ES2256953T3 - Procedimiento de tipificacion del antigeno menor de histocompatibilidad ha-1. - Google Patents
Procedimiento de tipificacion del antigeno menor de histocompatibilidad ha-1.Info
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Abstract
EN LA PRESENTE INVENCION SE PRESENTA UN PROCEDIMIENTO PARA TIPIFICAR LOS ALELOS DEL ANTIGENO MENOR DE HISTOCOMPATIBILIDAD HA - 1 EN UNA MUESTRA QUE CONSISTE EN: A) PONER EN CONTACTO LOS ACIDOS POLINUCLEICOS GENOMICOS DE LA MUESTRA CON AL MENOS UN PAR DE IMPRIMADORES, CON LO QUE EL IMPRIMADOR 5'' Y/O 3'' DE DICHO PAR COMO MINIMO DE IMPRIMADORES SE HIBRIDA ESPECIFICAMENTE A REGIONES CIBLAS QUE COMPRENDEN NUCLEOTIDOS POLIMORFICOS EN DICHOS ALELOS Y LLEVAR A CABO UNA REACCION DE AMPLIFICACION; B) PARA CADA UNO DE DICHO PAR DE IMPRIMADORES SE DETECTA SI EN EL PASO A) SE HA FORMADO O NO UN PRODUCTO DE AMPLIFICACION; C) SE DEDUCE DEL RESULTADO DEL PASO B) QUE ALELO HA - 1 SE ENCUENTRA PRESENTE EN DICHA MUESTRA. EN LA PRESENTE INVENCION TAMBIEN SE PRESENTA UN PROCEDIMIENTO PARA LA TIPIFICACION GENOMICA DE ALELOS DEL ANTIGENO MENOR DE HISTOCOMPATIBILIDAD HA - 1 EN UNA MUESTRA QUE CONSISTE EN: A) AMPLIFICAR UN FRAGMENTO DE DICHOS ALELOS, COMPRENDIENDO DICHO FRAGMENTO AL MENOS UN NUCLEOTIDO POLIMORFICO,MEDIANTE EL USO DE AL MENOS UN PAR DE IMPRIMADORES QUE SE HIBRIDEN ESPECIFICAMENTE A REGIONES CIBLAS CONSERVADAS DE DICHOS ALELOS; B) SE HIBRIDA EL PRODUCTO AMPLIFICADO DEL PASO A) CON AL MENOS UNA SONDA QUE SE HIBRIDE ESPECIFICAMENTE A UNA REGION CIBLA QUE COMPRENDE UNO O MAS NUCLEOTIDOS POLIMORFICOS EN DICHO ALELO; C) SE DEDUCE DEL RESULTADO DEL PASO B) QUE ALELO HA - 1 SE ENCUENTRA PRESENTE EN DICHA MUESTRA. ADEMAS, EN LA PRESENTE INVENCION SE PRESENTAN IMPRIMADORES Y SONDAS A UTILIZAR EN LOS PROCEDIMIENTOS MENCIONADOS. TAMBIEN SE PRESENTAN KITS DE DIAGNOSTICO PARA LA REALIZACION DE DICHOS PROCEDIMIENTOS.
Description
Procedimiento de tipificación del Antígeno Menor
de Histocompatibilidad HA-1.
La presente invención se refiere al campo de la
tipificación del Antígeno Menor de Histocompatibilidad.
El transplante de la médula ósea (BMT), una de
las áreas que la invención trata y el área en la que se origina la
presente invención, encuentra su aplicación en el tratamiento de,
por ejemplo, diferentes enfermedades como anemia aplástica grave,
leucemia y enfermedades de inmunodeficiencia.
En los primeros días de esta técnica muchos
transplantes fracasaron debido al rechazo del injerto por el
huésped. Los transplantes que tuvieron éxito, sin embargo, a menudo
produjeron una respuesta inmune de los linfocitos presentes en el
injerto frente a los diversos tejidos del huésped (Enfermedad de
injerto frente e huésped (GvHD)). Se sabe en la actualidad que la
respuesta GvHD se debe principalmente a la presencia de antígenos
mayores de histocompatibilidad (H) que presentan una barrera al
transplante. Por tanto, resulta en la actualidad una práctica
rutinaria injertar únicamente materiales que emparejen HLA (tanto en
familiares como en individuos relacionados) dando como resultado un
índice muy mejorado de éxito en el transplante de la médula ósea.
Sin embargo, a pesar de esta mejora, así como a la mejora de la
quimioterapia o radioterapia pre-transplante y a la
disponibilidad de fármacos inmunosupresores potentes,
aproximadamente un 20-70% de los pacientes tratados
padecen todavía de GvHD (el porcentaje es dependiente de la edad y
del donante de médula ósea). Para evitar la GvHD se ha sugerido
eliminar las células (células T maduras) que producen dicha reacción
a partir del injerto. Esto sin embargo conduce a menudo a un
fracaso del injerto o a la recurrencia de la enfermedad original.
Las células responsables de la GvHD son también las células que
reaccionan a menudo frente a las células aberrantes originales en,
por ejemplo, la leucemia (respuesta injerto frente a leucemia).*
*Blasczyk y col (Tissue Antigens 1996; 47:
102-110) describen un procedimiento para la
tipificación basado en el secuenciamiento de los alelos
HLA-A. Los alelos HLA-A se
secuencian utilizando cebadores de secuenciamiento que se emparejan
con motivos de secuencia conservada.
Blasczyk y col (Tissue Antigens 1996; 47:
102-110) describen un procedimiento para la
tipificación basado en el secuenciamiento de los alelos
HLA-A. Los alelos HLA-A se
secuencian utilizando cebadores de secuenciamiento que se emparejan
con motivos de secuencia conservada.
Ya que el BMT se lleva a cabo en nuestros días
principalmente con injertos emparejados en HLA, la GvHD que se
sigue originando debe estar producida por otro grupo de antígenos.
Es muy probable que el grupo de los así denominados antígenos H
menores (mHag) que son antígenos de histocompatibilidad que no
codifican MHC (a diferencia de los antígenos H mayores) son al
menos responsables de manera parcial del resto de las incidencias
de GvHD. Se descubrieron los mHag en un principio en cepas
congénicas de ratón en estudios de rechazos tumorales y rechazo de
la piel. En ratones, el uso de cepas engendradas por endogamia ha
mostrado que los mHag se codifican por al menos 50 loci diferentes
alélicamente polimorfos dispersos a lo largo del genoma. En los
seres humanos, aunque complejos de identificar, se ha demostrado
que existen los mHag, pero su número global y complejidad permanece
incierta. Es probable que los antígenos H menores sean bastante
diferentes entre sí y bastante diferentes de los antígenos H
mayores, son de manera probable un grupo diverso y elusivo de
fragmentos de moléculas que están participando en diversas
funciones de mantenimiento celular. Su antigenicidad puede volverse
muy incidental, tal como los fragmentos de proteínas polimórficas
procesadas de manera natural que se asocian con productos MHC.
Algunos de los antígenos mH parecen expresarse de manera amplia en
diversos tejidos a lo largo del cuerpo mientras que otros muestran
una distribución de tejido limitada.
Uno de los antígenos menores de
histocompatibilidad mejor conocido es el antígeno
H-Y. H-Y es un antígeno mH que
puede conducir al rechazo de injertos de órganos y medula ósea
procedentes de machos con emparejamiento HLA en pacientes hembra, y
a una mayor incidencia de GvHD en injertos hembra a macho, de manera
particular si la donante hembra ha estado previamente embarazada.
El antígeno H-Y puede jugar también un papel en la
espermatogénesis. El antígeno H-Y humano es un
residuo de 11 péptidos derivado de SMCY, una proteína del cromosoma
Y conservada desde el punto de vista evolutivo. Otro antígeno mH
bien conocido que puede conducir a la GvHD es el antígeno
HA-2. El antígeno HA-2 es un residuo
de 9 péptidos que se deriva muy probablemente de una miosina de
clase I. Sin embargo, la naturaleza del antígeno
HA-1, responsable de la mayoría de los casos
actuales de GvHD sigue siendo elusiva. Los transplantes de médula
ósea humana llevados a cabo como tratamiento terapéutico de la
anemia aplástica grave, leucemia y enfermedad inmuno deficiente
fueron una realidad en los años setenta. En la actualidad, se han
mejorado mucho los resultados a largo plazo del transplante de
médula ósea alogénico (BMT) debido a la utilización de hermanos con
HLA emparejados como donantes de médula, la quimioterapia
pretransplante avanzada, el uso de potentes fármacos
inmunosupresores como profilaxis de la enfermedad Injerto frente a
huésped (GVHD), mejores antibióticos y procedimientos de
aislamiento. Sin embargo, los resultados del BMT clínico revelan
que la selección de donantes/pacientes idénticos en MHC no es una
garantía para evitar la GVHD o la supervivencia libre de enfermedad
incluso cuando el donante y el paciente están muy relacionados. El
BMT alogénico, de manera especial en adultos, da como resultado,
dependiendo de la cantidad de disminución de células T del injerto,
hasta el 80% de los casos de GVHD. En la situación HLA
genotípicamente idéntica, esto alcanza cantidades del
15-35%, mientras que en las combinaciones de
paciente/donante emparejadas con HLA fenotípico la incidencia de
GVHD es significativamente mayor, es decir, 50-80%.
Las disparidades en los antígenos menores de histocompatibilidad
(mHag) entre donante y paciente constituyen un riesgo potencial de
GVHD o de fracaso del injerto, que necesita la inmunosupresión
farmacológica a largo plazo en pacientes de transplantes de órganos
y médula ósea. Se cree también que los mHag están implicados en el
efecto secundario "beneficioso" de la GVHD, es decir, la
actividad Injerto frente a Leucemia. Diversos informes demuestran la
presencia de mHag anti huésped CTL específico en pacientes que
padecen de GVHD tras BMT HLA genotípicamente idéntico. En nuestro
laboratorio se trabajó mucho en la caracterización adicional de un
(pequeño) número de mHag anti huésped CTL específicos. Para ello,
se aislaron clones específicos para mHag huésped a partir de la
sangre periférica (PBL) de pacientes que padecían de GvHD grave. Se
obtuvieron originalmente clones CD8^{+} CTL mHag
HA-1 específicos tras reestimulación in vivo
de PBL cebados procedentes de tres pacientes que padecían de GvHD
tras BMT con HLA idéntico pero con mHag no idéntico. Se clonaron las
líneas post BMT CTL mediante dilución limitante, dando como
resultado el aislamiento de un gran número de clones CTL mHag
específicos. Los subsiguientes análisis inmunogenéticos revelaron
que los clones CTL (tal como se han descrito anteriormente)
identificaron cinco mHag no enlazados con el sexo, designados
HA-1, -2, -3, -4, -5, que se reconocen en una forma
clásica del MHC restringido. EL mHag HA-3 se
reconoce en presencia de HLA-A1 y mHag
HA-1, -2, -4 -5 requieren la presencia de
HLA-A-2. Los estudios de segregación
demostraron que cada mHag de HA-1 a
HA-5 es el producto de un gen único que se segrega
de forma mendeliana, y que HA-1 y
HA-2 no se codifican dentro de la región HLA. Los
mHag difieren uno respecto del otro en las frecuencias del
fenotipo: mHag aparece con relativa frecuencia (es decir, un 69%)
mientras que mHag HA-2 aparece con mucha frecuencia
(es decir, un 95%) en la población sana HLA-A2
positiva. Un inventario en cinco pacientes de respuestas CTL
específicas anti huésped mHag-1, -2, -3, -4 y -5
tras BMT demostró en 3 pacientes clones específicos para el mHag
HA-1. Esta observación apunta al comportamiento
inmunodominante del mHag HA-1. Con respecto al mHag
expresado en diferentes tejidos, observamos una distribución ubicua
frente a restringida en los tejidos del mHag analizado. La expresión
del mHag HA-1 está restringida a las células de la
línea celular hematopoiética, tales como timocitos, linfocitos de
sangre periférica, células B y monocitos. Igualmente, de la médula
ósea se derivan células que presentan el antígeno profesional: las
células dendríticas y las células de Langerhans epidérmicas expresan
el mHag Ha-1. El mHag Ha-1 se
expresa también en células precursoras leucémicas clonogénicas así
como en células leucémicas mieloides y linfoides aisladas de manera
reciente, indicando que las CTL mHag específicas son capaces de la
lisis antígeno específica restringida al HLA de clase I de las
células leucémicas. Para sustanciar la importancia de los sistemas
antigénicos mH humanos, investigamos si el mHag se conservaba en
evolución entre los primates humanos y no humanos. Para ello, se
transfectaron células procedentes de primates no humanos con el gen
HLAA2.1 humano. El análisis siguiente con nuestro alo
HLA-A-2.1 humano y cuatros clones
mhAg A2.1 CTL restringidos reveló la presentación de un alo de mono
antropomorfo y de mono y los péptidos mHag HY, HA-1
y HA-2 en el contexto de células diana de mono
antropomorfo y mono transfectadas por la molécula HLAA2.1 humana.
