DE69833120T2

DE69833120T2 - Verfahren zur Typisierung des HA-1 Nebenhistokompatibilitätsantigens

Info

Publication number: DE69833120T2
Application number: DE69833120T
Authority: DE
Inventors: Els Goulmy
Original assignee: Universiteit Leiden
Current assignee: Universiteit Leiden
Priority date: 1997-07-23
Filing date: 1998-07-23
Publication date: 2007-03-01
Anticipated expiration: 2018-07-24
Also published as: EP0966545B1; US20050233350A1; ES2256953T3; WO1999005313A2; WO1999005313A3; DK0966545T3; EP0966545A2; ATE315103T1; JP2002510978A; CA2266456A1; DE69833120D1; US6830883B1; AU9071398A; AU732952B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Typisierung des minoren Histokompatibilitätsantigens.
Knochenmarktransplantation (BMT), eines der Gebiete, mit dem sich die Erfindung befaßt, und das Gebiet, aus dem die vorliegende Erfindung stammt, findet seine Anwendung in der Behandlung von zum Beispiel schwerer aplastischer Anämie, Leukämie und Immunschwäche-Erkrankungen.
In den Anfängen dieser Technik schlugen viele Transplantationen aufgrund der Abstoßung des Transplantats durch den Empfänger fehl. Transplantate, die sich übertragen ließen, führten jedoch häufig zu einer Immunreaktion von Lymphocyten, die im Transplantat vorhanden waren, gegen verschiedene Gewebe des Empfängers (Transplantat-Wirt-Erkrankung (GvHD)). Es ist nun bekannt, dass die GvHD-Reaktion im Wesentlichen auf die Anwesenheit von Naupthistokompatibilitäts-(H)-Antigenen zurückzuführen ist, welche eine Transplantationsbarriere aufbauen. Daher ist es heute Routinepraxis, nur HLA-passende Materialien zu transplantieren (sowohl von verwandten als auch von nicht verwandten Personen), was zu einer wesentlich verbesserten Erfolgsrate bei der Knochenmarktransplantation geführt hat. Jedoch leiden trotz sowohl dieser Verbesserung als auch der Verbesserungen bei der Chemotherapie oder Radiotherapie im Vorfeld der Transplantation und der Verfügbarkeit von wirksamen immunsuppressiven Arzneimitteln etwa 20-70% der behandelten Patienten immer noch an GvHD (der Prozentsatz ist von Alter und Knochenmarkspender abhängig). Um GvHD zu vermeiden, wurde vorgeschlagen, die Zellen (reife T-Zellen), die diese Reaktion verursachen, aus dem Transplantat zu entfernen. Dies führt jedoch häufig zum Fehlschlagen der Transplantation oder zum Wiederauftreten der ursprünglichen Erkrankung. Die Zellen, die für GvHD verantwortlich sind, sind auch die Zellen, die häufig gegen die ursprünglichen entarteten Zellen reagieren, zum Beispiel bei Leukämie (Transplantat gegen Leukämie-Reaktion).
Blasczyk et al. (Tissue Antigens 1996; 47:102-110) offenbaren ein Verfahren für auf Sequenzierung basierende Typisierung von HLA-A-Allelen. HLA-A-Allele werden sequenziert, indem Sequenzierungsprimer verwendet werden, die zu konservierten Sequenzmotiven passen.
Da BMT heutzutage im Wesentlichen mit HLA-passenden Transplantaten ausgeführt wird, muss die GvHD, die immer noch auftritt, durch eine andere Antigengruppe verursacht werden. Es ist sehr wahrscheinlich, dass die Gruppe der so genannten minoren H-Antigene (mHag), die nicht durch MHC codierte Histokompatibilitätsantigene sind (im Gegensatz zu den Haupt-H-Antigenen), wenigstens zum Teil für das verbleibende Auftreten von GvHD verantwortlich ist. mHag sind ursprünglich in kongenetischen Mausstämmen bei Studien zur Abstoßung von Tumoren und Haut entdeckt worden. Bei Mäusen hat die Verwendung von Inzucht-Stämmen gezeigt, dass mHag durch fast 50 verschiedene allelische polymorphe Stellen codiert wird, die im gesamten Genom verstreut liegen. Obgleich es schwierig ist, sie zu identifizieren, ist für den Menschen gezeigt worden, dass es mHag gibt, jedoch bleibt ihre gesamte Anzahl und Komplexität ungewiss. Minore H-Antigene sind höchst wahrscheinlich untereinander recht unterschiedlich und unterscheiden sich deutlich von Haupt-H-Antigenen, sie sind vermutlich eine vielfältige und schwer fassbare Gruppe von Molekülfragmenten, die an verschiedenen Funktionen im Haushalt der Zelle Anteil haben. Ihre Antigenität kann sehr zufällig auftreten, etwa in Form von aus natürlichen prozessierten Fragmenten von polymorphen Proteinen, die mit MHC-Produkten in Zusammenhang stehen. Einige der mH-Antigene scheinen weithin in verschiedenen Geweben im ganzen Körper exprimiert zu werden, während andere begrenzte Gewebeverteilung aufweisen.
Eines der besser bekannten minoren Histokompatibilitätsantigene ist das H-Y-Antigen. H-Y ist ein mH-Antigen, das zur Abstoßung von HLA-passenden männlichen Organ- und Knochenmarktransplantaten bei weiblichen Empfängern und zu einem erhöhten Auftreten von GvHD bei weiblichen Transplantaten auf männliche Empfänger führen kann, besonders, wenn die weibliche Spenderin zuvor schwanger gewesen ist. Das H-Y-Antigen kann auch eine Rolle in der Spermatogenese spielen. Das menschliche H-Y-Antigen ist ein Peptid mit 11 Resten, das von SMCY, einem in der Evolution konservierten Protein des Y-Chromosoms abstammt. Ein anderes gut bekanntes mH-Antigen, das zu GvHD führen kann, ist das HA-2-Antigen. Das menschliche HA-2-Antigen ist ein Peptid mit 9 Resten, welches wahrscheinlich von einem Myosin der Klasse I abstammt. Die Natur des HA-1-Antigens, das für eine Mehrzahl der derzeitigen Fälle an GvHD verantwortlich ist, ist jedoch bisher schwer fassbar geblieben. Menschliche Knochenmarktransplantationen, durchgeführt als therapeutische Behandlung von schwerer aplastischer Anämie, Leukämie und Immunschwäche-Erkrankung, wurde in den 70er Jahren verfügbar. Gegenwärtig sind die Langzeitergebnisse bei allogener Knochenmarktransplantation (BMT) auf Grund der Verwendung von HLA-passenden Verwandten als Knochenmarkspender, verbesserter Chemoradiotherapie im Vorfeld der Transplantation, der Verwendung von wirksamen immunsuppressiven Arzneien als Prophylaxe gegen die Transplantat-Wirt-Erkrankung (GvHD), verbesserter Antibiotika- und Isolierungsverfahren wesentlich verbessert worden. Trotzdem zeigen die Ergebnisse klinischer BMT, dass die Auswahl von MHC-identischen Spendern/Empfängern keine Garantie für die Vermeidung von GvHD oder das krankheitsfreie Überleben ist, selbst wenn Spender und Empfänger nahe miteinander verwandt sind. Allogene BMT führt besonders bei Erwachsenen, in Abhängigkeit vom Ausmaß der Verarmung an T-Zellen im Transplantat, in bis zu 80% der Fälle zu GvHD. In der genotypisch identischen HLA-Situation erreicht sie 15-35%, wobei das Auftreten von GvHD bei den phänotypisch HLA-passenden Empfänger/Spender-Kombinationen signifikant höher ist, d.h. 50-80%. Ungleichheiten bei minoren Histokompatibilitätsantigenen (mHag) zwischen Spender und Empfänger schaffen ein mögliches Risiko für GvHD oder Versagen des Transplantats, was lebenslange pharmakologische Immunsuppression bei den Empfängern von Organ- oder Knochenmarktransplantaten erforderlich macht. Ebenso nimmt man an, dass mHag an der „guten" Nebenwirkung von GvHD, d.h. der Transplantat-gegen-Leukämie-Aktivität, beteiligt sind. Mehrere Berichte zeigten die Anwesenheit von anti-Wirt-mHag spezifischen CTL bei Patienten, die nach genotypisch HLA-identischer BMT an GvHD litten. In unserem Labor wurde viel Energie in die weitere Charakterisierung einer (kleinen) Reihe von anti-Wirt-mHag spezifischen CTLs gesetzt. Dazu wurden CTL-Clone, die für Wirt-mHag spezifisch waren, aus dem peripheren Blut (PBL) von Patienten, die an schwerer GvHD litten, isoliert. mHag-HA-1-spezifische CD8⁺-CTL-Clone wurden ursprünglich nach Restimulierung von in vivo sensibilisierten PBLs von drei Patienten erhalten, welche nach HLA-identischer, aber nicht mHag-identischer BMT unter GvHD litten. Die CTL-Linien nach der BMT wurden durch begrenzte Verdünnung cloniert, was zur Isolierung einer großen Anzahl an mHag-spezifischen CTL-Clonen führte. Nachfolgende immungenetische Analysen zeigten, dass die CTL-Clone (wie vorstehend beschrieben) fünf nicht geschlechtgebundene mHag identifizierten, mit HA-1, -2, -3, -4, -5 bezeichnet, die in einer klassischen MHC-begrenzten Weise erkannt werden. mHag HA-3 wird in Anwesenheit von HLA-A1 erkannt, und mHag HA-1, -2, -4 und 5 erfordern die Anwesenheit von HLA-A2. Segregationsstudien zeigten, dass jedes der mHag HA-1 bis HA-5 das Produkt eines einzigen Gens ist, das auf Mendelsche Weise segregiert, und dass HA-1 und HA-2 nicht innerhalb der HLA-Region codiert werden. Die mHag unterscheiden sich untereinander in den Phänotyphäufigkeiten: in der HLA-A2-positiven, gesunden Population trat mHag HA-1 relativ häufig auf (d.h. 69%), wohingegen mHag HA-2 sehr häufig auftrat (d.h. 95%). Eine Untersuchung an fünf Patienten mit für mHag HA-1, -2, -3, -4 und -5 spezifischen anti-Wirt-CTL-Antworten nach BMT zeigte für drei Patienten Clone, die für das mHag HA-1 spezifisch waren. Diese Beobachtung deutet auf das immundominante Verhalten von mHag HA-1 hin. Im Hinblick auf mHag, das in verschiedenen Geweben exprimiert wird, beobachteten wir allgegenwärtige gegenüber begrenzter Gewebeverteilung der analysierten mHag. Die Expression des mHag HA-1 ist auf die Zellen des hämatopoietischen Zellstammbaums, wie etwa Thymocyten, periphere Blut-Lymphocyten, B-Zellen, Monocyten, beschränkt. Das Gleiche gilt für die vom Knochenmark abstammenden professionellen Antigen präsentierenden Zellen: die dendritischen Zellen und die epidermalen Langerhansschen Zellen exprimieren das mHag HA-1. Das mHag HA-1 wird auch sowohl auf clonogenen leukämischen Vorläuferzellen exprimiert als auch auf frisch isolierten myeloiden und lymphoiden leukämischen Zellen, wodurch angezeigt wird, dass für mHag spezifische CTLs zur auf HLA Klasse I beschränkten Antigenspezifischen Lyse von leukämischen Zellen in der Lage sind. Um die Wichtigkeit der menschlichen mH-Antigensysteme zu untermauern, erforschten wir, ob die mHag in der Evolution zwischen Menschen und nicht menschlichen Primaten konserviert worden sind. Zu diesem Zweck wurden Zellen von nicht menschlichen Primaten mit dem menschlichen HLAA2.1-Gen transfiziert. Nachfolgende Analysen mit unserem menschlichem allo-HLA-A2.1 und vier mHag A2.1 beschränkten CTL-Clonen ergaben im Zusammenhang mit dem transfizierten menschlichen HLA-A2.1-Molekül die Präsentation von allo- und mHag-HY-, -HA-1- und -HA-2-Peptiden von Menschenaffen und anderen Affen durch Zielzellen von Menschenaffen und anderen Affen. Dies legt nahe, dass das HA-1-Peptid über mindestens 35 Millionen Jahre konserviert ist. Eine in die Zukunft gerichtete Untersuchung wurde durchgeführt, um den Einfluss und die klinische Bedeutung von mHag bei genotypisch HLA-identischer BMT auf das Auftreten von akuter (Grad ≥ 2) GvHD zu dokumentieren. Die Ergebnisse der mHag-Typisierung unter Verwendung der CTL-Clone, die für fünf gut definierte mHag HA-1 bis HA-5 spezifisch sind, zeigten einen signifikanten Zusammenhang zwischen der Nichtübereinstimmung von mHag HA-1, -2, -4 und -5 und GvHD. Ein signifikanter Zusammenhang (P = 0,024) mit der Entwicklung von GvHD wurde beobachtet, wenn nur für mHag HA-1 analysiert wurde. Um eine vermutliche Peptidnatur des mHag HA-1 zu analysieren, analysierten wir die Erfordernisse der von MHC codierten TAP1- und TAP2-Genprodukte für die mHag-Peptidpräsentation an der Zelloberfläche. Die Transportergene TAP1 und TAP2, die mit der Antigenpräsentation in Zusammenhang stehen, werden für die Auslieferung von Peptiden aus dem Cytosol mit dem endoplasmatischen Retikulum benötigt. Die Verfügbarkeit einer menschlichen Zelllinie „T2", der Gene sowohl für Transport als auch für eine Proteasom-Untereinheit fehlt, ermöglichte uns, die Prozessierung und Präsentation von menschlichem mHag zu untersuchen. Wir zeigten, dass die (Ratten)Transportgenprodukte TAP1 und TAP2u zur Prozessierung und Präsentation von antigenen Peptiden des intrazellulären mH-Proteins HA-1 benötigt wurden. Information über das TCR-Repertoire nach BMT beim Menschen ist extrem rar. Wir haben die Zusammensetzung der T-Zell-Rezeptor (TCR)-V-Region des mHag HA-1-spezifischen CD8⁺-CTL-Clons durch DNA-Sequenzierung der α- und P-Ketten analysiert. Wir beobachteten durch die Analyse des TCR die Verwendung von 12 Clonen, die von 3 nicht verwandten Individuen stammten, dass die TCRβ-Ketten alle das TCRβV6S9-Gensegment verwendeten und bemerkenswerte Ähnlichkeiten innerhalb der N-D-N-Regionen aufwiesen.
Seit der vorliegenden Erfindung hat jedoch niemand die Identifizierung von Aminosäuresequenzen von antigenen Peptiden, die für das mHag-HA-1-Antigen von Bedeutung sind, durchgeführt, noch hat jemand die Identifizierung der Proteine, von denen dieses Antigen abstammt, durchgeführt.
Es ist daher ein Ziel der vorliegenden Erfindung, die Aminosäuresequenz des HA-1-Antigens zu bestimmen.
Es ist ebenso ein Ziel der vorliegenden Erfindung, die Nucleinsäuresequenz des HA-1-Antigens zu bestimmen, genauer die c-DNA und die genomische Sequenzen, die HA-1-Antigene codieren.
Es ist ebenfalls ein Ziel der vorliegenden Erfindung, Primer und Sonden zur Verfügung zu stellen, die die Typisierung des HA-1-Antigens ermöglichen.
Es ist ebenfalls ein Ziel der vorliegenden Erfindung, Kits zur Verfügung zu stellen, die es ermöglichen, das HA-1-Antigen zu typisieren.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben nun zum ersten Mal ein Peptid identifiziert, das ein wesentlicher Teil des mHag HA-1 ist. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben ebenfalls sowohl die cDNA-Sequenz als auch die genomischen Sequenzen der beiden HA-1-Allele identifiziert.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung beschreiben zum ersten Mal ein (Poly)peptid, das ein T-Zellepitop umfasst, das vom minoren Histokompatibilitätsantigen HA-1 erhalten werden kann, welches die Sequenz VLXDDLLEA oder ein Derivat hiervon mit ähnlichen funktionalen oder immunologischen Eigenschaften umfasst, worin X einen Histidin- (H) oder einen Arginin- (R) Rest darstellt.
Diagnostische Anwendungen, die in dieser Erfindung ins Auge gefasst werden, beinhalten HA-1-Typisierung, Aufdeckung genetischer Abweichungen und dergleichen, sind aber nicht hierauf begrenzt.
Auf der Basis des hierin beschriebenen Peptids wurden genetische Sonden oder Primer hergestellt, die zur Durchmusterung auf das Gen, welches das Protein codiert, verwendet werden können. Auf der Basis des hierin beschriebenen Peptids können anti-idiotypische B-Zellen und/oder T-Zellen und Antikörper hergestellt werden. Verschiedene Techniken, die das Auffinden geeigneter Spender oder Empfänger ermöglichen, können, basierend auf Amplifikation von HA-1 verwandten Nucleinsäuresequenzen oder auf dem immunologischen Nachweis von HA-1 verwandten Peptidsequenzen verwendet werden, wie nachstehend dargestellt wird.
Nach einer Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Typisierung von Allelen des minoren Histokompatibilitätsantigens HA-1 in einer Probe, welches den Nachweis von polymorphen Nucleotiden in der cDNA oder genomischen Nucleinsäuren der genannten Allele umschließt, genauer die Allele H und R von HA-1, wie in 5 dargestellt wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird dieses Verfahren zur Typisierung ein Verfahren zur Typisierung genomischer DNA sein. Alternativ kann dieses Verfahren auch ein Verfahren zur Typisierung von cDNA sein.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft die genomische Typisierung von Allelen des minoren Histokompatibilitätsantigens HA-1 in einer Probe, wobei dieses Verfahren umschließt:

