DE69828791T2

DE69828791T2 - Das antigen ha-1

Info

Publication number: DE69828791T2
Application number: DE69828791T
Authority: DE
Inventors: Afra Elsa GOULMY; Frederick Donald HUNT; Henry Victor ENGELHARD
Original assignee: Universiteit Leiden
Current assignee: Universiteit Leiden
Priority date: 1997-07-23
Filing date: 1998-07-23
Publication date: 2006-01-12
Anticipated expiration: 2018-07-24
Also published as: CA2298887A1; WO1999005174A1; AU8564098A; US7205119B2; ES2236924T3; AU8563998A; US20040191268A1; EP0996636A1; JP2001510851A; PT996636E; EP0996636B1; ATE287900T1; DE69828791D1; US20080206268A1; AU756962B2; US6878375B1; WO1999005173A1; DK0996636T3

Description

Die Erfindung betrifft das Gebiet der Immunologie, insbesondere das Gebiet der zellulären Immunologie.
Knochenmarkstransplantation (BMT), eines der Gebiete, mit denen sich die Erfindung beschäftigt, und das Gebiet, aus dem die vorliegende Erfindung stammt, findet ihre Anwendung bei der Behandlung zum Beispiel von schwerer aplastischer Anämie, Leukämie und Immunschwächekrankheiten.
In der Frühzeit dieser Technik versagten viele Transplantate durch Abstoßung des Transplantats durch den Empfänger. Erfolgreiche Transplantate führten jedoch häufig zu einer Immunantwort durch im Transplantat vorhandene Lymphocyten gegen verschiedene Gewebe des Empfängers (Graft-versus-Host-Reaktion (GvHD)). Es ist jetzt bekannt, dass die GvHD-Reaktion hauptsächlich auf die Anwesenheit von Haupthistokompatibilitätsantigenen (H) zurückzuführen ist, die eine Transplantationsbarriere darstellen. Daher ist es jetzt Routine, nur HLAübereinstimmende Materialien (entweder von Geschwistern oder von nicht verwandten Individuen) zu verpflanzen, was zu einer stark verbesserten Erfolgsrate bei der Knochenmarkstransplantation führt. Trotz dieser Verbesserung sowie Verbesserungen in der Prätransplantations-Chemotherapie oder -Radiotherapie und der Verfügbarkeit von starken immunsuppressiven Wirkstoffen leiden jedoch immer noch etwa 20-70% der behandelten Patienten an GvHD (der Prozentsatz hängt vom Alter und vom Knochenmarkspender ab). Um GvHD zu vermeiden, wurde vorgeschlagen, die Zellen (reife T-Zellen), die diese Reaktion verursachen, aus dem Transplantat zu entfernen. Dies führt jedoch häufig zu einem Versagen des Transplantats oder zu einem Rezidiv der ursprünglichen Krankheit. Die für GvHD verantwortlichen Zellen sind auch die Zellen, die häufig zum Beispiel bei Leukämie gegen die ursprünglichen aberrierenden Zellen reagieren (Graft-versus-Leukämie-Reaktion).
Da BMT heutzutage hauptsächlich mit HLA-übereinstimmenden Transplantaten durchgeführt wird, muss die GvHD, die immer noch auftritt, durch eine andere Gruppe von Antigenen verursacht sein. Es ist sehr wahrscheinlich, dass die Gruppe der sogenannten Neben-H-Antigene (mHag), die (im Unterschied zu den Haupt-H-Antigenen) nicht vom MHC codiert werden, wenigstens teilweise für die restlichen Fälle von GvHD verantwortlich sind. mHag wurden ursprünglich in kongenen Stämmen von Mäusen bei Tumorabstoßungs- und Hautabstoßungsstudien entdeckt. Bei Mäusen hat die Verwendung von ingezüchteten Stämmen gezeigt, dass mHag von fast 50 verschiedenen allelisch polymorphen Loci codiert werden, die über das gesamte Genom verstreut sind. Obwohl mHag bei Menschen nur mühsam zu identifizieren sind, wurde ihre Existenz bestätigt, doch ihre Gesamtzahl und Komplexität bleibt ungewiss. Neben-H-Antigene sind höchstwahrscheinlich ganz verschieden voneinander und ganz verschieden von Haupt-H-Antigenen; sie sind wahrscheinlich eine schwer fassbare Gruppe von vielfältigen Fragmenten von Molekülen, die bei verschiedenen zellulären konstitutiven Funktionen beteiligt sind. Ihre Antigenität kann in sehr zufälliger Weise als natürlicherweise prozessierte Fragmente von polymorphen Proteinen, die mit MHC-Produkten vergesellschaftet sind, auftreten. Einige der mH-Antigene scheinen verbreitet auf verschiedenen Geweben im ganzen Körper exprimiert zu werden, während andere eine beschränkte Gewebeverteilung zeigen.
Eines der besser bekannten Nebenhistokompatibilitätsantigene ist das H-Y-Antigen. H-Y ist ein mH-Antigen, das zur Abstoßung von HLA-übereinstimmenden männlichen Organ- und Knochenmarkstransplantaten durch weibliche Empfänger und zu einer größeren Häufigkeit von GvHD bei Männern, denen ein Transplantat von einer Frau eingepflanzt wird, insbesondere wenn der weibliche Spender vorher schwanger war, führen kann. Das H-Y-Antigen kann auch eine Rolle bei der Spermatogenese spielen. Das humane H-Y-Antigen ist ein Peptid mit 11 Aminosäureresten, das von SMCY, einem in der Evolution konservierten Protein des Y-Chromosoms, stammt. Ein anderes wohlbekanntes mH-Antigen, das zu GvHD führen kann, ist das HA-2-Antigen. Das humane HA-2-Antigen ist ein Peptid mit 9 Aminosäureresten, das wahrscheinlich von einem Klasse-I-Myosin abgeleitet ist. Die Natur des HA-1-Antigens, das für eine größere Zahl von derzeitigen Fällen von GvHD verantwortlich ist, hat sich jedoch bisher der Aufklärung entzogen. Humane Knochenmarkstransplantationen, die als therapeutische Behandlung von schwerer aplastischer Anämie, Leukämie und Immunschwächekrankheiten durchgeführt wird, wurde in den 70er Jahren verfügbar. Inzwischen haben sich die langfristigen Ergebnisse bei allogener Knochenmarkstransplantation (BMT) aufgrund der Verwendung von HLA-übereinstimmenden Geschwistern als Knochenmarkspender, fortschrittlicher Prätransplantations-Chemotherapie, der Verwendung von starken immunsuppressiven Wirkstoffen als Prophylaxe für die Graft-versus-Host-Reaktion (GvHD), besserer Antibiotika und Isolierungsverfahren stark verbessert. Dennoch zeigen die Ergebnisse von klinischen BMT, dass die Auswahl von MHC-identischen Spendern/Empfängern keine Garantie für die Vermeidung von GvHD oder ein krankheitsfreies Überleben ist, selbst wenn Spender und Empfänger nahe verwandt sind. Allogene BMT, insbesondere bei Erwachsenen, führt je nach dem Ausmaß der T-Zell-Abreicherung des Transplantats bei bis zu 80% der Fälle zu GvHD. Im Fall eines identischen HLA-Genotyps beträgt die Häufigkeit 15-35%, während die Häufigkeit von GvHD bei den Empfänger/Spender-Kombinationen mit übereinstimmendem HLA-Phänotyp erheblich höher ist, d.h. 50-80%. Abweichungen in den Nebenhistokompatibilitätsantigenen (mHag) zwischen Spender und Empfänger bilden ein potentielles Risiko in Bezug auf GvHD oder Versagen des Transplantats und erfordern eine lebenslange pharmakologische Immunsuppression bei Empfängern von Organ- und Knochenmarkstransplantaten. Man vermutet auch, dass mHag an der "günstigen" Nebenwirkung der GvHD, d.h. der Graft-versus-Leukämie-Aktivität, beteiligt sind. In mehreren Berichten wurde die Anwesenheit von Anti-Empfänger-mHag-spezifischen CTL bei Patienten nachgewiesen, die nach einer BMT mit identischen HLA-Genotypen an GvHD litten.
