DE60132699T2 - Nukleinsäuren und polypeptide, die sich auf b7 beziehen und ihre verwendungen zur immunmodulierung - Google Patents

Nukleinsäuren und polypeptide, die sich auf b7 beziehen und ihre verwendungen zur immunmodulierung Download PDF

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Description

  • VERWANDTE ANMELDUNGEN
  • Die vorliegende Patentanmeldung ist eine Teilfortführungsanmeldung der US-Patentanmeldung mit Aktenzeichen 60/209 811, eingereicht am 6. Juni, 2000 und der US-Patentanmeldung mit Aktenzeichen 60/272 107, eingereicht am 28. Februar, 2001.
  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft isolierte Nucleinsäuren, die B7-verwandte Polypeptide codieren, die als BSL2 bezeichnet werden und die Zellen modulieren, die für Immun- und Entzündungsreaktionen von Bedeutung sind, wie beispielsweise T-Zellen. BSL1 und BSL3 werden hierin ebenfalls beschrieben. Ebenfalls damit im Zusammenhang stehen Expressionsvektoren und Fusionskonstrukte, die Nucleinsäuren aufweisen, die B7-verwandte Polypeptide codieren. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die isolierten, B7-verwandten Polypeptide und Anti-Körper die speziell mit der B7-verwandten Polypeptide reaktionsfähig sind. Beschrieben werden hierhin B7-verwandte Polypeptide aufweisende, isolierte Fusionsproteine oder Teile der B7-verwandten Polypeptiden. Zusätzlich betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zum Isolieren und Identifizieren des/der entsprechenden Gegenrezeptors/Gegenrezeptoren der B7-verwandten Polypeptide, der Nutzung von B7-verwandten Polypeptiden oder Fusionsproteinen. Ebenfalls einbezogen sind Methoden der Immunmodulation eines Probanden durch die Verabreichung von Zusammensetzungen der B7-verwandten Polypeptide, Fusionsproteine, zugehöriger Antikörper oder Teilen oder Derivaten davon. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Methoden der Immunmodulation von Tier- oder Humanpatienten durch die Verabreichung von Zusammensetzungen gentechnisch veränderter Vektoren, die B7-verwandte Polypeptid Expressionskassetten aufweisen, wie sie hierin offenbart sind.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Die Primärrektion von T-Zellen unter Beteiligung einer T-Zellenaktivierung, Expansion und Differenzierung ist für die Auslösung einer Immunreaktion auf ein Fremd-Antigen entscheidend. Die Aktivierung von T-Zellen durch Antigen präsentierende Zellen (APC) erfordert mindestens zwei separate Signale (K. E. Hellstrom et al. (1996) Cancer Chemother. Pharmacol. 38: S 40-1; N. K. Damle et al. (1992) J. Immunol. 148: 1985–92; J. M. Green et al. (1994) Eur. J. Immunol. 24: 265–72; E. C. Guinan et al. (1994) Blond 84: 3261–82; J. W. Hodge et al. (1995) Cancer Res. 55: 3598–603). Das erste Signal bewirkt ein T-Zelleneintritt in den Zellzyklus und wird durch Fremd-Antigene die von dem Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) präsentiert werden, vermittelt. Das zweite Signal, das bezeichnet wird als "Costimulation", bewirkt eine Cytokin-Erzeugung und T-Zellenproliferation, ist jedoch weder antigenspezifisch noch MHC-restringiert (R. H. Schwartz (1990) Science 248: 1349–1356).
  • Man nimmt an, dass die Costimulation durch ein oder mehrere ausgeprägte Zelloberflächenmoleküle vermittelt wird, die durch APC's exprimiert werden (M. K. Jenkins et al. (1988) J. Immunol. 140: 3324–3330; P. S. Linsley et al. (1991) J. Exp. Med. 173: 721–730; C. D. Gimmi et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 6575–6579; J. W. Young et al. (1992) J. Clin. Invest. 90: 229–237; L. Koulova et al. (1991) J. Exp. Med. 173: 759–762; H. Reiser et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89–271–275; G. A. an-Seventer et al. (1990) J. Immunol 144: 4579–4586; J. M. LaSalle et al. (1991) J. Immunol. 147–774–80; M. I. Dustin et al. (1989) J. Exp. Med. 169: 503; R. J. Armitage et al. (1992) Nature 357: 80–82; Y.
  • Liu et al. (1992) J. Exp. Med. 175: 437–445). Deutliche Anzeigen legen nahe, dass es sich bei B7, einem APC-Zelloberflächenprotein, um ein derartiges costimulatorisches Molekül handelt (P. S. Linsley et al. (1991) J. Exp. Med. 173: 721–730; C. D. Gimmi et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 6575–6579; L. Koulova et al. (1991) J. Exp. Med. 173: 759–762; H. Reiser et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 271–275; P. S. Linsley et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 5031–5035; G. J. Freeman et al. (1991) J. Exp. Med. 174: 625–631).
  • Von B7 hat sich gezeigt, dass es an zwei Gegenrezeptoren (Liganden) bindet, die auf T-Zellen exprimiert sind, bezeichnet als CD28 und CTLA-4. An CD28 bindendes B7 induziert T-Zellen zur Proliferation und Secretion von IL-2 (P. S. Linsley et al. (1991) J. Exp. Med. 173, 721–730; C. D. Gimmi et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 6575–6579; C. B. Thompson et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1333–1337; C. H. June et al. (1990) Immunol. Today 11: 211–6; F. A. Harding et al. (1992) Nature 356: 607–609), wodurch eine volle T-Zellaktivierung möglich ist. Dem gegenüber vermittelt an CTLA-4 bindendes B7 eine T-Zell-Abwärtsregulierung. Die Bedeutung des B7:CD28/CTLA-4-costimmulatorischen Weges ist in vitro und in mehreren in vivo-Modellsystemen nachgewiesen worden. Die Blockade dieses Weges führt zu der Entwicklung einer antigenspezifischen Toleranz in Maus- und Humansystemen (F. A. Harding et al. (1992) Nature 356: 607–609; D. J. Lenschow et al. (1992) Science 257: 789–792; L. A. Turka et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 11102–11105; C. D. Gimmi et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6586–6590). Dem gegenüber induziert die ektopische Expression von B7 in B7-negativen, murinen Tumorzellen eine T-Zellen-vermittelte, spezifische Immunität begleitet von einer Tumorrejektion und einem lang andauernden Schutz gegenüber Tumorangriff (L. Chen et al. (1992) Cell 71: 1093–1102; S. E. Townsend et al. (1993) Science 259: 368–370; S. Gaskar et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5687–5690). Daher bietet eine Veränderung des B7:CD28/CTLA-4-Weges ein großes Potential zur Stimulierung oder Unterdrückung von Immunreaktionen in Menschen.
  • Zusätzlich zu dem bereits charakterisierten B7-Molekül (nachfolgend bezeichnet als B7-1) sind B7-1-ähnliche Moleküle identifiziert worden. Siehe hierzu zum Beispiel M. Azuma et al. (1993) Nature 366: 76–79; C. Chen et al. (1994) J. Immunol. 152: 4929–36; R. H. Reeves et al. (1997) Mamm. Genome 8: 581–582; K. Ishikawa et al. (1998) DNA Res. 5: 169–176; US-P-5 942 607 , erteilt am 24. August, 1999 an Freeman et al.). Insbesondere sind PD-L1 und PD-L2 als Inhibitoren für die T-Zellaktivierung identifiziert worden (G. J. Freeman et al. (2000) J. Exp. Med. 192: 1027–1034; Y. Latchman et al., (2001) Nature Immunology 2: 261–268), während B7-H1, B7-H3 und B7-DC als Costimulatoren einer T-Zellproliferation beschrieben worden sind (H. Dong et al. (1999) Nature Medicine 5: 1365–1369; A. I. Chapoval (2001) Nature Immunology 2: 269–274; Tseng et al. (2001) J. Exp. Med. 193(7): 839–45).
  • Daher gibt es eine wachsende Familie von Faktoren im Zusammenhang mit B7-1, die die T-Zellaktivierung modulieren (siehe die Übersichtsarbeit von J. Henry et al. (1999) Immunol. Today 20: 285–288). Die Identifikation, Isolierung und Charakterisierung von B7-verwandten Faktoren sind daher bedeutende Zielstellungen für ein weitergehendes Verständnis der T-Zellaktivierung und -funktion sowohl in einem normalen Zustand als auch in Krankheitszuständen bei Tieren und speziell Menschen. Dementsprechend offenbart die vorliegende Erfindung die Identifikation und Charakterisierung der drei B7-verwandten Faktoren, die bezeichnet werden als BSL1, BSL2 und BSL3. Ebenfalls werden zahlreiche Assays und Behandlungen unter Nutzung der BSL1-, BSL2- und BSL3-Faktoren offenbart.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Gewährung isolierter Nucleinsäuren, welche B7-verwandte Polypeptide codieren, die die inflammatorischen und Immunreaktionen modulieren und einschließlich die T-Zellaktivierung. B7-verwandte Polypeptide innerhalb des Schutzumfanges der Erfindung schließen Gegenrezeptoren auf der Oberfläche von APC's ein, die zum Binden von CD28- und/oder CD28-verwandten Liganden in der Lage sind. Speziell gilt dieses für B7-verwandte Polypeptide, bezeichnet als BSL2-Polypeptide, und lösliche Fragmente oder Derivate davon. Spezieller ist die B7-verwandte Nucleinsäure:
    • i) ein Nucleinsäuremolekül, das ein Polypeptid codiert, welches die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 11 oder 13 umfasst;
    • ii) ein Nucleinsäuremolekül, das die Aminsäuren 1–465 der SEQ ID NO: 7 codiert;
    • iii) ein Nucleinsäuremolekül, das ein Polypeptid codiert, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens zu 99% identisch ist mit der SEQ ID NO: 11;
    • iv) ein Nucleinsäuremolekül, das ein Polypeptid codiert, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens 99,5% identisch ist mit der SEQ ID NO: 13;
    • v) eine Nucleotidsequenz, die Polynucleotide umfasst, die die Aminosäuren 1–698 der SEQ ID NO: 9 codieren;
    • vi) eine Nucleotidsequenz, die Polynucleotide umfasst, die die Aminosäuren 2–698 der SEQ ID NO: 9 codieren;
    • vii) eine Nucleotidsequenz, die Polynucleotide umfasst, die die Aminnosäuren 69–698 von SEQ ID NO: 9 codieren;
    • viii) eine Nucleotidsequenz, die Nucleotide 1–2094 von SEQ ID NO: 8 umfasst;
    • ix) eine Nucleotidsequenz, die Nucleotide 4–2094 der SEQ ID NO: 8 umfasst;
    • x) eine Nucleotidsequenz, die Nucleotide 205–2094 der SEQ ID NO: 8 umfasst;
    • xi) ein Nucleinsäuremolekül, das die Nucleotidsequenz der SEQ ID NO: 6, 10 oder 12 umfasst;
    • xii) eine Nucleotidsequenz, die ein Polypeptid codiert, das die Aminosäuresequenz umfasst, die durch die DNA codiert wird, die in PTA-1987, in PTA-1988 oder PTA-1993 enthalten ist;
    • xiii) ein Nucleinsäuremolekül, das komplementär m der Sequenz des Nucleinsäuremoleküls nach einem der Punkte (i) bis (xi) ist; und
    • xiv) eine Nucleotidsequenz, die eine extrazelluläre Domäne einer Aminosäuresequenz codiert, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NO: 7, 11 und 13, und einer Nucleotidsequenz, die eine Fc-Domäne des Immunglobulins G codiert.
  • Darüber hinaus werden hierin Nucleinsäure-Sonden beschrieben, die zum Assayieren einer biologischen Probe auf Vorhandensein von APC's verwendbar sind, welche die BSL2-Faktoren exprimieren.
  • Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Schaffung von Vektoren (zum Beispiel Expressionsvektoren) und von Fusionskonstrukten, welche B7-verwandte Polypeptide codierende Nucleinsäuren umfassen. Expressionsvektoren leiten die Synthese der entsprechenden Polypeptide oder Peptide in einer Vielzahl von Wirten, speziell eukaryotischen Zellen, wie beispielsweise Säuger- und Insektenzellkultur, und prokaryotischen Zellen, wie beispielsweise Escherichia coli. Expressionsvektoren innerhalb des Schutzumfanges der Erfindung umfassen eine Nucleinsäuresequenz, die mindestens eines der B7-verwandten Polypeptide entsprechend der Beschreibung hierin codiert, sowie einen operativ mit der Nucleinsäuresequenz verbundenen Promotor. In einer der Ausführungsformen umfasst der Expressionsvektor eine DNA-Sequenz, die die extrazelluläre Domäne von BSL2 (SEQ ID NO: 7, 11 oder 13) codiert, die mit einer DNA-Sequenz fusioniert ist, welche die Fc-Region von Human-Immunglobulin G1 (IgG1) codiert. Derartige Expressionsvektoren können verwendet werden, um Wirtszellen zu transformieren oder transfizieren und dadurch Polypeptide oder Peptide und einschließlich Fusionsproteine oder -Peptide zu erzeugen, die von Nucleinsäuremolekülen codiert werden, wie hierin beschrieben wird.
  • Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Gewährung von B7-verwandten Polypeptiden, einschließlich die BSL2-Polypeptide oder Teile oder Derivate davon. Bevorzugte B7-verwandte Polypeptide umfassen die Aminosäuresequenzen des BSL2(SEQ ID NO: 7, 11 oder 13)-Polypeptide oder Teile davon. Diese Polypeptide umfassen mindestens einen Teil der voll entwickelten Formen der BSL2-Polypeptide und umfassen bevorzugt lösliche Formen dieser Polypeptide. Ebenfalls einbezogen in die vorliegende Erfindung sind Polypeptide, die mit der in der SEQ ID NO: 7, 11 oder 13 ausgeführten Aminosäuresequenz eine mäßige bis wesentliche Homologie teilen, wobei es sich bei den genannten SEQ ID NO: 7, 11 oder 13 um natürlich vorkommende Isoformen der BSL1-, BSL2- oder BSL3-Polypeptide oder modifizierten Rekombinanten Polypeptide handelt.
  • Eine noch andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Gewährung isolierter Fusionsproteine, die die B7-verwandten Polypeptide umfassen, oder Teile oder Derivate davon, wie sie hierin offenbart sind. In einem der Aspekte umfasst das Fusionsprotein einen extrazellulären Domäneabschnitt eines B7-verwandten Polypeptids, das mit einem anderen Polypeptid fusioniert ist, welches die Löslichkeit, die Reinigung, die Bindungsaffinität und/oder Valenz des B7-verwandten Polypeptids verändert. Bevorzugt kann ein DNA-Molekül, das einen extrazellulären Domänenabschnitt der BSL2-Polypeptide codiert, mit einer DNA verbunden werden, welche die Fc-Region von Human-IgG1 codiert, um DNA-Fusionsprodukte zu erzeugen, welche die BSL2-Ig-Fusionsproteine codieren.
  • Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Gewährung von Verfahren zum Isolieren und Identifizieren des/der entsprechenden Gegenrezeptors/Gegenrezeptoren der B7-verwandten Polypeptide, indem die isolierten, B7-verwandten Polypeptide, Fusionsproteine oder zugehörigen Antikörper genutzt werden, wie sie hierin offenbart sind. In einer der Ausführungsformen können isolierte BSL2-Polypeptide oder Teile davon mit Proteinextrakten inkubiert werden, die aus Zellen der Immun- oder inflammatorischen Reaktion erhalten wurden, wie beispielsweise T-Zellen, um einen BSL/Rezeptor-Komplex zu bilden, wonach mit Anti-BSL-Antikörpern inkubiert wird, um den BSL/Rezeptor-Komplex zu isolieren. Alternativ kann ein das BSL-2-Polypeptid aufweisendes Fusionsprotein mit Proteinextrakten inkubiert werden, die aus Zellen der Immun- oder inflammatorischen Reaktion erhalten wurden, wie beispielsweise T-Zellen, wonach mit Antikörpern inkubiert wird, die spezifisch mit dem Fusionsprotein reagieren. Rezeptoren, die an den B7-verwandten Polypeptiden binden, würden erwartungsgemäß eine signifikante, immunmodulatorische Aktivität besitzen.
  • Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Gewährung von diagnostischen Methoden und Kits unter Nutzung der B7-verwandten Faktoren der vorliegenden Erfindung und einschließlich Nucleinsäuren, Polypeptide, Antikörper oder funktionelle Fragmente davon. Derartige Faktoren können beispielsweise in diagnostischen Methoden und Kits zum Messen der Expressionswerte von B7-verwandten Faktoren und zum Screening auf verschiedene B7-verwandte Erkrankungen angewendet werden. Darüber hinaus können die hierin beschriebenen, B7-verwandten Nucleinsäuren verwendet werden, um chromosomale Anormalitäten zu identifizieren, die BSL2 beeinflussen, und um allele Varianten oder Mutationen von BSL2 in einem Individuum oder einer Population zu identifizieren.
  • Eine noch andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Gewährung von isolierten Antikörpern und einschließlich monoklonalen und polyklonalen Antikörpern, die spezifisch auf die B7-verwandten Polypeptide, Fusionsproteine oder Teile oder Derivate davon reaktionsfähig sind, wie sie hierin beschrieben werden. Bevorzugt werden monoklonale Antikörper hergestellt, die spezifisch auf die BSL2(SEQ ID NO: 7, 11 oder 13)-Polypeptide oder Teile oder Derivate davon reaktionsfähig sind.
  • Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Gewährung von Verfahren zur Immunmodulation eines Human- oder Tierprobanden durch Verabreichung von Zusammensetzungen der B7-verwandten Peptide, Fusionsproteine oder Teilen oder Derivaten davon, wie sie hierin offenbart werden. Derartige Zusammensetzungen würden erwartungsgemäß die Aktivitäten der Zellen der Immun- oder inflammatorischen Reaktion aufwärts oder abwärts regulieren (zum Beispiel T-Zellen). Beispielsweise können B7-verwandte Polypeptide in einer Zusammensetzung mit CD28 Wechselwirken und dadurch die Immunzellaktivität aufwärts regulieren. Alternativ können B7-verwandte Polypeptide in einer Zusammensetzung mit CTLA-4 Wechselwirken und dadurch die Immunzellaktivität abwärts regulieren. In einer der Ausführungsformen werden Zusammensetzungen von BSL2-Ig-Fusionsproteinen an einen Probanden beispielsweise via Injektion verabreicht, um eine systemische Immunsupression oder Immunstimulation herbeizuführen. Derartige Zusammenstetzungen können allein oder in Kombination mit einem oder mehreren immunmodulatorischen Molekülen verabreicht werden.
  • Eine noch andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Gewährung von Antikörpern, die spezifisch auf B7-verwandte Polypeptide, Fusionsproteine oder Teile oder Derivate davon reaktionsfähig sind, wie sie hierin zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Immunmodulation eines Human- oder Tier-Probanden offenbart werden. Derartige Zusammensetzungen können erwartungsgemäß die costimulatorischen Aktivitäten der B7-verwanten Polypeptide blockieren und die Zellen der Immun- oder inflammatorischen Reaktion (zum Beispiel T-Zellen) dementsprechend abwärts regulieren. In einer der Ausführungsformen werden Zusammensetzungen von monoklonalen Antikörpern, die spezifisch auf BSL2(SEQ ID NO: 7, 11 oder 13)-Polypeptide oder Fragmente davon reaktiv sind, beispielsweise via Injektion an einen Probanden verabreicht, um eine Immunsupression oder induzierte Toleranz herbeizuführen. Derartige Zusammensetzungen lassen sich allein oder in Kombination mit einem oder mehreren immunmodulatorischen Molekülen verabreichen. Die Verfahren zum Induzieren von Toleranz, wie sie hierin beschrieben werden, lassen sich prophylaktisch zur Verhütung von Immunreaktionen anwenden, wie beispielsweise Transplantatabstoßung (massives Organ oder Knochenmark) und Wirt-anti- Transplantat-Reaktion, speziell in autologer Knochenmarkstransplantation. Derartige Anwendungen können auch therapeutisch in der Behandlung von Autoimmunerkrankungen, Transplantatabstoßung und etablierter Wirt-anti-Transplantat-Reaktion in einem Probanden von Nutzen sein.
  • Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Gewährung von Anwendungen von genetisch bearbeiteten Vektoren oder Zellen, die B7-verwandte Polypeptid-Expressionskassetten aufweisen, wie sie hierin offenbart wurden, und zwar für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Immunmodulation eines Human- oder Tier-Probanden. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Zellen antigen-präsentierende Zellen, wie beispielsweise Macrophagen, die so transfiziert oder transduziert sind, dass sie eine Expression von einem oder mehreren der B7-verwandten Polypeptide und einschließlich der BSL2(SEQ ID NO: 7, 11 oder 13)-Polypeptide oder Fragmente oder Derivate davon ermöglichen, die dann beispielsweise via Transplantation in den Empfänger eingeführt werden. Gemäß der vorliegenden Erfindung können die die BSL2-Polypeptide codierenden Gene allein oder in Kombination mit Genen transfiziert oder transduziert werden, die andere immunmodulatorische Moleküle codieren.
  • Weitere Aufgaben und Vorteile, die durch die vorliegende Erfindung erzielt werden, werden anhand der detaillierten Beschreibung und der nachfolgenden Exemplifizierung offensichtlich.
  • BESCHREIBUNG DER FIGUREN
  • Die beigefügten Zeichnungen der Figuren werden zur eingehenderen Beschreibung der Erfindung präsentiert und um durch Klarstellung ihrer verschiedenen Aspekte das Verständnis zu fördern. In den Figuren der vorliegenden Erfindung werden die Nucleotide und Aminosäuresequenzen mithilfe von Abkürzungen in deren Einbuchstabencode dargestellt.
  • 1A bis 1C veranschaulichen das Nucleotid und die vorhergesagte Aminosäuresequenz von BSL1. 1A zeigt die Nucleotidsequenz von BSL1 (SEQ ID NO: 1), die aus dem Klon der vollen Länge ermittelt wurde, das aus einer cDNA-Bank isoliert wurde, die aus human-mikrovaskulären Endothelzellen erzeugt wurde, die mit TNF-Alpha behandelt wurden; Nucleotide 1–92 enthalten die 5'-nichttranslatierte Region; Nucleotide 93–95 enthalten das Translationsinitiationssignal (ATG); Nucleotide 93–962 codieren die Protein-codierende Region; Nucleotide 963–965 enthalten das Translationsterminationssignal (TAA); Nucleotide 963–1576 enthalten die 3'-nichttranslatierte Region und Nucleotide 1577–1605 enthalten den Poly(A)+RNA-Schwanz. 1B zeigt die vorhergesagte Aminosäuresequenz von BSL1 (SEQ ID NO: 2); Aminosäuren 1–240 enthalten die vorhergesagte extrazelluläre Domäne (ECD). 1C zeigt die Nucleotidsequenz von BSL1 (SEQ ID NO: 3), ermittelt aus dem Klon voller Länge, der aus einer cDNA-Bank isoliert wurden, die aus GM-CSF/IL-4-differentierten Human-Monocytenzellen erzeugt wurde; Nucelotide 1–92 enthalten die 5'-nichttranslatierte Region; Nucleotide 93–95 enthalten das Translationsinitiationssignal (ATG); Nucleotide 93–962 enthalten die Protein-codierende Sequenz; Nucleotide 963–965 enthalten das Translationsstopsignal (TAA) und Nucleotide 963–3621 enthalten die 3'-nichttranslatierte Region (eine einzige Sequenz ist in Fettdruck gezeigt).
  • 2A bis 2B veranschaulichen die Nucleotid- und vorhergesagte Aminosäuresequenz des BSL1-Ig-Fusionskonstruktes. 2A zeigt die Nucleotidsequenz des BSL1-Ig-Fusionskonstrukes Ig (SEQ ID NO: 4); Nucleotide 1–72 codieren die vorhergesagte CD5-Signalsequenz; Nucleotide 73–78 enthalten die SpeI-Restriktionsstelle; Nucleotide 78–729 codieren die vorhergesagte BSL1 ECD; Nucleotide 730–1440 codieren den Fc-Abschnitt von Human-IgG1; und Nucleotide 1441–1443 enthalten das Translationsstopsignal (TGA). 2B zeigt die BLS1-Ig-vorhergesagte Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 5).
  • 3A bis 3F veranschaulichen das Nucleotid und die vorhergesagten Aminosäuresequenzen von BSL2-Klonen. 3A zeigt die Nucleotidsequenz des BSL2-4616811-Klons (SEQ ID NO: 5); Nucleotide 1–12 schließen die Vektorsequenz ein; Nucleotide 121–123 enthalten das Translationsinitiationssignal (ATG); zwischen den Nucleotiden 204–205 befindet sich die vorhergesagte Signalpeptid-Spaltungsstelle; Nucleotide 1516–1587 codieren die vorhergesagte Transmembrandomäne; Nucleotide 1723–1725 enthalten das Translationsterminationssignal (TGA). 3B zeigt die vorhergesagte Aminosäuresequenz des BSL2-4616811-Klons (SEQ ID NO: 7); die Aminosäuren (1–465) enthalten die vorhergesagte ECD. 3C zeigt die Nucleotidsequenz des BSL-2-L165-21-Klons (SEQ ID NO: 10), Nucleotide 1–3 codieren das Translationsinitiationssignal (ATG); zwischen den Nucleotiden 84–85 befindet sich die vorhergesagte Signalpeptid-Spaltungsstelle; Nucleotide 742–813 codieren die vorhergesagte Transmembrandomäne; Nucleotide 949–951 enthalten das Translationsterminationssignal (TGA). 3D zeigt die vorhergesagte Aminosäuresequenz des BSL2-L165-21-Klons (SEQ ID NO: 11); die Aminosäuren 1–247 enthalten die vorhergesagte ECD. 3E zeigt die Nucleotidsequenz des BSL2-L165-35b-Kolons (SEQ ID NO: 12); die Nucleotide 1–3 codieren das Translationsinitiationssignal (ATG); zwischen den Nucleotiden 84–85 befindet sich die vorhergesagte Signalpeptid-Spaltungsstelle; die Nucleotide 742–813 codieren die vorhergesagte Transmembrandomäne; die Nucleotide 949–951 enthalten das Translationsterminationssignal (TGA). 3F zeigt die vorhergesagte Aminosäuresequenz des BSL2-L165-35b-Klons (SEQ ID NO: 13); die Aminosäuren 1–247 enthalten die vorhergesagt ECD.
  • 4A bis 4B veranschaulichen die Nucleotid- und vorhergesagten Aminosäuresequenzen des BSL2-4616811-Ig-Fusionskonstruktes. 4A zeigt die Nucleotidsequenz des BSL2-4616811-Ig-Ig-Klons (SEQ ID NO: 8); Nucleotide 1–3 enthalten das Translationsinitiationssignal (ATG); die Nucleotide 1–1394 codieren die native BSL2-4616811-Sequenz; Nucleotid 1395 ist eine stille Mutation, die eingeführt wurde, um die Konstruktion des Fusionsproteins zu erleichtern; die Nucleotide 1396–2097 codieren den Fc-Abschnitt des Human-IgG1; die Nucleotide 2095–2097 enthalten das Translationsterminationssignal (TGA). 4B zeigt die vorhergesagte Aminosäuresequenz des BSL2-4616811-Ig-Fusionsproteins (SEQ ID NO: 9); die Aminosäuren 1–465 enthalten die native Sequenz von BSL2-4616811; die Aminosäuren 466–698 enthalten die Fc-Domäne von Human-IgG.
  • 5A bis 5B veranschaulichen die Nucleotid- und vorhergesagte Aminosäuresequenz von BSL3. 5A zeigt die Nucleotidsequenz von BSL3 (SEQ ID No: 14); die Nucleotide 1–326 enthalten 5'-ungesättigte Region; die Nucleotide 327–329 enthalten das Translationsinitiationssignal (ATG); die Nucleotide 981–1055 codieren eine vorhergesagte Transmembrandomäne; die Nucleotide 1146–1148 enthalten das Translationsterminationssignal (TGA); 5B zeigt die BSL3-vorhergesagte Aminosäuresequenz (Aminosäuren 1–273) (SEQ ID NO: 15); die Aminosäuren 1–219 enthalten die vorhergesagte ECD.
  • 6A bis 6B veranschaulichen die Nucleotid- und vorhergesagten Aminosäuresequenzen des BSL3-Ig-Fusionskonstruktes; 6A zeigt die Nucleotidsequenz von BSL3-Ig (L232-6) (SEQ ID NO: 16); die Nucleotide 1–3 enthalten das Translationsinitiationssignal (ATG); die Nucleotide 1–651 codieren die native BSL3-Sequenz; die Nucleotide 652–654 codieren eine künstliche Sequenz, die während der Konstruktion eingeführt wird; die Nucleotide 655–1356 codieren die Fc-Domäne von Human-IgG; 6B zeigt die vorhergesagte Aminosäuresequenz von BSL3-Ig (L232-6) (SEQ ID NO: 17); die Aminosäuren 1–217 enthalten die native BSL3-Sequenz; die Aminosäure 218 enthält eine künstliche Sequenz, die während der Konstruktion eingeführt wird; die Aminosäuren 219–451 enthalten die Fc-Domäne von Human-IgG.
  • 7A bis 7H veranschaulichen die Reagenzien und Ergebnisse der Expressionsanalyse, die für BSL1, BSL2 und BSL3 ausgeführt wurde; 7A zeigt die Nucleotidsequenz der BSL1-Sonde (SEQ ID NO: 18), die für die Northern-Blot-Analyse verwendet wurde; 7B zeigt die Nucleotidsequenz der BSL2-Sonde (SEQ ID NO: 19), die für die Northern-Blot-Analyse verwendet wurde; 7C zeigt die Nucleotidsequenz der BSL3-Sonde (SEQ ID NO: 20); 7D zeigt die Werte von BSL1, BSL3 und BSL3 mRNA, die in verschiedenen Zelltypen beobachtet und mithilfe der Northern-Blot-Analyse bestimmt wurden; "PBT" bezeichnet T-Zellen des peripheren Bluts; "CD3/CD28" bezeichnet eine Stimulation mit Anti-CD3- und Anti-CD28-Antikörpern; "PMA" bezeichnet die Simulation mit Phorbol-12-myristat-13-acetat; "LPS" bezeichnet die Simulation mit Lipopolysaccharid; "PBM" bezeichnet Monozyten des peripheren Bluts; "PHA" bezeichnet die Stimulation mit Phytohämaglutinin; "GM-CSF/IL-4" bezeichnet die Stimulation mit GM-CSF und IL-4; "HMVEC" bezeichnet Human-microvaskuläre Endothelzellen; "TNF-alpha" bezeichnet die Simulation mit TNF-alpha; und "H292 (nüchtern)" bezeichnet H292-Zellen von Nüchtern-Serum; 7E zeigt BSL3-Expressionswerte in verschiedenen Gewebearten, die mithilfe der Northern-Blot-Analyse von kommerziell verfügbaren Blots bestimmt wurden, indem radiomarkierte BSL3/KpnI + XbaI-Sonde bestimmt wurden; 7F zeigt BSL3-Expressionswerte in verschiedenen Gewebearten, die mithilfe der Hybridisationsanalyse von kommerziell verfügbaren Mikroarrays unter Verwendung von radiomarkierter BSL3/KpnI + XbaI-Sonde bestimmt wurden; 7G zeigt BSL1-Expressionswerte in verschiedenen Gewebearten, die mithilfe der quantitativen PCR bestimmt wurden; 7H zeigt BSL3-Expressionswerte in verschiedenen Gewebearten, die mithilfe der quantitativen PCR bestimmt wurden.
  • 8A bis 8E veranschaulichen die Ergebnisse der PCR-Analyse, die zur Bestimmung der relativen Werte der BSL2-4616811- oder BSL2-L165-35b-Transkripte in verschiedenen Zelltypen mit oder ohne Stimulation ausgeführt wurden. Der obere Pfeil zeigt auf die BSL2-4616811-Transkripte repräsentierenden Bänder. Der untere Pfeil zeigt auf die Bänder, die das BSL2-L165-35b-Transkript repräsentieren. 8A zeigt die Ergebnisse für Raji, Ramos, PM-LCL und PL-LCL-Zelltypen mit oder ohne PMA und Ionomycin-Stimulation; 8B zeigt die Ergebnisse für CE-LCL-Zellen, HL60, Thp1 und HUVEC-Zelltypen mit oder ohne Stimulation; 8C zeigt die Ergebnisse für T-Zellen von peripherem Blut mit oder ohne PMA und Ionomycin-Stimulation. Die Ergebnisse von Zellen, die aus zwei separaten Spendern isoliert wurden, sind dargestellt (Spender 079 und Spender 124); 8D zeigt die Ergebnisse für CEM und HUT78-Zellen mit oder ohne PMA und Ionomycin-Stimulation; 8E zeigt die Ergebnisse für eine PCR-Reaktion unter Verwendung von BSL2-4616811-Plasmide als Template. Spur 1: Lambda BstEII DNA-Leiter; Spur 2: PCR-Produkt. Der obere Pfeil zeigt zu der Größe des vorhergesagten PCR-Produktes aus dem BSL2-4616811-Transkript. Der untere Pfeil zeigt zu der Größe des vorhergesagten PCR-Produktes für das BSL2-L165-35b-Transkript. Die Ergebnisse demonstrieren, dass der Vorwärtsprimer überwiegend die spezifische Bindungsstelle in der ersten variablen Faltung eher als bei der homologen Stelle in der zweiten variablen Faltung von BSL2-4616811 bindet.
  • 9A bis 9F veranschaulichen die Ergebnisse einer mithilfe der Fluoreszenz aktivierten Zellsortierung (FACS), die unter Verwendung von BSL1-, BSL2- und BSL3-monoklonalen Antikörper ausgeführt wurde; 9A zeigt die FACS-Analyse von A549-epithelen Lungenzellen unter Verwendung von BSL1-monoklonalen Antikörpern. Spalte 1: keine monoklonalen Antikörper; Spalte 2: Isotyp-Kontrolle; Spalte 3: BSL1-Hybridom-Überstand 32; 9B zeigt die FACS-Analyse von A549-epithelen Lungenzellen unter Verwendung von BSL2-4616811-monoklonalen Antikörpern. Spalte 1: keine monoklonalen Antikörper; Spalte 2: Isotyp-Kontrolle; Spalte 3: BSL2 MAb 1F7G2; Spalte 4: BSL2 Mab 2B10D7; Spalte 5: BSL2 Mab 3E6D3; Spalte 6: BSL2 Mab 4C2C6; Spalte 7: BSL2 Mab 5D7E2; 9C zeigt die FACS-Analyse verschiedener Zelltypen unter Verwendung von BSL3-monoklonalen Antikörpern; 9D zeigt die FACS-Analyse von Endothelzellen der Human-Nabelvene (HUVEC) mit oder ohne TNF-alpha-Stimulation unter Verwendung von BSL3-monoklonalen Antikörpern; 9E und 9F zeigen FACS-Analysen von Monocyten des peripheren Bluts (PBMC) mit oder ohne GM-CSF/IL4 oder PHA-Stimulation unter Verwendung BSL3-monoklonalen Antikörpern; 9E zeigt die Ergebnisse von Zellen, die vom Spender 126 isoliert wurden; 9F zeigt Ergebnisse von Zellen, die vom Spender 145 isoliert wurden.
  • 10A bis 10E veranschaulichen die Costimulation von T-Zellen des peripheren Bluts unter Verwendung von BSL2-4616811-Ig (BSL2vovolg)- und BSL3-Ig-Fusionsproteinen in Gegenwart von CD3-monoklonalem Antikörper. Das L6-Ig-Fusionsprotein wurde als negative Kontrolle verwendet; 10A zeigt Ergebnisse von Zellen, die von Spender 010 isoliert wurden; 10B zeigt Ergebnisse von Zellen, die vom Spender 127 isoliert wurden; 10C und 10D zeigen Ergebnisse von Zellen, die vom Spender 78 isoliert wurden; 10E und 10F zeigen Ergebnisse von Zellen, die vom Spender 124 isoliert wurden; 10G bis 10J veranschaulichen die Blockade der Costimulation von T-Zellen des peripheren Bluts unter Verwendung von BSL2- oder BSL3-monoklonalen Antikörpern; 10G und 10I zeigen die Ergebnisse von Zellen, die mit CD3-monoklonalen Antikörpern und BSL2-4616811-Ig (BSL2vovolg) stimuliert wurden und mit BSL2-monoklonalen Antikörpern blockiert wurden; Spalte 1: BSL2-1F7G2 MAb; Spalte 2: BSL2-2B10D7 MAb; Spalte 3: BSL2-3E6D3 MAb; Spalte 4: BSL2-5D7E2 MAb und Spalte 5: Kontrollantikörper vom Isotyp; 10G zeigt die Ergebnisse von Zellen, die vom Spender 010 isoliert wurden; 10I zeigt die Ergebnisse von Zellen, die vom Spender 127 isoliert wurden; 10H und 10J zeigen die Ergebnisse von Zellen, die mit CD3-monoklonalen Antikörpern und BSL3-Ig-Fusionsprotein stimuliert und mit BSL3-monoklonalen Antikörpern blockiert wurdne. Spalte 1: BSL3-1A4A1 MAb; Spalte 2: BSL3-2B6H7 MAb und Spalte 3: Kontrollantikörper vom Isotyp; 10H zeigt die Ergebnisse von Zellen, die vom Spender 010 isoliert wurden; 10J zeigt Ergebnisse von Zellen, die vom Spender 127 isoliert wurden.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • IDENTIFIKATION VON B7-VERWANDTEN FAKTOREN
  • Es sind drei B7-verwandte Faktoren mit der Bezeichnung BSL1, BSL2 und BSL3 identifiziert und charakterisiert worden. Diese B7-verwandten Faktoren können eine molekulare Grundlage für die Aktivierung von Zellen der Immun- und inflammatorischen Reaktion liefern, wie beispielsweise T-Zellen, und zwar zu unterschiedlichen Zeitpunkten und bei verschiedenen Erkrankungen und Krankheitszuständen. Darüber hinaus lassen sich die offenbarten, B7-verwandten Faktoren zur Verhütung oder Behandlung bestimmter Erkrankungen nutzen, indem die Aktivität von Zellen der Immun- oder inflammatorischen Reaktion moduliert wird, wie beispielsweise die T-Zellen, und die hierin im Detail beschriebenen Methoden zur Anwendung gelangen. Diese Methoden können als Pophylaxe oder für Behandlungen von Krebserkrankungen oder Immunität bezogenen Krankheiten angewendet werden, wie nachfolgend detailliert beschrieben wird.
  • IDENTIFIKATION VON B7-VERWANDTEN GENEN AUS CDNA-BANKEN:
  • Zur Identifikation von B7-verwandten Faktoren können cDNA-Banken konstruiert und unter Anwendung verschiedener gut etablierter Methoden analysiert werden. Es kann eine Messenger-RNA aus Zellen erhalten werden, die B7-1- und/oder B7-verwandte Faktoren exprimieren. Beispielsweise kann mRNA aus differenzierten mononucleären Zellen des peripheren Bluts des Menschen erhalten werden. Alternativ kann mRNA aus verschiedenen Unterreihen von neoplastischen B-Zellen und einschließlich Tumorzellen erhalten werden, die von Patienten mit Non-Hodgkin's-Lymphom isoliert werden (L. Chaperot et al. (1999) Exp. Hematol. 27: 479–88). Von diesen Zellen ist bekannt, dass sie B7-1 exprimieren und auf diese Weise B7-verwandte Faktoren exprimiert werden können und auch als eine Quelle für die nRNA zum Aufbau der cDNA-Bank dienen können.
  • Die gesamte zelluläre mRNA kann mithilfe einer Vielzahl von Methoden isoliert werden, wie beispielsweise der Guanidinium-Thiocyanat-Extraktion (J. M. Chirgwin et al. (1979) Biochemistry 18: 5294–5299; Chomczynski et al. (1987) Anal. Biochem. 162: 156–9). Nach der Isolation kann Poly(A)+ RNA unter Verwendung Oligo(dT)-Cellulose gereinigt werden. Die gereinigte Poly(A)+ RNA lässt sich sodann als ein Template für die cDNA-Synthese unter Einsatz der Umkehrtranskription-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR; siehe C. R. Newton et al. (1997) PCR 2. Ausgabe, Scientific Publishers, Oxford, England) verwendet werden. Nach der Umkehrtranskription kann die cDNA umgewandelt werden zu doppelsträngiger DNA, indem konventionelle Methoden zur Anwendung gelangen (siehe hierzu H. Okayama et al. (1982) Mol. Cell. Biol. 2: 161; U. Gubler et al. (1983) Gene 25: 263).
  • Das Klonieren der doppelsträngigen cDNA's lässt sich unter Anwendung von Methoden erreichen, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind (siehe hierzu J. Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, NY; F. M. Ausubel et al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY). Die Verwendung synthetischer Adaptoren vor dem Klonieren ist besonders bevorzugt, weil diese die notwendige Spaltung der cDNA mit einem oder mehreren Restriktionsenzymen hinfällig machen (siehe beispielsweise E. C. Bottger (1989) Biotechniques 7: 925–6, 928–90). Unter Anwendung dieser Methode können der DNA nicht-selbst komplementäre Kinase-Adaptoren vor der Ligation mit dem Vektor hinzugefügt werden. Es kann nahezu jeder beliebige Adaptor zum Einsatz gelangen.
