DE69823352T2

DE69823352T2 - Cd28/ctla-4 inhibierende peptidomimetika und diese enthaltende pharmazeutische zusammensetzungen

Info

Publication number: DE69823352T2
Application number: DE69823352T
Authority: DE
Inventors: Nabil El Tayar; Steven Blechner; Brad Jameson; Mark Tepper
Original assignee: Applied Research Systems ARS Holding NV
Current assignee: Merck Serono SA
Priority date: 1997-06-12
Filing date: 1998-06-11
Publication date: 2004-09-02
Anticipated expiration: 2018-06-12
Also published as: CA2293666A1; JP2009029833A; AU8070698A; WO1998056401A1; JP2002505673A; AU743939B2; ES2215306T3; DK0989858T3; EP0989858B1; IL133467A; ATE264688T1; EP0989858A1; IL133467A0; PT989858E; US6337316B1; EP0989858A4; DE69823352D1

Description

Hintergrund der Erfindung
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Peptidomimetika, die zur Hemmung der Wechselwirkungen von CD28 und/oder CTLA-4 mit CD80 (B7-1) und CD86 (B7-2) befähigt sind, und pharmazeutische Zusammensetzungen davon. Sie betrifft auch die Verwendung des Peptidomimetikums zur Herstellung pharmazeutischer Zusammensetzungen, die bei pathologischen Zuständen, welche CD28- und/oder CTLA-4-Agonismen oder -Antagonismen erfordern, wirksam sind.
Beschreibung des Standes der Technik
Die Wechselwirkung von Antigen, das im Zusammenhang mit den MHC-Molekülen der Klasse II präsentiert wird, mit dem T-Zell-Antigen-Rezeptor-Komplex (TCR) liefert das primäre Signal an die T-Helferzellen zur Auslösung der klonalen Proliferation. Die optimale T-Zell-Aktivierung erfordert jedoch zusätzlich zur Einbindung des TCR ein co-stimulatorisches Signal. Obwohl mehrere co-stimulatorische Moleküle an der Auslösung des "zweiten Signals" beteiligt sind, ist klar geworden, dass eines der wichtigsten Signale durch die Wechselwirkung von CD28 mit B7-Molekülen (CD80 und CD86), welche auf der Oberfläche der Antigen-präsentierenden Zelle präsentiert werden (siehe 1), bereitgestellt wird.
Das Zelloberflächen-Molekül CD28 ist ein Mitglied der Glycoprotein-Ig-Superfamilie von Proteinen, das aus 201 Aminosäuren besteht (Aruffo und Seed, 1987). Es wurde festgestellt, dass es in der Natur als ein Homodimer vorliegt und im Wesent lichen auf der Oberfläche von 80% der humanen T-Zellen (alle CD4⁺-Zellen und etwa 50% der CD8⁺-Zellen) und eigentlich von allen Maus-T-Zellen exprimiert wird (Linsley und Ledbetter, 1993). Die Anbindung von CD28 durch seinen natürlichen Liganden B7-1 oder B7-2 (CD80, CD86) führt zu einem zweiten Signal an die T-Zelle und zu einem Anstieg der IL-2 Produktion, die mit der Niederregulation von CD28 im Hinblick auf die mRNA-Spiegel und die Zelloberflächenexpression einhergeht (Linsley et al., 1993). Man nimmt an, dass das zweite Signal für die Auslösung der Proliferation der Antigen-spezifischen T-Zelle entscheidend ist. Die Beeinflussung durch dieses zweite Signal in Gegenwart des ersten Signals (TCR-Signal) führt zur Antigen-spezifischen T-Zellen-Anergie (keine Ansprechbarkeit) (Linsley et al., 1992). Während des Zeitraums, in dem CD28 nieder-moduliert wird, wird gleichzeitig ein eng verwandtes Glycoprotein, CTLA-4, hoch reguliert (Freeman et al., 1992). Es wird allgemein angenommen, dass CD28 das positive costimulatorische Signal für das Wachstum und die Differenzierung liefert, während CTLA-4 für ein nachfolgendes negatives Signal der zellulären Aktivierungsereignisse verantwortlich ist (zum Überblick siehe Lenschow et al., 1996).
Sowohl CD28 als auch CTLA-4 binden an die B7-Proteinfamilie, besonders an B7-2 und B7-1 (Azuma, et al., 1993). Im Hinblick auf B7-1 ist bekannt, dass CTLA-4Ig mit einer 20–100fach höheren Affinität als CD28Ig bindet (Linsley et al., 1991).
Frisch isolierte humane und Maus B-Zellen exprimieren geringe Spiegel an B7-2 jedoch nicht an B7-1, obwohl die Spiegel beider B7 nach der Aktivierung hoch reguliert werden (Hathcock et al., 1994).
In vitro-Untersuchungen haben gezeigt, dass die Blockierung der Costimulation von T-Zellen über den CD28-Signaltransduktionsweg (signaling pathway) zur Entwicklung von Antigen-spezifischer T-Zell-Anergie führt (Harding et al., 1991; Boussiotis et al., 1993; Linsley et al., 1991).
CTLA-4Ig ist in einer breiten Vielfalt von Tiermodellen verwendet worden, um die in vivo-Wirksamkeit der Blockierung des CD28-Signaltransduktionswegs zu untersuchen. Die ersten in vivo-Untersuchungen zeigten, dass CTLA-4Ig fähig ist, die humorale Antwort an ein T-Zell-abhängiges Antigen zu unterdrücken (Linsley et al., 1992).
Andere Studien haben veranschaulicht, dass die Blockierung des CD28 co-stimulatorischen Signals zur Vermeidung der Xenograft-Abstoßung (Lenschow et al., 1992), der kardialen Allograft-Abstoßung (Turka et al., 1992; Lin et al., 1993), des systemischen Maus-Lupus (Finck et al., 1994; Chu et al., 1996), der Transplant-gegen-Wirt-Erkrankung (GVHD) (Wallace et al., 1995) und der experimentellen allergischen Enzephalomyelitis (EAE) (Cross et al., 1995; Perrin et al., 1995; Arima, et al., 1996) wirksam ist.
Die Verabreichung von CTLA-4Ig zum Zeitpunkt der allogenen Transplantation verlängert die Überlebenszeit des Transplantats, sie verhindert jedoch nicht die Abstoßung (Turka et al. 1992). Verschiebt man die Verabreichung von CTLA-4Ig bis auf zwei Tage nach der Transplantation, dann wird sowohl eine langzeitige Überlebensrate des Allografts, als auch eine Toleranz gegenüber der nachfolgenden in vivo-Exposition mit einem Alloantigen (Lin et al., 1993; Sayegh et al., 1995) beobachtet.
Judge et al. (1996) haben kürzlich den in vitro-Wirkmechanismus von CTLA-4Ig untersucht und sie haben festgestellt, dass die verschobene Verabreichung des Proteins zu einer 80–90%ige Abnahme an Cytokinen des Th1-Typs führte und die Ausdehnung (Expansion) von Antigen-spezifischen T-Zellen um 50% abstumpfte (glatt machte). Somit kann CTLA-4Ig das Gleichgewicht zwischen der Ansprechbarkeit auf den Th1- und den Th2-Typ regulieren.
Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass ausreichende Beweise dafür vorhanden sind, dass die Blockierung des CD28 co-stimulatorischen Signalwegs ein geeignetes therapeuti sches Ziel für die Immunmodulation sein kann. CTLA-4Ig befindet sich derzeit in der Phase II der klinischen Versuche bei Psoriasis-Patienten. Seine praktische Anwendbarkeit zur chronischen Immuntherapie ist jedoch eingeschränkt, da es nur parenteral verabreicht werden kann und Dosen von mg/kg erforderlich sind.
Ein kleines Molekülmimetikum von CTLA-4/CD28 hätte große klinische und kommerzielle Vorteile und stellt ein lang erwartetes Erfordernis dar.
Untersuchungen bezüglich der orts-gerichteten Mutagenese sowohl mit CTLA-4 als auch mit CD28 lassen einem Hexapeptid-Stretch einschließlich mehrerer Schlüsselstellen in der CDR3-Region des Proteins, MetTyrProProProTyr (SEQ-ID-Nr.: 31), als eine kritische Kontaktstelle in der Wechselwirkung mit B7 vermuten (Peach et al., 1994).
EP 682039 offenbart, dass CTLA-4-Ig-Fusionsproteine die Wechselwirkung mit B7-Antigen blockieren. Es offenbart auch CTLA-4Ig-Mutanten, in der jede beliebige der Aminosäuren, einschließlich der Sequenz MetTyrProProProTyr (SEQ-ID-Nr.: 31), durch Ala ersetzt worden ist.
WO 95/33770 ist im Allgemeinen auf Liganden von T-Zellen-Oberflächenmolekülen gerichtet, insbesondere auf CTLA-4, das die Antigen-spezifische Apoptose von aktivierten T-Zellen induziert. CTLA-4-Fragmente enthaltende isolierte Peptide, die das Epitop für eine derartige Bindung bilden, sind gleichfalls offenbart und beansprucht. Derartige Epitope schließen die Aminosäuresequenz ProProTyrTyrLeu (SEQ-ID-Nr.: 32) ein (teilweise überlappend mit dem vorstehend beschriebenen Hexapeptid MetTyrProProProTyr (SEQ-ID-Nr.: 31)).
Wissenschaftler bei Glaxo haben kürzlich versucht, sowohl lineare als auch hinsichtlich der Konformation begrenzte Peptide zur Nachbildung dieser Region zu verwenden (Ellis et al. 1996). Die Glaxo-Studie führte jedoch zu keinem Herstellungsverfahren.
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Kurzdarstellung der Erfindung
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, die vorstehend beschriebenen Mängel auf dem Fachgebiet zu überwinden, indem biologisch aktive Peptidomimetika von CD28 oder CTLA-4 bereitgestellt werden.
Demgemäss stellt die vorliegende Erfindung Peptidomimetika von CD28 oder CTLA-4 bereit, die fähig sind, die Wechselwirkung von CD28 und/oder CTLA-4 mit CD80 (B7-1) und CD86 (B7-2) zu hemmen. Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung enthalten eine Kernsequenz, die den Aminosäureresten 2 bis 9 von SEQ-ID-Nr.: 1 entsprechen und die cyclisiert sind, und die an dieser Kernsequenz zusätzliche N-terminale und/oder C-terminale Aminosäurereste einschließen können.
Die vorliegende Erfindung stellt auch eine pharmazeutische Zusammensetzung, die Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung und pharmazeutisch verträgliche Exzipienten einschließt, bereit.
Des weiteren stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung der Verbindungen der vorliegenden Erfindung zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von pathologischen Zuständen und Erkrankungen, die durch die Hemmung der Wechselwirkung von CD28 und/oder CTLA-4 mit CD80 und CD86 gebessert werden, bereit.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
1 veranschaulicht schematisch die Beteiligung von CD28 bei der Aktivierung von T-Helferzellen.
2 zeigt die Anordnung der Aminosäuresequenz von CD28 (SEQ-ID-Nr.: 33), CTLA-4 (SEQ-ID-Nr.: 34); und REI (SEQ-ID-Nr.: 35), die zur molekularen Modellierung von CD28/CTLA-4 verwendet wurde.
3 zeigt ein molekulares Modell in Form eines Banddiagramms des CTLA-4-Homodimers, basierend auf dem REI-Templat.
4 zeigt die Anordnung der Aminosäuresequenz des B7-1-Proteins (SEQ-ID-Nr.: 36) mit einer schweren Ig-Kette des MCO-Antikörpers (SEQ-ID-Nr.: 37).
5 zeigt ein Banddiagramm des CTLA-4-Monomer/B7-1-Proteinkomplexes.
6 zeigt ein Säulendiagramm einer Bewertung der Peptide AT 199, 200 und 201 in einem Human-MLR (A gegen B).
7 zeigt ein Säulendiagramm einer Bewertung der Peptide AT 199, 200 und 201 in einem Human-MLR (B gegen A).
8 zeigt ein Säulendiagramm einer Bewertung von cyclisierten und linearen AT 199 Peptiden in einem Human-MLR (A gegen B).
9 zeigt ein Säulendiagramm einer Bewertung der Peptide AT 199 und 201 in einer Maus-MLR.
10 zeigt ein Säulendiagramm eines Toxizitätstests der Peptide AT 199 und 200 in THP-1-, Jurkat- und PLB-Zellen.
11 zeigt ein Säulendiagramm zur Wirkung der Peptide AT 199 und 200 auf die PHA-vermittelte Stimulierung von PBL.
Beschreibung der Erfindung im Einzelnen
Die biologisch aktiven Peptidomimetika von CD28 oder CTLA-4 gemäß der vorliegenden Erfindung sind unter Anwendung einer molekularen Modellierungsstrategie gestaltet worden, die auf einem "Haut und Knochen" – Gestaltungstyp basieren, wie nachstehend diskutiert.
