JP2002510978A

JP2002510978A - 副組織適合性抗原ｈａ―１のタイピング法

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Publication number: JP2002510978A
Application number: JP50936899A
Authority: JP
Inventors: エルスハウルミー
Original assignee: レイクスウニヴェルシテイトレイデン
Priority date: 1997-07-23
Filing date: 1998-07-23
Publication date: 2002-04-09
Also published as: AU9071398A; ES2256953T3; DE69833120T2; WO1999005313A2; WO1999005313A3; CA2266456A1; EP0966545B1; US20050233350A1; AU732952B2; DK0966545T3; US6830883B1; ATE315103T1; EP0966545A2; DE69833120D1

Abstract

(57)【要約】本発明は、サンプル中の副組織適合性抗原HA-1の対立遺伝子のタイピングのための方法を提供し、該方法はa)該サンプル中の該ゲノムポリ核酸を、少なくとも１対のプライマーと接触させて、該少なくとも一対のプライマーの5'−および／または3'−プライマーを、該対立遺伝子中の多形性ヌクレオチドを含むターゲット領域と特異的にハイブリッド化し、かつ増幅反応を実施し、b)該少なくとも１対のプライマー各々について、該工程a)において増幅生成物が形成されたか否かを検出し、c)該サンプル中に、どのHA-1の対立遺伝子が存在するかを、該工程b)の結果から推定する工程を含む。本発明は、またサンプル中の該副組織適合性抗原HA-1の対立遺伝子のゲノムタイピングのための方法を提供し、該方法はa)少なくとも一つの多形性ヌクレオチドを含む、該対立遺伝子のフラグメントを、該対立遺伝子内の保存されたターゲット領域と特異的にハイブリッド化している、少なくとも１対のプライマーを使用することにより増幅し、b)該工程a)の増幅された生成物を、該対立遺伝子内の１以上の多形性ヌクレオチドを含むターゲット領域と特異的にハイブリッド化している、少なくとも１つのプローブとハイブリッド化し、c)該サンプル中に、どのHA-1の対立遺伝子が存在するかを、該工程b)の結果から推定する工程を含む。更に、本発明は上記方法で使用するためのプライマーおよびプローブを提供する。該方法の実施を可能とする、診断用のキットをも提供する。

Description

【発明の詳細な説明】副組織適合性抗原HA-1のタイピング法本発明は、副組織適合性抗原(minor histocompatiblilty)のタイピングの分野に関連する。本発明が関連する領域の一つであり、かつ本発明が出発点とした領域である骨髄移植(BMT)は、例えば重度の再生不良性貧血、白血病および免疫不全疾患の治療において、その用途が見出されている。この技術の初期においては、多くの移植が宿主による該移植片の拒絶反応により失敗した。しかしながら、成功した移植はしばしば、該宿主の種々の組織に対して、該移植片中に存在するリンパ細胞による免疫応答をもたらした(移植片対宿主疾患(GvHD))。今では、このGvHD応答は、主として、移植障壁として存在する主要組織適合性(H)抗原の存在に起因するものであることが知られている。従って、骨髄移植におけるより改善された成功率を与える、（同胞または非関連個体何れか由来の）HLA-適合性物質のみを移植することが、今日の日常的な慣習となっている。しかしながら、この改善並びに予備移植化学療法または放射線療法における改善および強力な免疫抑制薬物の入手可能性にも拘らず、治療した患者の約20-70%が、依然としてGvHDに罹っている(この割合は、年齢および骨髄ドナー依存性である)。GvHDを回避するために、この反応の原因となる細胞（成熟Ｔ細胞）を該移植片から除去することが示唆されている。しかしながら、これはしばしば、移植の失敗または元の疾患の再発をもたらす。GvHDの原因となる該細胞は、また白血病等に見られるような、元の異常な細胞に対してしばしば反応する細胞でもある(移植片対白血病応答)。 BMTは、今日では主としてHLA適合移植片を使用して実施しているので、依然として発生する該GvHDは、他の抗原群により引き起こされるはずである。（主要Ｈ抗原とは違って）非-MHCコード組織適合性抗原である、一連の所謂副Ｈ抗原(mHa g)が、残りのGvHDの発生率に対して少なくとも部分的にその原因となっている可能性が非常に高い。mHagは、もともとは腫瘍拒絶および皮膚拒絶反応におけるマウスの共通遺伝子系において発見された。マウスにおいて、同系繁殖系の使用は、該mHagが、ゲノム全体に渡り散在する殆ど50もの異なる対立遺伝子型多形性遺伝子座によりコードされることを示した。同定することは厄介であるが、ヒトにおいて、mHagが存在することが明らかにされているが、その全体としての数および複雑度は未確認である。副Ｈ抗原は、相互に全く異なっており、また主要Ｈ抗原とも全く異なっているものと考えられ、これらは恐らく種々の細胞のハウスキーピング機能に関与する分子の、多様かつ確認しにくい一群のフラグメントであると思われる。その抗原性は極めて偶発的に、MHC生成物と結合した多形性タンパクの自然に処理されたフラグメントとして生ずる可能性がある。該岨抗原の幾つかは、身体全体に渡る種々の組織上で広範に発現されると考えられるが、他のものは限られた組織分布を示す。よりよく知られた副組織適合性抗原の一つは、H-Y抗原である。このH-Yは、特に女性のドナーが以前に妊娠した経験がある場合には、HLA-適合男性器官および骨髄移植の、該女性レシピエントによる拒絶反応、および女性対男性移植におけるGvHDの高い発生率に導く可能性のある、mH抗原である。該H-Y抗原は、また精子形成において重要な役割を演じている可能性がある。このヒトH-Y抗原は、進化的に保存された染色体タンパクであるSMCYを由来とする、11残基をもつペプチドである。GvHDに導く、もう一つのよく知られたmH抗原は、HA-2抗原である。このヒトHA-2抗原は多分クラスＩミオシンから誘導された９残基をもつペプチドである。しかしながら、GvHDの一般的な場合の大部分の原因となる、このHA-1抗原の性質は、依然として確認できないままである。重度の再生不良性貧血、白血病および免疫不全疾患の治療として実施されるヒト骨髄移植は、70例において利用された。現在は、同種異系骨髄移植(BMT)の長期に渡る結果は、骨髄ドナーとしてHLA-適合性同胞の利用、進歩した移植前の化学放射線療法、強力な免疫抑制薬剤、例えば移植片対宿主疾患(GVHD)予防、より良好な抗体および単離手順により大幅に改善されつつある。それにも拘らず、臨床的なBMTの結果は、MHC同一性ドナー／レシピエントの選択が、ドナーとレシピエントとが密接に関係していても、GVHDの回避または疾患を伴わない生存の保証がないことを明らかにした。特に成人における同種異系BMTは、該移植片のＴ細胞の欠乏量に依存して、GVHDの場合の80%までに見られる。該HLAの遺伝子型について同等な状況において、これは15-35%に達し、一方で表現型についてHLA適合性のレシピエント／ドナーの組み合わせにおいては、GVHDの発症率は著しく高く、50-80% である。ドナーとレシピエントとの間の副組織適合性抗原(mHag)に関する不適合性は、GVHDまたは移植片不良に関連する潜在的な危険性を構成し、これらは生活上、器官および骨髄移植レシピエントの長期に渡る薬理的な免疫抑制を必要とする。mHagが、「有利な」GVHDの副作用、即ち該移植片対白血病活性に関与しているものと考えられている。幾つかの報告は、HLAと遺伝子型について同一のBMT後に、GVHDに罹った患者における、抗−宿主mHag特異的CTLの存在を明らかにした。我々の研究室においては、（少）数の抗−宿主mHag特異的CTLSの更なる特徴付けに多大な努力が払われた。これまでに、宿主mHagに対して特異的なCTLクローンは、重度のGvHDに罹った患者の末梢血管(PBL)から単離された。mHagHA-1特異的CD8⁺CTLクローンは、HLAと同一であるがmHagとは非類似のBMT後に、GvHDに罹った３名の患者由来の、インビボで感作されたPBLの再刺激の後、初めて得られた。この後BMT CTL系を限界希釈によりクローニングし、多数のmHag−特異的CTL クローンを単離した。後の免疫原的な分析は、このCTLクローンは、（上記のように）５種の性に無関係のmHag、即ちHA-1、-2、-3、-4および-5と命名されたmH agを同定し、これらは古典的なMHC制限様式で識別されることを明らかにした。m HagHA-3は、HLA-A1の存在下で認識され、またmHagHA-1、-2、-4および-5の認識は、HLA-A2の存在を必要とした。分離の研究は、mHaGHA-1〜HA-5各々が、メンデル遺伝方式で分離された単一の遺伝子の生成物であり、かつHA-1およびHA-2が、該HLA領域でコードされないことを明らかにした。該mHagは表現型の頻度において相互に異なっており、mHagHA-1は比較的高頻度(即ち、69%)で出現し、一方でm HagHA-2は、HLA-A2正の健康な集団において、極めて高い頻度(即ち、95%)で出現した。本発明の、BMT後の５名の患者における、mHagHA-1、-2、-3、-4および-5 特異的抗−宿主CTL応答は、３名の患者における、該mHagHA-1特異的クローンの存在を明らかにした。この観測は、mhagHA-1の免疫優性挙動を暗示している。種々の組織上で発現された該mHagに関連して、我々は該解析されたmHagの偏在−制限組織分布を観測した。該mhagHA-1の発現は、造血細胞系統の細胞、例えば胸腺細胞、末梢血リンパ細胞、Ｂ細胞、単球に制限されている。また、骨髄由来のプロフェッショナル(professional)抗原呈示細胞、樹状細胞および表皮ランゲルハンス細胞も、このmHagHA-1を発現する。このmHagHA-1は、またクロノジェン白血病先駆体細胞並びに新たに単離された骨髄系細胞およびリンパ様白血病細胞上で発現され、これはmHag特異的CTLが、白血病細胞の、HLAクラスＩの制限された抗原特異的溶解を可能とすることを示している。ヒトmH抗原系の重要性を立証するために、我々は、該mHagが、ヒトとヒト以外の霊長類との間の進化において保存されているか否かを検証した。