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GEBIET DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf Methoden und Zusammensetzungen,
mit deren Hilfe eine Immunantwort moduliert werden kann. Die Erfindung
beinhaltet außerdem
die Anwendung des Proteins OX-2 zur Unterdrückung einer Immunantwort.
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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Das
Immunsystem schützt
den Körper
vor Infektionserregern und Krankheiten und ist für den Menschen lebenswichtig.
In einigen Fällen
kann das Immunsystem jedoch auch die Ursache für Krankheiten sein. Ein Beispiel
ist eine Autoimmunerkrankung, bei der das Immunsystem sein eigenes
Wirtsgewebe angreift, was in vielen Fällen zu einer schwächenden
Erkrankung und manchmal sogar zum Tode führt. Andere Beispiele autoimmuner
Krankheiten sind Multiple Sklerose, insulinpflichtiger Typ 1-Diabetes
Mellitus, Lupus Erythematosus und Arthritis. Ein zweites Beispiel
dafür,
wie das Immunsystem Krankheiten verursachen kann, ist während Transplantationen
von Gewebe oder Organen. Wenn es sich nicht um genetisch identische
Tiere, wie zum Beispiel eineiige Zwillinge handelt, werden Gewebe-
und Organtransplantate vom Immunsystem des Empfängers als fremd abgestoßen. Die
Immunreaktion gegen Transplantate ist bei Transplantationen zwischen
Spezies oder Xenotransplantationen sogar noch deutlicher zu erkennen.
Ein drittes Beispiel dafür,
wie das Immunsystem dem Wirt Schaden zufügen kann, ist während einer
allergischen Reaktion, bei der das Immunsystem durch ein ansonsten
unauffälliges
Antigen aktiviert wird, wodurch eine Entzündung verursacht und in einigen
Fällen
das Gewebe angegriffen werden kann.
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Um
die durch Transplantationen, Autoimmunerkrankungen und allergische
Reaktionen verursachten schädlichen
Immunreaktionen zu hemmen, werden normalerweise immunsuppressive
Medikamente (wie zum Beispiel Cyclosporin A, Tacrolimus und Corticosteroide)
oder Antikörper-Therapien
(wie zum Beispiel Anti-T-Zellen-Antikörper) verabreicht.
Leider gehen mit diesen unspezifischen Modi der Immunsuppression
häufig unerwünschte Nebenwirkungen
einher. So kann Cyclosporin beispielsweise zu verringerter Nierenfunktion, Hochdruck
und Toxizität
führen
und muss dem Patienten außerdem
sein Leben lang verabreicht werden. Corticosteroide schwächen die
Abwehrkräfte
und können
zu schmerzhafter Arthritis, Osteoporose und Katarakten führen. Die
Anti-T-Zellen-Antikörper
können
Fieber, Hochdruck, Durchfall oder sterile Meningitis verursachen und
sind außerdem
verhältnismäßig teuer.
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Auf
Grund der mit Immunsuppression verbundenen Probleme hat man sich
in letzter Zeit um die Entwicklung von Methoden oder Therapien bemüht, die
beim Wirt Unempfänglichkeit
oder Toleranz gegenüber Transplantaten,
im Falle einer Autoimmunerkrankung dem „eigenen" Gewebe gegenüber und den mit Allergien verbundenen
unauffälligen
Antigenen gegenüber
induzieren. Der Erfinder hat die bei Abstoßungen von Transplantaten eine
Rolle spielenden Mechanismen untersucht und Methoden für die Induktion
eines Zustands von antigenspezifischer, immunologischer Toleranz
bei Transplantationen entwickelt. Vor allem bei Modellen, bei denen
Tieren Allotransplantate eingesetzt wurden, hat der Erfinder zeigen
können,
dass die Überlebenszeit des
Transplantats gesteigert werden kann, indem das Empfängertier
vor der Transplantation über
die Pfortader eine Infusion bestrahlter Milzzellen vom Spendertier
gelegt bekam. Im Gegensatz dazu verlängerte eine vor der Transplantation
stattfindende Infusion über
die Schwanzvene des Tieres die Lebenszeit des Transplantats jedoch
nicht.
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Wenn
es gelänge,
die molekularen Mechanismen zu verstehen, die bei der Induktion
von Toleranz durch portal-venöse
(pv) Immunisierung eine Rolle spielen, könnte dies vielleicht zur Entwicklung
von Methoden zur Induktion einer Immuntoleranz führen, die bei Transplantationen,
Autoimmunerkrankungen und Allergien von Nutzen sein könnte.
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In
WO-A-97/21450 werden Methoden und Zusammensetzungen zur Anwendung
von OX-2 Proteinen zur Modulierung einer durch eine T-Zelle vermittelten
Immunantwort offengelegt. Bestimmte, offengelegte Erkrankungen können jeweils
durch die Regulierung einer solchen Antwort nach oben und nach unten
behandelt werden.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Der
vorliegende Erfinder hat Gene identifiziert, die nach portal-venöser Immunisierung
eine Expressionssteigerung aufweisen. Eines der isolierten Gene
codiert OX-2, ein Molekül
mit bislang unbestimmter Funktion und der Ig-Superfamilie zugehörig. Der Erfinder hat gezeigt,
dass durch eine Verabreichung von Antikörpern zu OX-2 die Überlebenszeit
von Transplantaten, die generell nach einer vor der Transplantation
stattfindenden pv-Immunisierung zu erwarten sind, gehemmt wird.
Außerdem
hat der Erfinder gezeigt, dass zwischen dem Niveau von OX-2 und
dem Risiko von Fehlgeburten ein negativer Zusammenhang besteht.
Der Erfinder hat ferner gezeigt, dass OX-2 zytotoxische Zellen und
IL-2-Produktion hemmt und IL-4-Produktion
induziert. Diese Ergebnisse weisen alle darauf hin, dass OX-2 bei
Immunsuppression eine Rolle spielt.
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Demzufolge
stellt die vorliegende Erfindung eine Anwendung eines OX-2-Proteins oder einer
ein OX-2-Protein codierenden Nukleinsäuresequenz für die Herstellung
eines Medikaments, das der Unterdrückung einer Immunantwort dient,
bereit.
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In
einer Ausführungsform
dient das Medikament der Induktion einer Immuntoleranz einem transplantierten
Organ oder Gewebe gegenüber.
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In
einer weiteren Ausführungsform
dient das Medikament der Vorbeugung oder Hemmung der Transplantat-gegen-Wirt-Reaktion.
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In
noch einer weiteren Ausführungsform
dient das Medikament der Vorbeugung oder Hemmung von Fehlgeburten.
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In
einer weiteren Ausführungsform
dient das Medikament der Vorbeugung oder Behandlung einer Autoimmunerkrankung.
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In
noch einer weiteren Ausführungsform
dient das Medikament der Vorbeugung oder Behandlung einer Allergie.
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Der
Erfinder hat das murine OX-2-Gen kloniert und sequenziert. Dementsprechend
beinhaltet die Erfindung außerdem
die Anwendung einer isolierten, ein murines OX-2-Gen codierenden
Nukleinsäuresequenz, die
die in 7 gezeigte Sequenz und SEQ.ID.NR:1
aufweist und ein isoliertes, murines OX-2-Protein, das die in 8 gezeigte
Aminosäuresequenz
und SEQ.ID.NR:2 aufweist.
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Wie
oben festgestellt, kann OX-2 zur Induktion von Immunsuppression
verwendet werden. Daraus ist zu schließen, dass eine Hemmung von
OX-2 für
die Vorbeugung von Immunsuppression nützlich sein könnte.
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Deshalb
stellt die vorliegende Erfindung, unter einem anderen Aspekt, eine
Anwendung für
die Herstellung eines Medikaments bereit, das, mithilfe eines Wirkstoffes,
der OX-2 hemmt, der Induktion oder Erhöhung einer Immunantwort dient.
Der OX-2 Hemmstoff ist ein OX-2 bindender Antikörper oder ein Antisense-Oligonukleotid, das
die Expression von OX-2 hemmt.
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Weitere
Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden aus der
folgenden detaillierten Beschreibung ersichtlich werden. Es ist
jedoch zu beachten, dass die detaillierte Beschreibung und die spezifischen
Beispiele zwar auf bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung
hinweisen, jedoch einzig und allein der Veranschaulichung dienen,
da verschiedene Änderungen
und Modifikationen, die in den Rahmen dieser Erfindung fallen, den
Fachleuten aus dieser detaillierten Beschreibung ersichtlich sein
werden.
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KURZE BESCHREIBUNG DER
ZEICHNUNGEN
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Die
Erfindung wird nun unter Bezug auf die Zeichnungen beschrieben,
wobei:
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1 die
PCR-Validierung von suppressiver subtraktiver Hybridisierung unter
Verwendung von b-actin-Primern darstellt.
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2 die PCR-Validierung von suppressiver
subtraktiver Hybridisierung unter Verwendung von IL-10 Primern darstellt.
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3 ein Autoradiograph ist, der 32P-markierte
Sonden aus 4 durch den subtraktiven Hybridisierungsvorgang entstandenen
Klonen verwendet.
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4 ein Durchflusszytometrieprofil von an
der Milz haftenden Zellen ist.
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5A und B Western-Blots sind, die die gesteigerte
Expression von OX-2-Antigenen nach der pv-Immunisierung veranschaulichen. 5A zeigt Färbungen
mit einem Kontrollmaus-Antikörper,
anti-Maus-CD8a. 5B zeigt Färbungen mit anti-Ratte-MRC-OX-2.
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6 ein
Diagramm ist, das den Überlebensprozentsatz
der Anzahl von Tagen nach einer Nierentransplantation gegenüberstellt.
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7 die
cDNA-Sequenz vom MRC-OX-2 von Ratte, Maus und Mensch zeigt.
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8 die
abgeleitete Proteinsequenz vom MRC-OX-2 von Ratte, Maus und Mensch
zeigt.
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9A und 9B Säulendiagramme
sind, die die Zytokinproduktion und Zellproliferation nach Stimulation
durch allogene dendritische Zellen (DC) unter Verwendung von hepatischen
NPMC zeigen.
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10A, 10B und 10C Säulendiagramme
sind, die die Hemmung von Zellproliferation und Zytokinproduktion
durch hepatische NPMC darstellen.
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11 eine Säulendiagrammanalyse
von FACS-Daten darstellt, die die OX-2-Expression in einer Subpopulation
von NPC zeigt.
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12 die PCR-Analyse der mRNA-Expression von B7-1,
B7-2 und OX-2 in verschiedenen hepatischen NPMC-Zellfraktionen zeigt.
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13A und 13B Säulendiagramme
sind, die die Proliferation und Zytokinproduktion durch NPMC aus
mit Flt3L behandelten Mäusen
zeigen.
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14 ein Säulendiagramm
ist, das die von C3H-Mäusen
mit C57BL16-Nierentransplantaten produzierten Zytokine und die von
mit Flt3 behandelten C57BL16-Spendern produzierten NPC zeigt.
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15 ein Diagramm ist, das die Hemmung von Transplantatabstoßung mit
NPC von mit Flt3 behandelten Mäusen
zeigt.
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16 ein Diagramm ist, das zeigt, das anti-OX-2
die durch NPC erzielte Hemmung rückgängig macht.
Die Auswirkung von anti-B7-1, anti-B7-2 und anti-OX-2 auf primäre Allostimulation
wird gezeigt.
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17 ein Diagramm ist, das zeigt, dass anti-OX-2
mAb die Hemmung durch NPC rückgängig macht und
die Entwicklung von immunregulierenden Zellen hemmt.
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18A eine Photographie ist, die die in-situ-Hybridisierung
mit Antisense-OX-2 in einer 8-11 Tage alten Plazenta einer Maus
zeigt, die eine Fehlgeburt erlitten hat.
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18B eine Photographie ist, die die in-situ-Hybridisierung
mit Antisense-OX-2 in einer 8-11 Tage alten Plazenta einer Maus
zeigt, die nicht für
spontane Fehlgeburten anfällig
ist.
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DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
DER ERFINDUNG
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Der
vorliegende Erfinder hat Gene identifiziert, die nach portal-venöser Immunisierung
eine Expressionssteigerung aufweisen. Diese Gene spielen bei der
Entwicklung von Immunsuppression oder Toleranz eine Rolle und könnten für die Entwicklung
von Therapien zur Vorbeugung und Behandlung von Transplantatabstoßungen,
Fehlgeburten, Autoimmunerkrankungen oder Allergien nützlich sein.
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Mithilfe
von suppressiver subtraktiver Hybridisierung (SSH) ist es dem Erfinder
gelungen, einen Klon zu isolieren, der vorzugsweise in Mäusen exprimiert
wird, die allogene Nierentransplantate zusammen mit einer vor der
Transplantation stattfindenden spenderspezifischen Immunisierung
empfangen, und der das Protein OX-2 codiert. Das OX-2-Protein (auch
als MRC-OX-2 bekannt) bei Ratten wurde als ein 41 Kd-47Kd Glykoprotein
beschrieben, das auf der Zelloberfläche von Thymocyten, follikulären dendritischen
Zellen und Endothelium, B-Zellen und neuronalen Zellen exprimiert
ist. Unterschiede in der sichtbaren Größe des Moleküls in unterschiedlichen
Geweben ist wahrscheinlich eine Funktion differentieller Glykosylierung.
Die Funktion des Moleküls
war bislang unbekannt, doch eine DNA- und Aminosäuresequenz-Analyse hat gezeigt,
dass es einen hohen Grad von Homologie mit den Molekülen der
Immunglobulin-Genfamilie aufweist, die sowohl Moleküle beinhaltet,
die wichtig für
die Antigen-Erkennung durch Lymphozyten und die Zell-Zell-Interaktion
sind (z.B. CD4, CD8, ICAMs, VCAMs), als auch Adhäsionsrezeptormoleküle (NCAMs)
im Nervensystem. Mitglieder der Immunglobulin-Superfamilie unterscheiden
sich von anderen Molekülen
der Integrin- und Selektin-Familien, die zumindest innerhalb des
Immunsystems bei der Zellerkennung, Migration und sogar der Entwicklung
des lymphozytischen Erkennungsrepertoire (durch die Regulierung
intrathymischer Auswahlereignisse) ebenfalls eine wichtige Rolle
zu spielen scheinen. Es ist immer deutlicher geworden, dass Moleküle dieser
verschiedenen Familien eine wichtige Rolle in menschlichen Krankheiten
spielen.
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Der
Erfinder hat gezeigt, dass durch eine Verabreichung von Antikörpern zu
OX-2 die Überlebenszeit von
Transplantaten, die generell nach einer vor der Transplantation
stattfindenden pv-Immunisierung zu erwarten sind, gehemmt wird.
Außerdem
hat der Erfinder gezeigt, dass zwischen dem Niveau von OX-2 und
dem Risiko von Fehlgeburten ein negativer Zusammenhang besteht.
Der Erfinder hat ferner gezeigt, dass OX-2 zytotoxische Zellen und
IL-2-Produktion hemmt und IL-4-Produktion
induziert. Die Daten bestätigen
den Verdacht, dass OX-2 bei Immunsuppression eine Rolle spielt.
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THERAPEUTISCHE METHODEN
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Induktion von Immunsuppression
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Ein
Aspekt der vorliegenden Erfindung beschäftigt sich mit einer Anwendung
eines OX-2-Proteins oder einer ein OX-2-Protein codierenden Nukleinsäuresequenz
für die
Herstellung eines Medikaments zur Unterdrückung einer Immunantwort.
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Der
Begriff „OX-2-Protein" beinhaltet sowohl
das OX-2-Protein in seiner ganzen Länge als auch Fragmente oder
Abschnitte des Proteins, die ausreichen, um eine Immunantwort zu
unterdrücken.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
wird das OX-2-Protein als ein lösliches
Fusionsprotein präpariert.
Das Fusionsprotein kann die an eine Immunglobulin(Ig)-Fc-Region
gebundene extrazelluläre
Domäne von
OX-2 enthalten. Die OX-2-Fusion kann mithilfe der bekannten Techniken
präpariert
werden. Gewöhnlich wird
eine DNA-Sequenz, die die extrazelluläre Domäne von OX-2 codiert an eine
DNA-Sequenz, die die Fc des Ig codiert, gebunden und dann in einem
angemessenen Expressionssystem exprimiert, in dem das OX-2-FcIg-Fusionsprotein produziert
wird. Das OX-2-Protein ist entweder von bekannten Quellen erhältlich oder
mithilfe von rekombinanten DNA-Techniken präpariert werden. Das Protein
kann eine der bekannten und veröffentlichten
Sequenzen für
OX-2 aufweisen. (Die Sequenzen sind von GenBank erhältlich.
Die Zugangsnummer für
menschliche Sequenzen ist Nr. M17226 X0523; die Zugangsnummer für Sequenzen
der Ratte ist Nr. X01785; die Zugangsnummer für Sequenzen der Maus ist Nr.
AF029214.) Das Protein kann außerdem
so modifiziert werden, dass es Substitutionen, Insertionen und/oder
Deletionen von Aminosäure
enthält,
die die immunsuppressiven Eigenschaften des Proteins nicht verändern. Konservierte
Aminosäuresubstitutionen
bedeuten, dass eine oder mehrere Aminosäuren der OX-2-Aminosäuresequenz
mit Aminosäuren ähnlicher
Ladung, Größe und/oder
Hydrophobiecharakteristika ersetzt werden. Solange nur konservierte
Substitutionen durchgeführt
werden, sollte das resultierende Analog zum OX-2-Protein funktional äquivalent
sein. Nicht konservierte Substitutionen bedeuten, dass eine oder
mehrere Aminosäuren
der OX-2-Aminosäuresequenz
mit einer oder mehreren Aminosäuren
ersetzt werden, deren Ladung, Größe und/oder
Hydrophobiecharakteristika unähnlich
sind.
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Das
OX-2-Protein kann modifiziert werden, um es therapeutisch wirksamer
oder geeigneter zu machen. So kann das OX-2-Protein beispielsweise
cyclisiert werden, da die Cyclisierung es einem Peptid ermöglicht,
eine vorteilhaftere Konformation anzunehmen. Die Cyclisierung der
OX-2-Peptide kann mithilfe der bekannten Techniken erreicht werden.
Insbesondere können
Disulfidbindungen zwischen zwei angemessen voneinander entfernten
Komponenten mit freien Sulfhydryl-Gruppen geformt werden. Die Bindungen
können
zwischen Seitenketten von Aminosäuren,
nicht den Aminosäuren
zugehörigen
Komponenten oder einer Kombination von beiden geformt werden. Außerdem können die
OX-2-Proteine oder Peptide der vorliegenden Erfindung in pharmazeutische
Salze verwandelt werden, indem man sie mit anorganischen Säuren, wie
zum Beispiel Chlorwasserstoffsäure,
Schwefelsäure,
Bromwasserstoffsäure,
Phosphorsäure,
etc, reagieren lässt,
oder mit organischen Säuren,
wie Ameisensäure,
Essigsäure,
Propionsäure,
Glykolsäure,
Milchsäure,
Cyanursäure,
Oxalsäure,
Bernsteinsäure,
Apfelsäure,
Weinsteinsäure,
Zitronensäure,
Benzoesäure,
Salizylsäure,
Benzolsulfonsäure
und Toluolsulfonsäure.
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Die
Verabreichung einer „wirksamen
Menge" des OX-2-Proteins
und der Nukleinsäure
gemäß der vorliegenden
Offenlegung definiert eine Menge, die in der notwendigen Dosierung
und über
eine notwendige Zeitspanne insofern wirksam ist, als dass sie die
gewünschte
Wirkung erzielt. Die wirksame Menge des OX-2-Proteins oder der Nukleinsäure gemäß der Erfindung
kann je nach den Faktoren von Krankheitsstadium, Alter, Geschlecht
und Gewicht des Tieres unterschiedlich ausfallen. Das Dosierungsregime
kann angepasst werden, um eine optimale therapeutische Antwort zu
erzielen. So können
beispielsweise mehrere geteilte Dosen täglich verabreicht werden oder
die Dosis kann je nach den Anforderungen der therapeutischen Situation
proportional reduziert werden.
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Der
Begriff „Tier", wie er hier gebraucht
wird, beinhaltet alle Mitglieder des Tierreiches, einschließlich des
Menschen.
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In
einer Ausführungsform
stellt die vorliegende Erfindung eine Anwendung für die Herstellung
eines Medikaments bereit, das der Induktion von Immuntoleranz gegenüber einem
transplantierten Organ oder Gewebe dient und aus einem OX-2-Protein oder einer
Nukleinsäuresequenz,
die ein OX-2-Protein codiert, besteht.
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Unter
dem Begriff „Immuntoleranz
induzieren" versteht
man eine Beeinflussung des Immunsystems, durch die dieses einem
speziellen Antigen gegenüber
unempfänglich
gemacht wird, ohne dass dadurch eine verlängerte, allgemeine Immundefizienz
induziert wird. Der Begriff „Antigen" bezeichnet eine
Substanz, die in der Lage ist, eine Immunantwort zu induzieren.
Im Falle einer Autoimmunerkrankung bedeutet Immuntoleranz, dass
das Immunsystem einem Auto-Antigen gegenüber unempfänglich gemacht wird, das der
Wirt als fremd erkennt, wodurch eine Autoimmunantwort verursacht
wird. Im Fall einer Allergie bedeutet Immuntoleranz, dass das Immunsystem
einem Allergen gegenüber
unempfänglich
gemacht wird, das normalerweise eine Immunantwort im Wirt verursacht.
Im Fall einer Transplantation bedeutet Immuntoleranz, dass man das
Immunsystem den Antigenen des Transplantats gegenüber unempfänglich macht.
Ein Alloantigen bezieht sich auf ein Antigen, das nur in einigen
Mitgliedern einer Spezies vorzufinden ist, wie zum Beispiel Blutgruppenantigene. Ein
Xenoantigen bezieht sich auf ein Antigen, das in den Mitgliedern
einer Spezies aber nicht in den Mitgliedern einer anderen vorzufinden
ist. Dementsprechend ist ein Allotransplantat ein Transplantat zwischen
Mitgliedern derselben Spezies und ein Xenotransplantat ein Transplantat
zwischen Mitgliedern verschiedener Spezies.
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Der
Empfänger
kann ein Mitglied des Tierreiches sein, einschließlich Nagetieren,
Schweinen, Katzen, Hunden, Wiederkäuern, nicht menschlichen Primaten
und vorzugsweise Menschen. Das zu transplantierende Organ oder Gewebe
kann von derselben Spezies stammen wie der Empfänger (Allotransplantat) oder
von einer anderen Spezies (Xenotransplantat). Die Gewebe oder Organe
können
alle Gewebe oder Organe sein, einschließlich Herz, Leber, Niere, Lunge,
Pankreas, pankreatische Zellen, Gehirngewebe, Hornhaut, Knochen, Magen,
Haut und hämatopoetische
Zellen.
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Die
Medikamente der Offenlegung können
verwendet werden, um Transplantat-gegen-Wirt-Reaktionen vorzubeugen,
bei der die Immunzellen im Transplantat eine Immunattacke auf das
Immunsystem des Empfängers
auslösen.
Dies kann vorkommen, wenn das zu transplantierende Gewebe Immunzellen
enthält, wie
wenn Knochenmark oder Lymphgewebe transplantiert werden, um beispielsweise
Leukämie,
aplastische Anämie
und Enzym- oder Immundefizienzen zu behandeln.
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Folglich
stellt die vorliegende Erfindung in einer anderen Ausführungsform
eine Anwendung für
die Herstellung eines Medikaments bereit, das zur Vorbeugung oder
Hemmung von Transplantat-gegen-Wirt-Reaktionen dient, und aus einem
OX-2-Protein oder
einer ein OX-2-Protein codierenden Nukleinsäuresequenz hergestellt wird.
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Der
vorliegende Erfinder hat gezeigt, dass eine Verbindung zwischen
den Niveaus von OX-2-Expression und Fruchtbarkeit besteht. Insbesondere
hat der Erfinder zeigen können,
dass niedrige Niveaus (oder kein Niveau) von OX-2 mit Fehlgeburten
zusammenhängen.
Folglich stellt die vorliegende Erfindung eine Anwendung für die Herstellung
eines Medikaments bereit, das der Vorbeugung oder Hemmung von Fehlgeburten dient,
und aus einem OX-2-Protein oder einer ein OX-2-Protein codierenden Nukleinsäuresequenz
hergestellt wird.
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Wie
zuvor erwähnt
können
die offengelegten Medikamente außerdem zur Behandlung oder
Vorbeugung von Autoimmunerkrankungen angewendet werden. Bei einer
Autoimmunerkrankung erkennt das Immunsystem des Wirts ein spezielles
Antigen nicht als „eigen" an, wodurch eine
Immunreaktion gegen die das Antigen exprimierende Gewebe des Wirts
ausgelöst
wird. Normalerweise ist das Immunsystem seinem eigenen Wirtsgewebe
gegenüber
tolerant, weshalb Autoimmunität
als ein Zusammenbruch des Immuntoleranzsystems verstanden werden
kann.
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Folglich
stellt die vorliegende Erfindung in einer weiteren Ausführungsform
eine Anwendung für
die Herstellung eines Medikaments bereit, das zur Vorbeugung oder
Behandlung einer Autoimmunerkrankung dient und aus einem OX-2-Protein
oder einer ein OX-2-Protein codierenden Nukleinsäuresequenz hergestellt wird.
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Autoimmunerkrankungen,
die gemäß der vorliegenden
Erfindung behandelt oder verhindert werden können, beinhalten, ohne auf
diese beschränkt
zu sein, insulinpflichtigen Typ 1-Diabetes Mellitus, Atemnotsyndrom
beim Erwachsenen, chronisch entzündliche
Darmerkrankungen, Dermatitis, Meningitis, thrombotisch-thrombozytopenische
Purpura, Sjögren-Syndrom,
Enzephalitis, Uveitis, Leukozyten-Adhäsionsdefizienz, rheumatische
Arthritis, rheumatisches Fieber, Reiter-Syndrom, psoriatische Arthritis,
progressive systemische Sklerose, primäre biliäre Zirrhose, Pemphigus, Pemphigoid,
nekrotisierende Vasculitis, Myasthenia gravis, Multiple Sklerose,
Lupus Erythematosus, Polymyositis, Sarkoidose, Granulomatose, Vasculitis,
perniziöse
Anämie,
entzündliche
ZNS-Erkrankung, Antigen-Antikörper-Komplex-vermittelte
Krankheiten, autoimmune hämolytische
Anämie,
Hashimoto-Thyreoiditis,
Graves-Krankheit, habituelle Spontanaborte, Raynaud-Syndrom, Glomerulonephritis,
Dermatomyositis, chronisch aktive Hepatitis, Zöliakie, autoimmunologische
Komplikationen von AIDS, atrophische Gastritis, ankylosierende Spondylitis
und Addison-Krankheit.