In unserem Labor haben wir uns sehr bemüht, eine (kleine) Anzahl von Anti-Empfänger-mHag-spezifischen CTL näher zu charakterisieren. Dazu wurden CTL-Klone, die spezifisch für Empfänger-mHag waren, aus dem peripheren Blut (PBL) von Patienten isoliert, die an schwerer GvHD leiden. mHag-HA-1-spezifische CD8-positive CTL-Klone wurden ursprünglich nach der Restimulation von in vivo aktivierten PBLs aus drei Patienten erhalten, die nach einer BMT mit identischem HLA, aber nicht identischem mHag an GvHD litten. Die Post-BMT-CTL-Linien wurden durch Endpunktverdünnung kloniert, was zur Isolierung einer großen Zahl von mHag-spezifischen CTL-Klonen führte. Anschließende immungenetische Analysen zeigten, dass die CTL-Klone (wie sie oben beschrieben wurden) fünf nicht geschlechtsgekoppelte mHag identifizierten, die als HA-1, -2, -3, -4 und -5 bezeichnet wurden und die in klassischer MHC-restringierter Weise erkannt werden. mHag HA-3 wird in Gegenwart von HLA-A1 erkannt, und mHag HA-1, -2, -4 und -5 erfordern die Anwesenheit von HLA-A2. Segregationsstudien zeigten, dass die mHag HA-1 bis HA-5 jeweils das Produkt eines einzelnen Gens sind, das in Mendelscher Weise aufspaltet, und dass HA-1 und HA-2 nicht innerhalb des HLA-Bereichs codiert sind. Die mHag unterscheiden sich voneinander in den Phänotyphäufigkeiten: Das mHag HA-1 erschien relativ häufig (d.h. 69%), während das mHag HA-2 in der HLA-A2-positiven gesunden Population sehr häufig (d.h. 95%) erschien. Eine Bestandsaufnahme von mHag-HA-1-, -2-, -3-, -4- und -5-spezifischen Anti-Empfänger-CTL-Reaktionen bei fünf Patienten nach einer BMT ergab bei 3 Patienten für das mHag HA-1 spezifische Klone. Diese Beobachtung deutet auf das immundominante Verhalten des mHag HA-1 hin. In Bezug auf die Expression von mHag auf verschiedenen Geweben beobachteten wir eine ubiquitäre bzw. restringierte Gewebeverteilung der analysierten mHag. Die Expression des mHag HA-1 ist auf die Zellen des blutbildenden Zellstammbaums, wie Thymocyten, Lymphocyten des peripheren Bluts, B-Zellen und Monocyten, beschränkt. Das mHag HA-1 wird auch von den aus dem Knochenmark stammenden professionellen antigenpräsentierenden Zellen exprimiert: den dendritischen Zellen und den epidermalen Langerhans-Zellen. Das mHag HA-1 wird auch auf klonogenen leukämischen Vorläuferzellen sowie auf frisch isolierten Myeloid- und Lymphoid-Leukämiezellen exprimiert, was darauf hinweist, dass mHag-spezifische CTLs zu einer HLA-Klasse-I-restringierten antigenspezifischen Lyse von leukämischen Zellen befähigt sind. Um die Bedeutung der humanen mH-Antigensysteme zu untermauern, untersuchten wir, ob die mHag in der Evolution zwischen humanen und nichthumanen Primaten konserviert sind. Dazu wurden Zellen von nichthumanen Primaten mit dem humanen HLAA2.1-Gen transfiziert. Anschließende Analysen mit unserem humanen Allo-HLA-A2.1 und vier mHag-A2.1-restringierten CTL-Klonen ergaben die Präsentation von Menschenaffen- und Nichtmenschenaffen-Allo- und mHag-HY-, -HA-1- und -HA-2-Peptiden im Kontext des transfizierten humanen HLA-A2.1-Moleküls durch Menschenaffen- und Nichtmenschenaffen-Targetzellen. Dies impliziert, dass das HA-1-Peptid wenigstens 35 Millionen Jahre lang konserviert wurde. Eine prospektive Studie wurde durchgeführt, um die Wirkung von mHag bei BMT mit identischen HLA-Genotypen auf die Häufigkeit von akuter (Grad ≥ 2) GvHD und ihre klinische Relevanz zu dokumentieren. Die Ergebnisse der mHag-Typbestimmung unter Verwendung der CTL-Klone, die spezifisch für fünf wohldefinierte mHag HA-1 bis HA-5 waren, zeigten eine signifikante Korrelation zwischen einer fehlenden Übereinstimmung in den mHag HA-1, -2, -4 und -5 und GvHD. Eine signifikante Korrelation (p = 0,024) mit der Entwicklung von GvHD wurde beobachtet, wenn nur auf das mHag HA-1 analysiert wurde. Um die mutmaßliche peptidische Natur des mHag HA-1 zu analysieren, analysierten wir die Notwendigkeit von MHC-codierten TAP1- und TAP2-Genprodukten für eine mHag-Peptid-Präsentation auf der Zelloberfläche. Die Transportergene TAP1 und TAP2, die mit der Antigenpräsentation assoziiert sind, sind für die Abgabe von Peptiden aus dem Cytosol mit dem Endoplasmatischen Retikulum erforderlich. Die Verfügbarkeit einer humanen Zelllinie "T2", der sowohl Transport- als auch Proteasom-Untereinheit-Gene fehlen, ermöglichte es uns, die Prozessierung und Präsentation von humanem mHag zu untersuchen. Wir zeigten, dass die (Ratten-)Transportgenprodukte TAP1 und TAP2u für die Prozessierung und Präsentation von antigenen Peptiden aus dem intrazellulären mH-Protein HA-1 erforderlich sind. Informationen über das TCR-Repertoire nach einer BMT beim Menschen gibt es extrem wenig. Wir analysierten die Zusammensetzung des T-Zell-Rezeptor-(TCR)-V-Bereichs von mHag-HA-1-spezifischen CD8-positiven CTL- Klonen durch DNA-Sequenzierung der α- und β-Ketten. Durch Analysieren der TCR-Verwendung von 12 Klonen, die von 3 nicht verwandten Individuen stammten, beobachteten wir, dass die TCRβ-Ketten alle das TCRβV6S9-Gensegment verwendeten und bemerkenswerte Ähnlichkeiten innerhalb der N-D-N-Bereiche zeigten.
Bis zur vorliegenden Erfindung ist es jedoch niemandem gelungen, Aminosäuresequenzen von antigenen Peptiden zu identifizieren, die für das mHag-HA-1-Antigen relevant sind, noch ist es jemandem gelungen, die Proteine zu identifizieren, von denen dieses Antigen abgeleitet ist. Wir haben jetzt zum ersten Mal ein Peptid identifiziert, das ein relevanter Bestandteil des mHag HA-1 ist.
Diese Erfindung stellt also ein (Poly)Peptid bereit, das ein T-Zell-Epitop umfasst, welches aus dem Nebenhistokompatibilitätsantigen HA-1 erhältlich ist und die Sequenz VLXDDLLEA umfasst, wobei X einen Histidinrest (H) darstellt.
Wie diese Sequenzen erhalten werden, ist im experimentellen Teil beschrieben. Ein wichtiger Bestandteil dieses neuen Verfahrens, um zu diesen Sequenzen zu gelangen, ist die Reinigung und die Wahl des Ausgangsmaterials. Das Verfahren ist daher ebenfalls Bestandteil des Umfangs dieser Erfindung. Jetzt, wo die Sequenz bekannt ist, ist es jedoch selbstverständlich nicht mehr notwendig, dieses Verfahren zu befolgen, da die Peptide leicht synthetisch hergestellt werden können, wie in der Technik wohlbekannt ist.
Die Erfindung stellt ein (Poly)Peptid bereit, das im Kontext des HLA-A2.1-Moleküls dem Immunsystem funktionelle präsentiert werden kann. Im Allgemeinen variiert die Länge von Peptiden, die in einem solchen Kontext präsentiert werden, von etwa 7 bis etwa 15 Aminosäureresten, und ein Polypeptid kann enzymatisch zu einem Peptid dieser Länge prozessiert werden. Ein von der Erfindung bereitgestelltes Peptid hat typischerweise eine Länge von wenigstens 7 Aminosäuren, aber vorzugsweise wenigstens 8 oder 9 Aminosäuren. Die größte Länge eines von der Erfindung bereitgestellten Peptids beträgt nicht mehr als 15 Aminosäuren, aber vorzugsweise nicht mehr als etwa 13 oder 11 Aminosäuren.
Ein von der Erfindung bereitgestelltes Peptid enthält die notwendigen Ankerreste für eine Präsentation in der Furche des HLA-A2.1-Moleküls. Ein von der Erfindung bereitgestelltes immunogenes Polypeptid umfasst ein 7-15 Aminosäuren langes von der Erfindung bereitgestelltes Peptid, das gegebenenfalls von geeigneten Enzymspaltungsstellen flankiert ist, die die Verarbeitung des Polypeptids ermöglichen.
Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Peptid mit der Sequenz VLHDDLLEA, das die Lyse der Zelle induziert, die es in einer sehr geringen Konzentration an vorhandenem Peptid präsentiert. Dies impliziert nicht, dass Peptide, die die Lyse bei höheren Konzentrationen induzieren, nicht geeignet sind. Dies hängt großenteils von der Anwendung und von anderen Eigenschaften der Peptide ab, die nicht alle im Rahmen der vorliegenden Erfindung getestet werden konnten. Die Peptide und anderen Moleküle gemäß der Erfindung finden insofern eine Verwendung, als sie verwendet werden können, um eine Toleranz des Spenderimmunsystems bei HA-1-negativen Spendern zu induzieren, so dass restliche Lymphocyten des peripheren Bluts in dem schließlich transplantierten Organ oder dem Knochenmark, je nachdem, nicht auf Empfänger-HA-1-Material bei einem HA-1-positiven Empfänger reagieren. Auf diese Weise wird GvHD verhindert oder abgeschwächt. Andererseits kann eine Toleranz bei HA-1-negativen Empfängern grundsätzlich genauso induziert werden, so dass nach Empfang eines Organs oder Knochenmarks von einem HA-1-positiven Spender keine Abstoßung auf der Basis des HA-1-Materials erfolgt. Zur Induktion der Toleranz können sehr geringe Dosen wiederholt gegeben werden, zum Beispiel intravenös, aber andere Verabreichungswege können sehr wohl ebenfalls geeignet sein. Eine weitere Möglichkeit ist die wiederholte orale Verabreichung von hohen Dosen der Peptide. Die Peptide können allein oder in Kombination mit anderen Peptiden oder als Bestandteil von größeren Molekülen oder gekoppelt an Trägermaterialien in allen geeigneten Trägersubstanzen verabreicht werden. Weitere Anwendungen des Peptids liegen in der prophylaktischen Verabreichung desselben an Individuen, die ein Transplantat erhalten haben, zur Verhinderung von GvHD. Dies kann entweder mit Agonisten, möglicherweise in Kombination mit einem Adjuvans, oder mit Antagonisten, die die verantwortlichen Zellen blockieren können, erfolgen. Dies kann mit oder ohne die gleichzeitige Verabreichung von Peptidsequenzen, die von TCR abgeleitet sind, oder von Cytokinen erfolgen. Weiterhin können die Peptide gemäß der Erfindung verwendet werden, um therapeutische Agentien herzustellen, die in der Lage sind, eine Untergruppe von Zellen, insbesondere Zellen mit hämatopoetischem Ursprung, direkt oder indirekt zu eliminieren. Dies kann durch die folgenden Beispiele veranschaulicht werden, die sich auf Therapeutika im Zusammenhang mit Leukämie beziehen.
Ein HA-1-positiver Empfänger (bei einer Knochenmarkstransplantation) kann einer zusätzlichen Konditionierungsbehandlung vor der Knochenmarkstransplantation unterzogen werden. Dies bedeutet, dass ein Mittel, das ein Peptid gemäß der Erfindung (ein HA-1-Peptid) spezifisch erkennt, wenn es selektiv auf hämatopoetischen Zellen präsentiert wird, dem Empfänger vor der Transplantation verabreicht wird, wobei dieses Mittel die Eliminierung der Zellen, die das Peptid präsentieren, induziert. Dieses Mittel eliminiert alle restlichen Zellen (leukämischen Zellen) hämatopoetischen Ursprungs. Zu diesen Mitteln gehören unter anderem T-Zellen (die ex vivo durch Pulsen mit den von der Erfindung bereitgestellten Peptiden maßgeschneidert werden und gegebenenfalls mit einem Suizid-Gen versehen sind) und/oder Antikörper, die an toxische Struktureinheiten gekoppelt sind.
Ein HA-1-negativer Spender für eine Knochenmarkstransplantation kann mit einem Peptid gemäß der Erfindung, einem HA-1-Peptid, geimpft werden. Nach der Transplantation an einen HA-1-positiven Empfänger kann das Immunsystem des Spenders alle restlichen oder rezidivierenden HA-1-Peptid-präsentierenden Zellen im Empfänger, die selbstverständlich leukämisch sind, eliminieren. Dies ist ein weiteres Beispiel für eine maßgeschneiderte Immuntherapie, die von der Erfindung zur Verfügung gestellt wird.
Ein HA-1-positiver Empfänger, dem HA-1-negatives (oder auch HA-1-positives) Knochenmark transplantiert wurde und der unter einer rezidivierenden Krankheit (Rückfall), d.h. HA-1-positiven leukämischen Zellen leidet, kann (wieder) mit einem Mittel (wie oben) behandelt werden, das ein Peptid gemäß der Erfindung (ein HA-1-Peptid) spezifisch erkennt, wenn es selektiv auf hämatopoetischen Zellen präsentiert wird, wobei dieses Mittel die Eliminierung der Zellen, die das Peptid präsentieren, induziert. Im Falle von HA-1-positivem Knochenmark, das einem HA-1-positiven Empfänger transplantiert wird, ist es noch wesentlich (im Falle einer rezidivierenden Krankheit), alle HA-1-positiven Zellen zu eliminieren, obwohl dies das transplantierte Material beinhaltet, da die HA-1-positive Leukämie sonst den Empfänger tötet. Um den letzteren Fall zu vermeiden kann der Patient gegebenenfalls erneut eine Transplantation erhalten. Bei solchen Therapieanweisungen ist es möglich, zuerst eine passive Immuntherapie mit Agentien (Zellen, Antikörpern usw.) einzusetzen, die spezifische peptidexprimierende Zellen (z.B. leukämische Zellen), die zerstört werden müssen, spezifisch erkennen und eliminieren, und danach wird der Patient in einer zweiten Phase mit BMT-Zellen rekonstituiert, die die abgetöteten Zellen ersetzen. Die Erfindung stellt also zusätzliche (oder sogar ersetzende) Vorschriften zu anderen therapeutischen Maßnahmen, wie Bestrahlung, bereit.