これまでに、ヒト以外の霊長類由来の細胞を、ヒトHLAA2.1遺伝子でトランスフェクションした。我々のヒト同種HLA-A2.1および４種のmHagA2.1 制限CLTクローンに関するその後の解析は、類人猿およびサルのターゲット細胞によりトランスフェクションした、ヒトHLA-A2.1分子との関連で、類人猿およびサルの同種およびmHagHY、HA-1およびHA-2ペプチドの発現を明らかにした。このことは、該HA-1ペプチドが、少なくとも３千５百万年間に渡って保存されていることを示す。この予測的研究は、急性(等級≧2)GVHDの発生率に対する、HLAと遺伝子型について同一のBMTにおけるmHagの効果および臨床的な関連性を実証するために実施した。十分に定義された５種のmHagHA-1〜HA-5に対して特異的な該CT Lクローンを使用した、該mHagのタイピングの結果は、mHagHA-1、-2、-4および- 5不整合とGVHDとの間の有意な相関関係を立証した。GVHDの発症に関する有意な相関性(P=0.024)が、mHagHA-1についてのみ解析した場合に観測された。該mHagH A-1の推定的なペプチド特性の解析のために、我々は、該細胞表面におけるmhag ペプチド発現に対する、該MHCをコードするTAP1およびTAP2遺伝子生成物の要件を分析した。抗原発現に関連する、トランスポーター遺伝子TAP1およびTAP2が、小胞体を有するサイトゾルからのペプチドの放出のために必要とされる。トランスポートおよびプロテアソームサブユニット遺伝子両者を欠く、ヒト細胞系“T2 ”の利用性は、我々がヒトmHagの処理および表示に関する研究を行うことを可能とした。我々は、該（ラット）トランスポート遺伝子生成物TAP1およびTAP2uが、該細胞内mHタンパクHA-1由来の抗原性ペプチドの処理および表示にとって必要であることを明らかにした。ヒトにおけるTCRレパートリーの後BMTに関する情報は、極めて少ない。我々は、mHag HA-1特異的CD8+CLTクローンの、Ｔ細胞レセプタ(TCR)のＹ領域の組成を、該αおよびβ鎖のDNA配列決定により分析した。我々は、３種の関連性をもたない個体由来の12個のクローンのTCR利用性を分析することにより、該TcRβ鎖全てが、TC RβV6S9遺伝子セグメントを使用しており、かつ該N-D-N領域内で顕著な類似性を示すことを観測した。しかしながら、本発明以前には、誰も該mHagHA-1抗原に関連する抗原性ペプチドのアミノ酸配列を同定することに成功しておらず、またこの抗原が由来とする該タンパクの同定に成功した者はいなかった。従って、本発明の目的の一つは、該HA-1抗原のアミノ酸配列を明らかにすることにある。また、該HA-1抗原の核酸配列、より具体的にはそのcDNAおよびHA-1抗原をコードするゲノム配列を導くことも、本発明の目的の一つである。本発明の目的は、またHA-1抗原のタイピングを可能とするプライマーおよびプローブを提供することにある。 HA-1抗原をタイピングすることを可能とする、キットを提供することも、本発明の目的の一つである。本発明者等は、mHagHA-1の関連部分であるペプチドを、初めて同定した。本発明者等は、またそのcDNA配列並びに２つのHA-1の対立遺伝子のゲノム配列を同定した。本発明者等は、初めて、配列VLXDDLLEAを含む該副組織適合性抗原HA-1から得ることのできる、T-細胞エピトープを含有する（ポリ）ペプチド、または同様な機能または免疫学的特性をもつその誘導体を記載する。ここで、Ｘはヒスチジン (H)またはアルギニン(R)残基である。本発明において意図している診断的用途は、HA-1のタイピング、遺伝的異常性の検出等であるが、これらに制限されない。ここに記載するペプチドを基にして、該タンパクをコードする遺伝子のスクリーニングにおいて使用可能な、遺伝子プローブまたはプライマーを製造した。ここに記載するペプチドを基にして、抗−イディオタイプＢ細胞および／またはＴ細胞並びに抗体を製造することができる。適当なドナーまたはレシピエントの検出を可能とする、種々の技術を使用することができ、これは、以下に更に説明されるであろうHA-1関連核酸配列の増幅またはHA-1関連ペプチド配列の免疫学的な検出に基づくものである。一態様によれば、本発明はサンプル中の該副組織適合性抗原HA-1の対立遺伝子のタイピングのための方法に係わり、該方法は、該cDNAまたは該対立遺伝子、より具体的には第５図に示すような、HA-1の該ＨおよびＲ対立遺伝子のゲノム核酸中の多形性ヌクレオチドの検出工程を含む。好ましい一態様においては、該タイピング法は、ゲノムDNAのタイピング法である。また、該方法はcDNAのタイピング法でもあり得る。本発明のもう一つの態様は、サンプル中の該副組織適合性抗原HA-1の対立遺伝子のゲノムタイピング法に係わり、該方法は a)サンプル中の該ゲノムポリ核酸を、少なくとも１対のプライマーと接触させて、該少なくとも一対のプライマーの5'−および／または3'−プライマーを、該対立遺伝子中の多形性ヌクレオチドを含むターゲット領域と特異的にハイブリッド化し、かつ増幅反応を実施し、 b)該少なくとも１対のプライマー各々について、該工程a)において増幅生成物が形成されたか否かを検出し、 c)該サンプル中に、どのHA-1の対立遺伝子が存在するかを、該工程b)の結果から推定する工程を含む。好ましい態様によれば、本発明は上記方法に関連し、該方法は更に該副組織適合性抗原HA-1の該対立遺伝子が、第５図に示すような該Ｈ対立遺伝子および該Ｒ対立遺伝子であることを特徴とする。本発明は、予想外のことに、該RT-PCR法で使用した該プライマーは、ゲノム DNAを鋳型として使用した場合には、特異的ポリマー核酸フラグメントの増幅を生じないことを教示する。この問題を解決するために、本発明は、また該HA-1の遺伝子座のゲノム構造をも記載する。実施例３で説明するように、このゲノム構造の解析は、該HA-1ペプチドが２つのエキソン（第５図）によりコードされることを示している。スプライスドナーサイトが、該HA-1コード配列中の該多形性コドンの４ヌクレオチド後方に配置されている。従って、該HA-1抗原のゲノムタイピング法の実施は、該HA-1コード配列に介在しているイントロンに関する配列情報を必要とする。この配列情報は、本発明により与えられ、かつ以下に配列番号１として示されている。この配列は、該介在するイントロン（第５図においてイントロンａとして示されている）の一部を示し、この配列の第一のヌクレオチドは、イントロンａの最初のヌクレオチドである。従って、本発明はまた、配列番号１により特定される単離ポリ核酸、あるいは配列番号１に対して少なくとも80%、または少なくとも9 0%、あるいは少なくとも95%もしくは少なくとも99%の配列相同性を示す単離ポリ核酸、またはプライマーまたはプローブとして使用できる、該ポリ核酸の任意のフラグメントにも関連する。イントロンａのもう一つの部分、より具体的にはエキソンｂ（第５図）の前方に位置する部分に対応する配列情報は、EMBLデータベースに、承認番号AC00415 1の下で記載されている。しかしながら、この配列は、上記方法用のプライマーの設計のためには不適当である。というのは、この増幅されたフラグメントの長さは、該増幅反応の効率を低下するであろうからである。本発明はまた、配列番号17(HA-1 R対立遺伝子)により特定される単離ポリ核酸、あるいは配列番号17に対して少なくとも80%、または少なくとも90%、あるいは少なくとも95%もしくは少なくとも99%の配列相同性を示す単離ポリ核酸、またはプライマーまたはプローブとして使用できる、該ポリ核酸の任意のフラグメントにも関連する。本発明はまた、配列番号18(HA-1 R対立遺伝子)により特定される単離ポリ核酸、あるいは配列番号18に対して少なくとも80%、または少なくとも90%、あるいは少なくとも95%もしくは少なくとも99%の配列相同性を示す単離ポリ核酸、またはプライマーまたはプローブとして使用できる、該ポリ核酸の任意のフラグメントにも関連する。本発明はまた、配列番号17または18の境界上にあるKIAA0223(GENBANK承認番号 D86976)の配列、特に該KIAA0223配列中の配列番号17または18の5'側にある配列の任意の部分にも関する。このような配列は、本発明の請求の範囲に記載したような、HA-1のタイピングのためのプライマーの設計のために有用である。上記工程ｂに記載した該増幅生成物の検出のために、当分野で公知の種々の方法を利用できる。その一つの方法は、該増幅反応後に得られる混合物を、ゲル電気泳動操作にかけ、核酸の染色後に、該増幅生成物を肉眼で検出することからなる。あるいはまた、該増幅生成物を、例えば標識したプライマーを使用することにより標識でき、またハイブリダイゼーション等により固体担体上に捕獲することができ、また該固体担体上で検出することができる。しかしながら、その他の検出方法も、本発明の範囲内にあることは明らかである。より好ましい態様の一つによれば、本発明は上記のような方法に係わり、該方法は更に該少なくとも１対のプライマーが、該HA-1対立遺伝子内の位置４または位置４および８にヌクレオチドを含む、ターゲット領域と特異的にハイブリッド化する5'−プライマーを含み、あるいは該少なくとも１対のプライマーが、該HA-1対立遺伝子内の位置８または位置４および８にヌクレオチドを含む、ターゲット領域と特異的にハイブリッド化する 3'−プライマーを含むことにより特徴付けられ、その位置は第５図に示されている。より好ましい態様によれば、本発明は上記のような方法に係わり、該方法は更に該5'−プライマーが、イントロンａ内のターゲット領域と特異的にハイブリッド化している、3'−プライマーと結合しているか、および／または該3'−プライマーが、エキソンａ内のターゲット領域と特異的にハイブリッド化している、5'−プライマーと結合していることにより特徴付けられ、イントロンａおよびエキソンａは第５図に示されている。この態様によれば、イントロンａにおける該ターゲット領域は、上で説明したように、配列番号１により特定される配列内に、理想的に配置されている。また、エキソンａ内のターゲット領域と特異的にハイブリッド化している、5'−プライマーと結合している、該3'−プライマーの該ターゲット領域は、必然的に配列番号１により特定される配列と重なり合うであろう。更に好ましい実施態様によれば、本発明は、プライマーが表１から選ばれることを更に特徴とする、上記方法に関する。