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Wie
zuvor erwähnt
können
die offengelegten Medikamente auch zur Behandlung oder Vorbeugung
einer allergischen Reaktion verwendet werden. Bei einer allergischen
Reaktion löst
das Immunsystem eine Attacke gegen ein normalerweise harmloses,
unauffälliges
Antigen oder Allergen aus. Zu den Allergien, denen mithilfe der
Methoden der Erfindung vorgebeugt oder die durch diese behandelt
werden können,
gehören, ohne
auf diese beschränkt
zu sein, Heuschnupfen, Asthma, atopische Ekzeme und Allergien gegen
Gifteiche und Giftefeu, Hausstaubmilben, Bienenpollen, Nüsse, Schellfisch,
Penicillin und eine Vielzahl anderer.
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Folglich
stellt die Erfindung in einer weiteren Ausführungsform eine Anwendung für die Herstellung
eines Medikaments bereit, das der Vorbeugung oder Behandlung einer
Allergie dient und aus einem OX-2-Protein oder einer ein OX-2-Protein codierenden
Nukleinsäuresequenz
hergestellt wird.
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Immunsuppression vorbeugen
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Ein
weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt eine Anwendung
für die
Herstellung eines Medikaments zur Vorbeugung von Immunsuppression
in einem Tier bereit, das aus einem unten beschriebenen, OX-2 hemmenden
Wirkstoff hergestellt wird.
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Es
gibt eine Vielzahl von Situationen, in denen eine Vorbeugung von
Immunsuppression wünschenswert
wäre, einschließlich, ohne
auf diese Beispiele beschränkt
zu sein, bei der Behandlung von Infektionen, Krebs und erworbenem
Immunschwäche
Syndrom (AIDS).
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Der
Wirkstoff kann ein OX-2-spezifischer Antikörper sein. Der vorliegende
Erfinder hat Antikörper
gegen OX-2 präpariert,
die in den Beispielen 4 und 5 beschrieben werden. Antikörper gegen
OX-2 können
auch mithilfe der bekannten Techniken präpariert werden, zum Beispiel
denen von Kohler und Milstein beschriebenen: Nature 256, 495 (1975)
und in den U.S. Patent Nrn. RE 32.011; 4.902.614; 4.543.439; und
4.411.993. (Man siehe auch Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A
New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, Kennett, McKearn
und Bechtol (Hrsg.), 1980, und Antibodies: A Laboratory Manual,
Harlow und Lane (Hrsg.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988).
Im Kontext der vorliegenden Erfindung werden unter Antikörpern monoklonale
Antikörper,
polyklonale Antikörper,
Antikörper-Fragmente
(z.B. Fab und F(ab')2)
und rekombinant produzierte Bindungspartner verstanden.
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Alternativ
dazu kann der Wirkstoff ein Antisense-Oligonukleotid sein, das die
Expression von OX-2 hemmt. Antisense-Oligonukleotide, die komplementär zu einer
Nukleinsäuresequenz
eines OX-2-Gens sind, können
in den Methoden der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um
OX-2 zu hemmen. Der vorliegende Erfinder hat Antisense-Oligonukleotide
zu OX-2 präpariert,
die in Beispiel 3 beschrieben werden.
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Der
hier verwendete Begriff Antisense-Oligonukleotid bedeutet eine Nukleotid-Sequenz,
die zu ihrem Ziel komplementär
ist.
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In
einer Ausführungsform
der Erfindung ist das Antisense-Oligonukleotid komplementär zu einem
Nukleinsäuremolekül, das eine
wie in 7 gezeigte Sequenz oder ein
Fragment dieser aufweist, wobei T auch U sein kann.
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Der
Begriff „Oligonukleotid" bezieht sich auf
ein Oligomer oder Polymer aus Nukleotid- oder Nukleosidmonomeren,
die aus natürlich
vorkommenden Basen, Zuckern und Rückgrat-Bindungen bestehen.
Der Begriff beinhaltet außerdem
modifizierte oder substituierte Oligomere, die nicht natürlich vorkommende
Monomere oder Abschnitte dieser umfassen und ähnlich funktionieren. Solche
modifizierten oder substituierten Oligonukleotide sind den natürlichen
Formen gelegentlich vorzuziehen, da sie Eigenschaften wie eine verstärkte Zellaufnahme
oder gesteigerte Stabilität
in Präsenz
von Nukleasen aufweisen. Der Begriff beinhaltet außerdem schimärische Oligonukleotide,
die zwei oder mehrere chemisch unterschiedliche Regionen enthalten.
So können
schimärische
Oligonukleotide zum Beispiel mindestens eine Region modifizierter
Nukleotide enthalten, die vorteilhafte Eigenschaften verleihen (z.
B. gesteigerte Nuklease-Resistenz, gesteigerte Zellaufnahme) oder zwei
oder mehr Oligonukleotide der Erfindung können verbunden werden, um ein
schimärisches
Oligonukleotid zu formen.
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Die
Antisense-Oligonukleotide können
Ribonukleinsäuren
oder Desoxyribonukleinsäuren
sein und können
natürlich
vorkommende Basen einschließlich
Adenin, Guanin, Cytosin, Thymidin und Uracil enthalten. Die Oligonukleotide
können
außerdem
modifizierte Basen wie zum Beispiel Xanthin, Hypoxanthin, 2-Aminoadenin,
6-Methyl, 2-Propyl und andere Alkyl-Adenine, 5-halo-Uracil, 5-halo-Cytosin, 6-aza-Uracil,
6-aza-Cytosin und 6-aza-Thymin, Pseudouracil, 4-Thiouracil, 8-halo-Adenin
und andere 8-substituierte Adenine, 8-halo-Guanine, 8-amino-Guanin, 8-thiol-Guanin,
8-Thioalkyl-Guanine, 8-Hydroxyl-Guanin
und andere 8-substituierte Guanine, andere aza- und deaza-Uracile,
Thymidine, Cytosine, Adenine oder Guanine, 5-trifluormethyl-Uracil und
5-trifluorcytosin
enthalten.
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Andere
Antisense-Oligonukleotide können
modifizierten Phosphor, Sauerstoff-Heteroatome im Phosphatrückgrat,
kurzkettiges Alkyl oder Cycloalkyl-Rückgrat-Bindungen
oder kurzkettige heteroatomare oder heterozyklische Rückgrat-Bindungen enthalten.
Die Antisense-Oligonukleotide können
beispielsweise Phosphorthioate, Phosphotriester, Methylphosphonate
und Phosphordithioate enthalten. In einer Ausführungsform der Erfindung bestehen
Phosphorthioat-Bindungen
zwischen den vier bis sechs 3'-Terminus-Basen.
In einer anderen Ausführungsform
verketten Phosphorthioat-Bindungen alle Nukleotide.
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Die
Antisense-Oligonukleotide können
außerdem
Nukleotid-Analoge umfassen, die besser als therapeutische oder experimentelle
Reagenzien geeignet sind. Ein Beispiel eines Oligonukleotid-Analogs
ist eine Peptidnukleinsäure
(PNA), wobei das Desoxyribose (oder Ribose)-Phosphat-Rückgrat in
der DNA (oder RNA) durch ein Polyamid-Rückgrat ersetzt wird, das dem
in Peptiden gefundenen ähnlich
ist (P. E. Nielsen, et al Science 1991, 254, 1497). Außerdem wurde
gezeigt, dass PNA-Analoge einem Abbau durch Enzyme gegenüber resistent
sind und sowohl in vivo als auch in vitro lange überleben können. PNAs binden sich außerdem stärker an
eine komplementäre
DNA-Sequenz, da zwischen dem PNA-Strang und dem DNA-Strang keine durch
Ladungen verursachte Abstoßung
eintritt. Andere Oligonukleotide können Nukleotide enthalten,
die Polymerrückgrate,
zyklische Rückgrate
oder azyklische Rückgrate
enthalten. So können
die Nukleotide beispielsweise Morpholin-Rückgratstrukturen aufweisen
(U.S. Pat. Nr. 5.034.506). Oligonukleotide können ferner Gruppen wie zum
Beispiel Reportergruppen, eine Gruppe zur Verbesserung der pharmakokinetischen
Eigenschaften eines Oligonukleotids oder eine Gruppe zur Verbesserung
der pharmakodynamischen Eigenschaften eines Antisense-Oligonukleotids
enthalten. Antisense-Oligonukleotide können auch die Formen von Zucker
nachbilden.
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Die
Antisense-Nukleinsäuremoleküle können mithilfe
von chemischer Synthese und enzymatischen Ligationsreaktionen unter
Verwendung der bekannten Vorgehensweisen konstruiert werden. Die
Antisense-Nukleinsäuremoleküle können mithilfe
von natürlich
vorkommenden Nukleotiden oder unterschiedlich modifizierten Nukleotiden
chemisch synthetisiert werden, deren Design auf eine Steigerung
der biologischen Stabilität
der Moleküle
oder der physikalischen Stabilität
des Duplexes, der mit der mRNA oder dem nativen Gen geformt wird,
z.B. Phosphorthioat-Derivate oder Acridin-substituierte Nukleotide,
abzielt. Die Antisense-Sequenzen können unter Anwendung eines
Expressionsvektors, der in Form eines rekombinanten Plasmids, Phagemids
oder abgeschwächten
Virus in die Zellen eingeführt
wird, biologisch produziert werden, wobei Antisense-Sequenzen unter
der Kontrolle einer hocheffizienten Regulierungsregion produziert
werden, deren Aktivität
durch den Zelltyp, in den der Vektor eingeführt wird, bestimmt werden kann.
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ZUSAMMENSETZUNGEN
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Die
Erfindung bezieht sich deshalb auf die Herstellung pharmazeutischer
Zusammensetzungen.
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Diese
pharmazeutischen Zusammensetzungen können der intraläsionalen,
intravenösen,
topischen, rektalen, parenteralen, lokalen, inhalierenden oder subkutanen,
intradermalen, intramuskulären,
intrathekalen, transperitonealen, oralen und intrazerebralen Anwendung
dienen. Die Zusammensetzung kann flüssige, feste oder halbfeste
Form annehmen, beispielsweise Pillen, Tabletten, Cremes, Gelatinekapseln,
Kapseln, Zäpfchen,
weiche Gelatinekapseln, Gele, Membrane, „Tubelets", Lösungen
oder Suspensionen.
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Die
pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung können für die Verabreichung
an Menschen oder Tiere gedacht sein. Die zu verabreichenden Dosierungen
hängen
von individuellen Bedürfnissen, der
erwünschten
Wirkung und dem gewählten
Verabreichungsweg ab.
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Die
pharmazeutischen Zusammensetzungen können gemäß der zur Präparation
pharmazeutisch akzeptabler Zusammensetzungen zur Verabreichung an Patienten
bekannten Methoden präpariert
werden und auf solche Weise, dass eine wirksame Menge der aktiven
Substanz in einer Mischung mit einem pharmazeutisch akzeptablen
Vehikel vereint wird. Geeignete Vehikel werden beispielsweise in
Remington's Pharmaceutical
Sciences (Remington's
Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa., USA
195) beschrieben.
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Auf
dieser Grundlage beinhalten die pharmazeutischen Zusammensetzungen,
ohne auf diese beschränkt
zu sein, die aktive Verbindung oder Substanz in Verbindung mit einem
oder mehreren pharmazeutisch akzeptablen Vehikeln oder Verdünnungsmitteln,
die in gepufferten Lösungen
mit einem geeigneten pH-Wert enthalten sind und mit den physiologischen
Flüssigkeiten
isoosmotisch sind. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können zusätzlich andere
Wirkstoffe enthalten, wie zum Beispiel immunsuppressive Medikamente
oder Antikörper,
um die Immuntoleranz oder immunstimulierenden Wirkstoffe zu verstärken und so
die Immunantwort zu verstärken.
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Pharmazeutische
Zusammensetzungen zur Induktion von Immuntoleranz können eine
wirksame Menge von OX-2-Protein im Gemisch mit einem pharmazeutisch
akzeptablen Verdünnungsmittel
oder Träger
umfassen. Das OX-2-Protein
wird vorzugsweise als Immunadhäsionsmolekül in löslicher
Form präpariert,
die dem Patienten verabreicht werden kann. Im Fall von Gewebe- oder
Organtransplantationen enthält
die Zusammensetzung vorzugsweise OX-2-Proteine in löslicher
Form, die am Ort der Transplantation intravenös injiziert oder direkt übergossen
werden können.
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Pharmazeutische
Zusammensetzungen zur Induktion von Immuntoleranz können eine
wirksame Menge eines Nukleinsäuremoleküls umfassen,
das ein OX-2-Protein
im Gemisch mit einem pharmazeutisch akzeptablen Verdünnungsmittel
oder Träger
codiert.
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Die
ein OX-2-Protein codierenden Nukleinsäuremoleküle der Offenlegung können bei
der Gentherapie zur Induktion von Immuntoleranz angewendet werden.
Rekombinante Moleküle,
die eine Nukleinsäuresequenz
umfassen, die ein OX-2-Protein
oder ein Fragment davon codiert, können mithilfe von Trägervehikeln wie
zum Beispiel retroviralen Vektoren, adenoviralen Vektoren und DNA-Virusvektoren direkt
in Zellen oder Gewebe in vivo eingeführt werden. Sie können außerdem mithilfe
von physikalischen Techniken in Zellen eingeführt werden, wie zum Beispiel
Mikroinjektionen und Elektroporation oder durch chemische Methoden
wie Mitfällung
und Inkorporation von DNA in Liposomen abgeliefert werden. Rekombinante
Moleküle
können
auch in Form eines Aerosols oder durch Lavage abgeliefert werden.
Die Nukleinsäuremoleküle können mithilfe
von beispielsweise direkten Injektionen in Zellen auch extrazellulär appliziert
werden. Die OX-2 codierenden Nukleinsäuremoleküle werden vorzugsweise mit
einem Nukleinsäuremolekül, das eine
Immunglobulin(Ig)-Fc-Region codiert, als Fusion präpariert.
Als solches wird das OX-2-Protein in vivo als ein lösliches
Fusionsprotein exprimiert.
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Pharmazeutische
Zusammensetzungen zur Vorbeugung von Immunsuppression können eine
wirksame Menge eines OX-2-Hemmstoffes im Gemisch mit einem pharmazeutisch
akzeptablen Verdünnungsmittel oder
Träger
umfassen. Solche Zusammensetzungen können als Impfstoff entweder
allein oder in Kombination mit anderen aktiven Wirkstoffen oder
Antigenen verabreicht werden. Bei der Anwendung einer Kombination können die
OX-2-Hemmstoffe adjuvant wirken, indem sie die Immunantwort auf
das Antigen im Impfstoff potenzieren.
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Pharmazeutische
Zusammensetzungen zur Vorbeugung von Immunsuppression können eine
wirksame Menge eines Antikörpers
zu OX-2 im Gemisch mit einem pharmazeutisch akzeptablen Verdünnungsmittel oder
Träger
umfassen. Diese Antikörper
können
intravenös
abgeliefert werden.
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Pharmazeutische
Zusammensetzungen zur Vorbeugung von Immunsuppression können eine
wirksame Menge einer Antisense-Oligonukleotid-Nukleinsäure, die zu einer Nukleinsäuresequenz
eines OX-2-Gens komplementär
ist, im Gemisch mit einem pharmazeutisch akzeptablen Verdünnungsmittel
oder Träger
umfassen. Die Oligonukleotidmoleküle können wie oben für die OX-2-Nukleinsäuresequenzen
enthaltenden Zusammensetzungen beschrieben verabreicht werden.
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MURINES OX-2
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Der
Erfinder hat das murine OX-2-Gen kloniert und sequenziert. Folglich
beinhaltet die Offenlegung auch eine isolierte Nukleinsäuresequenz,
die ein murines OX-2-Gen codiert und die in 7 und SEQ.ID.NR.:1
gezeigte Sequenz aufweist.
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Der
Begriff „isoliert" bezieht sich auf
eine Nukleinsäure,
die im Wesentlichen frei von zellulärem Material oder Kulturmedium
ist, wenn sie mithilfe von rekombinanten DNA-Techniken oder chemischen
Vorläufern oder
anderen Chemikalien, wenn chemisch synthetisiert, produziert wird.
Der Begriff „Nukleinsäure" soll DNA und RNA
beinhalten und kann entweder doppel- oder einzelsträngig sein.
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Vorzugsweise
umfasst das gereinigte und isolierte Nukleinsäuremolekül (a) eine in SEQ.ID.NR.:1
gezeigte Nukleinsäuresequenz,
wobei T auch U sein kann; (b) Nukleinsäuresequenzen, die zu (a) komplementär sind;
(c) ein Fragment von (a) oder (b), das mindestens 15 Basen und vorzugsweise
20 bis 30 Basen aufweist und das mit (a) oder (b) unter strikten
Hybridisierungsbedingungen hybridisieren wird; oder (a) ein Nukleinsäuremolekül, das sich
aufgrund der Degeneration des genetischen Codes von allen anderen
Nukleinsäuren
von (a) oder (b) in seinen Codon-Sequenzen unterscheidet.
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Es
sollte bemerkt werden, dass die Offenlegung Nulcleinsäuremoleküle beinhaltet,
die Trunkierungen des murinen OX-2-Proteins und Analoge und Homologe
der Proteine der Erfindung und Trunkierungen dieser wie unten beschrieben
codieren. Es ist außerdem
zu beachten, dass verschiedene Formen der Nukleinsäuremoleküle, die
durch alternatives Splicing einer einer cDNA der Erfindung entsprechenden
mRNA auftreten, für die
Erfindung von Nutzen sind.
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Ein
isoliertes Nukleinsäuremolekül, das DNA
ist, kann auch durch die selektive Amplifikation einer Nukleinsäure, die
ein neuartiges Protein der Erfindung mittels Polymerase-Kettenreaktion-(PCR)-Methoden
und cDNA oder genomischer DNA codieren, isoliert werden. Es ist
möglich,
synthetische Oligonukleotid-Primer aus Nukleinsäuremolekülen wie in 7 gezeigt
zu entwerfen und dann bei der PCR zu verwenden. Eine Nukleinsäure kann
von cDNA oder genomischer DNA ausgehend mithilfe dieser Oligonukleotid-Primer
und den üblichen
PCR-Amplifikationstechniken
amplifiziert werden. Die so amplifizierte Nukleinsäure kann
in einen passenden Vektor kloniert und durch DNA-Sequenzanalyse
charakterisiert werden. Es sollte deutlich sein, dass cDNA von mRNA
ausgehend präpariert
werden kann, indem gesamtzelluläre
mRNA durch eine Vielzahl von Techniken isoliert wird, zum Beispiel
mithilfe der Guanidiniumthiocyanat-Extraktionsprozedur von Chirgwin
et al, Biochemistry, 18, 5294-5299 (1979). cDNA wird dann von der
mRNA ausgehend mithilfe von reverser Transkriptase synthetisiert
(zum Beispiel, Moloney MLV reverse Transkriptase, erhältlich von
Gibco/BRL, Bethesda, MD oder AMV reverse Transkriptase, erhältlich von
Seikagaku America, Inc., St. Petersburg, FL.).
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Ein
isoliertes Nukleinsäuremolekül, das in
der Erfindung nützlich
ist und RNA ist, kann durch die Klonierung einer ein neuartiges
Protein der Erfindung codierenden cDNA in einen passenden Vektor,
der eine Transkription der cDNA erlaubt, um ein RNA-Molekül zu produzieren,
das ein OX-2-Protein der Erfindung codiert, isoliert werden. So
kann die cDNA beispielsweise downstream eines Bakteriophage-Promotors
in einen Vektor kloniert werden (z. B. ein T7- Promoter), cDNA kann
in vitro mit T7 Polymerasen transkribiert werden und die daraus
resultierende RNA kann mithilfe der üblichen Techniken isoliert
werden.
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Ein
in der Erfindung verwendetes Nukleinsäuremolekül kann mithilfe der üblichen
Techniken auch chemisch synthetisiert werden. Verschiedene Methoden
der chemischen Synthetisierung von Poly-Deoxynukleotiden sind bekannt,
einschließlich
der Festphasensynthese, die wie die Peptidsynthese mittlerweile
vollständig automatisiert
ablaufen und kommerziell als DNA-Synthesizer erhältlich sind (siehe z.B. Itakura
et al. U.S. Patent Nr. 4.598.049; Caruthers et al. U.S. Patent Nr.
4.458.066; und Itakura U.S. Patent Nrn. 4.401.796 und 4.373.071).
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Die
Sequenz eines in der Erfindung verwendeten Nukleinsäuremoleküls kann
relativ zu ihrer normalen Präsentation
für die
Transkription invertiert werden, um ein Antisense-Nukleinsäuremolekül zu produzieren. Vorzugsweise
wird die Antisense-Sequenz
konstruiert, indem eine vor dem Initiationscodon liegende Region oder
eine nicht konservierte Region invertiert werden. Im Besonderen
können
die in den Nukleinsäuremolekülen gemäß der Erfindung
oder einem Fragment dieser enthaltenen Nukleinsäuresequenzen und vorzugsweise eine
Nukleinsäuresequenz
wie sie in 7 gezeigt wird, relativ zu
ihrer normalen Präsentation
für Transkriptionszwecke
invertiert werden, um Antisense-Nukleinsäuremoleküle zu produzieren.
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Die
Antisense-Nukleinsäuremoleküle können mithilfe
von natürlich
vorkommenden Nukleotiden oder unterschiedlich modifizierten Nukleotiden,
welche zur Steigerung der biologischen Stabilität der Moleküle oder der physikalischen
Stabilität
des Duplexes, der mit der mRNA oder dem nativen Gen geformt wird,
z.B. Phosphorthioat-Derivate oder Acridin-substituierte Nukleotide,
entworfen wurden, chemisch synthetisiert werden. Die Antisense-Sequenzen
können
unter Anwendung eines Expressionsvektors, der in Form eines rekombinanten
Plasmids, Phagemids oder abgeschwächten Virus in die Zellen eingeführt wird,
biologisch produziert werden, wobei Antisense-Sequenzen unter der
Kontrolle einer hocheffizienten Regulierungsregion produziert werden,
deren Aktivität
durch den Zelltyp, in den der Vektor eingeführt wird, bestimmt werden kann.
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Die
Erfindung kann außerdem
Nukleinsäuren
verwenden, die Fusionsproteine codieren, welche ein OX-2-Protein
gemäß der Erfindung
und ein ausgewähltes
Protein oder ein auswählbares
Markerprotein umfassen.
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Die
Offenlegung beinhaltet ferner ein isoliertes Protein, das die in 8 und
SEQ. ID. NR.:2 gezeigte Aminosäuresequenz
aufweist.
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Im
Kontext der vorliegenden Erfindung kann ein Protein verschiedene
strukturelle Formen des primären
Proteins beinhalten, die ihre biologische Aktivität zurückbehalten.
So kann ein in der Erfindung verwendetes Protein beispielsweise
die Form saurer oder basischer Salze oder neutrale Form annehmen.
Zusätzlich können individuelle
Aminosäurereste
durch Oxidation oder Reduktion modifiziert werden.
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Zusätzlich zu
den Aminosäuresequenzen
in ihrer ganzen Länge
(8) können
die Proteine auch Trunkierungen des Proteins und Analoge und Homologe
des Proteins und Trunkierungen von diesem wie hierin beschrieben
beinhalten. Trunkierte Proteine können Peptide von mindestens
fünfzehn
Aminosäureresten umfassen.
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Analoge
des Proteins, das die in 8 gezeigte
Sequenz aufweist und/oder die hierin beschriebenen Trunkierungen
dieses können
eine Aminosäuresequenz
beinhalten, ohne auf diese beschränkt zu sein, die eine oder
mehrere Aminosäuresubstitutionen,
Insertionen und/oder Deletionen enthält. Aminosäuresubstitutionen können konservierter
oder nicht konservierter Natur sein. Konservierte Aminosäuresubstitutionen
bedeuten, dass eine oder mehrere Aminosäuren des Proteins gemäß der Erfindung
mit Aminosäuren ähnlicher
Ladung, Größe und/oder
Hydrophobiecharakteristika ersetzt werden. Wenn nur konservierte
Substitutionen vorgenommen werden, sollte das resultierende Analog
funktional äquivalent
sein. Nicht konservierte Substitutionen bedeuten, dass eine oder
mehrer Aminosäuren
der Aminosäuresequenz
mit einer oder mehreren Aminosäuren
ersetzt werden, deren Ladung, Größe und/oder
Hydrophobiecharakteristika anders ist.
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Eine
oder mehrere Aminosäureinsertionen
können
in die auf 8 gezeigten Aminosäurensequenzen
eingeführt
werden. Aminosäureinsertionen
können
aus einzelnen Aminosäureresten
oder sequenziellen Aminosäuren
bestehen, deren Länge
von 2 bis 15 Aminosäuren
reicht. Aminosäureinsertionen
können
beispielsweise verwendet werden, um das Protein inaktiv zu machen.
Diese Prozedur kann in vivo verwendet werden, um die Aktivität eines
Proteins zu hemmen.
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Deletionen
können
aus der Entfernung einer oder mehrerer Aminosäuren oder diskreten Portionen dieser
aus der in 8 gezeigten Aminosäuresequenz
bestehen. Die gelöschten
Aminosäuren
können
aber müssen
nicht benachbart sein. Die untere Grenzlänge des resultierenden Analogs
mit einer Deletionsmutation beträgt
ungefähr
10 Aminosäuren
und vorzugsweise 100 Aminosäuren.
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Analoge
eines Proteins der Öffenlegung
können
durch die Einführung
von Mutationen in die das Protein codierende Nukleotidsequenz präpariert
werden. Mutationen in Nukleotidsequenzen, die für die Expression von Analogen
eines Proteins der Erfindung konstruiert wurden, müssen den
Leserahmen der Codesequenzen beibehalten. Ferner schaffen die Mutationen
vorzugsweise keine komplementären
Regionen, die hybridisieren könnten
um sekundäre
mRNA-Strukturen
zu produzieren, wie zum Beispiel Schleifen oder Haarnadeln, welche
die Translation der Rezeptor-mRNA nachteilig beeinflussen könnten.
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Mutationen
können
an speziellen Loci eingeführt
werden, indem die Oligonukleotide, die eine mutierte Sequenz enthalten,
synthetisiert werden, wobei diese von Restriktionsstellen flankiert
werden, durch die eine Ligation an Fragmente der nativen Sequenz
möglich
wird. Nach der Ligation codiert die resultierende rekonstruierte
Sequenz einen Analog, der die gewünschte Aminosäureinsertion,
-substitution oder -deletion aufweist.