Esto implica que el péptido HA-1 se conservó
durante al menos 35 millones de años. Se llevó a cabo un estudio
prospectivo con el fin de documentar el efecto y la relevancia
clínica del mHag en el BMT genotípicamente idéntico en HLA respecto
de la incidencia de GVHD agudo (grado \geq 2). Los resultados de
la tipificación de mHag utilizando clones CTL específicos para
cinco mHag de Ha-1 a Ha-5, bien
definidos demostró una correlación significativa entre los mHag
HA-1, -2, -4 y -5 mal emparejados y la GVHD. Se
observó una correlación significativa (P = 0,024) con el desarrollo
de GVHD cuando se analizó para únicamente mHag HA-1.
Para analizar la supuesta naturaleza peptídica del mHag
HA-1, se analizó el requerimiento de los productos
del gen TAP1 y TAP2 por MHC respecto de la presencia del péptido
mhag sobre la superficie celular. Se necesitan los genes
transportadores TAP1 y TAP2 asociados con la presencia del antígeno
para la liberación de los péptidos desde el citosol con el retículo
endoplásmico. La disponibilidad de una línea celular humana
"T2" que carece de la subunidad génica de transporte como
proteosoma nos permite estudiar el procesamiento y la presencia del
mHag humano. Demostramos que se requerían los productos de los
genes de transporte (rat) TAP1 y TAP2u para el procesamiento y
presencia de los péptidos antigénicos de la proteína mH
intracelular HA-1. La información acerca del
repertorio de TCR post BMT en el hombre es extremadamente escasa.
Hemos analizado la composición de la región V del receptor de la
célula T (TCR) en los clones CD8+ CTL mHAG-1
específicos mediante secuenciamiento del ADN de las cadenas a y P.
Observamos analizando la utilización del TCR en 12 clones derivados
de 3 individuos no relacionados que todas las cadenas TcR\beta
utilizaron el segmento del gen TCR\betaV6S9 y mostraron
similaridades remarcables dentro de las regiones
N-D-N.
Sin embargo, hasta la presente invención nadie ha
tenido éxito en la identificación de secuencias de aminoácidos de
los péptidos antigénicos relevantes para el antígeno mHag
Ha-1, ni tampoco nadie ha tenido éxito en la
identificación de las proteínas de las cuales se deriva este
antígeno.
Es por tanto un objetivo de la presente invención
derivar la secuencia de aminoácidos del antígeno
HA-1.
Es también un objetivo de la presente invención
derivar la secuencia de ácido nucleico del antígeno
HA-1, de manera más particular el ADNc y las
secuencias genómicas que codifican los antígenos
HA-1.
Es también un objetivo de la presente invención
proporcionar cebadores y sondas que permitan la tipificación de los
antígenos HA-1.
Es también un objetivo de la presente invención
proporcionar conjuntos que permitan la tipificación de los antígenos
HA-1.
Los presentes inventores han identificado ahora
por primera vez un péptido que es una parte relevante de mHag
HA-1. Los presentes inventores han identificado
también la secuencia del ADNc así como las secuencias genómicas de
dos alelos HA-1.
Los presentes inventores describen por primera
vez un (poli) péptido que comprende un epítopo de célula T que se
obtiene a partir del antígeno menor de histocompatibilidad
HA-1 que comprende la secuencia VLXDDLLEA, o un
derivado de la misma, que tiene propiedades funcionales o
inmunológicas similares, en la que X representa una histidina (H) o
un residuo de arginina (R).
Las aplicaciones diagnósticas que se proponen en
esta invención incluyen, pero no se limitan a la tipificación de
HA-1, la detección de las aberraciones genéticas y
similares.
Sobre la base del péptido descrito en el presente
documento se produjeron sondas o cebadores genéticos que se pueden
usar para seleccionar el gen que codifica la proteína. Sobre la base
del péptido descrito en el presente documento se pueden producir
células B y/o células T y anticuerpos antiidiotípicos. Se pueden
utilizar diversas técnicas para permitir la detección de donantes o
pacientes adecuados, basándose en la amplificación de las
secuencias de ácido nucleico relacionadas con HA-1 o
sobre la detección inmunológica de las secuencias con las de
péptidos relacionados con HA-1 como se establecerá
de forma adicional.
De acuerdo con una forma de realización, la
presente invención se refiere a un procedimiento para tipificar los
alelos del antígeno menor de histocompatibilidad
HA-1 en una muestra que comprende la detección de
nucleótidos polimórficos, en el ADNc o los ácidos nucleicos
genómicos de dichos alelos, de manera más particular los alelos H y
R de HA-1 como se establecerá en la Figura 5.
En una forma de realización preferente dicho
procedimiento de tipificación será un procedimiento de tipificación
del ADN genómico. De manera alternativa, dicho procedimiento puede
ser también un procedimiento de tipificación del ADNc.
Otra forma de realización de la presente
invención se refiere a la tipificación genómica de los alelos del
Antígeno Menor de Histocompatibilidad HA-1 en una
muestra, comprendiendo dicho procedimiento:
- a)
- poner en contacto los ácidos polinucleicos genómicos en la muestra con al menos un par de cebadores, en los que los cebadores 5'- y/o 3' de al menos un par de cebadores se hibridan de manera específica con las regiones diana que comprenden nucleótidos polimórficos en dichos alelos, y llevan a cabo una reacción de amplificación;
- b)
- para cada uno de al menos dicho par de cebadores que detectan o no si en la etapa a) se forma un producto de amplificación;
- c)
- inferir a partir del resultado de la etapa b) que el alelo HA-1 está presente en dicha muestra.
De acuerdo con una forma de realización
preferida, la presente invención se refiere a un procedimiento tal
como se ha descrito anteriormente, caracterizado de manera adicional
por que dichos alelos del Antígeno Menor de Histocompatibilidad
HA-1 son el alelo H y el alelo R tal como se muestra
en la Figura 5.
La presente invención enseña que, de manera
inesperada, los cebadores usados en el procedimiento
RT-PCR, no conducen a la amplificación de un
fragmento de ácido polinucleico específico cuando se utiliza ADN
genómico como molde. Para resolver este problema, la presente
invención describe también la estructura genómica del locus
HA-1. Tal como se detalla en el Ejemplo 3, el
análisis de la estructura genómica muestra que el péptido
HA-1 se codifica mediante dos exones (figura 5). Se
localiza un emplazamiento donante de empalme cuatro nucleótidos
después del codón polimórfico en la secuencia de codificación
HA-1. Por tanto, el establecimiento de un
procedimiento para la tipificación genómica del antígeno
HA-1 requiere información de la secuencia del intrón
que interrumpe la secuencia de codificación de
HA-1. Esta secuencia de información se proporciona
por la presente invención y se muestra a continuación como SEC ID Nº
1.
\newpage
Esta secuencia representa parte del intrón de
interrupción (indicado como intrón a en la figura 5), siendo el
primer nucleótido de esta secuencia el primer nucleótido del intrón
a. La presente invención puede utilizar también de esta manera un
ácido polinucleico aislado identificado mediante la SEC ID Nº 1, o
un ácido polinucleico aislado que presenta al menos un 80%, o al
menos un 90%, o al menos un 95%, o al menos un 99% de homología de
secuencia con la SEC ID Nº 1, o cualquier fragmento de dichos ácidos
polinucleicos como cebador o como sonda.
Se ha descrito en la base de datos EMBL la
secuencia de información que corresponde a otra parte del intrón a,
de manera particular la parte que se sitúa enfrente del exón b
(figura 5) bajo número de acceso AC004151. Sin embargo esta
secuencia no es adecuada para el diseño de cebadores para el
procedimiento anteriormente mencionado, debido a que la longitud del
fragmento amplificado podría disminuir la eficacia de la reacción de
amplificación.
La presente invención se refiere también al ácido
polinucleicco aislado identificado mediante la SEC ID Nº 17 (alelo
HA-1 R) o un ácido polinucleico aislado que presenta
al menos un 80%, o al menos un 90%, o al menos un 95%, o al menos
un 99% de homología de secuencia con la SEC ID Nº 17, o cualquier
fragmento de dicho ácido polinucleico que se pueda utilizar como
cebador o como sonda.
La presente invención se refiere también al ácido
polinucleico aislado identificado mediante la SEC ID Nº 19 (alelo
HA-1 H), o un ácido polinucleico aislado que
presenta al menos un 80%, o al menos un 90%, o al menos un 95%, o
al menos un 99% de homología de secuencia con la SEC ID Nº 19, o
cualquier fragmento de dicho ácido polinucleico que se pueda
utilizar como cebador o como sonda.
Para la detección del producto de amplificación
mencionado en la etapa b anterior, se pueden utilizar diferentes
procedimientos conocidos en la técnica. Un procedimiento consiste en
someter la mezcla obtenida tras la reacción de amplificación a
electroforesis en gel y detectar de manera visual el producto de
amplificación tras la tinción del ácido nucleico. De manera
alternativa se puede marcar el producto de la amplificación
utilizando por ejemplo cebadores marcados, y se puede capturar
sobre el soporte sólido, por ejemplo mediante hibridación, y se
puede detectar sobre un soporte sólido. Está claro, sin embargo, que
quedan dentro del alcance de la presente invención otros
procedimientos de detección.
De acuerdo con una forma de realización más
preferida, la presente invención se refiere a un procedimiento tal
como se ha indicado anteriormente, caracterizado de manera adicional
porque:
al menos un par de dichos cebadores comprenden un
cebador 5' que se hibrida de manera específica con una región diana
que comprende los nucleótidos en la posición 4 o en las posiciones 4
y 8 en el alelo HA-1, o
al menos un par de dichos cebadores comprenden un
cebador 3' que se hibrida de manera específica con una región diana
que comprende los nucleótidos en la posición 8 o en las posiciones 4
y 8 en el alelo HA-1, siendo indicadas dichas
posiciones en la figura 5.
De acuerdo con una forma de realización incluso
más preferida, la presente invención se refiere a un procedimiento
tal como se ha indicado anteriormente, caracterizado de manera
adicional porque:
se combina dicho cebador 5'- con un cebador 3'-
que se hibrida de manera específica con una región diana en el
intrón a, y/o
se combina dicho cebador 3'- con un cebador 5'-
que se hibrida de manera específica con una región diana en el exón
a,
indicándose el intrón a y el exón a en la figura
5.
De acuerdo con esta forma de realización, dicha
región diana en el intrón se localiza de manera ideal en la
secuencia identificada mediante la SEC ID Nº 1, como se ha detallado
anteriormente. También la región diana de dicho cebador 3'- que se
combina con un cebador 5'- se hibrida de manera específica con una
región diana en el exón a se solapará necesariamente con la
secuencia identificada mediante SEC ID Nº 1.
De acuerdo con una forma de realización incluso
más preferida, la presente invención se refiere a un procedimiento
tal como se ha indicado anteriormente caracterizado de manera
adicional porque los cebadores se escogen de la
Tabla 1:
Tabla 1:
Nombre | Secuencia (5' a 3') | SEC ID Nº |
Conjunto 1 | ||
C-hacia delante | GTGCTGCCTCCTGGACACTG | 2 |
H-hacia atrás | TGGCTCTCACCGTCATGCAG | 3 |
R-hacia atrás | TGGCTCYCACCGTCACGCAA | 4 |
Conjunto 2 | ||
C-hacia atrás | GCATTCTCTGTTTCCGTGTT | 5 |
H-hacia delante | CTTAAGGAGTGTGTGCTGCA | 6 |
R-hacia atrás | CTTAAGGAGTGTGTGTTGCG | 7 |
El conjunto 1 está constituido por un cebador 5'-
común (hacia delante) y dos cebadores 3'- diferentes (hacia atrás),
uno para el alelo H y uno para el alelo R. La región diana del
cebador 5'- común se localiza en el exón a. La región diana de los
cebadores 3'- comprende los nucleótidos polimórficos en las
posiciones 4 y 8 en la secuencia de codificación
HA-1 (figura 5) y se solapa de forma parcial con la
secuencia identeficada mediante SEC ID Nº 1. El conjunto 2 está
constituido por un cebador 3'- común y dos cebadores 5'- diferentes.
La región diana del cebador común se localiza en la ausencia
identificada mediante la SEC ID Nº 1, mientras que las regiones
diana de los cebadores 5' se localizan en el exón a y comprende los
nucleótidos polimórficos en las posiciones 4 y 8. El ejemplo 6
muestra un experimento de tipificación genómica que hace uso de
estos conjuntos de cebadores.
De acuerdo con otra forma de realización
preferida, la presente invención se refiere a un equipo diagnóstico
para la tipificación genómica de los alelos del Antígeno menor de
Histocompatibilidad HA-1 de acuerdo con cualquiera
de los procedimientos indicados anteriormente, comprendiendo dicho
conjunto:
a) al menos un cebador capaz de hibridarse de
manera específica con las regiones diana que comprenden los
nucleótidos polimórficos en dichos alelos, en los que dichos
nucleótidos polimórficos se detectan en una región de di-
cho alelo que se corresponde con la SEC ID Nº 17 o 19 en, de manera respectiva, el alelo HA-1 R o el alelo HA-1 H;
cho alelo que se corresponde con la SEC ID Nº 17 o 19 en, de manera respectiva, el alelo HA-1 R o el alelo HA-1 H;
b) de manera opcional, un enzima y/o los
reactivos que permiten la reacción de amplificación;
c) de manera opcional, los medios que permiten la
detección de los productos amplificados.
