DE68928069T2 - Anti-T-Zell Rezeptordeterminanten zur Behandlung von Autoimmunkrankheiten - Google Patents

Description

• Die vorliegende Erfindung betrifft die Diagnose und Behandlung von Autoimmunerkrankungen.
• Autoimmunerkrankungen sind ein Ergebnis eines Versagens des Immunsystems, eine Selbsterkennung zu vermeiden. Der Angriff von Wirtszellen durch das Immunsystem kann zu einer großen Anzahl von Erkrankungen führen, einschließlich neuraler Krankheiten, wie multipler Sklerose und Myasthenia gravis, Krankheiten der Gelenke, wie rheumatoider Arthritis, Angriffen auf Nukleinsäuren, wie sie bei systemischem Lupus erythematosus beobachtet werden, und anderen Krankheiten, die mit verschiedenen Organen assoziiert sind, wie Psoriasis, juvenilem Diabetes, Sjögren- Syndrom, Thyreoiditis. Diese Erkrankungen können eine Vielzahl von Symptomen aufweisen, die von geringfügig und irritierend bis zu lebensbedrohlich variieren können.
• In den letzten 10 Jahren wurden zunehmende Anstrengungen unternommen, die verschiedenen Prozesse des Immunsystems zu verstehen und wie das Immunsystem moduliert werden kann, um das natürliche System zum Schutz des Wirtes gegen Pathogene zu verbessern. Die MM Komplexität des Immunsystems ist eine entmutigende Barriere für dessen Aufklärung gewesen. Die vielen verschiedenen Zelltypen, ihre unterschiedlichen Rollen, die Natur ihrer Wechselwirkungen, die an ihren Wechselwirkungen beteiligten Moleküle und die Art, auf die die verschiedenen Moleküle aktiviert werden, um ihre Rollen zu erfüllen, tragen sämtlich zu der Komplexität und den Schwierigkeiten bei der Gestaltung experimenteller Verfahren bei. Bei dem Versuch, die Mechanismen zu verstehen, die an der immunologischen Antwort beteiligt sind, bestehl ein substantielles Interesse, zu verstehen, auf welche Weise das System degeneriert, um sich selbst anzugreifen. Indem die Beziehungen zwischen dem Immunsystem und dem Unterscheiden zwischen selbst und nicht-selbst verstanden werden, kann es Wege geben, um den Wirt vor Autoimmunerkrankungen zu schützen oder solche Individuen zu diagnostizieren, die für Autoimmunerkrankungen anfällig sein könnten, und für die es Wege geben könnte, um ein gewisses Ausmaß an Schutz bereitzustellen.
• Berichte betreffend die Behandlung einer Vielzahl von Autoimmunerkrankungen, insbesondere mit Antikörpern, umfassen Steinman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1981) 78:7111-7114; Zamvil et al., J. Exp. Med. (1985) 162:2107-2124; Waldor et al., Science (1985) 227:415-417; Zamvil et al., Nature (1985) 317:355-358, Steinman et al., Ann. NY Acad. Sci (1986) 475:274- 284; Zamvil et al., Nature (1986) 324:258-260; Steinman, "Treatment of Autoimmune Disease with Monoclonal Antibodies" In New Horizons in Animal Models for Autoimmune Disease, Academic Press, 1987, S. 277-288; Vladutiu und Steinman, Cell Immunol. (1987) 109:169-180.
• Beziehungen zwischen variablen Regionen von T-Zell-Rezeptoren und andere charakteristische Eigenschaften sind in Winoto et al., Nature, (1986) 324:679-682; Kappler et al., Cell (1987) 49:263-271; und Sinha et al., Science (1988) 239:1026-1029 beschrieben.
• Sequenzen von verschiedenen T-Zell-Rezeptor-Untereinheiten können gefunden werden in Yoshikai et al., J. Exp. Med. (1986) 164:90-103; Arden et al., Nature (1985) 316:783-787; Kimura et al., J. Exp. Med. (1986) 164:739; und Lai et al., Nature (1988) 331:543-546.
• Siehe auch U.S.-Patent Nr. 4 695 459, erteilt am 22. September 1987, das die Behandlung von Autoimmunerkrankungen unter Verwendung von anti-Leu3-Antikörpern beschreibt.
• WO-A-86/06413 betrifft ein Reagens, das an T-Zellen binden kann und eine Spezifität für eine einmalige Sequenz innerhalb der variablen Region der β-Kette des T-Zell-Rezeptors aufweist, wobei das Vorliegen einer erhöhten Anzahl von T-Zellen, die die einmalige Sequenz tragen, bezogen auf die bei einem normalen Individuum vorliegende Anzahl von T-Zellen, die die Sequenz tragen, mit einer speziellen Erkrankung assoziiert ist.
• Die Erfindung stellt ein Verfahren zum Nachweisen der Anfälligkeit eines Menschen für eine Autoimmunerkrankung bereit, wobei das Verfahren umfaßt, die Gegenwart eines Locus im Genom eines Menschen nachzuweisen, der mindestens einen Teil der variablen Region eines T-Zell-Rezeptors kodiert, die mit dem Auftreten der Autoimmunerkrankung assoziiert ist.
• Die Erfindung stellt auch ein Peptid bereit, welches eine Aminosäuresequenz umfaßt, die von einem Locus für eine variable Region eines T-Zell-Rezeptors kodiert wird, die mit dem Auftreten einer Autoimmunerkrankung assoziiert ist.
• Die Erfindung stellt ferner eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Hemmung von durch Lymphozyten vermittelten Angriffen auf humane syngene Zellen, die mit einer Autoimmunerkrankung assoziiert sind, bereit, enthaltend einen monoklonalen Antikörper mit Spezifität, für eine Aminosäuresequenz, die von einem Locus für eine variable Region eines T-Zell-Rezeptors kodiert wird, die mit der Autoimmunerkrankung assoziiert ist, vermischt mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger, und stellt auch eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Hemmung von Angriffen von Lymphozyten auf humane syngene Zellen, die mit einer Autoimmunerkrankung assoziiert sind, bereit, enthaltend ein Peptid der Erfindung vermischt mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger.
• Die Erfindung stellt ferner einen monoklonalen Antikörper mit Spezifität für eine Aminosäuresequenz, die von einem Locus für eine variable Region eines T-Zell-Rezeptors kodiert wird, die mit einer Autoimmunerkrankung assoziiert ist, zur Verwendung als ein Arzneimittel bereit, und stellt auch die Verwendung eines monoklonalen Antikörpers mit Spezifität für eine Aminosäuresequenz, die von einem Locus für eine variable Region eines T- Zell-Rezeptors kodiert wird, die mit einer Autoimmunerkrankung assoziiert ist, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer Autoimmunerkrankung bereit.
• Die Erfindung stellt auch ein Peptid der Erfindung für eine Verwendung als Arzneimittel bereit und stellt ferner die Verwendung eines Peptids der Erfindung zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer Autoimmunerkrankung bereit.
• Es ist jetzt gefunden worden, daß eine Beziehung zwischen dem Vorliegen von einem oder mehreren Loci der variablen Region eines T-Zell-Rezeptors und der Anfälligkeit für Autoimmunerkrankungen besteht. Darüber hinaus kann bei jenen Wirten, die die T- Zell-Rezeptoren, die das Expressionsprodukt derartiger Loci umfassen, exprimieren, ein Verhindern der Bindung derartiger T- Zellen an die Zielzellen prophylaktischen und/oder therapeutischen Nutzen bringen.
• Der T-Zell-Rezeptor hat zwei an der Bindung beteiligte Untereinheiten, entweder α und β oder γ und δ. Die mit den Untereinheiten assoziierten variablen Regionen weisen eine ähnliche Organisation auf wie jene der Immunglobuline, wobei die β- und γ-Untereinheiten eine variable Region aufweisen, die Exonen umfaßt, die mit den V-, D- und J-Regionen assoziiert sind, wohingegen die α- und δ-Untereinheiten Exons umfassen, die die V- und J- Regionen kodieren. Durch Umlagerung von Keimbahn-DNA werden die Exonen mit der konstanten oder konservierten Region verknüpft und durch nachfolgendes Spleißen der Messenger-RNA wird ein offenes Leseraster erzielt, das die Untereinheit kodiert. Abhängig von dem jeweiligen genetischen Erbgut des Wirts werden sich die Loci der variablen Region des Individiums unterscheiden. Durch Bestimmen dieser mit einer bestimmten Autoimmunerkrankung assoziierten Loci kann pränatal oder zu jedem beliebigen Zeitpunkt danach eine Anfälligkeit für die bestimmte Autoimmunerkrankung diagnostiziert und zu jedem Zeitpunkt vor oder während des Auftretens von Symptomen der Erkrankung der Wirt auf eine Weise behandelt werden, die den Angriff durch die T-Zellen, die die bestimmte variable Region tragen, gegen die Zielzellen hemmt. Die T-Zell-Rezeptoren binden abhängig von der Natur der T-Zelle an Haupthistokompatibilitäts-Klasse I- oder -Klasse II- Antigene. CD4 ist mit Klasse II-MHC assoziiert.
• Die Autoimmunerkrankungen von bedeutender Verbreitung umfassen multiple Sklerose, die mit einer Zerstörung von Myelin und Gliazellen verbunden ist, rheumatoide Arthritis, die mit Gelenkschädigungen verbunden ist, systemischen Lupus erythematosus (SLE), der mit einer Ablagerung von Autoantikörpern und Immunkomplexen verbunden ist, Psoriasis, Pemphigus vulgaris, juvenilen Diabetes, der mit einer Zerstörung von β-Zellen in den Langerhans'- Inseln verbunden ist, Sjögren-Syndrom, Thyreoiditis, Hashimoto's-Thyreoiditis und Myasthenia gravis, obwohl es noch viele andere gibt.
