BR112021004656A2 - conjugado fármaco-ligante de análogo exatecano, método para preparar o mesmo e aplicação do mesmo - Google Patents

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Feng He
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Abstract

A presente invenção refere-se a um conjugado fármaco-ligante de um análogo de exatecano, um método para preparar o mesmo e uma aplicação do mesmo. Especificamente, a presente invenção fornece um conjugado fármaco-ligante possuindo uma estrutura mostrada na fórmula (-D), um método para preparação desse fim, uma composição farmacêutica contendo o mesmo e seu uso na preparação de fármacos para o tratamento de câncer por meio de regulação do receptor. A definição de cada substituinte na fórmula (-D) é a mesma que na descrição.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “CONJU- GADO FÁRMACO-LIGANTE DE ANÁLOGO EXATECANO, MÉTODO PARA PREPARAR O MESMO E APLICAÇÃO DO MESMO”.
CAMPO DE INVENÇÃO
[001] A presente invenção refere-se a um conjugado fármaco-li- gante de análogo exatecan com uma nova estrutura. Especificamente, a presente invenção refere-se a um conjugado fármaco-ligante de aná- logo exatecan com uma unidade estrutural Y, um método para preparar o mesmo, uma composição farmacêutica que compreende o conjugado e um uso do conjugado ou da composição farmacêutica.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[002] A quimioterapia continua sendo uma das terapias anticâncer mais importantes, juntamente com a cirurgia, a radioterapia e a terapia direcionada. Embora existam muitos tipos de citotoxinas altamente efi- cientes, a diferença entre as células tumorais e as células normais é muito pequena, o que limita a ampla aplicação clínica desses compostos anticâncer devido ao efeito colateral tóxico. Os fármacos com anticorpos tornaram-se os fármacos de linha de frente para a terapia antitumoral devido à especificidade do anticorpo monoclonal antitumoral para o an- tígeno de superfície de células tumorais. No entanto, quando o anticorpo é usado sozinho como fármaco antitumoral, a eficácia é frequentemente insatisfatória.
[003] Conjugados de anticorpo e fármaco (ADCs) permitem a com- binação de um anticorpo monoclonal ou um fragmento de anticorpo com uma citotoxina biologicamente ativa através de um ligador quimica- mente estável, aproveitando a especificidade da ligação do anticorpo aos antígenos de superfície de células normais ou células tumorais e a alta eficiência da citotoxina, evitando a baixa eficácia do anticorpo e o efeito colateral tóxico da citotoxina. Isso significa que, em comparação com fármacos convencionais de quimioterapia, conjugados de fármacos de anticorpo podem se ligar com precisão às células tumorais e reduzir o efeito sobre as células normais (Mullard A, (2013) Nature Reviews Drug Discovery, 12: 329-332; DiJoseph JF, Armellino DC, (2004) Blood, 103: 1807-1814).
[004] Em 2000, o primeiro conjugado de anticorpo e fármaco Mylo- targ (gemtuzumab ozogamicina, Wyeth Pharmaceuticals) foi aprovado pela Food e Drug Administration (FDA) dos EUA para o tratamento de leucemia mieloide aguda (Drugs de the Future (2000) 25 (7): 686; US4970198; US 5079233; US 5585089; US 5606040; US 5693762; US 5739116; US 5767285; US 5773001).
[005] Em agosto de 2011, a ADCetris (brentuximab vedotin, Seattle Genetics Inc.) foi aprovado pelo FDA Fast Track dos EUA para o trata- mento de linfoma de Hodgkin e linfoma anaplásico recidivante de gran- des células (Nat. Biotechnol (2003) 21 (7): 778-784; WO2004010957; WO2005001038; US7090843A; US7659241; WO2008025020). Adce- tris8 é um novo fármaco ADC alvo, que permite que o fármaco atue diretamente no CD30 alvo da célula do linfoma, desencadeie a endoci- tose e, consequentemente, induza a apoptose das células tumorais.
[006] Ambos Mylotarg e Adcetris são terapias alvo para tumores hematológicos, cuja estrutura organizacional é relativamente simples em comparação com os tumores sólidos. Em fevereiro de 2013, Kadcyla (ado-trastuzumab emtansina, T-DM1) foi aprovado pela FDA para o tra- tamento de pacientes com câncer de mama avançado ou metastático que são HER2-positivos com Trastuzumab (nome comercial: Hercep- tina)-resistente e paclitaxel-resistente (WO2005037992; US8088387). Kadcyla é um primeiro fármaco ADC aprovada pela FDA para o trata- mento de tumores sólidos.
[007] Existem vários tipos de pequenas moléculas citotóxicas usa- das no conjugado anticorpo fármaco, um dos quais é derivado de camp-
totecina, que mostra efeito antitumoral por inibir a topoisomerase |. Do- cumentos relatando o uso do derivado de camptotecina, exatecan (nome químico: (18,98S)-1-amino-9-etil-5-fluoro-2,3-di-hidro-9-hidróxi-4-metil-1AH, — 12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]imidazo[1,2-b]quinolina-10,13(9H,15H)-diona) em conjugado de fármaco anticorpo (ADC) compreende WO?2014057687, Clinical Cancer Research (2016) 22 (20): 5097-5108, e Cancer Sci (2016) 107: 1039-1046. No entanto, um maior desenvolvi- mento de fármaco ADC com melhor eficácia ainda é necessário.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[008] A fim de melhorar o ligante, especialmente o efeito de aco- plamento entre o anticorpo e o fármaco, a presente invenção fornece um conjugado fármaco-ligante ou um sal ou solvato farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que o conjugado fármaco-ligante compreende uma estrutura de fórmula (-D): vd e O. DS F 1 E Xeon o (Do) em que:
[009] Y é selecionado a partir do grupo consistindo em -O- (CRºRP)M-CRIR2-C(O0)-, -O-CRIR2-= (CRºR?)m-, -O-CRIR2-, -NH- (CRºRº)Mm-CRIR2-C(O)- e -S-(CRºRP)m-CR!R2-C(O)-;
[010] Rº e RP são idênticos ou diferentes e são, cada um, indepen- dentemente selecionados a partir do grupo consistindo em átomo de hidrogênio, átomo de deutério, halogênio, alquila, haloalquila, alquila deuterada, alcóxi, hidróxi, amino, ciano, nitro, hidroxialquila, cicloalquila e heterociclila;
[011] ou, Rº e Rº juntos com o átomo de carbono ao qual eles estão ligados formam uma cicloalquila ou heterociclila;
[012] R' é selecionado a partir do grupo consistindo em halogênio, alquila deuterada, cicloalquila, cicloalquilalquila, heterociclila, arila e he- teroarila;
[013] R? é selecionado a partir do grupo consistindo em átomo de hidrogênio, halogênio, haloalquila, alquila deuterada, cicloalquila, ciclo- alquilalquila, alcoxialquila, heterociclila, arila e heteroarila;
[014] ou, R' e R? juntos com o átomo de carbono ao qual eles es- tão ligados formam uma cicloalquila ou heterociclila;
[015] ou, Rº e R? juntos com o átomo de carbono ao qual eles es- tão ligados formam uma cicloalquila ou heterociclila;
[016] em que, a linha ondulada em -D representa um átomo de hidrogênio, ou uma ligação covalente a uma unidade ligador ou um an- ticorpo que se liga ao antígeno expresso pela célula alvo;
[017] m é um inteiro de 0 a 4.
[018] Em algumas modalidades da presente invenção, o conju- gado fármaco-ligante fornecido ou o sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo é um composto com a Fórmula (-D:) ou um conju- gado fármaco-ligante do mesmo ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo: o oia to o OE 4 “oH 9 (-D) em que:
[019] R' é uma cicloalquilalquila ou cicloalquila, e preferivelmente C3-6 cicloalquilalquila ou Ca-6 cicloalquila;
[020] R? é selecionado a partir do grupo consistindo em átomo de hidrogênio, haloalquila e C3. cicloalquila, e preferivelmente átomo de hidrogênio;
[021] ou, R' e R? juntos com o átomo de carbono ao qual eles es- tão ligados formam uma Cz.6 cicloalquila;
[022] a linha ondulada na Fórmula -D: representa um átomo de hidrogênio, ou uma ligação covalente a uma unidade ligador ou um an- ticorpo que se liga ao antígeno expresso pela célula alvo;
[023] mébou.
[024] Em algumas modalidades da presente invenção, o conju- gado fármaco-ligante fornecido ou o sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo é um conjugado fármaco-ligante de Fórmula (Pc-L- Y-Dr) ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo: os | (PeL-Y-Dr) em que:
[025] Y é selecionado a partir do grupo consistindo em -O- (CRºRP)m-CRIR2-C(O0)-, — -O-CRIR2-(CRºR?)m-, — -O-CRIR2-, — -NH- (CRºRº)m-CR'R2-C(O)- e -S-(CRºRº)n-CR'R2-C(O)-;
[026] Rº e R? são idênticos ou diferentes e são, cada um, indepen- dentemente selecionados a partir do grupo consistindo em átomo de hidrogênio, átomo de deutério, halogênio, alquila, haloalquila, alquila deuterada, alcóxi, hidróxi, amino, ciano, nitro, hidroxialquila, cicloalquila e heterociclila;
[027] ou, Rº e Rº juntos com o átomo de carbono ao qual eles es- tão ligados formam uma cicloalquila ou heterociclila;
[028] R' é selecionado a partir do grupo consistindo em halogênio, haloalquila, alquila deuterada, cicloalquila, cicloalquilalquila, alcoxial- quila, heterociclila, arila e heteroarila;
[029] R? é selecionado a partir do grupo consistindo em átomo de hidrogênio, halogênio, haloalquila, alquila deuterada, cicloalquila, ciclo- alquilalquila, alcoxialquila, heterociclila, arila e heteroarila;
[030] ou, R' e R? juntos com o átomo de carbono ao qual eles es- tão ligados formam uma cicloalquila ou heterociclila;
[031] ou, Rº e R? juntos com o átomo de carbono ao qual eles es- tão ligados formam uma cicloalquila ou heterociclila;
[032] m é um inteiro de 0 a 4;
[033] n é 1 a 10, que pode ser um inteiro ou um decimal;
[034] Pc é um ligante; e L é uma unidade ligadora.
[035] Em algumas modalidades da presente invenção, no conju- gado fármaco-ligante fornecido ou o sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo,
[036] -Y- é -O-(CRºRP)M-CR!R2-C(O)-;
[037] Rº e R? são idênticos ou diferentes e são, cada um, indepen- dentemente selecionados a partir do grupo consistindo em átomo de hidrogênio, átomo de deutério, halogênio e alquila;
[038] R' é uma C3.6 cicloalquilalquila ou C3-6 cicloalquila;
[039] R? é selecionado a partir do grupo consistindo em átomo de hidrogênio, haloalquila e C3. cicloalquila, e preferivelmente átomo de hidrogênio;
[040] ou, R' e R? juntos com o átomo de carbono ao qual eles es- tão ligados formam uma Cz.6 cicloalquila;
[041] mébou.
[042] Em algumas modalidades da presente invenção, no conju- gado fármaco-ligante fornecido ou o sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo, a unidade estrutural -Y- é -O-(CH2)M-CR'R2-C(O)-;
[043] R' é uma C3.6 cicloalquilalquila ou C3-6 cicloalquila;
[044] R? é selecionado a partir do grupo consistindo em átomo de hidrogênio, haloalquila e C3.6 cicloalquila;
[045] ou, R' e R? juntos com o átomo de carbono ao qual eles es- tão ligados formam uma Cz.6 cicloalquila;
[046] mébou.
[047] Em algumas modalidades da presente invenção, no conju- gado fármaco-ligante fornecido ou o sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo, a unidade estrutural -Y- é -O-(CH2)M-CR!R2-C(O)-;
[048] R' é uma C3.6 cicloalquilalquila ou C3-6 cicloalquila;
[049] R? é um átomo de hidrogênio;
[050] ou, R' e R? juntos com o átomo de carbono ao qual eles es- tão ligados formam uma Cz.6 cicloalquila;
[051] mébou.