  • Es kann eine cDNA-Bankfolge exprimiert werden, wenn sie in Sense-Orientierung in einen Vektor eingesetzt wird, der einen geeigneten Promotor liefert. Vektoren können auch einen Replikationsursprung enthalten und verschiedene Enhancersequenzen, gespleißte Akzeptor/Donatorsequenzen und Polyadenylierungssequenzen. In die Vektoren kann ferner ein Marker einbezogen sein, der die Selektion von Zellen ermöglicht, welche das Vektorkonstrukt enthalten. Bei den Markern kann es sich um ein induzierbares oder nichtinduzierbares Gen handeln, und er wird in der Regel eine positive Selektion unter Induktion bzw. ohne Induktion ermöglichen. Beispiele für Markergene schließen Neumycin- ein, Dihydrofolat-Reduktase, Glutamin-Synthetase und dergleichen. Vor allem lassen sich präparierte cDNA-Banken aus verschiedenen kommerziellen Quellen erhalten (zum Beispiel Incyte Genomics, Inc., St. Louis, MO; Stratagene, La Jolla, CA).
  • Die cDNA-Bank kann zum Klonieren von B7-verwandten Faktoren unter Ersatz von Methoden des Expressionsklonieren verwendet werden (siehe zum Beispiel B. Seed et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3365–3369; A. Aruffo et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 8573–8577). In einer der Ausführungsformen wird in eine Zelllinie mithilfe bekannter Methoden der Transfektion eine Plasmid-DNA eingesetzt (zum Beispiel DEAE-Dextran), wobei man die cDNA-Insertionen replizieren und exprimieren lässt. Das B7-1-Antigen wird von den transfizierten Zellen unter Verwendung eines Anti-B7-1-monoklonalen Antikörpers (zum Beispiel 133 und B1.1) und antimuriner IgG- und IgM-beschichteter immunomagnetischer Kügelchen abgereichert. Transfektanten, die B7-verwandte Faktoren exprimieren, werden positiv selektiert durch Inkubation mit CTLA-4-Ig und CD28-Ig, gefolgt von einem Panning mit Anti-Human-Ig-Immunoglobulin. Nach dem Panning wird von den Zellen, die einem Panning unterworfen worden waren episomale DNA gewonnen und in einen kompetenten, bakteriellen Wirt transfiziert, bevorzugt Escherichia coli (E. coli). Anschließend wird Plasmid-DNA erneut in die Zelllinie eingeführt und der Zyklus der Expression und des Pannings mindestens zweimal wiederholt. Nach dem letzten Panning-Zyklus wird aus einzelnen Kolonien Plasmid-DNA präpariert, in die Zelllinie transfiziert und auf Expression der B7-verwandten Polypeptide mithilfe einer indirekten Immunofluoreszenz mit CTLA-4-Ig und CD28-Ig analysiert. Nach dem Klonieren werden Plasmide aus den Klonen präpariert, die mit dem CTLA-4-Ig stark reaktiv sind, und anschließend unter Anwendung konventioneller Methoden des Sequenzierens sequenziert (Übersichtsarbeit bei G. W. Slater et al. (1998) Electrophoresis 19: 1525–41).
  • IDENTIFIKATION VON B7-VERWANDTEN GENEN IN PROTEINSEQUENZ-DATENBANKEN
  • Alternativ können B7-verwandte Faktoren mithilfe eines Screenings verfügbarer Sequenz-Datenbanken identifiziert werden. Die Polypeptidsequenz, die durch einen bereits identifizierten B7-Faktor (zum Beispiel B7-1, B7-2 oder B7-H1) oder einem B7-verwandten Faktor, wie er hierin offenbart wurde (zum beispiel BSL1, BSL2 oder BSL3) codiert wird, lässt sich mit den Polypeptidsequenzen vergleichen, die in den verschiedenen Protein-Datenbanken vorhanden sind. Öffentlich verfügbare Protein-Datenbanken, zum Beispiel GenBank, GenPept, SWISS-PROT, Protein Data Bank (PDB), Protein Information Resource (PIR), Human UniGene (National Center for Biotechnology Information), lassen sich verwenden, um festzustellen, ob zusätzlich B7-verwandte Faktoren in einer Sauger-Spezies und bevorzugt einem Menschen vorhanden sind. Alternativ lassen sich Proteinsequenz-Datenbanken im privaten Besitz, zum Beispiel die Incyte Genomics-Sequenz-Datenbank (Incyte Genomics) zur Identifikation von B7-verwandten Faktoren verwenden. Datenbanken mit relativ wenigen redundanten Sequenzen, zum Beispiel PIR oder SWISSPROT-Datenbanken, lassen sich zur Verbesserung der statistischen Signifikanz einer Sequenzanpassung benutzen. Allerdings sind Datenbanken bevorzugt, die umfangreicher und auf dem neusten Stand sind, zum Beispiel GenBank, GenPept und Incyte Genomics-Datenbanken (Incyte Genomics).
  • Zur Ausrichtung und zum Vergleich bereits identifizierter B7-Faktorsequenzen mit den Sequenzen, die in den Proteinsequenz-Datenbanken vorhanden sind, kann jede beliebige bekannte Methode zur Anwendung gelangen. Vorzugsweise wird das BLAST-Programm angewendet (S. F. Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403–410; S. Karlin et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci USA 87: 2264–68; S. Karlen et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873–7). Mit BLAST werden lokale Alignments zwischen der Sequenz des bereits identifizierten Proteins und der Proteinsequenzen in den Datenbanken identifiziert und die Wahrscheinlichkeit des lokalen Alignments vorhergesagt, das gelegentlich auftreten kann. Obgleich die BLAST-Originalprogramme, die für lückenfreie lokale Alignments genutzt werden, sind neuerlich entwickelte BLAST-Programme, wie beispielsweise WU-BLAST2/BLAST v2.0 (S. F. Altschul et al. (1996) Methods Enzymol. 266, 460–480) modifiziert worden, um gapped-local-Alignments ähnlich dem SSEARCH einzubauen (T. F. Smith et al. (1981) J. Mol. Biol. 147: 195–197) und FASIA-Programme (W. R. Pearson (1990) Methods Enzymol. 183: 63–98). Darüber hinaus sind "positionsspezifisch-iterierte BLAST-Programme" (PSI-BLAST) entwickelt worden, um schwache und jedoch biologisch relevante Sequenzähnlichkeiten zu identifizieren (S. F. Altschut et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389–3402). Darüber hinaus sind "pattern-hit-initiated BLAST"(PHI-BLAST)-Programme entworfen worden, um spezifische Muster oder Sequenzmotive zu identifizieren, die von entfernt verwandten Proteinen geteilt werden (Z. Zhang et al. (1998) Nucleic Acids Res. 26: 3986–3990). Ebenfalls stehen spezialisierte BLAST-Programme für die Ausführung einer Suche von Human-Mikrobiellen und Malaria-Genomsequenzen zur Verfügung, sowie für suchen auf Vektor-, Immunglobulin- und vorherbestimmte Human-Consensussequenzen (National Center für Biotechnology Information (NCBI), Bethesda, MD).
  • Sowohl das FASIA- als auch das BLAST-Programm identifizieren sehr kurze exakte Sequenzanpassungen zwischen der fraglichen Sequenz und den Datenbanksequenzen, analysieren die besten Kurzsequenzanpassungen ("Hits"), um zu ermitteln, ob längere Strecken einer Sequenzähnlichkeit vorliegen, und um dann die besten Hits durch dynamisches Programmieren zu optimieren (S. F. Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403–410; W. R. Pearson, supra). In Gegensatz dazu vergleicht das SSEARCH-Programm die fragliche Sequenz mit allen Sequenzen in der Datenbank über paarweise Sequenzvergleiche (T. F. Smith et al., supra). Daher wird das SSEARCH-Programm als sensibler angesehen als die BLAST- und FASTA-Programme, wobei es jedoch allerdings deutlich langsamer ist. Die BLAST- und FASTA-Programme nutzen mehrere Annäherungen zur Erhöhung der Suchgeschwindigkeit und nutzen statistische Parameter (siehe nachfolgend), um Empfindlichkeit und Selektivität zu erhöhen und sich in der Leistung des SSEARCH-Programms anzunähern. Ein spezielles Programm des Sequenz-Alignments lässt sich auf der Grundlage der Anforderungen an eine Sequenzsuche oder einzelner Präferenzen wählen. In einigen Fällen kann es notwendig sein, mehr als ein Alignment-Suchprogramm zu verwenden, um die Ergebnisse des gesuchten Alignments zu bestätigen oder nicht eindeutige Suchergebnisse aufzulösen.
  • In der BLAST-Analyse wird im typischen Fall eingesetzt: (i) eine Scoring-Matrix (wie beispielsweise BLOSSUM 62 oder PAM 120), um jedem Rest einen gewichteten Homologiewert zuzuordnen, und (ii) ein/mehrere filterndes Programm(e) (wie beispielsweise SEG oder XNU), das stark wiederholte Sequenzen aus der Berechung erkennt und eliminiert. Sodann wird eine geeignete Homologie-Abtrennung durch Ausführung von BLAST-Vergleichen (indem eine spezielle Scoring-Matrix und Filterprogramm verwendet werden) zwischen Sequenzen ermittelt, von denen bekannt ist, dass sie verwandt sind. Es gilt als selbstverständlich, dass andere geeignete Scoring-Matrices und Filterprogramme zur Anwendung gelangen können, wenn die Abtrennung entsprechend der Beschreibung hierin kalibriert ist. Das bedeutet, dass die spezielle Trennzelle variieren kann, wenn unterschiedliche Standardparameter verwendet werden, dass sie jedoch den gezeigten P(N)-Scores entspricht, wenn stark verwandte Sequenzen unter Anwendung solcher spezieller Parameter verglichen werden.
  • B7-VERWANDTE NUCLEINSÄUREN
  • Einer der Aspekte der vorliegenden Erfindung betrifft isolierte Nucleinsäuren mit einer Nucleotidsequenz, wie beispielsweise BSL2 (SEQ ID NO: 6, 10 oder 12). Die Nucleinsäuremoleküle der Erfindung können eine DNA oder RNA sein. Eine bevorzugte Nucleinsäure ist eine DNA, die das Human-BSL2 (SEQ ID NO: 7, 11 oder 13) codiert. Fragmente oder funktionelle Äquivalente davon, die hierin beschrieben werden, sind Nucleinsäuren, die mindestens die folgenden zusammenhängenden Nucleotide umfassen: 15, 20, 25, 50, 60, 100, 200, 240, 255, 270, 300, 305, 310, 410, 500, 630, 700 oder 1.000.
  • Der in der gesamten vorliegenden Erfindung verwendetet Begriff "isoliert" bezieht sich auf eine B7-verwandte Nucleinsäure, Polypeptid, Peptid, Proteinfusion oder Antikörper, die weitgehend frei sind von zellulärem Material oder Kulturmedium. Ein isoliertes oder weitgehend gereinigtes Molekül enthält weniger als etwa 50% und bevorzugt weniger als etwa 25% und am meisten bevorzugt weniger als etwa 10% der zellulären Komponenten, mit denen es in Zusammenhang steht.
  • In den Begriff "funktionelles Äquivalent" sollen Sequenzen als einbezogen gelten, welche funktionell äquivalente B7-verwandte Faktoren codieren. In ein funktionelles Äquivalent eines B7-verwandten Proteins sind Fragmente oder Varianten einbezogen, die mindestens eine charakteristische Funktion des B7-verwandten Proteins ausführen (zum Beispiel Liganden binden, antigene, intra- oder interzelluläre Aktivität). Beispielsweise können DNA-Segzenzpolymorphismen im Inneren der Nucleotidsequenz eines B7-verwandten Faktors und speziell solche in der dritte Base eines Codons, zu "stillen" Mutationen führen, die die codierte Aminosäuresequenz des Proteins aufgrund der Entartung des genetischen Codes nicht beeinflussen.
  • Bevorzugte Ausführungsformen schließen eine isolierte Nucleinsäure ein, die mindestens 99, 99,5 oder 100% Sequenzidentität mit einer Polynucleotidsequenz von BSL2 (SEQ ID NO: 6, 10 oder 12) teilt. Diese Polynucleotidsequenz kann mit den Nucleotidsequenzen von BSL2 (SEQ ID NO: 6, 10 oder 12) identisch sein oder kann bis zu einer bestimmten ganzzahligen Zahl von Nucleotidveränderungen im Vergleich zu der Referenzsequenz einschließen.
  • Wie auf dem Fachgebiet bekannt ist, handelt es sich bei dem Begriff "Identität" um eine Beziehung zwischen zwei oder mehreren Polypeptidsequenzen oder zwei oder mehreren Polynucleotidsequenzen, die durch Vergleichen der Sequenzen bestimmt wird. Auf dem Fachgebiet bedeutet "Identität" auch der Grad der Verwandtschaft der Sequenz zwischen Polypeptid- oder Polynucleotidsequenzen, welches grade der Fall ist, die anhand der Anpassung zwischen Strängen solcher Sequenzen bestimmt wird. "Identität" und "Ähnlichkeit" lassen sich mühelos mithilfe bekannter Methoden berechnen, einschließlich solcher Methoden, die beschrieben wurden in Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., Herausgeber Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing. Informatics und Genome Projects, Smith, D. W., Herausgeber Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M. und Griffin, H. G., Herausgeber Humana Press, New Jersy, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; und Sequence Analysis Primer, Gribskov. M. und Devereux, J., Herausgeber M. Stockton Press, New York, 1991, und Carillo, H., und Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988), ohne auf diese beschränkt zu sein.
  • Bei Nucleinsäuren kann die Sequenzidentität durch Vergleichen fraglicher Sequenzen mit Sequenzen in öffentlich verfügbaren Sequenz-Datenbanken (NCBI) unter Anwendung des BLASTN2-Algorithmus bestimmt werden (S. F. Altschul et a., 1997, Nucl. Acids Res., 25: 3389–3402). Die Parameter für eine typische Suche sind: E = 0,05, v = 50, B = 50, worin E die erwartete Wahrscheinlichkeit der Score-Trennung ist, v ist die Zahlt der Datenbankeinträge, die in den Berichten der Ergebnisse zurückgeführt wurden, und B ist die Zahl der Sequenzausrichtungen, die in den Berichten der Ergebnisse zurückgeführt wurden (S. F. Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol., 215: 403–410).
  • In einer anderen Vorgehensweise kann die Identität der Nucleotidsequenz unter Anwendung der folgenden Gleichung berechnet werden: % Identität = (Zahl der identischen Nucleotide)/(Ausrichtungslänge in Nucleotiden)·100. Bei dieser Berechnung sind in die Länge der Ausrichtung innere Lücken einbezogen, nicht jedoch endständige Lücken. Alternativ kann die Identität einer Nucleotidsequenz experimentell unter Anwendung spezieller Bedingungen der Hybridisation bestimmt werden, wie sie nachfolgend beschrieben werden.
  • Veränderungen von Nucleinsäuren werden aus der Gruppe ausgewählt, bestehend aus mindestens einer Nucleotiddeletion, Substitution, einschließlich Transition und Transversion, Insertion oder Modifikation (zum Beispiel über RNA- oder DNA-Analoga, Dephosphorylierung, Methylierung oder Markierung). Veränderungen können an den terminalen Stellen 5' oder 3' der Referenz-Nucleotidsequenz oder irgendwo anders zwischen solchen terminalen Stellen auftreten, die entweder einzeln unter den Nucleotiden in der Referenzsequenz verstreut sind oder in einer oder mehreren zusammenhängenden Gruppen innerhalb der Referenzsequenz. Veränderungen einer Nucleinsäuresequenz von BSL2 (SEQ ID NO: 6, 10 oder 12) können Nonsense-, Missense- oder Rasterverschiebungsmutationen in der codierenden Sequenz erzeugen und verändern dadurch das durch die Nucleinsäure codierte Polypeptid.
  • Beschrieben werden hierin gespleißte Varianten, die von den Nucleinsäuresequenzen BSL1 (SEQ ID NO: 1 und 3), BSL2 (SEQ ID NO: 6, 10 oder 12) oder BSL3 (SEQ ID NO: 14) deriviert sind. Der Begriff "gespleißte Variante", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf eine Variante von B7-verwandten Nucleinsäuren und Polypeptiden, die mithilfe einer differentiellen Bearbeitung des/der primären Transkriptes/Transkripte von Genom-DNA erzeugt wurden. Eine andere gespleißte Variante kann beispielsweise eine beliebige Sequenz der Sequenzen von BSL2 (SEQ ID NO: 6, 10 oder 12) aufweisen, wie sie hierin offenbart werden. Andere gespleißte Varianten können auch andere Kombinationen von Intronen/Exonen von BSL1, BSL2 oder BSL3 aufweisen, die vom Fachmann ermittelt werden können. Andere gespleißte Varianten können experimentell beispielsweise durch Isolieren und Analysieren zellulärer RNA's ermittelt werden (zum Beispiel Southern-Blotting oder PCR) oder durch Screening von cDNA-Banken unter Verwendung von B7-verwandten Nucleinsäure-Sonden oder Primern, wie sie hierin beschrieben werden. In einer anderen Vorgehensweise können andere gespleißte Varianten unter Anwendung verschiedener Methoden und Computerprogramme oder Computersysteme vorhergesagt werden, die dem Fachmann auf dem Gebiet verfügbar sind.
  • Allgemeine Methoden zur Vorhersage der Spleißstelle finden sich in Nakata, 1985, Nucleic Acids Res. 13: 5327–5340. Darüber hinaus können gespleißte Stellen unter Anwendung beispielsweise von GRAILTM vorhergesagt werden (E. C. Uberbacher und R. J. Mural, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 11261–11265; E. C. Uberbacher, 1995, Trends Biotech., 13: 497–500; http://grail.lsd.oml.gov/grailexp); GenView (L. Milanesi et al., 1993, Proceedings of the Second international Conference an Bioinformatics, Supercomputing, und Complex Genome Analysis, H. A. Lim et al. (Herausgeber), World Scientific Publishing, Singapore, S. 573–588; http://125.itba.mi.cnr.it/∼webgene/wwwgene_help.htmi); SpliceView (http://www. itba.mi.cnr.it/webgene); und HSPL (V. V. Solovyev et al., 1994, Nucleic Acids Res. 22: 5156–5163; V. V. Solovyev et al., 1994, "The Prediction of Human Exons by Oligonucleotide Composition und Discriminant Analysis of Spliceable Open Reading Frames," R. Altman et al. (Herausgeber), The Second International conference an Intelligent systems for Molecular Biology, AAAI Press, Menlo Park, CA, S. 354–362; V. V. Solovyev et al., 1993, "Identification Of Human Gene Functional Regions Based On Oligonucleotide Composition," L. Hunter et al. (Herausgeber), In Proceedings of First International conference an Intelligent System for Molecular Biology. Bethesda, S. 371–379) computer systems.
  • Hinzu kommen Computerprogramme, wie beispielsweise GeneParser (E. E. Snyder und G. D. Stormo, 1995, J. Mol. Biol. 248: 1–18; E. E. Snyder und G. D. Stormo, 1993, Nucl. Acids Res. 21(3): 607–613; http://mcdb.cotorado.edu/∼eesnyder/GeneParser.html); MIEF (M. Q. Zhang, 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 565–568; http://argon.cshl.org/genefinder); MORGAN (S. Salzberg et al., 1998, J. Corp. Biol. 5: 667–680; S. Salzberg et al. (Herausgeber), 1998, Computational Methods in Molecular Biology, Elsevier Science, New York, NY, S. 187–203); VEIL (J. Henderson et al., 1997, J. Corp. Biol. 4: 127–141); GeneScan (S. Tiwari et al., 1997, CABIOS (BiIlnformatics) 13: 263–270); GeneBuilder (L. Milanesi et al., 1999, Bioinformatics 15: 612–621); Eukryotic GeneMark (J. Besemer et al., 1999, Nucl. Acids Res. 27: 3911–3920); und FEXH (V. V. Solovyev et al., 1994, Nucleic Acids Res. 22: 5156–5163). Darüber hinaus lassen sich Spleißstellen (d. h. frühere oder potentielle Spleißstellen) in cDNA-Sequenzen beispielsweise unter Verwendung des RNASPL vorhersagen (V. V. Solovyev et al., 1994, Nucleic Acids Res. 22: 5156–5163); oder INTRON (A. Globek et al., 1991, INTRON version 1.1 manual, Laborstory of Biochemical Genetics, NIMH, Wasthigton, D.C.)-Programme.
  • Es werden hierin natürlich auftretende Polymorphismen von BSL2 (SEQ ID NO: 6, 10 oder 12) beschrieben. Wie dem Fachmann klar ist, unterliegen die Genome aller Organismen einer spontanen Mutation im Verlaufe ihrer anhaltenden Evolution unter Erzeugung varianter Formen von Gensequenzen (Gusella, 1986, Ann. Rev. Biochem. 55: 831–854). Restriktionsfragment-lange Polymorphismen (RFLP's) schließen Varianten in DNA-Sequenzen ein, die die Länge eines Restriktionsfragmentes in der Sequenz verändern (Rotstein et al. 1980, Am. J. Hum. Genet. 32, 314–331 (1980). RFLP's haben verbreitete Anwendung in genetischen Analysen bei Mensch und Tier gefunden (siehe hierzu WO 90/13668 , WO 90/11369 , Donis-Keller, 1987, Cell 51: 319–337; Lander et al., 1989, Genetics 121: 85–99). Kurze, tandemartige Wiederholungen (STR) schließen tandemartige Di-, Tri- und Tetranucleotid-wiederholte Motive ein, die auch bezeichnet werden als Polymorphismen mit einer variablen Zahl von tandemartigen Wiederholungen (VNTR). Die VNTR's sind in Identitätsanalysen und Vaterschaftsanalysen verwendet worden ( US-P-5 075 217 ; Armour et al., 1992, FERS Lett. 307: 113–115; Horn et al., WO 91/14003 ; Jeffreys, EP 370,719 ) sowie in einer großen Zahl von genetischen Kartierungsstudien.
  • Einzelne Nucleotid-Polymorphismen (SNP's) sind weitaus häufiger als RFLPS, STR's und VNTR's. SNP's können in Protein codierenden (zum Beispiel Exon) oder nichtcodierenden (zum Beispiel Intron, 5'UTR, 3'UTR)-Sequenzen auftreten. Die SNP's in Protein codierenden Regionen können stille Mutationen aufweisen, die die Aminosäuresequenz eines Proteins nicht verändert. Alternativ können SNP's in Protein codierenden Regionen konservative oder nichtkonservative Aminosäureänderungen erzeugen, wie sie nachfolgend detailliert beschrieben werden. In einigen Fällen können SNP's zur Expression eines fehlerhaften Proteins oder eines Proteins anderer Variante führen und potentiell zu einer genetischen Erkrankung. SNP's innerhalb Protein codierender Sequenzen können zu genetischen Erkrankungen führen, wie beispielsweise in dem β-Globin (Sichelzellenanämie) und CFTR(cystische Fibrose)-Gene. In nichtcodierenden Sequenzen können SNP's ebenfalls zu einer fehlerhaften Proteinexpression führen (zum Beispiel als Ergebnis einer fehlerhaften Spleißung). Andere einzelne Nucleotid-Polymorphismen haben keine phänotypischen Wirkungen.
  • Einzelne Nucleotid-Polymorphismen können in der gleichen Weise wie RFLP's und VNTR's verwendet werden, bieten jedoch mehrere Vorteile. Einzelne Nucleotid-Polymorphismen neigen zum Auftreten mit größerer Häufigkeit und sind im typischen Fall gleichförmiger über das Genom beabstandet als andere Polymorphismen. Außerdem sind verschiedene SNP's oftmals leichter zu unterscheiden als andere Typen von Polymorphismen (zum Beispiel durch Anwendung von Assays unter Einsatz von Allel-spezifischen Hybridisierungssonden oder Primern). In einer der Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung enthält eine BSL2-Nucleinsäure mindestens ein SNP. Die Erfindung umfasst außerdem zahlreiche Kombinationen dieser SNP's. In einem bevorzugten Aspekt steht ein B7-verwandtes SNP in Verbindung mit einer Immunsystem-Erkrankung, wie beispielsweise Erkrankungen, wie sie detailliert hierin beschrieben werden.
  • Ferner werden hierin Nucleinsäuremoleküle beschreiben, die eine mäßige Homologie mit den BSL2(SEQ ID NO: 6, 10 oder 12)-Nucleinsäuresequenzen teilen und zu den BSL2-Nucleinsäuremolekülen unter moderat stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisieren. Mehr bevorzugt sind Nucleinsäuremoleküle, die eine stärkere Homologie mit den BSL2-Nucleinsäuresequenzen teilen und zu BSL1, BSL2- oder BSL3-Nucleinsäuremolekülen unter stark stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisieren. Wie hierin verwendet, bezieht sich die Formulierung "mäßige Homologie" auf Sequenzen, die mindestens 60% der Sequenzidentität mit einer Referenzsequenz teilen (zum Beispiel BSL1, BSL2 oder BSL3), während die Formulierung "stärkere Homologie" sich auf Sequenzen bezieht, die mindestens 90% Sequenzidentität mit einer Referenzsequenz teilen. Es gilt jedoch als anerkannt, dass Polypeptide und die solche Polypeptide codierenden Nucleinsäuren, die wendiger als den vorstehend beschriebenen Wert der Homologie enthalten, als Spleißvarianten hervorgehen, oder dass sie durch konservative Aminosäure-Substitutionen modifiziert werden (oder Substitution von degenerierten Codonen), was in den Schutzumfang der Erfindung als einbezogen gilt.
  • Die Formulierung "Hybridisierungsbedingungen", wie sie hierin benutzt wird, bezieht sich auf Bedingungen, unter denen ein doppelsträngiges Nucleinsäure-Hybrid aus zwei einzelnen Nucleinsäure-Strängen gebildet wird und stabil bleibt. Wie dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt ist, spiegelt sich die Stabilität der Hybridsequenz in der Schmelztemperatur (Tm) des Hybrids wider (siehe hierzu F. M. Ausubel et al., Herausgeber, (1995) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley und Sons, Inc., New York, NY). Mit jeweils 1% Abnahme in der Sequenzhomologie nimmt die Tm näherungsweise um 0,5° bis 1,5°C ab. Normalerweise ist die Stabilität einer Hybridsequenz eine Funktion der Länge und des Guanin/Cytosin-Gehalt des Hybrids, der Natriumionenkonzentration und der Inkubationstemperatur. Im typischen Fall wird die Hybridisierungsreaktion anfangs unter Bedingungen einer geringen Stringenz ausgeführt, gefolgt von Wäschen mit variierender, jedoch höherer Stringenz. Die Bezugnahme auf die Stringenz der Hybridisierung bezieht sich auf diese Waschbedingungen.
  • Bedingungen einer "hohen Stringenz" können beispielsweise durch Hybridisierung in 50% Formamid, 5 × Denhardt's-Lösung, 5 × SSPE und 0,2% SDS bei 42°C, gefolgt von einem Waschen in 0,1 × SSPE und 0,1% SDS bei 65°C geschaffen werden. Vergleichsweise kann eine "mäßige Stringenz" durch Hybridisierung in 50% Formamid, 5 × Denhardt's-Lösung, 5 × SSPE und 0,2% SDS bei 42°C, gefolgt von einem Waschen in 0,2 × SSPE und 0,2% SDS bei 65°C geschaffen werden. Darüber hinaus können Bedingungen einer "geringen Stringenz" beispielsweise durch Hybridisierung in 10% Formamid, 5 × Denhardt's-Lösung, 6 × SSPE und 0,2% SDS bei 42°C, gefolgt von einem Waschen in 1 × SSPE und 0,2% SDS bei 50°C geschaffen werden. Es gilt als selbstverständlich, dass sich diese Bedingungen unter Anwendung einer Vielzahl von Puffer und Temperaturen variieren lassen, wie dem Fachmann auf dem Gebiet gut bekannt sein wird.
  • Ebenfalls hierin beschrieben wird die Nucleinsäure, die ein DNA-Molekül ist, welches mindestens einen Teil des B7-verwandten Faktors codiert. Ein Nucleinsäuremolekül, das einen neuartigen B7-verwandten Faktor codiert, kann aus einer aktivierten B-Lymphocyten vorliegender mRNA erhalten werden. Ebenfalls ist es möglich, Nucleinsäuremoleküle, die B7-verwandte Faktoren codieren, von B-Zell-genomischer DNA zu erhalten. Damit lässt sich einen B7-verwandten Faktor codierende Nucleinsäure entweder aus einer cDNA oder einer Genom-Bank entsprechend den hierin detailliert beschriebenen Protokollen klonieren. Nucleinsäuren, die neuartige B7-verwandte Faktoren codieren, können auch aus genomischer DNA oder cDNA unter Anwendung etablierter Methoden der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) kloniert werden (siehe hierzu K. Mullis et al. (1986) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51: 260; K. H. Roux (1995) PCR Methods Appl. 4: S 185) und zwar entsprechend der hierin bereitgestellten Information über die Nucleinsäuresequenz. Die Nucleinsäuremolekülle der Erfindung können auch chemisch unter Anwendung von Standardmethoden synthetisch dargestellt werden. Es sind zahlreiche Methoden für die synthetische Darstellung von Polydesoxynucleotiden auf chemischem Wege bekannt, einschließlich Synthese in fester Phase, die wie die Peptid-Synthese in kommerziell verfügbaren DNA-Synthesevorrichtungen vollständig automatisiert worden ist (siehe beispielsweise die US-P-4 598 049 von Itakura et al.; US-P-4 458 066 von Caruthers et al.; US-P-4 401 796 und 4 373 071 von Itakura).
  • Für den Fachmann auf dem Gebiet wird erkennbar sein, dass es Variationen in einem oder mehreren Nucleotiden (bis zu etwa 3 bis 4% der Nucleotide) der Nucleinsäuremoleküle, die neuartige B7-verwandte Faktoren codieren, unter Individuen innerhalb einer Population aufgrund einer natürlichen Allel-Variation geben kann. Innerhalb des Schutzumfanges der Erfindung liegt jede einzelne und alle derartige Nucleotidvariationen und resultierenden Aminosäure-Polymorphismen. Darüber hinaus kann es eine oder mehrere Isoformen oder verwandte oder kreuzreagierende Familienvertreter der B7-verwandten Faktoren geben, die hierin beschrieben werden. Derartige Isoformen oder Familienvertreter sind als Polypeptide festgelegt, die in ihrer Funktion und Aminosäuresequenz zu einem B7-verwandten Faktor verwandt sind (zum Beispiel BSL1, BSL2 oder BSL3), die jedoch durch Gene an verschiedenen Loci codiert werden. Darüber hinaus ist es möglich, die DNA-Sequenz von B7-verwandten Faktoren unter Anwendung von genetischen Methoden zu modifizieren, um Proteine oder Peptide mit veränderten Aminosäuresequenzen zu erzeugen.
  • DNA-Sequenzmutationen können in eine ein B7-verwandten Faktor codierende Nucleinsäure mithilfe jeder beliebigen Zahl von Methoden eingeführt werden, einschließlich solche für die Erzeugung einfacher Deletionen oder Insertionen, systematische Deletionen, Insertionen oder Substitutionen von Cluster von Basen oder Substitutionen von einzelnen Basen, um gewünschte Varianten zu erzeugen. Mutationen des BT-verwandten Nucleinsäuremoleküls, um Aminosäuresubstitutionen oder -deletionen zu erzeugen, werden bevorzugt durch ortsspezifische Mutagenese erhalten. Ortsspezifische Mutagenesesysteme sind auf dem Fachgebiet gut bekannt und lassen sich von kommerziellen Quellen erhalten (siehe beispielsweise Amersham Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ). Eine Anleitung zum Bestimmen, welche Aminosäurereste substituiert werden können, insertiert oder deletiert werden können, ohne die biologische oder immunologische Aktivität zu verlieren, lassen sich mithilfe von Computerprogrammen finden, wie sie auf dem Fachgebiet gut bekannt sind, beispielsweise mit der DNASTAR-Software (DNASTAR, Inc., Madison, WI). Mutante Formen der BSL1-, BSL2- oder BSL3-Nucleinsäuremoleküle gelten als innerhalb des Schutzumfanges der vorliegenden Erfindung, wo das exprimierte Polypeptid oder Peptid zur Modulation der Aktivität von Immun- oder inflammatorischen Zellen in der Lage ist (zum Beispiel T-Zellen).
  • Ein Fragment des Nucleinsäuremoleküls, das einen neuartigen B7-verwandten Faktor codiert, ist definiert als eine Nucleotidsequenz, die weniger Nucleotide hat als die Nucleotidsequenz, die die gesamte Aminosäuresequenz des B7-verwandten Faktors codiert. Nucleinsäurefragmente, die Polypeptide codieren, die die Fähigkeit zum Binden an ihren natürlichen Liganden an den Zellen der Immun- oder inflammatorischen Reaktion bewahren, wie beispielsweise den T-Zellen, und entweder Immunreaktionen amplifizieren oder blockieren (wie sich beispielsweise durch Lymphokinproduktion und/oder T-Zell-Proliferation durch T-Zellen zeigt, die ein primäres Aktivierungspotential empfangen haben), gelten als im Schutzumfang der Erfindung liegend. Beispielsweise liegen in dem Schutzumfang der Erfindung Nucleinsäurefragmente, welche Polypeptide oder Peptide eines B7-verwandten Faktors codieren, die die Fähigkeit der Polypeptide oder Peptide zum Binden von CD28- und/oder CD28-verwandten Ligand/Liganden bewahren und ein costimulatorisches Signal an T-Zellen liefern. Im Allgemeinen wird das Nucleinsäuremolekül, das ein Fragment eines B7-verwandten Faktors codiert, aus der codierenden Sequenz für das voll entwickelte Protein ausgewählt. Allerdings kann es in einigen Fällen wünschenswert sein, alle oder einen Teil eines Fragmentes oder Fragmente von der codierenden Region auszuwählen, die die Leadersequenz einschließen.
  • Beschrieben wird hierin ein Nucleinsäuremolekül entsprechend einem Fragment einer BSL2-Nucleinsäuresequenz, die als eine Sonde zum Assayieren einer biologischen Probe für die Expression eines oder mehrerer B7-verwandter Faktoren oder als ein Primer für das DNA-Sequenzieren oder die PCR-Amplifikation verwendet werden kann. Bevorzugt haben derartige Fragmente mindestens 8 zusammenhängende Nucleotide in der Länge und mehr bevorzugt mindestens 12 zusammenhängende Nucleotide in der Länge und noch mehr bevorzugt mindestens 15 zusammenhängenden Nucleotide in der Lange und sogar noch mehr bevorzugt mindestens 20 zusammenhängende Nucleotide in der Länge. Nucleinsäuremoleküle im Schutzumfang der Erfindung können auch Linkersequenzen enthalten, modifizierte Restiktionsendonuclease-Stellen und andere Sequenzen, die zum molekularen Klonieren, zur Expression oder Reinigung von rekombinantem Protein oder Fragmenten davon verwendbar sind. Nucleinsäuremoleküle gemäß der vorliegenden Erfindung können auch mit Radioisotopen konjugiert sein oder chemilumineszente, fluoreszente oder andere markierende Verbindungen sein (zum Beispiel Digoxigenin). Darüber hinaus können die Nucleinsäuremoleküle der vorliegenden Erfindung durch Nucleinsäure modifizierende Enzyme modifiziert sein, zum Beispiel Kinasen oder Phosphatasen. Diese und andere Modifikationen von Nucleinsäuremolekülen sind auf dem Fachgebiet gut bekannt.
  • Zusätzlich kann ein Nucleinsäuremolekül, das einen B7-verwandten Faktor codiert oder ein biologisch aktives Fragment davon, mit einer heterologen Sequenz ligiert sein, um ein Fusionsprotein zu codieren (auch bezeichnet als chimäres Protein). Beispielsweise kann es zum Aufbau einer Nucleinsäure verwendbar sein, die ein Fusionsprotein codiert, das einen B7-verwandten Faktor aufweist und die Fc-Domäne von Human-IgG, wie hierin beschrieben wird. Die resultierenden BSL1-Ig, BSL2-Ig und BSL3-Ig-Fusionsproteine können sodann in Wirtszellen exprimiert werden und zur Herstellung pharmazeutischer Zusammensetzungen verwendet werden, die zur Immunmodulation verwendbar sind (siehe nachfolgend). Fusionsproteine, die B7-verwandte Polypeptide aufweisen, können auch für die Isolation und Reinigung von B7-verwandten Polypeptiden oder Antikörpern verwendet werden (siehe nachfolgend). Zusätzlich können Fusionsproteine verwendet werden, um zelluläre Liganden oder bindende Partner für BSL1, BSL2 oder BSL3 zu identifizieren (siehe nachfolgend).
  • B7-VERWANDTE NUCLEINSÄURE-EXPRESSIONSVEKTOREN
  • Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft Expressionsvektoren, die eine Nucleinsäure aufweisen, die mindestens einen B7-verwandten Faktor entsprechend der Beschreibung hierin codiert, funktionsfähig verknüpft mit mindestens einer regulatorischen Sequenz. "Funktionsfähig verknüpft" soll bedeuten, dass die Nucleotidsäuresequenz mit einer regulatorischen Sequenz in einer solchen Weise verknüpft ist, dass eine Expression der Nucleotidsequenz möglich ist. Regulatorische Sequenzen sind auf dem Fachgebiet bekannt und werden zur direkten Expression des gewünschten Proteins in einer entsprechenden Wirtszelle gewählt. Dementsprechend schließt der Begriff regulatorische Sequenz Promotoren ein, Enhancer und andere Expressionskontrollelemente (siehe hierzu D. V. Goeddel (1990) Methods Enzymol. 185: 3–7). Es sollte als selbstverständlich gelten, dass der Aufbau des Expressionsvektors von solchen Faktoren abhängen kann, wie beispielsweise die Wahl der Wirtszelle, die transfiziert werden soll, und/oder der Typ des Polypeptids, bei dem zu Exprimieren wünscht.
  • Geeignete Wirtszellen zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung schließen Bakterien ein, Pilze, Hefe, Pflanzen, Insekten und tierische Zellen und speziell Zellen von Säugern und Mensch. Bevorzugte Replikations- und Vererbungssysteme schließen M13 ein, ColE1, SV40, Baculovirus, Lambda, Adenvirus, CEN ARS, 2 μm ARS und dergleichen. Es sind zahlreiche regulatorische Elemente (zum Beispiel Promotoren) isoliert worden und haben sich in der Transkription und Translation von heterologen Proteinen in zahlreichen Wirten als wirksam gezeigt. Derartige regulatorische Regionen, Methoden der Isolation, Arten der Manipulation usw. sind auf dem Fachgebiet bekannt. Nicht einschränkende Beispiele für bakterielle Promotoren schließen den β-Lactamase(Penicillinase)-Promotor ein, Lactosepromotor; Tryptophan(trp)-Promotor; araBAD(arabinose)-Operonpromotor; Lambda-derivierter P1-Promotor und N-Gen-Ribosombindungsstelle, sowie den Hybriden tac-Promotor, der von Sequenzen des trp deriviert wird, und lac UV5-Promotoren. Nicht einschränkende Beispiele für Hefe-Promotoren schließen den 3-Phosphoglyceratkinase-Promotor ein, Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase(GAPDH)-Promotor, Galactokinase(GAL1)-Promotor, Galactoepimerase-Promotor und Alkoholdehydrogenase(ADH1)-Promotor. Geeignete Promotoren für Säugerzellen schließen ohne Einschränkung virale Promotoren ein, wie beispielsweise solche von Simian Virus 40 (SV40), Rous-Sarcom-Virus (RSV), Adenvirus (ADV) und Rinderpapillomvirus (BPV).
  • Eukaryotische Zellen können auch Terminationssequenzen erfordern, Polyadenylierungssequenzen und Enhancersequenzen, welche die Genexpression modulieren. Sequenzen, die eine Amplifikation des Gens bewirken, können ebenfalls wünschenswert sein. Diese Sequenzen sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Darüber hinaus können ebenfalls Sequenzen einbezogen sein, die die Sektrektion des rekombinanten Produkts von Zellen erleichtern, einschließlich und ohne Einschränkung Bakterien, Hefe und tierische Zellen, wie beispielsweise secretorische Signalsequenzen und/oder Präprotein- oder Proproteinsequenzen. Derartige Sequenzen sind auf dem Fachgebiet gut beschrieben worden.
  • Geeignete Expressionsvektoren schließen pUC ein, pBluescript (Stratagene), pET (Novagen, Inc., Madison, WI) und pREP(Invitrogen)-Plasmide, ohne auf diese beschränkt zu sein. Vektoren können eine oder mehrere Replikations- und Vererbungssysteme zum Klonieren oder zur Expression von einem oder mehreren Markern für die Selektion in dem Wirt enthalten, zum Beispiel auf antibiotische Resistenz, sowie eine oder mehrere Expressionskassetten. Die insertierten, codierenden Sequenzen können mithilfe von Standardmethoden synthetisch dargestellt werden, aus natürlichen Quellen isoliert werden oder als Hybride hergestellt werden. Die Ligation der codierenden Sequenzen zu transkriptionellen, regulatorischen Elementen (zum Beispiel Promotoren, Enhancer und/oder Isolatoren) und/oder zu anderen Aminosäure codierenden Sequenzen, kann unter Anwendung etablierter Methoden ausgeführt werden.