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Als
Alternative dazu können
auf Oligonukleotide gerichtete stellenspezifische Mutagenese-Prozeduren
eingesetzt werden, um ein verändertes
Gen bereitzustellen, das je nach der benötigten Substitution, Deletion
oder Insertion veränderte
spezifische Codone aufweist. Die Deletion oder Trunkierung eines
Proteins der Offenlegung kann auch durch Verwendung nahe liegender
Restriktionsstellen der Endonuklease, die an der gewünschten
Deletion anliegen, konstruiert werden. Anschließend an die Restriktion können Überhänge ausgefüllt und
die DNA relegiert werden. Exemplarische Methoden der oben aufgelisteten
Veränderungen
sind von Sambrook et al offengelegt worden (Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, 2te Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press,
199).
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Ebenso
erwägt
wurden Isoformen der beschriebenen Proteine. Eine Isoform enthält dieselbe
Anzahl und Arten von Aminosäuren
wie ein Protein der Erfindung, doch die Isoform weist eine andere
molekulare Struktur auf. Die von der vorliegenden Offenlegung erwägten Isoformen
sind diejenigen, die dieselben Eigenschaften wie das hierin beschriebene
Protein aufweisen.
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Die
vorliegende Erfindung beinhaltet außerdem die Anwendung eines
Proteins der Offenlegung, das mit einem ausgewählten Protein oder einem auswählbaren
Markerprotein konjugiert wird, um Fusionsproteine zu produzieren.
Zusätzlich
können
immunogene Portionen eines offengelegten Proteins gemäß der Erfindung in
den Rahmen der Offenlegung fallen.
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Die
Proteine (einschließlich
Trunkierungen, Analoge, etc.) können
mithilfe von rekombinanten DNA-Methoden präpariert werden. Folglich können Nukleinsäuremoleküle mit einer
Sequenz, die ein beschriebenes Protein codiert, auf bekannte Art
und Weise in einen passenden Expressionsvektor inkorporiert werden, der
eine gute Expression des Proteins sicherstellt. Zu den möglichen Expressionsvektoren
gehören,
ohne auf diese beschränkt
zu sein, Cosmide, Plasmide oder modifizierte Viren (z. B. replikative,
defektive Retroviren, Adenoviren und Adeno-assoziierte Viren), wobei
der Vektor mit der verwendeten Wirtszelle kompatibel sein muss.
Die Expressionsvektoren sind „für die Transformation
einer Wirtszelle geeignet",
was bedeutet, dass die Expressionsvektoren ein Nukleinsäuremolekül der Offenlegung
und regulierende Sequenzen enthalten, die auf der Basis der für die Expression
zu verwendenden Wirtszellen ausgewählt werden, die wirksam an
das Nukleinsäuremolekül gebunden
sind. Wirksam gebunden soll bedeuten, dass die Nukleinsäure so an
regulierende Sequenzen gebunden ist, dass eine Expression der Nukleinsäure möglich wird.
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Deshalb
beinhaltet die Offenlegung einen rekombinanten Expressionsvektor,
der ein beschriebenes Nukleinsäuremolekül oder ein
Fragment dieses und die notwendigen regulierenden Sequenzen für die Transkription
und Translation der eingeführten
Proteinsequenz enthält.
Solche Expressionsvektoren können
in den oben beschriebenen Therapien, die eine ein OX-2-Protein codierende
Nukleinsäuresequenz
verwenden, von Nutzen sein. Geeignete regulierende Sequenzen können von
einer Vielzahl von Quellen abgeleitet werden, einschließlich bakterieller,
fungaler oder viraler Gene (Man siehe zum Beispiel die von Goeddel
beschriebenen regulierenden Sequenzen, in Gene Expression Technology:
Methods an Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)).
Die Auswahl passender regulierender Sequenzen hängt ab von der gewählten Wirtszelle
und sollte von einem Fachmann leicht zu treffen sein. Beispiele
solcher regulierenden Sequenzen beinhalten: Ein transkriptioneller
Promoter und Enhancer oder eine RNA-Polymerase-Bindungssequenz, eine ribosomale Bindungssequenz,
einschließlich
eines Translation-Initiationssignals. Zusätzlich können je nach ausgewählter Wirtszelle
und dem verwendeten Vektor andere Sequenzen, zum Beispiel ein Replikationsursprung, zusätzliche
DNA-Restriktionsstellen, Enhancer und Sequenzen, die die Induzierbarkeit
von Transkription übertragen,
in den Expressionsvektor inkorporiert werden. Es sollte auch bemerkt
werden, dass die notwendigen regulierenden Sequenzen durch das native
Protein und/oder dessen flankierende Regionen geliefert werden können.
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Ebenfalls
nützlich
für die
Zwecke der Erfindung ist ein rekombinanter Expressionsvektor, der
ein DNA-Nukleinsäuremolekül der Erfindung
umfasst, das in den Expressionsvektor in einer Antisense-Orientierung
kloniert ist. Dies bedeutet, dass das DNA-Molekül wirksam und auf solche Art
und Weise an eine regulierende Sequenz gebunden ist, dass die Expression
eines RNA-Moleküls,
das in Antisense zu einer Nukleotidsequenz ist, die die in 7 gezeigten
Nukleotide umfasst, durch Transkription des DNA-Moleküls möglich wird.
Die wirksam an die Antisense-Nukleinsäure gebundenen regulierenden
Sequenzen können
so ausgewählt
werden, dass sie die kontinuierliche Expression des Antisense-RNA-Moleküls ausrichten.
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Die
rekombinanten Expressionsvektoren können außerdem ein auswählbares
Markergen enthalten, das die Auswahl der mithilfe eines rekombinanten
Moleküls
der Erfindung transformierten oder transfizierten Wirtszellen vereinfacht.
Beispiele auswählbarer
Markergene sind ein Protein wie zum Beispiel G418 und Hygromycin
codierende Gene, die eine Resistenz speziellen Medikamenten gegenüber übertragen,
wie zum Beispiel β-Galaktosidase,
Chloramphenicol Acetyltransferase oder Firefly-Luziferase. Die Transkription des auswählbaren
Markergens wird über
die Konzentrationsveränderungen
des auswählbaren
Markerproteins überwacht,
wie zum Beispiel β-Galaktosidase,
Chloramphenicol Acetyltransferase oder Firefly-Luziferase. Falls das auswählbare Markergen
ein Protein codiert, das eine antibiotische Resistenz wie zum Beispiel
eine Neomycin-Resistenz überträgt, können gleichzeitig
mit G418 Transformant-Zellen ausgewählt werden. Zellen, die das
auswählbare
Markergen inkorporiert haben, überleben,
während
die anderen Zellen absterben. Hierdurch werden die Visualisierung
und der Assay der Expression der rekombinanten Expressionsvektoren
der Erfindung möglich
und vor allem können
so die Auswirkungen einer Mutation auf Expression und Phänotyp bestimmt
werden. Es ist zu beachten, dass auswählbare Marken auf einem von
der betrachteten Nukleinsäure getrennten
Vektor eingeführt
werden können.
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Die
rekombinanten Expressionsvektoren können außerdem Gene enthalten, die
einen Fusionsanteil codieren, der eine gesteigerte Expression des
rekombinanten Proteins bereitstellt; eine gesteigerte Löslichkeit des
rekombinanten Proteins bereitstellt; und bei der Reinigung eines
bestimmten rekombinanten Proteins hilft, indem er als ein Ligand
in der Affinitätsreinigung
agiert. So kann beispielsweise eine proteolytische Schnittstelle
dem rekombinanten Zielprotein zugefügt werden, um nach der Reinigung
des Fusionsproteins eine Trennung des rekombinanten Proteins von
dem Fusionsanteil zu ermöglichen.
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Rekombinante
Expressionsvektoren können
in Wirtszellen eingeführt
werden, um eine Transformant-Wirtszelle zu produzieren. Der Begriff „Transformant-Wirtszelle" soll prokaryotische
und eukaryotische Zellen beinhalten, die mit einem rekombinanten
Expressionsvektor der Erfindung transformiert oder transfiziert worden
sind. Die Begriffe „transformiert
mit", „transfiziert
mit", „Transformation" und „Transfektion" sollen die Einführung von
Nukleinsäure
(z. B. einem Vektor) in eine Zelle unter Anwendung einer der vielen
möglichen, bekannten
Techniken einschließen.
Prokaryotische Zellen können
mit Nukleinsäure
zum Beispiel durch Elektroporation oder Calciumchlorid-vermittelte
Transformation transformiert werden. Nukleinsäure kann mithilfe herkömmlicher
Techniken wie zum Beispiel Calciumphosphat- oder Calciumchlorid-Mitfällung, DEAE-Dextranvermittelte
Transfektion, Lipofektin, Elektroporation oder Mikroinjektion eingeführt werden.
Geeignete Methoden der Transformation und Transfektion von Wirtszellen
können
bei Sambrook et al(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2te Ausgabe,
Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) und in anderen Labor-Lehrbüchern gefunden
werden.
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Zu
den geeigneten Wirtszellen gehört
eine Vielzahl prokaryotischer und eukaryotischer Wirtszellen. So können die
Proteine der Erfindung beispielsweise in bakteriellen Zellen wie
E.coli, Insektenzellen (unter Verwendung von Baculovirus), Hefezellen
oder Säugetierzellen
exprimiert werden. Andere geeignete Wirtszellen können bei
Goeddel gefunden werden, Gene Expression Technology: Methods an
Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1991).
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Die
für die
Erfindung nützlichen
Proteine können
auch durch chemische Synthese unter Anwendung von den in der Chemie
von Proteinen bekannten Techniken wie zum Beispiel Festphasen-Synthese
(Merrifield, 1964, J. Am. Chem. Assoc. 85:2149-2154) oder Synthese
in homogenen Lösungen
(Houbenweyl, 1987, Methods of Organic Chemistry, Hrsg. E. Wansch,
Vol. 15 I and II, Thieme, Stuttgart) präpariert werden.
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Die
folgenden Beispiele veranschaulichen die vorliegende Erfindung ohne
sie einzuschränken.
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BEISPIELE
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Beispiel 1
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Dieses
Beispiel verdeutlicht die gesteigerte Expression bestimmter Gene
nach einer pv-Immunisierung
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Mäuse:
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C3H/HEJ-
und C57BL/6-Mäuse
wurden bei The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, gekauft. Die Mäuse wurden
zu fünft
in Käfigen
untergebracht und ad libitum mit Futter und Wasser versorgt. Alle
Mäuse wurden
im Alter von 8-12 Wochen verwendet.
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Monoklonale Antikörper:
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Die
folgenden monoklonalen Antikörper
(Mabs) von Pharmingen (San Diego, CA) wurden verwendet: anti-IL-2
(JES6-1A12; biotinylierte JES6-5H4); anti-IL-4 (11B11; biotinylierte
BVD6-24G2); anti-IFNg (R4-6A2; biotinylierte XMG1.2); anti-IL-10 (JES5-2A5;
biotinylierte SXC-1, Pharmingen, San Diego, CA); Maus-IgGl-Isotypkontrolle (Klon
107.3, BALB/c anti-TNP). Streptavidin-Meerrettich-Peroxidase und rekombinante Maus-GM-CSF
wurden ebenfalls bei Pharmingen (San Diego, CA) erstanden.
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NLDC-145
(anti-Maus dendritische Zellen) und F(abŌ)2-Kaninchen anti-Ratte IgG FITC-Konjugat (nicht
kreuzreaktiv mit Maus IgG) oder F(abŌ)2-Kaninchen anti-Maus IgG PE wurde bei
Serotec, Kanada, erstanden.
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Kaninchen-Komplemente,
L3T4, anti-thyl.2, anti-Ly2.2 (Maus-IgG3), FITC-MAC-1 und Maus-IgG1 anti-Ratte-OX-2
wurden bei Cedarlane Labs, Hornby, Ontario, erstanden.
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Anti-CD28
(PV-1) und anti-CTLA (UC10-4F10-11) wurden jeweils von Dres. C.
June und J. Bluestone erstanden, während anti-B7-1 und anti-B7-2
von Dr. G. Powers erstanden wurden. Hohe Titer der vier letzteren 4
Antikörper
wurden durch in vitro Kulturen in einem CELLMAX-System (CELLCO Inc.,
Germantown, MD, USA) produziert.
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Präparation von Zellen:
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Mit
einzelnen Mäusen
der verschiedenen behandelten Gruppen wurden in jedem Experiment
Zellsuspensionen der Milz, Peyerschen Platten (PP) und mesenterischen
Lymphknoten (MLN) aseptisch präpariert.
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Dort,
wo dendritische Zellen durch Kulturen von Knochenmarkszellen in
vitro gewonnen wurden, wurde die folgende Technik verwendet (Gorczynski
et al, 1996a). Knochenmarksmaterial wurde aus den Oberschenkelknochen
der männlichen
Spendermäuse
C57BL/6 (oder BALB/c) abgesaugt, gewaschen und dann in αF10 resuspendiert.
Die Zellen wurden mit einer Mischung aus Antikörpern (L3T4, anti-thyl.2, anti-Ly2.2)
und Kaninchen-Komplement sequenziell behandelt und die toten Zellen
durch Zentrifugalkraft über
Maus-Lymphopaque (Cedarlane Labs, Ontario) entfernt. Die Zellen
wurden 3 × in αF10 gewaschen
und in 10ml αF10
in Gewebe-Kulturkolben
bei einer Konzentration von 2 × 106/ml mit 500U/ml rekombinantem murinen GM-CSF (Pharmingen,
USA) kultiviert. Frischer GM-CSF wurde in 36-stündigen
Intervallen zugegeben. Die Zellen wurden an den Tagen 3,5 und 7
der Kultur über
Lymphopaque getrennt und dann wieder in αF10 mit rekombinantem GM-CSF
rekultiviert. Nach 10 Tagen wurde ein Aliquot der Probe mit NLDC-145
und FITC anti-Ratte IgG, anti-OX-2 und PE anti-Maus-IgG, FITC-anti-B7-1
oder FITC-anti-B7-2 gefärbt.
Die durchschnittliche Färbung mit
diesen Antikörpern
unter Verwendung von Zellen, die aus solchen Kulturen geerntet wurden,
betrug jeweils 93%±7%,
14%±5%,
78%±9%
und 27%±6%.
Die verbleibenden Zellen wurden gewaschen und wie beschrieben in
die Pfortader injiziert.
-
Pfortader-Immunisierungen
und Nierentransplantation
-
Die
pv-Immunisierungen und Nierentransplantation wurden wie zuvor beschrieben
durchgeführt (Gorczynski
et al, 1994). Alle C3H Mäuse
erhielten pv/iv-Immunisierung
mit 15 × 106 C57BL/6 10 Tage lang kultivierten, vom
Knochenmark derivierten, dendritischen Zellen, gefolgt von der C57BL/6-Nierentransplantation.
Die Tiere erhielten 1 intramuskuläre (im) Injektion mit 10 mg/Kg
Cyclosporin A am Tag der Transplantation. Fünf Tage nach der Transplantation
wurden Mäuse geopfert,
damit Gewebe entnommen und RNA präpariert werden konnte. In anderen
Studien wurden Tiere wie in dem Text beschrieben geopfer.
-
Wenn
monoklonale Antikörper
in transplantierte Mäuse
injiziert wurden, erhielten die Tiere in 2-tägigen Intervallen 100mg intravenös (iv) (× 4 Injektionen),
wobei die erste Injektion innerhalb von 2 Stunden nach der Transplantation
stattfand.
-
Zytokinproduktion aus
Milzzellen transplantierter Mäuse:
-
In
für die
Einschätzung
der Induktion von Zytokinproduktion verwendeten Kulturen wurden
Milzresponderzellen verwendet, die mit dreifachen, bestrahlten (2000R)
C57BL/6 Milz-Stimulatorzellen in αF10
stimuliert worden waren. In einer Vielzahl von Studien wurden bei
der Zytokinproduktion von Milz, Lymphknoten oder Peyerschen Platten
der transplantierten Mäuse
keine bedeutenden quantitativen oder qualitativen Unterschiede beobachtet
werden. (Gorczynski et al, 1995b). Überschüssige Flüssigkeiten wurden in Stunde
40 aus replikativen Wells gesammelt und dreifach in ELISA-Assays
auf ihre Lymphokinproduktion hin getestet. Alle Capture-Antikörper, biotinylierten
Detektionsantikörper
und rekombinanten Zytokine wurden bei Pharmingen (San Diego, CA – siehe
oben) erstanden.
-
Beim
Assay von IFNγ wurden
mit 100ng/ml R4-6A2 beschichtete 96-Well-Nunc-Platten mit flachem Boden (Gibco,
BRL) verwendet. Verschiedene Volumina überschüssiger Flüssigkeiten wurden dreifach
bei 4°C gebunden
und 3 × gewaschen,
woraufhin anti-IFNγ (XMG1.2)
zugegeben wurde. Nach dem Waschen wurden die Platten mit Streptavidin-Meerrettich-Peroxidase
(Cedarlane Labs) inkubiert, mit einem passenden Substrat entwickelt,
woraufhin OD405 mithilfe eines ELISA-Plattenlesers bestimmt
wurde. IL-10 wurde mit einem ähnlichen
ELISA-System mit JESS-2A5 als Capture-Antikörper und biotinyliertem SXC-1
als entwickelndem Antikörper
getestet. Jeder Assay konnte zuverlässig Zytokinwerte zwischen
0,01 und 0,1 ng/ml nachweisen. ELISA-Assays für IL-2 und IL-4 verwendeten
JES6-1A12 und 11B11 als Capture-Antikörper, mit biotinylierten JES6-5H4
oder BVD6-24G2 als entwickelnden Antikörpern. Die Detektionsempfindlichkeit
lag bei 10pg/ml für jedes
Zytokin.
-
Oligonukleotid-Primer:
-
Die
zur PCR-Amplifikation für β-actin und
verschiedene Zytokine verwendeten Primer sind in früheren Veröffentlichungen
beschrieben worden (Gorczynski, R.M., 1995a; Gorczynski, R.M. 1995b;
Gorczynski, R.M., 1996a). Außerdem
wurden die folgenden Oligonukleotide synthetisiert.
-
cDNA-Synthese-Primer für Driver-ds-cDNA
(DP):
-
-
Adapter 1 (Ad1):
-
- 5'-CTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3'
-
Adapter 2 (Ad2):
-
- 5'-TGTAGCGTGAAGACGACGAAAGGGCGTGGTGCGGAGGGCGGT-3'
- PCR-Primer1 (P1): 5'-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3'
- Nested-Primer 1 (NP1): 5'-TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3'
- PCR-Primer2 (P2): 5'-TGTAGCGTGAAGACGACAGAA-3'
- Nested-Primer 2 (NP2): 5'-AGGGCGTGGTGCGGAGGGCGGT-3'
-
Driver- und Tester-Präparation:
-
Es
wurde RNA aus den gesammelten mesenterischen Lymphknoten (MLN) und
Peyerschen Platten (PP) von 5 Mäusen
pro Gruppe extrahiert, die Nierentransplantate mit iv- oder mit
pv-Immunisierung erhalten hatten. Poly(A)+mRNA
wurde aus der Driver(iv)-Gruppe präpariert und 2mg Material wurden
für eine
ds-cDNA-Synthese mit 1ng DP-Primer und einem cDNA-Synthese-Kit (Clontech) mit
T4-DNA-Polymerase verwendet. Die letztendliche cDNA-Präparation
wurde mit RsaI in einer 50ml Reaktionsmischung mit 15 Einheiten
Enzym (GIBCO) 3 Stunden lang verdaut, dann wurde die cDNA mit Phenol
extrahiert, mit Ethanol gefällt
und in 7ml deionisiertem Wasser (mit einer ungefähren Konzentration von 300ng/ml)
resuspendiert.
-
Mit
RsaI verdaute ds-Tester-cDNA (pv-Gruppe) wurde auf ähnliche
Art und Weise präpariert.
50ng der in TE-Puffer verdünnten
Tester-cDNA wurde mit 2ml Ad1 und Ad2 (jeder bei 10mM) in getrennten
Ligationsreaktionen bei 16°C
18 Stunden lang mit 50 Einheiten/m1 T4-Ligase ligiert. Dann wurde
1ml von 0,2M EDTA zugegeben, die Mischung bei 70°C 5 Minuten lang erhitzt, um
die Ligase zu deaktivieren und das Produkt bei –70°C gelagert.
-
Subtraktive Hybridisierung
und PCR-Amplifikation
-
600ng
Driver(iv)-ds-cDNA wurden in zwei Röhrchen gegeben, die 20ng Ad1-
und Ad2-ligierte-pv-cDNA enthielten. Die Proben wurden gemischt,
mit Ethanol gefällt,
in Hybridisierungspuffer resuspendiert, mit Mineralöl bedeckt
und auf gängige
Art und Weise denaturiert/ausgeglüht. Die zwei unabhängigen Proben
wurden dann kombiniert, es wurden 200ng frische Driver-cDNA zugegeben,
um eine weitere Anreicherung von differentiell exprimierten mRNAs
zu ermöglichen
und die Mischung wurde erneut 10 Stunden lang bei 68°C denaturiert
und ausgeglüht.
Die letzte Probe wurde in Hepes-Puffer mit EDTA verdünnt und
bei –20°C gelagert.
-
Nach
der Subtraktion wurden zwei PCR-Amplifikationen auf der subtrahierten
cDNA durchgeführt.
Bei der ersten wurde 1ml subtrahierter cDNA mit 1ml von jeweils
P1 und P2 amplifiziert. Die Amplifikationsbedingungen entsprachen
den von Diatchenko beschriebenen. Die amplifizierten Produkte wurden
zehnfach in deionisiertem Wasser verdünnt und 1m1 des Produkts wurde
für eine
weitere Amplifikation verwendet, die mithilfe der Nested-Primer
(NP1 und NP2) und einer Amplifikationsreaktion mit 10 Zyklen stattfand.
Aliquots der ursprünglichen
Driver/Tester und subtrahierte cDNAs wurden für PCR-Reaktionen verwendet,
bei denen Kontroll-Oligonukleotid-Primer (β-actin) für bekannte „Haushaltsgene" und Primer für Gene,
bei denen zuvor dokumentiert worden war, dass ihre Expression in
iv/pv-immunisierten Mäusen
unterschiedlich ausfällt,
verwendet wurden. Diese Daten werden in 1 und 2 gezeigt.
-
1 zeigt
die PCR-Validierung suppressiver, subtraktiver Hybridisierung. Proben
unsubtrahierter (Bahnen 1, 3, 5 und 7) oder subtrahierter (Bahnen
2, 4, 6 und 8) mRNA wurden rückwärts transkribiert
und mit b-actin-Primern
für verschiedene
PCR-Zykluszeiten in PCR getestet. Bahnen 1 und 2: 15 Zyklen; Bahnen
3 und 4: 20 Zyklen; Bahnen 5 und 6: 25 Zyklen; Bahnen 7 und 8: 30
Zyklen.
-
2 zeigt die PCR-Validierung suppressiver,
subtraktiver Hybridisierung. Proben unsubtrahierter (Bahnen 2 und
4) oder subtrahierter (Bahnen 3 und 5) mRNA wurden wie in 1 getestet,
mit der Ausnahme, dass Primer für
IL-10 verwendet wurden, wobei die verschiedenen Zykluszeiten gezeigt
werden. Bahnen 2 und 3: 20 Zyklen; Bahnen 4 und 5: 30 Zyklen; Bahn
1: mol. Gew. Standard.
-
Zusätzlich wurde
die Klonierung der subtrahierten cDNA wie folgt durchgeführt.
-
Klonierung
und weitere Analyse von subtrahierter cDNA
-
Die
PCR-amplifizierte cDNA wurde mit einem TA-Klonierungskit (Invitrogen,
Kalifornien) kloniert, indem sie direkt in den PCR-II-Vektor ligiert
wurde. Die Ligation wurde bei einem Insert: Vektor-Verhältnis von 3:1
in 1 × Ligationspuffer
mit T4-Ligase (3U/μl)
bei 14°C über Nacht
durchgeführt.
Ligationsprodukte wurden dann unter Anwendung eines gängigen Transformationsprotokolls
in INTFαF'-kompetente Escherichia
Coli insertiert und mit Ampicillin auf Platten mit X-gal (5-Brom-4-Chlor-3-Indolyl-D-Galactosid)
ausgewählt.
Miniprep-Plasmid-DNA wurde mit einem Spin-Kit für Plasmidextraktion (Qiagen,
Deutschland) gereinigt und mit dem Restriktionsenzym EcoR I geschnitten,
um zu bestimmen, ob die Plasmide das erwartete Insert enthielten. Plasmide
mit Inserts wurden unter Verwendung eines T7-Sequenzierkits (Pharmacia
Biotech, Kanada) mithilfe der Dideoxy-Sequenzierungsmethode sequenziert.
Nukleinsäure-Homologiesuchen
wurden mithilfe des BLAST-Programms
am National Center for Biotechnology Information (NIH, Bethesda,
USA) durchgeführt.
-
Weitere
Analysen klonierten Materials wurden wie folgt unter Anwendung von
Northern-Hybridisierung durchgeführt.
Inserts in pCRII wurden 12 Zyklen lang mithilfe von Nested-PCR-Primern
amplifiziert. Das amplifizierte Material wurde mithilfe von Qiaquick
Spin PCR Purification Kits (Qiagen) gereinigt, durch Random-Priming mit 32P markiert und als eine Sonde für Northern-Hybridisierung
mit 20mg-Proben
der ursprünglichen (und
frischen) iv- oder pv-Gesamt-RNA verwendet. Die Hybridisierung wurde
in 5ml ExpressHyb-Lösung (Clontech)
mit einem Minimum von 5 × 106cpm pro 100ng cDNA-Sonde und 0,1 mg/ml beschalltem,
durch Hitze denaturiertem Lachssperma durchgeführt. Filter wurden 4 Mal gewaschen,
jeder 15 Minuten lang bei 27°C mit
1×SSC
und 0,1% SDS, gefolgt von einer Wäsche hoher Stringenz bei 42°C, 30 Minuten
lang mit 0,2xSSC und 0,1% SDS. Die Expositionszeiten lagen zwischen
18 Stunden und 6 Tagen. 3 zeigt einen
Autoradiograph, der 32gP-markierte Sonden
verwendet, welche ausgehend von 4 Klonen präpariert und mithilfe der oben
beschriebenen Vorgehensweise des subtraktiven Hybridisierens erzielt
wurden (mit pv-cDNA als Testermaterial und iv-cDNA als Driver). Eine markierte Kontrollsonde
wurde mit einem PCR-Amplicon für
Maus-b-actin präpariert.
Dann wurde Gesamt-RNA von Mäusen
präpariert,
die iv- oder pv-immunisiert wurden, woraufhin äquivalente Mengen wie gezeigt
in replikative Bahnen geladen wurden, wobei Gele nach 18 Stunden
(Klon #28) und bis zum sechsten Tag (Klon #71) entwickelt wurden.
Klon 8 ist dem Maus-Poly(A)-Bindungsprotein am Ähnlichsten.
Klon 16 ist dem MRC-OX-2 der Maus am Nächsten. Klon 28 ist dem menschlichen
Zinkfinger-Protein am Ähnlichsten.
Klon 71 weist keine homologe Sequenz auf.