[052] Em algumas modalidades da presente invenção, no conju- gado fármaco-ligante fornecido ou o sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo, a unidade estrutural -Y- é -O-(CH2)M-CR!R2-C(O)-;
[053] R' é uma Ca.6 cicloalquilalquila ou C3.6 cicloalquila;
[054] R? é um átomo de hidrogênio;
[055] ou, R' e R? juntos com o átomo de carbono ao qual eles es- tão ligados formam uma Cz.6 cicloalquila;
[056] mé o.
[057] Em algumas outras modalidades da presente invenção, no conjugado fármaco-ligante fornecido ou o sal farmaceuticamente acei- tável ou solvato do mesmo, a unidade estrutural -Y- é selecionada a par- tir do grupo consistindo em: j F3;C to, de o oo 10Ro 40X x 10% x o o o o Rx e o.
[058] Em algumas outras modalidades da presente invenção, no conjugado fármaco-ligante fornecido ou o sal farmaceuticamente acei- tável ou solvato do mesmo, o terminal O de -Y- é conectado à unidade ligadora L.
[059] Em algumas outras modalidades da presente invenção, o conjugado fármaco-ligante fornecido ou o sal farmaceuticamente acei- tável ou solvato do mesmo é um conjugado fármaco-ligante de Fórmula (Pc-L-D1) ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo: RR O n
A IA F o Ao (Pe-L-D) em que:
[060] R' é uma cicloalquilalquila ou cicloalquila, e preferivelmente C3-6 cicloalquilalquila ou Ca-6 cicloalquila;
[061] R? é selecionado a partir do grupo consistindo em átomo de hidrogênio, haloalquila e C3. cicloalquila, e preferivelmente átomo de hidrogênio;
[062] ou, R' e R? juntos com o átomo de carbono ao qual eles es- tão ligados formam uma Cz.6 cicloalquila;
[063] mébou;
[064] n é 1 a 10, que pode ser um inteiro ou um decimal;
[065] Pc é um ligante; e L é uma unidade ligadora.
[066] Em outra modalidade preferida da presente invenção, no conjugado fármaco-ligante ou o sal farmaceuticamente aceitável ou sol- vato do mesmo de acordo com a presente invenção, n é 2 a 8, que pode ser um inteiro ou um decimal; e preferivelmente n é 3 a 8, que pode ser um inteiro ou um decimal.
[067] Em outra modalidade preferida da presente invenção, no conjugado fármaco-ligante ou o sal farmaceuticamente aceitável ou sol- vato do mesmo de acordo com a presente invenção, a unidade ligadora
Lé-LiLLô-L-,
[068] L' é selecionado a partir do grupo consistindo em -(succini- mida-3-il-N)-W-C(O)-, -CH2-C(O)-NR3-W-C(O)- e -C(O)-W-C(O)-, em que W é selecionado a partir do grupo consistindo em C1-8 alquila, C1-8 alquil-cicloalquila e heteroalquila linear compreendendo 1 a 8 átomo(s), a heteroalquila compreende 1 a 3 heteroátomo(s) selecionados a partir do grupo consistindo em N, O e S, em que a C1.6 alquila, cicloalquila e heteroalquila linear são cada uma independente, opcional e ainda subs- tituídas por um ou mais substituinte(s) selecionados a partir do grupo consistindo em halogênio, hidróxi, ciano, amino, alquila, cloroalquila, al- quila deuterada, alcóxi e cicloalquila;
[069] L? é selecionado a partir do grupo consistindo em - NR*(CH2CH20)p! CH2CH2C(O)-, -NR*(CH2CH20)p? CH2C(O)-, - S(CH2)p'C(O)- e uma ligação química, em que p'* é um inteiro de 1 a 20; e L? é preferivelmente uma ligação química;
[070] Lô é um resíduo de peptídeo composto de 2 a 7 aminoácidos, em que os aminoácidos são opcional e ainda substituídos por um ou mais substituinte(s) selecionados a partir do grupo consistindo em halo- gênio, hidróxi, ciano, amino, alquila, cloroalquila, alquila deuterada, alcóxi e cicloalquila;
[071] Lº é selecionado a partir do grupo consistindo em - NR%(CR6Rº).-, -C(O)NRS, -C(O)NR%(CH2):- e uma ligação química, em que t é um inteiro de 1 a 6; e Lº é preferivelmente -NRº(CRºR”)t-;
[072] R3, Rº e Rº são idênticos ou diferentes e são, cada um, inde- pendentemente selecionados a partir do grupo consistindo em átomo de hidrogênio, alquila, haloalquila, alquila deuterada e hidroxialquila;
[073] R$ e R7 são idênticos ou diferentes e são, cada um, indepen- dentemente selecionados a partir do grupo consistindo em átomo de hidrogênio, halogênio, alquila, haloalquila, alquila deuterada e hidroxial- quila.
[074] Em algumas outras modalidades da presente invenção, no conjugado fármaco-ligante ou o sal farmaceuticamente aceitável ou sol- vato do mesmo, a unidade ligadora L' é selecionado a partir do grupo consistindo em -(succinimida-3-il-N)-(CH2)s'-C(O)-, -(succinimida-3-il- N)-CHa-ciclohexil-C(O)-, — -(succinimida-3-il-N)-(CH2CH20)s2-CH2CH>- C(O)-, -CH2-C(O)-NR3-(CH2)s?-C(O)- e -C(O)-(CH2)sº*C(O)-, em que s' é um inteiro de 2 a 8, s? é um inteiro de 1 a 3, sê é um inteiro de 1a 8, e s* é um inteiro de 1 a 8; e s' é preferivelmente 5.
[075] Em algumas outras modalidades da presente invenção, no conjugado fármaco-ligante ou o sal farmaceuticamente aceitável ou sol- vato do mesmo, a unidade ligadora L? é selecionado a partir do grupo consistindo em -NRº(CH2CH20)p?' CH2C(O)- e uma ligação química, em que p' é um inteiro de 6 a 12.
[076] Em algumas outras modalidades da presente invenção, no conjugado fármaco-ligante fornecido ou o sal farmaceuticamente acei- tável ou solvato do mesmo, Lº é selecionado a partir de -NRÍ(CR6R)t-, R$ é selecionado a partir do grupo consistindo em átomo de hidrogênio e alquila, Rº e R são idênticos ou diferentes e são, cada um, indepen- dentemente selecionados a partir do grupo consistindo em átomo de hidrogênio e alquila, t é 1 ou 2, e preferivelmente 2; Lº é preferivelmente -NR5CRºR7-; e Lº é mais preferivelmente -NHCH>-.
[077] Em algumas outras modalidades da presente invenção, no conjugado fármaco-ligante fornecido ou o sal farmaceuticamente acei- tável ou solvato do mesmo, a unidade ligadora -L- é -L1-L2-L3-L4-, o o MÁ,
[078] Lté O e es' é um inteiro de 2a 8;
[079] L? é uma ligação química;
[080] Lô é um resíduo de tetrapeptídeo;
[081] Lº é -NR(CRSR)t-, Rº é selecionado a partir do grupo con-
sistindo em átomo de hidrogênio e alquila, R$ e R7 são idênticos ou di- ferentes e são, cada um, independentemente selecionados a partir do grupo consistindo em átomo de hidrogênio e alquila, e té 1 ou 2.
[082] Em algumas outras modalidades da presente invenção, no conjugado fármaco-ligante fornecido ou o sal farmaceuticamente acei- tável ou solvato do mesmo, a unidade ligadora -L- é -L1-L2-L3-L4-,
[083] L' é -(succinimida-3-il-N)-CH2-ciclohexil-C(O)-;
[084] L? é -NR*(CH2CH20)aCH2C0(O)-;
[085] L? é um resíduo de tetrapeptídeo;
[086] Lº é -NRS(CR6R)t-, Rº é selecionado a partir do grupo con- sistindo em átomo de hidrogênio e alquila, R$ e R7 são idênticos ou di- ferentes e são, cada um, independentemente selecionados a partir do grupo consistindo em átomo de hidrogênio e alquila, e té 1 ou 2.
[087] Em algumas outras modalidades da presente invenção, no conjugado fármaco-ligante fornecido ou o sal farmaceuticamente acei- tável ou solvato do mesmo, o resíduo de peptídeo de Lº é um resíduo de aminoácido composto de um, dois ou mais aminoácido(s) seleciona- dos a partir do grupo consistindo em fenilalanina (E), glicina (G), valina (V), lisina (K), citrulina, serina (S), ácido glutâmico (E) e ácido aspártico (N), preferivelmente um resíduo de aminoácido composto de um, dois ou mais aminoácido(s) selecionados a partir do grupo consistindo em fenilalanina e glicina, mais preferivelmente o resíduo de tetrapeptídeo, e o mais preferivelmente o resíduo de tetrapeptídeo de GGFG (glicina- glicina-fenilalanina-glicina).
[088] Em algumas outras modalidades da presente invenção, no conjugado fármaco-ligante fornecido ou o sal farmaceuticamente acei- tável ou solvato do mesmo, o L' terminal de uma unidade ligadora -L- é conectado ao ligante, e o Lº terminal de uma unidade ligadora -L- é co- nectado a Y.
[089] Em algumas outras modalidades da presente invenção, no conjugado fármaco-ligante fornecido ou o sal farmaceuticamente acei- tável ou solvato do mesmo, -L-Y- é: 6 Rº 9 spo Ró
[090] L' é selecionado a partir do grupo consistindo em -(succini- mida-3-il-N)-(CH2)s*-C(O)- e -(succinimida-3-il-N)-CH>2-ciclohexil-C(O)-;
[091] L? é -NR*(CH2CH20)p! CH2C(O)- ou uma ligação química, e p' é um inteiro de 6 a 12;
[092] L? é um resíduo de tetrapeptídeo de GGFG;
[093] R' é uma cicloalquilalquila ou cicloalquila, e preferivelmente C3-6 cicloalquilalquila ou Ca-6 cicloalquila;
[094] R? é selecionado a partir do grupo consistindo em átomo de hidrogênio, haloalquila e C3. cicloalquila, e preferivelmente átomo de hidrogênio;
[095] ou, R' e R? juntos com o átomo de carbono ao qual eles es- tão ligados formam uma Cz.6 cicloalquila;
[096] Rº é selecionado a partir do grupo consistindo em átomo de hidrogênio e alquila, e Rô e R? são idênticos ou diferentes e são, cada um, independentemente selecionados a partir do grupo consistindo em átomo de hidrogênio e alquila;
[097] s! é um inteiro de 2 a 8, e preferivelmente 5;
[098] m é um inteiro de 0 a 4.
[099] Em algumas outras modalidades da presente invenção, no conjugado fármaco-ligante fornecido ou o sal farmaceuticamente acei- tável ou solvato do mesmo, -L-Y- é: 6R7 o o Ró
LN o e preferivelmente é:
GA SE om ds o So Y RIR?
LN o
[100] L? é -NR*(CH2CH20)aCH2C0(O)-;
[101] L? é um resíduo de tetrapeptídeo de GGFG;
[102] R' é uma cicloalquilalquila ou cicloalquila, e preferivelmente C3-6 cicloalquilalquila ou Ca-6 cicloalquila;
[103] R? é selecionado a partir do grupo consistindo em átomo de hidrogênio, haloalquila e C3. cicloalquila, e preferivelmente átomo de hidrogênio;
[104] ou, R' e R? juntos com o átomo de carbono ao qual eles es- tão ligados formam uma Cz.6 cicloalquila;
[105] R$ é selecionado a partir do grupo consistindo em átomo de hidrogênio e alquila, e Rô e R? são idênticos ou diferentes e são, cada um, independentemente selecionados a partir do grupo consistindo em átomo de hidrogênio e alquila;
[106] m é um inteiro de 0 a 4.