• Die mit einer Anfälligkeit für die Erkrankung assoziierten variablen Loci können auf mehreren unterschiedlichen Wegen identifiziert werden. Ein weg besteht, wenn ein Tiermodell existiert. In dieser Situation kann in vitro der spezielle Locus, der auch in dem Tiermodell vorhanden ist, das auf das Vorliegen eines Ziel-Proteinfragments auf einer Antigen-präsentierenden Zelle anspricht, wo die T-Zellen korrekt durch den Klasse II-MHC der Antigen-präsentierenden Zellen restringiert sind, identifiziert werden. Der Nachweis einer Expression des mit der Anfälligkeit für eine Erkrankung assoziierten, in beiden Fällen vorliegenden Locus der variablen Region kann erfolgen, indem man über monoklonale Antikörper mit Spezifität für das durch den Locus exprimierte Peptid verfügt. Alternativ könnten Southern-Blots ausgeführt werden, um das Vorliegen des Locus in dem Genom zu zeigen, oder Northern-Blots, um die Transkription des Locus zu zeigen. Auf diese Weise kann man rasch die gemeinsamen Loci der variablen Region(en) der Untereinheit(en), die bei der Erkrankung üblicherweise angetroffen werden, definieren.
• Es ist keine 100%ige Korrelation zu erwarten und diese wird normalerweise auch nicht erreicht. Es ist üblicherweise zufriedenstellend, daß bei mindestens 60 %, vorzugsweise bei mindestens 70 % der hinsichtlich der Krankheit positiven Individuen der Locus vorliegt. In ähnlicher Weise liegt bei weniger als etwa 50 %, vorzugsweise bei weniger als 30 % der Individuen, die die Symptome der Erkrankung nicht zeigen, der Locus vor. Diese Prozentsätze sollten auf Grundlage einer statistisch signifikanten Anzahl von Individuen bestimmt werden.
• Die gegenwärtig Tiermodellen zugänglichen Krankheiten umfassen multiple Sklerose, die eine Analogie zu experimenteller allergischer Enzephalitis bei Mäusen zeigt, Hashimoto's-Thyreoiditis, die eine Analogie zu experimenteller Autoimmun-Thyreoiditis bei Mäusen zeigt, systemischen Lupus erythematosus, der eine Analogie zu NZR/W-Mäusen zeigt, Myasthenia gravis, die eine Analogie zu experimenteller Myasthenia gravis bei Mäusen zeigt, juvenilen Diabetes, der eine Analogie zu der NOD-Maus und der BB-Ratte zeigt.
• Wenn ein Tier nicht verfügbar ist und ein Interesse an Primaten, insbesondere an Menschen besteht, können eine Anzahl verschiedener Techniken eingesetzt werden, um die Loci von Interesse zu identifizieren. Lymphozyten können aus einem Spender, der die Autoimmunerkrankung hat, isoliert werden. Makrophagen können isoliert werden, um als Antigen-präsentierende Zellen zu dienen, die zu den T-Zellen des Spenders autolog sind. Geringe Anzahlen von T-Zellen, im allgemeinen weniger als 10&sup5; vorzugsweise weniger als 10³, können vermehrt und mit den Makrophagen und dem mit der Autoimmunantwort assoziierten Antigen verwendet werden, um T-Zellen zu identifizieren, die durch die Gegenwart des Antigens und Antigen-präsentierender Zellen aktiviert werden. cDNA kann aus der Messenger-RNA der Zellen hergestellt werden bei Gruppen von Zellen, die eine Aktivierung zeigen, wie durch Sekretion von Interleukin-2, Vermehrung von Zellen oder andere Hinweismerkmale angezeigt wird. Die resultierende cDNA kann dann von der gleichen Zellpopulation, die keiner Aktivierung unterworfen worden ist, subtrahiert werden, so daß die restliche cDNA mit einer Vermehrung einer Bildung von Zellen, die den T-Zell-Rezeptor von Interesse aufweisen, wie auch mit einer erhöhten Expression des T-Zell-Rezeptors von Interesse korreliert werden kann. Die DNA kann identifiziert werden, indem eine Sonde für die konservierte Region eingesetzt wird, und die variable Region kann sequenziert werden. Die Sequenz der variablen Region kann dann verwendet werden, um den genomischen Locus zu identifizieren, wenn ein solcher Locus nicht vorab sequenziert und veröffentlicht worden ist.
• Alternativ können B-Zellen als Lymphozyten aus peripherem Blut des Wirtes, die an das mit der bestimmten Autoimmunerkrankung assoziierte Ziel-Antigen binden, durch Panning, Affinitätschromatographie, magnetische Auftrennung oder ähnliches identifiziert werden, wobei das Antigen als Ligand zur Identifizierung von Oberflächen-Immunglobulin, das an das Antigen bindet, verwendet wird. Die B-Zellen können dann an der Oberfläche immobilisiert und für eine Affinitätsauftrennung von T-Zellen verwendet werden, die das Fragment des Antigens in Zusammenhang mit einem MHC, hinsichtlich dessen die T-Zellen restringiert sind, erkennen. Die resultierende T-Zellpopulation, die hinsichtlich mit der Erkrankung assoziierter T-Zellen angereichert ist, kann dann wiederholt unter Einsatz eines ähnlichen Verfahrens angereichert werden. Die an T-Zellen angereicherte Population kann jetzt weiter durch Einsatz von Antigen-präsentierenden Zellen ohne Affinitätsauftrennung angereichert werden, um eine Vermehrung der T-Zell-Zielpopulation zu erreichen. Die resultierende Zellpopulation kann dann als Immunogen zur Herstellung monoklonaler Antikörper verwendet werden. Die monoklonalen Antikörper können mit T-Zellen aus Wirten, die die Autoimmunerkrankung haben, zur Identifizierung gemeinsamer antigener Stellen gescreent werden. Die Zellen mit gemeinsamen antigenen Stellen können auf die jeweiligen Exonen gescreent werden, die mit den variablen Regionen der verschiedenen Wirte assoziiert sind, um gemeinsame Loci für eine Diagnose der Erkrankung zu identifizieren, und die an der Expression von T-Zell-Rezeptor beteiligt sind, der an der Ätiologie der Erkrankung beteiligt ist.
• T-Zellen können auch im Falle von Autoimmun-Hirnerkrankungen, wie multipler Sklerose, angereichert werden, indem T-Zellen mit mit γ-Interferon gepulsten Astrozyten, mit oder ohne Myelin, inkubiert werden. Die Astrozyten präsentieren den T-Zellen Myelinfragmente über MHC. Astrozyten exprimieren konstitutiv keine MHC-Klasse II-Moleküle, können jedoch mit γ-Interferon hierzu induziert werden.
• Diese Techniken sind wohl etabliert und können leicht wiederholt werden, um eine Identifizierung der mit einer bestimmten Autoimmunerkrankung assoziierten relevanten Exonen zu ermöglichen. Bezüglich der Verfügbarkeit eines Tiermodells sind die DNA-Sequenz-Homologien der Familien der variablen Region von Maus und Mensch korreliert worden, so daß eine Identifizierung der variablen Region aus der Maus direkt den humanen Locus identifiziert.
• Eine Selektion des Genprodukts einer bestimmten variablen Region eines T-Zell-Rezeptors kann auf einer Vielzahl von Wegen erreicht werden; abhängig von der Natur der Erkrankung können verschiedene Protokolle oder Strategien eingesetzt werden.
• Für Erkrankungen, wie Myasthenia gravis, wo das spezifische Auto-Antigen, das das Ziel der autoreaktiven T-Zellen ist, bekannt ist, bei Myasthenia gravis der Acetylcholin-Rezeptor, können T-Zellen mit Spezifität für das die Erkrankung induzierende Autoantigen gezüchtet werden. Für Myasthenia gravis werden T- Zellen mit Spezifität für den Acetylcholin-Rezeptor gezüchtet, indem der Vorgehensweise zum Vermehren Autoantigen-spezifischer T-Zellklone gefolgt wird, wie sie bereits früher beschrieben wurde (Zamvil et al., Nature (1985) 317:355-358; und Zamvil et al., Nature (1986) 324:258-260). Lymphozyten aus peripherem Blut (PBL) werden aus Voliblut von myasthenischen Patienten isoliert. Assays werden bei einer relativ niedrigen Konzentration von Zellen, im allgemeinen weniger als 10&sup6;, vorzugsweise weniger als etwa 5×10&sup5;, in einem geeigneten Medium, z.B. RPMI, supplementiert mit 10 % autologem Serum, ausgeführt. Zellen können dann mit Acetylcholin-Rezeptor aus Säugetier oder bekanntermaßen T-Zellen von myasthenischen Patienten stimulierenden spezifischen Peptiden stimuliert werden: dementsprechend sprechen myasthenische Patienten, die HLA-DR3, DQw2 sind, auf das Acetylcholin-Rezeptor-Peptid p257-261 (L-L-V-I-V-E-L-I-P-S-T-S-S) an, wohingegen myasthenische Patienten, die HLA-DR5, DQw3 sind, auf p195-212 (D-T-P-Y-L-D-I-I-Y-H-F-V-M-Q-R-L-P-L) ansprechen.
• Geigneterweise beträgt die Dosierung etwa 5-20 µg/ml des Peptids, um Kulturen zu stimulieren, die anfänglich für etwa 5 Tage, vorzugsweise etwa 6 Tage oder mehr verabreicht werden. Lebensfähige Zellen werden gesammelt und etwa 5×10&sup5; lebensfähige Zellen mit 3×10&sup7; autologen Antigen-präsentierenden Zellen (mit etwa 3300 Rad bestrahlt) und etwa 20 µg/ml Acetylcholin-Rezeptor für ein spezifisches Peptid stimuliert. Etwa 12 Tage später werden lebensfähige Zellen gesammelt, z.B. auf einem Ficoll-Gradienten, und durch limitierende Verdünnung ("limiting dilution") zu etwa 0,3 Zellen/Vertiefung in Gegenwart von etwa 5×10&sup5; Antigen-präsentierenden Zellen und humanem Interleukin-2 kloniert. Zellen aus einzelnen Vertiefungen werden vermehrt und in Gewebekulturflaschen gezüchtet.
• Die Genverwendung hinsichtlich der variablen Region des T-Zell- Rezeptors kann dann durch Sequenzieren der mRNA oder cDNA unter Einsatz der Polymerasekettenreaktion und von Oligonukleotiden als Primern, die den Leader-V- und V-J- oder V-D-Junktionen entsprechen, abhängig davon, ob die α- oder β-Untereinheit beteiligt ist, bestimmt werden. Die Polymerasekettenreaktion wird ausführlich in Sinha et al., Science (1988) 239:1026 und Saiki et al., Nature (1986) 324:163 beschrieben. Durch Vergleichen der identifizierten V-Region mit Zellen von anderen Opfern der Krankheit kann festgestellt werden, daß eine bestimmte Sequenz mit der Krankheit identifiziert werden könnte.