Zu den weiteren therapeutischen Anwendungen des Peptids gehören die Induktion von Toleranz gegenüber HA-1-Proteinen bei (Auto)Immunkrankheiten, die mit HA-1 zusammenhängen. Andererseits können sie in Impfstoffen bei (Auto)-Immunkrankheiten, die mit HA-1 zusammenhängen, verwendet werden.
Diagnostische Anwendungen liegen eindeutig im Rahmen des fachlichen Könnens. Sie umfassen unter anderem die HA-1-Typbestimmung, den Nachweis von genetischen Aberrationen und dergleichen. Spezifische Gensequenzen können mit verschiedenen Verfahren, die in der Technik bekannt sind, nachgewiesen werden, wie Hybridisierung oder Amplifikation mit PCR und dergleichen. Der immunologische Nachweis von Peptiden wird ebenfalls verbreitet praktiziert.
Auf der Basis des hier beschriebenen Peptids können genetische Sonden oder Primer hergestellt werden, die verwendet werden können, um ein Screening nach dem das Protein codierenden Gen durchzuführen. Andererseits sind solche Sonden auch für Nachweiskits geeignet. Auf der Basis des hier beschriebenen Peptids werden antiidiotypische B-Zellen und/oder T-Zellen und Antikörper erzeugt. Verschiedene Techniken, die den Nachweis von geeigneten Spendern oder Empfängern ermöglichen und auf der Amplifikation von mit HA-1 zusammenhängenden Nucleinsäuresequenzen oder auf dem immunologischen Nachweis von mit HA-1 zusammenhängenden Peptidsequenzen beruhen, können verwendet werden. Geeignete Amplifikations- oder Nachweistechniken sind in der Technik bekannt, und die Erfindung ermöglicht die Herstellung von diagnostischen Testkits für die Bestimmung und Typbestimmung von HA-1-Allelen. Das mit GvHD assoziierte mH-Antigen HA-1 ist ein Peptid, das von einem Proteinallel eines diallelischen genetischen Systems abgeleitet ist. Die Identifizierung dieses mH-Antigens HA-1 ermöglicht die prospektive HA-1-Typbestimmung von BMT-Spendern und -Empfängern zur Verbesserung der Spenderauswahl und dadurch zur Verhinderung einer GvHD-Induktion. Alle diese Ausführungsformen wurden durch die vorliegende Offenbarung ermöglicht und sind daher Bestandteil der vorliegenden Erfindung. Die Techniken zur Herstellung dieser Ausführungsformen liegen alle im Rahmen des fachlichen Könnens.
Weiterhin ermöglicht die Identifizierung des HA-1-Antigens die Herstellung von synthetischen HA-1-Peptiden. Das HA-1-Peptid wird verwendet, um eine Toleranz im lebenden Knochenmark oder Organ (Niere, Leber, Darm, Haut usw.) von HA-1-negativen Spendern gegenüber HA-1-positiven Patienten zu induzieren. Bei einer Knochenmarkstransplantation wird das Peptid (allein oder in Kombination mit anderen verabreicht) verwendet, um eine Toleranz im lebenden Knochenmarkspender zu induzieren. Das oder die Peptide können oral, intravenös, intraokular, intranasal oder in sonstiger Weise verabreicht werden. Bei allen Formen der Organ-, Gewebe- und Knochenmarkstransplantation wird das HA-1-Peptid verwendet, um eine Toleranz bei HA-1-negativen Empfängern zu induzieren.
Die Dosisbereiche für die Peptide und Antikörper gemäß der Erfindung, die bei den hier beschriebenen therapeutischen Anwendungen verwendet werden sollen, werden auf der Basis von Studien mit steigenden Dosen in der Klinik in klinischen Versuchen, für die es strenge Vorschriften gibt, festgelegt.
Ein wichtiger Vorteil der Verwendung von mHag-spezifischen CTLs bei der passiven Immuntherapie zum Beispiel von Leukämie liegt in ihrer eingeschränkten und spezifischen Schädigung der Targetzellen. Wir ziehen Vorteil aus drei der bekannten Merkmale von humanen mHag, d.h. 1) der MHC-restringierten Erkennung durch T-Zellen, 2) der variablen Phänotyp-Häufigkeiten, d.h. mHag-Polymorphismus, und 3) der eingeschränkten Gewebeverteilung, die eine spezifische und gezielte Zielsteuerung bei einer mit mHag HA-1 zusammenhängenden Therapie ermöglicht. Die restriktive HA-1-Gewebeexpression erhöht den Erfolg einer passiven Immuntherapie von verschiedenen Typen von Krebs, wie Zellen des kleinzelligen Lungenkarzinoms, die ebenfalls das HA-1-Antigen exprimieren, erheblich. Da mHag außerdem eindeutig auf zirkulierenden leukämischen Zellen und klonogenen leukämischen Vorläuferzellen sowohl myeloiden als auch lymphoiden Ursprungs exprimiert werden, können beide Typen von Leukämien gezielt angesteuert werden. mHag-Peptid-CTLs können ex vivo aus mHag-negativen BM-Spendern für mHag-positive Patienten erzeugt werden. Peptidspezifische CTL-Klone von einem HLA-A1-positiven, mHag-negativen gesunden Blutspender werden erzeugt, indem man autologe APCs mit einem synthetischen Peptid pulst, das mit mHag HA-1 zusammenhängt. Proliferierende Klone werden expandiert und auf spezifische cytotoxische Aktivität getestet. Nach der Transfusion (entweder vor der BMT als Teil der Konditionierungsbehandlung oder nach der BMT als Begleittherapie) eliminieren die mHag-Peptid-spezifischen CTLs die leukämischen Zellen des mHag-positiven Patienten und, wenn sie von dem Patienten stammen, auch die hämatopoetischen Zellen des Patienten, verschonen jedoch die nichthämatopoetischen Zellen des Patienten. Falls notwendig, stellt eine anschließende BMT von einem mHag-negativen Spender das blutbildende System des Patienten wieder her. Ein universeller Ansatz besteht darin, "vorgefertigte" mHag-Peptid-spezifische CTLs zu erzeugen, aber mHag-negative gesunde Blutspender mit häufigen HLA-homozygoten Haplotypen zu verwenden. Patienten, die mHag-positiv sind (und deren BM-Spender mHag-negativ sind) und die mit dem HLA-Typ des CTL-Spenders übereinstimmen, können mit diesen "gebrauchsfertigen" allopeptidspezifischen CTLs behandelt werden. Die Transduktion dieser CTLs mit einem Suizid-Gen ermöglicht die Eliminierung der CTLs, falls nachteilige Wirkungen auftreten. Zur Veranschaulichung sind auch unten im experimentellen Teil mehrere Verfahren und Anwendungen angegeben.
Experimenteller Teil
Graft-versus-Host-Reaktion (GvHD) ist eine häufige und lebensbedrohliche Komplikation nach einer allogenen HLA-identischen Knochenmarkstransplantation (BMT). Empfänger von HLA-identischem Knochenmark entwickeln akute oder chronische Graft-versus-Host-Reaktion in 36% bzw. 49% der Fälle^1,2. Abweichungen in Genen, die von denen des MHC verschieden sind und die als Nebenhistokompatibilitäts-(mH)-Antigene bezeichnet werden, sind eindeutig an der Entwicklung von GvHD nach einer HLA-identischen BMT beteiligt. Eine neuere retrospektive Analyse zeigte die signifikante Assoziation zwischen einer fehlenden Übereinstimmung im mH-Antigen HA-1 und der Induktion von GvHD nach einer HLA-identischen BMT³. Nebenhistokompatibilitätsantigene werden von MHC-restringierten T-Zellen erkannt, und es wurde gezeigt, dass es sich um Peptide handelt, die von intrazellulären Proteinen abgeleitet sind, welche von MHC-Molekülen präsentiert werden^4,6. Hier berichten wir über die erste Identifizierung eines polymorphen Gens, das ein humanes mH-Antigen codiert. Das mit GvHD assoziierte mH-Antigen HA-1 ist ein Nonapeptid, das von dem diallelischen KIAA0223-Gen abgeleitet ist. Das HA-1-allelische Gegenstück, das vom KIAA0223-Gen codiert wird, unterscheidet sich nur in einer Aminosäure vom mH-Antigen HA-1. Familienstudien zeigten eine exakte Korrelation zwischen dem KIAA0223-Gen-Polymorphismus und dem HA-1-Phänotyp, wie zuvor anhand der Erkennung durch die HA-1-spezifischen CTL-Klone bestimmt wurde. Die Aufklärung des HA-1-codierenden Gens ermöglicht eine prospektive HA-1-DNA-Typbestimmung von BMT-Spendern und -Empfängern zur Verbesserung der Spenderauswahl und Verhinderung von GvHD.
Cytotoxische T-Zell-Klone, die für das mH-Antigen HA-1 spezifisch sind, wurden aus drei verschiedenen Patienten mit schwerer GvHD isoliert⁷. Das mH-Antigen HA-1 wird im Kontext von HLA-A2.1 präsentiert und ist in 69% der HLA-A2.1-positiven Population vorhanden⁷. Es wurde gezeigt, dass die HA-1-Expression gewebespezifisch ist und auf Zellen hämatopoetischen Ursprungs einschließlich dendritischer Zellen, Langerhans-Zellen und leukämischer Zellen beschränkt ist^8-10. Eine Familienanalyse deutete auf die Mendelsche Vererbung von HA-1 und eine vom MHC-Komplex unabhängige Aufspaltung hin¹¹. Ein Vergleich der T-Zell-Rezeptor-(TCR)-Sequenzen von verschiedenen HA-1-spezifischen T-Zell-Klonen, die von verschiedenen Individuen abgeleitet sind, ergab eine konservierte Verwendung des TCR Vb6.9 sowie konservierte Aminosäuren im CDR3-Bereich¹². In einer retrospektiven Studie wurde die fehlende Übereinstimmung bei mehreren mH-Antigenen in Bezug auf die Assoziation mit GvHD nach HLA-identischer BMT bewertet. Eine einzige fehlende HA-1-Übereinstimmung zwischen Spender und Empfänger war signifikant mit der Induktion von GvHD nach HLA-identischer BMT korreliert³.