[107] Em algumas outras modalidades da presente invenção, no conjugado fármaco-ligante fornecido de Fórmula (Pc-L-Y-Dr) ou o sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo, -L-Y- is o 6R o O Ró
[108] L? é uma ligação química;
[109] Lô é um resíduo de tetrapeptídeo de GGFG;
[110] R' é uma cicloalquilalquila ou cicloalquila, e preferivelmente C3-6 cicloalquilalquila ou Ca-6 cicloalquila;
[111] R? é selecionado a partir do grupo consistindo em átomo de hidrogênio, haloalquila e C3. cicloalquila, e preferivelmente átomo de hidrogênio;
[112] ou, R' e R? juntos com o átomo de carbono ao qual eles es- tão ligados formam uma Cz.6 cicloalquila;
[113] R$ é selecionado a partir do grupo consistindo em átomo de hidrogênio e alquila, e Rô e R? são idênticos ou diferentes e são, cada um, independentemente selecionados a partir do grupo consistindo em átomo de hidrogênio e alquila;
[114] s! é um inteiro de 2 a 8, e preferivelmente 5;
[115] m é um inteiro de 0 a 4.
[116] Outro aspecto da presente invenção fornece um conjugado fármaco-ligante ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo, em que um conjugado fármaco-ligante contém uma estrutura de Fórmula (-L-Y-): 6 RI o o Ró
[117] que pode ser usada para formar um conjugado fármaco-li- gante conectando o fármaco e o ligante via um fragmento de ligador; em que:
[118] L' é selecionado a partir do grupo consistindo em -(succini- mida-3-il-N)-(CH2)s*-C(O)- e -(succinimida-3-il-N)-CH>2-ciclohexil-C(O)-;
[119] L? é -NR*(CH2CH20)p! CH2C(O)- ou uma ligação química, e p' é um inteiro de 1 a 20;
[120] L? é um resíduo de tetrapeptídeo de GGFG;
[121] R' é uma cicloalquilalquila ou cicloalquila, e preferivelmente C3-6 cicloalquilalquila ou Ca-6 cicloalquila;
[122] R? é selecionado a partir do grupo consistindo em átomo de hidrogênio, haloalquila e C3. cicloalquila, e preferivelmente átomo de hidrogênio;
[123] ou, R' e R? juntos com o átomo de carbono ao qual eles es- tão ligados formam uma Cz.6 cicloalquila;
[124] R>, Rº e R7 são idênticos ou diferentes e são, cada um, inde- pendentemente selecionados a partir do grupo consistindo em átomo de hidrogênio e alquila;
[125] s! é um inteiro de 2a 8;
[126] m é um inteiro de 0 a 4.
[127] Outro aspecto da presente invenção fornece um conjugado fármaco-ligante ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo, em que um conjugado fármaco-ligante compreende contém uma estrutura de Fórmula (-L-Y-): o 6 R7 [o] AA Ato 0 Rô CLY)
[128] em que:
[129] L? é uma ligação química;
[130] L? é um resíduo de tetrapeptídeo de GGFG;
[131] R' é uma cicloalquilalquila ou cicloalquila, e preferivelmente C3-6 cicloalquilalquila ou Ca-6 cicloalquila;
[132] R? é selecionado a partir do grupo consistindo em átomo de hidrogênio, haloalquila e C3. cicloalquila, e preferivelmente átomo de hidrogênio;
[133] ou, R' e R? juntos com o átomo de carbono ao qual eles es- tão ligados formam uma Cz.6 cicloalquila;
[134] Rº é selecionado a partir do grupo consistindo em átomo de hidrogênio e alquila, e Rô e R? são idênticos ou diferentes e são, cada um, independentemente selecionados a partir do grupo consistindo em átomo de hidrogênio e alquila;
[135] s'! é um inteiro de 2a 8;
[136] m é um inteiro de 0 a 4.
[137] Em algumas outras modalidades da presente invenção, o conjugado fármaco-ligante fornecido de Fórmula (Pc-L-Y-Dr) ou o sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo é um conjugado fár- maco-ligante de Fórmula (Pc-La-Y-Dr) ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo: oH (Pe-Ly-Y-Dr) º em que:
[138] W é selecionado a partir do grupo consistindo em C1-8 alquila, C'1-8 alquil-cicloalquila e heteroalquila linear compreendendo 1 a 8 átomo(s), a heteroalquila compreende 1 a 3 heteroátomo(s) seleciona- dos a partir do grupo consistindo em N, O e S, em que a C1.68 alquila, cicloalquila e heteroalquila linear são cada uma independente, opcional e ainda substituídas por um ou mais substituinte(s) selecionados a partir do grupo consistindo em halogênio, hidróxi, ciano, amino, alquila, cloro- alquila, alquila deuterada, alcóxi e cicloalquila;
[139] L? é selecionado a partir do grupo consistindo em - NR*(CH2CH20)p?' CH2CH2C(O)-, -NR$(CH2CH20)p?' CH2C(O)-, - S(CH2)p'C(O)- e uma ligação química, em que p' é um inteiro de 1 a 20;
[140] Lô é um resíduo de peptídeo composto de 2 a 7 aminoácidos, o aminoácido pode ser substituído ou não substituído, quando substitu- ído, o grupo(s) substituinte pode ser substituído em qualquer ponto de conexão disponível, o grupo(s) substituinte é um ou mais grupo(s) inde- pendentemente selecionados a partir do grupo consistindo em halogê- nio, hidróxi, ciano, amino, alquila, cloroalquila, alquila deuterada, alcóxi e cicloalquila;
[141] R' é selecionado a partir do grupo consistindo em halogênio, cicloalquilalquila, alquila deuterada, cicloalquila, heterociclila, arila e he- teroarila, preferivelmente cicloalquilalquila ou cicloalquila, e mais prefe- rivelmente C3-6 cicloalquilalquila ou C3-6 cicloalquila;
[142] R? é selecionado a partir do grupo consistindo em átomo de hidrogênio, halogênio, haloalquila, alquila deuterada, cicloalquila, hete- rociclila, arila e heteroarila, e preferivelmente átomo de hidrogênio; ou, R' e R? juntos com o átomo de carbono ao qual eles estão ligados for- mam uma cicloalquila ou heterociclila;
[143] Rº e R5 são idênticos ou diferentes e são, cada um, indepen- dentemente selecionados a partir do grupo consistindo em átomo de hidrogênio, alquila, haloalquila, alquila deuterada e hidroxialquila;
[144] Rô e R? são idênticos ou diferentes e são, cada um, indepen- dentemente selecionados a partir do grupo consistindo em átomo de hidrogênio, halogênio, alquila, haloalquila, alquila deuterada e hidroxial- quila;
[145] m é um inteiro de 0 a 4;
[146] n é um inteiro diferente de zero ou decimal a partir de 0 a 10, preferivelmente um inteiro ou decimal a partir de 1 a 10;
[147] Pc é um ligante.
[148] Em algumas outras modalidades da presente invenção, o conjugado fármaco-ligante fornecido de Fórmula (Pc-La-Y-Dr) ou o sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo é um conjugado fár- maco-ligante de Fórmula (Pc-Lv-Y-Dr) ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo: [o o o ORR O 7 TAÇAS a) L tra ão : “ Ja o em que:
[149] s! é um inteiro de 2 a 8, e preferivelmente 5;
[150] Pc, R', R2à, R5-R', m e n são como definidos na Fórmula (Pc- La-Y-Dr).
[151] A unidade ligadora -L-Y- do conjugado fármaco-ligante da presente invenção inclui, mas não é limitada a: o 1 y2 o E) Oo NA No o H Oo n o H Oo
3. o o o o -L-Y3- MA AAA no a o no no n o Lys % o o no Oo 7 NAN No % o H o H o n o LS. % Ê 7 HR KH Y 7 NAN NAAS o no no n o o -L-Ye6- o "nº Oo NA No o H Oo n o 4 o o -L-Y7- o np O e) AA No o H o H o H o o
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[152] Os conjugados fármaco-ligante de Fórmula (Pc-L-Y-Dr) da presente invenção incluem, mas não são limitados a:
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A EL et NAS NF o % on XY Jd" em que Pc e n são como definidos na Fórmula (Pc-La-Y- Dr).
[153] Em algumas outras modalidades da presente invenção, no conjugado fármaco-ligante ou o sal farmaceuticamente aceitável ou sol- vato do mesmo, Pc é um anticorpo ou um fragmento de ligação a antí- geno do mesmo, o anticorpo é selecionado a partir do grupo consistindo em anticorpo quimérico, anticorpo humanizado e anticorpo completa- mente humanizado, e preferivelmente um anticorpo monoclonal.
[154] Em algumas outras modalidades da presente invenção, no conjugado fármaco-ligante ou o sal farmaceuticamente aceitável ou sol- vato do mesmo, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo é selecionado a partir do grupo consistindo em anticorpo anti- HER?2 (ErbB2), anticorpo anti-EGFR, anticorpo anti-B7-H3, anticorpo anti-c-Met, anticorpo anti-HER3 (ErbB3), anticorpo anti-HER4 (ErbB4), anticorpo anti-CD20, anticorpo anti-CD22, anticorpo anti-CD30, anti- corpo anti-CD33, anticorpo anti-CD44, anticorpo anti-CD56, anticorpo anti-CD70, anticorpo anti-CD73, anticorpo anti-CD105, anticorpo anti- CEA, anticorpo anti-A33, anticorpo anti-Cripto, anticorpo anti-EphA2, anticorpo anti-G250, anticorpo anti-MUCI, anticorpo anti-Lewis Y, anti- corpo anti-VEGFR, anticorpo anti-GPNMB, anticorpo antiintegrina, anti- corpo anti-PSMA, anticorpo anti-Tenascin-C, anticorpo anti-SLC44A4 e anticorpo anti-Mesotelina, e fragmentos de ligação a antígeno dos mes- mos.
[155] Em algumas outras modalidades da presente invenção, no conjugado fármaco-ligante ou o sal farmaceuticamente aceitável ou sol- vato do mesmo, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo é selecionado a partir do grupo consistindo em Trastuzumab, Pertuzumab, Nimotuzumab, Enoblituzumab, Emibetuzumab, Inotuzu- mab, Pinatuzumab, Brentuximab, Gemtuzumab, Bivatuzumab, Lorvo- tuzumab, cBR96 e Glematumamab, e fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos.
[156] Os conjugados fármaco-ligante de Fórmula (Pc-L-Y-Dr) da presente invenção incluem, mas não são limitados às seguintes Fórmu- las:
Ss o let o no K o u | Trastuzumab + AA, NA A NAO 7 ADOS “o Ho Ho H AS r / Pr | "NINO | ON! C é or Jd o! < o A o o o Trastuzumab- Fi A, ND Re 3 8 RO R E (TS
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Cr Y ] Ç + o Ho Ho À H Peamer A AI RO, NA A NA so Ho Ho H o AX Pr o NT AF Ns De n Y SS" 7 o - S ) ; CL o no o V H Pertuzumabr PANA NA Ao x o Ho Ho H 2, (. FO o, =/"F FNv A | der Sn ' o |! - SR o e o unoefro x Trastuzumab- Y NA NA NAN Oo N ” ADC-10/ 20 HO HS H o ÁK r ADC-I1 ON dg E
A k e or jo ' o | 7 CL o no o TH f : — Trastuzumab PANA RANA ANA 7 do Ho H H o SA o. (Ad YY" N ' L NO! / o) - RS o A o no Ko H Trastuzumao CA RA NR INE Na) Y N N NO + > <o Ho no H IA kh.
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L YN o 1 7 s A o o o | d H H - tros A NA, NA E O Ss aC! o Ho ho H 270 ON en F
AJ LC O or dn o! em que, n é um inteiro diferente de zero ou decimal a partir de O a 10, preferivelmente n é um inteiro ou decimal a partir de 1 a 10; mais preferivelmente n é 2 a 8, que pode ser um inteiro ou um decimal; e o mais preferivelmente n é 3 a 8, que pode ser um inteiro ou um deci- mal.
