de HLA clase I que representan cambios de aminoácido en CD42

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TABLA 5 Péptidos enlazantes de HLA que representan cambios de aminoácido en proteínas CD seleccionadas

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TABLA 6

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Claims (19)

1. Un procedimiento para proporcionar epitopos de variantes alélicas de péptidos o de proteínas antígenos procedentes de una especie específica basada en cambios de uno o de varios aminoácidos relacionados con el polimorfismo que codifica un solo nucleótido, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:

(i)

la definición de una proteína o de un péptido de interés o de un subconjunto de los mismos;

(ii)

el cribado de una base de datos que representa al menos dos o más librerías de ADN de dichas especies para dicho péptido o proteína definidos o un subconjunto de los mismos,

(iii)

la identificación y la selección de cambios de aminoácido de variantes alélicas de péptido/proteína, un producto de expresión o un fragmento de las mismas que es codificado por una secuencia de ADN que contiene, al menos, polimorfismo de un solo nucleótido en la región codificante,

(iv)

la creación de epitopos 8meros hasta 25meros, que comprenden el residuo de aminoácido que contiene dicho polimorfismo, y

(v)

la selección de aquellos epitopos que se enlacen con la proteína MHC.

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2. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que se ha producido o provocado un estado quimérico con respecto a las variantes alélicas mediante células alo-transplantadas, y las células del receptor expresan y presentan variantes alélicas diferentes de las del donante.

3. Un procedimiento según la reivindicación 1-2, en el que el péptido antígeno o la proteína antígena están relacionados con una enfermedad o con un desorden y dicha enfermedad o dicho desorden requiere transplante alogénico.

4. Un procedimiento según la reivindicación 3, en el que dicho péptido antígeno o proteína antígena son expresados en un tejido u órgano enfermo en comparación con las células del tejido u órgano normal.

5. Un procedimiento según la reivindicación 2 o 4, en el que dicha enfermedad o desorden es cáncer y dicho tejido u órgano enfermo es canceroso.

6. Un procedimiento según la reivindicación 5, en el que las células cancerosas del receptor han expresado la versión alélicas que era diferente de la de las células alo-transplantadas del donante.

7. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que la proteína MHC es una molécula HLA.

8. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que los epitopos creados en la etapa (iv) de la reivindicación 1, son péptidos 9meros a 16meros.

9. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que los epitopos inducen una respuesta inmune a la enfermedad injerto-versus-huésped (GVHD).

10. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que los epitopos inducen una respuesta inmune de injerto-versus-tumor (GVT).

11. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que dicha proteína o polipéptido de interés se elige entre los antígenos que han sido enumerados en las tablas 1 a 6.

12. Un procedimiento para la generación de un perfil SNP de uno o varios individuos de una especie dada, mediante la aplicación del procedimiento de la reivindicación 1 para una pluralidad de proteínas procedentes de dichos individuos.

13. Un procedimiento según la reivindicación 12, en el que dicho perfil SNP estaba relacionado con la enfermedad.

14. Un procedimiento según la reivindicación 13, en el que dicha enfermedad es cáncer.

15. Un procedimiento de diagnóstico de una enfermedad en un individuo mediante la generación de su perfil polimórfico relacionado con SNP con el procedimiento de la reivindicación 12.

16. Un procedimiento ex-vivo para determinar y seleccionar diferentes variantes alélicas de una proteína específica a partir de un primer individuo, comparada con la de un segundo individuo de la misma especie, deduciéndose dicha diferencia una condición patógena específica o enfermedad de uno de dichos individuos, comprendiendo el procedimiento las etapas siguientes:

(i)

la toma de una muestra del tejido o del órgano seleccionado del primer individuo así como del segundo individuo,

(ii)

el cribado de cada muestra para, al menos, un emparejamiento incorrecto de un solo aminoácido de variantes alélicas de dicha proteína, cuyo emparejamiento incorrecto se enlaza con la proteína HLA y es codificado por un único SNP o por un producto de expresión del mismo, o por un fragmento de este producto de expresión, y

(iii)

la selección de dichos emparejamientos incorrectos, que se producen únicamente en uno de los individuos.

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17. Un procedimiento según la reivindicación 16, en el que la muestra se deriva de tejido enfermo y el emparejamiento incorrecto de aminoácido se produce en el individuo que se encuentra en una condición patógena.

18. Un procedimiento según la reivindicación 17, en el que un péptido o polipéptido que representa dicho emparejamiento incorrecto de un solo aminoácido se enlaza únicamente, o de manera preferente, con la célula que presenta el antígeno o con la proteína HLA del individuo enfermo.

19. Un procedimiento según la reivindicación 18, en el que dicho péptido o polipéptido es reconocido por los linfocitos T citotóxicos (CTLs).