-
Western-Blotting-Protokoll:
-
Die
angewandte Technik war im Wesentlichen die von Sandhu et al (1991)
beschriebene und von Bronstein et al (1992) modifizierte. Vierzehn
Tage nach der Nierentransplantation wurden unter Verwendung der
in 5 beschriebenen Gruppen Proben
entnommen. Frische Thymuszellen der Ratte dienten als Kontrolle.
Die Proben wurden in 12% SDS-PAGE durch Elektrophorese getrennt
und vor der Zugabe von primären Antikörpern auf
PVDF-Membrane (Novex Co., San Diego, CA) übertragen. Ein kommerzielles
anti-Ratte OX-2 wurde als Test-Reagens verwendet; der Kontrollantikörper war
ein Antikörper
zu Maus-CD8a. Der verwendete entwickelnde Antikörper war eine kommerzielle
Meerrettich-Perodixase, die mit anti-Maus-IgG markiert war. Alle
Reagenzien wurden bei Cedarlane Labs (Hornby, Ontario, Kanada) erstanden.
-
Homologievergleiche der
DNA-Sequenz:
-
Unter
Anwendung eines DNASIS-Programms (Version 2.0) wurde ein Vergleich
von Maus-OX-2 mit bekannten cDNA-Sequenzen für B7-1, B7-2, CD28 und CTLA-4
durchgeführt.
-
ERGEBNISSE
-
Bewertung der suppressiven
subtraktiven Hybridisierungstechnik (SSH)
-
Um
die Wirksamkeit der verwendeten SSH-Technik zu bewerten, hat sich
der Erfinder auf seine älteren Arbeiten
bezogen, die mithilfe von PCR-Analyse gezeigt hatten, dass im lymphoiden
Gewebe von pv-immunisierten Mäusen
eine gesteigerte Expression von mRNA für IL-10-Gene nachzuweisen ist.
Folglich wurde eine Verdünnungsanalyse
von cDNA aus dem Tester, Driver und subtrahierten Material mithilfe
von PCR-Primern für β-actin und
IL-10 durchgeführt.
Wie in 1 gezeigt, konnte im subtrahierten Material erst
nach 35 Zyklen der Amplifikation ein nachweisbares Signal für β-actin festgestellt
werden. Im Gegensatz dazu war in dem unsubtrahierten Material bereits
nach 15 Zyklen ein Signal präsent.
Mithilfe zusätzlicher
quantitativer Modellmessungen wurde festgestellt, dass dies einer
Depletion von β-actin
mRNA von ungefähr
1000-10.000 entsprach. In einer anderen Studie, in der IL-10 mRNA
(2) analysiert wurde, konnte eine
bedeutende Anreicherung von IL-10 mRNA festgestellt werden, die
durch den Vergleich der nachweisbaren Amplifikation bei 30 Zyklen in
subtrahiertem/unsubtrahiertem Material bestimmt wurde (siehe Bahnen
4 und 5, 2).
-
In
einem weiteren Test der Wirksamkeit der Subtraktion wurde die Mischung
aus unsubtrahierter und subtrahierter Tester-(pv)-cDNA markiert
und mit Northern-Blots
von iv-(Tester) und pv-(Driver)-Gesamt-RNA hybridisiert. Die Ergebnisse
(die Daten werden hier nicht gezeigt) wiesen darauf hin, dass die
subtrahierte Tester-cDNA-Sonde
tatsächlich
ein bedeutend stärkeres
Signal mit der Tester-RNA produzierte. Unter Berücksichtigung der Tatsache,
dass alle cDNA-Spezies zur Produktion eines Signals in einem Northern-Blot
eine Konzentration von über
0,1-0,3% der cDNA-Mischung
darstellen müssen,
sind diese Daten erneut konsistent mit unserer Produktion eines
hohen Niveaus von Anreicherung der pv-spezifischen-cDNA, bei einer gleichzeitigen Reduktion
von überschüssigen cDNAs,
die zwischen Tester (pv) und Driver (iv)-Material üblich ist.
-
Nachweis einzigartiger
cDNA-Fragmente im Gewebe pv-immunisierter Mäuse
-
Die
Wirksamkeit und Gültigkeit
von SSH für
den Nachweis von cDNAs, die nur in der Gewebeprobe der pv-immunisierten
Mäusen
auftraten, wurde nach der Klonierung und Sequenzanalyse von ausgewählten Tester-spezifischen
cDNAs erneut bestätigt.
10 wahllos ausgewählte
cDNA-Klone (von 66 sequenzierten) wurden verwendet, um multiple
Präparationen
von vollständiger
pv- oder iv-RNA zu sondieren. Alle legten einzigartige mRNAs bloß, die vorzugsweise
in den pv-Proben exprimiert wurden. In 3 werden
Autoradiogramme von 4 dieser Northern-Blots zusammen mit einer β-actin-Sonde
als Kontrolle gezeigt. Es wurden Expositionszeiten zwischen 18 Stunden
und 6 Tagen verwendet, die als Hinweis auf pv-spezifische cDNAs
verschiedener Vorkommen in den betrachteten Proben interpretiert
wurden.
-
Die
cDNA-Inserts der 4 gezeigten Klone wurden, zusammen mit den anderen
62 Klonen, teilweise sequenziert und auf ihre Homologie hin in der
GenBank und EMBL-Datenbanken analysiert. Eine Zusammenfassung dieser
Daten wird in Tabelle 1 gezeigt. Es ist zu beachten, dass um die
30 cDNA-Fragmente mindestens 50% Homologie mit anderen beschriebenen
Sequenzen aufwiesen (BLAST Zähler >250 über mindestens 50nt).
Weitere 14 Klone zeigten ähnliche
Homologie mit bekannten Genen von der Ratte/vom Menschen. Beide
Gruppen können
Mitglieder verschiedener Genfamilien darstellen. Zusätzlich zeigten
22 Klone keine bedeutsamen Treffer mit Eingaben in der Datenbank
und könnten
deshalb neuartige Gene darstellen, die nach der pv-Immunisierung
nach oben reguliert wurden. Das die gezeigten Daten nur eine minimale
Schätzung
solcher differentiell exprimierter Gene sein kann, wird aus der
Tatsache deutlich, dass KEINE Homologie mit IL-4- oder IL-10-Gensequenzen (mRNAs,
die bekannt dafür
sind, nach der pv-Immunisierung übermäßig exprimiert zu
werden – siehe
auch 2) in den 66 analysierten Klonen
nachgewiesen wurden.
-
Die
Sequenzhomologie für
die in 3 gezeigten Klone (>80% Homologie über der
verglichenen Sequenz) führte
zu einer weiteren Charakterisierung dieser Klone. Es wurde gezeigt,
dass Klon 8 dem Maus-Poly(A)-Bindungsprotein
am ähnlichsten
war; Klon 16 war dem Ratten-MRC-OX-2 am ähnlichsten; und Klon 28 war
den menschlichen Zinkfingerproteinen am ähnlichsten. Für Klon 71
wurde keine homologe Sequenz gefunden. In den folgenden Daten wird
die Analyse einer dieser Klone beschrieben, die Homologie mit der
cDNA einer Ratte zeigten (für
OX-2, ein Molekül,
das zuvor als vorzugsweise auf Rattenthymocyten und dendritischen
Zellen exprimiert charakterisiert wurde). Die Überlegung, die hinter einer
weiteren Erforschung dieses Klons steht, ist in den Daten begründet, die
zeigen, dass eine Infusion dendritischer Zellen über die Pfortader eine wirksame
Methode für
eine Verlängerung
der Lebensdauer von Allotransplantaten in unseren Modellsystemen
ist. Es sollte jedoch beachtet werden, dass während die vom Knochenmark derivierten
dendritischen Zellen, die durch die Pfortader infusiert wurden,
selbst OX-2 exprimieren (siehe oben), identische Daten wie die in 3 gezeigten in Northem-Gelen erzielt wurden,
und zwar mithilfe von Geweben aus Mäusen, welche wie in den frühesten Studien
(1-5) bestrahlte Milzzellen (OX-2 durch FACS-Analyse) über die
Pfortader erhielten. Außerdem
war in beiden Situationen keine OX-2 mRNA durch diese Vorgehensweise
des suppressiven subtraktiven Hybridisierens nachweislich, wenn
das verwendete Gewebe nach 0,5-2,5 Tagen nach der Transplantation
geerntet wurde. Diese Ergebnisse stehen mit der Idee im Einklang,
dass das nachweisbare OX-2-Signal
ein Ergebnis von neuartig gesteigerter Expression in Zellen nach
der pv-Immunisierung
ist.
-
Sondierung einer cDNA-Bibliothek
im Gewebe pv-immunisierter Mäuse
nach Expression des murinen Äquivalents
von Ratten-OX-2
-
Eine
cDNA-Eibliothek wurde aus mRNA konstruiert, die aus einer Sammlung
von 5 C3H-Mäusen
präpariert
wurde, welche pv-Immunisierung mit 25 × 106 bestrahlten
(2000 Rads) C57BL/6 Knochenmarkszellen erhielten, gefolgt von einer
Nierentransplantation wie unter Materialien und Methoden beschrieben,
unter Verwendung eines bei C1onTech gekauften Kits. Die Klone wurden
in LB-Medium auf Platten verteilt und mit dem in 3 beschriebenen 32gP-markierten Amplicon sondiert, das Homologie
mit Ratte-OX-2 zeigt. Ein 1,3Kb-Klon wurde nachgewiesen, amplifiziert
und es wurde gezeigt, dass er nach 32P-Markierung
ein differentiell exprimiertes Produkt durch Northern-Gel-Analyse
nachwies. Nach der Sequenzierung mithilfe eines automatisierten
DNA-Sequenzers und Fluoreszenzmarkierten Deoxynukleotiden wurde
festgestellt, dass dieses 1,3Kb-Fragment >95% Homologie mit der die 3'-nicht-translatierte
Region der Ratte-OX-2-mRNA codierenden Region, wie sie durch die
GenBank-Sequenz für
Ratte-OX-2 bestimmt wurde, aufwies.
-
Unter
Verwendung eines Primer-Konstruktionsprogramms wurden ein 5'PCR-Primer, der die
Positionen 1-19 der Ratten-GenBank-Sequenz darstellt (die einer
Portion der 5'-nicht-translatierten
Region und der Führungssequenz
entsprach) und 3' Primer
unserer charakterisierten Maussequenz synthetisiert; dann wurde eine
Long-Distance-Amplifikation durchgeführt, um ein Amplicon zu produzieren,
das den offenen Leserahmen (ORF) des murinen Äquivalents des Ratten-OX-2-Gens
codieren sollte. Die Länge
dieses Amplicons wurde (wie erwartet) als ungefähr 1,4Kb bestimmt. Die automatisierte
Sequenzierung produzierte eine Sequenz voller Länge für den Maushomolog zum Ratte-MRC-OX-2-Gen,
einschließlich
eines ORF mit >90%
Homologie (vorhergesagte Aminosäuresequenz)
zum entsprechenden Rattenprodukt, zusammen mit der 3'-nicht-translatierten
Region. Diese Sequenz wurde bei der GenBank eingereicht (Zugangsnummer
AF004023).
-
Mithilfe
eines DNASIS-Programms wurde gezeigt, dass die vorhergesagte Maus-Proteinsequenz
ungefähr
51% Homologie mit B7-1 und B7-2, 48% mit CD28 und 54% mit CTLA4
aufweist (unveröffentlicht).
-
Belege dafür dass das
exprimierte OX-2-Homolog bei der verlängerten Lebensdauer eines Transplantats
nach pv-Immunisierung eine wichtige Rolle spielt
-
Um
die mögliche
Wichtigkeit des durch das OX-2-Gen codierten Produkts zu definieren,
verwendeten wir einen kommerziellen Antikörper zu Ratte-OX-2 in einem
Transplantat-Modell bei Mäusen,
die pv-Immunisierung und eine Nierentransplantation erhielten. In
der ersten dieser Studien wurde gefragt, ob es Belege für eine spezifisch
gesteigerte Expression des OX-2-Moleküls nach der pv-Immunisierung gäbe. Durch FACS-Analyse,
mithilfe einer doppelten Färbung
hepatischer mononuklearer Zellen und Milzzellen mit OX-2 und NLDC145,
wurde eine ähnlich
Anzahl von NLDC145+-Zellen in Leber- oder
Milzproben von iv- und pv-immunisierten Mäusen gefunden (jeweils 5 × 105 und 6,5 × 106),
doch eine vierfache Steigerung der Anzahl von OX-2+ NLDC145+ nach der pv-Immunisierung. 4 zeigt
ein Durchflusszytometrieprofil von an der Milz haftenden Zellen
iv-immunisierter/transplantierter Mäuse (Kästen A und B) oder pv- immunisierter/transplantierter Mäuse (Kästen C und
D). Zellen wurden 7 Tage nach der Transplantation geerntet und sowohl
mit NLDC145 und F(ab')2FITC-anti-Ratte-IgG, als auch mit Kontroll(Klon 107.3)-Maus-IgG1-Serum
(linke Kästen)
oder anti-OX-2 (rechte
Kästen)
und F(ab')2-PE-anti-Maus-IgG gefärbt. Die Daten repräsentieren
eine der drei verschiedenen Studien. Die gezeigten Werte stellen
die gesamte Zellpopulation in jedem Quadranten dar. Die absoluten
Zahlen (× 105) von doppelten, positiven Zellen in der
Leber oder der Milz pv-immunisierter Mäuse betrugen jeweils 3,2±0,5 und
39±8
(siehe 4 für FACS-Profile von an der Milz
haftenden Zellen). Diese vierfache Steigerung wurde unabhängig von
den für
die pv-Immunisierung verwendeten Zellen beobachtet, die entweder vom
Knochenmark derivierte dendritische Zellen (einige 20% OX-2+ – siehe
oben) oder bestrahlte, ganze, lymphoide Milzzellen (OX-2–)
waren, was darauf hindeutet, dass sie nicht nur die überlebenden
OX-2+ (Spender)-Zellen, sondern die neuartige
Expression von OX-2 in vivo erkannten.
-
Western-Blot, 5, zeigt die gesteigerte Expression des
OX-2-Antigens nach
der pv-Immunisierung. Die für
das ,Western-Blotting' verwendete
Technik wurde bereits beschrieben. Die Proben wurden unter Verwendung
der in 6 beschriebenen Gruppen 14
Tage nach der Nierentransplantation entnommen. Frische Ratten-Thymuszellen
(Bahn 5) wurden als Kontrolle verwendet. Bahnen 1 und 2 stellen
Proben dar, die aus 3 Spendern/Gruppe gesammelt wurden (jeweils
iv-immunisiert; pv-immunisiert + Infusion von anti-OX-2). Die Proben
in Bahnen 3 und 4 stammen von einzelnen Mäusen, die nur pv-Immunisierung
und eine Nierentransplantation erhielten (keine Antikörper-Behandlung).
In 5B wird die Färbung
mit anti-Ratte MRC-OX-2 gezeigt; und in 5A mit
einem Kontroll-Antikörper
(zu Maus Ly2.1), anti-Maus cD8a. Der verwendete entwickelnde Antikörper war
eine kommerzielle Meerrettich-Peroxidase, die mit anti-Maus-IgG
markiert war. Bei der Verwendung des Maus-IgG1-Isotop-Kontrollklons 107.3
wurde kein Signal beobachtet (BALB/c-anti-TNP) – Daten hier nicht gezeigt.
Die Daten sind repräsentativ
für 1 von
3 äquivalenten
Studien.
-
Das
Western-Blotting (siehe 5A und 5B)
von Proben, die aus der Milz von iv- gegen pv-immunisierten und
transplantierten Mäusen
14 Tage nach der Nierentransplantation präpariert wurden, wiesen Färbungen
einer wandernden Bande mit einem geschätzten Molekulargewicht von
43Kd auf, in Übereinstimmung
mit anderen Daten, die eine ausufernde Glykosylierung dieses Moleküls in isoliertem
Rattenthymus berichten. Bei Mäusen,
die eine pv-Immunisierung zusammen mit einer in vivo Behandlung
mit anti-OX-2 erhielten, war in den Western-Blots kein nachweisbares
Signal zu beobachten (siehe Bahn 2, 5).
Bei einer murinen IgG1-Isotop-Kontrolle (BALB/c anti-TNP, Klon 107.3:
unveröffentlicht)
konnte keine Färbung
gesehen werden, weshalb es unwahrscheinlich ist, dass die beobachtete
Bande ein Fc-Rezeptor war.
-
6 ist
ein Diagramm, das den Überlebensprozentsatz
der Anzahl von Tagen nach einer Nierentransplantation gegenüberstellt.
Kommerzieller anti-OX-2
monoklonaler Antikörper,
aber nicht anti-Maus CD28 oder anti-Maus CTLA4, macht die Verlängerung
der Lebenszeit von Transplantaten nach spenderspezifischer pv-Immunisierung
rückgängig. Gruppen
von 6 C3H-Mäusen
erhielten C57BL/6 Nierenallotransplantate ohne weitere Behandlung
(nur Cyclosporin A, -♢-), oder mit zusätzlicher pv-Immunisierung mit
15 × 10
6 C57BL/6 aus Knochenmark derivierten dendritischen
Zellen
wie
oben beschrieben. Subgruppen letzterer Mäuse erhielten iv-Injektionen
(jeden zweiten Tag × 4
Injektionen) mit 100mg/Maus eines kommerziellen anti-Ratte OX-2
monoklonalen Antikörpers
oder
der Isotop-Kontrolle
(Klon 107.3, -∇-)
oder von Antikörpern
zu Maus-CD28
oder
CTLA4 (-*-). Die Überlebensrate
bei Tieren der verschiedenen gezeigten Gruppen wurde aus 2 Studien
gesammelt. Es ist zu beachten, dass die Maus-Isotop-Kontrolle selbst
keine Modifikation der gesteigerten Nierentransplantatlebensdauer
nach pv-Immunisierung produzierte (*p<0,02, Mann-Whitney U-Test).
-
In
zwei letzten Studien erhielten die Mäuse pv-Immunisierung und Transplantation
wie zuvor, wurden dann jedoch zusätzlich mit kommerziellem anti-Ratte OX-2 iv-injiziert
(× 4 Injektionen;
100mg/Maus in 2-tägigen
Intervallen). Wie in 5A und B und 6 gezeigt,
verringerten diese Infusionen von anti-OX-2 die verlängerte Überlebenszeit
von Transplantaten wesentlich (6) und
steigerten die Expression des OX-2-Antigen (Western-Blotting, 5A und 5B),
wie sie nach der pv-Immunisierung beobachtet wurde. Eine Verwendung zusätzlicher
Behandlungen mit anti-CD28/anti-CTLA4 (siehe 6) oder,
in hier nicht gezeigten Studien, mithilfe von anti-B7-1 oder anti-B7-2,
verursachten keine Störung
der auf eine pv-Immunisierung folgenden Überlebenszeit eines Transplantats.
Die Infusion des IgG1-Isotop-Kontroll-Mab (Klon 107.3) veränderte die
gesteigerte Überlebenszeit
von Transplantaten nach pv-Immunisierung ebenfalls nicht (siehe 6).
-
In
getrennten Experimenten wurden Zellen von Mäusen geerntet, die pv-Immunisierung zusammen mit
einer zusätzlichen
Behandlung monoklonaler Antikörper
wie gezeigt erhielten (siehe Tabelle 2). Nach der Behandlung mit
anti-OX-2 war keine
veränderte
Zytokinproduktion (mit Polarisierung zur Produktion von IL-4 und
IL-10) mehr zu erkennen, wie sie der Erfinder in multiplen Modellsystemen
beschrieben hat, in denen Tiere vor der Transplantation pv-spenderspezifische
Immunisierungen erhielten. Eine Behandlung mit einem der vier anderen
getesteten monoklonalen Antikörper
produzierte keine solche Umkehrung der Polarisierung von Zytokinproduktion,
wie sie nach der pv-Immunisierung zu beobachten ist; in der Tat
wurde sichtbar, dass eine Verwendung dieser Mabs ohne pv-Immunisierung
einen Trend zu gesteigerter Überlebenszeit
von Transplantaten (nicht gezeigt) und einer bedeutenden Polarisierung
der Zytokinproduktion hin zur gesteigerten IL-4- und IL-10-Produktion produzierte,
der dem durch die pv-Immunisierung selbst produzierten ähnlich ist
(obere Hälfte von
Tabelle 2).
-
OX-2
ist ein Molekül,
das bereits von Barclay et al (1981, 1982) als vorzugsweise auf
Rattenthymocyten und dendritischen Zellen exprimiert beschrieben
wurde. Dendritische Zellen sind für ihre Bedeutung als Signalzellen
für Lymphozyten
bekannt und können
potentiell die Zytokinproduktion und Transplantatabstoßung regulieren,
weshalb eine Infusion dendritischer Zellen ein wirksames Mittel
zur Induktion von pv-Toleranz ist. Der Erfinder hat bestimmt, dass
die OX-2-Expression nach der pv-Immunisierung gesteigert wird und
hat außerdem
untersucht, ob dies irgendwelche funktionalen Folgen haben könnte. Wie
in 4 und 5 gezeigt,
gibt es tatsächlich
eine wesentlich gesteigerte Expression von OX-2 in Milzzellen, die
aus pv-immunisierten Mäusen
isoliert wurden, zusammen mit einer gesteigerten Überlebenszeit
von Transplantaten und einer Polarisierung der Zytokinproduktion
(6 und Tabelle 2). Im Gegensatz dazu zerstört eine
in vavo Infusion von anti-OX-2 die gesteigerte Expression dieses
Moleküls
und macht gleichzeitig die beobachtete gesteigerte Überlebensdauer
von Transplantaten und das veränderte
Zytokinprofil rückgängig. Diese
Daten stehen mit der möglichen
Funktion von OX-2+ Zellen bei der Förderung
der Überlebenszeit
von Transplantaten im Einklang.
-
In
den beschriebenen Studien waren die dendritischen Spenderzellen,
die durch die Pfortader per Infusion verabreicht wurden selbst OX-2+ (siehe oben, Beschreibung von Materialien
und Methoden). Dennoch wurden in Studien, bei denen wir bestrahlte
ganze Milzzellen (OX-2– durch FACS) für die pv-Infusion
verwendeten, mithilfe von FACS-Analysen (4)
und Western-Blots (5) und durch eine
suppressive, subtraktive Hybridisierung (3)
identische Daten gesammelt. Dies steht mit dem Mangel an Belegen
für eine
gesteigerte mRNA-Expression von OX-2 früh (1-2 Tage) nach einer Transplantation,
wie oben bemerkt, im Einklang. Deshalb erscheint es am Wahrscheinlichsten,
das ein operational wichtiges „OX-2-Signal", das in der Milz
von pv-immunisierten Mäusen
nachgewiesen wird, aus neuer Expression deriviert werden kann, und
nicht unbedingt von per Infusion verabreichten OX-2+-Zellen.
Ohne einen polymorphen Marker für
OX-2 kann jedoch nicht bestimmt werden, ob die gesteigerte Expression
von Spender- oder Wirtszellen (oder beiden) stammt. Es mag überraschend
erscheinen, dass zwischen dem murinen Antikörper zum Ratte-OX-2 und dem
murinen OX-2 eine Kreuzreaktion auf die gezeigte Art und Weise stattfindet.
Eine definitive Analyse der an vivo-Rolle von OX-2 muss wie oben
weiter untersucht werden, und zwar mit Antikörpern, die gegen das murine
OX-2-Homolog entwickelt wurden – diese
Experimente sind zur Zeit im Gange. Außerdem sollte darauf hingewiesen werden,
dass obwohl eine pv-Immunisierung nur zu einer vierfachen Veränderung
der absoluten Anzahl von nachweisbaren OX-2+ NLDC+-Zellen in der Milz/Leber führte (siehe
Text und 4), trotzdem ein klarer Unterschied
bei den OX-2-Signalen
in Northern-Gelen unter Verwendung von RNA aus pv- gegen iv-immunisierten Mäusen (3), zusammen mit Belegen für eine Rolle
dieser quantitativen Differenz für
die letztendliche Überlebenszeit
von Transplantaten (6) nachgewiesen wurde. Es ist
anzunehmen, dass diese Ergebnisse jeweils die begrenzte Empfindlichkeit
des verwendeten Northern-Assay und eine Funktion der Quantifizierung von „Kostimulation", die nach der OX-2:OX-2-Ligand-Interaktion stattfindet,
reflektieren.
-
Obwohl
eine ungefähr
bei 50% liegende Homologie der vorhergesagten Proteinsequenz des
murinen OX-2 mit murinen B7-1, B7-2, CD28 und CTLA4 (Borriello et
al, 1997) bestand, machten die Antikörper zu diesen letzteren Molekülen die
verlängerte Überlebenszeit
von Transplantaten und die veränderte
Zytokinproduktion nach der pv-Immunisierung nicht rückgängig (6,
Tabelle 2 – siehe
auch (Castle et al, 1993)). Diese Antikörper, die ohne pv-Immunisierung per
Infusion verabreicht wurden, produzierten im Gegenteil selbst einige
der Änderungen
bei der Zytokinproduktion, die durch pv-Immunisierung induziert
wird (Tabelle 2).
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BEISPIEL 2
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Murines OX-2
-
Dieses
Beispiel beschreibt die Klonierung und Sequenzierung von murinem
MRC OX-2.
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Mithilfe
eines Cap Finder PCR cDNA library construction kit (Clontech) wurde
eine cDNA-Bibliothek aus MLN-Zellen konstruiert, die aus erwachsenen
C3H-Mäusen
deriviert wurden, welche 5 Tage zuvor mit 10 × 106 allogenen
B10.BR, aus Knochenmark derivierten, dendritischen, allogenen Zellen über den
portalvenösen
(pv) Weg immunisiert worden waren. Der Erfinder hatte zuvor, mithilfe
eines PCR-Select cDNA subtraction hybridazation kit (Clontech) und
RNAs, die aus gesammelten MLN von über den pv-Weg oder über die
laterale Schwanzvene (iv) immunisierten Mäusen ein 350bp-Amplicon isoliert,
das über
98% Homologie mit der 3' nicht-translatierten
Region von Ratte-MRC-OX-2 cDNA aufwies. Durch Northem-Blot-Analyse
konnte bestätigt werden,
dass dieses Amplicon ein differentiell exprimiertes Produkt in RNAs
nachwies, die aus iv- bzw. pv-immunisierten
Mäusen
präpariert
wurden. Dieses Amplicon wurde verwendet, um 5 × 105 Klone der amplifizierten
Bibliothek zu überprüfen. Die
Sequenzen der cDNA- Klone
wurden mithilfe eines Applied Biosystems 377 Automated Sequencer,
unter Verwendung der Dye Terminator Cycle Sequencing Method (Applied
Biosystems, Foster City, CA) festgelegt. Die Nukleotidsequenz, von
der in dieser Veröffentlichung
berichtet wurde, ist bei der GenBank/EMBL-Datenbank unter der Zugangsnummer
AF004023 eingereicht worden.