  • In einer der Ausführungsformen weist der Expressionsvektor eine Nucleinsäure auf, die mindestens einen Abschnitt des BSL2-Polypeptids codiert. In einer anderen Ausführungsform weist der Expressionsvektor eine DNA-Sequenz auf, die ein heterologes Polypeptid oder Peptid codiert. Derartige Expressionsvektoren können verwendet werden, um Wirtszellen zu transfizieren und dadurch Polypeptide oder Peptide erzeugen und einschließlich Fusionsproteine oder Peptide, die durch Nucleinsäuremoleküle codiert werden, wie nachfolgend beschrieben wird.
  • ISOLATION VON B7-VERWANDTEN POLYPEPTIDEN
  • Es werden hierin Methoden zum Isolieren von B7-verwandten Polypeptiden und verwandten Peptiden beschrieben. Wie hierin verwendet, sind die Begriffe "Protein" und "Polypeptid" synonym. Peptide sind als Fragmente oder Abschnitte von Proteinen oder Polypeptiden definiert, bevorzugt von Fragmenten oder Abschnitten, die die gleiche oder eine äquivalente Funktion oder Aktivität haben wie das vollständige Protein. In Assays und Behandlungen gemäß der vorliegenden Erfindung können sowohl natürlich auftretende als auch rekombinante Formen der B7-verwandten Polypeptide oder Peptide angewendet werden. Methoden zum direkten Isolieren und Reinigen von Polypeptiden oder Peptiden von natürlichen Quellen, wie beispielsweise zellulären oder extrazellulären Lysaten, sind auf dem Fachgebiet gut bekannt (siehe hierzu E. L. V. Harris und S. Angal, Herausgeber. (1989) Protein Purification Methods: A Practical Approach, IRL Press, Oxford, England). Derartige Methoden schließen ohne Einschränkung die preparative Disk-Gelelektrophorese, isoelektrische Fokussierung, Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC), Umkehrphasen-HPLC, Gelfiltration, Ionenaustausch und Säulenchromatographie sowie Gegenstromverteilung und Kombinationen davon. Natürlich auftretende Polypeptide lassen sich von zahlreichen möglichen Quellen reinigen, zum Beispiels Plasma, Körperzellen und -gewebe oder von Körperflüssigkeiten.
  • Zur Erzeugung von rekombinanten B7-verwandten Polypeptiden oder Peptiden werden DNA-Sequenzen, die B7-verwandte Polypeptide oder Peptide codieren, in einen geeigneten Vektor zur Expression in intakten Wirtszellen oder in zellfreien Translationssystemen kloniert (siehe hierzu J. Sambrook et al, supra). Prokaryotische und eukaryotische Vektoren sowie Wirtszellen können zum Einsatz gelangen. Die spezielle Wahl eines Vektors, einer Wirtszelle oder eines Translationssystem ist für die Praxis der Erfindung nicht entscheidend. Nach Erfordernis können DNA-Sequenzen für eine wirksamere Expression in einem vorgegebenen Wirtsorganismus optimiert werden. Beispielsweise können Codone verändert werden, um mit der bevorzugten Codonnutzung in einer vorgegebenen Wirtszelle oder einem zellfreien Translationssystem unter Anwendung von Methoden in Einklang zu bringen, die routinemäßig auf dem Fachgebiet praktiziert werden.
  • Bei einigen Aufgaben kann es von Vorteil sein, Peptide oder Polypeptide in einem rekombinanten System zu erzeugen, worin die Peptide oder Polypeptide zusätzliche Sequenz-Anhänge zur Erleichterung der Reinigung führen. Derartige Marker schließen Epitop-Anhänge und Protein-Anhänge ein. Nicht einschränkende Beispiele für Epitop-Anhänge schließen c-myc ein, Haemaglutinin (HA), Polyhistidin (6X-HIS), GLU-GLU und DYKDDDDK (FLAG®) Epitop-Anhänge. Epitop-Anhänge können den Peptiden mithilfe einer Reihe etablierter Methoden hinzugefügt werden. DNA-Sequenzen von Epitop-Anhängen können in Peptid codierenden Sequenzen als Oligonucleotide insertiert werden oder durch Primer, die in der PCR-Amplifikation verwendet werden. Als Alternative lassen sich Peptid codierende Sequenzen in spezifische Vektoren klonieren, die Fusionen mit Epitop-Anhängen schaffen; beispielsweise pRSET-Vektoren (Invitrogen Corp., San Diego, CA). Nicht einschränkende Beispiele für Protein-Anhänge schließen Glutathion-S-transferase (GST) ein, grün fluoreszierendes Protein (GFP) und Maltose bindendes Protein (MBP). Protein-Anhänge werden an Peptide oder Polypeptide mithilfe verschiedener wohlbekannter Methoden angebracht. In einer der Vorgehensweisen kann die codierende Sequenz eines Polypeptids oder Peptids in einen Vektor kloniert werden, der eine Fusion zwischen dem Polypeptid oder Peptid und einen Protein-Anhang, das von Interesse ist, erzeugen. Geeignete Vektoren schließen die exemplarischen Plasmide ein, pGEX (Amersham Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ), pEGFP (CLONTECH Laboratories, Inc., Palo Alto, CA) und pMALTM (New England BioLabs, Inc., Beverly, MA), ohne auf diese beschränkt zu sein. Nach der Expression kann das Epitop oder Protein, die mit Polypeptid oder Peptid als Anhang versehen sind, von einem rohen Lysat des Translationssystems oder der Wirtszelle mithilfe der Chromatographie auf einer geeigneten Festphasenmatrix gereinigt werden. In einigen Fällen kann es nach der Reinigung von Vorteil sein, den Epitop- oder Protein-Anhang zu entfernen (d. h. über eine Proteasespaltung).
  • Geeignete zellfreie Expressionssysteme zur Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung schließen Kaninchen-Reticulocytenlysat ein, Weizenkeimextrakt, pankreatische, mikrosomale Membranen des Hundes, E. coli S30-Extrakt und gekoppelte Transkriptions/Translationssysteme (Promega Corp., Madison, WI). Diese Systeme ermöglichen die Expression von rekombinanten Polypeptiden oder Peptiden bei Zugabe von Klonierungsvektoren, DNA-Fragmenten oder RNA-Sequenzen, die codierende Regionen und entsprechende Promotorelemente enthalten.
  • Wirtszellen für rekombinante Klonierungsvektoren schließen bakterielle Zellen ein, archebakterielle, fungale, pflanzliche, Insekten- und Tierzellen ein und speziell Zellen von Säugern. Von speziellem Interesse sind: E. coli, B. subtilis, S. aureus, S. cerevisiae, S. pombe, N. crassa, SF9, C129, 293, NIH 3T3, CHO, COS und HeLa-Zellen. Diese Zellen lassen sich zweckmäßig mithilfe einer beliebigen, geeigneten Methode transformieren, transfizieren oder transduzieren, wobei die Methode einschließt: Elektroporation, CaCl2-, LiCl-, LiAc/PEG-, Sphäroplasting-, Calciumphosphat-, DEAE-Dextran, Liposom-vermittelte DNA-Aufnahme, Injektion, Mikroinjektion, Mikroprojektilbeschuss oder andere etablierte Methoden.
  • Um Wirtszellen zu identifizieren, die den Expressionsvektor enthalten, wird in der Regel ein Gen, das einen selektierbaren Marker enthält, in die Wirtszellen zusammen mit dem Gen, das von Interesse ist, eingeführt. Bevorzugte selektierbare Marker schließen solche ein, die zur Arzneimittelresistenz beitragen, wie beispielsweise G418, Hygromycin, Methotrexat oder Amplicilin. Selektierbare Marker können auf dem gleichen Plasmid wie das Gen, das von Interesse ist, eingeführt werden. Wirtszellen, die das Gen, das von Interesse ist, enthalten, werden mithilfe der Medikamentenauswahl als Zellen identifiziert, die die Arzneimittelresistenz-Marker führen und in Wachstumsmedien überleben, die das entsprechende Arzneimittel enthalten.
  • Die überlebenden Zellen können zur Erzeugung von rekombinanten B7-verwandten Polypeptiden oder Peptiden oder Fusionen davon einem Screening unterzogen werden. In einer der Ausführungsformen werden die rekombinanten Polypeptide auf der Zelloberfläche ausgeschieden und lassen sich mithilfe eines Zelloberflächenanfarbens mit Liganden auf die B-Zell-Antigene identifizieren (zum Beispiel CD28-Ig). In einer anderen Ausführungsform werden die rekombinanten Polypeptide in dem Cytoplasma der Wirtszellen gehalten und lassen sich in Zellextrakten unter Verwendung von Anti-B7-verwandten Polypeptid-Antikörpern identifizieren. In noch einer anderen Ausführungsform werden lösliche rekombinante Polypeptide in das Wachstumsmedium ausgeschieden und können durch ein Screening des Wachstumsmediums mit Anti-B7-verwandten Polypeptid-Antikörpern identifiziert werden. Ein lösliches, ausgeschiedenes, rekombinantes B7-Polypeptid schließt die extrazelluläre Domäne des Polypeptids oder ein beliebiges Fragment davon ein, in das die cytoplasmischen und/oder Transmembran-Regionen nicht einbezogen sind. Die Zelloberfläche und die rekombinanten, B7-verwandten Polypeptide können nach Zell-Lyse und Extraktion der zellulären Proteine isoliert werden, während die ausgeschiedenen, rekombinanten, B7-verwandten Polypeptide aus dem Zell-Wachstumsmedium mithilfe von Standardmethoden isoliert werden können (siehe hierzu I. M. Rosenberg, Herausgeber (1996) Protein Analysis and Purification: Benchtop Techniques, Birkhuser, Boston, Cambridge, MA).
  • Methoden auf Basis von Antikörpern können zur Reinigung von natürlich oder rekombinant erzeugten B7-verwandten Polypeptiden oder Peptiden angewendet werden. Antikörper, welche diese Polypeptide oder davon abgeleiteten Peptide erkennen, lassen sich unter Anwendung von Methoden erzeugen und isolieren, die dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt sind (siehe nachfolgend). B7-verwandte Polypeptide oder Peptide können dann aus einem rohen Lysat mithilfe der Chromatographie auf Antikörper-konjugierten Festphasen-Matrices gereinigt werden (siehe hierzu E. Harlow und D. Lande, 1999, Using Antibodies: A Laborstory Manual, Cold Spring Harbor Laborstory, Cold Spring Harbor, NY). Andere Reinigungsmethoden, die auf dem Fachgebiet bekannt sind und angewendet werden, lassen sich ebenfalls einsetzen.
  • Es ist festzustellen, dass transfizierte Wirtszellen, die B7-verwandte Faktoren exprimieren (zum Beispiel BSL1, BSL2 und/oder BSL3) oder Teile davon auf der Oberfläche der Zelle innerhalb des Schutzumfanges der vorliegenden Erfindung liegen. Beispielsweise kann eine Tumorzelle, wie beispielsweise ein Sarkom, Melanom, Leukämie, Lymphom, Karzinom oder Neuroblastom, mit einem Expressionsvektor transfiziert werden, der die Expression von mindestens einem B7-verwandten Faktor auf der Oberfläche der Tumorzelle deriviert. Derartige transfizierte Tumorzellen lassen sich zur Behandlung von Tumorimmunität entsprechend der detaillierten Beschreibung hierin verwenden.
  • B7-VERWANDTE POLYPEPTIDE
  • Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft isolierte B7-verwandte Polypeptide. Die vorliegenden Erfindung umfasst die BSL2-Polypeptide (SEQ ID NO: 7, 11 oder 13). Ferner werden hierin Fragmente und funktionelle Äquivalente beschrieben, zum Beispiel Polypeptide, die mindestens 5, 12, 20, 30, 50, 100, 170, 200, 210, 300 oder 500 zusammenhängende Aminosäurereste aufweisen. Bevorzugt sind Polypeptide, die eine mäßige Homologie mit BSL2(SEQ ID NO: 7, 11 oder 13)-Polypeptiden teilen. Mehr bevorzugt sind Polypeptide, die eine wesentliche Homologie mit BSL2 (SEQ ID NO: 7, 11 oder 13) teilen.
  • Der Begriff "funktionelles Äquivalent" soll Proteine einschließen, die sich in der Aminosäuresequenz von einem vorgegebenen B7-verwandten Polypeptid unterscheiden, wie beispielsweise die Sequenz von BSL1 (SEQ ID NO: 2), BSL2 (SEQ ID NO: 7, 11 oder 13) oder BSL3 (SEQ ID NO: 15)-Polypeptid, wobei jedoch diese Unterschiede zu einem modifizierten Protein führen, das mindestens eine charakteristische Funktion des B7-verwandten Polypeptids ausführt (zum Beispiel Ligandenbindung, antigene, intra- oder interzelluläre Aktivität). Beispielsweise kann ein funktionelles Äquivalent eines BSL1-, BSL2- oder BSL3-Polypeptids eine Modifikation haben, wie beispielsweise eine Substitution, Addition oder Deletion eines Aminosäurerestes, der in der Funktion dieses Polypeptids nicht unmittelbar beteiligt ist (d. h. die Fähigkeit dieser Polypeptide zu einer Costimulation der T-Zellproliferation). Darüber hinaus werden nicht in der Natur vorkommende Analoga von B7-verwandten Polypeptiden, die zum Binden von CD28 und/oder CD28-verwandten Ligand(en) in der Lage sind, als funktionelle Äquivalente betrachtet. Es werden hierin detailliert zahlreiche Modifikationen der B7-verwandten Polypeptide zur Erzeugung funktioneller Äquivalente dieser Polypeptide beschrieben.
  • Es ist ebenfalls möglich, die Struktur eines B7-verwandten Polypeptids für solche Aufgaben wie die Erhöhung der Löslichkeit, Verstärkung der therapeutischen oder prophylaktischen Wirkung (Reaktionsfähigkeit) oder Stabilität (zum Beispiel Gebrauchsdauer ex vivo und Beständigkeit gegenüber proteolytischen Abbau in vivo) zu modifizieren. Derartige modifizierte Proteine werden als funktionelle Äquivalente der B7-verwandten Polypeptide entsprechend der Festlegung hierin betrachtet. Bevorzugt werden die B7-verwandten Polypeptide so modifiziert, dass sie ihre Fähigkeit zum Costimulation einer T-Zellenproliferation bewahren. Diese Reste, von denen sich zeigt, dass sie weitgehend mit den CD28 oder CD28-verwandten Liganden auf T-Zellen Wechselwirken, lassen sich durch Austausch dieser essentiellen Aminosäure gegen einen anderen und vorzugsweise ähnlichen Aminosäurerest modifizieren (eine konservative Substitution), dessen Vorhandensein ein Verstärken oder Vermindern zeigt, nicht jedoch die Rezeptorwechselwirkung eliminiert oder beeinflusst. Darüber hinaus können derartige Aminosäurereste, die für die Rezeptorwechselwirkung nicht entscheidend sind, modifiziert werden, indem sie gegen eine andere Aminosäure ausgewechselt werden, deren Einbau die Reaktivität verstärken, vermindern oder nicht herbeiführen kann. Beispielsweise kann ein B7-verwandtes Polypeptid durch Substitution von Cycsteinresten mit anderen Aminosäuren modifiziert werden, wie beispielsweise Alanin, Serin, Threonin, Leucin oder Glutaminsäure, um eine Dimerisierung über Disulfid-Bindungen zu verhindern. Darüber hinaus können die Aminosäure-Seitenketten eines B7-verwandten Polypeptids der Erfindung chemisch modifiziert werden. Außerdem kann ein B7-verwandtes Polypeptid durch Ringschluss der Aminosäuresequenz modifiziert werden.
  • Um die Stabilität und/oder Reaktivität zu erhöhen, können die B7-verwandten Polypeptide verändert werden, um einen oder mehrere Polymorphismen in die Aminosäuresequenz einzubauen. Darüber hinaus können D-Aminosäuren, nichtnatürliche Aminosäuren oder Nonaminosäuren-Analoga substituiert oder hinzugefügt werden, um ein modifiziertes Polypeptid zu erzeugen. Darüber hinaus können die hierin offenbarten B7-verwandten Polypeptide unter Verwendung von Polyethylenglykol (PEG) entsprechend den bekannten Methoden (Wie et al., supra) modifiziert werden, um ein Protein zu erzeugen, das mit PEG konjugiert ist. Darüber hinaus kann PEG während der chemischen Synthese des Proteins hinzugefügt werden. Andere mögliche Modifikationen schließen Methoden der Reduktion/Alkylierung ein (Tarr (1986) Methods of Protein Microcharacterization, J. E. Silver, Herausgeber, Humana Press, Clifton, NJ, S. 155–194); Acylierung (Tarr, supra); chemische Kopplung an einen entsprechenden Träger (Mishell und Shiigi, Herausgeber (1980) Selected Methods in Cellular Immunology, W. H. Freeman, San Francisco, CA; US-P-4 939 239 ; oder eine milde Formalinbehandlung (Marsh (1971) Int. Arch. of Allergy and Appl. Immunol. 41: 199–215) des B7-verwandten Polypeptids.
  • Modifizierte Polypeptide können konservative Änderungen haben, worin eine substituierte Aminosäure ähnliche Struktur- oder chemische Eigenschaften hat, zum Beispiel Austausch von Leucin gegen Isoleucin. Häufiger kann ein modifiziertes Polypeptid über nichtkonservative Änderungen verfügen, zum Beispiel Substitution eines Glycins mit einem Tryptophan. Eine Anleitung zur Bestimmung, welche Aminosäurereste substituiert werden können, insertiert werden können oder deletiert werden können, ohne die biologische oder immunologische Aktivität zu opfern, lassen sich unter Anwendung von Computerprogrammen herausfinden, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind, wie beispielsweise DNASTAR-Software (DNASTAR, Inc., Madison, WI).
  • Nichteinschränkende Beispiele für konservative Substitutionen in der B7-verwandten Aminosäuresequenz können entsprechend der folgenden Tabelle aufgeführt werden:
    Originalrest konservative Substitution(en)
    Ala Ser
    Arg Lys
    Asn Gin, His
    Asp Glu
    Cys Ser
    Gin Asn
    Glu Asp
    Gly Pro
    His Asn, Gin
    Ile Leu, Val
    Leu Ile, Val
    Lys Arg, Gin, Glu
    Met Leu, Ile
    Phe Met, Leu, Tyr
    Ser Thr
    Thr Ser
    Trp Tyr
    Tyr Trp, Phe
    Val Ile, Leu
  • Wesentliche Änderungen der Funktion oder Immunogenität lassen sich durch Auswahl von Substitutionen vornehmen, die weniger konservativ als solche sind, die vorstehend in der Tabelle angegeben sind. Beispielsweise können nichtkonservative Substitutionen ausgeführt werden, die nachhaltiger die Struktur des Polypeptids im Bereich der Veränderung beeinflussen, wie beispielsweise die Alpha-Helikale oder Beta-Blatt-Struktur; die Lage oder Hydrophobizität des Moleküls an der Targetstelle; oder das Volumen der Seitenkette. Die Substitutionen, von den generell erwartet wird, dass sie die stärksten Änderungen hinsichtlich der Eigenschaften des Polypeptids ergeben, sind solche, wo 1) ein hydrophiler Rest, zum Beispiel Seryl oder Threonyl, substituiert wird an (oder durch) einen hydrophoben Rest, zum Beispiel Leucyl, Isoleucyl, Phenylalanyl, Valyl oder Alanyl; 2) ein Cystein oder Prolin substituiert wird an (oder durch) irgendeinen anderen Rest; 3) ein Rest mit einer elektropositiv geladenen Seitenkette, zum Beispiel Lysyl, Arginyl oder Histidyl, substituiert wird an (oder durch) einen elektronegativ geladenen Rest, zum Beispiel Glutamyl oder Aspartyl; oder 4) ein Rest mit einer volumigen Seitenkette, zum Beispiel Phenylalanin, substituiert wird an (oder durch) einen Rest, der keine Seitenkette hat, zum Beispiel Glycin.
  • Bevorzugte Polypeptid-Ausführungsformen schließen ferner ein isoliertes Polypeptid ein, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die mindestens 90, 95, 97, 98, 99, 99,5 oder 100% Identität mit einer Aminosäuresequenz von BSL2 (SEQ ID NO: 7, 11 oder 13) teilt. Diese Polypeptidsequenz kann identisch sein mit der Sequenz von BSL2 (SEQ ID NO: 7. 11 oder 13) oder kann bis zu einer bestimmten ganzzahligen Zahl von Aminosäureänderungen im Vergleich zu der Bezugssequenz einschließen.
  • Die relative Identität der Sequenz lässt sich unter Anwendung von Computerprogrammen oder durch direkten Sequenzvergleich identifizieren. Bevorzugte Computerprogramme zur Bestimmung der Identität zwischen zwei Sequenzen schließen die folgenden ein, ohne auf diese beschränkt zu sein: GCG-Programm-Software, FASTA, BLASTP und TBLASTN (siehe zum Beispiel D. W. Mount, 2001, Bioinformatics: Sequence and Genome Analysis, Cold Spring Harbor Laborstory Press, Cold Spring Harbor, Nr. 7). Die BLASTP- und TBLASTN-Programme sind bei der NCBI und anderen Quellen öffentlich verfügbar. Der wohlbekannte Smith-Waterman-Algorithm kann ebenfalls zur Bestimmung der Identität angewendet werden.
  • Beispielhafte Parameter für den Aminosäuresequenzvergleich schließen die folgenden ein: 1) Algorhythmus von Needleman und Wunsch, 1970, J Mol. Biol. 48: 443–453; 2) BLOSSUM62-Vergleichsmatrix von Hentikoff und Hentikoff, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915–10919; 3) "Gap-Penalty" = 12 und 4) Gap-Länge-Penalty = 4. Ein Programm, das mit diesen Parametern anwendbar ist, ist öffentlich verfügbar als das "Gap"-Programm (Genetics Computer Group, Madison, WI). Die vorgenannten Parameter sind Standardparameter für Polypeptidvergleiche (ohne "Penalty" für End-Gaps).
  • Alternativ kann die Identität der Polypeptidsequenz unter Anwendung der folgenden Gleichung berechnet werden: %Identität = (die Zahl der identischen Reste)/(Ausrichtungslange in den Aminosäureresten)·100
  • Für diese Berechnung schließt die Ausrichtungslange interne Gaps ein, schließt jedoch keine terminalen Gaps ein.
  • Die hierin beschriebenen Polypeptidsequenzen können mit den Sequenzen von BSL2 (zum Beispiel SEQ ID NO: 7, 11 oder 13) identisch sein oder können bis zu einer bestimmten ganzzahligen Zahl von Aminosäureveränderungen einschließen. Polypeptidveränderungen werden ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus mindestens einer Aminosäuredeletion, -substitution, einschließlich konservative und nichtkonservative Substitution, oder -insertion. Veränderungen können an den Amino- oder Carboxy-terminalen Positionen der Referenz-Polypeptidsequenz auftreten oder an irgendeiner anderen Stelle zwischen solchen terminalen Positionen, die entweder individuell unter den Aminosäuren in der Referenzsequenz verteilt sind oder in einer oder mehreren zusammenhängenden Gruppen im Inneren der Referenzsequenz. Polypeptidvarianten können codiert sein durch BLS1-, BSL2- oder BSL3-Nucleinsäuren, die einzelne Nucleotidpolymorphismen und/oder alternierende Spleißvarianten aufweisen. Polypeptide lassen sich auch beispielsweise modifizieren durch Phosphorylierung, Sulfatation oder Acylierung. Sie können außerdem auch mit einem Marker modifiziert sein, der zur Bereitstellung eines detektierbaren Signals in der Lage ist, entweder direkt oder indirekt, und zwar einschließlich radioisotope und Fluoreszenzverbindungen, ohne auf diese beschränkt zu sein.
  • Hierin werden isolierte, synthetisch dargestellte und/oder rekombinante Abschnitte oder Fragmente eines BSL2-(SEQ ID NO: 7, 11 oder 13)Proteins oder Polypeptid beschrieben. Es können Polypeptidfragmente (d. h. Peptide) erzeugt werden, die über die volle oder partielle Funktion von sich aus verfügen oder die, wenn sie gemischt werden mit (und zwar vollständig, teilweise oder nichtfunktionell allein) spontan mit einem oder mehreren anderen Polypeptiden zusammenkommen, um ein funktionelles Protein aufzubauen, das mindestens über ein funktionelles Merkmal eines BSL1-, BSL2- oder BSL3- Proteins der vorliegenden Erfindung verfügt. Darüber hinaus können B7-verwandte Polypeptidfragmente beispielsweise eine oder mehrere Domänen des Polypeptids entsprechend der Offenbarung hierin aufweisen (zum Beispiel die Transmembran oder extrazelluläre Domäne).
  • Die Polypeptide, die hierin beschrieben sind und funktionskonservative Varianten einschließen, können aus Wildtyp- oder Mutantenzellen (zum Beinspiel Humanzellen oder Zelllinien) von heterologen Organismen oder Zellen isoliert werden (zum Beispiel Bakterien-, Hefe-, Insekten-, Pflanzen- und Säugerzellen) oder aus zellfreien Translationssystemen (zum Beispiel Weizenkeim-, mikrosomalen Membran- oder bakteriellen Extrakten), in die eine Protein codierende Sequenz eingeführt und exprimiert worden ist. Darüber hinaus können die Polypeptide Bestandteil von rekombinanten Fusionsproteinen sein. Die Polypeptide können vorteilhaft auch mithilfe der Chemie der synthetischen Darstellung erzeugt werden. Polypeptide lassen sich chemisch und synthetisch mithilfe kommerziell verfügbarer und automatisierter Prozeduren darstellen, einschließlich Ausschluss-Festphasensynthese, partiellen Festphasenmethoden, Fragmentkondensation oder klassische Lösungssynthese. Sowohl die natürlich vorkommenden als auch die rekombinanten Formen der Polypeptide der Erfindung lassen sich vorteilhaft zum Screening von Verbindungen auf Bindungsaktivität verwenden. Die Polypeptide der Erfindung finden auch als therapeutische Mittel sowie als antigene Komponenten zur Herstellung von Antikörpern Verwendung, wie hierin detailliert beschrieben wird.
  • ANTIKÖRPER ZU B7-VERWANDTEN POLYPEPTIDEN
  • Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung umfasst Antikörper, die speziell B7-verwandte Polypeptide oder Peptide erkennen, d. h. die BSL2-Polypeptide oder Fragmente, die davon deriviert sind. Wie hierin verwendet, bezieht sich "Antikörper" auf intakte Moleküle sowie Fragmente davon, wie beispielsweise Fab, F(ab)2 und Fv, die zum Binden einer epitopischen Determinante in der Lage sind. Antikörper, die an einem B7-verwandten Polypeptid und bevorzugt das BSL1(SEQ ID NO: 2)-, BSL2(SEQ ID NO: 7, 11 oder 13)- oder BSL3(SEQ-ID NO: 15)-Polypeptid binden, lassen sich unter Verwendung des isolierten B7-verwandten Polypeptids oder Peptidfragmente davon als das Immungen oder immunisierende Antigen mithilfe von Methoden herstellen, die auf dem Fachgebiet bekannt sind (siehe hierzu I. Lefkovits, Herausgeber (1996) Immunology Methods Manual Academic Press, Inc., San Diego, CA). Wie für dem Fachmann auf dem Gebiet ersichtlich ist, kann das Immungen an einem Trägerprotein nach Erfordernis konjugiert sein, um die Immunisierungsstärke zu erhöhen und speziell dann, wenn ein kleines Peptid verwendet wird. Üblicherweise verwendete Träger, die routinemäßig chemisch gekoppelt an Peptiden verwendet werden, schließen Serumalbumine ein, zum Beispiel Rind-, Schaf-, Ziege- oder Fisch-Serumalbum, Thyroglobulin und "Schlüsselloch-Napfschnecke-Hämocyanin". Der gekoppelte Immunogenträger wird sodann zum Immunisieren eines Empfängertieres verwendet (zum Beispiel Maus, Ratte, Schaf, Ziege oder Kaninchen).
  • Der Begriff "antigene Determinante" bezeichnet das Fragment eines Moleküls (d. h. ein Epitop) das den Kontakt mit einem speziellen Antikörper herstellt. Wenn das B7-Polypeptid oder -Peptidfragment verwendet wird, um ein Wirtstier zu immunisieren, können zahlreiche Regionen des Polypeptids oder -Peptidfragments in die Erzeugung von Antikörpern einbezogen sein, die speziell an einer vorgegebenen Region oder dreidimensionalen Struktur an dem Polypeptid oder Peptid binden. Derartige Regionen oder Strukturen werden als antigene Determinanten oder Epitope bezeichnet. Eine antigene Determinante kann mit dem intakten Antigen (d. h. dem zur Herbeiführung der Immunreaktion verwendeten Immunogen) zum Binden an einem Antikörper konkurrieren. Bevorzugt sind solche antigenen Determinanten, die auf das BSL1(SEQ ID NO: 2)-, BSL2(SEQ ID NO: 7, 11 oder 13)- oder BSL(SEQ ID NO: 15)-Polypeptid oder Peptid spezifisch sind. B7-verwandte, von Polypeptid- oder Peptid-derivierte Immunogene können unter Anwendung der vorstehend beschriebenen Methoden erhalten werden. Beispielsweise lassen sich B7-verwandte Polypeptid- oder Peptid-Fragmente von natürlichen oder rekombinierten Quellen isolieren und durch Ausschneiden der Polypeptide oder Peptid-Fragmente aus den Gelen und speziell SDS-PAGE-Gelen, reinigen.
  • BSL2-spezifische Antikörper schließen polyklonale und monoklonale Antikörper ein. Die Antikörper können in einem Wirttier durch Immunisation mit B7-verwandten Polypeptid-derivierten, immunogenen Komponenten hervorgebracht werden oder können durch in vitro-Immunisierung (Sensibilisierung) von Immunzellen erzeugt werden. Die als Immunogene verwendeten immunogenen Komponenten zur Auslösung der Erzeugung von Antikörpern lassen sich von Plasma isolieren, rekombinant erzeugen oder chemisch durch Synthese darstellen. Die Antikörper können auch in rekombinanten Systemen erzeugt werden, die mit entsprechender Antikörper codierender DNA programmiert sind. Alternativ können die Antikörper durch biochemischen Umbau von gereinigten schweren und leichten Ketten aufgebaut werden. In die Antikörper einbezogen sind Hybrid-Antikörper, chimäre Antikörper, humanisierte Antikörper (siehe beispielsweise die US-P-5 585 089 von C. J. Queen et al.) und univalente Antikörper. Ebenfalls einbezogen sind Fab-Fragmente, Fab'- und F(ab)2-Fragmente von Antikörpern. Bemerkenswert ist, dass Antikörper, die speziell entweder die ausgeschiedene Zelloberflächenform erkennen, oder die cytoplasmische, lösliche Form eines B7-verwandten Faktors, isoliert werden können.
  • Hybridoma, die monoklonale Antikörper gegen die immunogenen Komponenten der Erfindung erzeugen, lassen sich mithilfe gut bekannter Methoden herstellen. Hybridoma können durch Fusion einer immortalisierten Zelllinie mit einem B-Lymphocyt hergestellt werden, der den gewünschten Antikörper erzeugt. Alternativ sind fusionsfreie Methoden zum Erzeugen von immortalen Antikörper erzeugenden Zelllinien möglich und liegen innerhalb des Umfanges der vorliegenden Erfindung (siehe Casali et al. (1986) Science 234: 476). Immortalisierte Zelllinien sind im typischen Fall transformierte Säugerzellen und speziell Myelomzellen von Nagetieren, Rind und von humaner Herkunft. Aus Gründen der Einfachheit und Verfügbarkeit werden am Häufigsten Myelom-Zelllinien von Ratte oder Maus eingesetzt. Zum Auswählen der Hybridoma, wie beispielsweise HAT(Hypoxanthin-Aminopterin-Thymidin)-Selektion, lassen sich Standardprozeduren anwenden. Hybridoma, welche die gewünschten monoklonalen Antikörper ausscheiden, lassen sich auswählen, indem das Kulturmedium der Zellen mithilfe von Standard-Immunoassays assayiert wird, wie beispielsweise Immunoblotting, ELISA (enzymgekoppelte Immunasorbtionsbestimmung; E. Engvall et al. (1971) Immunochemistry, 8: 871–4; und D. J. Reen (1994) Methods Mol. Biol. 32: 461–6), RIA (Radioimmunoassay) oder vergleichbare Assays. Antikörper können aus dem Medium unter Anwendung von Standardmethoden der Proteinreinigung gewonnen werden (siehe Tijssen (1985) Practice and Theory of Enzyme Immunoassays, Elsevier, Amsterdam).
  • In einer der Ausführungsformen werden Antikörper, die mit einem B7-verwandten Polypeptid oder Peptidfragment reagieren, verwendet, um ein B7-verwandtes Polypeptid oder Peptidfragment in einer biologischen Probe zu identifizieren oder zu isolieren. Um ein B7-verwandtes Polypeptid aus einer Probe zu isolieren, werden Antikörper, die speziell ein B7-verwandtes Polypeptid oder Peptidfragment erkennen oder dieses binden, mit einem festen Träger konjugiert, der Antikörper-konjugierte, feste Körper mit der Probe oder einem Aliquot der Probe inkubiert und das Polypeptid oder Peptid, das an den Antikörpern bindet, aus dem festen Träger eluiert. Um ein B7-verwandtes Polypeptid oder Peptidfragment in einer Probe nachzuweisen, wird die Probe mit Antikörpern inkubiert, die speziell ein B7-verwandtes Polypeptid oder Peptidfragment unter Bedingungen erkennen und binden, unter denen es den Antikörpern möglich ist, an dem Polypeptid oder Peptidfragment zu binden, wobei das Binden der Antikörper an dem B7-verwandten Polypeptid oder Peptidfragment bestimmt wird.
  • ASSAYS UNTER NUTZUNG VON B7-VERWANDTEN NUCLEINSÄUREN ODER POLYPEPTIDEN
  • Expressionsanalyse von B7-verwandten Faktoren: Es können mehrere gut etablierte Methoden angewendet werden, um die Expressionsmengen, Muster und die zelltypische Spezifität der B7-verwandten Faktoren zu bestimmen. Beispielsweise können mRNA-Mengen unter Einsatz der Northern-Blot-Analyse bestimmt werden (J. C. Alwine et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5350–5354; I. M. Bird (1998) Methods Mol. Biol. 105: 325–36.), wodurch Poly(A)+RNA aus den Zellen isoliert wird, mithilfe der Gel-Elektrophorese abgetrennt wird, auf einer Trägeroberfläche geblotted wird (zum Beispiel Nitrocellulose oder Immobilon-Ny+ (Millipore Corp., Redford, MA) und mit einer markierten (zum Beispiel fluroeszentmarkiert oder radiomarkiert) Oligonucleotid-Sonde inkubiert wird, die zum Hybridisieren mit der mRNA in der Lage ist, die von Interesse ist. Alternaiv können mRNA-Mengen mithilfe einer quantitativen (eine Übersichtsarbeit findet sich bei W. M. Freeman et al. (1999) Biotechniques 26: 112–122) oder halbquantitativen RT-PCR-Analyse (Ren et al. Mol. Brain Res. 59: 256–63) bestimmt werden. Nach dieser Methode wird Poly(A)+RNA aus den Zellen isoliert, für die cDNA-Synthese verwendet und die resultierende cDNA mit PCR-Primern inkubiert, die zum Hybridisieren mit dem Template in der Lage sind, wonach die Template-Sequenz unter Erzeugung von Mengen des PCR-Produktes amplifiziert wird, die zu den Zellmengen der mRNA proportional sind, die von Interesse ist. Eine andere Methode, nämlich eine in situ-Hybridisierung, kann ebenfalls zur Bestimmung der mRNA-Mengen angewendet werden (eine Übersichtsarbeit findet sich bei A. K. Raap (1998) Mutat. Res. 400: 287–298). Methoden der in situ-Hybridisierung ermöglichen den visuellen Nachweis der mRNA in einer Zelle, indem die Zelle mit einer markierten (zum Beispiel fluoreszentmarkiert oder digoxigeninmarkiert) Oligonucleotid-Sonde inkubiert wird, welche die mRNA, die von Interesse ist hybridisiert, wonach die Zelle mithilfe der Mikroskopie untersucht wird.
  • CHROMOSOMALE KARTIERUNG VON B7-VERWANDTEN GENEN
  • Die chromosomale Lage von B7-verwandten Genen kann mithilfe zahlreicher, auf dem Fachgebiet bekannter Methoden bestimmt werden. Beispielsweise kann ein hochauflösendes, chromosomales "Banding" verwendet werden (eine Übersichtsarbeit findet sich bei M. Ronne (1990) In Vivo 4: 337–65). Die Methoden des hochauflösenden Bandings nutzen gestreckte Chromosomen von Zellen in frühen mitotischen Stadien, die unter Anwendung von DNA-Synthesehemmern synchronisiert worden sind (zum Beispiel Methotrexat oder Thymidin) oder mithilfe von DNA-bindenden Mitteln synchronisiert worden sind (zum Beispiel Ethidiumbromid). Allerdings lassen sich diese Methoden nur zum Kartieren eines Gens bis zu einem relativ großen Chromosomenbereich kartieren (etwa 3 Mb). Für eine genauere Genkartierung kann die Methode der fluoreszenten in situ-Hybridisierung (FISH) angewendet werden. Speziell werden bei den hochauflösenden FISH-Methoden (A. Palotie et al. (1996) Ann. Med. 28: 101–106) freies Chromatin, DNA-Fasern oder mechanisch gedehnte Chromosomen eingesetzt, um Gensequenzen zu kartieren, die eine Größe von mehreren Kilobasen bis zu 300 kb haben. Alternativ kann die chromosomale Lage eines Gens aus der Genomdatenbank bestimmt werden, beispielsweise der Genomdatenbank "Homo sapiens", die auf der Entrez Genom-Website verfügbar ist (http://www.ncbi.nim.nih.gov:80/entrez/query.fcgi?db=Genname; National Center for Biotechnology Information, Bethesda, MD).
  • IDENTIFIKATION VON T-ZELLENLIGANDEN
  • Die B7-verwandten Polypeptide oder Peptide, die hierin offenbart werden, lassen sich zur Identifikation ihrer zusammenhängenden Liganden auf Zellen der Immunreaktion oder inflammatorischen Reaktion verwenden, wie beispielsweise T-Zellen (d. h. CD28- oder CTLA-4-verwandte Liganden). Die Ligandenkandidaten oder -fragmente die daraus deriviert werden, lassen sich mithilfe zahlreicher auf dem Fachgebiet gut bekannter Methoden identifizieren und analysieren (siehe beispielsweise T. E. Creighton, Herausgeber, 1997, Proteins Structure: A Practical Approach, IRL Press at Oxford Press, Oxford, England). Beispielsweise können T-Zellliganden, die an den B7-verwandten Polypeptiden oder Peptiden binden, aus Extrakten oder Lysaten identifiziert werden, die von Zellen (zum Beispiel T-Zellen) der Immunreaktion oder inflammatorischen Reaktion von Tieren und bevorzugt von Menschen erhalten werden. Die aus diesen Quellen erhaltenen Proteine können zu Bändern unter Anwendung der Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) separiert und durch Elektroblotting übertragen werden, beispielsweise auf einen geeigneten Festphasenträger oder einer solchen Membran (zum Beispiel Nitrozellulose oder Polyvinylidenfluorid (PVDF)). Der Festphasenträger oder eine solche Membran können sodann mit einer markierten Form eines B7-verwandten Polypeptids oder Peptids inkubiert werden, zum Beispiel BSL1-, BSL2- oder BSL3-Proteine, die mit den Banden übereinstimmen, die ein spezielles Binden mit dem markierten, B7-verwandten Polypeptid oder Peptid zeigen und anschließend mithilfe einer Aminosäureanalyse und/oder Edman-Abbau identifiziert, isoliert, gereinigt und analysiert werden können, um die Aminosäuresequenz von daraus derivierten Peptiden zu bestimmen.