• Für jene Erkrankungen, bei denen ein spezifisches Autoantigen nicht identifiziert worden ist oder eine alternative Route gewünscht wird, kann auf Oligoklonalität von T-Zellen in einem begrenzten anatomischen Kompartiment, das für die Erkrankung charakteristisch ist, zurückgegriffen werden, beispielsweise Synovialis bei rheumatoider Arthritis (Stamenkovic et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85:1179-1183) oder die Cerebrospinalflüssigkeit bei multipler Sklerose (Hafler et al., Neurology (1987) 36:314). T-Zellen werden aus dem Kompartiment isoliert und das Gen für die V-Region des T-Zell-Rezeptors durch die Polymerasekettenreaktion amplifiziert und unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Primer-Oligonukleotide sequenziert. Wieder können die resultierenden Sequenzen mit anderen Patienten, Opfern der jeweiligen Erkrankungen, verglichen werden, um die Allgemeingültigkeit der Sequenz für eine Diagnose der Erkrankung zu zeigen.
• Für Krankheiten, wie Morbus Basedow, wo das Zielorgan außer durch einen chirurgischen Eingriff nicht zugänglich ist, kann der Zusammenhang zwischen dem Gen für die T-Zell-Rezeptor-V-Region in der Keimbahn und der Anfälligkeit für die Krankheit wie folgt ermittelt werden. Durch Einsatz von Sonden für den T-Zell- Rezeptor und Southern-Hybridisierung kann ein T-Zell-Rezeptor- Polymorphismus bei Patienten mit der Krankheit im Gegensatz zu normalen Patienten identifiziert werden. Wenn derartige Polymorphismen in signifikanter Weise mit der Krankheit assoziiert 30 sind (p &le; 0,03 bei X²-Analyse), kann das jeweilige V-Region- Genprodukt, das mit der T-Zell-Rezeptorsonde assoziiert ist, als Ziel für einen therapeutischen Eingriff verwendet werden. Dieser Analysentyp hat einen spezifischen T-Zell-Rezeptor-Polymorphismus bei 90 % (9/10) Patienten mit Morbus Basedow im Vergleich zu 39/70 gesunden Personen (p < 0,001), bei 23/28 Patienten mit multipler Sklerose im Vergleich zu 21/70 Kontrollpersonen (p < 0,01) und bei 14/17 Patienten mit Myasthenia gravis im Vergleich zu 21/70 Kontrollpersonen (p < 0,01) gezeigt.
• Die vorliegende Analyse kann als solche oder in Verbindung mit mit MHC-Beziehungen assoziierten Analysen verwendet werden. Eine große Menge an Literatur ist erarbeitet worden, um zu zeigen, daß viele Autoimmunerkrankungen mit einem speziellen Histokompatibilitätsantigen-Profil assoziiert sind. Wenn man sowohl die Assoziation mit dem T-Zell-Rezeptor als auch die jeweilige HLA- oder MHC-Restriktion kennt, können sowohl die Anfälligkeit für die Autoimmunerkrankung als auch das Vorliegen von T-Zellen, die bei der Ätiologie der Erkrankung wirksam werden, nachgewiesen werden.
• Für eine Diagnose kann entweder die Nukleinsäure oder das Antigen nachgewiesen werden. Für Nukleinsäuren können Zellen durch jedes geeignete Mittel isoliert und durch Einsetzen geeigneter Sonden und Verwendung von Techniken, wie Southern-Transfer, Dot- Blots oder ähnlichem das Vorliegen des bestimmten Gens für die V-Region nachgewiesen werden. Dementsprechend kann leicht bestimmt werden, ob eine Anfälligkeit für die Autoimmunerkrankung vorliegt. Abhängig von der Natur der Erkrankung kann eine Gelegenheit für einen prophylaktischen Eingriff bestehen, um die Wahrscheinlichkeit für ein Auftreten der Erkrankung zu verringern. Alternativ kann gewünscht werden, die Anzahl von Zellen zu bestimmen, die den T-Zell-Rezeptor exprimieren. Dies kann auf einem von zwei Wegen erreicht werden. Die Messenger-RNA kann aus T-Zellen isoliert und mit einer geeigneten Sonde für die V-Genregion hybridisiert werden. Durch Einsatz von Northern-Techniken kann das Vorliegen der Messenger-RNA, die den T-Zell-Rezeptor kodiert, nachgewiesen und ein qualitativer Wert hinsichtlich der Menge an exprimiertem T-Zell-Rezeptor, der das Gen für die bestimmte V-Region enthält, erhalten werden.
• Für eine Diagnose kann Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (RFLP) Anwendung finden. Eine Keimbahn-Umlagerung des diagnostischen Locus wird ein mit einer Sonde für einen derartigen Locus hybridisierendes Fragment mit gegenüber Keimbahn-DNA ohne Umlagerung unterschiedlicher Größe liefern. Auf diese Weise kann ein Kit, der eine Zusammenstellung von Sonden für die für eine Autoimmunerkrankung charakteristischen Loci umfaßt, für einen Nachweis von nach ihrer Größe aufgetrennten genomischen Fragmenten, die mit einem oder zwei Restriktionsenzym(en) verdaut worden sind, eingesetzt werden. Die Sonden können mit radioaktiven Markierungen, z.B. ³²P, Biotin, fluoreszierenden Stoffen oder ähnlichem für einen Nachweis markiert werden.
• Noch geeigneter können Antikörper eingesetzt werden, die mit einer Spezifität für die V-Region eines T-Zell-Rezeptors von Interesse erzeugt werden können. Antikörper können gegen die &alpha;-V- Region und/oder die &beta;-V-Region erzeugt werden und können in einigen Fällen gegen &delta;- oder &gamma;-V-Regionen hergestellt werden. Der entscheidende Faktor ist, daß eine Korrelation zwischen dem Vorliegen einer bestimmten V-Region und einer Anfälligkeit für oder dem Vorliegen einer bestimmten Autoimmunerkrankung gezeigt werden kann.
• Die Antikörper können gemäß herkömmlichen Verfahren hergestellt werden, indem insbesondere die monoklonalen Antikörper-Techniken eingesetzt werden, wie sie ursprünglich von Kohler und Milstein beschrieben und die für eine Produktion von monoklonalen Antikörpern umfassend verbessert worden sind. Siehe beispielsweise die U.S.-Patente Nr. 4 690 893, 4 713 325, 4 714 681, 4 716 111, 4 716 117 und 4 720 459.
• Für eine Diagnose kann eine beliebige mehrerer geeigneter Techniken, die Antikörper einsetzen, eingesetzt werden. Zahlreiche Patente wie auch Veröffentlichungen haben eine Anzahl von Techniken unter Verwendung einer großen Vielzahl von Markierungen für einen Nachweis beschrieben. Die Markierungen umfassen Teilchen, Enzyme, chromophore, Fluorophore, chemolumineszierende Stoffe und ähnliches. Die jeweilige Markierung oder Technik, die eingesetzt wird, ist für diese Erfindung nicht entscheidend, jede geeignete Technik kann eingesetzt werden. Die Techniken können entweder kompetitive oder nicht-kompetitive Methodiken einsetzen, einschließlich Sandwich-Methodiken, bei denen ein Antikörper an die konstante Region des T-Zell-Rezeptors oder eine andere konservierte Region bindet, wohingegen der andere Antikörper für die V-Region von Interesse spezifisch ist. Die Zellen werden üblicherweise gemäß herkömmlichen Verfahren lysiert, um membranfeie Proteine bereitzustellen. Zelluläre Rückstände können entfernt und das Protein extrahiert und gewonnen werden. Alternativ können intakte Zellen eingesetzt und durch Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung oder ähnliches, bei dem die T-Zell-Population quantitativ bestimmt werden kann, nachgewiesen werden.
• Für therapeutische Zwecke kann ein Interesse daran bestehen, humane Antikörper zu verwenden. Normalerweise wird es nicht erlaubt sein, einen Menschen mit dem T-Zell-Rezeptor oder einem Fragment davon zu immunisieren, um für die Sequenz von Interesse spezifische B-Zellen zu aktivieren. Jedoch gibt es Alternativen, indem Mäuse oder andere niedere Säugetiere immunisiert, die Gene, die die variablen Regionen der für die T-Zell-Region von Interesse spezifischen Antikörper kodieren, isoliert und durch Verknüpfen mit einer geeigneten humanen konstanten Region manipuliert werden können. Mit dem resultierenden chimären Konstrukt, das eine variable Region von der Maus und eine humane konstante Region umfaßt, kann dann ein Mikroorganismus oder eine Säugetier-Wirtszelle in Kultur, insbesondere ein Lymphozyt, transformiert werden und die hybriden Antikörper können exprimiert werden. Von besonderem Interesse wären konstante IgG-Regionen. Siehe beispielsweise EPA 85.305604.2 (EP-A-0 173 494).
• In einigen Fällen kann es zufriedenstellend sein, Antikörper aus der Maus zu verwenden, wenn eine Toleranz erzielt werden kann oder ein gewisses Ausmaß an Immunsuppression involviert sein kann. Eine Immunsuppression kann durch Cyclosporin, Bestrahlung, anti-Leu3 (anti-CD4) (U.S.-Patent Nr. 4 681 760) oder ähnliches erzielt werden.
• Die Antikörper können auf eine Vielzahl von Weisen verwendet werden, beispielsweise zum Hemmen einer Bindung zwischen der T- Zelle und der Zielzelle, zum Abtöten von T-Zellen oder zum Isolieren der T-Zellen. Im ersten Fall kann der vollständige Antikörper oder Fab-Fragmente oder sogar nur die Fv-Region verabreicht werden. Durch Entfernen der ganzen oder eines Teils der konstanten Region kann eine Verringerung der Immunantwort eintreten. Um die T-Zellen, die die besondere V-Region tragen, selektiv abzutöten, kann eine Vielzahl von Immunotoxinen verwendet werden, die den Antikörper oder ein spezifisches Bindungsfragment davon, gebunden an das Gesamtmolekül oder einen Teil eines Pflanzentoxins, wie Ricin, Abrin, usw., oder Diphtherietoxin, umfassen können. Durch Einsetzen eines geeigneten Antikörper-Isotyps, z.B. IgM oder IgG&sub3;, kann die Komplementkaskade mit einbezogen werden. Alternativ kann ein radioaktiver Substituent verwendet werden, der eine letale Dosis bei Binden des Antikörpers an die Wirtszelle liefert. Alternativ kann der Antikörper oder das Fragment davon mit einem zytolytischen Mittel für eine spezifische Eliminierung der unerwünschten T-Zellen konjugiert werden. Schließlich können die T-Zellen durch extrakorporale Maßnahmen entfernt werden, wie Plasmapherese, bei der Plasma durch oder über an einen Träger gebundene Antikörper geleitet werden kann, wobei die unerwünschten T-Zellen selektiv entfernt werden.