Um das mH-Antigen HA-1- zu identifizieren, wurden HLA-A2.1-Moleküle aus den zwei HA-1-exprimierenden EBV-transformierten B-Lymphoblastoid-Zelllinien (EBV-BLCL) Rp und Blk gereinigt. Die HLA-A2.1-gebundenen Peptide wurden durch Säurebehandlung isoliert, und eine Fraktionierung der Peptide wurde durch mehrere Durchläufe einer Umkehrphasen-HPLC durchgeführt. Die Fraktionen wurden auf ihre Fähigkeit analysiert, eine HA-1-spezifische Lyse zu induzieren, wobei man in einem ⁵¹Cr-Freisetzungsassay T2-Zellen als Targetzellen und einen HA-1-spezifischen CTL-Klon als Effektorzellen verwendete (1a). Fraktion 24 enthielt HA-1-Aktivität und wurde zweimal weiter mit Umkehrphasen-HPLC fraktioniert, wobei man einen anderen organischen Modifikator verwendete (1b, c). Fraktion 33 und 34 der dritten HPLC-Fraktionierung zeigten HA-1-Aktivität im ⁵¹Cr-Freisetzungsassay und wurden durch Tandem-Massenspektrometrie analysiert. Da in diesen Fraktionen über 100 verschiedene Peptide vorhanden waren, wurden etwa 40% der Fraktionen 33 und 34 mit einem direktgekoppelten Mikrokapillaren-Säulenausstrom-Verteiler chromato graphiert. Die Fraktionen wurden gleichzeitig durch Tandem-Massenspektrometrie und ⁵¹Cr-Freisetzungsassay analysiert (1d). Fünf Peptidspezies (bei m/z 550, 520, 513, 585 und 502) waren spezifisch in aktiven Fraktionen vorhanden und fehlten in Fraktionen ohne Aktivität im CML-Assay. Eine kollisionsaktivierte Dissoziationsanalyse des in Frage kommenden Peptids bei m/z 550 ergab die Sequenz YXTDRVMTV. X steht für Isoleucin oder Leucin, die mit dieser Art von Massenspektrometer nicht voneinander unterschieden werden können. Ein synthetisches Peptid mit dieser Sequenz war jedoch nicht in der Lage, das HA-1-Epitop zu rekonstituieren (Ergebnisse nicht gezeigt). Um zu bestimmen, welcher der vier übrigen Kandidaten das HA-1-Peptid war, wurde die zweite HA-1-Reinigung der EBV-BLCL Blk bewertet. Die HA-1-positive Peptidfraktion 33 der zweiten Umkehrphasen-HPLC-Fraktionierung wurde weiter durch Mikrokapillaren-HPLC mit einem dritten organischen Modifikator chromatographiert. In einem ⁵¹Cr-Freisetzungsassay wurde ein einzelner Peak rekonstituierender Aktivität beobachtet (Ergebnisse nicht gezeigt). Die Massenspektralanalyse dieser Fraktionen zeigte, dass nur der Peptidkandidat mit m/z 513 vorhanden war. Dieses Peptid wurde mit kollisionsaktivierter Dissoziationsanalyse analysiert und als VXHDDXXEA sequenziert (2a). Isoleucin- und Leucinvarianten des Peptids wurden synthetisiert und auf der Mikrokapillaren-HPLC-Säule laufen gelassen. Nur das Peptid VLHDDLLEA eluierte zusammen mit dem natürlich prozessierten Peptid 513 (Ergebnisse nicht gezeigt). Dann wurde synthetisches VLHDDLLEA in unterschiedlicher Konzentration zu einem CML-Assay mit 3 verschiedenen HA-1-spezifischen CTL-Klonen gegeben und zeigte eine Erkennung des Peptids durch alle drei Klone mit einer halbmaximalen Aktivität bei 150-200 pM für alle drei Klone (2b). Dadurch wurde bewiesen, dass das mH-Antigen HA-1 durch das Nonapeptid VLHDDLLEA repräsentiert wird.
Datenbankrecherchen, die durchgeführt wurden, um das HA-1 codierende Gen zu identifizieren, ergaben, dass das HA-1-Peptid VLHDLLEA in 8 von 9 Aminosäuren mit dem Peptid VLRDDLLEA aus der partiellen komplementären KIAA0223-DNA-(cDNA)-Sequenz identisch ist, die von der Zelllinie KG-1 der akuten myelogenen Leukämie abgeleitet ist. Da HA-1 eine Populationshäufigkeit von 69% hat, kamen wir zu dem Schluss, dass die VLRDDLLEA-Peptidsequenz das HA-1-allelische Gegenstück darstellen könnte, das in den übrigen 31% der Population vorhanden ist. Um diese Annahme weiterzuverfolgen, führten wir eine cDNA-Sequenzanalyse des mutmaßlichen HA-1-codierenden Bereichs von KIAA0223 in EBV-BLCL durch, der von einem angenommenen homozygot HA-1-positiven (vR), von einem angenommenen HA-1-negativen Individuum (DH) und von der KG-1-Zelllinie abgeleitet war (Tabelle 1). Der HA-1-codierende Bereich von KIAA0223 des HA-1+/+ Individuums (vR) wies zwei Nucleotidunterschiede gegenüber der KIAA0223-Sequenz in der Datenbank auf, was zur Aminosäuresequenz VLHDDLLEA führte (die als HA-1" bezeichnet wurde). Der HA-1-codierende Bereich von KIAA0223 des HA-1-/- Individuums (DH) zeigte 100% Homologie mit der beschriebenen KIAA0223-Sequenz (als HA-1^R bezeichnet). Die KG-1-Zelllinie exprimierte beide KIAA0223-Allele. Da KG-1 nicht das Restriktionsmolekül HLA-A2.1 exprimiert, das für die T-Zell-Erkennung notwendig ist, transfizierten wir KG-1 mit HLA-A2.1 und verwendeten diese Zellen als Targetzellen in einem ⁵¹Cr-Freisetzungsassay mit dem HA-1-spezifischen T-Zell-Klon als Effektorzellen. Gemäß den Ergebnissen der cDNA-Sequenzanalyse wurden die KG-1-Zellen vom HA-1-spezifischen T-Zell-Klon erkannt (Daten nicht gezeigt). Dieses Ergebnis ließ vermuten, dass das KIAA0223-Gen ein diallelisches System bildet, wovon das HA-1^H-Allel zu einer Erkennung durch die mH-Antigen-HA-1-spezifischen T-Zell-Klone führt. Zwei Familien, die zuvor einer HA-1-Typbestimmung mit HA-1-spezifischen CTL unterzogen wurden, wurden auf dem cDNA-Niveau auf ihren KIAA0223-Polymorphismus untersucht. Die Familienmitglieder der Familie 1 wurden einem Screening auf ihren KIAA0223-Sequenzpolymorphismus durch Sequenzieren des HA-1-codierenden Sequenzbereichs unterzogen. Alle HA-1-negativen Mitglieder wiesen die HA-1^R-Sequenz auf, während sich alle HA-1-positiven Mitglieder als heterozygot erwiesen und somit beide HA-1-Allele trugen (3a). Wir entwarfen anschließend HA-1-allelspezifische PCR-Primer, um eine andere Familie, bei der zuvor eine zelluläre Typbestimmung bezüglich HA-1 durchgeführt worden war, einem Screening zu unterziehen. Beide Eltern und ein Kind wurden als heterozygot bezüglich HA-1 bestimmt, zwei HA-1-negative Kinder wurden als homozygot bezüglich des HA-1^R-Allels bestimmt, und ein Kind wurde als homozygot bezüglich des HA-1^H-Allels bestimmt (3b). Das Screening zeigte bei beiden Familien eine exakte Korrelation des HA-1-Phänotyps, der anhand der Erkennung durch die HA-1-spezifischen T-Zell-Klone bestimmt wurde, und des KIAA0223-Gen-Polymorphismus.
Um definitiv zu beweisen, dass das KIAA0223-Gen das mH-Antigen HA-1 codiert, wurden der HA-1-codierende Sequenzbereich von KIAA0223 sowohl des HA-1^H-als auch des HA-1^R-Allels in einen eukaryontischen Expressionsvektor kloniert und in Kombination mit HLA-A2.1 transient in HA-1-negative HeLa-Zellen transfiziert. Die HA-1-spezifische T-Zell-Erkennung dieser transfizierten HeLa-Zellen wurde unter Verwendung eines TNFα-Freisetzungsassays bestimmt. Die HeLa-Zellen, die mit dem die HA-1^H-Sequenz enthaltenden Vektor transfiziert waren, wurden von zwei HA-1-spezifischen T-Zell-Klonen erkannt (3c). Dagegen führte eine Transfektion des die HA-1^R-Sequenz enthaltenden Vektors nicht zu einer Erkennung. Unsere Ergebnisse beweisen also eindeutig, dass das mH-Antigen HA-1 vom HA-1^H-Allel des KIAA0223-Gens codiert wird.
Rekonstitutions- und HLA-A2.1-Bindungsassays wurden durchgeführt, um die Kapazität des HA-1^R-Peptids VLRDDLLEA, an HLA-A2.1 zu binden und von den HA-1-spezifischen T-Zell-Klonen erkannt zu werden, zu bestimmen. Die Konzentration des HA-1^R-Peptids, die die Bindung eines fluoreszenten Standardpeptids an HLA-A2.1 um 50% hemmte (IC50), betrug 365 nM, was in den Bereich einer mäßigen Bindungsstärke fällt, während der IC50-Wert des HA-1^H-Peptids 30 nM betrug, was in den Bereich einer Bindung mit hoher Affinität fällt (4a)^13,14. Verschiedene Konzentrationen von VLRDDLLEA wurden in einem ⁵¹Cr-Freisetzungsassay mit drei HA-1-spezifischen T-Zell-Klonen getestet. Einer von drei getesteten Klonen (3HA15) zeigte eine Erkennung des HA-1^R-Peptids, aber nur bei einer 1000mal höheren Peptidkonzentration, als sie für die Erkennung des HA-1^H-Peptids notwendig ist (4b). Da die Bindungsaffinität der beiden Peptide an HLA-A2.1 sich nur um den Faktor 10 unterscheidet, kann geschlossen werden, dass alle T-Zell-Klone das HA-1^H-Peptid spezifisch erkennen.
Der 3HA15-T-Zell-Klon, der das HA-1^R-Peptid in hohen Konzentrationen erkennt, erkennt keine HA-1^R-homozygoten Individuen. Dies lässt vermuten, dass das VLRDDLLEA-Peptid von HLA-A2.1 nicht präsentiert wird oder unterhalb der Nachweisgrenze der T-Zelle präsentiert wird. Um zu bestimmen, ob das HA-1^R-Peptid VLRDDLLEA von HLA-A2.1 präsentiert wurde, wurden HLA-A2.1-gebundene Peptide von einer HA-1^R-homozygoten EBV-BLCL eluiert und mit Umkehrphasen-HPLC fraktioniert. Das synthetische HA-1-Peptid VLRDDLLEA wurde auf Umkehrphasen-HPLC laufen gelassen, um zu bestimmen, bei welcher Fraktion dieses Peptid eluiert wird. Die entsprechenden HPLC-Fraktionen, die von der HA-1^R-exprimierenden EBV-BLCL abgeleitet waren, wurden unter Verwendung von Massenspektrometrie analysiert. Die Anwesenheit des Peptids VLRDDLLEA konnte nicht nachgewiesen werden (Ergebnisse nicht gezeigt), was darauf hinweist, dass dieses Peptid von HLA-A2.1 auf der Zelloberfläche nicht oder nur in sehr geringen Mengen präsentiert wird. Dies ist höchstwahrscheinlich auf die 10mal niedrigere Bindungsaffinität des Peptids gegenüber HLA-A2.1 zurückzuführen. Das angenommene Fehlen des HA-1^R-Peptids in HLA-A2.1 weist darauf hin, dass dieses Allel als Nullallel in Bezug auf die T-Zell-Reaktivität angesehen werden muss. Dies impliziert, dass nur BMT in der Richtung von einem HA-1^R/R (HA-1-negativen) Spender zu einem HA-1^H/H oder HA-1^R/H(HA-1-positiven) Empfänger und nicht umgekehrt erheblich mit GvHD assoziiert wäre. Dies wird in einer retrospektiven Studie, bei der der HA-1-Typ von HLA-2.1-positiven BMT-Paaren bestimmt wurde, tatsächlich beobachtet³. Jedoch können von HA-1^R abgeleitete Peptide an andere HLA-Allele binden und möglicherweise von T-Zellen erkannt werden. Wenn die letzteren Peptide vom HA-1^H-Allel nicht erzeugt und präsentiert werden, kann eine T-Zell-Reaktivität gegenüber dem HA-1^R-Allel ins Auge gefasst werden, und eine GvHD in dieser Richtung kann auftreten.
