CN117138060A - 抗体-药物缀合物的新辅助剂用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于抗体‑药物缀合物(ADC)在癌症疗法中的新辅助剂用途的改进的方法和组合物，优选包含蒽环或喜树碱、更优选包含SN‑38或前‑2‑吡咯啉并多柔比星(P2PDox)的ADC。在用标准抗癌疗法例如手术、放射疗法、化学疗法或免疫疗法治疗之前，将ADC作为新辅助剂施用。ADC的新辅助剂用途显著提高标准抗癌疗法的功效，并且可以减小原发性肿瘤体积或消除微转移。在最优选的实施方案中，新辅助剂ADC与标准抗癌疗法组合成功治疗对标准治疗有抗性的癌症，例如三阴性乳腺癌(TNBC)。

Description

抗体-药物缀合物的新辅助剂用途
本申请是申请日为2015年10月5日，申请号为201580064509.5,发明名称为“抗体-药物缀合物的新辅助剂用途”的专利申请的分案申请。
相关申请
本申请依据35U.S.C.119(e)要求于2014年10月7日提交的临时美国专利申请序列号62/060,858的权益，其全部内容通过引用并入本文。
序列表
本申请含有已经经由EFS-Web以ASCII格式提交并且全部内容据此通过引用并入的序列表。在2015年9月23日创建的所述ASCII副本命名为IMM350WO1_SL.txt，且大小为23,226字节。
发明领域
本发明涉及免疫缀合物在新辅助剂疗法中的用途。优选地，免疫缀合物包含抗体部分和选自喜树碱或蒽环组的药物的药物部分。更优选地，抗体部分结合至肿瘤相关抗原(TAA)。最优选地，喜树碱是SN-38或蒽环是2-吡咯啉并多柔比星的前药形式(在本文中称为P2PDox)。抗体和药物部分可以经由增加治疗功效的细胞内可裂解的键连接。优选地，如下文所述，连接抗体部分与药物部分的接头是CL2A。在具体实施方案中，免疫缀合物可以以提供最佳功效和最小毒性的特定剂量和/或施用时间表施用，允许有效治疗对标准抗癌疗法有抗性的癌症，例如三阴性乳腺癌(TNBC)、转移性结肠癌、转移性非小细胞肺癌(NSCLC)、转移性胰腺癌、转移性肾细胞癌、转移性胃癌、转移性前列腺癌或转移性小细胞肺癌。优选的实施方案涉及TNBC中的新辅助剂用途。新辅助剂免疫缀合物在标准抗癌疗法(例如手术、放射疗法、化学疗法或免疫疗法)之前施用。
发明背景
在用主要疗法(例如，手术或放射疗法)治疗之前，将新辅助剂施用给患者(参见，例如维基百科-新辅助剂治疗)。新辅助剂癌症疗法的目的是在主要疗法之前减少患者肿瘤的大小或程度，优选地改善成功结果的可能性和/或减少在不存在新辅助剂疗法时需要的更广泛治疗的副作用(同上)。新辅助剂治疗也可以靶向可能不受主要疗法影响的微转移(同上)。最近，新辅助剂疗法已经作为一种更快地测试新型化学疗法的手段来发挥作用，因为对新辅助剂疗法的响应可以在相对少数的患者中快速评估，并且可以预测更长期的结果(Rastagi等，2008，J Clin Oncol 26:778-85；Bardia&Baselga，2013，Clin Cancer Res19:6360-70)。实际上，来自新辅助剂研究的证据表明，即使在两个新辅助剂化学疗法周期后，在手术时确定病理学完全响应(pCR)(即，乳腺和腋窝中没有残留疾病)预测长期临床响应(Rastagi等，2008，J Clin Oncol 26:778-85；von Mickwitz等，2012，J Clin Oncol 30:1796-1804；Huober等，2010，Breast Cancer Res Treat 124:133-40)。
癌症中新辅助剂治疗史是广泛的。该领域中的许多早期工作涉及在手术切除或放射疗法之前采用新辅助剂化学疗法。Ervin等(1984，Arch Otolaryngol 110:241-5)报道了在手术加放射疗法或单独的高剂量放射疗法之前利用顺铂、博莱霉素和甲氨蝶呤的晚期头颈癌的新辅助剂化学疗法。尽管看到了一些成果的改善，特别是当新辅助剂疗法导致实质性肿瘤减少时，但疾病的复发是常见的(Ervin等，1984)。在骨原性肉瘤(Rosen&Nirenberg，1985，Prog Clin Biol Res 201:39-51)、乳腺癌(Ragaz等，1985，Prog Clin Biol Res201:77-87)、食管癌(Kelsen等，1986，Semin Surg Oncol 2:170-6)、肛门和直肠癌(Smith等，1986，Am J Surg 151:577-80)、肺癌(Cox等，1986，Cancer Treat Rep70:1219-20)和许多其它形式的癌症中也报道了新辅助剂化学疗法和/或放射疗法。虽然利用新辅助剂疗法改善的成果常有报道，但新辅助剂化学疗法和/或放射疗法在癌症中改善长期患者存活的程度一般尚未经前瞻性研究得以证实(参见，例如Bittoni等，2014，Gastroenterol ResPract 2014:183852；Doval等，2013，J Indian Med Assoc111:629-31)。
最近，已经尝试抗体或抗体-药物缀合物(ADC)在乳腺癌中的新辅助剂应用。在HER2阳性转移性乳腺癌的新辅助剂治疗中，已经对帕妥珠单抗(抗HER2)进行了研究并且与曲妥珠单抗和多西他赛组合获得FDA批准(Sabatier和Goncalves，2014，Bull Cancer 101:765-71；Esserman&DeMichele，Clin Cancer Res 20:3632-36)。包含缀合至强效微管抑制剂安坦辛的抗HER2抗体的Ado-曲妥珠单抗安坦辛(T-DM1)已被批准用于HER2阳性转移性乳腺癌用于先前疗法失败且正针对新辅助剂用途经历研究的患者(Corrigan等，2014，AnnPharmacother[印刷前的电子版(Epub ahead of print)，2014年7月31日])。
尽管这些结果是有前景的，但是抗HER2抗体在例如缺乏雌激素受体、孕酮受体和HER2的表达的三阴性乳腺癌(TNBC)中几乎没有用(例如，Gogia等，2014，Indian J Cancer51:163-6)。TNBC占乳腺癌的约10％至20％，并且比这种疾病的其它形式更具攻击性和致死性，对于几乎所有患转移性TNBC的女性而言，即便进行了全身疗法，最终仍死于该疾病。本领域需要更有效形式的基于免疫缀合物的新辅助剂癌症疗法，特别是对于对标准抗癌治疗有抗性的癌症形式(例如TNBC)。
发明概述
本发明使用药物的抗体缀合物，例如喜树碱(例如，SN-38)或蒽环(例如，P2PDOX)，与超毒性化学治疗剂(例如，加利车霉素、美登木素生物碱或MMAE)的亚纳摩尔至皮摩尔毒性相比，所述抗体缀合物在体外具有纳摩尔毒性。非超毒性药物的使用允许使用不需要细胞内化以释放游离药物而是允许药物的一些细胞外释放的抗体-药物接头。就下文描述的CL2A接头而言，50％的缀合药物在24小时内释放，从而通过在细胞外和细胞内两者释放药物来提高药物的生物利用度。此外，使用相对无毒的药物允许施用更高剂量的ADC，得到更好的治疗效果。
本发明通过提供用于制备和施用ADC(例如喜树碱抗体或蒽环-抗体免疫缀合物)的新辅助剂方法和组合物，解决了本领域尚未满足的需要。优选地，喜树碱是SN-38或蒽环是P2PDOX。所公开的方法和组合物用于对其它形式的疗法而言难治或较少响应的癌症的新辅助剂治疗。难治性癌症可以包括但不限于三阴性乳腺癌、转移性结肠癌、转移性非小细胞肺癌(NSCLC)、转移性胰腺癌、转移性肾细胞癌、转移性胃癌、转移性前列腺癌或转移性小细胞肺癌。
抗体可以是各种同种型，优选人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4，更优选包含人IgG1铰链和恒定区序列。抗体或其片段可以是嵌合抗体、人源化抗体或全人抗体或其抗原结合片段，例如van der Neut Kolfschoten等(Science 2007；317:1554-1557)所述的半IgG4抗体或市售的单结构域抗体(例如，纳米抗体)(例如，Ghent,Belgium)。更优选地，抗体或其片段可以被设计或选择为包含属于特定同种异型的人恒定区序列，当将免疫缀合物施用于人受试者时，其可导致降低的免疫原性。用于施用的优选同种异型包括非G1m1同种异型(nG1m1)，例如G1m3、G1m3,1、G1m3,2或G1m3,1,2。更优选地，同种异型选自由以下组成的组：nG1m1、G1m3、nG1m1,2和Km3同种异型。
对于癌症的新辅助剂治疗而言，许多由肿瘤细胞表达或以其它方式与肿瘤细胞相关的抗原在本领域中是已知的，包括但不限于碳酸酐酶IX、α-甲胎蛋白(AFP)、α-辅肌动蛋白-4、A3、对A33抗体具有特异性的抗原、ART-4、B7、Ba 733、BAGE、BrE3-抗原、CA125、CAMEL、CAP-1、CASP-8/m、CCL19、CCL21、CD1、CD1a、CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD11A、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD29、CD30、CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD46、CD52、CD54、CD55、CD59、CD64、CD66a-e、CD67、CD70、CD70L、CD74、CD79a、CD80、CD83、CD95、CD126、CD132、CD133、CD138、CD147、CD154、CDC27、CDK-4/m、CDKN2A、CTLA-4、CXCR4、CXCR7、CXCL12、HIF-1α、结肠特异性抗原-p(CSAp)、CEACAM5、CEACAM6、c-Met、DAM、EGFR、EGFRvIII、EGP-1(TROP-2)、EGP-2、ELF2-M、Ep-CAM、成纤维细胞生长因子(FGF)、Flt-1、Flt-3、叶酸受体、G250抗原、GAGE、gp100、GRO-β、HLA-DR、HM1.24、人绒毛膜促性腺激素(HCG)及其亚基、HER2/neu、组蛋白H2B、组蛋白H3、组蛋白H4、HMGB-1、缺氧诱导因子(HIF-1)、HSP70-2M、HST-2、Ia、IGF-1R、IFN-γ、IFN-α、IFN-β、IFN-λ、IL-4R、IL-6R、IL-13R、IL-15R、IL-17R、IL-18R、IL-2、IL-6、IL-8、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-23、IL-25、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、KC4-抗原、KS-1-抗原、KS1-4、Le-Y、LDR/FUT、巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)、MAGE、MAGE-3、MART-1、MART-2、NY-ESO-1、TRAG-3、mCRP、MCP-1、MIP-1A、MIP-1B、MIF、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5ac、MUC13、MUC16、MUM-1/2、MUM-3、NCA66、NCA95、NCA90、PAM4抗原、胰腺癌粘液素、PD-1、PD-L1、PD-1受体、胎盘生长因子、p53、PLAGL2、前列腺酸性磷酸酶、PSA、PRAME、PSMA、P1GF、ILGF、ILGF-1R、IL-6、IL-25、RS5、RANTES、T101、SAGE、S100、存活蛋白、存活蛋白-2B、TAC、TAG-72、腱生蛋白、TRAIL受体、TNF-α、Tn抗原、汤姆森-弗里德里希抗原(Thomson-Friedenreich antigens)、肿瘤坏死抗原、VEGFR、ED-B纤连蛋白、WT-1、17-1A-抗原、补体因子C3、C3a、C3b、C5a、C5、血管生成标志物、bcl-2、bcl-6、Kras、原癌基因标志物和原癌基因产物(参见例如，Sensi等，Clin Cancer Res2006,12：5023-32；Parmiani等，JImmunol2007,178:1975-79；Novellino等，Cancer Immunol Immunother 2005,54:187-207)。优选地，抗体结合AFP、CEACAM5、CEACAM6、CSAp、EGP-1(TROP-2)、AFP、MUC5ac、PAM4抗原、CD74、CD19、CD20、CD22或HLA-DR。
可以利用的示例性抗体包括但不限于hR1(抗IGF-1R，2010年3月12日提交的美国专利申请序列号12/722,645)、hPAM4(抗MUC5ac，美国专利No.7,282,567)、hA20(抗CD20，美国专利No.7,151,164)、hA19(抗CD19，美国专利No.7,109,304)、hIMMU31(抗AFP，美国专利No.7,300,655)、hLL1(抗CD74，美国专利No.7,312,318)、hLL2(抗CD22，美国专利No.5,789,554)、hRFB4(抗CD22，2014年2月25日提交的美国临时专利申请序列号61/944,295)、hMu-9(抗CSAp，美国专利No.7,387,772)、hL243(抗HLA-DR，美国专利No.7,612,180)、hMN-14(抗CEACAM5，美国专利No.6,676,924)、hMN-15(抗CEACAM6，美国专利No.8,287,865)、hRS7(抗TROP-2，美国专利No.7,238,785)、hMN-3(抗CEACAM6，美国专利No.7,541,440)、Ab124和Ab125(抗CXCR4，美国专利No.7,138,496)，每个引用的专利或申请的实施例部分通过引用并入本文。更优选地，所述抗体是IMMU-31(抗AFP)、hRS7(抗TROP-2)、hMN-14(抗CEACAM5)、hMN-3(抗CEACAM6)、hMN-15(抗CEACAM6)、hLL1(抗CD74)、hLL2(抗CD22)、hL243或IMMU-114(抗HLA-DR)、hA19(抗CD19)或hA20(抗CD20)。本文所用术语依帕珠单抗和hLL2可互换，术语维妥珠单抗与hA20、以及hL243g4P、hL243γ4P和IMMU-114亦如此。
可选择使用的抗体包括但不限于阿昔单抗(抗糖蛋白IIb/IIIa)、阿仑单抗(alemtuzumab)(抗CD52)、贝伐单抗(抗VEGF)、西妥昔单抗(抗EGFR)、吉妥单抗(抗CD33)、替伊莫单抗(ibritumomab)(抗CD20)、帕尼单抗(抗EGFR)、利妥昔单抗(抗CD20)、托西莫单抗(抗CD20)、曲妥珠单抗(抗ErbB2)、兰布罗单抗(lambrolizumab)(抗PD-1受体)、纳武单抗(nivolumab)(抗PD-1受体)、伊匹单抗(ipilimumab)(抗CTLA-4)、阿巴伏单抗(abagovomab)(抗CA-125)、阿德木单抗(抗EpCAM)、托西珠单抗(atlizumab)(抗IL-6受体)、贝那珠单抗(benralizumab)(抗CD125)、阿托珠单抗(obinutuzumab)(GA101，抗CD20)、CC49(抗TAG-72)、AB-PG1-XG1-026(抗PSMA，美国专利申请11/983,372，保藏为ATCC PTA-4405和PTA-4406)、D2/B(抗PSMA，WO2009/130575)、托珠单抗(抗IL-6受体)、巴利昔单抗(抗CD25)、达利珠单抗(抗CD25)、依法珠单抗(抗CD11a)、GA101(抗CD20；Glycart Roche)、莫罗单抗-CD3(抗CD3受体)、那他珠单抗(抗α4整联蛋白)、奥马珠单抗(抗IgE)；抗TNF-α抗体例如CDP571(Ofei等，2011，Diabetes 45：881-85)、MTNFAI、M2TNFAI、M3TNFAI、M3TNFABI、M302B、M303(Thermo Scientific，Rockford，IL)、英夫利昔单抗(infliximab)(Centocor，Malvern，PA)、赛妥珠单抗(UCB，Brussels，Belgium)、抗CD40L(UCB，Brussels，Belgium)、阿达木单抗(Abbott，Abbott Park，IL)和贝利木单抗(belimumab)(Human Genome Sciences)。最近，已经公开了(美国专利申请序列号14/180,646)所公开的方法和组合物中可以使用的针对人组蛋白H2B、H3和H4的人源化抗体。
优选地，抗体部分连接至少一个药物部分，更优选1至约5个药物部分，或约6至12个药物部分。在多种实施方案中，抗体部分可以连接至4或6个药物部分，或5个或更少的药物部分。每个抗体部分的药物部分的数目可以是1、2、3、4、5、6、7或更多。
示例性喜树碱是CPT-11。可获得关于CPT-11的药理学及其在体内转化为活性SN-38的广泛的临床数据(Iyer和Ratain，Cancer Chemother Pharmacol.42:S31-43(1998)；Mathijssen等，Clin Cancer Res.7:2182-2194(2002)；Rivory，Ann NY Acad Sci.922:205-215,2000))。活性形式SN-38比CPT-11有效约2至3个数量级。在具体的优选实施方案中，免疫缀合物可以是hMN-14-SN-38、hMN-3-SN-38、hMN-15-SN-38、hIMMU-31-SN-38、hRS7-SN-38、hR1-SN-38、hA20-SN-38、hPAM4-SN-38、hL243-SN-38、hLL1-SN-38、hRFB4-SN-38、hMu-9-SN-38或hLL2-SN-38缀合物。更优选地，使用CL2A接头将SN-38与抗体部分缀合。
示例性的蒽环是2-吡咯啉并多柔比星(P2PDox)的前药形式，例如美国专利申请序列号14/175,089中公开的N-(4,4-二乙酰氧基丁基)多柔比星。出乎意料地，由于与抗体肽链的交联形成，发现P2PDox与缀合的抗体紧密结合。交联有助于将由循环中游离药物的释放引起的毒性(例如心脏毒性)降至最低。优选地，P2PDox连接至链间二硫化物硫醇基团，同时处于前药形式。前药保护在注射后不久在体内快速除去，并且所得缀合物的2-PDox部分交联抗体的肽链，在抗体分子内形成分子内交联。这既稳定ADC，又防止与循环中的其它分子交联。在具体的优选实施方案中，免疫缀合物可以是hMN-14-P2PDox、hMN-3-P2PDox、hMN-15-P2PDox、hIMMU-31-P2PDox、hRS7-P2PDox、hR1-P2PDox、hA20-P2PDox、hPAM4-P2PDox、hL243-P2PDox、hLL1-P2PDox、hRFB4-P2PDox、hMu-9-P2PDox或hLL2-P2PDox缀合物。
多种实施方案可以涉及本发明方法和组合物在治疗癌症中的用途，所述癌症包括但不限于非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphomas)、B细胞急性和慢性淋巴样白血病、伯基特淋巴瘤(Burkitt lymphoma)、霍奇金氏淋巴瘤、急性大B细胞淋巴瘤、毛细胞白血病、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、急性淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、T细胞淋巴瘤和白血病、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(Waldenstrom'smacroglobulinemia)、癌、黑素瘤、肉瘤、神经胶质瘤、骨癌和皮肤癌。癌可包括口腔癌、食道癌、胃肠道癌、肺道癌、肺癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、子宫癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、尿膀胱癌、胰腺癌、骨癌、脑癌、结缔组织癌、肝癌、胆囊癌、尿膀胱癌、肾癌、皮肤癌、中枢神经系统癌和睾丸癌。
在某些实施方案中，药物缀合物可在用手术、放射疗法、化学疗法、使用裸抗体的免疫疗法、放射免疫疗法、免疫调节剂等治疗之前用作新辅助剂。这些新辅助剂疗法可以允许给予较低剂量的每种治疗剂，从而减少某些严重的副作用，或改善其它治疗(例如，手术)的功效。
免疫缀合物的优选最佳剂量可以包括3mg/kg和18mg/kg之间的剂量，优选每周一次、每周两次、每隔一周或每三周给药。最佳给药方案可以包括如下治疗周期：连续两周的治疗接着一周、两周、三周或四周的休息或治疗和休息周交替；或者一周的治疗接着两周、三周或四周的休息；或者三周的治疗接着一周、二周、三周或四周的休息；或者四周的治疗接着一周、二周、三周或四周的休息；或者五周的治疗接着一周、二周、三周、四周或五周的休息；或者每两周施用一次、每三周施用一次或每月施用一次。治疗可以延长任何周期数，优选至少2、至少4、至少6、至少8、至少10、至少12、至少14或至少16个周期。剂量可以高达24mg/kg。示例性使用剂量可包括1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg、10mg/kg、11mg/kg、12mg/kg、13mg/kg、14mg/kg、15mg/kg、16mg/kg、17mg/kg、18mg/kg、19mg/kg、20mg/kg、22mg/kg和24mg/kg。优选的剂量是4、6、8、9、10、12、14、16或18mg/kg。本领域普通技术人员将认识到，在选择免疫缀合物的最佳剂量时，可考虑多种因素，例如年龄、一般健康状况、特定器官功能或体重以及先前治疗对特定器官系统(例如，骨髓)的影响，并且在治疗过程中可以增加或减少施用的剂量和/或频率。剂量可以根据需要重复，在少至4至8次给药后观察到肿瘤收缩的迹象。本文公开的新辅助剂用途的优化施用剂量和方案在人受试者中示出出乎意料的优异功效和降低的毒性，其不能从动物模型研究预测。出乎意料的是，优越的功效允许治疗先前发现对一种或多种标准抗癌疗法具有抗性的肿瘤。
本发明要求保护的组合物和方法的出乎意料的结果是高剂量的抗体-药物缀合物的出乎意料的耐受性，即便是反复输注，也仅观察到较低级的恶心和呕吐毒性或可控的中性粒细胞减少。另一个出乎意料的结果是与将化学治疗药物缀合至白蛋白、PEG或其它载体的其它产物不同，缺乏抗体-药物缀合物的积累。缺乏积累与改善的耐受性和甚至在反复或增加给药后缺乏严重毒性相关。这些出乎意料的结果允许优化剂量和递送时间表，具有意想不到的高功效和低毒性。所要求保护的方法提供患先前抗性癌症的个体中实体瘤的大小为15％或更多、优选20％或更多、优选30％或更多、更优选40％或更多(通过最长直径测量)的收缩。普通技术人员将认识到肿瘤大小可以通过多种不同的技术测量，例如总肿瘤体积、任何尺寸的最大肿瘤大小或几个尺寸的大小测量的组合。这可以使用标准放射学程序，例如计算机断层摄影、超声检查和/或正电子发射断层摄影。测量大小的方法不如用免疫缀合物治疗观察降低肿瘤大小(优选导致肿瘤消除)的趋势重要。
虽然免疫缀合物可以作为定期团注注射施用，但在替代实施方案中，免疫缀合物可以通过抗体-药物缀合物的连续输注施用。为了增加血液中免疫缀合物的Cmax并延长PK，可以例如通过留置导管施用连续输注。此类装置在本领域中是已知的，例如 或/>导管(参见，例如Skolnik等，TherDrug Monit 32：741-48,2010)，并且可以使用任何此类已知的留置导管。各种连续输注泵也是本领域已知的，并且可以使用任何此类已知输注泵。连续输注的剂量范围可以为每天0.1至3.0mg/kg之间。更优选地，这些免疫缀合物可以通过静脉内输注经2至5小时、更优选2-3小时的较短时间段施用。
在特别优选的实施方案中，免疫缀合物和给药方案在对标准疗法有抗性的患者中可以是有效的。例如，可以将hMN-14-SN-38免疫缀合物施用于对使用伊立替康(SN-38的母体试剂)的先前治疗未响应的患者。出乎意料的是，伊立替康抗性患者可以显示出对hMN-14-SN-38的部分或甚至完全响应。免疫缀合物特异性靶向肿瘤组织的能力可以通过治疗剂改善的靶向和增强的递送来克服肿瘤抗性。或者，抗CEACAM5免疫缀合物(例如，hMN-14)可与抗CEACAM6免疫缀合物(例如，hMN-3或hMN-15)共同施用。与替代的标准治疗处理相比，其它抗体-SN-38或抗体-P2PDox免疫缀合物可显示出相似的改善的功效和/或降低的毒性，并且不同免疫缀合物的组合或ADC与缀合至放射性核素、毒素或其它药物的抗体的组合可以提供甚至更加改善的功效和/或降低的毒性。特定的优选受试者可以是转移性结肠癌患者、三阴性乳腺癌患者、HER+、ER+、孕酮+乳腺癌患者、转移性非小细胞肺癌(NSCLC)患者、转移性胰腺癌患者、转移性肾细胞癌患者、转移性胃癌患者、转移性前列腺癌患者或转移性小细胞肺癌患者。
附图简述
图1.示例性抗体-药物缀合物，显示通过细胞内可裂解的CL2A接头与SN-38喜树碱药物缀合的hRS7抗TROP-2抗体。
图2A.多柔比星的结构。“Me”是甲基。
图2B.2-吡咯啉并多柔比星(2-PDox)的结构。“Me”是甲基。
图2C.2-吡咯啉并多柔比星(P2PDox)的前药形式的结构。“Me”是甲基并且“Ac”是乙酰基。
图2D.P2PDox的马来酰亚胺活化形式的结构，用于抗体偶联。“Me”是甲基并且“Ac”是乙酰基。
图3A.IMMU-132在Calu-3人NSCLC异种移植物中的体内功效。
图3B.IMMU-132在COLO205人结肠癌异种移植物中的体内功效。
图3C.IMMU-132在Capan-1人胰腺癌异种移植物中的体内功效。
图3D.IMMU-132在BxPC-3人胰腺癌异种移植物中的体内功效。
图3E.IMMU-132在SK-MES-1人鳞状细胞肺癌异种移植物中的体内功效。
图3F.IMMU-132在NCI-N87人胃癌异种移植物中的体内功效。
图4A.IMMU-132在MDA-MB-468人TNBC异种移植物中的体内功效。
图4B.IMMU-132在MDA-MB-468人TNBC异种移植物中的体内功效。首先用对照(非靶向)ADC处理携带肿瘤的小鼠。在使肿瘤生长之后，从第78天开始给小鼠施用指定剂量的IMMU-132。即使在使肿瘤生长至大尺寸后，IMMU-132也有效地诱导肿瘤消退。
图4C.IMMU-132在MDA-MB-231人TNBC异种移植物中的体内功效。
图5A.招募到IMMU-132-01试验的14名TNBC患者的最佳响应。
图5B.招募到IMMU-132-01试验的14名TNBC患者的进展时间。
图6A.IgG和ADC的IMMU-132峰值血清浓度作为剂量水平的函数。
图6B.当归一化到患者体重时，IgG和ADC的IMMU-132峰值血清浓度作为剂量水平的函数。
图7A.IMMU-132总IgG相对于总IMMU-132的药代动力学。
图7B.IMMU-132总SN-38相对于游离SN-38的药代动力学。
图7C.基于ELISA或血清中SN-38浓度的IMMU-132的清除。
图8A.在NCI-N87人胃癌异种移植物中不同的IMMU-132给药方案。
图8B.在BxPC-3人胰腺癌异种移植物中不同的IMMU-132给药方案。
图9A.暴露于1μM游离SN-38或等量的IMMU-132的NCI-N87人胃癌中IMMU-132介导的凋亡信号传导。
图9B.SK-BR-3和MDA-MB 486乳腺癌细胞中IMMU-132介导的PARP裂解。
图10.在胰腺癌异种移植模型中IMMU-132相对于伊立替康的药物毒理学研究。
图11.TNBC中紫杉醇+/-IMMU-132的新辅助剂治疗方案。
图12.在具有皮下人肿瘤异种移植物的裸鼠中的疗法，使用2.25mg/kg蛋白质剂量(0.064mg/kg药物剂量)的MAb-P2PDox缀合物在具有Capan-1人胰腺癌异种移植物的裸鼠中每周两次×2周(n＝5)。
图13A.多次注射hLL1-P2PDox缀合物的MTD研究。向小鼠静脉内施用每剂量25μg的hLL1-P2PDox(q4dx4)。
图13B.多次注射hLL1-P2PDox缀合物的MTD研究。向小鼠静脉内施用每剂量50μg的hLL1-P2PDox(q4dx4)。
图13C.多次注射hLL1-P2PDox缀合物的MTD研究。向小鼠静脉内施用每剂量100μg的hLL1-P2PDox(q4dx4)。
图13D.多次注射hLL1-P2PDox缀合物的MTD研究。向小鼠静脉内施用每剂量150μg的hLL1-P2PDox(q4dx4)。
图14A.P2PDox缀合物在具有NCI-N87人胃癌异种移植物的裸鼠中的体内功效。向小鼠施用盐水对照。
图14B.P2PDox缀合物在具有NCI-N87人胃癌异种移植物的裸鼠中的体内功效。如箭头所示，向小鼠施用45μg的hA20-P2PDox。
图14C.P2PDox缀合物在具有NCI-N87人胃癌异种移植物的裸鼠中的体内功效。如箭头所示，向小鼠施用45μg的hMN-15-P2PDox。
图14D.P2PDox缀合物在具有NCI-N87人胃癌异种移植物的裸鼠中的体内功效。如箭头所示，向小鼠施用45μg的hRS7-P2PDox。
图14E.P2PDox缀合物在具有NCI-N87人胃癌异种移植物的裸鼠中的体内功效。如箭头所示，向小鼠施用45μg的hLL1-P2PDox。
图14F.P2PDox缀合物在具有NCI-N87人胃癌异种移植物的裸鼠中的体内功效。如箭头所示，向小鼠施用45μg的hMN-14-P2PDox。
图15.hRS7-P2PDox的不同给药时间表对具有NCI-N87人胃癌异种移植物的裸鼠的存活率的影响。
图16.不同单剂量的hRS7-P2PDox对人胃癌异种移植物生长的影响。
图17.不同单剂量的hRS7-P2PDox对携带人胃癌异种移植物的小鼠的存活率的影响。
图18.各种hRS7-ADC相对于hRS7 IgG的ADCC。
发明详述
定义
在下面的描述中，使用了多个术语，并且提供以下定义以便于理解所要求保护的主题。本文中没有明确定义的术语根据其明确和普通的含义使用。
除非另有说明，否则不定冠词(a/an)意指“一个或多个”。
本文中使用的术语约意指值的正或负百分之十(10％)。例如，“约100”是指在90和110之间的任何数。
本文所用的抗体是指全长(即，天然存在的或通过正常免疫球蛋白基因片段重组过程形成的)免疫球蛋白分子(例如，IgG抗体)或免疫球蛋白分子的抗原结合部分，例如抗体片段。抗体或抗体片段可以在所要求保护的主题的范围内缀合或以其它方式衍生化。此类抗体包括但不限于IgG1、IgG2、IgG3、IgG4(和IgG4亚型)以及IgA同种型。
抗体片段是抗体的一部分，例如F(ab')2、F(ab)2、Fab'、Fab、Fv、scFv(单链Fv)、单结构域抗体(DAB或VHH)等，包括上述引用的IgG4的半分子(van der Neut Kolfschoten等(Science 2007；317(9月14日)：1554-1557)。下文更详细地讨论了称为纳米抗体(Ghent，Belgium)的市售形式的单结构域抗体。不管结构如何，使用的抗体片段与被完整抗体识别的相同抗原结合。术语“抗体片段”还包括通过结合特异性抗原形成复合物而起抗体作用的合成或遗传工程化的蛋白质。例如，抗体片段包括由以下组成的分离片段：可变区，例如由重链和轻链的可变区组成的“Fv”片段；其中轻链和重链可变区通过肽接头连接的重组单链多肽分子(“scFv蛋白”)；和由模拟高变区的氨基酸残基组成的最小识别单元(例如CDR)。可以以不同的方式构建Fv片段以产生多价和/或多特异性结合形式。在多价的情况下，它们具有针对特定表位的多于一个结合位点，而对于多特异性形式，结合多于一个表位(相同抗原或针对一种抗原和不同抗原)。
裸抗体通常是不与治疗剂缀合的完整(全长)抗体。这是因为抗体分子的Fc部分提供效应子或免疫功能，例如补体结合和ADCC(抗体依赖性细胞毒性)，其将机制设定为可能导致细胞裂解的作用。然而，Fc部分可能不是抗体的治疗功能所需要的，而是其它机制，例如细胞凋亡、抗血管生成、抗转移活性、抗粘连活性(例如，抑制异型或同型粘附)和干扰信号传导途径，可能发挥作用并干扰疾病进展。裸抗体包括多克隆和单克隆抗体及其片段，包括鼠抗体以及某些重组抗体，例如嵌合抗体、人源化抗体或人抗体及其片段。本文所用“裸露的”与“未缀合的”同义，并且意指不与治疗剂连接或缀合。