• Für therapeutische Zwecke kann der Antikörper mit herkömmlichen pharmazeutisch oder pharmakologisch akzeptablen Trägern für eine Verabreichung, geeigneterweise durch Injektion, formuliert werden. Träger umfassen entionisiertes Wasser, physiologische Kochsalzlösung, Phosphat-gepufferte physiologische Kochsalzlösung, Ringer-Lösung, Dextrose-Lösung und Hank's-Lösung. Andere Zusatz stoffe können Zusatzstoffe zur Einstellung von Isotonie, Puffer, Konservierungsmittel und ähnliches umfassen. Der Antikörper oder das Derivat desselben wird üblicherweise in aufgereinigter Form in Konzentrationen im Bereich von etwa 0,05 bis 10 µg/ml formuliert. Der Antikörper kann parenteral, typischerweise intravenös oder intramuskulär, als Bolus, mit Unterbrechungen oder in einem kontinuierlichen Verabreichungsschema verabreicht werden.
• Wünschenswerterweise sollte die Dosis etwa 75 % der unerwünschten T-Zellen, vorzugsweise mindestens etwa 90 % depletieren oder zumindest binden. Typische Dosen für erwachsene Menschen liegen im Bereich von etwa 10 bis 100 mg. Dosen für Kinder oder andere Tierarten können aus der Dosis für erwachsene Menschen auf Grundlage des relativen Körpergewichts extrapoliert werden.
• Anstelle von Antikörpern können Oligopeptide eingesetzt werden, die die gleiche oder im wesentlichen die gleiche Sequenz haben wie die Oligopeptidsequenz, die als charakteristisches Merkmal für die Autoimmunerkrankung identifiziert worden ist. Diese Sequenzen werden Oligopeptide mit mindestens 8, üblicherweise mindestens 10 und vorzugsweise mindestens 12 Aminosäuren und im allgemeinen nicht mehr als etwa 20 Aminosäuren der Kette der T- Zell-Rezeptor-Untereinheit sein. Obwohl die vollständige Untereinheit oder die vollständigen Untereinheiten eingesetzt werden können, wird üblicherweise nicht mehr als etwa 50 % der Anzahl von Aminosäuren eingesetzt werden, wobei insbesondere die konservierte oder konstante Region ausgenommen wird, wohingegen die gesamte oder ein Teil der variablen Region, die den besonderen Locus umfaßt, enthalten sein wird. Das Oligopeptid kann mit anderen Peptiden oder Proteinen aus einer Vielzahl von Gründen verknüpft werden, beispielsweise um eine verbesserte Stabilität, Desensibilisierung, leichte Herstellung oder Aufreinigung oder ähnliches zu vermitteln. Diese Peptide können verwendet werden, um die Bindung des T-Zell-Rezeptors an das Zielantigen zu inhibieren. Das Peptid kann auf im wesentlichen die gleiche Weise wie für die Antikörper beschrieben formuliert werden. Die Menge an verabreichter Wirksubstanz wird in weitem Rahmen in Abhängigkeit von der jeweiligen Zusammensetzung, dem jeweiligen Patienten, der Anzahl und Häufigkeit der Verabreichungen, der Art der Verabreichung usw. variieren. Üblicherweise wird sie etwa 0,01 bis 10 µg/kg Wirt, noch üblicher etwa 0,05 bis 5 µg/kg Wirt betragen, wobei die Konzentration von etwa 10 µg/ml bis etwa 1 µg/ml reichen kann.
• Die Verabreichungsweise kann abhängig von der Formulierung und Natur der Wirksubstanz in weitem Umfang variiert werden. Eine Verabreichung kann parenteral, intravasal, peritoneal, subkutan, oral usw. erfolgen und Katheter, Pumpen, konstante Diffusionsmembranen usw. einsetzen.
• Die Oligopeptide können auf mehreren Wegen hergestellt werden. Geeigneterweise entsprechend herkömmlichen Syntheseverfahren. Wenn es sich um längere Sequenzen handelt, wie 30 Aminosäuren oder mehr, können rekombinante DNA-Techniken eingesetzt werden, bei denen das Gen entsprechend herkömmlichen Wegen, wie durch kommerziell erhältlichen DNA-Synthetisiervorrichtungen, synthetisiert, unter Einsatz der Polymerasekettenreaktion amplifiziert und dann in einen geeigneten Vektor, der die erforderlichen transkriptionellen und translationalen Initiations- und Terminationsregionen aufweist, insertiert werden kann. Mit dem resultierenden Vektor wird dann ein Wirt transformiert, in dem der Expressionsvektor repliziert und eine funktionale Expression erhalten wird. Das Produkt kann sezerniert und aus dem Medium gewonnen werden oder, wenn es nicht sezerniert, sondern im Cytoplasma zurückgehalten wird, werden die Zellen geerntet, lysiert und das gewünschte Protein entsprechend herkömmlichen Verfahren isoliert und aufgereinigt.
• Anstelle des Oligopeptids können anti-idiotype Antikörper eingesetzt werden. Durch Herstellen eines monoklonalen Antikörpers gegen das idiotype Epitop des Antikörpers gegen das bestimmte Oligopeptid, kann der anti-idiotype Antikörper das Oligopeptid nachahmen und dazu dienen, mit dem T-Zell-Rezeptor um den MHC zu kompetitieren. Der anti-Idiotyp kann eine größere Stabilität bei einer Verabreichung wie auch andere Vorteile bedingen.
• Die schützenden Zusammensetzungen können in vitro oder in vivo verwendet werden, indem sie zu Gruppen von Zellen, umfassend Lymphozyten und mit der Autoimmunerkrankung assoziierte Zellen oder Zielprotein, zugesetzt werden. Durch Zusetzen der schützenden Zusammensetzung, üblicherweise eines Proteins, wie eines Antikörpers oder Peptids mit der geeigneten Sequenz bezüglich der variablen Region, kann die Verbreitung der Zellen und/oder des Zielproteins verhindert werden. Wenn Zellen beteiligt sind, werden die T-Zellen durch das Haupthistokompatibilitätsantigen der Zielzellen restringiert werden, wobei die Zielzellen üblicherweise zu den T-Zellen syngen sind.
• Zusätzlich zu den Zusammensetzungen dieser Erfindung können andere Zusammensetzungen eingesetzt werden, um den Schutz zu verstärken. Diese Zusammensetzungen können Oligopeptide, ein oder mehrere unterschiedliche Oligopeptide, die die folgende Sequenz umfassen, enthalten: geladene Aminosäure, zwei hydrophobe Aminosäuren und als mindestens eine der nächsten zwei Aminosäuren eine polare Aminosäure, wobei die geladene oder polare Aminosäure durch Glycin substituiert sein kann, wobei üblicherweise nicht mehr als eine durch Glycin substituiert ist. Die geladenen Aminosäuren sind Asparaginsäure, Glutaminsäure, Lysin, Arginin und Histidin (D, E, K, R, H). Die hydrophoben Aminosäuren sind Alanin, Prolin, Valin, Leucin, Isoleucin, Methionin, Phenylalanin, Tryptophan und Tyrosin, d.h. sowohl die aliphatischen als auch aromatischen neutralen oder im wesentlichen neutralen Aminosäuren, die nicht mehr als ein Heteroatom, z.B. ein Chalkogen, in der Seitenkette aufweisen (A, P, V, L, I, M, F, W und Y). Die polaren Aminosäuren werden die geladenen Aminosäuren wie auch Serin, Threonin, Asparagin und Glutamin (S, T, N und Q) sein.
• Die Sequenz mit diesem Motiv wird Teil einer Sequenz eines Immunogens von Interesse, das mit einer Autoimmunerkrankung assoziiert ist, sein, z.B. Myelin und multiple Sklerose, wobei üblicherweise mehr als eine Teilsequenz, die das bestimmte Motiv enthält, in dem Immunogen vorliegt. Das das bestimmte Motiv umfassende Oligopeptid kann aus jeder beliebigen Stelle der Immunogensequenz stammen, d.h. N-terminal oder C-terminal proximal oder zentral, wobei die Oligopeptidsequenz normalerweise im wesentlichen homolog zu 9 bis 15 Aminosäuren der Immunogensequenz sein wird, obwohl längere Sequenzen auch eingesetzt werden können. Üblicherweise betrifft der Homologieunterschied nicht mehr als 2 nicht konservative Läsionen, noch üblicher nicht mehr als 2 Läsionen, die Insertionen, Deletionen, konservative oder nicht-konservative Substitutionen sein können.
• Üblicherweise wird sich die in dem Oligopeptid vorliegende Motivsequenz an einer anderen Stelle als an dem C-Terminus des Oligopeptids befinden, wobei sie wünschenswerterweise am N-Terminus und nicht näher am C-Terminus ist als das Zentrum der Sequenz, wenn die zweite, dritte oder vierte Aminosäure des Motivs (abhängig davon, ob sich vier oder fünf Aminosäuren in dem Motiv befinden) die zentrale Aminosäure ist.
• Die Zusammensetzungen dieser Erfindung werden üblicherweise mindestens eine Sequenz eines Immunogens von Interesse, das das bestimmte Motiv umfaßt, enthalten und können zwei oder mehr Oligopeptidmotive enthalten, die Sequenzen von etwa 9 bis Aminosäuren, die in dem Immunogen vorliegen, enthalten, abhängig von der Anzahl von in dem Immunogen vorliegenden Motiven. Wenn eine Mehrzahl von Motiven in dem Immunogen vorliegt, können dementsprechend alle oder weniger als alle der die Motive umfassenden Sequenzen in einer einzigen Zusammensetzung eingesetzt werden. Üblicherweise wird die Zusammensetzung nicht mehr als 10 Verschiedene, ein Motiv umfassende Oligopeptide, noch üblicher nicht mehr als etwa 6 verschiedene Oligopeptide umfassen.