  • Als ein alternatives Vorgehen kann ein B7-verwandtes Polypeptid aufweisendes Fusionsprotein an einen festen Träger angebracht und mit Extrakten inkubiert werden, die aus Zellen erhalten wurden, wie beispielsweise CHO- oder COS-Zellen, die mit einer entsprechenden cDNA-Bank transfiziert sind. Beispielsweise kann eine cDNA-Bank von ruhenden oder aktivierten, immortalen Human-T-Zelllinien aufgebaut werden, wie beispielsweise CEM-, HUT78- oder Jurkat-Zelllinien oder aus ruhenden oder aktivierten Human-T-Zellen, die von peripherem Blut deriviert sind, von Tonsillen, Rückenmark, Thymus oder anderen speziellen Lymphoidgeweben. Diese Zellen lassen sich durch Zugabe von anti-CD3- und anti-CD28-monoklonalen Antikörpern, von Phytohämaglutinin (PHA) oder Phorbol-12-Myristat-13-Acetat (PMA) mit Ionomycin aktivieren. Das cDNA-Bankkonstrukt kann eine entfernbare Epitopmarkierung (siehe vorstehend) enthalten, die von dem Fusionsprotein verschieden ist und die Reinigung des/der Expressionsproduktes/Expressionsprodukte der Bank erleichtert, die mit dem Fusionsprotein zusammenhängen. Die isolierten Datenbank-Expressionsprodukte können anschließend isoliert und charakterisiert werden. Darüber hinaus kann ein Fusionsprotein, das ein B7-verwandtes Polypeptid aufweist, an einen festen Träger angebracht werden (zum Beispiel eine Säule, die Kügelchen aufweist, die speziell an dem Fusionsprotein binden) und mit Lysaten inkubiert werden, die von Zellen erhalten werden, wie beispielsweise T-Zellen, die für integrale Membranproteinen angereichert sind. Die Zellulatproteine, die mit dem Fusionsprotein zusammenhängen, können isoliert und anschließend unter Anwendung der MALDI-TOF-Analyse charakterisiert werden (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time Of Flight Analysis; eine Übersichtsarbeit von Yates JR 3rd. (1998) J. Mass Spectrom. 33: 1–19; P. Chaurand et al. (1999) J. Am. Soc. Mass Spectrom. 10: 91–103). Fusionsproteine können beispielsweise FLAG®-(B. L. Brizzard et al. (1994) Biotechniques 16: 730–735), 6X-HIS und GST-markierte Fusionsproteine (siehe vorstehend) einschließen, die an den festen Trägern angebracht sind, die mit Anti-FLAG®-Antikörpern, Nickel bzw. Glutathionmolekillen konjugiert sind. Methoden zum Erzeugen und Reinigen derartiger Fusionsproteine sind auf dem Fachgebiet gut bekannt.
  • Ein anderer geeigneter Ligand-Bindungsassay ist das Hefe/Zwei-Hybridsystem (Fields et al. (1989) Nature 340: 245–246; US.-P-5 283 173 ). Das Zwei-Hybridsystem beruht auf der Rekonstitution von Transkriptionsaktivität durch Assoziation des DNA-Bindens und der Transkriptionsaktivations-Domäne eines transkriptionellen Aktivators über eine Protein-Protein-Wechselwirkung. Der Hefe/GAL4-transkriptioneller Aktivator kann auf diese Weise zur Anwendung gelangen, obgleich auch andere Transkriptionsfaktoren verwendet worden sind und auf dem Fachgebiet gut bekannt sind. Zur Ausführung des Zwei-Hybridassays werden die GAL4-DNA-bindende Domäne und die GAL4-Transkriptionsaktivierungs-Domäne separat als Fusionen zu potentiell wechselwirkenden Polypeptiden exprimiert. Beispielsweise kann das eine Fusionsprotein ein B7-verwandtes Polypeptid aufweisen, das mit der GAL4-DNA-bindenden Domäne fusioniert ist. Das andere Fusionsprotein kann beispielsweise eine T-Zell-cDNA-Bank-codiertes Polypeptid aufweisen, das mit der GAL4-Transkriptionsaktivierungs-Domäne fusioniert ist. Wenn die zwei coexprimierten Fusionsproteine in dem Nucleus einer Wirtszelle Wechselwirken, wird ein Reportergen (zum Beispiel LacZ) unter Erzeugung eines detektierbaren Phänotyps aktiviert. Die Wirtszellen, die Zwei-Hybrid-Wechselwirkungen zeigen, lassen sich verwenden, um die enthaltenen Plasmide zu isolieren, die die cDNA-Banksequenzen enthalten. Diese Plasmide können analysiert werden, um die Nucleinsäuresequenz zu bestimmen und die vorhergesagte Polypeptidsequenz des Kandidaten des T-Zellliganden.
  • Als alternative Vorgehensweisen können verwandte in vivo-Methoden dienen, wie beispielsweise das Drei-Hybridsystem (Licitra et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 12817–12821) und das Reverse-Zwei-Hybridsystem (Vidal et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 10315–10320). Kommerziell verfügbare Zwei-Hybridsysteme, wie beispielsweise die CLONTECH MatchmakerTM-Systeme und Protokolle (CLONTECH, Palo Alto, CA) können ebenfalls angewendet werden (siehe hierzu ebenfalls A. R. Mendelsohn et al. (1994) Curr. Op. Biotech. 5: 482; E. M. Phizicky et al. (1995) Microbiological Rev. 59: 94; M. Yang et al. (1995) Nucleic Acids Res. 23: 1152; S. Fields et al. (1994) Trends Genet. 10: 286; und US-P-6283 173 und 5 468 614 ).
  • Ligandensequenz(en), die von einem/mehreren Ligandenbindungsassay(s) erhalten wird/werden, lassen sich mit den betreffenden Sequenzen in verfügbaren Datenbanken vergleichen, wie beispielsweise GenPept, SWISS-PROT und Incyte Genomics-Datenbanken (Incyte Genomics), ohne auf diese beschränkt zu sein. Die Datenbanken, die bereits identifizierte und annotierte Sequenzen enthalten, können auf Polypeptid und Gensequenz voller Länge unter Anwendung beispielsweise der BLAST-Analyse (siehe vorstehend) abgesucht werden. In Fällen, in denen Sequenzen der Liganden in voller Länge nicht verfügbar sind lassen sich verlängerte oder überlappende Teilklonierungen mithilfe von Methoden erzielen, die auf dem Fachgebiet bekannt sind und konventionell praktiziert werden. Nichteinschränkende Beispiele derartiger Methoden schließen Hybridisierung zu Plasmid- oder Phagenbanken von genomischer DNA oder cDNA ein; PCR von den gleichen Banken unter Verwendung von B7-verwandten Faktor-Primerpaaren; oder Hybridisierung oder PCR direkt zu der genomischen DNA oder cDNA. Diese Klone lassen sich dann zu Genen voller Länge sequenzieren und zusammenbauen, indem ein Fragmentsequenz-Ausrichtungsprogramm verwendet wird (PHRAP; Nickerson et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 2745–2751).
  • ASSAYS FÜR B7-VERWANDTE FAKTORAKTIVITÄT
  • Das Screening der Fragmente, Mutanten oder Varianten von solchen, die eine charakteristische B7-verwandte Polypeptidaktivität bewahren, wie sie hierin beschrieben wird, kann unter Anwendung einer oder mehrerer verschiedener Assays erfolgen. Beispielsweise können geeignete Zellen, wie zum Beispiel CHO-Zellen, mit den klonierten Varianten transfiziert und anschließend auf Zelloberflächen-Phänotyp durch indirekte Immunfluoreszenz und Cytofluoriemetrie analysiert werden. Die Zelloberflächenexpression der transfizierten Zellen wird unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers bewertet, der speziell mit einer Zelloberflächenform eines B7-verwandten Faktors reaktionsfähig ist (siehe vorstehend). Die Erzeugung von ausgeschiedenen Formen der B7-verwandten Faktoren kann mithilfe der Immunpräzipitation unter Anwendung eines monoklonalen Antikörpers bewertet werden, der speziell mit einem B7-verwandten Faktor reaktionsfähig ist.
  • Andere, mehr bevorzugte Assays nutzen den Vorteil der funktionellen Merkmale der B7-verwandten Faktoren. Wie bereits ausgeführt wurde, bewirkt das Binden der B7-verwandten Faktoren an ihren T-Zellligand(en), dass die Zellen erhöhte Mengen an lymphokinen und speziell Interleukin-2 erzeugen. Damit lässt sich die B7-verwandte Faktorfunktion bewerten, indem die Synthese von Lymphokinen gemessen wird, wie beispielsweise Interleukin-2 oder anderer neuartiger und noch undefinierter Cytokine, und/oder indem die T-Zellproliferation durch CD28+ T-Zellen assayiert wird, die ein primäres Aktivierungssignal erhalten haben. Es kann jeder beliebige von mehreren konventionellen Assays für Interleukin-2 eingesetzt werden (siehe C. B. Thompson (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1333).
  • Die gleichen grundlegenden funktionellen Assays können auch zum Screening auf B7-verwandte Polypeptide, Peptide, Fusionsproteine oder Antikörper angewendet werden, welche die T-Zellaktivierung blockieren. Die Fähigkeit solcher Proteine zum Blockieren des normalen costimulatorischen Signals und zum Einleiten eines Anergiezustandes kann unter Anwendung aufeinander folgender Schritte bei der Stimulierung der T-Zellen mit Antigen bestimmt werden, welche Zellen präsentieren, die das Zelloberflächen-B-Zellaktivierungsantigen B7 exprimieren und Antigen präsentieren. Wenn die T-Zellen auf die Aktivierungsschritte reaktionslos sind, was mithilfe der IL-2-Synthese und der T-Zellproliferation bestimmt wird, ist ein Zustand der Anergy induziert worden und kann mithilfe von Methoden bestimmt werden, die auf dem Fachgebiet bekannt sind (siehe R. H. Schwartz (1990) Science 248: 1349–1356).
  • MODULATOREN VON B7-VERWANDTEN FAKTOREN
  • Die BLS1-, BSL2- und BSL3-Polypeptide, Polynucleotide, Varianten oder Fragmente davon können zum Screening auf Mitteln zum Testen verwendet werden (zum Beispiel Agonisten, Antagonisten oder Inhibitoren) die die Menge oder Aktivität des entsprechenden, B7-verwandten Polypeptids modulieren. Darüber hinaus können B7-verwandte Moleküle verwendet werden, um endogene Modulatoren zu identifizieren, die an BSL1-, BSL2- oder BSL3-Polypeptiden oder Polynucleotiden in der Zelle binden. In einem der Aspekte der vorliegenden Erfindung wird mit voller Länge das BSL1-Polypeptid (zum Beispiel SEQ ID NO: 2), BSL2-Polypeptid (mm Beispiel SEQ ID NO: 7, 11 oder 13) oder BSL3-Polypeptid (zum Beispiel SEQ ID NO: 15) zur Identifikation von Modulatoren verwendet. Alternativ werden Varianten oder Fragmente eines BSL1-, BSL2- oder BSL3-Polypeptids verwendet. Derartige Fragmente können beispielsweise eine oder mehrere Domänen des B7-verwandten Polypeptids aufweisen (zum Beispiel die extrazellulären und Transmembran-Domänen), wie hierin offenbart wird. Von besonderem Interesse sind Screeningassays, mit denen Mittel identifiziert werden, die relativ geringe Werte der Toxizität in Humanzellen haben. Für diese Aufgabe kann eine große Vielzahl von Assays angewendet werden, einschließlich Assays des in vitro-Protein-Protein-Bindens, Assays der elektrophoretischen Mobilitätsverschiebung, Immunoassays und dergleichen.
  • Der Begriff "Modulator", wie er hierin verwendet wird, beschreibt jedes beliebige Testmittel, Molekül, Protein, Peptid oder Verbindung mit der Fähigkeit zur direkten oder indirekten Veränderung der physiologischen Funktion, Stabilität oder Mengen des BSL1-, BSL2- und BSL3-Polypeptids. Modulatoren, die an den B7-verwandten Polypeptiden oder Polynucleotiden der Erfindung binden, sind potentiell in diagnostischen Anwendungen und/oder pharmazeutischen Zusammensetzungen verwendbar, wie hierin detailliert beschrieben wird. Testmittel, die als Modulatoren verwendbar sind, können zahlreiche chemische Klassen umfassen, obgleich es sich bei ihnen im typischen Fall um organische Moleküle handelt und bevorzugt um kleine organische Verbindungen mit einem Molekulargewicht von mehr als 50 und weniger als etwa 2.500 Dalton. Diese Moleküle können funktionelle Gruppen aufweisen, die für eine strukturelle Wechselwirkung mit Proteine und speziell der Wasserstoffbindung notwendig sind und schließen im typischen Fall mindestens eine Amin-, Carbonyl-, Hydroxyl- oder Carboxyl-Gruppe ein und bevorzugt mindestens zwei der funktionellen chemischen Gruppen. Testmittel, die als Modulatoren verwendet werden können, weisen oftmals zyklische Kohlenstoff- oder heterozyklische Strukturen auf und/oder aromatische oder polyaromatische Strukturen, die mit einer oder mehreren der vorgenannten, funktionellen Gruppen substituiert sind. Testmittel können ebenfalls Biomoleküle umfassen, worin Peptide einbezogen sind, Saccharide, Fettsäuren, Steroide, Purine, Pyrimidine, Derivate, Strukturanaloga oder Kombinationen davon.
  • Testmittel, die als Modulatoren Anwendung finden, können beispielsweise einschließen: 1) Peptide, wie beispielsweise lösliche Peptide und einschließlich Ig-schwanztragende Fusionspeptide und Vertreter der Random-Peptidbanken (siehe zum Beispiel Lam et al. (1991) Nature 354: 82–84; Houghten et al. (1991) Nature 354: 84–86) und kombinatorische, chemisch derivierte Molekularbanken, erzeugt aus Aminosäuren mit D- und/oder L-Konfiguration; 2) Phosphorpeptide (zum Beispiel Vertreter von Random- und teilweise degenerierten, gerichteten Phosphorpeptid-Banken, (siehe zum Beispiel Songyang et al., (1993) Cell 72: 767–778); 3) Antikörper (zum Beispiel polyklonale Antikörper, monoklonale, humanisierte, antiidiotypische, chimäre und Einzelketten-Antikörper sowie Fab, F(ab')2, Fab-Expressionsbank-Fragmente und Epitop bindende Fragmente und Antikörper) und 4) kleine organische und anorganische Moleküle.
  • Testmittel und Modulatoren können aus einer Vielzahl von Quellen erhalten werden, einschließlich Banken von synthetischen oder natürlich auftretenden Verbindungen. Banken von synthetischen Verbindungen sind kommerziell verfügbar beispielsweise bei Maybridge Chemical Co. (Trevillet, Cornwall, UK), Comgenex (Princeton, NJ), Brandon Associates (Merrimack, NH) und Microsource (New Milford, CT). Eine seltene chemische Bank ist bei Aldrich Chemical Company, Inc. (Milwaukee, WI) verfügbar. Banken von natürlichen Verbindungen weisen bakterielle, pilzliche, pflanzliche oder tierische Extrakte auf, die beispielsweise verfügbar sind bei Pan Laborstories (Bothell, WA). Darüber hinaus sind zahlreiche Mittel für eine Random- und gerichtete Synthese einer großen Vielzahl von organischen Verbindungen und Biomolekülen verfügbar, einschließlich der Expression von randomisierten Oligonucleotiden.
  • Alternativ lassen sich Banken von natürlichen Verbindungen in Form von bakteriellen, pilzlichen, pflanzlichen und tierischen Extrakten mühelos erzeugen. Methoden für die Synthese von Molekularbanken sind leicht verfügbar (siehe zum Beispiel DeWitt et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6909; Erb et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 11422; Zuckermann et al. (1994) J. Med. Chem. 37: 2678; Cho et al. (1993) Science 261: 1303; Carell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2059; Carell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2061 und in Gallop et al. (1994) J. Med. Chem. 37: 1233). Zusätzlich können natürlich vorkommende oder synthetische Verbindungsbanken und Verbindungen mühelos durch konventionelle chemische, physikalische und biochemische Mittel modifiziert werden (siehe zum Beispiel Blondelle et al. (1996) Trends in Biotechn. 14: 60) und können verwendet werden, um kombinatorische Banken m erzeugen. In einer anderen Vorgehensweise können bereits identifizierte, pharmakologische Mittel direkten oder zufälligen chemischen Modifikationen unterzogen werden, wie beispielsweise Acylierung, Alkylierung, Veresterung, Amidifikation, wobei die Analoga auf BSL1-, BSL2- und BSL3-modulierende Aktivität gescreent werden können.
  • Auf dem Fachgebiet sind zahlreiche Methoden zum Erzeugen von kombinatorischen Banken bekannt, einschließlich solche, die biologische Banken umfassen; Banken für räumlich adressierbare Parallel-Festphasen oder Lösungsphasen; Methoden für synthetische Banken, die eine Dekonvulation benötigen; die Methode der "One-Bead-One-Compound"-Bank; und Methoden der synthetischen Bank unter Anwendung der Affinitätschromatographie-Selektion. Die Vorgehensweise der biologischen Bank ist auf Polypeptidbanken beschränkt, während die anderen vier Vorgehensweisen auf Banken von Verbindungen für Polypeptid, Nonpeptid-Oligomer oder kleine Moleküle anwendbar sind (K. S. Lam, 1997, Anticancer Drug Des. 12: 145).
  • Die Banken können in Lösung gescreent werden (zum Beispiel Houghten, (1992) Biotechniques 13: 412–421) oder auf Perlen (Lam, (1991) Nature 354: 82-84), Chips (Fodor, (1993) Nature 364: 555–556), Bakterien oder Sporen (Ladner US-P-S 223 409 ), Plasmiden (Cull et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89-1865-1869) oder auf Phagen (Scott und Smith, (1990) Science 249: 386–390; Devlin, 1990, Science 249: 404–406; Cwirla et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 6378–6382; Felici, (1991) J. Mol. Biol. 222: 301–310; Ladner, supra).
  • Wenn es sich beim Screening-Assay um ein Bindungsassay handelt, können ein BSL1-, BSL2- und BSL3-Polypeptid, Polynucleotid, Analogsubstanz, oder Fragment davon mit einem Marker vereint werden, wobei der Marker direkt oder indirekt ein detektierbares Signal bereitstellen kann. Verschiedene Marker schließen Radioisotope ein, Fluoreszenzsubstanzen, Chemielumineszenzsubstanzen, Enzyme, spezifisch bindende Moleküle, Partikel, zum Beispiel magnetische Partikel und dergleichen. Spezifisch bindende Moleküle schließen Paar ein, wie beispielsweise Biotin und Streptavidin, Digoxin und Antidigoxin, usw. Bei den spezifisch bindenden Vertretern wird normalerweise der komplementäre Vertreter mit einem Molekül markiert, das eine Detektion ermöglicht, die den bekannten Prozeduren entspricht.
  • In den Screening-Assay kann eine Vielzahl anderer Reagenzien miteinbezogen werden. Diese schließen Reagenzien ein, wie beispielsweise Salze, neutrale Proteine, zum Beispiel Albumin, Detergenzien, usw. die zur Anwendung gelangen können, um ein optimales Binden von Protein-Protein zu erleichtern und/oder nichtspezifische oder Hintergrundwechselwirkungen zu verringern. Reagenzien, die die Wirksamkeit des Assays verbessern, wie beispielsweise Proteasehemmer, Nucleasehemmer, antimikrobielle Mittel, usw. können verwendet werden. Die Komponenten werden in einer beliebigen Reihenfolge zugegeben, mit der das angestrebte Binden erzeugt wird. Inkubationen werden bei einer beliebigen Temperatur ausgeführt, bei der die optimale Aktivität erleichtert wird und im typischen Fall zwischen 4° und 40°C. Die Inkubationszeiten werden auf optimale Aktivität ausgewählt, können jedoch auch so optimiert sein, dass ein schnelles Screening mit hohem Durchsatz erleichtert wird. Normalerweise sind zwischen 0,1 und 1 Stunden ausreichend. Im Allgemeinen wird eine Mehrzahl von Assay-Mischungen parallel mit unterschiedlichen Konzentrationen des Mittels gefahren, um eine differenzierte Reaktion auf diese Konzentrationen zu erhalten. Im typischen Fall dient eine dieser Konzentrationen als Negativkontrolle, d. h. bei einer Konzentration von Null oder unterhalb der Nachweismenge.
  • Zur Ausführung zellfreier Screening-Assays kann es wünschenswert sein, entweder als BSL1-, BSL2- oder BSL3-Polypeptid, Polynucleotid oder Fragment an einer Oberfläche zu immobilisieren, um die Identifikation von Modulatoren zu erleichtern, die an diesen Molekülen binden, sowie eine Automation des Assays möglich zu machen. Beispielsweise kann ein Fusionsprotein, das ein BSL1-, BSL2- oder BSL3-Polypeptid und einen Affinitätsmarker aufweist, erzeugt werden, wie hierin detailliert beschrieben wird. In einer der Ausführungsformen wird ein GST-Fusionsprotein, welches ein BSL1-, BSL2- oder BSL3-Polypeptid aufweist, auf Glutathion-Sepharose-Kügelchen adsorbiert (Sigma Chemical, St. Louis, MO) oder auf Glutathion-derivatisierten Mikrotiterplatten. Zell-Lysate (zum Beispiel solche die 35S-markierte Polypeptide enthalten) werden den mit Polypeptid beschichteten Kügelchen unter Bedingungen zugegeben, die eine komplexe Bildung ermöglichen (zum Beispiel bei physiologischen Bedingungen in Berg auf Salz und pH-Wert). Nach der Inkubation werden die mit Polypeptid beschichteten Kügelchen zur Entfernung von etwaigen ungebundenen Polypeptiden gewaschen und die Menge des immobilisierten Radiomarkers bestimmt. Alternativ wird der Komplex dissoziativ aufgelöst und der in dem Überstand vorhandene Radiomarker bestimmt. In einer anderen Vorgehensweise werden die Kügelchen mithilfe der SDS-Page analysiert, um die BSL1-, BSL2- oder BSL3-bindenden Polypeptide zu identifizieren.
  • Zur Identifikation von Agonisten oder Antagonisten, die die Funktion oder Mengen des BSL1-, BSL2- oder BSL3-Polypeptids ändern, können zahlreiche Bindungsassays angewendet werden. Diese Assays sind so ausgelegt, dass die Wechselwirkung von Testmitteln mit BSL1-, BSL2- oder BSL3-Polypeptiden, Polynucleotiden, funktionellen Äquivalenten oder Fragmenten davon detektiert wird. Wechselwirkungen können mithilfe einer direkten Messung des Bindens detektiert werden. Alternativ können Wechselwirkungen durch indirekte Indikatoren des Bindens detektiert werden, wie beispielsweise eine Stabilisierung/Destabilisierung der Proteinstruktur oder Aktivierung/Hemmung der biologischen Funktion. Nichteinschränkende Beispiele für anwendbare Bindungsassays werden nachfolgend detailliert beschrieben.
  • Modulatoren, welche BSL1-, BSL2- oder BSL3-Polypeptide, Polynucleotide, funktionelle Äquivalente oder Fragmente davon binden, können unter Anwendung einer Echtzeit-Bimolekular-Wechselwirkungsanalyse identifiziert werden (BIA; Sjolander et al. (1991) Anal. Chem. 63: 2338–2345; Szabo et al. (1995) Curr. Opin. Struct. Biol. 5: 699–705; zum Beispiel BIAcoreTM; LKB Pharacia, Schweden). Modulatoren können auch mithilfe von Szintillations-Näherungsassays identifiziert werden (SPA, beschrieben in der US-P-4 568 649 ). Bindungsassays unter Verwendung von mitochondrialen Targetsignalen (Hurt et al. (1985) EMBO J. 4: 2061–2068; Eilen und Schatz, (1986) Nature 322: 228–231) einer Vielzahl von definierten Polymeren, die auf einem Feststoffsubstrat synthetisiert werden (Foder et al. (1991) Science 251: 767–773) können ebenfalls eingesetzt werden.
  • Zur Identifikation von Modulatoren können Zwei-Hybridsysteme angewendet werden (siehe zum Beispiel die US-P-5 283 317 ; Zervos et al. (1993) Cell 72: 223–232; Madura et al. (1993) J. Biol. Chem. 268: 12046–12054; Bartel et al. (1993) Biotechniques 14: 920–924; Iwabuchi et al. (1993) Oncogene 8: 1693–1696; und Brent WO 94/10300 ). Alternativ können Drei-Hybridsysteme (Licitra et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 12817–12821) und reverse-Zwei-Hybridsysteme (Vidal et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 10315–10320) angewendet werden. Kommerziell verfügbare Zwei-Hybridsysteme, wie beispielsweise CLONTECH MatchmakerTM-Systeme und Protokolle (CLONTECH Laboratories, Inc., Palo Alto, CA) sind ebenfalls anwendbar (siehe auch A. R. Mendelsohn et al. (1994) Curr. Op. Biotech. 5: 482; E. M. Phizicky et al. (1995) Microbiological Rev. 59: 94; M. Yang et al. (1995) Nucleic Acids Res. 23: 1152; S. Fields et al. (1994) Trends Genet. 10: 286; und US-P-6 283 173 und 5 468 614 ).
  • In den letzten Jahren sind mehrere Methoden automatischer Assays entwickelt worden, womit ein Screening von Tausenden von Testmitteln in kurzer Zeit möglich wird. In Verbindung mit der vorliegenden Erfindung ist die Anwendung von Screeningmethoden mit hohem Durchsatz besonders bevorzugt. Die hierin beschriebenen Bindungsassays können auf Screens mit hohem Durchsatz angepasst werden, oder es können alternative Screen eingesetzt werden. Beispielsweise ermöglichen Screens mit hohem Durchsatz und kontinuierlichem Format (SF-HTS) unter Verwendung mindestens einer porösen Matrix dem Wissenschaftler eine große Zahl von Testmitteln über einen großen Bereich biologischer oder biochemischer Aktivität zu testen (siehe die US-P-5 976 813 von Beutel et al.). Darüber hinaus lässt sich die CF-HTS zur Ausführung von mehrstufigen Assays anwenden.
  • DIAGNOSTIK
  • Nach einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können die B7-verwandten Polynucleotide oder Fragmente davon für diagnostische Zwecke angewendet werden. Die B7-verwandten Polynucleotide, die zur Anwendung gelangen können, schließen Oligonucleotidsequenzen ein, komplementäre RNA-DNA-Moleküle und PNA's. Die Polynucleotide können verwendet werden, um die Längen von BSL1-, BSL2- und BSL3-mRNA nachzuweisen und quantitativ in biologischen Proben zu bestimmen, in denen eine Expression (oder Unter- oder Überexpression) von BSL1-, BSL2- und BSL3-Polynucleotide in Korrelation mit der Krankheit stehen kann. Der Diagnostikassay kann zur Unterscheidung zwischen dem Fehlen, dem Vorhandensein, der Erhöhung und der Abnahme der Expression von BSL1, BSL2 und BSL3 verwendet werden und zur Überwachung der Regulierung von BSL1-, BSL2- und BSL3-Polynucleotid-Mengen während der therapeutischen Behandlung oder Intervention.
  • In einem der Aspekte können PCR-Sonden verwendet werden, um B7-verwandte Polynucleotidsequenzen zu detektieren, einschließlich BSL1-, BSL2- und BSL3-genomische DNA-Sequenzen und BSL1-, BSL2- und BSL3-verwandte Nucleinsäuresequenzen. Die Spezifität der Sonde wird unabhängig davon, ob sie aus einer hochspezifischen Region erzeugt ist, zum Beispiel mindestens 8 bis 10 oder 12 bis 15 zusammenhängende Nucleotide in der 5'-regulatorischen Region oder einer weniger spezifischen Region, zum Beispiel speziell in der 3'-codierenden Region, bestimmen, ob die Sonde lediglich in der Natur vorkommende Sequenzen identifiziert, die B7-verwandtes Polypeptid codieren, Allele davon oder verwandte Sequenzen.
  • Sonden können ebenfalls zum Nachweise von BSL1-, BSL2- und BSL3-verwandten Sequenzen verwendet werden und sollten bevorzugt mindestens 60% und mehr bevorzugt mehr als 90% Identität im Bezug auf das BSL1-, BSL2- und BSL3-Polynucleotid oder einer komplementären Sequenz oder Fragmenten davon aufweisen. Die Sonden der vorliegenden Erfindung können DNA oder RNA sein, wobei die Sonden alle oder ein Teil der Nucleotidsequenz von BSL1 (SEQ ID NO: 2), BSL2 (SEQ ID NO: 7, 11 oder 13) oder BSL3 (SEQ ID NO: 15) aufweisen können oder ein komplementäre Sequenz davon und einen Promotor einschließen können, Enhancer-Elemente und Intronen des in der Natur auftretenden BSL1-, BSL2 oder BSL3-Polynucleotids.
  • Methoden zum Erzeugen spezieller Sonden für B7-verwandte Polynucleotide schließen das Klonieren von Nucleinsäuresequenzen von BSL1, (SEQ ID NO: 2), BSL2 (SEQ ID NO: 7, 11 oder 13) oder BSL3 (SEQ ID NO: 15) oder eines Fragments davon in die Vektoren für die Erzeugung von mRNA-Sonden ein. Derartige Vektoren sind auf dem Fachgebiet bekannt, kommerziell verfügbar und können verwendet werden, um RNA-Sonden in vitro mithilfe der Zugabe der entsprechenden RNA-Polymerasen und den entsprechenden markierten Nucleotiden zu synthetisieren. Hybridisierungssonden können mithilfe einer Vielzahl von Detektor/Reportergruppen markierte werden, zum Beispiel mit Radionucleotiden, wie beispielsweise 32P oder 35S, oder enzymatischen Markern, wie beispielsweise Alkaliphosphatase, gekoppelt mit der Sonde über Avidin/Biotin-koppelnde Systeme und dergleichen.
  • Es ist eine große Zahl von Markern und Methoden zur Konjugation bekannt und wird in der Fachwelt eingesetzt und lässt sich in zahlreichen Nucleinsäure- und Aminosäure-Assays anwenden. Möglichkeiten zum Erzeugen einer markierten Hybridisierung oder von PCR-Sonden zum Detektieren von Sequenzen in Verbindung mit Polynucleotiden, die BSL1-, BSL2- oder BSL3-Polypeptid codieren, schließen Oligo-markieren ein, Nick-Translation, Endmarkierung oder PCR-Amplifikation unter Verwendung eines markierten Nucleotids. Alternativ können BSL1-, BSL2- oder BSL3-Polynucleotidsequenzen oder irgendwelche anderen Teile oder Fragmente davon in einen Vektor zur Erzeugung einer mRNA-Sonde kloniert werden. Derartige Vektoren sind auf dem Fachgebiet bekannt, sind kommerziell verfügbar und können zur synthetischen Darstellung von RNA-Sonden in vitro-Zugabe einer geeigneten RNA-Polymerase dargestellt werden, wie beispielsweise T7, T3 oder SP(6) und markierte Nucleotide. Diese Prozeduren können unter Anwendung einer Vielzahl von kommerziell verfügbaren Kids ausgeführt werden (zum Beispiel von Amersham Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ; Promega Corp., Madison WI; und U.S. Biochemical Corp., U.S. Biochemical Amersham, Cleveland, OH). Geeignete Reportermoleküle oder Marker, die zur Anwendung gelangen können, schließen ein: Radionucleotide, Enzyme, Fluoreszenzsubstanzen, Chemilumineszentsubstanzen oder chromogene Mittel, sowie Substrate, Cofaktoren, Inhibitoren, magnetische Partikel und dergleichen.
  • B7-verwandte Polynucleotidsequenzen oder Fragmente oder komplementäre Sequenzen davon können in der Southern- oder Northern-Analyse, im Dot-Blot oder anderen membranbasierenden Technologien verwendet werden; in PCR-Technologien oder in Dip-Stick, Pin, ELISA oder Biochip-Assays unter Einsatz von Fluids oder Geweben von Patientenbiopsien, um den Status von beispielsweise Mengen oder Überexpression von BSL1, BSL2 oder BSL3 nachzuweisen oder eine veränderte BSL1-, BSL2- oder BSL3-Expression zu detektieren. Derartige qualitative oder quantitative Methoden sind auf dem Fachgebiet gut bekannt (G. H. Keller und M. M. Manuk, 1993, DNA Probes, 2. Ed, Macmillan Publishers Herausgeber, England; D. W. Dieffenbach und G. S. Dveksier, 1995, PCR Primer: A Laborstory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, NY; B. D. Hames und S. J. Higgins, 1985, Gene Probes 1, 2, IRL Press at Oxford University Press, Oxford, England).
  • BSL1-, BSL2- und BSL3-Oligonucleotide lassen sich chemisch, synthetisch darstellen, lassen sich enzymatisch erzeugen oder aus einer rekombinanten Quelle herstellen. Oligomere werden bevorzugt zwei Nucleotidsequenzen aufweisen, von denen die eine eine Sense-Orientierung hat (5'→3') und eine andere eine Antisense-Orientierung hat (3'→5'), und zwar eingesetzt unter optimierten Bedingungen zur Identifikation eines speziellen Gens oder Erkrankung. Die gleichen zwei Oligomere, zusammengesetzte Reihen von Oligomeren und selbst ein degenerierter Pool von Oligomeren können unter weniger strengen Bedingungen für die Detektion und/oder quantitative Bestimmung von eng verwandten DNA- oder RNA-Sequenzen eingesetzt werden.
  • Methoden, die zur quantitativen Bestimmung der Expression von B7-verwandten Faktoren geeignet sind, schließen das Radiomarkieren ein oder die Biotinylierung von Nucleotiden, die Co-Amplifikation einer Kontroll-Nucleinsäure sowie Standardkurven, auf denen die experimentellen Ergebnisse intabuliert sind (P. C. Melby et al. (1993) J. Immunol. Methods 159: 235–244; und C. Duplaa et al. (1993) Anal. Biochem. 229–236). Die Geschwindigkeit der quantitativen Bestimmung mehrfacher Proben lässt sich erhöhen, indem man den Assay in einem ELISA-Format fahrt, wo das Oligomer von Interesse in verschiedenen Verdünnungen präsentiert wird und eine spektrophotometrische oder colorimetrische Reaktion einen schnellen, quantitativen Nachweis liefert.
  • In einem speziellen Aspekt kann eine Nucleinsäuresequenz, die zu einem B7-verwandten Polynucleotid oder Fragment davon komplementär ist, in einem Assay von Nutzen sein, in welchem Krankheiten in Verbindung mit fehlerhaften Immunreaktionen nachgewiesen werden und zwar speziell solche, wie sie hierin beschrieben werden. Es kann ein BSL1-, BSL2- und/oder BSL3-Polynucleotid mithilfe von Standardmethoden markiert werden und einer biologischen Probe von einem Patienten unter geeigneten Bedingungen für die Erzeugung von Hybridisationskomplexen hinzugefügt werden. Nach einer geeigneten Inkubationsdauer kann die Probe gewaschen und das Signal quantitativ bestimmt und mit einem Standardwert verglichen werden. Wenn die Größe des Signals in der Testprobe deutlich gegenüber demjenigen einer vergleichbaren Negativkontroll-Probe (normal) verändert ist, lassen sich die veränderten Werte der BSL1-, BSL2- und/oder BSL3-Nucleotidsequenz mit dem Vorhandensein einer damit im Zusammenhang stehenden Erkrankung in Korrelation bringen. Derartige Assays können auch angewendet werden, um die Wirksamkeit eines speziellen prophylaktischen oder therapeutischen Protokolls in Tieruntersuchungen, in klinischen Versuchsreihen oder bei einem einzelnen Patienten auszuwerten.
  • Um eine Grundlage für die Diagnose einer Erkrankung in Verbindung mit einer veränderten Expression von einem oder mehreren B7-verwandten Faktoren zu schaffen, wird ein normales oder Standardprofil der Expression ermittelt. Dieses kann erfolgen, indem biologische Proben inkubiert werden, die von normalen Probanden genommen wurden, entweder Tier oder Mensch, und zwar mit einer Sequenz, die zu einem BSL1-, BSL2-, BSL3-Polynucleotid oder einem Fragment davon unter Bedingungen komplementär ist, die zur Hybridisierung oder Amplifikation geeignet sind. Die Standardhybridisierung lasst sich quantitativ bestimmen, indem man die Werte, die von normalen Probanden erhalten wurden, mit denen von einem Experiment vergleicht, wo eine bekannte Menge an weitgehend gereinigtem Polynucleotid verwendet wurde. Von normalen Proben erhaltende Standardwerte können mit Werten verglichen werden, die von Proben von Patienten erhalten wurden, die für die Erkrankung symptomatisch sind. Eine Abweichung zwischen den Standardwerten und Probandenwerten (Patient) wird benutzt, um das Bestehen der Erkrankung zu bestätigen.
  • Sobald die Krankheit diagnostiziert ist und ein Behandlungsprotokoll aufgestellt wurde, können Hybridisierungsassays auf regelmäßiger Basis wiederholt werden, um festzustellen, ob sich die Größe der Expression in dem Patienten derjenigen zu nähern beginnt, die in einem normalen Probanden beobachtet wird. Die von aufeinander folgenden Assays erhaltenen Ergebnisse lassen sich verwenden, um die Wirksamkeit der Behandlung über eine Dauer darzustellen, die von mehreren Tagen bis zu Monaten reicht.
  • In Bezug auf Krankheiten unter Beteiligung einer hyperaktiven oder hypoaktiven Immunreaktion kann das Vorhandensein anormaler Mengen (vermindert oder erhöht) von B7-verwandtem Transkript in einer biologischen Probe (zum Beispiel Körperflüssigkeit, Zellen, Gewebe; oder Zell- oder Gewebeextrakte) von einem Probanden auf eine Prädisposition für die Entwickelung der Krankheit hinweisen oder kann ein Mittel zum Nachweisen der Krankheit vor dem Auftreten aktueller klinischer Symptome ermöglichen. Eine enger eingegrenzte Diagnose dieses Typs kann Vertretern des Gesundheitssystems eine Möglichkeit zum Einsatz von Präventivmaßnahmen oder einer aggressiven Behandlung zu einem früheren Zeitpunkt geben, wodurch die Entwicklung oder der weitere Fortschritt der Erkrankung verhindert werden.
  • In einem der speziellen Aspekte können BSL2-Oligonucleotide für PCR-basierende Diagnostik verwendet werden. Beispielsweise kann die PCR angewendet werden, um eine "Genetic Bit Analysis" (GBA) von BSL1, BSL2 und//oder BSL3 entsprechend den veröffentlichten Methoden auszuführen (T. T. Nikiforov et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22(20): 4167–75; T. T. Nikiforov et al. (1994) PCR Methods Appl. 3(5): 285–91). in der PCR-basierenden GBA werden spezielle Fragmente einer genomischen DNA, welche die polymorphe(n) Stelle(n) enthält, zuerst mithilfe der PCR unter Anwendung eines nichtmodifizierten und eines Phosphorthioat modifizierten Primers amplifiziert. Das doppelsträngige PCR- Produkt wird einsträngig gemacht und anschließend hybridisiert, um den immobilisierten Oligonucleotid-Primer in Mulden einer Mikrotiterplatte zu hybridisieren. Zu beachten ist, dass der Primer so beschaffen ist, dass er unmittelbar angrenzend an der polymorphen Stelle, die von Interesse ist, wieder reassoziieren kann. Das 3'-Ende des Primers wird unter Verwendung einer Mischung von individuell markierten Didesoxynucleosidtriphosphaten verlängert. Anschließend wird die Markierung an der verlängerten Base bestimmt. Bevorzugt wird die GBA unter Anwendung von halbautomatisierten ELISA- oder Biochip-Formaten ausgeführt (siehe zum Beispiel S. R. Head et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25(24): 5065–71; T. T. Nikiforov et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22(20): 4167–75).
  • Als Targets in einem Mikroarraysystem (zum Beispiel Biochip) können Oligonucleotide oder längere Fragmente verwendet werden, die von mindestens einer hierin beschriebenen B7-verwandten Polynucleotidsequenz deriviert sind. Der Mikrorarray kann angewendet werden, um das Expressionsniveau großer Zahlen von Genen gleichzeitig zu überwachen (um ein Transkriptbild zu erzeugen) und genetische Varianten, Mutationen und Polymorphismen zu identifizieren. Diese Information lasst sich zur Bestimmung der Genfunktion verwenden, um die genetische Basis einer Erkrankung zu verstehen, um eine Erkrankung zu diagnostizieren und um die Wirksamkeiten therapeutischer oder prophylaktischer Mittel zu entwickeln und zu kontrollieren. Die Herstellung und Anwendung von Mikroarrays ist beschrieben worden in den: WO 95/11995 von Chee et al.; D. J. Lockhart et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 1675–1680; M. Schena et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 10614–10619; US-P-6 015 702 von P. Lal et al.; J. Worley et al. (2000) Microarray Biochip Technology, M. Schena, Herausgeber, Biotechniques Book, Natick, MA, S. 65–86; Y. H. Rogers et al. (1999) Anal. Biochem. 266(1): 23–30; S. R. Head et al. (1999) Mol. Cell. Probes. 13(2): 81–7; S. J. Watson et al. (2000) Biol. Psychiatry 48(12): 1147–56.
  • Mikroarrays, die Arrays von B7-verwandten Polynucleotidsequenzen enthalten, lassen sich verwenden, um die Expressionsniveaus von B7-verwandten Faktoren in einem Probanden zu messen. Insbesondere kann zur Diagnose eines Probanden mit einem Krankheitszustand oder einer Erkrankung, die in Korrelation mit veränderten BSL1-, BSL2- und/oder BSL3-Expressionsniveaus steht, eine Probe von einem Menschen oder einem Tier (die zum Beispiel RNA enthält) als eine Sonde auf einem Biochip verwendet werden, der ein Array von BSL1-, BSL2- und/oder BSL3-Polynucleotiden (zum Beispiel DNA) in abnehmenden Konzentrationen enthält (zum Beispiel 1 ng, 0,1 ng, 0,01 ng, usw.). Die Testprobe kann mit Proben von erkrankten oder normalen Proben verglichen werden. Ebenfalls lassen sich Biochips zur Identifikation von BSL1-, BSL2- und BSL3-Mutationen oder -Polymorphismen in einer Population unter Einbeziehung von Deletionen, Insertionen und Fehlanpassungen verwenden, ohne auf diese beschränkt zu sein. Beispielsweise lassen sich Mutationen wie folgt identifizieren: (i) Aufbringen von B7-verwandten Polynucleotiden der vorliegenden Erfindung auf einen Biochip; (ii) eine Testprobe nehmen (die zum Beispiel nRNA enthält) und die Probe dem Biochip hinzufügen; (iii) Bestimmen, ob die Testproben mit den auf den Chip aufgebrachten B7-verwandten Polynucleotiden unter verschiedenen Hybridisierungsbedingungen hybridisierung (siehe zum Beispiel V. R. Chechetkin et al. (2000) J. Biomol. Struct. Dyn. 18(1): 83–101). Alternativ kann ein Mikroarray-Sequenzieren ausgeführt werden (siehe zum Beispiel E. P. Diamandis (2000) Clin. Chem. 46(10): 1523–5).