a) In-Kontakt-Bringen der genomischen Polynucleinsäuren in der Probe mit mindestens einem Paar Primer, wobei der 5'- und/oder der 3'-Primer des mindestens einen Paars Primer spezifisch mit Zielregionen hybridisieren, die polymorphe Nucleotide in den genannten Allelen umschließen und Durchführung einer Amplifikationsreaktion;
b) Nachweis für jedes dieses mindestens einen Paars Primer, ob in Schritt a) ein Amplifikationsprodukt gebildet wird oder nicht;
c) Folgerung aus dem Ergebnis des Schrittes b), welches HA-1-Allel in der genannten Probe vorhanden ist.

Im Einklang mit einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein wie nachstehend beschriebenes Verfahren, das weiterhin dadurch gekennzeichnet ist, dass die genannten Allele des minoren Histokompatibilitätsantigens HA-1 das Allel H und das Allel R sind, wie in 5 dargestellt.
Die vorliegende Erfindung lehrt, dass die in dem RT-PCR-Verfahren verwendeten Primer unerwartet nicht zur Amplifikation eines spezifischen Polynucleinsäurefragmentes führen, wenn genomische DNA als Matrize verwendet wird. Um dieses Problem zu lösen, offenbart die vorliegende Erfindung auch die genomische Struktur der HA-1-Stelle. Wie in Beispiel 3 erläutert, zeigt die Analyse der genomischen Struktur, dass das HA-1-Peptid durch zwei Exons codiert wird (5). Eine Spleiß-Donorstelle liegt vier Nucleotide hinter dem polymorphen Codon in der Codierungssequenz von HA-1. Daher erfordert die Aufstellung eines Verfahrens zur genomischen Typisierung des HA-1-Antigens Sequenzinformation des Introns, welches die Codierungssequenz von HA-1 unterbricht. Diese Sequenzinformation wird durch die vorliegende Erfindung bereit gestellt und wird nachstehend als SEQ ID NO 1 dargestellt.
Diese Sequenz stellt einen Teil des unterbrechenden Introns dar (in 5 als Intron a bezeichnet), wobei das erste Nucleotid dieser Sequenz das erste Nucleotid von Intron a ist. Die vorliegende Erfindung kann daher auch eine isolierte Polynucleinsäure, die durch SEQ ID NO 1 identifiziert wird, oder eine isolierte Polynucleinsäure, die mindestens 80% oder mindestens 90% oder mindestens 95% oder mindestens 99% Sequenzhomologie zur SEQ ID NO 1 aufweist, oder jedes Fragment der genannten Polynucleinsäuren als einen Primer oder als eine Sonde verwenden.
Sequenzinformation, die einen anderen Abschnitt von Intron a betrifft, genauer den Teil, welcher vor Exon b (5) gelegen ist, ist in der EMBL-Datenbank unter der Zugangsnummer AC004151 offenbart. Diese Sequenz ist jedoch zum Entwurf von Primern für das vorstehend genannte Verfahren nicht geeignet, da die Länge des amplifizierten Fragmentes die Wirksamkeit der Amplifikationsreaktion herabsetzen würde.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch isolierte Polynucleinsäure, die durch SEQ ID NO 17 (Allel HA-1 R) erkannt wird, oder eine isolierte Polynucleinsäure, die mindestens 80% oder mindestens 90% oder mindestens 95% oder mindestens 99% Sequenzhomologie zur SEQ ID NO 17 aufweist, oder jedes Fragment der genannten Polynucleinsäure, das als ein Primer oder als eine Sonde verwendet werden kann.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch isolierte Polynucleinsäure, die durch SEQ ID NO 19 (Allel HA-1 H) erkannt wird, oder eine isolierte Polynucleinsäure, die mindestens 80% oder mindestens 90% oder mindestens 95% oder mindestens 99% Sequenzhomologie zur SEQ ID NO 19 aufweist, oder jedes Fragment der genannten Polynucleinsäure, das als ein Primer oder als eine Sonde verwendet werden kann.
Zum Nachweis des Amplifikationsproduktes, welches vorstehend in Schritt b genannt ist, können verschiedene Verfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, verwendet werden. Ein Verfahren besteht darin, dass das nach der Amplifikationsreaktion erhaltene Gemisch der Gel-Elektrophorese unterworfen wird und das Amplifikationsprodukt nach Anfärben der Nucleinsäure visuell nachgewiesen wird. Alternativ kann das Amplifikationsprodukt markiert werden, zum Beispiel durch Verwendung markierter Primer, und kann an einen festen Untergrund gebunden werden, zum Beispiel durch Hybridisierung, und kann auf dem festen Untergrund nachgewiesen werden. Es ist jedoch klar, dass andere Nachweisverfahren ebenfalls innerhalb des Rahmens der vorliegenden Erfindung liegen.
Im Einklang mit einer mehr bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein wie vorstehend angezeigtes Verfahren, das darüber hinaus dadurch gekennzeichnet ist, dass:
das mindestens eine Paar Primer einen 5'-Primer umfasst, der spezifisch mit einer Zielregion hybridisiert, die die Nucleotide an Position 4 oder an den Positionen 4 und 8 im HA-1-Allel aufweist, oder
das mindestens eine Paar Primer einen 3'-Primer umfasst, der spezifisch mit einer Zielregion hybridisiert, die die Nucleotide an Position 8 oder an den Positionen 4 und 8 im HA-1-Allel aufweist, wobei die genannten Positionen in 5 gekennzeichnet sind.
In Einklang mit einer noch mehr bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein wie vorstehend angezeigtes Verfahren, das darüber hinaus dadurch gekennzeichnet ist, dass:
der 5'-Primer mit einem 3'-Primer kombiniert ist, der spezifisch mit einer Zielregion in Intron a hybridisiert und/oder
der 3'-Primer mit einem 5'-Primer kombiniert ist, der spezifisch mit einer Zielregion in Exon a hybridisiert,
wobei Intron a und Exon a in 5 gekennzeichnet sind.
Im Einklang mit dieser Ausführungsform liegt die Zielregion in Intron a idealerweise innerhalb der Sequenz, die durch SEQ ID NO 1 erkannt wird, wie vorstehend erklärt. Auch die Zielregion des 3'-Primers, der mit einem 5'-Primer kombiniert wird, welcher spezifisch mit einer Zielregion in Exon a hybridisiert, wird sich notwendigerweise mit der durch SEQ ID NO 1 erkannten Sequenz überschneiden.
In Einklang mit einer noch mehr bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein wie vorstehend angezeigtes Verfahren, das darüber hinaus dadurch gekennzeichnet ist, dass die Primer aus Tabelle 1 ausgewählt werden:
Tabelle 1 Sequenz der Primer, die zur genomischen Typisierung von HA-1-Allelen durch sequenzspezifische Amplifikation verwendet wurden.
Satz 1 besteht aus einem allgemeinen 5'-Primer (vorwärts) und zwei unterschiedlichen 3'-Primern (revers), einem für das Allel H und einem für das Allel R. Die Zielregion für den allgemeinen 5'-Primer liegt im Exon a. Die Zielregion für die 3'-Primer umfasst die polymorphen Nucleotide an den Positionen 4 und 8 in der Codierungssequenz von HA-1 (5) und überschneitet sich teilweise mit der Sequenz, die durch SEQ ID NO 1 identifiziert wird. Satz 2 besteht aus einem allgemeinen 3'-Primer und zwei unterschiedlichen 5'-Primern. Die Zielregion für den allgemeinen Primer liegt innerhalb der Sequenz, die durch SEQ ID NO 1 identifiziert wird, wohingegen die Zielregionen der 5'-Primer im Exon a gelegen sind und die polymorphen Nucleotide an den Positionen 4 und 8 umfassen. Beispiel 6 zeigt ein Experiment zur genomischen Typisierung, in welchem diese Primer-Sätze verwendet werden.
Im Einklang mit einer anderen bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung einen Diagnose-Satz zur genomischen Typisierung von Allelen des minoren Histokompatibilitätsantigens HA-1 nach jedem der vorstehend angezeigten Verfahren, wobei der genannte Satz umfasst:

a) mindestens einen Primer, der in der Lage ist, spezifisch mit Zielregionen zu hybridisieren, die polymorphe Nucleotide in den genannten Allelen umfassen, worin die genannten polymorphen Nucleotide in einer Region der genannten Allele nachgewiesen werden, die SEQ ID NO 17 oder 19 in Allel HA-1 R beziehungsweise Allele HA-1 H entspricht;
b) optional ein Enzym und/oder Reagenz, das die Amplifikationsreaktion ermöglicht;
c) optional ein Mittel, das den Nachweis der amplifizierten Produkte ermöglicht.

Im Einklang mit einer anderen bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur genomischen Typisierung von Allelen des minoren Histokompatibilitätsantigens HA-1 in einer Probe, wobei das Verfahren umfasst:

a) Amplifizieren eines Fragmentes der Allele, wobei das Fragment mindestens ein polymorphes Nucleotid umfasst, durch Verwendung von mindestens einem Paar Primer, welches spezifisch mit konservierten Zielregionen in den Allelen hybridisiert;
b) Hybridisierung des amplifizierten Produktes aus Schritt a) mit mindestens einer Sonde, die spezifisch mit einer Zielregion hybridisiert, welche ein oder mehrere polymorphe Nucleotide in dem Allel umfasst;
c) Schlussfolgerung aus dem Ergebnis aus Schritt b), welches HA-1-Allel in der Probe vorliegt.