[157] Outro aspecto da presente invenção fornece um composto de Fórmula (D) ou um tautômero, mesômero, racemato, enantiômero, diastereômero do mesmo, ou mistura dos mesmos, ou um sal farma- ceuticamente aceitável dos mesmos,
nov" es
S o (0) em que:
[158] Y é selecionado a partir do grupo consistindo em -O- (CRºR?)M-CRIR2-C(O)-, -O-CRIR2- (CRºRP)m -, -O-CRIR2-, -NH- (CRºRº)Mm-CRIR2-C(O)- e -S-(CRºRP)m-CR!R2-C(O)-;
[159] Rº e R? são idênticos ou diferentes e são, cada um, indepen- dentemente selecionados a partir do grupo consistindo em átomo de hidrogênio, átomo de deutério, halogênio, alquila, haloalquila, alquila deuterada, alcóxi, hidróxi, amino, ciano, nitro, hidroxialquila, cicloalquila e heterociclila;
[160] ou, Rº e Rº juntos com o átomo de carbono ao qual eles es- tão ligados formam uma cicloalquila ou heterociclila;
[161] R' é selecionado a partir do grupo consistindo em halogênio, cicloalquilalquila, alquila deuterada, cicloalquila, alcoxialquila, heteroci- clila, arila e heteroarila;
[162] R? é selecionado a partir do grupo consistindo em átomo de hidrogênio, halogênio, haloalquila, alquila deuterada, cicloalquila, ciclo- alquilalquila, alcoxialquila, heterociclila, arila e heteroarila;
[163] ou, R' e R? juntos com o átomo de carbono ao qual eles es- tão ligados formam uma cicloalquila ou heterociclila;
[164] ou, Rº e R? juntos com o átomo de carbono ao qual eles es- tão ligados formam uma cicloalquila ou heterociclila;
[165] m é um inteiro de 0 a 4.
[166] Em uma modalide preferida de outro aspecto da presente invenção, o composto fornecido de Fórmula (D) ou o tautômero, mesô- mero, racemato, enantiômero, diastereômero do mesmo, ou mistura dos mesmos, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é um com- posto de Fórmula (D1) ou um tautômero, mesômero, racemato, enanti- ômero, diastereômero do mesmo, ou mistura dos mesmos, ou um sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos, o
HO PS ITNH RR YO CH. o. ASI ; NA,
AD % soH o DP)
[167] em que: R' é uma C3.6 cicloalquilalquila ou Ca.6 cicloalquila;
[168] R? é selecionado a partir do grupo consistindo em átomo de hidrogênio, haloalquila e C3.6 cicloalquila;
[169] ou, R' e R? juntos com o átomo de carbono ao qual eles es- tão ligados formam uma Cz.6 cicloalquila;
[170] mébou.
[171] Os compostos de Fórmula (D) da presente invenção incluem, mas não são limitados a:
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NÉ FARA 08 F 1 % voH o 1 N(18,95).9-EUi-5-fuoro-9-hidróxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H 12H benzo(delpirano[3' 4:6,Tindoli- Zinof12-blquinolin-1-i1)-1-hidroxiciclopropano-1-carboxamida 1
F
O Ho.
EI à <A 2 > E = > 2 2-Ciclopropil-N-((1S,9S)-9-eli-5-fioro-9-hidróxi-A-metil-10,13-dioxo-1,2,3,9,10,12,13, 15-octahidrobenzo[delpirano(3'.4:.6,7in- dolizino(1,2-blquinolin-1-1)-2-hidroxiacetamida 2.
hr o f Hoy A [Ls
Q o 2º — ? a 20 o, (S)-2-Ciclopropil-N-((1S,9S)-9-etil-5-fiuoro-9-hidróxi-4-metil-10,13-dioxo-1,2,3,9,10,12,13,15-octahidrobenzo[de]pi- rano[3'4'6,Tjindolizino[1,2-bJquinolin-1-1)-2-hidroxiacetamida 2-A |
F oo HO. N Ê n O
N o= 28 — + A 28 o (R)-2-Ciclopropil-N-(1S,9S)-9-eti-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13-dioxo-1,2,3,9,10,12,1315-octahidrobenzo(de]oi- rano[3'4'6,Tjindolizino[1,2-bJquinolin-1-1)-2-hidroxiacetamida 2-B ) HoXLo HN, o +
AA > WS (XIRA +. r o Jon 4 NK(1S,98)-9-Eti-5-fuoro-9-hidróxi-A-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-nexahidro-1H, 12H-benzolde]pirano[3'4'6,Tindoli- zino(1,2-bJquinolin-1-1)-1-hidroxiciclopentano-1-carboxamida 4 p AN, o nO= FP”
XD a F o oH 5 NK(1S,98)-9-Eti-5-fuoro-9-hidróxi-A-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-nexahidro-1H, 12H-benzolde]pirano[3'4'6,Tindoli- Zino(1,2-blquinolin-1-1)-1-(hidroximeti)ciclopropano-1-carboxamida 5 Ho, o HN, o
NOTA Ss 7 SN >) A. F o oH 6 NK(1S,98)-9-Eti-5-fuoro-9-hidróxi-A-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-nexahidro-1H, 12H-benzolde]pirano[3'4'6,Tindoli- zino(1,2-bJquinolin-1-1)-1-(hidroximetil)ciclobutano-1-carboxamida 6 to o
E o nm
NA 7 $$ O o “oH É 7 N(18,98).9-EUi-5-fuoro-9-hidróxi-4-metil-10,13-diox0-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H 12H benzo[delpirano[3:.4:6,Tindoli- zinof12-blquinolin-1-11)-1-hidroxiciclobutano-1-carboxamida 7 o Db F to A A A = 4 Aos
MR ” 124 O* (S)-3-Ciclopropil-N-(1S,98)-9-etl-5-fiuoro-9-hidróxi-A-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H, 12H.benzoldelpi- rano(3'4'6,Tlindolizino(1,2-blquinolin-1-11)-2-hidroxipropanamida 12: o CS Ho. N ra ad q 128 + ou o 128 o (R)-3-Ciclopropi-N4(15,9S)-9-eHi-5-fuoro-9-hidróxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H 12H-benzoldelpi- rano(3'4'6,Tlindolizino(1,2-blquinolin-1-11)-2-hidroxipropanamida 12:8
[172] ou um tautômero, mesômero, racemato, enantiômero, dias- tereômero do mesmo, ou mistura dos mesmos, ou um sal farmaceuti- camente aceitável dos mesmos.
[173] Uma modalidade preferida de outro aspecto da presente in- venção fornece um composto de Fórmula (La-Y-Dr) ou um tautômero, mesômero, racemato, enantiômero, diastereômero do mesmo, ou mis- tura dos mesmos, ou um sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos: o
N Cds Y o R' R? Oo CH; o R NOIS 3 Nº :
ST YD E “OH (LYDN O em que
[174] W é selecionado a partir do grupo consistindo em C1-8 alquila, C'1-8 alquil-cicloalquila e heteroalquila linear compreendendo 1 a 8 átomo(s), a heteroalquila compreende 1 a 3 heteroátomo(s) seleciona- dos a partir do grupo consistindo em N, O e S, em que a C1.68 alquila, cicloalquila e heteroalquila linear são cada uma independente, opcional e ainda substituídas por um ou mais substituinte(s) selecionados a partir do grupo consistindo em halogênio, hidróxi, ciano, amino, alquila, cloro- alquila, alquila deuterada, alcóxi e cicloalquila;
[175] L? é selecionado a partir do grupo consistindo em - NR*(CH2CH20)p?' CH2CH2C(O)-, -NR$(CH2CH20)p?' CH2C(O)-, - S(CH2)p'C(O)- e uma ligação química, em que p' é um inteiro de 1 a 20;
[176] Lô é um resíduo de peptídeo composto de 2 a 7 aminoácidos, em que os aminoácidos são opcional e ainda substituídos por um ou mais substituinte(s) selecionados a partir do grupo consistindo em halo- gênio, hidróxi, ciano, amino, alquila, cloroalquila, alquila deuterada, alcóxi e cicloalquila, quando substituído, o grupo(s) substituinte pode ser substituído em qualquer ponto de conexão disponível, o grupo(s) subs- tituinte é um ou mais grupo(s) independentemente selecionados a partir do grupo consistindo em halogênio, hidróxi, ciano, amino, alquila, cloro- alquila, alquila deuterada, alcóxi e cicloalquila;
[177] R' é selecionado a partir do grupo consistindo em halogênio, cicloalquilalquila, alquila deuterada, cicloalquila, alcoxialquila, heteroci- clila, arila e heteroarila;
[178] R? é selecionado a partir do grupo consistindo em átomo de hidrogênio, halogênio, haloalquila, alquila deuterada, cicloalquila, ciclo- alquilalquila, alcoxialquila, heterociclila, arila e heteroarila; ou, R' e R? juntos com o átomo de carbono ao qual eles estão ligados formam uma cicloalquila ou heterociclila;
[179] Rº e Rº são idênticos ou diferentes e são, cada um, indepen- dentemente selecionados a partir do grupo consistindo em átomo de hidrogênio, alquila, haloalquila, alquila deuterada e hidroxialquila;
[180] Rô e R? são idênticos ou diferentes e são, cada um, indepen- dentemente selecionados a partir do grupo consistindo em átomo de hidrogênio, halogênio, alquila, haloalquila, alquila deuterada e hidroxial- quila;
[181] m é um inteiro de 0 a 4.
[182] Em uma modalide preferida de outro aspecto da presente in- venção, o composto fornecido de Fórmula (La-Y-Dr) ou o tautômero, me- sômero, racemato, enantiômero, diastereômero do mesmo, ou mistura dos mesmos, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, é um composto de Fórmula (Lv-Y-Dr) ou um tautômero, mesômero, racemato, enantiômero, diastereômero do mesmo, ou mistura dos mesmos, ou um sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos: q , >) x NY N "NH E NX TT EO e Vs en, a AAA NA DD,
SS LX-DO % Son ó
[183] em que R', R?à, R5-R7, s' e m são como definidos na Fórmula (La-Y-Dr).