Bisher wurden nur wenige murine und humane mH-Antigene auf dem Peptid- und Genniveau identifiziert. Zwei murine mH-Antigene werden von Mitochondrien-Proteinen codiert, was zu vier bzw. zwei Allelen führt^15-17. Außerdem wurde von zwei murinen H-Y-mH-Antigenen gezeigt, dass es sich um Peptide handelt, die von Genen auf dem Y-Chromosom codiert werden^18-21. Das humane SMCY- Gen, das sich auf dem Y-Chromosom befindet, codiert die HLA-B7- und die HLA-A2.1-restringierten H-Y-mH-Antigene^5,6. Von den humanen nicht geschlechtsgekoppelten mH-Antigenen wurde nur das mH-Antigen HA-2 auf dem Peptidniveau sequenziert, aber das HA-2-codierende Gen blieb unbekannt⁴. Die Identifizierung des Gens, das das mH-Antigen HA-1 codiert, ist der erste Beweis dafür, dass humane mH-Antigene von polymorphen Genen abgeleitet sind. Das HA-1-codierende KIAA0223-Gen hat zwei Allele, die sich in zwei Nucleotiden unterscheiden, welche zu einem einzigen Aminosäureunterschied führen. Da das KIAA0223-Gen jedoch noch nicht vollständig sequenziert wurde, bleibt noch festzustellen, ob zusätzliche Aminosäurepolymorphismen zwischen den beiden Allelen dieses Gens vorhanden sind.
Da das HA-1-mH-Antigen das einzige bekannte humane mH-Antigen ist, das mit der Entwicklung von GvHD nach einer BMT korreliert ist, sind die Ergebnisse unserer Studie von erheblicher klinischer Relevanz³. Obwohl die Zahl der verschiedenen humanen mH-Antigene wahrscheinlich groß ist, wird davon ausgegangen, dass nur wenige immundominante mH-Antigene für die GvHD-Gefahr verantwortlich sein können²². Die Identifizierung solcher humanen immundominanten mH-Antigene und das Screening nach solchen Antigenen kann zu einer erheblichen Abnahme der GvHD nach einer BMT führen. Wir beschreiben hier die erste Aufklärung eines polymorphen Gens, das das immundominante mH-Antigen HA-1 codiert. Dies ermöglichte es uns, HA-1-allel-spezifische PCR-Primer für die Typbestimmung von Spender und Empfänger vor der Transplantation zu entwerfen, um die Auswahl des Spenders zu verbessern und dadurch eine HA-1-induzierte GvHD-Entwicklung zu verhindern.
Es ermöglichte uns auch, damit zu beginnen, leukämische Zellen, die auf hämatopoetischen Zellen vorhandene Nebenantigene tragen, gezielt anzugreifen. Eine Möglichkeit, zu Mitteln zu gelangen, die gezielt leukämische Zellen angreifen, ist die ex-vivo-Präparation von CTLs. Dies wird im Folgenden erklärt. Die allogene Knochenmarkstransplantation (BMT) ist eine häufige Behandlung von hämatologischen Malignitäten²⁹. Das Rezidiv der zugrundeliegenden Malignität ist eine Hauptursache für eine erfolglose Behandlung^30,31. CML-Patienten, die einen Rückfall hatten, können erfolgreich durch Infusionen mit Spenderlymphocyten (DLI) behandelt werden^32,33, aber die Behandlung ist bei AML und ALL mit einem Rückfall weniger effektiv^32,33 und wird häufig durch Graft-versus-Host-Reaktion (GvHD) kompliziert^32-34. Vom Spender abgeleitete CTLs, die spezifisch für Nebenhistokompatibilitätsantigene (mHags) des Patienten sind, spielen sowohl bei GvHD- als auch bei GvL-Reaktivitäten eine wichtige Rolle^{10, 35-38}. Die mHags HA-1 und HA-2 induzieren in vivo HLA-A2-restringierte CTLs. Die mHags HA-1 und HA-2 werden ausschließlich auf hämatopoetischen Zellen einschließlich leukämischen Zellen^10,36 und Vorläufern leukämischer Zellen^37,38, aber nicht auf Zellen der GvHD-Targetorgane, wie Hautfibroblasten, Keratinocyten oder Leberzellen⁸, exprimiert. Bis vor kurzem war die chemische Natur der mHags HA-1 und HA-2 noch nicht enträtselt^4,39. Wir berichten hier über die Möglichkeit der ex-vivo-Erzeugung von mHag-HA-1- und -HA-2-spezifischen CTLs aus naiven mHag-HA-1- und/oder -HA-2-negativen gesunden Blutspendern mit dem Zweck einer passiven Immuntherapie von rezidivierender Leukämie mit einer geringen GvHD-Gefahr. Um die optimale antigenpräsentierende Zelle (APC) für die exvivo-Erzeugung von HA-1- und HA-2-spezifischen CTLs zu definieren, präparierten wir mononukleäre Zellen des peripheren Bluts (PBMC), Monocyten, zirkulierende dendritische Zellen des peripheren Bluts (PBDC) oder von CD34-positiven Vorläuferzellen des Knochenmarks abgeleitete dendritische Zellen (BMDC) aus fünfzehn HLA-A2-positiven, HA-1- oder HA-2-negativen gesunden Blutspendern. Diese APCs wurden mit synthetischen HA-1- und/oder HA-2-Peptiden gepulst und verwendet, um autologe naive CD8-positive T-Zellen zu stimulieren. Die Versuche, HA-1- oder HA-2-spezifische CTLs unter Verwendung von Monocyten oder PBMC zu induzieren, waren nicht sehr erfolgreich. PBMC induzierten nur in einem von drei Versuchen HA-2-spezifische CTLs. Unter Verwendung von Monocyten erzeugten wir zwei HA-1-Peptid-spezifische CTLs, aber diese CTLs lysierten in unseren Experimenten keine HA-1-positiven Targetzellen (Daten nicht gezeigt). Es ist möglich, dass diese "peptidspezifischen" CTLs eine geringere Affinität zu dem natürlich exprimierten HA-1-Antigen haben, aber dies bedeutet nicht, dass diese Zellen nicht verwendet werden können, um CTLs gegen Nebenantigene zu erzeugen.
PBDC von neun Individuen wurden angereichert, um HA-1- oder HA-2-spezifische CTLs zu induzieren. In den vier Fällen, in denen die Präparate eine Reinheit von weniger als 30% hatten, lysierten die CTLs peptidbeladene Targetzellen aber keine mHag-positiven Targetzellen (Daten nicht gezeigt). Dagegen erkannten die CTLs in allen Fällen (n = 5), in denen die PBDC-Reinheit 30% oder mehr betrug, nicht nur mHag-negative, peptidgepulste Targetzellen, sondern auch mHag-positive EBV-LCL, was die Erkennung des natürlich exprimierten Liganden beweist (1). Diese Ergebnisse unterstreichen die überlegene Fähigkeit von DC, T-Zell-Anworten von naiven Vorläufern zu induzieren, und bestätigen die derzeitige Meinung⁴⁰. Ähnlich induzierten zwei BMDC CTLs, die sowohl peptidgepulste Targetzellen als auch HA-1-positive Targetzellen erkannten (5). Keine cytotoxische Aktivität gegen autologe PHA-stimulierte T-Zell-Blasten (PHA-Blasten) oder gegen mHag-negative EBV-LCL wurde beobachtet. Es wurde also weder Autoreaktivität noch Alloantigenreaktivität gegen die Antigene von Dritten beobachtet. Mehrere HA-1- oder HA-2-spezifische CTL-Klone, die aus diesen CTLs isoliert wurden, reagierten ebenfalls nicht gegen autologe Zellen. Diese Ergebnisse zeigen, dass HA-1- und HA-2-spezifische CTLs nach einer BMT sicher auf Patienten übertragen werden können.
Die ex vivo induzierten HA-1- und HA-2-spezifischen CTLs wurden auf ihre auf hämatopoetische Zellen eingeschränkte Reaktivität getestet und mit den in vivo induzierten HA-1- und HA-2-spezifischen CTLs verglichen (6). PHA-Blasten, aber keine Fibroblasten (auch nicht nach IFN-γ/TNF-α-Stimulation) wurden sowohl von ex vivo als auch von in vivo induzierten HA-1- und HA-2-spezifischen CTLs erkannt. Fibroblasten wurden nur nach dem Pulsen mit den mHag-Peptiden lysiert, was ihre Anfälligkeit für CTL-vermittelte Lyse beweist. Diese Daten bestätigen nicht nur, dass die HA-1- und HA-2-Antigene ausschließlich auf hämatopoetischen Zellen funktionell exprimiert werden⁸, sondern zeigen auch, dass eine passive Übertragung von HA-1- oder HA-2-spezifischen CTLs auf HA-1- oder HA-2-positive Patienten die nichthämatopoetischen Gewebe und Zellen des Patienten schont. Nach einer passiven Übertragung von HA-1- und HA-2-spezifischen CTLs ist also nur eine geringe Gefahr von GvHD zu erwarten. Etwas Vorsicht kann notwendig sein, da wir schon früher bewiesen haben, dass eine HA-1-Abweichung zwischen Patient und Spender mit der Entwicklung von GvHD bei Erwachsenen assoziiert ist³. Daher übertragen wir die CTLs nicht früher als 50-60 Tage nach der BMT. Es wird angenommen, dass die meisten hämatopoetischen Zellen des Empfängers dann durch Spenderzellen ersetzt worden sind. Alternativ dazu kann man auch die HA-1- und HA-2-spezifischen CTLs mit einem Suizid-Gen transduzieren, das die in-vivo-Eliminierung von Zellen ermöglicht, wenn nachteilige Wirkungen auftreten⁴¹.