Im Einklang mit einer mehr bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein wie vorstehend angezeigtes Verfahren, welches darüber hinaus dadurch gekennzeichnet ist, dass die genannten Allele des minoren Histokompatibilitätsantigens HA-1 das Allel H und das Allel R sind.
Im Einklang mit einer noch mehr bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein wie vorstehend angezeigtes Verfahren, welches darüber hinaus dadurch gekennzeichnet ist, dass der mindestens ein Paar Primer einen 5'-Primer, der spezifisch mit einer konservierten Zielregion in Exon a hybridisiert, und/oder einen 3'-Primer, der spezifisch mit einer konservierten Zielregion in Intron a hybridisiert, umfasst, wobei Exon a und Intron a in 5 gekennzeichnet sind.
Idealerweise liegt die Zielregion des 3'-Primers innerhalb der Sequenz, die als SEQ ID NO 1 identifiziert worden ist. Offensichtlich kann die Zielregion des 3'-Primers auch flussabwärts dieser Sequenz liegen, d.h. in Intron a, Intron b, Exon b oder sogar flussabwärts von Exon b, jedoch ist die Wirksamkeit der Amplifikationsreaktion vermutlich geringer, wenn das amplifizierte Fragment sich verlängert. Im Einklang mit einer noch mehr bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein wie vorstehend angezeigtes Verfahren, welches darüber hinaus dadurch gekennzeichnet ist, dass die mindestens eine Sonde spezifisch mit einer Zielregion hybridisiert, die die Nucleotide an Position 4 und/oder 8 im HA-1-Allel aufweist, wobei die genannten Positionen in 5 gekennzeichnet sind.
Im Einklang mit einer noch mehr bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein wie vorstehend angezeigtes Verfahren, welches darüber hinaus dadurch gekennzeichnet ist, dass die genannten Primer und/oder die genannten Sonden aus Tabelle 2 ausgewählt werden.
Tabelle 2 Sequenz von Primern und Sonden, die zur genomischen Typisierung von HA-1-Allelen durch Amplifikation und sequenzspezifische Hybridisierung verwendet wurden.
Die Primer 3P1 und 3P2 hybridisieren spezifisch mit Zielregionen in SEQ ID NO 1. Die Zielregion von Primer 3P3 liegt flussabwärts von Exon b. Die Sonden aus Tabelle 2 hybridisieren alle spezifisch mit Zielregionen, die sich mit der Grenze zwischen Exon a und Intron a überschneiden. Die Sonden mit SEQ ID NO 11 bis 16 sind in der Weise optimiert worden, dass sie in Kombination unter den gleichen Bedingungen in einem LiPA-Assay funktionieren (siehe nachstehend). Der Fachmann wird erkennen, dass die Sonden und Primer mit SEQ ID NO 2 bis 16 durch Addition oder Deletion von einem oder mehreren Nucleotiden an ihren Enden angepasst werden können. Solche Anpassungen können erforderlich sein, wenn die Bedingungen von Amplifikation und Hybridisierung verändert werden, oder wenn das amplifizierte Material aus RNA statt aus DNA besteht, wie es in dem NASBA-System der Fall ist. Verschiedene Techniken können eingesetzt werden, um die sequenzspezifischen Hybridisierungsverfahren der vorliegenden Erfindung durchzuführen. Diese Techniken können Immobilisierung der amplifizierten HA-1-Polynucleinsäuren auf einem festen Untergrund und Durchführung der Hybridisierung mit markierten Oligonucleotid-Sonden einschließen. Genomische Polynucleinsäuren können auch ohne vorherige Amplifikation auf einem festen Untergrund immobilisiert und der Hybridisierung unterworfen werden. Alternativ können die Sonden auf einem festen Untergrund immobilisiert werden, und die Hybridisierung kann mit markierten HA-1-Polynucleinsäuren, bevorzugt nach der Amplifikation durchgeführt werden. Diese Technik wird reverse Hybridisierung genannt. Eine geeignete Technik der reversen Hybridisierung ist der Line-Probe-Test (LiPA). Dieser Test verwendet Oligonucleotid-Sonden, die in parallelen Reihen auf einem festen Untergrundstreifen immobilisiert sind (Stuyver et al., 1993). Es muss deutlich sein, dass jede andere Technik zur genomischen Typisierung von HA-1-Allelen ebenfalls durch die vorliegende Erfindung abgedeckt ist.
Es ist klar, dass die vorliegende Erfindung auch jeden der Primer mit SEQ ID NO 2 bis 10 und jede der Sonden mit SEQ ID NO 11 bis 16 betrifft, wobei die Primer und die Sonden zur Verwendung in einem Verfahren zur genomischen Typisierung von Allelen des minoren Histokompatibilitätsantigens HA-1 verwendet werden.
Im Einklang mit einer anderen bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung einen Diagnose-Satz zur genomischen Typisierung von Allelen des minoren Histokompatibilitätsantigens HA-1 nach jedem der vorstehend angezeigten sequenzspezifischen Hybridisierungsverfahren, wobei der Satz umfasst:

a) mindestens einen Primer, der spezifisch mit Zielregionen ohne polymorphe Nucleotide in den Allelen hybidisiert;
b) mindestens eine Sonde, die spezifisch mit einer Zielregion hybridisiert, welche ein oder mehrere polymorphe Nucleotide in dem Allel umfasst, wobei die polymorphen Nucleotiden in einer Region des genannten Allels nachgewiesen werden, welche SEQ ID NO 17 oder 19 in Allel HA 1 R beziehungsweise in Allel HA-1 H entspricht;
c) optional ein Enzym und/oder Reagenzien, die die Amplifikationsreaktion ermöglichen, und/oder Reagenzien, die die Hybridisierungsreaktion ermöglichen.

Im Einklang mit einer anderen bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung einen Diagnose-Satz zur genomischen Typisierung von Allelen des minoren Histokompatibilitätsantigens HA-1 nach jedem der vorstehend angezeigten sequenzspezifischen Hybridisierungsverfahren, wobei der Satz umfasst:

a) mindestens einen Primer, der in der Lage ist, spezifisch mit Zielregionen ohne polymorphe Nucleotide in den Allelen zu hybidisieren;
b) mindestens einen Primer, der in der Lage ist, spezifisch mit einer Zielregion zu hybridisieren, welche ein oder mehrere polymorphe Nucleotide in dem Allel umfasst, wobei die polymorphen Nucleotide in einer Region des Allels nachgewiesen werden, welche SEQ ID NO 17 oder 19 in Allel HA 1 R beziehungsweise in Allel HA-1 H entspricht;
c) optional ein Enzym und/oder Reagenzien, die die Amplifikationsreaktion ermöglichen, und/oder Reagenzien, die die Hybridisierungsreaktion ermöglichen.

Im Einklang mit einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Typisierung von Allelen des minoren Histokompatibilitätsantigens HA-1 durch Sequenzierung der Allele.
Im Einklang mit einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung auch Sätze zur Durchführung des Sequenzierungsverfahrens.
Im Einklang mit einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Typisierung von HA-1-Allelen, welches die Verwendung von Antikörpern beinhaltet, die spezifisch die in 5 dargestellten HA-1-Allele nachweisen. Die Antikörper werden bevorzugt monoclonale Antikörper sein und können durch jedes auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren hergestellt werden.
Im Einklang mit einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Diagnose-Satz zur Typisierung von HA-1-Allelen, welches die Verwendung von Antikörpern beinhaltet, die spezifisch die in 5 dargestellten HA-1-Allele nachweisen.
Definitionen
Die nachstehenden Definitionen und Erklärungen werden ein besseres Verständnis der vorliegenden Erfindung ermöglichen.
Das Zielmaterial in den zu analysierenden Proben werden genomische DNA oder amplifizierte Versionen hiervon sein. Diese Moleküle werden in dieser Anmeldung auch als „Polynucleinsäuren" bezeichnet. Für die Isolierung von RNA oder DNA aus einer Probe stehen gut bekannte Extraktions- und Reinigungsverfahren zur Verfügung (z.B. bei Sambrook et al., 1989).
Ein „polymorphes Nucleotid" betrifft ein Nucleotid in der Sequenz eines gegebenen HA-1-Allels, das sich von mindestens einem der Nucleotide unterscheidet, die an der entsprechenden Position in anderen HA-1-Allelen gefunden werden.
Der Ausdruck „Typisierung" eines HA-1-Allels betrifft die Identifizierung des Allels, d.h. Nachweis des Allels und Unterscheidung des Allels von anderen HA-1-Allelen.
Der in der vorliegenden Erfindung verwendete Ausdruck „Sonde" betrifft ein einzelsträngiges Oligonucleotid, welches entworfen wurde, um spezifisch mit HA-1-Polynucleinsäuren zu hybridisieren. Bevorzugt haben die Sonden der Erfindung eine Länge von 5 bis 50 Nucleotiden, mehr bevorzugt von etwa 10 bis 30 Nucleotiden. Besonders bevorzugte Sondenlängen umschließen 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27,28, 29 oder 30 Nucleotide. Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Nucleotide können Ribonucleotide, Desoxyribonucleotide und veränderte Nucleotide wie etwa Inosin sein oder Nucleotide, die veränderte Gruppen enthalten, die ihre Hybridisierungseigenschaften nicht wesentlich verändern.
Der Ausdruck „Primer" betrifft eine einzelsträngige Oligonucleotidsequenz, die in der Lage ist, als Initiationspunkt für die Synthese eines Primer-Extensionsproduktes zu dienen, welches komplementär zu dem zu kopierenden Nucleinsäurestrang ist. Die Länge und die Sequenz des Primers müssen in der Weise beschaffen sein, dass sie den Beginn der Synthese des Extensionsproduktes gestatten. Bevorzugt hat der Primer eine Länge von etwa 5 bis 50 Nucleotiden. Spezifische Länge und Sequenz werden von der Komplexität der gewünschten DNA- oder RNA-Ziele abhängig sein, wie auch von den Bedingungen, unter denen der Primer verwendet wird, wie etwa Temperatur und Ionenstärke. Es ist selbstverständlich, dass die Primer der vorliegenden Erfindung als Sonden und unter der Voraussetzung, dass die Versuchsbedingungen angepasst werden, auch umgekehrt verwendet werden können.
Der in dieser Erfindung verwendete Ausdruck „geeignetes Paar Primer" betrifft ein Paar Primer, das spezifische Amplifikation eines HA-1 Polynucleinsäurefragmentes gestattet.
Der Ausdruck „Zielregion" einer Sonde oder eines Primers ist im Einklang mit der vorliegenden Erfindung eine Sequenz innerhalb der HA-1-Polynucleinsäuren, zu der die Sonde oder der Primer vollständig komplementär oder teilweise komplementär (d.h. mit einem gewissen Grad an Nichtübereinstimmung) ist. Es ist selbstverständlich, dass das Komplement der genannten Zielsequenz in einigen Fällen ebenfalls eine geeignete Zielsequenz ist.
„Spezifische Hybridisierung" einer Sonde an eine Zielregion der HA-1-Polynucleinsäuren bedeutet, dass die Sonde ein Duplexmolekül mit einem Teil dieser Region oder mit der gesamten Region unter den gegebenen Versuchsbedingungen bildet und dass die Sonde unter diesen Bedingungen kein Duplexmolekül mit anderen Regionen der in der zu analysierenden Probe vorhandenen Polynucleinsäuren bildet. „Spezifische Hybridisierung" eines Primers an eine Zielregion der HA-1-Polynucleinsäuren bedeutet, dass der Primer unter den gegebenen Versuchsbedingungen während des Amplifikationsschrittes ein Duplexmolekül mit einem Teil dieser Region oder mit der gesamten Region bildet und dass der Primer unter diesen Bedingungen kein Duplexmolekül mit anderen Regionen der in der zu analysierenden Probe vorhandenen Polynucleinsäuren bildet. Es muss deutlich sein, dass der hierin verwendete Ausdruck „Duplexmolekül" ein Duplexmolekül betrifft, der zu spezifischer Amplifikation führt.
„Spezifische Amplifikation" eines Fragmentes der HA-1-Polynucleinsäuren bedeutet Amplifikation des Fragmentes, für welches die Primer entworfen wurden, und keines anderen Fragmentes der in der Probe vorliegenden Polynucleinsäuren.
Die Tatsache, dass Primer zur Amplifikation nicht exakt zur entsprechenden Zielsequenz in der Matrize passen müssen, um richtige Amplifikation zu garantieren, ist ausführlich in der Literatur dokumentiert worden (Kwok et al., 1990). Wenn die Primer nicht vollständig komplementär zu ihrer Zielsequenz sind, sollte jedoch in Betracht gezogen werden, dass die amplifizierten Fragmente die Sequenz der Primer und nicht die der Zielsequenz aufweisen werden. Primer können mit einer Markierung nach Wahl (z.B. Biotin) markiert werden. Das verwendete Amplifikationsverfahren kann entweder Polymerase-Kettenreaktion (PCR; Saiki et al., 1988), Ligase-Kettenreaktion (LCR; Landgren et al., 1988; Wu & Wallace, 1989; Barany, 1991), auf Nucleinsäuresequenz basierende Amplifikation (NASBA; Guatelli et al., 1990; Compton, 1991), auf Transkription basierendes Amplifikationssystem (TAS; Kwoh et al., 1989), Strangersatz-Amplifikation (SDA; Duck, 1990) oder Amplifikation durch Qβ-Replikase (Lornelli et al., 1989) oder jedes andere geeignete auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren sein, um Nucleinsäuremoleküle zu amplifizieren.
Sonden- und Primersequenzen liegen während der Spezifizierung als einzelsträngige DNA-Oligonucleotide vom 3'-Ende zum 5'-Ende vor. Für den Fachmann auf dem Gebiet ist offensichtlich, dass jede der nachstehend spezifizierten Sonden als solche oder in ihrer komplementären Form oder in ihrer RNA-Form (worin T durch U ersetzt ist) verwendet werden kann.
Die Sonden im Einklang mit der Erfindung können durch Clonieren von rekombinanten Plasmiden hergestellt werden, die die zugehörigen Nucleotidsequenzen einschließende Insertionen enthalten, welche, falls die Notwendigkeit besteht, aus den clonierten Plasmiden unter Verwendung von geeigneten Nucleasen ausgeschnitten und z.B. durch Fraktionierung nach Molekulargewicht gewonnen werden können. Die Sonden im Einklang mit der vorliegenden Erfindung können auch auf chemischem Wege synthetisiert werden, zum Beispiel durch das herkömmliche Phosphotriester-Verfahren.
Die als Primer oder Sonden verwendeten Oligonucleotide können auch Nucleotid-Analoga enthalten, wie etwa Phosphorothiate (Matsukura et al., 1987), Allcylphosphorothiate (Miller et al., 1979) oder Peptid-Nucleinsäuren (Nielsen et al., 1991; Nielsen et al., 1993), oder können interkalierende Agenzien enthalten (Asseline et al., 1984). Wie die meisten anderen Variationen oder Veränderungen, die in die ursprünglichen DNA-Sequenzen der Erfindung eingefügt wurden, werden diese Variationen Anpassungen im Hinblick auf die Bedingungen, unter denen das Oligonucleotid verwendet werden sollte, um die geforderte Spezifität und Sensitivität zu erhalten, erforderlich machen. Die letztendlichen Ergebnisse der Hybridisierung werden jedoch im Wesentlichen die gleichen sein, wie jene, die mit nicht veränderten Oligonucleotiden erhalten werden. Die Einführung dieser Veränderungen kann vorteilhaft sein, um Eigenschaften wie etwa Kinetik der Hybridisierung, Reversibilität der Hybridbildung, biologische Stabilität der Oligonucleotidmoleküle usw. positiv zu beeinflussen.
Der Ausdruck „fester Untergrund" kann jedes Substrat betreffen, an das eine Sonde gebunden werden kann, unter der Bedingung, dass es ihre Hybridisierungseigenschaften erhält, und unter der Bedingung, dass der Spiegel an Hintergrund-Hybridisierung niedrig bleibt. Gewöhnlich wird das feste Substrat eine Mikrotiterplatte, eine Membran (z.B. Nylon oder Nitrocellulose) oder eine Mikrokugel (Perle) oder ein Chip sein. Vor dem Auftragen auf die Membran oder der Fixierung kann es vorteilhaft sein, die Nucleinsäure-Sonde zu verändern, um die Fixierung zu erleichtern oder die Wirksamkeit der Hybridisierung zu verbessern. Solche Veränderungen können das Anhängen eines Homopolymers, Anbindung von verschiedenen reaktiven Gruppen wie etwa aliphatischen Gruppen, NH₂-Gruppen, SH-Gruppen, Carboxylgruppen oder Anbindung von Biotin, Haptenen oder Proteinen umfassen.
Der Ausdruck „markiert" betrifft die Verwendung von markierten Nucleinsäuren. Markierung kann durch die Verwendung von markierten Nucleotiden, die während des Polymerase-Schrittes der Amplifikation eingebaut werden, wie etwa von Saiki et al. (1988) oder Bej et al., (1990) dargestellt wurde, oder von markierten Primern oder durch jedes andere Fachleuten auf diesem Gebiet bekannte Verfahren durchgeführt werden. Die Art der Markierung kann isotopisch (³²P, ³⁵S usw.) oder nicht isotopisch (Biotin, Digoxigenin usw.) sein.
Die „biologische Probe" kann zum Beispiel Blut, Mundabstrich oder jede andere Probe sein, die genomische DNA enthält.
Zum Entwerfen von Sonden mit den erwünschten Eigenschaften können die nachstehenden nützlichen Richtlinien, die Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind, angewendet werden.
Weil der Umfang und die Spezifität von solchen Hybridisierungsreaktionen, wie sie hierin beschrieben werden, durch eine Reihe von Faktoren beeinträchtigt werden, werden Beeinflussung eines oder mehrerer dieser Faktoren die genaue Sensitivität und Spezifität einer bestimmten Sonde in der Weise bestimmen, ob sie perfekt komplementär zu ihrem Ziel ist oder nicht. Die Wichtigkeit und die Auswirkung von verschiedenen Versuchsbedingungen werden nachstehend hierin erläutert.