[184] Os compostos de Fórmula (La-Y-Dr) da presente invenção in- cluem, mas não são limitados a: e E E o TÁ o no Hg Oo H Go A, RAÇA A N o Ho no ns o
QN F 8 X 1 bi Pe o
1-(((8)-7-Benzil-20-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-11)-3,6,9,12,15-pentaoxo-2,5,8,11,14-penta-azaicosil)óxi)-N-((1S,98)-9-etil-5-fluoro- 9-hidróxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H, 12H-benzo[delpirano[3' 4':6,7jindolizino[1,2-blquinolin-1-INciclopropano-1- carboxamida 8 F) CA AA AA Ah N ao A a d E EE 8 o 2
NT
LION F com , Z N((108)-10-Benzit-2-ciclopropil-1-(((1S,9S)-9-etil-5-fuoro-9-hidróxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H, 12H-benzoldeloi- rano[3'46,Tlindolizino[1,2-blquinolin-1-iamino)-1,6,9,12,15-pentaoxo-3-oxa-5,8,11,14-tetra-azahexadecan-16-1).6-2,5-dioxo-2,5- dihidro-1H-pirrol-1-iNhexanamida 9 o CX. o HO x o Ya pi ANNA No NA Ô Ho Ho H o. NA o A 9a d ON F soH EN r o N((2R,108)-10-Benzi-2-ciclopropil-1-(((15,9S)-9-etil-5-iuaro-9-hidróxi-A-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H- benzoldelpirano[3 4':6,Tlindolizino[1,2-blquinolin-1-1)amino)-1,6,9,12,15-pentaoxo-3-0xa-5,8,11,14-tetra-azahexadecan-16-1)-6-(2,5- dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-i)hexanamida 9-2 o o o o í H K H Non A, NA NANA, N NO N nO o Ho HO H o, -N
N F o E) Ron o N((25,108) 10-Benzi-2-ciclopropil-1-((15,98)-9-eti-5-fuoro-9-hidróxi-A-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13, 15-hexahidro-1H 12H- benzoldelpirano[3 4':6,Tlindolizino[1,2-blquinolin-1-1)amino)-1,6,9,12,15-pentaoxo-3-0xa-5,8,11,14-tetra-azahexadecan-16-1)-6-(2,5- dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-i)hexanamida 9-8 o (f. f nd | y pi A A HA A AA a A io o no to ú GA O. = / TF " NAN
A O, Lon
Y o | 1-(((8)-7-Benzil-20-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-11)-3,6,9,12,15-pentaoxo-2,5,8,11,14-penta-azaicosil)óxi)-N-((1S,98)-9-etil-5-fluoro- 9-hidróxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H, 12H-benzo[delpirano[3' 4''6,Tindolizino[1,2-bJquinolin-1-IN)ciciobutano-1- carboxamida 11 º o o o * é H H o Gti, ço A o no no 4 ó o 2
NÉ 144 FS F 140 IS! ó NAG2R 108)-10-Benzir-2-(ciclopropilmetil)-1-(((18,95)-9-eH-5-fiuoro-S-hidróxi-d-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H, 12H- benzoldelpirano[3 4':6,Tlindolizino[1,2-blquinolin-1-1)amino)-1,6,9,12,15-pentaoxo-3-0xa-5,8,11,14-tetra-azahexadecan-16-1)-6-(2,5- dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanamida 14-A o D.A JÁ o o fo Go AL FAIA o no ro K o AA
III ATA. 148 & » N-((25,10S)-10-Benzil-2-(ciclopropilmetil)-1-((1S,9S)-9-etil-5-fiuoro-9-hidróxi-A-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H- benzoldelpirano(3' 46, Tlindolizino(1,2-blquinolin-1-l)amino)-1,6,9,12,15-pentaoxo-3-0xa-5,8,11,14-tetra-azahexadecan-16-1)-6-(2,5- dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-i)hexanamida 14-B s * Le ” o o o o ko CAI ALA o A A
A “Pes as o, TI(S)-9-Benzi-22-(2,5-dioxo-2.5-dihidro-1H-pirol-111-58,11,14,17-pentaoxo-2-0xa-4,7,10,13,16-penta-azadocosil)-N-((15,95)-9-241-5- fuoro-B-hidróxict-meti-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H 12H-benzoldelpirano[3,4'6,7iindolizino[1,2-Blquinolin-1-i)ciclopro- pano-1-carboxamida 15 o Lo) Cora Gon PA Lin A ço à
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TA Ad F 16 E So TI(S)-9-Benzi-22-(2,5-dioxo-2.5-dihidro-1H-pirol-111-58,11,14,17-pentaoxo-2-0xa-4,7,10,13,16-penta-azadocosil)-N-((15,95)-9-241-5- fiuoro-9-hidróxi-A-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H 12H-benzofde]pirano[3.4”6,7indotizino[1,2-blquinolin-1-iI)ciclobutano- Tearboxamida 16
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[185] ou um tautômero, mesômero, racemato, enantiômero, dias-
tereômero do mesmo, ou mistura dos mesmos, ou um sal farmaceutica- mente aceitável dos mesmos.
[186] Outro aspecto da presente invenção fornece um método para preparar o composto de Fórmula (D1) ou o tautômero, mesômero, racemato, enantiômero, diastereômero do mesmo, ou mistura dos mes- mos, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, compreendendo a seguinte etapa de: o mo eo o CH: RR À CH; Hot o + -N LA De > -N LA De RR FR De Fr ID % oH % .moH (No) º o) o o) condensando o composto de Fórmula (Y1) e o composto de Fórmula (Dr) para obter o composto de Fórmula (D1), em que: R!, R e m são como definidos na Fórmula (D1).
[187] Outro aspecto da presente invenção fornece um método para preparar o composto de Fórmula (Lv-Y-Dr) ou o tautômero, mesô- mero, racemato, enantiômero, diastereômero do mesmo, ou mistura dos mesmos, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, compreen- dendo a seguinte etapa de: , O A T+ = á À en Cad : AA õ D Í AD om qr 0)
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PL AL” (Y-DO Y suo condensando o composto de Fórmula (IA) e o composto de Fórmula (IB) para obter o composto de Fórmula (Lv-Y-Dr),
em que: R', R?, R5-R7, s! e m são como definidos na Fórmula (Lv-Y-Dr).
[188] Outro aspecto da presente invenção fornece um método para preparar o composto de Fórmula (Lv-Y-Dr) ou o tautômero, mesô- mero, racemato, enantiômero, diastereômero do mesmo, ou mistura dos mesmos, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, compreen- dendo a seguinte etapa de: o o NOx as FÃ o 9 (A No ST TI VE PALA, . AA d o o = Ca ns ie FEAT — AA,
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NA ADE coro AY O fon fas condensando o composto de Fórmula (IA) e o composto de Fórmula (IB) para obter o composto de Fórmula (Lv-Y-Dr), em que: R', R?, R5-R7, s! e m são como definidos na Fórmula (Lv-Y-Dr).
[189] Outro aspecto da presente invenção fornece um método para preparar o conjugado fármaco-ligante de Fórmula (Pc-La-Y-Dr) ou o sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo, compreen- dendo a seguinte etapa de: 2 2 Ar QE Ss + RR o, cn ADAÔMA — d aDO oa o | ÁS or EE NE aos e YO FADA, à ) on d
[190] Pc é acoplado ao composto de Fórmula (La-Y-Dr) após redu- ção para dar o composto de Fórmula (Pc-La-Y-Dr); o agente redutor é preferivelmente TCEP; em que:
[191] Pc é um ligante;
[192] W, L2, Lô, R1, RA, R9-R7, m e n são como definidos na Fór- mula (Pc-La-Y-Dr).
[193] Outro aspecto da presente invenção ainda refere-se a a com- posição farmacêutica compreendendo uma quantidade terapeutica- mente eficaz do conjugado fármaco-ligante ou composto ou o sal farma- ceuticamente aceitável ou solvato do mesmo de acordo com a presente invenção, e um ou mais veículo(s), diluente(s) ou excipiente(s) farma- ceuticamente aceitáveis.
[194] Outro aspecto da presente invenção ainda refere-se a a com- posição farmacêutica compreendendo o composto de Fórmula (D) ou o tautômero, mesômero, racemato, enantiômero, diastereômero do mesmo, ou mistura dos mesmos, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo de acordo com a presente invenção, e um ou mais veículo(s), diluente(s) ou excipiente(s) farmaceuticamente aceitáveis.
[195] Outro aspecto da presente invenção ainda refere-se a um conjugado fármaco-ligante ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo compreendendo um ligante e um fármaco ligada ao ligante, em que um fármaco é selecionada a partir do grupo consistindo no composto de Fórmula (D), o composto de Fórmula (La-Y-Dr), ou o tautômero, mesômero, racemato, enantiômero, diastereômero do mesmo, ou mistura dos mesmos, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo de acordo com a presente invenção, o fármaco é preferivel- mente ligada ao ligante via um ligador, e o ligante é preferivelmente um anticorpo monoclonal.
[196] Outro aspecto da presente invenção ainda refere-se a um método para preparar um conjugado fármaco-ligante ou um sal farma- ceuticamente aceitável ou solvato do mesmo, compreendendo uma etapa de ligar o composto de Fórmula (D), o composto de Fórmula (La- Y-Dr), ou o tautômero, mesômero, racemato, enantiômero, diastereô- mero do mesmo, ou mistura dos mesmos, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo de acordo com a presente invenção ao ligante, pre- ferivelmente via um ligador, e o ligante é preferivelmente um anticorpo monoclonal.
[197] Outro aspecto da presente invenção ainda refere-se a o con- jugado fármaco-ligante ou composto, ou o sal farmaceuticamente acei- tável ou solvato do mesmo de acordo com a presente invenção, para uso como um fármaco.
[198] Outro aspecto da presente invenção ainda refere-se a um uso do conjugado fármaco-ligante ou composto, ou o sal farmaceutica- mente aceitável ou solvato do mesmo, ou a composição farmacêutica compreendendo o mesmo de acordo com a presente invenção na pre- paração de um medicamento para tratar ou prevenir um tumor, e prefe- rivelmente o tumor é um câncer relacionado à expressão de HER?2, HER3 ou EGFR.
[199] Outro aspecto da presente invenção ainda refere-se a um uso do conjugado fármaco-ligante ou composto, ou o sal farmaceutica- mente aceitável ou solvato do mesmo, ou a composição farmacêutica compreendendo o mesmo de acordo com a presente invenção na pre- paração de um medicamento para tratar ou prevenir um câncer, o cân- cer é preferivelmente selecionado a partir do grupo consistindo em cân- cer de mama, câncer de ovário, câncer cervical, câncer uterino, câncer de próstata, câncer de rim, câncer de uretra, câncer de bexiga, câncer de fígado, câncer de estômago, câncer de endométrio, câncer de glân- dula salivar, câncer de esôfago, melanoma, glioma, neuroblastoma, sar- coma, câncer de pulmão (por exemplo, câncer de pulmão de células pequenas e câncer de pulmão de células não pequenas), câncer de có- lon, câncer retal, câncer colorretal, leucemia (por exemplo, leucemia lin- focítica aguda, leucemia mieloide aguda, leucemia promielocítica aguda, leucemia mieloide crônica, leucemia linfocítica crônica), câncer ósseo, câncer de pele, câncer de tireoide, câncer de pâncreas, câncer de prós- tata e linfoma (por exemplo, linfoma de Hodgkin, Linfoma não-Hodgkin, ou linfoma anaplásico recorrente de células grandes).
[200] Outro aspecto da presente invenção ainda refere-se a um método para tratar and/or prevenir um tumor, compreendendo adminis- trar a um paciente em necessidade do mesmo uma quantidade terapeu- ticamente eficaz do conjugado fármaco-ligante ou composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo, ou a composição farmacêutica compreendendo o mesmo de acordo com a presente in- venção, e preferivelmente o tumor é um câncer relacionado à expressão de HER2, HER3 ou EGFR.
[201] Outro aspecto da presente invenção ainda refere-se a um método para tratar ou prevenir um câncer, compreendendo administrar a um paciente em necessidade do mesmo uma quantidade terapeutica- mente eficaz do conjugado fármaco-ligante ou composto, ou o sal far- maceuticamente aceitável ou solvato do mesmo, ou a composição far- macêutica compreendendo o mesmo de acordo com a presente inven- ção, o câncer é preferivelmente selecionado a partir do grupo consis- tindo em câncer de mama, câncer de ovário, câncer cervical, câncer uterino, câncer de próstata, câncer de rim, câncer de uretra, câncer de bexiga, câncer de fígado, câncer de estômago, câncer de endométrio, câncer de glândula salivar, câncer de esôfago, melanoma, glioma, neu- roblastoma, sarcoma, câncer de pulmão (por exemplo, câncer de pul- mão de células pequenas e câncer de pulmão de células não pequenas), câncer de cólon, câncer retal, câncer colorretal, leucemia (por exemplo,
leucemia linfocítica aguda, leucemia mieloide aguda, leucemia promi- elocítica aguda, leucemia mieloide crônica, leucemia linfocítica crônica), câncer ósseo, câncer de pele, câncer de tireoide, câncer pancreático e linfoma (por exemplo, linfoma de Hodgkin, linfoma não-Hodgkin, ou lin- foma anaplásico recorrente de grandes células).
[202] A dosagem do composto ou composição utilizada no método de tratamento da presente invenção irá geralmente variar de acordo com a gravidade da doença, o peso do paciente e a eficácia relativa do composto. No entanto, como um guia geral, uma dose unitária ade- quada pode ser de 0,1 a 1000 mg.
[203] Além do composto ativo, a composição farmacêutica da pre- sente invenção também pode compreender um ou mais auxiliares, in- cluindo preenchedores (diluente), aglutinante, agente umectante, desin- tegrante, excipiente e similares. Dependendo do modo de administração, a composição pode compreender 0,1 a 99% em peso do composto ativo.