• Bei der Herstellung der Zusammensetzungen würde man ein Immunogen auswählen, das zu der Autoimmunerkrankung von Interesse in Beziehung steht, gegen die eine Immunantwort eines Patienten moduliert werden soll. Das Oligopeptid kann dazu dienen, den Wirt zu desensibilisieren, um einen Immunangriff gegen das endogene Protein oder eine Zelle, die das endogene Protein produziert, zu verhindern.
• Das bestimmte Protein von Interesse wird hinsichtlich des Vorliegens des bestimmten Motivs und einer oder mehrerer Sequenzen, die das ausgewählte Motiv umfassen, gescreent. Wenn der Haplotyp des beabsichtigten Empfängers bekannt ist, kann eine Sequenz gegenüber einer anderen bevorzugt werden. Wenn jedoch der Haplotyp nicht bekannt ist oder die Zusammensetzung an eine Anzahl verschiedener Patienten verabreicht werden könnte, ist es häufig wünschenswert, mehrere Sequenzen als Oligopeptide in derselben Zusammensetzungen zu kombinieren. Die Oligopeptide können als individuelle Peptide vorliegen oder miteinander in einer einzigen Sequenz verknüpft sein, mit oder ohne dazwischenliegende Brücken, wobei jegliche Brücken andere sein werden als die natürlicherweise vorkommenden verbrückenden Sequenzen des Immunogens. Wünschenswerterweise weist eine jede derartige Sequenz weniger als etwa 100 Aminosäuren, noch üblicher weniger als etwa 60 Aminosäuren auf.
• Die Oligopeptide können auf eine Vielzahl von Weisen modifiziert werden. Für eine Desensibilisierung können die Peptide mit syngenen Milzzellen konjugiert oder mit einem harmlosen Immunogen, gegen das der Patient vorab immunisiert worden ist, wie Tetanus- Toxoid, Rinderserumalbumin, usw., verknüpft sein. Hilfsstoffe werden normalerweise vermieden.
• Sequenzen, die für eine Desensibilisierung eingesetzt werden können, werden die Sequenzen von hinsichtlich des Patienten endogenen Proteinen sein, die an Autoimmunerkrankungen beteiligt sind, die Proteine, wie die im peripheren Nervensystem (PNS) oder dem zentralen Nervensystem (ZNS) gefundenen neurologischen Proteine und den Acetylcholin-Rezeptor (AChR), umfassen. Diese Proteine werden als P&sub0;, das in PNS und ZNS gefunden wird, P1, in basischem Myelinprotein, das vorherrschende ZNS-Protein von Myelin, P2, ein vorherrschendes Myelinprotein des PNS, PLP, ein Proteolipidprotein, ein PNS- und ZNS-Myelinbestandteil, und als der Acetylcholin-Rezeptor bezeichnet. P1 ist an post-Immunisierungs-Enzephalomyelitis beteiligt und könnte an multipler Sklerose beteiligt sein. P2 ist an post-Immunisierungs-Neuritis (Guillain-Barre-Syndrom) beteiligt, einer Hauptkomplikation beispielsweise bei dem Schweine-Grippe-Immunisierungsprogramm, und der Acetylcholin-Rezeptor ist beteiligt an Myasthenia gravis und könnte eine Rolle bei post-Immunisierungs-Myositis spielen. Diese Proteinfragmente können durch eine oder mehrere Läsionen modifiziert werden, um die Bindungsaffinität für das Transplantationsantigen aufrechtzuerhalten, wohingegen die Bindungsaffinität zu dem T-Zell-Rezeptor substantiell verringert wird.
• Zusätzlich zu Oligopeptiden, die das bestimmte Motiv enthalten, sind andere einsetzbare Oligopeptide jene N-terminalen Peptide, die acetyliert sind, wobei lediglich erforderlich ist, daß das Ausgangs-Immunogen als N-acetyliertes Protein vorliegt. Von besonderem Interesse für diesen Zweck ist der N-Terminus des basischen Myelinproteins, der die Sequenz Ac-A-S-Q-K-R-P-S-Q-R- H-G-S-K-Y-L aufweist; andere acetylierte N-Terrnini umfassen den des P2-Proteins, der die Sequenz Ac-S-N-K-F-L-G-T-W-K-L-V-S-S-G hat.
• Transplantationsantigene haben polymorphe Regionen, wo die individuellen Allele mit speziellen Patienten assoziiert sind. Zumeist wird der Patient diploid und heterozygot sein, so daß jeder Patient zwei Haplotypen haben wird, was bedeutet, daß es zwei unterschiedliche Kopien eines bestimmten Transplantationsantigen-Typs von demselben Locus gibt, sofern der Patient nicht hinsichtlich dieses bestimmten Locus homozygot ist. Dementsprechend werden bei einem individuellen Patienten oder einer Mehrzahl von Patienten üblicherweise Mischungen von Oligopeptiden eingesetzt werden.
• Die Oligopeptide können gleichzeitig mit oder nach den Oligopeptiden des T-Zell-Rezeptors verabreicht werden. Die Oligopeptide können auf eine Vielzahl von Wegen verabreicht werden, als solche oder in Verbindung mit verschiedenen Zusatzstoffen. Verschiedene Träger können eingesetzt werden, die physiologisch akzeptabel sind, wie Wasser, Alkohol, physiologische Kochsalzlösung, Phosphat-gepufferte physiologische Kochsalzlösung, Zucker, Mineralöl, usw. Andere Zusatzstoffe können gleichfalls zugesetzt werden, wie Stabilisatoren, Detergentien, Geschmacksstoffe, Verdickungsmittel, usw. Die verabreichte Menge an Wirksubstanz variiert in weitern Rahmen abhängig von der jeweiligen Zusammensetzung, dem jeweiligen Patienten, der Anzahl und Häufigkeit der Verabreichungen, der Art der Verabreichung usw. Üblicherweise wird es sich um etwa 0,01 bis 10 µm/kg Patient, noch üblicher um etwa 0,05 bis 5 µg/kg Patient handeln, wobei die Konzentration von 10 µg/ml bis 1 mg/ml variieren kann.
• Die folgenden Beispiele werden zur Veranschaulichung und nicht zur Beschränkung aufgeführt.
EXPERIMENTELLER TEIL MATERIAL UND METHODEN Mäuse:
• Weibliche PL/J- und (PL/J X SJL/J)F&sub1; ([PLSJ]F&sub1;)-Mäuse wurden vom Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, erworben und in den Tierhäusern in den Departments of Genetics and Medical Microbiology, Stanford University, Stanford, CA, gehalten.
Antigene:
• NH&sub2;-terminale MBP-Peptide wurden entsprechend den Sequenzen für MBP aus Ratte und aus Rind durch Festphasentechniken synthetisiert (Zamvil et al., Nature (1986), 324:258). Diese Peptide enthielten > 90 % des gewünschten Produktes, wie mittels einer Hochdruckflüssigkeitsphasensäule (Merck & Co., Inc., Rahway, NJ) und Aminosäureanalyse bestimmt wurde.
T-Zell-Klone:
• für NH&sub2;-terminales MBP spezifische T-Zell-Klone wurden unter Einsatz von intaktem MBP und von MBP-Peptiden isoliert (Zamvil et al., ebenda (1985) 317:355; Zamvil et al., J. Exp. Med. (1985) 162:2107). Diese Klone wurden aus homozygoten PL/J-Mäusen mit Ausnahme der Klone F&sub1;-12 und F&sub1;-21, die aus einer (PLSJ)F&sub1;-Maus isoliert worden waren, isoliert. Sämtliche be schriebenen Klone weisen gleichermaßen dieselbe Klasse II (1-Au) Restriktion und Spezifität für NH&sub2;-terminales MBP (1-9) auf. Aus derselben T-Zellinie isolierte Klone unterschieden sich in ihrer TCR &beta;-Ketten-Umlagerung oder ihrer Reaktivität gegenüber TCR V&beta;8- spezifischen monoklonalen Antikörpern (mAb) (Tabelle 1).
• Dementsprechend ist keiner der diskutierten Klone ein doppelt vorhandener "Schwester-Klon. Die T-Zell-Klone PJR-25, PJB-20, PJpR-6.2, PJpR-6.4, PJpBR-3.2 und F&sub1;-12 sind enzephalitogen. Die T-Zell-Klone PJB-18, PJH-1.5 und F&sub1;-21 sind nicht-enzephalitogen (Zamvil et al., J. Immunol. (1987) 139:1075). Andere für NH&sub2;- terminales MBP spezifische T-Zell-Klone sind in vivo nicht untersucht worden. TABELLE I Überprüfung von für NH&sub2;-terminales MBP spezifischen T-Zell-Klonen mit TCR V&beta;8-spezifischen mAbs
• Die Zellklone wurden mit KJ16 (Haskins et al., a.a.O.) und F23.1 (Staerz et al., siehe unten), wie in Materialien und Methoden beschrieben, angefärbt.
• Intaktes MBP und MBP-Peptide wurden für eine Selektion, wie bereits früher beschrieben (siehe Referenzen von Zamvil, a.a.O.), verwendet. Das Peptide pR1-11 ist Ac-ASqKRPSQRHG und pBR1-11 ist Ac-AAQKRPSQRHG. Sämtliche Klone wurden aus homozygoten PL/J-Mäusen mit Ausnahme von F&sub1;-12 und F&sub1;-21, die aus einer (PLSJ)F&sub1;-Maus isoliert worden waren, isoliert. Die Klone PJB-18 und PJB-20 wurden aus derselben T-Zellinie isoliert. Diese zwei Klone unterscheiden sich in der Umlagerung des Gens für ihre &beta;-kette. Die Klone PJpR-5.2 und PJpR-5.3, PJp5-6.2 und PJpR-6.4 und PJpBR-3.1 und PJpBR-3.2 wurden aus von drei unterschiedlichen Mäusen gewonnenen Linien isoliert. Für jedes Paar unterschied sich en Mitglied von dem anderen in der Reaktivität gegenüber V&beta;8- spezischen Antikörpern. Dementsprechend ist keiner der berichteten Klone ein doppelt vorhandener "Schwster"-Klon. Die T-Zell-Klone PJR-25, PJB-20, PJpR-6.2, PJpT-6.5, PJpBR-3.2 und F&sub1;-12 sind enzephaltiogen, wie beschrieben (siehe Referenzen von Zamvil, a.a.O.). Die T-Zell-Klone PJB-18, PJH-1.5 und F&sub1;-21 sind 2nicht-enzephaltigen. Andere für NH&sub2;-terminales MBP spezifisches T-Zell-Klone sind in vivo nicht untersucht worden.
Proliferationsassay:
• Die Proliferationsantworten wurden bestimmt, wie in Zamvil et al., Nature (1985), a.a.O. beschrieben. Entweder 10&sup4; klonierte T-Zellen oder 4×10&sup4; Lymphknotenzellen wurden mit 5×10&sup5; &gamma;-bestrahlten (3000 rad) PL/J-APC aus der Milz in 0,2 ml Kulturmedium in Mikrotiterplatten mit flachen Böden und 96 Vertiefungen (Modell 3072; Falcon Labware, Oxnard, CA) gezüchtet. Nach 48 Stunden Inkubation wurde jede Vertiefung mit 1 µCi [³H]Thymidin gepulst und 16 Stunden später geerntet. Der mittlere Thymidin-Einbau in cpm wurde für jeweils 3fach erzeugte Kulturen berechnet. Standardabweichungen bei den mehrfach erzeugten Kulturen lagen jeweils innerhalb eines Mittelwerts von 10 %.