Sowohl CD28 als auch CTLA-4-Proteine sind homodimere Mitglieder der Ig-Superfamilie, die aus einer einzigen variablen Ig-Domäne bestehen. Es wurde eine Homologie-Suche in der Brookhaven-Datenbank der bekannten Strukturen durchgeführt und es wurde ein kristallisiertes Beispiel eines Ig-Homodimers (Code – REI) gefunden. Die Anordnung der in den Modellierungsstudien verwendete Sequenz ist in 2 dargestellt.
Sowohl die Modelle für CTLA-4 als auch für CD28 wurden konstruiert, indem Seitenketten des REI-Templats ersetzt wurden. Da die Länge der CDR3-Loop in REI zwei Aminosäuren kürzer ist als die entsprechende Region entweder von CD28 oder von CTLA-4, wurde eine CDR3-Loop einer geeigneten Länge (erhalten aus der Brookhaven-Datenbank, PDB1JHL.ENT) an das Templat-Molekül aufgepfropft. Das neu konstruierte Modell wurde mittels einer Konjugat-Gradienten-Funktion bis zur Konvergenz minimiert. Fünf Cyclen mit anelierter Dynamik (annealed dynamics) (Iteration einer Energie-abhängigen Simulation der molekularen Bewegung, gefolgt von einer energetischen Minimierung) wurden angewendet, um die Struktur vor dem abschließenden Minimierungsschritt zu optimieren. Ein Banddiagramm des CTLA-4-Homodimers ist in 3 dargestellt.
Das molekulare Modell des B7-1-Moleküls wurde analog zu der für CD28/CTLA-4 angewendeten Strategie konstruiert. Die beste bei einer Suche in der Brookhaven-Datenbank gefundene Anordnung war die schwere Kette einer Ig-Variablen und die konstante Domäne des MCO-Antikörpers. Die zum Aufbau des B7-1-Modells verwendete Sequenzanordnung ist in 4 dargestellt.
Nachdem das Modell für B7-1 konstruiert wurde, wurde ein vorläufiges Modell des CTLA-4 (CD28)/B7-1-Komplexes gebaut. Mehrere Arbeitsgruppen haben umfangreiche Untersuchungen zur ortsspezifischen Mutagenese veröffentlicht, die auf die Definition der bei der Komplexbildung beteiligten CTLA-4/B7- Oberflächen gezielt waren (Peach et al., 1994, 1995; Guo et al., 1995). Diese Mutationen wurden an den modellierten Proteine ausgerichtet und sie dienten als Leitfaden bei der Bildung des homodimeren Bindungskomplexes. Aus Gründen der Vereinfachung zeigt 5 nur das monomere CTLA-4-Molekül, das mit B7-1 in Wechselwirkung tritt.
Bei der Herstellung der Peptidomimetika von CD28 oder CTLA-4 als Inhibitoren des CD28 co-stimulatorischen Signalwegs wurden die vorstehend beschriebenen molekularen Modelle als Gestaltungsmodelle verwendet. Die Peptidomimetika gemäß der vorliegenden Erfindung, die zur Hemmung der Wechselwirkung von CD28 und/oder CTLA-4 mit CD80 (B7-1)- und CD86 (B7-2)-Molekülen fähig sind, weisen eine Aminosäurekernsequenz, LeuMetTyrProProProTyrTyr, die den Aminosäureresten 2 bis 9 von SEQ-ID-Nr.: 1 entspricht, auf. Zusätzlich zu dieser Aminosäurekernsequenz können die Peptidomimetika zusätzlich zu den Aminosäureresten 2 bis 9 von SEQ-ID-Nr.: 1 weitere N-terminale und/oder C-terminale Reste aufweisen.
Vorzugsweise befindet sich ein Cys-Rest sowohl unmittelbar N-terminal als auch unmittelbar C-terminal zu der in SEQ-ID-Nr.: 1 dargestellten Aminosäurekernsequenz. Das Peptidomimetikum der vorliegenden Erfindung liegt cyclisiert vor. Die cyclisierten Peptidomimetika der vorliegenden Erfindung schließen die Sequenz von SEQ-ID-Nr.: 1 ein und die Cyclisierung des Peptids erfolgt vorzugsweise über eine Cys-Cys-Disulfidbrücke zwischen den Resten 1 (Cys) und 10 (Cys) von SEQ-ID-Nr.: 1. Andererseits kann das Peptidomimetikum mit einem Linker, wie einem synthetischen chemischen Linker, cyclisiert werden, der den Rest 2 (Leu) und den Rest 9 (Tyr) der Aminosäurekernsequenz verbindet, welcher den Resten 2 bis 9 von SEQ-ID-Nr.: 1 entspricht. Somit erfolgt die Cyclisierung vorzugsweise innerhalb einer Aminosäure des Rests 2 und des Rests 9 von SEQ-ID-Nr.: 1. Andere Beispiele für synthetische chemische Linker schließen chemischen Linker ein, die in Olson et al. (1993), usw. offenbart sind, wie eine Lys-Asp- Salzbrücke, die Lanthanid-Cyclisierung, die N-terminale bis C-terminale Cyclisierung, sie sind jedoch nicht auf diese beschränkt.
Es ist auch bevorzugt, dass in den Peptidomimetika der vorliegenden Erfindung zusätzlich zu der Kernsequenz, die den Resten 2 bis 9 von SEQ-ID-Nr.: 1 entspricht, bis zu elf weitere Aminosäurereste am N-terminalen Ende vorliegen, und/oder bis zu elf weitere Aminosäurereste am C-terminalen Ende vorliegen. Bevorzugter liegen zwei weitere Aminosäurereste sowohl am N-terminalen als auch am C-terminalen Ende zusätzlich zur Sequenz von SEQ-ID-Nr.: 1 vor, wobei diese zusätzlichen Aminosäurereste positiv geladene Aminosäurereste sind. Die Aminosäuresequenz von SEQ-ID-Nr.: 2 ist ein Beispiel für eine bevorzugte Ausführungsform eines cyclisierten Peptidomimetikums der vorliegenden Erfindung, wobei die Cyclisierung über eine Cys-Cys-Disulfidbrücke zwischen den Resten 3 und 12 von SEQ-ID-Nr.: 2 erfolgt.
Die Peptidomimetika gemäß der vorliegenden Erfindung können des weiteren eine oder mehrere Aminosäuresequenzen einschließen, ausgewählt aus SEQ-ID-Nr.: 5, SEQ-ID-Nr.: 7, SEQ-ID-Nr.: 14, SEQ-ID-Nr.: 19 und SEQ-ID-Nr.: 20, welche miteinander verbunden sein können und/oder an die SEQ-ID-Nr.: 1 oder die Sequenz, die den Resten 2 bis 9 von SEQ-ID-Nr.: 1 entspricht, gebunden sein können, entweder direkt oder über einen geeigneten synthetischen chemischen Linker. Es ist auch vorgesehen, dass die Peptidomimetika der vorliegenden Erfindung jene Peptidomimetika einschließen, in denen ein oder mehrere derartige bioisotere Fragmente wie sie bei der Gestaltung von Arzneistoffen verwendet werden, in Kombination mit oder anstelle der zusätzlich zur Aminosäurekernsequenz vorhandenen weiteren N-terminalen und/oder C-terminalen Resten vorliegen.
Es sollte erwähnt werden, dass die Peptidomimetika der vorliegenden Erfindung keine Fragmente von CTLA-4/CD28-Molekülen sind, dass sie jedoch spezifisch gestaltet und nachfolgend aus einer Vielzahl von Möglichkeiten ausgewählt worden sind, basierend auf den Ergebnissen der in den Beispielen beschriebenen biologischen Tests.
Die hier verwendete Strategie war es, sowohl potenzielle Kontaktoberflächen von CD28/CTLA-4-Proteinen mit B7 zu identifizieren und zu verwerten als auch eine Region des CD28/CTLA-4-Moleküls auszuwählen, die für die Vermittlung der Homodimer-Bildung verantwortlich ist, als ein Mittel zur potenziellen Zerstörung der geeigneten Präsentation des Homodimers.
Sechs Regionen der modellierten CD28/CTLA-4-Moleküle wurden als potenzielle Ziele für die Peptidgestaltung identifiziert (siehe Tabelle 1).
Tabelle 1: Hergestellte untersuchte Peptide
Die erste Region entspricht dem aminoterminalen Ende des Proteins. Diese ist eine lang gezogene (β-Strang) Ausdehnung von Aminosäuren und sie ist der Einführung der Konformationsbeschränkungen nicht zugänglich. Es wird vorausgesagt, dass das aminoterminale Ende direkt unterhalb der CDR3-Region liegt und einen Teil der B7-Kontaktoberfläche bildet.
Die zweite Region entspricht dem CDR1 analogen Teil des Proteins. Durch Untersuchungen mittels ortsspezifischer Mutagenese ist gezeigt worden, dass die CDR1-Domäne an der Bindung an B7 beteiligt ist (Peach et al., 1994). Da die CDR1-Region keine dichte β-Drehung bildet, sondern eher eine lose ausgebildete Loop (Schleife), ist es schwierig, die konformativ abgegrenzten Peptide zu gestalten, die diese Region ausbilden. Die hier angewendete Strategie war es, eine maximale Flexibilität an den abgegrenzten Peptiden zu erhalten, die für diese Region gestaltet wurden.
Der dritte Peptidsatz wurde entsprechend der Loop-Region zwischen den Resten 40–45 hergestellt, die eine der hauptsächlichen Kontaktstellen bilden, von denen angenommen wird, dass sie das Homodimer zusammen halten. Da das an der Zelloberfläche funktionell exprimierte CD28/CTLA-4 vorrangig in Form eines Homodimers vorliegt (es gibt Hinweise darauf, dass einige der monomeren Präsentationen entsprechend B7 beteiligt sind), wobei es der Zweck dieser Analoge war, die Bildung des Homodimers zu zerstören.
Von dem vierten Peptidsatz, der sich von der 60–65 Loop ableitet (SEQ-ID-Nr.: 15, 16 und 17), wird nicht angenommen, dass er ein Teil der B7-Kontaktoberfläche ist, er bildet jedoch eine Loop, die sich hauptsächlich an der Oberfläche befindet. Gemäß dem vorliegenden Wechselwirkungsmodell sollten die entsprechend dieser Region gestalteten Peptide keinerlei biologische Aktivität besitzen. Sollte ein beliebiges dieser Analoge eine hemmende Wirkung aufweisen, dann ist dies der Beweis, dass das vorliegende Wechselwirkungsmodell ungenau ist.
Es wird angenommen, dass die durch die Reste 70–57 gebildete Loop an dem direkten Kontakt mit B7 beteiligt ist. Aus dieser Region wurden drei Analoge synthetisiert (siehe Tabelle 1, SEQ-ID-Nr.: 18, 19 und 20). AT 132 stellt die abgegrenzte native Sequenz dar. Die Modellierung dieses Analogen ließ vermuten, dass die vorgesehene Loop nicht stabil ausgebildet wurde. AT 133 wurde gestaltet, um dieser Instabilität abzuhelfen, indem als Ersatz für den hoch flexiblen Glycylrest ein Prolin eingeführt wird (ein verhältnismäßig starrer, die Drehung fördernder Rest). AT 135 ist ein kürzeres Analoges von AT 133, dass dazu dienen soll, die Beteiligung der Reste zu untersuchen, die den zentralen Teil der 70–75 Loop flankieren.
Abschließend wurde die zu CDR3 analoge Region von CTLA-4/CD28 verwendet (SEQ-ID-Nr.: 21–30). Einzelne ortsspezifische Mutationen in dieser Region von CTLA-4Ig hoben vollständig die Bindung an B7 auf (Peach et al., 1994). Die Gestaltung eines analogen Modells dieser Region brachte jedoch einige beträchtliche Herstellungsprobleme mit sich. Die zentrale Hexapeptidsequenz aus dieser Region ist MetTyrProProProTyr (SEQ-ID-Nr.: 31). Dieses sind verhältnismäßig hydrophobe Reste und die Tripleausdehnung Prolin ist konformativ starr. In Bezug auf das molekulare Modell des CTLA-4/B7-Komplexes wird angenommen, dass diese Region den Teil für einen engen Kontakt darstellt. Es gibt Hinweise, dass die meisten wirksamen Inhibitoren von Protein-Protein-Wechselwirkungen in der Regel eine elektrostatisch wirksame "Zeit"-sequenz benötigen, die das auslösende "Händeschütteln" (Hand-Shaking) des Bindungsereignisses nachbildet. In der Konsequenz wurde bei der Herstellung des CDR3-Panels von Analogen eine Vielzahl verschiedener Verfahren angewendet. Die Analyse des Oberflächengebiets, das die CDR3-Region des Proteins umfasst, weist darauf hin, dass es von einem positiv geladenen Potenzial umgeben ist. Daher wurden Lysin, Arginin und Histidin als endständige Reste der Analogen eingebaut, um diese positive Potenzial nachzubilden und die Löslichkeitseigenschaften der synthetisierten Peptide zu unterstützen.
In dem besonderen Fall von AT 199 wurde ein Hybridanaloges gestaltet. Als erstes wurden vier stark geladene (positiv) Reste benachbart zu den Cysteinen eingebaut, welche sowohl die amino- als auch die carboxyterminalen Enden dieses Analogen flankieren. Da hydrophobe Reste dazu neigen, sich von den hydrophilen Resten zu entfernen, sollte dieses Gestaltungsmodell die MetTyrProProProTyr-Loop (SEQ-ID-Nr.: 31) von den positiv geladenen Resten entfernen und die exakte Bildung der CDR3-Drehung unterstützen. Die flankierenden Reste wurden ausgewählt, um die Reste nachzubilden, die sich räumlich gegenüberstehend zu der CDR3-Region in dem nativen Protein befinden und die an der Bindung an B7 beteiligt sind. Sie stellen auch wichtige Orte für den elektrostatischen Kontakt dar.