Die ex vivo induzierten HA-1- und HA-2-spezifischen CTLs wurden anschließend auf cytolytische Aktivität gegen die für diese Studie wichtigsten Targetzellen, leukämische Zellen, analysiert. In vivo induzierte HA-1- und HA-2-spezifische CTLs und ein HLA-A2-spezifischer alloreaktiver CTL wurden als Kontrolleffektorzellen verwendet. Wie in 7 gezeigt ist, wurden AML- und ALL-Zellen durch HLA-A2-spezifische alloreaktive CTL und durch in vivo induzierte HA-1- und HA-2-spezifische CTLs lysiert, was darauf hinweist, dass die leukämischen Zellen HLA-A2-positiv waren und HA-1- oder HA-2-Antigene exprimierten. Wie erwartet, lysierten die ex vivo induzierten CTLs die leukämischen Zellen, die mit den Kontrolleffektorzellen vergleichbar waren. Diese Ergebnisse zeigen, dass HA-1- und HA-2-spezifische CTLs auch als Therapie für rezidivierende AML oder ALL, die gegenüber einer DLI-Behandlung resistent sind, verwendet werden können. Das Ausmaß der Cytotoxizität konnte nach der IFN-γ- und TNF-α-Behandlung der leukämischen Zellen erheblich erhöht werden, was darauf hinweist, dass Cytokine die HLA-Klasse-I-Expression auf den leukämischen Zellen hochregulierten. HA-1- und HA-2-spezifische CTL-Klone erzeugen ex vivo IFN-γ und TNF-α. Es ist möglich, dass die Cytokinerzeugung durch HA-1- und HA-2-spezifische CTLs auch in vivo erfolgt. Alternativ dazu kann die Wirksamkeit einer passiven Immuntherapie mit HA-1- und HA-2-spezifischen CTLs in Resistenzfällen durch gleichzeitige Verabreichung von IFN-α verstärkt werden. Die Möglichkeit einer passiven Immuntherapie mit ex vivo erzeugten CTLs hängt auch von ihrer Expandierbarkeit auf eine ausreichend Anzahl ab. Wir bewerteten daher die Expansionsraten von HA-1- und HA-2-spezifischen CTLs, die durch DC erzeugt wurden. Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass eine ausreichende Anzahl von CTLs für die passive Immuntherapie erhalten werden kann, wenn T-Zell-Kulturen mit 5 × 10⁷ Responderzellen gestartet werden. Zum Beispiel zeigten zwei HA-2-spezifische CTLs, die durch PBDC induziert wurden, Expansionsraten von über 9, 25 und 8 nach der zweiten, dritten bzw. vierten Woche. Diese Expansionsraten ergeben eine geschätzte Gesamtausbeute von 3 × 10⁹ bis 10¹⁰ CTLs am Ende der vierten Woche. Die Expansionskinetik der HA-1-spezifischen CTLs war langsamer, aber die Zellen expandierten während jeder Restimulation konsistent mit Verdoppelungszeiten von 2 bis 3 Tagen. Es wird geschätzt, dass nach fünf Wochen Kultur 10⁹ HA-1-spezifische CTLs erhalten werden können.
Unsere Ergebnisse zeigen also zum ersten Mal, dass mHag-HA-1- und -HA-2-spezifische CTLs ex vivo reproduzierbar aus HLA-A2-positiven, mHag-HA-1- und/oder -HA-2-negativen gesunden Blutspendern erzeugt werden können, indem man dendritische Zellen verwendet, die mit synthetischen Peptiden gepulst wurden. Nach der erfolgreichen Anwendung von EBV-spezifischen CTLs als spezielle passive Immuntherapie von mit EBV zusammenhängenden Malignitäten⁴² liefern unsere Ergebnisse jetzt eine neue Möglichkeit für die Behandlung von rezidivierenden HA-1- und/oder HA-2-positiven Leukämiepatienten mit HA-1- oder HA-2-spezifischen CTLs, die ex vivo von ihren HLA-identischen, mHag-negativen Knochenmarksspendern induziert wurden.
Verfahren
Zellkultur. Die CD8-positiven, NLA-A2.1-restringierten, HA-1-spezifischen cytotoxischen T-Zell-Klone 3HA15, Klon 15 und 5W38 waren von den PBMC von zwei Patienten abgeleitet, die einer HLA-identischen Knochenmarkstransplantation unterzogen worden waren^7,23. Die Klone wurden durch wöchentliche Stimulation mit bestrahlten allogenen PBMC und BLCL in RPMI-1640-Medium, das 15% Humanserum, 3 mM 1-Glutamin, 1% Leukoagglutinin-A und 20 E/ml rIl-2 ent hielt, kultiviert. Die HLA-A2.1-positiven HA-1-exprimierenden EBV-transformierten B-Zelllinien (BLCL) Rp und Blk wurden in IMDM gehalten, das 5% FCS enthielt. Die KG-1- und T2-Zelllinien wurden in 1640-Medium kultiviert, das 3 mM 1-Glutamin und 10% FCS enthielt.
⁵¹Cr-Freisetzungsassay. HPLC-Fraktionen und synthetische Peptide wurden in einem ⁵¹-Cr-Freisetzungsassay getestet, wie es beschrieben ist²⁴. 2500 ⁵¹Cr-markierte T2-Zellen in 25 ml wurden 30 Minuten lang bei 37°C mit 25 ml Peptid inkubiert, das in Hanks 50 mM Hepes gelöst war. Cytotoxische T-Zellen wurden in einem Endvolumen von 150 ml hinzugefügt. Wenn HPLC-Peptidfraktionen getestet wurden, wurde T2 während der ⁵¹Cr-Markierung mit 2 mg/ml MA2.1 inkubiert. Nach 4 Stunden bei 37°C wurden die Überstände geerntet.
Peptidreinigung. Peptide wurden aus gereinigten HLA-A2.1-Molekülen eluiert, wie es schon früher beschrieben wurde²⁴. Kurz gesagt, HLA-A2.1-Moleküle wurden zweimal durch Affinitätschromatographie mit BB7.2-gekoppelten CNBr-aktivierten Sepharose-4B-Kügelchen (Pharmacia LKB) aus 90·10⁹ HLA-A2.1-positiven EBV-BLCL gereinigt und gründlich gewaschen. Peptide wurden durch Behandlung mit 10% Essigsäure aus den HLA-A2.1 eluiert, weiterhin durch 1% TFA angesäuert und durch Filtration über ein 10-kD-Centricon-Filter (Amicon) von der schweren Kette des HLA-A2.1 und β2-Mikroglobulin abgetrennt. Die Peptide wurden unter Verwendung von Umkehrphasen-Mikro-HPLC (Smart System, Pharmacia) fraktioniert. Für die erste Reinigung wurden drei Durchläufe HPLC-Fraktionierung verwendet, um die NLA-A2.1-restringierten HA-1-aktiven Peptidfraktionen von 90·10⁹ Rp-Zellen zu reinigen. Die erste Fraktionierung bestand aus Puffer A (0,1% HFBA in H₂O), Puffer B (0,1% HFBA in Acetonitril). Der Gradient war 100% Puffer A (0 bis 20 min), 0 bis 15% Puffer B (20 bis 25 min) und 15 bis 70% Puffer B (25 bis 80 min) bei einer Fließgeschwindigkeit von 100 ml/min. Fraktionen von 100 ml wurden aufgefangen. Fraktion 24 des ersten Gradienten wurde weiter fraktioniert. Die zweite Fraktionierung bestand aus Puffer A (0,1% TFA in H₂O), Puffer B (0,1% TFA in Acetonitril). Der Gradient war 100% Puffer A (0 bis 20 min), 0 bis 12% Puffer B (20 bis 25 min) und 12 bis 50% Puffer B (25 bis 80 min) bei einer Fließgeschwindigkeit von 100 ml/min. Fraktionen von 100 ml wurden aufgefangen. Ein flacherer dritter Gradient wurde verwendet, um Fraktion 27, die HA-1-Aktivität enthielt, weiter zu reinigen. Der Gradient war 100% Puffer A (0 bis 29 min), 0 bis 18% Puffer B (29 bis 34 min), 18% Puffer B (34 bis 39 min), 18 bis 23,9% Puffer B (39 bis 98 min) bei einer Fließgeschwindigkeit von 100 ml/min. 1/180 bis 1/45 des Ausgangsmaterials wurde verwendet, um im ⁵¹Cr-Freisetzungsassay auf positive Fraktionen zu testen. Vergleichbare HPLC-Fraktionierungen wurden für die zweite Reinigung von HLA-A2.1-restringierten HA-1-aktiven Peptidfraktionen von 90·10⁹ Blk verwendet. 40% der HA-1-haltigen Fraktion 33 der zweiten HA-1-Reinigung wurden für eine zusätzliche Umkehrphasen-Mikrokapillaren-HPLC-Fraktionierung verwendet. Puffer A war 0,1% Triethylamin (TEA) in Wasser, mit Essigsäure auf pH 6,0 gepuffert, und Puffer B war 0,085% TEA in 60% Acetonitril, mit Essigsäure auf pH 6,0 gepuffert. Der Gradient war 100% Puffer A (0 bis 5 min), 0 bis 100% B (5 bis 45 min) bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,5 ml/min. Fraktionen wurden 5 bis 15 Minuten lang jede Minute, 15 bis 20 Minuten lang alle 30 Sekunden, 20 bis 40 Minuten lang alle 20 Sekunden und 40 bis 45 Minuten lang alle 30 Sekunden in 50 ml 0,1% Essigsäure aufgefangen. Von jeder aufgefangenen Fraktion wurden 20% verwendet, um auf HA-1-Aktivität zu testen, und 80% wurden verwendet, um massenspektrometrische Daten zu erhalten.
Massenspektrometrie. Fraktionen von der dreidimensionalen HPLC-Trennung der Rp-Reinigung, die die HA-1-Aktivität enthielten, wurden durch Mikrokapillaren-HPLC-Elektrospray-Ionisationsmassenspektrometrie analysiert²⁵ Die Peptide wurden auf eine C18-Mikrokapillarensäule (75 mm Innendurchmesser × 10 cm) geladen und mit einem 34-Minuten-Gradienten von 0 bis 60% B eluiert, wobei Lösungsmittel A 0,1 M Essigsäure in Wasser war und Lösungsmittel B Acetonitril mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,5 ml/min war. Ein Fünftel der abfließenden Lösung wurde in den Näpfen einer 96-Napf-Platte abgelagert, die in jedem Napf 100 μl Kulturmedium enthielt (10-Sekunden-Fraktionen), während die übrigen vier Fünftel in die Elektrosprayquelle des TSQ-70U geleitet wurden. Massenspektren und CAD-Massenspektren wurden auf einem Finnigan-MAT-TSQ-7000- Triple-Quadrupol-Massenspektrometer (San Jose, Kalifornien), das mit einer Elektrospray-Ionenquelle ausgestattet war, aufgezeichnet.