  • Es können eine B7-verwandte Nucleinsäuresequenz oder eine komplementäre Sequenz oder ein Fragment davon als Sonden verwendet werden, die zum Kartieren der natürlich auftretenden genomischen Sequenz verwendbar sind. Die Sequenzen können auf ein spezielles Chromosom, auf eine spezielle Region eines Chromosoms oder auf artifizielle Chromosomkonstruktionen (HAC's) kartiert werden, auf Hefeartifizielle Chromosomen (YAC's), auf bakterielle artifizielle Chromosomen (BAC's), bakterielle PI-Konstruktionen oder einzelne Chromosom-cDNA-Banken (siehe C. M. Price (1993) Blood Rev., 7: 127–134 und von B. J. Trask (1991) Trends Genet. 7: 149–154).
  • Es können Antikörper, die spezifisch an ein BSL2-Polypeptid binden, zur Diagnose von Erkrankungen oder Krankheiten verwendet werden, die durch eine Unterexpression oder Überexpression des BSL2-Polynucleotids oder -Polypeptids charakterisiert sind, oder in Assays zur Überwachung von Patienten, die mit einem BSL2-Polypeptid oder -Peptid oder einem BSL2-Agonisten, -Antagonisten oder -Inhibitor behandelt werden. Die für Diagnosezwecke brauchbaren Antikörper lassen sich in der gleichen Weise wie diejenigen zur Verwendung in therapeutischen Methoden herstellen, wie sie hierin beschrieben wurden. Diagnostische Assays für ein BSL2-Polypeptid schließen Methoden ein, bei denen der Antikörper und ein Marker zum Nachweis des Proteins in biologischen Proben verwendet werden (zum Beispiel Körperflüssigkeiten des Menschen, Zellen, Gewebe oder Extrakte von Zellen oder Geweben). Die Antikörper können mit oder ohne Modifikation verwendet werden und können markiert werden, indem man sie entweder kovalent oder nicht kovalent mit einem Reportermolekül vereint. Es kann eine große Vielzahl von Reportermolekülen, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, zur Anwendung gelangen, von denen mehrere hierin beschrieben werden.
  • Es ist eine Reihe von Fluoreszenzmaterialien bekannt und kann zum Markieren von B7-verwandten Polypeptid oder -Antikörpern genutzt werden, die spezifisch daran binden. Diese schließen beispielsweise ein: Fluorescein, Rhodamin, Auramin, Texas Red, AMCA-blau und Lucifer Yellow. Ein spezielles detektierendes Material ist Anti-Kaninchen-Antikörper, hergestellt in Ziegen und konjugiert mit Fluorescein über ein Isothiocyanat. B7-verwandte Polypeptide oder Antikörper daran, können ebenfalls mit einem radioaktiven Element oder mit einem Enzym markiert werden. Die radioaktive Markierung kann mithilfe beliebiger, gegenwärtig verfügbarer Zähl-Prozeduren detektiert werden. Bevorzugte Isotope schließen ein: 3H, 14C, 32P, 35S 36C, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I 131I und 136Re. EnzymMarker sind in ähnlicher Weise verwendbar und können mithilfe irgendeiner der gegenwärtig genutzten kalorimetrischen, spektrophotometrischen, fluorospektrophotometrischen, amperometrischen oder gasometrischen Methoden detektiert werden. Das Enzym kann durch Reaktion mit brückenbildenden Molekülen konjugiert werden, wie beispielsweise Carbodiimide, Diisocyanate, Glutaraldehyd und dergleichen. Viele der Enzyme, die in diesen Prozeduren angewendet werden können, sind bekannt und können genutzt werden. Bevorzugt sind Peroxidase, β-Glucuronidase, β-D-Glucosidase, β-D-Galactosidase, Urease, Glucose-Oxidase plus Peroxidase und Alkaliphosphatase (siehe zum Beispiel US-P-3 654 090 ; 3 850 752 und 4 016 043 ).
  • Die Antikörper-basierende Diagnostik und ihre Anwendung sind dem Fachmann auf dem Gebiet vertraut und können im Sinne der vorliegenden Erfindung angewendet werden. Als nicht einschränkende Beispiele können "kompetitive" ( US-P-3 654 090 und 3 850 752 ), "Sandwich"-( US-P-4 016 043 ) und "Doppelantikörper"- oder "DASP"-Assays angewendet werden. Auf dem Fachgebiet sind mehrere Prozeduren zum Messen von B7-verwandten Polypeptidmengen bekannt, einschließlich ELISA, RIA und FACS, und liefern eine Grundlage zum Diagnostizieren veränderter oder anormaler Mengen an B7-verwandter Polypeptidexpression. Normalwerte oder Standardwerte für die B7-verwandte Polypeptidexpression werden ermittelt, indem man biologische Proben inkubiert, die von normalen Probanden, vorzugsweise Mensch, mit Antikörper auf B7-verwandtes Polypeptid unter Bedingungen genommen wurden, die für eine Komplexbildung geeignet sind. Der Umfang der Standard-Komplexbildung lässt sich quantitativ mithilfe zahlreicher Methoden bestimmen, wobei photometrische Mittel bevorzugt sind. Die Mengen an B7-verwandtem Polypeptid, das in einer Probandenprobe, Negativkontrollprobe (normal) und Positivkontrollprobe (Krankheit) exprimiert wird, werden mit den Standardwerten verglichen. Die Abweichung zwischen Standard- und Probandenwerten ergeben die Parameter zur Diagnose der Krankheit.
  • In einem anderen Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung Diagnostik-Kits zum Nachweisen von B7-verwandten Polynucleotid(en) oder Polypeptid(en) insofern sie die Erkrankung oder Anfälligkeit auf eine Erkrankung betrifft und speziell die Erkrankungen des Immunsystems, wie sie hierin beschrieben werden. Derartige Kits umfassen ein oder mehrere der folgenden:
    • (a) ein B7-verwandtes Polynucleotid entsprechend der Festlegung in den beigefügten Ansprachen und bevorzugt die Nucleotidsequenz BSL2 (SEQ ID NO: 6, 10 oder 12) oder ein Fragment davon, oder
    • (b) eine zu derjenigen von (a) komplementäre Nucleotidsequenz oder
    • (c) ein B7-verwandtes Polypeptid und bevorzugt das Polypeptid von BSL2 (SEQ ID NO: 7, 11 oder 13) oder ein Fragment davon oder
    • (d) einen Antikörper auf ein B7-verwandtes Polypeptid entsprechend den Festlegungen in den beigefügten Ansprüchen und bevorzugt zu dem Polypeptid von BSL2 (SEQ ID NO: 7, 11 oder 13) oder einem Antikörper-bindungsfähigen Fragment davon. Es gilt als selbstverständlich, dass jedes dieser Kits (a), (b), (c) oder (d) eine stoffliche Komponente aufweisen kann und Gebrauchsanweisungen miteinbezogen sein können. Die Kits können ebenfalls periphere Reagenzien enthalten, wie beispielsweise Puffer, Stabilisatoren, usw.
  • In die vorliegende Erfindung ebenfalls einbezogen ist ein Test-Kit zum genetischen Screening, das zur Identifikation von Mutationen in B7-verwandten Faktoren genutzt werden kann. Indem Patienten mit mutierter BSL2-DNA identifiziert und die Mutation mit einer Datenbank verglichen wird, die bekannte Mutationen in BSL2 und einen speziellen Krankheitszustand oder Erkrankung enthält, können eine Identifikation und/oder Bestätigung für einen speziellen Krankheitszustand oder Erkrankung vorgenommen werden. Dementsprechend wird ein derartiges Kit einen PCR-basierenden Test umfassen, bei dem ein Transkribieren der Patienten-mRNA mit einem spezifischen Primer beteiligt ist und das Amplifizieren der resultierenden cDNA unter Anwendung einer anderen Reihe von Primern. Das amplifizierte Produkt wäre mithilfe der Gelelektrophorese nachweisbar und ließe sich mit bekannten Standards für BSL2 vergleichen. Bevorzugt ließe sich dieses Kit für eine Blutprobe, Serumprobe oder Speichelprobe von Patienten nutzen und die DNA könnte unter Anwendung von Standardmethoden extrahiert werden. Sodann würde man eine bekannte Mutation flanierende Primer verwenden, um ein Fragment der BSL2 zu amplifizieren. Das amplifizierte Teilstück würde sodann sequenziert werden, um das Vorhandensein einer Mutation zu bestimmen.
  • THERAPEUTIK
  • PHARMAZEUTISCHE ZUSAMMENSETZUNGEN:
  • Die hierin beschriebenen Zusammensetzungen umfassen eine B7-verwandte Nucleinsäure, Polypeptid, Antikörper, Ligand, Modulator (zum Beispiel Agonist, Antagonist oder Inhibitor) oder Fragmente oder funktionelle Varianten davon sowie einen physiologisch duldbaren Träger, Excipienten oder Streckmittel, wie sie hierin detailliert beschrieben werden. In die vorliegende Erfindung als miteinbezogen gelten ferner pharmazeutische Zusammensetzungen, die in der Ausführung der therapeutischen Methoden der vorliegenden Erfindung verwendbar sind. Vorzugsweise schließt eine pharmazeutische Zusammensetzung eine Zumischung ein, einen pharmazeutisch duldbaren Excipienten (Träger) und ein oder mehrere B7-verwandte Polypeptide, Nucleinsäure, Ligand, Modulator, Antikörper oder Fragment oder funktionelles Äquivalent davon, wie hierin beschrieben wird, sowie einen Wirkstoff. Da es sich bei B7-verwandten Polypeptiden oder Peptiden um natürlich vorkommende, zellulare Komponenten handelt, können sie dem Kreislaufsystem eines Probanden mit einem Minimum an Risiko unerwünschter, immunologischer Komplikationen verabreicht werden.
  • Die Herstellung pharmazeutischer Zusammensetzungen, die biologische Reagenzien als Wirkstoffe enthalten, ist auf dem Fachgebiet gut bekannt. Im typischen Fall werden derartige Zusammensetzungen als injizierbare Präparate entweder in Form von flüssigen Lösungen oder Suspensionen hergestellt, wobei jedoch auch feste Formen hergestellt werden können, die zur Auflösung oder Suspendierung in Flüssigkeit vor der Injektion geeignet sind. Das Präparat kann auch emulgiert sein. Der therapeutische Wirkstoff wird oftmals mit Excipienten gemischt, bei denen, die pharmazeutisch duldbar und mit dem Wirkstoff kompatiebel sind. Geeignete Excipienten sind beispielsweise Wasser, physiologische Kochsalzlösung, Dextrose, Glyzerin, Ethanol oder dergleichen sowie Kombinationen davon. Darüber hinaus kann die Zusammensetzung nach Erfordernis geringfügige Mengen an Hilfssubstanzen enthalten, wie beispielsweise Mittel zum Benetzen oder Emulgieren, pH-puffernde Mittel, die die Wirksamkeit des Wirkstoffes erhöhen.
  • Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können entsprechend den etablierten Methoden erzeugt und in Behandlungsprotokollen in Abhängigkeit von der zu behandelnden Krankheit oder dem erkrankten Zustand erzeugt und eingesetzt werden (siehe beispielsweise P. D. Mayne (1996) Clinical Chemistry in Diagnosis and Treatment, 6. Ausgabe, Oxford University Press, Oxford, England; Gilman et al., Herausgeber (1990) Goodman und Gilman's: The Pharmacological Basis of Therapeutics, B. Ausgabe, Pergamon Press; Avis et al., Herausgeber (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Dekker, New York, NY und Lieberman et al., Herausgeber (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Dekker, New York, NY).
  • Pharmazeutische Zusammensetzungen lassen sich als Salzformen oder in neutraler Form erzeugen. Salze können mit zahlreichen Säuren erzeugt werden, einschließlich Salzsäure, Schwefelsäure, Essigsäure, Milchsäure, Weinsäure, Apfelsäure und Succinsäure, ohne auf diese beschränkt zu sein. Die Zusammensetzungen können in Form von Lösungen vorliegen, Suspensionen, Suppositorien, Tabletten, Pillen, Kapseln, Verbindungen mit verzögerter Freisetzung oder Pulver. Derartige Formulierungen können 10 bis 95% (Gewicht/Gewicht) des Wirkstoffes und bevorzugt 25 bis 70% (Gewicht/Gewicht) enthalten.
  • Wenn die aktive Verbindung durch Injektion verabreicht wird, können beispielsweise etwa 1 μg bis 3 mg und bevorzugt von etwa 20 μg bis 500 μg aktive Verbindung (zum Beispiel B7-verwandtes Polypeptid) pro Dosiseinheit verabreicht werden. Die pharmazeutischen Präparate und Zusammensetzungen können außerdem einen oder mehrere physiologisch duldbare Träger, Excipienten, Steckmittel, Zerfallhilfsmittel, Gleitmittel, Weichmacher, Füllstoffe, Farbmittel, Dosierungsmittel, Absorptionsverstärker, Stabilisiermittel oder Bakteriozide enthalten. Die Erzeugung und Formulierung derartiger Zusammensetzungen und Präparate werden mithilfe von Methoden ausgeführt, wie sie auf dem Fachgebiet bekannt sind und praktiziert werden.
  • Exemplarische Formulierungen werden nachfolgend gegeben: Intravenöse Formulierung I:
    Inhaltsstoff mg/ml
    BSL1, BSL2 oder BSL3 MAb 5,0
    Dextrose nach USP 45,0
    Natriumbisulfit nach USP 3,2
    EDTA, Dinatriumsalz nach USP 0,1
    Wasser zur Injektion q. s. a. d. 1,0 ml
    Intravenöse Formulierung II:
    Inhaltsstoff mg/ml
    BSL1, BSL2 oder BSL3 MAb 5,0
    Natriombisulfit nach USP 3,2
    Dinatrium-EDTA nach USP 0,1
    Wasser zur Injektion q. s. a. d. 1,0 ml
    Intravenöse Formulierung III:
    Inhaltsstoff mg/ml
    BSL1-, BSL2- oder BSL3-Protein, Ig-Fusionsprotein oder Agonist 10,0
    Natriombisulfit nach USP 3,2
    Dinatrium-EDTA nach USP 0,1
    Wasser zur Injektion q. s. a. d. 1,0 ml
    Intravenöse Formulierung IV:
    Inhaltsstoff mg/ml
    BSL1-, BSL2- oder BSL3-Protein, Ig-Fusionsprotein oder Agonist 10,0
    Dextrose nach USP 45,0
    Natriumbisulfit nach USP 3,2
    EDTA, Dinatriumsalz nach USP 0,1
    Wasser zur Injektion q. s. a. d. 1,0 ml
  • Wie hierin verwendet, bedeutet "pg" Pikogramm, "ng" bedeutet Nanogramm, "μg" bedeutet Mikrogramm, "mg" bedeutet Milligramm, "μl" bedeutet Mikroliter, "ml" bedeutet Milliliter und "l" bedeutet Liter.
  • Nach der Herstellung pharmazeutischer Zusammensetzungen können diese in geeignete Behälter gegeben werden und für die Behandlung der angegebenen Erkrankungen gekennzeichnet werden. Eine solche Kennzeichnung kann die Menge, die Häufigkeit und die Methode der Verabreichung einschließen. Präparate können systemisch auf oralem oder parenteralem Weg verabreicht werden. Nichteinschränkende, parenterale Wege der Darreichung schließen subkutan ein, intramuskulär, intraperitonial, intravenös, transdermal, Inhalation, intranasal, intraarteriell, intrathecal, enteral, sublingual oder rektal.
  • Eine therapeutisch wirksame Menge einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die ein oder mehrere B7-verwandte Polypeptide, Fusionsproteine, Peptidfragmente oder Antikörper enthält, die mit diesen Komponenten spezifisch reagieren, ist eine Menge, die ausreicht, um eine Erkrankung oder einen Krankheitszustand in Verbindung mit veränderten Aktivierungsmengen von Zellen der Immunreaktion oder inflammatorischen Reaktion, wie beispielsweise T-Zellen, zu verringern, zu milder oder zu eliminieren. Eine wirksame Menge kann in einer einzelnen Darreichung zugeführt werden oder im Verlaufe wiederholter Darreichungen an einen zu behandelnden Probanden. Der therapeutischen Verabreichung kann eine prophylaktische Verabreichung nach der Behandlung der Erkrankung folgen. Eine nur prophylaktisch wirksame Menge ist eine Menge, die wirksam ist, um eine Erkrankung zu vermeiden, und wird von der speziellen Krankheit und dem Probanden abhängen. Die therapeutisch wirksame Dosis kann anfangs beispielsweise entweder in Zellkultur-Assays oder in Tiermodellen, normalerweise Mäuse, Ratten, Kaninchen, Hunde, Schaf, Ziegen, Schweine oder Nonhuman-Primaten ermittelt werden. Das Tiermodell kann auch zur Bestimmung der verträglichen Höchstdosis und des geeigneten Darreichungsweges angewendet werden. Eine solche Information lässt sich dann verwenden, um anwendbare Dosismengen und Darreichungswege in Menschen zu ermitteln.
  • Die Verabreichung der therapeutischen Zusammensetzungen an einen Probanden lässt sich unter Anwendung bekannter Prozeduren mit Dosismengen und über eine Zeitdauer ausführen, die zum Erreichen des gewünschten Resultats wirksam sind. Beispielsweise kann eine therapeutisch wirksame Menge von B7-verwandten Polypeptiden, Fusionsproteinen, Peptiden oder Antikörpern, die mit diesen Komponenten reagieren, in Abhängigkeit von Faktoren variieren, wie beispielsweise Alter, Geschlecht und Gewicht des einzelnen Probanden sowie der Behandlungsmöglichkeit, um die gewünschte Reaktion in dem Probanden hervorzubringen. Die Dosismengen können so eingestellt werden, dass eine optimale therapeutische Reaktion hervorgerufen wird. Beispielsweise können mehrere aufeinander folgende Dosierungen täglich verabreicht werden, oder die Dosis kann proportional verringert werden, wie durch die Erfordernisse der therapeutischen Situation angezeigt ist.
  • GENTRANSFERTHERAPIE
  • Zusätzlich können Wirtszellen, die genetisch so bearbeitet wurden, dass sie das Gen führen, welches ein B7-verwandtes Polypeptid, Fusionspeptid oder Peptidfragment codiert, das ein Fragment des BSL1-(SEQ ID NO: 2), BSL2-(SEQ ID NO: 7, 11 oder 13) oder BSL3-(SEQ ID NO: 15)Polypeptidsequenz aufweist, in einen Probanden mit Bedarf für eine Immunmodulation eingeführt werden. Nach der Expression und Erzeugung des B7-verwandten-Peptids durch die Wirtszelle kann das auf diese Weise erzeugte B7-verwandte Polypeptid, Fusionsprotein oder Peptid ein Binden von CD28- und/oder CD28-verwandten Ligand(en) bewirken, um in dem Empfänger die Aktivierung von Zellen der Immunreaktion oder inflammatorischen Reaktion zu modulieren (zum Beispiel T-Zellen). Wirtszellen lassen sich genetisch mithilfe einer Vielzahl von molekularen Methoden und Methoden bearbeiten, die in der Fachwelt bekannt sind, wie beispielsweise Transfektion, Infektion oder Transduktion. Die Transduktion, wie sie hierin angewendet wird, bezieht sich üblicherweise auf Zellen, die genetisch so verarbeitet wurden, dass sie ein Fremdgen oder heterologes Gen enthalten, und zwar über die Einführung eines viralen oder nichtviralen Vektors in die Zellen. Häufiger bezieht sich die Transfektion auf Zellen, die genetisch so bearbeitet wurden, dass sie ein in einem Plasmid oder nichtviralen Vektor ruhendes Fremdgen enthalten. Wirtszellen können mithilfe verschiedener Vektoren transfiziert und transduziert werden und können so als Vehikel zur Genzuführung dienen, um die exprimierten Produkte in den Muskel zu übertragen.
  • Obgleich virale Vektoren für Gentransfer-Therapien bevorzugt sind, können mithilfe zahlreicher, auf dem Fachgebiet bekannter Methoden Zellen genetisch so bearbeitet werden, dass sie Nucleinsäuresequenzen enthalten, die das gewünschte Genprodukt/Genprodukte codieren. Beispielsweise können Zellen genetisch bearbeitet werden durch Fusion, Transfektion, Lipofektion vermittelt durch Anwendung von Liposomen, Elektroporation, Präzipitation mit DEAE-Dextran oder Calciumphosphat, Partikelbeschuss (Biolistik) mit Nucleinsäure beschichteten Partikeln (zum Beispiel Goldpartikel); Mikroinjektion oder genetisch bearbeitete Mikroorganismen (K. Yazawa et al. (2000) Cancer Gene Ther. 7: 269–274). Vektoren zum Einführen von Heterologa (d. h. Fremda) Nucleinsäure (DNA oder RNA) in Muskelzellen für die Expression aktiver/bioaktiver Produkte sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Derartige Vektoren besitzen eine Promotorsequenz und bevorzugt einen Promotor, der zellspezifisch ist und upstream zu der zu exprimierenden Sequenz angeordnet ist. Die Vektoren können ggf. auch ein oder mehrere exprimierbare Markergene zur Expression als eine Indikation einer erfolgreichen Transfektion und Expression der Nucleinsäuresequenzen enthalten, die in dem Vektor enthalten sind. Darüber hinaus können Vektoren so optimiert werden, dass sie eine unerwünschte Immunogenität auf ein Minimum herabsetzen und eine Langzeitexpression des gewünschten Genproduktes/der gewünschten Genprodukte auf ein Maximum bringen (siehe Nabel (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 324–326). Darüber hinaus können Vektoren auf Basis des Zelltyps gewählt werden, der für die Behandlung als Target dient. Beispielsweise sind Vektoren für die Behandlung von Tumor- oder Krebszellen beschrieben worden (P. L. Hallenbeck et al. (1999) Hum. Gene Ther. 10: 1721–1733; T. Shibata et al. (2000) Gene Ther. 7: 493–498; M. Puhlmann et al. (2000) Cancer Gene Ther. 7: 66–73; N. Krauzewicz et al. (2000) Adv. Exp. Med. Biol. 465: 73–82).
  • Veranschaulichende Beispiele für Vehikel oder Vektorkonstrukte zur Transfektion oder Infektion der Wirtszellen schließen replikationsdefekte, virale Vektoren, DNA-Virus oder RNA-Virus(Retrovirus)-Vektoren ein, wie beispielsweise Adenvirus, Herpessimplex-Virus und Adeno-assoziierte virale Vektoren. Adeno-assoziierte Virusvektoren sind einsträngig und ermöglichen die wirksame Zuführung von Mehrfachkopien von Nucleinsäure zu dem Zellkern. Bevorzugt sind Adenovirus-Vektoren. Die Vektoren werden normalerweise weitgehend frei sein von jeglicher prokaryotischer DNA und können eine Reihe verschiedener funktioneller Nucleinsäuresequenzen aufweisen. Ein Beispiel für derartige funktionelle Sequenzen kann eine DNA-Region sein, die transkriptionelle und translationelle regulatorische Initiations- und Terminationssequenzen aufweist, einschließlich Promotoren (zum Beispiel starke Promotoren, induzierbare Promotoren und dergleichen) und Enhancer, die in den Wirtszellen aktiv sind. Ebenfalls einbezogen als Bestandteil der funktionellen Sequenzen ist ein offenes Leseraster (Polynucleotidsequenz), das ein Protein codiert, welches von Interesse ist. Ebenfalls können flankierende Sequenzen für eine ortsgerichtete Integration einbezogen sein. In einigen Fällen wird die 5'-flankierende Sequenz eine homologe Rekombination ermöglichen und dadurch die Beschaffenheit der transkriptionellen Initiationsregion verändern, um so für eine induzierbare oder nichtinduzierbare Transkription zur Erhöhung oder Verringerung beispielsweise des Transkriptionsmaßes zu sorgen.
  • Im Allgemeinen kann der codierte und exprimierte B7-verwandte Faktor intrazellulär sein, d. h. in dem Cytoplasma, dem Kern oder einer Organelle einer Zelle erhalten bleiben, oder kann durch die Zelle ausgeschieden werden. Bei einer Sekretion kann die natürliche Signalsequenz, die in dem B7-verwandten Strukturgen vorhanden ist, erhalten bleiben. Wenn das Polypeptid oder Peptid ein Fragment eines B7-verwandten Faktors ist, das größer ist, kann eine Signalsequenz so beschaffen werden, sodass bei Sekretion und Bearbeitung an der Bearbeitungsstelle das gewünschte Protein die natürliche Sequenz haben wird. Spezielle Beispiele codierender Sequenzen, die zur Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung von Interesse sind, schließen die BSL2 (SEQ ID NO: 7, 11 oder 13) Polypeptid-codierenden Sequenzen ein. Wie bereits erwähnt, kann ein Marker zur Selektion von Zellen vorhanden sein, die das Vektorkonstrukt enthalten. Der Marker kann ein induzierbares oder ein nichtinduzierbares Gen sein und wird in der Regel eine positive Selektion unter Induktion bzw. ohne Induktion ermöglichen. Beispiele fü Markergene schließen Neomycin ein, Dihydrofolatreduktase, Glutaminsynthetase und dergleichen.
  • Der Vektor, der eingesetzt wird, wird in der Regel einen Ursprung von Replikations- und anderen Genen einschließen, die für die Replikation in den Wirtszellen erforderlich sind, wie sie routinemäßig in der Fachwelt zum Einsatz gelangen. Als Bestandteil des Konstruktes kann beispielsweise das Replikationssystem einbezogen werden, das den Replikationsursprung aufweist und etwaige Proteine in Verbindung mit der Replikation, die durch einen speziellen Virus codiert wird. Das Replikationssystem muss so ausgewählt werden, dass die Gene, die die Produkte codieren, die für die Replikation erforderlich sind, die Zellen schließlich nicht transformieren. Derartige Replikationssysteme werden durch den replikationsdefekten Adenvirus dargestellt (siehe G. Acsadi et al. (1994) Hum. Mol. Genet. 3: 579–584) und durch den Epstein-Barr-Virus. Beispiele für replikationsdefekte Vektoren und speziell für retrovirale Vektoren, die replikationsdefekt sind, sind BAG (siehe beispielsweise Price et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 156; Safes et al. (1986) EMBO J., 5: 3133). Es gilt als selbstverständlich, dass das abschließende Genkonstrukt ein oder mehrere Gene von Interesse enthalten kann, wie beispielsweise ein Gen, welches ein bioaktives, metabolisches Molekül codiert. Darüber hinaus lassen sich cDNA, synthetisch erzeugte DNA oder chromosomale DNA einsetzen, indem Methoden und Protokolle genutzt werden, wie sie in der Fachwelt bekannt sind und dort praktiziert werden.
  • Nach einer der Vorgehensweisen der Gentherapie wird ein Vektor, der einen B7-verwandten Faktor codiert, direkt in die Empfhägerzellen injiziert (in vivo-Gentherapie). Alternativ werden Zellen von den vorgesehenen Empfängern explantiert, genetisch so modifiziert, dass sie einen B7-verwandten Faktor codieren und in den Spender reimplantiert (ex vivo-Gentherapie). Eine ex vivo-Methode bietet den Vorteil eines effizienten Virusgentransfers, der den Vorgehensweisen des in vivo-Gentransfers überlegen ist. In der ex vivo-Gentherapie werden die Wirtszellen zuerst mit bearbeiteten viralen Vektoren infiziert, die mindestens ein B7-verwandtes Gen enthalten, welches ein B7-verwandtes Genprodukt codiert, werden in einem physiologisch duldbaren Träger oder Exzipienten suspendiert, wie beispielsweise physiologische Kochsalzlösung oder Phosphat gepufferte Salzlösung und dergleichen, und anschließend dem Wirt verabreicht. Das gewünschte Genprodukt wird durch die injizierten Zellen exprimiert, die auf diese Weise das Genprodukt in den Wirt einführen. Die eingeführten Genprodukte können dadurch zur Behandlung oder Milderung einer Erkrankung genutzt werden, die in Verbindung mit veränderten Mengen der Aktivierung von Zellen mit Immunreaktion oder inflammatorischer Reaktion stehen (zum Beispiel T-Zellen).
  • METHODE DER IMMUNMODULATION
  • Die BSL2-Nucleinsäure- und Polypeptidsequenzen lassen sich in der Entwicklung von therapeutischen Reagenzien verwenden, die über die Fähigkeit verfügen, entweder Immunreaktionen (zum Beispiel T-Zellaktivierung) aufwärts regulieren (amplifizieren) oder abwärts regulieren (unterdrücken). Insbesondere können B7-verwandte Polypeptide mit CD28 Wechselwirken und dadurch eine Immunzellaktivität aufwärts regulieren. Alternativ können B7-verwandte Polypeptide mit CTLA-4 Wechselwirken und dadurch eine Immunzellaktivität abwärts regulieren. Beispielsweise können lösliche, dimere Formen der B7-verwandten Polypeptide, die an dem/den CD28- und/oder CD28-verwandten Liganden binden, jedoch dabei versagen, ein costimulatorisches Signal an die T-Zellen zu senden, verwendet werden, um die T-Zellaktivierung zu blockieren und dadurch ein spezifisches Mittel bereitzustellen, mit dem in einem Probanden Toleranz ausgelöst wird. In ähnlicher Weise können gegen einen oder mehrere B7-verwandte Faktoren gerichtete Antikörper verwendet werden, um die Wechselwirkung zwischen den B7-verwandten Faktoren und ihren damit zusammenhängenden Ligand(en) zu blockieren, wodurch die Aktivierung der Zellen der Immunreaktion oder inflammatorischen Reaktion (zum Beispiel T-Zellen) gehemmt wird. Darüber hinaus können Fusionsproteine, die mindestens ein Fragment eines B7-verwandten Faktors fusioniert mit mindestens der Fc-Domäne eines IgG-Moleküls aufweisen, verwendet werden, um Zellen aufwärts oder abwärts zu regulieren, die den/die zusammenhängenden Ligand(en) des B7-verwandten Faktors exprimieren (zum Beispiel T-Zellen). Darüber hinaus können Antisense- oder Triplex-Oligonucleotide, die an der Nucleotidsequenz eines oder mehrerer B7-verwandter Faktoren binden, verwendet werden, um die Expression dieser Faktoren zu vermindern. Im Gegensatz dazu können Zelloberfläche-multivalente Formen von B7-verwandten Faktoren, die an dem/den CD28- und/oder CD28-verwandten Ligand(en) binden und ein costimulatorisches Signal für die Zellen der Immunreaktion oder inflammatorischen Reaktion bereitstellen, wie beispielsweise T-Zellen, verwendet werden, um die Aktivierung dieser Zellen zu erhöhen. Ebenfalls ist es möglich, mehr als einen B7-verwandten Faktor, Fusionsprotein, Antikörper oder therapeutisch aktive Fragmente davon zu nutzen, um die Aktivität von Immun- oder inflammatorischen Zellen (zum Beispiel T-Zellen) in einem Tier oder Menschen als Probanden aufwärts oder abwärts zu regulieren.
  • Angesichts der vorgegebenen Struktur und Funktion der B7-verwandeten Faktoren, wie sie hierin offenbart werden, ist es spezieller möglich, die Funktion eines B7-verwandten Faktors in einer Reihe von Möglichkeiten aufwärts oder abwärts zu regulieren. Das Aufwärtsregulieren oder Abwärtsregulieren von einem oder mehreren B7-verwandten Faktorfunktionen (d. h. Verhindern eines hohen Maßes der Lymphokinsynthese durch aktivierte T-Zellen) sollte bei der Behandlung von Autoimmun-Erkrankungen nützlich sein, wie beispielsweise rheumatoider Arthritis, multipler Sklerose, Lupus erythematosus, Hashimoto's thyroiditis, primäres Myxödem, Basedokrankheit, perniziöse Anämie, autoimmun atrophische Gastritis, Insulin-abhängiger Diabetes melitus, Good-Pasture's-Syndrom, Myasthenia gravis, Pemphigus, Morbus Crohn, sympatischer Opthalmia, autoimmune Uveitis, autoimmune hämolytische Anämie, idiopathische Thrombocytopenie, primäre biliäre Zirrhose, ulcerative Colitis, Sjogren's Syndrom, Polymyositis und gemischte Bindegewebserkrankung. B7-verwandte Faktoren können auch zur Behandlung von entzündungsbedingter Psoriasis, chronischer obstruktiver pulmonärer Erkrankung, Asthma und Atherosklerose abwärts reguliert werden. Zusätzlich können B7-verwandte Faktoren für die Behandlung von Gewebe, Knochenmark und Organtransplantation und Wirt-anti-Transplantatreaktion abwärts reguliert werden. Beispielsweise sollte eine Blockierung der T-Zellfunktion zu einer verringerten Gewebezerstörung bei Gewebetransplantation führen. Im typischen Fall wird die Gewebeabstoßung bei Gewebetransplantaten durch dessen Erkennung als Fremdmaterial eingeleitet, gefolgt von einer Immunreaktion, die das Transplantat zerstört. Die B7-verwandten Moleküle der vorliegenden Erfindung können auch zur Behandlung oder Verhütung von Krebserkrankungen verwendet werden, wie sie nachfolgend detailliert beschrieben werden.
  • Die B7-verwandten Nucleinsäuremoleküle können zu Aufbau von Therapeutika verwendet werden, um die Funktion von einem oder mehreren B7-verwandten Faktoren zu blockieren. Insbesondere können Antisense- oder Triplex-Oligonucleotide verabreicht werden, um die Expression der BSL1-, BSL2- und/oder BSL3-Faktoren zu verhindern. Beispielsweise kann ein Oligonucleotid (zum Beispiel DNA-Oligonucleotid), welches zu der BSL1-, BSL2- und/oder BSL3-mRNA hybridisiert, verwendet werden, um auf die mRNA für den RnaseH-Abbau zu zielen. Alternativ kann ein Oligonucleotid, das zu der Translationsinitiationsstelle der BSL1(SEQ ID NO: 1 oder 3)-, BSL2(SEQ ID NO: 6, 10 oder 12)- oder BSL3(SEQ ID NO: 14)-mRNA hybridisiert, verwendet werden, um die Translation der mRNA zu verhindern. In einer anderen Vorgehensweise können Oligonucleotide, die an der doppelsträngigen DNA des/der BSL1-, BSL2- und/oder BSL3-Gens/Gene binden, verabreicht werden. Derartige Oligonucleotide können ein Triplexkonstrukt bilden und das Aufwickeln und die Transkription der DNA verhindern, die den B7-verwandten Faktor, auf den gezielt wird, codiert. In allen Fällen kann das entsprechende Oligonucleotid synthetisch dargestellt werden, als pharmazeutische Zusammensetzung formuliert und an einen Probanden verabreicht werden. Die Synthese und Nutzung von Antisense- und Triplex-Oligonucleotiden ist bereits beschrieben worden (siehe beispielsweise H. Simon et al. (1999) Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 9: 527–31; F. X. Barre et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 3084–3088; R. Elez et al. (2000) Biochem. Biophys. Res. Commun. 269: 352–6; E. R. Sauter et al. (2000) Clin. Cancer Res. 6: 654–60).
  • Antisense-Oligonucleotide sind eine in der Natur aufretende Oligonucleotid-Spezies oder synthetische Spezies, die aus in der Natur auftretenden Untereinheiten oder deren engen Verwandten gebildet wird. Antisense-Oligonucleotide können auch Teile einschließen, die ähnlich wie Oligonucleotide fungieren, die jedoch nicht natürlich auftretende Abschnitte haben. Antisense-Oligonucleotide können so über veränderte Zucker-Abschnitte oder Zucker-Zwischenverknüpfungen verfügen. Unter diesen sind Phosphorthioate und andere Schwefel enthaltende Spezies exemplarisch, die auf dem Fachgebiet bekannt sind.
  • In bevorzugten Ausführungsformen sind mindestens eine der Phosphodiester-Bindungen des Antisense-Oligonucleotid mit einer Struktur substituiert worden, die zur Verstärkung der Fähigkeit der Zusammensetzungen dient, um in die Region von Zellen einzudringen, wo sich die RNA befindet, deren Aktivität moduliert werden soll. Bevorzugt weisen derartige Substitutionen Phosphorthioat-Bindungen auf, Methylphosphonat-Bindungen oder kurzkettige Alkyl- oder Zykloalkylstrukturen. Gemäß anderen bevorzugten Ausführungsformen sind die Phosphodiester-Bindungen mit Strukturen substituiert, die sofort weitgehend nichtionisch oder nicht-chiral sind, oder mit Strukturen, die chiral und enantiomer-spezifisch sind. Der Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet wird in der Lage sein, andere Verknüpfungen zur Verwendung in der Praxis der Erfindung auszuwählen.
  • In Antisense-Oligonucleotide können Spezies einbezogen sein, die mindestens einige modifizierte Base-Formen haben. Damit können Purine und Pyrimidine außer denen zum Einsatz gelangen, die normalerweise in der Natur angetroffen werden. In ähnlicher Weise können Modifikationen an den Furanosyl-Teilen der Nucleotid-Untereinheiten herbeigeführt werden, solange die wesentlichen Grundsätze der vorliegenden Erfindung eingehalten sind. Beispiele für derartige Modifikationen sind mit 2'-O-Alkyl- und 2'-Halogen-substituierte Nucleotide. Einige nichteinschränkende Beispiele für Modifikationen in der 2'-Stellung von Zucker-Teilen, die in der vorliegenden Erfindung verwendbar sind, schließen OH ein, SH, SCH3, F, OCH3, OCN, O(CH2)n NH2 und O(CH2)n CH3, worin n 1 bis etwa 10 beträgt. Derartige Antisense-Oligonucleotide sind funktionell austauschbar mit natürlichen Oligonucleotiden oder synthetischen Oligonucleotiden, die gegenüber der natürlichen Struktur ein oder mehrere Unterschiede zeigen. Alle derartigen Analogsubstanzen gelten in der vorliegenden Erfindung miteinbezogen, solange sie ihre Funktion effektiv ausüben, mit BSL1-, BSL2- oder BSL3-DNA oder -RNA hybridisieren, um deren Funktion zu hemmen.
  • Bei Antisense-Therapeutika weisen die Oligonucleotide bevorzugt etwa 3 bis etwa 50 Untereinheiten auf. Mehr bevorzugt weisen die Oligonucleotide und Analoga etwa 8 bis etwa 25 Untereinheiten auf und noch mehr bevorzugt haben sie etwa 12 bis etwa 20 Untereinheiten. Wie hierin festgelegt, ist eine "Untereinheit" eine Base- und Zucker-Kombination, die geeigneterweise an angrenzenden Untereinheiten über Phosphodiester- oder andere Bindungen gebunden sind.
  • Antisense-Oligonucleotide können mithilfe von Standardmethoden erzeugt werden/siehe hierzu beispielsweise Shewmaker et al. in der US-P-5 107 065 ). Die gemäß der vorliegenden Erfindung zur Anwendung gelangenden Oligonucleotide lassen sich mühelos und routinemäßig mithilfe wohlbekannter Methoden der Festphasensynthese erzeugen. Eine Anlage für eine solche Synthese ist bei verschiedenen Herstellern verfügbar, einschließlich PE Applied Biosystems (Forster City, CA). Es kann auch jede beliebige andere Maßnahme für eine derartige Synthese eingesetzt werden, wobei jedoch die eigentliche Synthese der Oligonucleotide innerhalb der Möglichkeiten des Praktikers liegt. Ebenfalls ist die Herstellung anderer Oligonucleotide bekannt, wie beispielsweise Phosphorthioate und alkylierte Derivate.
  • Die Oligonucleotide sind so aufgebaut, dass sie mit BSL2-RNA (zum Beispiel mRNA) oder -DNA hybridisieren. Beispielsweise kann ein Oligonucleotid (zum Beispiel ein DNA-Oligonucleotid), das mit B7-verwandter mRNA hybridisiert, verwendet werden, um auf die mRNA bei einer RnaseH-Digestion zu zielen. Alternativ kann ein Oligonucleotid, das zu der Translationsinitiationsstelle von B7-verwandter mRNA hybridisiert, zur Verhinderung einer Translation der mRNA verwendet werden. In einer anderen Vorgehensweise können Oligonucleotide, die an der doppelsträngigen DNA von BSL2 binden, verabreicht werden. Derartige Oligonucleotide können ein Triplex-Konstrukt bilden und die Transkription der DNA-codierenden BSL2-Polypeptide hemmen. Die Paarbildung einer Tripelhelix verhindert die ausreichende Öffnung der Doppelhelix, um ein Binden von Polymerase, Transkriptionsfaktoren oder regulatorischen Molekülen zu ermöglichen. Neuere Fortschritte bei den Therapeutika unter Verwendung von Triplex-DNA sind bereits beschrieben worden (siehe beispielsweise J. E. Gee et al. (1994) Molecular and Immunologic Approaches, Futura Publishing Co., Mt. Kisco, NY).