[204] A composição farmacêutica contendo o ingrediente ativo pode estar em uma forma adequada para administração oral, por exem- plo, um comprimido, trocisco, pastilha, suspensão aquosa ou oleosa, pó dispersível ou grânulo, emulsão, cápsula dura ou mole, xarope ou elixir. Uma composição oral pode ser preparada de acordo com qualquer mé- todo conhecido na técnica para a preparação de composição farmacêu- tica. Tal composição pode compreender aglutinantes, preenchedores, lubrificantes, desintegrantes ou agentes umectantes farmaceuticamente aceitáveis e similares. Tal composição também pode compreender um ou mais componentes selecionados do grupo que consiste em adoçan- tes, agentes aromatizantes, corantes e conservantes, a fim de fornecer uma formulação farmacêutica agradável e saborosa.
[205] Uma suspensão aquosa compreende um ingrediente ativo em mistura com excipientes adequados para a fabricação de uma sus- pensão aquosa. A suspensão aquosa também pode compreender um ou mais conservantes, um ou mais corantes, um ou mais agentes aro- matizantes e um ou mais adoçantes.
[206] Uma suspensão de óleo pode ser formulada suspendendo o ingrediente ativo em um óleo vegetal. A suspensão de óleo pode com- preender um espessante. Os adoçantes e agentes aromatizantes acima mencionados podem ser adicionados para fornecer uma formulação sa- borosa.
[207] A composição farmacêutica também pode ser um pó disper- sível e grânulo para a preparação de uma suspensão aquosa, que for- nece o ingrediente ativo pela adição de água para misturar com um ou mais dispersante (s), agente (s) umectante (s), agente (s) de suspensão ou conservante (s). Outros excipientes, tais como agentes adoçantes, agentes aromatizantes e agentes corantes também podem ser adicio- nados. Estas composições podem ser preservadas adicionando antioxi- dantes, como ácido ascórbico.
[208] A composição farmacêutica da presente invenção também pode estar na forma de uma emulsão de óleo em água.
[209] A composição farmacêutica pode estar na forma de uma so- lução aquosa injetável estéril. Os veículos ou solventes aceitáveis que podem ser usados são água, solução de Ringer ou solução isotônica de cloreto de sódio. A formulação injetável estéril pode ser uma microemul- são de óleo em água injetável estéril na qual o ingrediente ativo é dis- solvido em uma fase de óleo. Por exemplo, o ingrediente ativo é dissol- vido em uma mistura de óleo de soja e lecitina. A solução de óleo é então adicionada a uma mistura de água e glicerina e processada para formar uma microemulsão. A solução injetável ou microemulsão pode ser intro- duzida na corrente sanguínea de um paciente por injeção em bolus local. Alternativamente, a solução e a microemulsão são preferivelmente ad- ministradas de uma maneira que mantém uma concentração circulante constante do composto da presente invenção. A fim de manter esta con- centração constante, um dispositivo de administração intravenosa con- tínua pode ser usado. Um exemplo de tal dispositivo é Deltec CADD- PLUS. TM. Bomba de injeção intravenosa de 5400.
[210] A composição farmacêutica pode estar na forma de uma sus- pensão aquosa ou oleosa injetável estéril para administração intramus- cular e subcutânea. Tal suspensão pode ser formulada com dispersan- tes adequados ou agentes molhantes e agentes de suspensão como descrito acima de acordo com técnicas conhecidas. A formulação inje- tável estéril também pode ser uma solução ou suspensão injetável es- téril preparada em um diluente ou solvente não tóxico parentericamente aceitável. Além disso, óleos fixos estéreis podem ser facilmente usados como um solvente ou meio de suspensão.
[211] O composto da presente invenção pode ser administrado na forma de um supositório para administração retal. Estas composições farmacêuticas podem ser preparadas misturando o fármaco com um ex- cipiente não irritante adequado que é sólido a temperaturas normais, mas líquido no reto, fundindo-se assim no reto para liberar o fármaco. Esses materiais incluem manteiga de cacau, gelatina de glicerina, óleo vegetal hidrogenado, uma mistura de polietilenoglicóis de vários pesos moleculares e seus ésteres de ácidos graxos.
[212] É bem conhecido pelos versados na técnica que a dosagem de um medicamento depende de uma variedade de fatores, incluindo, mas não se limitando aos seguintes fatores: atividade de um composto específico, idade do paciente, peso do paciente, saúde geral do paci- ente, comportamento do paciente, dieta do paciente, tempo de adminis- tração, via de administração, taxa de excreção, combinação de fárma- cos e similares. Além disso, o tratamento ideal, tal como modo de trata- mento, dose diária do composto de fórmula (1) ou o tipo de sal farma- ceuticamente aceitável do mesmo, pode ser verificado de acordo com regimes terapêuticos tradicionais.
DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[213] Figura 1A: Resultados de teste de estabilidade de plasma de ADC-19 da presente invenção.
[214] Figura 1B: Resultados de teste de estabilidade de plasma de ADC-18 da presente invenção.
[215] Figura 1C: Resultados de teste de estabilidade de plasma de ADC-20 da presente invenção.
[216] Figura 2: Avaliação da eficácia de ADC-21 e ADC-24 da pre- sente invenção em camundongos portando tumor JIMT-1.
[217] Figura 3: Avaliação da eficácia de ADC da presente invenção em tumr de xenoenxerto de célula SK-BR-3 de câncer de mama humano em camundongos nus.
[218] Figura 4: Resultados de teste de estabilidade de plasma de ADC-25 da presente invenção.
[219] Figura 5: Eficácia de ADC da presente invenção em tumor de xenoenxerto de U87NG astroblastoma cerebral humano em camundon- gos nus.
[220] Figura 6: Eficácia de ADC da presente invenção em tumor de xenoenxerto Detroit 562 de células metastáticas de fluido pleural de car- cinoma faringeal humano em camundongos nus.
[221] Figura 7: Eficácia de ADC da presente invenção em tumor de xenoenxerto U87MG de glioma humano em camundongos nus.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Definições
[222] A menos que definido de outra forma, todos os termos técni- cos e científicos usados neste documento são consistentes com o en- tendimento comum daqueles versados na técnica ao qual pertence a presente invenção. Embora quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes aos descritos neste documento possam ser usados na prá- tica ou teste da presente invenção, métodos e materiais preferidos são descritos neste documento. Ao descrever e prever a presente invenção, os seguintes termos são usados de acordo com as seguintes definições.
[223] Quando um nome comercial é usado na presente invenção, o requerente pretende incluir as preparações, o fármaco genérica e os ingredientes ativos do produto sob o nome comercial.
[224] Salvo indicação em contrário, os termos usados na especifi- cação e reivindicações têm os significados descritos abaixo.
[225] "Ligante" refere-se a um composto de macromolécula capaz de reconhecer e se ligar a um antígeno ou receptor associado a uma célula alvo. O papel do ligante é entregar o fármaco à população de células alvo que se liga ao ligante. Esses ligantes incluem, mas não es- tão limitados a, hormônios proteicos, lectinas, fatores de crescimento, anticorpos ou outras moléculas que podem se ligar às células. Em uma modalidade da presente invenção, o ligante é representado por Pc. O ligante pode formar uma ligação com a unidade de ligação por meio de um heteroátomo no ligante. O ligante é preferivelmente um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo. O anticorpo é selecio- nado a partir do grupo que consiste em anticorpo quimérico, anticorpo humanizado, anticorpo totalmente humanizado ou anticorpo murino e, preferivelmente, um anticorpo monoclonal.
[226] O termo "fármaco" refere-se a um fármaco citotóxica, que é representada por Dr, sendo uma molécula química que pode interrom- per fortemente o crescimento normal das células tumorais. Em princípio, todas os fármacos citotóxicas podem matar células tumorais em uma concentração suficientemente alta. No entanto, pode causar a apoptose de células normais e efeitos colaterais graves ao matar células tumorais devido à falta de especificidade. Este termo inclui toxinas, tais como to-
xinas de moléculas pequenas ou toxinas enzimaticamente ativas de ori- gem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal, radioisótopos (por exemplo, radioisótopos de At2!1, [131, [125, y%9o, Re186, Re188, sm'153, Bi212, P3?? and Lu), fármacos tóxicas, fármacos quimioterápicas, antibióticos e enzimas nucleolíticas e, preferivelmente, fármacos tóxicas.
[227] O termo "unidade ligadora", "fragmento de ligação" ou "uni- dade de ligação" refere-se a um fragmento estrutural químico ou ligação, que está ligada a um ligante em uma extremidade e ligada a um fármaco em outra extremidade, ou ligada a outros ligadores e então ligado à fár- maco. As modalidades preferidas da presente invenção são represen- tadas por L e Lº a Li, em que a extremidade L' está ligada ao ligante e a extremidade Lº está ligada à fármaco (Dr) através da unidade estrutu- ral Y.
[228] O ligador, incluindo unidade de extensão, unidade espaça- dora e unidade de aminoácido, pode ser sintetizado por métodos conhe- cidos na técnica, tais como aqueles descritos em US 2005-0238649A1. O ligador pode ser um "ligador clivável" que facilita a liberação do fár- maco na célula. Por exemplo, um ligador lábil a ácido (por exemplo, hi- drazona), um ligador sensível à protease (por exemplo, sensível à pep- tidase), um ligador lábil à luz, um ligador de dimetila ou um ligador con- tendo dissulfeto pode ser usado (Chari et al, Cancer Research 52: 127- 131 (1992); Patente US No. 5.208.020).
[229] O termo "conjugado fármaco-ligante" significa que um ligante está ligado a um fármaco biologicamente ativa por meio de uma unidade de ligação estável. Na presente invenção, o "conjugado fármaco-ligante" é preferivelmente um conjugado anticorpo-fármaco (ADC), o que signi- fica que um anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo está ligado a um fármaco tóxica com atividade biológica por meio de uma unidade de ligação estável.
[230] Os códigos de três letras e os códigos de uma letra para os aminoácidos usados na presente invenção são conforme descritos em J. biol. Chem, 243, p3558 (1968).
[231] O termo "anticorpo" refere-se a imunoglobulina, uma estru- tura de cadeia de quatro peptídeos conectada entre si por uma ligação dissulfeto intercadeia entre duas cadeias pesadas idênticas e duas ca- deias leves idênticas. Diferentes regiões constantes de cadeia pesada de imunoglobulina exibem diferentes composições e sequências de aminoácidos, portanto, apresentam antigenicidade diferente. Conse- quentemente, as imunoglobulinas podem ser divididas em cinco tipos, ou chamados de isotipos de imunoglobulina, a saber IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, com a cadeia pesada correspondente yu, 5, y, a e e£, respectiva- mente. De acordo com a composição de aminoácidos da região de do- bradiça e o número e localização das ligações dissulfeto da cadeia pe- sada, o mesmo tipo de lg pode ainda ser dividido em diferentes subtipos, por exemplo, IgG pode ser dividida em IgG1, IgG2, I9G3 e IgG4. A ca- deia leve pode ser dividida em cadeia K ou À com base em diferentes regiões constantes. Cada cinco tipos de lg podem ter uma cadeia K ou A. Os anticorpos descritos na presente invenção são preferivelmente an- ticorpos específicos contra os antígenos de superfície celular nas célu- las alvo, exemplos não limitativos são um ou mais dos seguintes anti- corpos: anticorpo anti-HER2 (ErbB2), anticorpo anti-EGFR, anticorpo anti-B7-H3, anticorpo anti-c-Met, anticorpo anti-HER3 (ErbB3), anti- corpo anti-HER4 (ErbB4), anticorpo anti-CD20, anticorpo anti-CD22, an- ticorpo anti-CD30, anti Anticorpo CD33, anticorpo anti-CD44, anticorpo anti-CD56, anticorpo anti-CD70, anticorpo anti-CD73, anticorpo anti- CD105, anticorpo anti-CEA, anticorpo anti-A33, anticorpo anti-Cripto, anticorpo anti-EphA?2, anti Anticorpo G250, anticorpo anti-MUCI, anti- corpo anti-Lewis Y, anticorpo anti-VEGFR, anticorpo anti- GPNMB;, anti- corpo antiintegrina, anticorpo anti-PSMA, anticorpo anti-Tenascin-C, an- ticorpo anti-SLC44A4 ou anticorpo anti-mesotelina e, preferivelmente,
Trastuzumab (nome comercial Herceptin), Pertuzumab (também conhe- cido como 2C4, nome comercial Perjeta), Nimotuzumab (nome comer- cial Taixinsheng), Enoblituzumab, Emibetuzumab, Inotuzumab, Pinatu- zumab, Brentuximab, Gemtuzumab, Bivatuzumab, Lorvotuzumab, cBR96 e Glematumamab.