HLA-A2.1-Peptidbindungsassay. Ein quantitativer Assay auf HLA-A2.1-bindende Peptide auf der Basis der Hemmung der Bindung des fluoreszenten markierten Standardpeptids Hbc 18-27 F bis C6 (FLPSDCFPSV) an rekombinantes HLA-A2.1-Protein und β2-Mikroglobulin wurde verwendet^26,27. Kurz gesagt, HLA-A2.1-Konzentrationen, die ungefähr 40-60% gebundenes fluoreszentes Standardpeptid ergaben, wurden mit 15 pmol/Napf (150 nM) β2-Mikroglobulin (Sigma) verwendet. Verschiedene Dosen der Testpeptide wurden 1 Tag lang bei Raumtemperatur im Dunkeln zusammen mit 100 fmol/Napf (1 nM) fluoreszentem Standardpeptid, HLA-A2.1 und β2-Mikroglobulin in einem Volumen von 100 ml Assaypuffer inkubiert. Der Prozentsatz der MHC-gebundenen Fluoreszenz wurde durch Gelfiltration bestimmt, und die 50%-inhibitorische Dosis wurde für jedes Peptid abgeleitet, wobei man einseitige kompetitive lichtlineare Regressionsanalyse mit der Prismgraph-Software verwendete. Synthetische Peptide wurden auf einem Abimed-422-Multiple-Peptid-Synthesizer (Abimed, Langenfeld, Deutschland) hergestellt und waren gemäß einer Überprüfung durch Umkehrphasen-HPLC zu mehr als 90% rein.
RT-PCR-Amplifikation und Seguenzierung des KIAA0223-Bereichs, der für HA-1 codiert.
Gesamt-RNA oder mRNA wurde aus BLCL unter Verwendung des RNAzol-Verfahrens (Cinaa/Biotecx Laboratories, Houston, TX) oder nach den Anweisungen des Herstellers (QuickPrep mRNA-Reinigungs-Kit, Pharmacia Biotech) präpariert. cDNA wurde mit 1 mg RNA als Matrize und mit dem auf KIAA0223 beruhenden Rückwärts-Primer 5'-GCTCCTGCATGACGCTCTGTCTGCA-3' synthetisiert. Um den HA-1-Bereich von KIAA0223 zu amplifizieren, wurden die folgenden Primer verwendet: Vorwärts-Primer 5'-GACGTCGTCGAGGACATCTCCCAT-3' und Rückwärts-Primer 5'-GAAGGCCACAGCAATCGTCTCCAGG-3'. Die verwendeten Cyclusparameter waren Denaturierung bei 95°C, 1 min, Assoziation bei 58°C, 1 min, und Verlängerung bei 72°C, 1 min (25 Cyclen). Die PCR-Produkte wurden unter Verwendung des Magic PCR-Preps DNA-Reinigungssystems (Promega) gereinigt und unter Verwendung des pMosBlue-T-Vektor-Kits (Amersham Life Science) direkt kloniert. Sechs unabhängige Kolonien von jedem Individuum wurden unter Verwendung des T7-Sequenzierungskits (Pharmacia Biotech) sequenziert.
HA-1-allelspezifische PCR-Amplifikation
Im Falle einer HA-1-allelspezifischen PCR-Amplifikation wurde cDNA synthetisiert, wie es oben beschrieben ist. Eine PCR-Amplifikation wurde mit allelspezifischen Vorwärtsprimern durchgeführt: Für das HA-1^H-Allel wurde der Primer H1: 5'-CCT-TGA-GAA-ACT-TAA-GGA-GTG-TGT-GCT-GCA-3', für das HA-1^R-Allel der Primer R1: 5'-CCT-TGA-GAA-ACT-TAA-GGA-GTG-TGT-GTT-GCG-3' und für beide Reaktionen der Rückwärtsprimer, wie er oben beschrieben wurde, verwendet. Die verwendeten Cyclusparameter waren Denaturierung bei 95°C, 1 min, Assoziation bei 67°C, 1 min, und Verlängerung bei 72°C, 1 min (25 Cyclen).
Klonierung und Expression des HA-1H- und HA-1R-Allelbereiches von KIAA0223.
Ein auf KIAA0223 beruhender Vorwärtsprimer, der ein ATG-Startcodon enthielt (5'-CCG-GCA-TGG-ACG-TCG-TCG-AGG-ACA-TCT-CCC-ATC-3') und ein auf KIAA0223 beruhender Rückwärts-PCR-Primer, der ein Translations-Stopsignal enthielt (5'-CTA-CTT-CAG-GCC-ACA-GCA-ATC-GTC-TCC-AGG-3'), wurden entworfen und in einer RT-PCR-Reaktion mit cDNA, die von einem homozygoten HA-1^H- und einem homozygoten HA-1^R-BLCL abgeleitet war, verwendet. Die verwendeten Cyclusparameter waren Denaturierung bei 95°C, 1 min, Assoziation bei 60°C, 1 min, und Verlängerung bei 72°C, 1 min (25 Cyclen). Die gewünschten PCR-Produkte wurden unter Verwendung des Magic PCR-Preps DNA-Reinigungssystems (Promega) gereinigt. Die gereinigte DNA wurde unter Verwendung des pMosBlue-T-Vektor-Kits (Amersham Life Science) direkt kloniert und im eukaryontischen pCDNA3.1(+)-Vektor unter der Kontrolle eines CMV-Promotors rekloniert. Transiente Cotransfektionen wurden mit HLA-A2.1 in HeLa-Zellen unter Verwendung von DEAE-Dextran-Copräzipitation durchgeführt. Nach 3 Tagen Kultur wurden HA-1-spezifische T-Zellen hinzugefügt, und nach 24 Stunden wurde die TNFα-Freisetzung im Überstand unter Verwendung von WEHI-Zellen gemessen²⁸.
Peptide: HA-1- und HA-2-Peptide wurden unter Verwendung eines halbautomatischen Multiple-Peptid-Synthesizers synthetisiert^4,39. Die Reinheit der Peptide wurde durch Umkehrphasen-HPLC (high pressure liquid chromatography) überprüft.
Antigenpräsentierende Zellen:
PBMC wurden durch Ficoll-Hypaque-Dichtegradiententrennung von Blut, das durch manuelle Hämapherese gesammelt wurde, isoliert.
Monocyten wurden durch Kunststoffadhärenz während der PBDC-Anreicherung isoliert.
PBDC wurden aus PBMC durch Abreicherung von T-Zellen, Monocyten, B- und NK-Zellen angereichert, wie es schon früher beschrieben wurde. Kurz gesagt, T-Zellen wurden durch Rosettenbildung mit Schaf-Erythrocyten abgereichert. Nicht-T-Zellen wurden 36 h lang bei 37°C in RPMI + 10% autologem Plasma kultiviert. Nach der Abreicherung von Monocyten wurden nichtadhärente Zellen auf 14,5% Metrizamid-Gradienten geschichtet und zentrifugiert. Die leichten PBDC wurden aus der Interphase gewonnen. PBDC wurden durch FACS identifiziert, da sie negativ auf CD3, CD14, CD16 und CD19 und positiv auf HLA-DR waren. Die Präparate enthielten 2-6 × 10⁶ Zellen mit einem DC-Gehalt von 20-50%. In manchen Fällen wurden die leichten Zellen weiter von CD14- und CD19-Zellen abgereichert, indem man antikörperbeschichtete Magnetkügelchen verwendete.
BMDC wurden aus CD34-positiven Zellen des Knochenmarks (isoliert unter Verwendung eines CD34+-Isolationskits, MACS, Bergisch Gladbach, Deutschland) durch Kultivieren mit 100 ng/ml FLT3-Ligand (Genzyme, Leuven; Belgien), 30 ng/ml IL-3, 25 ng/ml SCF (Genzyme), 50 E/ml TNF-α (Genzyme), 250 E/ml GM-CSF (Genzyme) während 10 bis 14 Tagen differenziert. Die Kulturen enthielten 20-60% DC, was anhand der hohen Konzentrationen von DR und der negativen Expression von CD3/CD14/CD16/CD19 nachgewiesen wurde.
Ex-vivo-Induktion von HA-1- und HA-2-spezifischen CTLs: APC wurden 90 min lang in serumfreiem AIM-V-Medium mit HA-1- oder HA-2-Peptiden (beide 10 mg/ml) gepulst. Nach dem Waschen wurden APC und 10-15 × 10⁶ Responderzellen (CD4-abgereicherte autologe PBMC) mit verschiedenen Verhältnissen von APC zu Responderzellen je nach der Art der APC (5:1, 1:3 und 1:10 für PBMC, Mo bzw. DC) in 24-Napf-Kulturplatten kultiviert. Das Kulturmedium war RPMI, das mit 10% autologem Plasma, 1 E/ml IL-2 (Cetus), 1 E/ml IL-12 (Genzyme) versetzt war. Die Zellen wurden in einem angefeuchteten Gemisch aus Luft und 5% CO₂ auf 37°C gehalten. Am 5. Tag wurden 10 E/ml IL-2 hinzugefügt. Ab dem siebten Tag wurden die T-Zell-Kulturen wöchentlich mit peptidgepulsten autologen Monocyten restimuliert. 24 h nach jeder Restimulierung wurden 10 E/ml IL-2 hinzugefügt. Die T-Zelllinien wurden mit 10-20 E/ml IL-2-haltigem Kulturmedium expandiert.
Cytotoxizitäts-(⁵¹Cr-Freisetzunas)-Assays: Standard-4-h-⁵¹Cr-Freisetzungsassays unter Verwendung von PHA-Blasten, EBV-BLCL und Fibroblasten und leukämischen Zellen als Targetzellen wurden so durchgeführt, wie es schon früher beschrieben wurde⁸. Die prozentuale spezifische Lyse wurde unter Verwendung der folgenden Formel berechnet: 100 × (cpm experimentelle Freisetzung – cpm spontane Freisetzung) / (cpm maximale Freisetzung – cpm spontane Freisetzung).
Targetzellen: EBV-BLCL wurden so erzeugt, wie es schon früher beschrieben wurde⁸, und in RPMI plus 10% FCS kultiviert. PHA-aktivierte T-Zell-Blasten (PHA-Blasten) wurden durch Stimulation von PBMC mit 0,1 mg/ml PHA (Wellcome) während 72 h erhalten. PHA-Blasten wurden mit Medium, das 20 E/ml IL-2 enthielt, expandiert. Hautfibroblasten eines HLA-A2-positiven, HA-1-positiven, HA-2-positiven gesunden Individuums wurden isoliert, kultiviert und getestet, wie es schon früher beschrieben wurde⁸. Kurz gesagt, Fibroblasten wurden trypsinisiert und in den Näpfen von flachbödigen 96-Napf-Mikrotiter kulturplatten in einer Konzentration von 3 × 103 Zellen/Napf mit oder ohne Zugabe von IFN-γ und TNF-α (beide 300 E/ml) während 72 h kultiviert. Wenn es angegeben ist, wurden die Targetzellen während der ⁵¹Cr-Markierung mit HA-1- oder HA-2-Peptiden (beide 10 mg/ml) gepulst.
PBMC oder BM von Leukämiepatienten (AML oder ALL), die > 95% morphologisch erkennbare maligne Zellen enthielten, wurden als leukämische Zellen zugeordnet. Leukämische Zellen wurden aufgetaut und 72 h lang in RPMI plus 10% Humanserum mit oder ohne Zugabe von IFN-γ und TNF-α (beide 300 E/ml) kultiviert, bevor sie als Targetzellen verwendet wurden.
In vivo induzierte mHag-spezifische T-Zell-Klone: In vivo induzierte, mHag-HA-1- und -HA-2-spezifische CD8-positive CTL-Klone wurden von Leukämiepatienten nach einer BMT isoliert und im Detail dokumentiert³⁵.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
Tabelle 1. KIAA0223-Sequenzpolymorphismus bei mH-HA-1-positiven und -HA-1-negativen Individuen.