組１は共通の5'−プライマー（フォワード）及び２種の異なる3'-プライマー（リバース）(一つはＨ対立遺伝子に関するプライマーであり、また一つはＲ対立遺伝子に関するプライマーである)からなる。共通の5'-プライマーの標的領域はエクソンａ中に配置される。3'-プライマーの標的領域はHA-1コーディング配列（図５）中の位置４及び８の多形ヌクレオチドを含み、配列番号１により同定された配列と一部オーバーラップする。組２は共通の3'-プライマー及び２種の異なる5'-プライマーからなる。共通プライマーの標的領域は配列番号１により同定された配列中に配置され、一方、5'-プライマーの標的領域はエクソンａ中に配置され、位置４及び８に多形ヌクレオチドを含む。実施例６はこれらのプライマー組を使用するゲノムタイピング実験を示す。別の好ましい実施態様によれば、本発明は上記方法のいずれかによる副組織適合抗原HA-1の対立遺伝子のゲノムタイピング用の診断キットに関するものであり、前記キットは a)上記方法のいずれかに記載の少なくとも一種のプライマー、 b)必要により、増幅反応を可能にする酵素及び／または試薬、 c)必要により、増幅産物の検出を可能にする手段を含む。別の好ましい実施態様によれば、本発明はサンプル中の副組織適合抗原HA-1の対立遺伝子のゲノムタイピング方法に関するものであり、前記方法は a)前記対立遺伝子のフラグメント（前記フラグメントは少なくとも一種の多形ヌクレオチドを含む）を前記対立遺伝子中の保存標的領域に特異的にハイブリッド形成するプライマーの少なくとも一つの対の使用により増幅し、 b)工程a)の増幅産物を前記対立遺伝子中に一種以上の多形ヌクレオチドを含む標的領域に特異的にハイブリッド形成する少なくとも一種のプローブにハイブリッド形成し、 c)工程b)の結果からどのHA-1対立遺伝子が前記サンプル中に存在するのかを推定することを特徴とする。更に好ましい実施態様によれば、本発明は、副組織適合抗原HA-1の前記対立遺伝子がＨ対立遺伝子及びＲ対立遺伝子であることを更に特徴とする、上記方法に関する。更に好ましい実施態様によれば、本発明は、プライマーの少なくとも一つの対がエクソンａ中の保存標的領域に特異的にハイブリッド形成する5'-プライマー及び／またはイントロンａ中の保存標的領域に特異的にハイブリッド形成する3' -プライマーを含み、エクソンａ及びイントロンａが図５に示されることを更に特徴とする、上記方法に関する。理想的には、前記3'-プライマーの標的領域は配列番号１として同定された配列中に配置される。明らかに、前記3'-プライマーの標的領域はまたこの配列の下流、即ち、イントロンａ、イントロンｂ、エクソンｂ中、または更にはエクソンｂの下流に配置されてもよいが、増幅反応の効率は増幅フラグメントが長くなるにつれておそらく低くなる。更に好ましい実施態様によれば、本発明は、前記少なくとも一種のプローブがHA-1対立遺伝子中の位置４及び／または８のヌクレオチドを含む標的領域に特異的にハイブリッド形成し、前記位置が図５に示されることを更に特徴とする、上記方法に関する。更に好ましい実施態様によれば、本発明は、前記プライマー及び／または前記プローブが表２から選ばれることを更に特徴とする、上記方法に関する。プライマー3P1及び3P2は配列番号１中の標的配列に特異的にハイブリッド形成する。プライマー3P3の標的領域はエクソンｂの下流に配置される。表２のプローブは全てエクソンａ−イントロンａ境界とオーバーラップする標的領域に特異的にハイブリッド形成する。配列番号11〜16を有するプローブがLiPAアッセイ（以下を参照のこと）で同じ条件で組み合わせて機能するように最適化された。当業者は、配列番号２〜16を有するプローブ及びプライマーがそれらの端における一種以上のヌクレオチドの付加または欠失により適合されてもよいことを認めるであろう。増幅もしくはハイブリダイゼーションの条件が変化される場合、または増幅物質がNASBA系の場合のようにＤＮＡに代えてＲＮＡである場合、このような適合が必要とされるかもしれない。異なる技術が本発明の配列特異的ハイブリダイゼーション方法を行うのに適用し得る。これらの技術は増幅HA-1 ポリ核酸を固体担体に固定し、標識オリゴヌクレオチドプローブでハイブリダイゼーションを行うことを含んでもよい。また、ゲノムポリ核酸は先に増幅しないで固体担体に固定され、ハイブリダイゼーションにかけられてもよい。また、プローブが固体担体に固定されてもよく、ハイブリダイゼーションが好ましくは増幅後に標識HA-1ポリ核酸を用いて行われてもよい。この技術が逆ハイブリダイゼーションと称される。都合の良い逆ハイブリダイゼーション技術はライン・プローブアッセイ(LiPA)である。このアッセイは固体担体ストリップに平行な線として固定されるオリゴヌクレオチドプローブを使用する(Stuyverら，1993)。HA-1 対立遺伝子のゲノムタイピングに関するあらゆるその他の技術がまた本発明により含まれることが理解されるべきである。また、本発明は配列番号２〜10を有するあらゆるプライマー及び配列番号11〜 16を有するあらゆるプローブに関することが明らかであり、前記プライマー及び前記プローブは副組織適合抗原HA-1の対立遺伝子のゲノムタイピング方法に使用される。別の好ましい実施態様によれば、本発明は上記配列特異的ハイブリダイゼーション方法のいずれかによる副組織適合抗原HA-1の対立遺伝子のゲノムタイピング用の診断キットに関するものであり、前記キットは a)上記方法のいずれかに記載の少なくとも一種のプライマー、 b)必要により、増幅反応を可能にする酵素及び／または試薬、及び／またはハイブリダイゼーション反応を可能にする試薬を含む。別の好ましい実施態様によれば、本発明は上記配列特異的ハイブリダイゼーション方法のいずれかによる副組織適合抗原HA-1の対立遺伝子のゲノムタイピング用の診断キットに関するものであり、前記キットは a)上記方法のいずれかに記載の少なくとも一種のプライマー、 b)上記方法のいずれかに記載の少なくとも一種のプローブ、 c)必要により、増幅反応を可能にする酵素及び／または試薬、及び／またはハイブリダイゼーション反応を可能にする試薬を含む。別の実施態様によれば、本発明はまた前記対立遺伝子を配列決定することによる副組織適合抗原HA-1の対立遺伝子のタイピング方法に関する。別の実施態様によれば、本発明はまた前記配列決定方法を行うためのキットに関する。別の実施態様によれば、本発明はまた図５に示されたHA-1対立遺伝子を特異的に検出する抗体を使用することを特徴とするHA-1対立遺伝子のタイピング方法に関する。前記抗体はモノクローナル抗体であることが好ましく、当業界で知られているあらゆる方法により産生し得る。別の実施態様によれば、本発明はまた図５に示されたHA-1対立遺伝子を特異的に検出する抗体を使用することを特徴とするHA-1対立遺伝子のタイピング用の診断キットに関する。定義以下の定義及び説明は本発明の良き理解を可能にするであろう。分析されるサンプル中の標的物質はゲノムＤＮＡまたはその増幅された変種であろう。これらの分子はまた本件出願において“ポリ核酸”と称される。公知の抽出操作及び精製操作がサンプルからのＲＮＡまたはＤＮＡの単離に利用し得る（例えば、Sambrookら，1989）。 “多形ヌクレオチド”はその他のHA-1対立遺伝子中の相当する位置で見られるヌクレオチドの少なくとも一種とは異なる所定のHA-1対立遺伝子の配列のヌクレオチドを表す。 HA-1対立遺伝子の“タイピング”という用語は対立遺伝子の同定、即ち、対立遺伝子の検出及びその他のHA-1対立遺伝子からのその対立遺伝子の識別を表す。本発明の“プローブ”という用語はHA-1ポリ核酸に特異的にハイブリッド形成するように設計される一本鎖オリゴヌクレオチドを表す。本発明のプローブは長さが約５〜50ヌクレオチドであることが好ましく、約10〜30ヌクレオチドであることが更に好ましい。プローブの特に好ましい長さは10、11、12、13、14、15、 16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29または30のヌクレオチドを含む。本発明に使用されるヌクレオチドはリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド及びイノシンの如き修飾ヌクレオチドまたはそれらのハイブリダイゼーション特性を実質的に変化しない修飾基を含むヌクレオチドであってもよい。 “プライマー”という用語はコピーされる核酸ストランドに相補性であるプライマー延長産物の合成のための開始点として作用することができる一本鎖オリゴヌクレオチド配列を表す。プライマーの長さ及び配列は、それらが延長産物の合成を開始するようなものである必要がある。プライマーは長さが約5-50ヌクレオチドであることが好ましい。特定の長さ及び配列は必要とされるＤＮＡ標的またはＲＮＡ標的の複雑度に依存するだけでなく、プライマーが使用される条件、例えば、温度及びイオン濃度に依存するであろう。本発明のプライマーは、実験条件が適合されることを条件として、プローブとして使用されてもよく、またその逆であってもよいことが理解されるべきである。本発明における“好適なプライマー対”という表現はHA-1ポリ核酸フラグメントの特異的増幅を可能にするプライマーの対を表す。本発明のプローブまたはプライマーの“標的領域”という用語は、そのプローブまたはプライマーが完全相補性または部分相補性（即ち、或る程度のミスマッチを含む）であるHA-1ポリ核酸中の配列である。前記標的配列の補体がまた幾つかの場合に好適な標的配列であることが理解されるべきである。 HA-1ポリ核酸の標的領域へのプローブの“特異的ハイブリダイゼーション”は、前記プローブが使用される実験条件下でこの領域の一部または全領域と二重らせんを形成すること、及びこれらの条件下で前記プローブが分析されるサンプル中に存在するポリ核酸のその他の領域と二重らせんを形成しないことを意味する。HA-1ポリ核酸の標的領域へのプライマーの“特異的ハイブリダイゼーション ”は、増幅工程中に、前記プライマーが使用される実験条件下でこの領域の一部または全領域と二重らせんを形成すること、及びこれらの条件下で前記プライマーが分析されるサンプル中に存在するポリ核酸のその他の領域と二重らせんを形成しないことを意味する。ここに使用される“二重らせん”は特異的増幅をもたらす二重らせんを意味することが理解されるべきである。 HA-1ポリ核酸のフラグメントの“特異的増幅”は、プライマーが設計されたフラグメントの増幅を意味し、サンプル中に存在するポリ核酸のその他のフラグメントの増幅を意味するものではない。