嵌合抗体是含有重链抗体和轻链抗体两者的可变结构域的重组蛋白，包括来源于一个物种的抗体的互补决定区(CDR)，优选啮齿动物抗体，更优选鼠抗体，而抗体分子的恒定结构域衍生自人抗体的恒定结构域。对于兽医应用，嵌合抗体的恒定结构域可以衍生自其它物种(例如灵长类动物、猫或狗)的恒定结构域。
人源化抗体是重组蛋白，其中来自一个物种的抗体(例如，鼠抗体)的CDR从鼠抗体的可变重链和可变轻链转移到人重链可变结构域和轻链可变结构域(框架区)中。抗体分子的恒定结构域衍生自人抗体的恒定结构域。在一些情况下，人源化抗体的框架区的特定残基，特别是接触或靠近CDR序列的那些，可以被修饰，例如用来自原始鼠、啮齿动物、亚人灵长类动物或其它抗体的相应残基替换。
人抗体是例如从已被“工程化”以响应于抗原攻击产生人抗体的转基因小鼠获得的抗体。在该技术中，将人重链基因座和轻链基因座的元素引入源自含有内源重链基因座和轻链基因座的靶向破坏的胚胎干细胞系的小鼠品系。转基因小鼠可以合成对各种抗原具有特异性的人抗体，并且小鼠可以用于产生分泌人抗体的杂交瘤。从转基因小鼠获得人抗体的方法由Green等，Nature Genet.7：13(1994)，Lonberg等，Nature 368：856(1994)，和Taylor等，Int.Immun.6：579(1994)描述。还可以通过遗传或染色体转染方法以及噬菌体展示技术构建全人抗体，所有这些都是本领域已知的。参见例如McCafferty等，Nature 348：552-553(1990)，用于在体外从来自未免疫供体的免疫球蛋白可变结构域基因库产生人抗体及其片段。在该技术中，将抗体可变结构域基因读框克隆到丝状噬菌体的主要或次要外壳蛋白基因中，并在噬菌体颗粒的表面上展示为功能性抗体片段。因为丝状颗粒含有噬菌体基因组的单链DNA拷贝，所以基于抗体的功能特性的选择也导致编码显示那些特性的抗体的基因的选择。噬菌体以这种方式模拟B细胞的一些特性。噬菌体展示可以以多种形式进行，其综述参见例如，Johnson和Chiswell，Current Opinion in Structural Biology 3:5564-571(1993)。人抗体也可以通过体外活化的B细胞产生。参见美国专利No.5,567,610和No.5,229,275，每一个的实施例部分通过引用并入本文。
治疗剂是与结合部分(例如，抗体或抗体片段)分开、同时或相继施用并且可用于治疗疾病的分子或原子。治疗剂的实例包括但不限于抗体、抗体片段、缀合物、药物、细胞毒剂、促凋亡剂、毒素、核酸酶(包括DNA酶和RNA酶)、激素、免疫调节剂、螯合剂、硼化合物、光活化剂或染料、放射性同位素或放射性核素、寡核苷酸、干扰RNA、肽、抗血管生成剂、化学治疗剂、细胞因子、趋化因子、前药、酶、结合蛋白或肽或其组合。
免疫缀合物是与治疗剂缀合的抗体、抗体片段或其它抗体部分。本文所用术语“缀合物”与“免疫缀合物”可互换使用。
本文所用术语抗体融合蛋白是重组产生的抗原结合分子，其中一个或多个天然抗体、单链抗体或抗体片段连接至另一部分，例如蛋白质或肽、毒素、细胞因子、激素等。在某些优选的实施方案中，融合蛋白可以包含两个或更多个融合在一起的相同或不同的抗体、抗体片段或单链抗体，其可以结合相同抗原或不同抗原上的相同表位、不同表位。
免疫调节剂是在存在时改变、抑制或刺激机体免疫系统的治疗剂。通常，使用的免疫调节剂刺激免疫细胞在免疫应答级联(例如，巨噬细胞、树突细胞、B细胞和/或T细胞)中增殖或变得活化。如本文所述的免疫调节剂的实例是细胞因子，其是约5-20kDa的可溶性小蛋白，在与特异性抗原接触时由一个细胞群体(例如，致敏的T淋巴细胞)释放，并且作为细胞间的细胞间介质。如技术人员将理解的，细胞因子的实例包括淋巴因子、单核因子、白细胞介素和几种相关的信号分子，例如肿瘤坏死因子(TNF)和干扰素。趋化因子是细胞因子的子集。某些白细胞介素和干扰素是刺激T细胞或其它免疫细胞增殖的细胞因子的实例。
CPT是喜树碱的缩写。本申请中所使用的CPT代表喜树碱本身或喜树碱的类似物或衍生物。喜树碱及其一些类似物的结构，其中所示的编号和用字母A-E标记的环，在如下图表1中的式1中给出。
图表1
喜树碱缀合物
用于制备包含连接至抗体或抗原结合抗体片段的喜树碱治疗剂的免疫缀合物的非限制性方法和组合物如下所述。在优选的实施方案中，通过在药物与抗体之间放置限定的聚乙二醇(PEG)部分(即，包含限定数量的单体单元的PEG)来提高药物的溶解度，其中限定的PEG是低分子量PEG，优选含有1-30个单体单元，更优选含有1-12个单体单元。
优选地，第一接头在一端连接药物并且在另一端可以用乙炔或叠氮基团终止。该第一接头可以包含在一端具有叠氮基或乙炔基并在另一端具有不同反应性基团(例如，羧酸或羟基)的限定的PEG部分。所述双官能定义的PEG可以连接至氨基醇的胺基，并且后者的羟基可以以碳酸酯的形式连接至药物上的羟基。或者，所述限定的双官能PEG的非叠氮化物(或乙炔)部分可以连接至L-氨基酸或多肽的N-末端，而C-末端连接至氨基醇的氨基，后者的羟基可分别以碳酸酯或氨基甲酸酯的形式连接至药物的羟基上。
包含抗体偶联基团和与第一接头的叠氮化物(或乙炔)基团互补的反应性基团-即乙炔(或叠氮化物)的第二接头可以经由乙炔-叠氮化物环加成反应与药物-(第一接头)缀合物反应，以提供可用于与疾病靶向抗体缀合的最终双官能药物产品。抗体偶联基团优选是硫醇或巯基反应性基团。
在乙炔-叠氮化物“点击化学”偶联中，铜(+1)-催化的环加成反应发生在乙炔部与叠氮化物部分之间(Kolb HC和Sharpless KB，Drug Discov Today 2003；8:1128-37)，尽管点击化学的替代形式是已知的并且可以使用。该反应使用溴化亚铜和三苯基膦的混合物，以使得在非极性有机溶剂(例如，二氯甲烷)中高效偶联。点击化学的优点是它是化学选择性的，并且补充其它熟知的缀合化学例如硫醇-马来酰亚胺反应。在下面的讨论中，当缀合物包含抗体或抗体片段时，可以替换另一类型的结合部分，例如靶向肽。
下文提供了在C-20碳酸酯存在下，在涉及CPT类似物(例如，SN-38)的药物-接头前体制备中选择性再生10-羟基的方法。也可以使用药物中的活性羟基(例如SN-38中的酚羟基)的其它保护基，例如叔丁基二甲基甲硅烷基或叔丁基二苯基甲硅烷基，并且这些可以通过四丁基氟化铵脱保护，然后将衍生的药物与抗体-偶联部分相连。CPT类似物的10-羟基作为除了‘BOC’之外的酯或碳酸酯可选地被保护，使得双官能CPT与抗体缀合，而不需要对该保护基团进行先前的脱保护。在施用生物缀合物后，保护基可以在生理pH条件下容易地脱保护。
图1中示出了ADC的示例性实施方案，图1说明了通过细胞内可裂解的CL2A接头与SN-38喜树碱缀合的hRS7(抗TROP-2)的结构。
在多种实施方案中，抗体和药物的缀合物可以通过切向流过滤(TFF)方法使用50,000Da分子量截留膜使用25至30个透析过滤体积的缀合物配制缓冲液纯化，所述缓冲液用于纯化数百克的缀合物。该方法避免了对在尺寸排阻和疏水色谱柱上使用昂贵和麻烦的色谱纯化的需要。
在其它实施方案中，将缀合物配制在pH为6至7.0的古德生物缓冲液中，并冻干储存。优选地，古德缓冲液选自由以下组成的组：2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)、4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸(HEPES)和1,4-哌嗪二乙磺酸(PIPES)，pH范围为6-7，优选在6.5至7的pH范围内，并且以10-100mM、优选25mM的缓冲液浓度。最优选的配制缓冲液是25mM MES，pH6.5。
在另一些实施方案中，将纯化的缀合物与赋形剂(例如，海藻糖和聚山梨醇酯80)组合、冻干并作为冻干物在-20℃至8℃的温度范围内储存。
蒽环缀合物
图2示出用于缀合以形成ADC的示例性蒽环，前-2-吡咯啉并多柔比星(P2PDox)。母体化合物2-吡咯啉并多柔比星在1996年首次由Schally的小组描述，Schally的小组后来将其用于与多种受体靶向的肽缀合用于临床前探查(Nagy等，1996a，Proc Natl Acad SciUSA 93:7269-73；Nagy等，1996b，Proc Natl Acad Sci USA 93:2464-9；Nagy等，1997，ProcNatl Acad Sci USA 94:652-6；Nagy等，1998，Proc Natl Acad Sci USA 95:1794-9)。这是多柔比星的衍生物，其中道诺糖胺(daunosamine)氮掺入到5元烯胺中，使其成为高效的烷化剂，其细胞毒性为多柔比星的500-1000倍。药物的超敏性需要在隔离器中进行特殊处理，以确保安全。
另一组研究了2-吡咯啉并多柔比星的前药形式，该组公开了多柔比星的衍生物，即N-(4,4-二乙酰氧基丁基)多柔比星(Farquhar等，1998，J Med Chem 41:965-72；美国专利No.5,196,522；6,433,150)，其在体内可转化为2-吡咯啉并多柔比星。该衍生物通过用4,4-二乙酰氧基丁醛使多柔比星还原烷基化而制备。然而，在二硫化物还原的抗体的硫醇上，使用酸不稳定基团(例如，腙)作为可裂解接头，该前药不与抗体或其它靶向分子连接。
以下各实施例使用P2PDox作为用于新辅助剂用途的ADC中的药物。这具有若干优点：(i)仅处理前药，从而减少安全性问题；(ii)原料多柔比星(Dox)可以以cGMP级别的量获得；和(iii)将Dox转化为活化的P2PDox(P2PDox)的化学仅涉及几个合成步骤。图2A-2D示出Dox、2-PDox、P2PDox(P2PDox)和活化的P2PDox的结构。为了偶联到IgG，用SMCC-酰肼活化P2PDox，该程序引入酸不稳定的腙以及马来酰亚胺基团，后者用于与轻度还原的抗体的硫醇缀合。
作为ADC新辅助剂用途的药物之一的2-吡咯啉并多柔比星的选择，特别是其用于与MAb缀合的前药形式，使得能够快速开发免疫缀合物，因为原料多柔比星容易以cGMP级获得。P2PDox上的酮提供了在单一步骤中掺入酸不稳定的腙和抗体结合的马来酰亚胺基团的手段。根据文献先例(Farquhar等，1998,41:965-72；Guillemard和Uri，2004，Oncogene 23:3613-12)，在2-PDox形式中多柔比星的氨基的衍生化应该克服与多柔比星相关的多重耐药性。如果需要，为了放射性标记目的和/或进一步调节可施用的剂量，该设计提供了将亲水基团添加到接头或N-烷基部分中的选择，而不影响在体内产生的活性2-吡咯啉并多柔比星结构。
目前由其它人检查的大多数ADC包含微管蛋白作用、超毒性登木素生物碱和奥瑞斯他汀，其是细胞周期各时期特异性的。有趣的是，除曲妥珠单抗-DM1之外，这些ADC似乎在实体癌临床上表现出较窄的治疗指数。DNA烷化剂(例如，2-PDox)是细胞周期各时期非特异性的。基于通过不同的细胞杀伤机制起作用的药物成分，所提出的ADC提供了与其它超毒性ADC的偏离，并提供改善的治疗指数，所述ADC是显示出比许多其它抗体(例如，EpCAM MAb)更强的癌症特异性的内化抗体和连接化学。如下所示，迄今为止在胰腺癌、乳腺癌和胃癌的攻击性异种移植模型中进行的临床前研究显示hRS7-P2PDox缀合物在低剂量和安全剂量下非常有活性，导致完全消退。在携带人血液学和实体瘤的小鼠中用靶向此类类肿瘤并与P2PDox缀合的多种抗体进行处理的研究也显示优异的肿瘤控制(与对照组相比，延迟或生长衰退)，即便以偶发剂量，主要是由于中性粒细胞减少引起的剂量限制毒性，其通过将剂量调节为低于最大耐受剂量(MTD)来控制，通常是导致5％或更少死亡率的剂量。研究支持抗体-P2PDox缀合物的新辅助剂用途。
一般抗体技术
用于制备针对实际上任何靶抗原的单克隆抗体的技术是本领域公知的。参见例如Kohler和Milstein，Nature 256：495(1975)和Coligan等.(编著)，CURRENT PROTOCOLS INIMMUNOLOGY，第1卷，第2.5.1-2.6.7页(John Wiley&Sons 1991)。简言之，单克隆抗体可以通过如下所述获得：用包含抗原的组合物注射小鼠，除去脾脏以获得B淋巴细胞，将B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤，克隆杂交瘤，选择产生针对抗原的抗体的阳性克隆，培养产生针对抗原的抗体的克隆，并从杂交瘤培养物中分离抗体。
各种技术，例如嵌合或人源化抗体的产生，可涉及抗体克隆和构建的程序。可以通过多种分子克隆程序(例如RT-PCR、5'-RACE和cDNA文库筛选)获得目标抗体的抗原结合Vκ(可变轻链)和VH(可变重链)序列。来自表达鼠抗体的细胞的抗体的V基因可以通过PCR扩增和测序来克隆。为了证实其真实性，克隆的VL和VH基因可以如Orlandi等(Proc.Natl.Acad.Sci.，86:3833(1989))所述作为嵌合抗体在细胞培养物中表达。基于V基因序列，人源化抗体然后可以如Leung等所述进行设计和构建(Mol.Immunol.，32:1413(1995))。
可以通过一般分子克隆技术(Sambrook等，Molecular Cloning，A laboratorymanual，第2版(1989))从产生鼠抗体的任何已知的杂交瘤系或转染细胞系制备cDNA。可以使用引物VK1BACK和VK1FOR(Orlandi等，1989)或Leung等(BioTechniques，15:286(1993))描述的延伸引物组扩增抗体的Vκ序列。可以使用引物对VH1BACK/VH1FOR(Orlandi等，1989)或与Leung等(Hybridoma，13:469(1994))描述的鼠IgG恒定区退火的引物扩增VH序列。如Leung等(Mol Immunol，32:1413(1995))所述，人源化V基因可以通过长寡核苷酸模板合成和PCR扩增的组合来构建。
可以将Vκ的PCR产物亚克隆到分期载体(staging vector)中，例如基于pBR327的分期载体VKpBR，其含有Ig启动子、信号肽序列和方便的限制性位点。可以将VH的PCR产物亚克隆到类似的分期载体中，例如基于pBluescript的VHpBS。含有Vκ和VH序列以及启动子和信号肽序列的表达盒可以从VKpBR和VHpBS切出并分别连接至合适的表达载体，例如pKh和pG1g(Leung等，Hybridoma，13:469(1994))。可以将表达载体共转染到合适的细胞中，监测上清液中嵌合抗体、人源化抗体或人抗体的产生。或者，可以切除Vκ和VH表达盒，并将其亚克隆进单一表达载体，例如pdHL2，如Gillies等(J.Immunol Methods 125:191(1989)所述，并且还示于Losman等，Cancer，80:2660(1997))。
在一个替代实施方案中，可以将表达载体转染到已经预先适应于在无血清培养基中转染、生长和表达的宿主细胞中。可以使用的示例性细胞系包括Sp/EEE、Sp/ESF和Sp/ESF-X细胞系(参见例如美国专利No.7,531,327；7,537,930和7,608,425；其各自的实施例部分通过引用并入本文)。这些示例性细胞系基于用突变Bcl-EEE基因转染的Sp2/0骨髓瘤细胞系，暴露于甲氨蝶呤以扩增转染的基因序列并预先适应无血清细胞系用于蛋白质表达。
嵌合抗体和人源化抗体
嵌合抗体是其中人抗体的可变区已被例如小鼠抗体的可变区(包括小鼠抗体的互补决定区(CDR))替代的重组蛋白。当施用于受试者时，嵌合抗体表现出降低的免疫原性和增加的稳定性。构建嵌合抗体的方法是本领域公知的(例如，Leung等，1994，Hybridoma 13:469)。
嵌合单克隆抗体可以通过将小鼠CDR从小鼠免疫球蛋白的可变重链和可变轻链转移到人抗体的相应可变结构域来人源化。嵌合单克隆抗体中的小鼠框架区(FR)也被人FR序列替换。为了保持人源化单克隆的稳定性和抗原特异性，可以用小鼠对应残基替换一个或多个人FR残基。人源化单克隆抗体可用于受试者的治疗性治疗。用于产生人源化单克隆抗体的技术是本领域公知的。(参见例如Jones等，1986，Nature，321:522；Riechmann等，Nature，1988,332:323；Verhoeyen等，1988，Science，239:1534；Carter等，1992，Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA，89:4285；Sandhu，Crit.Rev.Biotech.，1992,12:437；Tempest等，1991，Biotechnology 9:266；Singer等，J.Immun.，1993,150:2844。)
其它实施方案可以涉及非人灵长类动物抗体。用于在狒狒中产生治疗有用的抗体的一般技术可以在例如Goldenberg等，WO 91/11465(1991)和Losman等，J.Cancer 46:310(1990)中找到。在另一个实施方案中，抗体可以是人单克隆抗体。此类抗体可以从转基因小鼠获得，所述转基因小鼠已被工程化以产生响应于抗原攻击的特异性人抗体，如下文所讨论的。
人抗体
使用组合方法或用人免疫球蛋白基因座转化的转基因动物产生全人抗体的方法是本领域已知的(例如，Mancini等，2004，New Microbiol.27:315-28；Conrad和Scheller，2005，Comb.Chem.High Throughput Screen.8:117-26；Brekke和Loset，2003，Curr.Opin.Pharmacol.3:544-50；各自通过引用并入本文)。预期此类全人抗体表现出比嵌合抗体或人源化抗体甚至更少的副作用，并且在体内作为基本上内源的人抗体起作用。在某些实施方案中，所要求保护的方法和程序可以利用通过这些技术产生的人抗体。
在一个替代方案中，噬菌体展示技术可用于产生人抗体(例如，Dantas-Barbosa等，2005，Genet.Mol.Res.4:126-40，通过引用并入本文)。人抗体可以从正常人或从表现出特定疾病状态(例如癌症)的人产生(Dantas-Barbosa等，2005)。从患病个体构建人抗体的优点是循环抗体库可偏向针对疾病相关抗原的抗体。
在该方法的一个非限制性实例中，Dantas-Barbosa等(2005)构建了来自骨肉瘤患者的人Fab抗体片段的噬菌体展示文库。通常，总RNA获自循环血液淋巴细胞(同上)。从μ、γ和κ链抗体库克隆重组Fab，并插入到噬菌体展示文库中(同上)。将RNA转化为cDNA并用于使用针对重链和轻链免疫球蛋白序列的特异性引物制备Fab cDNA文库(Marks等，1991，J.Mol.Biol.222:581-97，通过引用并入本文)。根据Andris-Widhopf等(2000，于PhageDisplay Laboratory Manual，Barbas等(编著)，第1版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，NY第9.1至9.22页，通过引用并入本文)进行文库构建。用限制性内切核酸酶消化最终的Fab片段并插入噬菌体基因组以制备噬菌体展示文库。此类文库可以通过标准噬菌体展示方法筛选。本领域技术人员将认识到，该技术仅是示例性的，并且可以利用通过噬菌体展示制备和筛选人抗体或抗体片段的任何已知方法。
在另一个替代方案中，使用如上所述的标准免疫方案，可以使用已经被遗传工程化以产生人抗体的转基因动物产生针对基本上任何免疫原性靶标的抗体。从转基因小鼠获得人抗体的方法由Green等，Nature Genet.7:13(1994)，Lonberg等，Nature 368:856(1994)和Taylor等，Int.Immun.6:579(1994)所述。此类系统的非限制性实例是来自Abgenix(Fremont，CA)的(例如，Green等，1999，J.Immunol.Methods 231:11-23，其通过引用并入本文)。在/>和相似的动物中，小鼠抗体基因已经失活并被功能性人抗体基因替代，而小鼠免疫系统的其余部分保持完整。
用种系配置的YAC(酵母人工染色体)转化所述种系配置的YAC含有沿着附属基因和调节序列的人IgH和Igκ基因座的部分，包括大部分可变区序列。人可变区库可用于产生产生抗体的B细胞，其可以通过已知技术加工成杂交瘤。用靶抗原免疫的通过正常免疫应答产生人抗体，其可以通过上述标准技术收获和/或产生。可获得各种品系的/>其中每一种均能够产生不同类别的抗体。转基因产生的人抗体已示出具有治疗潜力，同时保留正常人抗体的药代动力学性质(Green等，1999)。技术人员将认识到，所要求保护的组合物和方法不限于使用/>系统，而是可以利用已被遗传工程化以产生人抗体的任何转基因动物。
抗体片段的产生
抗体片段可以例如通过常规方法经胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化完整抗体来获得。例如，可以通过用胃蛋白酶酶促裂解抗体从而提供表示为F(ab')2的5S片段来产生抗体片段。可以使用硫醇还原剂和任选地由二硫键断裂产生的巯基的封闭基团进一步裂解该片段，以产生3.5S Fab'单价片段。或者，使用胃蛋白酶的酶促裂解产生两个单价Fab片段和Fc片段。用于产生抗体片段的示例性方法公开于美国专利No.4,036,945；美国专利No.4,331,647；Nisonoff等，1960，Arch Biochem Biophys，89:230；Porter，1959，Biochem.J.，73:119；Edelman等，1967，METHODS IN ENZYMOLOGY，第422页(Academic Press)和Coligan等(编著)，1991，CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY，(John Wiley&Sons)中。
也可以使用裂解抗体的其它方法，例如分离重链以形成单价轻-重链片段，进一步裂解片段或其它酶促、化学或遗传技术，只要片段结合被完整抗体识别的抗原即可。例如，Fv片段包含VH和VL链的缔合。这种缔合可以是非共价的，如Inbar等，1972，Nat'l.Acad.Sci.USA，69：2659所述。或者，可变链可通过分子间二硫键连接或通过化学品例如戊二醛交联。参见Sandhu，1992，Crit.Rev.Biotech.，12:437。
优选地，Fv片段包含通过肽接头连接的VH和VL链。这些单链抗原结合蛋白(scFv)通过构建包含通过寡核苷酸接头序列连接的编码VH和VL结构域的DNA序列的结构基因来制备。将结构基因插入随后导入宿主细胞(例如，大肠杆菌)的表达载体中。重组宿主细胞合成具有桥接两个V结构域的接头肽的单个多肽链。用于产生scFv的方法是本领域公知的。参见Whitlow等，1991，Methods:A Companion to Methods in Enzymology 2:97；Bird等，1988，Science，242:423；美国专利No.4,946,778；Pack等，1993，Bio/Technology，11:1271和Sandhu，1992，Crit.Rev.Biotech.，12:437。
抗体片段的另一种形式是单结构域抗体(dAb)，有时称为单链抗体。用于产生单结构域抗体的技术是本领域公知的(参见例如Cossins等，Protein Expression andPurification，2007,51：253-59；Shuntao等，Molec Immunol 06,43:1912-19；Tanha等，J.Biol.Chem.2001,276:24774-780)。其它类型的抗体片段可以包含一个或多个互补决定区(CDR)。CDR肽(“最小识别单位”)可以通过构建编码目标抗体的CDR的基因来获得。此类基因例如通过使用聚合酶链反应从抗体产生细胞的RNA合成可变区来制备。参见Larrick等，1991，Methods：A Companion to Methods in Enzymology 2:106；Ritter等(编著)，1995，MONOCLONAL ANTIBODIES:PRODUCTION，ENGINEERING AND CLINICAL APPLICATION，第166-179页(Cambridge University Press)；Birch等(编著)，1995，MONOCLONAL ANTIBODIES:PRINCIPLES AND APPLICATIONS，第137-185页(Wiley-Liss，Inc。)
抗体变异
在某些实施方案中，可以改变抗体的序列，例如抗体的Fc部分，以优化缀合物的生理特征，例如血清中的半衰期。在蛋白质中替换氨基酸序列的方法是本领域公知的，例如通过定点诱变(例如，Sambrook等，Molecular Cloning，Alaboratory manual，第2版，1989)。在优选的实施方案中，所述变异可涉及在Fc序列中添加或去除一个或多个糖基化位点(例如，美国专利No.6,254,868，其实施例部分通过引用并入本文)。在其它优选的实施方案中，可以在Fc序列中进行特定氨基酸替换(例如，Hornick等，2000，J Nucl Med 41：355-62；Hinton等，2006，J Immunol 176：346-56；Petkova等，2006，Int Immunol 18：1759-69；美国专利No.7,217,797；分别通过引用并入本文)。
抗体同种异型
治疗性抗体的免疫原性与输注反应的风险增加和治疗响应的持续时间减少相关(Baert等，2003，N Engl J Med 348：602-08)。治疗性抗体在宿主中诱导免疫应答的程度可以部分地通过抗体的同种异型确定(Stickler等，2011，Genes and Immunity 12：213-21)。抗体同种异型与抗体恒定区序列中特定位置处的氨基酸序列变化相关。含有重链γ型恒定区的IgG抗体的同种异型称为Gm同种异型(1976，J Immunol 117：1056-59)。
对于常见的IgG1人抗体，最普遍的同种异型是G1m1(Stickler等，2011，Genes andImmunity 12：213-21)。然而，G1m3同种异型也频繁发生在白种人中(Stickler等，2011)。据报道，当施用于非G1m1(nG1m1)受体(例如，G1m3患者)时，G1m1抗体含有倾向于诱导免疫应答的同种异型序列(Stickler等，2011)。非G1ml同种异型抗体在施用于G1ml患者时不具有免疫原性(Stickler等，2011)。
人G1m1同种异型包含重链IgG1的CH3序列中Kabat第356位处的氨基酸天冬氨酸和Kabat第358位处的亮氨酸。nG1m1同种异型包含Kabat第356位处的氨基酸谷氨酸和Kabat第358位处的甲硫氨酸。G1m1和nG1m1同种异型两者在Kabat第357位处包含谷氨酸残基，并且同种异型有时称为DEL和EEM同种异型。以下显示示例性抗体利妥昔单抗(SEQ ID NO：1)和维妥珠单抗(SEQ ID NO：2)的G1m1和nG1m1同种异型抗体的重链恒定区序列的非限制性实例。
利妥昔单抗重链可变区序列(SEQ ID NO：1)
维妥珠单抗重链可变区(SEQ ID NO：2)
Jefferis和Lefranc(2009，mAbs 1：1-7)综述了IgG同种异型的序列变化特征及其对免疫原性的影响。他们报道了与G1m17同种异型中Kabat第214位处的赖氨酸残基相比，G1m3同种异型的特征在于在Kabat第214位处的精氨酸残基。nG1m1,2同种异型的特征在于在Kabat第356位处的谷氨、在Kabat第358位处的甲硫氨酸和在Kabat第431位处的丙氨酸。G1m1,2同种异型的特征在于在Kabat第356位处的天冬氨酸、在Kabat第358位处的亮氨酸和在Kabat第431位处的甘氨酸。除了重链恒定区序列变体，Jefferis和Lefranc(2009)还报道了κ轻链恒定区中的同种异型变体，Km1同种异型的特征在于Kapat第153位处的缬氨酸和Kabat第191位处的亮氨酸，Km1,2同种异型的特征在于在Kabat第153位处的丙氨酸和在Kabat第191位处的亮氨酸，并且Km3同种异型的特征在于在Kabat第153位处的丙氨酸和Kabat第191位处的缬氨酸。
关于治疗性抗体，维妥珠单抗和利妥昔单抗分别是针对CD20的人源化和嵌合IgG1抗体，其用于治疗多种血液恶性肿瘤。表1比较了利妥昔单抗相对于维妥珠单抗的同种异型序列。如表1所示，利妥昔单抗(G1m17,1)是DEL同种异型IgG1，在利妥昔单抗的Kabat第214位(重链CH1)的赖氨酸相对于维妥珠单抗的精氨酸中具有另外的序列变化。已经报道，维妥珠单抗在受试者中比利妥昔单抗的免疫原性更低(参见，例如Morchhauser等，2009，J ClinOncol 27:3346-53；Goldenberg等，2009，Blood 113:1062-70；Robak&Robak，2011，BioDrugs 25:13-25)，这是归因于人源化抗体与嵌合抗体之间差异的效应。然而，EEM和DEL同种异型之间的同种异型差异可能也解释了维妥珠单抗的较低的免疫原性。
表1.利妥昔单抗相对于维妥珠单抗的同种异型
为了降低nG1m1基因型个体中治疗性抗体的免疫原性，需要选择抗体的同种异型，以对应于以Kabat第214位处的精氨酸为特征的G1m3同种异型，和以Kabat第356位处的谷氨酸、Kabat第358位处的甲硫氨酸和Kabat第431位处的丙氨酸为特征的nG1m1,2无效同种异型。出乎意料地，发现在长时间段内重复皮下施用G1m3抗体不会导致显著的免疫应答。在替代实施方案中，与G1m3同种异型共有的人IgG4重链具有在Kabat 214处的精氨酸、在Kabat356处的谷氨酸、在Kabat 359处的甲硫氨酸和在Kabat 431处的丙氨酸。由于免疫原性似乎至少部分地与那些位置处的残基相关，因此使用人IgG4重链恒定区序列作为治疗性抗体也是优选的实施方案。G1m3 IgG1抗体与IgG4抗体的组合也可用于治疗性施用。
已知的抗体