– Die Stabilität des [Sonde : Ziel]-Nucleinsäure-Hybrids sollte so gewählt werden, dass sie mit den Versuchsbedingungen verträglich ist. Dies kann durch das Vermeiden langer AT-reicher Sequenzen, durch Beendung der Hybride mit G:C-Basenpaaren und durch Entwerfen der Sonde mit einer geeigneten Tm erreicht werden. Die Anfangs- und Endpunkte der Sonde sollten so gewählt werden, dass die Länge und das % GC-Ergebnis in einer Tm etwa 2-10°C höher als die Temperatur ist, bei der der letzte Test durchgeführt werden wird. Die Basenzusammensetzung der Sonde ist signifikant, weil G-C-Basenpaare im Vergleich zu A-T-Basenpaaren auf Grund zusätzlicher Wasserstoffbindungen eine größere thermische Stabilität aufweisen. Daher wird eine Hybridisierung mit komplementären Nucleinsäuren mit höherem G-C-Anteil bei höheren Temperaturen stabiler sein.
– Bedingungen wie Ionenstärke und Inkubationstemperatur, unter denen eine Sonde verwendet werden wird, sollten ebenfalls beim Entwurf der Sonde in Betracht gezogen werden. Es ist bekannt, dass der Grad der Hybridisierung ansteigen wird, wenn die Ionenstärke des Reaktionsgemisches ansteigt, und dass sich die thermische Stabilität der Hybride mit dem Ansteigen der Ionenstärke erhöht. Auf der anderen Seite werden chemische Reagenzien wie etwa Formamid, Harnstoff, DMSO und Alkohole, die Wasserstoffbrücken aufbrechen, die Stringenz der Hybridisierung erhöhen. Destabilisierung der Wasserstoffbrücken durch solche Reagenzien kann die Tm wesentlich reduzieren. Allgemein tritt optimale Hybridisierung bei synthetischen Oligonucleotid-Sonden mit einer Länge von etwa 10 bis 50 Basen etwa 5°C unterhalb der Schmelztemperatur für ein gegebenes Duplexmolekül ein. Inkubation bei Temperaturen unterhalb des Optimums kann gestatten, dass nicht passende Basensequenzen hybridisieren, und kann daher zu reduzierter Spezifität führen.
– Es ist wünschenswert, Sonden zu haben, die nur unter Bedingungen hoher Stringenz hybridisieren. Unter Bedingungen hoher Stringenz werden sich nur hoch komplementäre Nucleinsäurehybride bilden; Hybride ohne einen ausreichenden Grad an Komplementarität werden sich nicht bilden. Dem zufolge bestimmt die Stringenz der Versuchsbedingungen das Ausmaß an Komplementarität, das zwischen zwei Nucleinsäuresträngen, die ein Hybrid bilden, notwendig ist. Der Grad der Stringenz wird in der Weise gewählt, dass der Unterschied in der Stabilität zwischen dem mit dem Ziel gebildeten Hybrid und der Nucleinsäure, die nicht Ziel ist, maximal ist.
– Regionen in der Ziel-DNA oder -RNA, von denen bekannt ist, dass sie starke interne Strukturen bilden, die Hybridisierung verhindern, sind weniger bevorzugt. In gleicher Weise sollten Sonden mit ausgedehnter Eigenkomplementarität vermieden werden. Wie vorstehend erläutert, ist Hybridisierung die Zusammenlagerung von zwei Einzelsträngen aus komplementären Nucleinsäuren, um einen durch Wasserstoffbrücken gebundenen Doppelstrang zu bilden. Wenn einer der beiden Stränge vollständig oder zum Teil in einem Hybrid gebunden ist, liegt es auf der Hand, dass er weniger in der Lage sein wird, an der Bildung eines neuen Hybrids beteiligt zu sein. Es können intramolekulare und intermolekulare Hybride aus den Molekülen eines Sondentyps gebildet werden, wenn ausreichend Eigenkomplementarität vorhanden ist. Solche Strukturen können durch sorgfältiges Entwerfen von Sonden vermieden werden. Durch das Entwerfen einer Sonde in der Weise, dass ein ausreichender Abschnitt der interessierenden Sequenz als Einzelstrang vorliegt, können die Rate und das Ausmaß der Hybridisierung wesentlich erhöht werden. Es sind Computerprogramme verfügbar, um nach dieser Art von Wechselwirkung zu suchen. Es kann jedoch unter bestimmten Umständen nicht möglich sein, diese Art von Wechselwirkung zu vermeiden.
– Standardhybridisierung und Waschbedingungen werden im Abschnitt Material & Methoden in den Beispielen offenbart. Andere Bedingungen sind zum Beispiel 3X SSC (Natriumcitrat), 20% deionisiertes FA (Formamid) bei 50°C. Andere Lösungen (SSPE (Natriumsalzlösung-Phosphat-EDTA), TMAC (Tetramethylammoniumchlorid), usw.) und Temperaturen können ebenfalls unter der Voraussetzung, dass Spezifität und Sensitivität der Sonden erhalten bleiben, verwendet werden. Falls notwendig müssen leichte Veränderungen an den Sonden in der Länge oder in der Sequenz durchgeführt werden, um die unter den gegebenen Umständen erforderliche Spezifität und Sensitivität zu erhalten.

Der Ausdruck „Hybridisierungspufferlösung" betrifft eine Pufferlösung, die eine Hybridisierungsreaktion zwischen den Sonden und den Polynucleinsäuren, die in der Probe vorliegen, oder den amplifizierten Produkten unter den geeigneten stringenten Bedingungen gestattet.
Der Ausdruck „Waschlösung" betrifft eine Lösung, die das Waschen der gebildeten Hybride unter den geeigneten stringenten Bedingungen ermöglicht.
Kurze Beschreibung der Abbildungen und Tabellen
Tabelle 1
Sequenz der Primer, die zur genomischen Typisierung von HA-1-Allelen durch sequenzspezifische Amplifikation verwendet wurden.
Tabelle 2
Sequenz der Primer und Sonden, die zur genomischen Typisierung von HA-1-Allelen durch Amplifikation und sequenzspezifische Hybridisierung verwendet wurden.
Tabelle 3
Zelluläre und genomische Typisierung von HA-1 in drei HLA-A*0201-positiven Familien.
Tabelle 4
Vergleich von zellulärer und genomischer Typisierung durch PCR oder LiPA von HA-1 in Familie 1.
Tabelle 5
KIAA0223-Sequenzpolymorphismus in für mH HA-1-positiven und HA-1-negativen Individuen. Die Sequenzierung der HA-1-Region im Gen KIAA0223 in homozygoten HA-1 +/+- und HA-1 –/–-Individuen und KG-1 ergab zwei Allele, die sich in zwei Nucleotiden unterschieden, was zu einer unterschiedlichen Aminosäure (von H zu R) führte und mit HA-1^H und HA-1^R bezeichnet wurde. Für DH und vR wurden 6 unabhängige PCR-Produkte sequenziert. Für KG-1 wurden 8 PCR-Produkte sequenziert.
1. Rekonstitution von HA-1 mit HPLC-fraktionierten Peptiden, die aus HLA-A2.1-Molekülen in einem ⁵¹Cr-Freisetzungstest mit dem für mH HA-1 spezifischen T-Zell-Clon 3HA15 eluiert worden waren.

a) Peptide wurden aus 90 × 10⁹ HA-1- und HLA-A2.1-positiven Rp-Zellen eluiert und unter Verwendung von Umkehrphasen-HPLC mit HFBA als organischem Modifikator aufgetrennt.
b) Fraktion 24 der ersten HPLC-Dimension, die HA-1-Aktivität enthielt, wurde durch Umkehrphasen-HPLC mit TFA als organischem Modifikator weiter fraktioniert.
c) HA-1, das die Fraktion 27 des zweiten Gradienten enthielt, wurde darüber hinaus der Chromatographie mit einem schwächeren Gradienten, bestehend aus 0,1% Acetonitril/min unterworfen. Hintergrundlyse von T2 durch die CTL in Abwesenheit von Peptiden betrug in a 3%, in b und c 0%. Positive Kontrolllyse betrug in a 99%, in b 74% und in c 66%.
d) Bestimmung der HA-1-Peptid-Kandidaten. Die HPLC-Fraktion 33 aus der Auftrennung in 1c wurde der Chromatographie mit einem online-Mikrokapillarsäulen-Effluenz-Splitter unterworfen und durch Elektrospray-Ionisationsmassenspektrometrie und einen ⁵¹Cr-FreisetzungsTest analysiert. Die HA-1-Rekonstitutionsaktivität als Prozent spezifischer Freisetzung wurde mit der Menge an Peptidkandidaten, gemessen als Ionenfluss, verglichen.

2. Sequenzierung des mH HA-1-Peptids durch Tandem-Massenspektrometrie.

a) Dissoziationsmassenspektrum von Stoßaktivierung des Peptidkandidaten mit m/z 513.
b) Rekonstitutionstest mit verschiedenen Konzentrationen an synthetischem mH HA-1-Peptid mit drei HA-1-spezifischen T-Zell-Clonen, 3HA15, Clon 15 und 5W38. Hintergrundlyse von T2 durch die CTL in Abwesenheit aller Peptide betrug für 3HA15 4%, für Clon 15 10% und für 5W38 2%. Positive Kontrolllyse betrug für 3HA15 46%, für Clon 15 47% und 5W38 48%.