増幅プライマーが適切な増幅を補償するために鋳型中の相当する標的配列と正確にはマッチする必要がないという事実が文献(Kwokら，1990)に詳細に記載されている。しかしながら、プライマーがそれらの標的配列に全く相補性ではない場合、増幅されたフラグメントが標的配列ではなくプライマーの配列を有することが考慮されるべきである。プライマーは特別の標識（例えば、ビオチン）で標識されてもよい。使用される増幅方法はポリメラーゼ連鎖反応（PCR;Saikiら，198 8）、リガーゼ連鎖反応(LCR;Landgrenら，1988;Wu&Wallace，1989;Bara-ny，199 1)、核酸配列をベースとする増幅(NASBA;Gustolliら，1990;Compton,1991)、転写をベースとする増幅系(TAS;Kwohら，1989)、ストランド置換増幅(SDA;Duck，1 990)またはＱβレプリカーゼによる増幅(Lomeliら，1989)或いは当業界で知られている核酸分子を増幅するのに適したあらゆるその他の方法であってもよい。プローブ配列及びプライマー配列は本明細書中5'末端から3'末端への一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドとして表される。以下に特定されるプローブのいずれもががこのようなものとして、またはそれらの相補性形態もしくはそれらのＲＮＡ形態(ＴがＵにより置換される)で使用し得ることが当業者に明らかである。本発明のプローブは相当するヌクレオチド配列を含むインサートを含む組換えプラスミドのクローニング、必要により適当なヌクレアーゼの使用によるクローン化プラスミドからの後者の切除そして、例えば、分子量による分別によるそれらの回収により調製し得る。また、本発明のプローブは、例えば、通常のホスホ −トリエステル方法により化学合成し得る。プライマーまたはプローブとして使用されるオリゴヌクレオチドはまたヌクレオチド類似体、例えば、ホスホロチエート(Matsukuraら，1987)、アルキルホスホロチエート(Millerら，1979)またはペプチド核酸(Nielsenら，1991;Nielsenら，1993)を含んでもよく、またはインターカレーション剤(Asselineら，1984)を含んでもよい。本発明の当初のＤＮＡ配列に導入された殆どのその他の変化または修飾として、これらの変化は、オリゴヌクレオチドが必要とされる特異性及び感度を得るのに使用されるべきである条件に関して適合を必要とするであろう。しかしながら、ハイブリダイゼーションの最終の結果は未修飾オリゴヌクレオチドで得られた結果と実質的に同じであろう。これらの修飾の導入は特性、例えば、ハイブリダイゼーション速度論、ハイブリッド形成の可逆性、オリゴヌクレオチド分子の生物学的安定性等に積極的に影響するために有利であり得る。 “固相”という用語は、オリゴヌクレオチドプローブが結合し得るあらゆる基質を表し得るが、但し、それがそのハイブリダイゼーション特性を保持することを条件とし、またハイブリダイゼーションのバックグラウンドレベルが低く留まることを条件とする。通常、固体基質はミクロタイタ・プレート、膜（例えば、ナイロンまたはニトロセルロース）または微小球体（ビード）もしくはチップであろう。膜への適用または固定の前に、固定を促進し、またはハイブリダイゼーション効率を改良するために核酸プローブを修飾することが都合が良いかもしれない。このような修飾はホモポリマーテーリング、異なる反応性基、例えば、脂肪族基、NH₂基、SH基、カルボキシル基とのカップリング、またはビオチン、ハプテンもしくはタンパク質とのカップリングを含んでもよい。 “標識された”という用語は標識核酸の使用を表す。標識はSaikiら(1988)もしくはBejら(1990)により説明されたような増幅のポリメラーゼ工程中にとり込まれる標識ヌクレオチドまたは標識プライマーの使用、或いは当業者に知られているあらゆるその他の方法により行われてもよい。標識の性質は放射性同位元素（³²P、³⁵S等）または非放射性同位元素（ビオチン、ジゴキシゲニン等）であってもよい。 “生物学的サンプル”は、例えば、血液、口用の綿棒またはゲノムＤＮＡを含むあらゆるその他のサンプルであってもよい。所望の特性を有するプローブを設計するために、当業者に知られている下記の有益なガイドラインが適用し得る。本明細書に記載されるようなハイブリダイゼーション反応の程度及び特異性が幾つかの因子により影響されるので、一種以上のこれらの因子の操作が特別なプローブ（その標的に完全に相補性であるか否かを問わない）の正確な感度及び特異性を決めるであろう。種々のアッセイ条件の重要性及び効果が本明細書に更に説明される。 ^**［プローブ：標的］核酸ハイブリッドの安定性はアッセイ条件と適合性であるように選ばれるべきである。これは長いATに富む配列を回避することにより、ハイブリッドをG:C塩基対で終端することにより、また適当なTmを有するプローブを設計することにより達成し得る。プローブの開始点及び終点は、長さ及びGC ％が最終アッセイが行われる温度よりも約2-10℃高いTmをもたらすように選ばれるべきである。プローブの塩基組成が重要である。何とならば、G-C塩基対は付加的な水素結合のためにA-T塩基対と較べて大きい熱安定性を示すからである。こうして、高いG-C含量の相補核酸を伴うハイブリダイゼーションは高温で更に安定であろう。 ^**プローブが使用される条件、例えば、イオン濃度及びインキュベーション温度がプローブを設計する時に考慮されるべきである。ハイブリダイゼーションの程度は反応混合物のイオン濃度が増大するにつれて増大すること、またハイブリッドの熱安定性はイオン濃度を増大するにつれて増大することが知られている。一方、化学試薬、例えば、ホルムアルデヒド、尿素、DMSO及びアルコール（これらは水素結合を分断する）がハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを増大するであろう。このような試薬による水素結合の不安定化はTmを大きく低下し得る。一般に、長さ約10-50塩基の合成オリゴヌクレオチドプローブに最適のハイブリダイゼーションは所定の二重らせんの融解温度より約５℃下で起こる。最適値を下回る温度におけるインキュベーションはミスマッチ塩基配列にハイブリッド形成させ、それ故、低下された特異性をもたらし得る。 ^**高ストリンジェンシーの条件下でのみハイブリッド形成するプローブを有することが望ましい。高ストリンジェンシー条件下では、高度に相補性の核酸ハイブリッドのみが形成するであろう。相補性の充分な程度を有しないハイブリッドは形成しないであろう。それ故、アッセイ条件のストリンジェンシーはハイブリッドを形成する２種の核酸ストランドの間で必要とされる相補性の量を決める。ストリンジェンシーの程度は、標的及び非標的核酸と形成されたハイブリッド間の安定性の相違を最大にするように選ばれる。 ^**ハイブリダイゼーションに抑制性の強い内部構造を形成することが知られている標的ＤＮＡまたはＲＮＡ中の領域はそれ程好ましくない。同様に、強力な自己相補性を有するプローブは避けられるべきである。先に説明したように、ハイブリダイゼーションは水素結合した二本鎖を形成する相補核酸の二つの一本鎖の会合である。二つのストランドの一つがハイブリッドに全部または一部関与している場合、それは新しいハイブリッドの形成にそれ程関与することができないことは暗黙のことである。充分な自己相補性がある場合、プローブの一つの型の分子中に形成された分子内ハイブリッド及び分子間ハイブリッドがあり得る。このような構造は慎重なプローブ設計により避けられる。関係する配列の実質的な部分が一本鎖であるようにプローブを設計することにより、ハイブリダイゼーションの速度及び程度が大いに増大される。コンピュータ・プログラムがこの型の相互作用について探査するのに利用できる。しかしながら、或る場合には、この型の相互作用を回避することが可能ではないかもしれない。 ^**通常のハイブリダイゼーション及び洗浄条件が実施例の物質及び方法の節に開示される。その他の条件は、例えば、50℃における3X SSC(クエン酸ナトリウム食塩水)、20％の脱イオンFA（ホルムアルデヒド）である。また、プローブの特異性及び感度が維持されることを条件として、その他の溶液(SSPE(リン酸ナトリウム食塩水EDTA)、TMAC（テトラメチルアンモニウムクロリド）等)及び温度が使用し得る。必要とされる場合、プローブの長さまたは配列のわずかな変更が所定の状況下で必要とされる特異性及び感度を維持するために行われるべきである。 “ハイブリダイゼーション緩衝液”という用語は適当なストリンジェンシー条件下でプローブとサンプル中に存在するポリ核酸、または増幅産物との間のハイブリダイゼーション反応を可能にする緩衝液を意味する。 “洗浄溶液”という用語は適当なストリンジェンシー条件下で形成されたハイブリッドの洗浄を可能にする溶液を意味する。図面と表の簡単な説明表１配列特異的増幅によるHA-1対立遺伝子のゲノム分類に用いられるプライマーの配列。表２増幅及び配列特異的ハイブリッド形成によるHA-1対立遺伝子のゲノム分類に用いられるプライマーとプローブの配列表３３種のHLA-A0201陽性家系におけるHA-1の細胞とゲノムの分類表４家系１のHA-1のPCR又はLiPAによる細胞とゲノムの分類の比較表５ mH HA-1陽性及びHA-1陰性個体におけるKIAA0223配列多型性。HA-1+/+及びHA-1-/ -同型接合個体とKG-1におけるKIAA0223遺伝子のHA-1領域のシークエンシングから１つのアミノ酸の違いが生じる２つのヌクレオチドが異なる２つの対立遺伝子がわかり、HA-1^HとHA-1^Rと呼んだ。DHとvRについては６個の独立したPCR産物を配列決定した。KG-1については８個のPCR産物を配列決定した。図１．mH HA-1特異的T細胞クローン3HA15を用いた⁵¹Cr遊離分析においてHLA-A2. 1から溶離したペプチドを分画したHPLCによるHA-1の再構成。 a．90.10⁹HA-1及びHLA-A2.1陽性Rp細胞からペプチドを溶離し、有機修飾因子としてHFBAにより逆相HPLCを用いて分離した。 b．HA-1活性を含む第１HPLCの画分24を有機修飾因子としてTFAにより逆相HPLCで分画した。 c．第２勾配の画分27を含むHA-1を0.1％アセトニトリル/分からなる浅い第３勾配でクロマトグラフィー処理した。ペプチド不在下のCTLによるT2のバックグラウンド溶解はaが３％、bとcが0％であった。