Das Arginin an dem aminoterminalen Ende des Analogen ist eine Nachbildung von Arg33 in dem nativen Protein. Der Histidinrest an dem carboxyterminalen Ende des Peptids soll His2 an dem aminoterminalen Ende des Proteins nachbilden, welcher direkt unterhalb der CDR3 Region liegt.
Die Peptide AT 200 und AT 201 wurden als Kontrollen für AT 199 gestaltet. Peach et al. (1994) hatten gezeigt, dass eine einzelne Substitution eines Methioninrestes durch einen Alaninrest in der CDR3-Region zu einer vollständigen Aufhebung der Bindung von CTLA-4Ig an B7 führt. Daher ist AT 200 bezüglich der Sequenz mit AT 199 identisch, mit der Ausnahme, dass Met durch einen Ala-Rest ersetzt ist. AT 201 ist bezüglich der Sequenz ebenfalls mit AT 199 identisch, mit der Ausnahme, dass Met durch einen flexiblen Gly-Rest ersetzt ist.
Die Peptidomimetika der vorliegenden Erfindung können durch jedes beliebige auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren hergestellt werden, insbesondere durch gut etablierte chemische Syntheseverfahren, die automatische Festphasen-Peptidsynthesizer nutzen, mit nachfolgender chromatografischer Reinigung. Insbesondere könnte mit den, in den Beispielen offenbarten Verfahren die Herstellung und vorzugsweise die Cyclisierung derartiger Peptide nachvollzogen werden.
Die pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung von pathologischen Zuständen und Erkrankungen, die durch die Hemmung der Wechselwirkung von CD28 und/oder CTLA-4 mit CD80 und CD86 gemäß der vorliegenden Erfindung gebessert werden, enthält ein im Wesentlichen gereinigtes Peptidomimetikum als einen wirksamen Inhaltsstoff. Abhängig davon, ob das Peptidomimetikum eine oder mehrere Aminosäuresequenzen von SEQ-ID-Nr. 5; SEQ-ID-Nr. 7; SEQ-ID-Nr. 14; SEQ-ID-Nr. 19; und SEQ-ID-Nr. 20 einschließt, kann die pharmazeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung des weiteren ein oder mehrere getrennte Peptide einschließen, die eine Aminosäuresequenz aufweisen, ausgewählt aus SEQ-ID-Nr. 5; SEQ-ID-Nr. 7; SEQ-ID-Nr. 14; SEQ- ID-Nr. 19; und SEQ-ID-Nr. 20, wenn sie nicht bereits in dem Peptidomimetikum vorliegen.
Beispiele für pathologische Zustände und Erkrankungen, in denen die Peptidomimetika der vorliegenden Erfindung vorteilhafter Weise als ein prophylaktisches, ein therapeutisches oder ein diagnostisches Mittel verwendet werden können, sind Erkrankungen des Immunsystems und Krebserkrankungen. Spezielle Beispiele schließen derartige Autoimmunerkrankungen, wie Psoriasis, Multiple Sklerose, Lupus Erythematosus, Diabetes, rheumatische Arthritis, ein, sowie die Therapie der Abstoßungen von Transplantaten, einschließlich bei der Transplantation fester Organe und bei zellulären Transplantaten, sie sind jedoch nicht auf diese beschränkt.
Weitere Gegenstände und Vorteile der vorliegen Erfindungen sind anhand der nachfolgenden Beschreibung ersichtlich.
Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Verabreichung einer pharmakologisch wirksamen Menge des Peptids der vorliegenden Erfindung an Personen mit einem Risiko zur Entwicklung von pathologischen Zuständen und Erkrankungen, die durch die Hemmung der Wechselwirkung von CD38 und/oder CTLA-4 mit CD80 und CD86 gebessert werden oder an Personen, die bereits derartige pathologische Zustände und Erkrankungen aufweisen.
Jeder beliebige mit dem Wirkprinzip verträgliche Weg der Verabreichung kann angewendet werden, besonders bevorzugt ist jedoch die parenterale Verabreichung, da systemische Wirkungen in einem kürzeren Zeitraum erreicht werden können. Die parenterale Verabreichung kann auf einer Vielzahl verschiedener Wege erfolgen, einschließlich aber nicht ausschließlich subkutan, intravenös, intradermal, intramuskulär, intraperitonal, intracerebral, intranasal, oral, transdermal oder buccal.
Es ist klar, dass die Dosierung der zu verabreichenden Peptide von dem Alter, dem Geschlecht, dem Gesundheitszustand, dem Gewicht, der Art der begleitenden Behandlung und der Häufigkeit der Behandlung abhängt. Dem Fachmann ist klar, dass die Dosierung auf den einzelnen Patienten zugeschnitten wird und er kann diese leicht bestimmen. Die Dosierung kann zwischen 0,1 bis 20 mg/kg Körpergewicht liegen, und sie liegt vorzugsweise zwischen 0,1 und 1 mg/kg Körpergewicht.
Die pharmazeutische Zusammensetzung zur parenteralen Anwendung, einschließlich des Wirkprinzips und eines geeigneten Vehikulums, kann in injizierbarer Form hergestellt werden. Vehikula zur parenteralen Verabreichung sind auf dem Fachgebiet gut bekannt und sie schließen beispielsweise Wasser, Kochsalzlösung und physiologische Puffer ein. Das Vehikulum kann geringe Mengen an Exzipienten enthalten, um die Stabilität und den isotonen Zustand der Lösung aufrecht zu erhalten.
Die Herstellung der pharmazeutischen Zusammensetzungen kann entsprechend den üblichen Vorgehensweisen ausgeführt werden, und vorzugsweise liegt der Peptidgehalt im Bereich zwischen 10 mg/ml und 1 000 mg/ml.
Die Erfindung wird im nachfolgenden anhand von Beispielen und den beigefügten Figuren beschrieben, wobei diese die vorliegende Erfindung in keiner Weise einschränken.
Beispiel 1: Peptidsynthese
Gemäß der nachfolgend beschriebenen Fmoc-Standardverfahren wurden 34 Peptide synthetisiert, wobei die Abkürzungen wie folgt sind: Acetonitril (ACN), Benzyl (Bzl), tert-Butyloxycarbonyl (BOC), Dichlormethan (DCM), Diisopropylethylamin (DIEA), Dimethylformamid (DMF), 5,5''-Dithiobis[2-nitrobenzoesäure] (DTNB), 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl (FMOC), 2-[1H-Benzotriazol-1-yl]-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorophosphat (HBTU), 1-Hydroxybenztriazol (HOBt), N-Methylmorpholin (NMM), N-Methylpyrrolidon (NMP), 2,2,5,7,8-Pentamethylchroman-6-sulfonyl (PMC), tert-Butyl (tBu), Triphenylmethyl (TRT), Trifluoressigsäure (TFA), Heptafluorbuttersäure (HFBA).
Harze
Das hauptsächlich verwendete Harz ist ein Rink-Amid-Methylbenzylhydrylamin-Harz, das einen Standardträger bei der Synthese von Peptiden mit einem C-terminalen Amid darstellt. Für Peptide, die ein freies C-terminates Carbonsäure-Ende erfordern, werden Wang-Harze verwendet, an denen die erste Fmoc-Aminosäure gebunden ist. Die Wang-Harze, die einen p-Benzoyloxybenzyl-Henkel enthalten, stellen die Standardträger zur Herstellung von Peptidsäuren durch das Fmoc-Festphasen-Verfahren im Großmaßstab dar. Beide Harze wurden von NovaBiochem bezogen.
Bei der Synthese verwendete Aminosäuren
Zusammenbau der Ketten
Zunächst wurden geschützte Peptidketten unter Anwendung der Fmoc-Strategie mittels eines Peptidsynthesizers Inc. Modell 431A von Applied Biosystems oder eines Rainin Symphony Multiple Peptidsynthesizers hergestellt. Beide Synthesizer nutzen Basen-labile Fmoc N-terminal geschützte Aminosäuren mit geeigneten Seitenkettenschutzgruppen, 20% Piperidin zur Entfernung der N-terminalen Schutzgruppen und HBTU zur Aktivierung und Kupplung der Aminosäuren.
Spaltung/Extraktion
Die zur Entfernung der Seitenkettenschutzgruppen und Freisetzung des Peptids aus dem Harz verwendeten Standardspaltungscocktails: Gemisch A: 95% TFA, 5% entionisiertes Wasser.
Für Peptide, die kein Arginin, Methionin, Tryptophan enthalten, oder Aminosäuren mit der Trityl-Schutzgruppe (Cystein, Histidin, Asparagin, Glutamin): Gemisch B: 82,5 TFA, 5% Phenol, 5% entionisiertes Wasser, 5% Thioanisol, 2,5% Ethandithiol.
Für Arginin oder Methionin enthaltende Peptide: Gemisch B: 87% TFA, 4,3% entionisiertes Wasser, 4,3% Thioanisol, 4,3% Ethandithiol.
Ein alternativer Cocktail für Peptide, die Arginin oder Methionin enthalten: Gemisch C: 95% TFA, 2,5% entionisiertes Wasser, 2,5% Ethandiol.
Für Peptide, die kein Arginin oder Methionin enthalten und die Tryphtophan oder die Trityl-Schutzgruppe enthalten: die Spaltungsreaktion wurde unter Verwendung von 100 mg–1 g Peptid-Harz ausgeführt, das in ein 20 ml-Glasgefäß gegeben und mit einem Eisbad gekühlt wird. Der Spaltungscocktail wird hergestellt und gleichfalls in einem Eisbad gekühlt, und anschließend dem Peptid-Harz bis zu einem Endvolumen von annähernd 10 ml zugesetzt. Das Gefäß wird aus dem Eisbad entfernt und bis auf Raumtemperatur erwärmt. Das Gefäß wird verschlossen und das Reaktionsgemisch wird über einen Zeitraum von 1,5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach 1,5 Stunden wird die Lösung mittels Vakuum durch einen mittel- bis grobkörnigen porösen Filter in annähernd 30 ml kaltem MTBE (Methyl-t-butylether) filtriert. Das Reaktionsgefäß wird mit 1 ml TFA gewaschen und durch den gleichen Filtertrichter in den kalten MTBE filtriert. Die gesamte Lösung wird anschließend in ein 50 ml-Zentrifugenröhrchen überführt und annähernd 10 Minuten bei 2000 U/min bei Raumtemperatur zentrifugiert. Der Überstand wird abgesaugt und der Niederschlag wird in 40 ml kalten MTBE resuspendiert und erneut zentrifugiert. Dieser Schritt wird einmal wiederholt. Der abschließende Überstand wird abgesaugt und der Niederschlag wird mit Stickstoff behandelt, um den größten Teil des verbliebenden Ethers abzudampfen. Das Peptid wird anschließend in 20–30 ml einer wässrigen 1%–10% Essigsäure gelöst, mit annähernd 100–150 ml entionisiertem Wasser verdünnt, eingefroren und lyophilisiert.
Beispiel 2: Cyclisierung
Peptide, die mit zwei Cysteinen zur Cyclisierung über eine Disulfidbindung gestaltet werden, werden auf einem dieser beiden Wege behandelt. Wenn mittels analytischer HPLC nachgewiesen wird, dass das ungereinigte Peptid eine Reinheit von wenigstens 65% ohne wesentliche sekundäre Peaks aufweist (> 20% des Hauptprodukts), wird das Peptid als erstes cyclisiert und anschließend gereinigt. Dieses betrifft etwa 90% der Peptide, die an der Einrichtung hergestellt wurden. Weist das ungereinigte Peptid wesentliche sekundäre Deletionsprodukte auf, wird es zunächst gereinigt, anschließend cyclisiert und dann erneut gereinigt.
Das Verfahren zur Cyclisierung umfasst die Bildung einer Disulfidbindung durch Luftoxidation. Als erstes werden 25 mg–100 mg ungereinigtes Peptid in entionisiertem Wasser mit einem Verhältnis von 6–10 ml/mg Peptid gelöst. Während des Rührens wird der pH-Wert der Lösung mit 1,0 M NH₄HCO₃ (pH 8, 5) auf annähernd 8,3 erhöht. Die Lösung wird über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, wobei ausreichend gerührt wird, damit Wirbelbewegungen entstehen, die bis nahe an den Boden des Gefäßes heran reichen. Am nächsten Tag (annähernd 18–24 h) wird die Cyclisierung des Peptids mittels analytischer Umkehrphasen-HPLC bezüglich charakteristischer Veränderungen in den Retentionszeiten und bei einer Absorption bei 280 nm, die der Disulfidbindung entspricht, überprüft. Die Lösung wird anschließend lyophilisiert und gelagert oder gereinigt, indem sie direkt auf eine präparative Umkehrphasen-HPLC-Säule geladen wird.
Reinigung
1. Präparative Umkehrphasen-HPLC