FACS-Analyse:
• Jeder Klon wurde mit KJ16 (Haskins et al., J. Exp. Med. (1984) 160:452) und anti-L3T4 (GK1.5) (Dialynas et al., Immnol. Rev. (1983) 74:29; Hayakawa et al., J. Exp. Med. (1983) 157:202) angefärbt. 5×10&sup5; T-Zellen wurden mit 1 µg Biotin-konjugiertem KJ16 und 1 µg Fluorescein-konjugiertem GKL.5, gefolgt von Texas-Rot-Avidin inkubiert. Eine Immunfluoreszenzanalyse wurde an einem Doppellaser-FACS IV (Becton Dickinson Immunocytometry, Fullerton, CA), das mit logarithmischen Amplifiziereinrichtungen ausgestattet war, ausgeführt. Zwei-Farben-Anfärbungsdaten wurden als "Contour-Plots" erhalten, bei denen die Mengen an grüner und roter Fluoreszenz pro Zelle die Anordnung auf einer zweidimensionalen Oberfläche definierten.
Southern-Analyse:
• Die TCR-Sonde V&beta;c5.1, ist ein 280-bp Pst-Pvu II- Subklon von V&beta;c8.1(V&beta;c5.1) (Patten et al., Nature (1984) 312:40). Die DNA-Sonde 5'V&beta;c5.2), ein 0,5 kb-Pvu II-Fragment (erhältlich von M.M. Davis, Stanford University, Stanford, CA) ist 2 kb 5' von V&beta;8.2 lokalisiert. Die J&beta;2-spezifische Sonde ist eine genomische 1,2 kb-Sonde, die J&beta;2.1 2.7 (Chien et al., Nature (1984) 309:322) umfaßt. Leber- und T-Zell-DNA wurden durch Standardverfahren isoliert (Kaiser und Murray, 1985, in DNA Cloning: A Practical Approach, Band I, M. Glover, Hrsg., IRL Press Limited, Oxford, Seiten 38-39). Jede 10 µg DNA enthaltende Probe wurde entweder mit Xba I oder Hind III vollständig verdaut, auf 0,8%igen Agarosegelen aufgetrennt und auf Nitrocellulosefilter transferiert. Die Filter wurden bei 42 ºC 4 Stunden in 50 % Formamid, 5×SSPE, 100 µg/ml Lachssperma-DNA, 1× Denhardt-Lösung, 0,1 % SDS und 10 mM Tris (pH 8,0) vorhybridisiert. Hybridisierungen wurden in dem gleichen Puffer, der 5×10&sup6; cpm/ml Hexamergeprimte Sonde enthielt, 20 Stunden bei 42 ºC ausgeführt. Die Filter wurden in 2×SSC, 0,1 % SDS bei Raumtemperatur gewaschen. Sie wurden zwei weitere Male jeweils 1 Stunde bei 60 ºC in 0,2×SSC, 0,1 % SDS gewaschen.
Induktion von EAE:
• Die Induktion von EAE mit dem enzephalitogenen, MBP-spezifischen T-Zell-Klon PJR-25 wurde ausgeführt, wie beschrieben in Zamvil et al., Nature (1985), a.a.O.; Zamvil et al., J. Exp. Med. (1985), a.a.O. 5×10&sup6; über Ficoll aufgetrennte Zellen des Klons PJR-25 wurden intravenös (PLSJ)F&sub1;-Empfängermäusen 6 Stunden nach einer intraperitonealen Injektion von mAb injiziert. EAE wurde, wie bereits früher in Zamvil et al., Nature (1985), a.a.O.; Zamvil et al., J. Exp. Med. (1985), a.a.O. beschrieben, eingestuft. 0: kein Anzeichen von EAE; 1: lediglich verringerter Schwanz-Tonus; 2: milde Paraparese; 3: mäßig schwere Paraparese; 4: vollständige Paraplegie; 5: Moribund.
ERGEBNISSE TCR &beta;-Ketten-Expression durch für NH&sub2;-terminales MBP spezifische T-Zellen.
• 20 für Myelin-bindendes Protein (MBP) spezifische T-Zell-Klone (L3T4&spplus;, Lyt2&supmin;) wurden in dieser Studie untersucht. 18 dieser Klone wurden aus 14 individuellen, homozygoten PL/J- Mäusen und 2 Klone aus einer einzigen (PLSJ)F&sub1;-Maus isoliert. Diese Klone wurden nach Immunisierung mit verschiedenen Formen von MBP und MBP-Peptiden isoliert. Alle 20 Klone weisen die gleiche Spezifität für ein NH&sub2;-terminales Nonapeptid und die gleiche Klasse II (I-Au)-Restrikt ion auf. Sie sind hinsichtlich fremder MHC-Klasse II-Moleküle nicht alloreaktiv. Die Expression des Gens für die TCR &beta;-Kette durch diese Klone wurde mit für die TCR V&beta;8-Gen-Unterfamilie spezifischen monoklonalen Antikörpern untersucht. Der TCR-spezifische mAb KJ16.133 (Haskins et al. (1984), a.a.O.) erkennt eine Determinante, die mit der Expression zweier Mitglieder dieser TCR V&beta;-Gen-Unterfamilie (Behlke et al., J. Exp. Med. (1987) 165:257) (gleichfalls bekannt als V&beta;c5 (Patten et al., a.a.O.), V&beta;8.1 (V&beta;c5.1) und V&beta;&sub2; (V&beta;c5.2), assoziiert ist. Der KJ16-Phänotyp wird von 16 % der PL/J-T-Lymphozyten exprimiert. Im Gegensatz dazu exprimieren SJL/J-Mäuse die V&beta;8 (KJ16)-Unterfamilie nicht. Das FACS-Anfärbungsmuster mit KJ16 wurde für 6 repräsentative T-Zell-Klone, von denen vier KJ16&spplus; und zwei KJ16&supmin; sind, bestimmt. Von den 18 PL/J-Klonen sind 14 (78 %) KJ16&spplus; (Tabelle 1). Dieser hohe Prozentsatz an KJ16&spplus; (V&beta;8&spplus;)-Klonen ist kein Artefakt aus einer Untersuchung doppelt vorliegender Schwesterklone, die aus derselben T-Zellinie isoliert worden sind. Bei jenen Linien, wo zwei Klone gezeigt sind (Tabelle I), unterschieden sich die Klone entweder in ihrer Antikörperreaktivität oder in der Umlagerung des Gens für ihre TCR &beta;-Kette. Dementsprechend entsprechen 78 % KJ16&spplus;-Klone einem Minimalwert. Wenn zusätzliche, für NH&sub2;-terminales MBP spezifische Schwesterklone untersucht wurden, sind 85 % KJ16&spplus; (V&beta;8&spplus;). Darüber hinaus werden die KJ16&supmin;-Klone nicht mit einem anderen mab, F23.1 (Staerz et al., J. Immunol. (1985) 134:3994), der eine TCR-Determinante erkennt, die mit der Expression sämtlicher drei Mitglieder der V&beta;8-Unterfamilie, V&beta;8.1, V&beta;8.2 und V&beta;8.3 (Behlke et al., a.a.O.), assoziiert ist, angefärbt.
• Die vorherrschende Verwendung der TCR V&beta;8-Gen-Unterfamilie ist kein in vitro-Klonierungsartefakt. Die proliferative T-Zell- Antwort wurde bei mit MBP 1-11 (Aminosäuren 1-11 von MBP) stimulierten oder geprimten PL/J-Mäusen nach FACS-Sortierung von L3T4&spplus;-Lymphknotenzellen in L3T4&spplus;/V&beta;8&spplus;- und L3T4&spplus;/V&beta;8&supmin;-Subpopulationen untersucht. Bei zwei getrennten Experimenten tritt > 90 % der proliferativen T-Zell-Antwort in der V&beta;8+-Subpopulation auf. Obwohl die V&beta;8&supmin;-Subpopulation von mit MBP 1-11 stimulierten oder geprimten Lymphknotenzellen nicht auf MBP 1-11 anspricht, spricht diese Subpopulation auf PPD (aufgereinigtes Proteinderivat aus Mycobacterium tuberculosis), eine Positivkontrolle, an. Dementsprechend wurde durch Untersuchen sowohl von in vitro- isolierten T-Zell-Klonen als auch von Primärkulturen gezeigt, daß eine überwiegende Verwendung der TCR V&beta;8-Unterfamilie bei der T-Lymphozyten-Autoimmunantwort auf den NH&sub2;-Terminus von MBP vorliegt.
Genetische Analyse von TCR ß-Ketten von für NH&sub2;-terminales MBP spezifischen T-Zell-Klonen:
• Eine Southern-Blot-Analyse wurde verwendet, um zu bestimmen, ob für NH&sub2;-terminales MBP spezifische KJ16&spplus;-T-Zell-Klone dieselbe &beta;-Ketten-V-D-J-Kombination verwenden, und um zu identifizieren, welches Mitglied oder welche Mitglieder der V&beta;8-Unterfamilie verwendet werden. Ein Blot von durch Xba I verdauter genomischer DNA, die aus mehreren dieser Klone isoliert worden war, wurde mit einer Sonde, bezeichnet als V&beta;c5.1, die für die V&beta;8(V&beta;c5)-Unterfamilie spezifisch ist, gescreent. Diese Sonde hybridisiert mit sämtlichen drei V&beta;8-Genen, wobei V&beta;8.1 zu 92 % bzw. 85 % zu V&beta;8.2&supmin; bzw. V&beta;8 homolog ist (Barth et al., Nature (1985) 316:517). Auf durch Xba I verdauter Keimbahn-DNA sind die V&beta;8.1-, V&beta;8.2- und V&beta;&sub3;-Gene auf separaten 10,0 kb-, 5,5 kb- bzw. 3,9 kb-Fragmenten lokalisiert. Es wurde beobachtet, daß Umlagerungen eines Mitglieds der V&beta;8-Unterfamilie bei den KJ16&spplus;-Klonen PJR-25, PJB-18 und PJpR-6.2 vorlagen. Eine Keimbahnkonfiguration für sämtliche V&beta;8-Mitglieder wird bei dem KJ16 - Klon PJpR-6.4 beobachtet. Die Größen dieser umgelagerten Banden stimmen mit sämtlichen KJ16&spplus;-Klonen, die V&beta;8.2 verwenden, überein. Um diese Möglichkeit zu bestätigen, wurde ein Blot von durch Xba I verdauter DNA auch mit einem 0,5 kb-Pvu II-Fragment (erhältlich von M.M. Davis, Stanford University, Stanford, CA), das 2 kb 5' von V&beta;8.2 lokalisiert ist, hybridisiert. Eine unter Verwendung dieser 0,5 kb-Sonde nachgewiesene Umlagerung ist für die Verwendung von V&beta;8.2 spezifisch. Eine Umlagerung des V&beta;8.2-Gens wird bei sämtlichen vier KJ16&spplus;-Klonen beobachtet, die durch Hybridisierung mit dieser 0,5 kb-Sonde untersucht worden sind. Ein anderer KJ16&spplus;-Klon, der enzephalitogene Klon PJpBR-3.2 (Tabelle I), der auf dieselbe Weise untersucht worden war, verwendet gleichfalls TCR V&beta;8.2.