正の対照溶解はaが99％、bが74％、 cが66％であった。 d．HA-1候補ペプチドの定量。図1cの分離からのHPLC画分33をオンライン微量毛管カラム溶離スプリッターでクロマトグラフィー処理し、エレクトロスプレーイオン化質量分析と⁵¹Cr遊離分析により分析した。比遊離％としてのHA-1再構成活性をイオン電流として測定したペプチド候補の存在量と比較した。図２．タンデム質量分析によるmH HA-1ペプチドのシークエンシング。 a．m/z 513のペプチド候補の衝突活性化解離質量スペクトル。 b．３種のHA-1特異的T細胞クローン、3HA15、クローン15と5W38を用いた異なる濃度の合成mH HA-1ペプチドによる再構成分析。ペプチド不在下のCTLによるT2のバックグラウンド溶解は3HA15が4％、クローン15が10％及び5W38が2％であった。正の対照溶解は、3HA15が46％、クローン15が47％及び5W38が48％であった。図３．mH抗原HA-1表現型で正確に相関したKIAA0223。 a．HA-1 mH抗原分類家系におけるKIAA0223のHA-1領域を配列決定した。各家系メンバーの６つのPCR産物を配列決定した。家系メンバー00、07と09は、６つのPCR 産物中全てにHA-1^Rを発現した。家系メンバー01は２つのPCR産物中でHA-1^H対立遺伝子を発現し、４つのPCR産物中でHA-1^R対立遺伝子を発現した。家系メンバー 08は４つのPCR産物中でHA-1^H対立遺伝子を発現し、２つのPCR産物中でHA-1^R対立遺伝子を発現した。 b．HA-1表現型と正確に相関したHA-1 mH抗原分類家系におけるHA-1対立遺伝子特異的PCR反応。得られたPCR産物のサイズは、cDNA配列から演繹した予想したサイズと一致した。 c．KIAA0223のHA-1^H対立遺伝子をトランスフェクションするとmH HA-1特異的T細胞による認識がもたらされる。KIAA0223のHA-1^Hコード配列とHA-1^Rコード配列は、ヒーラ細胞へトランスフェクションしたHLA-A2.1と一緒になった。３日後にHA -1特異的CTLクローン5W38と3HA15を加え、24時間後に上清中のTNFαの遊離を測定した。クローンQ66.9はインフルエンザマトリックスペプチド58-66に特異的であった。pcDNA3.1(+)ベクターのみのトランスフェクション後にTNFα産生は見られなかった(結果は示されていない)。図４ a．HLA-A2.1へのHA-1^HとHA-1^Rペプチドの結合。HA-1^HとHA-1^Rペプチドの結合について無細胞ペプチド結合分析において組換えHLA-A2.1とβ2ミクログロブリンへの蛍光ペプチドFLPSDCFPSVの結合を阻害する能力を分析した。代表的な実験を示す。４回の実験の結果に対してIC50を求め、VLHDDLLEAが30nMであり、VLRDDLL EAが365nMであった。 b．HA-1特異的T細胞を用いた異なる濃度の合成HA-1^Rペプチドによる再構成分析。HA-1^Rペプチドを滴定し、T2細胞とプレインキュベートした。３種のHA-1特異的T細胞クローン、5W38、3HA15とクローン15を加え、４時間の⁵¹Cr遊離分析を行った。ペプチド不在下のCTLによるT2のバックグラウンド溶解は、3HA15が10％であり、クローン15が10％であり、5W38が2％であった。正の対照溶解は、3HA15が 46％であり、クローン15が47％であり、5W38が48％であった。図５ HA-1遺伝子座の配列とゲノム構造。図1a、HA-1のHとR対立遺伝子のコード配列。太字は多型性ヌクレオチドを示す。図1ｂ．HA-1遺伝子座のエキソン-イントロン境界。エキソン配列を大文字、イントロン配列を小文字で示す。図６臨床試料中のHA-1対立遺伝子のゲノム分類。表１の２組のプライマーを使用して配列特異的増幅によりゲノム分類を行った。ゲル中上の２つの断片はH対立遺伝子に由来し、下の２つの断片はR対立遺伝子に由来する。図７家系１のLiPAによるHA-1の分類実施例 1 ．実施例1:HA-1のcDNA調製 1.1結果移植片対宿主反応による疾患(GvHD)は、同種HLA同一骨髄移植(BMT)後にしばしば起こる致命的な合併症である。HLA同一骨髄のレシピエントは急性又は慢性の移植片対宿主反応による疾患を各々36％と49％生じる^1,2。マイナー組織適合性( mH)抗原と呼ばれるMHC以外の遺伝子の相違は、HLA同−BMT後のGvHDの発症に関係することが明らかである。最近の回顧的分析からmH抗原HA-1のミスマッチとHLA 同一BMT後のGvHDの誘発間にかなり関連があることがわかった³。マイナー組織適合抗原は、MHC制限T細胞によって認識され、MHC分子によって示される細胞内タンパク質に由来するペプチドであることがわかった^4,6。ここではヒトmH抗原をコードしている多型遺伝子の最初の同定が報告される。GvHD関連mH抗原HA-1は、二対立遺伝子KIAA0223遺伝子に由来するノナペプチドである。KIAA0223によってコードされたHA-1対立遺伝子対応物は、mH抗原HA-1と１つのアミノ酸でのみ異なっている。家系の研究から、HA-1特異的CTLクローンによる認識によって前に求められたようにKIAA0223遺伝子多型とHA-1表現型間の正確な相関が示された。HA -1コード遺伝子の解明は、BMTドナーとレシピエントの予想されるHA-1 DNA分類がドナー選定とGvHD予防を向上させることを可能にする。 mH抗原HA-1に特異的な細胞毒性T細胞クローンは重篤なGvHDの３人の異なる患者から単離された⁷。mH抗原HA-1はHLA-A2.1の関係に存在し、HLA-A2.1陽性集団の69％に存在した⁷。HA-1発現は、樹状突起細胞、ランケルハンス細胞や白血病細胞を含む造血起原の細胞に特異的で限定される組織であることが示された^8-10 。家系分析からHA-1のメンデル遺伝様式とMHC複合体と独立した分離が示された¹ ¹ 。異なる個体に由来する異なるHA-1特異的T細胞クローンのT細胞レセプター(TC R)配列の比較からTCR Vβ6.9の保存使用とCDR3領域の保存アミノ酸がわかった¹² 。回顧的研究においては、多くのmH抗原のミスマッチをHLA同−BMT後のGvHDとの関連について評価した。ドナーとレシピエント間の単一のHA-1ミスマッチがHLA 同一BMT後のGvHDの誘発と顕著に相関した。 mH抗原HA-1を同定するために、HLA-A2.1分子を２種のHA-1発現EBV形質転換Bリンパ芽球細胞系(EBV-BLCL)RpとBlkから精製した。HLA-A2.1結合ペプチドを酸処理により単離し、ペプチドの分画を多数回の逆相HPLCで行った。画分について⁵¹ Cr遊離分析における標的細胞としてT2細胞を用いエフェクター細胞としてHA-1特異的CTLクローンを用いてHA-1特異的溶解を誘導する能力を分析した(図1a)。画分24はHA-1活性を含み、異なる有機修飾因子を用いて逆相HPLCにより２回分画した(図1b.c.)。第3HPLC分画の画分33と34はHA-1活性⁵¹Cr遊離分析を示し、タンデム質量分析により分析した。これらの画分に100種類を超える異なるペプチドが存在することから、画分33と34の約40％をオンライン微量毛管カラム溶離スプリッターでクロマトグラフィー処理した。画分をタンデム質量分析と⁵¹Cr遊離分析により同時に分析した(図1d)。５種類のペプチド(m/z550、520、513、585と502) が活性画分に特異的に存在し、CML分析で活性を示さない画分には存在しなかった。ペプチド候補m/z550の衝突活性化解離分析から配列YXTDRVMTVがわかった。X は、この種類の質量分析で判別できないイソロイシン又はロイシンを表す。しかしながら、この配列による合成ペプチドはHA-1エピトープを再構成することができなかった(結果は示されていない)。残っている４候補がHA-1ペプチドであることを求めるために、第２HA-1精製のEBV-BLCL Blkを評価した。第２逆相HPLC分画のHA-1陽性ペプチド画分33を第３有機修飾因子を用いて微量HPLCによりクロマトグラフィー処理した。⁵¹Cr遊離分析において再構成活性の１本のピークが見られた(結果は示されていない)。これらの画分の質量スペクトル分析からペプチド候補m/z513だけが存在することがわかった。このペプチドを衝突活性化解離分析により分析し、VXHDDXXEAとして配列決定された(図2a)。ペプチドのイソロイシンとロイシン変異体を合成し、微量毛管HPLCカラムに流した。ペプチドVLHDDLLEA のみが天然処理ペプチドと同時溶離した(結果は示されていない)。次に、３種類の異なるHA-1特異的CTLクローンによるCML分析に異なる濃度で添加した合成VLHD DLLEAから、半最大活性が150〜200pMのペプチドの３クローン全て又は３クローン全てによる認識が示された(図2b)。これにより、mH抗原HA-1がノナペプチドVL HDDLLEAによって表されることが示された。 HA-1をコードしている遺伝子を同定するために行われたデータベースの検索から、HA-1ペプチドVLHDLLEAが急性骨髄性白血病KG-1細胞系(遺伝子バンク受託No. D86976)に由来するKIAA0223部分相補的DNA(cDNA)配列からのペプチドVLRDDLLEA と９個のうち８個のアミノ酸が同じであることがわかった。HA-1の集団頻度が69 ％であることから、VLRDDLLEAペプチド配列が集団の残りの31％に存在するHA-1 対立遺伝子対応物を表すと考えた。この仮定を述べるために、推定HA-1ホモ接合陽性(vR)、推定HA-1陰性個体(DH)及びKG-1細胞系に由来するEBV-BLCLのKIAA0223 の推定HA-1コード領域のcDNA配列分析を行った(表5)。HA-1 +/+個体（vR）のKIA A0223のHA-1コード領域はデータバンク中の２つのヌクレオチドの相違を示し、アミノ酸配列VLHDDLLEAとなる(HA-1^Hと名付けた)。HA-1 -/-個体(DH)のKIAA0223 のHA-1コード領域は報告されているKIAA0223配列と100％のホモロジーを示した( HA-1^Rと名付けた)。KG-1細胞株は両方のKIAA0223対立遺伝子を発現していた。KG -1はＴ細胞認識に必要な拘束分子HLA-A2.1を発現していないため、KG-1をＨＬＡ −A2.1でトランスフェクションし、この細胞を⁵¹Cr-遊離アッセイの標的細胞として、エフェクター細胞としてのHA-1特異的Ｔ細胞クローンとともに使用した。 cDNA配列解析の結果に従い、KG-1細胞HA-1特異的Ｔ細胞クローンによって認識された(データは示していない)。