3. Der KIAA0223-Polymorphismus korrelierte exakt mit dem mH-Antigen HA-1-Phänotyp.

a) Die HA-1-Region von KIAA0223 wurde in einer mH HA-1-Antigen typisierten Familie sequenziert. 6 PCR-Produkte von jedem Familienmitglied wurden sequenziert. Die Familienmitglieder 00, 07 und 09 exprimierten das HA-1^R in allen 6 PCR-Produkten. Das Familienmitglied 01 exprimierte das HA-1^H Allel in 2 PCR-Produkten und das HA-1^R in 4 PCR-Produkten. Das Familienmitglied 02 exprimierte das HA-1^H-Allel in 3 PCR-Produkten und das HA-1^R in 3 PCR-Produkten. Das Familienmitglied 08 exprimierte das HA-1^H-Allel in 4 PCR-Produkten und das HA-1^R-Allel in 2 PCR-Produkten.
b) Die für das HA-1-Allel spezifische PCR-Reaktion in einer mH HA-1-Antigen typisierten Familie korrelierte exakt mit dem HA-1-Phänotyp. Die Größen der entstandenen PCR-Produkte stimmten mit den erwarteten Größen überein, die aus der cDNA-Sequenz abgeleitet worden waren.
c) Transfektion des HA-1^H-Allels von K1AA0223 führte zur Erkennung durch mH HA-1-spezifische T-Zellen. Die HA-1^H- und die HA-1^R-Codierungssequenzen von KIAA0223 wurden zusammen mit HLA-A2.1 in Hela-Zellen transfiziert. Nach 3 Tagen wurden die für HA-1 spezifischen CTL-Clone 5W38 und 3HA15 zugegeben und nach den 24 Stunden wurde die TNFα-Freisetzung im Überstand gemessen. Der Clon Q66.9 ist für das Peptid 58-66 der Influenza-Matrix spezifisch. Nach Transfektion des Vektors pcDNA3.1(+) allein wurde keine TNFα-Produktion beobachtet (Ergebnisse nicht dargestellt).

4.

a) Bindung von HA-1^H- und HA-1^R-Peptiden an HLA-A2.1. Die Bindung von HA-1^H- und HA-1^R-Peptiden wurde auf ihre Fähigkeit untersucht, die Bindung des fluoreszierenden Peptids FLPSDCFPSV an rekombinantes HLA-A2.1 und β2-Mikroglobulin in einem zellfreien Peptidbindungstest zu hemmen. Ein repräsentatives Experiment wird dargestellt. Der IC50 wird aus den Ergebnissen von 4 Experimenten bestimmt und betrug 30 nM für VLHDDLLEA und 365 nM für VLRDDLLEA.
c) Rekonstitutionstest mit verschiedenen Konzentrationen an synthetischem HA-1^R-Peptid mit für HA-1 spezifischen T-Zellen. Das HA-1^R-Peptid wurde titriert und mit T2-Zellen präinkubiert. Drei für HA-1 spezifische T-Zell-Clone, 5W38, 3HA15 und Clon 15 wurden zugegeben und ein ⁵¹Cr-Freisetzungstest über 4 h wurde durchgeführt. Hintergrundlyse von T2 durch die CTL in Abwesenheit aller Peptide betrug für 3HA15 4%, für Clon 15 10% und für 5W38 2%. Positive Kontrolllyse betrug für 3HA15 46%, für Clon 15 47% und 5W38 48%.