Anmerkung: Peptide, die zu einer hydrophoberen Natur neigen, werden unter Verwendung von HFBA anstelle von TFA gereinigt, um die chromatografische Auflösung des Endprodukts zu verbessern.
Bedingungen: System – Walters Delta Prep 4000-
Säule – Vydac Umkehrphase C18, 10 μm, 2,2 × 25 cm (Kat.-Nr. 218TP1022)
Puffer – A: Wasser/0,1% TFA B: Acetonitril/0,1% TFA
Flussrate – 15 ml/Minute
Detektion – Waters 484 UV-Detektor, 220 nm
Gradient – Variable, üblicherweise 0,33% B/min bis zu 1,0% B/min

Die lyophisilisierten ungereinigten Peptide werden hergestellt, indem 50–100 mg Peptid in 200 ml wässriger 0,1% TFA gelöst werden. Den cyclisierten Peptiden, die bei pH 8–8,5 bereits in Lösung vorliegen, wird zunächst reines TFA zugesetzt, um den pH-Wert auf einen Bereich von 2–3 zu senken. Die Peptidlösung wird anschließend direkt durch das Pufferreservoir "A" auf eine präparative Säule aufgetragen und das Gradientenprogramm wird gestartet. Die gesammelten Fraktionen werden über ein analytisches HPLC-System mit einem Autosampler über Nacht laufen lassen. Überlappende Fraktionen, deren Reinheit mittels Peakintegration mit > 95% bewertet wird, werden gepoolt und lyophilisiert.
Sep-Pak-Reinigung

Bedingungen: Ausrüstung – Baker-Festphasen-Extraktion
12-Öffnungsleitung
Säulen – Waters Vac 12 cc 2 Gramm Sep-Pak-Säule
Puffer – H₂O/0,1% TFA
20%, 30%, 50%, 99,9% Acetonitril/0,1% TFA Lösungen