• Die Größen der Fragmente, die bei mit Xba I verdauter DNA festgestellt werden, sind konsistent mit der Verwendung von Mitgliedern des J&beta;2-Locus. Um dies zu bestätigen, wurden Blots aus durch Hind III verdauter DNA hergestellt. V&beta;8.2 und V&beta;8.3 sind beide auf demselben 9,6 kb-Hind III-Fragment lokalisiert. V&beta;8.1 ist auf einem 1,2 kb-Fragment lokalisiert. Bei einer Verwendung von V&beta;8.2 erzeugt eine Umlagerung, die J&beta;1, einbezieht, ein Hind III-Fragment von 13-14 kb, wohingegen eine Umlagerung, die J&beta;2 einbezieht, ein Hind III-Fragment von 8-10 kb erzeugt. Aus durch Hind III verdauter DNA erzeugte Blots wurden mit der Sonde V&beta;c5.1 (V&beta;8.1) und einer J&beta;2-spezifischen Sonde (Chien et al., a.a.O.) hybridisiert. Das V&beta;8.1, enthaltende 1,2 kb-Fragment wanderte aus diesen Gelen heraus. Die bei einer Hybridisierung sowohl mit J&beta;2- als auch mit V&beta;c5.1 (V&beta;8.1)-Sonden festgestellten umgelagerten Banden sind 8,5-9,5 kb, was anzeigt, daß jede Umlagerung von V&beta;8.2 eine V&beta;8.2DJ&beta;2-Umlagerung ist. Zwei Umlagerungsmuster wurden mit den V&beta;- und J&beta;-Sonden festgestellt, was zeigt, daß zwei unterschiedliche J&beta;-Gene an dem zweiten Locus verwendet werden müssen. Ergebnisse eines ECORV-Blots zeigten die Verwendung zweier separater J&beta;-Gene. Die Umlagerung in Klon PJR-25 entspricht jener von PJB-18 und die Umlagerung in Klon PJB-20 ist die gleiche wie bei PJpR-6.2.
• Der T-Zell-Klon PJB-18 umfaßt TCR 13-Ketten-Umlagerungen, die den V&beta;8-Locus auf beiden homologen Chromosomen einbeziehen. Eine Umlagerung verwendet V&beta;8.2 und eine davon getrennte Umlagerung ist mit der Verwendung von V&beta;8.3 konsistent. Die zwei V-D-J-Umlagerungen führten zu der Deletion von sowohl der V&beta;8.1-Keimbahnbande als auch V&beta;82-Keimbahnbande. Der T-Zell-Klon PJpR-6.2 zeigte eine Deletion sämtlicher Mitglieder der V&beta;8-Gen-Unterfamilie auf einem Chromosom und weist eine Umlagerung zu V&beta;8.2 auf dem anderen auf, was eine Keimbahnkopie des V&beta;8.3-Gens auf diesem Chromosom zurückläßt. Mit einer J&beta;1-spezifischen Sonde wurde gezeigt, daß dieser Klon ein J&beta;1-Gen für die V-D-J-Umlagerung auf dem anderen Chromosom verwendet. Beide Chromosomen können TCR-Gene umlagern, obwohl entsprechend Allelausschluß nur eines produktiv ist. Von den zwei Umlagerungen bei PJB-18 und PJpR-6.2 muß die V&beta;8.2 enthaltende Umlagerung die funktionale sein, da beide Klone mit KJ16, das V&beta;8.1 und V&beta;8.2, aber nicht V&beta;8.3 erkennt, reagieren. Eine andere V&beta;-Familie ist in für den N-Terminus des Myelin-bindenden Proteins spezifischen Klonen mit derselben Klasse II-Restriktion, V&beta;4, als eine in geringerem Ausmaß beteiligte Familie identifiziert worden.
Prävention von EAE mit einem anti-TCR- T-Zell-Rezeptor V-Region-Antikörper
• (PLSJ)F&sub1;-Empfängermäusen wurden intraperitoneal 500 µg des über eine DEAE-Säule aufgereinigten monoklonalen Antikörpers F23.1, der eine mit der Expression sämtlicher drei Mitglieder der V&beta;8- Unterfamilie assoziierte TCR-Determinante erkennt (Staerz et al., a.a.O.), injiziert. Kontrollmäusen wurde intraperitoneal 1,0 ml PBS injiziert. 6 Stunden später wurden Empfängermäusen 5×10&sup6; Zellen des enzephalitogenen Klons PJR-25 injiziert. Die Mäuse wurden täglich durch zwei voneinander unabhängige Beobachtungspersonen untersucht. Die Schwere von EAE wurde wie folgt eingestuft: 0: kein Anzeichen von EAE; 1: lediglich verringerter Schwanz-Tonus; 2: milde Paraparese; 3: mäßig schwere Paraparese; 4: vollständige Paraplegie; 5: Moribund. Die Ergebnisse dieses Experiments sind in der nachfolgenden Tabelle angegeben. TABELLE II Eine in vivo-Verabreichung eines monoklonalen Antikörpers, der für den Antigen-spezifischen TCR spezifisch ist, verhindert eine Induktion von EAE
• * Injektion von 500 µg mAb F23.1 14 Tage nach einer Injektion von PJR-25.
• Im Gegensatz dazu verhindert eine Verabreichung von F23.1 an SJL/J-Mäuse, denen die V&beta;8-Unterfamilie fehlt, EAE nicht. Wenn KJ23a (Kappler et al., Cell (1987) 49:263) an SJL/J-Mäuse verabreicht wird, die eine T-Zellinie erhalten hatten, die eine Reaktivität gegenüber dem Peptid p89-101 des basischen Myelinproteins zeigt, entwickelten 0/4 Mäuse EAE im Vergleich zu 10/12 Mäusen, die F23.1 erhalten hatten. KJ23A erkennt V&beta;17a. V&beta;17a ist homolog zu V&beta;4 beim Menschen, wohingegen V&beta;8.2 zu V&beta;.2 beim Menschen homolog ist (Lai et al., Nature (1988) 331:543).
• Inder nächsten Studie wurde bestimmt, ob EAE verhindert werden konnte, wenn (PLSJ)F&sub1;-Mäuse das Peptid p1-11 von basischem Myelinprotein in komplettem Freund-Adjuvans (CFA) erhielten. p1-11 in CFA induziert T-Zell-Klone, die die V&beta;8.2-TCR-Genfamilie verwenden, wie auch Klone, die p1-11 erkennen und V&beta;8.2 nicht umlagern. 78 % (14/18) T-Zell-Klone, die gegenüber p1-11 reaktiv sind, lagern V&beta;8.2 um und können mit den monoklonalen Antikörpern KJ16 und F23.1 bei einer durchflußzytometrischen Analyse angefärbt werden. Mäusen wurde intraperitoneal 500 µg F23.1 1 Tag vor, 1 Tag nach und 9 Tage nach einer Behandlung mit p1-11 in komplettem Freund-Adjuvans verabreicht. Kontrollmäuse erhielten Leu 5b, einen nicht kreuzreaktiven mab aus der Maus, der hinsichtlich des Isotyps mit F23.1 übereinstimmt. Während 1/19 Mäuse, die F23.1 erhielten, EAE entwickelten, entwickelten 10/20 Mäuse, die Leu 5b erhalten hatten, EAE und wurden paralysiert (p ( 0,001). Diese Ergebnisse dienen dazu, zu zeigen, daß V&beta;8.2 bei der Entwicklung von EAE, einem Modell für multiple Sklerose, eine kritische Rolle spielt und daß ein Ausweichen auf V1.8.2-negative Klone, die EAE hervorrufen könnten, nicht auftritt.
Umkehrung von EAE mit einem anti-TCR V-Region-Antikörper
• EAE wurde mit dem T-Zell-Klon PJr25 induziert, wie bereits früher beschrieben (Zamvil et al., Nature (1986) 324:258). Eine Therapie wurde mit dem mAb F23.1 innerhalb von 24 Stunden nach dem Zeitpunkt, zu dem Mäuse zum ersten mal eine Paralyse entwikkelten, begonnen. (PLSJ)F1-Mäuse wurden statistisch in 2 Gruppen eingeteilt, von denen 16 F23.1 erhielten und 16 paralysierte Mäuse Leu 5b, eine gegenüber dem CD2-Antigen reaktive, hinsichtlich des Isotyps übereinstimmende Kontrolle, erhielten. Die Mäuse erhielten 2 Injektionen von monoklonalem Antikörper (100 µg) zuerst innerhalb von 24 Stunden nach dem Ausbruch der Paralyse und dann 72 Stunden später. Innerhalb von 96 Stunden nach Beginn der Behandlung mit F23.1 zeigten Mäuse eine bedeutende Umkehrung hinsichtlich ihrer Paralyse und 13 von 16 waren 10 Tage nach Beginn der Therapie vollständig ohne Krankheit. Kontrolltiere blieben während den 40 Tagen Beobachtung nach Beginn der Therapie paralysiert. Am Tag 35 wurde ein Rückfall bei den Tieren, die mab F23.1 erhalten hatten, festgestellt. Ähnliche Ergebnisse wurden festgestellt, wenn EAE in (PLSJ)F1- Mäusen mit basischem Myelinprotein in komplettem Freund-Adjuvans induziert wurde.
• Nach Vorliegen einer Paralyse wurden Mäusen intraperitoneal 0,2 mg F23.1 (anti-V&beta;&sub2;) oder KJ23a (anti-V&beta;17a) verabreicht. KJ23A verhindert eine mit V&beta;i&sub7;a-positiven T-Zellen induzierte EAE bei SJL/J-Mäusen, die p89-106 des basischen Myelinproteins erhalten hatten. 12 von 19 Mäusen, die F23.1 erhalten hatten, kehrten innerhalb von 72 Stunden zum Normalzustand zurück, wohingegen 21 von 22 Mäusen, die KJ23a erhalten hatten, nach 72 Stunden weiterhin paraplegisch blieben. Rückfälle traten bei 6 von 19 mit F23.1 behandelten Mäusen im Verlauf der nächsten 2 Wochen auf, während 21 von 22 mit KJ23a behandelten Mäusen paralysiert blieben.
• Diese Ergebnisse zeigen, daß eine restringierte TCR &beta;-Ketten- Expression bei der Autoimmunantwort auf den enzephalitogenen NH&sub2;- Terminus des basischen Myelinproteins auftritt. Es liegt eine überwiegende Expression der TCR V&beta;8-Unterfamilie, insbesondere von V&beta;8.2 vor. Diese Ergebnisse zeigen ferner, daß eine in vivo Verabreichung eines TCR V&beta;8-spezifischen monoklonalen Antikörpers EAE, ein Modell für multiple Sklerose, verhindern oder umkehren kann. Dementsprechend können bei klinischen Situationen, bei denen autoaggressive T-Zellen identifiziert werden können, Antikörper gegen die TCR V-Region eine hochspezifische Form der Therapie darstellen.
• Aus den vorstehend angegebenen Ergebnissen ist ersichtlich, daß die Erfindung neue Einsichten bereitstellt, die für Diagnose, Prophylaxe und Behandlung von Autoimmunerkrankungen verwendet werden können. Dementsprechend können Sequenzen identifiziert werden, die die Anfälligkeit eines Individiums für eine bestimm te Autoimmunerkrankung anzeigen können, bei der frühzeitige Maßnahmen die abträglichen Wirkungen der Erkrankung verhindern oder bedeutend verringern können. Dementsprechend bestehen Möglichkeiten für Prophylaxe und Therapie bei derart schwächenden Krankheiten, wie multipler Sklerose, SLE, Diabetes und ähnlichern. Das für Diagnose und Therapie eingesetzte Verfahren kann etablierten Protokollen und Techniken folgen, wobei übliche Reagenzien in Verbindung mit den erfindungsgemäß bereitgestellten Materialien eingesetzt werden können. Auf diese Weise ermöglicht die Erfindung eine leichte Beobachtung und Behandlung der vorstehend angegebenen Autoimmunerkrankungen. Modifizierungen der vorstehend beschriebenen Weisen zum Ausführen der Erfindung, die für Fachleute in Medizin, Immunologie, Hybridomtechnologie, Pharmakologie und/oder verwandten Gebieten naheliegend sind, sollen im Rahmen der folgenden Ansprüche liegen.