5. Sequenzen und genomische Struktur des HA-1-Locus. 1a, Codierungssequenzen der Allele H und R von HA-1. Fett gedruckte Buchstaben kennzeichnen die polymorphen Nucleotide. 1b, Exon-Intron-Grenzen des HA-1-Locus. Exon-Sequenzen werden in Großbuchstaben dargestellt, Intron-Sequenzen in kleinen Buchstaben.
6. Genomische Typisierung von HA-1-Allelen in klinischen Proben. Genomische Typisierung wurde durch sequenzspezifische Amplifikation unter Verwendung von zwei Primer-Sätzen aus Tabelle 1 durchgeführt. Die beiden oberen Fragmente im Gel stammen vom Allel H, die beiden unteren Fragmente vom Allel R.
BEISPIELE
1. Beispiel 1: Herstellung von HA-1-cDNA
1.1 Ergebnisse
Die Transplantat-Wirt-Erkrankung (GvHD) ist eine häufige und lebensbedrohende Komplikation nach allogener HLA-identischer Knochenmarktransplantation (BMT). Empfänger von HLA-identischem Knochenmark entwickeln akute oder chronische Transplantat-Wirt-Erkrankung in 36% beziehungsweise 49% der Fälle^1,2. Nichtübereinstimmung in Genen, die nicht den MHC betreffen und als minore Histokompatibilitäts (mH)-antigene bezeichnet werden, sind eindeutig an der Entwicklung von GvHD nach HLA-identischer BMT beteiligt. Eine retrospektive Analyse zeigte kürzlich die signifikante Verbindung zwischen Nichtübereinstimmung des mH-Antigens HA-1 und der Auslösung von GvHD nach HLA-identischer BMT³. Minore Histokompatibilitätsantigene werden durch MHC-beschränkte T-Zellen erkannt, und es wurde gezeigt, dass sie Peptide sind, die von intrazellulären Proteinen abstammen, welche von MHC-Molekülen präsentiert werden^4-6. Hier beschreiben wir die erste Identifizierung eines polymorphen Gens, das ein menschliches mH-Antigen codiert. Das mit GvHD verbundene mH-Antigen HA-1 ist ein Nonapeptid, das vom di-allelischen Gen KIAA0223 abstammt. Das allelische HA-1-Gegenstück, das vom Gen KIAA0223 codiert wird, unterscheidet sich nur in einer Aminosäure vom mH-Antigen HA-1. Familienstudien zeigten eine exakte Korrelation zwischen dem Polymorphismus des Gens KIAA0223 und dem HA-1-Phänotyp, welcher zuvor durch Erkennung durch die für HA-1 spezifischen CTL-Clone bestimmt worden war. Die Aufklärung des HA-1 codierenden Gens ermöglicht vorausschauende DNA-Typisierung des HA-1 von BMT-Spendern und -Empfängern, um die Auswahl des Spenders zu verbessern und GvHD zu vermeiden.
Zytotoxische T-Zell-Clone, die für das mH-Antigen HA-1 spezifisch sind, sind aus drei verschiedenen Patienten mit schwerer GvHD isoliert worden. Das mH-Antigen HA-1 wird im Zusammenhang mit HLA-A2.1 präsentiert und kommt in 69% der HLA-A2.1-positiven Bevölkerung vor⁷. Es wurde gezeigt, dass die Expression von HA-1 gewebespezifisch ist und auf Zellen hämopoietischer Herkunft, einschließlich dendritischer Zellen, Langerhans'-Zellen und leukämischer Zellen, beschränkt ist^8-10. Familienanalyse deutete auf einen Mendelschen Vererbungsgang für HA-1 und eine vom MHC-Komplex unabhängige Segregation hin¹¹. Ein Vergleich von Sequenzen des T-Zell-Rezeptors (TCR) von verschiedenen für HA-1 spezifischen T-Zell-Clonen, die von verschiedenen Individuen stammten, offenbarte konservative Verwendung des TCR Vβ6.9 und konservative Aminosäuren in der CDR3-Region¹². In einer retrospektiven Studie wurde Nichtübereinstimmung für eine Reihe von mH-Antigenen unter Berücksichtigung der Verbindung mit GvHD nach HLA-identischer BMT bewertet. Eine einzelne Nichtübereinstimmung für HA-1 zwischen Spender und Empfänger war signifikant mit dem Auslösen von GvHD nach HLA-identischer BMT korreliert³.
Um das mH-Antigen HA-1 zu identifizieren, wurden HLA-A2.1-Moleküle aus zwei HA-1 exprimierenden, EBV-transformierten B-lymphoblastoiden Zelllinien (EBV-BLCL) Rp und Blk gereinigt. Die an HLA-A2.1 gebundenen Peptide wurden durch Säurebehandlung isoliert, und Fraktionierung der Peptide wurde durch mehrfache Durchläufe von Umkehrphasen-HPLC durchgeführt. Die Fraktionen wurden auf ihre Fähigkeit analysiert, HA-1-spezifische Lyse zu induzieren, indem T-Zellen als Zielzellen und ein für HA-1 spezifischer CTL-Clon als Effektorzellen in einem ⁵¹Cr-Freisetzungstest verwendet wurden (1a). Fraktion 24 enthielt HA-1-Aktivität und wurde mit Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung eines unterschiedlichen organischen Modifikators zweimal weiter fraktioniert (1b.c.). Fraktion 33 und 34 der dritten HPLC-Fraktionierung zeigten im ⁵¹Cr-Freisetzungstest HA-1-Aktivität und wurden durch Tandem-Massenspektrometrie analysiert. Weil über 100 verschiedene Peptide in diesen Fraktionen vorlagen, wurden etwa 40% der Fraktionen 33 und 34 der Chromatographie mit einem On-line-Mikrokapillarsäulen-Effluent-Splitter unterworfen. Die Fraktionen wurden gleichzeitig durch Tandem-Massenspektrometrie und ⁵¹Cr-Freisetzungstest analysiert (1d.). Fünf Peptidarten (bei m/z 550, 520, 513, 585 und 502) lagen spezifisch in den aktiven Fraktionen vor und fehlten in Fraktionen ohne Aktivität im CML-Test. Stoßaktivierte Dissoziationsanalyse des Peptid-Kandidaten m/z 550 ergab die Sequenz YXTDRVMTV. X steht für Isoleucin oder Leucin, welche durch diesen Massenspektrometer-Typ nicht unterschieden werden können. Ein synthetisches Peptid mit dieser Sequenz war jedoch nicht in der Lage, das HA-1-Epitop wiederherzustellen (Ergebnisse nicht dargestellt). Um zu bestimmen, welches der vier verbleibenden Kandidaten das HA-1-Peptid war, wurde die zweite HA-1-Reinigung der EBV-BLCL Blk ausgewertet. Die HA-1-positive Peptidfraktion 33 der zweiten Fraktionierung durch Umkehrphasen-HPLC wurde wiederum der Chromatographie durch Mikrokapillar-HPLC mit einem dritten organischen Modifikator unterworfen. Ein einziger Gipfel für Wiederherstellungsaktivität wurde in einem ⁵¹Cr-Freisetzungstest beobachtet (Ergebnisse nicht dargestellt). Die Massenspektralanalyse dieser Fraktionen ergab, dass lediglich der Peptid-Kandidat m/z 513 vorlag. Dieses Peptid wurde mit stoßaktivierter Dissoziationsanalyse analysiert und als VXHDDXXEA sequenziert (2a). Varianten des Peptids mit Isoleucin und Leucin wurden synthetisiert, und man ließ sie die Mikrokapillar-HPLC-Säule durchlaufen. Nur Peptid VLHDDLLEA coeluierte mit dem natürlich prozessierten Peptid 513 (Ergebnisse nicht dargestellt). Als nächstes offenbarte synthetisches VLHDDLLEA, das in verschiedenen Konzentrationen zu einem CML-Test mit 3 verschiedenen für HA-1 spezifischen CTL-Clonen zugegeben worden war, die Erkennung des Peptids durch alle drei Clone mit einer halbmaximalen Aktivität bei 150–200 pM für alle drei Clone (2b). Dies zeigte, dass das mH-Antigen HA-1 durch das Nonapeptid VLHDDLLEA dargestellt wird.
Durchmusterungen von Datenbanken, die vorgenommen wurden, um das HA-1 codierende Gen zu identifizieren, ergaben, dass das HA-1-Peptid VLHDLLEA für 8 von 9 Aminosäuren mit dem Peptid VLRDDLLEA von der zum Teil komplementären DNA- (cDNA-) Sequenz von K1AA0223 identisch war, welche von der KG-1-Zellinie für akute myelogene Leukämie abstammt (GENBANK Zug.Nr. D86976). Weil HA-1 eine Häufigkeit von 69% in der Bevölkerung hat, schlossen wir, dass die Peptidsequenz VLRDDLLEA das HA-1-allele Gegenstück darstellen könnte, welches in den verbleibenden 31% der Bevölkerung vorliegt. Um diese Annahme zu überprüfen, führten wir eine Analyse der cDNA-Sequenz der vermuteten HA-1 codierenden Region von KIAA0223 in EBV-BLCL durch, die von einem vermuteten HA-1-homozygot positiven (vR), von einem vermuteten HA-1-negativen Individuum (DM) und von der KG-1-Zelllinie stammte (Tabelle 5). Die HA-1 codierende Region von KIAA0223 des HA-1 +/+-Individuums (vR) wies zwei Nucleotid-Unterschiede zu der Sequenz von KIAA0223 in der Datenbank auf, die zu der Aminosäuresequenz VLHDDLLEA (als HA-1^H bezeichnet) führten. Die HA-1 codierende Region von KIAA0223 des HA-1 –/–-Individuums (DH) wies 100% Homologie mit der berichteten Sequenz von KIAA0223 auf (als HA-1^R bezeichnet). Die KG-1-Zelllinie exprimierte beide Allele von KIAA0223. Weil KG-1 das Restriktionsmolekül HLA-A2.1, das zur T-Zell-Erkennung notwendig ist, nicht exprimiert, transfizierten wir KG-1 mit HLA-A2.1 und verwendeten diese Zellen als Zielzellen in einem ⁵¹Cr-Freisetzungstest mit dem für HA-1 spezifischen T-Zell-Clon als Effektorzellen. Nach den Ergebnissen der cDNA-Sequenzanalyse wurden die KG-1-Zellen durch den für HA-1 spezifischen T-Zell-Clon erkannt (Daten nicht dargestellt). Dieses Ergebnis legte nahe, dass das Gen K1AA0223 ein di-allelisches System bildet, bei dem das Allel HA-1^H zur Erkennung durch die für das mH-Antigen HA-1 spezifischen T-Zell-Clone führt.
Zwei Familien, die im Voraus mit für HA-1 spezifischen CTL als HA-1 typisiert worden waren, wurden auf der cDNA-Ebene auf ihren KIAA0223-Polymorphismus untersucht. Die Familienmitglieder der Familie 1 wurden durch Sequenzierung der HA-1-Codierungssequenzregion auf ihren KIAA0223-Sequenzpolymorphismus durchmustert. Alle HA-1-negativen Mitglieder wiesen die HA-1^R-Sequenz auf, während sich bei allen HA-1-positiven Mitgliedern herausstellte, dass sie heterozygot waren und daher beide HA-1-Allele in sich trugen (3a). Nachfolgend entwarfen wir für die HA-1-Allele spezifische PCR-Primer, um eine weitere Familie, die im Voraus auf zellulärer Ebene als HA-1 typisiert worden war, zu durchmustern. Beide Eltern und ein Kind wurden als heterozygot für HA-1, zwei HA-1-negative Kinder als homozygot für das Allel HA-1^R und ein Kind als homozygot für das Allel HA-1^H bestimmt (3b). Die Durchmusterung der beiden Familien wies eine exakte Korrelation mit dem HA-1-Phänotyp auf, wie er durch Erkennung durch die für HA-1 spezifischen T-Zell-Clone und den Gen-Polymorphismus für KIAA0223 bestimmt worden war.
Um eindeutig zu beweisen, dass das Gen KIAA0223 das mH-Antigen HA-1 codiert, wurde die HA-1 codierende Sequenzregion von KIAA0223 sowohl des Allels HA-1^H als auch des Allels HA-1^R in einen eukaryontischen Expressionsvektor cloniert und vorübergehend zusammen mit HLA-A2.1 in HA-1-negative Hela-Zellen transfiziert. HA-1-spezifische T-Zell-Erkennung dieser transfizierten Hela-Zellen wurde unter Verwendung eines TNFα-Freisetzungstestes untersucht. Die mit dem die HA-1^H-Sequenz enthaltenden Vektor transfizierten Hela-Zellen wurden von zwei für HA-1 spezifischen T-Zell-Clonen erkannt (3c). Im Gegensatz dazu führte die Transfektion des die HA-1^R-Sequenz enthaltenden Vektors nicht zur Erkennung. Abschließend zeigen unsere Ergebnisse deutlich, dass das mH-Antigen HA-1 durch das Allel HA-1^H des Gens KIAA0223 codiert wird.
Rekonstitutions- und HLA-A2.1-Bindungstests wurden durchgeführt, um die Kapazität des HA-1^R-Peptids VLRDDLLEA, HLA-A2.1 zu binden und von den für HA-1 spezifischen T-Zell-Clonen erkannt zu werden, zu bestimmen. Die Konzentration des HA-1^R-Peptids, das die Bindung eines fluoreszierenden Standardpeptids an HLA-A2.1 um 50% (IC50) hemmte, betrug 365 nM, womit es unter die Gruppe mit mittlerer Bindungsaffinität fällt, wohingegen der IC50 des HA-1^H-Peptids 30 nM betrug, womit es im Bereich hoher Bindungsaffinität liegt (4a)^13,14. Unterschiedliche Konzentrationen an VLRDDLLEA wurden in einem ⁵¹Cr-Freisetzungstest mit drei für HA-1 spezifischen T-Zell-Clonen untersucht. Einer der drei untersuchten Clone (3HA15) zeigte Erkennung des HA-1^R-Peptids, allerdings nur bei 1000-fach höherer Peptidkonzentration als der, die für die Erkennung des HA-1^H-Peptids notwendig war (4b). Da die Bindungsaffinität der beiden Peptide zu HLA-A2.1 sich nur um das 10-fache unterscheidet, kann gefolgert werden, dass all diese T-Zell-Clone spezifisch das HA-1^H-Peptid erkennen.
Der T-Zell-Clon 3HA15, der das HA-1^R-Peptid in hohen Konzentrationen erkennt, erkennt für HA-1^R homozygote Individuen nicht. Dies legt nahe, dass das Peptid VLRDDLLEA von HLA-A2.1 nicht präsentiert wird oder unterhalb der Nachweisgrenze der T-Zellen präsentiert wird. Um zu bestimmen, ob das HA-1R-Peptid VLRDDLLEA durch HLA-A2.1 präsentiert wurde, wurden an HLA-A2.1 gebundene Peptide von einem für HA-1^R homozygoten EBV-BLCL eluiert und mit Umkehrphasen-HPLC fraktioniert. Das synthetische HA-1-Peptid VLRDDLLEA ließ man die Umkehr-HPLC durchlaufen, um zu bestimmen, in welcher Fraktion dieses Peptid eluiert wurde. Die zugehörigen HPLC-Fraktionen, die von dem HA-1^R exprimierenden EBV-BLCL stammten, wurden unter Verwendung der Massenspektrometrie analysiert. Anwesenheit des Peptids VLRDDLLEA konnte nicht nachgewiesen werden (Ergebnisse nicht dargestellt), was anzeigt, dass dieses Peptid nicht oder in sehr geringen Mengen von HLA-A2.1 an der Zelloberfläche präsentiert wird. Dies ist höchst wahrscheinlich auf die 10-fach geringere Bindungsaffinität des Peptids zu HLA-A2.1 zurückzuführen. Die vermutete Abwesenheit des HA-1^R-Peptids in HLA-A2.1 zeigt an, dass dieses Allel als ein Null-Allel in Bezug auf T-Zell-Reaktivität angesehen werden muss. Dies legt nahe, dass nur BMT in Richtung von einem HA-1^R/R (HA-1-) Spender auf einen HA-1^H/H oder HA-1^R/H (HA-1+) Empfänger und nicht anders herum signifikant mit GvHD verbunden sein würde. Dies ist tatsächlich in einer retrospektiven Untersuchung beobachtet worden, in der HLA-2.1-positive BMT-Paare für HA-1 typisiert worden waren³. Jedoch können von HA-1^R stammende Peptide an andere HLA-Allele binden und möglicherweise von T-Zellen erkannt werden. Wenn diese Peptide nicht von dem Allel HA-1^H erzeugt und präsentiert werden, kann T-Zell-Reaktivität gegenüber dem Allel HA-1^R vorstellbar sein, und GvHD kann in dieser Richtung auftreten.
Bisher sind nur wenige murine und menschliche mH-Antigene auf der Peptid- und Gen-Ebene identifiziert worden. Zwei murine mH-Antigene werden durch mitochondrielle Proteine codiert, was zu vier beziehungsweise zwei Allelen führt^15-17. Zusätzlich stellte sich heraus, dass zwei murine H-Y-mH-Antigene Peptide waren, die von auf dem Y-Chromosom liegenden Genen codiert werden^18-21. Das menschliche auf dem Y-Chromosom gelegene SMCY-Gen codiert die HLA-B7- und die HLA-A2.1-begrenzten H-Y-mH-Antigene^5,6. Von den menschlichen, nicht geschlechtsgebundenen mH-Antigenen ist nur das mH-Antigen HA-2 auf der Peptidebene sequenziert worden, das HA-2 codierende Gen blieb jedoch unbekannt⁴. Mit der Identifizierung des das mH-Antigen HA-1 codierenden Gens ist erstmals gezeigt worden, dass menschliche mH-Antigene auf polymorphe Gene zurückgehen. Das HA-1 codierende Gen KIAA0223 weist zwei Allele auf, die sich in zwei Nucleotiden unterscheiden, was zu einem Unterschied in einer einzigen Aminosäure führt.
Weil das mH-Antigen HA-1 das einzige bekannte menschliche mH-Antigen ist, das mit der Entwicklung von GvHD nach BMT verbunden ist, sind die Ergebnisse unserer Studie von signifikanter klinischer Bedeutung³. Obwohl die Anzahl der verschiedenen menschlichen mH-Antigene vermutlich hoch ist, wird vermutet, dass nur wenige immundominante mH-Antigene für das Risiko für GvHD in Betracht kommen können. Die Identifizierung dieser menschlichen immundominanten mH-Antigene und die Durchmusterung auf solche Antigene kann zu einem signifikanten Rückgang von GvHD nach BMT führen. Hier beschreiben wir die erste Aufklärung eines polymorphen Gens, das das immundominante mH-Antigen HA-1 codiert. Dies ermöglicht uns, für das HA-1-Allel spezifische Primer zur Typisierung von Spender und Empfänger vor einer Transplantation zu entwerfen, um die Auswahl des Spenders zu verbessern und damit von HA-1 ausgelöste Entwicklung von GvHD zu vermeiden.
1.2 Verfahren
1.2.1 Zellkultur
Die CD8+, HLA-A2.1 beschränkten, für HA-1 spezifischen zytotoxischen T-Zell-Clone 3HA15, Clon 15 und 5W38 wurden von PBMC von zwei Patienten erhalten, die HLA-identische Knochenmarktransplantation erhalten hatten^7,23. Die Clone wurden durch wöchentliche Stimulation mit bestrahlten allogenen PBMC und BLCL in RPMI-1640-Kulturmedium kultiviert, das 15% menschliches Serum, 3 mM 1-Glutamin, 1% Leukoagglutinin-A und 20 Einheiten/ml rIL-2 enthielt. Die HLA-A2.1-positiven, HA-1 exprimierenden, EBV transformierten B-Zelllinien (BLCL) Rp und Blk wurden in IMDM enthaltendem 5%igem FKS gehalten. Die KG-1- und T2-Zelllinien wurden in 1640-Kulturmedium kultiviert, welches 3 mM 1-Glutamin und 10% FKS enthielt.
1.2.2 ⁵¹Cr-Freisetzungstest.
HPLC-Fraktionen und synthetische Peptide wurden, wie beschrieben, in einem ⁵¹Cr-Freisetzungstest untersucht²⁴. 2500 mit ⁵¹Cr markierte T2-Zellen in 25 μl wurden mit 25 μl Peptid, das in 50 mM Hank-Hepes gelöst war, über 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Zytotoxische T-Zellen wurden zu einem Endvolumen von 150 μl zugegeben. Wenn HPLC-Peptidfraktionen untersucht wurden, wurde T2 mit 2 μg/ml MA2.1 während der ⁵¹Cr-Markierung inkubiert. Nach 4 Stunden bei 37°C wurden die Überstände geerntet.
1.2.3. Peptidreinigung