在多种实施方案中，所要求保护的方法和组合物可以利用本领域已知的多种抗体中的任一种。使用的抗体可以从许多已知来源商购获得。例如，多种抗体分泌性杂交瘤系可从美国典型培养物保藏中心(ATCC，Manassas，VA)获得。针对多种疾病靶标(包括但不限于肿瘤相关抗原)的大量抗体已经保藏在ATCC和/或已经公布了可变区序列，并且可用于要求保护的方法和组合物中。参见，例如，美国专利No.7,312,318；7,282,567；7,151,164；7,074,403；7,060,802；7,056,509；7,049,060；7,045,132；7,041,803；7,041,802；7,041,293；7,038,018；7,037,498；7,012,133；7,001,598；6,998,468；6,994,976；6,994,852；6,989,241；6,974,863；6,965,018；6,964,854；6,962,981；6,962,813；6,956,107；6,951,924；6,949,244；6,946,129；6,943,020；6,939,547；6,921,645；6,921,645；6,921,533；6,919,433；6,919,078；6,916,475；6,905,681；6,899,879；6,893,625；6,887,468；6,887,466；6,884,594；6,881,405；6,878,812；6,875,580；6,872,568；6,867,006；6,864,062；6,861,511；6,861,227；6,861,226；6,838,282；6,835,549；6,835,370；6,824,780；6,824,778；6,812,206；6,793,924；6,783,758；6,770,450；6,767,711；6,764,688；6,764,681；6,764,679；6,743,898；6,733,981；6,730,307；6,720,155；6,716,966；6,709,653；6,693,176；6,692,908；6,689,607；6,689,362；6,689,355；6,682,737；6,682,736；6,682,734；6,673,344；6,653,104；6,652,852；6,635,482；6,630,144；6,610,833；6,610,294；6,605,441；6,605,279；6,596,852；6,592,868；6,576,745；6,572；856；6,566,076；6,562,618；6,545,130；6,544,749；6,534,058；6,528,625；6,528,269；6,521,227；6,518,404；6,511,665；6,491,915；6,488,930；6,482,598；6,482,408；6,479,247；6,468,531；6,468,529；6,465,173；6,461,823；6,458,356；6,455,044；6,455,040,6,451,310；6,444,206；6,441,143；6,432,404；6,432,402；6,419,928；6,413,726；6,406,694；6,403,770；6,403,091；6,395,276；6,395,274；6,387,350；6,383,759；6,383,484；6,376,654；6,372,215；6,359,126；6,355,481；6,355,444；6,355,245；6,355,244；6,346,246；6,344,198；6,340,571；6,340,459；6,331,175；6,306,393；6,254,868；6,187,287；6,183,744；6,129,914；6,120,767；6,096,289；6,077,499；5,922,302；5,874,540；5,814,440；5,798,229；5,789,554；5,776,456；5,736,119；5,716,595；5,677,136；5,587,459；5,443,953；5,525,338，其各自的实施例部分通过引用并入本文。这些仅是示例性的，并且多种其它抗体及其杂交瘤是本领域已知的。本领域技术人员将认识到，针对几乎任何疾病相关抗原的抗体序列或抗体分泌性杂交瘤可以通过简单搜索ATCC、NCBI和/或USPTO数据库获得针对所选疾病相关目标靶标的抗体。克隆的抗体的抗原结合结构域可以使用本领域公知的标准技术扩增、切除、连接至表达载体中，转染到适应的宿主细胞中并用于蛋白质产生(参见例如美国专利No.7,531,327；7,537,930；7,608,425和7,785,880，每个的实施例部分通过引用并入本文)。
可以在所要求保护的方法和组合物的范围内使用的特定抗体包括但不限于LL1(抗CD74)、LL2或RFB4(抗CD22)、维妥珠单抗(hA20，抗CD20)、利妥昔单抗(抗CD20)、阿托珠单抗(GA101，抗CD20)、兰布罗单抗(抗PD-1受体)、纳武单抗(抗PD-1受体)、伊匹单抗(抗CTLA-4)、RS7(抗上皮糖蛋白-1(EGP-1，也称为TROP-2))、PAM4或KC4(均为抗粘蛋白)、MN-14(抗癌胚抗原(CEA，也称为CD66e或CEACAM5)、MN-15或MN-3(抗CEACAM6)、Mu-9(抗结肠特异性抗原-p)、Immu 31(抗α甲胎蛋白)、R1(抗IGF-1R)、A19(抗CD19)、TAG-72(例如，CC49)、Tn、J591或HuJ591(抗PSMA(前列腺特异性膜抗原))、AB-PG1-XG1-026(抗PSMA二聚体)、D2/B(抗PSMA)、G250(抗碳酸酐酶IX MAb)、L243(抗HLA-DR)阿仑单抗(抗CD52)、贝伐单抗(抗VEGF)、西妥昔单抗(抗EGFR)、吉妥珠单抗(抗CD33)、替伊莫单抗(抗CD20)、帕尼单抗(抗EGFR)、托西莫单抗(抗CD20)、PAM4(克利伐珠单抗(aka clivatuzumab)，抗粘蛋白)和曲妥珠单抗(抗ErbB2)。此类抗体是本领域已知的(例如，美国专利No.5,686,072；5,874,540；6,107,090；6,183,744；6,306,393；6,653,104；6,730,300；6,899,864；6,926,893；6,962,702；7,074,403；7,230,084；7,238,785；7,238,786；7,256,004；7,282,567；7,300,655；7,312,318；7,585,491；7,612,180；7,642,239；和美国专利申请公开No.20050271671；20060193865；20060210475；20070087001；各自的实施例部分通过引用并入)。使用的具体已知抗体包括hPAM4(美国专利No.7,282,567)、hA20(美国专利No.7,151,164)、hA19(美国专利No.7,109,304)、hIMMU-31(美国专利No.7,300,655)、hLL1(美国专利No.7,312,318)、hLL2(美国专利No.5,789,554)、hMu-9(美国专利No.7,387,772)、hL243(美国专利No.7,612,180)、hMN-14(美国专利No.6,676,924)、hMN-15(美国专利No.8,287,865)、hR1(美国专利申请12/772,645)、hRS7(美国专利No.7,238,785)、hMN-3(美国专利No.7,541,440)、AB-PG1-XG 1-026(美国专利申请11/983,372，保藏为ATCC PTA-4405和PTA-4406)和D2/B(WO 2009/130575)，每个所述专利或专利申请的文本相对于附图和实施例部分通过引用并入本文。
可使用所述缀合物靶向的其它有用的抗原包括碳酸酐酶IX、α-甲胎蛋白(AFP)、α-辅肌动蛋白-4、A3、对A33抗体具有特异性的抗原、ART-4、B7、Ba733、BAGE、BrE3-抗原、CA125、CAMEL、CAP-1、CASP-8/m、CCL19、CCL21、CD1、CD1a、CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD11A、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD29、CD30、CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD46、CD52、CD54、CD55、CD59、CD64、CD66a-e、CD67、CD70、CD70L、CD74、CD79a、CD80、CD83、CD95、CD126、CD132、CD133、CD138、CD147、CD154、CDC27、CDK-4/m、CDKN2A、CTLA-4、CXCR4、CXCR7、CXCL12、HIF-1α、结肠特异性抗原-p(CSAp)、CEACAM5、CEACAM6、c-Met、DAM、EGFR、EGFRvIII、EGP-1(TROP-2)、EGP-2、ELF2-M、Ep-CAM、成纤维细胞生长因子(FGF)、Flt-1、Flt-3、叶酸受体、G250抗原、GAGE、gp100、GRO-β、HLA-DR、HM1.24、人绒毛膜促性腺激素(HCG)及其亚基、HER2/neu、HMGB-1、缺氧可诱导因子(HIF-1)、HSP70-2M、HST-2、Ia、IGF-1R、IFN-γ、IFN-α、IFN-β、IFN-λ、IL-4R、IL-6R、IL-13R、IL-15R、IL-17R、IL-18R、IL-2、IL-6、IL-8、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-23、IL-25、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、KC4抗原、KS-1-抗原、KS1-4、Le-Y、LDR/FUT、巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)、MAGE、MAGE-3、MART-1、MART-2、NY-ESO-1、TRAG-3、mCRP、MCP-1、MIP-1A、MIP-1B、MIF、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5ac、MUC13、MUC16、MAM-1/2、MAM-3、NCA66、NCA95、NCA90、PAM4抗原、胰腺癌粘液素、PD-1、PD-L1、PD-1受体、胎盘生长因子、p53、PLAGL2、前列腺酸性磷酸酶、PSA、PRAME、PSMA、P1GF、ILGF、ILGF-1R、IL-6、IL-25、RS5、RANTES、T101、SAGE、S100、存活蛋白、存活蛋白-2B、TAC、TAG-72、腱生蛋白、TRAIL受体、TNF-α、Tn抗原、汤姆森-弗里德里希抗原、肿瘤坏死抗原、VEGFR、ED-B纤连蛋白、WT-1、17-1A-抗原、补体因子C3、C3a、C3b、C5a、C5、血管生成标志物、bcl-2、bcl-6、Kras、原癌基因标志物和原癌基因产物(参见，例如Sensi等，Clin Cancer Res2006,12:5023-32；Parmiani等，J Immunol2007,178：1975-79；Novellino等，Cancer Immunol Immunother 2005,54:187-207)。
如流式细胞术所示，对造血恶性细胞的合适抗原(簇命名(Cluster Designation)或CD)靶标的综合分析是Craig和Foon，Blood，在2008年1月15日在线预先公开；DOL10.1182/blood-2007-11-120535，其可以是针对药物缀合的免疫疗法选择合适抗体的指南。
CD66抗原由分别由癌胚抗原(CEA)基因家族成员BCG、CGM6、NCA、CGM1和CEA编码的具有相似结构的五种不同糖蛋白(CD66a-e)组成。这些CD66抗原(例如，CEACAM6)主要在粒细胞、消化道的正常上皮细胞和各种组织的肿瘤细胞中表达。还包括作为癌症的合适靶标的是癌症睾丸抗原，例如NY-ESO-1(Theurillat等，Int.J.Cancer 2007；120(11):2411-7)和骨髓性白血病(Kozlov等，Cancer Genet.Cytogenet.2005；163(1)：62-7)和B细胞疾病中的CD79a以及非霍奇金氏淋巴瘤的CD79b(Poison等，Blood 110(2):616-623)。许多上述抗原公开于2002年11月15日提交的题为“Use of Multi-specific，Non-covalent Complexesfor Targeted Delivery of Therapeutics”的美国临时申请序列第60/426,379号中。归因于更具治疗耐受性的前体恶性细胞群体的癌干细胞(Hill和Perris，J.Natl.CancerInst.2007；99:1435-40)具有可靶向某些癌症类型的抗原，例如前列腺癌(Maitland等，Ernst Schering Found.Sympos.Proc.2006；5:155-79)、非小细胞肺癌(Donnenberg等，J.Control Release 2007；122(3):385-91)和胶质母细胞瘤(Beier等，Cancer Res.2007；67(9):4010-5)中的CD133和在结肠直肠癌(Dalerba等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2007；104(24)10158-63)、胰腺癌(Li等，Cancer Res.2007；67(3):1030-7)和头颈部鳞状细胞癌(Prince等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2007；104(3)973-8)中的CD44。乳腺癌治疗的另一个有用的靶标是Taylor等描述的LTV-1抗原(Biochem.J.2003；375:51-9)。
对于多发性骨髓瘤疗法，已描述了针对例如CD38和CD138(Stevenson，MolMed2006；12(11-12):345-346；Tassone等，Blood 2004；104(12):3688-96)、CD74(Stein等，同上)、CS1(Tai等，Blood 2008；112(4):1329-37和CD40(Tai等，2005；Cancer Res.65(13):5898-5906)的合适的靶向抗体。
巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)是先天和适应性免疫和凋亡的重要调节剂。据报道CD74是MIF的内源性受体(Leng等，2003，J Exp Med197:1467-76)。拮抗性抗CD74抗体对MIF介导的细胞内途径的治疗效果可用于治疗宽范围的疾病状态，例如尿膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、结肠癌和慢性淋巴细胞性白血病(例如，Meyer-Siegler等，2004，BMC Cancer12:34；Shachar&Haran，2011，Leuk Lymphoma52:1446-54)。米拉妥珠单抗(Milatuzumab)(hLL1)是用于治疗MIF介导的疾病的治疗用途的示例性抗CD74抗体。
抗TNF-α抗体是本领域已知的，并且可用于治疗癌症。已知的针对TNF-α的抗体包括人抗体CDP571(Ofei等，2011，Diabetes45:881-85)；鼠抗体MTNFAI、M2TNFAI、M3TNFAI、M3TNFABI、M302B和M303(Thermo Scientific，Rockford，IL)；英夫利昔单抗(Centocor，Malvern，PA)；赛妥珠单抗(UCB，Brussels，Belgium)；和阿达木单抗(Abbott，Abbott Park，IL)。这些和许多其它已知的抗TNF-α抗体可用于所要求保护的方法和组合物中。
检查点抑制剂抗体主要用于癌症疗法。免疫检查点是指免疫系统中负责维持自身耐受性和调节免疫系统使外周组织损伤最小化的响应程度的抑制途径。然而，肿瘤细胞也可以激活免疫系统检查点以降低针对肿瘤组织的免疫应答的有效性。示例性的针对细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA4，也称为CD152)、程序性细胞死亡蛋白1(PD1，也称为CD279)和程序性细胞死亡1配体1(PD-L1，也称为CD274)的检查点抑制剂抗体可以与一种或多种其它试剂组合使用以增强针对癌细胞或组织的免疫应答的有效性。示例性抗PD1抗体包括兰布罗单抗(MK-3475，MERCK)、纳武单抗(BMS-936558，BRISTOL-MYERS SQUIBB)、AMP-224(MERCK)和皮地利珠单抗(pidilizumab)(CT-011，CURETECH LTD.)。抗PD1抗体可商购获得，例如从(AB 137132)、/>(EH12.2H7，RMP1-14)和AFFYMETRLXEBIOSCIENCE(J105，J116，MIH4)。示例性抗PD-L1抗体包括MDX-1105(MEDAREX)、MEDI4736(MEDIMMUNE)MPDL3280A(GENENTECH)和BMS-936559(BRISTOL-MYERS SQUIBB)。抗PD-L1抗体也可商购获得，例如来自AFFYMETRLX EBIOSCIENCE(MIH1)。示例性抗CTLA4抗体包括伊匹单抗(Bristol-Myers Squibb)和曲美木单抗(tremelimumab)(PFIZER)。抗PD1抗体可商购自例如/>(AB 134090)、SINO BIOLOGICAL INC.(11159-H03H，11159-H08H)和THERMOSCIENTIFIC PIERCE(PA5-29572，PA5-23967，PA5-26465，MA1-12205，MA1-35914)。伊匹单抗最近已经获得FDA批准用于治疗转移性黑素瘤(Wada等，2013，J Transl Med 11:89)。
在另一个优选的实施方案中，使用快速内化并随后重新表达、加工和在细胞表面上呈递的抗体，使得细胞能够连续吸收和加速循环缀合物。最优选的抗体/抗原对的实例是LL1，抗CD74 MAb(不变链，II类特异性分子伴侣，Ii)(参见，例如，美国专利No.6,653,104；7,312,318；各自的实施例部分通过引用并入本文)。CD74抗原在B细胞淋巴瘤(包括多发性骨髓瘤)和白血病、某些T细胞淋巴瘤、黑素瘤、结肠癌、肺癌和肾癌、成胶质细胞瘤和某些其它癌症中高度表达(Ong等，Immunology 98:296-302(1999))。关于CD74抗体在癌症中的用途的综述包含在Stein等，Clin Cancer Res.2007年9月15日；13(18Pt2):5556s-5563s中，其通过引用并入本文。
优选地用抗CD74抗体治疗的疾病包括但不限于非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏病、黑素瘤、肺癌、肾癌、结肠癌、多形性成胶质细胞瘤、组织细胞瘤、骨髓性白血病和多发性骨髓瘤。CD74抗原在靶细胞表面上持续表达短时间，随后抗原内化和抗原重新表达使得靶向LL1抗体与其携带的任何化学治疗部分一起内化。这允许高浓度治疗性LL1-化学治疗性药物缀合物在这些细胞内积累。内化的LL1-化学治疗性药物缀合物通过溶酶体和核内体循环，并且化学治疗部分在靶细胞内以活性形式释放。
在所要求保护的方法和组合物的实践中，上述抗体和其它已知的针对肿瘤相关抗原的抗体可以用作免疫缀合物。
双特异性抗体和多特异性抗体
双特异性抗体可用于许多生物医学应用中。例如，具有肿瘤细胞表面抗原结合位点和T细胞表面受体结合位点的双特异性抗体可以指导T细胞对特异性肿瘤细胞的裂解。识别神经胶质瘤的双特异性抗体和T细胞上的CD3表位已经成功地用于治疗人患者的脑肿瘤(Nitta等.Lancet.1990；355：368-371)。在某些实施方案中，本文公开的用于治疗剂缀合的技术和组合物可以与用作抗体部分的双特异性或多特异性抗体一起使用。
用于产生双特异性或多特异性抗体的许多方法是已知的，例如在美国专利No.7,405,320中公开的，其实施例部分通过引用并入本文。双特异性抗体可以通过四源杂交瘤(quadroma)法产生，其涉及两种不同杂交瘤的融合，每种产生识别不同抗原位点的单克隆抗体(Milstein和Cuello，Nature，1983；305：537-540)。
用于产生双特异性抗体的另一种方法使用异双功能交联剂来化学栓系两种不同的单克隆抗体(Staerz等，Nature.1985；314：628-631；Perez等，Nature.1985；316：354-356)。双特异性抗体也可以通过将两种亲本单克隆抗体中的每一种分别还原为各自的半分子来产生，然后将其混合并再氧化以获得杂交结构(Staerz和Bevan.Proc Natl Acad SciUSA.1986；83：1453-1457)。另一种替代方案包括使用合适的接头化学交联两个或三个单独纯化的Fab'片段。(参见，例如，欧洲专利申请0453082)。
其它方法包括通过经由逆转录病毒衍生的穿梭载体将不同的可选择标志物基因转移到各自的亲本杂交瘤中来提高产生杂交杂交瘤的效率，所述亲本杂交瘤随后被融合(DeMonte等，Proc Natl Acad Sci USA.1990，87：2941-2945)；或用含有不同抗体的重链和轻链基因的表达质粒转染杂交瘤细胞系。
同源的VH和VL结构域可以与具有合适组成和长度(通常由多于12个氨基酸残基组成)的肽接头连接以形成具有结合活性的单链Fv(scFv)。制备scFv的方法公开于美国专利No.4,946,778和美国专利No.5,132,405中，每个的实施例部分通过引用并入本文。将肽接头长度减少到小于12个氨基酸残基来阻止VH和VL结构域在同一条链上的配对，并且强制VH和VL结构域与其它链上的互补结构域配对，导致功能多聚体的形成。与3至12个氨基酸残基之间的接头连接的VH和VL结构域的多肽链主要形成二聚体(称为双抗体)。使用0至2个氨基酸残基之间的接头，三聚体(称为三体)和四聚体(称为四体)是有利的，但是除了接头长度以外，寡聚的确切模式似乎取决于组成以及V-结构域的取向(VH-接头-VL或VL-接头-VH)。
用于产生多特异性或双特异性抗体的这些技术在低产量、必需纯化、低稳定性或该技术的劳动强度方面表现出各种困难。最近，称为“DOCK-AND-LOCKTM”(DNLTM)的双特异性构建体已被用于产生实际上任何所需抗体、抗体片段和其它效应分子的组合(参见例如，美国专利No.7,550,143；7,521,056；7,534,866；7,527,787和USSN11/925,408，各自的实施例部分通过引用并入本文)。该技术利用互补蛋白结合结构域，称为锚定结构域(AD)和二聚化及停靠结构域(docking domains)(DDD)，其彼此结合并允许复合物结构的装配，范围从二聚体、三聚体、四聚体、五聚体和六聚体不等。这些以高产率形成稳定的复合物，而不需要大量纯化。该技术允许单特异性、双特异性或多特异性抗体的装配。本领域已知的用于制备双特异性或多特异性抗体的任何技术可用于实践本发明要求保护的方法。
例如优选用于癌症疗法的使用组合包括CD20+CD22抗体、CD74+CD20抗体、CD74+CD22抗体、CEACAM5(CEA)+CEACAM6(NCA)抗体、胰岛素样生长因子(ILGF)+CEACAM5抗体、EGP-1(例如，RS-7)+ILGF抗体、CEACAM5+EGFR抗体。此类抗体不仅需要组合使用，而且可以组合作为各种形式的融合蛋白，例如IgG、Fab、scFv等，如美国专利No.6,083,477；6,183,744和6,962,702和美国专利申请公开No.20030124058；20030219433；20040001825；20040202666；20040219156；20040219203；20040235065；20050002945；20050014207；20050025709；20050079184；20050169926；20050175582；20050249738；20060014245和20060034759所述，各自的实施例部分通过引用并入本文。
预靶向
双特异性或多特异性抗体也可用于预靶向技术。预靶向是最初开发用于解决直接靶向抗体的缓慢血液清除的多步骤过程，这种缓慢血液清除有助于对正常组织(例如，骨髓)的不期望的毒性。通过预靶向，放射性核素或其它治疗剂连接至在几分钟内从血液中清除的小递送分子(可靶向构建体)。首先施用预靶向双特异性或多特异性抗体，其具有用于可靶向构建体的结合位点以及靶抗原，使游离抗体从循环中清除，然后施用可靶向构建体。
预靶向方法公开于例如Goodwin等，美国专利No.4,863,713；Goodwin等，J.Nucl.Med.29：226,1988；Hnatowich等，J.Nucl.Med.28：1294,1987；Oehr等.J.Nucl.Med.29：728,1988；Klibanov等，J.Nucl.Med.29：1951,1988；Sinitsyn等，J.Nucl.Med.30:66，1989；Kalofonos等，J.Nucl.Med.31：1791,1990；Schechter等，J.Cancer 48：167,1991；Paganelli等，Cancer Res.51：5960,1991；Paganelli等，Nucl.Med.Commun.12：211,1991；美国专利No.US5,256,395；Stickney等，Cancer Res.51：6650，1991；Yuan等，Cancer Res.51：3119,1991；美国专利No.6,077,499；7,011,812；7,300,644；7,074,405；6,962,702；7,387,772；7,052,872；7，138，103；6,090,381；6,472,511；6,962,702；和6,962,702，其各自通过引用并入本文。
可通过以下方法提供治疗或诊断受试者的疾病或病症的预靶向方法：(1)向受试者施用双特异性抗体或抗体片段；(2)任选地向受试者施用清除组合物，并使组合物从循环中清除抗体；和(3)向受试者施用可靶向构建体，其含有一种或多种螯合的或化学结合的治疗剂或诊断剂，例如SN-38或P2PDox。预靶向技术可用作新辅助剂疗法中的一个步骤。
可定向构建体
在某些实施方案中，可以选择用一种或多种用于预靶向的治疗剂或诊断剂标记的可靶向构建体肽以结合至具有可靶向构建体肽的一个或多个结合位点和与疾病或病症相关的靶抗原一个或多个结合位点的双特异性抗体。双特异性抗体可以用于预靶向技术，其中可以首先向受试者施用抗体。可允许双特异性抗体结合靶抗原和未结合的抗体从循环中清除的足够时间。然后可以将可靶向构建体(例如，可标记的肽)施用于受试者，并使其与双特异性抗体结合并定位在患病细胞或组织。
此类可靶向构建体可以具有不同的结构，并且不仅被选择用于以高亲和力结合到可靶向构建体的抗体或片段的可用性，而且当在预靶向方法和双特异性抗体(bsAb)或多特异性抗体中使用时快速体内清除。疏水剂在引起强烈免疫应答方面最佳，而亲水剂优选用于快速体内清除。因此，建立了疏水性与亲水性之间的平衡。这可以部分地通过使用亲水性螯合剂来抵消许多有机部分的固有疏水性来实现。此外，可以选择具有相反溶液性质的可靶向构建体的亚基，例如含有氨基酸的肽，其中一些是疏水性的，一些是亲水性的。
可以使用具有少至两个氨基酸残基，优选2至10个残基的肽，并且还可以与其它部分(例如，螯合剂)偶联。接头应该是低分子量缀合物，优选具有小于50,000道尔顿，有利地小于约20,000道尔顿、10,000道尔顿或5,000道尔顿的分子量。更通常地，可靶向构建体肽将具有四个或更多个残基和一个或多个半抗原以结合例如双特异性抗体。示例性半抗原可以包括In-DTPA(铟-二亚乙基三胺五乙酸)或HSG(组胺琥珀酰甘氨酸)。可靶向构建体还可以包含一个或多个螯合部分，例如DOTA(1,4,7,10-四氮杂环十二烷1,4,7,10-四乙酸)、NOTA(1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸)、TETA(对溴乙酰氨基-苄基-四乙胺四乙酸)、NETA([2-(4,7-二羧甲基[1,4,7]三氮杂环壬烷-1-基-乙基]-2-羰甲基-氨基]乙酸)或其它已知的螯合部分。螯合部分可用于例如结合治疗性和或诊断性放射性核素、顺磁离子或造影剂。
可靶向构建体还可以在骨架结构中包含非天然氨基酸，例如D-氨基酸，以增加肽在体内的稳定性。在替代实施方案中，可以使用其它骨架结构，例如由非天然氨基酸或类肽构建的那些。
常规使用固相支持物和反复正交脱保护和偶联的标准技术，在自动化肽合成仪上方便地合成用作可靶向构建体的肽。有利地，用标准保护基团(例如，Boc基团)封闭肽中以后用于缀合螯合部分或其它试剂的游离氨基，而可以将N-末端残基乙酰化以提高血清稳定性。此类保护基是本领域技术人员公知的。参见Greene和Wuts Protective Groups inOrganic Synthesis，1999(John Wiley and Sons，N.Y.)。当肽被制备用于以后在双特异性抗体系统中使用时，它们有利地从树脂上裂解以产生相应的C-末端酰胺，以便抑制体内羧肽酶活性。
当采用用双特异性抗体预靶向时，抗体将含有由靶组织产生或与靶组织相关的抗原的第一结合位点和可靶向构建体上半抗原的第二结合位点。示例性半抗原包括但不限于HSG和In-DTPA。针对HSG半抗原产生的抗体是已知的(例如，679抗体)，并且可以容易地并入合适的双特异性抗体中(参见，例如美国专利No.6,962,702；7,138,103和7,300,644，关于实施例部分通过引用并入本文)。然而，与其结合的其它半抗原和抗体是本领域已知的并且可以使用，例如In-DTPA和734抗体(例如，美国专利No.7,534,431，实施例部分通过引用并入本文)。
DOCK-AND-LOCKTM(DNLTM)
在优选的实施方案中，二价或多价抗体形成为DOCK-AND-LOCKTM(DNLTM)复合物(参见，例如美国专利No.7,521,056；7,527,787；7,534,866；7,550,143和7,666,400，各自的实施例部分通过引用并入本文)。一般来说，该技术利用了在cAMP依赖性蛋白质激酶(PKA)的调节(R)亚基的二聚化和停靠结构域(DDD)序列与来自任意多种AKAP蛋白质的锚结构域(AD)序列之间发生的特异性和高亲和力结合相互作用的优点(Baillie等，FEBSLetters.2005；579：3264.Wong和Scott，Nat.Rev.Mol.Cell Biol.2004；5：959)。DDD和AD肽可以连接至任何蛋白、肽或其它分子。因为DDD序列自发地二聚化并结合到AD序列，所以该技术允许在可以连接至DDD或AD序列的任何选择的分子之间形成复合物。
尽管标准DNLTM复合物包含具有连接至一个AD连接分子的两个DDD连接分子的三聚体，但是复合物结构的变化允许形成二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体和其它多聚体。在一些实施方案中，DNLTM复合物可以包含结合相同的抗原决定簇或两种或更多种不同抗原的两种或更多种抗体、抗体片段或融合蛋白。DNLTM复合物还可以包含一种或多种其它效应物，例如蛋白质、肽、免疫调节剂、细胞因子、白细胞介素、干扰素、结合蛋白、肽配体、载体蛋白、毒素、核糖核酸酶例如豹蛙酶(onconase)，抑制性寡核苷酸例如siRNA、抗原或外来抗原、聚合物例如PEG、酶、治疗剂、激素、细胞毒性剂、抗血管生成剂、促凋亡剂或任何其它分子或聚集体。
在1968年首次从兔骨骼肌中分离出PKA，其在由第二信使cAMP与R亚基的结合触发的最佳研究的信号转导途径之一中起重要作用(Walsh等，J.Biol.Chem.1968；243：3763)。全酶的结构由通过R亚基保持为无活性形式的两个催化亚基组成(Taylor，J.Biol.Chem.1989；264：8443)。发现PKA的同工酶具有两种类型的R亚基(RI和RII)，并且每种类型具有α和β同种型(Scott，Pharmacol.Ther.1991；50：123)。因此，PKA调节亚基的四种同种型是RIα、RIβ、RIIα和RIIβ。R亚基仅作为稳定的二聚体分离，并且二聚化结构域已示出由RIIα的前44个氨基末端残基组成(Newlon等，Nat.Struct.Biol.1999；6：222)。如下所述，其它调节亚基的氨基酸序列的相似部分参与二聚化和停靠，每个位于调节亚基的N末端附近。cAMP与R亚基的结合导致用于广谱丝氨酸/苏氨酸激酶活性的活性催化亚基的释放，其经由其与AKAP的停靠通过PKA的区室化而朝向所选择的底物定向(Scott等，J.Biol.Chem.1990；265；21561)。
由于1984年表征出首个AKAP(微管相关蛋白-2)(Lohmann等，Proc.Natl.Acad.SciUSA.1984；81：6723)，超过50种定位于各种亚细胞位点(包括质膜、肌动蛋白细胞骨架、细胞核、线粒体和内质网)的AKAP已经在从酵母到人的物种范围中鉴定了多种结构(Wong和Scott，Nat.Rev.Mol.Cell Biol.2004；5：959)。AKAP针对PKA的AD是14-18个残基的两亲性螺旋(Carr等，J.Biol.Chem.1991；266：14188)。AD的氨基酸序列在每个AKAP中是非常不同的，针对RII二聚体报道的结合亲和力为2至90nM的范围(Alto等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2003；100：4445)。AKAP仅与二聚体R亚基结合。对于人RIα，AD结合由23个氨基末端残基形成的疏水表面(Colledge和Scott，Trends Cell Biol.1999；6：216)。因此，人RIIα的二聚化结构域和AKAP结合结构域都位于同一N-末端44个氨基酸序列内(Newlon等，Nat.Struct.Biol.1999；6：222；Newlon等，EMBO J.2001；20：1651)，其在本文中称为DDD。