De acuerdo con otra forma de realización
preferida, la presente invención se refiere a un procedimiento para
la tipificación genómica de los alelos del Antígeno Menor de
Histocompatibilidad HA-1 en una muestra,
comprendiendo dicho procedimiento:
- a)
- amplificar un fragmento de dichos alelos, dicho fragmento comprende al menos un nucleótido polimórfico, mediante el uso de al menos un par de cebadores que se hibridan de manera específica con las regiones dianas conservadas en dichos alelos;
- b)
- hibridar el producto amplificado de la etapa a) con al menos una sonda que se hibrida de manera específica con una región diana que comprende uno o más nucleótidos polimórficos en dicho alelo;
- c)
- inferir a partir del resultado de la etapa b) que el alelo HA-1 está presente en dicha muestra.
De acuerdo con una forma de realización más
preferida, la presente invención se refiere a un procedimiento tal
como se ha indicado anteriormente caracterizado de manera adicional
porque dichos alelos del Antígeno Menor de Histocompatibilidad
HA-1 son el alelo H y el alelo R.
De acuerdo con una forma de realización incluso
más preferida, la presente invención se refiere a un procedimiento
tal como se ha indicado anteriormente caracterizado de manera
adicional porque al menos uno de dicho par de cebadores comprende un
cebador 5'- que se hibrida de manera específica con una región diana
conservada en el exón a y/o un cebador 3' que se hibrida de manera
específica con una región diana conservada en el intrón a, estando
indicados el exón a y el intrón a en la figura 5.
De manera ideal, la región diana de dicho cebador
3'- se localiza en la secuencia identificada como SEC ID Nº 1. De
manera obvia, la región diana de dicho cebador 3'- se puede
localizar también corriente abajo de esta secuencia, es decir, en
el intrón a, intrón b, exón b, o incluso corriente abajo del exón b,
pero la eficacia de la reacción de amplificación es probable que
sea menor a medida que el fragmento amplificado se hace más largo.
De acuerdo con una forma de realización incluso más preferida, la
presente invención se refiere a un procedimiento tal como se ha
indicado anteriormente caracterizado de manera adicional porque al
menos una de dicha sonda se hibrida de manera específica con una
región diana que comprende los nucleótidos en la posición 4 y/u 8 en
el alelo HA-1, estando indicadas dichas posiciones
en la figura 5.
De acuerdo con una forma de realización incluso
más preferida, la presente invención se refiere a un procedimiento
tal como se ha indicado anteriormente caracterizado de manera
adicional porque dichos cebadores y/o dichas sondas se escogen de la
Tabla 2.
Nombre | Secuencia (5' a 3') | SEC ID Nº |
Cebadores | ||
5P1 (0 C-hacia delante) | GTGCTGCCTCCTGGACACTG | 2 |
3P1 | GCTCTCATGGCCTCTTCCAC | 8 |
3P2 | GCATTCTCTGTTTCCGTGTT | 9 |
3P3 | GGCAGAGAGCCCTCGCAGCC | 10 |
Sondas | ||
HA1-R1(1) | GTGTGTTGCGTGACGGTG | 11 |
HA1-R1(2) | GTGTGTTGCGTGACG | 12 |
HA1-R1(3) | TGTGTGTTGCGTGACG | 13 |
HA1-H1(1) | TGTGTGCTGCATGACGGTG | 14 |
HA1-H1(2) | TGTGTGCTGCATGACGGT | 15 |
HA1-H1(3) | GTGTGCTGCATGACGGTG | 16 |
Los cebadores 3P1 y 3P2 se hibridan de manera
específica con las regiones diana en la SEC ID Nº 1. La región
diana del cebador 3P3 se localiza corriente abajo del exón b. Todas
las sondas de la Tabla 2 se hibridan de manera específica con
regiones diana que se solapan con la frontera exón
a-intrón a. Se han optimizado las sondas con las
SEC ID Nº 11 a 16 para funcionar en combinación en las mismas
condiciones en un ensayo LIPA (véase a continuación). La persona
experta reconocerá que las sondas y cebadores con las SEC ID Nº 2 a
16 se pueden adaptar mediante la adición o supresión de uno o más
nucleótidos en sus extremidades. Se pueden requerir dichas
adaptaciones si se cambian las condiciones de amplificación o
hibridación, o si el material amplificado es ARN en lugar de ADN,
como es el caso en el sistema NASBA. Se pueden aplicar diferentes
técnicas para llevar a cabo los procedimientos de hibridación de
secuencia específica de la presente invención. Estas técnicas
pueden comprender inmovilizar los ácidos polinucleicos
HA-1 amplificados sobre un soporte sólido y llevar
a cabo la hibridación con sondas de oligonucleótidos marcados.
Pueden inmovilizarse también los ácidos polinucleicos genómicos
sobre un soporte sólido sin mayor amplificación y someterse a
hibridación. De manera alternativa, se pueden inmovilizar las
sondas sobre un soporte sólido y se puede llevar a cabo la
hibridación con ácidos polinucleicos HA-1 marcados,
de manera preferible tras la amplificación. Esta técnica se denomina
hibridación inversa. Una técnica de hibridación inversa conveniente
es el ensayo de la sonda en línea (LiPA). Este ensayo utiliza
sondas de oligonucleótidos inmovilizados en forma de líneas
paralelas sobre una banda de soporte sólido (Stuyver y col., 1993).
Se entiende que cualquier otra técnica para la tipificación genómica
de los alelos HA-1 está también cubierta por la
presente invención.
Está claro que la presente invención se refiere
también a cualquiera de los cebadores con las SEC ID Nº 2 a 10 y a
cualquiera de las sondas con las SEC ID Nº 11 a 16, siendo dichos
cebadores y dichas sondas para uso en un procedimiento para la
tipificación genómica de los alelos del Antígeno Menor de
Histocompatibilidad HA-1.
De acuerdo con otra forma de realización
preferida, la presente invención se refiere a un equipo diagnóstico
para la tipificación genómica de los alelos del Antígeno Menor de
Histocompatibilidad HA-1 de acuerdo con cualquiera
de los procedimientos de hibridación de secuencia específica
indicados anteriormente, comprendiendo dicho equipo:
- a)
- al menos un cebador que se hibrida de manera específica con las regiones diana sin nucleótidos polimórficos en dichos alelos;
- b)
- al menos una sonda que se hibrida de manera específica con una región diana que comprende uno o más nucleótidos polimórficos en dicho alelo, en la que dichos nucleótidos polimórficos se detectan en una región de dicho alelo que corresponde a la SEC ID Nº 17 ó 19 en, de manera respectiva, el alelo HA-1 R o el alelo HA-1 H;
- c)
- de manera opcional, un enzima y/o reactivos que permitan la reacción de amplificación, y/o reactivos que permiten la reacción de hibridación.
De acuerdo con otra forma de realización
preferida, la presente invención se refiere a un equipo diagnóstico
para la tipificación genómica de los alelos del Antígeno Menor de
Histocompatibilidad HA-1 de acuerdo con cualquiera
de los procedimientos de hibridación de secuencia específica
indicados anteriormente, comprendiendo dicho equipo:
- a)
- al menos un cebador capaz de hibridarse de manera específica con las regiones diana sin nucleótidos polimórficos en dichos alelos;
- b)
- al menos un cebador capaz de hibridarse de manera específica con una región diana que comprende uno o más nucleótidos polimórficos en dicho alelo, en la que dichos nucleótidos polimórficos se detectan en una región de dicho alelo que corresponde con la SEC ID Nº 17 ó 19 en, de manera respectiva, el alelo HA-1 R o el alelo HA-1 H;
- c)
- de manera opcional, un enzima y/o reactivos que permitan la reacción de amplificación, y/o los reactivos que permitan la reacción de hibridación.
De acuerdo con otra forma de realización, la
presente invención se refiere también a un procedimiento para la
tipificación de los alelos del Antígeno Menor de Histocompatibilidad
HA-1 por medio del secuenciamiento de dicho
alelo.
De acuerdo con otra forma de realización, la
presente invención se refiere también a los equipos para llevar a
cabo dicho procedimiento de secuenciación.
De acuerdo con otra forma de realización, la
presente invención se refiere también a un procedimiento para la
tipificación de los alelos HA-1 que comprende la
utilización de anticuerpos que detectan de manera específica los
alelos HA-1 que se muestran en la Figura 5. Dichos
anticuerpos serán de manera preferible anticuerpos monoclonales y se
pueden producir por cualquier procedimiento conocido en la
técnica.
De acuerdo con otra forma de realización, la
presente invención se refiere también a un equipo diagnóstico para
la tipificación de los alelos HA-1 que comprende la
utilización de anticuerpos que detectan de manera específica los
alelos HA-1 que se muestran en la Figura 5.
Las siguientes definiciones y explicaciones
permitirán una mejor comprensión de la presente invención.
El material diana en las muestras que se van a
analizar será el ADN genómico o las versiones amplificadas del
mismo. Estas moléculas se denominan también en esta aplicación
"ácidos polinucleicos". Están disponibles procedimientos de
extracción y purificación bien conocidos para el aislamiento del ARN
o el ADN de una muestra (por ejemplo en Sambrook y col., 1989).
Un "nucleótido polimórfico" se refiere a un
nucleótido de la secuencia de un alelo HA-1 dado que
difiere en al menos uno de los nucleótidos que se encuentran en la
posición correspondiente en otros alelos HA-1.
El término "tipificación" de un alelo
HA-1 se refiere a la identificación del alelo, es
decir, la detección del alelo y la discriminación del alelo de otros
alelos HA-1.
El término "sonda" de acuerdo con la
presente invención se refiere a un oligonucleótido de cadena única
que se diseña para hibridarse de manera específica con los ácidos
polinucleicos HA-1. De manera preferible, las sondas
de la invención son de aproximadamente 5 a 50 nucleótidos de
longitud, de manera más preferible de aproximadamente 10 a 30
nucleótidos. Las longitudes particularmente preferidas de las sondas
incluyen, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23,
24, 25, 26, 27, 28, 29 ó 30 nucleótidos. Los nucleótidos, tal como
se utilizan en la presente invención pueden ser ribonucleótidos,
desoxirribonucleótidos, y nucleótidos modificados tales como
inosina o nucleótidos que contienen grupos modificados que no
alteran de manera esencial sus características de hibridación.
El término "cebador" se refiere a una
secuencia de oligonucleótido de cadena única capaz de actuar como un
punto de iniciación para la síntesis de un producto de extensión del
cebador que es complementario de la cadena de ácido nucleico que se
va a copiar. La longitud y la secuencia del cebador deben ser tales
que permitan cebar la síntesis de los productos de extensión. De
manera preferible el cebador tiene aproximadamente
5-50 nucleótidos de longitud. La longitud y
secuencia específica dependerán de la complejidad del ADN o ARN
dianas requeridos, así como de las condiciones en las cuales se
utiliza el cebador, tales como la temperatura y la fuerza iónica. Se
entiende que los cebadores de la presente invención que se pueden
utilizar como sondas y viceversa, siempre que se adapten las
condiciones experimentales.
La expresión "pareja de cebadores adecuada"
en esta invención se refiere a una pareja de cebadores que permiten
la amplificación específica de un fragmento de ácido polinucleico
HA-1.
El término "región diana" de una sonda o un
cebador de acuerdo con la presente invención es una secuencia en el
interior de los ácidos polinucleicos HA-1 de los que
la sonda o el cebador son completamente complementarios o
parcialmente complementarios (es decir, con algún grado de mal
emparejamiento). Se entiende que el complemento de dicha secuencia
diana es también una secuencia diana adecuada en algunos casos.
La "Hibridación específica" de una sonda con
una región diana de los ácidos polinucleicos HA-1
significa que dicha sonda forma un dúplex con parte de esta región
o con la región completa bajo las condiciones experimentales
utilizadas, y que bajo aquellas condiciones dicha sonda no forma un
dúplex con otras regiones de los ácidos polinucleicos presentes en
la muestra que se va a analizar. La "Hibridación específica" de
un cebador con una región diana de los ácidos polinucleicos
HA-1 significa que, durante la etapa de
amplificación, dicho cebador forma un dúplex con parte de esta
región o con la región completa bajo las condiciones experimentales
utilizadas, y que bajo aquellas condiciones dicho cebador no forma
un dúplex con otras regiones de los ácidos polinucleicos presentes
en la muestra que se va a analizar. Se comprende que "dúplex",
tal como se usa por la presente, significa un dúplex que conducirá a
la amplificación específica.
La "Amplificación específica" de un
fragmento de ácidos polinucleicos HA-1 significa la
amplificación del fragmento para el cual se designaron los
cebadores, y no de cualquier otro fragmento de los ácidos
polinucleicos que esté presente en una muestra.