Die Peptide wurden aus gereinigten HLA-A2.1-Molekülen eluiert, wie vorstehend beschrieben²⁴. In Kürze, HLA-A2.1-Moleküle wurden durch Affinitätschromatographie mit BB7.2-gekoppelten CNBR-aktivierten Sepharose-4B-Perlen (Pharmacia LKB) zweimal aus 90 × 10⁹ HLA-A2.1-positiven EBV-BLCL gereinigt und ausgiebig gewaschen. Die Peptide wurden von HLA-A2.1 unter Behandlung mit 10%iger Essigsäure eluiert, weiter mit 1% TFA angesäuert und von der schweren Kette des HLA-A2.1 und dem β2-Mikroglobulin durch Filtration durch einen 10 kD-Centricon- (Amicon)-Filter getrennt. Die Peptide wurden unter Verwendung der Umkehrphasen-Mikro-HPLC (Smart System, Pharmacia) fraktioniert. Für die erste Reinigung wurden drei Durchläufe der HPLC-Fraktionierung verwendet, um die HLA-A2.1-beschränkten aktiven HA-1-Peptidfraktionen von 90 × 10⁹ Rp-Zellen zu reinigen. Die erste Fraktion enthielt an Pufferlösung A: 0,1% HFBA in H₂O, Pufferlösung B: 0,1% HFBA in Acetonitril. Der Gradient betrug 100% Pufferlösung A (0 bis 20 min), 0 bis 15% Pufferlösung B (20 bis 25 min) und 15 bis 70% Pufferlösung B (25 bis 80 min) bei einer Durchflussrate von 100 μl/min. Fraktionen von 100 μl wurden gesammelt. Fraktion 24 des ersten Gradienten wurde weiter fraktioniert. Die zweite Fraktion enthielt an Pufferlösung A: 0,1% TFA in H₂O, Pufferlösung B: 0,1% TFA in Acetonitril. Der Gradient betrug 100% Pufferlösung A (0 bis 20 min), 0 bis 12% Pufferlösung B (20 bis 25 min) und 12 bis 50% Pufferlösung B (25 bis 80 min) bei einer Durchflussrate von 100 μl/min. Fraktionen von 100 l wurden gesammelt. Ein schwächerer dritter Gradient wurde verwendet, um Fraktion 27 weiter zu reinigen, die HA-1-Aktivität enthielt. Der Gradient betrug 100% Pufferlösung A (0 bis 29 min), 0 bis 18% Pufferlösung B (29 bis 34 min), 18 Pufferlösung B (34 bis 39 min), 18 bis 23,9% Pufferlösung B (39 bis 98 min) bei einer Durchflussrate von 100 μl/min. 1/180 bis 1/45 des Ausgangsmaterials wurden im ⁵¹Cr-Freisetzungstest zur Untersuchung auf positive Fraktionen verwendet. Vergleichbare HPLC-Fraktionen wurden für die zweite Reinigung von HLA-A2.1-beschränkten aktiven HA-1-Peptidfraktionen aus 90 × 10⁹ Blk verwendet. 40% der HA-1 enthaltenden Fraktion 33 der zweiten HA-1-Reinigung wurden für eine zusätzliche Fraktionierung durch Umkehrphasen-Mikrokapillar-HPLC verwendet. Pufferlösung A bestand aus 0,1% Triethylamin (TEA) in Wasser, mit Essigsäure auf pH-Wert 6,0 gepuffert, und Pufferlösung B bestand aus 0,085% TEA in 60% Acetonitril, mit Essigsäure auf pH-Wert 6,0 gepuffert. Der Gradient betrug 100% Pufferlösung A (0 bis 5 min), 0 bis 100% B (5 bis 45 min) bei einer Durchflussrate von 0,5 μl/min. Die Fraktionen wurden in 50 μl 0,1%iger Essigsäure jede Minute über 5 bis 15 Minuten, alle 30 Sekunden über 15 bis 20 Minuten, alle 20 Sekunden über 20 bis 40 Minuten und alle 30 Sekunden über 40 bis 45 Minuten gesammelt. Von jeder gesammelten Fraktion wurden 20% zur Untersuchung auf HA-1-Aktivität verwendet, und 80% wurden verwendet, um massenspektrometrische Daten zu erhalten.
1.2.4. Massenspektrometrie.
Fraktionen aus der dritten Dimension der HPLC-Auftrennung der Rp-Reinigung, die die HA-1-Aktivität enthielten, wurden durch Mikrokapillar-HPLC-Elektrospray-Ionisierungsmassenspektrometrie analysiert²⁵. Die Peptide wurden auf eine C18-Mikrokapillarsäule (75 μm i.D. × 10 cm) geladen und über 34 Minuten mit einem Gradienten aus 0 bis 60% B eluiert, wobei Lösungsmittel A aus 0,1 M Essigsäure in Wasser und Lösungsmittel B aus Acetonitril bei einer Durchflussrate von 0,5 μl/min bestand. Ein Fünftel des Effluenten wurde in die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen aufgetragen, die 100 μl Kulturmedium in jeder Vertiefung enthielt (10-Sekunden-Fraktionen), während die restlichen vier Fünftel in die Elekktrospray-Quelle des TSQ-70U geleitet wurden. Die Massenspektren und CAD-Massenspektren wurden auf einem Finnigan-MATTSQ-7000 (San Jose, Kalifornien) Dreifach-Quadropol-Massenspektrometer, das mit einer Elektrospray-Ionenquelle ausgestattet war, aufgezeichnet.
1.2.5. Untersuchung zur HLA-A2.1-Peptidbindung.
Eine quantitative Untersuchung auf HLA-A2.1-bindende Peptide wurde verwendet, die auf einer Hemmung der Bindung des fluoreszenzmarkierten Standardpeptids Hbc 18-27 F an C6 (FLPSDCFPSV) an rekombinantes HLA-A2.1-Protein und β2-Mikroglobulin beruht^26,27. In Kürze, HLA-A2.1-Konzentrationen, die etwa 40-60% gebundenes fluoreszierendes Standardpeptid enthielten, wurden mit 15 pMol/Vertiefung (150 nM) β2-Mikroglobulin (Sigma) verwendet. Verschiedene Dosen der Testpeptide wurden zusammen mit 100 fMol/Vertiefung (1 nM) fluoreszierendem Standardpeptid, HLA-A2.1 und β2-Mikroglobulin über 1 Tag bei Zimmertemperatur im Dunkeln in einem Volumen von 100 μl in Untersuchungspufferlösung inkubiert. Der Prozentsatz der MHC-gebundenen Fluoreszenz wurde durch Gelfiltration bestimmt, und die 50%-hemmende Dosis wurde für jedes Peptid unter Verwendung der nicht linearen einseitigen Kompetitions-Regressionsanalyse für Wettbewerb um eine Bindungsstelle mit der Prismgraph-Software ermittelt. Synthetische Peptide wurden in einem Abimed 422-Mehrfachpeptidsynthesegerät (Abimed, Langenfeld, Deutschland) hergestellt und besaßen eine mehr als 90%ige Reinheit, was durch Umkehrphasen-HPLC überprüft wurde.
1.2.6 RT-PCR-Amplifikation und Sequenzierung der HA-1 codierenden KIAA0223-Region.
Vollständige oder m-RNA wurde aus BLCL unter Verwendung des RNAzol-Verfahrens (Cinaa/Biotecx Laboratories, Houston, TX) oder nach den Anweisungen des Herstellers (QuickPrep mRNA-Reinigungs-Kit, Pharmacia Biotech) hergestellt. cDNA wurde mit 1 μg RNA als Matrize und mit dem auf KIAA0223 basierenden reversen Primer
5'-GCTCCTGCATGACGCTCTGTCT GCA-3'
synthetisiert. Um die HA-1-Region von KIAA0223 zu amplifizieren, wurden die nachstehenden Primer verwendet:
Vorwärts gerichteter Primer
5'-GACGTCCTCGAGGACATCTCCCAT-3'
und reverser Primer
5'-CAAGGCCACAGCAATCGTCTCCAGG-3'.
Die verwendeten Zyklus-Parameter waren: Denaturierung 95°C, 1 min, Anelierung 58°C, 1 min und Extension 72°C, 1 min (25 Zyklen). Die PCR-Produkte wurden unter Verwendung des Magic-PCR-Preps DNA-Reinigungssystems (Promega) gereinigt und direkt unter Verwendung des pMosBlue T-Vector-Kits (Amersham LIFE SCIENCE) cloniert. Sechs unabhängige Kolonien pro Individuum wurden unter Verwendung des T7-Sequenzierungs-Kits (Pharmacia Biotech) sequenziert.
1.2.7. Für Allel HA-1 spezifische PCR-Amplifikation.
In dem Fall der für das Allel HA-1 spezifischen PCR-Amplifikation wurde cDNA, wie vorstehend beschrieben, synthetisiert. Eine PCR-Amplifikation wurde mit den für das Allel spezifischen vorwärts gerichteten Primern durchgeführt: für das Allel HA-1^H: Primer H1:
5'-CCT-TGA-GAA-ACT-TAA-GGA-GTG-TGT-GCT-GCA-3',
für das Allel HA-1^R: Primer R1:
5'-CCT-TGA-GAA-ACT-TAA-GGA-GTG-TGT-GTT-GCG-3'
und für beide Reaktionen wurde der vorstehend beschriebene reverse Primer verwendet. Die verwendeten Zyklus-Parameter waren Denaturierung 95°C, 1 min, Anelierung 67°C, 1 min und Extension 72°C, 1 min (25 Zyklen).
1.2.8. Clonierung und Expression der allelen Region HA-1^H und HA-1^R von KIAA0223.
Ein vorwärts gerichteter auf KIAA00223 basierender PCR-Primer, der ein ATG-Startcodon enthielt
(5'-CCG-GCA-TGG-ACG-TCG-TCG-AGG-ACA-TCT-CCC-ATC-3'),
und ein auf KIAA0223 basierender reverser PCR-Primer, der ein translationales Stop-Signal enthielt
(5'-CTA-CTT-CAG-GCC-ACA-GCA-ATG-GTC-TCC-AGG-3')
wurden entworfen und in einer RT-PCR-Reaktion mit cDNA verwendet, die von einem für HA-1^H homozygoten und einem für HA-1^R homozygoten BLCL stammte. Die verwendeten Zyklus-Parameter waren Denaturierung 95°C, 1 min, Anelierung 60°C, 1 min und Extension 72°C, 1 min (25 Zyklen). Die gewünschten PCR-Produkte wurden unter Verwendung des Magic-PCR-Preps DNA-Reinigungssystems (Promega) gereinigt. Die gereinigte DNA wurde direkt unter Verwendung des pMosBlue T-Vector-Kits (Amersham LIFE SCIENCE) cloniert und unter der Kontrolle eines CMV-Promotors in den eukaryontischen Vektor pCDNA3.1(+) recloniert. Vorübergehende Kotransfektion wurde mit HLA-A2.1 in Hela-Zellen unter Verwendung von gemeinsamer DEAE-Dextran-Fällung durchgeführt. Nach Kultivierung über 3 Tage wurden für HA-1 spezifische T-Zellen zugegeben, und nach 24 Stunden wurde die Freisetzung von TNFα im Überstand unter Verwendung von WEHI-Zellen gemessen²⁸.
2. Beispiel 2: Material und Methoden zur Isolierung von genomischer DNA von HA-1-Allelen
Zellkultur und Isolierung von genomischer DNA:
Genomische DNA wurde mit dem High-Pure-Template Reinigungs-Kit von Boehringer Mannheim nach den Anweisungen des Herstellers aus tiefgefrorenen peripheren Blutlymphocyten (PBL) isoliert. EBV-transformierte LCLs-Zellen wurden in RPMI-1640 kultiviert, das 3 mM L-Glutamin und 10% FKS enthielt. Zur Isolierung der DNA wurden die Zellen geerntet, zweimal mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen, in 200 μl resuspendiert und bei –20°C bis zum Gebrauch gelagert. Für jede DNA-Isolierung wurden 2 × 10⁶ Zellen verwendet.
Genomische PCR:
Für jede PCR-Reaktion wurden 100-200 ng genomische DNA verwendet. Amplifikationen wurden mit 20 pMol von jedem Primer in 100 μl 10 mM Tris/HCl (pH-Wert 8,4)-Pufferlösung, die 50 mM KCl, 4 mM MgCl₂, 0,06 mg/ml BSA, 0,5 mM dNTPs und 2,5 Einheiten Taq-Polymerase (Roche Molecular Systems, Brancheburg, New Jersey) enthielt, durchgeführt. Alle Reaktionen begannen mit einem Denaturierungsschritt von 5 min bei 95°C. Die Zyklusbedingungen waren für alle Primer-Kombinationen 95°C über 1 min und 65°C über 1 min über zehn Zyklen. Es folgten 20 Zyklen bei 95°C über 1 min, 62°C über 1 min, 72°C über 1 min und eine Extension des letzten Schrittes über 5 min bei 72°C.
Isolierung von Cosmid-DNA:
Zur Isolierung von Cosmid-DNA in großem Umfang wurde 1 l LB-Medium (20 μg/ml Ampicillin) beimpft und über Nacht bei 37°C unter heftigem Schütteln (300 UpM) kultiviert. Die Cosmid-DNA wurde unter Verwendung des Isolierungsprotokolls für Plasmide mit geringer Anzahl an Kopien des Quiagen Plasmid Purification Kit nach den Anweisungen des Herstellers isoliert. Mit diesem Isolierungsverfahren wurden im Durchschnitt 500 μg gereinigte Cosmid-DNA gewonnen.
Sequenzierung von Cosmid-DNA:
Für jede Sequenzierungsreaktion wurden 10 μg Cosmid-DNA verwendet. Die Sequenzierungsreaktionen wurden mit dem T7-Sequenzierungs-Kit (Pharmacia Biotech) durchgeführt.
mHag HA-1 spezifische CTL:
EBV-transformierte LCLs wurden mit für HA-1 spezifischen CTLs getestet. Die Reaktivität wurde durch einen Chrom-Freisetzungstest bestimmt. Mit ⁵¹Cr markierte Zielzellen (3 × 10³) wurden zusammen mit Verdünnungsreihen aus Effektor-T-Zellen auf Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen mit rundem Boden (Costar 3799) inkubiert. Nach 4 Stunden bei 37°C wurden zellfreie Überstände zur Gamma-Zählung geerntet. Der Prozentsatz an spezifischer Lyse wurde wie nachstehend berechnet: 5 spezifische Lyse = (experimentelle Freisetzung – spontane Freisetzung) /(maximale Freisetzung – spontane Freisetzung) × 100%. Spontane Freisetzung und maximale Freisetzung sind die Chrom-Freisetzung von Zielzellen in Kulturmedium allein beziehungsweise in Kulturmedium, das 1% Triton-X 100 enthält.
3. Beispiel 3: Das HA-1-Peptid wird durch zwei Exons codiert
Zur Bestimmung der genomischen Struktur, die das HA-1-Peptid umgibt, wurde eine von menschlichen, männlichen PBLs stammende Cosmid-Bibliothek durchmustert. Das 312 Bp große cDNA-Fragment, das das HA-1-Peptid codiert, wurde als Sonde verwendet. Drei sich überschneidende Cosmide wurden isoliert. Das Cosmid pTCF-HA-1, das das R-Allel enthielt, wurde zum Teil sequenziert. Die Sequenzreaktion ergab eine Spleiß-Donor-Stelle vier Nucleotide hinter dem polymorphen HA-1-Codon gelegen. Eine Spleiß-Akzeptor-Stelle konnte vor dem zweiten Exon, das das HA-1-Peptid codiert, identifiziert werden (5). Daher wird die HA-1-Peptidsequenz durch zwei Exons codiert.
4. Beispiel 4: Allel-spezifische PCR mit genomischer DNA
Zur genomischen Allel-spezifischen Typisierung wurden zwei verschiedene Primer-Sätze entworfen. Beide Sätze umfassen einen allgemeinen Primer und einen entweder für das HA-1-H-Allel oder das -R-Allele spezifischen (Tabelle 1). Der allgemeine Primer aus Satz 1 stammt aus dem Exon, das die ersten vier Aminosäuren des HA-1-Peptides codiert. Die H/R-Primer umfassen Intron-Sequenzen, die Spleiß-Donor-Stelle und den für das Allel spezifischen Teil der Exonsequenz. Satz 2 besteht aus einem allgemeinen Primer, der von dem Intron stammt, das in pTCF-HA-1 identifiziert worden war, und vom Exon stammende Primer, die das H- und R-Allele abdecken. Amplifikation mit Primer-Satz 1 führte zu einem 190 Bp großen Fragment, Primer-Satz 2 ergab ein 331 Bp großes Fragment. Beide Primer-Sätze zeigten die erwarteten Längen der Fragmente und sind für die genomische Typisierung geeignet. Weil die Primer in der Weise ausgesucht wurden, dass sie die DNA unter identischen PCR-Bedingungen amplifizieren sollten, kann einen Kombination aus beiden Primer-Sätzen in der selben PCR-Reaktion verwendet werden. In diesem Fall wurde ein drittes Fragment mit einer Größe von 535 Bp beobachtet, welches auf die Amplifikation der DNA zwischen den beiden verschiedenen allgemeinen Primer zurückzuführen ist (Daten nicht dargestellt).
5. Beispiel 5: Familienstudien
Die Durchführbarkeit der genomischen Typisierung wurde an 24 Mitgliedern, die zu drei HLA-A*0201 positiven Familien gehörten, überprüft. Die Ergebnisse der DNA-Typisierung wurden mit der mHag HA-1-CTL-Typisierung verglichen (Tabelle 3) und zeigte eine exakte Übereinstimmung. 6 zeigt die Analyse der genomischen DNA des HA-1-Locus in einer repräsentativen Familie. Der Knochenmarkspender (06) und der Empfänger (02) waren HLA-identisch. Der Spender war für das R-Allel homozygot. Der Empfänger war heterozygot (H/R) und präsentierte daher das HA-1-Antigen an der Zelloberfläche. Diese Nichtübereinstimmung führte zu GvHD, daher reagierten die T-Zellen des Spenders gegen das mHag des Empfängers. In dieser Familie waren der Spender und der Empfänger HLA-identisch, aber sie wiesen eine Nichtübereinstimmung in der HA-1-Sequenz auf. Die selben Ungleichheiten für HA-1 konnten in Familie 2 beobachtet werden. Wieder war der Spender (07) homozygot für das R-Allel und der Patient (02) war heterozygot (H/R), was zu GvHD führte. Familie 3 repräsentiert die Trennung des Alleles HA-1 H über drei Generationen in einer gesunden Familie. Das H-Allel stammt vom Großvater (01) und wurde auf zwei Generationen vererbt. Die Großmutter (00) ist, obwohl HLA-A*0201-positiv, homozygot für das R-Allel. Ihre Kinder (03, 04 und 05) sind alle heterozygot für den HA-1-Locus. Das Kind 04 heiratete Individuum 34, welches HLA-A*0201-positiv, aber homozygot für das R-Allel ist. Von ihren Nachkommen erbte nur 84 das Allel HA-1 H vom Großvater. Die anderen Enkel (82, 83 und 85) sind homozygot für HA-1 R.
Tabelle 3 Zelluläre und genomische Typisierung für HA-1 in drei HLA-A*0201-positiven Familien
6. Beispiel 6: Typisierung der HA-1-Allele durch das LiPA-Verfahren
Das nachstehende Verfahren zur Typisierung der HA-1-Allele H und R in einer Probe basiert auf der LiPA-Technik (Stuyver et al., 1993). Für jede PCR-Reaktion werden 100-200 ng genomischer DNA verwendet. Amplifikationen werden mit 20 pMol von jedem Primer in 100 μl 10 mM Tris/HCl (pH-Wert 8,4) -Pufferlösung, die 50 mM KCl, 4 mM MgCl₂, 0,06 mg/ml BSA, 0,5 mM dNTPs und 2,5 Einheiten Taq-Polymerase (Roche Molecular Systems, Brancheburg, New Jersey) enthielt, durchgeführt. Alle Reaktionen beginnen mit einem Denaturierungsschritt von 5 min bei 95°C. Die Zyklusbedingungen sind für alle Primer-Kombinationen 95°C über 1 min und 65°C über 1 min über zehn Zyklen. Es folgen 20 Zyklen bei 95°C über 1 min, 62°C über 1 min, 72°C über 1 min und eine Extension des letzten Schrittes über 5 min bei 72°C. Die HA-1-Allele werden nachfolgend durch einen reversen Hybridisierungsschritt an Oligonucleotid-Sonden, die auf einem Nitrocellulosestreifen immobilisiert worden sind, typisiert. Sonden, die spezifisch mit dem R-Allel hybridisieren, sind zum Beispiel HA1-R1(1) (SEQ ID NO 11), HA1-R1(2) (SEQ ID NO 12) und HA1-R1(3) (SEQ ID NO 13). Sonden, die spezifisch mit dem H-Allel hybridisieren, sind zum Beispiel HA1-H1(1) (SEQ ID NO 14), HA1-H1(2) (SEQ ID NO 15) und HA1-H1(3) (SEQ ID NO 16). Die Hybridisierung wird in 5 × SSPE, 0,5% SDS bei 56°C über 30 min durchgeführt. Ein stringenter Waschschritt wird in 2 × SSPE, 0,1% SDS bei 56°C über 10 min durchgeführt.
Ein LiPA, der die spezifischen Sonden HA1-H1(1) (SEQ ID NO 14), HA1-R1(3) (SEQ ID NO 13) und eine Sonde zur Kontrolle der colorimetrischen Reaktion umfasst, wurde auf die Durchführbarkeit mit den 6 Proben der Familie 1 geprüft. Die durch LipA erhaltenen Ergebnisse bestätigten die Ergebnisse der genomischen Typisierung durch PCR und die CTL-Typisierung (Tabelle 4).
Tabelle 4 Vergleich der zellulären und genomischen Typisierung von HA-1 in Familie 1 durch PCR oder LiPA
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Claims