この結果はKIAA0223遺伝子が、HA-1^H対立遺伝子m H抗原HA-1特異的Ｔ細胞クローンによって認識されるという、２対立遺伝子系を構成することを示すものである。それまでHA-1特異的CTLによってHA-1にタイピングされていた２つの家系を、そのKIAA0223多型性についてcDNAレベルで調べた。家系１の構成員を、HA-1コード配列領域をシーケンシングすることによりKIAA0223配列多型性に関してスクリーニングした。全てのHA-1陰性構成屓はHA-1^R配列を示し、全てのHA-1陽性構成員はヘテロ接合であることが分かり、従って、朗報ともHA-1対立遺伝子を保持していた(図3a)。我々は次に細胞的にHA-1としてタイピングされていた別の家系をスクリーニングするためにHA-1対立遺伝子特異的PCRプライマーを設計した。両親および１人の子がHA-1に関してヘテロ接合であると決定され、HA-1陰性の２人の子供がHA-1^R対立遺伝子に関してホモ接合であり、１人の子供がHA-1^H対立遺伝子に関してホモ接合であると決定された(図３ｂ)。両方の家系のスクリーニングにより、HA-1特異的Ｔ細胞クローンによる認識によって決定されるHA-1表現型とKIAA0223遺伝子多型性とに正確な相関が示された。 KIAA0223遺伝子がmH抗原HA-1をコードすることをはっきりと証明するために、 HA-1^HおよびHA-1^R対立遺伝子のKIAA0223のHA-1コード配列領域を真核発現ベクターにクローニングし、HA-1陰性Hela細胞にHLA-A2.1と組み合わせてトランジェントトランスフェクションした。TNFα遊離アッセイを用いてこれらの形質転換Hel a細胞に関するHA-1特異的Ｔ細胞認識をアッセイした。HA-1^H配列を含むベクターで形質転換されたHela細胞は２種類のHA-1特異的Ｔ細胞クローン（図３ｃ）によって認識された。これに対して、HA-1^R配列を含むベクターによるトランスフェクションでは認識に至らなかった。結論として、我々の結果はmH抗原HA-1はKIAA 0223遺伝子のHA-1^H対立遺伝子によってコードされていることが明確に証明された。 HA-IRペプチドVLRDDLLEAのHLA-A2.1への結合能およびHA-1特異的Ｔ細胞クローンによって認識されるかどうかを決定するために認識およびHLA-A2.1結合アッセイを行なった。蛍光標準ペプチドのHLA-A1への結合を50％阻害するHLA-A2.1のHA -1^Rペプチドの濃度（IC50）は365nMであった。これは中間的な結合であるが、一方、HA-1^HペプチドのIC50は30nMであり、これは高親和性結合体の領域である（図４a）^13,14。３種類のHA-1特異的Ｔ細胞クローンでの⁵¹Cr-遊離アッセイにおいて種々の濃度のVLRDDLLEAをテストした。テストした３種のクローンのうちの１つ（3HA15）はHA-1^Rペプチドを認識することが示されたが、HA-1^Hペプチドの認識に必要な濃度の1000倍高いペプチド濃度においてのみである(図４ｂ)。２種類のペプチドのHLA-A2.1に対する親和性は10倍しか異ならないので、全てのＴ細胞クローンは特異的にHA-1Hペプチドを認識していると結論することが出来る。濃度下のＨＡ−１^Rペプチドを認識する３ＨＡ１５Ｔ細胞クローンは、ＨＡ−1^R のホモ接合性個体を認識しない。このことは、ＶＬＲＤＤＬＬＥＡペプチドはＨＬＡ−Ａ２．１によっては提示されないか、又はＴ細胞の検出限界未満で提示されていることを示唆している。ＨＡ−１^RペプチドＶＬＲＤＤＬＬＥＡがＨＬＡ−Ａ２．１によって提示されるかどうかを決定するために、ＨＬＡ−Ａ２．１結合ペプチドをＨＡ−１^Rホモ接合性ＥＢＶ−ＢＬＣＬから溶離し、逆相ＨＰＬＣを用いて分画した。合成ＨＡ−１ペプチドＶＬＲＤＤＬＬＥＡを逆相ＨＰＬＣに流し、このペプチドが溶離する画分を決定した。ＨＡ−１^R発現ＥＢＶ−ＢＬＣＬに由来する対応のＨＰＬＣ画分を、質量分析法を使用して分析した。ペプチドＶＬＲＤＤＬＬＥＡの存在を検出することはできなかった(データは示さず) 。このことは、このペプチドはＨＬＡ−Ａ２．１により細胞表面上に提示されないか、又は非常に微量提示されることを示している。これは、おそらくＨＬＡ− Ａ２．１に対するペプチドの結合親和性が１０倍低いことによるものであろう。ＨＬＡ−Ａ２．１において想定されるＨＡ−１^Rペプチドの不在は、この対立遺伝子はＴ細胞反応性に関しては無効の対立遺伝子として考慮しなければならないことを示している。このことは、ＨＡ−１^R/R（ＨＡ−１−）ドナーからＨＡ− １^H/H又はＨＡ−１^R/H（ＨＡ−１＋）レシピエントのみのＢＭＴのみがＧｖＨＤと有意に関連し、逆は関連しないことを意味している。実際にこのことは、ＨＬＡ−２．１陽性のＢＭＴペアがＨＡ−１³に対して分類された過去の研究において観察される。しかしながら、ＨＡ−１^Rに由来するペプチドは、その他のＨＬＡ対立遺伝子に結合し、おそらくＴ細胞によって認識されるだろう。後者のペプチドが生成せず、ＨＡ−１^R対立遺伝子により提示されない場合、ＨＡ−１^R対立遺伝子に対するＴ細胞反応性が予見され、その方向のにおけるＧｖＨＤが起こるだろう。今日までに、わずか少数のマウス及びヒトｍＨ抗原が、ペプチド及び遺伝子レベルで同定されている。２種のマウスｍＨ抗原はミトコンドリアタンパク質によりコードされており、これはそれぞれ４又は２つの対立遺伝子を導く^15-17。更に、２種のマウスＨ−ＹｍＨ抗原は、Ｙ−染色体に位置する遺伝子によりコードされるペプチドであることが示された^18-21。Ｙ染色体上に位置するヒトＳＭＣＹ遺伝子は、ＨＬＡ−Ｂ７及びＨＬＡ−Ａ２．１制限Ｈ−ＹｍＨ抗原をコードする^5,6。性に関連しないヒトのｍＨ抗原のなかで、ｍＨ抗原ＨＡ−２のみがペプチドレベルで配列決定されている。しかし、ＨＡ−２をコードする遺伝子は未知のままである⁴。ｍＨ抗原ＨＡ−１をコードする遺伝子の同定は、ヒトｍＨ抗原が多型性遺伝子に由来していることの最初の証明になる。ＨＡ−１をコードするＫＩＡＡ０２２３遺伝子は、２つのヌクレオチドで異なる２つの対立遺伝子を有しており、これは１つの単一アミノ酸の差異を導く。ＨＡ−１ｍＨ抗原は、ＢＭＴ後のＧｖＨＤの発達と関連する唯一の既知のヒトｍＨ抗原であるので、本発明者等の研究結果は、有意な臨床的関連性がある³。異なるヒトｍＨ抗原の数はおそらく高いけれども、極僅かの免疫優性ｍＨ抗原がＧｖＨＤに対するリスクの原因となることができると予見される²³。ヒト免疫優性ｍＨ抗原の同定及びそのスクリーニングは、ＢＭＴ後のＧｖＨＤの有意な減少を引き起こすだろう。本明細書において、本発明者等は、免疫優性ｍＨ抗原ＨＡ −１をコードする多型性遺伝子の最初の解明について記載する。このことは、本発明者等が移植前のドナー及びレシピエントの分類用ＨＡ−１対立遺伝子特異的ＰＣＲプライマーを本発明者等が設計し、ドナーの選択を改善し、これによりＨＡ−１誘導ＧｖＨＤ発達を防止することを可能にする。１．２方法１．２．１細胞培養ＣＤ８＋ＨＬＡ−Ａ２．１制限ＨＡ−１特異的キラーＴ細胞クローン３ＨＡ１５、クローン１５及び５Ｗ３８は、ＨＬＡ同一骨髄移植を受けた二人の患者のＰＢＭＣに由来した^7,23。クローンを、１５％ヒト血清、３ｍＭＬ−グルタミン、１％白血球凝集素Ａ及び２０Ｕ／ｍｌｒＩＬ−２を含むＲＰＭＩ−１６４０培地中、照射同種ＰＢＭＣ及びＢＬＣＬを用いた一週間にわたる刺激により培養した。ＨＬＡ−Ａ２．１陽性ＨＡ−１発現ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞系（ＢＬＣＬ）Ｒｐ及びＢｌｋを、５％ＦＣＳ含有ＩＭＤＭ中で維持した。ＫＧ−１及びＴ２細胞系は、３ｍＭＬ−グルタミン及び１０％ＦＣＳを含む１６４０培地中で培養した。１．２．２ ⁵¹Ｃｒ放出アッセイＨＰＬＣ画分及び合成ペプチドを、文献²⁴に記載されるようにして⁵¹Ｃｒ放出アッセイで試験した。２５μｌ中の２５００の⁵¹Ｃｒ標識Ｔ２細胞を、ハンクス５０ｍＭＨｅｐｅｓ中に溶解した２５μｌペプチドと共に、３７℃で３０分間インキュベートした。キラーＴ細胞を最終容積１５０μｌ中に添加した。ＨＰＬＣペプチド画分を試験するときは、⁵¹Ｃｒ標識化の間、Ｔ２を２μｇ／ｍｌＭＡ２．１と共にインキュベートした。３７℃で４時間後、上清を集めた。１．２．３ペプチド精製文献²⁴に記載されたようにして、ペプチドを、精製ＨＬＡ−Ａ２．１分子の中から溶離した。要約すると、ＨＬＡ−Ａ２．１分子を、ＢＢ７．２結合ＣＮＢＲ −活性化セファロース４Ｂビーズ（ファルマシア（Pharmacia）ＬＫＢ）を用いたアフィニティークロマトグラフィーにより、９０．１０⁹ＨＬＡ−Ａ２．１陽性ＥＢＶ−ＢＬＣＬから２回精製し、大規模洗浄した。ペプチドを、１０％酢酸で処理し、更に１％ＴＦＡで酸性化することにより、ＨＬＡ−Ａ２．１から溶離し、１０ｋＤセントリオン（Centricon）(アミコン(Amicon))フィルターを用いてろ過することによりＨＬＡ−Ａ２．１重鎖及びβ２−ミクログロブリンから分離した。ペプチドを、逆相マイクロＨＰＬＣ（スマート・システム(Smart Syste m)、ファルマシア）を使用して分画した。第一の精製のために、３回のＨＰＬＣ分画を使用して、９０．１０⁹Ｒｐ細胞からＨＬＡ−Ａ２．１制限ＨＡ−１活性ペプチド画分を精製した。第一の画分は、緩衝液Ａ：Ｈ₂Ｏ中の０．１％ＨＦＢＡ、緩衝液Ｂ：アセトニトリル中の０．１ＨＦＢＡから構成された。勾配は、１００％緩衝液Ａ(０〜２０分)、０〜１５％緩衝液Ｂ（２０〜２５分）及び１５〜７０％緩衝液Ｂ（２５〜８０分）(流量１００μｌ／分)であった。１００μｌの画分を集めた。第一の勾配の画分２４を更に分画した。第２の分画は、緩衝液Ａ：Ｈ₂Ｏ中の０．１％ＴＦＡ、緩衝液Ｂ：アセトニトリル中の０．１％ＴＦＡから構成された。勾配は、１００％緩衝液Ａ(０〜２０分)、０〜１２％緩衝液Ｂ（２０〜２５分）及び１２〜５０％緩衝液Ｂ（２５〜８０分)(流量１００μｌ／分 )であった。１００μｌの画分を集めた。より浅い第三の勾配を使用して、ＨＡ −１活性を含んでいた画分２７を更に精製した。勾配は、１００％緩衝液Ａ(０〜２９分)、０〜１８％緩衝液Ｂ(２９〜３４分)、１８％緩衝液Ｂ（３４〜３９分）及び１８〜２３．９％緩衝液Ｂ（３９〜９８分）(流量１００μｌ／分)であった。出発物質の１／１８０から１／４５を、⁵¹Ｃｒ放出アッセイにおいて陽性の画分についての試験に使用した。比較可能なＨＰＬＣ分画を、９０．１０⁹ＢｌｋからのＨＬＡ−Ａ２．１制限ＨＡ−１活性ペプチド画分の第２の精製に使用した。