我们已经开发出利用人PKA调节亚基的DDD和AKAP的AD作为一对极好的接头模块用于将任何两个实体(以下称为A和B)停靠到非共价复合物中的平台技术，可以通过将半胱氨酸残基引入DDD和AD中的关键位置从而促进二硫键的形成以进一步锁定到DNLTM复合物中。该方法的一般方法如下。通过将DDD序列与A的前体相连来构建实体A，产生下文称为a的第一组分。因为DDD序列将影响二聚体的自发形成，因此A将由a2组成。通过将AD序列与B的前体相连来构建实体B，产生下文称为b的第二组分。包含在a2中的DDD的二聚基序将产生用于结合b中包含的AD序列的停靠位点，从而促进a2和b容易地缔合以形成由a2b构成的二元、三聚复合物。该结合事件通过随后经二硫键共价地固定两个实体的反应而发生不可逆，其基于有效的局部浓度原则非常有效地发生，因为初始结合相互作用应当将反应性巯基置于DDD和AD两者上到接近(Chmura等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2001；98：8480)以位点特异性地连接。使用接头、适体模块和前体的各种组合，可以生产和使用多种不同化学计量的DNLTM构建体(参见，例如，美国专利No.7,550,143；7,521,056；7,534,866；7,527,787和7,666,400)。
通过连接远离两个前体的官能团的DDD和AD，预期此类位点特异性连接也保持两种前体的原始活性。该方法本质上是模块化的，并且潜在地可以应用于位点特异性和共价地连接多种物质，包括肽、蛋白质、抗体、抗体片段和具有广泛活性的其它效应物部分。利用下文实施例中描述的构建AD和DDD缀合效应物的融合蛋白方法，几乎任何蛋白质或肽均可掺入DNLTM构建体中。然而，该技术不是限制性的，可以利用其它缀合方法。
已知用于制备融合蛋白的多种方法，包括核酸合成、杂交和/或扩增以产生编码目标融合蛋白的合成的双链核酸。可以通过标准分子生物学技术将此类双链核酸插入用于融合蛋白产生的表达载体中(参见，例如Sambrook等，Molecular Cloning，A laboratorymanual，第2版，1989)。在此类优选实施方案中，AD和/或DDD部分可以连接至效应蛋白或肽的N末端或C末端。然而，技术人员将认识到，AD或DDD部分与效应物部分的连接位点可以根据效应物部分的化学性质和涉及其生理活性的效应物部分的一个或多个部分而变化。多种效应物部分的位点特异性附接可以使用本领域已知的技术进行，例如使用二价交联试剂和/或其它化学缀合技术。
替代DNLTM结构
在某些替代实施方案中，可使用替代的构建抗体或抗体片段形成DNLTM构建体，其中AD部分可连接在κ轻链的C末端(Ck)，而不是重链上的Fc的C末端。可替代地形成的DNLTM构建体可以如2012年6月1日提交的美国临时专利申请序列No.61/654,310、2012年6月20日提交的61/662,086、2012年7月19日提交的61/673,553和2012年8月13日提交61/682,531中所公开的制备，所述各专利申请的全部文本通过引用并入本文。轻链缀合的DNLTM构建体在体外表现出增强的Fc效应物功能活性，并改善了体内药代动力学、稳定性和抗淋巴瘤活性(Rossi等，2013，Bioconjug Chem 24：63-71)。
如在美国临时专利申请序列号61/654,310、61/662,086、61/673,553和61/682,531中所公开的，可以制备Ck-缀合的DNLTM构建体。简言之，通过重组工程产生Ck-AD2-IgG，由此将AD2肽融合至κ轻链的C末端。因为CK的天然C末端是半胱氨酸残基，其与CH1形成二硫桥，使用16个氨基酸残基的“铰链”接头将AD2与CK-VH1二硫桥间隔开。使用先前用于表达同源CH3-AD2-IgG模块的pdHL2载体构建用于Ck-AD2-IgG-维妥珠单抗和Ck-AD2-IgG-依帕珠单抗的哺乳动物表达载体。合成包含从Bam HI限制位点(在VK/CK内含子内)至CK内含子的3’的Xho I限制位点范围的pdHL2载体序列的2208个碱基对的核苷酸序列，其中对于铰链接头插入编码序列和对于CK在编码序列的3’端处同框插入AD2。将该合成序列通过Bam HI和Xho I限制性位点插入到维妥珠单抗和依帕珠单抗的IgG-pdHL2表达载体中。如针对CH3-AD2-IgG模块所述进行具有SpESFX-10的生产克隆的产生。通过在分批滚瓶培养中稳定转染的生产克隆产生Ck-AD2-IgG-维妥珠单抗和Ck-AD2-IgG-依帕珠单抗，并使用MabSelect(GEHealthcare)蛋白A亲和层析以一步法从上清液中纯化。
噬菌体展示
所要求保护的组合物和/或方法的某些实施方案可以涉及各种靶分子、细胞或组织的结合肽和/或肽模拟物。结合肽可以通过本领域已知的任何方法来鉴定，包括但不限于噬菌体展示技术。噬菌体展示的各种方法和用于产生不同肽群体的技术是本领域公知的。例如，美国专利No.5,223,409；5,622,699和6,068,829公开了用于制备噬菌体文库的方法。噬菌体展示技术涉及遗传操作噬菌体，使得小肽可以在其表面上表达(Smith和Scott，1985，Science 228：1315-1317；Smith和Scott，1993，Meth.Enzymol.21：228-257)。除了肽之外，更大的蛋白质结构域(例如，单链抗体)也可以展示在噬菌体颗粒的表面上(Arap等，1998，Science 279：377-380)。
可以通过淘选(panning)来分离针对给定器官、组织、细胞类型或靶分子具有选择性的靶向氨基酸序列(Pasqualini和Ruoslahti，1996，Nature 380：364-366；Pasqualini，1999，The Quart.J.Nucl.Med.43：159-162)。简言之，将含有推定的靶向肽的噬菌体文库施用于完整的生物体或分离的器官、组织、细胞类型或靶分子，并收集含有结合的噬菌体的样品。结合靶标的噬菌体可从靶器官、组织、细胞类型或靶分子洗脱，然后通过在宿主细菌中生长来扩增。
在某些实施方案中，噬菌体可在各轮淘选之间于宿主细菌中繁殖。不是被噬菌体裂解，而是细菌可以分泌展示特定插入物的噬菌体的多个拷贝。如果需要的话，扩增的噬菌体可以再次暴露于靶器官、组织、细胞类型或靶分子，并收集用于其它轮淘选。可以进行多轮淘选，直到获得一群选择性或特异性结合剂。可通过对对应于噬菌体基因组中的靶向肽插入物的DNA进行测序来测定肽的氨基酸序列。然后可以通过标准蛋白质化学技术(Arap等，1998，Smith等，1985)将所鉴定的靶向肽作为合成肽产生。
在一些实施方案中，可以使用消减方案来进一步减少背景噬菌体结合。减除的目的是从结合除目标靶标以外的靶标的文库中除去噬菌体。在替代实施方案中，噬菌体文库可以针对对照细胞、组织或器官预筛选。例如，可以在针对对照正常细胞系预筛选文库后鉴定肿瘤结合肽。减除后，可以针对目标分子、细胞、组织或器官筛选文库。减除方案的其它方法是已知的，并且可以用于所要求保护的方法的实践中，例如如美国专利No.5,840,841、5,705,610、5,670,312和5,492,807中所公开的。
纳米抗体
纳米抗体是大小为约12-15kDa(长度为约110个氨基酸)的单结构域抗体。纳米抗体可以选择性地结合靶抗原，如全长抗体，并且对抗原具有相似的亲和力。然而，由于它们的大小小得多，它们可以更好地穿透入实体瘤中。较小的大小还有助于纳米抗体的稳定性，其比全长抗体更耐pH和极端温度(Van Der Linden等，1999，Biochim Biophys Act 1431：37-46)。单结构域抗体最初是在发现骆驼(骆驼、羊驼、美洲鸵)拥有没有轻链的完全功能性抗体(例如，Hamsen等，2007，Appl Microbiol Biotechnol 77：13-22)之后开发的。重链抗体由单个可变结构域(VHH)和两个恒定结构域(CH2和CH3)组成。像抗体一样，纳米抗体可以被开发并用作多价和/或双特异性构建体。纳米抗体的人源化形式在靶向多种靶抗原(例如IL-6R、vWF、TNF、RSV、RANKL、IL-17A&F和IgE(例如，Ghent，Belgium))的商业开发中，在癌症中具有潜在的临床应用(例如，Saerens等，2008，Curr Opin Pharmacol 8：600-8；Muyldermans，2013，Ann Rev Biochem82：775-97)。
纳米抗体的血浆半衰期比全长抗体的血浆半衰期短，主要通过肾途径消除。因为它们缺乏Fc区，所以它们不显示补体依赖性细胞毒性。
可以通过用靶抗原免疫骆驼、美洲驼、羊驼或鲨鱼，然后分离mRNA，克隆到文库中并筛选抗原结合来产生纳米抗体。纳米抗体序列可以通过标准技术人源化(例如Jones等，1986，Nature 321：522，Riechmann等，1988，Nature 332：323，Verhoeyen等，1988，Science239：1534，Carter等，1992，Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 89：4285，Sandhu，1992，Crit.Rev.Biotech.12：437，Singer等，1993，J.Immun.150：2844)。人源化是相对直接的，这是因为骆驼科和人FR序列之间的高同源性。
在多种实施方案中，主题免疫缀合物可以包含用于将缀合的药物靶向递送至细胞、组织或器官的纳米抗体。使用的纳米抗体公开于例如美国专利No.7,807,162；7,939,277；8,188,223；8,217,140；8,372,398；8,557,965；8,623,361和8,629,244，各自的实施例部分通过引用并入本文)。
缀合方案
优选的缀合方案基于在中性或酸性pH下容易的硫醇-马来酰亚胺、硫醇-乙烯砜、硫醇-溴乙酰胺或硫醇-碘乙酰胺反应。这消除了对于(例如)当使用活性酯时必需的缀合的更高pH条件的需要。示例性缀合方案的进一步的细节在下面实施例部分中描述。
治疗性治疗
在另一方面，本发明涉及治疗受试者的方法，包括向受试者施用治疗有效量的如本文所述的治疗性缀合物。可以用本文所述的治疗性缀合物治疗的疾病包括但不限于B细胞恶性肿瘤(例如，非霍奇金氏淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、霍奇金氏淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、急性淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、毛细胞白血病)，使用例如针对另一CD22表位(hRFB4)的抗CD22抗体例如hLL2MAb(依帕珠单抗，参见美国专利No.6,183,744)，或针对其它B细胞抗原(例如CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD37、CD40、CD40L、CD52、CD74、CD80或HLA-DR)的抗体。其它疾病包括但不限于内胚层来源的消化系统上皮细胞腺癌，诸如乳腺癌和非小细胞肺癌的癌症以及其它癌、肉瘤、神经胶质瘤、骨髓性白血病等。特别地，有利地使用针对由恶性实体瘤或造血肿瘤产生的或与之相关的抗原(例如，癌胚抗原)的抗体，所述恶性实体瘤或造血肿瘤例如胃肠癌、胃癌、结肠癌、食道癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌、肝癌、前列腺癌、卵巢癌、睾丸癌、脑癌、骨癌或淋巴肿瘤、肉瘤或黑素瘤。此类治疗剂可以根据疾病状态和缀合物的耐受性给予一次或重复给予，并且还可以任选地与其它治疗形式(例如手术、外部辐射、放射免疫疗法、免疫疗法、化学疗法、反义疗法、干扰RNA疗法、基因疗法等组合使用。每种组合将适应肿瘤类型、阶段、患者状况和先前治疗以及由管理医师考虑的其它因素。
本文所用术语“受试者”是指任何动物(即，脊椎动物和无脊椎动物)，包括但不限于哺乳动物，包括人。该术语不旨在限于特定的年龄或性别。因此，成年和新生受试者以及胎儿，无论是男性还是女性，都由该术语涵盖。本文给出的剂量是针对人的，但是可以根据重量或平方米大小调整为其它哺乳动物以及儿童的大小。
在优选的实施方案中，包含抗EGP-1(抗TROP-2)抗体(例如hRS7MAb)的治疗性缀合物可用于治疗癌，例如食道癌、胰腺癌、肺癌、胃癌、结肠直肠癌、尿膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、肾癌和前列腺癌，如美国专利No.7,238,785；7,517,964和8,084,583中所公开的；其实施例部分通过引用并入本文。hRS7抗体是包含轻链互补决定区(CDR)序列CDR1(KASQDVSIAVA，SEQ ID NO：3)；CDR2(SASYRYT，SEQ ID NO：4)；和CDR3(QQHYITPLT，SEQ IDNO：5)和重链CDR序列CDR1(NYGMN，SEQ ID NO：6)；CDR2(WINTYTGEPTYTDDFKG，SEQ ID NO：7)和CDR3(GGFGSSYWYFDV，SEQ ID NO：8)的人源化抗体。
在另一个优选的实施方案中，包含抗CEACAM5抗体(例如，hMN-14，拉贝珠单抗(labretuzumab))和/或抗CEACAM6抗体(例如，hMN-3或hMN-15)的治疗性缀合物可用于治疗表达CEACAM5和/或CEACAM6的多种癌症中的任一种，如美国专利No.8,287,865；7,951,369；5,874,540；6,676,924和8,267,865中所公开的，各自的实施例部分通过引用并入本文。可以使用抗CEACAM5、抗CEACAM6或两者的组合治疗的实体瘤包括但不限于乳腺癌、肺癌、胰腺癌、食管癌、甲状腺癌、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、尿膀胱癌、口癌和胃癌。大多数癌症，包括胃肠道癌、呼吸道癌、泌尿生殖道癌和乳腺癌，表达CEACAM5，并且可以用本发明免疫缀合物治疗。hMN-14抗体是包含轻链可变区CDR序列CDR1(KASQDVGTSVA；SEQ ID NO：9)、CDR2(WTSTRHT；SEQ ID NO：10)和CDR3(QQYSLYRS；SEQ ID NO：11)和重链可变区CDR序列CDR1(TYWMS；SEQ ID NO：12)、CDR2(EIHPDSSTINYAPSLKD；SEQ ID NO：13)和CDR3(LYFGFPWFAY；SEQ ID NO：14)的人源化抗体。
hMN-3抗体是包含轻链可变区CDR序列CDR1(RSSQSIVHSNGNTYLE，SEQ ID NO：15)、CDR2(KVSNRFS，SEQ ID NO：16)和CDR3(FQGSHVPPT，SEQ ID NO：17)和重链CDR序列CDR1(NYGMN，SEQ ID NO：18)、CDR2(WINTYTGEPTYADDFKG，SEQ ID NO：19)和CDR3(KGWMDFNSSLDY，SEQ ID NO：20)的人源化抗体。
hMN-15抗体是包含轻链可变区CDR序列SASSRVSYIH(SEQ ID NO：21)；GTSTLAS(SEQID NO：22)；和QQWSYNPPT(SEQ ID NO：23)；和重链可变区CDR序列DYYMS(SEQ ID NO：24)；FIANKANGHTTDYSPSVKG(SEQ ID NO：25)和DMGIRWNFDV(S EQ ID NO：26)的人源化抗体。
在另一个优选的实施方案中，包含抗CD74抗体(例如，美国专利No.7,074,403；7,312,318；7,772,373；7,919,087和7,931,903中公开的hLL1，米拉妥珠单抗，其各自的实施例部分通过引用并入本文)的治疗性缀合物可以用于治疗表达CD74的多种癌症中的任一种，包括但不限于肾癌、肺癌、肠癌、胃癌、乳腺癌、前列腺癌或卵巢癌，以及几种血液癌症，例如多发性骨髓瘤、慢性淋巴细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病、非霍奇金氏淋巴瘤和霍奇金氏淋巴瘤。hLL1抗体是包含轻链CDR序列CDR1(RSSQSLVHRNGNTYLH；SEQ ID NO：27)、CDR2(TVSNRFS；SEQ ID NO：28)和CDR3(SQSSHVPPT；SEQ ID NO：29)和重链可变区CDR序列CDR1(NYGVN；SEQ ID NO：30)、CDR2(WINPNTGEPTFDDDFKG；SEQ ID NO：31)和CDR3(SRGKNEAWFAY；SEQ ID NO：32)的人源化抗体。
在另一个优选的实施方案中，包含抗CD22抗体(例如hLL2，依帕珠单抗，公开于美国专利No.5,789,554；6,183,744；6,187,287；6,306,393；7,074,403和7,641,901，各自的实施例部分通过引用并入本文，或嵌合或人源化RFB4抗体)的治疗性缀合物可用于治疗表达CD22的多种癌症中的任一种，包括但不限于B细胞淋巴瘤的无痛形式、B细胞淋巴瘤的侵袭性形式、慢性淋巴细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病、非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤或弥漫性B细胞淋巴瘤。hLL2抗体是包含轻链CDR序列CDR1(KSSQSVLYSANHKYLA，SEQ ID NO：33)、CDR2(WASTRES，SEQ ID NO：34)和CDR3(HQYLSSWTF，SEQ ID NO：35)和重链CDR序列CDR1(SYWLH，SEQ ID NO：36)、CDR2(YINPRNDYTEYNQNFKD，SEQ ID NO：37)和CDR3(RDITTFY，SEQ ID NO：38)的人源化抗体。
在优选的实施方案中，包含抗CSAp抗体(例如，hMu-9MAb)的治疗性缀合物可用于治疗结肠直肠癌以及胰腺癌和卵巢癌，如美国专利No.6,962,702；7,387,772；7,414,121；7,553,953；7,641,891和7,670,804中公开，各自的实施例部分通过引用并入本文。hMu-9抗体是包含轻链CDR序列CDR1(RSSQSIVHSNGNTYLE，SEQ ID NO：39)、CDR2(KVSNRFS，SEQ IDNO：40)和CDR3(FQGSRVPYT，SEQ ID NO：41)和重链可变CDR序列CDR1(EYVIT，SEQ ID NO：42)、CDR2(EIYPGSGSTSYNEKFK，SEQ ID NO：43)和CDR3(EDL，SEQ ID NO：44)的人源化抗体。
包含hPAM4 MAb的治疗性缀合物可用于治疗胰腺癌或其它实体瘤，如美国专利No.7,238,786和7,282,567中所公开的，各自的实施例部分通过引用并入本文。hPAM4抗体是包含轻链可变区CDR序列CDR1(SASSSVSSSYLY，SEQ ID NO：45)；CDR2(STSNLAS，SEQ IDNO：46)；和CDR3(HQWNRYPYT，SEQ ID NO：47)和重链CDR序列CDR1(SYVLH，SEQ ID NO：48)；CDR2(YINPYNDGTQYNEKFKG，SEQ ID NO：49)和CDR3(GFGGSYGFAY，SEQ ID NO：50)的人源化抗体。
在另一个优选的实施方案中，包含抗AFP MAb(例如，IMMU31)的治疗性缀合物可以用于使用人源化、嵌合和人抗体形式治疗肝细胞癌、生殖细胞肿瘤和其它产生AFP的肿瘤，如美国专利No.7,300,655中所公开的，其实施例部分通过引用并入本文。IMMU31抗体是包含重链CDR序列CDR1(SYVIH，SEQ ID NO：51)、CDR2(YIHPYNGGTKYNEKFKG，SEQ ID NO：52)和CDR3(SGGGDPFAY，SEQ ID NO：53)和轻链CDR1(KASQDINKYIG，SEQ ID NO：54)、CDR2(YTSALLP，SEQ ID NO：55)和CDR3(LQYDDLWT，SEQ ID NO：56)的人源化抗体。
在另一个优选的实施方案中，包含抗HLA-DR MAb(例如，hL243)的治疗性缀合物可用于治疗淋巴瘤、白血病、皮肤癌、食管癌、胃癌、结肠癌、直肠癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、尿膀胱癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、睾丸癌、肾癌、肝癌、黑素瘤或其它产生HLA-DR的肿瘤，如美国专利No.7,612,180中所公开，其实施例部分通过引用并入本文。hL243抗体是包含重链CDR序列CDR1(NYGMN，SEQ ID NO：57)、CDR2(WINTYTREPTYADDFKG，SEQ ID NO：58)和CDR3(DITAVVPTGFDY，SEQ ID NO：59)及轻链CDR序列CDR1(RASENIYSNLA，SEQ ID NO：60)、CDR2(AASNLAD，SEQ ID NO：61)和CDR3(QHFWTTPWA，SEQ ID NO：62)的人源化抗体。
在另一个优选的实施方案中，包含抗CD20 MAb(例如，维妥珠单抗(hA20)、1F5、阿托珠单抗(GA101)或利妥昔单抗)的治疗性缀合物可用于治疗淋巴瘤、白血病、伯基特淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、小淋巴细胞淋巴瘤、弥漫性B细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病，如美国专利No.7,435,803或8,287,864中所公开的，其各自的实施例部分通过引用并入本文。hA20(维妥珠单抗)抗体是包含轻链CDR序列CDRL1(R ASSSVSYIH，SEQ ID NO：63)、CDRL2(ATSNLAS，SEQ ID NO：64)和CDRL3(QQWTSNPPT，SEQ ID NO：65)和重链CDR序列CD RH1(SYNMH，SEQ ID NO：66)、CDRH2(AIYPGNGDTSYNQKFK G，SEQ ID NO：67)和CDRH3(STYYGGDWYFDV，SEQ ID NO：68)的人源化抗体。
在另一个优选的实施方案中，包含抗CD 19MAb(例如，hA19)的治疗性缀合物可用于治疗B细胞相关淋巴瘤和白血病，例如非霍奇金氏淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病或急性淋巴细胞性白血病，如美国专利No.7,109,304、7,462,352、7,902,338、8,147,831和8,337,840中所公开的，各自的实施例部分通过引用并入本文。hA19抗体是包含轻链CDR序列CDR1KASQSVDYDGDSYLN(SEQ ID NO：69)、CDR2 DASNLVS(SEQ ID NO：70)和CDR3 QQSTEDPWT(SEQID NO：71)和重链CDR序列CDR1 SYWMN(SEQ ID NO：72)、CDR2QIWPGDGDTNYNGKFKG(SEQ IDNO：73)和CDR3RETTTVGRYYYAMDY(SEQ ID NO：74)的人源化抗体。
包含抗腱生蛋白抗体的治疗性缀合物可用于治疗造血和实体瘤，并且包含抗腱生蛋白抗体的缀合物可用于治疗实体瘤，优选脑癌如胶质母细胞瘤。
优选地，用于治疗人疾病的抗体是人或人源化(CDR移植)形式的抗体；但也可以使用鼠和嵌合形式的抗体。相同物种的IgG分子作为递送剂是最优选的，以使免疫应答最小化。当考虑重复治疗时，这是特别重要的。对于人而言，人或人源化IgG抗体不太可能产生来自患者的抗IgG免疫应答。抗体例如hLL1和hLL2在结合到靶细胞上的内化抗原后快速内化，这意味着携带的化学治疗药物也快速内化到细胞中。然而，具有较慢内化速率的抗体也可用于实现选择性疗法。
本领域普通技术人员将认识到，包含与抗体或抗体片段缀合的喜树碱或蒽环的本发明的免疫缀合物可以单独使用或与一种或多种其它治疗剂(例如第二抗体、第二抗体片段、第二免疫缀合物、放射性核素、毒素、药物、化学治疗剂、放射疗法、趋化因子、细胞因子、免疫调节剂、酶、激素、寡核苷酸、RNAi或siRNA)组合使用。此类另外的治疗剂可以单独施用，与本发明抗体-药物免疫缀合物组合或连接至本发明抗体-药物免疫缀合物。
在某些实施方案中，与本发明的免疫缀合物组合使用的治疗剂可以包含一种或多种同位素。用于治疗患病组织的放射性同位素包括但不限于111In、177Lu、212Bi、213Bi、211At、62Cu、67Cu、90Y、125I、131I、32P、33P、47Sc、l11Ag、67Ga、142Pr、153Sm、161Tb、166Dy、166Ho、186Re、188Re、189Re、212Pb、223Ra、225Ac、59Fe、75Se、77As、89Sr、99Mo、105Rh、109Pd、143Pr、149Pm、169Er、194Ir、198Au、199Au、227Th和211Pb。治疗性放射性核素优选具有20至6,000keV范围的衰变能，对于俄歇(Auger)发射体优选为60至200keV的范围，对于β发射体为100-2,500keV，且对于α发射体为4,000-6,000keV。有用的发射β粒子的核素的最大衰变能优选为20-5,000keV，更优选为100-4,000keV，且最优选为500-2,500keV。还优选基本上与发射俄歇的颗粒一起衰变的放射性核素。例如，Co-58、Ga-67、Br-80m、Tc-99m、Rh-103m、Pt-109、In-111、Sb-119、I-125、Ho-161、Os-189m和Ir-192。有用的发射β粒子的核素的衰变能优选<1,000keV，更优选<100keV，且最优选<70keV。还优选随着α-颗粒的产生而实质上衰变的放射性核素。这种放射性核素包括但不限于：Dy-152、At-211、Bi-212、Ra-223、Rn-219、Po-215、Bi-211、Ac-225、Fr-221、At-217、Bi-213、Th-227和Fm-255。有用的发射α粒子的放射性核素的衰变能优选为2,000-10,000keV，更优选为3,000-8,000keV，且最优选为4,000-7,000keV。使用的其它潜在放射性同位素包括11C、13N、15O、75Br、198Au、224Ac、126I、133I、77Br、113mIn、95Ru、97Ru、103Ru、105Ru、107Hg、203Hg、121mTe、122mTe、125mTe、165Tm、167Tm、168Tm、197Pt、109Pd、105Rh、142Pr、143Pr、161Tb、166Ho、199Au、57Co、58Co、51Cr、59Fe、75Se、201T1、225Ac、76Br、169Yb等。
放射性核素和其它金属可以例如使用与抗体或缀合物连接的螯合基团递送。大环螯合物例如NOTA、DOTA和TETA与各种金属和放射性金属一起使用，最特别是分别与镓、钇和铜的放射性核素一起使用。此类通过根据目标金属调节环的大小可使此类金属-螯合剂络合物非常稳定。可以使用其它环型螯合物，例如用于络合223Ra的大环聚醚。
与本文所述的免疫缀合物组合使用的治疗剂还包括例如化学治疗药物，例如长春花生物碱、蒽环、表鬼臼毒素、紫杉烷、抗代谢物、酪氨酸激酶抑制剂、烷化剂、抗生素、Cox-2抑制剂、抗有丝分裂剂、抗血管生成剂和促细胞凋亡剂，特别是多柔比星、甲氨蝶呤、紫杉醇、其它喜树碱和来自这些和其它类别的抗癌剂的其它抗癌剂等。其它癌症化学治疗药物包括氮芥、烷基磺酸盐、亚硝基脲、三氮烯、叶酸类似物、嘧啶类似物、嘌呤类似物、铂配位络合物、激素等。合适的化学治疗剂描述于REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES，第19版(Mack Publishing Co.1995)和GOODMAN AND GILMAN'S THE PHARMACOLOGICAL BASIS OFTHERAPEUTICS，第7版(MacMillan Publishing Co.1985)以及这些出版物的修订版中。其它合适的化学治疗剂，例如实验性药物，是本领域技术人员已知的。
示例性的使用药物包括但不限于5-氟尿嘧啶、阿法替尼、阿普利啶(阿普立啶)、阿扎利平(azaribine)、阿那曲唑、蒽环、阿西替尼、AVL-101、AVL-291、苯达莫司汀、博来霉素、硼替佐米、伯舒替尼、苔藓抑素-1、白消安、刺孢霉素(calicheamycin)、喜树碱(camptothecin)、卡铂、10-羟基喜树碱、卡莫司汀、西乐葆、苯丁酸氮芥、顺铂(CDDP)、Cox-2抑制剂、伊立替康(CPT-11)、SN-38、卡铂、克拉屈滨、喜树碱(camptothecans)、克里唑替尼、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、达沙替尼、地尼西宝(dinaciclib)、多西他赛、放线菌素、柔红霉素、多柔比星、2-吡咯啉并多柔比星(2P-DOX)、氰基吗啉代多柔比星、多柔比星葡糖苷酸、表柔比星葡糖苷酸、埃罗替尼、雌莫司汀、表鬼臼毒素、埃罗替尼、恩替诺特、雌激素受体结合剂、依托泊苷(VP16)、依托泊苷葡糖苷酸、磷酸依托泊苷、依西美坦、芬戈莫德、氟尿苷(FUdR)、3',5'-O-二油酰基-FudR(FUdR-dO)、氟达拉滨、氟他胺、法呢基-蛋白转移酶抑制剂、夫拉平度(flavopiridol)、福他替尼(fostamatinib)、ganetespib、GDC-0834、GS-1101、吉非替尼、吉西他滨、羟基脲、依鲁替尼(ibrutinib)、伊达比星、艾德力布(idelalisib)、异环磷酰胺、伊马替尼、L-天冬酰胺酶、拉帕替尼、来那度胺(lenolidamide)、甲酰四氢叶酸、LFM-A13、洛莫司汀、甲二氯二乙胺、美法仑、巯基嘌呤、6-巯基嘌呤、甲氨蝶呤、米托蒽醌、光神霉素、丝裂霉素、米托坦、诺维本、来那替尼、尼罗替尼、亚硝基脲、奥拉帕尼(olaparib)、普卡霉素(plicomycin)、丙卡巴肼、紫杉醇、PCI-32765、喷司他丁、PSI-341、雷洛昔芬、司莫司汀、索拉非尼、链脲霉素、SU11248、舒尼替尼、他莫昔芬、替莫唑胺(DTIC的水性形式)、反铂(transplatinum)、沙利度胺、硫鸟嘌呤、塞替派、替尼泊苷、拓扑替康、尿嘧啶氮芥、瓦他拉尼、长春瑞滨、长春碱、长春新碱、长春花生物碱和ZD1839。此类药剂可以是本文所述缀合物的一部分，或者可以在缀合物之前、同时或之后与所述缀合物组合施用。或者，本领域已知的一种或多种治疗性裸抗体可与所述缀合物组合使用。示例性治疗性裸抗体如上所述。
可以与免疫缀合物一起使用的治疗剂还可以包含与靶向部分缀合的毒素。在这方面可以使用的毒素包括蓖麻毒素、相思豆毒素、核糖核酸酶(RNA酶)、DNA酶I、葡萄球菌肠毒素-A、美洲商陆抗病毒蛋白(pokeweed antiviral protein)、白树毒素、白喉毒素、假单胞菌(Pseudomonas)外毒素和假单胞菌内毒素。(参见，例如Pastan等，Cell(1986)，47：641和Sharkey和Goldenberg，CA Cancer J Clin.2006年7月-8月；56(4)：226-43。)适用于本文的另外的毒素是本领域技术人员已知的并且公开于US 6,077,499中。