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Die
in 7 gezeigte cDNA weist einen offenen Leserahmen
von 837 Basenpaaren und eine abgeleitete Aminosäuresequenz (8)
von 248 Aminosäuren
auf, von denen 30 eine gespaltene Leader-Sequenz darstellen. Das
vorhergesagte Molekulargewicht dieser und der äquivalenten Moleküle in Ratten
und Menschen beträgt
ungefähr
25kDa. Das gemessene Molekulargewicht in Rattenthymocyten, in denen
das Molekül
stark glykosyliert ist, beträgt
47kDa.
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Das
murine MRC OX-2 zeigt insgesamt jeweils ungefähr 92% und 77% Homologie auf
dem Aminosäureniveau
mit äquivalenten
Molekülen
bei jeweils Ratten oder Menschen. Wie beim Rattenmolekül bereits bemerkt,
stellt die Sequenz von 203-229 wahrscheinlich eine membranspannende
Domäne
dar (stark hydrophobe Region), während
die Region zwischen 229-248 wahrscheinlich die intrazytoplasmatische
Region ist, mit einer Strecke stark basischer Rückstände direkt vom C-Terminal bis
zur Position 229. Die Homologie in den kombinierten Transmembranen
und C-Terminal-Regionen bei Ratte und Mensch zeigt jeweils ungefähr 98% und
85% Ähnlichkeit.
Wie aufgrund der Mitgliedschaft in der Ig-Supergenfamilie vorhergesagt, gibt es
eine Anzahl von konservierten Cys-Rückständen, die
zwischen β-Strängen Ig-ähnlicher
Domänen
Disulphid-Bindungen formen (jeweils 21 und 91; 130 und 184); zuvor
war erkannt worden, dass Rückstand
91 unter den Mitgliedern der Immunglobulin-Superfamilie am stärksten konserviert
war. Homologie zwischen der N-Terminal Ig-Domäne bei Ratte und Mensch, gegenüber der
nächsten
Ig-Domäne,
liegt jeweils bei 88% und 82% oder 97% und 73%. Diese relative Konzentration
von Variabilität
zwischen Ratte und Maus in der V-Terminal Ig-Domäne wird verständlicher,
wenn die Ligandenspezifität
für die
Moleküle
in diesen Spezies erklärt
wird. Es ist zu beachten, dass die angenommene extrazelluläre Portion
des Moleküls
(1-202) eine Anzahl von Stellen für N-Glykosylierung enthält, die über Spezies hinweg konserviert
werden (44, 65, 73, 80, 94, 121, 130 und 151). Dasselbe wurde bereits
von der cDNA-Sequenz bei Ratten berichtet und von der gemessenen
Größe des exprimierten
Materials in Rattenthymocyten gefolgert.
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Die
intrazytoplasmatische Region der Moleküle weist weder eine Sequenzidentität mit bekannten
signalisierenden Kinasen auf, noch die gut beschriebene Konsens-Sequenz
für das
so genannte Immunoreceptor tyrosine activation motif (ITAM: DXXYXXLXXXXYDXL).
Außerdem
fehlen ihr typische SH2- oder SH3-Domänen, die als „Andockstelle" für Adapter-Moleküle dienen
könnten,
welche dann wiederum andere Proteinkinasen in einer Aktivierungskaskade
hinzuwählen
könnten.
Folglich stellt die Ligand-bindende Aktivität der extrazellulären Domänen vermutlich
die biologisch wichtige Region des Moleküls dar. Einige mögliche Funktionen, die
Ligand-Interaktionen mit OX-2 zuzuschreiben sind, können aus
anderen Daten in der Literatur gefolgert werden. Ng-CAM, ein homologes
Molekül,
soll eine Proteintyrosinphosphatase über N-gebundene Oligosaccharid-Rückstände binden,
und Proteintyrosinphosphatasen sind bekannt dafür, bei der Regulierung von
Immunantworten eine Schlüsselrolle
zu spielen. Kürzlich
wurde außerdem
gezeigt, dass ALCAM, ein weiteres Adhäsionsmolekül und Mitglied der Ig-Superfamilie,
dessen Gen sich beim Menschen in der Nähe des Gens von OX-2 auf Chromosom
3 befindet, CD6 bindet (ein Mitglied der scavenger receptor cystein
rich family, SRCR), wobei Antikörper
zu CD6 selbst eine Rolle bei der Regulierung der Immunfunktion spielen
könnten.
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BEISPIEL 3
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OX-2-positive Zellen hemmen
die Typ-1 Zytokinproduktion
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Der
Erfinder hat gezeigt, dass hepatische mononukleare, nicht-parenchymale
Zellen (NPC) die bei der Inkubation von allogenen C57BL/6 dendritischen
Zellen (DC) mit C3H Milzresponderzellen zu beobachtende Immunantwort
hemmen können.
Aus diesen Kulturen derivierte Zellen übertragen eine gesteigerte Überlebenszeit
von C57BL/6 Nierenallotransplantaten bei C3H-Mäusen. Der Erfinder fand außerdem heraus,
dass eine gesteigerte Expression von OX-2 auf dendritischen Zellen
mit einer Hemmung der Zytokinproduktion und Abstoßung von Nierenallotransplantaten
verbunden ist. Der Erfinder erforschte außerdem, ob die Hemmung durch
hepatische NPC eine Funktion von OX-2-Expression durch diese Zellen
sein könnte.
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Frische
aus der Milz derivierte C57BL/6 DC wurden mit C3H Milzresponderzellen
und anderen vermeintlich ko-regulierenden Zellen kultiviert. Die
letzteren wurden aus frischen C3H oder C57BL/6 Leber-NPC oder aus
C3H oder C57BL/6 Mäusen
deriviert, welche 10 Tage lang mit intravenösen Infusionen menschlicher Flt3
Liganden (Flt3L) behandelt worden waren. Verschiedene Populationen
muriner, aus Knochenmark derivierter dendritischer Zellen aus Kulturen
von Knochenmark mit (IL-4+GM-CSF) wurden ebenfalls als Quelle vermeintlich
regulierender Zellen verwendet. Überschüssige Flüssigkeiten
aller stimulierten Kulturen wurden auf ihre funktionale Expression
verschiedener Zytokine hin untersucht (IL-2, IL-4, IFNγ, TGFβ). Es wurde
festgestellt, dass frische C57BL/6 Milz-DC die Produktion von IL-2
und nicht die von IL-4 induzierten. Zellen aus den erwähnten Quellen
hemmten die IL-2 und IFNγ-Produktion
und förderten
die IL-4 und TGFß-Produktion. Die
Hemmung war mit einer gesteigerten Expression von OX-2 auf diesen
Zellen verbunden, wie sie durch semi-quantitative PCR und FACS-Analyse definiert
wurde. Bei der Größen-Fraktionierung
waren die Zellen, die OX-2 exprimierten, eine Subpopulation von
NLDC 145+-Zellen. Diese Daten weisen darauf hin, dass die OX-2 exprimierenden
Zellen bei der Induktionsregulierung von Zytokinproduktion durch
konventionelle, allostimulierende DC eine Rolle spielen.
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MATERIALIEN UND METHODEN
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Mäuse: Männliche
und weibliche C3H/HEJ und B10.BR (H-2k/k),
B10.D2 (H-2d/d) und C57BL/6 (H-2b/b) Mäuse
wurden bei den Jackson Laboratorien, Bar Harbour, in Maine gekauft.
Die Mäuse
wurden zu fünft
in Käfigen
untergebracht und ad libitum mit Futter und Wasser versorgt. Alle
Mäuse wurden
im Alter von 8-12 Wochen verwendet.
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Monoklonale
Antikörper:
Die folgenden monoklonalen Antikörper
(Mabs), die, soweit nicht anders erwähnt, alle von Pharmingen (San
Diego, CA, USA) stammen, wurden verwendet: anti-IL-2 (JES6-1A12;
biotinyliert, JES6-5H4); anti-IL-4 (11B11; ATCC; biotinyliert, BVD6-24G2);
anti-IFNγ (R4-6A2,
ATCC; biotinylierte XMG1.2); anti-IL-10 (JESS-2A5; biotinyliert,
SXC-1); PE anti-B7-1/B7-2 (Cedarlane Labs, Hornby, Ontario, Kanada).
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Immuno-Precise
Antibodies Ltd. (Victoria, BC, Kanada) präparierte anti-Maus OX-2 monoklonale
Antikörper
mit Ratten, nachdem diese mit einem rohen Membranextrakt LPS-stimulierter
muriner DC immunisiert worden waren, worauf eine Fusion einer nicht
sezernierenden Ratten-Myelom-Elternzelllinie folgte (YB2/3HI.P2.G11.16Ag.20). Überschüssige Flüssigkeiten
von Hybridoma wurden in ELISA unter Verwendung von mit einer 40-45Kd-Präparation
aus DC-Extrakten auf Western-Gelen vorbeschichteten Platten überprüft (Barclay,
A.N. 1981. Immunology 44:727; Barclay, A.N. und H.A. Ward. 1982.
Eur. J. Biochem. 129:447). Positive Klone wurden mithilfe von FACS-Analysen
von CHO-Zellen, die mit einem cDNA-Klon transduziert worden waren, der
das murine OX-2 in voller Länge
codierte, erneut überprüft (Chen,
Z., H. Zeng und R.M. Gorczynski. 1997. BBA. Mol. Basis Dis. 1362:6-10).
FITC-konjugiertes F(ab')2
Kaninchen anti-Ratte IgG (nicht kreuzreaktiv mit Maus IgG) von Serotec,
Kanada wurde als zweiter Antikörper
verwendet. Der für
weitere Analysen ausgewählte
Mab (M3B5) wurde in einem CELLMAX System (Cellco. Inc., Germantown,
MD) in großen Mengen
gezüchtet.
Eine rohe Präparation
von Ratten-Immunglobulin (30% gesättigte Ammoniumsulfat-Präparation)
wurde als ein Kontroll-Ig verwendet.
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In
Gewebekultur-Assays, bei denen anti-Zytokin-Mabs verwendet wurden,
um die Spezifität
des Assays zu bestätigen,
wurde festgestellt, dass 10μg/ml
der relevanten Mabs ausreichten, um bis zu 50ng/ml des getesteten
Zytokins zu neutralisieren.
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NLDC145
(anti-Maus DC) wurden ebenfalls bei Serotec erstanden. Das rekombinante
Maus IL-4 wurde freundlicherweise von Dr. L. Yang (The Toronto Hospital)
zur Verfügung
gestellt; Maus-rGM-CSF wurde bei Pharmingen gekauft. Das rekombinante
menschliche Flt3L (aus CHO-Zellen deriviert) wurde freundlicherweise
von Dr. A. B. Troutt, Immunex Corp., Seattle, Washington, USA zur
Verfügung
gestellt.
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Nierentransplantation
-
Die
Nierentransplantation ging im Wesentlichen so wie auch anderswo
beschrieben vonstatten (Gorczynski, R.M. et al, 1994a. Transplantation
58:816-820). Die Tiere wurden mit einer Kombination aus Halothan und
Distickstoffmonoxid, unter Verwendung von Novogesic für die postoperative
Analgesie anästhesiert.
Eine orthotopische Nierentransplantation wurde mithilfe der routinemäßigen Prozeduren
durchgeführt.
Kurz gesagt, die Spendertiere erhielten 200 Einheiten Heparin und
die Nieren wurden vor der Entfernung und Transplantation in die
Empfängertiere
mit linker Nephrektomie mit 2ml eiskalter heparinisierter, physiologischer
Salzlösung gespült. Die
Nierenarterie des Transplantats wurde an der abdominalen Aorta des
Empfängers
anastomosiert und die Nierenarterie wurde an der unteren Hohlvene
des Empfängers
anastomosiert. Der Ureter wurde unter Verwendung eines kleinen Blasenausschnitts
des Spenders in die Blase des Empfängers genäht. Alle Empfänger erhielten
im-Injektionen mit Cefotetan (30mg/Kg) am Tag der Transplantation
und an den 2 darauf folgenden Tagen. Die verbleibende Wirtsniere
wurde, wo nicht anders bestimmt, 2 Tage nach der Transplantation entfernt.
Die Behandlung der Empfänger
mit pv-Immunisierung durch monoklonale Antikörper oder durch orale Immunisierung
lief wie in den einzelnen Studien beschrieben ab.
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Immunisierung über Pfortader
oder oralen Weg
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Die
Immunisierung über
die Pfortader oder den oralen Weg wurde wie oben beschrieben durchgeführt (Gorczynski,
R.M. 1995a. Cell. Immunol. 160:224-231; Gorczynski, R.M. et al,
Transplantation 62:1592-1600). Alle Tiere wurden mit Nembutal anästhesiert.
Der abdominale Einschnitt verlief entlang der Mittellinie und die Eingeweide
wurden offengelegt. Zellen wurden in 0,1 ml durch eine obere Mesenterialvene
mithilfe einer Nadel Stärke
30 injiziert. Nach der Injektion wurde die Nadel schnell herausgezogen,
um eine Hämostase
ohne Bildung von Hämatomen
sicherzustellen, indem durch einen 2mm 3 Gelschaum leichter Druck
ausgeübt
wurde.
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Aus
Knochenmark derivierte dendritische Zellen (DZ) für die pv-Immunisierung wurden
durch eine Kultur von T-depletierten Knochenmarkszellen an vitro
mit rIL-4 und rGM-CSF erzielt (Gorczynski, R.M. et al. Transplantation
62:1592-1600). Die Färbung
mit NLDC145 und FITC anti-Ratte IgG oder mit FITC anti-CD3 bestätigt >95% NLDC145+ und <5% CD3+ Zellen am
10 Tag nach Beginn der Kultur (Gorczynski, R.M. et al. Transplantation
62:1592-1600). Diese Zellen wurden gewaschen und dann in Mäuse injiziert
oder für
gemischte Leukozyten-Kulturen
verwendet.
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Präparation von Zellen:
-
Suspensionen
von Milz- und Knochenmarkszellen (Gorczynski, R.M. et al. Transplantation 62:1592-1600)
wurden von einzelnen Mäusen
ausgehend für
jedes Experiment aseptisch präpariert.
Hepatische, mononukleare nicht-parenchymale Zellen (NPC) wurden
im Wesentlichen wie anderswo beschrieben isoliert (Gorczynski, R.M.
1994b. Immunology 81:27-35). Das Gewebe wurde zuerst bei 37°C 45 Minuten
lang mit einer Mischung aus Collagenase/Dispase verdaut und dann über Maus-Lymphopaque
(Cedarlane Labs) getrennt (15 Minuten bei Raumtemperatur und 17.000rpm).
Mononukleare Zellen wurden in α-Minimal
Essential Medium, das mit 2-Mercaptoethanol und 10% fötalem Kalbsserum
(aF10) ergänzt
wurde, resuspendiert. Wenn die Zellen aus mit Flt3L injizierten
Mäusen
stammten, wurden die Tiere täglich
10 Tage lang per iv-Injektion mit 10mg/Maus-Flt3L behandelt. Nach der Enzymverdauung
war die Erholung von Leber/Milzzellen bei diesen Mäusen im
Vergleich zu mit Salzlösung
injizierten Kontrollen wesentlich gesteigert (jeweils 120 × 106, 390 × 106 gegen 7 × 106 und
120 × 106).
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Zytotoxizität und Zytokin-Assays:
-
Um
die Induktion von Zytotoxizität
oder Zytokinproduktion zu bewerten, wurden Kulturen verwendet, in
denen Responderzellen mit bestrahlten (2000R) Stimulatorzellen dreifach
in αF10
stimuliert wurden. Überschüssige Flüssigkeiten
wurden aus replikativen Wells nach 40 Stunden für Zytokin-Assays gesammelt
(siehe unten). Es konnten keine reproduzierbaren Unterschiede der
Zytokin-Niveaus in Kulturen nachgewiesen werden, die zwischen 36
und 54 Std. Stimulation getestet wurden. In einigen Experimenten
erhielten die Kulturen 1 μCi/Well
(nach 72 Std.) 3HTdR die Proliferation wurde
bewertet, indem Zellen 14 Stunden später geerntet und in einem Well-artigen β-Zähler gezählt wurden.
-
Dort,
wo die Zytotoxizität
gemessen werden sollte, wurden Zellen aus äquivalenten Kulturen nach 5 Tagen
geerntet und gesammelt, gezählt
und dann mit verschiedenem Effektor: Ziel-Verhältnis mit 51CrEL4 (H2b/b) oder P815 (H2d/d)
Tumorzielzellen rekultiviert. Überschüssige Flüssigkeiten
wurden nach 4 Std. für
eine Bewertung spezifischer Zytotoxizität entnommen.
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Die
Aktivität
von IL-2 und Il-4 wurde per Bioassay getestet, unter Verwendung
der IL-2/IL-4-abhängigen
Zelllinien, also jeweils CTLL-2 und CT4.S. Rekombinante Zytokine
für eine
Standardisierung der Assays wurden bei Genzyme gekauft (Cambridge,
MA). IL-2-Assays wurden in Präsenz
von 11B11 durchgeführt,
um eine potentielle Stimulation von CTLL-2 mit IL-4 zu blockieren;
IL-4-Assays wurden in Präsenz
von S4B6 durchgeführt,
um eine IL-2-vermittelte Stimulation zu blockieren. Sowohl der IL-2-
als auch der IL-4-Assay konnten 50pg des den Kulturen zugegebenen
rekombinanten Lymphokin reproduzierbar nachweisen.
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Zusätzlich wurden
IL-2, IL-4, IFNγ und
IL-10 mithilfe von ELISA-Assays getestet. Für IFNγ verwendete der Assay mit 100ng/ml
R4-6A2 beschichtete Nunc-Platten
mit flachem Boden (Gibco, BRL). Unterschiedliche Verdünnungen
der überschüssigen Flüssigkeiten
wurden dreifach bei 4°C
gebunden, × 3
gewaschen und mit biotinyliertem anti-IFNγ (XMG1.2) versetzt. Nach dem
Waschen wurden die Platten mit Streptavidin-Meerrettich-Peroxidase
(Cedarlane Labs, Hornby, Ontario) inkubiert, mit einem geeigneten
Substrat entwickelt und OD405 wurde mithilfe
eines ELISA-Plattenlesers bestimmt. Das rekombinante IFNγ für die Standardisierung stammte
von Pharmingen. IL-10 wurde ähnlich
mit ELISA getestet, wobei JES5-2A5 als Capture-Antikörper und
biotinylierter SXC-1 als entwickelnder Antikörper verwendet wurden. Der
rIL-10 für
die Standardisierung stammte von Pepro Tech Inc. (Rocky Hill, NJ).
Jeder Assay wies 0,1ng/ml Zytokin nach. ELISA-Assays für IL-2 und
IL-4 verwendeten JES6-1A12 und 11B11 als Capture-Antikörper, mit
JAS6-5H4 oder BVD6-24G2 als entwickelnde Antikörper. Die Detektionsempfindlichkeit
betrug 20pg/ml für
jedes Zytokin. Dort, wo die Korrelation zwischen Bioassay und ELISA
für IL-2
oder IL-4 kontrolliert wurde, war diese hervorragend (r>0,90). In den unten
beschriebenen Studien stammen die gezeigten Daten einzig und allein
aus ELISA-Assays. Dort, wo Zytokindaten aus mehreren Studien gesammelt
wurden (z. B. 14, 16, 17),
wurden die absoluten Werte der Zytokinproduktion wie oben erhalten,
und zwar unter Verwendung kommerzieller rekombinanter Zytokine,
um die Assays zu standardisieren. Wir stellten fest, dass überschüssige Flüssigkeiten
von C3H-anti-C57BL/6-Kulturen unter den beschriebenen Bedingungen
reproduzierbar jeweils 950±200
und 80±25
pg/ml IL-2 und IL-4 enthielten.
-
Präparation von RNA:
-
Verschiedene
Quellen von Gewebe, das aus weiblichen, nierentransplantierten Mäusen, die
DC erhielten, und aus Nierenallotransplantaten männlicher Mäuse stammten, wurden für die RNA-Extraktion
wie anderswo beschrieben geerntet (Gorczynski, R.M. 1995a Cell.
Immunol. 160:224-231). Die OD280/260 jeder Probe wurde gemessen,
wonach eine reverse Transkription mithilfe von Oligo-(dT)-Primern
(27-7858: Pharmacia, USA) durchgeführt wurde. Die cDNA wurde auf
ein Gesamtvolumen von 100ml mit Wasser verdünnt und bei –70°C gefroren,
bis sie in PCR-Reaktionen mit Primern für murine GAPDH, B7-1, B7-2
oder OX-2 verwendet wurde. Die Sense (S) und Antisense (AS) Primer
wurden vom Biotechnology Service Centre, Hospital for Sick Children,
Toronto, unter Verwendung veröffentlichter
Sequenzen synthetisiert. 5'-Primer
wurden für PCR
mit 32P endmarkiert und wiesen vergleichbare
Niveaus spezifischer Aktivität
nach der Reinigung durch Ethanol-Fällung auf. 5ml cDNA wurden über 35 Zyklen
per PCR amplifiziert, woraufhin die Proben in 12,5% Polyacrylamid-Gelen
analysiert und dann übernacht
(18 Std.) Autoradiographien ausgesetzt wurden. In Kontrollstudien,
unter Verwendung von H-Y-Primer-Gruppen, hat sich diese Technik
als zuverlässig
erwiesen, wenn es um den Nachweis von H-Y-mRNA in Extrakten weiblicher
Milzzellen ging, denen männliche
Zellen in einer Konzentration von 1:105 zugesetzt worden waren (Gorczynski,
R. M. 1995a. Cell. Immunol. 160:224-231; Gorczynski, R.M. et al.
Transplantation 62:1592-1600). Für
einen quantitativen Vergleich der Expression verschiedener PCR-Produkte
wurden die Autoradiogramme densitometrisch gescannt.
GAPDH-Sense:
5'TGATGACATCAAGAAGGTGGTGAAG3'
GAPDH-Antisense:
5'TCCTTGGAGGCCATGTAGGCCAT3'
B7-1-Sense:
5'CCTTGCCGTTACAACTCTCC3'
B7-1-Antisense:
5'CGGAAGCAAAGCAGGTAAT3'
B7-2-Sense:
5'TCTCAGATGCTGTTTCCGTG3'
B7-2-Antisense:
5'GGTTCACTGAAGTTGGCGAT3'
OX-2-Sense:
5'GTGGAAGTGGTGACCCAGGA3'
OX-2-Antisense:
5'ATAGAGAGTAAGGCAAGCTG3'
-
Statistische Analyse:
-
In
Studien mit multiplen Gruppen wurde zum Vergleich der Bedeutsamkeit
ANOVA durchgeführt.
In einigen Fällen
(wie durch individuelle Umstände
definiert) wurde danach auch noch ein paarweiser Vergleich zwischen
Gruppen durchgeführt.
-
ERGEBNISSE:
-
Antigenstimulation, im
Präsenz
hepatischer NPC, induziert die Entwicklung einer Zellpopulation,
die fähig
ist, die Proliferation und IL-2-Produktion beim adoptiven Transfer
zu hemmen:
-
In
einem älteren
Manuskript (Gorczynski, R.M et al, Transplantation. 66:000-008)
wurde berichtet, dass in Präsenz
syngener NPC und allogener (C57BL/6)-DC stimulierte C3H-Milzzellen
eine Zellpopulation produzierten, die fähig war, die Erzeugung von
IL-2 von frischen, mit C57BL/6-DC stimulierten Milzzellen zu hemmen
und fähig
war, die Abstoßung
von C57BL/6-Nierenallotransplantaten
in vivo zu hemmen. Um eine Antwort auf die Frage zu finden, ob diese
Funktion von NPC MHC-abhängig
war oder nicht, wurde die folgende Studie durchgeführt.
-
C57BL/6
(H2b/b) Milzzellen wurden an vitro mit B10.BR
(H2k/k), aus Knochenmark derivierten DC
stimuliert, in Präsenz/Abwesenheit
der folgenden NPC: C57BL/6; B10.BR; B10.D2 (H2d/d).
Außerdem
wurden Kontrollkulturen nur mit den NPC inkubiert. Die Proliferation
und IL-2-/IL-4-Produktion wurde in einem Aliquot dieser primären Kulturen
gemessen. Außerdem
wurden nach 5 Tagen Zellen aus einer anderen Gruppe der primären Kulturen
geerntet, gewaschen und 2 × 105 Zellen zu Kulturen gegeben, die 5 × 106 frische C57BL/6-Milzzellen und B10.BR-DC
enthielten. Die Proliferation und Zytokinproduktion wurde in diesen
letzteren Kulturen auf die übliche
Art und Weise gemessen. In den Kästen
A) und B) von 9 werden gesammelte Daten aus
drei äquivalenten
Studien gezeigt.
-
9 ist
ein Säulendiagramm,
das die Regulierung der Proliferation und Zytokinproduktion nach
der Stimulation durch allogene DC unter Verwendung hepatischer NPC
gemäß den hierin
beschriebenen Methoden zeigt. Die Kulturen im Kasten A) wurden nur
mit 5 × 106 C57BL/6-Milzresponderzellen (Gruppe 1)
oder mit 2 × 105 B10.BR-DC (Gruppe 2) initiiert. Weitere
Gruppen (jeweils 3-5 und 6-8) enthielten C57BL/6-Responderzellen
und 2 × 105 NPC von jeweils entweder C57BL/6, B10.D2
oder B10.BR (3-5) oder dieselben NPC und B10.BR-DC (6-8). Daten
zeigen eine mittlere Proliferation und Zytokinproduktion aus dreifachen
Kulturen in drei getrennten Studien. In Kasten B) zeigen die Daten
die Proliferation und Zytokinproduktion aus Kulturen von 5 × 106 C57BL/6-Respondermilzzellen, die dreifach
mit 2 × 105 B10.BR-DC allein stimuliert wurden oder mit
der Zugabe von 2 × 105-Zellen, die aus den im oberen Kasten gezeigten
Kulturen geerntet wurden. Die Daten stellen auch hier das arithmetische
Mittel von 3 getrennten Experimenten dar. *p<0,05 im Vergleich zu Kontrollkulturen
(ganz links in jedem Kasten).
-
Verschiedene
Punkte sind hier von Interesse. Wie zuvor dokumentiert, führte die
Zugabe von NPC, die mit Milzresponderzellen (in diesem Fall C57BL/6)
syngen waren, zu mit allogenen (B10.BR)-DC stimulierten Zellen zu
einer verringerten Proliferation und IL-2-Produktion dieser Responderzellen
verglichen mit Zellen, die nur mit DC stimuliert worden waren (man
vergleiche Gruppen 6 und 2 des oberen Kastens in 9,
Kasten A). Im Gegensatz dazu war die IL-4-Produktion verstärkt worden.