Die ungereinigten lyophilisierten Peptide werden hergestellt, indem 15–25 mg Peptid in 8 ml wässriger 0,1% TFA gelöst werden. Sep-Pak-Säulen werden als erstes konditioniert mit 30 ml 99,9% ACN/0,1% TFA, gefolgt durch 30 ml H₂O/0,1% TFA. Die Peptidlösungen werden aufgetragen, dem folgt ein weiterer Waschvorgang mit H₂O/0,1% TFA, anschließend werden sie entweder mit 20% oder mit 30% ACN/0,1% TFA Puffern eluiert. Ein abschließender Waschvorgang mit 50% ACN/0,1% TFA wird durchgeführt, um die vollständige Elution sicherzustellen sowie aus Vergleichszwecken. Das aufgetragenen Volumen, die H₂O-Waschlösungen, die Volumina an 20%–30% ACN und 50% ACN werden getrennt gesammelt und anschließend mittels analytischer HPLC überprüft. Die eluierten Peptidlösungen werden anschließend 3 : 1 mit entionisiertem Wasser verdünnt und lyophilisiert.
Beispiel 3: Charakterisierung
1. Analytische Umkehrphasen-HPLC (zur Überprüfung der Homogenität des Endprodukts)

Bedingungen: System – Waters 500 Pumpen, 717 Autosampler, 490 Multiwellenlängen-UV-Detektor
Säulen – Vydac C 18,5 mm, 046 × 0, 25 cm (Kat.-Nr. 218TP54)
Puffer – A: H₂O/0,1% TFA B: Acn/0,1% TFA
Flussrate – 1 ml/Minute
Detektion – 214 nm, 280 nm
Gradient – 2% B/Minute

Gereinigte lyophilisierte Peptidproben werden hergestellt, indem 0,2–1,0 mg Peptid in wässriger 0,1% TFA bis zu einer Konzentration von 0,5–1,0 mg/ml gelöst werden. 15–18 μl werden auf die Säule injiziert und mit einem Gradientenprogramm von 0–50% ACN 25 Minuten eluiert. Die Chromatografiedaten werden erfasst und mittels eines Waters Expert-ease-Software-Systems gespeichert.
2. Massenspektrometrie (zur Überprüfung der Homogenität und der kovalenten Struktur)

System: Perseptive Biosystems Voyager Elite
Typ: MALDI-TOF (Matrix-gestützte Laserdesorption/Ionisierung Time-of-flight)
Matrix: α-Cyano-4-hydroxyzimtsäure (Sigma, C-2020), 10 mg/ml in 67% ACN/0,1% TFA