另一类治疗剂可以包含一种或多种免疫调节剂。使用的免疫调节剂可以选自细胞因子、干细胞生长因子、淋巴毒素、造血因子、集落刺激因子(CSF)、干扰素(IFN)、促红细胞生成素、血小板生成素及其组合。特别有用的是淋巴毒素例如肿瘤坏死因子(TNF)、造血因子例如白细胞介素(IL)、集落刺激因子例如粒细胞集落刺激因子(G-CSF)或粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，干扰素，例如干扰素-α、-β、-γ或-λ，和干细胞生长因子，例如称为“S1因子”的干细胞生长因子。包括在细胞因子中的是生长激素，例如人生长激素、N-甲硫氨酰基人生长激素和牛生长激素；甲状旁腺激素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素例如促卵泡激素(FSH)；促甲状腺激素(TSH)和促黄体生成激素(LH)；肝生长因子；前列腺素；成纤维细胞生长因子；催乳素；胎盘催乳素；OB蛋白；肿瘤坏死因子-α和-β；麻疹抑制物质；小鼠促性腺激素相关肽；抑制素；激活素；血管内皮生长因子；整合素；血小板生成素(TPO)；神经生长因子例如NGF-β；血小板生长因子；转化生长因子(TGF)例如TGF-α和TGF-β；胰岛素样生长因子-I和-II；红细胞生成素(EPO)；骨诱导因子；干扰素例如干扰素-α、-β、-γ和-λ；集落刺激因子(CSF)，例如巨噬细胞-CSF(M-CSF)；白介素(IL)例如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-21、IL-25、LIF；试剂盒配体或FLT-3；血管抑素；血小板反应蛋白；内皮抑制素；肿瘤坏死因子和淋巴毒素(LT)。本文所用术语细胞因子包括来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白质和天然序列细胞因子的生物活性等效物。
使用的趋化因子包括RANTES、MCAF、MIP1-α、MIP1-β和IP-10。
配制和施用
缀合物的合适的施用途径包括但不限于经口、肠胃外、皮下、直肠、经粘膜、肠内施用、肌肉内、髓内、鞘内、直接心室内、静脉内、玻璃体内、腹膜内、鼻内或眼内注射。优选的施用途径是肠胃外。或者，可以以局部而不是全身方式施用化合物，例如通过将化合物直接注射到实体瘤中。
可根据已知方法配制免疫缀合物以制备药学上有用的组合物，其中免疫缀合物与药学上合适的赋形剂以混合物组合。无菌磷酸盐缓冲盐水是药学上合适的赋形剂的一个实例。其它合适的赋形剂是本领域技术人员公知的。参见例如Ansel等，PHARMACEUTICALDOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS，第5版(Lea&Febiger1990)和Gennaro(编著)，REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES，第18版(Mack Publishing Company 1990)及其修订版。
在优选的实施方案中，使用选自由以下组成的组的缓冲液在古德生物缓冲液(pH6-7)中配制免疫缀合物：N-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙磺酸(ACES)；N-(2-乙酰氨基)亚氨基二乙酸(ADA)；N,N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸(BES)；4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸(HEPES)；2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)；3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)；3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸(MOPSO)；和哌嗪-N,N'-双(2-乙磺酸)[Pipes]。更优选的缓冲剂是MES或MOPS，优选浓度范围为20至100mM，更优选约25mM。最优选的是25mM MES，pH 6.5。制剂还可包含作为赋形剂的25mM海藻糖和0.01％v/v聚山梨醇酯80，由于添加的赋形剂，最终缓冲液浓度改为22.25mM。优选的储存方法是作为缀合物的冻干制剂，在-20℃至2℃的温度范围内储存，最优选的储存温度为2℃至8℃。
免疫缀合物可以配制用于经由例如团注注射、慢速输注或连续输注来静脉内施用。优选地，本发明的抗体在小于约4小时的时间内、更优选在小于约3小时的时间内输注。例如，前25-50mg可以在30分钟(优选甚至15分钟)内输注，并且其余的在接下来的2-3小时内输注。用于注射的制剂可以以单位剂型存在，例如在安瓿或多剂量容器中，加入防腐剂。组合物可以采取在油性或水性媒介物中的悬液、溶液或乳液的形式，并且可以含有配制剂，例如助悬剂、稳定剂和/或分散剂。或者，活性成分可以是粉末形式，用于在使用前用合适的媒介物(例如，无菌无热原水)构成。
可以采用另外的药学方法来控制治疗性缀合物的作用持续时间。控制释放制剂可以通过使用聚合物复合或吸附免疫缀合物来制备。例如，生物相容性聚合物包括聚(乙烯-共-乙酸乙烯酯)基质和硬脂酸二聚物和癸二酸的聚酐共聚物的基质。Sherwood等，Bio/Technology 10：1446(1992)。免疫缀合物从这种基质释放的速率取决于免疫缀合物的分子量、基质内免疫缀合物的量和分散颗粒的大小。Saltzman等，Biophys.55：163(1989)；Sherwood等，同上。其它固体剂型描述于Ansel等，PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS ANDDRUG DELIVERY SYSTEMS，第5版(Lea&Febiger 1990)和Gennaro(编著)，REMINGTON'SPHARMACEUTICAL SCIENCES，第18版(Mack Publishing Company 1990)及其修订版。
通常，向人施用免疫缀合物的剂量将根据诸如患者的年龄、体重、身高、性别、一般医学状况和先前的医疗史等因素而不同。可能期望为接受者提供作为单次静脉内输注的约1mg/kg至24mg/kg范围内的免疫缀合物剂量，尽管也可根据情况施用较低或较高剂量。对于70kg患者，1-20mg/kg的剂量例如为70-1,400mg，或者对于1.7米患者为41-824mg/m2。剂量可以根据需要重复，例如，每周一次，持续4-10周，每周一次持续8周，或每周一次持续4周。根据维持治疗中的需要，它也可以更低频率给予，例如每隔一周，持续几个月，或每月或每季度，持续数月。优选的剂量可以包括但不限于1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg、10mg/kg、11mg/kg、12mg/kg、13mg/kg、14mg/kg、15mg/kg、16mg/kg、17mg/kg、18mg/kg、19mg/kg、20mg/kg、22mg/kg和24mg/kg。可以使用在1至24mg/kg范围内的任何量。所述剂量优选多次施用，每周一次或两次。可以使用4周、更优选8周、更优选16周或更长的最小剂量时间表。施用时间表可以包括以选自由以下组成的组的周期每周施用一次或两次：(i)每周；(ii)每隔一周；(iii)治疗一周，然后休息两、三或四周；(iv)治疗两周，然后休息一、二、三或四周；(v)治疗三周，然后休息一、二、三、四或五周；(vi)治疗四周，然后休息一、二、三、四或五周；(vii)治疗五周，然后休息一、二、三、四或五周；和(viii)每月。该循环可以重复4、6、8、10、12、16或20次或更多次。
或者，免疫缀合物可以每2或3周一次剂量施用，重复总共至少3次剂量。或者，每周两次，持续4-6周。如果剂量降低至约200-300mg/m2(对于1.7米患者，每剂量为340mg，或对于70kg患者，为4.9mg/kg)，可以每周施用一次或甚至两次，持续4至10周。或者，可以减少剂量时间表，即每2或3周，持续2至3个月。然而，已经确定甚至更高的剂量，例如每周一次或每2-3周一次的12mg/kg可以通过缓慢静脉内输注施用重复给药周期。给药时间表可以任选地以其它间隔重复，并且可以通过各种肠胃外途径给予剂量，适当调整剂量和方案。
在优选的实施方案中，免疫缀合物用于治疗癌症。癌症的实例包括但不限于癌、淋巴瘤、成胶质细胞瘤、黑素瘤、肉瘤和白血病、骨髓瘤或淋巴样恶性肿瘤。此类癌症的更具体的实例在下面提到并且包括：鳞状细胞癌(例如上皮鳞状细胞癌)、尤因肉瘤(Ewingsarcoma)、维尔姆斯氏瘤(Wilms tumor)、星形细胞瘤、包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺的腺癌和肺鳞癌在内的肺癌、腹膜癌、包括胃肠癌在内的胃部癌或胃癌、胰腺癌、多形性成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、尿膀胱癌、肝细胞瘤、肝细胞癌、神经内分泌肿瘤、髓样甲状腺癌、分化型甲状腺癌、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾脏癌或肾癌、前列腺癌、外阴癌、肛门癌、阴茎癌以及头颈癌。术语“癌症”包括原发性恶性肿瘤细胞或肿瘤(例如，其细胞没有迁移到受试者体内除原始恶性肿瘤或肿瘤的部位之外的部位的肿瘤)和继发性恶性肿瘤细胞或肿瘤(例如，由转移引起的那些，恶性细胞或肿瘤细胞迁移到与原始肿瘤的位点不同的次级位点)。
癌症或恶性肿瘤的其它实例包括但不限于：急性儿童成淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性骨髓性白血病、肾上腺皮质癌、成人(原发性)肝细胞癌、成人(原发性)肝癌、成人急性淋巴细胞性白血病、成人急性骨髓性白血病、成人霍奇金氏淋巴瘤、成人淋巴细胞性白血病、成人非霍奇金氏淋巴瘤、成人原发性肝癌、成人软组织肉瘤、AIDS相关淋巴瘤、AIDS相关性恶性肿瘤、肛门癌、星形细胞瘤、胆管癌、尿膀胱癌、骨癌、脑干神经胶质瘤、脑肿瘤、乳腺癌、肾盂和输尿管癌、中枢神经系统(原发性)淋巴瘤、中枢神经系统淋巴瘤、小脑星形细胞瘤、脑星形细胞瘤、子宫颈癌、儿童(原发性)肝细胞癌、儿童(原发性)肝癌、儿童急性淋巴细胞性白血病、儿童急性骨髓性白血病、儿童脑干神经胶质瘤、儿童小脑星形细胞瘤、儿童脑星形细胞瘤、儿童颅外生殖细胞肿瘤、儿童霍奇金氏病、儿童霍奇金氏淋巴瘤、儿童下丘脑和视觉通路神经胶质瘤、儿童淋巴细胞性白血病、儿童成神经管细胞瘤、儿童非霍奇金氏淋巴瘤、儿童松果体和幕上原始神经外胚层肿瘤、儿童原发性肝癌、儿童横纹肌肉瘤、儿童软组织肉瘤、儿童视觉通路和下丘脑神经胶质瘤、慢性淋巴细胞性白血病、慢性骨髓性白血病、结肠癌、皮肤T细胞淋巴瘤、内分泌胰岛细胞癌、子宫内膜癌、室管膜瘤、上皮癌、食管癌、尤因氏肉瘤(Ewing's Sarcoma)和相关肿瘤、外分泌胰腺癌、颅外生殖细胞肿瘤、肝外生殖细胞肿瘤、肝外胆汁导管癌、眼癌、女性乳腺癌、戈谢病(Gaucher's Disease)、胆囊癌、胃癌、胃肠道类癌瘤、胃肠道肿瘤、生殖细胞肿瘤、妊娠滋养层细胞肿瘤、毛细胞白血病、头颈癌、肝细胞癌、霍奇金氏淋巴瘤、高丙种球蛋白血症、下咽癌、肠癌、眼内黑素瘤、胰岛细胞癌、胰岛细胞胰腺癌、卡波西肉瘤(Kaposi'sSarcoma)、肾癌、喉癌、唇和口腔癌、肝癌、肺癌、淋巴增殖性障碍、巨球蛋白血症、男性乳腺癌、恶性间皮瘤、恶性胸腺瘤、成神经管细胞瘤、黑素瘤、间皮瘤、转移性潜隐原发性鳞状颈癌、转移性原发性鳞状颈癌、转移性鳞状颈癌、多发性骨髓瘤、多发性骨髓瘤/浆细胞瘤、骨髓增生异常综合征、骨髓性白血病、骨髓性白血病、骨髓增生性病症、鼻腔和鼻旁窦癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、非黑素瘤皮肤癌、非小细胞肺癌、潜隐原发性转移性鳞状颈癌、口咽癌、骨-/恶性纤维肉瘤、骨肉瘤/恶性纤维组织细胞瘤、骨肉瘤/骨的恶性纤维组织细胞瘤、卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞肿瘤、卵巢低恶性潜在肿瘤、胰腺癌、副蛋白血症、真性红细胞增多症、甲状旁腺癌、阴茎癌、嗜铬细胞瘤、垂体肿瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、原发性肝癌、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌、肾盂和输尿管癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、结节性肉芽肿、塞扎里综合征(Sezary Syndrome)、皮肤癌、小细胞肺癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状颈癌、胃癌、幕上原始神经外胚层和松果体肿瘤、T细胞淋巴瘤、睾丸癌、胸腺瘤、甲状腺癌、肾盂和输尿管的过渡细胞癌、过渡性肾盂和输尿管癌、滋养层细胞肿瘤、输尿管和肾盂细胞癌、尿道癌、子宫癌、子宫肉瘤、阴道癌、视觉途径和下丘脑神经胶质瘤、外阴癌、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、维尔姆斯氏瘤以及位于上述器官系统中除了肿瘤外的任何其它过度增殖性疾病。
本文描述和要求保护的方法和组合物可用于治疗恶性或恶变前病状，并预防进展至肿瘤或恶性状态，包括但不限于上述那些病症。此类用途在已知或怀疑先前发展成肿瘤或癌症的病状中指示，特别是其中已经发生由增生、化生或最特别是发育不良组成的非肿瘤性细胞生长的病状(对于这种异常生长病状的综述，参见Robbins和Angell，BasicPathology，第2版，W.B.Saunders Co.，Philadelphia，第68-79页(1976))。
发育不良通常是癌症的先兆，并且主要在上皮中发现。它是非赘生性细胞生长的最无序形式，涉及个体细胞均一性的丧失和细胞的结构定向。发育不良特征性地发生在存在慢性刺激或炎症的地方。可以治疗的发育不良病症包括但不限于无汗性外胚层发育不良、异侧(anterofacial)发育不良、窒息性胸部发育不良、心房-手指(atriodigital)发育不良、支气管肺发育不良、脑发育不良、颈部发育不良、软骨外胚层发育不良、锁骨颅骨发育异常、先天性外胚层发育异常、颅骨骨干(craniodiaphysial)发育不良、颅骨腕跗(craniocarpotarsal)发育不良、颅干骺端(craniometaphysial)发育不良、釉质发育不良、骨干发育不良、外胚层发育不良、釉质发育不良、脑视神经发育不良、偏侧骨骺发育不良(dysplasia epiphysialis hemimelia)、多发性骨骺发育不良(dysplasia epiphysialismultiplex)、点状骨骺发育不良(dysplasia epiphysialis punctata)、上皮发育不良、面-指(趾)生殖器(faciogigitogenital)发育不良、家族性颌骨纤维性发育不良、家族性白色皱襞发育不良(familial white folded dysplasia)、纤维肌性发育不良、骨纤维性发育不良、旺盛骨性(florid osseous)发育不良、遗传性肾-视网膜发育不良、出汗性外胚层发育不良、少汗性外胚层发育不良、淋巴细胞性胸腺发育不良、乳房发育不良、下额骨颜面发育不良、干骺端发育不良、蒙底尼(Mondini)发育不良、单骨性纤维发育不良、粘膜上皮发育不良、多发性骨骺发育不良、眼-耳-脊椎(oculoauriculovertebral)发育不良、眼-牙-指(趾)(oculodentodigital)发育不良、眼椎骨(oculovertebral)发育不良、牙原性发育不良、眼下颚(opthalmomandibulomelic)发育不良、根尖周牙骨质发育不良、多骨性纤维性发育不良、假性软骨发育不良性脊椎骨骺发育不良(pseudoachondroplasticspondyloepiphysial dysplasia)、视网膜发育不良、隔-视神经(septo-optic)发育不良，脊椎骨骺(spondyloepiphysial)发育不良和心室挠骨(ventriculoradial)发育不良。
可以治疗的其它肿瘤前病症包括但不限于良性增生性病症(例如，良性肿瘤、纤维囊性病状、组织肥大、肠息肉或腺瘤和食道发育不良)、白斑病、角化病、博文氏病(Bowen'sdisease)、农民皮肤(Farmer's Skin)、日光性唇炎和日光性角化病。
在优选的实施方案中，本发明的方法用于抑制癌症，特别是上面列出的癌症的生长、进展和/或转移。
另外的过度增殖性疾病、病症和/或病状包括但不限于恶性肿瘤和相关病症的进展和/或转移，所述恶性肿瘤和相关病症例如白血病(包括急性白血病；例如急性淋巴细胞性白血病、急性骨髓性白血病[包括成髓细胞、早幼粒细胞、骨髓单核细胞、单核细胞和红白血病])和慢性白血病(例如，慢性骨髓性[粒细胞性]白血病和慢性淋巴细胞性白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤(例如，霍奇金氏病和非霍奇金氏病)、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、重链疾病和实体瘤，所述实体瘤包括但不限于肉瘤和癌例如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮内淋巴肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管源性(bronchogenic)癌、肾细胞癌、肝细胞癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、维尔姆斯氏瘤、宫颈癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、尿膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤(emangioblastoma)、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、黑素瘤、成神经细胞瘤和视网膜母细胞瘤。
三阴性乳腺癌(TNBC)
在具体实施方案中，本发明涉及ADC免疫缀合物用于三阴性乳腺癌的新辅助剂治疗的用途。TNBC，如该术语所指，是指没有雌激素和孕酮受体(ER，PR)以及HER2(ERBB2)表达的乳腺癌。这种类型占所有侵袭性乳腺癌的约15-20％，并且是高度恶性的。与其它乳腺癌相比，TNBC患者显示出更高的远处复发和死亡率(Millikan等，Breast Cancer Res Treat2008；109：123-139)，其中转移性疾病患者的中值存活期仅为13个月(Kassam等，ClinBreast Cancer 2009；9：29-33)。在流行率方面，TNBC在年轻患者、BRCA1突变携带者以及在特定族群(例如，非裔美国人和西班牙裔女性)中更常见(Bauer等，Cancer 2007,109：1721-1728；Sorlie等，Proc Natl Acad Sci U S A2003,100：8418-8423；26-28；Foulkes等，NEngl J Med 2010,363：1938-1948)。这表明种系遗传背景在TNBC的转录和分化中起作用。在组织学上，大多数TNBC肿瘤是侵袭性导管癌，并且具有更高的组织学分级、更大的肿瘤大小，并且在诊断时最经常是淋巴结阳性(Dent等，Clin Cancer Res 2007,13：4429-4434)。预后与转移行为相关，不同的亚型显示不同的转移模式。乳腺癌通常转移到骨，但是基底样疾病主要受到向脑、肺和远处淋巴结的转移控制(Kennecke等，J Clin Oncol 2010,28：3271-3277；Sihto等，Breast Cancer Res 2011，13：R87)。非基底形式显示类似的转移模式，但具有更频繁的肝转移。
Lehmann等(Lehmann等，J Clin Invest 2011,121(7)：2750-2767)提出了TNBC的六种特异性分子亚型：两种基底样BL1和BL2，它们是最普遍的，并且因为与基底样内源亚型相似，以及由此类细胞表达的基因的表达，例如细胞角蛋白5、6或17，而接受该名称；第三免疫调节亚型；间充质(M)和间充质干细胞样(MSL)亚型；第六种是鲁米那雄激素受体(LAR)。
基底样肿瘤显示TP53的高增殖和频繁突变，并且与BRCA1突变状态相关。认为此类肿瘤通过缺乏与在BRCA突变携带者中失活的BRCA的同源重组而具有失调的DNA修复(Rehman等，Nat Rev Clin Oncol 2010,7：718-724)。已发现BL1亚系优先响应顺铂，其通过鸟嘌呤交联的形成引起DNA损伤。几个临床试验已经评估并继续评估铂剂在基底样TNBC中的作用(Ademuyiwa等，J Onc 2013；2013：219869)。LAR型可以对进行临床评价的抗雄激素受体治疗有响应。
因为目前没有靶向疗法，TNBC的治疗(类似于典型乳腺癌)涉及手术、放射疗法和化学疗法。最具活性的化学治疗剂是蒽环和紫杉烷类。七项新辅助剂临床试验的元分析显示，在接受蒽环和紫杉烷类治疗的36％的患者中实现了病理完全响应(乳房和淋巴结中没有侵袭性乳腺癌)(von Minckwitz等.J Clin Oncol 2012，30(15)：1796-1804)。TNBC中新辅助剂疗法的各种试验的概述已经表明，以各种组合给予的诸如多柔比星、环磷酰胺、多柔比星、紫杉烷、表柔比星、多西他赛、紫杉醇、贝伐单抗、吉西他滨、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、卡培他滨、长春新碱、顺铂和卡铂的此类常见癌药在涉及超过100名患者的试验中导致pCR率为28-52％(Engebraaten等，Am J Pathol 2013年10月；183(4)：1064-1074)。尽管含铂方案在乳腺癌中是有活性的，但是利用这种方案的TNBC结果并非同样优越(Engebraaten等Am JPathol2013年10月；183(4)：1064-1074)。在表柔比星、环磷酰胺和多西他赛方案中加入卡铂未示出在新辅助剂情形中加入卡铂的优点(Alba等，Breast Cancer Res Treat2012年11月；136(2)：487-493)。
一般来说，TNBC患者对化学疗法的响应比对ER阳性HER2阴性肿瘤患者的响应更强，但矛盾的是他们具有较差的结果(Carey等，Clin Cancer Res.2007年4月15日；13(8)：2329 -2334)。TNBC中pCR的速率可以是20％或更高(Engebraaten等，Am J Pathol2013年10月；183(4)：1064-1074)，并且那些应答具有良好的长期结果，但是大多数TNBC患者没有实现pCR，并且因此比患ER+疾病的患者更积极地进展(Carey等，Clin Cancer Res.2007年4月15日；13(8)：2329-2334；Liedtke等，J Clin Oncol.2008年3月10日；26(8)：1275-1281)。对于未实现pCR的TNBC患者，在五年的时间内复发率为40％至50％之间(von Minckwitz等，JClin Oncol 2012,30(15)：1796-1804；Liedtke等，J Clin Oncol.2008年3月10日；26(8)：1275-1281)，证实了不良结果，尽管TNBC患者可能具有更高的化学敏感性。这强调了新型治疗剂在TNBC中实现更高比率的pCR的关键未满足的需求。
还在TNBC患者中评价生物治疗剂，例如PARP抑制剂和血管内皮生长因子(VEGF)抑制剂(Schneider等，J Clin Oncol 2005；23(8)：1782-1790；von Minckwitz等，N Eng JMed2012；366(4)：299-309)。实际上，因为TNBC与BRCA相关的乳腺癌具有临床相似性，所以PARP抑制剂是治疗TNBC的有吸引力的候选物，但是迄今为止还未得到证实。然而，具有与拓扑异构酶I抑制剂类似的作用机制的IMMU-132(Cardillo等，Clin Cancer Res 2011；17：3157-3169)已显示作为转移性TNBC患者以及在TNBC细胞系中单一疗法的临床消退(Cardillo等，Clin Cancer Res 2011；17：3157-3169和下文实施例)。
在TNBC新辅助剂治疗中的IMMU-132
某些实施方案涉及IMMU-132(一种包含连接至抗TROP-2hRS7抗体的SN-38喜树碱型药物的多个拷贝的ADC)在TNBC中的新辅助剂用途。SN-38是CPT-11(伊立替康)的活性代谢物，其不是乳腺癌中的标准药物，但可在TNBC中提供独特的治疗益处。已经假定TNBC在其表型上类似于表达BRCA1突变的癌症，因此可以响应于在此类BRCA1患者中有效的药剂(例如，铂和烷化剂)以及拓扑异构酶I抑制剂(例如喜树碱类如拓扑替康和伊立替康)，这是由于与BRCA相关的DNA修复机制的缺陷。这些通过在双链DNA中诱导断裂而起作用，影响DNA修复并导致细胞死亡(Hastak等，Cancer Res 2010；70：7970-7980)。类似的作用机制，抑制聚(腺苷二磷酸核糖)聚合酶(PARP)，其在DNA修复中也起重要作用，如BRCA，但是PARP抑制剂引起对一条DNA链的损伤，由于BRCA突变和PARP抑制，其不能通过同源重组得以修复。
我们已经发现包含与选择性靶向在TNBC(和其它上皮癌)中表达增强的蛋白(TROP-2)的人源化单克隆抗体(mAb)缀合的SN-38(拓扑异构酶I抑制剂)的免疫缀合物IMMU-132具有通过PARP抑制使DNA链断裂的类似效果(Cardillo等，Clin Cancer Res2011；17：3157-3169)。因此，该免疫缀合物可以在TNBC的联合疗法中代替具有高毒性的铂和其它DNA损伤药物(例如顺铂，卡铂)。IMMU-132在具有转移性实体癌(包括转移性TNBC)患者中的当前结果表明其比母体伊立替康药物更好的耐受，因为其具有明显的高治疗指数，比给予伊立替康时具有更易控制的毒性。尽管不知道伊立替康和拓扑异构酶I抑制剂在乳腺癌(包括TNBC)中是有活性的，但是目前使用IMMU-132进行的TNBC试验表明其在转移性TNBC中是有效的(Starodub等，J Clin Oncol 32：5s，2014(补充；摘要3032)，这可能是因为与给予伊立替康时相比，更高比例的该DNA损伤药物通过载体抗体与TNBC细胞上的TROP-2蛋白的选择性结合而靶向肿瘤位点(基于在下面的实施例中讨论的临床前发现)。事实上，我们的临床前研究已证实IMMU-132在TNBC异种移植模型中的活性。IMMU-132的其它属性是其涉及内化抗体(RS7)，因此选择性地将毒性药物SN-38掺入靶向癌细胞中。此外，作为IMMU-132的靶标的TROP-2是由许多上皮癌以比正常细胞更高的量表达的钙信号转导蛋白，并且已经在一些癌症中显示为增加的恶性肿瘤的预后指标。目前IMMU-132在多种晚期实体癌以及TNBC中的经验证实了下面描述的并且部分公开的临床前人癌症异种移植物研究结果(Cardillo等，Clin Cancer Res2011；17：3157 -3169)。
TROP-2(IMMU-132免疫缀合物的靶抗原)是在多种人癌症(包括肺癌、乳腺癌、结肠直肠癌、胰腺癌、前列腺癌和卵巢癌)上表达的36-kDa细胞表面糖蛋白(参见，例如Lipinski等，Proc Natl Acad Sci USA 1981；78：5147-5150；Stein等，Cancer Res 1990；50：1330-1336；Alberti等，Hybridoma 1992；11：539-545；Wang等，Mol Cancer Ther2008；7：280-285；Cubas等，Biochim Biophys Acta 2009；1796：309-314)。已经显示它用作钙信号转导物(Ripani等，Int J Cancer 1998；76：671-676)并且与细胞迁移和非贴壁依赖性生长相关(Hastak等，Cancer Res 2010；70：7970-7980)。重要的是，TROP-2的高表达与更具攻击性的疾病和不良预后相关，使其成为癌症疗法的理想靶标(Shimada等，Cancer Sci 2005；96：668-675；Wang等，Mol Cancer Ther2008；7：280-285；Cubas等，Biochim Biophys Acta2009；1796：309-314)。
SN-38由于其在水性介质中的不溶性而不能原样使用。伊立替康对活性药物SN-38的生物转化是非常低效的，并且也是患者可变的。为了使SN-38直接可达靶位点，用抗TROP-2(hRS7)抗体制备SN-38的抗体-药物缀合物(ADC)。检查了许多接头，并且选择一个接头“CL2A”作为最佳执行接头(Cardillo等，Clin Cancer Res 2011；17：3157-3169；Moon等JMed Chem 2008.51,6916 -6926；Govindan等，Clin Cancer Res 2009；15：6052-6061；Govindan等，Mol Cancer Ther2013年6月；12(6)：968-978)。SN-38衍生物CL2A-SN-38的缀合物表明缀合位点，并且药物断裂位点示于图1中。已描述了CL2A-SN-38与轻度减少的hRS7的缀合(Moon等，J Med Chem 2008.51,6916-6926；Govindan等，Clin Cancer Res 2009；15：6052-6061)。TROP-2+细胞系的抗原结合被保留在ADC中，其在体外源性许多TROP-2+细胞系中也表现出与游离药物相似的单位数纳摩尔效价。通过质谱测量确定平均药物-抗体取代比(DAR)为7.6，并且通过吸光度测量证实了相同。未结合的游离药物的水平<5％，在临床级制剂的规格限制内。
在cGMP条件和CL2A-SN-38组分和ADC两者的QA监督下，以200克规模的抗体上进行了ADC的大规模制备。迄今为止已经制备了八种此类缀合物制剂(8×200克)，其中产品以2-8℃作为冻干制剂以100-mg等分试样储存。制剂对储存的稳定性现已记录了3年。
在人血清中，在37℃下在体外，已显示hRS7-CL2A-SN-38在约24小时内释放50％的游离药物。与具有不同的、高度稳定的接头的缀合物相比，CL2A接头导致游离药物的高得多的生物利用度。这是因为游离药物的释放不取决于抗体缀合物的内化和随后的细胞加工，这也使得其在肿瘤表面上的抗原密度低的情况下是有吸引力的。
病理完全响应(pCR)作为TNBC中的替代终点
pCR已经成为用于TNBC患者的新辅助剂疗法试验的公认的终点(Bardia&Baselga，Clin Cancer Res 2013年12月1日；19(23)：6360-6370；Ademuyiwa等，J One 2013；2013：219869；Food and Drug Administration.Draft Guidance for Industry：PathologicComplete Response in Neoadjuvant Treatment of High-Risk Early-Stage BreastCancer：Use as a Endpoint to Support Accelerated Approval。2012年5月)。pCR在FDA指导文件中定义为“在新辅助剂全身疗法完成后，切除的乳腺标本和所有取样的同侧淋巴结的苏木精和曙红评估中没有任何残留侵入性癌症(即，在目前的AJCC分段系统中的ypT0ypN0)“(Food and Drug Administration.Draft Guidance for Industry：Pathologic Complete Response in Neoadjuvant Treatment of High-Risk Early-Stage Breast Cancer：Use as an Endpoint to Support Accelerated Approval。2012年5月)(斜体强调增加)。尽管这允许药物在与转移性疾病的情形中相比较的少数量的患者中进行快速测试，手术效果的评估可能导致在新辅助剂疗法实施后约6个月内或更早的基于手术结果的加速(临时)药物批准，但仍然需要跟踪以确定无事件生存(EFS)率和总生存(OS)率以证实促成最终药物批准的临床益处。加速批准的这条途径意味着药物可以更早地被普遍使用，增加其在多种临床研究和情形中的应用，这可以为面对TNBC手术的女性提供非常快速的益处。如果IMMU-132的毒性曲线确实比解决类似作用机制的铂和PARP药物更好，那么添加该新型治疗剂可能引起TNBC疗法的新辅助剂(以及也许辅助和转移情形)的范例变化。此外，由于IMMU-132的靶标TROP-2也在非三阴性(TN)肿瘤中以高患病率表达，因此该试剂在这些其它乳腺癌类型中也可显示独特的活性。在转移性和早期TNBC的治疗中的有前景的结果将鼓励在非TN癌患者中研究该试剂。