NPC allein, ob syngen oder allogen zu den Responderzellen, produzierte
keine offensichtliche Wirkung (Gruppen 3-5, Kasten A) von 9).
Außerdem waren
Zellen aus primären
Kulturen, die die DC+NPC-Mischung erhielten, in der Lage, die Proliferation
und IL-2-Produktion aus frischen Milzzellen, die in sekundären Kulturen
mit denselben (B10.BR)-DC (siehe Kasten B) in 9)
stimuliert wurden, zu hemmen (und gleichzeitig die IL-4-Produktion
zu fördern).
Die in dieser Abbildung gezeigten Daten machen jedoch auch etwas
anderes deutlich. Es wurde dieselbe Hemmung von Proliferation/IL-2-Produktion
in primären
Kulturen festgestellt, die entweder mithilfe von B10.BR-NPC (MHC
abgestimmt auf die DC-Stimulusgruppe 8, Kasten A) oder mit dritten
B10.D2-NPC (MHC weder abgestimmt auf Milzresponderzellen noch auf
allogene Stimulator-DC-Gruppe
7, Kasten A) von 9). Erneut wurde in Kulturen,
die nur mit B10.BR oder B10.D2 NPC (Gruppen 4 und 5) stimuliert
wurden, keine offensichtliche Wirkung festgestellt. Zuletzt wurde
gezeigt, dass aus primären
Kulturen entnommene Zellen, die mit DC und NPC aus entweder B10.BR
oder B10.D2 stimuliert wurden, ebenfalls die Proliferation/IL-2-Produktion
aus sekundären C57BL/6-Milzzellkulturen,
die mit B10.BR-DC stimuliert wurden, hemmen könnten. Erneut wurde deutlich, dass
Zellen aus primären
Kulturen mit nur NPC keine solche Hemmung produzierten (siehe Kasten
B) in 9). Folglich sind weder die
in primären
Kulturen gesehene Hemmung von Proliferation/IL-2-Produktion und Verstärkung der IL-4-Produktion noch
die in sekundären
Kulturen gemessene Induktion von Unterdrückung, allesamt NPC-induziert,
MHC-abhängig.
-
Spezifität der durch
hepatische NPC induzierten Hemmung/Unterdrückung:
-
Eine
Auslegung der in 9 und anderswo gezeigten Daten
ist die, dass NPC ein Signal an DC-stimulierte Zellen abliefern,
das vom durch die DC selbst bereitgestellten Antigen-Signal unabhängig ist
(und nicht MHC-abhängig
ist). Dieses Signal moduliert das durch die DC bereitgestellte antigenspezifische
Signal. Um die Antigen-Spezifität
der in 9 beschriebenen Immunregulierung
bewerten zu können,
wurde das folgende Experiment durchgeführt.
-
C57BL/6-Milzresponderzellen
wurden mit B10.D2 oder B10.BR, aus Knochenmark derivierten DC in Präsenz/Abwesenheit
von NPC aus B10.BR oder B10.D2-Mäusen
stimuliert. Die Proliferation und Zytokinproduktion wurde wie zuvor
in Aliquots dieser Kulturen gemessen. Außerdem wurden weitere Aliquots
von Zellen, die aus diesen primären
Kulturen geerntet worden waren, Kulturen frischer C57BL/6-Milzzellen,
die mit B10.BR- (Kasten B)-10)
oder B10.D2-(Kasten
C) 10)-DC-Zellen stimuliert worden waren, zugegeben.
Erneut wurde die Proliferation und Zytokinproduktion gemessen. Die
aus drei solchen Studien gesammelten Daten werden in 10 gezeigt.
-
10 zeigt die Spezifität der Hemmung von Proliferation
oder Zytokinproduktion durch hepatische NPC (siehe 9 und
Beschreibung von 9 für weitere Details). In Kasten
A) werden 5 × 106 C57BL/6-Milzzellen dreifach, 3 Tage lang
mit 2 × 105 B10.BR- oder B10.D2-DC stimuliert, mit/ohne
2 × 105 NPC, die von B10.D2 oder B10.BR-Mäusen deriviert
wurden. Die gezeigten Daten sind das arithmetische Mittel von 3
wiederholten Studien. In Kästen
B) und C) wurden frische C57BL/6-Milzresponderzellen dreifach mit entweder
B10.BR-DC (Kasten B) oder B10.D2-DC (Kasten C) kultiviert, mit/ohne
2 × 105 zusätzlicher
Zellen aus den primären
Kulturen (Gruppen 1-6 in Kasten A). Auch hier stellen die Daten
das arithmetische Mittel der Proliferation/Zytokinproduktion aus
3 Studien dar. *p<0,05
verglichen mit Kontrollkulturen (ganz links in jedem Kasten).
-
Die
Daten aus den primären
Kulturen (Kasten A)) rekapitulieren die in 9 gemachten
Beobachtungen und zeigen, dass NPC die Proliferation und IL-2-Produktion
aus DC-stimulierten Responderzellen unabhängig von Antigen und MHC hemmen.
Die Daten in den Kästen
B) und C) dieser Abbildung zeigen jedoch ganz klar, dass der adoptive
Transfer der Hemmung unter Verwendung von Zellen aus diesen primären Kulturen
antigenabhängig
verläuft
und von der Antigen-Spezifität der in
der primären
Kultur verwendeten DC bestimmt wird und nicht der für die Induktion
der Unterdrückung
verwendeten NPC. Diese zusätzlichen
Zellen in der NPC-Population weisen folglich die funktionale Eigenschaft
auf, dass sie „bei
der Induktion von Unterdrückung
als ,Facilitator-Zellen' agieren". Bitte beachten
Sie, dass in anderen Studien (Daten hier nicht gezeigt), in denen
das letzte Assay-System
die Messung der Zytotoxizität
allogenen Zielzellen gegenüber
beinhaltete, eine ähnliche
Hemmung der Lysis (und nicht der Zytokinproduktion) beobachtet wurde,
wobei Zellen verwendet wurden, die aus primären, mit DC und hepatischen
NPC stimulierten Kulturen geerntet worden waren (siehe Gorczynski,
R.M. et al. 1998a, Transplantation. 66:000-008).
-
Hepatische Zellpräparationen
aus mit Flt3L behandelten Mäusen
sind eine potente Quelle für
DC und „Facilitator"-Zellen:
-
Es
ist ausführlich
berichtet worden, dass eine pv-Infusion von Alloantigenen oder eine
iv-Infusion von leberderivierten, allogenen, mononuklearen Zellen
eine operationelle Unempfänglichkeit
bei Empfängertieren induziert
(Gorczynski, R.M. 1995a, Cell. Immunol. 160:224-231; Gorczynski,
R.M. et al. Transplantation 62:1592-1600; Gorczynski, R.M. et al.
1994a. Transplantation 58:816-820; Gorczynski, R.M. und D. Wojcik. 1992.
Immunol. Lett. 34:177-182; Gorczynski, R.M. et al. 1995b. Transplantation.
60:1337-1341). Die gesamte Ausbeute hepatischer, mononuklearer Zellen
bei normalen Mäusen
beträgt
um die 5 × 106 Zellen/Maus. Um die Ausbeute zu steigern
und die Möglichkeit
zu erforschen, dass die Leber selbst eine Quelle von sowohl allostimulierenden
DC und „Facilitator"-Zellen ist, wurden 2 C57BL/6-Mäuse 10 Tage
lang täglich
iv-Infusionen von 10mg/Maus menschlicher, CHO-derivierter Flt3L
ausgesetzt, die als Wachstumsfaktor für DC bekannt sind (Steptoe,
R.J. et al. 1997. J Immunol. 159:5483-5491). Lebergewebe wurden
aus diesen Spendern geerntet und gesammelt und mononukleare Zellen
wurden wie im Abschnitt über
Materialien und Methoden beschrieben präpariert (Mittel 130 × 106 Zellen/Spender). Dann wurden diese Zellen
unter Verwendung von Techniken der Schwerkraftsedimentation von
Einheiten einer Subfraktionierung durch Größe unterzogen (Miller, R.G.
und R.A. Phillips. 1969. J. Cell. Comp. Physiol. 73:191-198). Ein
typisches Größenprofil
für zurück gewonnene
Zellen wird in 11 gezeigt (eine von 3 Studien).
-
11 zeigt die OX-2-Expression in einer Subpopulation
von NPC. Es handelt sich hier um eine Sedimentationsanalyse (Zellprofil)
und FACS-Analyse von Zellen, die nach 10 Tagen aus mit Flt3L-behandelten C57BL/6-Mäusen isoliert
worden waren. Zwei der C57BL/67 Mäuse erhielten 10 Tage lang
täglich
10μg/Maus Flt3L
iv. Hepatische NPC wurden 3 Std. lang bei 4°C sedimentiert und die gezeigten
Fraktionen gesammelt (Fraktionen (Fx) 1-4, Sedimentationsgeschwindigkeiten
von jeweils 2,5-3,8, 3,8-5,1, 5,1-6,4 und 6,4-8,0 mm/Std.). Aliquots
der Zellen wurden dreifach mit den gezeigten Mabs gefärbt. Die
verbleibenden Zellen wurden wie in 12-14 verwendet.
Die Daten wurden aus 3 Studien gesammelt.
-
In
denselben Studien wurden aus den verschiedenen in 11 gezeigten Fraktionen isolierte Zellen wie folgt
getestet. Zuerst wurden die Zellen mit FITC-markierten Mabs zu B7-1,
B7-2, NLDC145 und Ratte-anti-Maus OX-2 (M3B5) gefärbt, mit
FITC anti-Ratte-IgG als zweitem Antikörper. Zusätzlich wurde aus den verschiedenen
Zellproben extrahierte mRNA durch PCR auf die Expression von GAPDH,
B7-1, B7-2 und OX-2 getestet. Die Daten werden in 11 (aus 3 getrennten Studien gesammelt) und 12 (repräsentative PCR-Daten
aus einem Experiment) gezeigt.
-
12 zeigt den PCR-Nachweis von B7-1, B7-2 und OX-2
in hepatischen NPMC. Es handelt sich um eine PCR-Analyse von mRNA-Expression
von OX-2, B7-1 und B7-2 in verschiedenen hepatischen NPC-Zellfraktionen,
die aus mit Flt3L behandelten Mäusen
isoliert wurden (siehe 11).
Die Daten sind repräsentativ
für 1 von
3 Studien.
-
Weitere
Aliquots der Zellen wurden zur Stimulation frischer C3H-Milzresponderzellen
in Kultur verwendet. Proliferation- und Zytokin-Assays wurden wie
zuvor durchgeführt
(siehe 9) und außerdem wurden Zellen aus diesen
primären
Kulturen entnommen und zu frischen sekundären Kulturen von C3H-Milzresponderzellen
und C57BL/6 aus Knochenmark derivierten DC gegeben. Auch hier wurde
die Proliferation und Zytokinproduktion von diesen sekundären Kulturen
ausgehend getestet. Daten, die aus 3 Studien dieser Art gesammelt
wurden, werden in 13 gezeigt (Kästen A)
und B)).
-
13 zeigt, dass hepatische NPMC von mit Flt3L behandelten
Mäusen
zu IL-2- und IL-4-Produktion führt.
Die Stimulation von Proliferation/Zytokinproduktion durch NPC aus
mit Flt3L behandelten Mäusen
und die Hemmung derselben (wo die Stimulation durch eine getrennte
Population von DC induziert wird) ist eine Funktion verschiedener
Zellpopulationen. (Siehe Text und 11-12 für weitere
Details.) Hepatische NPC-Fraktionen wurden von mit Flt3L behandelten
C57BL/6-Mäusen
deriviert und verwendet, um C3H-Milzzellen
in dreifachen Kulturen, allein oder in Präsenz von aus Knochenmark derivierten
C57BL/6-DC (siehe Kasten A) zu stimulieren. Die Daten zeigen das
arithmetische Mittel für
die Proliferation/Zytokinproduktion aus 3 Experimenten.
-
Zusätzlich wurden
aus diesen primären
Kulturen geerntete Zellen zu frischen C3H-Milzzellen gegeben, die mit C57BL/6-DC
(Kasten B) stimuliert worden waren, woraufhin die Proliferation/Zytokinproduktion
erneut getestet wurde. *p<0,05
verglichen mit Kontrollgruppen (ganz links im Kasten).
-
Zuletzt
wurden Zellen aus den unterschiedlichen Fraktionen per iv-Infusion
2/Gruppe C3H-Mäusen verabreicht,
die auch C57BL/6-Nierenallotransplantate als Antigen-Herausforderung
erhielten. Milzzellen wurden 10 Tage nach der Transplantation aus
diesen einzelnen Mäusen
geerntet und in Kultur erneut mit C57BL/6 oder B10.D2-DC stimuliert,
wobei die Zytokine wieder nach 40 Std. gemessen wurden (siehe 14).
-
14 ist ein Säulendiagramm
von aus Zellen aus C3H-Mäusen
produzierten Zytokinen, welche C57BL/b-Nierenallotransplantate und
NPC aus mit Flt3 behandelten C57BL/6-Spendern erhalten hatten. OX-2+-NPC, die den Empfängern von Nierenallotransplantaten
per iv-Infusion verabreicht wurden, führten zur Polarisierung der
Zytokinproduktion (zu IL-4, IL-10 und TGFβ) in Milzzellen, die aus diesen
Mäusen
geerntet und an vitro erneut stimuliert worden waren. Fraktionen
von NPC aus mit Flt3L behandelten C57BL/6 Mäusen (aus 11) wurden per iv-Infusion 2/Gruppe C3H-Empfängern verabreicht,
die C57BL/6-Nierenallotransplantate (gemeinsam mit CsA) auf übliche An
und Weise erhielten (siehe Materialien und Methoden). Die Mäuse wurden
14 Tage nach der Transplantation geopfert und die Milzzellen wurden
in vitro dreifach mit C57BL/6-DC-Stimulatorzellen
stimuliert. Die Zytokine in den überschüssigen Flüssigkeiten
dieser Kulturen wurden nach 60 Std. getestet. Die Daten zeigen das
arithmetische Mittel, das aus Kulturen von 3 Studien dieser Art
gesammelt wurde. *p<0,05
verglichen mit Kontrollgruppen (ganz links – nicht NPC-infusiert).
-
Die
Daten in 11 zeigen, dass getrennte Subpopulationen
aus langsam sedimentierenden Zellen OX-2 in den aus mit Flt3L behandelten
Mäusen
geernteten Zellen exprimieren, verglichen mit Zellen, die B7-1 und/oder
B7-2 exprimierten. Im Allgemeinen fand die Expression von OX-2 und
B7-2 in äquivalenten
Subpopulationen statt. Schneller sedimentierende Zellen (Fx 3 und
4 in 11) verfärbten sich wohl bei NLDC145, waren
jedoch durch Fluoreszenz hauptsächlich
für B7-1
positiv, und nicht für
B7-2 oder OX-2. Die FACS-Analyse von Zellpopulationen (11) und PCR-Analyse von mRNA (12) führten
zu ähnlichen
Ergebnissen.
-
Als
die funktionale Kapazität
dieser verschiedenen Zellpopulationen erforscht wurde (13 und 14),
stellte sich heraus, dass eine optimale direkte Stimulation (oder
Proliferation und IL-2-Produktion) durch B7-1-exprimierende Zellen
verursacht wurde (Fxs 3 und 4 in Kasten A) von 13), während
die nur OX-2-exprimierenden Zellen (Fxs 1 und 2 in 11 und 12)
in der Lage waren, die vorher definierten hemmenden Wirkungen (9 & 10)
in dem 2-stufigen Kulturensystem (Kasten B) in 13) zu produzieren. Dieselben Zellen (Fxs 1 und
2) waren wiederum in der Lage, nach iv-Infusionen Zellen aus Mäusen mit
Nierenallotransplantaten so zu polarisieren, dass diese nach einer
erneuten Stimulation in vitro (14) hauptsächlich IL-4,
IL-10 und TGFβ produzierten.
Diese Daten stehen mit der Auffassung im Einklang, dass nach einer
FltL-Behandlung von Mäusen
eine Expansion einer Population von immunstimulierenden DC in der Leber
auftritt, die außerdem
eine weitere getrennte Population von (Facilitator-)Zellen enthält, die
die Immunregulierung fördern.
-
Belege dafür, dass
Zellpopulationen mit „Facilitator"-Aktivität aus der
Leber von mit Flt3L behandelten Mäusen die Überlebenszeit von Transplantaten
in vivo verlängern:
-
Auch
anderswo ist seitdem berichtet worden, dass eine gute Korrelation
zwischen Behandlungen (wie zum Beispiel pv-Immunisierung), die die
IL-2-Produktion
senken und die IL-4-Produktion aus erneut stimulierten Zellen und
die Verlängerung
der Überlebenszeit
von Transplantaten steigern (Gorczynski, R.M. und D. Wojcik. 1994.
J. Immunol. 152:2011-2019; Gorczynski, R.M. 1995a. Cell. Immunol.
160:224-231; Gorczynski, R.M. et al, Transplantation 62:1592-1600)
und dass die gesteigerte Expression von OX-2 ebenfalls unabhängig mit
einer gesteigerten Überlebenszeit
von Transplantaten nach einer pv-Immunisierung verbunden ist (Gorczynski,
R.M. et al 1998b. Transplantation. 65:1106-1114), wobei die nächste Frage
die war, ob die aus mit Flt3L behandelten Mäusen isolierten Zellen, die
die hemmende Funktion in vitro stimulierten (siehe 9, 10 und 13)
und gesteigerte Mengen von OX-2 exprimierten (11, 12) selbst in der Lage waren,
die gesteigerte Überlebenszeit
von Transplantaten an vivo zu fördern.
-
Gruppen
von 2 C57BL/6-Mäusen
erhielten wie zuvor über
10 Tage iv-Infusionen
von 10mg/Maus Flt3L. Es wurden Zellen von der Leber durch Enzymverdauung
isoliert und durch Schwerkraftsedimentation von Einheiten fraktioniert.
Es wurden 4 Sammlungen von Zellen gewonnen und ein Aliquot wurde
wie zuvor in FACS mit anti-OX-2 gefärbt. Gruppen von 2 C3H-Mäusen erhielten
10 × 106 Zellen per iv aus den 4 getrennten Sammlungen.
Eine Kontrollgruppe erhielt nur Salzlösungsinjektionen. In den folgenden
48 Std. erhielten alle Mäuse
C57BL/6-Nierentransplantate.
Alle Mäuse
erhielten am Tag der Nierentransplantation CsA (10mg/Kg). Die Daten
in 15 wurden aus 3 Studien dieser Art gesammelt (und
stellen 6 Mäuse/Gruppe
dar) und zeigen die Überlebensrate
der Tiere in diesen 5 verschiedenen Gruppen.
-
15 zeigt, dass in empfangende C3H-Mäuse per
iv-Infusion verabreichte NPC aus mit Flt3L behandelten C57BL/6-Mäusen die
Abstoßung
des C57BL/6-Nierenallotransplantats hemmt. Zwei Mausgruppen erhielten
die verschiedenen Subpopulationen von NPC, die aus den in
11 und
12 gezeigten
mit Flt3L behandelten Mäusen
deriviert wurden. Fxs 1 und 2 waren OX-2
+.
Die Mäuse
erhielten C57BL/6 Nierenallotransplantate innerhalb von 48 Std.
zusammen mit CsA (siehe Materialien und Methoden). Die Überlebensrate
der Tiere wurde als ein Endpunkt verfolgt. Die gezeigten Daten wurden
aus 3 Studien (6 Mäuse/Gruppe) gesammelt.
*p<0,05 verglichen
mit Mäusen,
die nur CsA erhielten
-
Aus
dieser Abbildung ist sehr deutlich zu ersehen, dass nur hepatische
Zellen, die OX-2 exprimierten (Fxs 1 und 2 – siehe 11 und 12)
in der Lage waren, die Überlebenszeit
der Transplantate nach der iv-Infusion zu fördern. Ein Vergleich dieser
Daten mit denen in 13 bestätigt außerdem, dass diese Zellpopulationen
ebenfalls jene waren, die mithilfe eines 2-stufigen Kulturen-Assay-Systems als mit einer
funktionalen „Facilitator"-Aktivität versehen
identifiziert worden waren (siehe auch 9 und 10).
Zwischen den Gruppen, die NPC-Fx1
oder NPC-Fx2 erhielten, gab es in diesem Experiment keine wesentlichen
Unterschiede, was die Überlebensrate
anging, was mit den relativ äquivalenten
Niveaus der OX-2-Expression in diesen Fraktionen im Einklang steht
(11).
-
Anti-OX-2 monoklonaler
Antikörper
in vitro macht die durch hepatische NPC induzierte Regulierung rückgängig:
-
In
einer letzten Studie sollte herausgefunden werden, ob anti-OX-2
monoklonaler Antikörper
M3B5, wenn zu Kulturen von C3H-Milzresponderzellen, allogenen (C57BL/6)
DC und NPC aus C57BL/6-Mäusen
zugegeben, der Hemmung von IL-2 Produktion in primären Kulturen
und der Entwicklung von Zellen, die in der Lage sind, solche Zytokin-Antworten
von frisch stimulierten Responderzellen in sekundären Kulturen
zu hemmen (siehe 9, 10 und 13),
vorbeugen könnte.
Die Daten in 16 und 17 sind
aus 3 Studien dieser Art gesammelt.
-
16 ist ein Säulendiagramm,
das die Wirkung von anti-B7-1; B7-2; oder OX-2 auf primäre Allostimulation
zeigt. Es zeigt, dass anti-OX-2-Mab die IL-2-Zytokinproduktion an vitro nach der
Stimulation von C3H-Milzresponderzellen mit C57BL/6-DC steigert.
Subgruppen der Kulturen enthielten die gezeigten Mabs. Zytokine
wurden nach 60 Std. getestet. Alle Daten stellen das aus 3 wiederholten
Studien gesammelte arithmetische Mittel dar. *p<0,05 verglichen mit Kontrollgruppe
(ganz links).
-
17 ist ein Säulendiagramm,
das zeigt, dass anti-OX-2 die Hemmung durch NPC rückgängig macht.
Es zeigt, dass anti-OX-2-Mab die Entwicklung von immunregulierenden
Zellen in vitro nach der Inkubation mit hepatischen NPC hemmt. C3H-Milzresponderzellen
wurden dreifach mit C57BL/6-DC
zusammen mit NPC inkubiert (siehe 9 und 10).
Subgruppen dieser Kulturen enthielten die gezeigten Mabs. Die Zytokine
wurden nach 60 Std. in Kulturen getestet (Kasten A). Zusätzlich wurden
Zellen aus allen Gruppen geerntet, gewaschen und zu frischen C3H-Milzresponderzellen
und C57BL/6-DC gegeben (Kasten B). Die Zytokine in diesen Gruppen
wurden 60 Std. später
getestet. Alle Daten stellen das aus 3 wiederholten Studien gesammelte
arithmetische Mittel dar. *p<0,05
verglichen mit Kontrollgruppe aus Kulturen von NPC ohne monoklonale
Antikörper
(ganz links in der Abbildung) – siehe
auch 16.
-
Es
gab zwei Arten primärer
Kulturen, jene, die nur C3H-Milzresponderzellen und C57BL/6-DC enthielten
(16) oder dieselbe Mischung mit zugegebenen C57BL/6-NPC
(17). Untermengen dieser Kulturen enthielten zusätzlich entweder
5μg/ml anti-B7-1,
anti-B7-2 oder anti-OX-2. Überschüssige Flüssigkeiten aus
Responderzellen, die nur in Präsenz
von DC stimuliert worden waren, wurden 60 Std. später auf
Zytokinproduktion getestet (16).
Die überschüssigen Flüssigkeiten
aus primären
Kulturen, die sowohl mit DC als auch NPC inkubiert worden waren,
wurden nach 60 Std. geerntet und auf ihre Zytokinproduktion getestet (17A). Zusätzlich wurden Zellen nach 5
Tagen geerntet, gewaschen und zu sekundären Kulturen frischer C3H-Responderzellen mit
frischen C57BL/6-DC gegeben. Bei dieser zweiten Kultivierungsstufe
wurden keine monoklonalen Antikörper
zugegeben. Die Daten für
die Zytokinproduktion dieser sekundären Kulturen werden in 17B gezeigt.
-
Die
Zugabe von anti-B7-1 oder anti-B7-2 zu mit DC stimulierten Milzkulturen
führte
zur Hemmung der Zytokinproduktion (16),
während
im Gegensatz dazu der anti-OX-2 monoklonale Antikörper zu
einer Steigerung der IL-2-Produktion in diesen primären Kulturen
führte
(16). Wir haben bereits an anderer Stelle von ähnlichen
Ergebnissen berichtet (Ragheb et al – zur Veröffentlichung eingereicht).
Interessant ist, dass anti-OX-2 die durch NPC verursachte Hemmung
der Zytokinproduktion in diesen primären Kulturen zerstörte (17A – siehe
auch 9, 10 und 13).
Außerdem
beugte anti-OX-2
der funktionalen Entwicklung einer Zellpopulation vor, die in der
Lage gewesen wäre,
die Hemmung der Zytokinproduktion auf frisch stimulierte Milzzellen
zu übertragen
(17B).
-
DISKUSSION
-
Es
besteht ein großes
theoretisches und auch praktisches Interesse daran, die Mechanismen
zu verstehen, durch die ein Zustand antigen-spezifischer Toleranz
in lymphoiden Populationen induziert werden kann. Eine effektive
Toleranzinduktion ist bis jetzt nur begrenzt möglich, weshalb, um nur ein
Beispiel zu nennen, erfolgreiche Allo- (und Xeno-)transplantationen
nur eingeschränkt
möglich
sind (Akatsuka, Y., C. Cerveny und J.A. Hansen. 1996. Hum. Immunol.
48:125-134). Viel Arbeit ist in die Erforschung der Möglichkeit
investiert worden, durch prä-
(oder peri-)transplantative, spenderspezifische Immunisierung einen
solchen Zustand herzustellen (Qian, J.H. et al. 1985. J. Immunol.
134:3656-3663; Kenick, S., et al. 1987. Transpl. Proc. 19:478-480; Gorczynski,
R.M. 1992. Immunol. Lett. 33:67-77; Thelen, M. und U. Wirthmüller. 1994.
Curr. Opin. Immunol. 6:106-112; Akolkar, P.N. et al. 1993. J. Immunol.
150 (April 1):2761-2773; Ahvazi, B.C. et al. J. Leu. Bio. 58 (1):23-31;
Albina, J.E. et al. 1991. J. Immunol. 147:144-152). Es gibt gute
Gründe
zu der Annahme, dass eine portal-venös (pv) verlaufende Immunisierung
irgendwie zu einer Toleranzinduktion führt und dass diese Immunregulierung
anscheinend durch das Verfolgen von Veränderungen bei der Zytokinproduktion
in den Wirtszellen zu überwachen
ist, in denen es zu einer verringerten Produktion von IL-2, IL-12
und IFNγ und
zu einer gesteigerten Produktion von IL-4, IL-10, IL-13 und TGFβ kommt (Thelen,
M. und U. Wirthmüller.
1994. Curr. Opin. Immunol. 6:106-112; Gorczynski, R.M. et al. 1998a.
Transplantation. 66:000-008). Welche dieser Zytokinveränderungen
direkt und kausal impliziert ist (wenn überhaupt), bleibt bis jetzt
jedoch unklar.