El hecho de que los cebadores de amplificación no
tengan que emparejarse de manera exacta con la correspondiente
secuencia diana en el molde para garantizar una amplificación
apropiada está ampliamente documentado en la bibliografía (Kwok y
col., 1990). Sin embargo, cuando los cebadores no son completamente
complementarios con su secuencia diana, deberá tenerse en cuenta
que los fragmentos amplificados tendrán la secuencia de los
cebadores y no la de la secuencia diana. Se pueden marcar los
cebadores con un marca de elección (por ejemplo, biotina). El
procedimiento de amplificación utilizado puede ser bien la reacción
en cadena de la polimerasa (PCR; Saiki y col., 1988), la reacción
en cadena de la ligasa (LCR; Langren y col., 1988; Wu & Wallace,
1989; Barany, 1991), la amplificación basada en la secuencia del
ácido nucleico (NASBA; Guatelli y col., 1990; Compton, 1991), el
sistema de amplificación basado en la transcripción (TAS; Kwoh y
col., 1989), la amplificación del desplazamiento de cadena (SDA;
Duck, 1990) o la amplificación por medio de la Qb replicasa (Lomeli
y col., 1989) o cualquier otro procedimiento adecuado para
amplificar las moléculas de ácido nucleico conocido en la
técnica.
Se representan a lo largo de la memoria las
secuencias de la sonda y el cebador en forma de oligonucleótidos de
ADN de cadena única desde el extremo 5' al 3'. Es obvio para una
persona experta en la técnica que cualquiera de las sondas
especificadas a continuación puede ser utilizada como tal, o en su
forma complementaria, o en su forma de ARN (en la que T se sustituye
por U).
Las sondas de acuerdo con la invención se pueden
preparar mediante clonación de los plásmidos recombinantes que
contienen insertos que incluyen las secuencias de nucleótidos
correspondientes, si se necesita mediante excisión de la última a
partir de los plásmidos clonados mediante la utilización de las
nucleasas adecuadas y recuperando éstas, por ejemplo, mediante
fraccionamiento de acuerdo con el peso molecular. Se pueden
sintetizar también químicamente las sondas de acuerdo con la
presente invención, por ejemplo, mediante el procedimiento
convencional del fosfo-triéster.
Los oligonucleótidos utilizados como cebadores o
sondas pueden comprender también análogos de nucleótidos tales como
fósforotiatos (Matsukura y col., 1987), alcilfósforotiatos (Miller y
col., 1979) o péptidos de ácidos nucleicos (Nielsen y col., 1991;
Nielsen y col., 1993) o pueden contener agentes intercalantes
(Asseline y col., 1984). Como la mayoría de las diferentes
variaciones o modificaciones introducidas en las secuencias de ADN
originales de la invención, estas variaciones necesitarán
adaptaciones con respecto a las condiciones bajo las cuales se van a
utilizar los oligonucleótidos para obtener la especificidad y la
sensibilidad requerida. Sin embargo, los resultados eventuales de
la hibridación serán esencialmente los mismos que aquellos obtenidos
con los oligonucleótidos sin modificar. Puede ser ventajosa la
introducción de estas modificaciones con el fin de influenciar de
manera positiva características tales como la cinética de
hibridación, la reversibilidad de la formación del híbrido, la
estabilidad biológica de las moléculas de oligonucleótidos, etc.
El término "soporte sólido" puede referirse
a cualquier sustrato al cual se puede acoplar una sonda de
oligonucleótido, siempre que esta retenga sus características de
hibridación y siempre que el nivel de fondo de la hibridación
permanezca bajo. Usualmente el sustrato sólido será una placa de
microvaloración, una membrana (por ejemplo de nylon o
nitrocelulosa) o una microesfera (perla) o una oblea. Antes de la
aplicación a la membrana o la fijación puede ser conveniente
modificar la sonda de ácido nucleico con el fin de facilitar la
fijación o mejorar la eficiencia de la hibridación. Dichas
modificaciones pueden abarcar la cola del homopolímero, acoplándose
con diferentes grupos reactivos tales como grupos alifáticos, grupos
NH_{2}, grupos SH, grupos carboxílicos, o acoplándose con
biotina, haptenos o proteínas.
El término "marcado" se refiere al uso de
ácidos nucleicos marcados. La marcación se puede llevar a cabo
mediante la utilización de nucleótidos marcados incorporados
durante la etapa de la polimerasa de la amplificación, tal como se
ilustra por Saiki y col. (1988) o Bej y col. (1990), o cebadores
marcados, o por cualquier otro procedimiento conocido por las
personas expertas en la técnica. La naturaleza de la marca puede ser
isotópica (^{32}P, ^{35}S, etc), o no isotópica (biotina,
digoxigenina, etc).
La "muestra biológica" puede ser por ejemplo
sangre, hisopos de algodón de la boca o cualquier otra muestra que
comprenda ADN genómico.
Para diseñar sondas con características deseadas
se pueden aplicar las siguientes directrices útiles conocidas por
las personas expertas en la técnica.
Debido a que la extensión y especificidad de las
reacciones de hibridación tales como descritas en el presente
documento se ven afectadas por numerosos factores, la manipulación
de uno o más de estos factores determinará la sensibilidad y
especificidad exactas de una sonda particular, ya sea perfectamente
complementaria con su diana o no. Se explican de manera adicional
en el presente documento la importancia y el efecto de diversas
condiciones de ensayo.
**Deberá escogerse la estabilidad del híbrido de
ácido nucleico [sonda : diana] para que sea compatible con las
condiciones de ensayo. Esto puede llevarse a cabo evitando las
secuencias ricas en AT largo, terminando los híbridos con pares de
bases G:C, y diseñando la sonda con una Tm apropiada. Deberán
escogerse los puntos de comienzo y fin de la sonda de tal manera
que la longitud y el % de GC den como resultado una Tm
aproximadamente 2-10ºC mayor que la temperatura a
la cual se llevará a cabo el ensayo final. Es significativa la
composición de bases de la sonda debido a que los pares de bases
G-C presentan mayor estabilidad térmica en
comparación a los pares de bases A-T debido al
enlace de hidrógeno adicional. De esta manera, la hibridación que
implica ácidos nucleicos complementarios de mayor contenido en
G-C será más estables a temperaturas más altas.
**Deberán tenerse también en cuenta condiciones
tales como la fuerza iónica y la temperatura de incubación bajo la
cual se utilizará la sonda cuando se diseña una sonda. Se sabe que
el grado de hibridación aumentará tanto como aumente la fuerza
iónica de la mezcla de reacción, y que la estabilidad térmica de los
híbridos aumentará con el incremento de la fuerza iónica. Por otra
parte, los reactivos químicos, tales como la formamida, urea, DMSO
y alcoholes, que interrumpen los enlaces de hidrógeno, aumentarán el
rigor de la hibridación. La desestabilización de los enlaces de
hidrógeno por dichos reactivos puede reducir mucho la Tm. De manera
general, la hibridación óptima en sondas de oligonucleótidos
sintéticos de aproximadamente 10-50 bases de
longitud se produce aproximadamente 5ºC por debajo de la
temperatura de fusión para un dúplex dado. La incubación a
temperaturas por debajo de la óptima puede permitir un mal
emparejamiento de las secuencias de bases a hibridar y puede por
tanto dar como resultado una especificidad reducida.
**Es deseable tener sondas que se hibriden
únicamente bajo condiciones de rigor alto. Bajo condiciones de
rigor alto únicamente se formarán híbridos de ácidos nucleicos
complementarios; no se formarán híbridos sin un grado suficiente de
complementariedad. De acuerdo con esto, el rigor de las condiciones
de ensayo determina la cantidad de complementariedad necesaria
entre dos cadenas de ácido nucleico que forman un híbrido. El grado
de rigor se escoge de manera que maximice la diferencia de
estabilidad entre el híbrido formado con la diana y el ácido
nucleico sin diana.
**Son menos preferidas las regiones en el ADN o
ARN diana que se sabe que forman estructuras internas fuertes
inhibitorias de la hibridación. Asimismo deberán evitarse las sondas
con autocomplemetariedad extensiva. Tal como se ha detallado
anteriormente la hibridación es la asociación de dos cadenas únicas
de ácidos nucleicos complementarios para formar una doble cadena
con enlaces de hidrógeno. Es implícito que si una de las dos cadena
está completa o parcialmente implicada en un híbrido será menos
capaz de participar en la formación de un nuevo híbrido. Pueden
existir híbridos intramoleculares e intermoleculares formados en el
interior de las moléculas de un tipo de sonda si existe suficiente
autocomplementariedad. Se pueden evitar dichas estructuras mediante
un diseño cuidadoso de la sonda. Diseñando una sonda de tal manera
que una porción sustancial de la secuencia de interés sea una
cadena única, se puede aumentar mucho la velocidad y extensión de la
hibridación. Están disponibles programas de ordenador para
investigar este tipo de interacción. Sin embargo, en ciertos
ejemplos, no puede ser posible evitar este tipo de interacción.
Se describen en la sección de Materiales y
Procedimientos de los Ejemplos las condiciones de hibridación
estándar y de lavado. Otras condiciones son por ejemplo 3 X SSC
(Solución Salina de Citrato de Sodio), FA (Formamida) desionizada al
20% a 50ºC. Se pueden utilizar también otras soluciones (SSPE
(Solución salina de fosfato de sodio EDTA), TMAC (Cloruro de
Tetrametilamonio), etc.) y temperaturas siempre que se mantengan la
especificidad y la sensibilidad de las sondas. Cuando se necesite,
se tienen que llevar a cabo modificaciones ligeras en longitud o en
secuencia de las sondas para mantener la especificidad y la
sensibilidad requerida bajo las circunstancias dadas.
El término "tampón de hibridación" significa
un tampón que permite una reacción de hibridación entre las sondas
y los ácidos polinucleicos presentes en la muestra, o los productos
amplificados, bajo las condiciones de rigor apropiadas.
El término "solución de lavado" significa
una solución que permite el lavado de los híbridos formados bajo las
condiciones de rigor apropiadas.
Tabla
1
Secuencia de cebadores utilizados para la
tipificación genómica de los alelos HA-1 mediante
amplificación de la secuencia específica.
Tabla
2
Secuencia de cebadores y sondas utilizados para
la tipificación genómica de los alelos HA-1 mediante
amplificación e hibridación de la secuencia específica.
Tabla
3
Tipificación celular y genómica para
HA-1 en tres familias HLA-A*0201
positivas.
Tabla
4
Comparación de la tipificación celular y genómica
mediante PCR o LiPA de HA-1 en la familia 1.
Tabla
5
Polimorfismo de la secuencia KIAA0223 en
individuos mH HA-1 positivo y HA-1
negativo. El secuenciamiento de la región HA-1 en el
gen KIAA0223 en individuos homocigóticos HA-1 +/+ y
HA-1 -/- y KG-1 reveló dos alelos
que diferían en dos nucleótidos, dando como resultado una diferencia
en un aminoácido (de H a R) y se designó HA-1^{H}
y HA-1^{R}. Se secuenciaron productos PCR
independientes para DH y vR6. Se secuenciaron los productos PCR para
KG-1 8.
Figura
1
Reconstitución de HA-1 con
péptidos fraccionados mediante HPLC eluidos de moléculas
HLA-A2.1 en un ensayo de liberación de ^{51}Cr con
mH HA-1 específico del clon de células T 3HA15.
a. Se eluyeron los péptidos a partir de
90.10^{9} células Rp positivas HA-1 y
HLA-A2.1 y se separaron utilizando HPLC en fase
reversa con HFBA como modificador orgánico.
b. Se fraccionó de manera adicional la fracción
24 de la primera dimensión del HPLC que contenía la actividad de
HA-1 mediante HPLC en fase reversa con TFA como
modificador orgánico
c. Se cromatografió de manera adicional la
fracción 27 que contenía HA-1 del segundo gradiente
con un tercer gradiente somero constituido por acetonitrilo al
0.1%/min La lisis de fondo de T2 mediante el CTL en ausencia de
cualquier péptido fue en a de un 3%, en b y en c del 0%. El control
positivo de la lisis fue en a de un 99%, 74% en b y 66% en c.
d. determinación de los péptidos
HA-1 candidatos. Se cromatografió mediante HPLC la
fracción 33 a partir de la separación en la Fig. 1c con un divisor
en línea del efluente de la columna microcapilar en línea y se
analizó mediante espectrometría de masas con ionización de electro
spray y un ensayo de liberación de ^{51}Cr. Se comparó la
actividad reconstituyente de HA-1 como porcentaje
específico de liberación con la abundancia de los péptidos
candidatos medido en forma de corriente de iones.
Figura
2
Secuenciamiento del péptido mH
HA-1 mediante espectrometría de masas en tandem.
a. Espectro de masa de disociación mediante
activación de la colisión del péptido candidato con m/z de 513.
b. Ensayo de reconstitución con diferentes
concentraciones del péptido mH HA-1 sintético con
tres clones de células T HA-1 específicos, 3HA15,
clon 15 y 5W38. La lisis de fondo de T2 mediante el CTL en ausencia
de cualquier péptido fue del 4% para 3HA15, del 10% para el clon 15
y del 2% para 5W38. El control de lisis positiva fue del 46% para
3HA15, del 47% para el clon 15 y del 48% para 5W38.
Figura
3
El polimorfismo KIAA0223 se correlaciona
exactamente con el fenotipo mH del antígeno
RA-1.
a. Se secuenció la región HA-1 de
KIAA0223 en la familia tipificada del antígeno HA-1
mH. Se secuenciaron 6 productos PCR de cada miembro de la familia.