在一项元分析中综述的TNBC的新辅助剂试验中，只有3项试验报道了长期无病生存和OS，并且这些对于接受基于铂的新辅助剂疗法的患者而言极好(Petrelli等，BreastCancer Res Treat 2014；144：223-232)。在乳腺和腋窝中实现pCR的TNBC患者(ypT0N0)比具有残留疾病的患者具有更好的无事件存活。在涉及11,955位患者的12个国际试验的另一个分析中，TNBC中的pCR证实为改善的EFS和OS的替代终点(Cortazar等，Lancet 2014年7月12日；384(9938)：164-172)。就EFS而言，例如在3岁时，pCR患者显示90％的比率，相比之下，非pCR TNBC患者显示为约60％(Cortazar等，Lancet2014年7月12日；384(9938)：164-172)。
总之，新辅助剂化学疗法已经成为TNBC患者的响应亚组的标准治疗，尽管事实上没有建立特定的治疗方案作为优选；仅使用紫杉烷类和蒽环似乎是标准方式。在先前全身治疗失败的转移性TNBC患者中添加示出良好活性的新的靶向治疗剂可以在新辅助剂情形中最佳和最快速地评价，其中将其添加到常规组合疗法中，并与没有该候选治疗剂的相同疗法进行比较。在比较试验中测试新药物可以帮助建立标准疗法，并且还可以允许将响应类型扩展到其它亚组，并且将pCR响应率提高到超过目前对患者具有高水平毒性的水平。普遍认为蒽环与紫杉烷类和环磷酰胺组合在TNBC中提供高比率的pCR(von Minckwitz&Fontanella，Breast 2013年8月；22增刊2：S149-S151)，这具有高毒性。也正在研究添加铂剂，例如顺铂和卡铂。下面的研究评估了将作为拓扑异构酶I抑制剂的IMMU-132添加到TAC方案中，因为当与TAC组合时，卡铂具有增加的毒性。该方法应导致更多的乳腺保护、更耐受的治疗和增加的治愈率。
试剂盒
多种实施方案可涉及含有适于治疗患者的组分的试剂盒。示例性试剂盒可以含有至少一种本文所述的缀合的抗体或其它靶向部分。如果含有用于施用的组分的组合物未配制用于通过消化道递送，例如通过经口递送，则可以包括能够通过一些其它途径递送试剂盒组分的装置。用于诸如肠胃外递送的应用的一种类型的装置是用于将组合物注射到受试者体内的注射器。也可以使用吸入装置。
试剂盒组分可以包装在一起或分离成两个或更多个容器。在一些实施方案中，容器可以是含有适于重构的组合物的无菌冻干制剂的小瓶。试剂盒还可以包含一种或多种适于重构和/或稀释其它试剂的缓冲液。可以使用的其它容器包括但不限于袋、托盘、盒、管等。试剂盒组分可以被包装和无菌地保持在容器内。可以包括的其它组分是针对使用试剂盒的人的使用说明书。
本申请涉及以下各项：
1.一种用于癌症的新辅助剂治疗的方法，其包括：
a)向患有癌症的受试者施用抗体-药物缀合物(ADC)，其中所述药物选自由蒽环和喜树碱组成的组；和
b)用选自由以下组成的组的标准抗癌疗法治疗所述受试者：手术、放射疗法、化学疗法和免疫疗法，其中在所述标准抗癌疗法之前施用所述ADC。
2.如项1所述的方法，其中所述喜树碱是SN-38。
3.如项1所述的方法，其中所述蒽环是前-2-吡咯啉并多柔比星(P2PDox)。
4.如项1所述的方法，其中所述ADC包含选自由抗体、抗原结合抗体片段和靶向肽组成的组的抗体部分。
5.如项4所述的方法，其中所述抗体部分结合至选自由以下组成的组的肿瘤相关抗原：碳酸酐酶IX、CCCL19、CCCL21、CSAp、CD1、CD1a、CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD11A、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、IGF-1R、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD29、CD30、CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD45、CD46、CD47、CD52、CD54、CD55、CD59、CD64、CD66a-e、CD67、CD70、CD70L、CD74、CD79a、CD80、CD83、CD95、CD126、CD133、CD138、CD147、CD154、AFP、PSMA、CEACAM5、CEACAM-6、c-MET、B7、纤连蛋白的ED-B、因子H、FHL-1、Flt-3、叶酸受体、GRO-β、组蛋白H2B、组蛋白H3、组蛋白H4、HMGB-1、缺氧诱导因子(HIF)、HM1.24、胰岛素样生长因子-1(ILGF-1)、IFN-γ、IFN-α、IFN-β、IL-2、IL-4R、IL-6R、IL-13R、IL-15R、IL-17R、IL-18R、IL-6、IL-8、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-23、IL-25、IL-10、LIV-1、MAGE、mCRP、MCP-1、MIP-1A、MIP-1B、MIF、D-DT(D-多巴色素互变异构酶)、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5ac、MUC16、PAM4抗原、NCA-95、NCA-90、Ia、HM1.24、EGP-1(TROP-2)、EGP-2、HLA-DR、腱生蛋白、Le(y)、RANTES、T101、TAC、Tn抗原、汤姆森-弗里德里希抗原、肿瘤坏死抗原、TNF-α、TRAIL受体(R1和R2)、VEGFR、EGFR、PlGF、补体因子C3、C3a、C3b、C5a、C5和原癌基因产物。
6.如项4所述的方法，其中所述抗体部分选自由以下组成的组：hR1(抗IGF-1R)、hPAM4(抗MUC5ac)、hA20(抗CD20)、GA101(抗CD20)、hA19(抗CD19)、hIMMU-31(抗AFP)、hLL1(抗CD74)、hLL2(依帕珠单抗，抗CD22)、hRFB4(抗CD22)、hMu-9(抗CSAp)、hL243(抗HLA-DR)、hL243 IgG4P(抗HLA-DR)、hMN-14(抗CEACAM5)、hMN-15(抗CEACAM6)、hRS7(抗TROP-2)、hMN-3(抗CEACAM6)、Ab124(抗CXCR4)和Ab125(抗CXCR4)。
7.如项4所述的方法，其中所述抗体片段选自由以下组成的组：F(ab')2、F(ab)2、Fab、Fab'和scFv片段。
8.如项4所述的方法，其中所述抗体或抗原结合抗体片段包含选自由IgG1、IgG2、IgG3和IgG4组成的组的人恒定区。
9.如项4所述的方法，其中所述抗体是非G1m1(nG1m1)抗体。
10.如项4所述的方法，其中所述抗体具有G1m3重链同种异型。
11.如项4所述的方法，其中所述抗体具有nG1m1,2重链无效同种异型。
12.如项4所述的方法，其中所述抗体具有Km3轻链同种异型。
13.如项3所述的方法，其中所述P2PDox通过交联剂连接至抗体、抗体片段或肽，所述交联剂选自由SMCC酰肼、氨氧基、苯酰肼和4-(肼基磺酰基)苯甲酸组成的组。
14.如项3所述的方法，其中所述P2PDox包含马来酰亚胺部分，并且通过所述马来酰亚胺与半胱氨酸残基的反应连接至所述抗体、抗体片段或肽。
15.如项3所述的方法，其中所述P2PDox与所述抗体或抗原结合抗体片段形成分子内交联。
16.如项15所述的方法，其中所述分子内交联在体内使所述缀合物稳定并防止游离药物在循环中释放。
17.如项1所述的方法，其中所述ADC包含将所述药物连接至所述抗体的接头。
18.如项17所述的方法，其中所述药物是SN-38并且所述接头是CL2A。
19.如项1所述的方法，其还包括向所述受试者施用至少一种治疗剂。
20.如项19所述的方法，其中所述治疗剂选自由以下组成的组：药物、前药、毒素、酶、酪氨酸激酶抑制剂、鞘氨醇抑制剂、免疫调节剂、细胞因子、激素、第二抗体、第二抗体片段、免疫缀合物、放射性核素、反义寡核苷酸、RNAi、抗血管生成剂、促凋亡剂和细胞毒性剂。
21.如项20所述的方法，其中所述药物选自由以下组成的组：5-氟尿嘧啶、阿法替尼、阿普立啶、阿扎利平、阿那曲唑、蒽环、阿西替尼、AVL-101、AVL-291、苯达莫司汀、博来霉素、硼替佐米、伯舒替尼、苔藓抑素-1、白消安、刺孢霉素、喜树碱、卡铂、10-羟基喜树碱、卡莫司汀、西乐葆、苯丁酸氮芥、顺铂(CDDP)、Cox-2抑制剂、伊立替康(CPT-11)、SN-38、卡铂、克拉屈滨、喜树碱、克唑替尼、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、达沙替尼、地尼西宝、多西他赛、放线菌素、柔红霉素、多柔比星、2-吡咯啉并多柔比星(2P-DOX)、氰基吗啉代多柔比星、多柔比星葡糖苷酸、表柔比星葡糖苷酸、埃罗替尼、雌莫司汀、表鬼臼毒素、埃罗替尼、恩替诺特、雌激素受体结合剂、依托泊苷(VP16)、依托泊苷葡糖苷酸、磷酸依托泊苷、依西美坦、芬戈莫德、氟尿苷(FUdR)、3',5'-O-二油酰基-FudR(FUdR-dO)、氟达拉滨、氟他胺、法呢基-蛋白转移酶抑制剂、夫拉平度、福他替尼、ganetespib、GDC-0834、GS-1101、吉非替尼、吉西他滨、羟基脲、依鲁替尼、伊达比星、艾德力布、异环磷酰胺、伊马替尼、L-天冬酰胺酶、拉帕替尼、来那度胺、甲酰四氢叶酸、LFM-A13、洛莫司汀、甲二氯二乙胺、美法仑、巯基嘌呤、6-巯基嘌呤、甲氨蝶呤、米托蒽醌、光神霉素、丝裂霉素、米托坦、诺维本、来那替尼、尼罗替尼、亚硝基脲、奥拉帕尼、普卡霉素、丙卡巴肼、紫杉醇、PCI-32765、喷司他汀、PSI-341、雷洛昔芬、司莫司汀、索拉非尼、链脲霉素、SU11248、舒尼替尼、他莫昔芬、替莫唑胺(DTIC的水性形式)、反铂、沙利度胺、硫鸟嘌呤、塞替派、替尼泊苷、拓扑替康、尿嘧啶氮芥、瓦他拉尼、长春瑞滨、长春花碱、长春新碱、长春花生物碱和ZD1839。
22.如项20所述的方法，其中所述毒素连接至抗体或抗原结合抗体片段，并且选自由以下组成的组：蓖麻毒素、相思豆毒素、α毒素、皂草素、核糖核酸酶(RNA酶)，例如豹蛙酶、DNA酶I、葡萄球菌肠毒素-A、美洲商陆抗病毒蛋白、白树毒素、白喉毒素、假单胞菌外毒素和假单胞菌内毒素。
23.如项20所述的方法，其中所述放射性核素连接至抗体或抗原结合抗体片段，并且选自由以下组成的组：111In、111At、177Lu、211Bi、212Bi、213Bi、211At、62Cu、67Cu、90Y、125I、131I、133I、32P、33P、47Sc、111Ag、67Ga、153Sm、161Tb、152Dy、166Dy、161Ho、166Ho、186Re、188Re、189Re、211Pb、212Pb、223Ra、225Ac、77As、89Sr、99Mo、105Rh、149Pm、169Er、194Ir、58Co、80mBr、99mTc、103mRh、109Pt、119Sb、189mOs、192Ir219Rn、215Po、221Fr、225Fm、11C、13N、15O、75Br、198Au、199Au、224Ac、77Br、113mIn、95Ru、97Ru、103Ru、105Ru、107Hg、203Hg、121mTe、122mTe、125mTe、227Th、165Tm、167Tm、168Tm、197Pt、109Pd、142Pr、143Pr、161Tb、57Co、58Co、51Cr、59Fe、75Se、201Tl、76Br和169Yb。
24.如项20所述的方法，其中所述免疫调节剂选自由以下组成的组：细胞因子、趋化因子、干细胞生长因子、淋巴毒素、造血因子、集落刺激因子(CSF)、干扰素、促红细胞生成素、血小板生成素、肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素(IL)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和称为“S1因子”的干细胞生长因子。
25.如项24所述的方法，其中所述细胞因子选自由以下组成的组：人生长激素、N-甲硫氨酰基人生长激素、牛生长激素、甲状旁腺激素、甲状腺素、胰岛素、胰岛素原、松弛素、松弛素原、促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)、促黄体生成激素(LH)、肝生长因子、前列腺素、成纤维细胞生长因子、催乳素、胎盘催乳素、OB蛋白、肿瘤坏死因子-α、肿瘤坏死因子-β、苗勒氏管抑制物、小鼠促性腺激素相关肽、抑制素、激活素、血管内皮生长因子、整联蛋白、血小板生成素(TPO)、NGF-β、血小板生长因子、TGF-α、TGF-β、胰岛素样生长因子-I、胰岛素样生长因子-II、红细胞生成素(EPO)、骨诱导因子、干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ、巨噬细胞-CSF(M-CSF)、IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-21、IL-25、LIF、FLT-3、血管抑素、血小板反应蛋白、内皮抑制素、肿瘤坏死因子和淋巴毒素。
26.如项24所述的方法，其中所述趋化因子选自由以下组成的组：RANTES、MCAF、MIP1-α、MIP1-β和IP-10。
27.如项20所述的方法，其中所述抗血管生成剂选自由以下组成的组：MIF、D-DT和HMGB-1。
28.如项1所述的方法，其中所述癌症是实体瘤或造血癌。
29.如项1所述的方法，其中所述癌症选自由以下组成的组：B细胞淋巴瘤、B细胞白血病、霍奇金氏病、T细胞白血病、T细胞淋巴瘤、骨髓瘤、结肠癌、胃癌、食管癌、髓样甲状腺癌、肾癌、乳腺癌、肺癌、胰腺癌、尿膀胱癌、卵巢癌、子宫癌、子宫颈癌、睾丸癌、前列腺癌、肝癌、皮肤癌、骨癌、脑癌、直肠癌和黑素瘤。
30.如项29所述的方法，其中所述B细胞白血病或B细胞淋巴瘤选自由以下组成的组：无痛形式的B细胞淋巴瘤、侵袭性形式的B细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病、毛细胞白血病、非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、弥漫性B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤和多发性骨髓瘤。
31.如项1所述的方法，其中所述癌症是转移性的。
32.如项1所述的方法，其中所述癌症选自由以下组成的组：三阴性乳腺癌(TNBC)、转移性结肠癌、转移性非小细胞肺癌(NSCLC)、转移性胰腺癌、转移性肾细胞癌、转移性胃癌、转移性前列腺癌和转移性小细胞肺癌。
33.如项1所述的方法，其中所述癌症对其它疗法是难治的，但响应于使用新辅助剂ADC的治疗。
34.如项1所述的方法，其中所述患者在用所述新辅助剂ADC治疗之前未响应至少一种其它疗法。
实施例
通过以下实施例说明本发明的多种实施方案，但不限制其范围。
实施例1.CL2A-SN-38免疫缀合物的制备
在用于合成CL2A-SN-38的优选反应方案中，在室温下将EEDQ(0.382g)加入到市售Fmoc-Lys(MMT)-OH(0.943g)和对氨基苄醇(0.190g)在二氯甲烷(10mL)的混合物中，并搅拌4小时。萃取后处理，然后进行快速色谱，得到1.051g呈白色泡沫的物质。电喷雾质谱显示在m/e 745.8(M+H)和m/e 780.3(M+Cl-)处的峰，与结构一致。将Lys(MMT)-PABOH中间体(0.93g)溶于二乙胺(10mL)中并搅拌2小时。除去溶剂后，在己烷中洗涤残余物，得到0.6g呈无色沉淀的中间体(通过HPLC，为91.6％纯)。HPLC滞留时间：2.06分钟。电喷雾质谱显示在m/e 523.8(M+H)、m/e 546.2(M+Na)和m/e 522.5(M-H)处的峰。
使用二氯甲烷(10mL)中的EEDQ将该粗制中间体(0.565g)与市售O-(2-叠氮基乙基)-O'-(N-二甘醇酰基(diglycolyl)-2-氨基乙基)七乙二醇(‘PEG-N3’，0.627g)偶联。溶剂去除和快速色谱得到0.99g叠氮基-PEG-Lys(MMT)-PABOH中间体(呈淡黄色油状物；87％产率)。电喷雾质谱示出在m/e 1061.3(M+H)、m/e 1082.7(M+Na)和m/e1058.8(M-H)处的峰，与结构一致。在氩气下使中间体3(0.92g)与10-O-TBDMS-SN-38-20-O-氯甲酸酯在二氯甲烷(10mL)中反应10分钟。通过快速色谱纯化混合物，得到0.944g呈淡黄色油状物的叠氮基-PEG-Lys(MMT)-PAB-O-SN-38-TBDMS(产率＝68％)。向在二氯甲烷(10mL)中的该中间体(0.94g)中加入TBAF(1M于THF中，0.885mL)和乙酸(0.085mL)在二氯甲烷(3mL)中的混合物，然后搅拌10分钟。用二氯甲烷(100mL)稀释混合物并用0.25M柠檬酸钠和盐水洗涤。除去溶剂得到0.835g呈黄色油状产物的叠氮基-PEG-Lys(MMT)-PAB-O-SN-38(纯度99％)。电喷雾质谱显示在m/e1478(M+H)、m/e 1500.6(M+Na)、m/e 1476.5(M-H)、m/e 1590.5(M+TFA)处的峰，与结构一致。
在CuBr(0.0083g)、DIEA(0.01mL)和三苯基膦(0.015g)的存在下，使该叠氮基衍生的SN-38中间体(0.803g)与4-(N-马来酰亚胺基甲基)-N-(2-丙炔基)环己烷-1-甲酰胺(“MCC-炔”；0.233g)在二氯甲烷(10mL)中反应18小时。萃取后处理，包括用0.1M EDTA(10mL)洗涤和进行快速色谱，得到0.891g呈黄色泡沫状的MCC-PEG-Lys(MMT)-PAB-O-SN-38中间体(产率＝93％)。电喷雾质谱示出在m/e 1753.3(M+H)、m/e 1751.6(M-H)、1864.5(M+TFA)处的峰，与结构一致。最后，用二氯乙酸(0.3mL)和苯甲醚(0.03mL)在二氯甲烷(3mL)中的混合物脱保护，然后用醚沉淀，得到0.18g(97％产率)的呈浅黄色粉末的CL2A-SN-38终产物。电喷雾质谱示出在m/e1480.7(M+H)、1478.5(M-H)处的峰，与结构一致。
与抗体的缀合
将抗CEACAM5人源化MAb(hMN-14)、抗CD22人源化MAb(hLL2)、抗CD20人源化MAb(hA20)、抗EGP-1人源化MAb(hRS7)和抗粘蛋白人源化MAb(hPAM4)缀合至CL2A-SN-38以制备免疫缀合物。在磷酸盐缓冲液中在pH 7-7.4的范围内用三(2-羧乙基)膦(TCEP)将每种抗体温和还原，将pH调节至6.5，并使用5-10％v/v的DMSO作为共溶剂，使其与约10倍摩尔过量的CL2A-SN-38反应，并在环境温度下孵育20分钟。用相对于抗体10倍摩尔过量的作为水溶液使用的N-乙基马来酰亚胺使任何过量的硫醇封端。
通过切向流过滤(TFF)，使用20-30透析过滤体积的最终配制缓冲液(25mM MES，pH6.5)来纯化缀合物。该方法避免了在尺寸排阻柱和疏水柱上的繁琐的顺序纯化，从而使数百克的缀合物以容易的方式纯化。通过在366nm处的吸光度测定产物的SN-38，并与标准值相关联。从280nm处的吸光度推导蛋白质浓度，校正该波长下SN-38吸光度的溢出。由这些测定SN-38/MAb取代率(DAR)。将纯化的缀合物作为冻干制剂储存在玻璃小瓶中，在真空下加盖并储存在-20℃冷冻箱中。药物-抗体比例(DAR)通常在5至7范围内(即，每个抗体部分5至7个药物部分)。
纯化上述ADC并用2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)(pH 6.5)进行缓冲液交换，并进一步用海藻糖(25mM终浓度)和聚山梨酯80(0.01％v/v终浓度)配制，作为赋形剂添加的结果，最终缓冲液浓度变为22.25mM。将配制的缀合物冻干并储存在密封的小瓶中，储存在2℃-8℃。冻干的免疫缀合物在储存条件下是稳定的，并保持其生理活性。
实施例2.用IMMU-132治疗的各种实体瘤中的临床前研究
体外表征-使用TROP-2-阳性人前列腺癌细胞系PC-3作为靶标，以评估与未缀合的hRS7 IgG相比，通过IMMU-132进行的抗原结合的可能变化。如在三个单独的情况测量的，在IMMU-132与未缀合的hRS7 IgG的结合之间没有显著差异(KD-值分别为0.658±0.140nM相对于0.564±0.055nM)。
使用低密度FcRn生物传感器芯片通过表面等离子体共振(BIACore)分析测定人新生儿受体(FcRn)结合。使用每种测试试剂的三个单独组的五个稀释的三个结合运行证实SN-38与hRS7 IgG的缀合不显著影响其对FcRn的结合亲和力(KD-值分别为92.4±5.7nM和191.9±47.6nM；P＝0.07)。
TROP-2在广泛的人实体瘤细胞系(包括TNBC细胞系(例如，MDA-MB-231和MDA-MB-268))中表达。表达水平在肿瘤类型之间和类型内不同(表2)。例如，与MDA-MB-231相比，由MDA-MB-468表达的TROP-2约为10倍，但与HER2+SK-BR-3肿瘤系相比没有差异。所有这些肿瘤类型对细胞毒性效应IMMU-132敏感。引起50％生长抑制所需的浓度(IC50值)在低纳摩尔范围内。在这些测定中，游离SN-38倾向于比ADC更具细胞毒性，但是这最可能是由于呈游离形式的药物相对于IMMMU-132结合至细胞以及被细胞摄取所需的时间容易获得。在TROP-2表达水平和对SN-38的敏感性之间似乎没有相关性。BxPC-3具有最高表达水平的TROP-2，但是游离SN-38与IMMU-132之间的IC50值存在4倍的差异，而相比之下，COLO205表达少约8倍的TROP-2但在IC50值方面仅显示2倍的差异。
各种实体瘤中的体内功效-在多个实体瘤异种移植模型中进行IMMU-132的初始功效研究(Cardillo等，Clin Cancer Res 2011；17：3157-3169)。这些包括胰腺癌、肺癌、结肠癌和胃癌(图3；剂量以SN-38等效物给出)。在所有检查的6个实体瘤中，当与盐水对照(P<0.043，曲线下面积AUC)相比时，IMMU-132显著抑制肿瘤生长。在6个肿瘤中的5个中，当与非肿瘤靶向对照ADC(P<0.05，AUC)相比时，特异性IMMU-132疗法提供了显著的抗肿瘤响应。此外，当与施用相当于伊立替康形式多10倍的SN-38的小鼠相比时，IMMU-132提供了显著更佳的抗肿瘤效果(图3A、C和D)。只有当伊立替康的MTD施用于动物时，才与在这些实验中获得的ADC相同(图3B和E)。然而，给予小鼠的伊立替康方案中包含的总SN-38等效物总计约2,400μg，这比施用IMMU-132治疗方案(64μg)的SN-38等效物高37.5倍。重要的是，小鼠将伊立替康更有效地转化为SN-38，比人高5至10倍(Morton等，Cancer Res 2000；60(15)：4206-4210；Furman等，J Clin Oncol 1999；17(6)：1815-1824；Zamboni等，Clin Cancer Res1998；4(2)：455-462)。因此，即使在小鼠中具有这种巨大的伊立替康优势，IMMU-132也提供了等效的抗肿瘤效果。
实施例3.用IMMU-132治疗的TNBC的体内研究
在携带MDA-MB-468TNBC肿瘤的小鼠中评估IMMU-132(图4A；剂量以SN-38等效物给出)。当与盐水、伊立替康(6mg/kg)或对照抗CD20 ADC、hA20-CL2A-SN-38(P<0.0012，AUC)相比时，IMMU-132(0.2mg/kg)引起显著的肿瘤消退。即使当剂量降低至0.12mg/kg时，IMMU-132也显著降低小鼠中的肿瘤体积(P<0.0017，AUC)。重要的是，在该低量的IMMU-132下给予的SN-38等效物的总量仅为9.6μg，而施用给小鼠的6mg/kg表示62.5倍的优势(600μg累积剂量)。然而，在伊立替康组中的第一只小鼠因疾病进展而丧失时，用IMMU-132(0.12mg/kg)处理的小鼠中的肿瘤体积(TV)显著小于用伊立替康处理的那些小鼠中的肿瘤体积(分别为TV＝0.17±0.12cm3相对于0.53±0.29cm3；P＝0.0094，双尾t检验)。如在其它实体瘤模型中发现的，使用IMMU-132将少量SN-38特异性靶向肿瘤比剂量大得多的非靶向药物更有效。
在疗法第56天(移植后第78天)，低剂量hA20-CL2A-SN-38(抗CD20)对照组(0.12mg/kg)中的小鼠中的肿瘤进展到它们没有不同于盐水对照小鼠的点(分别为TV＝0.74±0.41cm3相对于0.63±0.37cm3)。在该时间点，决定确定这些肿瘤是否会对IMMU-132治疗有响应，尽管它们进展到相当大的大小(图4B)。当与在第78天开始用IMMU-132进行的疗法相比时，所有小鼠显示出阳性响应，5周后肿瘤显著更小(分别为TV＝0.14±0.14cm3相对于0.74±0.41cm3；P＝0.0031，双尾t检验)，甚至在IMMU-132治疗开始时大于1.0cm3的肿瘤，消退超过88％(1.32cm3，消退至0.06cm3，和1.08cm3消退至0.13cm3)。与在MDA-MB-468中观察到的效果相反，携带MDA-MB-231TNBC肿瘤的小鼠对IMMU-132治疗没有响应(图4C)，这可能与该肿瘤的非常快速的增殖和/或其非常低的TROP-2表达相关。
实施例4.使用IMMU-132的人临床试验
IMMU-132已经完成了25例具有不同转移性实体癌患者的剂量发现I期试验，这些患者在最后一次疗法后复发且中位数为3次先前疗法。25例中的23例通过计算机断层扫描(CT)评估RECIST1.1，且结果如下。(1)在21天周期的第1天和第8天，给予8-10mg/kg/剂量的治疗的剂量时间表是可耐受且有效的。(2)可以施用重复的周期，甚至长达10个月，偶尔剂量延迟和/或剂量减少，但是对G-CSF造血支持的需要最小。(3)尽管重复治疗过程，但通过敏感性ELISA测试未检测到抗药物或抗抗体抗体。(4)主要毒性为中性粒细胞减少、腹泻和脱发，与单独给予的SN-38的母体化合物伊立替康的那些相一致，但用IMMU-132更易于控制。(5)通过作为最佳响应实现在13例患者中稳定的疾病，在3例(TNBC、小细胞肺癌和结肠直肠癌)中部分响应，以及在7例中进行性疾病，IMMU-132在人受试者中表现出抗肿瘤活性。在I期研究中患有转移性激素难治性(hormone-refractive)前列腺癌的患者中，最长的进展时间几乎为57周。
这些结果在II期试验中得到确认，II期试验已经招募了在21天周期的第1天和第8天给予8或10mg/kg剂量的多种转移性实体癌的超过100例患者，重复与患者的状况和耐受性允许一样频繁。副作用与I期经验的经验没有不同，但功效相当令人鼓舞，尤其是在转移性TNBC患者中。
目前，在14例CT可评估的TNBC患者中，4例经历部分响应，6例疾病稳定(一例显示RECIST1.1收缩27％)，4例患有进行性疾病作为最佳响应(图5A-B)。TNBC在该试验中的招募继续，预期将对20例患者进行安全性和响应评估。这些TNBC患者经过1-9次先前疗法，在招募之前复发到最后一次。值得注意的是，显示PR的12-14例患者在招募之前经历过2-6次先前疗法。
在I期部分中响应的第一例患者在疗法之前和之后的皮肤受累之间显示出令人印象深刻的响应(未示出)。在II期部分中具有部分响应的其它患者包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、食管癌和尿膀胱癌。
这些结果确认IMMU-132具有比伊立替康更好的治疗指数，因为其在较低毒性剂量下具有活性，表明由抗TROP-2抗体选择性靶向的更高剂量的SN-38提供由这种拓扑异构酶I抑制剂产生的足够选择性的DNA损伤以在已知对这类试剂响应的更多癌症类型中实现响应。出乎意料的是，在转移性TNBC患者中在其重复先前疗法失败后观察到的高响应率，因为众所周知每个连续治疗法的响应减弱。通过免疫组织化学的评价示出，在该试验中几乎所有存档的肿瘤标本表达靶抗原TROP-2。在对TNBC和非TNBC的肿瘤微阵列的单独研究中，我们已经确认超过90％表达TROP-2，其中超过65％具有强烈的2+和3+染色。因此，我们得出结论，TNBC且可能还有非TNBC是这些癌症中对靶向TROP-2的这种SN-38缀合的抗体敏感的肿瘤，因此代表TNBC的第一肿瘤靶向疗法。
当与其它药剂组合时，剂量限制性毒性和潜在的关注
可耐受的中性粒细胞减少症(没有神经病或对阿霉素、紫杉烷和铂剂显著的其它副作用的证据)表明IMMU-132可与这些药剂的一种或多种组合，特别是在新辅助剂情形中的未曾接受过治疗(treatment-naive)的患者中。考虑到紫杉醇在多柔比星+环磷酰胺之后或之前的延长使用，我们推断IMMU-132应与紫杉醇组合给予12周，其中IMMU-132的典型周期是在每21天的第1天和第8天给予8mg/kg。在完成紫杉醇±IMMU-132的12周治疗方案后，根据使用的标准方案(以下实施例)，多柔比星和环磷酰胺每隔一周施用4个疗程。根据IMMU-132是一种附加物的研究组，对照组经具有使用紫杉醇、多柔比星+环磷酰胺的疗法。为了限制中性粒细胞减少和避免发热性中性粒细胞减少，根据组合所经历的中性粒细胞减少的级别和持续时间，允许IMMU-132在其方案中的剂量减少。如在目前的经验中，紫杉醇还可能需要减少，并且用G-CSF(例如，Neupogen)的造血支持的选择由管理医师决定用于第一疗程。然而，我们需要在多柔比星+环磷酰胺第二组开始后(基于共同研究者的推荐)进行预防性G-CSF疗法。
基于我们在利用多个疗程目前治疗的超过125例转移性癌症患者中使用IMMU-132的经验，并且当患者具有许多先前的细胞毒性疗法时，使用以下IMMU-132剂量和时间表。尽管具有几种先前疗法的患者耐受8、10和甚至12mg/kg的多剂量IMMU-132，但是对于该组合我们使用8mg/kg，因为该剂量水平很少导致>2级的中性粒细胞减少，即便在多次剂量之后亦如此，并且在该水平上具有治疗活性。虽然我们预期用紫杉醇出现中性粒细胞减少效应，但是在该组合中8.0mg/kg剂量水平的IMMU-132减轻了更严重的结果。
实施例5.接受IMMU-132的多种晚期癌症患者的药代动力学和免疫原性.
在上述I期试验中，对于每次治疗，在输注结束30分钟内收集血清样品(大多数输注持续2至3.5小时)，代表“峰值”水平，然后刚好在下一次给药之前收集，代表“谷”水平。两个ELISA测定用于测量峰和谷血清样品。一个测定使用涂覆有抗SN-38抗体(由Immunomedics开发)的平板以通过结合附接至完整缀合物(ADC)的SN-38来捕获产物。然后使用特异性抗独特型抗体(即，抗hRS7 IgG)将结合的产物鉴定为目标抗体。因此，该测定测量完整的缀合物。另一个测定被配置为检测血清中的hRS7 IgG。图6A显示4个剂量水平中的IgG和ADC的峰值水平。当峰值水平相对于患者体重标准化(即，μg/mL/kg)时，可见随着剂量增加而浓度也增加的趋势(图6B)。
对多个剂量的代表性患者的血清中2种产物的浓度的分析显示峰值水平保持在相似水平，当剂量减少时调整得更低(未示出)。在任何谷样品中都不存在ADC，但是在之前剂量的7-14天内可以检测到低浓度的IgG(未示出)。该发现与体外稳定性数据一致，表明在约1天内，从IgG中释放出50％的SN-38(Cardillo等，Clin Cancer Res 2011；17：3157-3169)。
通过反相HPLC分析，通过提取血清对来自招募到试验的I期部分的患者的选择的峰和谷血清样品进行SN-38测定。分析以2份进行，一份在提取的血清中检测到未结合的SN-38(游离)，而另一个过程包括在提取之前的酸水解步骤，其释放与IgG结合的SN-38(总)，然后作为总SN-38(即，结合+游离SN-38)的一部分进行测量。在5例测定未结合的SN-38的患者中，其水平为在血清中发现的SN-38总量的≤3％(表3)。因此，血清中的≥97％的SN-38在输注结束的30分钟内与IgG结合。
表3.未结合(游离)和总(在酸水解后)的SN-38的血清浓度(ng/mL)在所选患者中在第一剂量后0.5小时取样.