Claims (38)

1. Verfahren zum Nachweis der Anfälligkeit eines Menschens für eine Autoimmunerkrankung, bei dem man die Gegenwart eines Locus im Genom eines Menschen nachweist, der für mindestens einen Teil der variablen Region eines T-Zell-Rezeptors kodiert, die mit dem Auftreten der Autoimmunerkrankung assoziiert ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem man Nukleinsäuren nachweist, die für den Teil der variablen Region des T-Zell- Rezeptors kodieren.

3. Verfahren nach Anspruch 2, bei dem die Nukleinsäure genomische DNA ist.

4. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem man das Expressionsprodukt des Locus nachweist.

5. Verfahren nach jeglichem der Ansprüche 1 bis 4, bei dem der Locus mindestens für einen Teil der variablen Region einer &beta;-Untereinheit eines T-Zell-Rezeptors kodiert.

6. Verfahren nach Anspruch 5, bei dem der Locus mindestens für einen Teil einer V&beta;12- oder V&beta;4-Region kodiert.

7. Verfahren nach Anspruch 5, bei dem der Locus das humane Äquivalent zu dem Locus V&beta;8.1, V&beta;8.2, V&beta;8.3 oder V&beta;17a der Maus ist.

8. Verfahren nach jeglichem der Ansprüche 1 bis 7, bei dem die Autoimmunerkrankung die Zerstörung von Gliazellen und/oder von Myelin umfaßt.

9. Verfahren nach jeglichem der Ansprüche 1 bis 7, bei dem die Autoimmunerkrankung Multiple Sklerose ist.

10. Verfahren nach jeglichem der Ansprüche 1 bis 5, bei dem die Auto immunerkrankung rheumatoide Arthritis, systemischer Lupus erythematosus, Psoriasis, Pemphigus vulgaris, juveniler Diabetes, Sjögren-Syndrom, Thyreoiditis, Hashimoto's- Thyreoiditis oder Myasthenia gravis ist.

11. Peptid, welches eine Aminosäure-Sequenz enthält, die von einem Locus für eine variable Region eines T-Zell-Rezeptors kodiert wird, die mit dem Auftreten einer Autoimmunerkrankung assoziiert ist.

12. Peptid nach Anspruch 11, in dem die Aminosäure-Sequenz mindestens 8 Aminosäuren umfaßt.

13. Peptid nach den Ansprüchen 11 oder 12, bei dem der Locus mindestens für einen Teil der variablen Region einer 13-Untereinheit eines T-Zell-Rezeptors kodiert.

14. Peptid nach Anspruch 13, bei dem der Locus mindestens für einen Teil einer V&beta;12- oder V&beta;4-Region kodiert.

15. Peptid nach Anspruch 13, bei dem der Locus das humane Äquivalent zu dem Locus V&beta;8.1, V&beta;8.2, V&beta;8.3 oder V&beta;17a der Maus ist.

16. Peptid nach jeglichem der Ansprüche 11 bis 15, bei dem die Autoimmunerkrankung die Zerstörung von Gliazellen und/oder von Myelin umfaßt.

17. Peptid nach Anspruch 16, bei dem die Autoimmunerkrankung Multiple Sklerose ist.

18. Peptid nach jeglichem der Ansprüche 11 bis 13, bei dem die Autoimmunerkrankung rheumatoide Arthritis, systemischer Lupus erythematosus, Psoriasis, Pemphigus vulgaris, juveniler Diabetes, Sjögren-Syndrom, Thyreoiditis, Hashimoto's- Thyreoiditis oder Myasthenia gravis ist.

19. Pharmazeutische Zusammensetzung zur Hemmung von durch Lymphozyten gesteuerten Angriffen auf humane syngene Zellen, die mit einer Autoimmunerkrankung assoziiert sind, enthaltend einen monoklonalen Antikörper mit Spezifität für eine Aminosäure-Sequenz, die von einem Locus für eine variable Region eines T-Zell-Rezeptors kodiert wird, die mit der Autoimmunerkrankung assoziiert ist, vermischt mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger.

20. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 19, bei dem der monoklonale Antikörper ein humanisierter Antikörper ist.

21. Pharmazeutische Zusammensetzung nach den Ansprüchen 19 oder 20, bei welcher der monoklonale Antikörper Spezifität für eine Aminosäure-Sequenz besitzt, die von einem Locus für mindestens einen Teil der variablen Region einer &beta;-Untereinheit eines T-Zell-Rezeptors kodiert wird.

22. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 21, bei der der Locus für mindestens einen Teil des V&beta;12- oder V&beta;4-Region kodiert.

23. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 21, bei der der Locus das humane Äquivalent des Locus V&beta;8.1, V&beta;8.2, V&beta;8.3 oder V&beta;17a der Maus ist.

24. Pharmazeutische Zusammensetzung nach jeglichem der Ansprüche 19 bis 23, bei der die Autoimmunerkrankung die Zerstörung von Gliazellen und/oder von Myelin umfaßt.

25. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 24, bei der die Autoimmunerkrankung Multiple Sklerose ist.

26. Pharmazeutische Zusammensetzung nach jeglichem der Ansprüche 19 bis 21, bei der die Autoimmunerkrankung rheumatoide Arthritis, systemischer Lupus erythematosus, Psoriasis, Pemphigus vulgaris, juveniler Diabetes, Sjögren-Syndrom, Thyreoiditis, Hashimoto's-Thyreoiditis oder Myasthenia gravis ist.

27. Pharmazeutische Zusammensetzung zur Hemmung von durch Lymphozyten gesteuerten Angriffen auf humane syngene Zellen, die mit einer Autoimmunerkrankung assoziiert sind, enthaltend ein Peptid nach jeglichem der Ansprüche 11 bis 18 vermischt mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger.

28. Monoklonaler Antikörper mit Spezifität für eine Aminosäure- Sequenz, die von einem Locus für eine variable Region eines T-Zell-Rezeptors kodiert wird, die mit einer Autoimmunerkrankung assoziiert ist, zur Verwendung als Arzneimittel.

29. Verwendung eines monoklonalen Antikörpers mit Spezifität für eine Aminosäure-Sequenz, die von einem Locus für eine variable Region eines T-Zell-Rezeptors kodiert wird, die mit einer Autoimmunerkrankung assoziiert ist, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer Autoimmunerkrankung.

30. Verwendung eines monoklonalen Antikörpers nach Anspruch 29, bei der die Autoimmunerkrankung die Zerstörung von Gliazellen und/oder von Myelin umfaßt.

31. Verwendung nach Anspruch 30, bei der die Autoimmunerkrankung Multiple Sklerose ist.

32. Verwendung eines monoklonalen Antikörpers nach Anspruch 29, bei der die Autoimmunerkrankung rheumatoide Arthritis, systemischer Lupus erythematosus, Psoriasis, Pemphigus vulgaris, juveniler Diabetes, Sjögren-Syndrom, Thyreoiditis, Hashimoto's-Thyreoiditis oder Myasthenia gravis ist.

33. Peptid nach jeglichem der Ansprüche 11 bis 18 zur Verwendung als Arzneimittel.

34. Verwendung eines Peptids nach jeglichem der Ansprüche 11 bis 18 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer Autoimmunerkrankung.

35. Verwendung nach Anspruch 34, bei der die Autoimmunerkrankung die Zerstörung von Gliazellen und/oder von Myelin umfaßt.

36. Verwendung eines Peptids nach Anspruch 35, bei der die Autoimmunerkrankung Multiple Sklerose ist.

37. Verwendung nach Anspruch 34, bei der die Autoimmunerkrankung rheumatoide Arthritis, systemischer Lupus erythematosus, Psoriasis, Pemphigus vulgaris, juveniler Diabetes, Sjögren- Syndrom, Thyreoiditis, Hashimoto's-Thyreoiditis oder Myasthenia gravis ist.

38. Anti-idiotypischer Antikörper gegen ein Peptid nach jeglichem der Ansprüche 11 bis 18.