Los miembros 00, 07 y 09 de la familia expresaron el
HA-1^{R} en los 6 productos PCR. El miembro 01 de
la familia expresó el alelo HA-1^{H} en 2
productos PCR y el alelo HA-1^{R} en 4 productos
PCR. El miembro 02 de la familia expresó el alelo
HA-1^{H} en 3 productos PCR y el alelo
Ha-1^{R} en 3 productos PCR. El miembro 08 de la
familia expresó el alelo HA-1^{H} en 4 productos
PCR y el alelo HA-1^{R} en 2 productos PCR.
b. El alelo HA-1 específico de la
reacción PCR en la familia tipificada del antígeno
HA-1 mH se correlacionó de manera exacta con el
fenotipo HA-1. Los tamaños de los productos PCR
resultantes fueron consistentes con los tamaños esperados deducidos
de la secuencia de ADNc.
c. La transfección del alelo
HA-1^{H} de K1AA0223 conduce al reconocimiento
mediante las células T mH HA-1 específicas. Las
secuencias de codificación de HA-1^{H} y
HA-1^{R} de KIAA0223 fueron transfectados de
manera conjunta con HLA-A2.1 en células Hela.
Después de 3 días, se añadieron los clones CTL HA-1
específicos de 5W38 y 3HA15, y después de 24 horas se midió la
liberación de TNF\alpha en el sobrenadante. El clon Q66.9 es
específico para los péptidos 58-66 de la matriz de
la gripe. No se observó producción de TNF\alpha después de la
transfección del vector pcDNA3.I (+) en solitario (no se muestran
los resultados).
Figura
4
a. Enlace de los péptidos
HA-1^{H} y HA-1^{R} con
HLA-A2.1. Se ensayó el enlace de los péptidos
HA-1^{H} y HA-1^{R} con respecto
de su capacidad para inhibir el enlace del péptido fluorescente
FLPSDCFPSV con el HLA-A2.1 recombinante y la
microglobulina \beta2 en un ensayo de enlace con células libres de
péptido. Se muestra un experimento representativo. Se determinó el
CI50 sobre los resultados de 4 experimentos y fue de 30 nM para
VLHDDLLEA y 365 nM para VLRDDLLEA.
b. Ensayo de reconstitución con diferentes
concentraciones del péptido HA-1^{R} sintético con
células T HA-1 específicas. Se valoró el péptido
HA-1^{R} y se preincubó con células T2. Se
añadieron tres clones de células T HA-1 específicas,
5W38, 3HA15 y el clon 15, y se llevó a cabo un ensayo de liberación
con ^{51}Cr durante 4 horas. La lisis de fondo de T2 mediante el
CTL en ausencia de cualquier péptido fue del 4% para 3HA15, del 10%
para el clon 15, y del 2% para 5W38. El control positivo de la lisis
fue del 46% para 3HA15, del 47% para el clon 15 y del 48% para
5W38.
Figura
5
Secuencias y estructura geonómica del
locus HA-1. Figura 1a, secuencias de
codificación de los alelos H y R de HA-1. Los
caracteres en negrita indican los nucleótidos polimórficos. Figura
1b, fronteras exón-intrón del locus
HA-1. Se muestran las secuencias exón en mayúscula y
las secuencias intrón en minúscula.
Figura
6
Tipificación genómica de los alelos
HA-1 en muestras clínicas. Se llevó a cabo la
tipificación genómica mediante amplificación de secuencia
específica, mediante el uso de los dos conjuntos de cebadores de la
Tabla 1. Los dos fragmentos superiores del gel se originaron a
partir del alelo H, los dos fragmentos inferiores a partir del alelo
R.
1. Ejemplo
1
La enfermedad injerto frente a huésped (GvHD) es
una complicación frecuente y con riesgo para la vida tras un
transplante de médula ósea alogénico (BMT)
HLA-idéntico. Los receptores de médula ósea
HLA-idéntica desarrollan la enfermedad injerto
frente a huésped aguda o crónica en un 36% y 49%
respectivamente^{1,2}. Las diferencias en los genes distintas de
las del MHC denominadas como Antígenos Menores de
Histocompatibilidad (mH), están claramente implicadas en el
desarrollo de GvHD tras BMT HLA-idéntico. Un
análisis retrospectivo reciente reveló la asociación significativa
entre el error de emparejamiento del antígeno mH
HA-1 y la inducción de GvHD tras BMT
HLA-idéntico^{3}. Los Antígenos Menores de
Histocompatibilidad se reconocen por las células T restringidas con
MHC, y se demostró que eran péptidos derivados de proteínas
intracelulares que presentan las moléculas
MHC^{4-6}. Aquí informamos de la identificación
por primera vez de un gen polimórfico que codifica un antígeno mH
humano. El antígeno mH HA-1 asociado con GvHD es un
nonapéptido derivado del gen dialélico KIAA0223. La contraparte
alélica HA-1 codificada por el gen KIAA0223 se
diferencia únicamente en un aminoácido del antígeno mH
HA-1. Los estudios familiares demuestran una
correlación exacta entre el polimorfismo del gen KIAA0223 y el
fenotipo HA-1 tal como se determinó anteriormente
por reconocimiento de los clones CTL HA-1
específicos. La elucidación del gen que codifica
HA-1 permite la perspectiva de tipificar el ADN del
HA-1 de donantes y receptores de BMT para mejorar
la selección de donantes y la prevención de GvHD.
Se han aislado los clones de células T
citotóxicas específicas del antígeno mH HA-1
procedentes de tres pacientes diferentes con GvHD grave^{7}. El
antígeno mH HA-1 se presenta en e contexto de
HLA-A2.1, y está presente en el 69% de la población
HLA-A2.1 positiva^{7}. Se demostró que la
expresión de HA-1 es específica del tejido y está
limitada a las células de origen hematopoiético, que incluyen
células dendríticas, células de Langerhans y células
leucémicas^{8-10}. El análisis familiar indicó un
modo mendeliano de herencia para HA-1 y la
segregación independiente del complejo MHC^{11}. La comparación de
las secuencias del receptor de las células T (TCR) de diferentes
clones de células T HA-1 específicos derivados de
individuos diferentes reveló la utilización conservada del TCR
V\beta6.9 y los aminoácidos conservados en la región CDR3^{12}.
En un estudio retrospectivo, se evaluó el mal emparejamiento de
numerosos antígenos mH con respecto a la asociación con GvHD tras
BMT HLA-idéntico. Un mal emparejamiento
HA-1 único entre el donante y el receptor estuvo
significativamente correlacionado con la inducción de GvHD tras BMT
HLA-idéntico^{3}.
Para identificar el antígeno mH de
HA-1, se purificaron moléculas de
HLA-A2.1 procedentes de dos HA-1 que
expresaban líneas celulares de linfoblastoide B transformado por
EBV (EBV-BLCL) Rp y Blk. Se aislaron los péptidos
de enlace de HLA-A2.1 mediante tratamiento ácido, y
se llevó a cabo el fraccionamiento de los péptidos mediante
múltiples vueltas de HPLC en fase reversa. Se analizaron las
fracciones por su capacidad de inducir la lisis
HA-1 específica usando células T2 como células diana
y un clon CTL HA-1 específico como célula efectora
en un ensayo de liberación con ^{51}Cr (Fig 1a). La fracción 24
contenía la actividad de HA-1, y se fraccionó dos
veces de manera adicional con HPLC en fase reversa utilizando un
modificador orgánico diferente (Fig 1b.c.). Las fracciones 33 y 34
del tercer fraccionamiento HPLC mostraron la actividad de
HA-1 en el ensayo de liberación con ^{51}Cr y se
analizaron mediante espectroscopia de masas en tandem. Debido a que
estuvieron presentes unos 100 péptidos diferentes en estas
fracciones, se cromatografíó alrededor del 40% de las fracciones 33
y 34 con una columna microcapilar con divisor del efluente en línea.
Se analizaron de manera simultánea las fracciones mediante
espectroscopia de masas en tandem y el ensayo de liberación con
^{51}Cr (Fig 1d). Cinco especies de péptidos (a m/z 550, 520,
513, 585 y 502) estuvieron presentes de manera específica en las
fracciones activas y ausentes en fracciones sin actividad en el
ensayo CML. El análisis de disociación activada mediante colisión
del péptido candidato a m/z 550 reveló la secuencia YXTDRVMTV. X
significa isoleucina o leucina que no pueden ser discriminadas con
este tipo de espectrometría de masas. Sin embargo, un péptido
sintético con esta secuencia no fue capaz de reconstituir el
epitopo HA-1 (no se muestran los resultados). Para
determinar cuál de los cuatro candidatos restantes era el péptido
HA-1 se evaluó la purificación del segundo
HA-1 del EBV-BLCL Blk. Se
cromatografió de manera adicional la fracción 33 del péptido
HA-1 positivo del segundo fraccionamiento mediante
HPLC en fase reversa mediante HPLC microcapilar con un tercer
modificador orgánico. Se observó un pico único de actividad
reconstituyente en un ensayo de liberación con ^{51}Cr (no se
muestran los resultados). El análisis espectral de masas de estas
fracciones reveló que estuvo presente el único péptido candidato a
m/z 513. Se analizó este péptido con el análisis de disociación
activada mediante colisión y se secuenció como VXHDDXXEA (Fig 2a).
Se sintetizaron las variantes de isoleucina y leucina del péptido y
se hicieron circular sobre la columna de HPLC microcapilar.
Únicamente el péptido VLHDDLLEA se coeluyó con el péptido 513
procesado de manera natural (no se muestran los resultados). A
continuación se añadió VLHDDLLEA sintético en una concentración
diferente a un ensayo CML con tres diferentes clones CTL
HA-1 específicos que revelaron el reconocimiento por
parte de los tres clones del péptido con una actividad semimáxima a
150-200 pM para los tres clones (Fig 2b). Esto
demostró que el antígeno mH de Ha-1 está
representado por el nonapéptido
VLHDDLLEA.
VLHDDLLEA.
Las búsquedas en la base de datos realizadas para
identificar el gen que codifica HA-1 revelaron que
el péptido HA-1 VLHDLLEA era idéntico a excepción
de 8 ó 9 aminoácidos al péptido VLRDDLLEA procedente de la secuencia
complementaria parcial del ADN (ADNc) KIAA0223, derivado de la
línea celular KG-1 de la leucemia mielogénica aguda
(Nº de acceso GENBANK D86986). Puesto que HA-1 tiene
una frecuencia en la población del 69%, razonamos que la secuencia
del péptido VLRDDLLEA podría representar la contraparte alélica
HA-1 presente en el resto del 31% de la población.
Para elaborar esta asunción realizamos el análisis de secuencia del
ADNc de la supuesta región que codifica el HA-1 del
KIAA0223 en EBV-BLCL derivado de un supuesto
homozigótico HA-1 positivo (vR), de un presunto
individuo HA-1 negativo (DH) y de la línea celular
KG-1 (Tabla 5). La región que codifica el
HA-1 del KIAA0223 del individuo HA-1
+/+ (vR) presentó dos nucleótidos diferentes respecto de la
secuencia de KIAA0223 de la base de datos, llevando a la secuencia
de aminoácidos VLHDDLLEA (designada como
HA-1^{H}). La región que codifica
HA-1 del KIAA0223 del individuo HA-1
-/- (DH) demostró una homología del 100% con la secuencia informada
del KIAA0223 (designada como HA-1^{R}). La línea
celular KG-1 expresó ambos alelos KIAA0223. Puesto
que KG-1 no expresa la molécula de restricción
HLA-A2.1 necesaria para el reconocimiento de las
células T, transfectamos KG-1 con
HLA-A2.1, y se usaron estas células como células
diana en un ensayo de liberación con ^{51}Cr con el clon de
célula T HA-1 específico como células efectoras. De
acuerdo con los resultados del análisis de secuencias del ADNc, las
células KG-1 fueron reconocidas por el clon de
célula T HA-1 específico (no se muestran los
datos). Este resultado sugiere que el gen KIAA0223 forma un sistema
dialélico, del cual el alelo HA-1^{H} conduce al
reconocimiento por el antígeno mH de los clones de células T
HA-1 específico.
Se estudiaron dos familias que se habían
tipificado previamente respecto de HA-1 con CTL
HA-1 específico acerca del nivel del ADNc de su
polimorfismo KIAA0223. Se seleccionaron los miembros familiares de
la familia 1 por su polimorfismo de la secuencia KIAA0223
secuenciando la región de la secuencia que codifica
HA-1. Todos los miembros HA-1
negativos presentaron la secuencia HA-1^{R},
mientras que todos los miembros HA-1 positivos
resultaron ser heterocigóticos, portando de esta manera ambos alelos
HA-1 (Fig 3a). Diseñamos de manera siguiente los
cebadores PCR específicos del alelo HA-1 para
seleccionar otra familia que previamente se había tipificado para
HA-1. Se determinó que ambos padres y un hijo eran
heterocigóticos para HA-1, dos hijos
HA-1 negativos eran homocigóticos para el alelo
HA-1^{R} y un hijo homozigótico para el alelo
HA-1^{H} (Fig. 3b). La selección de ambas
familias mostró una correlación exacta del fenotipo
HA-1 tal como se determina mediante el
reconocimiento por los clones de células T HA-1
específicos y el polimorfismo del gen KIAA0223.