Verfahren zur Typisierung von Allelen des minoren Histokompatibilitätsantigens HA-1 in einer Probe, wobei das Verfahren den Nachweis von polymorphen Nucleotiden in der cDNA oder den genomischen Nucleinsäuren der Allele umfasst, dadurch gekennzeichnet, dass die polymorphen Nucleotide in einem Bereich des Allels nachgewiesen werden, der der Sequenz-Identifikationsnummer 17 oder 19 in dem Allel HA-1 R bzw. dem Allel HA-1 H entspricht.
Verfahren nach Anspruch 1, das weiterhin dadurch gekennzeichnet ist, dass die Allele des minoren Histokompatibilitätsantigens HA-1 das Allel H und das Allel R sind, die mit der Sequenz-Identifikationsnummer 17 und der Sequenz-Identifikationsnummer 19 bezeichnet sind.
Verfahren zur genomischen Typisierung nach den Ansprüchen 1 bis 2 mit den Schritten: a) in-Kontakt-Bringen der genomischen Polynucleinsäuren in der Probe mit mindestens einem Paar Primer, wodurch der 5'-Primer und/oder der 3'-Primer des mindestens einen Paars Primer spezifisch mit Zielbereichen hybridisieren können/kann, die polymorphe Nucleotide in den Allelen aufweisen, wobei die polymorphen Nucleotide in einem Bereich des Allels nachgewiesen werden, der der Sequenz-Identifikationsnummer 17 oder 19 in dem Allel HA-1 R bzw. dem Allel HA-1 H entspricht, und Durchführen einer Amplifikationsreaktion; b) für jedes des mindestens einen Paars Primer Nachweisen, ob im Schritt a) ein Amplifikationsprodukt gebildet wird oder nicht; und c) Schließen aus dem Ergebnis des Schritts b), welches HA-1-Allel in der Probe vorliegt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, das weiterhin dadurch gekennzeichnet ist, dass das mindestens eine Paar Primer einen 5'-Primer aufweist, der spezifisch mit einem Zielbereich hybridisieren kann, der die Nucleotide an der Position 4 oder an den Positionen 4 und 8 in dem HA-1-Allel aufweist, oder das mindestens eine Paar Primer einen 3'-Primer aufweist, der spezifisch mit einem Zielbereich hybridisieren kann, der die Nucleotide an der Position 8 oder an den Positionen 4 und 8 in dem HA-1-Allel aufweist, wobei die Position 1 die Position des ersten Nucleotids mit der Sequenz-Identifikationsnummer 17 oder 19 ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, das weiterhin dadurch gekennzeichnet ist, dass die Primer aus der Gruppe Sequenz-Identifikationsnummer 2, Sequenz- Identifikationsnummer 3, Sequenz-Identifikationsnummer 4, Sequenz-Identifikationsnummer 5, Sequenz-Identifikationsnummer 6 und Sequenz-Identifikationsnummer 7 gewählt werden.
Verfahren zur genomischen Typisierung nach Anspruch 1 oder 2 mit den Schritten: a) Amplifizieren eines Fragments der Allele, das mindestens ein polymorphes Nucleotid aufweist, wobei die polymorphen Nucleotide in einem Bereich des Allels nachgewiesen werden, der der Sequenz-Identifikationsnummer 17 oder 19 in dem Allel HA-1 R bzw. dem Allel HA-1 H entspricht, durch Verwenden mindestens eines Paars Primer, die spezifisch mit Zielbereichen in den Allelen ohne polymorphe Nucleotide hybridisieren; b) Hybridisieren des amplifizierten Produkts der Schritts a) mit mindestens einer DNA-Probe, die spezifisch mit einem Zielbereich hybridisiert, der ein oder mehrere polymorphe Nucleotide in dem Allel aufweist; und c) Schließen aus dem Ergebnis des Schritts b), welches HA-1-Allel in der Probe vorliegt.
Verfahren nach Anspruch 6, das weiterhin dadurch gekennzeichnet ist, dass das mindestens eine Paar Primer einen 5'-Primer, der spezifisch mit einem Zielbereich ohne polymorphe Nucleotide in einem Bereich hybridisieren kann, der der Sequenz GTGTTGCGTGACG des HA-1-Allels entspricht, und/oder einen 3'-Primer, der spezifisch mit einem Zielbereich ohne polymorphe Nucleotide in einem Bereich hybridisieren kann, der der Sequenz-Identifikationsnummer 1 des HA-1-Allels entspricht, aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 6 oder 7, das weiterhin dadurch gekennzeichnet ist, dass die mindestens eine DNA-Probe spezifisch mit einem Zielbereich hybridisiert, der die Nucleotide an der Position 4 und/oder 8 in dem HA-1-Allel aufweist, wobei die Position 1 die Position des ersten Nucleotids mit der Sequenz-Identifikationsnummer 17 oder 19 ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 8, das weiterhin dadurch gekennzeichnet ist, dass die Primer aus der Gruppe Sequenz-Identifikationsnummer 2, Sequenz-Identifikationsnummer 8, Sequenz-Identifikationsnummer 9 und Sequenz-Identifikationsnummer 10 gewählt werden und/oder die DNA-Proben aus der Gruppe Sequenz-Identifikationsnummer 11, Sequenz-Identifikationsnummer 12, Sequenz-Identifikationsnummer 13, Sequenz-Identifikationsnummer 14, Sequenz-Identifikationsnummer 15 und Sequenz-Identifikationsnummer 16 gewählt werden.
Primer zur Verwendung in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9 zur genomischen Typisierung von Allelen des minoren Histokompatibilitätsantigens HA-1, der mindestens 80% Sequenzhomologie mit der Sequenz-Identifikationsnummer 17 oder Sequenz-Identifikationsnummer 19 zeigt.
DNA-Probe zur Verwendung in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 9 zur genomischen Typisierung von Allelen des minoren Histokompatibilitätsantigens HA-1, die mindestens 80% Sequenzhomologie mit der Sequenz-Identifikationsnummer 17 oder Sequenz-Identifikationsnummer 19 zeigt.
Isolierte Polynucleinsäure, die mit der Sequenz-Identifkationsnumtner 17 oder Sequenz-Identifikationsnummer 19 bezeichnet ist, oder isolierte Polynucleinsäure, die mindestens 80% Sequenzhomologie mit den Polynucleinsäuren zeigt.
Verfahren zur genomischen Typisierung von Allelen des minoren Histokompatibilitätsantigens HA-1 nach Anspruch 1 oder 2 durch Sequenzieren des Allels.
Diagnose-Satz zur Typisierung von Allelen des minoren Histokornpatibilitätsantigens HA-1 nach einem der Ansprüche 3 bis 6, der Folgendes aufweist: a) mindestens einen Primer, der spezifisch mit Zielbereichen hybridisieren kann, die polymorphe Nucleotide in den Allelen aufweisen, wobei die polymorphen Nucleotide in einem Bereich des Allels nachgewiesen werden, der der Sequenz-Identifikationsnummer 17 oder 19 in dem Allel HA-1 R bzw. dem Allel HA-1 H entspricht; b) wahlweise ein Enzym und/oder Reagenzien, das/die die Amplifikationsreaktion ermöglicht/ermöglichen; und c) wahlweise Mittel, die den Nachweis der amplifizierten Produkte ermöglichen.
Diagnose-Satz zur genomischen Typisierung von Allelen des minoren Histokampatibilitätsantigens HA-1 nach einem der Ansprüche 6 bis 9, der Folgendes aufweist: a) mindestens einen Primer, der spezifisch mit Zielbereichen ohne polymorphe Nucleotide in den Allelen hybridisiert; b) mindestens eine DNA-Probe, die spezifisch mit einem Zielbereich hybridisiert, der ein oder mehrere polymorphe Nucleotide in den Allelen aufweist, wobei die polymorphen Nucleotide in einem Bereich des Allels nachgewiesen werden, der der Sequenz-Identifikationsnummer 17 oder 19 in dem Allel HA-1 R oder dem Allel HA-1 H entspricht; und c) wahlweise ein Enzym und/oder Reagenzien, das/die die Amplifikationsreaktion ermöglicht/ermöglichen, und/oder Reagenzien, die die Hybridisierungsreaktion ermöglichen.
Diagnose-Satz zur genomischen Typisierung von Allelen des minoren Histokompatibilitätsantigens HA-1 nach Anspruch 13, der Folgendes aufweist: a) mindestens einen Primer, der spezifisch mit Zielbereichen ohne polymorphe Nucleotide in den Allelen hybridisieren kann; b) mindestens einen Primer, der spezifisch mit einem Zielbereich hybridisieren kann, der ein oder mehrere polymorphe Nucleotide in den Allelen aufweist, wobei die polymorphen Nucleotide in einem Bereich des Allels nachgewiesen werden, der der Sequenz-Identifikationsnummer 17 oder 19 in dem Allel HA-1 R oder dem Allel HA-1 H entspricht; und c) wahlweise ein Enzym und/oder Reagenzien, das/die die Amplifikationsreaktion ermöglicht/ermöglichen, und/oder Reagenzien, die die Sequenzierungsreaktion ermöglichen.
Verfahren zur Typisierung von HA-1-Allelen, das die Verwendung von Antikörpern umfasst, die die mit der Sequenz-Identifikationsnummer 18 und der Sequenz-Identifkationsnummer 20 bezeichneten HA-1-Allele spezifisch nachweisen.
Diagnose-Satz zur Typisierung von HA-1-Allelen, der Antikörper aufweist, die die mit der Sequenz-Identifikationsnummer 18 und der Sequenz-Identifikationsnummer, 20 bezeichneten HA-1-Allele spezifisch nachweisen.