Von den Peptiden werden Proben mit Konzentrationen von 1–10 μl in 50% ACN/0,1% TFA hergestellt. Auf die Wells der Analysenplatte werden 5 μl Peptidprobe gefolgt von 0,5 μl Matrixlösungen aufgetragen und trocknen lassen. Die Analysenplatte wird in das Gerät geladen und die Proben werden mittels eines verzögerten Reflektron-Extraktionsverfahrens gescannt und analysiert. Für jede Probe wird ein kumulatives Datensignal bei einem Laserbeschuss von 32–128 erfasst und analysiert. Jeder Lauf schließt eine Probe als auch ein Standardpeptid zur Kalibrierung ein.
3. Ellman-Reagenztest (zur Überprüfung der Cyclisierung der Disulfidbindung)
Die Cyclisierung der Disulfidbindung von Peptiden, die Tryptophan oder Tyrosin enthalten, können nicht mittels HPLC UV-Detektion bei 280 nm überprüft werden, infolge ihrer hohen Absorption bei dieser Wellenlänge. Der Ellman-Reagenztest auf Anwesenheit freier Sulfhydrylgruppen der Cycsteinseitenkette ist ein alternativer Indikator hinsichtlich der Bildung der Disulfidbindung.
Von den Peptiden werden Proben mit einer Konzentration von 0,5 mMol in Reaktionspuffer hergestellt (0,1 M Natriumphosphat, pH 8). Das Ellman-Reagenz, DTNB, wird mit einer Konzentration von 4 mg/ml und der Cysteinhydrochloridmonohydrat-Standard mit einer Konzentration von 0,5 mMol im gleichen Puffer hergestellt. 250 μl Probe, 50 μl Ellman-Reagenz und 2,5 ml Reaktionspuffer werden gemischt und 15 Minuten bei Raumtempe ratur inkubiert. Der Leerwert des Reaktionspuffers und eine Standardprobe an Cystein werden ebenfalls getestet. Eine gelbe Farbe kennzeichnet die Anwesenheit freier Sulfhydrylgruppen.
Beispiel 4: Human Mixed Lymphocyte Response (MLR)
Isolation von PBL: Vollblut von Spendern wurde von Interstate Blood Bank, Memphis, TN erhalten. Der Umgang mit den Blutproben erfolgt bei Sicherheitsstufe 2, so wie es für potenziell infektiöse Blutproben im CDC/NIH Manual Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories; 3. Ausgabe, 1993, Seite 10 gefordert wird. Periphere mononukleare Blutzellen (PBMC) wurden mittels Reinigung mit Ficoll-Hypaque von den roten Blutzellen und Granulozyten abgetrennt. Peripheres Gesamtblut wurde 1 : 2 in PBS verdünnt und 30 ml wurden in einem 50 ml Polypropylenröhrchen mit 15 ml Ficoll-Hypaque überschichtet. Die Röhrchen wurden 30 min bei 25°C bei 400 × g zentrifugiert. Nach der Zentrifugierung wurde die Grenzschicht zwischen der oberen Plasmaschicht und der unteren Ficollschicht gesammelt, die Zellen wurden 2 × mit RPMI 1640 gewaschen und die Zahl der lebensfähigen Zellen wurde mittels Trypanblau bestimmt. Die Zellen, die in dem Assay als Responder verwendet werden sollen, werden auf Eis gelagert, bis die Behandlung der Stimulatorzellen mit Mitomycin C beendet war.
Mitomycin C-Behandlung von Stimulatoren
PBMC, die wie vorstehend beschrieben isoliert wurden, und die in dem Assay als Stimulatoren verwendet werden sollen, werden auf 2–4 × 10⁶ Zellen/ml in Komplettmedium (RPMI 1640 enthaltend 10% Hitze-inaktiviertes humanes AB-Serum, 2 mM Glutamin, 50 μM 2-Mercatoethanol und 100 U/ml Penicillin – 100 μg/ml Streptomycin) eingestellt und 30 min mit Mitomycin C (25 μg/ml) in einem 37°C Wasserbad behandelt. Nach der Behandlung wurden die Zellen 3 × mit 5 Volumen Komplettmedium gewaschen und die Zahl der lebensfähigen Zellen wurde mittels Trypanblau bestimmt. Um autologe Stimulationskontrollen einsetzen zu können, wurden einige Responderzellen ebenfalls mit Mitomycin C wie vorstehend beschrieben behandelt.
CTLA-4Ig und Peptide
Gereinigtes CTLA-4Ig-Fusionsprotein wurde als 1 mg/ml Lösung in sterilem PBS aus einer NS-1-Zelllinie, die freundlicherweise von Dr. T. Strom (Beth Israel Hospital, Boston, MA) zur Verfügung gestellt wurde, wie in Steurer et al., 1995, beschrieben, hergestellt. Das Protein wurde bei –80°C gefroren gelagert. Nach dem Auftauen wurde die aliquote Menge bei 4°C gelagert. Die gereinigten Peptide wurden entsprechend der bekannten Verfahren lyophilisiert. Es wurden 2 mM Konzentrationen der Peptide in sterilem PBS, pH 7,4, hergestellt, in Mikroreagenzröhrchen in aliquoten Mengen gefüllt und bei –20°C eingefroren. Für das Assay wurde eine aliquote Menge des Peptids aufgetaut und bis auf 200 μM in Komplettmedium verdünnt.
Mixed Lymphocyte Response Assay (Human)
Für das one-way allogene Mixed Lymphocyte Response (MLR) Assay wurden Responderzellen mit einer Konzentration von 10⁵ Zellen/Well und Stimulatorzellen mit einer Konzentration von 5 × 10⁹ Zellen/Well in 96-Well-Rundboden-Platten ausplattiert. Die Zellen wurden mit seriellen Verdünnungen an anti-CD4 Ab Leu 3A (1 μg/ml–0,06 μg/ml) als Dreifachbestimmungen oder einem Isotyp-angepassten Kontroll-Ab inkubiert. Als eine zusätzliche Kontrolle wurde Cyclosporin A mit einer Konzentration von 1 μg/ml verwendet.
CTLA-4Ig wurde in Konzentrationen von 10 μg/ml bis 0,15 μg/ml seriell verdünnt und getestet. Die Peptide wurden entweder direkt oder in Anwesenheit einer konstanten Impfdosis an CTLA-4Ig bei einer Konzentration von 0,5 μg/ml getestet. Die Platten wurden 7 Tage bei 37°C in befeuchteter 5% CO₂-Atmosphäre inkubiert.
Die Proliferation der Zellen wurde bestimmt, indem die Wells die letzten 18 h des Assays mit ³H-Tdr (1 μCi/Well) gepulst wurden. Die Platten wurden mittels eines Tomtec-Plattenharvesters geerntet und die eingebauten Counts wurden unter Verwendung eines Mikrobetaplatten-plus-Readers bestimmt.
Mitogen Stimulationsassay
Für diese Assays wurden die Ficoll-Hypaque gereinigten PBMC (10⁵ Zellen/Well) in 96-Well-Flachboden-Gewebekulturplatten mit den angezeigten Konzentrationen an Phytohämagglutinin (PHA: 5, 2,5, 1,25, 0,5 μg/ml) über einen Zeitraum von 3 Tagen bei 37°C in einem befeuchteten 5%CO₂/Luft-Inkubator inkubiert. Die Zellen wurden in An- oder Abwesenheit verschiedener Konzentrationen an CTLA-4Ig, gereinigten anti-CD80 Ab (1 μg/ml), anti-CD86 Ab (1 μg/ml) und den seriell von 100 μM bis 12,5 μM verdünnten Peptiden 199 und 201 für die Zeitdauer des Assays inkubiert.
Die Proliferation der Zellen wurde bestimmt, indem die Wells die letzten 6 h des Assays mit ³H-Tdr (1 μCi/Well) gepulst wurden. Die Platten wurden mittels eines Tomtec-Plattenharvesters geerntet und die eingebauten Counts wurden unter Verwendung eines Wallace-Mikrobetaplatten-plus-Readers bestimmt.
Beispiel 5: Maus-MLR
Die one-way Maus-MLRs wurden durchgeführt unter Verwendung von Maus-C57B1/6-Splenozyten als Stimulatoren und BalB/c-Splenozyten als Responder.
Isolierung von Maus-Splenozyten
6-8 Wochen alten Mäusen wurde die Milz entnommen (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME). Die Zellen wurden aus der Kapsel mittels steriler vereister Deckplättchen aus Glas abgetrennt und 1 × in kaltem RPMI 1640 gewaschen. Die roten Blut zellen wurden lysiert, indem die Splenozytensuspension mit kaltem Trisammoniumchlorid-Puffer (2 ml/Milz) auf Eis über einen Zeitraum von 3 min behandelt wurde. Nach der Lyse wurden die Zellen 2 × mit 5 Volumen Komplettmedium (RPMI 1640 enthaltend 10% Hitze-inaktiviertes FKS, 2 mM Glutamin, 50 μM 2-Mercaptoethanol, 100 U/ml Penicillin – 100 μg/ml Streptomycin, 1 mM Natriumpyruvat und 1 mM nicht-essentielle Aminosäuren) gewaschen.
Die Kunststoff-adhärenten Zellen wurden aus den Splenozyten von Balb/c-Mäusen entfernt, indem die Zellkonzentration auf 3 × 10⁶ Zellen/ml in Komplettmedium eingestellt wurde und die Zellen 1,5–2 h bei 37°C in T-75 Flaschen inkubiert wurden. Nach der Inkubation wurden die nicht-adhärierten Zellen gesammelt, indem die Flaschen sorgfältig gewaschen wurden und die prozentuale Ausbeute (60–70%) bestimmt wurde. Balb/c-Responderzellen wurden auf Eis gelagert bis die Mitomycin C-Behandlung der Stimulatorzellen beendet war.
Mitomycin C-Behandlung von Stimulatoren
Nach der RBC-Lyse wurden die Splenozyten von C57B1/6-Mäusen auf 2–4 × 10⁶ Zellen/ml in Komplettmedium eingestellt und mit Mitomycin C (50 μg/ml) 30 min bei 37°C in befeuchtetem 5%igem CO₂ in Luftatmosphäre behandelt. Nach der Behandlung wurden die Zellen 3 × mit 5 Volumen Komplettmedium gewaschen und die Zahl der lebensfähigen Zellen wurde mit Trypanblau bestimmt.
Um autologe Stimulationskontrollen einsetzen zu können, wurden einige Responderzellen ebenfalls mit Mitomycin C, wie vorstehend beschrieben, behandelt.
Mixed Lymphocyte Response Assay (Maus)
Für das Assay wurden Responder- und Stimulatorzellen mit einer Konzentration von 10⁵ Zellen/Well in 96-Well-Rundboden-Platten ausplattiert. Die Zellen wurden mit seriel len Verdünnungen an anti-CD4 Ab (50 ng/ml – 0,05 ng/ml) als Dreifachbestimmungen oder einem Isotyp-angepassten Kontroll-Ab inkubiert. Als eine zusätzliche Kontrolle wurde Cyclosporin A mit einer Konzentration von 1 μg/ml verwendet. Die CD28/CTLA-4-Peptide 199 und 201 wurden mit einer Endkonzentration von 100 μM bis auf 1,56 μM seriell verdünnt und getestet. CTLA-4Ig, das seriell aus einer Konzentration von 10 μg/ml verdünnt wurde, wurde als Positivkontrolle zur Hemmung des MLR verwendet.
Geeignet verschlüsselte Peptidkontrollen und Matrixkontrollen wurden in jedem Assay verwendet. Die Platten wurden 4 Tage bei 37°C in befeuchtetem 5%igem CO₂ in Luftatmosphäre inkubiert. Die Proliferation der Zellen wurde bestimmt, indem die Wells die letzten 6 h des Assays mit ³H-Tdr (1 μCi/Well) gepulst wurden. Die Platten wurden geerntet und die eingebauten Counts wurden, wie vorstehend beschrieben, bestimmt.
Beispiel 6: Biologisches Screening der Peptide in dem Human-MLR und CTLA-4-Ig-Bindungsassay
Eine Gesamtzahl von 34 Peptiden wurde bezüglich der Hemmung der Lymphozytenproliferation in dem humanen MLR getestet. Jedes Peptid wurde in einem MLR bei Dosen getestet, die im Bereich von 12,5 bis 100 μM lagen. Die Aktivität jedes Peptids wurde identifiziert, indem den Peptiden ein + oder ein – zugeordnet wurde, in Abhängigkeit seiner Fähigkeit, die Lymphozytenproliferation in dem MLR zu hemmen (cpms).
Ein – wurde vergeben, wenn alle getesteten Peptidkonzentrationen eine cpm-Veränderung von < 15% ergaben.
Ein +, ++ oder +++ wurde in Abhängigkeit von der durch das Peptid hervorgerufenen Hemmung vergeben, wobei:
+ vergeben wurde, wenn die getestete Peptidkonzentration eine cpm-Änderung von > 20% ergab;
++ vergeben wurde, wenn das getestete Peptid eine cpm-Änderung von > 25% in einer Dosis-abhängigen Weise ergab; und
+++ vergeben wurde, wenn das getestete Peptid eine cpm-Änderung von > 50% in einer Dosis-abhängigen Weise ergab.
Zusätzlich zu dem MLR wurden diese 34 Peptide auch in einem CTLA-4Ig/B7-Bindungstest bewertet, in dem die Fähigkeit dieser Peptide, die Bindung von CTLA-4Ig an B7 bei Cess-B-Zellen zu beeinflussen, mittels FACS-Analyse untersucht wurde.
Wie im MLR wurde jedem Peptid ein + oder + zugeordnet, in Abhängigkeit von seiner Fähigkeit, die CTLA-4Ig-Bindung an Cess-B-Zellen zu beeinflussen; wobei – keiner Änderung der Bindung entspricht, + einer geringen Änderung von < 10% bezüglich der Bindung entspricht, und ++ einer Änderung von > 20% bezüglich der Bindung entspricht. Die Ergebnisse des MLR und der B7-Bindungsanalyse sind in Tabelle 3 dargestellt.
Tabelle 3: Überblick über die MLR/Bindungsdaten mit dem Peptidpanel
Die Daten für jedes Peptid wurden ohne Bias (Grundwert) analysiert, derart, dass die Ergebnisse aus den früheren Assays nicht dahingehend betrachtet wurden, ob dem Peptid ein + oder ein – zugeordnet wurde.
Aus der vorstehenden Tabelle ist ersichtlich, dass nur eine geringe Anzahl der Peptide Aktivität in einem dieser Assays aufwies. Diejenigen Peptide, die entweder in dem MLR oder dem Bindungsassay Aktivität aufwiesen (AT#s: 106, 107, 128, 131, 132, 133, 135, 136, 199), wurden erneut mehrere Male getestet, um zu prüfen, ob die ursprüngliche Beobachtung reproduzierbar war.
Basierend auf den kumulativen Ergebnissen dieser Analyse wurden die Peptide, die entweder in dem MLR oder dem Bindungsassay eine semi-reproduzierbare Hemmung aufwiesen, für die weitere Analyse ausgewählt. Die ausgewählten Peptide waren AT 106, 128, 133, 135 und 136, und später das Peptid AT 199.
Analyse der in dem primären Screening positiven Peptide (AT 106, 128, 133, 135 und 136)
Da die Peptide AT 106, 128, 133, 135 und 136 während des primären Screenings in dem MLR und/oder den Bindungsassays eine gewisse Aktivität zeigten, wurden diese Peptide für die weitere Analyse ausgewählt. Diese Peptide wurden erneut in dem MLR und Bindungsassay entweder allein oder in Kombination getestet. In zwei MLR wiesen diese Peptide selbst keinerlei konsistente Wirkung auf das MLR bei Konzentrationen bis zu 200 μM auf. Die Analyse dieser gleichen Peptide in dem Cess-B-Bindungsassay zeigt keine Wirkung auf die CTLA-4Ig Bindung.
Identifizierung und Bewertung von AT 199
Während des Verlaufs unseres Screenings waren die drei letzten getesteten Peptide die Peptide 199, 200 und 201. Die Ergebnisse aus zwei MLR, welche die Aktivität von AT199, 200 und 201 im Dosisbereich bis zu 100 μM vergleichen, sind in 6 und 7 dargestellt.
Wie aus einem MLR ersichtlich, hemmte AT 199 die Lymphozytenproliferation um ≈ 70%, wohingegen sie in dem anderen MLR um ≈ 30% gehemmt wurde. Der Grad der Lymphozytenproliferation (30 000 cpm) war in beiden Assays gleich. So haben wir keine Erklärung für die geringere Hemmung von AT 199 in diesem MLR, gleichartige Trends sind für CTLA-4Ig beobachtet worden und sie könnten eine Funktion des Zustands der in dem MLR verwendeten Zellen sein. Dass AT 199 beide MLR nicht in wirksamer Weise hemmte, lässt vermuten, dass dieses Peptid nicht cytotoxisch ist und dass die Aktivität von AT 199 biologisch wesentlich ist. AT 199 wurde insgesamt in 6 humanen MLR-Assays getestet und es war in 5 der 6 Assays aktiv.
Die Massenspektrometrieanalysen jedes dieser Analogen zeigte, dass die erwartete Masse erhalten wurde, dass AT 199 jedoch einen wesentlichen Anteil an linearem Produkt enthielt (32%).
Um nachzuweisen, dass die beobachtete Aktivität von AT 199 nicht auf ein Syntheseartefakt zurückzuführen ist und um zu unterscheiden, ob das gefaltete Analoge oder die freie lineare Form des Analogen für das in dem MLR beobachtete hemmende Verhalten verantwortlich ist, wurden drei neue Ansätze an AT 199 hergestellt.
AT 199.2A wurde aus AT 199.1 synthetisiert, wobei die Faltungsbedindungen auf 5 Tage verlängert wurden und der pH-Wert des Faltungspuffers von pH 8,5 auf pH 10,0 erhöht wurde, um die Wirksamkeit des Verfahrens zu verbessern.