Para probar de manera definitiva que el gen
KIAA0223 codifica el antígeno mH de HA-1 se clonaron
los alelos HA-1^{H} y HA-1^{R}
de la región de la secuencia que codifica el HA-1 de
KIAA0223 en un vector de expresión eucariota, y se transfectó de
manera no estacionaria en células Hela HA-1
negativas en combinación con HLA-A2.1. Se ensayó el
reconocimiento de la célula T HA-1 específico de
estas células Hela transfectadas utilizando un ensayo de liberación
de TNF\alpha. Se reconocieron las células Hela transfectadas con
la secuencia HA-1^{H} que contenía el vector
mediante dos clones de células T HA-1 específicos
(Fig. 3C). Por el contrario, la transfección de la secuencia
HA-1^{R} que contenía el vector no condujo al
reconocimiento. En conclusión, nuestros resultados demuestran
claramente que el antígeno mH de HA-1 se codifica
mediante el alelo HA-1^{H} del gen KIAA0223.
Se llevaron a cabo ensayos de reconstitución y
enlace del HLA-A2.1 para determinar la capacidad del
péptido VLRDDLLEA de HA-1^{R} para enlazar con
HLA-A2.1 y ser reconocido por los clones de células
T HA-1 específicos. La concentración del péptido
HA-1^{R} que inhibió el enlace de un péptido
estándar fluorescente y el HLA-A2.1 en un 50%
(CI50) fue de 365 nM, que cae entre los ligantes intermedios,
mientras que el CI50 del péptido HA-1^{H} fue de
30 nM, que está en el intervalo de ligantes de afinidad alta (Fig.
4a)^{13,14}. Se ensayaron diferentes concentraciones de
VLRDDLLEA en un ensayo de liberación con ^{51}Cr con tres clones
de células T HA-1 específicos. Uno de tres clones
ensayados (3HA15) mostró reconocimiento del péptido
HA-1^{R}, pero únicamente a una concentración de
péptido 1000 veces mayor que la necesaria para el reconocimiento del
péptido HA-1^{H} (Fig 4b). Como la afinidad del
enlace de los dos péptidos con HLA-A2.1 difiere
únicamente en un factor de 10, se puede concluir que todos los
clones de células T reconocen de manera específica el péptido
HA-1^{H}.
El clon de la célula T 3HA15, que reconoce el
péptido HA-1^{R} a altas concentraciones, no
reconoce los individuos homocigóticos HA-1^{R}.
Esto sugiere que el péptido VLRDDLLEA no se presentó por
HLA-A2.1 o se presentó por debajo del límite de
detección de la célula T. Para determinar si el péptido VLRDDLLEA de
HA-1^{R} se presentó por
HLA-A2.1, se eluyeron los péptidos de enlace de
HLA-A2.1 a partir de EBV-BLCL
homozigótico de HA-1^{R} y se fraccionaron con
HPLC en fase reversa. Se sometió el péptido VLRDDLLEA de
HA-1 sintético a HPLC reversa para determinar a
cuál fracción se eluyó este péptido. Se analizaron las fracciones
HPLC correspondientes derivadas de EBV-BLCL que
expresaba HA-1^{R} utilizando espectrometría de
masas. No se pudo detectar la presencia del péptido VLRDDLLEA (no
se muestran los resultados), indicando que este péptido no está
presente o está en muy bajas cantidades en HLA-A2.1
sobre la superficie celular. Esto es más posible debido a que la
afinidad del enlace es 10 veces menor que la del péptido para
HLA-A2.1. La ausencia supuesta del péptido
HA-1^{R} en HLA-A2.1 indica que
este alelo debe considerarse como un alelo nulo con respecto a la
reactividad de la célula T. Esto implica que solo el BMT procedente
de un donante HA-1^{R/R} (HA-1-)
en la dirección de un receptor HA-1^{H/H} ó
HA-1^{R/H} (HA-1 +), y no al
revés, estarían asociados de manera significativa con el GvHD. Esto
se ha observado sin duda en un estudio retrospectivo en el que se
tipificaron pares BMT HLA-2.1 positivo respecto de
HA-1^{3}. Sin embargo, los péptidos
HA-1^{R} derivados pueden enlazarse con otros
alelos HLA y posiblemente ser reconocidos por las células T. Si
estos últimos péptidos no se generan y presentan por el alelo
HA-1^{H}, entonces, se puede suponer la
reactividad de las células T respecto del alelo
HA-1^{R}, y se puede producir la GvHD en dicha
dirección.
Únicamente se han identificado una pequeña
cantidad de los antígenos mH humanos y murina en el nivel del
péptido y gen. Se codifican dos antígenos mH de murina por la
proteínas mitocondriales llevando en, de manera respectiva, cuatro y
dos alelos^{15-17}. De manera adicional, se ha
demostrado que dos antígenos mH H-Y de murina eran
péptidos codificados por genes localizados en el cromosoma
Y^{18-21}. El gen SMCY humano, localizado
sobre el cromosoma Y, codifica los antígenos mH HY restringidos de
HLA-B7 y HLA-A2^{5,6}. De los
antígenos mH humanos no relacionados con el sexo sólo se ha
secuenciado el antígeno mH de HA-2 en el nivel del
péptido, pero el gen que codifica HA-2 permanece
desconocido^{4}. La identificación del gen que codifica el
antígeno mH de HA-1 es la primera demostración de
que los antígenos mH humanos se derivan de genes polimórficos. El
gen KIAA0223 que codifica HA-1 tiene dos alelos que
difieren en dos nucleótidos que conducen a una diferencia de un
único
aminoácido.
aminoácido.
Debido a que el antígeno HA-1 mH
es el único antígeno mH humano conocido que está correlacionado con
el desarrollo de GvHD tras BMT, los resultados de nuestro estudio
son de relevancia clínica significativa^{3}. Aunque el número de
los diferentes antígenos mH humanos es probablemente alto, se cree
que únicamente una pequeña cantidad de antígenos mH inmunodominantes
pueden tenerse en cuenta para el riesgo de GvHD^{22}. La
identificación de estos antígenos mH inmunodominantes humanos, y la
selección de estos antígenos pueden dar como resultado una
disminución significativa en la GvHD tras BMT. Describimos aquí la
primera elucidación de un gen polimórfico que codifica el antígeno
mH inmunodominante de HA-1. Esto permite el uso para
diseñar cebadores PCR específicos del alelo HA-1
para la tipificación del pretransplante en donantes y receptores
para mejorar la selección de donantes y la prevención por tanto del
desarrollo de GvHD inducido por HA-1.
Se derivaron los clones 3HA-15,
clon 15 y 5W38 de células T citotóxicas HA-1
específicas restringidas con CD8+ HLA-A2.1 a partir
de PBMC de dos pacientes que habían experimentado transplante de
médula ósea HLA-idéntico^{7,23}. Se cultivaron
los clones con estimulación semanal con PBMC y BLCL alogénico
irradiado en medio RPMI-1640 que contenía suero
humano al 15%, 1-glutamina 3 mM,
leucoaglutinina-A al 1% y 20 U/ml de
rIL-2. Las líneas celulares Rp y Blk de EBV B
transformadas que expresan HA-1
HLA-A2.1 positivas (BLCL) se mantuvieron en IMDM que
contenía FCS al 5%. Las líneas celulares KG-1 y T2
se cultivaron en medio 1640 que contenía 1-glutamina
3 mM y FCS al 10%.
Se ensayaron las fracciones de HPLC y los
péptidos sintéticos en un ensayo de liberación con ^{51}Cr tal
como se ha descrito ^{24}. Se marcaron con ^{51}Cr 2500 células
T en 25 \mul, se incubaron con 25 \mul de péptido disuelto en
Hepes 50 mM de Hanks durante 30 minutos a 37ºC. Se añadieron células
T citotóxicas en un volumen final de 150 \mul. Cuando se ensayaron
por HPLC las fracciones del péptido, se incubó T2 con 2 \mug/ml de
MA2.1 durante el marcado con ^{51}Cr. Tras 4 horas a 37ºC se
cosecharon los sobrenadantes.
Se separaron por elución los péptidos de las
moléculas de HLA-A2.1 purificadas tal como se ha
descrito anterior-
mente^{24}. De forma breve, se purificaron las moléculas HLA-A2.1 dos veces a partir de 90.10^{9} EBV-BLCL de HLA-A2.1 positivas mediante cromatografía de afinidad con BB7.2 acoplado con perlas de sefarosa 4B activadas con CNBR (Pharmacia LKB) y se lavaron de manera extensiva. Se eluyeron los péptidos a partir de HLA-A2.1 con tratamiento con ácido acético al 10%, acidificado de manera adicional por TFA al 1% y separado de la cadena pesada de HLA-A2.1 y de la \beta2-microglobulina mediante filtración con un filtro 10 kD Centricon (Amicon). Se fraccionaron los péptidos utilizando micro HPLC en fase reversa (Smart Sistema, Pharmacia). Para la primera purificación se utilizaron tres rondas de fraccionamiento mediante HPLC para purificar las fracciones del péptido activo HA-1 restringido con HLA-A2.1 a partir de 90.10^{9} células Rp. El primer fraccionamiento estuvo constituido por el tampón A: HFBA al 0,1% en H_{2}O, tampón B: HFBA al 0,1% en acetonitrilo. El gradiente fue 100% de tampón A (0 a 20 min), 0 a 15% de tampón B (20 a 25 min) y 15 a 70% de tampón B (25 a 80 min) a un caudal de 100 \mul/min Se recogieron las fracciones de 100 \mul. Se fraccionó de manera adicional la fracción 24 del primer gradiente. El segundo fraccionamiento estuvo constituido por el tampón A: TFA al 0,1% en H_{2}O, tampón B: TFA al 0,1% en acetonitrilo. El gradiente fue 100% de tampón A (0 a 20 min), 0 a 12% de tampón B (20 a 25 min), y 12 a 50% de tampón B (25 a 80 min) a un caudal de 100 \mul/min. Se recogieron fracciones de 100 \mul. Se utilizó un tercer gradiente somero para purificar de manera adicional la fracción 27 que contenía la actividad de HA-1. el gradiente fue de 100% de tampón A (0 a 29 min), 0 a 18% de tampón B (29 a 34 min), 18% de tampón B (34 a 39 min), 18 a 23,9% de tampón B (39 a 98 min) a un caudal de 100 \mul/min Se utilizó de 1/180 a 1/45 de material de partida para el ensayo de las fracciones positivas en el ensayo de liberación con ^{51}Cr. Se utilizaron fraccionamientos HPLC comparables para la segunda purificación de las fracciones de péptido activo HA-1 restringidas con HLA-A2.1 a partir de 90.10^{9} Blk. Se utilizó el 40% de la fracción 33 que contenía el HA-1 de la segunda purificación de HA-1 para un fraccionamiento adicional mediante HPLC microcapilar en fase reversa. El tampón A fue trietil amina al 0,1% (TEA) en agua tamponada a pH 6,0 con ácido acético y el tampón B fue TEA al 0,085% en acetonitrilo al 60% tamponado a pH 6,0 con ácido acético. El gradiente fue del 100% de tampón A (0 a 5 min), 0 a 100% de B (5 a 45 min) a un caudal de 0,5 \mul/min Se recogieron las fracciones en 50 \mul de ácido acético al 0,1% cada minuto durante 5 a 15 minutos, cada 30 segundos de 15 a 20 minutos, cada 20 segundos de 20 a 40 minutos, y cada 30 segundos de 40 a 45 minutos. De cada fracción recogida se utilizó un 20% para el ensayo de la actividad de HA-1 y se utilizó un 80% para obtener los datos del espectro de masas.
mente^{24}. De forma breve, se purificaron las moléculas HLA-A2.1 dos veces a partir de 90.10^{9} EBV-BLCL de HLA-A2.1 positivas mediante cromatografía de afinidad con BB7.2 acoplado con perlas de sefarosa 4B activadas con CNBR (Pharmacia LKB) y se lavaron de manera extensiva. Se eluyeron los péptidos a partir de HLA-A2.1 con tratamiento con ácido acético al 10%, acidificado de manera adicional por TFA al 1% y separado de la cadena pesada de HLA-A2.1 y de la \beta2-microglobulina mediante filtración con un filtro 10 kD Centricon (Amicon). Se fraccionaron los péptidos utilizando micro HPLC en fase reversa (Smart Sistema, Pharmacia). Para la primera purificación se utilizaron tres rondas de fraccionamiento mediante HPLC para purificar las fracciones del péptido activo HA-1 restringido con HLA-A2.1 a partir de 90.10^{9} células Rp. El primer fraccionamiento estuvo constituido por el tampón A: HFBA al 0,1% en H_{2}O, tampón B: HFBA al 0,1% en acetonitrilo. El gradiente fue 100% de tampón A (0 a 20 min), 0 a 15% de tampón B (20 a 25 min) y 15 a 70% de tampón B (25 a 80 min) a un caudal de 100 \mul/min Se recogieron las fracciones de 100 \mul. Se fraccionó de manera adicional la fracción 24 del primer gradiente. El segundo fraccionamiento estuvo constituido por el tampón A: TFA al 0,1% en H_{2}O, tampón B: TFA al 0,1% en acetonitrilo. El gradiente fue 100% de tampón A (0 a 20 min), 0 a 12% de tampón B (20 a 25 min), y 12 a 50% de tampón B (25 a 80 min) a un caudal de 100 \mul/min. Se recogieron fracciones de 100 \mul. Se utilizó un tercer gradiente somero para purificar de manera adicional la fracción 27 que contenía la actividad de HA-1. el gradiente fue de 100% de tampón A (0 a 29 min), 0 a 18% de tampón B (29 a 34 min), 18% de tampón B (34 a 39 min), 18 a 23,9% de tampón B (39 a 98 min) a un caudal de 100 \mul/min Se utilizó de 1/180 a 1/45 de material de partida para el ensayo de las fracciones positivas en el ensayo de liberación con ^{51}Cr. Se utilizaron fraccionamientos HPLC comparables para la segunda purificación de las fracciones de péptido activo HA-1 restringidas con HLA-A2.1 a partir de 90.10^{9} Blk. Se utilizó el 40% de la fracción 33 que contenía el HA-1 de la segunda purificación de HA-1 para un fraccionamiento adicional mediante HPLC microcapilar en fase reversa. El tampón A fue trietil amina al 0,1% (TEA) en agua tamponada a pH 6,0 con ácido acético y el tampón B fue TEA al 0,085% en acetonitrilo al 60% tamponado a pH 6,0 con ácido acético. El gradiente fue del 100% de tampón A (0 a 5 min), 0 a 100% de B (5 a 45 min) a un caudal de 0,5 \mul/min Se recogieron las fracciones en 50 \mul de ácido acético al 0,1% cada minuto durante 5 a 15 minutos, cada 30 segundos de 15 a 20 minutos, cada 20 segundos de 20 a 40 minutos, y cada 30 segundos de 40 a 45 minutos. De cada fracción recogida se utilizó un 20% para el ensayo de la actividad de HA-1 y se utilizó un 80% para obtener los datos del espectro de masas.