第２のＨＡ−１精製物のＨＡ−１含有画分３３の４０％を、更なる逆相ミクロキャピラリーＨＰＬＣ分画に使用した。緩衝液Ａは、酢酸でｐＨ６．０に緩衝化した水中の０．１％トリエチルアミン（ＴＥＡ）であり、緩衝液Ｂは、酢酸でｐＨ６．０に緩衝化した６０％アセトニトリル中の０．０８５ＴＥＡであった。勾配は、１００％緩衝液Ａ(０〜５分)、０〜１００％緩衝液Ｂ（５〜４５分）(流量１００μｌ／分)であった。画分を、０．１％酢酸５０μｌ中に、５〜１５分は毎分、１５〜２０分は３０秒毎、２０〜４０分は２０秒毎、４０〜４５分は３０秒毎に集めた。集めた画分について、２０％をＨＡ−１活性についての試験に使用し、８０％をマススペクトルデータを得るために使用した。１．２．４質量分析Ｒｐ精製物の三次元ＨＰＬＣ分離より得た、ＨＡ−１活性を含んでいる画分を、ミクロキャピラリーＨＰＬＣ−エレクトロスプレーイオン化質量分析法により分析した²⁵。ペプチドを、Ｃ１８ミクロキャピラリーカラム（７５μｍ、内径× １０ｃｍ）中へロードし、０〜６０％のＢの３４分間の勾配により溶離した。溶媒Ａは水中の０．１Ｍ酢酸であり、溶媒Ｂはアセトニトリルであった(流量０．５μｌ／分)。５分の１の溶出液を、各ウェルが１００μｌの培養培地を含む９６ウェルプレートのウェル中へ置いた(１０秒間の画分)。一方、残りの５分の４はＴＳＱ−７０Ｕのエレクトロスプレー源に向けた。マススペクトル及びＣＡＤマススペクトルを、エレクトロスプレーイオン源を備えたフィニガン（Finnigan ）−ＭＡＴＴＳＱ−７０００（サンノゼ、カリフォルニア）３重４極質量分析計上で記録した。１．２．５．ＨＬＡ−Ａ２．１ペプチド結合アッセイ蛍光標識標準ペプチドＨｂｃ１８−２７Ｆ−Ｃ６（ＦＬＰＳＤＣＦＰＳＶ）の組替えＨＬＡ−Ａ２．１タンパク質及びβ２−ミクログロブリンへの結合の阻害に基づき、ＨＬＡ−Ａ２．１結合ペプチドについての定量分析を使用した^26,27 。要約すると、蛍光標準ペプチドへの約４０〜６０％の結合を与えるＨＬＡ−Ａ２．１濃度を、１５ｐｍｏｌ／ウェル（１５０ｎＭ）β２−ミクログロブリン（シグマ(Sigma)）と共に使用した。試験するペプチドの種々の投与量を、１００ｆｍｏｌ／ウェル（１ｎＭ）蛍光標準ペプチド、ＨＬＡ−Ａ２．１及びβ２−ミクログロブリンと一緒に、分析用緩衝液１００μｌ中、暗闇、室温下で１日間インキュベートした。ＭＨＣ結合蛍光の百分率を、ゲル濾過により測定し、各ペプチドについて５０％阻害投与量を、プリズムグラフ（prismgraph）ソフトウェアを有する１部位競合非線形回帰分析により測定した。合成ペプチドは、アビムド（ Abimed）４２２多重ペプチド合成機（アビムド、ランゲンフェルド、ドイツ）内で製造し、逆相ＨＰＬＣによりチェックしたところ純度は９０％をこえていた。 1.2.6 HA-1をコードするKIAA0223領域のRT-PCR増幅およびシーケンシング全RNAまたはmRNAをBLCLからRNAzol法（Cinaa/Biotecx Laboratories，Houston ，TX）または業者の説明書（QuickPrep mRNA精製キット、Pharmacia Biotech）に従って調製した。テンプレートとしての１μgのRNAとKIAA0223に基づく逆方向プライマー5'-GCTCCTGCATGACGCTCTGTCTGCA-3'とでcDNAを合成した。KIAA0223のH A-1領域を増幅するために以下のプライマーを使用した：順方向プライマー5'-GA CGTCGTCGAGGACATCTCCCAT-3'および逆方向プライマー5'-GAAGGCCACAGCAATCGTCTCC AGG-3'。使用するサイクルパラメータは、変性95℃にて１分間、アニーリング58 ℃にて１分間、伸長72℃にて１分間（25サイクル）とした。PCR産物はマジックP CR-Preps DNA精製システム（Promega）を使用して精製し、pMosBlue Tベクターキット（Amersham LIFE SCIENCE）を使用して直接クローニングした。それぞれから６つの独立のクローンを選びT7-シーケンシングキット（Pharmacia Biotech ）を用いてシーケンシングした。 1.2.7 HA-1対立遺伝子特異的PCR増幅 HA-1対立遺伝子特異的PCR増幅の場合、cDNAは上述のように合成した。PCR増幅は対立遺伝子特異的順方向プライマーで行なった：HA-1^H対立遺伝子に対してはプライマーH1：5'-CCT-TGA-GAA-ACT-TAA-GGA-GTG-TGT-GCT-GCA-3'、HA-1^R対立遺伝子に対してはプライマーR1：5'-CCT-TGA-GAA-ACT-TAA-GGA-GTG-TGT-GTT-G CG-3'および、双方の反応に対して上述の逆方向プライマーを使用した。使用したサイクルパラメーターは、変性、95℃で１分間、アニーリング、67℃にて１分間および伸長、72℃にて１分間（25サイクル）である。 1.2.8 KIAA0223のHA-1^HおよびHA-1^R対立遺伝子領域のクローニングと発現 KIAA00223に基づく、ATG開始コドンを有する順方向プライマー（5'-CCG-GCA-T GG-ACG-TCG-TCG-AGG-ACA-TCT-CCC-ATC-3'）およびKIAAO023に基づく、翻訳停止シグナルを有する逆方向プライマー（5'-CTA-CTT-CAG-GCC-ACA-GCA-ATC-GTC-TCC -AGG-3'）を設計し、ホモ接合HA-1^Hおよびホモ接合HA-1^R BLCL由来のcDNAとのRT -PCR反応に使用した。使用したサイクルパラメーターは、変性95℃、１分間、アニーリング60℃、１分間および伸長72℃、１分間（25サイクル）である。望みの PCR産物をマジックPCR-Preps DNA精製キット（Promega）を使用して精製した。精製したDNAをPmosBlue Tベクターキット（Amersham LIFE SCIENCE）を用いて直接クローニングし、真核用pCDNA3.1(+)ベクター中でCMVプロモーター制御下に再クローニングした。DEAE-デキストラン共沈殿法を使用して、Hela細胞中に対してHLA-A2.1とトランジェント・コトランスフェクションを行なった。培養３日後にHA-1特異的Ｔ細胞を加え、24時間後にWEHI細胞を用いて上清中へのTNFα放出を測定した²⁸。２．実施例２：HA-1対立遺伝子のゲノムDNA単離のための材料と方法細胞培養とゲノムDNAの単離：凍結末梢血リンパ細胞(PBL)から、Boehringer MannheimのPure Template Puri ficationキットゲノムDNAを用いて業者の説明に従ってゲノムDNAを単離した。EB V-形質転換LCL細胞を3mMのL-グルタミンと10％のFCSを含むRPMI-1640中で培養した。DNA単離のために細胞を集め、リン酸緩衝食塩水(PBS)で２回洗浄し、200μl に再懸濁し、使用するまで-20℃に保存した。各DNAの単離のだめには2x10⁶個の細胞を使用した。ゲノムPCR：各PCR反応のためには100〜200ngのゲノムDNAを使用した。増幅は、50mM KCl、 4mM MgCl₂、0.06mg/ml BSA、0.5mM dNTP、および2.5ユニットのTaqポリメラーゼ (Roche Molecular Systems，Branchebur，New Jersy)を含む100μlの10mM Tris/ HClバッファー（PH8.4）中で、20pmolの各プライマーを用いて行なった。全ての反応は、95℃、５分間の変性ステップから開始させた。全てのプライマーの組み合わせに対して、サイクル条件は95℃にて１分間、65℃にて１分間を10サイクルとした。その後、95℃にて１分間、62℃にて１分間、72℃にて１分間を20サイクル行ない、最後のステップにおける伸長を72℃にて５分間行なった。コスミドDNAの単離：コスミドDNAの大スケール単離のために、1LのLB-培地（20μg/mlアンピシリン）に接種し、激しく振盪しながら（300rpm）37℃にて一晩増殖させた。コスミド DNAはQuiagenプラスミド精製キットの低コピー数プラスミド単離法を用い、業者の説明に従って単離した。この単離方法には平均して500μgの精製コスミドDNA を生じさせた。コスミドDNAのシーケンシング：各シーケンシング反応用には、10μgのコスミドDNA。シーケンシング反応はT7 シーケンシングキット(Pharmacia Biotech)で行なった。 mHag HA-1特異的CTL； EBV-形質転換-LCLをHA-1特異的CTLでテストした。反応性はクロム遊離アッセイで測定した。⁵¹Crラベルした標的細胞（3x10³）をエフェクターＴ細胞の系列希釈物と、96穴丸底マイクロタイタープレート（Costar 3799）中で共インキュベーションした。37℃にて４時間後、γ測定のために無細胞上清を集めた。特異的溶解パーセントを以下のように計算した：5 特異的溶解＝（実験的遊離−自然遊離）／（最大遊離−自然遊離）ｘ100％。自然遊離および最大遊離は、そそれぞれ、培地単独中の標的細胞のクロム遊離および１％のTriton-X 100を含む培地中での標的細胞のクロム遊離である。３．実施例３ HA-1ペプチドは２つのエクソンにコードされている HA-1ペプチド周辺のゲノム構造を決定するために、ヒト男性PBL由来のコスミドライブラリーをスクリーニングした。HA-1をコードする312bpのcDNA断片をスクリーニングのためのプローブとして使用した。オーバーラップする３種のコスミドを単離した。R-対立遺伝子を含むコスミドpTCF-HA-1を部分的にシーケンシングした。シーケンシング反応はHA-1多型コドンの４ヌクレオチド後のスプライシング・ドナー部位を明らかにした。スプライシング・アクセプター部位はHA-1 ペプチドをコードする第２エクソンの前に同定することが出来る(図５)。このように、HA-1ペプチド配列は２つのエクソンによってコードされている。４．実施例４ゲノムDNAに関する対立遺伝子特異的PCR 対立遺伝子特異的ゲノムタイピングのために異なる２つのプラーマーセットを設計した。両方のセットとも１つの共通プライマーとHA-1H対立遺伝子またはR- 対立遺伝子のいずれかに特異的な１つのプライマーを含んでいる(表１)。セット１の共通プライマーはHA-1ペプチドの最初の４つのアミノ酸をコードするエクソンに由来するものである。H/Rプライマーはイントロン配列、スプライシング・ドナー配列およびエクソン配列の対立遺伝子特異的部分を含んでいる。セット２はpTCF-HA-１中で同定されるイントロン由来の共通プライマーとH-およびR-対立遺伝子をカバーするエクソン由来プライマーからなっている。