AT 199.2B wurde mit Jodacetamid behandelt, um ein reines lineares Analoges zu reinigen. Dieses Verfahren modifiziert die freien Sulfhydrylgruppen durch eine einfache Alkylierung des Schwefels derart, dass die Cysteine nicht sterisch gehindert werden, sie jedoch weder reaktiv sind, noch für die Bildung einer Disulfidbindung verfügbar sind.
AT 199.3 wurde unter Anwendung des unveränderten Orginalprotokolls aus AT 199.1 synthetisiert. Tabelle 4 zeigt eine Zusammenstellung der synthetisierten AT 199-Analogen und die Ergebnisse einer quantitativen Ellman's Reaktion zur Bestimmung. des Gleichgewichts zwischen kovalent cyclisierten und freien linearen Populationen.
Tabelle 4: Ergebnisse des Gehalts an freien Sulfhydrylgruppen der AT 199 Analogen
Die neu synthetisierten Ansätze an AT 199 wurden verwendet, um genauer zu untersuchen, ob die linearen oder die cyclisierten AT 199-Populationen für die mit diesem Analogen beobachtete Aktivität verantwortlich sind (Anmerkung – es ist unklar, warum AT 199.3 wirksamer als AT 199.1 cyclisierte, da identische Verfahren verwendet wurden). Die Population an freiem Sulfhydryl-enthaltendem linearem Peptid war um mehr als eine Größenordung in dem AT 199.3-Analogen im Verhältnis zu dem ursprünglichen Ansatz verringert. Wenn die in den früheren MLR beobachtete Aktivität auf das freie lineare Analoge zurückzuführen ist, würde man eine dramatische Verringerung in der Aktivität von AT 199.3 erwarten. Durch das mit dem alkylierten AT 199.2B assoziierte Hemmprofil sollten wir in der Lage sein, zu erkennen, ob die beobachtete Aktivität in Bezug zu der Konformationsspezifität steht.
Bewertung von AT 199.3, 199.2A und 199.2B in dem Human-MLR
Wie vorstehend beschrieben, wurde für AT 199 eine andere Synthese durchgeführt (199.3), mit der Erzeugung einer linearen (199.2B) und einer vollständig cyclisierten (199.2A) Version von AT 199. Diese Peptide wurden in verschiedenen humanen MLR im Vergleich zu dem Peptid AT 201 und in An- und Abwesenheit von CTLA-4Ig (0,5 μg/ml) bewertet.
AT 199.3 und 199.2A hemmten das MLR bei 100 μM in einem Assay um 30% bzw. 50% und um 70% bzw. 25% in dem anderen MLR. Andererseits betrug die Hemmung von AT 199.2B in den MLR bei. der höchsten getesteten Konzentration (100 μM) < 10%. Aus diesem Ergebnis schlussfolgerten wir, dass für die Aktivität von AT 199 die cyclische Konformation erforderlich ist.
Diese Peptide wurden auch bezüglich der Aktivität in 2 anderen MLR getestet, in denen CTLA-4Ig mit einer Konzentration von 0,5 μg/ml zugesetzt wurde. Die Ergebnisse einer dieser Untersuchungen sind in 8 dargestellt.
Wurde AT 199.3 mit 0,5 μg/ml CTLA-4Ig versetzt, zeigte es eine hemmende Wirkung in dem MLR, die oberhalb CTLA-4Ig und noch darüber lag. AT 199.2A wies ebenfalls additive Wirkungen auf, wenn es in Kombination mit CTLA-4Ig zugesetzt wurde, AT 199.2B und das Peptid 201 zeigten jedoch keine Wirkung, wenn sie in Kombination mit CTLA-4Ig zugesetzt wurden. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass das cyclisierte AT 199 Aktivität bezüglich der Hemmung des humanen MLR aufwies und dass es die Wirkung von CTLA-4Ig steigern kann.
Bewertung von AT 199 in einem Maus-MLR
Die Primärsequenz von CTLA-4 ist bei Mensch und Maus sehr ähnlich. Ein Maus-CTLA-4Ig wurde in diesen Studien verwendet, um ein humanes MLR zu hemmen. Daher wurde die Aktivität von AT 199 auf ein Maus-MLR getestet. Die Ergebnisse dieser Studie sind in 9 dargestellt.
AT 199.3 hemmte das Maus-MLR zu ≈ 85%, was der Hemmung durch 10 μg/ml CTLA-4Ig entsprach. Das Peptid 201 hemmte in dem gleichen Assay nur zu ≈ 25%. Somit scheint es, dass AT 199 ähnlich wie CTLA-4Ig sowohl im humanen als auch im Maus-System aktiv ist.
Bewertung der Toxizität der Peptide AT 199 und 201
Um zu bestimmen, ob die Aktivität von AT 199 auf eine spezifische Wirkung auf die Lymphozytenproliferation in dem MLR oder auf eine allgemeine nicht-spezifische Hemmung der Lymphozytenproliferation (d. h. Toxizität) zurückzuführen ist, wurde die Toxizität von AT 199 gegen THP-1, Jurkat und ruhende und aktivierte PBL getestet. Die Ergebnisse dieser Versuche sind in 10 dargestellt.
Wie in 10 ersichtlich, wurde in Anwesenheit von 100 μM AT 199 keine Hemmung von THP-1, Jurkat oder ruhenden primären PBL beobachtet.
AT 199 wurde bezüglich der Hemmung von PHA-aktivierten PBL getestet. Die PHA-Aktivierung hat, obwohl sie nicht spezifisch auf den CD28-Signaltransduktionsweg gerichtet ist, Einfluss auf diesen Signalweg in Abhängigkeit von der zur Aktivierung der Lymphozyten verwendeten Konzentration an PHA. Um den Einfluss von AT 199 aus der Phytohämagglutinin-(PHA)-Aktivierung auf den CD28-Signalweg zu bestimmen, wurde CTLA-4Ig in jedes Assay mit einbezogen.
Die Wirkung von AT 199 auf eine repräsentative PHA-Aktivierung ist in 11 dargestellt. Wie in 11 ersichtlich, hemmten 10 μg/ml CTLA-4Ig die PHA-Aktivierung um ≈ 40–50% bei beiden PHA-Konzentrationen (2,5 und 5 μg/ml). Andererseits hatte AT 199 nur eine geringfügige Wirkung auf die Hemmung der PHA-Aktivierung in diesem Versuch, was vermuten lässt, dass die PHA-Aktivierung von Lymphozyten von diesem besonderen Spender nur teilweise über den CD28-Signalweg abläuft. Somit ist AT 199 gegenüber Lymphozyten nicht toxisch, es scheint jedoch eine geringere Potenz als CTLA-4Ig bezüglich der Wirkung auf den B7/B28-Signalweg zu haben.
Von der CDR3-Domäne abgeleitetes AT 199 war das einzige der 34 untersuchten Analoge, das eine wesentliche, reproduzierbare Hemmung in dem MLR aufwies. Die Hemmung war Dosisabhängig und wies einen wahrscheinlichen IC₅₀-Wert zwischen 50– 100 μM auf. Peach et al. (1994) haben gezeigt, dass eine einzelne Met durch Ala-Substitution in der CDR3-Region von humanen CTLA-4 die Fähigkeit des Proteins aufhebt, an B7 zu binden. Basierend auf dieser Beobachtung wurden zwei Kontrollpeptide von AT 199 synthetisiert, in denen Met entweder durch Ala (AT 200) oder durch Gly (AT 201) ersetzt wurde. Mit Ausnahme dieser einzigen Veränderung in der Aminosäure waren die Kontrollpeptide zu AT 199 identisch. Diese Kontrollpeptide hemmten keines der MLR, in denen sie getestet wurden, in der Höhe wie AT 199. Somit scheint AT 199 bezüglich seiner Fähigkeit, das MLR zu hemmen, Sequenzspezifität aufzuweisen.
AT 199 wurde mit Jodacetamid behandelt, um die Schwefelatome in dem Peptid in der Weise zu alkylieren, dass keine Disulfidbrücke gebildet werden kann. Dieses lineare Peptid, AT 199.2B, zeigte keine Wirkung auf die Proliferation des MLR. Somit scheint AT 199 Konformationsspezifität aufzuweisen.
AT 199 und seine Kontrollanalogen wurden bezüglich ihrer offenen Toxizität und nicht-spezifischen Hemmung untersucht. Die Peptide wurden wachsenden Kulturen von THP-1-Zellen, Jurkat-Zellen und primären peripheren Blutlymphozyten (PBL) zugesetzt. In keiner dieser Zellkulturen wurde eine Wirkung bezüglich des Wachstums beobachtet, was darauf hinweist, dass die in dem MLR beobachtete Hemmung nicht auf Toxizität zurückzuführen ist.
Um zu testen, ob es einen unerwarteten Hemmmechanismus gibt, wurde AT 199 unter Anwendung der PHA-Stimulation von PBL untersucht. Phytohämagglutinin (PHA) ist ein Lectin, das aus roten Bohnen extrahiert wird, und es ist ein Gemisch aus fünf tetrameren Glycoproteinen. PHA stimuliert T-Zellen in Anwesenheit von Accessory-Zellen (jedoch nicht B-Zellen) durch die Vernetzung einer Vielzahl kritischer T-Zell-Oberflächenmoleküle, einschließlich CD3, CD2, CD4, CD8 und LFA-1 (Geppert, 1992). Die Beteiligung von CD28 an dieser Stimulation ist von dem Grad der Vernetzung durch PHA abhängig. Bei der geeigneten PHA-Konzentration führt die gleichzeitige Einbindung von Zelloberfächenrezeptoren zu einer Proliferationsantwort, die die Notwendigkeit eines derartigen spezifischen co-stimulierenden Signals, wie des CD28-Signals, umgeht. Dies kann verfolgt werden, indem Hemmung mit CTLA-4Ig auf die PHA-Mito-genese geprüft wird. AT 199 hatte keine hemmende Wirkung auf die PHA-stimulierten T-Zellen unter den gleichen Bedingungen, bei denen das MLR dramatisch gehemmt wurde. CTLA-4Ig hemmte die PHA-Aktivierung geringfügig. Somit stimmen diese Daten mit der auf einen spezifischen Aspekt der T-Zell-Aktivierung gerichteten Wirkung überein.
Aus den Daten der hier verwendeten 34 Peptide kann geschlussfolgert werden, dass mindestens 1 Peptid (AT 199), das allein eine CD28 abhängige humane Immunantwort hemmt, isoliert worden ist.
Der Bezug zu bekannten Verfahrensschritten, Standardverfahrensschritten, bekannten Verfahren oder Standardverfahren ist in keiner Weise ein Zugeständnis, dass irgendein beliebiger Aspekt, eine Beschreibung oder Ausführungsform der vorliegenden Erfindung auf dem Fachgebiet offenbart ist, gelehrt wird oder naheliegend ist.
Die vorstehende Beschreibung der spezifischen Ausführungsformen lässt somit vollständig die allgemeine Natur der vorliegenden Erfindung erkennen, sodass andere, indem sie das auf dem Fachgebiet vorhandene Wissen (einschließlich der hier zitierten Bezüge) anwenden, die verschiedenen Anwendungen, wie die Ausführungsformen ohne unangemessene Versuchsführung leicht modifizieren und/oder anpassen können, ohne dass sie nicht der vorliegenden Erfindung entsprechen. Daher liegen derartige Anpassungen und Modifizierungen innerhalb der Bedeutung und des Bereichs von Äquivalenten der offenbarten Ausführungsformen, basierend auf den hier dargestellten Lehrmeinungen und Leitlinien. Es ist klar, dass die verwendeten Phrasen oder Begriffe der Beschreibung dienen und sie keine Einschränkung darstellen, sodass die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Begriffe oder Phrasen von dem Fachmann in Bezug auf die hier dargestellten Lehrmeinungen und Leitlinien, in Verbindung mit dem Wissen eines Fachmanns interpretiert werden können.
LITERATURHINWEISE
Arima, T. et al., Inhibition by CTLA-4Ig of experimental allergic encephalomyelitis. J. Immunol. 156: 4916–4924 (1996).
Aruffo, A. et al., Molecular cloning of a CD28 cDNA by high efficiency COS cell expression system. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 8573–8577 (1987).
Azuma, M. et al., B70 antigen is a second ligand for CTLA-4 and CD28. Nature 366: 76–79 (1993).
Boussiotis, V. A. et al., B7 but not intracellular adhesion molecule constimulation prevents the induction of human alloantigen-specific tolerance. J. Exp. Med. 178: 1753–1759 (1993).
Chu, G. B. et al., Intervention of CD4+ cell subset shifts and autoimmunity in the BXSB mouse by murine CTLA-4Ig. J. Immunol. 156: 1262–1268 (1996).
Cross, A. H. et al., Long-term inhibition of murine experimental autoimmune encephalomyelitis using CTLA-4-Fz supports a key role for CD28 costimulation. J. Clin. Invest. 95: 2783–2789 (1995).
Ellis, J. H. et al., Interactions of CD80 and CD86 with CD28 and CTLA-4. J. Immunol. 56: 2700–2709 (1996).
Finck, B. K. et al., Treatment of murine lupus with CTLA-4Ig. Science 265: 1225–1228 (1994).
Freeman, G. J. et al., CTLA-4 and CD28 mRNA are coexpressed in most T cells after activation. Expression of CTLA-4 and CD28 mRNA does not correlate with the pattern of lymphokine production. J. Immunol. 149: 3795–3801 (1992).
Geppert, T. "Phytohemaglutinin in Encyclopedia of Immunology, (Herausg.) Roitt, IM and Delves, PJ. Academic Press, London pp. 1233–1234.
Guo, Y. et al., Mutational analysis and an alternatively spliced product of B7 defines its CD28/CTLA-4-binding site on immunoglobulin C-like domain. J. Exp. Med. 181: 1345–1355 (1995).
Hathcock, K. S. et al., Comparative analysis of B7-1 and B7-2 costimulatory ligands: expression and function. J. Exp. Med. 180: 631–640 (1994).
Harding, F. A. et al., CD28-mediated signalling costimulates murine T cells and prevents induction of anergy in C-cell clones. Nature 356: 607–609 (1991).
Judge, T. A. et al., The in vivo mechanism of action of CTLA-4Ig. J. Immunol. 156: 2294–2299 (1996).
Lenschow, D. J. et al., Long-term survival of xenogeneic pancreatic islet grafts induced by CTLA-4Ig. Science 257: 789– 791 (1992).
Lenschow, D. J. et al., Differential effects of anti-B7-1 and anti-B7-2 monoclonal antibody treatment on the development of diabetes in the nonobese diabetic mouse. J. Exp. Med. 181: 1145–1155 (1995).
Lenschow, D. J. et al., CD28/B7 system of T cell costimulation. Ann. Rev. Immunol. 14: 233–258 (1996).
Lin, H. et al., Long-term acceptance of major histocompatibility complex mismatched cardiac allografts induced by CTLA-4Ig plus donor-specific transfusion. J. Exp. Med. 178: 1801–1807 (1993).
Linsley, P. S. et al., CTLA-4 is a second receptor for the B cell activation antigen B7. J. Exp. Med. 174: 561–568 (1991).
Linsley, P. S. et al., Immunosuppression in vivo by a soluble form of the CTLA-4 T cell activation molecule. Science 257: 792–794 (1992).
Linsley et al., The role of the CD28 receptor during T cell responses to antigen. Ann. Rev. Immunol. 11: 191–212 (1993).
Linsley, P. S. et al., CD28 engagement by B7/BB-1 induces transient down-regulation of CD28 synthesis and prolonged unresponsiveness to CD28 signaling. J. Immunol. 150: 3161–3169 (1993).
Olson, G. L. et al., Concepts and progress in the development of peptide mimetics. J. Medicinal Chem. 36: 3039–3049 (1993).
Peach, R. J. et al., Complementarity determining region 1 (CDR1)-and CDR3-analogous regions in CTLA-4 and CD28 determine the binding to B7-1. J. Exp. Med. 180: 2049–2058 (1994).
Peach, R. J. et al., Both extracellular immunoglobulinlike domains of CD80 contain residues critical for binding T Cell surface receptors CTLA-4 and CD28. J. Biol. Chem. 270: 21181 21187 (1995).
Perrin, P. J. et al., Role of B7 : CD28/CTLA-4 in the induction of chronic relapsing experimental allergic encephalomyelitis. J. Immunol. 154: 1481–1490 (1995).
Sayegh, M. H. et al., CD28-B7 blockade after alloantigenic challenge in vivo inhibits Th1 cytokines but spares Th2. J Exp. Med. 181: 1869–1874 (1995).
Steurer, W. et al., Ex vivo coating of islte cell allografts with murine CTLA-4/Fc promotes graft tolerance. J. Immunol. 155 (3): 1165–1174 (1995).
Turka, L. A. et al., T cell activation by the CD28-ligand B7 is required for cardiac allograft rejection in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 11102–11106 (1992).
Wallace, P. M. et al., CTLA-4Ig treatment ameliorates the lethality of murine graft-versus-host disease across major histocompatibility complex barriers. Transplantation 58: 602– 608 (1994).
Wallace, P. M. et al., Induction and reversal of longlived specific unresponsiveness to a T-dependent antigen following CTLA-4Ig treatment. J. Immunol. 154: 5885–5889 (1995).
SEQUENZ-LISTING