[232] A sequência de cerca de 110 aminoácidos adjacente ao ter- minal N das cadeias pesadas ou cadeias leves do anticorpo é altamente variável, conhecida como região variável (região Fv); o restante da se- quência de aminoácidos adjacente ao terminal C é relativamente estável, conhecido como região constante. A região variável inclui três regiões hipervariáveis (HVR) e quatro regiões de estrutura relativamente con- servadoras (FR). As três regiões hipervariáveis, que determinam a es- pecificidade do anticorpo, também são conhecidas como regiões deter- minantes de complementaridade (CDR). Cada região variável de cadeia leve (LCVR) ou cada região variável de cadeia pesada (HCVR) consiste em três regiões CDR e quatro regiões FR, com ordem sequencial do terminal amino ao terminal carboxila na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. As três regiões CDR da cadeia leve re- ferem-se a LCDR1, LCDR2 e LCDR3; e as três regiões CDR da cadeia pesada referem-se a HCDR1, HCDR2 e HCDR3.
[233] Os anticorpos da presente invenção incluem anticorpos mu- rinos, anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados e anticorpos to- talmente humanizados e, preferivelmente, anticorpos humanizados e anticorpos totalmente humanizados.
[234] O termo "anticorpo murino" na presente invenção refere-se ao anticorpo preparado a partir de murino de acordo com o conheci- mento e habilidades da área. Durante a preparação, o objeto de teste é injetado com antígeno específico, e então um hibridoma expressando o anticorpo que possui a sequência desejada ou características funcionais é isolado.
[235] O termo "anticorpo quimérico" é um anticorpo obtido pela fu- são de uma região variável de um anticorpo murino com uma região constante de um anticorpo humano, e o anticorpo quimérico pode aliviar a resposta imune induzida por anticorpo murino. Para estabelecer um anticorpo quimérico, é estabelecido um anticorpo monoclonal específico murino secretor de hibridoma e um gene de região variável é clonado a partir da célula de hibridoma murino; em seguida, um gene de região constante de anticorpo humano é clonado de acordo com o requisito; e o gene da região constante de humano está conectado ao gene da re- gião variável de murino para formar um gene quimérico, que é subse- quentemente inserido em um vetor de expressão; finalmente, a molé- cula de anticorpo quimérico é expressa em um sistema eucariótico ou procariótico.
[236] O termo "anticorpo humanizado", que também é conhecido como anticorpo enxertado com CDR, refere-se a um anticorpo gerado por enxerto de sequências de CDR murinas na estrutura da região vari- ável de anticorpo humano, ou seja, um anticorpo produzido em diferen- tes tipos de sequências de estrutura de anticorpo da linhagem germina- tiva humana. O anticorpo humanizado pode superar as respostas hete- rólogas induzidas por um grande número de componentes da proteína murina transportados pelo anticorpo quimérico. Essas sequências es- truturais podem ser obtidas a partir de um banco de dados público de DNA cobrindo sequências de genes de anticorpos da linhagem germi- nativa ou referências publicadas. Por exemplo, sequências de DNA de linhagem germinativa de genes de região variável de cadeia leve e pe- sada humana podem ser encontradas no banco de dados de sequência de linhagem germinativa humana "VBase" (disponível na world wide web em: www.mrccpe.com.ac.uk/vbase), também como em Kabat, E A, et al. 1991 Sequences de Proteins de Immunological Interest, 5º Ed. Para evitar uma diminuição na atividade causada pela imunogenicidade diminuída, as sequências estruturais na região variável do anticorpo hu- mano podem ser submetidas a mutações reversas mínimas ou muta- ções reversas para manter a atividade. O anticorpo humanizado da pre- sente invenção também compreende anticorpo humanizado no qual a maturação de afinidade de CDR é realizada por exibição de fago. Docu- mentos que ainda descrevem métodos de uso de anticorpos murinos envolvidos na humanização incluem, por exemplo, Queen et al., Proc., Natl.Acad.Sci.USA, 88, 2869, 1991 e método de Winter e colegas [Jo- nes et a/., Nature, 321, 522 (1986), Riechmann et a/., Nature, 332, 323- 327 (1988), Verhoeyen et al., Science, 239, 1534 (1988)].
[237] O termo "anticorpo totalmente humanizado" também é co- nhecido como "anticorpo monoclonal totalmente humanizado", em que a região variável e a região constante do anticorpo são ambas de origem humana, eliminando a imunogenicidade e os efeitos colaterais. O de- senvolvimento do anticorpo monoclonal passou por quatro estágios, a saber: anticorpo monoclonal murino, anticorpo monoclonal quimérico, anticorpo monoclonal humanizado e anticorpo monoclonal totalmente humanizado. O anticorpo da presente invenção é um anticorpo mono- clonal totalmente humanizado. As tecnologias relacionadas de prepara- ção de anticorpo totalmente humanizado incluem principalmente tecno- logia de hibridoma humano, tecnologia de linfócitos B transformados por EBV, tecnologia de exibição de fago, tecnologia de preparação de anti- corpo transgênico de camundongo, tecnologia de preparação de anti- corpo de célula B única e similares.
[238] O termo "fragmento de ligação a antígeno" refere-se a um ou mais fragmentos de um anticorpo que retém a capacidade de ligação específica ao antígeno. Foi demonstrado que fragmentos de anticorpo de comprimento total podem ser usados para atingir a função de ligação com um antígeno. Os exemplos de fragmentos de ligação no termo "fra- gmento de ligação a antígeno" incluem (i) fragmento Fab, um fragmento monovalente composto de domínios VL, VH, CL e CH1; (ii) fragmento F(ab')2, um fragmento bivalente que compreende dois fragmentos Fab conectados por uma ligação dissulfeto na região de dobradiça; (iii) frag- mento Fd, que consiste nos domínios VH e CH1; (iv) fragmento Fv, que consiste em domínios VH e VL de anticorpo de um braço; (v) domínio único ou fragmento dAb (Ward et a/. (1989) Nature 341:544-546) com- posto de domínio VH; e (vi) uma região determinante de complementa- ridade (CDR) isolada ou (vii) uma combinação de duas ou mais CDRs isoladas opcionalmente conectadas por um ligador sintético. Além disso, embora o domínio VL e o domínio VH do fragmento Fv sejam codifica- dos por dois genes separados, eles podem ser conectados por um liga- dor sintético usando métodos recombinantes, gerando assim uma única cadeia de proteína de uma molécula monovalente formada pelo empa- relhamento do domínio VL e VH (referido como Fv de cadeia simples (scFv); vide, por exemplo, Bird et a/. (1988) Science: 242: 423-426, e Huston et a/. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci USA 85: 5879-5883). Este an- ticorpo de cadeia única também se destina a ser incluído no termo "fra- gmento de ligação a antígeno" do anticorpo. Tais fragmentos de anti- corpo são obtidos usando técnicas convencionais conhecidas pelos ver- sados na técnica, e rastreados para fragmentos funcionais usando o mesmo método que para um anticorpo intacto. Os sítios de ligação a antígeno podem ser produzidos por tecnologia de DNA recombinante ou por ruptura enzimática ou química de uma imunoglobulina intacta. Os anticorpos podem ser anticorpos de diferentes isotipos, por exemplo, IgG (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3 ou subtipo I9G4), IgA1, IgA2, 1gD, IgE ou anticorpo IgM.
[239] Fab é um fragmento de anticorpo obtido pelo tratamento de uma molécula de anticorpo IgG com uma papaína (que cliva o resíduo de aminoácido na posição 224 da cadeia H). O fragmento Fab tem um peso molecular de cerca de 50.000 e tem atividade de ligação a antí- geno, em que cerca de metade do lado terminal N de cadeia H e toda a cadeia L é unida através de uma ligação dissulfeto.
[240] F(ab')2 é um fragmento de anticorpo obtido por digestão da parte a jusante das duas ligações dissulfeto na região de dobradiça de IgG com pepsina, que tem um peso molecular de cerca de 100.000 e tem atividade de ligação a antígeno e compreende duas regiões Fab que são ligadas na posição de dobradiça.
[241] Fab 'é um fragmento de anticorpo obtido pela clivagem da ligação dissulfeto na região de dobradiça de F(ab')2 acima, que tem um peso molecular de cerca de 50.000 e tem atividade de ligação a antí- geno.
[242] Além disso, Fab' pode ser produzido através da inserção de DNA que codifica o fragmento Fab' do anticorpo em um vetor de expres- são procariótica ou vetor de expressão eucariótica que é então introdu- zido em um procariota ou eucariota para expressar o Fab'.
[243] O termo "anticorpo de cadeia simples", "Fv de cadeia sim- ples" ou "scFv" refere-se a uma molécula que compreende um domínio variável de cadeia pesada de anticorpo (ou região; VH) e um domínio variável de cadeia leve de anticorpo (ou região; VL) conectado por um ligador. Tais moléculas de scFv podem ter a estrutura geral de NH2-VL- ligador-VH-COOH ou NH2-VH-ligador-VL-COOH. Um ligador adequado na técnica anterior consiste em sequência de aminoácidos GGGGS re- petida ou variante da mesma, por exemplo, usando uma variante com 1-4 repetições (Holliger et a/. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448). Outros ligadores que podem ser usados para a presente invenção são descritos por Alfthan et a/. (1995), Protein Eng. 8: 725-731, Choi et al. (2001), Eur. J. Immunol. 31: 94-106, Hu et a/. (1996), Cancer Res. 56: 3055-3061, Kipriyanov et al. (1999), J. Mol. Biol. 293: 41-56 e Roovers et al. (2001), Cancer Immunol.
[244] O termo "CDR" refere-se a uma das seis regiões hipervariá- veis dentro do domínio variável de um anticorpo que contribui principal- mente para a ligação a antígeno. Uma das definições mais comumente usadas para as seis CDRs é fornecida por Kabat E. A. et al. (1991) Se- quences de protein de immunological interest. Publicação NIH 91-3242. Tal como no presente documento utilizado, a definição Kabat de CDR aplica-se apenas a CDR1, CDR2 e CDR3 do domínio variável de cadeia leve (CDR L1, CDR L2, CDR L3 ou L1, L2, Lô), bem como CDR?2 e CDR3 do domínio variável de cadeia pesada (CDR H2, CDR H3 ou H2, H3).
[245] O termo "estrutura de anticorpo" refere-se a uma porção do domínio variável VL ou VH, que serve como uma estrutura para o loop de ligação a antígeno (CDR) do domínio variável. Essencialmente, é um domínio variável sem CDR.
[246] O termo "epítopo" ou "determinante antigênico" refere-se a um sítio de um antígeno ao qual uma imunoglobulina ou anticorpo es- pecificamente se liga. Os epítopos incluem tipicamente pelo menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 aminoácidos contíguos ou não contíguos em uma conformação espacial única. Vide, por exemplo, Epitope Mapping Protocols in Metods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996).
[247] Os termos "ligação específica", "ligação seletiva", "ligar sele- tivamente" e "ligar especificamente" referem-se à ligação de um anti- corpo a um epítopo em um antígeno predeterminado. Normalmente, o anticorpo se liga com uma afinidade (KD) de menos do que cerca de 10 7 M, tal como aproximadamente menos do que cerca de 10º M, 10º M ou 100 M ou menos.