  • Als nichteinschränkende Beispiele lassen sich Antisense-Oligonucleotide zur Hybridisierung mit den folgenden Regionen ausrichten: mRNA-Cap-Region; Translationsinitiationsstelle; Translationsterminationsstelle; Transkriptionsinitiationsstelle; Transkriptionsterminationsstelle, Polyadenylierungssignal; 3'-untranslatierte Region; 5'-untranslatierte Region; 5'-codierende Region; Mitte-codierende Region und 3'-codierende Region. Bevorzugt ist das komplementäre Oligonucleotid so aufgebaut, dass es mit der einzigsten 5'-Sequenz in BSL1, BSL2 oder BSL3 einschließlich beliebiger von etwa 15 bis 35 Nucleotiden, die die 5'-codierende Sequenz überspannen, hybridisiert. Entsprechende Oligonucleotide lassen sich unter Anwendung der OLIGO-Software aufbauen (Molecular Biology Insights, Inc., Cascade, CO; http://www.oligo.net).
  • Das Antisense-Oligonucleotid lässt sich synthetisch darstellen, als eine pharmazeutische Zusammensetzung formulieren und an einen Probanden verabreichen. Die Synthese und Nutzung von Antisense- und Triplex-Oligonucleotiden sind bereits beschrieben worden (siehe beispielsweise H. Simon et al. (1999) Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 9: 527–31; F. X. Barre et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 3084–3088; R. Elez et al. (2000) Biochem. Biophys. Res. Commun. 269: 352–6; E. R. Sauter et al. (2000) Clin. Cancer Res. 6: 654–60). Alternativ können Expressionsvektoren, deriviert von Retroviren, Adenviren, Herpes- oder Vacciniaviren oder von verschiedenen bakteriellen Plasmiden, für die Zuführung von Nucleotidsequenzen zu den als Ziel gewählten Organ-, Gewebe- oder Zellpopulation verwendet werden. Zur Konstruktion rekombinanter Vektoren, welche die Nucleinsäuresequenz exprimieren, die zu der Nucleinsäuresequenz komplementär ist, die ein BSL1-, BSL2- oder BSL3-Polypeptid codiert, können Methoden angewendet werden, die der Fachwelt wohl bekannt sind. Diese Methoden wurden sowohl von Sambrook et al. (1989) als auch von Ausubel et al. (1992) beschrieben. Beispielsweise kann eine BSL1-, BSL2- oder BSL3-Expression gehemmt werden, indem eine Zelle oder Gewebe mit einem Expressionsvektor transformiert werden, der hohe Mengen an nichttranslatierbaren Sense- oder Antisensesequenzen exprimiert. Selbst bei Abwesenheit einer Integration in die DNA können derartige Vektoren das Transkribieren von RNA-Molekülen fortsetzen, bis sie durch endogene Nucleasen unfähig geworden sind. Eine transiente Expression kann über Monate dauern oder länger mit einem nichtreplizierenden Vektor und sogar noch länger, wenn in das Vektorsystem entsprechende Replikationselemente einbezogen sind.
  • Es können verschiedene Assays verwendet werden, um die Fähigkeit von speziellen Antisense-Oligonucleotiden zu testen, die BSL1-, BSL2- oder BSL3-Expression zu hemmen. Beispielsweise können mRNA-Mengen mithilfe der Northern-Blot-Analyse ermittelt werden (Sambrook et al. (1989); Ausubel et al. (1992); J. C. Alwine et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5350–5354; I. M. Bird (1998) Methods Mol. Biol. 105: 325–36), quantitative oder semiquantitative RT-PCR-Analyse (siehe beispielsweise W. M. Freeman et al. (1999) Biotechniques 26: 112–122; Ren et al. (1998) Mol. Brain Res. 59: 256–63; J. M. Cale et al. (1998), Methods Mol. Biol. 105: 351–71), oder in situ-Hybridisierung (Übersichtsarbeit von A. K. Raap (1998) Mutat. Res. 400: 287–298). Alternativ können Antisense-Oligonucleotide durch Messen der Mengen an BSL1-, BSL2- oder BSL3-Polypeptid ermittelt werden, beispielsweise mithilfe der Western-Blot-Analyse, mithilfe der indirekten Immunoflureszenz, Immunopräzipitation-Methoden (siehe hierzu beispielsweise J. M. Walker (1998) Protein Protocols an CD-ROM, Humana Press, Totowa, NJ).
  • Die B7-verwandten Polypeptidsequenzen können auch beim Aufbau therapeutischer Mittel zum Blocken oder Verstärken der Aktivität von Zellen der Immunreaktion nützlich sein (zum Beispiel T-Zellen). Beispielsweise kann ein Fusionsprotein, welches den löslichen Teil eines B7-verwandten Polypeptids konjugiert mit der Fc-Domäne von Human-IgG aufweist, mithilfe von Standard-Rekombinationsmethoden aufgebaut werden, wie sie vorstehend beschrieben wurden. Die BSL1-Ig-, BSL2-Ig- und/oder BSL3-Ig-Fusionsproteine können als pharmazeutische Zusammensetzungen hergestellt und an einen Probanden verabreicht werden. Die BSL1-Ig-, BSL2-Ig- und/oder BSL3-Ig-Fusionsproteine können verwendet werden, um auf spezielle T-Zellen zur Zerstörung gerichtet zu werden, wodurch die T-Zell-Gesamtaktivierung verringert wird. Derartige Behandlungsmethoden können auf Tierexperimenten modelliert werden, die CTLA-4-Ig nutzen, um eine Herztransplantatabstoßung zu verhindern (Turka et al., supra). Für den Fachmann auf dem Gebiet wird es selbstverständlich sein, dass derartige Methoden zur Verwendung bei Menschen angepasst werden können sowie zur Verwendung unter anderen Bedingungen und einschließlich verschiedenen Transplantaten und Autoimmunerkrankungen. Alternativ können die BSL1-Ig-, BSL2-Ig- und/oder BSL3-Ig-Fusionsproteine verwendet werden, um die T-Zellaktivierung zu verstärken. Beispielsweise können BSL2-Ig- und BSL3-Ig-Fusionsproteine als costimulatorische Moleküle verwendet werden, wie hierin detailliert offenbart wurde.
  • Als eine alternative Vorgehensweise können Antikörper, die mit B7-verwandten Polypeptiden oder Peptiden spezifisch reagieren, zum Blockieren der Aktivität von Zellen der Immunreaktion oder inflammatorischen Reaktion verwendet werden (zum Beispiel T-Zellen). Es können Antikörper oder verwandte Antikörperfragmente, die an Peptiden oder Polypeptiden binden, welche die BSL1(SEQ ID NO: 2)-, BSL2(SEQ ID NO: 7, 11 oder 13)- oder BSL3(SEQ ID NO: 15)-Sequenzen aufweisen, als pharmazeutische Zusammensetzungen formuliert und allein oder in Kombination einem Probanden verabreicht werden. Derartige Antikörper können dann die Wechselwirkung der B7-verwandten Polypeptide mit CD28- und/oder CD28-verwandten Liganden hemmen und dadurch eine T-Zellaktivierung verhindern. Behandlungen unter Nutzung von Antikörpern, die gegen B7-verwandte Faktoren gerichtet sind, lassen sich an Tierexperimenten modellieren, bei denen Antikörper gegen CD28, B7-1 oder B7-2 verwendet werden (D. J. Lenshow et al. (1995) Transplantation 60: 1171–1178; Y. Seko et al. (1998) Circ. Res. 83: 463–469; A. Haczku et al. (1999) Am. J. Respir. Crit. Care Med. 159: 1638–1643). Der Fachmann auf dem Gebiet kann derartige Methoden zur Verwendung bei Menschen anpassen sowie zur Anwendung unter verschiedenen Bedingungen, welche eine Entzündung oder Transplantation umfassen.
  • Es ist bekannt, dass Antikörper-basierende Therapeutika, die aus Nonhuman-Quellen erzeugt sind, bei Human-Probanden eine unerwünschte Immunreaktion hervorrufen können. Um dieses Problem auf ein Minimum herabzusetzen, können chimäre Antikörperderivate erzeugt werden. Chimäre Antikörper vereinen eine variable Nonhuman-Tier-Region mit einer konstanten Humanregion. Chimäre Antikörper können entsprechend den auf dem Fachgebiet bekannten Methoden konstruiert werden (siehe Morrison et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851; Takeda et al. (1985) Nature 314: 452; US-P-4 816 567 von Cabilly et al.; US-P-4 816 397 von Boss et al.; European Patent Publication EP 171496 ; EP 0173494 ; United Kingdom Patent GB-P 2177096B ). Zusätzlich können Antikörper weiter mithilfe irgendeiner auf dem Fachgebiet bekannten Methode "humanisiert" werden (zum Beispiel Teng et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 7308–7312; Kozbor et al. (1983) Immunology Today 4: 7279; Olsson et al (1982) Meth. Enzymol. 92: 3–16; Internationale Patentanmeldung WO 92/06193 ; EP 0239400 ). Humanisierte Antikörper können auch von kommerziellen Quellen erhalten werden (zum Beispiel Scotgen Limited, Middlesex, Großbritannien). Eine Immuntherapie mit einem humanisierten Antikörper kann zu einer erhöhten, langfristigen Wirksamkeit für die Behandlung chronischer Erkrankungen oder Situationen führen, die wiederholte Antikörperbehandlungen erfordern.
  • In einer noch anderen Vorgehensweise kann ein isolierter Ligand eines B7-verwandten Faktors zum Abwärtsregulieren der Aktivität von Zellen der Immunreaktion oder inflammatorischen Reaktion (zum Beispiel T-Zellen) verwendet werden. Beispielsweise kann ein lösliches Fusionsprotein, das einen B7-verwandten Faktor-Liganden aufweist, hergestellt, isoliert und zur Erzeugung einer pharmazeutischen Immunzusammensetzung gemäß den hierin detailliert beschriebenen Methoden verwendet werden. Diese pharmazeutische Zusammensetzung kann anschließend einem Probanden verabreicht werden, um einen oder mehrere endogene, B7-verwandte Faktoren zu binden und die Aktivierung von Zellen der Immun- oder inflammatorischen Reaktion (zum Beispiel T-Zellen) zu blockieren, wie bereits beschrieben wurde.
  • Eine Aufwärtsregulierung einer B7-verwandten Faktorfunktion kann in einer Therapie ebenfalls von Nutzen sein. Da virale Infektionen hauptsächlich durch cytotoxische T-Zellen beseitigt werden, würde eine Zunahme der cytotoxischen Aktivität therapeutisch in Situationen von Nutzen sein, wo für einen tierischen und Humanprobanden eine schnellere oder gründlichere Beseitigung eines infektiösen, viralen Mittels vorteilhaft sein würde. Insbesondere besteht die Wirkung von B7-1 in einer Erhöhung der Cytotoxizität von T-Zellen durch Wechselwirkungen mit erkennendem/erkennenden Ligand(en). Derartige lösliche aktive Formen von B7-verwandten Polypeptiden können für die Behandlung örtlicher oder systemischer viraler Infektionen verabreicht werden, wie beispielsweise Immunmangelkrankheit (zum Beispiel HIV), Papilloma (zum Beispiel HPV), Herpes (zum Beispiel HSV), Enzephalitis, Influenza (zum Beispiel Humaninfluenza-Virus-A) und virale Erkältungsinfektionen (zum Beispiel humanes Rhinovirus). Beispielsweise lassen sich pharmazeutische Formulierungen von aktiven, multivalenten, B7-verwandten Faktoren topisch zur Behandlung viraler Hauterkrankungen verabreichen, wie beispielsweise Herpes-Läsionen oder Gürtelrose oder Genitalwarzen. Alternativ können pharmazeutische Zusammensetzungen von aktiven, multivalenten, B7-verwandten Faktoren systemisch zum Behandlung systemischer, viraler Erkrankungen verabreicht werden, wie beispielsweise Aids, Influenza, grippaler Infekt oder Enzephalitis.
  • Darüber hinaus kann eine Modulation der B7-verwandten Faktorfunktion in der Induktion von Tumorimmunität nützlich sein. Beispielsweise können Tumorzellen (zum Beispiel Sarcomzellen, Melanomzellen, Lymphomzellen, Leukämiezellen, Neuroblastomzellen oder Karzinomzellen) genetisch so bearbeiten, dass sie eine Nucleinsäure führen, die mindestens ein Fragment von mindestens einem B7-verwandten Faktor codiert, wie beispielsweise BSL1 (SEQ ID NO: 2), BSL2 (SEQ ID NO: 7, 11 oder 13) oder BSL3 (SEQ ID NO: 15), und anschließend an einen Probanden verabreichen, um in dem Probanden eine tumorspezifische Toleranz einzuführen. Insbesondere hat sich gezeigt, dass eine ektopische Expression von B7-1 in B7-neativen, murinen Tumorzellen eine von T-Zellen vermittelte spezifische Immunität einleitet, die von einer Tumorabstoßung begleitet ist und von einem längeren Schutz gegenüber Tumorbefall in Mäusen (L. Chen et al., supra; S. Townsend et al., supra; S. Gaskar et al., supra). Behandlungen mit einer Tumor- oder Krebszellgentherapie unter Nutzung von B7-verwandten Faktoren lässt sich an Tierexperimenten modulieren (siehe hierzu beispielsweise K. Dunussi-Joannopoulos et al. (1997) J. Pediatr. Hematol. Oncol. 19: 356–340; K. Hiroishi et al. (1999) Gene Ther. 6: 1988–1994; B. K. Martin et al. (1999) J. Immunol. 162: 6663–6670; M. Kuiper et al. (2000) Adv. Exp. Med. Biol. 465: 381–390) oder in Versuchsreihen der Humanphase I (H. L. Kaufman et at. (2000) Hum. Gene Ther. 11: 1065–1082), bei denen B7-1 oder B7-2 für die Gentransfertherapie verwendet werden. Es gilt als selbstverständlich, dass derartige Methoden für eine Anwendung mit verschiedenen Tumor- oder Krebszellen ausgelegt werden kann. Darüber hinaus lässt sich eine Tumorimmunität durch Verabreichung von B7-verwandtem Fusionsprotein erzielen, welches direkt die Immunzellen stimuliert (siehe hierzu beispielsweise die Internationale Patentanmeldung No. WO 01/21796 von V. Ling et al.).
  • PHARMAKOGENETIK
  • Die B7-verwandten Polypeptide und Polynucleotide sind auch in der pharmakogenetischen Analyse von Nutzen, d. h. der Untersuchung der Beziehung zwischen einem Genotyp einer Person und der Reaktion der Person auf eine therapeutische Zusammensetzung oder Medikament. Siehe hierzu beispielsweise Eichelbaum, M. (1996) Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 23(10–11): 983–985, und Linder, M. W. (1997) Clin. Chem. 43(2): 254–266. Der Genotyp des Individuums kann die Art und Weise bestimmen, wie ein Therapeutikum auf den Körper einwirkt, oder die Art und Weise, wie der Körper das Therapeutikum verstoffwechselt. Darüber hinaus beeinflusst die Aktivität der das Medikament verstoffwchselnden Enzyme sowohl die Intensität als auch die Dauer der therapeutischen Wirksamkeit. Unterschiede in der Wirksamkeit oder in dem Metabolismus von Therapeutika können zu einer schweren Toxizität oder einem therapeutischen Versagen (ihren. Dementsprechend kann der Arzt oder der Kliniker die Anwendung von Kenntnissen in Betracht ziehen, die in relevanten pharmakogenetischen Untersuchungen zur Bestimmung erhalten wurden, ob ein B7-verwandtes Polypeptid, Polynucleotid oder funktionelles Äquivalent, Fragment oder Modulator verabreicht werden, sowie die Anpassung der Dosierung und/oder des therapeutischen oder prophylaktischen Behandlungsprotokolls an ein B7-verwandtes Polypeptid, Polynucleotid, funktionelles Äquivalent, Fragment oder Modulator.
  • Im Allgemeinen lassen sich zwei Arten von pharmakogenetischen Erkrankungen unterscheiden. Genetische Erkrankungen können auf einen einzelnen Faktor zurückgeführt werden, der die Art und Weise verändert, wie das Arzneimittel auf den Körper einwirkt (veränderte Arzneimittelwirkung) oder auf einen Faktor, der die Art und Weise verändert, in der der Körper das Medikament verstoffwechselt (veränderter Arzneimittelmetabolismus). Diese Erkrankungen können entweder als seltene genetische Defekte oder als natürlich auftretende Polymorphismen in Erscheinung treten. Beispielsweise ist der Glukose-6-Phosphat-Dehydrogenasemangel (G6PD) eine häufig vererbte Enzymopatie, die nach Aufnahme von Oxidans-Arzneimitteln (Antimalariamittel, Sulfonamide, Analgetika, Nitrofurane) und dem Verzehr von Puffbohnen zur Hämolyse führen.
  • Die Entdeckung genetischer Polymorphismen von Arzneimittel metabolisierenden Enzymen (zum Beispiel N-Acetyltransferase 2 (NAT 2) und Cytochrom P450-Enzymen CYP2D6 und CYP2C 19) hat eine Erklärung dafür gegeben, warum einige Patienten nicht die erwarteten Arzneimittelwirkungen erhalten oder eine übertriebene Reaktion auf das Arzneimittel zeigen und die Toxizität nach Aufnahme der Standarddosis und Sicherheitsdosis eines Arzneimittels. Diese Polymorphismen drücken sich in zwei Phänotypen in der Population aus, den "Extensive Metabolizer" (EM) und "Poor Metabolizer" (PM). Das Vorherrschen des PM-Typs ist in unterschiedlichen Populationen verschieden. Das auf CYP2D6 codierende Gen ist stark polymorph, und es sind mehrere Mutationen in PM identifiziert worden, die alle zum Fehlen von funktioneller CYP2D6 führen. "Poor Metabolizer" erleiden sehr häufig eine übertriebene Arzneimittelreaktion und Nebenwirkungen, wenn sie Standarddosismengen erhalten. Wenn es sich bei einem Metaboliten um den wirksamen, therapeutischen Teil handelt, zeigt der PM-Typ keine therapeutische Reaktion. Dieses ist bei der analgetischen Wirkung von Codein nachgewiesen worden, die durch ihren CYP2D6-erzeugten Metaboliten morphin vermittelt wird. Am anderen extremen Ende gibt es beim ultraschnellen Metabolizer ein Versagen bei der Reaktion auf Standarddosismengen. Neuere Untersuchungen haben festgestellt, dass ultraschneller Metabolismus auf CYP2D6-Genamplifikation zurückzuführen ist.
  • In Analogie können ein genetischer Polymorphismus oder eine Mutation zu allelen Varianten von BSL1, BSL2 und/oder BSL3 in der Population führen, die unterschiedliche Aktivitätsniveaus haben. Die BSL1-, BSL2- und/oder BSL3-Polypeptide oder Polynucleotide ermöglichen dadurch einem Kliniker, eine genetische Veranlagung zu ermitteln, die den Behandlungsablauf beeinflussen kann. So kann in einer BSL-basierenden Behandlung ein Polymorphismus oder eine Mutation dazuführen, dass Individuen mehr oder weniger stark auf eine Behandlung ansprechen. Dementsprechend wäre es notwendig, eine Dosierung so zu modifizieren, dass die therapeutische Wirkung innerhalb einer bestehenden Population, in der es den Polymorphismus gibt, auf ein Maximum gebracht wird. Als eine Alternative zur genetischen Diagnose können die speziellen, polymorphen Polypeptide oder Polynucleotide identifiziert werden.
  • Zur Identifikation von Genen, die einer Arzneimittelreaktion vorhersagen, können mehrere pharmakogenetische Methoden zur Anwendung gelangen. Eine der pharmakogenetischen Vorgehensweise, die "Genom-Weite-Assoziation" beruht hauptsächlich auf einer hochauflösenden Kartierung des Human-Genoms. Diese hochauflösende Kartierung zeigt bereits identifizierte Gen-verwandte Marker (zum Beispiel eine "bi-allelische" Genmarker-Kartierung, die aus 60.000 bis 100.000 polymorphen oder variablen Stellen am Humangenom besteht, von denen jede zwei Varianten hat). Sodann kann eine hochauflösende Chromosomenkarte mit einer genomischen Karte jeder der statistisch signifikanten Zahl von Patienten verglichen werden, die an dem Medikamentenversuch der Phase II/III teilnehmen, um Marker in Verbindung mit speziell festgestellten Arzneimittelreaktionen oder Nebenwirkungen zu identifizieren. Alternativ kann eine hochauflösende Karte aus einer Kombination von einigen 10 Millionen bekannten Nucleotid-Polymorphismen (SNP) in dem Humangenom erzeugt werden. Wie hierin verwendet, ist ein "SNP" eine häufige Veränderung, die an einer einzelnen Nucleotidbase in einem Strang einer DNA auftritt. Beispielsweise kann ein SNP einmal pro 1.000 Basen DNA auftreten. Ein SNP kann in einem Krankheitsprozess beteiligt sein, wobei jedoch die überwiegende Mehrheit nicht in Verbindung mit Erkrankungen stehen muss. Bei einer vorgegebenen Chromosomenkarte auf Basis des Auftretens solcher SNP lassen sich in Abhängigkeit von einem speziellen Muster der SNP's in deren individuellen Genom zu genetischen Gruppen zusammenfassen. Auf diese Weise lassen sich Behandlungsprotokolle auf Gruppen genetisch ähnlicher Personen unter Berücksichtigung von Merkmalen abstimmen, die die genetisch ähnlichen Personen gemeinsam haben. Siehe hierzu beispielsweise D. R. Pfost et al. (2000) Trends Biotechnol. 18(8): 334-8.
  • Als ein anderes Beispiel lässt sich die Vorgehensweise "Cadidate-Gene-Approach" anwenden. Bei dieser Methode lassen sich, wenn ein Gen, das ein Arzneimitteltarget codiert, bekannt ist, alle üblichen Varianten dieses Gens verhältnismäßig leicht in der Population identifizieren und feststellen, ob der Besitz der einen Version eines Gens gegenüber einer anderen mit einer speziellen Arzneimittelreaktion in Verbindung steht.
  • Als noch ein weiteres Beispiel kann eine Vorgehensweise "Gene-Expression-Profiling-Approach" zur Anwendung gelangen. Diese Methode umfasst das Testen der Genexpression eines mit einem Arzneimittel behandelten Tieres (zum Beispiel ein B7-verwandtes Polypeptid, Polynucleotid, funktionelles Äquivalent, Fragment oder Mudulator), um festzustellen, ob Gen-Verbindungswege in Verbindung mit der Toxizität eingeschaltet worden sind. Die aus einer der hierin beschriebenen pharmakogenetischen Vorgehensweisen erhaltene Information kann verwendet werden, um eine geeignete Dosierung und Behandlungsprotokolle für eine prophylaktische oder therapeutische Behandlung eines Individuums zu bestimmen. Mit dieser Kenntnis kann man, wenn sie auf Dosierung oder Medikamentenauswahl angewendet wird, nachteilige Reaktionen oder ein therapeutisches Versagen vermeiden und damit die therapeutische und prophylaktische Wirksamkeit bei Behandlung eines Probanden mit einem B7-verwandten Polypeptid, Polynucleotid, funktionellen Äquivalent, Fragment oder Modulator erhöhen.
  • B7-verwandte Polypeptide oder Polynucleotide sind auch zur Überwachung therapeutischer Bewirkungen im Verlaufe klinischer Versuchsreihen und anderer Behandlung verwendbar. Damit können die therapeutische Wirksamkeit eines Mittels, das zur Erhöhung oder Verminderung der Genexpression ausgelegt ist, die Polypeptidmengen oder Aktivität im Verlaufe einer Behandlung unter Verwendung von B7-verwandten Polypeptiden oder Polynucleotiden überwacht werden. Beispielsweise kann eine Überwachung ausgeführt werden, indem man (i) eine "Pre-Administration"-Probe von einem Probanden vor der Verabreichung des Mittels erhält; (ii) den Umfang der Expression oder Aktivität des Polypeptids in der "Pre-Administration"-Probe nachweist; (iii) eine oder mehrere "Post-Administration"-Proben von einem Probanden. erhält; (iv) den Umfang der Expression oder Aktivität der Polypeptide in den "Post-Administration"-Proben nachweist; (v) den Umfang der Expression oder Aktivität des Polypeptids in der "Pre-Administration"-Probe mit dem Polypeptid in der "Post-Administration"-Probe oder Proben vergleicht und (vi) dementsprechend die Darreichung des Mittels an den Probanden erhöht oder verrringert.
  • TIERMODELLE
  • Es können B7-verwandte Polynucleotide verwendet werden, um genetisch veränderte Non-Human-Tiere oder Human-Zelllinien zu erzeugen. Es kann jedes beliebige Non-Human-Tier verwendet werden, wobei jedoch typische Tiere Nagetiere sind, wie beispielsweise Mäuse, Ratten oder Meerschweinchen. Genetisch veränderte Tiere oder Zelllinien können ein Gen führen, das so veränderte worden ist, dass es Deletionen enthält, Substitutionen, Insertionen oder Modifikationen der Polynucleotidsequenz (zum Beispiels Exonsequenz). Derartige Veränderungen können das Gen nichtfunktionell machen (d. h. eine Null-Mutation), indem ein "Knockout"-Tier oder Zelllinie erzeugt werden. Zusätzlich können genetisch veränderte Tiere ein oder mehrere exogene oder nicht in der Natur vorkommende Gene führen, zum Beispiel "Transgene" oder "Orthologe", die von verschiedenen Organismen deriviert sind (zum Beispiel menschlichen oder durch synthetische oder rekombinante Methoden erzeugt wurden. Genetisch veränderte Tiere oder Zelllinien können verwendet werden, um die BSL1-, BSL2- oder BSL3-Funktion, Regulierung zu untersuchen und Behandlungen für BSL1-, BSL2-oder BSL3-verwandte Erkrankungen zu entwickeln. Insbesondere können Knockout-Tiere und -Zelllinien verwendet werden, um Tiermodelle zu erstellen sowie in vitro-Modelle für die Analyse von BSL1-, BSL2- oder BSL3-verwandten Krankheiten. Darüber hinaus können transgene Tiere, die humanes BSL1, BSL2 oder BSL3 exprimieren, in Versuchen zur Auffindung von Arzneimitteln verwendet werden.
  • Ein "transgenes Tier" ist jedes beliebige Tier, das eine oder mehrere Zellen enthält, die eine genetische Information führen, die verändert oder direkt oder indirekt durch willkürliche, genetische Veränderung auf subzellulärem Niveau empfangen wurde, wie beispielsweise durch gerichtete Rekombination oder Mikroinjektion oder Infektion mit einem rekombinanten Virus. In den Begriff "transgenes Tier" sollen nicht die klassische Kreuzung oder in vitro-Befruchtung einbezogen sein, sondern dieser Begriff soll nur Tiere umfassen, in denen eine oder mehrere Zellen durch ein rekombinantes DNA-Molekül verändert wurde oder ein solches erhalten wurde. Dieses rekombinante DNA-Molekül kann speziell auf einen festgelegten genetischen Lokus gerichtet sein, kann regellos in ein Chromosom eingebaut sein oder kann eine extrachromosomale, replizierende DNA sein.
  • Wie hierin verwendet, bezeichnet der Begriff "ortholog" ein Gen oder ein Polypeptid, das von einer Spezies erhalten wurde, das zu einem analogen Gen oder Polypeptid von einer anderen Spezies homolog ist. Beispielsweise sind die Human-BSL3(SEQ ID NO: 15)- und Maus-AF142780-Polypeptide ortholog.
  • Transgene Tiere lassen sich nach der Behandlung von Keimzellen oder Zygoten auswählen. Beispielsweise kann die Expression eines exogenen BSL1-, BSL2- oder BSL3-Gens oder eine Variante davon durch funktionsfähige Verknüpfung des Gens mit einem Promotor und wahlweise einem Enhancer und anschließendes Mirkoinjizieren des Konstruktes in eine Zygote erreicht werden (siehe beispielsweise Hogan et al. (1994) Manipulating the Mouse Embryo, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY). Derartige Behandlungen schließen die Insertion des exogenen Gens und zerteilte homologe Gene ein. Alternativ kann/können das Gen/die Gene der Tiere durch Insertion- oder Deletions-Mutation anderer genetischer Veränderung(en) unter Anwendung konventioneller Methoden zerteilt werden (siehe hierzu beispielsweise Capecci, (1989) Science, 244: 1288; Valancuis et al. (1991) Mol. Cell Biol., 11: 1402; Hasty et al. (1991) Nature, 350: 243; Shinkai et al. (1992) Cell, 68: 855; Mombaerts et al. (1992) Cell, 68: 869; Philpott et al. (1992) Science, 256: 1448; Snouwaert et al. (1992) Science, 257: 1083; Donehower et al. (1992) Nature, 356: 215).
  • In einem der Aspekte der Erfindung können BSL1-, BSL2- oder BSL3-Knockout-Mäuse entsprechend wohlbekannten Methoden erzeugt werden (siehe hierzu beispielsweise M. R. Capecci, (1989) Science, 244: 1288–1292; P. Li et al. (1995) Cell 80: 401–411; L. A. Galli-Taliadoros et al. (1995) J. Immunol. Methods 181(1): 1–15; C. H. Westphal et al. (1997) Curr. Biol. 7(7): 530–3; S. S. Cheah et al. (2000) Methods Mol. Biol. 136: 455–63). Die Human-BSL1-, BSL2- und BSL3-Klone können zur Isolation von murinen Homologen verwendet werden. Murine Homologe können sodann verwendet werden, um ein murines BSL1-, BSL2- oder BSL3-gerichtetes Konstrukt herzustellen, welches BSL1, BSL2 oder BSL3 in der Maus durch homologe Rekombination an der entsprechenden chromosomalen Stelle zerteilen kann. Das gerichtete Konstrukt kann eine zerteilte oder deletierte murine BSL1-, BSL2- oder BSL3-Sequenz aufweisen, die an der Stelle des funktionierenden Fragmentes des nativen Maus-Gens insertiert ist. Beispielsweise kann das Konstrukt eine Insertion in der murinen BSL1-, BSL2- oder BSL3-Protein-codierenden Region enthalten.
  • Bevorzugt enthält das gerichtete Konstrukt Marker sowohl einer positiven als auch negativen Selektion. Der positive Selektionsmarker ermöglicht die selektive Eliminierung von Zellen, denen der Marker fehlt, während der negative Selektionsmarker die Eliminierung von Zellen ermöglicht, die den Marker führen. Insbesondere kann der positiv selektierbare Marker ein antibiotisches Resistenzgen sein, wie beispielsweise das Neomycin-Resistenzgen, welches in die codierende Sequenz von morinen BSL1, BSL2 oder BSL3 einfügt werden kann, um sie funktionslos zu machen, während gleichzeitig das Konstrukt selektierbar gemacht wird. Das Herpes-Simplex-Virus-Thymidinkinase (HSVtk)-Gen ist ein Beispiel für einen negativ selektierbaren Marker, der als ein zweiter Marker verwendet werden kann, um Zellen zu eliminieren, die diesen führen. Zellen mit dem HSVtk-Gen werden in Gegenwart von Gangzyklovir selektiv getötet. Als ein Beispiel kann ein positiver Selektionsmarker auf ein gerichtetes Konstrukt innerhalb der Region des Konstruktes positioniert sein, welche an dem BSL1-, BSL2- oder BSL3-Lokus integriert. Der negative Selektionsmarker kann auf dem gerichteten Konstrukt außerhalb der Region positioniert sein, die den BSL1-, BSL2- oder BSL3-Lokus integriert. Wenn daher das gesamte Konstrukt in der Zelle vorhanden ist, werden sowohl die positiven als auch die negativen Selektionsmarker vorhanden sein. Wenn das Konstrukt in das Genom integriert ist, wird der positive Selektionsmarker vorhanden sein, während der negative Selektionsmarker verloren gehen wird.
  • Das gerichtete Konstrukt kann beispielsweise in embryonalen Stammzellen (ES) eingesetzt werden. ES-Zellen können aus Vorimplantations-Embryos erhalten werden, die in vitro kultiviert wurden (M. J. Evans et al. (1981) Nature 292: 154–156; M. O. Bradley et al. (1984) Nature 309: 255–258; Gossler et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 9065–9069; Robertson et al. (1986) Nature 322: 445–448; S. A. Wood et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 4582–4584). Gerichtete Konstrukte lassen sich wirksam in die ES-Zellen mithilfe von Standardmethoden einführen, wie beispielsweise DNA-Transfektion oder durch Retrovirus-vermittelte Transduktion. Anschließend können die transformierten ES-Zellen mit Blastozyten von einem Nonhuman-Tier vereint werden. Die eingeführten ES-Zellen besiedeln den Embryo und tragen zu der Keimlinie des resultierenden chimären Tieres bei (R. Jaenisch, (1988) Science 240: 1468–1474). Die Verwendung von Gen-gerichteten ES-Zellen in der Erzeugung von Gen-gerichteten, transgenen Mäusen ist bereits beschrieben worden (siehe hierzu Thomas et al. (1987) Cell 51: 503–512), wobei sich an anderer Stelle Übersichtsarbeiten finden (Frohman et al. (1989) Cell 56: 145–147; Capecchi, (1989), Trends in Genet. 5: 70–76; Baribault et al. (1989) Mol. Biol. Med. 6: 481–492; Wagner, (1990) EMBO J. 9: 3025–3032; Bradley et al. (1992) Bio/Technology 10: 534–539).
  • Es können mehrere Methoden angewendet werden, um Homolog rekombinierte murine ES-Zellen auszuwählen. Bei einer der Methoden wird die PCR zum Screening von Pools von transformanten Zellen für die homologe Insertion eingesetzt, gefolgt von einem Screening einzelner Klone (Kim et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16: 8887–8903; Kim et al. (1991) Gene 103: 227–233). Bei einer anderen Methode wird ein Markergen eingesetzt, das so aufgebaut ist, dass es lediglich aktiv ist, wenn die homologe Insertion auftritt, wodurch es diesen Rekombinanten möglich ist, direkt selektiert zu werden (Sedivy et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 227–231). Beispielsweise kann die Methode der Positiv-Negativ-Selektion (PNS) zur Anwendung gelangen, wie sie vorstehend beschrieben wurde (siehe hierzu beispielsweise Mansour et al. (1988) Nature 336: 348–352; Capecchi, 1989, Science 244: 1288–1292; Capecchi, (1989) Trends in Genet. 5: 70–76). insbesondere ist die PNS-Methode für das Targeting von Genen anwendbar, die in geringen Mengen exprimiert werden.
  • Das Fehlen von funktionellen BSL1, BSL2 oder BSL3 in den Knockout-Mäusen kann beispielsweise mithilfe der RNA-Analyse festgestellt werden, mithilfe der Analyse der Proteinexpression und mithilfe von funktionellen Untersuchungen. Bei der RNA-Analyse werden RNA-Proben aus unterschiedlichen Organen der Knockout-Mäuse gewonnen und das BSL1-, BSL2- oder BSL3-Transkript in einer Northern-Blot-Analyse unter Verwendung von Oligonucleotid-Sonden nachgewiesen, die für das Transkript spezifisch sind. Bei der Detektion der Proteinexpression werden Antikörper, die auf BSL1-, BSL2- oder BSL3-Polypeptid spezifisch sind, verwendet, wie beispielsweise in der Analyse der Durchflusszytometrie, bei dem immunhistochemischen Anfärben und bei Aktivitätsassays. Alternativ werden funktionelle Assays unter Anwendung von Präparaten verschiedener Zelltypen ausgeführt, die von Knockout-Mäusen genommen wurden.
  • Zur Erzeugung transgener Mäuse können mehrere verschiedene Vorgehensweisen zur Anwendung gelangen. In einer der Vorgehensweisen wird ein in eine ES-Zelle durch homologe Rekombination integriert, ein intrachromosomales Rekombinationsereignis benutzt, um die selektierbare Marker zu eliminieren und lediglich das Transgen zurückgelassen (A. L. Joyner et al. (1989) Nature 338(6211): 153–6; P. Hasty et al. (1991) Nature 350(6315): 243–6; V. Valancius und O. Smithies, (1991) Mol. Cell Biol. 11(3): 1402–8; S. Fiering et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(18): 8469–73). In einer alternativen Vorgehensweise werden zwei oder mehrere Stämme erzeugt, von denen der eine Stamm das durch homologe Rekombination inaktivierte Gen enthält, während ein oder mehrere Stämme Transgene enthalten. Der Knockout-Stamm wird mit dem transgenen Stamm gekreuzt, um eine neue Linie von Tieren zu erzeugen, in denen das ursprüngliche Allel vom Wildtyp durch ein Transgen (obgleich nicht an der gleichen Stelle) ersetzt ist. Zu beachten ist, dass Knockout- und transgene Tiere mithilfe kommerzieller Einrichtungen erzeugt werden können (zum Beispiel The Lerner Research Institute, Cleveland, OH; B&K Universal, Inc., Fremont, CA; DNX Transgenic Sciences, Cranbury, NJ); Incyte Genomics, Inc., St. Louis, MO).
  • Transgene Tiere (zum Beispiel Mäuse), die ein Nucleinsäuremolekül enthalten, das Human-BSL1, -BSL2 oder -BSL3 codiert, können als in vivo-Modelle zur Untersuchung der Einflüsse einer veränderten Expression von BSL1, BSL2 oder BSL3 verwendet werden. Diese Tiere können auch in der Arzneimittelbewertung und bei Arbeiten zum Auffinden von Arzneimitteln verwendet werden, um Verbindung zu entdecken, die zur Hemmung oder Modulation der Aktivität von BSL1, BSL2 oder BSL3 wirksam sind, wie beispielsweise Verbindungen für die Behandlung von Erkrankungen des Immunsystems, Krankheiten oder Beschwerden. Der Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet ist in der Lage, Standardmethoden zur Erzeugung transgener Tiere anzuwenden, die Human-BSL1-, BSL2- oder BSL3-Polypeptid erzeugen, und diese Tiere in der Arzneimittelbewertung und in Projekten zur Auffindung von Arzneimitteln anzuwenden (siehe zum Beispiel die US-P-4 873 191 von Wagner; US-P-4 736 866 von Leder).
  • Transgene Tiere, wie sie hierin beschrieben wurden, können über einen rekombinanten Expressionsvektor verfügen, in welchem die Nucleotidsequenz, die Human-BSL1, -BSL2- oder -BSL3 codiert, funktionsfähig mit einem gewebespezifischen Promotor verknüpft ist, wodurch die codierende Sequenz lediglich in diesem speziellen Gewebe exprimiert wird. Beispielsweise kann der gewebespezifische Promotor ein säugerzellspezifischer Promotor sein und das auf diese Weise exprimierte, rekombinante Protein aus der Milch des Tieres gewonnen werden.
  • Ein BSL1-, BSL2- oder BSL3-"Knockout" kann erzeugt werden, indem dem Tier Antikörper (zum Beispiel neutralisierende Antikörper) verabreicht werden, die speziell ein endogenes BSL1-, BSL2- oder BSL3-Polypeptid erkennen. Die Antikörper können zur Zerteilung der Funktion des endogenen BSL1-, BSL2- oder BSL3-Polypeptids beitragen und dadurch einen Null-Phänotypen erzeugen. In einem der speziellen Beispiele kann ein murines BSL1-, BSL2- oder BSL3-Polypeptid oder Peptid zur Erzeugung von Antikörpern verwendet werden. Diese Antikörper können sodann einer Maus gegeben werden, um die Funktion des entsprechenden Maus-Proteins zu inaktivieren.
  • Darüber hinaus können Nichtsäuger-Organismen verwendet werden, um BSL1, BSL2 oder BSL3 sowie deren verwandte Krankheiten zu studieren. Beispielsweise können Modellorganismen, wie beispielsweise C. elegans, D. metanogaster und S. cerevisiae verwendet werden. BSL1-, BSL2- oder BSL3-Homologe können in diesen Modellorganismen identifiziert und unter Erzeugung eines Stammes mit BSL1-, BSL2- oder BSL3-Mangel mutiert oder deletiert werden. Human-BSL1, -BSL2 oder -BSL3 kann sodann auf die Fähigkeit zum "Komplimentieren" des Mangelstammes getestet werden. Die Stämme mit BSL1-, BSL2- oder BSL3-Mängeln können auch für ein Medikamentenscreening verwendet werden. Die Untersuchung von BSL1-, BSL2- oder BSL3-Homologa kann das Verständnis der biologischen Funktion erleichtern, welches dem Humangen entspricht, und kann die Identifikation bindender Proteine (zum Beispiel Agonisten und Antagonisten) fördern.
  • BEISPIELE
  • Die nachfolgend ausgeführten Beispiele sollen die verschiedenen Aspekte der vorliegenden Erfindung exemplifizieren und sind in keiner Weise zur Beschränkung der Erfindung auszulegen.