Claims

Verbindung, die Aminosäurereste 2 bis 9 von SEQ-ID-Nr.: 1 umfasst und über einen Linker zwischen den Aminsäureresten 2 und 9 von SEQ-ID-Nr.: 1 cyclisiert ist.
Verbindung nach Anspruch 1, die des weiteren 1 bis 11 Aminosäuren N-terminal zu den Aminosäureresten 2 bis 9 von SEQ-ID-Nr.: 1 umfasst.
Verbindung nach Anspruch 2, wobei die 1 bis 11 Aminosäuren N-terminal zu den Aminosäureresten 2 bis 9 von SEQ-ID-Nr.: 1 positiv geladene Aminosäuren sind.
Verbindung nach Anspruch 1, die des weiteren 1 bis 11 Aminosäuren C-terminal zu den Aminosäureresten 2 bis 9 von SEQ-ID-Nr.: 1 umfasst.
Verbindung nach Anspruch 4, wobei die 1 bis 11 Aminosäuren C-terminal zu den Aminosäureresten 2 bis 9 von SEQ-ID-Nr.: 1 positiv geladene Aminosäuren sind.
Verbindung nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 5, wobei der Linker eine Cys-Cys-Disulfidbrücke ist.
Verbindung nach Anspruch 1, die des weiteren eine oder mehrere Aminosäuresequenzen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus SEQ-ID-Nr.: 5, SEQ-ID-Nr.: 7, SEQ-ID-Nr.: 14, SEQ-ID-Nr.: 19 und SEQ.-ID-Nr. 20, umfasst.
Verbindung nach Anspruch 1, die die Aminosäuresequenz von SEQ-ID-Nr.: 1 umfasst, die über eine Cys-Cys-Disulfidbrücke zwischen den Aminosäureresten 1 und 10 von SEQ-ID-Nr.: 1 cyclisiert ist.
Verbindung nach Anspruch 8, die des weiteren eine oder mehrere Aminosäuresequenzen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus SEQ-ID-Nr.: 5, SEQ-ID-Nr.: 7, SEQ-ID-Nr.: 14, SEQ-ID-Nr.: 19 und SEQ.-ID-Nr. 20, umfasst.
Verbindung nach Anspruch 9, wobei die eine oder mehrere Aminosäuresequenzen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus SEQ-ID-Nr.: 5, SEQ-ID-Nr.: 7, SEQ-ID-Nr.: 14, SEQ-ID-Nr.: 19 und SEQ.-ID-Nr. 20, entweder miteinander und/oder an Aminosäuren von SEQ-ID-Nr.: 1 entweder direkt oder über einen Linker verbunden sind.
Verbindung nach Anspruch 9, die des weiteren 1 bis 10 Aminosäuren N-terminal zu den Aminosäureresten 1 bis 10 von SEQ-ID-Nr.: 1 umfasst.
Verbindung nach Anspruch 11, wobei die 1 bis 10 Aminosäuren N-terminal zu den Aminosäureresten 1 bis 10 von SEQ-ID-Nr.: 1 positiv geladene Aminosäuren sind.
Verbindung nach Anspruch 9, die des weiteren 1 bis 10 Aminosäuren C-terminal zu den Aminosäureresten 1 bis 10 von SEQ-ID-Nr.: 1 umfasst.
Verbindung nach Anspruch 13, wobei die 1 bis 10 Aminosäuren C-terminal zu den Aminosäureresten 1 bis 10 von SEQ-ID-Nr.: 1 positiv geladene Aminosäuren sind.
Verbindung nach Anspruch 9, die des weiteren zwei positiv geladene Aminosäuren sowohl N-terminal als auch C-terminal zu den Aminosäureresten 1 bis 10 von SEQ-ID-Nr.: 1 umfasst.
Verbindung nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 15 zur Verwendung als Arzneimittel.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine Verbindung nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 15, und einen pharmazeutisch verträglichen Exzipienten.
Verwendung einer Verbindung nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 15 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Erkrankungen des Immunsystems und Krebs.
Verwendung nach Anspruch 18, wobei die Erkrankung des Immunsystems aus Autoimmunerkrankungen, wie Psoriasis, Multipler Sklerose, Lupus Erythematosus, Diabetes, rheumatischer Arthritis, und Therapie von Transplantatabstoßungen einschließlich bei festen Organen und bei zellulären Transplantaten, ausgewählt ist.
Verwendung einer Verbindung nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 15 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung pathologischer Zustände und Störungen, die durch die Hemmung der Wechselwirkung von CD28 und/oder CTLA-4 mit CD80 und CD86 gebessert werden.