-
Eine
weitere Analyse der Zellpopulation, die in der Lage ist, nach pv-Immunisierung Toleranz
zu induzieren, führte
zu der leicht paradoxen Beobachtung, dass dendritische Spenderzellen
(DC) eine hervorragend tolerierende Population darstellten (Gorczynski,
R.M. 1995a. Cell. Immunol. 160:224-231; Gorczynski, R.M. et al.
Transplantation 62:1592-1600). Da Antigen-pulsierte DC herkömmlich als
ein optimales Immunisierungsregime angesehen werden, war der nach
der pv-Immunisierung
mit DC aktivierte Mechanismus, der zur Toleranz führte, von
Interesse (Banchereau, J. und R.M. Steinman. 1998. Nature. 392:245-252).
Es steht bereits fest, dass DC selbst eine äußerst heterogene Population
darstellen, was ihre Herkunft, Zelloberfläche, Phänotyp, Stoffumsatz in vivo
und möglicherweise
Funktion angeht (Salomon, B. et al. 1998. J. Immunol. 160:708-717; Leenen,
P.J.M. et al. 1998. J. Immunol. 160:2166-2173). In dem Maus-Lymphknoten
wurden mindestens 3 diskrete Populationen identifiziert, von denen
eine kleine CD8α+NLDC145+-Zellen
umfasste, wahrscheinlich lymphoider Herkunft und mit einem unreifen
Phänotyp,
deren Anzahl infolge einer Flt3L-Behandlung an vivo bedeutsam gesteigert
wurde (100x) (Salomon, B. et al. 1998. J. Immunol. 160:708-717) (die Verabreichung
der letzteren führt
Berichten zufolge zur Proliferation dendritischer und anderer Zellen
hämatopoetischer
Herkunft (Maraskovsky, E. et al. 1996. J. Exptl. Med. 184:1953-1962)).
Diese Zellen ähnelten
den interdigitierenden DC, die in den T-Zellbereichen der weißen Pulpa
der Milz gefunden werden und sind bei der durch andere (myeloisch
derivierte) DC induzierten Regulierung der Immunität impliziert
worden (Salomon, B. et al. 1998. J. Immunol. 160:708-717; Kronin,
V. et al. 1996. J. Immunol. 157:3819-3827; Suss, G. und K. Shortman.
1996. J. Exptl. Med. 183:1789-1796).
-
Eine
Vielzahl anderer Studien weist darauf hin, dass die Induktion von
Immunität
(gegenüber
Toleranz) nach der Antigenpräsentation
wirklich abhängig
von der Koexistenz anderer signalisierender Liganden auf der Oberfläche der
DC ist (die mit den passenden Gegenliganden auf der Oberfläche anderer
Zellen (z. B. stimulierter T-Zellen) in Interaktion treten) (Larsen,
C.P. et al. 1994. J. Immunol. 152:5208-5219; Lenschow, D. J. et al.
1996. Annu. Rev. Immunol. 14:233-258; Larsen, C.P. und T.C. Pearson.
1997. Curr. Opin. Immunol. 9:641-647). Es wurde spekuliert, dass
die Infusion von DC über
die Pfortader Toleranz induzierte, indem eine andere Zellpopulation
hinzugewählt
wurde, die durch die Expression einzigartiger Liganden auf der Zelloberfläche erkennbar
war und deren biologische Funktion die Erleichterung von Toleranzinduktion
und nicht von Immunität
war, wenn ein Antigen verbunden mit ansonsten immunogenen DC präsentiert
wurde. Vor kurzem wurden erste Belege zur Stützung dieser Hypothese vorgelegt
(Gorczynski, R.M. et al. 1998a. Transplantation. 66:000-008). Hier
wird dies als eine „Facilitator"-Zelle bezeichnet.
Darüber
hinaus wurde vorhergesagt, dass, da die pv- Immunisierung mit einer gesteigerten
Expression eines neuartigen Moleküls, OX-2, verbunden zu sein
schien, von dem zuvor berichtet wurde, dass es auf DC exprimiert
wird (Barclay, A.N. 1981. Immunology. 44:727; Barclay, A.N. und
H.A. Ward. 1982. Eur. J. Biochem. 129:447; Chen, Z. et al. 1997.
BBA. Mol. Basis. Dis. 1362:6-10; Gorczynski, R.M. et al. 1998b.
Transplantation. 65:1106-1114), dieses Molekül tatsächlich als ein „Marker" für die beschriebene
hypothetische „Facilitator"-Zelle dient. Die
hier beschriebenen Experimente stehen mit einer solchen Hypothese
im Einklang.
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Es
ist gezeigt worden, dass es innerhalb der hepatischen NPC-Population
eine Untermenge von Zellen gibt, die in der Lage sind, die Stimulation
durch allogene DC auf nicht-MHC-abhängige Art und Weise zu hemmen
(siehe 9 und 10)
und in der Lage sind, die Entwicklung einer antigen-spezifischen
immunregulierenden Zellpopulation in vitro zu induzieren (siehe 9 und 10).
Die nicht-MHC-abhängige
Natur dieser „Facilitator"-Zellinteraktion
weist darauf hin, dass diese funktioniert, indem sie ein Nebensignal
(ein regulierendes, nicht kostimulierendes Signal) für die DC
bereitstellt, die die T-Zellen in der beschriebenen allogenen, gemischten
Leukozytenreaktion stimulieren, wobei dies auf eine Art und Weise
geschieht, die der ursprünglichen
Beschreibung kostimulierender Interaktionen ähnlich ist (Jenkins, M.K. et
al. 1988. J. Immunol. 140:3324-3329). Dies führt dazu, dass die stimulierten
Lymphozyten ihr Zytokinproduktionsprofil verändern (mit verringerter IL-2-Produktion
und Proliferation) und fähig
werden, die Immunantwort, die bei frisch stimulierten Lymphozyten
beobachtet wird, zu regulieren (siehe Kasten B in 9 und 10).
Am Interessantesten ist jedoch, dass nach der Expansion von DC in
vivo durch Flt3L-Behandlung gezeigt werden konnte, dass die Leber
selbst sowohl eine immunstimulierende Population (der Geschwindigkeitssedimentationsanalyse
zufolge große
Zellen) und diese vermeintliche „Facilitator"-Zellpopulation enthält (siehe 11-15). Ferner befindet sich die
letztere biologische Aktivität
innerhalb einer langsam sedimentierenden (kleine Größe) NLDC145+-Zellpopulation, die auf der Zelloberfläche vorzugsweise
sowohl B7-2 als auch OX-2 exprimiert (siehe 11 und 12).
Als erforscht wurde, ob dieselbe Zellpopulation in vivo bei der
Regulierung von Transplantat-Toleranz aktiv war, wurde erneut festgestellt,
dass nach einer Behandlung mit Flt3L die Leber eine Population von
Zellen enthielt, die eine gesteigerte Nierentransplantat-Akzeptanz übertrug
(15) und parallel dazu das Zytokinproduktionsprofil
immunisierter Mäuse
dahingehend veränderte,
dass die Produktion von IL-4 und TGFβ gesteigert und die von IL-2
und IFNγ verringert
wurde (14).
-
Bei
einem letzten Versuch, die Rolle von OX-2-Expression selbst bei
dieser regulierenden Funktion zu erforschen, wurden frische Milzzellen
nur mit DC oder in Präsenz
von anti-B7-1, anti-B7-2 oder anti-OX-2 stimuliert. Es ist zu beachten,
dass andere Studien (Daten nicht gezeigt) bestätigt haben, dass selbst die
verwendeten aus Knochenmark derivierten DC eine kleine Anzahl von
OX-2+-Zellen enthielten (RMG – unveröffentlicht).
Im Gegensatz zu anti-B7-1 und anti-B7-2, durch die die Zytokinproduktion
verringert wurde, ein Ergebnis, das mit der hypothetisierten Rolle
für diese
als kostimulierende Moleküle übereinstimmt
(Hancock, W.W. et al. 1996. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93:13967-13972;
Freeman, G.J. et al. 1995. Immunity. 2:523-532; Kuchroo, V.K. et
al. 1995. Cell. 80:707-718), produzierten die anti-OX-2 eine kleine
aber bedeutsame (1,7-2,5-fach in drei Studien) Steigerung bei der
IL-2-Produktion
in diesem System (16). Noch wichtiger war jedoch,
dass die Inklusion von anti-OX-2-Mab in ein System, in das exogene „Facilitator"-Zellen zugegeben
wurden (aus NPC), die Induktion der Hemmung, wie sie normalerweise
in solchen Kulturen zu sehen ist, vollkommen blockierte (9 und 10;
mit unterem Kasten von 17 zu
vergleichen). Diese Daten stehen mit dem Konzept im Einklang, dass
OX-2 in dieser Situation ein regulierendes und nicht kostimulierendes
Signal abliefert.
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Wie
fügen sich
die vorliegenden Daten in den sich stets entwickelnden Rahmen des
Verständnisses der
Heterogenität
von DC ein? Wie oben bemerkt, ist darüber spekuliert worden, ob eine
getrennte Population von CD8α+NLDC145+ lymphoider
Herkunft, die als Antwort auf Flt3L proliferiert, für Immunregulierung
verantwortlich sein könnte.
Andere Daten haben IL-10 als ein Zytokin impliziert, das die Entwicklung/Reifung
von DC in eine Population verändern
könnte,
die gesteigerte Mengen von B7-2 exprimiert und in der Lage ist,
Toleranz zu induzieren (Steinbrink, K. et al. 1997. J. Immunol.
159:4780). Die Rolle, die eine Regulierung der Fas-Expression als
ein kontrollierendes Merkmal spielen könnte, ist bis jetzt unerforscht
(Suss, G. und K. Shortman. 1996. J. Exptl. Med. 183:1789-1796).
Die hierin offengelegten Daten sind die ersten, die ein anderes
Molekül implizieren,
nämlich
OX-2, wenn es um die Ablieferung eines tolerierenden Signals geht,
vielleicht in Verbindung mit Änderungen
der Expression von B7-2, Fas u.s.w.. Es ist faszinierend, dass obwohl
intra-thymische DC offensichtlich eine Schlüsselrolle bei der Regulierung
von Selbst-Toleranz spielen (Banchereau, A.N. und R.M. Steinman.
1998. Nature. 392:245-252), die natürliche Expression von OX-2
ursprünglich
zuerst auf thymischen DC beschrieben wurde (als auch im Gehirn)
(Barclay, A.N. 1981. Immuology. 44:727) – bis jetzt ist noch nicht
belegt worden, dass dies eine funktional relevante Expression für OX-2 an
dieser Stelle darstellt. Andere unabhängige Daten sind jedoch ebenfalls
zu dem Schluss gekommen, dass OX-2-Expression eine immunregulierende Rolle
spielt, was auch hier durch Assays der veränderten Zytokinproduktion in
vitro in Zellen getestet wurde, die in Präsenz/Abwesenheit von exprimierten
OX-2 stimuliert worden waren (Borriello, F. et al. 1997. J. Immunol.
158:4548).
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Es
ist berichtet worden, dass nach der pv-Immunisierung eine messbare
Expansion der Anzahl von Populationen von γδTCR+-Zellen
stattfindet, welche in der Lage sind, die gesteigerte Überlebenszeit
von Transplantaten durch adoptiven Transfer auf naive Empfänger zu übertragen
(Gorczynski, R.M. et al. 1996c. Immunology. 87 (3):381-389). Nur
wenig ist über
die Natur des durch diese Zellen erkannten Antigens bekannt, und
darüber,
warum sie, als eine Population, sich vorzugsweise nach der pv-Immunisierung
vermehren. Es wird spekuliert, dass dies letztendlich durch eine
differentielle Empfänglichkeit
von γδTCR+- gegenüber αβTCR+-Zellen für immunregulierende Signale,
die nach der OX-2-Expression abgeliefert werden, zu erklären sei.
-
Abschließend kann
gesagt werden, dass der Erfinder zum ersten Mal davon berichtet
hat, dass die funktionale Heterogenität der DC-Sammlung als differentielle
Expression von OX-2 auf der Zelloberfläche zu verstehen sein könnte. Die
Expression dieses Moleküls
scheint Zellen die Fähigkeit
zu vermitteln, Immunregulierung zu induzieren, die Überlebenszeit
von Nierentransplantaten zu steigern (und die Zytokinproduktion
sowohl in vivo als auch in vitro zu verändern). Die vorliegende Erfindung
schlägt
vor, dass solche OX-2-exprimierenden Zellen als „Facilitator"-Zellen bezeichnet
werden sollten (für
Toleranzinduktion).
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BEISPIEL 4
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Präparation muriner Antikörper
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Es
wurden Maus- und Rattenhybridome zu einem 43Kd Molekül präpariert,
das im Thymus, auf einer Subpopulation dendritischer Zellen und
im Gehirn, in aus der Maus, der Ratte und dem Menschen deriviertem Säugetiergewebe
exprimiert wurde. Unter Verwendung von CHO-Zellen, die transient
mit adenoviralen Vektoren) transfiziert wurden, welche ein cDNA-Konstrukt
für das
relevante OX-2-Gen
exprimieren, weisen die monoklonalen Antikörper (Mabs) ein Molekül nach,
das durch dieses Konstrukt codiert wurde (jeweils Ratte-OX-2 (rOX-2),
Maus-OX-2 (mOX-2) und Mensch-OX-2 (huOX-2)). Außerdem weisen zumindest einige
der anti-Ratte-Mabs Determinanten nach, die auf dem murinen OX-2-Molekül exprimiert
wurden.
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MATERIALIEN UND METHODEN
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Die
Antigenpräparation
aus Geweben und Western Blotting wurde wie in Gorczynski et al.,
Transplantation, 1998, 65:1106-1114 beschrieben durchgeführt:
Milzzellen
(menschliche Proben wurden bei der Organentnahme für Transplantationen
aus Leichen entnommen) wurden für
die Präparation
dendritischer Zellen/Makrophagen verwendet. Das Gewebe wurde mit
einer Mischung aus Kollagenase und Dispase verdaut und über Lymphopaque
zentrifugiert. Die Zellen wurden 2 Std. lang bei 37°C geklebt,
gründlich
gewaschen und 14 Std. lang bei 37°C
inkubiert. Dendritische Zellen wurden als nicht haftende Zellen
isoliert (Gorczynski et al., Transplantation, 1996. 62:1592-1600).
Routinefärbungen
der Maus-Splenozyten
mit NLDC-145 und FITC-anti-Ratte-IgG oder FITC-MAC-1 vor und nach
der nächtlichen
Inkubation produzierte das folgende Färbungsmuster in diesen haftenden
Zellen: jeweils 8%±2%, 90%±11% und
92%±9%,
9%±3%.
Die rohe (nicht haftende) Präparation
dendritischer Zellen wurde mit Lysispuffer extrahiert, zu einer
Proteinkonzentration von 10mg/ml getitert und für die Immunisierung verwendet.
Einige derselben Materialien wurden später bei den überprüfenden ELISAs
verwendet (unten).
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Wenn
bei der Western-Gelanalyse Gehirngewebe verwendet wurde, wurde eine
Elektrophorese ganzer Gewebeextrakte in 12%SDS-PAGE durchgeführt und
diese auf PVDF-Membrane übertragen
(Novex Co., San Diego, CA). Vermeintliche anti-OX-2 Mabs wurden
als Testreagens verwendet, wobei isotypische Antikörper (bei
ELISA Tests negativ) als Kontrollen verwendet wurden. Die Membrane
wurden unter Verwendung von entweder anti-Ratte- oder anti-Maus-Meerrettich-Peroxidase
und passenden Substraten entwickelt.
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Immunisierung und Produktion
von Mabs:
-
Vier
weibliche BALB/c-Mäuse
wurden zuerst durch intraperitoneale Injektionen mit 1mg dendritischem Antigen
aus Mensch oder Ratte in vollständigem
Freundschen Adjuvans immunisiert. Dann wurden wie oben drei Auffrischungsimpfungen
mit unvollständigem
Freundschen Adjuvans in 3-wöchigen
Intervallen verabreicht. Als der Serumtiter sich im Vergleich zu
einer präimmunen
Serumprobe, wie durch ELISA bestimmt, mehr als verzehnfacht hatte,
wurden die 2 höchsten
Responder intravenös
aufgefrischt. Drei Tage später
wurden die Spendermäuse
geopfert und die Milzzellen geerntet und gesammelt. Die Fusion der
Splenozyten mit X63-Ag8.6.5.3 BALB/c Myelom-Stammzellen wurde wie
zuvor beschrieben durchgeführt
(Kohler, G. und C. Milstein. 1975. Nature. 25: S. 256-259), mit
der Ausnahme, dass die einschrittige Auswahl und Klonierung der Hybridome
in einem 0,8% Methylzellulose-Medium durchgeführt wurde (Immuno-Precise Antibodies
Ltd., Victoria, BC). Dieses gesetzlich geschützte halbfeste Medium ermöglicht eine
HAT-Auswahl und Klonierung in nur einem Schritt und eliminiert die Überwucherung
langsamer wachsender, wünschenswerter
Klone durch schneller wachsende, und vielleicht unerwünschter
Hybridome. Klone wurden ausgesucht und in Wells von 96-Well-Gewebekulturplatten
in 200μl
D-MEM-Medium resuspendiert, das 1 % Hypoxanthin/Thymidin, 20% fötales Kalbserum,
1% OPI und 1 × 106/ml BALB/c
Thymocyten enthielt. Nach 4 Tagen wurden die überschüssigen Flüssigkeiten mithilfe von ELISA
auf mit dem immunisierenden Antigen beschichteten Platten auf Antikörper-Aktivität hin überprüft. Vermeintlich
positive Hybridome wurden mithilfe von Klonierung in begrenzter Verdünnung erneut
kloniert, um Monoklonalität
zu garantieren und in FACS auf aus Gehirngewebe präparierten
Extrakten überprüft (unten).
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Für die Produktion
von Ratten-mAbs wurden 2 Fisher-Ratten wie oben mit Mausantigen
immunisiert. Im Wesentlichen wurde dieselbe Prozedur befolgt, mit
der Ausnahme, dass die für
die Fusion verwendete Stammzelllinie YB2/0 war.
-
ELISA und FACS-Analyse
vermeintlicher Mabs:
-
Für die ELISA-Assays
wurden Polystyrenplatten verwendet, die mit 100ng/ml poly-L-Lysin
beschichtet worden waren, gefolgt von einer Inkubation über Nacht
mit dem rohen Antigen dendritischer Zellen (für die Immunisierung verwendet)
zu 10mg/ml. Die Wells wurden nach der Bindung überschüssiger Flüssigkeiten der Hybridome mithilfe
der oben beschriebenen anti-Ratte/anti-Maus Meerrettich-Peroxidase-Antikörpern gebunden
und die Platten in einem automatischen ELISA-Plattenleser analysiert (TiterTek Multiskan,
MCC/340, FlowLabs, Mississauga, Ontario, Kanada).
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Die
FACS-Analyse wurde unter Verwendung vermeintlicher anti-OX-2 Mabs
und den folgenden Zellen durchgeführt. Frische, periphere Blutleukozyten
(PBL), die über
Ratte/Maus-Lymphopaque (Cedarlane Laboratories) oder Ficoll-Hypaque
(menschlich) isoliert wurden; frische dendritische Zellen aus der
Milz (nach Haftung und Inkubation übernacht wie oben isoliert);
und CHO-Zellen, die mit viralen Vektoren transduziert wurden, die
so aufgebaut waren, dass sie eine einzelne Kopie einer cDNA enthielten,
die in die not1/bamH1-Stellen insertiert wurde und das relevante
speziesspezifische OX-2 wie in den veröffentlichten Sequenzen codierte (Chen,
Z. et al. 1997. BBA. Mol. Basis. Dis. 1362:6-10; McCaughan, G.W.
et al. 1987. Immunogenetics. 25: S. 133-135) oder mit dem Kontrollvektor
allein. FITC anti-Maus (oder anti-Ratte) IgG wurde als sekundärer Antikörper verwendet.
-
Gemischte
Leukozytenreaktivität
(MLR) und Zytokinproduktion: Es wurden allogene MLR-Kulturen in 24-Well-Kulturplatten
in 1 ml eines aMEM-Mediums, welches mit 10% FCS ergänzt worden
war, angesetzt, unter Verwendung von 1:1-Mischungen von 2,5 × 106 Responder-PBL und mit Mitomycin C behandelten
Stimulator-PBL. Die Zellen wurden aus C3H-Responder-Mäusen (mit
Stimulator-C57BL/6), Lewis (LEW)-Ratten (mit Brown Norway, BN, als
Stimulator) und einzelnen menschlichen Spendern entnommen. Überschüssige Flüssigkeiten
der Kulturen wurden nach 60 Std. geerntet und auf verschiedene Zytokine
hin getestet, wofür
die zuvor beschriebenen ELISA-Assays (Maus) oder CTLL-2 als Bioassay
für IL-2-Produktion
aus allen Quellen von Responderzellen verwendet wurden (Gorczynski,
R.M. et al., 1998c. Immunology. 93: S. 221-229).
-
ERGEBNISSE
-
Bewertung einer Reihe
von Mabs und deren Färbung
von Zellpopulationen in frischen PBL oder Milz:
-
Alle
in den hierin beschriebenen Experimenten getesteten Mabs wurden
zuerst wie oben unter Materialien und Methoden beschrieben überprüft, wiesen
ein Molekül
im Western-Gel von Gehirnextrakten nach, das ein Molekulargewicht
von 42-45 Kd aufwies, und färbten
außerdem
CHO, die durch OX-2 codierende virale Vektoren transduziert worden
waren. Die in Tabelle 3 gezeigten Daten zeigen die FACS-Analyse
für diese Mabs
unter Verwendung frischer Zellen. Die Daten wurden über mehrere
unabhängige
Analysen addiert, bei denen eine Anzahl von Mabs, die gegen OX-2
der Ratte, der Maus oder des Menschen gerichtet waren, auf ihre
Färbung
von aus frischen PBL oder Milz geernteten Zellen getestet wurden
(nur haftende Zellen wurden auf letzteres hin getestet: Diese stellten
in allen Fällen
ungefähr
5%-8% der gesamten Zellpopulation dar).
-
Aus
Tabelle 3 wird deutlich, dass PBL der FACS-Analyse zufolge in allen
getesteten Spezies ungefähr 1,3%-2,5%
OX-2+ Zellen enthielten, was bei den an
der Milz haftenden Zellen ähnlich
war, nämlich
4%-8% OX-2+ Zellen. Die vorherige Arbeit
des Erfinders bestätigend,
zeigten an der Milz haftende Zellen, die aus C3H-Mäusen
oder LEW-Ratten entnommen worden waren, welche 4 Tage zuvor über die Pfortader
mit 20 × 106 (oder jeweils 50 × 106)
C57BL/6 (oder BN) Knochenmarkszellen immunisiert worden waren, einen
3,5 bis 5-fachen Anstieg von OX-2+ Zellen
(siehe Tabelle 3). Unter diesen Bedingungen konnte von spezifischen
Steigerungen der Überlebenszeit
der später
stattfindenden Allotransplantate von Zellen/Gewebe berichtet werden (Gorczynski,
R.M. et al. 1996a. Transplantation 62:1592-1600).
-
Fähigkeit von anti-OX-2 Mabs.
die Zytokinproduktion in MLR in vitro zu modulieren:
-
In
einer letzten Studie wurde die Frage gestellt, ob diese Mabs die
Immunantwort (wie sie durch die Zytokinproduktion getestet werden
kann) von in einer allogenen, gemischten Leukozytenreaktion (MLR)
stimulierten Zellen an vitro verändern
können.
Der Erfinder hat bereits zeigen können, dass Zellen aus Mäusen, die zuvor über die
Pfortader allogen immunisiert worden waren, vor allem Typ-2-Zytokine produzieren,
und dass ein anti-OX-2-Mab diese Polarisierung der Zytokinproduktion
anscheinend rückgängig machen
kann (und so die gesteigerte Überlebenszeit
von Transplantaten bei diesen Mäusen
zerstören
kann). Die Daten in Tabelle 4 bestätigen diese Ergebnisse unter
Verwendung von 3 unabhängigen
Mabs zu Maus OX-2. Ferner zeigen Zellen der Ratte oder des Menschen,
die in Präsenz
eines anti-Ratte (oder Mensch) OX-2 stimuliert wurden, eine ähnlich verstärkte IL-2-Produktion als Zellen,
die in Präsenz
von isotopischem Kontroll-Ig (oder keinem Ig) stimuliert wurden,
ohne eine allgemeine Steigerung der Zytokinproduktion (bei der Analyse
wurde in keiner der Gruppen eine Veränderung bei der IL-6-Produktion
beobachtet).
-
DISKUSSION
-
Durch
die in diesem Beispiel vorgelegten Daten wird bestätigt, dass,
unter Verwendung speziesspezifischer Mabs zum OX-2 von Mensch, Ratte
oder Maus, die Mabs zu dem auf der Oberfläche der dendritischen Wirtszellen
nachgewiesenen Molekül
eine Rolle bei der Regulierung von Zytokinproduktion nach Allostimulation
in vitro spielen könnten
und dass insbesondere eine funktionale Blockierung der OX-2-Expression zu einer verstärkten IL-2-Produktion
(ein Typ-1-Zytokin) nach der Allostimulation führt (Tabelle 4). Borriello
et al haben außerdem
kürzlich
berichtet, dass OX-2-Expression für die Induktion von IL-2 und
IFNγ-Synthese
kein Kostimulator war (Borriello, F. et al. 1997. J. Immuno. 158:4548) – unsere
Daten implizieren, dass sie in Wirklichkeit ein negatives Signal
für die
Produktion von Typ-1-Zytokin
darstellt. Wie zuvor berichtet gab es bei Mäusen, die zuvor über die
Pfortader immunisiert worden waren, nach der Stimulation von Zellen
in Präsenz
von OX-2 (siehe Tabellen 3 und 4) eine 4-fache Steigerung OX-2 exprimierender
Zellen in PBL und Milz und eine Umkehrung der Polarisierung bei
der Zytokinproduktion (von Typ-2-Zytokinen zu Typ-1-Zytokinen) (Gorczynski,
R.M. et al. 1998. Transplantation. 65:1106-1114).
-
BEISPIEL 5
-
Präparation von Ratte-Antikörpern
-
Fünf Ratten
wurden unter Verwendung von GERBU-Adjuvans (GERBU Biotechnik, Gaiberg,
Deutschland) mit 500μg
Membranprotein, das aus der dendritischen (DC) Zelllinie DC2.4 (ein
Geschenk von K. Rock, Harvard) gereinigt worden war, immunisiert.