  • BEISPIEL 1: IDENTIFIKATION VON BSL2
  • SUCHOPERATIONEN IN DATENBANKEN
  • BSL2 wurde mithilfe der BLAST- und FASTA-Analyse in den Sequenz-Datenbanken (Incyte Genomics) unter Nutzung der B7-1- oder B7-2-Aminosäuresequenzen als Abfrage-Sequenzen identifiziert. Bei der BLAST-Analyse wurde die BLOSSUM-62-Scoringmatrix verwendet (S. Henikoff et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915–10919) und die verbleibenden Parameter auf die Standardkennungen gesetzt. Bei der FASIA-Analyse wurden alle Parameter auf Standardkennungen gesetzt (W. R. Pearson et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444–2448). Das Abfragen der Sequenz-Datenbank identifizierte zwei Incyte Genomics-"Templates": 252899.6 und die potentielle Spleiß-Variante 252899.8 (Incyte Genomics-Templates sind Consensus EST-Sequenzen, von denen ausgegangen wird, dass sie mRNA-Transkripte repräsentieren).
  • SEQUENZANALYSE DES BSL2-KLONS
  • Das Incyte Genomics-Template 252899.8 wurde verwendet, um ein Incyte Genomics-Klon 4616811 zu identifizieren. Der Incyte Genomics-Klon 4616811 gehört zu der Incyte Genomics Library ID No. BRAYDIT01, der ursprünglich unter Verwendung von Poly(A)+ RNA von erkranktem Hypothalamusgewebe konstruiert wurde. Der Incyte Genomics-Klon 4616811 wurde von Incyte Genomics erhalten und für die Sequenzanalyse (ABI-Cyclesequencer, PE Biosystems) mit den in der Tabelle 1 gezeigten Primern verwendet. TABELLE 1
    Figure 00610001
  • Zu beachten ist, dass die vorhergesagte Aminosäuresequenz des Incyte Genomics-Klons 4616811 zwei Reihen von V/C(variable/konstante Domäne)-Faltungen enthielt, während typische B7-verwandte Aminosäuresequenzen lediglich eine Reihe von V/C-Faltungen enthielten. Die Seqweb Gap (Genetics Computer Group)-Analyse zeigte, dass die BSL2-4616811-Sequenz weniger als 50% Sequenzidentität mit B7-1-, B7-2-, BSL1/B7-H1-Nucleotidsequenzen teilte, während die BSL2-4616811-Aminosäuresequenz weniger als 35% Sequenzidentität mit den B7-1-, B7-2- und BSL1/B7-H1-Aminosequenzen teilte. Es ist eine Sequenz ähnlich der BSL2-4616811 als eine Amyloid-Präkursorprotease in der Internationalen Patentanmeldung WO 00/68266 von G. W. Becker et al. identifiziert worden.
  • Die Nucleotid- und vorhergesagten Aminosäuresequenzen des Incyte Genomics-Klon 4616811 (BSL2-4616811) sind in den 3A und 3B gezeigt. Das Plasmid, welches eine DNA-codierende BSL2-4616811 (pINCY:BSL2-4616811) führt, wurde hinterlegt bei der American Type Culture Collection (ATCC, 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209 USA) unter der ATCC-Bezeichnung No. PTA-1993 am 06. Juni 2000.
  • KLONIEREN VOLLER LÄNGE
  • Zur Bestätigung der Sequenz des Incyte Genomics-Klons 4616811 wurden PCR-Primer aufgebaut, um die Nucleotidsequenz von dem vorhergesagten Translationsstartcodon zu dem vorhergesagten Translationsstopcodon von dem Klon zu amplifizieren: Vorwärtsprimer BSL2-7 (5'-ATGCTGCGTCGGCG-3') (SEQ ID NO: 55); Reverseprimer BSL2-8 (5'-TCAGGCTATTTCTTGTCCATCATC-3') (SEQ ID NO: 56).
  • Es wurde eine HMVEC-Bank aufgebaut, indem das SMARTTMRACE cDNA-Amplification-Kit (CLONTECH) entsprechend den Herstelleranweisungen verwendet wurde, indem Poly(A)+RNA verwendet wurde, die von humanen mikrovaskulären Endothelzellen erhalten wurde, die mit TNF-Alpha für 1 Stunde als das RACE-Reaktionstemplate behandelt wurde. Die PCR-Mischung enthielt 1 μl PCR-bereite HMVEC-Bank, 5 μl PCR-Puffer (GibcoBRL), 1,5 μl 50 mM MgCl2, 1 μl 10 mM dNTP's (Boehringer Mannheim Biochemicals/Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN), 25 pMol BSL2-7-Primer, 25 pMol BSL2-8-Primer und 1 μl CLONTECH-Advantage Enzyme-Mischung in einem Gesamtvolumen von 50 μl. Die PCR wurde in einem Modell PE Biosystems Thermal Cycler 9700 ausgeführt. Die PCR-Mischung wurde für 1 Minuten bei 94°C inkubiert, gefolgt von 35 Zyklen der Inkubation bei 94°C für 30 Sekunden, 60°C für 30 Sekunden und 72°C für 45 Sekunden, gefolgt von einer Inkubation für 10 Minuten bei 72°C.
  • Entsprechend den Herstellerangaben wurde ein Mikrotiter der PCR-Mischung direkt ligiert in pCR2.1 (Invitrogen). Eine der Hälften der Ligierungsmischung wurde zum Transfektieren von Max-Efficiency DH5 Alpha E Colizellen (GibcoBRL) entsprechend den Herstelleranweisungen verwendet. Die transfizierten Zellen wurden auf LB-Agarplättchen mit 100 μg/ml Ampicillin und 30 μg/ml X-gal aufgezogen und über Nacht bei 37°C inkubiert. Es wurden weiße Kolonien isoliert und über Nacht in 5 ml LB-Brühe mit einem Gehalt von 100 μg/ml Ampicillin aufgezogen.
  • Entsprechend den Herstellerangaben wurde Plasmid-DNA aus der Bakterienkultur unter Anwendung des Spin Miniprep-Kit (QIAGEN) isoliert. Die DNA wurde mit EcoRI digeriert, um die klonierte Insertion freizusetzen, und die Digestionsmischung mithilfe der Elektrophorese auf 1% Agarosegel analysiert. Insertfragmente größer als 700 bp wurden unter Verwendung von vektorspezifischer M13 (5'-GTTTTCCCAGTCACGAC-3') (SEQ ID NO: 57) und M13 Reverse (5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3') (SEQ ID NO: 58) sequenzierenden Primern (ABI-Cyclesequencer, PE, Applied Biosystems) sequenziert.
  • Die Sequenzanalyse zeigte, dass zwei gespleißte Varianten von BSL2 kloniert worden waren: BSL2-L165-21 und BSL2-L165-35b. Die Spleißvarianten BSL2-L165-21 und BSL2-L165-35b codierten Aminosäuresequenzen, die jeweils eine V/C-Faltung enthielten und zueinander um etwa 95% identisch waren. Außerdem zeigte die Seqweb Gap-Analyse (Genetics Computer Group), dass die BSL2-L165-21- und BSL2-L165-35b-Nucleotidsequenzen weniger als 50% Sequenzidentität mit den B7-1-, B7-2- und BSL1/B7-H1-Nucleotidsequenzen teilte, während die BSL2-L165-21- und BSL2-LI65-35b-Aminosäuresequenzen weniger als 35% Sequenzidentität mit den B7-1-, B7-2- und BSL1/B7-H1-Aminosäuresequenzen teilten.
  • Die Sequenzanalyse zeigte ferner, dass die Aminosäure- und Nucleotidsequenzen von BSL2-L165-21 weniger als 99% Sequenzidentität mit der PRO352-Aminosäure bzw. -Nucleotidsequenzen teilte, wie in der Internationalen Patentanmeldung WO 99/46281 von K. P. Baker et al. berichtet wird. Die Aminosäure- und Nucleotidsequenzen von BSL2-L165-35b teilten weniger als 99,5% Sequenzidentität mit den PRO352 Aminosäure- und Nucleotidsequenzen.
  • Aminosäuresequenz-Ausrichtungen unter Anwendung des GCG Gap-Programmes (GCG, Madison, WI) zeigten, dass die längste Strecke von identischen Aminosäureresten von 88 in der Länge angrenzenden BSL2-165-21- und PRO352-Aminosäuren teilen. Die längste Strecke von identischen Aminosäureresten, die von BSL2-L165-35b und PRO352 geteilt wurde hatte eine Länge von 168 angrenzenden Aminosäuren. Die längste Strecke identischer Aminosäuren, die von BSL2-4616811 und PRO352 geteilt wurde, hatte eine Länge von 206 angrenzenden Aminosäuren.
  • Nucleotidsequenz-Ausrichtungen zeigten, dass die längste Strecke identischer Basen, die von BSL2-L165-21 und PRO352 geteilt wurde, eine Länge von 254 angrenzenden Nucleotiden hatte. Die längste Strecke identischer Basen, die von BSL2-L165-35b und PRO352 geteilt wurde, hatte eine Länge von 305 angrenzenden Nucleotiden. Die längste Strecke identischer Basen, die von BSL2-4616811 und PRO352 geteilt wurde, hatte eine Länge von 302 angrenzenden Nucleotiden. Es zu beachten, dass auch BSL2-L165-35b als ein B7-H3-, costimulatorisches Molekül für T-Zellaktivierung identifiziert wurde (A. I. Chapoval et al. (2001) Nature Immunology 2: 269–274).
  • Die Nucleotid- und vorhergesagten Aminosäuresequenzen der gespleißten BSL2-L165-21-Variante sind in den 3C und 3D gezeigt, während die Nucleotid- und vorhergesagten Aminosäuresequenzen von BSL2-L165-35b in den 3E und 3F gezeigt sind. Das Plasmid, welches die DNA führte, die BSL2-L165-21 (pCR2.1:BSL2-L165-21) codiert, wurde hinterlegt bei der American Type Culture Collection (ATCC, 10801 University Blvd., Manassas, VA20110-2209 USA) unter der ATCC-Kennzeichnung No. PTA-1987, am 06. Juni 2000. Zusätzlich wurde das Plasmid, welches eine DNA führt, die BSL2-L165-35b codiert (pCR2.1:BSL2-L165-35b) hinterlegt bei der American Type Culture Collection (ATCC, 10801 University Blvd., Manassas, VA20110-2209 USA) unter der ATCC-Kennzeichnung No. PTA-1988, am 06. Juni 2000.
  • BEISPIEL 2: CHARAKTERISIERUNG VON BSL2
  • BSL2-EXPRESSIONSANALYSE
  • Die BSL2-Expressionsmuster wurden mithilfe der Northem-Blot-Analyse verschiedener Gewebe- und Zelltypen unter Verwendung der BSL2-4616811-derivierten Sonde bestimmt, wie sie in 6B gezeigt ist; die Prozedur wird wie folgt beschrieben.
  • Die BSL2-Espressionsmuster wurden mithilfe der Northern-Blot-Analyse mehrerer Zelltypen einschließlich der folgenden bestimmt: ruhende T-Zellen von peripherem Blut; T-Zellen von peripherem Blut, stimuliert mit Anti-CD3/Anti-CD28-Antikörpern; T-Zellen von peripherem Blut, stimuliert mit Phorbol-12-Myristat-13-Acetat (PMA); T-Zellen von peripherem Blut, stimuliert mit Phytohämaglutinin (PHA); ruhende THP1-Monocyten; THP1, stimuliert mit Lipopolysacharid (LPS); ruhende Monozyten des peripheren Bluts; ruhende Monozyten des peripheren Bluts, stimuliert mit PHA; ruhende Monozyten des peripheren Bluts, simuliert mit GM-CSF und IL-4; RAJI B-Zellen; RAMOS B-Zellen; ruhende, humande, mikrovaskuläre Endothel-Zellen (HMVEC); HMVEC, stimuliet mit TNF-alpha und mit serumunversorgte H292-Human-Lungenepithel-Zellen.
  • BEDINGUNGEN DER ZELLKULTUR
  • Es wurden T-Zellen des peripheren Bluts in RPMI 1640 (Hyclone) mit 10% Humanserum bei 37°C und 5% CO2 für 48 Stunden aufgezogen. T-Zellen des peripheren Bluts, stimuliert mit Anti-CD3- und Anti-CD28-Antikörpern wurden in RPMI 1640 mit 10% Humanserum bei 37°C und 5% CO2 für 24 bis 72 Stunden in Gegenwart von 1 μg/ml Anti-CD3-monoklonalen Antikörpern aufgezogen (P. S. Linsley et al. (1993) Ann. Rev. Immunol. 11: 191–212) sowie in 1 μg/ml Anti-CD28-monoklonalen Antikörpern (Linsley et al., supra). T-Zellen des peripheren Bluts, stimuliert mit PMA und Ionomycin wurden aufgezogen in RPMI 1640 (Hyclone) mit 10% Humanserum bei 37°C und 5% CO2 für 48 Stunden in Gegenwart von 30 ng/ml PMA mit 1 μM Ionomycin. T-Zellen des peripheren Bluts, stimuliert mit PHA, wurden aufgezogen in RPMI 1640 (Hyclone) mit 10% Humanserum bei 37°C und 5% CO2 für 48 Stunden in Gegenwart von 3 μg/ml PHA. Aus einer immortalen, humanen, monozytischen Zelllinie erhaltene THP1-Zellen wurden aufgezogen in RPMI 1640 (Hyclone) mit 10% fötalem Rinderserum bei 37°C und 5% CO2 mit oder ohne 100 ng/ml LPS für 2 Stunden. Monozyten den peipheren Bluts wurden aufgezogen in RPMI 1640 (Hyclone) mit 25% fötalem Rinderserum in Teflonplättchen bei 37°C und 5% CO2 mit oder ohne 1 μg/ml PHA oder 15 ng/ml GM-CSF mit 75 ng/ml IL-4 für 7 Tage. Von immortalen, humanen B-Zelllinien erhaltene RAJI- und RAMOS-Zellen wurden in RPMI 1640 (Hyclone) mit 10% fötalem Rinderserum bei 37°C und 5% CO2 aufgezogen. HMVEC wurde DMEM mit 10% fatalem Rinderserum bei 37°C und 5% CO2 mit oder ohne 10 ng/ml TNF-alpa für 1 bis 24 Stunden aufgezogen. Von einer immortalen, humanen Lungen-Epithel-Zelllinie erhaltene H292-Zellen wurden aufgezogen in RPM1 1640 (Hyclone) mit 10% fötalem Rinderserum bei 37°C und 5% CO2 und sodann in einem serumfreien Medium für 16 Stunden vor der Ernte aufgezogen.
  • NORTHERN-BLOT-ANALYSE
  • Für die Northem-Blot-Analyse wurde 0,5 μg Ganz-Poly(A)+-RNA, die vom jeweiligen Zelltyp erhalten wurde, auf einem 1,2% Agarose-Gel, das 3% Formaldehyde enthielt, separiert und auf eine Hybond-N+-Nylonmembran (Amersham) über Nacht unter Verwendung eines 20 × SSC-Transferpuffers transferiert. Die Membran wurde sodann einer Auto-Vernetzung unterzogen, 4 × mit SSPE gewaschen und an der Luft trocknen gelassen. Sodann wurde die Membran bei 65°C in ExpressHyb-Lösung (CLONTECH) für 1 Sunde vorhybridisiert und anschließend mit einer [32 P]dCTP-radiomarkierten (NEN, Boston, MA) primerunterstützten Random-BSL1-cDNA-Sonde hybridisiert. Die Sonde wurde von einem 666 bp BSL1 HindIII/Pstl-Fragment (6A) erhalten, das unter Anwendung der NucTrap-Reinigungssäule (Stratagene) gereinigt und radiomarkiert wurde, sodass es eine spezifische Aktivität von 2,0 × 106 cpm/ml hatte. Nach der Hybridisierung wurde die Membran in 2,0 × SSC mit 0,05% SDS bei 65°C gewaschen und an einem Film für 72 Stunden bei –70°C exponiert.
  • Es wurde ein 3,6 kb BSL2-mRNA-Transkript in mehreren Zelltypen detektiert. Insbesondere wurden hohe Mengen an BSL2 mRNA in allen HMVEC detektiert, das mit TNF-Alpha stimuliert war. Mäßige Mengen an BSL2 mRNA wurden in ruhenden THP1-Zellen detektiert und in THP1-Zellen, die mit LPS aktiviert waren (7D). Im Gegensatz dazu wurden geringe Mengen an BSL2 mRNA in Monozyten des peripheren Bluts, stimuliert mit PHA oder GM-CSF/IL-4 detektiert, während BSL2 mRNA nicht in ruhenden oder stimulierten T-Zellen des peripheren Bluts oder in ruhenden RAJI-Zellen, ruhenden RAMOS-Zellen oder serumunversorgten H292-Zellen detektiert wurden (7D).
  • PCR-ASSAY ZUR BESTIMMUNG DER RELATIVEN ABUNDANZ VON BSL2-4616811 UND BSL2-L165-35b
  • Um zu bestimmen, ob entweder BSL2-4616811 oder BSL2-L165-35b die vorherrschende Spezies von BSL2 sind und ob das Vorherrschen mit dem Zelltyp und/oder Stimulustyp übereinstimmt, wurde das folgende experimentelle Vorgehen angewendet. Die Analyse der Genomsequenz von BSL2 zeigte, dass in die Sequenz mehrere durch Intronen separierte Exonen einbezogen sind. Es wurde angenommen, dass von dieser Sequenz ein primäres Transkript erzeugt wurde und das primäre Transkript gespleißt wurde, um BSL2-4616811-reife RNA zu liefern. Die Analyse der BSL2-4616811-Sequenz zeigte, dass sie auf die folgenden codierte: ein 5'-UTR, eine iniziierende ATG, eine Signal-Peptidsequenz, eine variable Ig-Faltung (v1), eine Ig-konstante Faltung (c1), eine Ig-V-Faltung (v2), eine IG-C-Faltung (c2), ein kurzes Ligament einer vermutlichen Transmembrandomäne, ein kurzer cytoplasmischer Schwanz, ein Stopcodom und eine 3'-UTR.
  • Die BSL2-4616811-codierende Sequenz erschien in dem Humangenom einmalig, da die v1- und c1(v1c1)-Sequenz zu etwa 95% identisch mit der v2- und c2(v2c2)-Sequenz in der Aminosäurehülle war. Was von Bedeutung war, alle strukturell wichtigen Reste waren in den v1c1- und v2c2-Aminosäuresequenzen erhalten und die meisten Änderungen von v1c1 zu v2c2 waren konservative Änderungen. Ein Vergleich der BSL2-L165-21- und BSL2-L165-35b-Sequenzen (die lediglich einzelne V- und C-Faltungen enthielten) mit der BSL2-4516811-Sequenz zeigte, dass in jedem Fall ein Spleißereignis auftrat, das zu einer Verschiebung von v1 zu der exakten homologen Stelle in v2 führte. Allerdings verschob sich BSL2-L165-21 von v1 zu v2 an einer anderen Stelle als B5L2-L165-35b.
  • Trotz der 96%igen Identität zwischen v1c1 und v2c2 in der Nucleotid-Höhe lieferte ein Sequenzvergleich zwischen zwei Regionen unter Verwendung von GCG-Gap eine kurze Region mit relativ geringer Homologie. Es wurde ein Vorwärtsprimer, bezeichnet als BSL2-9, geschaffen, um den Vorteil dieser kurzen Region mit geringer Homologie zu nutzen. BSL2-9 wurde so geschaffen, dass es spezifisch an v1 (8E zeigt die Spezifität des BSL2-9-Primers) bindet. Ein Reverseprimer, BSL2-11 wurde geschaffen, um die Ligamentsequenz zu hybridisieren.
  • Zu beachten ist, dass das BSL2-4616811-Transpkript sowohl die BSL2-9-v1-Bindungsstelle in v1 als auch die homologe Stelle in v2 enthielt. Das BSL-L165-35b-Transkript enthielt lediglich die BSL2-9-v1-Bindungsstelle. Das BSL2-L165-21-Transkript enthielt lediglich die v2-Bindungsstelle. Dementsprechend war von einer mit den Primern BSL2-9 und BSL2-11 ausgeführten PCR zu erwarten, dass die folgenden erzeugt werden: 1) ein PCR-Produkt mit näherungsweise 1.150 bp, das BSL2-4616811 repräsentiert; oder 2) ein PCR-Produkt von etwa 550 bp, das BSL2-L165-35b repräsentiert.
  • Zunächst wurde eine PCR mit BSL2-4616811-Plasmid ausgeführt, um die Spezifität des BSL2-9-Primers zu bestätigen. Eine PCR wurde unter Verwendung von 2 μl 10 ng/μl BSL2-4616811-Plasmid-DNA, 5 μl PCR-Puffer (GibcoBRL), 1,5 μl 25 mM MgCl2 (GibcoBRL), 1 μl 10 mM dNTP's (GibcoBRL), 2,5 μl 10 pMol/μl BSL2-9-Primer (5' TGGTGCACAGCTTTGCT 3') (SEQ ID NO: 59), 2,5 μl 10 pMol/μl BSL2-11-Primer (5' TCTGGGGGGAATGTCAT 3') (SEQ ID NO: 60), 0,5 μl 5 U/μ GibcoBRL-Platin-Taq-DNA-Polymerase (Cat. # 10966-018) und 35 μl dH2O ausgeführt. Die PCR wurde auf einem PE Biosystems 9700 unter Anwendung der folgenden zyklierenden Bedingungen ausgeführt: 94°C für 30 Sekunden: gefolgt von 35 Zyklen bei 94°C für 30 Sekunden, 61°C für 30 Sekunden, 72°C für 60 Sekunden; gefolgt von 72°C für 10 Minuten. Danach wurde eine PCR-Reaktion mit dem 40 μl auf einen 1,2% Agarose-Gel nahe der Lambda-BstEII-DNA-Leiter (New England Biolabs Beverly, MA; Cat. # 301-4S) gefahren. Das 1.150 bp-Band war vorherrschend, was zeigt, dass der BSL2-9-PCR-Primer auf die BSL2-4616811-Sequenz spezifisch war (8E).
  • Es wurden RAJI, RAMOS, PM-LCL, PL-LCL und CE-LCL B-ähnliche Zelllinien, HL-60 und Thp1-Monozytische-ähnliche Zelllinien sowie CEM und Hut78 T-ähnliche Zelllinien in RPMI 1640 mit 10% FBS und 1% GibcoBRL-Penicillin/Streptomycin bis zu einer Konzentration von 5 × 105 Zellen/ml aufgezogen. Die Kulturen wurden aufgeteilt und die eine Hälfte der B-ähnlichen und T-ähnlichen Zellkulturen mit 30 ng/ml PMA und 1 μM Ionomycin für 24 Stunden stimuliert. Monozytische Zelllinien wurden mit 1 μg/ml LPS für 24 Stunden stimuliert. Eine erste Passage von HUVEC wurde bis zu einer 90% Konfluenz aufgezogen und eine Hälfte der Kultur mit 10 ng/ml TNF-α stimuliert und bei 6 oder 24 Stunden geerntet. Unstimulierte HUVEC wurde bei 24 Stunden geerntet.
  • Es wurden T-Zellen des peripheren Bluts von zwei Spender wie folgt gereinigt:
  • HERSTELLUNG VON PERIPHEREN T-ZELLEN
  • Durch Ausschlämmen wurden aus Blutzellen humane, periphere T-Zellen erhalten. Der Ausschlämmungspuffer enthielt 1 Liter RPMI (GibcoBRL/Life Technologies Inc., Rockville, MD; Cat. # 11875-085) mit 2,5 mM EDTA und 10 μg/ml Polymyxin B. Der Puffer wurde 1 Tag vor der Prozedur des Ausschlämmen angesetzt und bei Raumtemperatur aufbewahrt. Für die Prozedur des Aufschlämmmens wurden 225 ml EDTA Vollblut/Spender erhalten und aufbereitet. Zu zwölf 50 ml-Zentrifugenröhrchen wurden 20 ml Aufschlämmungspuffer zugegeben und die 225 ml Blut gleichmäßig auf die Röhrchen aufgeteilt. Die Mischung in jedem Röhrchen wurde mit 12 ml Ficoll-Lösung (Lymphozytentrennungmedium) unterschichtet (AccuPrep Lymphocytes, Accurate Scientific Co.; Cat. # 1053980). Die Röhrchen wurden mit 1.800 U/Min. für 25 Minuten zentrifugiert.
  • Mithilfe der folgenden Prozedur wurden rote Blutzellen von Schafen präpariert. Es wurden 12 ml "Sheep Blood Alsever's" (SRBC, Colorado Serum Co., Denver, CO, Cat. # CS1112) suspentdiert und für 10 Minuten bei 2.000 U/Min. zentrifugiert. Die obere Schicht des SRBC-Pellets wurde entfernt und das Pellet zweimal mit Ausschlämmungspuffer gewaschen. Nach jeder Wäsche wurde das Pellet für 8 Minuten bei 2.200 U/Min. zentrifugiert. Nach der zweiten Wäsche wurde das Pellet erneut in 5 ml Ausschlämmungspuffer suspendiert und tiefgekühlt.
  • Nach der Zentrifugation wurde der Überstand der Ficoll-unterschichteten Röhrchen abgesaugt, um näberungsweise 5 ml der Zwischenschicht zurückzulassen. Die Zwischenschicht wurde sodann sorgfältig in ein neues Rohr, ohne das Pellet der roten Blutkörperchen in dem jeweiligen Rohr zu stören, entnommen. Die Zwischenschichten von zwei 50 ml-Röhrchen wurden vereint und in ein neues 50 ml-Röhrchen gegeben, sodass insgesamt sechs 50 ml-Röhrchen erhalten wurden. Jedem Röhrchen wurde Ausschlämmungspuffer zugegeben, um das Endvolumen auf 50 ml pro Röhrchen bringen. Die Röhrchen wurden für 10 Minuten bei 1.800 U/Min. zentrifugiert und der Überstand entfernt. Die peripheren Blut-T-Zellen von jedem Spender wurden vereint und zwischen zwei Röhrchen aufgeteilt und in 40 ml Ausschlämmungspuffer pro Röhrchen suspendiert. Die Röhrchen wurden für 10 Minuten bei 1.500 U/Min. zentrifugiert, der Überstand abgesaugt und das Pellet erneut in 30 ml Ausschlämmungspuffer pro Röhrchen suspendiert.
  • Nach diesem Schritt wurden jedem Röhrchen 3 ml gewaschens SRBC zugegeben und die Mischung für 5 Minuten bei 1.000 U/Min. zentrifugiert. Das Pellet wurde auf Eis für mindestens 1 Stunde inkubiert und jedes Pellet durch Umkehren der Röhrchen erneut leicht in Suspension gebracht. Zum Unterschichten der Mischung in jedem Röhrchen wurden 12 ml Ficoll verwendet. Die Röhrchen wurden für 20 Minuten bei 2.500 U/Min. zentrifugiert und die Zwischenschichten entnommen und in neue Röhrchen wie bereits beschrieben gegeben. Die Zwischenschichten wurden sodann erneut in 10 ml Ausschlämmungspuffer suspendiert und bis zum Start der Prozedur der Ausschlämmung auf Eis aufbewahrt.
  • AUSSCHLÄMMUNG VON T-ZELLEN
  • Die Ausschlämmung wurde wie folgt vorgenommen. Der Durchsatz der Ausschlämmungspumpe wurde auf etwa 65 ml/Min. eingestellt und das Ethanol zur Aufbewahrung aus den Zuführleitungen für die Pumpe entfernt. Die Zuführleitungen, Kammern und der Rotor wurden mit etwa 100 ml destilliertem Wasser gewaschen. Der Pumpendurchsatz wurde auf 50 ml/Min. zurückgestellt und Ausschlämmungspuffer durch die Zuführleitungen, die Kammer und den Rotor geleitet. Die Zuführleitungen wurden auf Vorhandensein von Bläschen überprüft und etwaige Bläschen entfernt. Die Zentrifugendrehzahl wurde sodann auf 1.950 ± 1 U/Min. eingestellt und die Pumpe bei 15 ml/Min kalibriert. Der Pumpendurchsatz wurde sodann auf 11 ml/Min. verringert und der Hahn zu der Kammer geschlossen.
  • Zum Laden der Zellen wurde der Ladehahn der Spritze geschlossen und die Auslastpipette in das 50 ml-Reagenzglas gegeben, das als 11 ml/Min.-Fraktion gekennzeichent war. Die Zellen wurden gemischt und der Ladespritze zugegeben. Der Hahn der Ladespritze wurde geöffnet und das Zuführrohr mit 10 ml Ausschlämmungspuffer gespült. Sobald etwa 0,5 ml Zellen in der Spritze verblieben, wurde Ausschlämmungspuffer zugegeben und dieser Schritt ein weiteres Mal wiederholt. Nach diesem Schritt wurde der Hahn der Ladespritze geschossen und der Hahn der Kammer geöffnet. Es wurden 50 ml-Fraktionen bei einem Durchsatz der Pumpe von 11 (2 Fraktionen), 14, 16 und 36 (2 Fraktionen) ml/Min. aufgenommen und sodann auf Eis gegeben. Die Fraktion der T-Zellen wurde für 8 Min. bei 1.800 U/Min. zentrifugiert und die Zellen erneut in 10 ml 25%igem fötalem Rinderserum/RPMI mit 1 μg/ml Polymyxin B suspendiert. Die Zellen wurden gezählt und auf Eis bis zur Weiterverwendung aufbewahrt. Es wurden Zellen (1 × 106 Zellen/ml) zu RPMI 1640 mit 10% Humanserum und 1% GibcoBRL Penicillin/Streptomycin gegeben. Die Zellen wurden sodann bei 37°C und 5% CO2 für 72 Stunden inkubiert. Es wurden T75-Kolben mit 1 μg/ml CD3Mab G19.4 (hierin beschrieben) in PBS für 4 Stunden bei 37°C beschichetet. Der Kolben wurde zweimal mit PBS gewaschen und Zellen (1 × 105 Zellen/ml) in RPMI 1640 mit 10% Humanserum und 1% GibcoBRL Penicillin/Streptomycin, CD28 MAb 9.3 (bereits beschrieben) bis zu einer Endkonzentration von 1 μg/ml zugegeben. Die Zellen wurden für 72 Stunden bei 37°C und 5% CO2 aufgezogen. Die Zellen wurden (1 × 106 Zellen/ml) zu RPMI 1640 mit 10% Humanserum und 1% GibcoBRL Penicillin/Streptomycin hinzugefügt. Es wurde PMA zu 30 ng/ml zugegeben und Ionomycin zu 1 μM zugesetzt und für 48 Stunden bei 37°C und 5% CO2 inkubiert. Die Proliferation von stimulierten T-Zellen wurde visuell bestätigt. Alle Zelltypen wurden pelletisiert und auf Trockeneis tiefgefroren und bis zur Weiterverwendung bei –70°C aufbewahrt.
  • Es wurde Gesamt-RNA hergestellt, indem entsprechend den Herstelleranweisungen das Invitrogen (Carlsbad, CA) SNAP-GanzRNA-Isolationskit (Cat. # K1950-01) verwendet wurde. Der erste Strang cDNA wurde unter Verwendung des GibcoBRL Superscript First-Strand Synthesis System für RT-PCR (Cat. # 11904-018) entsprechend den Herstelleranweisungen für die Oligo-dT-Primeranlagerung hergestellt. Die PCR wurde unter Verwendung von 2 μl Erststrang-cDNA, 5 μl PCR-Puffer (GibcoBRL), 1,5 μl 25 mM MgCl2 (GibcoBRL), 1 μl 10 mM dNTP (GibcoBRL), 2,5 μl 10 pMol/μl BSL2-9-Primer (5' TGGTGCACAGCTTTGCT 3') (SEQ ID NO: 61), 2,5 μl 10 pMol/μl BSL2-11-Primer (5' TCTGGGGGGAATGTCAT 3') (SEQ ID NO: 62), 0,5 μl 5 U/μl GibcoBRL Platin-Taq DNA-Polymerase (Cat. # 10966-018) und 35 μl dH2O ausgeführt. Die PCR wurde auf einem PE-Biosystems 9700 ausgeführt, indem die folgenden Bedingungen des Zyklisierens angewendet wurden: 94°C für 30 Sekunden; gefolgt von 35 Zyklen bei 94°C für 30 Sekunden, 61°C für 30 Sekunden, 72°C für 60 Sekunden; gefolgt von 72°C für 10 Minuten. Danach wurden die 40 μl der PCR-Reaktion auf einem 1,2% Agarose-Gel unterworfen.
  • Die PCR-Analyse zeigt, dass bestimmte Zelltypen überwiegend das BSL2-4616811-Transkripft mit oder ohne Stimulation enthielten. Nichtstimulierte und stimulierte PL-LCL-Zellen zeigten höhere Mengen an BSL2-4616811-Transkript als die des BSL2-L165-35b-Transkrips (8A). Sowohl nichtsimulierte als auch stimulierte HUVEC-Zellen zeigten höhere Mengen des BSL2-4616811-Transkriptes als den BSL2-L165-35b-Transkriptes (8B).
  • Im Gegensatz dazu enthielten andere Zelltypen überwiegend das BSL2-L165-35b-Transkript mit oder ohne Simulation. Simulierte RAJI-Zellen und nichtstimulierte und stimulierte RAMOS-Zellen zeigten höhere Mengen des BSL2-L165-35b-Transkriptes als den BSL2-4616811-Transkript (8A). Nichtsimulierte und stimulierte HL60-Zellen zeigten höhere Mengen des BSL2-L165-35b-Transkriptes als den BSL2-4616811-Transkript (8B).
  • Darüber hinaus zeigten bestimmte Zelltypen eine Zunahme der Mengen an BSL2-4616811-Transkript bei Aktivierung. Nichtstimulierte PM-LCL-Zellen zeigten höhere Mengen des BSL2-4616811-Transkriptes, was bei Stimulation relativ zu den BSL2-L165-35b-Transkript zunahm (8A). Ähnlich zeigten nichtstimulierte CE-LCL-Zellen höhere Mengen des BSL2-4616811-Transkriptes, die relativ zu dem BSL2-165-35b-Transkript bei Stimulatin zunahme (8B). Nichtstimulierte Thp1-Zellen zeigten äquivalente Mengen des BSL2-4616811- und des BSL2-L165-35b-Transkriptes, wobei jedoch die Mengen des BSL2-4616811-Transkriptes bei Stimulation zunahmen (8B). Nichtstimulierte periphere Blut-T-Zellen vom Spender 079 zeigten überwiegend BSL-L165-35b, jedoch verschoben zu oberwiegend BSL2-4616811 bei Stimulation. Periphere Blut-T-Zellen vom Spender 124 zeigten eine weniger dramatische Verschiebung von BSL2-L165-35b zu BSL2-4616811 bei Stimulation (8C). Nichtstimulierte CEM- Zellen zeigten höhere Mengen des BSL2-L165-35b-Transkriptes, wobei jedoch die Mengen des BSL2-4616811-Transkriptes bei Aktivierung zunahmen (8D).
  • Andere Zelltypen zeigten eine Zunahme der BSL2-L165-35b-Mengen bei Aktivierung. Nichtstimulierte HUT78-Zellen zeigten höhere Mengen des BSL2-4616811-Transkriptes, wobei jedoch die Mengen des BSL2-L165-35b-Transkriptes bei Aktivierung zunahmen (8D). Die Ergebnisse verbunden mit der Bewahrung der Aminosäuresequenzen in allen vier Ig-Faltungen, die Bewahrung der strukturell bedeutenden Aminosäurereste in allen vier Ig-Faltungen und die konservative Beschaffenheit der Aminosäureunterschiede zwischen v1c1 und v2c2 stützen eine Funktion für BSL2-4616811 (BSL2vcvc), die von BSL2-L165-35b und BSL2-165-21 (BSL2vc) verschieden ist.
  • Um die Gegenwart von PCR-Artefakten auszuschließen, wurde das für 24 Stunden mit TNFα aktivierte PCR-Produkt von HUVEC unter Verwendung des Invitrogen Original TA Cloning Kit (Cat. # K2000-01) entsprechend den Herstelleranweisungen kloniert. Das Konstrukt wurde verwendet, um Bakterienzellen zu transfizieren, und es wurden 25 weiße Kolonien isoliert und in LB mit 100 μg/ml Ampicillin aufgezogen. DNA-Präparate wurden hergestellt und ein Sequenzieren ausgefüht. Von den 25 Klonen enthielten 10 Klone kein Insatz, 3 Klone erzeugten keine lesbare Sequenz, 3 Klone enthielten BSL2-verwandte Sequenzen mit ausgiebigen Deletionen und die übrigen 9 Klone erzeugten ein mit BSL2-4616811 übereinstimmende Sequenz.
  • Es wurde festgestellt, dass in nichtstimulierten RAJI-Zellen ein PCR-Produkt entsprechend der BSL2-4616811 oder BSL2-L165-35b zu beobachten war. Zur Bestätigung dieses Ergebnisses wurde die PCR für nichtstimulierte und stimulierte RAJI-Zellen entspreched der vorstehenden Beschreibung wiederholt. Wiederum wurde kein PCR-Produkt für die nichtstimulierten RAJI-Zellen nachgewiesen. Anschließend wurde eine PCR unter Verwendung von G3PDH-Primern mit einem Template ausgeführt, das von nichtstimulierten und stimulierten RAJI-Zellen isoliert wurde. Die Bedingungen des Zyklisierens waren identisch denjenigen, wie sie vorstehend beschrieben wurden mit der Ausnahme der Annealing-Temperature von 55°C und der Ausdehungszeit von 45 Sekunden. Es wurden sowohl für nichtsimulierte als auch für stimulierte RAJI-Zellen relativ gleiche Mengen an G3PDH-Produkt detektiert. Dieses lieferte eine weitere Bestätigung fur die Beobachtung, dass nichtstimulierte RAJI-Zellen kein detektierbares BSL2-Transkript enthalten.
  • BSL2-4616811-Ig-FUSIONSKONSTRUKT
  • Zum Aufbau des BSL2-4616811-Ig-Plasmids wurde die BSL2-4616811 extrazellulare Domänse von der erststrängigen cDNA PCR-amplifiziert (GibcoBRL Cat. # 11904-018). Es wurde cDNA von RNA hergestellt, gereinigt von THP1-Zellen, stimuliert mit 100 ng/ml LPS für 2 Stunden. Die RNA wurde unter Anwendung des Invitrogen FastTrack 2,0 (Cat. # K1593-02) gereinigt. In die PCR-Reaktion einbezogen waren 1 μl cDNA; 5 μl GibcoBRL 10 × PCR-Puffer; 1,5 μl 25 mM MgCl2; 1 μl 10 mM dNTP (Boehringer-Mannheim); 2,5 μl BSL2-L165-21-Ig-1-Primer (10 pM/μl); 2,5 μl BSL2-165-21-Ig-2-Primer (10 pM/μl); 1 μl CLONTECH Advantage-Polymerase (Cat. # 8417-1) und 35,5 μl MilliQH2O. Die Primer enthielten die folgende Sequenz: BSL2-L165-21-Ig-1; 5' gg ggt ace ATG CTG CGT CGG CG 3' (SEQ ID NO: 63); BSL2-L-165-21-Ig-2: 5' cg gaa ttc TGG GGG GAA TGT CAT AG 3' (SEQ ID NO: 64). Die PCR-Proben wurden für 1 Minute bei 94°C inkubiert, gefolgt von 35 Zyklen Inkubation bei 94°C für 30 Sekunden, 59°C für 30 Sekunden und 72°C für 45 Sekunden, gefolgt von Inkubation für 10 Minuten bei 72°C.
  • Anschließend wurden diese 30 μl der PCR-Reaktion auf einem 1,2% Agarose 0,5 × TBE-Gel verwendet. Es wurde ein Band von näherungsweise 1.100 bp exzidiert und unter Anwendung des QIAGEN-Gel-Extraction-Kit (Cat. # 28704) gereinigt. Ein Mikroliter des gereinigten PCR-Produktes (L254) wurde in pCR2.1 unter Anwendung des TA-Klonierungskits (Invitrogen; Cat. # K2050-01) ligiert. Fünf Mikroliter der Ligationsmischug wurden in MAX Efficiency DH5-Alpha-kompititente Bakterien transfiziert (GibcoBRL; Cat. # 18258-012) und die transfizierten Zellen auf LB-Platten aufgezogen, die 100 μg/ml Ampicillin und 800 μg X-Gal enthielten. Es wurden weiße Kolonien in 5 ml LB-Brühe geimpft, die 100 μg/ml Ampicillin enthielt, und für 18 Stunden bei 37°C aufgezogen. Die Plasmid-DNA wurde mit QIAGEN-Spin-Miniprep-Kit (Cat. # 27106) gereinigt. Die Plasmid-DNA wurde mit KpnI und EcoRI digeriert. Plasmide, die etwa 1.300 bp Insertionen enthielten, wurden unter Anwendung des automatischen DNA-Squenzierungsautomaten von Applied Biosystems sequenziert (ABI 3.700 Kapillararray-Sequenzer). Von der L254-7 wurde ermittelt, dass sie eine BSL2-4616811-Sequenz vom Wild-Typ enthielt.
  • Der Fc-Abschnitt von Human-IgG1 wurde PCR-amplifiziert unter Verwendung von 0,001 μl BSL1-Ig, wie bereits beschrieben wurde; 5 μl GibcoBRL-PCR-Puffer; 1,5 μl 25 mM MgCl2; 1 μl 10 mM dNTP (Boehringer-Mannheim); 2,5 μl Ig-1-Primer (10 pM/μl), 2,5 μl BSL1g-2-Primer (10 pM/μl); 1 μl CLONTECH Advantage-Polymerase; 36 μl dH2O. Die Primer enthielten die folgenden Sequenz: IgG-1: 5'g gaa ttc GAG CCC AAA TCT TGT GAC AA 3' (SEQ ID NO: 65); BSL1Ig-2 gc gc tct aga TCA TTT ACC CGG AGA CAG G (SEQ ID NO: 66). Die PCR-Proben wurden für 1 Minute bei 94°C inkubiert, gefolgt von 25 Zyklen Inkubation für 30 Sekunden bei 94°C, für 30 Sekunden bei 59°C und für 30 Sekunden bei 72°C; gefolgt von einer Inkubation für 10 Minuten bei 72°C.