プライマーセット１による増幅は190bpの断片を生じさせ、プライマーセット２は331bp断片を生じさせた。双方のプライマーセットとも期待した長さの断片を示したので、ゲノムタイピングに適している。同一のPCR条件下でDNAを増幅するようにプライマーを選択したので、両方のプラマーセットの組み合わせを同じPCR反応中で使用することができる。この場合、２種の異なる共通プライマー上のDNA増幅による535bp の第３の断片が観察された(データは示していない)。５．実施例５家系調査ゲノムタイピングの実効可能性を３つのHLA-A^*0201陽性家系の24人について調べた。DNAタイピングの結果をmHag HA-1 CTLタイピングと比較し(表３)、正確に相関することが示された。図６は代表的な家系のHA-1遺伝子座のゲノムDNA解析を示している。骨髄ドナー（06）およびレシピエント（02）はHLA-同一であった。ドナーはR-対立遺伝子に関してホモ接合であった。レシピエントはヘテロ接合 (H/R)であり、従って、HA-1抗原を細胞表面に提示していた。この不適合はGvHD を生じさせ、従ってドナーのＴ細胞はレシピエントのmHagに対して反応した。この家系においてはドナーとレシピエントはHLA-同一であったが、HA-1配列にミスマッチを有していた。HA-1に対して同じ不一致が家系２においても観察された。ここでもドナー（07）はR-対立遺伝子に関してホモ接合であり、患者（02）はヘテロ接合(H/R)であり、GvHDを生じさせた。家系３は３世代の健康な家系におけるHA-1 H対立遺伝子の分離を示す。H-対立遺伝子は祖父（01）に由来し、２世代に遺伝している。祖母(00)はHLA-A^*0201陽性であるがR-対立遺伝子に関してホモ接合である。子（03、04、05）はHA-1遺伝子座に関して全てヘテロ接合であった。子04はHLA-A^*0201陽性であるがR-対立遺伝子に関してホモ接合である個体34と結婚した。その子孫の中で、84だけがHA-1 H-対立遺伝子を祖父から受け継いだ。他の孫たち（82、83および85）はHA-1Rホモ接合であった。６．実施例６ LiPA法によるHA-1対立遺伝子タイピングサンプル中のHA-1対立遺伝子HおよびRのタイピングに関する以下の方法はLiPA 技術（Stuyverら、1993）に基づいている。各PCR反応に関して100〜200ngのゲノムDNAを用いた。増幅は50mM KCl、4mM MgCl₂、0.06mg/ml BSA、0.5mM dNTPおよび2.5ユニットのTaqポリメラーゼ(Roche Molecular Systems，Brancheburg，New Jersey)を含む100μlの10mM Tris/HCl(pH8.4)中で20pmolの各プライマーで行なった。全ての反応は、５分間95℃の変性ステップから開始させた。全てのプライマーの組み合わせに対してサイクル条件は95℃にて１分間、65℃にて１分間を10 サイクルとした。続いて、95℃にて１分間、62℃にて１分間、72℃にて１分間および最後のステップにおいて72℃にて５分間の伸長を行なった。続いてHA-1対立遺伝子をニトロセルロースのストリップに固定化したオリゴヌクレオチドプローブに対する逆ハイブリダイゼーションステップによってタイピングした。R-対立遺伝子に特異的にハイブリダイズするプローブは例えば、HA1-R1(1)(配列番号11 )、HA1-R1(2)(配列番号12)およびHA1-R1(3)（配列番号13）である。H-対立遺伝子に特異的にハイブリダイズするプローブは、例えば、HA1-H1(1)(配列番号14)、HA1-H1(2)（配列番号15）およびHA1-H1(3)（配列番号16）である。ハイブリダイゼーションは５ｘSSPE、0.5％SDS中、56℃にて 30分間行なった。ストリンジェントな洗浄ステップは２ｘSSPE、０．１％SDS中、56℃にて10分間行なった。特異的プローブHA1-H1(1)(配列番号14)、HA-1-R1(3 )（配列番号13）および発色反応（ＣＣ）のための対照プローブを含むLiPAを、家系１からの６つのサンプルについて実効可能性をテストした。LiPAによって得られた結果は（図７）PCRおよびCTLタイピングによる結果を確認するものであった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims

【特許請求の範囲】 1．サンプル中の副組織適合性抗原HA-1の対立遺伝子のタイピング方法であって、該対立遺伝子のゲノム核酸またはcDNA中の多形性ヌクレオチドを検出する工程を含むことを特徴とする、上記方法。 2．該副組織適合性抗原HA-1の該対立遺伝子が、第５図に示すＨ対立遺伝子およびＲ対立遺伝子である、請求の範囲第１項に記載の方法。 3．a)該サンプル中の該ゲノムポリ核酸を、少なくとも１対のプライマーと接触させ、該少なくとも一対のプライマーの5'−および／または3'−プライマーを、該対立遺伝子中の多形性ヌクレオチドを含むターゲット領域と特異的にハイブリダイズさせ、かつ増幅反応を実施し、 b)該少なくとも１対のプライマー各々について、該工程a)において増幅生成物が形成されたか否かを検出し、 c)該サンプル中に、どのHA-1の対立遺伝子が存在するかを、該工程b)の結果から推定する工程を含む、請求の範囲第１または２項に記載のゲノムタイピング方法。 4．更に、該少なくとも１対のプライマーが、該HA-1対立遺伝子内の位置４または位置４および８を含むターゲット領域と特異的にハイブリダイズする5'−プライマーを含み、あるいは該少なくとも１対のプライマーが、該HA-1対立遺伝子内の位置８または位置４および８を含むターゲット領域と特異的にハイブリダイズする3'−プライマーを含み、その位置が第５図に示されている、請求の範囲第１〜３項の何れかに記載の方法。 5．更に、該5'−プライマーが、イントロンａ内のターゲット領域と特異的にハイブリダイズしている、3'−プライマーと組み合わされ、および／または該3'−プライマーが、エキソンａ内のターゲット領域と特異的にハイブリダイズする5'−プライマーと組み合わされ、イントロンａおよびエキソンａは第５図に示されている、請求の範囲第４項に記載の方法。 6．更に、該プライマーが、以下に列挙するものから選択される、請求の範囲第１〜５項の何れかに記載の方法：配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７。 7．a)少なくとも一つの多形性ヌクレオチドを含む、該対立遺伝子のフラグメントを、該対立遺伝子内の保存されたターゲット領域と特異的にハイブリッド化している、少なくとも１対のプライマーを使用することにより増幅し、 b)該工程a)の増幅された生成物を、該対立遺伝子内の１以上の多形性ヌクレオチドを含むターゲット領域と特異的にハイブリダイズする少なくとも１つのプローブとハイブリダイズさせ、 c)該サンプル中に、どのHA-1の対立遺伝子が存在するかを、該工程b)の結果から推定する工程を含む、請求の範囲第１または２項に記載のゲノムタイピング方法。 8．更に、該少なくとも１対のプライマーが、エキソンａ内の保存されたターゲット領域と特異的にハイブリダイズする5'−プライマーおよび／またはイントロンａ内の保存されたターゲット領域と特異的にハイブリダイズする3'−プライマーを含み、該エキソンａおよび該イントロンａは、第５図に示されているものである、請求の範囲第７項に記載の方法。 9．更に、該少なくとも一つのプローブが、該HA-1対立遺伝子内の位置４および／または８に該ヌクレオチドを含む、ターゲット領域と特異的にハイブリッド化し、該位置が第５図に示された位置である、請求の範囲第７または８項の何れかに記載の方法。 10．更に、該プライマーが、配列番号２、配列番号８、配列番号９、配列番号10 から選択され、および／または該プローブが、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16から選択されるものである、請求の範囲第７〜９項の何れかに記載の方法。 11．該副組織適合性抗原HA-1の対立遺伝子をタイピングするための、請求の範囲第１〜10項の何れかに記載の方法で使用するためのプライマー。 12．該副組織適合性抗原HA-1の対立遺伝子のゲノムタイピングのための、請求の範囲第７〜10項の何れかに記載の方法で使用するためのプライマー。 13．配列番号１または配列番号17または配列番号18により特定される単離ポリ核酸、または該ポリ核酸に対して少なくとも80%の配列相同性を示す単離ポリ核酸、またはHA-1タイピング用のプライマーまたはプローブとして使用することのできる、該ポリ核酸の任意のフラグメント。 14．該対立遺伝子の配列決定による、請求の範囲第１または２項に記載の、該副組織適合性抗原HA-1の対立遺伝子のゲノムタイピング方法。 15．請求の範囲第３〜６項の何れかに記載の、該副組織適合性抗原HA-1の対立遺伝子のタイピング用の診断キットであって、 a)請求の範囲第１〜５項の何れかに記載の少なくとも一つのプライマーと、 b)場合により、該増幅反応を可能とする酵素および／または試薬と、 c)場合により、該増幅された生成物の検出を可能とする手段と、を含むことを特徴とする、上記診断用キット。 16．請求の範囲第７〜10項の何れかに記載の、該副組織適合性抗原HA-1の対立遺伝子のゲノムタイピング用の診断キットであって、 a)請求の範囲第７〜10項の何れかに記載の少なくとも一つのプライマーと、 b)請求の範囲第７〜10項の何れかに記載の少なくとも一つのプローブと、 c)場合により、該増幅反応を可能とする酵素および／または試薬、および／または該ハイブリッド化反応を可能とする試薬と、を含むことを特徴とする、上記診断用キット。 17．請求の範囲第14項記載の、該副組織適合性抗原HA-1の対立遺伝子のゲノムタイピング用の診断キットであって、 a)必須の、請求の範囲第７〜10項の何れかに記載の少なくとも一つのプライマーと、 b)場合により、該増幅反応を可能とする酵素および／または試薬、および／または該配列決定反応を可能とする試薬と、を含むことを特徴とする、上記診断用キット。 18．第５図に示した、HA-1の対立遺伝子を特異的に検出する抗体を使用する工程を含むことを特徴とする、該HA-1の対立遺伝子をタイピングする方法。 19．第５図に示した、HA-1の対立遺伝子を特異的に検出する抗体を含むことを特徴とする、該HA-1の対立遺伝子をタイピングするための診断用キット。