Se analizaron las fracciones de la separación
mediante HPLC tridimensional de la purificación de Rp que contenían
la actividad HA-1 mediante HPLC microcapilar -
espectrometría de masas por ionización de electrospray ^{25}. Se
cargaron los péptidos en una columna microcapilar C18 (75 \mum d.
i. x 10 cm) y se eluyeron 34 minutos con un gradiente de 0 a 60% de
B, en el que el solvente A fue ácido acético 0,1 M en agua y el
solvente B fue acetonitrilo a un caudal de 0,5 \mul/min Un quinto
del efluyente se depositó en los pocillos de una placa de 96
pocillos que contenían 100 \mul de medio de cultivo en cada
pocillo (fracciones de 10 segundos), mientras que los cuatro quintos
restantes se dirigieron a la fuente de electrospray
TSQ-70U. Se registraron el espectro de masas y el
espectro de masas CAD en un espectrómetro de masas de triple
cuadripolo Finnigan-MAT TSQ-7000
(San José, California), equipado con una fuente iónica de
electrospray.
\newpage
Se utilizó un ensayo cuantitativo para los
péptidos de enlace HLA-A2.1 basado en la inhibición
del enlace del péptido estándar marcado fluorescente Hbc
18-27 F con C6 (FLPSDCFPSV) para la proteína
recombinante HLA-A2.1 y la
\beta2-microglobulina^{26,27}. En breve, se
utilizaron concentraciones de HLA-A2.1que daban
aproximadamente un 40-60% de enlace con el péptido
estándar fluorescente con 15 pmol/pocillo (150 nM) de
\beta2-microglobulina (Sigma). Se incubaron
conjuntamente varias dosis de los péptidos de ensayo con 100
fmol/pocillo (1nM) de péptido estándar fluorescente
HLA-A2.1 y \beta2-microglobulina
durante 1 día a temperatura ambiente en la oscuridad en un volumen
de 100 \mul en tampón de ensayo. Se determinó el porcentaje de
fluorescencia por enlace con MHC mediante filtración en gel y se
dedujo la dosis inhibitoria al 50% para cada péptido usando análisis
por regresión no lineal de competición en un emplazamiento con el
software prismgraph. Los péptidos sintéticos se fabricaron en un
sintetizador de péptido múltiple Abimed 422 (Abimed, Langenfeld,
Alemania) y tuvieron una pureza superior al 90%, según se comprobó
mediante HPLC en fase reversa.
Se preparó el total o el ARNm a partir de BLCL
utilizando el procedimiento RNAzol (Laboratorios Cinaa/Biotecx,
Houston, TX) o de acuerdo con las instrucciones del fabricante
(Equipo de purificación de ARNm QuickPrep, Pharmacia Biotech) Se
sintetizó ADNc con 1 \mug de ARN como molde y con KIAA0223 basado
en el cebador inverso
5'-GCTCCTGCATGACGCTCTGTCT-GCA-3'.
Para amplificar la región HA-1 de KIAA0223 se
utilizaron los siguientes cebadores: Cebador hacia delante
5'-GACGTCGTCGAGGACATCTCCCAT-3'y el
cebador inverso
5'-GAAGGCCACAGCAATCGTCTCCAGG-3'.
Los parámetros de ciclo utilizados fueron desnaturalización a 95ºC,
1 min, templado a 58ºC, 1 min y extensión a 72ºC, 1 min (25
ciclos). Los productos PCR se purificaron utilizando el sistema de
purificación Magic PCR-Preps DNA (Promega) y se
clonaron de manera directa utilizando el equipo pMosBlue
T-vector (Amersham LIFE SCIENCE). Se secuenciaron
seis colonias independiente de cada individuo utilizando el equipo
de secuenciamiento T7 (Pharmacia Biotech).
En el caso de la amplificación PCR del alelo
específico HA-1, se sintetizó ADNc tal como se ha
descrito anteriormente. Se llevó a cabo una amplificación PCR con
cebadores hacia delante específicos del alelo: para el alelo
HA-1^{H} el cebador H1:
5'-CCT-TGA-GAA-ACT-TAA-GGA-GTG-TGT-GCT-GCA-3',
para el alelo HA-1^{R} el cebador R1:
5'-CCT-TGA-GAA-ACT-TAA-GGA-GTG-TGT-GTT-GCG-3'
y para ambos se utilizó la reacción con el cebador inverso tal como
se ha descrito anteriormente. Los parámetros de ciclo utilizados
fueron desnaturalización a 95ºC, 1 min, templado a 67ºC, 1 min y la
extensión a 72ºC, 1 min (25 ciclos).
Se diseñaron un cebador PCR hacia delante basado
en KIAA0223 hacia delante que contiene un codón de comienzo ATG
(5´-CCG-GCA-TGG-ACG-TCG-TCG-AGG-ACA-TCT-CCC-ATC-3')
y un cebador PCR basado en un KIAA0223 inverso que contiene una
señal de parada de traducción
(5'-CTA-CTT-CAG-GCC-ACA-GCA-ATC-GTC-TCC-AGG-3'),
y se utilizaron en una reacción RT-PCR con ADNc
derivado de BLCL HA-1^{H} homocigótico y
HA-1^{R} homocigótico. Los parámetros de ciclo
utilizados fueron desnaturalización a 95ºC, 1 min, templado a 60ºC,
1 min y extensión a 72ºC, 1 min (25 ciclos). Los productos PCR
deseados se purificaron utilizando el sistema de purificación del
ADN Magic PCR-Preps (Promega). El ADN purificado se
clonó directamente utilizando el equipo pMosBlue
T-vector (Amersham LIFESCIENCE) y se volvió a
clonar en el vector pCDNA3.1 (+) eucariota bajo el control de un
promotor CMV. Se llevaron a cabo cotransfecciones no estacionarias
con HLA-A2.1 en células Hela utilizando
coprecipitación DEAE-Dextrano. Tras 3 días de
cultivo se añadieron células T HA-1 específico y
después de 24 horas se midió la liberación de TNF\alpha en el
sobrenadante utilizando células WEHI ^{28}.
2. Ejemplo
2
Se aisló ADN genómico a partir de linfocitos de
sangre periférica congelada (PBL) con el High Pure Template
Purification Kit de Boehringer Mannheim de acuerdo con la
descripción de los fabricantes. Se cultivaron células LCL
transformadas con EBV en RPMI-1640 que contenía
L-glutamina 3 mM y FCS al 10%. Se cosecharon las
células para el aislamiento del ADN, se lavaron dos veces con una
solución salina tamponada de fosfato (PBS) se volvieron a suspender
en 200 \mul y se mantuvieron a -20ºC hasta uso. Para cada
aislamiento de ADN se utilizaron 2 x 10^{6} células.
Para cada reacción PCR se utilizaron
100-200 ng de ADN genómico. Se llevaron a cabo las
amplificaciones con 20 pmol de cada cebador en 100 \mul de tampón
Tris/HCl 10 mM (pH 8,4), que contenía KCl 50 mM, MgCl_{2} 4 mM,
0,06 mg/ml de BSA, dNTP 0,5 mM y 2,5 unidades de polimerasa Taq
(Roche molecular Systems, Brancheburg, New Jersey). Todas las
reacciones comenzaron con una etapa de desnaturalización de 5 min a
95ºC. Las condiciones de ciclación para todas las combinaciones de
cebadores fueron 95ºC durante 1 min y 65ºC durante 1 min para 10
ciclos. Seguido por 20 ciclos a 95ºC durante 1 min, 62ºC durante 1
min, 72ºC durante 1 min, y una extensión de la última etapa durante
5 min a 72ºC.
Para el aislamiento a gran escala del cósmido de
ADN se inocularon 11 de medio LB (20 \mug/ml de Ampicilina) y se
hicieron crecer durante la noche a 37ºC con agitación vigorosa (300
rpm). Se aisló el cósmido de ADN utilizando el protocolo de
aislamiento del plásmido de bajo número de copias del Quiagen
Plasmid Purification Kit de acuerdo con la descripción de los
fabricantes. Este procedimiento de aislamiento dio como resultado un
promedio de 500 \mug de cósmido de ADN purificado.
Para cada reacción de secuenciamiento se
utilizaron 10 \mug de cósmido de ADN. Se llevaron a cabo las
reacciones de secuenciamiento con el T7 Secuencing kit (Pharmacia
Biotech).
Se ensayaron LCL transformadas con EBV con CTL
HA-1 específico. Se determinó la reactividad
mediante un ensayo de liberación con cromo. Las células diana (3 x
10^{3}) marcadas con ^{51}Cr, se coincubaron con diluciones en
serie de células T efectoras en placas de microvaloración con 96
pocillos de fondo redondo (Costar 3799). Tras 4 horas a 37ºC se
cosecharon los sobrenadantes libres de células para el conteo gamma.
Se calculó el porcentaje específico de lisis como sigue: 5 lisis
específicas = (liberación experimental - liberación
espontánea)/(liberación máxima - liberación espontánea) x 100%. La
liberación espontánea y la liberación máxima son la liberación de
cromo de las células diana en el medio de cultivo solo y en el medio
de cultivo que contiene Tritón-X 100 al 1%, de
manera respectiva.
3. Ejemplo
3
Para la determinación de la estructura genómica
que rodea el péptido HA-1 se seleccionó una
biblioteca de cósmidos derivada de PBL masculino humano. Se utilizó
el fragmento de ADNc de 312 pb que codifica el péptido
HA-1 como sonda para la selección. Se aislaron tres
cósmidos solapantes. Se secuenció parcialmente el cósmido
pTCF-HA-1 que contenía el alelo R.
La secuencia de reacción reveló un emplazamiento donante de empalme
cuatro nucleótidos después del codón polimórfico de
HA-1. Podría identificarse un emplazamiento aceptor
de empalme al frente del segundo exón que codifica el péptido
HA-1 (Fig 5). De esta manera, la secuencia del
péptido HA-1 está codificada por dos exones.
4. Ejemplo
4
Para la tipificación específica del alelo
genómico se diseñaron dos conjuntos diferentes de cebadores. Ambos
conjuntos contienen un cebador común y uno específico para ambos
HA-1, alelo H o alelo R (tabla 1). El cebador común
del conjunto 1 se deriva del exón que codifica los primeros cuatro
aminoácidos del péptido HA-1. Los cebadores H/R
contienen secuencias intrónicas, el emplazamiento donante de empalme
y la parte específica del alelo de la secuencia del exón. El
conjunto 2 está constituido por un cebador común derivado del intrón
identificado en pTCF-HA-1 y los
cebadores derivados del exón que cubren el alelo H- y el R-. La
amplificación con el cebador del conjunto 1 dio como resultado un
fragmento de 190 pb, el cebador del conjunto 2 dio un fragmento de
331 pb. Ambos conjuntos de cebadores mostraron la longitud esperada
de fragmentos, y son adecuados para la tipificación genómica.
Debido a que los cebadores se escogen de forma que amplificarían el
ADN bajo condiciones PCR idénticas, se puede utilizar una
combinación de ambos conjuntos de cebadores en la misma reacción
PCR. En este caso se observó un tercer fragmento de 535 pb debido a
la amplificación del ADN entre los dos cebadores comunes diferentes
(no se muestran los datos).
5. Ejemplo
5
Se llevó a cabo la factibilidad de la
tipificación genómica sobre 24 miembro que pertenecen a tres
familias HLA-A*0201 positivo. Se compararon los
resultados de la tipificación del ADN con la tipificación de CTL de
mHag HA-1 (tabla 3) y mostraron una correlación
exacta. La Figura 6 muestra el análisis del ADN genómico del
locus HA-1 en una familia representativa. El
donante de médula ósea (06) y el receptor (02) fueron
HLA-idénticos. El donante fue homocigótico para el
alelo R. El receptor fue heterocigótico (H/R) y presentaba por tanto
el antígeno HA-1 en la superficie de la célula.