  • Anschließend wurden die 30 μl der PCR-Reaktion auf einem 1% Agarose-0,5 × TBE-Gel verwendet. Es wurde ein Band von etwa 700 bp exzidiert und unter Verwendung des QIAGEN Qiaquick-Gelextraktions-Kit gereinigt. Es wurden 2 μl des gereinigten Fragments (L174) in pCR2.1 unter Verwendung des TA-Klonierungskits (Invitrogen) ligiert. Fünf Mikroliter der Ligationsmischung wurden in GibcoBRL-MAX Efficiency-DH5-Alpha-kompetente Bakterien transfiziert und transfizierte Zellen auf LB-Platten aufgezogen, die 100 μg/ml Ampicillin und 800 μg X-Gal enthielten. Die Platten wurden für 18 Stunden bei 37°C inkubiert. Es wurde weiße Kolonien in 5 ml LB-Brühe geimpft, die 100 μg/ml Ampicillin enthielt, und für 18 Stunden bei 37°C aufgezogen. Die Plasmid-DNA wurde unter Verwendung des QIAGEN-Qiaprep-Spin-Miniprep-Kit hergestellt. Die Plasmid-DNA wurde mit mit EcoRI digeriert und auf einem Agarose-Gel verwendet. Plasmide, die Insertionen von etwa 900 bp enthielten, wurden sequenziert. Von der L174-3 wurde festgestellt, dass sie ein Human-IgG1 Fc-Sequenz vom Wild-Typ enthielt.
  • L174-3 wurde mit EcoRI/XbaI digeriert und auf 1,2% Agarose-0,5 × TBE-Gel separiert. Es wurde ein Band von etwa 750 bp exzidiert und unter Verwendung des QIAGEN-Gel-Extraktion-Kits gereinigt. Es wurden zehn Mikroliter des gereinigten Fragments auf einem Agarose-Gel nahe an einem Standard verwendet, um einen Schätzwert der Konzentration zu erhalten. Es wurden näherungsweise 10 ng des EcoRI/Xbal-Fragments in 40 ng EcoRI/XbaI-digeriert-pCDNA3.1+Vektor (Invitrogen) unter Verwendung von GibcoBRL-Hochkonzentration-T4DNA-Ligase (5 U/μl), verdünnt in GibcoBRL T4DNA-Ligasepuffer ligiert (Ligation 200). Fünf Mikroliter der Ligationsmischung wurden in MAX Efficiency DH5-Alpha- kompetente Bakterien (GibcoBRL) transfiziert und die transfizierten Zellen auf LB-Platten aufgezogen, die 100 μg/ml Ampicillin enthielten. Die Platten wurden für 18 Stunden bei 37°C inkubiert. Es wurden Kolonien in LB-Brühe geimpft, die 100 μg/ml Ampiclillin enthielt. Die Plasmid-DNA wurde unter Verwendung des QIAGEN-Spin-Miniprep-Kits gereinigt und sequenziert. Von der L200-1-Sequenz wurde festgestellt, dass sie mit der L174-3-Sequenz identisch war.
  • Das L254-7 BSL2-4146811-Konstrukt wurde mit KpnI/EcoRI digeriert. Es wurde ein Band von etwa 1.300 bp von einem 1,2% Agarose 0,5 × TBE-Gel exzidiert und in das L200-1 Fc-Konstrukt digeriert mit KpnI/EcoR ligiert. Es wurden fünf Miktroliter der Ligationsreaktion in MAX Efficiency DH5-Alpha-Zellen transfiziert und auf LB-Platten gezogen, die 100 μg/ml Ampicillin enthielten. Es wurden Kolonien aufgezogen und die Plasmid-DNA wie vorstehend gereinigt. Die Plasmid-DNA wurde mit KpnI/XbaI digeriert und auf einem Agarose-Gel wie vorstehend separiert. Die Plasmide, die ein Band von etwa 2 kb enthielten, wurden wie vorstehend sequenziert. Von BSL2-4616811-Ig wurde festgestellt, dass es BSL2-4616811 vom Wild-Typ und Human-IgG1-Sequenzen vom Wild-Typ enthielt. Das Nucleotid und die vorhergesagte Aminosäuresequenz von BSL2-4616811-Ig sind in den 4A und 4B dargestellt.
  • BSL2-MONOKLONALE ANTIKÖRPER
  • Das BSL2-4616811-Ig-Fusionsprotein wurde mithilfe der Affinitätsreinigung gereinigt.
  • REINIGUNG VON BSL2-4616811-IG-FUSIONSPROTEIN
  • Die Reinigung von BSL2-4616811-Ig (Human-IgG1) wurde mithilfe einer einstufigen Affinitätsreinigung erzielt. Der Überstand von transient transfizierten COS-Zellen, die BSL24616811-Ig exprimieren, wurde auf eine Sepharose-Säule von immobilisiertem Protein A gegeben. Die Säule wurde mit PBS solange gewaschen, bis die Absorption bei 280 nm Grundlinienniveau erreicht hatte. Das gebundene Protein wurde mit Immun Pure IgG Elution Buffer (Pierce Chemical, Rockford, IL; Cat. # 21004) eluiert. Die von dem gebundenen Protein erhaltenen Fraktionen wurden mit 1/8 (Volumen/Volumen) 3 M Natriumphosphat, pH 7, neutralisiert. Das resultierende Präparat wurde gegen PBS dialysiert und filtriert (0,2 μm). Die Puffer enthielten 0,02% (Gewicht/Volumen) Natriumazid. Das gereinigte Fusionsprotein wurde sodann verwendet, um Mäuse zu immunisieren, indem das nachstehend beschriebene Protokoll angewendet wurde mit der Ausnahme, dass ein vierter Boost verwendet wurde.
  • IMMUNISIERUNG MIT BSL2-POLYPEPTID
  • Für die erste Immunisierung wurden Mäuse zwischen 1 und 3 Monaten verwendet (BalbC; Hartan, Indianapolis, Indiana). Es wurde eine RIBI-Adjuvants wie folgt angesetzt: In eine Ampulle wurden 0,5 mg MPL (Monophospharyl-Lipid A; RIBI Immumochemical Research, Inc., Hamilton, MT); 0,5 mg TDM (synthetisches Trehalosedicorynomycolat; RIBI Immunochemical Research, Inc.) und 40 μl Squalen mit 0,2% Tween 80 zusammengemischt. Die Mischung wurde für 5 bis 10 Minuten bis 40° bis 45°C angewärmt und 2 ml BSL2-Polypeptid/PBS (125 μg/ml) zugegeben. Die Lösung wurde für mehrere Minuten heftig vortexiert. Die Lösung wurde in eine Spritze aufgezogen und sofort in die Mäuse injiziert.
  • Die Dosierungen folgten den Empfehlungen von RIBI Immunochemical Research, Inc. Bei der ersten Injektion wurden näherungsweise 100 μg BSL3-Polypeptid in 250 μl 1 × RIBI in PBS suspendiert. Die Mischung wurde intraperitoneal mit einer 21er Nadel injiziert. Bei den zweiten und anschließenden Injektionen wurden Boosts mindestens 3 Wochen im Abstand gegeben. Die Injektionen erfolgten mit halber Dosierung. Mindestens drei Wochen nach der dritten Injektion wurde das Tier, sobald der Titer einen akzeptablen Wert (siehe nachstehend) erreichte, mit einem abschließenden Boost versehen. Die abschließenden Injektionen von näherungsweise 1 mg/ml BSL2-Polypeptid wurden in PBS (RIBI wurde weggelassen) suspendiert und die Mischung intravenös über die Schwanzvenen verabreicht. Die Tiere wurden 3 bis 4 Tage später eingesammelt.
  • Zu Überwachung der Titerwerte wurden Serumproben vor der ersten Immunisierung (Hintergrund) und 7 bis 10 Tage nach jeder Immunisierung zur Titerüberwachung genommen. Die Titerwerte wurden mithilfe der ELISA gemessen. Die Seren wurden über Augenblut oder Schwanzblut erhalten. Im typischen Fall wurden 200 μl Blut zum Serumtesten entnommen. Anschließend wurden Hybridom-Zelllinien konstruiert und BSL2-MAbs wie folgt isoliert:
    HYBRIDOM-ZELLLINIEN: Hybridom-Zelllinien wurden unter Anwendung der folgenden Reagenzien konstruiert: Iscoves Modified Dulbecco's Mediom (GibcoBRL; Cat. # 12440-053); fötales Rinderserum (Hyclone; Cat. # A-1115L,Lot # 11152564) wärmeaktiviert für 30 Minuten bei 56°C; L-Glutamin-200 mm, 100 × (GibcoBRL; Cat. # 25030-081); Penicillin/Streptomycin (GibcoBRL; Cat. # 15140-122); ORIGEN Hybridoma Cloning Factor (Igen International, Inc., Gaithersburg, MD; Cat. # IG50-0615, Lot # 8077); HT Supplement 100 × (GibcoBRL; Cat. # 11067-030); HAT Supplement 100 × (GibcoBRL; Cat. # 31062-037); PEG 1500, (Boehringer Mannheim; Cat. # 783 641); Puffer zum Lysieren von roten Blutkörperchen von Lab Services (Cat. # 3KL-449); Trypane Blue; 70% Ethanol; Myelom-Zells (P3x) von ATCC.
  • Es wurden die folgende Anlage und Ausstattung angewendet: Laminarfluß-Haube; CO2 Inkubator, Umkehrmikroskop; 37°C-Wasserbad; Zentrifuge; 96iger Mikrotiterplatte mit flachen Mulden für Gewebekulturen (Corning; Cat. # 25860-96); serologische Pipetten und Integrid-Petrischalen (Falcom); 50 ml-Zentrifugenröhrchen (Corning; Cat. # 430921); konische 15 ml-Röhrchen (Falcon; Cat. # 2096); autoklavierte Scheren und Pinzetten; Mehrkanalpipette; breite Düse 200 μl-Pipettenspitzen (Denville Scientific, Inc., Metuchen, NJ; Cat. # P1105-CP); sterile Pipettenspitzen (VWR, Buffalo Grove, IL; Cat. # 53508-794).
  • HAT- und HT-Medium wurden wie folgt angesetzt:
    HAT-Medium HT-Medium
    IMDM 500 ml IMDM 500 ml
    L-Glutamin 2,5 ml L-Glutamin 2,5 ml
    Pen/Strep 5 ml Pen/Strep 5 ml
    HAT-Ergänzung 5 ml HAT-Ergänzung 5 ml
    Origen Hy, Clon. F. 10% Abschluß Origen Hy, Clon. F. 10% Abschluß
  • Die Mäuse erhielten einen abschließenden Boost für 3 bis 4 Tage vor der Fusion in PBS intravenös oder intraperitonel. Myelomzellen wurden in exponentiellem Wachstum (Log-Phase) gehalten. Die Mäuse wurden euthanisiert und die Milz von jeder Maus aseptisch entnommen. Die Milz wurde in eine Petrischale gegeben, die eine warme Iscoves-Lösung ohne FBS enthielt. Es wurde eine Suspension von Milzzellen angesetzt und in ein Zentrifugenröhrchen gegeben. Die HAT-sensitiven Myelomzellen wurden in ein separates 50 ml-Zentrifugenröhrchen gegeben. Die Milzzellen und Myelomzellen wurden bei 400 g für 5 Minuten zentrifugiert und der Überstand abgesaugt. Die roten Blutkörperchen der Milz wurden lysiert mit 5 ml RBC-Lysing Buffer für 1 Minuten und das Röhrchen mit SF-Medium gefüllt (Hybridom-serumfreies Medium); GibcoBRL; Cat. # 12045-076). Die Splenozyten wurden mit 50 ml SF-Medium gewaschen und Milzzellen und Myelomzellen in separaten Zentrifugenröhrchen mit 400 g für 5 Minuten zentrifugiert. Milzzellen und Myelomzellen wurden gezählt und erneut in 25 ml mit SF-Medium suspendiert. Die Myelomzellen wurden den Milzzellen zugesetzt, um ein Verhältnis von 1:4 zu erhalten. Die Mischung wurde bei 400 g für 10 Minuten unter Erzeugung eines festen Pellets zentrifugiert und die gesamte Mediumlösung durch Absaugen entfernt.
  • Für die Experimente der Zellfusion wurden PEG, SF-Medium und HAT-Medium bei 37°C inkubiert. Den Zellen wurde für 1 Minute für 1 ml 50%iges PEG zugegeben (das PEG wurde nach 30 Sekunden zugegeben und die Zellen für 30 Sekunden gerührt). Die PEG-Lösung wurde an der Seite des Röhrchens zugegeben und das Pellet leicht gerührt. Unter Rühren wurde 1 ml SF-Medium zu den Zellen für 1 Minute zugegeben und 8 ml SF-Medium den Zellen für 2 Minuten zugesetzt. Die Zellen wurden mit 400 g für 10 Minuten zentrifugiert und der Überstand abgesaugt. Die Zellen wurden in 10 ml HAT-selektivem Medium erneut suspendiert, indem man die Pipette direkt auf das Pellet richtete und rührte. Es wurde zusätzliches HAT-Medium zugesetzt, um die Zellkonzentration auf 5 × 105 Zellen/ml zu bringen. Die Zellen wurden in 96er Mikrotiterplatten für Gewebekultur mit 5 × 104 Zellen/Mulde aliquottiert. Nach 3 Tagen wurde HT-Medium mit 100 μl/Mulde zugegeben. Näherungsweise 10 Tage später wurden Klone auf Antikörpererzeugung getestet. Positive Klone wurden zu 1 Mulde von 24er Mikrotiterplatte ausgedehnt. Positive Klone wurden sodann erneut getestet, isotypiert und zu T25 ausgedehnt (0,25 cm2 Gewebekulturkolben).
  • ELISA-ANALYSE
  • Zum Testen auf positiven Klonen wurde eine ELISA-Analyse unter Verwendung der folgenden Reagenzien und Ausstattungen ausgeführt: Carbonat/Hydrogencarbonat pH 9,6 (Sigma, St. Louis, MO; Cat. # C-3041) für die Beschichtung; Immulon 2 ELISA-Platten (Dynex, Chantilly, VA; Cat. # 0110103455); 10 × PBS (GibcoBRL), hergestellt auf 1 × Konzentration; Waschpuffer mit Tween 20 (0,05% Endkonzentration in 1 × PBS; Blockierungspuffer/Probe-Streckmittel, aufweisend Waschpuffer mit 5% NFM fettfreie Milch; Chromogen-Mischung mit 50% TMB (Kirkegaard & Perry Labs Gaithersburg, MD; Cat. # 50-76-01) und 50% Peroxidase (Kirkegaard & Perry Labs Cat. # 50-65-00).
  • Für die ELISA-Analyse wurden die Platten mit 75 μl/Mulde (1 μg/ml) BSL3-Ig in Carbonat/Hydrogencarbonat übernacht bei 4°C beschichtet. Die Platten wurden mit PBS Tween 20 (unter Vewendung von Skatron) gewaschen und mit 300 μl Blockierungspuffer für 45 Minuten bei Raumtemperatur blockiert. Die Platten wurden trockengeschwenkt und mit 75 μl/Mulde Seren, verdünnt in Blockierungspuffer inkubiert (die Seren wurden mit 1:50 auf höchste Konzentration verdünnt und anschließend in einer Reihenverdünnung um Faktoren von drei) für 45 Minuten bei Raumtemperatur und wie zuvor gewaschen. Anschließend wurden die Platten mit 75 μl/Mulde Anti-Maus-IgG im Blockierungspuffer inkubiert (1:10.000 Verdünnung, HRP-markiert; Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) für 45 Minuten bei Raumtemperatur und wie zuvor gewaschen. Anschließend wurden die Platten mit 100 μl/Mulde Chromogen-Mischung inkubiert und bis zu 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Das Signal wurde mit 100 μl 1N Schwefelsäure abgeschreckt und die Proben bei 450/630 nm gelesen. Unter Anwendung von ELISA wurden Überstände von Hybridomas zunächst gegen BSL2-4616811-Ig-Fusionsprotein gescreent und sodann gegen Ig-Protein allein. Die Hybridoma, die Antikörper erzeugten, die an BSL2-4616811-Ig gebunden waren, nicht jedoch an Ig, wurden als positive Klone bezeichnet.
  • SUBKLONIERUNG:
  • Es wurden positive Klone von der ersten Fusionsplatte ausgedehnt. Sobald sie aufgezogen waren, wurden die Zellen durch zwei Runden Einzelzellklonierungen geschickt, um zu gewährleisten, dass sie monoklonal waren. Jedes Hybridom wurde auf eine 96-Mikrotiterkulturplatte bei einer Konzentration von 0,5 Zellen/Mulde oder weniger aufgezogen. Sobald sich makroskopische Kolonien gebildet hatten, wurden die Überstände mithilfe der ELISA einem Screening unterworfen. Die positiven Klone von jedem Hybridom wurden mithilfe der ELISA quantitativ bestimmt. Die Klone, die die stärksten Signale lieferten, wurden ausgedehnt und durch eine zweite Runde des Klonierens geschickt. Wiederum wurden positive Klone mithilfe der ELISA einem Screening unterworfen und quantitativ bestimmt. Die Klone die das stärkste Signal lieferten, wurden wieder eingefroren.
  • BEISPIEL 3: ASSAYS UNTER VERWENDUNG BSL-MONOKLONALER ANTIKÖRPER
  • FACS-ANALYSE VON LUNGENEPITHELZELLEN UNTER VERWENDUNG VON BSL1 UND BSL2 MONOKLONALE ANTIKÖRPER:
  • Es wurde A549, eine Lungenepithelzelllinie in RPM1 1640 (GibcoBRL Cat. # 11875-005) plus 10% FBS (Summit, Ft Collins, CO; Cat. # S-100-05) und 1% Penicillin-Streptomycin (GibcoBRL Cat. # 15140-122) bei 37°C und 5% CO2 bis zu einer Konfluenz in einem T75-Kolben (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ; Cat. # 353111) aufgezogen. Die Zellen wurden mit Versene (GibcoBRL Cat. # 15040-066) abgehoben und zweimal in RPMI 1640 geschwaschen. Die Zellen wurden zu einer 96-Mikrotiterplatte gegeben (Becton Dickinson Cat. # 353077) (2,5 × 105 Zellen pro Mulde) und bei 2.000 U/Min. in einer Beckman-Tischzentrifuge zentrifugiert. Anschließend wurden die Zellen erneut in RPMI 1640 oder RPMI1640 mit 1 μg negativer Kontrollantikörper (MAb 15E10AA) oder Hybridom-Überstand suspendiert und für 30 Minuten auf Eis inkubiert. Die Zellen wurden sodann zweimal in RPMI 1640 gewaschen und erneut in Anti-Maus-Anti-Fc von Ziege suspendiert, konjugierte Antikörper (BioSource, Camarillo CA; Cat. # AMI4408) auf 1:50 in RPMI 1640 verdünnt. Sodann wurden die Zellen auf Eis für 30 Minuten inkubiert, zweimal in RPMI 1640 gewaschen, in RPMI 1640 erneut suspendiert und auf einem Becton Dickinson FACScan analysiert. Die FACS-Analyse zeigte, dass BSL1 MAb 32F9A7 (9A) und BSL2-4616811 (9B) MAbs alle an den A549-Zellen gebunden waren.
  • FACS-ANALYSE VERSCHIEDENER ZELLTYPEN UNTER VERWENDUNG VON BSL3-MONOKLONALEN ANTIKÖRPERN
  • Um festzustellen, ob auf der Oberfläche der verschiedenen Zelltypen BSL3-Polypeptid exprimiert wurde, wurden Zellen in Medien aufgezogen, wie sie nachfolgend in Tabelle 2 gezeigt sind. Es wurde 1-JUT 78 angereichert mit 20% FBS (Summit Biotechnology, Ft Collins, CO; Cat. # S-100-05). Alle anderen Zelllinien wurden angereichert mit 10% Summit FBS. Zusätzlich wurden alle Zelllinien angereichert mit 1% Penicillin/Streptomycin (GibcoBRL; Cat. # 15140-122). Die Zelllinien wurden bei 37°C mit 5% CO2 aufgezogen. TABELLE 2
    Zelllinie Herkunft Medien
    HL60 prä-myeloid RPMI 1640
    THP1 monozytisch RPMI 1640
    A549 Lungenepithel RPMI 1640
    H292 Lungenepithel RPMI 1640
    PM LCL B-Linie RPMI 1640
    PL LCL B-Linie RPMI 1640
    CE LCL B-Linie RPMI 1640
    Ramos B-Linie RPMI 1640
    CEM T-Linie RPMI 1640
    HUT 78 T-Linie IMDM1
    Jurkat T-Linie RPMI 16402
    1MDM: GibcoBRL; Cat. # 12440-053 2RPMI 1640: GibcoBRL; Cat. # 11875-005
  • Die Zellen wurden bis etwa 5 × 105 Zellen/ml aufgezogen. Die Zellen wurden zweimal in serumfreiem RPMI 1640 gewaschen und erneut suspendiert, um eine Endkonzentration von 2,5 × 106 Zellen/ml zu ergeben. Es wurden Anti-BSL3 MAb 1A4A1-Antikörper oder Isotyp-Kontrolle MAb 15E10A3-Antikörper zu 5 μg/ml zugegeben und für 30 Minuten bei 4°C inkubiert. Die Zellen wurden zweimal in serumfreiem RBMI 1640 gewaschen und erneut in serumfreiem RBMI 1640 plus 2% Anti-Maus-IgG von Ziege, konjugiert zu FITC (BioSource, Camarillo, CA; Cat. # AMI4408) suspendiert. Die Zellen wurden bei 4°C für 30 Minuten inkubiert. Die Zellen wurden zweimal mit serumfreiem RPMI 1640 gewaschen und auf einem Becton Dickenson FACScan (Becton Dickenson, Franklin Lakes, NJ) analysiert.
  • Das BSL3-Polypeptid war exprimiert auf A549 (Lungenepithel), H292 (Lungenepithel), PM LCL (B-Linie), PL LCL (B-Linie), CE LCL (B-Linie) und HUT78 (T-Linie)-Zellen (9C).
  • FACS-ANALYSE VON HUMANEN, UMBILLIKALEN VENEN-ENDOTHELZELLEN UNTER VERWENDUNG VON BSL3-MONOKLONALEN ANTIKÖRPERN
  • Es wurden BSL3-monoklonale Antikörper verwendet, um die BSL3-Polypeptidmengen auf humanen, umbillikalen Venen-Endothelzellen mit oder ohne TNF-Alpha-Stimulation zu messen. Es wurden humane, umbillikale Venen-Endothelzellen (HUVEC) bei 37°C mit 5% CO2 in EGM-Medium (Clonetics, Walkersville, MD; Cat. # CC-4176) aufgezogen bis zur Konfluenz. TNF-Alpha wurde weggelassen oder bis zu 10 ng/ml für 24 Stunden zugegeben. Die Zellen wurden mit Versene (GibcoBRL; Cat. # 15040-066) abgehoben und für die Durchflusszytometrie unter Verwendung von Anti-BSL3 MAb 1A4A1-Antikörpern entsprechend der vorstehenden Beschreibung präpariert. Als Kontrolle wurde eine Durchflusszytometrie ohne Antikörper ausgeführt. Die Ergebnisse zeigten, dass die BLS3-Polypeptidmengen auf TNF-Alpha- stimuliertem HUVEC erhöht waren (9D). Diese Zunahme wurde nicht bei nichtstimulierten Zellen beobachtet (9D).
  • FACS-ANALYSE VON HUMANEN MONOZYTEN DEN PERIPHEREN BLUTS UNTER VERWENDUNG VON BSL3-MONOKLONALEN ANTIKÖRPERN
  • Es wurden BSL3-monoklonale Antikörper verwendet, um die BSL3-Polypeptidmengen auf Human-Monozyten des peripheren Bluts mit oder ohne GM-CSF IL-4 oder PHA-Stimulation zu messen. Monozyten des peripheren Bluts (PBMC) wurden wie folgt gereinigt. Es wurden Blutproben unter zwölf konischen 50 ml-Röhrchen gleichmäßig aliquottiert. Zu jeder der Proben wurde ein Volumenausschlämmungspuffer (bei Raumtemperatur) zugegeben. Die Proben wurden mit 10 ml LSM (Lymphozyten-Trennungsmischung)-Ficoll-Lösung unterschichtet und für 25 Minuten bei 1.800 U/Min. zentrifugiert. Die obere Schicht von rötlichem Material wurde entfernt und die LSM-Schicht in ein neues Röhrchen (6 Röhrchen pro Spender) gegeben. Die meisten der PBMC's wurden auf der Oberseite der LSM-Schicht festgestellt. Zu jedem Röhrchen wurde Ausschlämmungspuffer (50 ml) zugegeben und die Mischung für 8 Minuten bei 1.800 U/Min. zentrifugiert. Der Überstand wurde abgesaugt und die PBMC's erneut in 15 ml Ausschlämmungspuffer suspendiert. Die Mischung wurde in zwei neue konische 50 ml-Röhrchen gegeben (50 ml Gesamtvolumen pro Röhrchen) und für 8 Minuten bei 1.000 U/Min. zentrifugiert. Der Überstand wurde abgesaugt und dieser Prozess zwei weitere Male wiederholt.
  • Es wurden in Kolben, die RPMI 1640 mit 2% FBS enthielten, PBMC's bei 37°C mit 5% CO2 für eine Stunde inkubiert. Die Kolber wurden alle 20 Minuten einmal geschüttelt. Die Kolben wurden mit Medium (zweimal) leicht gewaschen, um T-Zellen und B-Zellen zu entfernen. Sodann wurden die Kolben gründlich mit RPMI 1640 plus 10% FBS und 1% Penicillin/Strepthomycin gewaschen, um Monozyten zu erhalten. Die PBMC's wurden zwei in RPMI 1640 mit 10% FBS und 1% Penicillin/Strepthomycin gewaschen. Sodann wurden die PBMC'c erneut auf 5 × 106 Zellen/ml suspendiert und in Kolben gegeben. Die PBMC's wurden bei 37°C mit 5% CO2 ohne Stimulation für 4 Tage inkubiert. In Parallelexperimenten wurden PBMC's mit GM-CSF (15 ng/ml) und IL-4 (75 ng/ml) für vier Tage inkubiert, oder die PBMC's wurden mit PHA (1 μg/ml) für vier Tage inkubiert. Die Kolben wurden gründlich mit RPMI 1640 gewaschen, um die Monozyten zu entfernen. Die PBMC's wurden zweimal in RPMI 1640 gewaschen und mithilfe der Durchflusszytometrie entsprechend der vorstehenden Beschreibung auf verschiedene Zelllinien wie vorstehend untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass die BSL3-Polypeptidmengen auf GM-CSF IL 4 oder PHA-stimulierten Zellen zunahmen (9E und 9F). Diese Zunahme wurde nicht bei nichtstimulierten Zellen beobachtet (9E und 9F).
  • COSTIMULATION VON T-ZELLEN DES PERIPHEREN BLUTS
  • Es wurden 96er Mikrotiterplatten (Becton Dickinson Cat. # 353072) mit den angegebenen Mengen von Anti-CD3 MAb G19.4 (wie bereits beschrieben) in PBS (GibcoBRL Cat. # 14190-144) beschichtet. Die Platten wurden für 16 Stunden bei 4°C inkubiert. Die Platten wurden zweimal in PBS gewaschen. Die folgenden Proteine wurden zugegeben: BSL2-4616811-Ig (20 μg/ml), BSL3-Ig (15 μg/ml) oder Chi L6 (10 μg/ml) in PBS. Chi L6 ist ein Proteinfragment, das den Fc-Abschnitt von Human-IgG aufweist und identisch mit dem Fc-Abschnitt ist, der in den BSL-Fusionsproteinen verwendet wurde, wie vorstehend beschrieben wurde. Es wurden unterschiedliche Konzentrationen von Protein verwendet, um die äquivalente Molarität zu ergeben. Die Platten wurden für 4 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Platten wurden zweimal in PBS gewaschen. Entsprechend der vorstehenden Beschreibung wurden T-Zellen des peripheren Bluts gereinigt. Es wurden Zellen (5 × 104 Zellen pro Mulde) in RPMI mit 10% Humanserum (Sigma Cat. # H-4522) und 1% Penicillin/Streptomycin zugegeben. Es wurden Zellen bei 37°C und 5% CO2 für 72 Stunden inkubiert. Während der letzten 8 Stunden wurden Zellen mit zusätzlichen 50 μl Medium inkubiert, das 50 μCi/ml 3H-Thymidin enthielt (NEN Cat. # NET-027). Die Zellen wurden auf einem Brandel-Zellernter geerntet (Brande], Gaithersburg, MD), indem Packard GF/C-Platten verwendet wurden (Packard, Meriden, CT; Cat. # 6005174), wonach die Platten über Nacht luftgetrocknet wurden. Danach wurden 50 μl Mikroscint 20 (Packard Cat. # 6013621) zugegeben und die Radiomarkierung auf einem Packard Topcount NXT gezählt.
  • BLOCKADE DER COSTIMULATION VON T-ZELLEN DES PERIPHEREN BLUTS UNTER VERWENDUNG VON BSL2- UND BSL3-MONOKLONALEN ANTIKÖRPERN
  • Es wurden 96er Mikrotiterplatten (Becton Dickinson Cat. # 353072) mit 20 μg/ml CD3 MAb G19.4 (bereits beschrieben) in PBS (GibcoBRL Cat. # 14190-144) beschichtet. Die Platten wurden über Nacht für 16 Stunden bei 4°C inkubiert. Die Platten wurden zweimal in PBS gewaschen. Die folgenden Proteine wurden zugegeben: BSL2-4616811-Ig (20 μg/ml), BSL3-Ig (15 μg/ml) oder (10 μg/ml) L6-Ig in PBS. Es wurden unterschiedliche Konzentrationen von Protein verwendet, um die äquivalente Molarität zu liefern. Es wurden Platten für 4 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Platten wurden zweimal in PBS gewaschen und die T-Zellen des peripheren Blutes entsprechend der vorstehenden Beschreibung gereinigt. Es wurden Zellen (5 × 104 Zellen pro Mulde) in RPMI mit 10% Humanserum (Sigma Cat. # H-4522) und 1% GibcoBRL Penicillin/Streptomycin zugegeben. Es wurden gereinigte BSL2- oder BSL3-MAbs oder MAbs vom Kontrolltyp bis zu einer Endkonzentration von 20 μg/ml zugegeben. Um die Costimulation zu assayieren wurden MAbs weggelassen. Die Platten wurden für 72 Stunden bei 37°C und 5% CO2 inkubiert. Während der letzten acht Stunden wurden die Zellen in einem zusätzlichen Medium von 50 μl mit 50 μCi/ml 3H-Thymidin (NEN Cat. # NET-027) inkubiert. Die Zellen wurden auf einem Brandel Zellernter unter Verwendung von Packard GF/C-Platten (Cat. # 6005174) geerntet und die Platten über Nacht luftgetrocknet. Anschließend wurden 50 μl Mikroscint 20 (Packard Cat. # 6013621) zugegeben und die Radiomarkierung auf einem Packard Topcount NXT gezählt.
  • Die Ergebnisse zeigten, dass BSL2-4616811-Ig- und BSL3-Ig-Fusionsproteine als costimulatorische Moleküle für T-Zellen des peripheren Bluts, inkubiert mit CD-3 MAb G19.4 (10A bis 10F) wirkten. Dieses wurde mit drei separaten Spender von T-Zellen peripheren Bluts bestätigt: Spender 010 (10A); Spender 127 (10B); Spender 078 (10C und 10D) und Spender 124 (10E und 10F). Die Ergebnisse zeigten ferner, dass BSL2- und BSL3-MAbs die costimulatorische Wirkung der BSL2-4616811-Ig- und BSL3-Ig-Fusionsproteine jeweils blockierten (10G bis 10J). Dieses wurde mit zwei separaten Spender von T-Zellen des peripheren Bluts bestätigt: Spender 010 (10G und 10H) und Spender 127 (10I-10J). SEQUENZLISTE
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Claims (25)

  1. Nucleinsäuremolekül oder Nucleotidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a) einem Nucleinsäuremolekül, das ein Polypeptid codiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 11 oder 13 umfasst; (b) einem Nucleinsäuremolekül, das die Aminosäuren 1 bis 465 von SEQ ID NO: 7 codiert; (c) einem Nucleinsäuremolekül, das ein Polypeptid codiert, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens zu 99% identisch ist zu SEQ ID NO: 11; (d) einem Nucleinsäuremolekül, das ein Polypeptid codiert, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens zu 99,5% identisch ist zu SEQ ID NO: 13; (e) einer Nucleotidsequenz, die Polynucleotide umfasst, die die Aminosäuren 1 bis 698 von SEQ ID NO: 9 codieren; (f) einer Nucleotidsequenz, die Polynucleotide umfasst, die die Aminosäuren 2 bis 698 von SEQ ID NO: 9 codieren; (g) einer Nucleotidsequenz, die Polynucleotide umfasst, die die Aminosäuren 69 bis 698 von SEQ ID NO: 9 codieren; (h) einer Nucleotidsequenz, die die Nucleotide 1 bis 2094 von SEQ ID NO: 8 umfasst; (i) einer Nucleotidsequenz, die die Nucleotide 4 bis 2094 von SEQ ID NO: 8 umfasst; (j) einer Nucleotidsequenz, die die Nucleotide 205 bis 2094 von SEQ ID NO: 8 umfasst; (k) einem Nucleinsäuremolekül, das die Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 6, 10 oder 12 umfasst; (l) einer Nucleotidsequenz, die ein Polypeptid codiert, das die Aminosäuresequenz umfasst, die durch die DNA codiert wird, die in PTA-1987, in PTA-1988 oder PTA-1993 enthalten ist; (m) einem Nucleinsäuremolekül, das komplementär zu der Sequenz des Nucleinsäuremoleküls nach einem der Punkte (a) bis (k) ist; und (n) einer Nucleotidsequenz, die eine extrazelluläre Domäne einer Aminosäuresequenz codiert, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 7, 11 und 13, und einer Nucleotidsequenz, die eine Fc-Domäne des Immunglobulins G codiert.
  2. Vektor, der das Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1 umfasst.
  3. Wirtszelle, die den Vektor nach Anspruch 2 umfasst, wobei die Wirtszelle ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Bakterien-, Hefe-, Insekten-, Säuger- und Pflanzenzellen.
  4. Polypeptid, codiert durch das Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1.
  5. Antikörper, der an das Polypeptid nach Anspruch 4 bindet.
  6. Antikörper nach Anspruch 5, der monoclonal ist.
  7. Hybridomzelle, die den Antikörper nach Anspruch 6 produziert.
  8. Arzneimittel, umfassend das Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1, die Wirtszelle nach Anspruch 3, das Polypeptid nach Anspruch 4, den Antikörper nach Anspruch 5 und einen physiologisch verträglichen Träger, Excipienten oder Verdünnungsmittel.
  9. Verfahren zum Identifizieren eines Liganden, der ein B7-verwandtes Polypeptid nach Anspruch 4 bindet, umfassend: (a) Bereitstellen eines festen Trägers mit einem daran haftenden B7-verwandten Polypeptid; (b) Inkontaktbringen des Trägers mit aus einer biologischen Probe erhaltenen Polypeptiden und Inkubieren des Trägers unter Bedingungen, die einem oder mehreren Polypeptiden aus der Probe ermöglichen, mit dem B7-verwandten Polypeptid zu assoziieren; und (c) Bestimmen, ob das B7-verwandte Polypeptid mit einem oder mehreren Polypeptiden der Probe assoziiert, und dabei Identifizieren eines Ligaeden, der an das B7-verwandte Polypeptid bindet.
  10. Verfahren zum Identifizieren einer Testsubstanz, die an ein B7-verwandtes Polypeptid nach Anspruch 4 bindet, umfassend: (a) Bereitstellen eines festen Trägers mit einem daran haftenden B7-verwandten Polypeptid; (b) Inkontaktbringen des Trägers mit Testsubstanzen und Inkubieren des Trägers unter Bedingungen, die einer oder mehreren Testsubstanzen) ermöglichen, mit dem B7-verwandten Polypeptid zu assoziieren; und (c) Bestimmen, ob das B7-verwandte Polypeptid mit einer oder mehreren Testsubstanz(en) assoziiert, wodurch eine Testsubstanz identifiziert wird, die an das B7-verwandte Polypeptid bindet.
  11. Verwendung des Nucleinsäuremoleküls nach Anspruch 1, der Wirtszelle nach Anspruch 3, des Polypeptids nach Anspruch 4 oder des Antikörpers nach Anspruch 5 für die Herstellung eines Arzneimittels zur Steigerung oder Verminderung der T-Zell-Aktivität in einem Individuum, umfassend: Verabreichen des Arzneimittels an das Individuum in einer Menge, die wirksam ist, die Immunzellaktivität zu verringern.
  12. In vitro-Verfahren zur Diagnose eines Zustandes, der mit erhöhter Immunzellaktivität assoziiert ist, umfassend: (a) Inkontaktbringen einer isolierten Nucleinsäure nach Anspruch 1 mit einer biologischen Probe unter hoch stringenten Bedingungen, die der Nucleinsäure erlauben, an eine Nucleinsäure in der Probe zu hybridisieren und dabei einen Komplex zu bilden; (b) Messen des Hybridisierungskomplexes von (a); und (c) Vergleichen der Menge an Hybridisierungskomplex von (a) mit einer Menge an Hybridisierungskomplex in einer biologischen Standardprobe, wobei ein Anstieg gegenüber der Standardmenge die Diagnose des Zustandes anzeigt.
  13. In vitro-Verfahren zur Diagnose eines Zustandes, der mit angestiegener Immunzellaktivität assoziiert ist, umfassend: (a) Inkontaktbringen des isolierten Antikörpers nach Anspruch 5 mit einer biologischen Probe unter Bedingungen, die es dem Antikörper ermöglichen, an eine Aminosäuresequenz in der Probe zu binden und dadurch einen Komplex zu bilden; und (b) Nachweis des Komplexes von (a); und (c) Vergleichen der Menge des Komplexes von (a) mit einer Menge an Komplex in einer biologischen Standardprobe, wobei ein Anstieg gegenüber der Standardmenge die Diagnose des Zustandes anzeigt.
  14. Verwendung nach Anspruch 11, wobei die Person mit einer viralen Infektion diagnostiziert wird.
  15. Verwendung nach Anspruch 14, wobei die virale Infektion ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer Infektion mit menschlichem Immunschwächevirus, menschlichem Papillomavirus, Herpes-Simplex-Virus, menschlichem Encephalitisvirus, menschlichem Rhinovirus und menschlichem Influenzavirus.
  16. Verwendung nach Anspruch 11, wobei die Person mit Krebs diagnostiziert wird.
  17. Verwendung nach Anspruch 11 oder Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, wobei das Individuum diagnostiziert wird mit oder der Zustand ein Zustand ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Gewebeabstoßung, Knochenmarksabstoßung, Organtransplantatabstoßung und Transplantat-Wirt-Reaktion.
  18. Verwendung nach Anspruch 11 oder Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, wobei das Individuum diagnostiziert wird mit oder der Zustand ein Zustand ist, der mit Entzündung assoziiert ist.
  19. Verwendung oder Verfahren nach Anspruch 18, wobei der Zustand ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Psoriasis, chronisch-obstruktiver Lungenerkrankung, Asthma und Atherosklerose.
  20. Verwendung nach Anspruch 11 oder Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, wobei das Individuum diagnostiziert wird mit oder der Zustand eine Autoimmunerkrankung ist.
  21. Verwendung oder Verfahren nach Anspruch 20, wobei die Autoimmunerkrankung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus rheumatoider Arthritis, multipler Sklerose, Lupus erythematodes, Hashimoto's Thyroiditis, primärem Myxödem, Morbus Basedow, perniziöser Anämie, autoimmuner atrophischer Gastritis, Insulin-abhängigem Diabetes mellitus, Goodpasture-Syndrom, Myasthenia gravis, Pemphigus, Morbus Crohn, sympathischer Opthalmie, autoimmuner Uveitis, autoimmuner hämolytischer Anämie, idiopathischer Thrombocytopenie, primärer biliärer Zirrhose, Colitis ulcerosa, Sjogren's-Syndrom, Polymyositis und gemischter Bindegewebserkrankung.
  22. Kit zum Nachweis eines B7-verwandten Nucleinsäuremoleküls, umfassend: (a) das isolierte Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1; und (b) mindestens eine Komponente, um die Bindung des isolierten Nucleinsäuremoleküls an ein B7-verwandtes Nucleinsäuremolekül nachzuweisen.
  23. Kit zum Nachweis eines B7-verwandten Polypeptids, umfassend: (a) den isolierten Antikörper nach Anspruch 5; und (b) mindestens eine Komponente, um die Bindung des isolierten Antikörpers an eine B7-verwandte Polypeptidsequenz nachzuweisen.
  24. Transgene Maus, umfassend das Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1.
  25. Zelllinie, umfassend das Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1.
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