Serum aus diesen Ratten wurde 7 Tage nach der dritten Immunisierung
getestet und mit einer Probe von vor der Immunisierung in einem
ELISA verglichen, wofür
plattengebundenes Material mit einem Molekulargewicht von 40Kd-45Kd,
das mittels Western-Blots eluiert wurde, und Alk Pase anti-Ratte-Ig
verwendet wurde. Zwei Ratten mit Antikörpern mit hohem Titer wurden
erneut immunisiert und 4 Tage später
geopfert, um zur Präparation
von Hybridomen eine Fusion von Milzzellen mit HAT-sensitiven Sp2/0
Stammzellen durchzuführen.
Hybridome wurden per ELISA überprüft (56/960+ve),
subkloniert und gefroren (–70°C). Für weitere
Spezifitätstests
der anti-OX-2 Mabs können
CHO-Zellen mit einem pBK eukaryotischen Expressionsvektor transfiziert
werden (Stratagene, CA), der OX-2 exprimiert. OX-2 cDNA ganzer Länge, einschließlich der
Leader-Sequenz, wurde aus DC2.4-Zellen amplifiziert, unter Verwendung
von Sense- und Antisense-Primern,
die für
eine direktionale Klonierung in den Vektor jeweils mit SpeI oder
XbaI-Stellen an ihren 5'-Enden
konstruiert waren. Durch Agarose-Gel-Elektrophorese erhielt man eine Bande
der erwarteten Größe (849bp).
Die Sequenz der klonierten cDNA wurde durch Sequenzierung mithilfe
eines automatisierten DNA-Sequenzers bestätigt (Chen, Z. und Gorczynski,
R.M. 1997. Biochem. Biophys. Acta. 100, befindet sich im Druck).
CHO-Zellen wurden durch Elektroporation (5 × 106 Zellen
in 0,5ml wurden bei 960MH2 und 120V unter
Verwendung eines Bio-Rad
Gene Pulser gepulst (Bio-Rad, Hercules, CA)), unter Verwendung des Plasmids
mit OX-2-Expression ganzer Länge
zusammen mit einem die Puromycin-Resistenz codierenden Plasmid (100:1
Verhältnis)
transfiziert, gefolgt von einer Auswahl in Puromycin (12μg/ml 4 Tage
lang). Puromycin-resistente Zellen wurden durch begrenzte Verdünnung kloniert.
5 CHO-transfizierende Klone wurden erhalten, die wie durch PCR bestätigt mRNA
für OX-2
exprimierten. Diese Klone können
für die Überprüfung auf vermeintliche
anti-Maus OX-2 Mabs der Ratte verwendet werden.
-
(a) FACS-Färbung von
Zellen pv-immunisierter Mäuse
mit anti-Maus OX-2
-
Es
wurde eine 4-fache Steigerung der Färbung von Milz- und hepatischen
NLDC145+-Zellen (dendritischer Zellmarker) von mit anti-Ratte OX-290
pv-immunisierten
Mäusen
beobachtet. Milz- und Lebergewebe von Mäusen können zu verschiedenen Zeiten
(12 Std.; 2, 7 und 14 Tagen) nach der pv-Immunisierung abgetrennt
und unter Verwendung von anti-NLDC 145, anti-OX-2 Mabs per Immunhistochemie
gefärbt
werden. Einzelne Zellsuspensionen aus denselben Geweben können unter
Verwendung von 3-farbiger FACS mit FITC-anti-Maus OX-2, Rhodamin-anti-NLDC
145 und Phykoerythrin-anti-T200 (Maus-Lymphozytenmarker) gefärbt werden.
In beiden Fällen
(sowohl FACS als auch Immunhistochemie) sind die passenden irrelevanten
Isotop-Kontroll-Antikörper
beinhaltet. Auch Gewebe aus Kontrollmäusen, die nur Nierentransplantate
oder diese nach zusätzlicher
iv-Immunisierung erhalten, können
untersucht werden. Der Nachweis von NLDC145+ (und/oder MAC-1+)-Zellen,
die eine gesteigerte Expression von OX-2 zeigen, wird nur für pv-immunisierte Mäusen vorhergesagt
(siehe Gorczynski, R. M. et al. 1998. J. Immunol. 160, befindet
sich im Druck). Der Erfinder hat gezeigt, dass DC-verbundene Antigene
nur in Tieren mit überlebenden
Transplantaten beständig sind
(Gorczynski, R. M., Chen, Z., Zeng, H. und Fu, X. M. 1998. Transplantation,
eingereicht). Außerdem
wurde bewertet, ob anti-OX-2, das zu verschiedenen Zeitpunkten nach
der Transplantation per Infusion verabreicht wurde, Abstoßungen verursacht
(b).
-
(b) Modulierung von Transplantatabstoßung und
Zytokinproduktion durch anti-Maus OX-2
-
C3H-Mäuse erhalten
pv-Immunisierung mit kultivierten C57BL/6 aus Knochenmark derivierten
dendritischen Zellen (DC), CsA und Nierenallotransplantate. Gruppen
von Mäusen
erhalten intravenöse
Infusionen verschiedener Ratte-anti-Maus OX-2-Mabs (100-500μg/Maus, x5
in 2-tägigen
Intervallen), beginnend zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Transplantation
(hierbei orientiert man sich an Daten aus (a)). Serumcreatinin und
tierisches Überleben
werden verfolgt. Serum aus mit Mab behandelten Mäusen wurde in ELISA und durch
FACS mit OX-2 exprimierenden CHO-Transfektanten (oben) getestet,
um Antikörper-Überschuss
zu garantieren. Falls die OX-2-Expression wichtig für die pv-induzierte
gesteigerte Überlebenszeit
von Transplantaten ist, werden die mit anti-OX-2 behandelten, pv-immunisierten
Mäuse Transplantate
genau wie die unbehandelten Kontrollen abstoßen, mit einer ähnlichen
Polarisierung der Zytokinproduktion hin zu Typ-1-Zytokinen (getestet
durch PCR; ELISA mit kultivierten, erneut stimulierten Zellen).
Als Kontrollen erhalten pv-immunisierte, transplantierte Mäuse anti-CD28
und anti-CTLA4; diese Mabs modifizieren die Auswirkungen der pv-Immunisierung,
wie sie durch Assays der Überlebenszeit
von Transplantaten oder der Polarisierung der Zytokinproduktion
getestet werden, nicht. Es wird erwartet, dass eine Behandlung mit
OX-2, jedoch nicht mit anderen Mabs, gleichzeitig die Expansion
von γδCR+-Zellen
nach der pv-Immunisierung zerstören
wird.
-
BEISPIEL 6
-
Präparation eines Fusionsproteins,
das die extrazelluläre
Domäne
von OX-2 an Maus-Fc bindet
-
Immunadhäsine, in
denen auf cDNA-Niveau ein hybrides Molekül durch die Fusion der extrazellulären Domäne (ED)
eines Adhäsionsmoleküls mit dem
Carboxyl- Terminus
von IgG-Schwerketten geschaffen wird, wobei das Ganze in Säugetierzellen
oder in einem Baculovirussystem exprimiert wird, haben sich bei
der Identifizierung und Isolierung der Gegenliganden für das jeweilige
Adhäsionsmolekül als äußerst hilfreich
erwiesen. Es wurden auf diese Art Liganden für eine Vielzahl von Mitgliedern
der TNFR-Familie identifiziert (Goodwin, R.G. et al. 1993. Eur.
J. Immunol. 23, 2631-2641; Gruss, H. und Dower, S. 1995. Blood 85,
3378-3404). Das Interesse an einem potentiellen Einsatz von Immunadhäsinen als
therapeutische Wirkstoffe ist gewachsen. Ein CTLA4-Immunadhäsin mit
der Kapazität,
sowohl B7-1 als auch B7-2 zu binden, wurde verwendet, um T-Zellen-Kostimulation zu
hemmen und das Niveau der Abstoßung
zu verringern (Larsen, C. P. et al. 1996. Nature 381, 434-438).
Es sei zu beachten, dass CD28/CTLA4 keine Gegenliganden für OX-289
sind. Vom Fusionsprotein wird erwartet, dass es die Zytokinproduktion
verändern
(gesteigerte IL-4, IL-10; verringerte IL-2, IFNγ) und die Überlebenszeit von Nierentransplantaten ähnlich wie
die pv-Immunisierung steigern wird. Wir erwarten, dass die synergetische
Blockade der Kostimulation (z. B. durch CTLA4-Fc) und die Auslösung eines
ko-regulierenden „Pathway" (durch OX-2ED-Fc)
Toleranz induzieren und die Überlebenszeit
von Transplantaten unendlich verlängern wird.
-
a) Konstruktion eines
OX-2 Fusionsproteins mit murinem IgGFc2a
-
Eine
die extrazelluläre
Region von OX-2 (OX-2ED) codierende cDNA wurde per PCR amplifiziert,
unter Verwendung eines 5'-Oligonukleotid-Primers,
der eine Sal1-Stelle-5' sofort
am Beginn der V-Region-Sequenz insertiert, und eines 3'-Primers, der eine BamH1-Stelle am 3'-Ende (der Stelle
der Verbindung mit Fc) schafft. Unter Verwendung von cDNA, die aus
Con-A aktivierten Milzzellen der Maus mit einem 5'-Primer, der eine
SpeI-Stelle enthielt und einem 3'-Primer,
der eine Sal1-Stelle enthielt, präpariert wurde, wurde das Signalpeptid
für IL-6
(SP-IL-6) per PCR amplifiziert und zu dem OX-2ED-Amplicon ligiert.
Die „in-frame"-Ligation über die Verbindung von SP-IL-6
und OX-2ED wurde durch manuelle Sequenzierung kontrolliert – die sich
ergebende cDNA, die durch den 5'SP-IL-6-Primer und den 3'OX-2ED-Primer amplifiziert
worden war, lag, wie erwartet bei 695bp. Es wurde ein Plasmid von
Dr. Terry Strom (Zheng, X. X. et al. 1995. Journal of Immunology. 154,
5590-5600) erstanden, welches murine IgGFc2a (Fcγ2a) exprimierte und modifiziert
worden war, um eine einzigartige BamH1-Stelle zu schaffen, die den
ersten Codon der Scharnierregion überspannt und mit einer einzigartigen
XbaI-Stelle 3' zum
Terminationscodon. Das IgGFc2a in diesem Insert wurde außerdem so
modifiziert, dass es das C1q-Bindungsmotiv ersetzte (und dieses
nicht lytisch machte) und die FcγR1-Bindungsstelle
deaktivierte (siehe Zheng, X.X. et al. 1995. Journal of Immunology.
154, 5590-5600). Die Ligation von OX-2ED und IgGFc2a in dem richtigen
Leserahmen an der BamH1-Stelle erzielt einen 1446bp langen offenen Leserahmen,
der ein einzelnes 478-Aminosäurepolypeptid
codiert (einschließlich
des 24-Aminosäuren-IL-6-Signalpeptids).
Das Homodimer weist ein geschätztes
Molekulargewicht von 105kDa auf, ausschließlich Glykosylierung. Das Fusionsgen
wird dann als eine SpeI-XbaI-Kassette in das eukaryotische Expressionsplasmid
pBK/CMV kloniert (Stratagene, CA). Dieses Plasmid weist einen CMV-Promoter/Enhancer
und ein Neomycinresistenzgen für
die Auswahl mithilfe von G418 auf. Die passende genetische Konstruktion
der OX-2ED-Fc kann durch direkte Sequenzierung nach der Klonierung
in den Plasmidvektor bestätigt
werden (Chen, Z. und Gorczynski, R. M. 1997. Biochem. Biophys. Acta.
100, befindet sich im Druck) – siehe
auch oben. Das Plasmid wird durch Elektroporation (siehe oben) in
CHO-Zellen transfiziert und im Medium mit 1,5mg/ml G418 ausgewählt (Geneticin:Life
Technologies, Inc.). Nach der Subklonierung werden stark produktive
Klone durch die Überprüfung von überschüssigen Flüssigkeiten
der Kulturen in ELISA unter Verwendung von anti-OX-2 Mabs als Capture-Antikörper und
Alk Pase gekoppelt mit anti-IgGFc2a als Detektionsantikörper ausgewählt. Das
OX-2ED-Fc-Fusionsprotein wird aus überschüssigen Flüssigkeiten der Kulturen unter
Verwendung von Affinitätschromatographie
an Protein-A-Sepharose gereinigt, gegen PBS dialysiert, filtersterilisiert
und in Aliquots bei –20°C gelagert.
Die Größe und OX-2(+IgGFc2a)-Spezifität des sezernierten
Produkts kann, mit Mabs zu OX-2 und monoklonalen anti-Maus-IgGFc2a
der Ratte (Pharmingen) mithilfe der Western-Blot-Analyse unter reduzierenden (+DTT)
und nicht reduzierenden (-DTT) Bedingungen bestätigt werden. Das Produkt kann
als ein Hemmstoff für
FACS- Färbung von
OX-2 exprimierenden CHO-Zellen (siehe oben) getitert werden, unter
Verwendung von Ratten-Mabs zu OX-2 als Sonde. Das Vorspiel zu Studien
(unten), die OX-2ED-Fc in vivo verwenden, bildet eine Studie der
Halbwertszeit (t½)
in Mausserum nach der Injektion von Gruppen von 6 8-wöchigen C3H-Mäusen. Dies
geschieht, indem Mäuse
iv-Injektionen mit 50μg
oder 10μg OX-2ED-Fc
verabreicht bekommen und dann serielle 50μl-Blutproben nach 0,3, 1, 6,
24, 48, 72 und 96 Stunden entnommen werden. Das Serum wird in ELISA
unter Verwendung von Platten analysiert, die mit anti-OX-2 als Capture-Antikörper und
mit Alk Pase gekoppelte monoklonale anti-IgGFc2a zur Detektion beschichtet
sind (wodurch sichergestellt wird, dass das Assay nur OX-2ED-Fc
nachweist und nicht OX-2 oder IgGFC2a allein). Basierend auf früheren Daten,
in denen Fc-Fusionsproteine zur Verlängerung der an vivo Halbwertszeit
verwendet wurden, wird eine t½ im
Bereich von 30-40 Std. erwartet (Zheng, X. X. et al. 1995. Journal
of Immunology. 154, 5590-5600).
-
b) OX-2:IgGFc-Immunadhäsion hemmt
MLR
-
CHO-Zellen
wurden mit einem das OX-2:Fc-cDNA-Insert tragenden Vektor transfiziert. Überschüssige Flüssigkeiten
wurden nach 7 Tagen aus den CHO-Zellen geerntet und mit 5 × 106 LEW-Milzzellen und 2,5 × 106 bestrahlten
LBNFI-Milzzellen kultiviert. Die überschüssigen Flüssigkeiten enthielten 50ng/ml
OX-2:Fc.
-
Die
Ergebnisse, die in Tabelle 5 gezeigt werden, machen deutlich, dass
die lösliche
OX-2:Fc-Immunadhäsion
die IL-2-Produktion und Erzeugung zytotoxischer T-Zellen hemmt und
IL-4-Produktion induziert. Diese Ergebnisse stützen eine Verwendung von OX-2
als ein Immunsuppressivum.
-
c) Verwendung von OX-2:Fc
in vivo zur Vorbeugung von Transplantatabstoβungen
-
Unter
(b) wurde gezeigt, dass eine Inkubation in Präsenz von 50ng/ml OX-2:Fc eine MLR-Reaktion
in vitro hemmen kann. Um die Hemmung von in vivo Transplantatabstoßungen nachzuweisen,
erhielten C3H-Mäuse
C57BL/6-Hauttransplantante
zusammen mit iv-Injektionen von OX-2:Fc (50μg/Maus), alle 2 Tage × 4 Injektionen.
Nach 10 Tagen wurden die Transplantate täglich auf Abstoßung hin
untersucht. In einer anderen Studie wurden 3 Mäuse/Gruppe (die Salzlösung oder
OX-2:Fc erhielten) nach 10 Tagen geopfert und Milzzellen in vitro
(× 48
Std.) erneut stimuliert, um die Zytokinproduktion analysieren zu
können.
Die Daten für
diese Studien werden in Tabellen 6 und 7 gezeigt. Aus diesen Daten
geht eindeutig hervor, dass OX-2:Fc das Potenzial zur Verwendung
als ein Immunsuppressivum aufweist, um die Akzeptanz von Transplantaten
zu verlängern.
Ferner verändert
OX-2:Fc, in Verbindung mit der gesteigerten Überlebenszeit von Transplantaten
in diesem Modell, die Polarisierung der Zytokinproduktion, wie bereits
für spenderspezifische
Immunisierung über
die Pfortader beschrieben worden ist.
-
BEISPIEL 7
-
OX-2 beugt Fehlgeburten
vor
-
Unter
Verwendung von Hybridisierung in situ hat der Erfinder gezeigt,
dass OX-2 nicht in der Plazenta von Mäusen mit gesteigertem Fehlgeburtenpotenzial
exprimiert wird. Im Gegensatz dazu wird OX-2 in der Plazenta normaler,
nicht für
Aborte anfälliger
Mäuse exprimiert.
-
Es
wurden CBA/J- und DBA/2J-Mäuse
verwendet. Paarungen von CBA/J (Weibchen) mit DBA/2J Männchen zeigen
ein hohes Vorkommen von Fehlgeburten (>80%), was beim umgekehrten Szenario nicht
der Fall ist. Plazentale Gewebe wurden Paarungen nach 8-11 Tagen
Gestation entnommen. Uteri wurden schockgefroren, 5μm Abschnitte
geschnitten und mit einer biotinylierten Antisense-Sonde für murines
OX-2 gefärbt. Die
in 18A und 18B gezeigten
Daten weisen auf eine gesteigerte Expression von OX-2 mRNA (in situ
Markierung) in der nicht abortierenden Rassenkombination hin, während in
der abortierenden Kombination die Expression fast völlig fehlt.
Diese Daten stehen mit der Auffassung im Einklang, dass OX-2-Expression dem
spontanen Fehlgeburt-Syndrom vorbeugt.
-
Während die
vorliegende Erfindung mit Bezug auf die derzeit als bevorzugt geltenden
Beispiele beschrieben worden ist, sollte deutlich sein, dass sich
die Erfindung nicht auf die offengelegten Beispiele beschränkt.
-
TABELLE 1
-
Zusammenfassung
der Sequenzen und Klone, die in der cDNA-Bibliothek pv-immunisierter Mäuse nachgewiesen
wurden.
| Treffer
Kategorien | Anzahl
repräsentierter
Klone (%) |
| Bekannte
Maus-Gene | 30
(45) |
| Nicht
Maus-Gene | 14
(21) |
| Kein
Treffer in der Datenbank | 22
(34) |
-
Fußnoten:
-
- Gene wurden als „Treffer" bezeichnet, wenn
sie eine BLAST-Zahl von >250
mit einem Minimum von 50bp-Ausrichtung aufwiesen.
-
TABELLE 2
-
Zytokinproduktion
in Zellen von Mäusen,
die pv-Immunisierung und anti-Ratte-OX-2 erhielten. Den
Empfängern
verabreichte Mabs
a Zytokin-Niveaus in überschüssigen Flüssigkeiten
von Kulturen
b -
Fußnoten:
-
- a. In jedem Experiment wurden 3 C3H Mäuse/Gruppe verwendet. Alle
Tiere erhielten wie unter Materialien und Methoden beschrieben CsA
und C57BL/6 Nierentransplantate. Die Mäuse in der unteren Hälfte der
Tabelle erhielten außerdem
pv-Infusionen mit 15 × 106 C57BL/6 aus Knochenmark derivierten dendritischen
Zellen am Tag der Transplantation. Dort, wo monoklonale Antikörper verabreicht
wurden, geschah dies mit einer Dosis von 100mg/Maus, × 4 Dosen
in 2-tägigen
Intervallen. Alle Mäuse
wurden 14 Tage nach der Transplantation geopfert. Milzzellen aus
einzelnen Tieren wurden dreifach 40 Std. lang in einer 1:1-Mischung
mit bestrahlten C57BL/6-Milzstimulatorzellen kultiviert.
- b. Das arithmetische Mittel (±SD) für dreifache Bestimmungen aus
einzelnen Proben der in der ersten Spalte beschriebenen Tiere. Alle
Zytokine wurden per ELISA getestet. IL-2, IL-4 und IL-10 sind als
pg/ml gezeigt, IFNg als ng/ml. Die Daten wurden aus 2 solchen Studien
gesammelt (insgesamt 6 einzelne Mäuse getestet/Gruppe).
- *stellt wesentliche Unterschiede zu Kontrollgruppe mit keinem
Mab dar (p<0,02).
-
TABELLE
3 FACS-Färbung von
PBL und an der Milz haftenden Zellen in verschiedenen Spezies, unter
Verwendung von anti-OX-2-Mabs
-
Fußnoten:
-
- a Frische Zellen wurden aus normalen
menschlichen Spendern (PBL), toten Transplantatspendern (menschliche
Milz) oder erwachsenen (8-10 Wochen) Spendermäusen oder -ratten entnommen.
Für jeden
getesteten Mab wurden jeweils dieselben 3 einzelnen Gewebespender
verwendet.
- b Spender-Vorbehandlung bezieht sich
auf die Infusion allogener Knochenmarkszellen in die Pfortader (C57BL/6
für C3H-Spendermäuse; BN
für LEW-Spenderratten)
4 Tage vor der Ernte von PBL oder Milz (siehe Text und (6)).
- c Arithmetisches Mittel (+SD) für Prozentsatz
von Zellen, die in 3 unabhängigen
Assays gefärbt
wurden. Kontroll-Antikörper
(FITC anti-Maus IgG (für
anti-Mensch oder anti-Ratte Mabs) oder FITC anti-Ratte IgG für anti-Maus
Mabs) ergaben keine wesentliche Färbung über Hintergrund (<0,2%).
-
TABELLE 4
-
Typ-1
Zytokinproduktion in MLR-Kulturen wird durch anti-OX-2 Mabs gesteigert.
-
-
-
Fußnoten:
-
- a. MLR-Kulturen wurden wie unter
Materialien und Methoden beschrieben angesetzt. Bei den menschlichen MLR-Kulturen
wurden 3 verschiedene Responder-Präparationen
für jeden
Mab verwendet und mit einer Sammlung von mit Mitomycin C behandelten
Milz-Stimulatorzellen stimuliert (aus einer wahllosen Mischung von
6 Milzspendern) behandelt. Bei den Maus-(C3H anti-C57BL/6) und Ratte-(LEW
anti-BN)MLR-Kulturen wurden
alle Assays für
jeden Mab dreifach angesetzt. Maus-Milzresponderzellen stammten aus Mäusen, die 4
Tage zuvor über
eine Pfortader-Infusion
mit C57BL/6-Knochenmarkszellen behandelt worden waren, mit Ausnahme
der als (Keine**) gezeigten Daten, wo die Responderzellen aus nicht
injizierten C3H-Mäusen stammten.
Mab wurde als eine 30% Konzentration überschüssiger Flüssigkeiten zugegeben. Überschüssige Flüssigkeiten
wurden nach 60 Std. für
Zytokin-Assays geerntet.
- b. Daten zeigen das arithmetische Mittel
(+SD) für
jeden Mab. Bei den Maus-Assays wurden alle überschüssigen Flüssigkeiten mithilfe von Bioassays
auf eine Anzahl von Zytokinen (ELISA) und auf IL-2/IL-6 hin getestet (Proliferation
von jeweils CTLL-2, B9). Überschüssige Flüssigkeiten
aus Ratte-/Mensch-Kulturen wurden nur in Bioassays getestet. Es
ist zu beachten, dass mit Isotyp-Kontroll-Igs (ELISA oder FACS zufolge
nicht reaktiv) inkubierte Zellen Zytokindaten abgaben, die von denen
aus Kulturen, die in Abwesenheit von Mab inkubiert worden waren,
nicht zu unterscheiden waren. p<0,05,
verglichen mit Kulturen ohne Mabs.
-
TABELLE
5 OX-2:Fc
Immunadhäsin
hemmt die gemischte Leukozytenreaktion in vitro
-
Fußnoten:
-
- a Überschüssige Flüssigkeiten wurden nach 7 Tagen
aus CHO-Zellen geerntet, die mit einem Kontroll-pbK-Vektor oder
einem Vektor transduziert wurden, der ein ein OX-2 codierendes cDNA-Insert
verbunden mit murinen Fc trägt.
Eine 1:1 Mischung überschüssiger Flüssigkeiten
wurde in Kulturen verwendet, die 5 × 106 LEW-Milz
und 2,5 × 106 bestrahlte LBNF1-Milzzellen enthielten;
dies entspricht 50ng/ml OX-2:Fc.
- b und c Prozentuale
Lysis mit Zellen nach 5 Tagen, unter Verwendung von 1 × 104 51Cr BN-Milz-ConA-Zielen; Zytokine
in überschüssigen Flüssigkeiten
der Kulturen nach 60 Std.
-
TABELLE
6 Hemmung
der Abstoßung
von Hauttransplantaten durch OX-2:Fc.
-
Fußnoten:
-
- 6 Mäuse/Gruppe
wurden wie gezeigt behandelt.
- NULL weist auf die Infusion von nur normalem Maus-IgG hin.
- Arithmetisches Mittel (+SD) der Überlebenszeit von Transplantaten
pro Gruppe.
-
TABELLE 7
-
Mäuse, die
Hauttransplantate erhalten hatten, bekamen per Infusion OX-2:Fc
verabreicht, was die Polarisierung der Zytokinproduktion rückgängig machte.
-
-
Fußnoten:
-
- 3 Mäuse/Gruppe
erhielten iv-Infusionen mit Salzlösung oder OX-2:Fc (50mg/Maus),
alle 2 Tage × 4,
ab dem Zeitpunkt der Transplantation von C57BL/6-Haut. Die Mäuse wurden
nach 10 Tagen geopfert und die Milzzellen in vitro mit bestrahlten
C57BL/6-Milzstimulatorzellen
stimuliert.
- Das Arithmetische Mittel (+SD) für IL-2/IL-4 in überschüssigen Flüssigkeiten
nach 48 Std. Die Daten wurden für
jede Mausmilz aus dreifachen Kulturen gesammelt.
-
VOLLSTÄNDIGE ZITATE
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oder der Isotop-Kontrolle (Klon 107.3, -∇-) oder von Antikörpern zu Maus-CD28
oder CTLA4 (-*-). Die Überlebensrate bei Tieren der verschiedenen gezeigten Gruppen wurde aus 2 Studien gesammelt. Es ist zu beachten, dass die Maus-Isotop-Kontrolle selbst keine Modifikation der gesteigerten Nierentransplantatlebensdauer nach pv-Immunisierung produzierte (*p<0,02, Mann-Whitney U-Test).