Este mal emparejamiento dio como resultado una GvHD, de esta
manera, las células T del donante reaccionaron frente al mHag del
receptor. En esta familia, el donante y el paciente fueron
HLA-idénticos, pero tenían un mal emparejamiento en
la secuencia HA-1. Se pueden observar las mismas
disparidades para HA-1 en la familia 2. Nuevamente
el donante (07) fue homocigótico para el alelo R y el paciente (02)
fue heterozigótico (H/R), dando como resultado una GvHD. La familia
3 representa la segregación del alelo HA-1 H en
tres generaciones de una familia sana. El alelo H se deriva del
abuelo (01) y se hereda por dos generaciones. La abuela (00) aunque
HLA-A*0201 positiva es homocigótica para el alelo R.
Sus hijos (03, 04 y 05) son todos heterocigóticos para el
locus HA-1. El hijo 04 se casó con el
individuo 34 que es HLA-A*0201 positivo, pero
homozigótico para el alelo R. De todos sus descendiente, únicamente
84 hereda el alelo HA-1 H del abuelo. Los otros
hijos mayores (82, 83 y 85) son HA-1 R
homocigóticos.
Familia 1 | Análisis CML | Análisis PCR |
00 | + | H/R |
01 | + | H/R |
02* | +. | H/R |
03 | - | R/R |
05 | + | H/H |
06* | - | R/R |
Familia 2 | ||
00 | - | R/R |
01 | + | H/R |
02* | + | H/R |
04 | + | H/R |
06 | + | H/R |
07* | - | R/R |
09 | - | R/R |
10 | + | H/R |
Familia 3 | ||
00 | - | R/R |
01 | + | H/R |
03 | + | H/R |
04 | + | H/R |
05 | + | H/R |
34 | - | R/R |
82 | - | R/R |
83 | - | R/R |
84 | + | H/R |
85 | - | R/R |
6. Ejemplo
6
El siguiente procedimiento para la tipificación
de los alelos HA-1 H y R en una muestra se basa en
la tecnología LiPA (Stuyver y col, 1993). Para cada reacción PCR se
utilizan 100-200 ng de ADN genómico. Se llevaron a
cabo las amplificaciones con 20 pmol de cada cebador en 100 \mul
de tampón Tris/HCl 10 mM (pH 8,4), que contenía KCl 50 mM,
MgCl_{2} 4 mM, 0,06 mg/ml de BSA, dNTP 0,5 mM y 2,5 unidades de
polimerasa Taq (Roche Molecular Systems, Brancheburg, New Jersey).
Todas las reacciones comienzan con una etapa de desnaturalización de
5 min a 95ºC. Las condiciones de ciclación para todas las
combinaciones de cebadores son de 95ºC durante 1 min y 65ºC durante
1 min durante diez ciclos. Seguido por 20 ciclos a 95ºC durante 1
min, 62ºC durante 1 min, 72ºC durante 1 min, y una extensión de la
última etapa durante 5 min a 72ºC. Subsiguientemente se tipifican
los alelos HA-1 mediante una etapa de hibridación
inversa con sondas de oligonucleótidos que se inmovilizan sobre una
tira de nitrocelulosa. Las sondas que se hibridan de manera
específica con el alelo R son, por ejemplo,
HA1-R1(1) (SEC ID Nº 11),
HA1-R1 (2) (SEC ID Nº 12) y
HA1-R1(3) (SEC ID Nº 13). Las sondas que se
hibridan de manera específica con el alelo H son, por ejemplo,
HA1-H1(1) (SEC ID Nº 14),
HA1-H1(2) (SEC ID Nº 15) y
HA1-H1(3) (SEC ID Nº 16). La hibridación se
lleva a cabo en 5x SSPE, SDS al 0,5% a 56ºC durante 30 min Se lleva
a cabo una etapa de lavado riguroso en 2x SSPEm SDS al 0,1% a 56ºC
durante 10 min.
Se ensayó la factibilidad de un LiPA que contenía
las sondas específicas HA1-H1(1) (SEC ID Nº
14), HA-1-R1(3) (SEC ID Nº
13) y una sonda para controlar la reacción colorimétrica (CC) con
las 6 muestras de la familia 1. Los resultados obtenidos mediante
LiPA confirmaron los resultados de tipificación genómica mediante
PCR y la tipificación CTL (tabla 4)
Familia 1 | Análisis CML | Análisis PCR | Análisis LiPA |
00 | + | H/R | H/R |
01 | + | H/R | H/R |
02 | + | H/R | H/R |
03 | - | R/R | R/R |
05 | + | H/H | H/H |
06 | - | R/R | R/R |
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Claims (18)
1. Un procedimiento para la tipiificación de los
alelos del Antígeno Menor de Histocompatibilidad
HA-1 en una muestra, comprendiendo dicho
procedimiento la detección de nucleótidos polimórficos en el ADNc o
los ácidos nucleicos genómicos de dichos alelos, en el que dichos
nucleótidos polimórficos se detectan en una región de dicho alelo
que se corresponde con la SEC ID Nº 17 ó 19 en, de manera
respectiva, el alelo HA-1 R o el alelo
HA-1 H.
2. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, caracterizado de manera adicional porque
dichos alelos del Antígeno Menor de Histocompatibilidad
HA-1 son el alelo H y el alelo R identificados por
la SEC ID Nº 17 y la SEC ID Nº 19.
3. Un procedimiento para la tipificación
genómica de acuerdo con la reivindicación 1 a 2 comprendiendo dicho
procedimiento:
- a)
- poner en contacto los ácidos polinucleicos genómicos en la muestra con al menos un par de cebadores en los que el cebador 5'- y/o el 3' de al menos uno de dicho par de cebadores es capaz de hibridarse de manera específica con las regiones diana que comprenden los nucleótidos polimórficos en dichos alelos, en el que dichos nucleótidos polimórficos se detectan en una región de dicho alelo que corresponde con la SEC ID Nº 17 ó 19 en, de manera respectiva, el alelo HA-1 R o el alelo HA-1 H, y llevando a cabo una reacción de amplificación;
- b)
- para cada uno de al menos dicho par de cebadores detectar si se forma o no un producto de amplificación en la etapa a);
- c)
- inferir a partir del resultado de la etapa b) qué alelo HA-1 está presente en dicha muestra.
4. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado de manera adicional
porque:
al menos uno de dicho par de cebadores comprende
un cebador 5'- que es capaz de hibridarse de manera específica con
una región diana que comprende los nucleótidos en posición 4 o en
las posiciones 4 y 8 en el alelo HA-1, o,
al menos uno de dicho par de cebadores comprende
un cebador 3' que es capaz de hibridarse de manera específica con
una región diana que comprende los nucleótidos en posición 8 o en
las posiciones 4 y 8 en el alelo HA-1,
en el que la posición 1 es la posición del primer
nucleótido de la SEC ID Nº 17 ó 19.
5. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado de manera adicional
porque se escogen los cebadores a partir de la siguiente lista:
SEC ID Nº 2, SEC ID Nº 3, SEC ID Nº 4, SEC ID Nº
5, SEC ID Nº 6, SEC ID Nº 7.
6. Un procedimiento para la tipificación genómica
de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, comprendiendo dicho
procedimiento:
- a)
- amplificar un fragmento de dichos alelos, comprendiendo dicho fragmento al menos un nucleótido polimórfico en el que dichos nucleótidos polimórficos se detectan en una región de dicho alelo que corresponde con la SEC ID Nº 17 ó 19 en, de manera respectiva, el alelo HA-1 R o el alelo HA-1 H, mediante el uso de al menos un par de cebadores que se hibridan de manera específica con las regiones diana en dichos alelos sin nucleótidos polimórficos;
- b)
- hibridar el producto amplificado de la etapa a) con al menos una sonda que se hibrida de manera específica con una región diana que comprende uno o más nucleótidos polimórficos en dicho alelo;
- c)
- inferir a partir del resultado de la etapa b qué alelo HA-1 está presente está presente en dicha muestra.
7. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 6, caracterizado de manera adicional porque al
menos uno de dicho par de cebadores comprende un cebador 5'- que se
hibrida de manera específica con una región diana sin nucleótidos
polimórficos que se corresponde con la secuencia GTGTTGCGTGACG de
dicho alelo HA-1 y/o un cebador 3' que se hibrida de
manera específica con una región diana sin nucleótidos polimórficos
en una región que se corresponde con la SEC ID Nº 1 de dicho alelo
HA-1.
8. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 6 ó 7 caracterizado de manera adicional
porque al menos una sonda se hibrida de manera específica con una
región diana que comprende los nucleótidos en posición 4 y/u 8 en el
alelo HA-1, en el que la posición 1 es la posición
del primer nucleótido de la SEC ID Nº 17 ó 19.
9. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de
las reividicaciones 6 a 8, caracterizado de manera adicional
porque:
dichos cebadores se escogen de la siguiente
lista:
SEC ID Nº 2, SEC ID Nº 8, SEC ID Nº 9, SEC ID Nº
10, y/o dichas sondas se escogen a partir de la siguiente lista:
SEC ID Nº 11, SEC ID Nº 12, SEC ID Nº 13, SEC ID
Nº 14, SEC ID Nº 15, SEC ID Nº 16.
10. Un cebador para uso en un procedimiento de
acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para la
tipificación genómica de los alelos del Antígeno Menor de
Histocompatibilidad HA-1, que presenta al menos un
80% de homología en la secuencia con la SEC ID Nº 17 o la SEC ID Nº
19.
11. Una sonda para uso en un procedimiento de
acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9 para la
tipificación genómica de los alelos del Antígeno Menor de
Histocompatibilidad HA-1, que presenta al menos un
80% de homología en la secuencia con la SEC ID Nº 17 o la SEC ID Nº
19.
12. Un ácido polinucleico aislado identificado
por la SEC ID Nº 17 o la SEC ID Nº 19 o un ácido polinucleico
aislado que presenta al menos un 80% de homología en la secuencia
con dichos ácidos polinucleicos.
13. Un procedimiento para la tipificación
genómica de los alelos del Antígeno Menor de Histocompatibilidad
HA-1 de acuerdo con las reivindicaciones 1 ó 2 por
medio del secuenciamiento de dicho alelo.
14. Un equipo diagnóstico para la tipificación
de los alelos del Antígeno Menor de Histocompatibilidad
HA-1 de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 3 a 6, comprendiendo dicho equipo:
- a)
- al menos un cebador capaz de hibridarse de manera específica con las regiones diana que comprenden los nucleótidos polimórficos en dichos alelos, en el que dichos nucleótidos polimórficos se detectan en una región de dicho alelo que se corresponde con la SEC ID Nº 17 ó 19, de manera respectiva, el alelo HA-1 R o el alelo HA-1 H;
- b)
- de manera opcional, un enzima y/o los reactivos que permiten la reacción de amplificación;
- c)
- de manera opcional, los medios que permiten la detección de los productos amplificados.
15. Un equipo diagnóstico para la tipificación
genómica de los alelos del Antígeno Menor de Histocompatibilidad
HA-1 de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 6 a 9, comprendiendo dicho equipo:
- a)
- al menos un cebador que se hibrida de manera específica con las regiones diana sin nucleótidos polimórficos en dichos alelos;
- b)
- al menos una sonda que se hibrida de manera específica con una región diana que comprende uno o más nucleótidos polimórficos en dicho alelo, en el que dichos nucleótidos polimórficos se detectan en una región de dicho alelo que se corresponde con la SEC ID Nº 17 o 18 en, de manera respectiva, el alelo HA-1 R o el alelo HA-1 H;
- c)
- de manera opcional, un enzima y/o los reactivos que permiten la reacción de amplificación, y/o los reactivos que permiten la reacción de hibridación.
16. Un equipo diagnóstico para la tipificación
genómica de los alelos del Antígeno Menor de Histocompatibilidad
HA-1 de acuerdo con la reivindicación 13,
comprendiendo dicho equipo:
- a)
- al menos un cebador capaz de hibridarse de manera específica con las regiones diana sin nucleótidos polimórficos en dichos alelos;
- b)
- al menos un cebador capaz de hibridarse de manera específica con una región diana que comprende uno o más nucleótidos polimórficos en dicho alelo, en el que dichos nucleótidos polimórficos se detectan en una región de dicho alelo que corresponde con la SEC ID Nº 17 ó 19 en, de manera respectiva, el alelo HA-1 R o el alelo HA-1 H;
- c)
- de manera opcional, un enzima y/o los reactivos que permiten la reacción de amplificación, y/o los reactivos que permiten la reacción de secuenciamiento.
17. Un procedimiento para la tipificación de los
alelos HA-1 que comprende la utilización de
anticuerpos que detectan de manera específica los alelos
HA-1 identificados mediante la SEC ID Nº 18 y la SEC
ID Nº 20.
18. Un equipo diagnóstico para la tipificación
de los alelos HA-1 que comprende los anticuerpos que
detectan de manera específica los alelos HA-1
identificados mediante la SEC ID Nº 18 y la SEC ID Nº 20.
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