10mg/kg
患者编号 总 游离
10 7355 179
12mg/kg
15 3230 97
17 3081 65
18 6675 118
22 6138 183
在招募到试验的扩大部分的所选患者中，在第一和第二剂量后1、2和3天收集另外的PK样品，以更仔细地检查IgG、缀合物和SN-38的清除率。图7示出接受8mg/kg的代表性患者，在前2次治疗的每次治疗后1天和2天收集另外的样品。图7A绘制了前2个剂量的IgG和IMMU-132的清除，以及为下一个周期(第21和28天)收集的峰/谷样品。这些数据确认完整的缀合物比IgG更快地清除，但是再次，这是因为SN-38被释放而发生。到第7天，所有的SN-38将被释放，因此没有检测到IMMU-132，而仍存在少量的IgG。图7B提供了相应浓度的总的和游离的SN-38。再次，游离SN-38的量仅为样品中总SN-38的1.8％至6.1％。到第7天，只有痕量的SN-38留在血清中。图7C基于ELISA检测方法或基于血清中的SN-38浓度绘制IMMU-132的清除。两组数据重叠，提供了ELISA是SN-38清除的合理替代测定的证据，其反映了血清中大多数SN-38结合至IgG的事实。
IMMU-132缺乏免疫原性，即便在经过多个月重复注射后亦如此。在研究开始之前和每4至6周的整个治疗中进行检测对hRS7 IgG或SN-38的抗体响应的ELISA测定。到目前为止测试的只有一例患者具有针对hRS7 IgG的阳性基线抗体(即，>50ng/mL)。然而，到目前为止，在任何患者的治疗过程中没有检测到抗hRS7 IgG和抗SN-38抗体响应，这是在已经接受多达30次注射的患者中。
实施例6.临床给药方案
临床上，将IMMU-132以8mg/kg(即，约0.16μg/kg SN-38等效物)施用。8mg/kg的人剂量转化为小鼠剂量为98.4mg/kg或对20g小鼠而言约2mg。将该剂量分割成三种不同给药方案之一的部分，其中一组动物接受1mg的两个IMMU-132剂量(第1天和第15天)，代表每隔一周的给药方案，一组给予500μg的四个剂量(第1天、第8天、第22天和第29天)，表示在21天的治疗周期中每周一次，持续2周，且最后一组给予250μg的8个剂量(第1、4、8、11、22、25、29和32天)，表示在21天治疗周期中每周两次，持续2周。在人胃癌和胰腺癌异种移植模型中测试这些给药方案(图8)。
在携带NCI-N87人胃癌异种移植物的动物中(图8A)，与未处理的对照动物相比，所有三种(2×1mg、4×0.5mg和8×0.25mg)剂量提供显著的抗肿瘤效果(P<0.0001；AUC)。尽管在存活中没有显著差异，但是4×0.5mg和8×0.25mg两组都导致88％和100％的阳性响应率，而相对地2×1mg组只有22％。
另外，在第49天(2×1mg组中的第一只小鼠达到>1.0cm3肿瘤体积的那天)，4×0.5mg组中的肿瘤显著更小(分别地平均TV＝0.637±0.274cm3相对于0.341±0.255cm3，P＝0.0259)。总之，当研究在第98天结束时，8只小鼠中的3只仍然活着，并且在4×0.5mg组中仍然表现出阳性响应，而相对地在2×1mg组中9只中有0只存活。
同样，在BxPC-3人胰腺癌异种移植模型(图8B)中，当与未处理的对照动物相比时，所有三种(2×1mg、4×0.5mg和8×0.25mg)剂量显著抑制肿瘤生长(P<0.0009；AUC)。当与2×1mg治疗组相比(当第一只小鼠安乐死用于疾病进展时那天；P<0.0093)时，4×0.5mg和8×0.25mg两组在疗法第32天导致显著更小的肿瘤。总体上，当与2×1mg处理组(P＝0.0357)相比时，用4×0.5mg IMMU-132处理的小鼠显示出显著的抗肿瘤效果。在存活方面，在2×1mg组与4×0.5mg组之间没有差异(分别地，中值存活期＝35天和46天)。然而，与其它两个治疗组(MST＝53天；P<0.0349；对数秩)相比，用8×0.25mg治疗的小鼠确实证明了优越的存活益处。所有三组均具有大于70％的阳性响应率，并且在肿瘤进展的时间上没有显著差异。总体而言，这些数据表明，与每隔一周提供大的推注剂量相比，分割剂量提供更好的生长控制。这支持了临床上实施每周给药。
实施例7.耐受性
使用小鼠和食蟹猴两者评估IMMU-132的毒性动力学(Cardillo等，Clin CancerRes 2011；17：3157-3169)。在Swiss-Webster小鼠中，以4、8或12mg/kg(250、500或750mg/kg蛋白剂量)的SN-38等效物施用两个剂量的IMMU-132，间隔三天。在动物中没有观察到明显的毒性迹象，如体重没有减轻(结果归档)所示。在第二次注射后7天，没有发生造血毒性，且血清化学仅显示升高的天冬氨酸转氨酶(AST)和丙氨酸转氨酶(ALT)水平。然而，这些酶恢复正常，并且在组织病理学检查后没有肝脏病变的证据。
由于IMMU-132不与由小鼠表达的TROP-2交叉反应，在其TROP-2被IMMU-132识别的食蟹猴模型中进行第二项研究。在该实验中，一组6只猴子(3只雄性和3只雌性)接受0.96mg/kg SN-38等效物(60mg/kg蛋白质剂量)IMMU-132，而第二组六只猴子接受1.92mg/kg(120mg/kg蛋白质剂量)。剂量间隔三天施用。所有猴子都耐受两种0.96mg/kg IMMU-132剂量，只有血细胞计数瞬时减少，所有这些都保持在正常范围内。体重减轻小于8％，其在注射后15天内回到基线。在第二次注射后8天，组织病理学示出对造血和胃肠器官以及女性生殖器官仅有最小至中等的微观变化。所有这些都在恢复期结束的第32天恢复正常。相比之下，两个1.92mg/kg剂量(120mg/kg蛋白质剂量)证明对猴子有毒。一只动物由于胃肠道并发症和严重的骨髓抑制而死亡。该组中其余动物同样表现出与在接受0.96mg/kg剂量的猴子中观察到的那些器官毒性相似的器官毒性但是水平严重得多。这些终末器官毒性与伊立替康一致，但最重要的是，在表达TROP-2的许多不同正常组织中没有TROP-2靶向毒性的证据。该研究表明，IMMU-132的两次注射的最大耐受剂量在0.96和1.92mg/kg之间，而人等效剂量将为20至40mg/kg(蛋白质剂量)之间。
实施例8.作用机制
一般而言，癌细胞可以经由称为外源性或内源性凋亡途径的两种主要途径之一来经历凋亡(Fulda&Debatin，Oncogene 2006；25(34)：4798-4811)。外源性途径的特征在于细胞表面死亡受体(例如，TNF家族受体)的接合，导致胱天蛋白酶-8的活化，这导致下游胱天蛋白酶(例如，胱天蛋白酶-3)的活化，并最终导致聚-ADP核糖聚合酶(PARP)的裂解、DNA片段化和细胞死亡。相反，内源性途径可以通过直接DNA损伤(例如，电离辐射)或通过导致细胞色素c从线粒体释放进入细胞质的其它细胞应激(例如，细胞周期停滞)触发。然后细胞色素c与凋亡蛋白酶激活因子-1(APAF-1)形成复合物，其作为激活胱天蛋白酶-9的平台，然后开始胱天蛋白酶活化级联，包括胱天蛋白酶-3和-7、PARP裂解和细胞死亡。
SN-38是已知的拓扑异构酶-I抑制剂，其诱导对细胞DNA的显著损伤。它介导早期促凋亡蛋白p53和p21WAF1/Cip1的上调，导致胱天蛋白酶激活和PARP裂解(Cusack等，CancerRes 2001；61：3535-3540；Liu等，Cancer Lett 2009；274：47-53；Lagadec等，Br J Cancer2008；98：335-344；Whitacre等，Clin Cancer Res 1999；5：665-672)。p21WAF1/Cip1的表达与细胞周期的G1停滞相关，并因此是内源性途径的标志(Sherr&Roberts，Genes Dev 1995；9：1149-1163)。我们先前证明，IMMU-132同样可以介导早期促凋亡信号传导事件(p53和p21WAF1/Cip1)的上调，导致在NSCLC(Calu-3)和胰腺(BxPC-3)细胞系中的PARP裂解(Cardillo等，Clin Cancer Res 2011；17：3157-3169)。
为了更好地确定IMMU-132利用的凋亡途径，将NCI-N87人胃癌细胞系暴露于1μM游离SN-38或等量的IMMU-132(图9A)。游离SN-38和IMMU-132两者都介导p21WAF1/Cip1的上调，但是直到48小时，上调的量才在暴露于游离SN-38相对于IMMU-132的细胞之间是相同的。这可能是由于与仅将游离药物加入培养的细胞中的容易获得性相比，SN-38从ADC的摄取和释放的延迟。考虑到伊立替康在体内相对于IMMU-132的快速清除，预期SN-38相对于IMMU-132在肿瘤中积累的优势，如下面在药物-毒理学研究中所证实的。
就胱天蛋白酶活化而言，游离SN-38和IMMU-132两者都在暴露48小时内显示出胱天蛋白酶-9和-7的裂解。该结果与HT-29结肠细胞系中的先前报道一致，其中10nM在72小时暴露后引起胱天蛋白酶9裂解(Lagadec等，Br J Cancer 2008；98：335-344)。然而，在同一报道中，他们没有看到胱天蛋白酶-3裂解，而我们确实示出裂解。可能是这是在72小时未检测到的早期事件，或者他们使用的SN-38的量(10nM)不足够高以示出与我们在我们的测定中使用的1μM相比存在这种情况。最后，游离SN-38和IMMU-132两者介导PARP裂解。这首先在24小时变得明显，在48小时具有增加的裂解。总之，这些数据证实了IMMU-132中包含的SN-38具有与游离SN-38相同的活性，并且该ADC诱导内源性凋亡途径。
微管抑制剂紫杉醇介导人乳腺癌中p21WAF1/Cip1的诱导(Blagosklonny等，CancerRes 1995；55：4623-4626)。这种诱导可以不依赖于p53状态(Li等，Cancer Res 1996；56：5055-5062)。此外，紫杉醇已示出在人乳腺癌细胞中激活胱天蛋白酶-2，进而开始胱天蛋白酶激活级联和PARP裂解(Jelinek等，Cancer Cell Int2013；13：42)。如所示(图9B)，IMMU-132同样示出在两种不同的人乳腺细胞系(包括TNBC MDA-MB-468)中介导PARP裂解。在暴露于1μM游离SN-38或等量的IMMU-132的48小时内，几乎完全裂解是明显的。此外，p21WAF1/Cip1在包含突变体p53的MDA-MB-468中上调。正在进行的实验将扩大确定哪些胱天蛋白酶在乳腺癌细胞中被IMMU-132激活，以及如果有的话，与紫杉醇可能存在重叠。
当组合两种化学治疗剂时的最佳情况是达到协同作用。为此，两种试剂应该通过两个独立的途径起作用，导致相同的结果或协同作用以扩增单个途径。当甲基硒酸(methylseleninic acid)与紫杉醇组合时，显示了TNBC中的这种情况的一个实例(Qi等，PLoS ONE 2012；7：e31539)。两种试剂都能够活化胱天蛋白酶-3并单独诱导PARP裂解，但是当组合时，它们增加了该活化的程度，结果是协同抑制细胞生长。像甲基硒酸一样，IMMU-132使用这些相同的凋亡途径中的许多，因此也可以与紫杉醇协同作用以放大这些信号。
如果不以正确的顺序施用，紫杉醇与5-FU、吉西他滨和卡铂的组合已示出拮抗性(Qi等.PLoS ONE 2012；7：e31539；Johnson等.Clin Cancer Res 1997；3：1739-1745；Johnson等，Clin Cancer Res 1999；5：2559-2565；Sui等，Cancer Biol Ther 2006；5：1015-1021；Xiong等，Cancer Biol Ther 2007；6：1067-1073)。在吉西他滨和卡铂的情况下，在这些其它药物之前施用紫杉醇是防止拮抗所必需的(Sui等，Cancer Biol Ther2006；5：1015-1021；Xiong等，Cancer Biol Ther 2007；6：1067-1073)。然而，对于5-FU，测序不改变这种拮抗结果(Johnson等.Clin Cancer Res 1999；5：2559-2565)。一个关键的发现是5-FU阻断了p21WAF1/Cip1的紫杉醇诱导。有趣的是，当SN-38与5-FU组合时，如果在SN-38之前加入5-FU或如果同时加入它们，则观察到拮抗作用。只有当细胞首先暴露于SN-38时，才可以加入5-FU以实现协同作用(Torigoe等，Anticancer Res 2009；29：2083-2090)。鉴于IMMU-132(如紫杉醇)介导p21WAF1/Cip1的上调，使用类似的凋亡途径，并且两者都具有与5-FU相似的拮抗问题，这两种药物可能协同作用。正在进行的实验正在研究结合IMMU-132疗法与紫杉醇的可能益处。这些包括体外凋亡信号事件和TNBC的体内模型，其中用IMMU-132和紫杉醇的组合治疗小鼠。
实施例9.IMMU-132相对于伊立替康在胰腺癌异种移植模型中的药物毒理学研究
在携带Capan-1胰腺癌异种移植物(约0.06-0.27g)的静脉注射40mg/kg伊立替康(773μg；总SN-38等效物＝448μg)或IMMU-132(1.0mg，DAR＝7.6，SN-38等效物＝20μg)的裸鼠中检查SN-38在组织中的清除和摄取。在小鼠中伊立替康剂量是MTD，并且在人中相当于3.25mg/kg或约126mg/m2。IMMU-132剂量远低于小鼠中的MTD，并且代表约4mg/kg IMMU-132(80μg/kg SN-38等效物)的人等效剂量。以5个间隔解剖动物组(n＝3)；对于伊立替康：5分钟，1、2、6和24小时，且对于IMMU-132：1、6、24、48、72小时。将取自动物的血清在水中稀释为1:2，然后用等份的甲醇：乙二醇：1M ZnSO4萃取。在该培养基中，SN-38、SN-38G(葡糖醛酸盐)和伊立替康被提取到有机相中，而蛋白质沉淀。因此，结合至IgG的任何SN-38将沉淀并且不被检测。
为了检测与IgG结合的SN-38，血清样品首先必须用6M HCl进行酸水解，然后在加入提取介质之前中和。该过程释放所有IgG结合的SN-38，伴随着样品中的任何未结合的(即，游离的)SN-38，将在提取介质的有机相中分离。据说用酸水解的提取样品来测量样品中SN-38的总量，而仅提取的样品测量样品中未结合或游离的SN-38。IgG结合的SN-38的量可以通过从总量减去游离而得到。因此，来自IMMU-132处理的动物的血清和组织匀浆物以两种方式进行处理，未水解/提取以分离未结合的SN-38和酸水解/提取样品提供总SN-38。首先在水(10份水比1份组织)中匀浆肿瘤、肝脏和小肠内容物。所有样品在萃取前用内标10-羟基-喜树碱(10-OH CT)加标，其有助于定量和监测回收。将少部分(例如，5至50μl)提取物的有机相施加到用来自每种目标产物的标准品进行预校准的分析型C-18HPLC柱。确定每个产物峰(即，SN-38、SN-38G、伊立替康和10-OH CT)的AUC。计算产物峰与内标峰的比例，并针对每种试剂的10至10,000ng/mL范围内的标准曲线作图。使用线性回归拟合对数转换数据。血清样品的测定的灵敏度为20ng/mL，因为样品以2:1稀释用于分析，而组织样品的灵敏度为110ng/mL，因为匀浆以11:1(1份组织比10份水)稀释。
在伊立替康治疗的动物中，SN-38只能在肿瘤中于5分钟、1和2小时时检测到)，而在这些相同样品和在6小时样品中检测到伊立替康和SN-38G(图10)；在24小时样品中没有检测到这些产物。尽管在肿瘤中具有高水平的伊立替康，但SN-38或SN-38G的浓度非常小。例如，在2小时，肿瘤中平均有101.6±58.6μg/g的伊立替康，肿瘤中的SN-38和SN-38G分别为仅1.6±1.0(1.6％)和1.3±1.2μg/g(1.3％)。因此，尽管非常快速地将大量的伊立替康摄入Capan-1肿瘤，但是肿瘤内的伊立替康非常差地转化为SN-38。
对于接受IMMU-132的动物，在肿瘤中没有可检测水平的未结合的SN-38或SN-38G；然而，检测到高水平的SN-38[总]。由于没有检测到未结合的SN-38或SN-38G，这意味着IMMU-132处理的动物的肿瘤中的所有SN-38结合至IgG，说明保留了产物完整性，SN-38仅通过缀合物与肿瘤的结合递送至肿瘤。重要的是要记住，用IMMU-132注射的SN-38的摩尔当量仅为注射伊立替康的动物中所含的SN-38的摩尔当量的一部分(例如，448μg SN-38，或如果基于25％转化率，约115μg相对于20μg的IMMU-132)。
将递送到伊立替康(3.9μg/g·h)肿瘤的SN-38的AUC与IMMU-132(474μg/g·h)的肿瘤中的SN-38[总]的AUC进行比较，发现与伊立替康相比，IMMU-132具有向Capan-1肿瘤递送多将近120倍的SN-38的能力，尽管在该研究中，与伊立替康相比，用IMMU-132给予了动物少22倍的SN-38等效物(448相对于20μg)。
在携带Capan-1肿瘤的动物中进行类似的分析，所述动物被给予不相关的非靶向抗体缀合物。IMMU-132的肿瘤/血液浓度比在给予非靶向SN-38抗体缀合物的动物中发现的比率高4倍，证实了使用特异性结合至肿瘤的缀合物的益处。
肝脏和粪便的分析：给予IMMU-132的动物肝脏中未结合的SN-38水平非常低，在1小时平均为130±58ng/g，在稍后时间没有发现可检测的水平。甚至SN-38[总]浓度相对低，在1、6和24小时分别平均为1023±202、909±186和203±29ng/g，在48和72小时没有在肝脏中发现可检测的水平。这与从小肠分离的粪便中相对低浓度的未结合的SN-38很好地一致(在1小时和6小时的整个内容物中为442±103ng和912±373ng)。在总处理的样品(结合+未结合)中的SN-38浓度仅略高于游离处理的样品(未结合)中的SN-38浓度，证实完整的缀合物不穿过肝胆清除途径进入肠。
在伊立替康治疗的动物中，SN-38浓度高得多，在5分钟时在肝脏中达到峰值(3,511±476ng/g)，在1小时时降至1296±505ng/g(此时，其比给予IMMU-132的动物中未结合的SN-38高将近10倍)，并且最后在6小时时测量638ng/g，然后在24小时时变得不可检测。出乎意料的是，SN-38可以在小肠内容物中检测到，甚至早在5分钟时(799±550ng/g)，并且在6小时内保持约10,000ng/g的水平，然后在24小时变得不可检测。这说明伊立替康如何快速转化为SN-38和SN-38G。如前所述，血液清除率数据显示，超过98％的产物正好在5分钟内从血液中消除。
实施例10.用于治疗CD74+人癌症的抗CD74-CL2A-SN-38缀合物
CD74是抗体-药物缀合物(ADC)的有吸引力的靶标，因为其在抗体结合后内化并再循环。CD74主要与血液癌症相关，但也在实体癌中表达。因此，检查了用人源化抗CD74抗体米拉妥珠单抗制备的ADC治疗表达CD74的实体瘤的效用。用可裂解接头(CL2A和CL2E)制备米拉妥珠单抗-多柔比星和两种米拉妥珠单抗-SN-38缀合物，它们在血清中的稳定性以及它们如何在溶酶体中释放SN-38不同。通过流式细胞术和免疫组织化学测定CD74表达。在人癌细胞系A-375(黑素瘤)、HuH-7和Hep-G2(肝癌)、Capan-1(胰腺)和NCI-N87(胃)和Raji伯基特淋巴瘤中进行体外细胞毒性和体内治疗研究。在表达其靶抗原的异种移植物中将米拉妥珠单抗-SN-38ADC与用抗TROP-2和抗CEACAM6抗体制备的SN-38ADC进行比较。
米拉妥珠单抗-多柔比星在淋巴瘤模型中最有效，而在A-375和Capan-1中，仅有米拉妥珠单抗-CL2A-SN-38示出治疗益处。尽管CD74的表面表达比TROP-2或CEACAM6低得多，但是米拉妥珠单抗-CL2A-SN-38在Capan-1中具有与抗TROP-2-CL2A-SN-38类似的功效，但是在NCI-N87中，抗CEACAM6和抗TROP-2缀合物是优异的。在单一剂量水平下在2个肝癌细胞系中的研究显示优于盐水处理的动物的显著益处，但不是针对不相关的IgG缀合物。CD74是一些实体瘤异种移植物中ADC的合适靶标，其功效很大程度上受CD74表达的均一性影响，并且CL2A连接的SN-38缀合物提供最好的治疗响应。
材料和方法
人肿瘤细胞系.Raji伯基特淋巴瘤、A-375(黑素瘤)、Capan-1(胰腺癌)、NCI-N87(胃癌)、Hep-G2肝癌和MC/CAR骨髓瘤细胞购自美国组织培养物保藏中心(American TissueCulture Collection)(Manassas，VA)。HuH-7肝癌细胞系购自日本健康科学研究资源库(Japan Health Science Research Resources Bank)(Osaka,Japan)。所有细胞系在37℃下在含有10％至20％胎牛血清和补充物的推荐培养基中在潮湿的CO2培养箱(5％)中培养。细胞传代<50次，并定期检查支原体。
抗体和缀合方法.米拉妥珠单抗(抗CD74 MAb)、依帕珠单抗(抗CD22)、维妥珠单抗(抗CD20)、拉贝珠单抗(labetuzumab)(抗CEACAM5)、hM15(抗CEACAM6)和hRS7(抗TROP-2)是人源化IgG1单克隆抗体。CL2A和CL2E接头及其SN-38衍生物如上述实施例所述制备并与抗体缀合。如先前所述(Griffiths等，2003，Clin Cancer Res9：6567-71)制备米拉妥珠单抗-多柔比星缀合物。通过IgG的二硫键还原，然后与这些接头的相应马来酰亚胺衍生物反应制备所有缀合物。分光光度分析估计药物：IgG摩尔取代比为5-7(1.0mg蛋白质含有约16μgSN-38或25μg多柔比星等效物)。
体外细胞结合和细胞毒性.将未缀合的和缀合的米拉妥珠单抗与抗原阳性细胞的细胞结合比较的测定和细胞毒性测试使用MTS染料还原方法(Promega，Madison，WI)。
流式细胞术和免疫组织学.以提供仅膜结合或膜和细胞质抗原的评估的方式进行流式细胞术。使用用抗人IgG缀合物显示的10μg/mL的抗体，在福尔马林固定的、石蜡包埋的皮下肿瘤异种移植物切片上进行免疫组织学，不用抗原修复方法进行染色。
体内研究.雌性裸鼠(4-8周龄)或雌性SCID小鼠(7周龄)购自Taconic(Germantown，NY)，并在1周的检疫后使用。经腹膜内施用所有试剂，包括盐水对照，每周两次，持续4周。具体剂量在结果中给出。通过每周重量测量评估毒性。对于Raji伯基特淋巴瘤模型，用0.1mL培养基中的2.5×106个Raji细胞静脉内注射SCID小鼠。五天后，动物接受单次静脉内注射(0.1mL)的缀合物或盐水(N＝10只/组)。每天观察小鼠的不适和麻痹的征兆，并且在产生后肢麻痹、初始体重减轻>15％或者如果以其它方式濒死(替代生存终点)，则实施安乐死。
在两个维度上通过卡尺测量皮下肿瘤，并且肿瘤体积(TV)计算为L×w2/2，其中L是最长直径且w是最短直径。每周至少进行一次测量，当肿瘤生长至1.0cm3(即，替代存活终点)时，终结动物。将A-375黑素瘤细胞系(在0.2mL中6×106个细胞)植入裸鼠中，且当肿瘤平均为0.23±0.06cm3时开始疗法(N＝8只/组)。使用来自连续传代肿瘤的肿瘤悬浮液(0.3mL的15％w/v肿瘤悬浮液)与来自组织培养物的8×106个细胞的组合，将Capan-1皮下植入裸鼠中。当TV平均为0.27±0.05cm3时开始治疗(N＝10只/组)。通过皮下注射来自末端培养物的0.2mL的基质胶和1×107个细胞的1:1(v/v)混合物来起始NCI-N87胃肿瘤异种移植物。当TV平均为0.249±0.045cm3时开始疗法(N＝7只/组)。按照相同的程序在裸鼠中形成Hep-G2和HuH-7肝癌异种移植物。当Hep-G2平均为0.364±0.062cm3(N＝5只/组)且HuH-7平均为0.298±0.055cm3(N＝5只/组)时开始疗法。
使用上述用于测定中值存活时间的替代终点，以Kaplan-Meier存活曲线表示功效。通过使用Prism GraphPad软件(LaJolla，CA)的对数秩(Mantel-Cox)检验进行分析，显著性为P<0.05。
结果
CD74在人肿瘤细胞系和异种移植物中的表达.主要基于通透化细胞的分析将来自4种不同实体瘤类型的6种细胞系鉴定为CD74阳性(表4)，因为实体瘤细胞系中仅膜CD74的MFI很经常比背景MFI(A-375黑素瘤细胞系除外)高<2倍。Raji中的表面CD74表达比实体瘤细胞系高>5倍，但通透化的Raji细胞中的总CD74与大多数实体瘤细胞系相似。
表4.通过表示为米拉妥珠单抗阳性门控细胞的平均荧光强度(MFI)的流式细胞术得到的CD74表达.
ND，未进行
a仅用GAH-FITC孵育的细胞的背景MFI。
免疫组织学显示Raji皮下异种移植物具有大致均匀和强烈的染色，具有显著的细胞表面标记(未示出)。Hep-G2肝癌细胞系具有最均匀的实体瘤摄取，具有中等强度(但主要是细胞质)的染色(未示出)，随后是A-375黑素瘤细胞系，其具有稍许不那么均匀的更强(但主要是细胞质)表达的染色(未示出)。Capan-1胰腺(未示出)和NCI-N87(未示出)胃癌细胞系具有中度(Capan-1)至强度(NCI-N87)CD74染色，但其不均匀分布。HuH-7肝癌细胞系(未示出)具有最不均匀和最弱的染色。
缀合物的免疫反应性.未缀合的米拉妥珠单抗、米拉妥珠单抗-CL2A-SN-38和米拉妥珠单抗-CL2E-SN-38缀合物的Kd值没有显著差异，分别平均为0.77nM、0.59nM和0.80nM。在MC/CAR多发性骨髓瘤细胞系中测量的未缀合的和缀合多柔比星的米拉妥珠单抗的Kd值分别为0.5±0.02nM和0.8±0.2nM(Sapra等，2008，Clin Cancer Res 14：1888-96)。
缀合物的体外药物释放和血清稳定性.在部分模拟溶酶体条件(即，低pH(pH5.0))的环境中和存在或不存在组织蛋白酶B的条件下测定从巯基乙醇封端的CL2A和CL2E接头释放SN-38的机制。CL2E-SN-38底物在不存在酶的情况下在pH 5下是惰性的(未示出)，但是在组织蛋白酶B的存在下，在Phe-Lys位点的裂解快速进行，其半衰期为34分钟(未示出)。活性SN-38的形成需要在SN-38的第10位的氨基甲酸酯键的分子内环化，其发生得更缓慢，半衰期为10.7小时(未示出)。
如所预期的，组织蛋白酶B对CL2A接头中活性SN-38的释放没有影响。然而，CL2A具有可裂解的碳酸苄酯键，以类似于CL2E接头的速率在pH 5.0下释放活性SN-38，半衰期为约10.2小时(未示出)。具有pH敏感性酰腙键的米拉妥珠单抗-多柔比星缀合物在pH 5.0下的半衰期为7至8小时(未示出)。
虽然所有这些接头在溶酶体相关条件下以相对相似的速率释放药物，但它们在血清中具有非常不同的稳定性。在21.55±0.17小时，米拉妥珠单抗-CL2A-SN-38释放50％的游离SN-38(未示出)，与其它CL2A-SN-38缀合物一致。然而，CL2E-SN-38缀合物是高度惰性的，半衰期外推至约2100小时。在98小时，米拉妥珠单抗-多柔比星缀合物释放50％的多柔比星，这与2种其它抗体-多柔比星缀合物相似(未示出)。
细胞毒性.与这些缀合物的评价相关的重要问题是游离多柔比星和SN-38在造血和实体瘤细胞系中的相对效力。我们组先前报道了SN-38在几种B细胞淋巴瘤和急性白血病细胞系中是有活性的，效力范围为0.13至2.28nM(Sharkey等，2011，Mol Cancer Ther 11：224-34)。随后用于体内疗法研究的4个实体瘤细胞系中的SN-38效力范围为2.0至6nM(未示出)。多柔比星具有混合响应，在Raji淋巴瘤和A-375黑素瘤细胞系中具有3-4nM效力，但是其对于Capan-1、NCI-N87和Hep G2细胞系的效力几乎低将近10倍。比较SN-38与多柔比星的效力的其它研究发现：LS174T结肠癌，18相对于18(分别为SN-38相对于多柔比星的nM效力)；MDA-MB-231乳腺癌，2相对于2nM；SK-OV-4卵巢癌，18相对于90nM；Calu-3肺腺癌，32相对于582nM；Capan-2胰腺癌，37相对于221nM；和NCI-H466小细胞肺癌，0.1相对于2nM。因此，SN-38在这6种细胞系中的4种中比多柔比星强5至20倍，在LS174T和MDA-MB-231中具有相似的效力。总的来说，这些数据表明多柔比星对实体瘤的效力低于SN-38，而SN-38似乎在实体和造血肿瘤中同样有效。
如所预期的，3种缀合物形式在体外的效力通常比游离药物弱一些数量级，因为预期两种药物容易转运到细胞中，而药物缀合物需要抗体结合以在细胞内运输药物(未示出)。CL2A连接的SN-38缀合物是例外，因为在4天测定期间，超过90％的SN-38从缀合物释放到培养基中(Cardillo等，2011，Clin Cancer Res 17：3157-69；Sharkey等，2011，MolCancer Ther 11：224-34)。因此，即使缀合物快速内化，也难以区分游离药物与CL2A连接的药物之间的差异。
与游离的SN-38相比，稳定的CL2E连接的SN-38在Raji细胞系中表现较好，但其在4种实体瘤细胞系中具有显著(7至16倍)更低的效力，表明CD74的相对低的表面表达可能在使这些实体瘤中的药物转运最小化中起作用。在所有细胞系中，与游离多柔比星相比，米拉妥珠单抗-多柔比星缀合物具有显著的效力差异，其作为CL2E-SN-38缀合物与实体瘤细胞系中游离SN-38相比具有相似的量级。
在上述6种另外的细胞系中，米拉妥珠单抗-CL2A-SN-38缀合物比米拉妥珠单抗-多柔比星缀合物的效力高9至60倍(未示出)，但是同样，该结果主要受以下事实影响：在4天孵育期间CL2A连接的缀合物将其大部分的SN-38释放到培养基中，而多柔比星缀合物在同一时间内至多释放其50％的药物。在这些其它细胞系中未检测到CL2E-连接的米拉妥珠单抗。
人肿瘤异种移植物的体内疗法.先前用用各种抗体制备的米拉妥珠单抗-多柔比星或SN-38缀合物的体内研究表明，它们在远远低于其最大耐受剂量的剂量下有效(Griffiths等，2003，Clin Cancer Res 9：6567-71；Sapra等，2005，Clin Cancer Res 11：5257-64；Govindan等，2009，Clin Cancer Res 15：6052-61；Cardillo等，2011，ClinCancer Res 17：3157-69；Sharkey等，2011，Mol Cancer Ther 11：224-34)，因此体内测试集中于比较类似的但是固定的量的耐受性良好水平的每种缀合物。
初始研究首先在淋巴瘤的弥散性Raji模型中检查多柔比星和SN-38缀合物，以便测量与2种SN-38缀合物相比，米拉妥珠单抗-多柔比星如何缀合(未示出)。所有特异性缀合物显著优于非靶向拉贝珠单抗-SN-38缀合物或盐水处理的动物，其具有仅20天的中值存活期(P<0.0001)。尽管体外研究表明Raji中的SN-38缀合物具有高达8倍的优势，但是用米拉妥珠单抗-多柔比星缀合物看到最佳存活，其中所有动物给予单一17.5mg/kg(350μg)剂量，且给予2.0mg/kg(40μg)的10只动物中有7只在研究结束(第112天)时存活(例如，17.5mg/kg剂量米拉妥珠单抗-多柔比星相对于米拉妥珠单抗-CL2A-SN-38，P＝0.0012)。对于更稳定的CL2E-SN-38缀合物而言，存活显著更低(分别地，P<0.0001和P＝0.0197，对于CL2A相对于CL2E，17.5mg/kg剂量和2.0mg/kg剂量)，尽管体外研究表明，两种缀合物在内化时以类似速率释放活性SN-38。
检查五种实体瘤细胞系，从A-375黑素瘤细胞系开始，因为它对多柔比星和SN-38两者具有最好的体外响应。A-375异种移植物快速生长，用盐水处理的对照动物具有仅10.5天的中值存活期(未示出)。12.5mg/kg(每只动物0.25mg)每周两次剂量的米拉妥珠单抗-CL2A-SN-38缀合物将存活期延长至28天(P＝0.0006)，其显著优于对照依帕珠单抗-CL2A-SN-38缀合物，其中值存活期为17.5天(P＝0.0089)，后者与盐水处理的动物没有显著差异(P＝0.1967)。米拉妥珠单抗-CL2A缀合物提供比米拉妥珠单抗-CL2E-SN-38缀合物显著更长的存活期(P＝0.0014)，其具有与其对照依帕珠单抗-CL2E-SN-38缀合物相同的14天的中值存活期。尽管给予比SN-38缀合物高2倍剂量的米拉妥珠单抗-多柔比星，但中值存活期没有优于盐水处理的动物(10.5天)。
与A-375黑素瘤模型一样，在Capan-1中，仅CL2A连接的SN-38缀合物有效，其中值存活期为35天，与未治疗的动物显著不同(P<0.036)(未示出)，即使以较低剂量(5mg/kg；每只动物100μg)亦如此(P<0.02)。米拉妥珠单抗-CL2E和非靶向的依帕珠单抗-CL2A-SN-38缀合物或2倍更高剂量的米拉妥珠单抗-多柔比星缀合物都不提供任何存活优势(P＝0.44相对于盐水)。值得注意的是，在给予相同剂量的内化抗TROP-2CL2A-SN-38缀合物(hRS7-SN-38；IMMU-132)的动物的相同研究中，中值存活期等于米拉妥珠单抗-CL2A-SN-38(未示出)。以前已将hRS7-CL2A-SN-38缀合物鉴定为用于治疗多种实体瘤的目标ADC(Cardillo等，2011，Clin Cancer Res 17：3157-69)。在Capan-1上的表面结合hRS7的MFI为237(未示出)，而对于米拉妥珠单抗为22(参见表4)。因此，尽管具有显著更低的表面抗原表达，但在该模型中米拉妥珠单抗-CL2A-SN-38缀合物表现与hRS7-CL2A-SN-38缀合物一样。
使用在2个实体瘤异种移植物中具有较差治疗结果的米拉妥珠单抗-多柔比星缀合物，焦点转移以将米拉妥珠单抗-SN-38缀合物与用针对TROP-2(hRS7)或CEACAM6(hMN-15)的其它人源化抗体制备的SN-38缀合物进行比较，其在许多实体瘤的表面上更高度表达(Blumenthal等，2007，BMC Cancer 7：2；Stein等，1993，Int J Cancer55：938-46)。检查了另外三种异种移植模型。
在胃肿瘤模型NCI-N87中，给予17.5mg/kg/剂量(350μg)的米拉妥珠单抗-CL2A-SN-38的动物提供了存活期的一些改善，但是与盐水处理的动物(31天相对于14天；P＝0.0760)或未结合维妥珠单抗抗CD20-CL2A-SN39缀合物(21天；P＝0.3128)相比其未能满足统计学显著性(未示出)。然而，hRS7-和hMN-15-CL2A缀合物分别将中值存活期显著改善至66天和63天(P＝0.0001)。表面表达的TROP-2和CEACAM6的MFI分别为795和1123，远高于仅为5的CD74(参见表4)。免疫组织学显示在该细胞系的异种移植物中CD74的相对强的细胞质表达，但重要的是它是分散的，仅出现在肿瘤内的确定的口袋中(未示出)。CEACAM6和TROP-2比CD74更均匀地表达(未示出)，其中CEACAM6更强烈地存在于细胞质和膜两者上，而TROP-2主要存在于膜上。因此，用抗CEACAM6和抗TROP-2缀合物改善的存活期最可能反映NCI-N87中更高的抗原密度和更均匀的表达两者。