Die Sequenzierung des HA-1-Bereichs im KIAA0223-Gen bei HA-1 +/+ und HA-1 -/- homozygoten Individuen und KG-1 ergab zwei Allele, die sich in zwei Nucleotiden unterschieden, was zu einem Unterschied in einer Aminosäure führte (H zu R), und als HA-1" und HA-1^R bezeichnet wurden. Für DH und vR wurden 6 unabhängige PCR-Produkte sequenziert. Für KG-1 wurden 8 PCR-Produkte sequenziert.
1. Rekonstitution von HA-1 mit HPLC-fraktionierten Peptiden, die in einem ⁵¹Cr-Freisetzungsassay mit dem mH-HA-1-spezifischen T-Zell-Klon 3HA15 eluiert wurden. a. Die Peptide wurden aus 90·10⁹ HA-1- und HLA-A2.1-positiven Rp-Zellen eluiert und unter Verwendung von Umkehrphasen-HPLC mit HFBA als organischem Modifikator getrennt. b. Fraktion 24 der ersten HPLC-Dimension, die HA-1-Aktivität enthielt, wurde weiter durch Umkehrphasen-HPLC mit TFA als organischem Modifikator fraktioniert. c. Die HA-1-haltige Fraktion 27 des zweiten Gradienten wurde weiter mit einem dritten, flacheren Gradienten, der aus 0,1% Acetonitril/min bestand, chromatographiert. Die Hintergrundlyse von T2 durch die CTL in Abwesenheit jeglicher Peptide betrug bei a 3%, bei b und c 0%. Die Lyse der positiven Kontrolle betrug bei a 99%, bei b 74% und bei c 66%. d. Bestimmung von in Frage kommenden HA-1-Peptiden. Die HPLC-Fraktion 33 aus der Trennung in 1c wurde mit einem direktgekoppelten Mikrokapillaren-Säulenausstrom-Verteiler chromatographiert und durch Elektrospray-Ionisationsmassenspektrometrie und einen ⁵¹Cr-Freisetzungsassay analysiert. HA-1-rekonstituierende Aktivität als prozentuale spezifische Freisetzung wurde mit der Häufigkeit von in Frage kommenden Peptiden verglichen, die als Ionenstrom gemessen wurde.
2. Sequenzierung des mH-HA-1-Peptids durch Tandem-Massenspektrometrie. a. Ein kollisionsaktiviertes Dissoziationsmassenspektrum des in Frage kommenden Peptids mit m/z = 513. b. Rekonstitutionsassay mit verschiedenen Konzentrationen eines synthetischen mH-HA-1-Peptids mit drei HA-1-spezifischen T-Zell-Klonen, 3HA15, Klon 15 und 5W38. Die Hintergrundlyse von T2 durch die CTL in Abwesenheit jeglicher Peptide betrug 4% für 3HA15, 10% für Klon 15 und 2% für 5W38. Die Lyse der positiven Kontrolle betrug 46% für 3HA15, 47% für Klon 15 und 48% für 5W38.
3. KIAA0223-Polymorphismus korrelierte exakt mit dem HA-1-Phänotyp des mH-Antigens. a. Der HA-1-Bereich von KIAA0223 wurde in einer Familie sequenziert, bei der ein HA-1-mH-Antigentyp bestimmt wurde. 6 PCR-Produkte von jedem Familienmitglied wurden sequenziert. Die Familienmitglieder 00, 07 und 09 exprimierten das HA-1^R bei allen 6 PCR-Produkten. Das Familienmitglied 01 exprimierte das HA-1^H-Allel in 2 PCR-Produkten und das HA-1^R-Allel in 4 PCR-Produkten. Das Familienmitglied 02 exprimierte das HA-1^H-Allel in 3 PCR-Produkten und das HA-1^R-Allel in 3 PCR-Produkten. Das Familienmitglied 08 exprimierte das HA-1^H-Allel in 4 PCR-Produkten und das HA-1^R-Allel in 2 PCR-Produkten. b. HA-1-allelspezifische PCR-Reaktion bei einer Familie, bei der ein HA-1-mH-Antigentyp bestimmt wurde, korrelierte exakt mit dem HA-1-Phänotyp. Die Größen der resultierenden PCR-Produkte waren mit den erwarteten Größen, die von der cDNA-Sequenz abgeleitet wurden, konsistent. c. Transfektion des HA-1^H-Allels von KIAA0223 führt zur Erkennung durch mH-HA-1-spezifische T-Zellen. Die HA-1^H- und die HA-1^R-codierende Sequenz von KIAA0223 wurden zusammen mit HLA-A2.1 in HeLa-Zellen transfiziert. Nach 3 Tagen wurden die HA-1-spezifischen CTL-Klone 5W38 und 3HA15 hinzugefügt, und nach 24 Stunden wurde die TNFα-Freisetzung im Überstand gemessen. Der Klon Q66.9 ist spezifisch für das Influenzamatrixpeptid 58-66. Nach einer Transfektion des pcDNA3.1(+)-Vektors allein wurde keine TNFα-Erzeugung beobachtet (Ergebnisse nicht gezeigt).
4a. Bindung des HA-1^H- und des HA-1^R-Peptids an HLA-A2.1. Die Bindung des HA-1^H- und des HA-1^R-Peptids wurde auf ihre Fähigkeit getestet, die Bindung des fluoreszenten Peptids FLPSDCFPSV an rekombinantes HLA-A2.1 und β2-Mikroglobulin in einem zellfreien Peptidbindungsassay zu hemmen. Ein repräsentatives Experiment ist gezeigt. Der IC50-Wert wird anhand der Ergebnisse von 4 Experimenten bestimmt und betrug 30 nM für VLHDDLLEA und 365 nM für VLRDDLLEA. b. Rekonstitutionsassay mit verschiedenen Konzentrationen von synthetischem HA-1^R-Peptid mit HA-1-spezifischen T-Zellen. Das HA-1^R-Peptid wurde titriert und mit T2-Zellen vorinkubiert. Drei HA-1-spezifische T-Zell-Klone, 5W38, 3HA15 und Klon 15, wurden hinzugefügt, und ein vierstündiger ⁵¹Cr-Freisetzungsassay wurde durchgeführt. Die Hintergrundlyse von T2 durch die CTL in Abwesenheit jeglicher Peptide betrug 4% für 3HA15, 10% für Klon 15 und 2% für 5W38. Die Lyse der positiven Kontrolle betrug 46% für 3HA15, 47% für Klon 15 und 48% für 5W38.
5. Cytotoxische T-Zell-Aktivität gegen peptidgepulste mHag-positive Targetzellen durch zwei ex-vivo-induzierte HA-1- (a, b) und zwei ex-vivo-induzierte HA-2-spezifische CTLs (c, d). CTLs, die in a, c, d gezeigt sind, werden mit Hilfe von PBDC induziert, während CTLs, die in b gezeigt sind, mit Hilfe von BMDC induziert werden. Targetzellen: autologe PHA-Blasten (♢); autologe PHA- Blasten, mit Peptid gepulst (♦); EBV-LCL positiv auf HA-1 (n = 4) oder HA-2 (n = 3) (Δ); EBV-LCL negativ auf HA-1 (n = 3) oder HA-2 (n = 3) (o); HA-1- oder HA-2-negative EBV-LCL, gepulst mit HA-1- oder HA-2-Peptid (•).
6. Auf hämatopoetische Zellen eingeschränkte Cytolyse, vermittelt durch in vivo (a, c) und ex vivo (b, d) induzierte, HA-1- (a, b) und HA-2-spezifische (c, d) CTLs. Alle Targetzellen stammten von demselben HLA-A2-positiven, HA-1-positiven, HA-2-positiven Blutspender. Targetzellen: PHA-Blasten (Δ); Fibroblasten (♦); Fibroblasten, mit IFN-γ und TFN-α (beide 300 E/ml) kultiviert (•); Fibroblasten, mit IFN-γ und TFN-α kultiviert und mit 10 μg/ml Peptid gepulst (o).
7. Lyse von HA-1-positiven (a, b, c) oder HA-2-positiven (d, e, f) leukämischen Zellen durch in vivo (b, e) und ex vivo (c, f) induzierte, HA-1- und HA-2-spezifische CTLs. Eine Lyse der Targetzellen durch den HLA-A2-spezifischen Kontroll-CTL-Klon ist in a und d gezeigt. Targetzellen: HA-1- oder HA-2-negative EBV-LCL (_), HA-1- oder HA-2-positive EBV-LCL (Δ), leukämische Zellen, positiv auf HA-1 (n = 49 oder HA-2 (n = 3) (♦); HA-1- oder HA-2-positive leukämische Zellen, kultiviert mit IFN-γ und TFN-α (•).
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Claims

Isoliertes oder synthetisches Peptid mit bis zu 15 Aminosäureresten, das ein T-Zell-Epitop bildet, welches aus dem Nebenhistokompatibilitätsantigen HA-1 erhältlich ist und die Sequenz VLXDDLLEA umfasst, wobei X einen Histidinrest darstellt, wobei die Sequenz gegebenenfalls von geeigneten Enzymspaltungsstellen flankiert ist, die die Verarbeitung des Peptids ermöglichen.
Isoliertes oder synthetisches immunogenes Polypeptid mit bis zu 15 Aminosäureresten, das aus dem Nebenhistokompatibilitätsantigen HA-1 erhältlich ist und die Sequenz VLXDDLLEA umfasst, wobei X einen Histidinrest darstellt, wobei die Sequenz gegebenenfalls von geeigneten Enzymspaltungsstellen flankiert ist, die die Verarbeitung des Peptids ermöglichen.
Peptid oder Polypeptid gemäß Anspruch 1 oder 2, das die Sequenz VLHDDLLEA umfasst.
Impfstoff, der ein Epitop gemäß Anspruch 1 oder 3 oder ein Polypeptid gemäß Anspruch 2 oder 3 umfasst.
Pharmazeutische Zubereitung, die ein Epitop gemäß Anspruch 1 oder 3 oder ein Polypeptid gemäß Anspruch 2 oder 3 umfasst.
Peptid oder Polypeptid gemäß den Ansprüchen 1 bis 3 zur Verwendung als Medizin.
Verfahren zur ex-vivo-Erzeugung einer cytotoxischen T-Zelle gegen das Nebenhistokompatibilitätsantigen HA-1, umfassend das In-Kontakt-Bringen einer antigenpräsentierenden Zelle, vorzugsweise einer dendritischen Zelle, mit einem Peptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, vorzugsweise im Kontext von HLA Klasse I, oder einem Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 2 bis 3 und das Stimulieren von autologen naiven CD8-positiven T-Zellen mit der antigenpräsentierenden Zelle.
Verfahren gemäß Anspruch 7, wobei die hämatopoetische Zelle negativ bezüglich des Nebenantigens ist.
Verfahren gemäß Anspruch 7 oder 8, wobei die cytotoxische T-Zelle mit einem Suizid-Gen ausgestattet ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 7 bis 9, wodurch die cytotoxische T-Zelle immortalisiert wird.
Cytotoxische T-Zelle, erhältlich durch ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 9 bis 10.
Cytotoxische T-Zelle gemäß Anspruch 11, die zur Expansion befähigt ist.