在Hep-G2肝癌细胞系中(未示出)，免疫组织学显示非常均匀的表达，具有CD74的中等细胞质染色，并且流式细胞术指示相对低的表面表达(MFI＝9)。在hMN-15的情况下MFI为175，且免疫组织学示出CEACAM6的相当均匀的膜和细胞质表达，其具有非常强烈的膜染色的分离的袋(未示出)。在携带Hep-G2异种移植物的动物中的研究发现，与盐水治疗组的21天相比，米拉妥珠单抗-CL2A-SN-38延长存活期至45天(P＝0.0048)，而hMN-15-CL2A-SN-38缀合物使存活期提高到35天。存在米拉妥珠单抗缀合物相对于hMN-15-CL2A-SN-38更有利的趋势，但其没有实现统计学显著性(46天相对于35天；P＝0.0802)。然而，未结合维妥珠单抗-CL2A-SN-38缀合物提供了与米拉妥珠单抗缀合物相似的存活优势。我们以前观察到，具有未结合缀合物的治疗结果可以与特异性CL2A连接的缀合物类似，特别是在较高蛋白质剂量下，但是特异性和对照缀合物的滴定通常选择性披露。因此，特异性缀合物在这些细胞系中都没有提供这些剂量的选择性治疗优势。
使用具有相似表面表达但略低于Hep-G2的细胞质水平的HuH-7肝癌细胞系(未示出)的另一研究(参见表4)发现，hMN-15-SN-38缀合物提供与米拉妥珠单抗-CL2A缀合物相比更长的(35天相对于18天)生存期优势，但没有显著差异(P＝0.2944)。虽然hMN-15和米拉妥珠单抗缀合物两者都显著优于盐水处理的动物(分别为P＝0.008和0.009)，但是在该剂量水平下，两种缀合物都不显著不同于非靶向的维妥珠单抗-SN-38缀合物(分别为P＝0.4602和0.9033)。在该细胞系(MFI＝81)中CEACAM6表面表达相对低，并且免疫组织学显示CD74(未示出)和CEACAM6(未示出)两者非常微弱且高度分散。
这些研究显示，SN-38抗体-药物缀合物的新辅助剂用途不限于抗TROP2(hRS7)抗体，而且还可以利用针对不同抗原靶标(例如，CD74)的抗体。
实施例11.hRS7-SN-38(IMMU-132)治疗疗法难治性转移性结肠癌(mCRC)的用途
该患者是一例患有mCRC的62岁女性，其最初于2012年1月出现转移性疾病。她在诊断后的几个星期内接受了腹腔镜回肠横切结肠切除术作为首次疗法，然后接受了4个周期的新辅助剂情形中的FOLFOX(甲酰四氢叶酸、5-氟尿嘧啶、奥沙利铂)化学疗法，而后在2012年3月实施右肝切除术以去除肝右叶的转移性病变。随后是在2012年6月恢复辅助FOLFOX方案，持续总共12个周期的FOLFOX。在8月，由于恶化的神经毒性，奥沙利铂从方案中舍弃。她的最后一个周期的5-FU是在2012年09月25日。
2013年1月进行的CT显示向肝转移。然后将其评估为招募到IMMU-132(hRS7-CL2A-SN-38)研究性研究的良好候选者。她的医疗史中的合并症包括哮喘、糖尿病、高血压、高胆固醇血症、心脏杂音、食管裂孔疝、甲状腺功能减退、腕管综合征、青光眼、抑郁症、不宁腿综合征和神经病。她的手术史包括输卵管结扎术(1975年)、甲状腺切除术(1983年)、胆囊切除术(2001年)、腕管解除(2008年)和青光眼手术。
在进入该试验时，她的靶病变是肝左叶中的3.1-cm肿瘤。非靶标损伤包括肝脏中的几个低衰减块。她的基线CEA为781ng/m。
在患者签署知情同意书之后，通过输注连续2周，然后休息一周，以每周一次的时间表给予IMMU-132，这构成治疗周期。在耐受时重复这些循环。IMMU-132(8mg/kg)的第一次输注在2013年2月15日开始，并且在无值得注意的事件的情况下完成。她在第一个周期过程中经历恶心(2级)和疲劳(2级)，并继续治疗，从那以后没有严重不良事件。她在2013年3月报道了脱发和便秘。通过计算机断层扫描(CT)，2013年4月8日进行(在6个剂量之后)的第一次反应评估显示目标病变收缩29％。她的CEA水平在2013年3月25日降至230ng/ml。在2013年5月23日的第二次反应评估(在10个剂量后)中，目标病变收缩39％，从而根据RECIST标准构成部分响应。她继续治疗，截至2013年06月14日，接受了由12个剂量的8mg/kg hRS7-CL2A-SN-38(IMMU-132)构成的6个周期。她的整体健康和临床症状从开始这项研究治疗后大大改善。
实施例12.hRS7-SN-38(IMMU-132)治疗疗法难治性转移性乳腺癌的用途
患者是一例患有IV期、三阴性乳腺癌(ER/PR阴性，HER-neu阴性)的57岁女性，最初于2005年诊断出。她在2005年经历了她左乳房的乳房肿瘤切除术，随后是在2005年9月的辅助剂情形中的剂量密集(Dose-Dense)ACT。然后她接受了放射疗法，其于11月完成。当患者在2012年初在对侧(右)乳房触摸肿块时，确定该疾病的局部复发，然后用CMF(环磷酰胺、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶)化学疗法治疗。她的病在同一年复发，在胸壁的皮肤中具有转移性病变。然后她接受卡铂+化学疗法方案，在此期间导致血小板减少。她的疾病进展，且她开始每周多柔比星，持续6个剂量。皮肤病也在进展。在2012年09月26日的FDG-PET扫描显示在胸壁和扩大的实体腋窝淋巴结上的疾病进展。患者给予羟考酮用于疼痛控制。
当打开胸壁病变并放血时，她从2012年10月至2013年2月给予(每2周，持续4个月)。然后她服用/>由于手和脚中的神经病变以及便秘，其耐受不好。皮肤病变是进行性的，然后她在给予知情同意后招募到IMMU-132试验。患者还具有甲状腺功能亢进和视觉障碍的病史，具有高的CNS疾病风险(然而，脑MRI对CNS疾病为阴性)。在招募到该试验时，她的右乳房的皮肤病变(靶标)测量为4.4cm，且最大直径为2.0cm。在右乳房她有另一个非靶标病变，且在右和左腋窝各有一个扩大的淋巴结。
第一次IMMU-132输注(12mg/kg)始于2013年3月12日，其被良好耐受。她的第二次输注由于在输注的安排日(一周后)的3级绝对嗜中性粒细胞计数(ANC)减少(0.9)而延迟。在一周延迟后和在接受之后，以25％剂量减少的9mg/kg施用她的第二IMMU-132。此后，她按照方案按时间表接受IMMU-132，每周一次，持续2周，然后停一周。她的第一次反应评估在2013年5月17日，3个疗法周期后，显示目标病变的长直径的总和减少43％，根据RECIST标准构成部分响应。她以9mg/kg剂量水平继续治疗。自从她开始IMMU-132治疗后，她的整体健康和临床症状明显改善。
实施例13.IMMU-132用于治疗TNBC的新辅助剂用途
该研究对于患有可手术的TNBC的II期和III期的18岁和更年长的女性是开放的。通过计算机将合格的患者招募并随机分配到两个相同的治疗组之一，除了在一组中在联合疗法的第一疗程中将IMMU-132添加到紫杉醇中，如下面的治疗方案所示(图11)。如果毒性超过先前试验的预测值，则为IMMU-132确定剂量降低和剂量延迟规则，使得紫杉醇在可能的情况下保持在规定的剂量。骨髓生长因子(例如，G-CSF)的使用由治疗医师在研究组中的该第一组合疗程中决定，但是当患者在手术前接受多柔比星和环磷酰胺的组合作为最终化学疗法过程时，强制预防性施用G-CSF以降低发热性中性粒细胞减少的风险。
纳入标准
1.诊断为侵袭性乳腺癌的年龄≥18岁的女性的书面知情同意。
2.通过针芯或切开(非切除)活检来组织学证实侵袭性乳腺癌。通过身体检查或放射学研究证实临床阶段T2-4 N0-2或T1 N1-2。
3.记录的乳腺癌基因(BRCA)种系突变测试。
4.雌激素受体(ER)-阴性、孕酮受体阴性和人表皮生长因子(HER2)-阴性(三阴性)乳腺癌。
5.ECOG行为状态0-1。
6.在登记后1个月内通过ECG和心脏超声(LVEF或缩短率(shortening fraction))证实正常心脏功能。
7.如CBC和Hgb水平所反映的足够的骨髓功能。
8.随机化前没有怀孕的可能性或妊娠试验阴性血清
排除标准
1.以前的全身或局部区域抗癌疗法，包括对目前乳腺癌有治疗意义的研究药剂。
2.之前用本试验中包括的任何药剂治疗过。
3.转移性乳腺癌
4.在随机化时用卵巢替代疗法或激素试剂或任何雌激素受体调节剂同时治疗。
5.研究登记的12个月内的癫痫发作史。
6.超过1级的任何原因导致的预先存在的神经病变。
7.预先存在的异常低值的白细胞(嗜中性粒细胞)、血小板、红细胞或血红蛋白。
8.除了宫颈癌原位或皮肤基底细胞癌以外的5年内的癌症史。
9.指示对新辅助剂疗法不耐受的医学疾患(不受控的肺部疾病、糖尿病、严重感染、活动性消化性溃疡、凝血障碍、结缔组织病、骨髓抑制性疾病)。
10.肝或肾功能不足。
11.使用地塞米松或高剂量皮质类固醇的禁忌症。
12.充血性心力衰竭或其它严重心脏病的病史，包括不受控的高血压。
13.怀孕或哺乳。
14.在开始本研究治疗之前30天内用任何研究药物治疗。
安全性和耐受性-从不良事件、标准安全实验室(CBC，差异和血小板计数，血清化学和尿分析)、身体检查、生命体征和EKG评估安全性和耐受性。进行多柔比星疗法的护理标准所要求的额外的心脏监测。不良事件由MedDRA系统分类，并且所有不良事件和异常实验室根据严重性使用NCI CTCAEv4.0毒性等级进行分类。在代表性的患者组中评价研究组中IMMU-132和另外的紫杉醇的药代动力学(PK)。结果通过标准PK参数表征，包括峰值和谷值、曲线下面积(AUC)、Cmax和T1/2。通过测量患者血液中的抗RS7和抗SN-38滴度的ELISA测试评估IMMU-132的免疫原性。
统计计划和数据分析-我们旨在通过添加至少20个百分点(增加57％)的IMMU-132来获得临床上有意义的pCR率的增加。对于功效计算(power calculations)，我们假设在没有IMMU-132的对照组中pCR率为35％且在具有IMMU-132的组中为55％。利用1:1随机化和比较比例的标准统计学，每个组至少94例患者将提供80％的功效以95％的置信度检测是否两个组之间存在该优点。因此，该终点所需的最小样本量约为200例患者。
此外，跟踪患者的复发和存活长达5年。加入IMMU-132后无事件生存期(EFS)或总生存期(OS)的10个百分点改善被接受为提供临床显著的益处。几项TNBC研究显示标准新辅助剂化学疗法的3年EFS率为60-80％。对于计算，我们假设在对照组中为70％，因为这是从1157例TNBC患者(43)的大型元分析中确定的，且因此在具有IMMU-132的组中为80％。假设EFS近似为指数衰减函数，中值EFS在对照组中为5.8年且在IMMU-132组中为9.4年，治疗组之间的风险比(HR)为0.62。假设自然增长(accrual)经过不超过3年且分析不早于4年的随访之后，每个组中约200例患者将提供85％的功效以95％的置信度来检测是否在两个组之间存在这种EFS差异。因此，使用EFS来证明临床显著益处，该终点所需的所需样本大小为约400例患者，但是超过10％以提供退出，我们估计招募440例患者进行该试验。
大多数TNBC中的新辅助剂疗法研究考虑复发终点，而不是生存期。虽然这项研究没有促进OS，但是MD Anderson研究(Liedtke等，J Clin Oncol.2008年3月10日；26(8)：1275-1281)报道5年时的OS率接近他们3年时的PFS率。这表明足够的事件将发生在大约另外2年的随访之后，以具有类似功效来证明基于OS的临床显著益处的相同的10个百分点改善度量。
实施例14.hRS7-SN-38(IMMU-132)治疗难治性、转移性、非小细胞肺癌的用途
一例60岁男性被诊断患有非小细胞肺癌。然后患者呈现有测量为6.5cm×4cm的左纵隔块和胸腔积液。在签署知情同意书后，以每隔一周18mg/kg的剂量向患者给予IMMU-132。在前两次注射期间，经历了中性粒细胞减少和腹泻的短暂期，4小时内4次排便，但是这些在2天内解决或响应症状药物。在总共输注6次IMMU-132后，指标病变(index lesion)的CT评价显示22％减少，刚好低于部分响应但是肿瘤明确缩小。当通过CT注意到指标病变直径的总和的45％肿瘤收缩的部分响应，因此根据RECIST标准构成部分响应时，患者再继续这种疗法两个月。
然后给予患者卡铂、贝伐单抗的化学疗法方案6个月并显示响应，然后在进展后，接受用卡铂、依托泊苷、和吉西他滨的另外疗程的化学疗法。纵隔肿瘤用ADC与化学疗法组合的新辅助剂用途消除。
实施例15.用抗MUC5ac-CL2A-SN-38免疫缀合物治疗转移性胰腺癌
该44岁患者具有转移性胰腺癌的病史，在胰腺头部具有胰腺导管腺癌，并且显示出向肝左叶和右叶的转移，前者测量为3×4cm且后者测量为2×3cm。患者被给予吉西他滨疗程，但没有显示客观响应。四周后，向其以8mg/kg的剂量静脉内给予hPAM4-CL2A-SN-38每周两次，持续2周，停一周，然后重复另外2个周期。一周后进行CT研究，并且转移灶消除，原发性肿瘤块减少32％(部分响应)，同时他的血液CA19-9滴度从基线的220降至放射学评价时的75。患者在每次用抗体-药物缀合物治疗后仅显示1级恶心和呕吐，且在最后一次治疗周期结束时显示2级中性粒细胞减少，其在4周后消退。转移性病变的消除和原发性肿瘤的尺寸减小允许手术切除先前不能手术的肿瘤块。手术治疗后6个月，患者没有显示胰腺癌的复发迹象。
实施例16.前-2-吡咯啉并多柔比星(P2PDox)的产生和使用
合成-本文公开了在P2PDox的合成途径中的中间体的结构，以及适用于与抗体或其它蛋白质或含巯基肽缀合的P2PDox的马来酰亚胺衍生物。用于制备示例性P2PDox的一般方案如以下方案1所示。我们进行了1-g规模反应以产生>1g的4,4-二乙酰氧基丁醛，产率为约40％。为了避免使用可能潜在地用氰化物污染产物的氰基硼氢化钠，将还原剂在还原性烷基化中变为三乙酰氧基硼氢化钠。在探索性规模上，记录多柔比星至P2PDox的>80％转化。将其增加至2-g规模以产生>1g的P2PDox(方案1)。通过修改所报道的方法(Nagy等，1998，Proc Natl Acad Sci USA 95：1794-9)来制备4,4-二乙酰氧基丁醛，其是避免有害的臭氧裂解步骤所必需的。用乙酸酐和氯化铟催化随后通过氯化钌和高碘酸钠组合氧化裂解烯烃的市售4-戊烯-1-醛的二乙酰氧基化(Yang&Zhang，2001,66：4814-8)提供了4,4-二乙酰氧基丁醛，其与多柔比星还原偶联得到P2PDox。
包括以下步骤：(i)向乙酸酐(7.45mL)和氯化铟(0.56g)在二氯甲烷(20mL)中的混合物中加入5.05g的4-戊烯-1-醛。10至30分钟后，用25％乙酸钠水溶液(20mL)处理反应混合物，并且用盐水洗涤有机层并干燥。除去溶剂，得到15.3g液体产物，将其用于下一步骤；(ii)将3.5mM氯化钌在水中的储备溶液(69.4mL)加入到步骤(i)产物在二氯甲烷的6:1乙腈-水(350mL)溶液中。分批加入高碘酸钠(29.7g)。反应完成后，如通过TLC分析判断的，将反应混合物用30mL饱和硫代硫酸钠处理，通过硅藻土垫过滤，并蒸发掉乙腈。用乙酸乙酯萃取剩余的水层，用25％乙酸钠、水和盐水洗涤并干燥。通过色谱法在硅胶上纯化粗制物质，使用乙酸乙酯-己烷混合物洗脱。纯产物在下一步中用于多柔比星的还原烷基化；(iii)将1.5克盐酸多柔比星溶于1,1,1,3,3,3-六氟异丙醇(195mL)和二异丙基乙胺(2.7mL)中，并与3.4g(7倍摩尔过量)的步骤(ii)的醛和0.66g三乙酰氧基硼氢化钠反应。反应在10分钟内完成，且产物在硅胶上纯化，使用二氯甲烷-异丙醇混合物洗脱，得到0.96g纯产物。电喷雾质谱显示在m/z 716.2570(M+H)处的质量与产物的结构一致。该结构也通过质子和C-13NMR谱证实。(iv)使用SMCC酰肼将来自步骤iii的P2PDox如下转化为MCC腙：向溶于75mL无水甲醇中的0.6g P2PDox中，并用0.34g的SMCC酰肼处理，基于所使用的P2PDox的量的分光光度定量计算为1.8倍过量。通过HPLC判断转化百分比为88％。LC-MS分析显示在m/z为949.3734(M+H)处有产物峰，与为949.3713(M+H)的计算的质量(m/z)一致。在除去溶剂后，材料原样用于缀合，因为未衍生的起始材料不缀合并在缀合物纯化过程中除去。
方案-1
小规模缀合物制备-缀合物制备遵循用PBS中的TCEP温和还原IgG的链间二硫键，然后偶联至10倍过量的活化的P2PDox的一般方法。在离心的尺寸排阻色谱(SEC)上在于25mM 3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)，pH 6.8中平衡的上，随后经过疏水柱来纯化缀合物。用海藻糖和聚山梨醇酯80配制产物，并冻干。具有4-7个药物/IgG范围内取代的缀合的产物通过尺寸排阻HPLC洗脱为单峰，并通过反相HPLC含有通常<1％的未缀合的游离药物。
扩大的缀合物制备规模-通过抗体的TCEP还原，随后使用12-倍过量的活化的P2PDox，利用作为共溶剂的DMSO(5％v/v)原位缀合，以5g和10g规模来制备人源化抗TROP-2抗体hRS7的缀合物。通过使用25mM MOPS缓冲液(pH 6.8)的切向流过滤纯化产物，20倍渗滤体积用于纯化。产物用25mM海藻糖和0.01％ 80配制，以20mg或100mg批次分装，并冻干。
代表性缀合物
还制备了hPAM4-P2PDox、hLL2-P2PDox和RFB4-P2PDox的缀合物，具有相似的蛋白回收率和纯度(未示出)。
实施例17.使用P2PDox的体外临床前研究
体外细胞结合研究-通过比较缀合物与未缀合抗体的结合的细胞结合测定来确认抗体结合的保留(Chari，2008，Acc Chem Res 41：98-107)。使用适当的靶细胞在4天的MTS测定中测试缀合物的效力。hRS7-P2PDox缀合物在胃(NCI-N87)、胰腺(Capan-1)和乳腺(MDA-MB-468)人癌细胞系中表现出0.35-1.09nM的IC50值，游离药物在相同细胞系中显示0.02-0.07nM效力。
血清稳定性-通过在37℃下以0.2mg/mL的浓度在人血清中孵育来确定原型P2PDox缀合物hRS7-P2PDox的血清稳定性。使用丁基疏水相互作用色谱(HIC)柱通过HPLC分析培养物，其中由于游离药物产生的峰和由于缀合物或较高分子量物质产生的峰之间具有良好的滞留时间分离。该分析显示游离药物没有从缀合物释放，表明缀合物的高血清稳定性。当使用含有与hRS7-P2PDox相同的可裂解接头的hRS7-多柔比星缀合物重复相同实验时，并且其中独立地验证游离药物以96小时的半衰期释放时，在HIC HPLC上观察到清楚形成游离药物峰，即多柔比星峰。
出乎意料的是，确定了P2PDox缀合物牢固地保持在抗体上，因为它将抗体的肽链交联在一起。交联使药物对抗体的附着稳定，使得药物仅在抗体被代谢后在细胞内释放。交联有助于使由循环中释放的游离药物引起的毒性(例如心脏毒性)最小化。以前使用2-PDox肽缀合物失败，因为药物在体内将肽与其它蛋白质或肽交联。对于本发明的缀合物，P2PDox以前药形式连接至链间二硫化物硫醇基团。在注射后很快在体内快速除去前药保护，并且所得缀合物的2-PDox部分使抗体的肽链交联，从而在抗体分子内形成分子内交联。这既稳定ADC，又防止与循环中的其它分子交联。
实施例18：使用P2PDox进行体内临床前研究
概况-通过长度(L)和宽度(W)的卡尺测量确定肿瘤大小，肿瘤体积计算为(LxW2)/2。测量肿瘤，并且小鼠每周称重两次。如果小鼠的肿瘤大小达到>1cm3、失去大于其起始体重的15％或以其它方式变得濒死，则将小鼠安乐死。肿瘤生长数据的统计分析基于曲线下面积(AUC)和存活时间。通过线性曲线建模获得个体肿瘤生长的概况。在生长曲线的统计分析之前，使用f检验来确定组之间的方差相等。使用双尾t检验来评估所有各种治疗组和非特异性对照之间的统计显著性。对于盐水对照分析，使用单尾t检验来评估显著性。使用Prism GraphPad Software(v4.03)软件包(Advanced Graphics Software，Inc.；Encinitas，CA)，用Kaplan-Meier图(对数秩分析)分析存活研究。临床前实验中的所有剂量均以抗体量表示。在药物方面，例如，当使用具有3-6个药物/IgG的ADC时，在20g小鼠中的100μg抗体(5mg/kg)携带1.4μg-2.8μg(0.14-0.17mg/kg)的P2PDox等效剂量。
≥300μg[约10μg P2PDox]的缀合物的单一静脉内剂量是致死的，但是在2周内给予4次45μg剂量被所有动物耐受。使用该给药方案，我们检查了hRS7-P2PDox在2个人肿瘤异种移植物模型Capan-1(胰腺癌)和NCI-N87(胃癌)中的治疗效果。肿瘤移植后7天在裸鼠中开始疗法。在建立的7日龄的Capan-1模型中，100％的已建立的肿瘤迅速消退，没有再生长的迹象(图12)。该结果在重复实验中再现(未示出)。在建立的NCI-N87模型中得出类似的发现(未示出)，其中在70天后施用的第二疗程安全地耐受并导致残余肿瘤的进一步消退(未示出)。靶向Trop-2的内化hRS7-SN-38缀合物提供比弱内化抗CEACAM5抗体hMN-14的缀合物更好的治疗响应(图2)。非靶向抗CD20 ADC hA20-P2PDox是无效的，表明选择性治疗功效(图2)。来自乳腺癌异种移植物(MDA-MB-468)和第二胰腺癌异种移植物(未示出)的数据重复了缀合物的特异性和显著的抗肿瘤作用的相同趋势。
具有6.8或3.7药物/IgG-抗体-药物缀合物(ADC)的取代的hRS7-P2PDox的PK和毒 性-已知携带多达8种超毒性药物/MAb的抗体-药物缀合物(ADC)比未修饰的MAb更快地清除并且增加脱靶毒性，这种发现导致目前使用≤4的药物取代的趋势(Hamblett等，2004，ClinCancer Res 10：7063-70)。制备缀合物并用约6：1和约3：1的平均药物/MAb取代率(MSR)进行评价。向正常小鼠组(n＝5)静脉内施用单剂量的未修饰的hRS7或hRS7-P2PDox，其药物取代为6.8或3.7(相同的蛋白质剂量)，并在注射后30分钟、4小时、24小时、72小时和168小时收集血清样品。通过ELISA分析这些的抗体浓度。在不同时间血清浓度没有显著差异，表明这些被类似清除。PK参数(Cmax，AUC等)是相似的。当以相同剂量的缀合药物施用时，具有更高或更低药物取代的缀合物在裸鼠中具有相似的耐受性。
最小有效剂量(MED)下的治疗效力-在携带NCI-N87人胃癌异种移植物的裸鼠中，通过施用9mg/kg、6.75mg/kg、4.5mg/kg、2.25mg/kg或1mg/kg的单次推注蛋白剂量来评价抗TROP-2抗体缀合物hRS7-P2PDox。当平均肿瘤体积(mTV)为0.256cm3时开始疗法。在第21天，盐水对照组(非处理组)中的mTV为0.801±0.181cm3，其显著大于用9、6.75、4.5或2.25mg/kg剂量治疗的小鼠的如下mTV：分别为0.211±0.042cm3、0.239±0.0,054cm3、0.264±0.087cm3和0.567±0.179cm3(P<0.0047，单尾t检验)。从这些看出，最小有效剂量被判断为2.25mg/kg，而9mg/kg表示MTD。
实施例19.抗体-P2PDox的MTD
比较小鼠中原型抗体hLL1的2-PDox和P2PDox缀合物的MTD研究表明P2PDox缀合物有效得多(未示出)。单次静脉内注射MTD在100至300μg之间。然后使用每次注射25μg至150μg之间的蛋白质剂量，以每四天一次，共四次注射(q4dx4)的时间表来测定多次注射的MTD。在这些剂量下，对动物给予100至600μg之间的累积剂量。下表5总结了各组。
表5.抗体-P2PDox的MTD的剂量和时间表
显示重量损失的图显示在图13A-D中。只有那些用25μg P2PDox-ADC治疗的小鼠仍然没有显示毒性的迹象。这是100μg的累积剂量，其也是作为单次注射施用时的耐受剂量(未示出)。因此，根据该实验，在小鼠中多次注射P2PDox-ADC的MTD为25μg q4dx4。仔细分析数据和重复实验建立了分次给药的MTD为45μg蛋白质剂量的缀合物，每4天施用，持续2周(45μg，q4dx4时间表)。
实施例20.使用P2PDox缀合物的其它研究
在未缀合的hRS7和与每个抗体6个分子的P2PDox缀合的P2PDox-hRS7之间观察到抗体部分与NCI-N87胃癌细胞的结合没有显著性差异(未示出)。对于P2PDox-hMN-15(抗CEACAM6)、P2PDox-hLL2(抗CD22)和P2PDox-hMN-24(抗CEACAM5)缀合物确认了缀合对抗体与靶抗原结合的影响的缺乏。得出结论，P2PDox与抗体的缀合不影响抗体-抗原结合活性。
检查P2PDox-mAb缀合物对靶细胞的细胞毒性。hRS7-P2PDox和hMN-15-P2PDox对MDA-MB-468、AG S、NCI-N87和Capan-1实体瘤细胞系具有细胞毒性(未示出)。hMN-14-P2PDox对Capan-1、BxPC-3和AsPC-1人胰腺肿瘤细胞系和AGS、NCI-N87和LS147T人胃和结肠肿瘤细胞系具有细胞毒性(未示出)。hLL2-P2PDOx对Daudi、Raji、Ramos和JVM-3造血肿瘤细胞系具有细胞毒性(未示出)。缀合物的IC50值在纳摩尔浓度范围内(未示出)。
在植入NCI-N87人胃癌异种移植物的裸鼠中进行进一步的体内功效研究(图14A-F)。使用4×45μg hRS7-P2PDox的一个治疗周期快速消退所有肿瘤(图14D)。在第一周期结束后约2个月开始第二治疗周期，导致除了一个hRS7-P2PDox治疗的动物之外的所有动物完全消退。hA20、hLL1和hMN-14缀合物对肿瘤进展几乎没有影响(图14A、14B、14E和14F)。施用P2PDox-hMN-15导致胃癌的延迟消退，其不如hRS7缀合物有效。
检查改变剂量方案对抗肿瘤功效的影响(图15)。实验在肿瘤植入后9天开始，当时所有组的平均肿瘤体积为0.383cm3并在第93天(疗法开始后84天)结束。在该研究中，180μg的单剂量、90μg的两周剂量和45μg的q4dx4都导致显著增加的存活期(图15)。对于盐水对照，9只小鼠中有0只存活(未示出)。对于接受45μg q4dx4的hRS7-P2PDox的小鼠，9只小鼠中有8只在第94天存活(未示出)。对于每周接受90μg x 2的hRS7-P2PDox的小鼠，9只小鼠中有9只在第94天存活(未示出)。对于接受单剂量的180μg hRS7-P2PDox的小鼠，9只小鼠中78只在第94天存活(未示出)。
在相同的剂量方案中，对照hA20缀合物对存活没有影响(图15)。毒性研究显示，hRS7-P2PDox的三种剂量时间表导致类似的低水平毒性(未示出)。
hRS7-P2PDox缀合物在Capan-1胰腺癌中也有效(未示出)，并且比hRS7-SN-38缀合物更有效地抑制肿瘤生长(未示出)。与hPAM4-SN-38缀合物相比，hPAM4-P2PDox缀合物在抑制Capan-1人胰腺癌的生长方面也更有效(未示出)。在Capan-1肿瘤注射后63天(接种后1天开始疗法)，在盐水对照中10只小鼠中有0只存活；对于用45μg的hPAM4-P2PDox处理2周、每周2次的小鼠，10只小鼠中有10只存活；对于用45μg的hA20-P2PDox处理2周、每周两次的小鼠，10只小鼠中有2只存活；对于用250μg的hPAM4-SN-38处理4周、每周两次的小鼠，10只小鼠中有0只存活；并且对于用250μg的h20-SN-38处理4周、每周两次的小鼠，10只小鼠中有0只存活。
hRS7-P2PDox在抑制PxPC-3胰腺癌的生长方面比hRS7-SN-38显著更有效(未示出)，并且在抑制MDA-MB-468乳腺癌的生长方面比hRS7-SN-38稍微更有效(未示出)。
不同单剂量的hRS7-P2PDox对NCI-N87胃癌异种移植物生长的影响示于图16中。使用单剂量，在90μg或更高时观察到对肿瘤生长的最大作用(图16)。与盐水对照相比，45μg的单剂量是观察到显著存活益处所需的最小剂量(图17)。
与hRS7 IgG相比，测定各种hRS7-ADC缀合物的ADCC活性(图18)。从购自新泽西血液中心的血液纯化PBMC。使用Trop-2阳性人胰腺癌细胞系(BxPC-3)作为靶细胞系，其中效应物与靶标的比例为100:1。将hRS7 IgG介导的ADCC与hRS7-前-2-PDox、hRS7-CL2A-SN-38以及还原和加帽的hRS7-NEM进行比较。所有均以33.3nM使用。
结果示于图18中。总体活性低，但显著。对于hRS7 IgG存在8.5％的特异性裂解，其与hRS7-前-2-PDox没有显著差异。两者均显著优于hLL2对照以及hRS7-NEM和hRS7-SN-38(P<0.02，双尾t-检验)。hRS7-NEM与hRS7-SN-38之间没有差异。
实施例21.用P2PDox-hRS7 ADC治疗三阴性乳腺癌
如上述实施例中所述制备P2PDox-hRS7 ADC。已经历至少两种标准疗法失败的三阴性乳腺癌患者接受3个周期的每3周静脉内注射70mg P2PDox-hRS7。在该剂量水平的P2PDox-hRS7下观察到客观响应，在两个周期的疗法后肿瘤体积平均减少35％。针对人抗hRS7抗体(HAHA)评价的所有血清样品为阴性。手术去除肿瘤后肿瘤块减小。
***
从前面的描述中，本领域技术人员可以容易地确定本发明的基本特征，并且在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对本发明进行各种改变和修改，以使其适应各种使用和条件而无需过度实验。本文引用的所有专利、专利申请和出版物通过引用并入本文。

Claims (12)

1.抗体-药物缀合物(ADC)与至少一种治疗剂在制备用于在手术之前患者的癌症的新辅助剂治疗的药物中的用途，
其中所述ADC中的药物是SN-38，并且所述ADC中的抗体是hRS7；并且
其中所述癌症是三阴性乳腺癌(TNBC)。
2.如权利要求1所述的用途，其中所述ADC包含将所述药物连接至所述抗体的接头。
3.如权利要求2所述的用途，其中所述接头是CL2A。
4.如权利要求1所述的用途，其中所述ADC是hRS7-CL2A-SN-38(IMMU-132)。
5.如权利要求1至4中任一项所述的用途，其中所述至少一种治疗剂选自由以下组成的组：药物、前药、毒素、酶、酪氨酸激酶抑制剂、鞘氨醇抑制剂、免疫调节剂、细胞因子、激素、第二抗体、第二抗体片段、免疫缀合物、放射性核素、反义寡核苷酸、RNAi、抗血管生成剂、促凋亡剂和细胞毒性剂。
6.如权利要求5所述的用途，其中所述药物选自由以下组成的组：5-氟尿嘧啶、阿法替尼、阿普立啶、阿扎利平、阿那曲唑、蒽环、阿西替尼、AVL-101、AVL-291、苯达莫司汀、博来霉素、硼替佐米、伯舒替尼、苔藓抑素-1、白消安、刺孢霉素、喜树碱(camptothecin)、卡铂、10-羟基喜树碱、卡莫司汀、西乐葆、苯丁酸氮芥、顺铂(CDDP)、Cox-2抑制剂、伊立替康(CPT-11)、SN-38、卡铂、克拉屈滨、喜树碱(camptothecans)、克唑替尼、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、达沙替尼、地尼西宝、多西他赛、放线菌素、柔红霉素、多柔比星、2-吡咯啉并多柔比星(2P-DOX)、氰基吗啉代多柔比星、多柔比星葡糖苷酸、表柔比星葡糖苷酸、埃罗替尼、雌莫司汀、表鬼臼毒素、埃罗替尼、恩替诺特、雌激素受体结合剂、依托泊苷(VP16)、依托泊苷葡糖苷酸、磷酸依托泊苷、依西美坦、芬戈莫德、氟尿苷(FUdR)、3',5'-O-二油酰基-FudR(FUdR-dO)、氟达拉滨、氟他胺、法呢基-蛋白转移酶抑制剂、夫拉平度、福他替尼、ganetespib、GDC-0834、GS-1101、吉非替尼、吉西他滨、羟基脲、依鲁替尼、伊达比星、艾德力布、异环磷酰胺、伊马替尼、L-天冬酰胺酶、拉帕替尼、来那度胺、甲酰四氢叶酸、LFM-A13、洛莫司汀、甲二氯二乙胺、美法仑、巯基嘌呤、6-巯基嘌呤、甲氨蝶呤、米托蒽醌、光神霉素、丝裂霉素、米托坦、诺维本、来那替尼、尼罗替尼、亚硝基脲、奥拉帕尼、普卡霉素、丙卡巴肼、紫杉醇、PCI-32765、喷司他汀、PSI-341、雷洛昔芬、司莫司汀、索拉非尼、链脲霉素、SU11248、舒尼替尼、他莫昔芬、替莫唑胺(DTIC的水性形式)、反铂、沙利度胺、硫鸟嘌呤、塞替派、替尼泊苷、拓扑替康、尿嘧啶氮芥、瓦他拉尼、长春瑞滨、长春花碱、长春新碱、长春花生物碱和ZD1839。
7.如权利要求5所述的用途，其中所述放射性核素连接至抗体或抗原结合抗体片段，并且选自由以下组成的组：111In、111At、177Lu、211Bi、212Bi、213Bi、211At、62Cu、67Cu、90Y、125I、131I、133I、32P、33P、47Sc、111Ag、67Ga、153Sm、161Tb、152Dy、166Dy、161Ho、166Ho、186Re、188Re、189Re、211Pb、212Pb、223Ra、225Ac、77As、89Sr、99Mo、105Rh、149Pm、169Er、194Ir、58Co、80mBr、99mTc、103mRh、109Pt、119Sb、189mOs、192Ir、219Rn、215Po、221Fr、225Fm、11C、13N、15O、75Br、198Au、199Au、224Ac、77Br、113mIn、95Ru、97Ru、103Ru、105Ru、107Hg、203Hg、121mTe、122mTe、125mTe、227Th、165Tm、167Tm、168Tm、197Pt、109Pd、142Pr、143Pr、161Tb、57Co、58Co、51Cr、59Fe、75Se、201Tl、76Br和169Yb。
8.如权利要求5所述的用途，其中所述免疫调节剂选自由以下组成的组：细胞因子、趋化因子、干细胞生长因子、淋巴毒素、造血因子、集落刺激因子(CSF)、干扰素、促红细胞生成素、血小板生成素、肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素(IL)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和称为“S1因子”的干细胞生长因子。
9.如权利要求8所述的用途，其中所述细胞因子选自由以下组成的组：人生长激素、N-甲硫氨酰基人生长激素、牛生长激素、甲状旁腺激素、甲状腺素、胰岛素、胰岛素原、松弛素、松弛素原、促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)、促黄体生成激素(LH)、肝生长因子、前列腺素、成纤维细胞生长因子、催乳素、胎盘催乳素、OB蛋白、肿瘤坏死因子-α、肿瘤坏死因子-β、苗勒氏管抑制物、小鼠促性腺激素相关肽、抑制素、激活素、血管内皮生长因子、整联蛋白、血小板生成素(TPO)、NGF-β、血小板生长因子、TGF-α、TGF-β、胰岛素样生长因子-I、胰岛素样生长因子-II、红细胞生成素(EPO)、骨诱导因子、干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ、巨噬细胞-CSF(M-CSF)、IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-21、IL-25、LIF、FLT-3、血管抑素、血小板反应蛋白、内皮抑制素、肿瘤坏死因子和淋巴毒素。
10.如权利要求8所述的用途，其中所述趋化因子选自由以下组成的组：RANTES、MCAF、MIP1-α、MIP1-β和IP-10。
11.如权利要求5所述的用途，其中所述抗血管生成剂选自由以下组成的组：MIF、D-DT和HMGB-1。
12.如权利要求1所述的用途，其中所述至少一种治疗剂是环磷酰胺、多柔比星和紫杉醇。
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