[248] O termo "molécula de ácido nucleico" refere-se a uma molé- cula de DNA e uma molécula de RNA. A molécula de ácido nucleico pode ser de filamento simples ou duplo, mas é preferivelmente um DNA de filamento duplo. Um ácido nucleico é "efetivamente ligado" quando é colocado em uma relação funcional com outra sequência de ácido nu- cleico. Por exemplo, se um promotor ou intensificador afeta a transcri- ção de uma sequência de codificação, o promotor ou intensificador é efetivamente ligado à sequência de codificação.
[249] O termo "vetor" refere-se a uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar outro ácido nucleico ao qual foi ligada. Em uma modalidade, o vetor é um "plasmídeo" que se refere a um loop de DNA de filamento duplo circular na qual um segmento de DNA adicional pode ser ligado. Em outra modalidade, o vetor é um vetor viral, em que um segmento de DNA adicional pode ser ligado ao genoma viral. Os vetores descritos neste documento são capazes de se autorreplicar em uma cé- lula hospedeira na qual foram introduzidos (por exemplo, um vetor bac- teriano tendo uma origem de replicação bacteriana e um vetor episso- mal de mamífero) ou podem ser integrados no genoma de uma célula hospedeira após introdução na célula hospedeira, sendo assim repli- cada juntamente com o genoma do hospedeiro (por exemplo, um vetor mamífero não epissomal).
[250] Métodos para produzir e purificar anticorpos e fragmentos de ligação a antígeno são bem conhecidos na técnica, tais como Cold Spring Harbor Antibody Technical Guide, Capítulos 5-8 e 15. O frag- mento de ligação a antígeno também pode ser preparado por métodos convencionais. Os anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno da invenção são geneticamente modificados para adicionar uma ou mais regiões FR humanas em regiões CDR não humanas. A (s) sequência (s) da linhagem germinativa FR humana podem ser obtidas alinhando ban- cos de dados de genes de linhagens germinativas variáveis de anticor- pos humanos IMGT e software MOE do site ImnMunoGeneTics (IMGT) em http://imgt.cinesfft ou do Journal de Immunoglobulins 20011SBNO012441351.
[251] O termo "célula hospedeira" refere-se a uma célula na qual um vetor de expressão foi introduzido. As células hospedeiras podem incluir células bacterianas, microbianas, vegetais ou animais. As bacté- rias suscetíveis de serem transformadas incluem membros de Entero- bacteriaceae, tais como cepas de Escherichia coli ou Salmonella; Baci- llaceae, tais como Bacillus subtilis; Pneumococo; Streptococcus e Hae- mophilus influenzae. Os micro-organismos adequados incluem Saccha- romyces cerevisiae e Pichia pastoris. As linhagens de células hospedei- ras de animais adequadas incluem CHO (linhagem de células de ovário de hamster chinês) e células NSO.
[252] O anticorpo construído geneticamente ou fragmento de liga- ção a antígeno da presente invenção pode ser preparado e purificado por métodos convencionais. Por exemplo, as sequências de cDNA que codificam uma cadeia pesada e uma cadeia leve podem ser clonadas e recombinadas em um vetor de expressão GS. O vetor de expressão de imunoglobulina recombinante pode ser transfectado de forma estável em células CHO. Como uma tecnologia existente mais recomendada, os sistemas de expressão de mamíferos podem resultar na glicosilação de anticorpos, particularmente no sítio terminal N altamente conservado da região Fc. Os clones positivos são expandidos em meio sem soro em um biorreator para produzir anticorpos. O meio de cultura contendo o anticorpo secretado pode ser purificado por técnica convencional. Por exemplo, a purificação é realizada usando uma coluna A ou G Sepha- rose FF que contém um tampão ajustado. Os componentes não especi- ficamente ligados são removidos por eluição. O anticorpo ligado é eluído por um método de gradiente de pH e os fragmentos de anticorpo são detectados por SDS-PAGE e coletados. O anticorpo pode ser filtrado e concentrado por um método convencional. O agregado solúvel e os mul- tímeros também podem ser removidos por métodos convencionais,
como exclusão por tamanho ou troca iônica. O produto resultante pre- cisa ser congelado imediatamente, como a -70 ºC, ou liofilização.
[253] O termo "peptídeo" refere-se a um fragmento composto entre o aminoácido e a proteína, consistindo em duas ou mais moléculas de aminoácidos conectadas entre si por meio de ligações peptídicas. Os peptídeos são fragmentos estruturais e funcionais de proteínas. Hormô- nios, enzimas e similares são essencialmente peptídeos.
[254] O termo "sacarídeo" refere-se a uma macromolécula bioló- gica composta por três elementos de C, H e O, que podem ser divididos em monossacarídeos, dissacarídeos e polissacarídeos.
[255] O termo "sonda fluorescente" refere-se a um tipo de molécu- las fluorescentes com fluorescência característica na região ultravioleta- visíivel-infravermelho próximo. A propriedade de fluorescência da sonda fluorescente (comprimentos de onda de excitação e emissão, intensi- dade, vida útil e polarização, etc.) pode variar sensivelmente de acordo com a propriedade do ambiente, como polaridade, índice de refração, viscosidade, etc. Interação não covalente entre a sonda fluorescente e ácido nucleico (DNA ou RNA), proteína ou outra estrutura macromole- cular permite a alteração de uma ou mais propriedades fluorescentes, que podem ser usadas para estudar a propriedade e o comportamento da substância macromolecular.
[256] O termo "fármaco tóxica" refere-se a uma substância que inibe ou interrompe a função das células e/ou causa a morte ou destrui- ção celular. Fármacos tóxicas incluem toxinas e outros compostos que podem ser usados no tratamento de tumores.
[257] O termo "toxina" refere-se a qualquer substância que pode ter um efeito prejudicial no crescimento ou proliferação de células. As toxinas podem ser toxinas de moléculas pequenas e seus derivados de bactérias, fungos, plantas ou animais, incluindo derivados de camptote- cina, como exatecano, maitansinoide e seus derivados (CN101573384),
como DM1, DM3, DMA4, auristatina F (AF) e seus derivados, como MMAF, MMAE, 3024 (WO 2016/127790 A1, composto 7), toxina da dif- teria, exotoxina, cadeia A de ricina, cadeia A de abrina, modeccina, a- sarcina, proteína tóxica de Aleutites fordii, proteína tóxica de diantina, proteína tóxica de Phytolaca americana (PAPI, PAPII e PAP-S), inibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inibidor de sapaonaria offici- nalis, gelonina, mitogelina, restrocina, fenomicina, enomicina e tricote- cenos.
[258] O termo "fármaco quimioterápica" refere-se a um composto químico que pode ser usado para tratar tumores. Essa definição tam- bém inclui agentes anti-hormonais que atuam para modular, reduzir, blo- quear ou inibir os efeitos dos hormônios que promovem o crescimento do câncer, que geralmente estão na forma de terapia sistêmica ou ho- lística. Eles podem ser hormônios. Exemplos de fármacos quimiotera- pêuticas incluem agentes alquilantes, tais como tiotepa; ciclosfamida (CYTOXANTY); sulfonato de alquila, tal como busulfan, improsulfan e piposulfan; aziridina tais como benaodopa, carboquona, meturedopa e uredopa; aziridina e metilamelamina incluindo altretamina, trietilenome- lamina, trietilenofosforamida, trietilenotiofosforamida e trimetilolomela- mina; mustardas de nitrogeno tais como clorambucila, clornafazina, co- lofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, cloridrato de ni- trobina; melfalan, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfa- mida, uramustina; nitrosureias tais como carmustina, clorozotocin, fote- mustina, lomustina, nimustina, ranimustina; antibiótico tais como aclaci- nomicina, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicina, cactinomi- cina C, calicheamicina, carabicina, cromomicina, carzinophilin, cromo- micina, actinomicina D, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-óxi-L- norleucina, doxorrubicina, epirubicina, esorrubicina, idarubicina, marcel- lomicina, mitomicina, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicina, pe-
plomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estrep- tonigrina; estreptozocina, tuberculocidina, ubenimex, zinostatina, zorru- bicina; antimetabólitos tais como metotrexato, 5-fluorouracil (5-FU); aná- logos de ácido fólico tais como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de pterina tais como fludarabina, 6-mercaptop- terina, tiometopterina, tioguanopterin; análogos de pirimidina tais como ancitabina, azacitidina, 6-azuridina, carmofur, citarabina, dideoxiuridina, doxitluridina, enocitabina, floxuridina, 5-FU; andogênios tais como ca- lusterona, dromostanolong propionato, epitiostanol, mepitiostano, testo- lactona; anti-adrenalinas tais como aminoglutetimida, mitotano, trilos- tano; suplementos de ácido fólico tais como ácido frolínico; aceglatona; aldofosfamidaglicosídeo; ácido aminolevulínico; amsacrina; bestrabucil; biasntreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elfomitina; acetato de eliptínio; etoglucídeo; nitrato de gálio; hidroxiureia; lentinan; lonidamina; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitracrina; pintos- tatin; fenamet; pirarubicin; ácido podofilínico; 2-etilhidrazida; procarba- zina; PSKGO; razoxano; sizofiran; espirogermânio; ácido tenuazônico; tri- aziquona; 2,2',2"-triclorrotrietilamina; uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; dibromodulcitol; pipobroman; gacitosina; arabinosícdeo ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; taxanos tais como pa- clitaxel (TAXOLO, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ) e do- cetaxel (TAXOTEREG, Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France); cloram- bucil; gemcitabina; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análo- gos de plantina tais como cisplatina e carboplatina; vinblastina; platina; etoposídeo (VP-16); ifosfamida; mitomicina C; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina; navelbina; novantrona; teniposídeo; daunorrubicina; ami- nopterina; xeloda; ibandronato; CPT-11; inibidor de topoisomerase RFS2000; difluorometilornitina (DMFO); esperamicinas de ácido reti- noico; capecitabina; e sal, ácido ou derivado farmaceuticamente aceitá-
vel de qualquer uma das substâncias acima. Esta definição também in- clui agentes anti-hormonais que podem modular ou inibir os efeitos dos hormônios em tumores, como anti-estrogênios, incluindo tamoxifeno, ra- loxifeno, inibidor de aromatase 4 (5) -imidazol, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY 117018, onapristone e Fareston; e anti-andró- genos, tais como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida e gose- relina; e sal, ácido ou derivado farmaceuticamente aceitável de qualquer uma das substâncias acima.
[259] O termo “alquila” refere-se a um grupo hidrocarboneto alifá- tico saturado, que é um grupo de cadeia reta ou ramificada compreen- dendo 1 a 20 átomos de carbono, preferivelmente uma alquila tendo 1 a 12 átomos de carbono, mais preferivelmente uma alquila tendo 1 a 10 átomos de carbono, e o mais preferivelmente uma alquila tendo 1 a 6 átomos de carbono. Exemplos não limitantes incluem metila, etila, n- propila, isopropila, n-butila, isobutila, terc-butila, sec-butila, n-pentila, 1,1-dimetilpropila, 1,2-dimetilpropila, 2,2-dimetilpropila, 1-etilpropila, 2- metilbutila, 3-metilbutila, n-hexila, 1-etil-2-metilpropila, 1,1,2-trimetilpro- pila, 1,1-dimetilbutila, 1,2-dimetilbutila, 2,2-dimetilbutila, 1,3-dimetilbutila, 2-etilbutila, 2-metilpentila, 3-metilpentila, 4-metilpentila, 2,3-dimetilbutila, n-heptila, 2-metilhexila, 3-metilhexila, 4-metilhexila, 5-metilhexila, 2,3-di- metilpentila, 2,4-dimetilpentila, 2,2-dimetilpentila, 3,3-dimetilpentila, 2- etilpentila, 3-etilpentila, n-octila, 2,3-dimetilhexila, 2,4-dimetilhexila, 2,5- dimetilhexila, 2,2-dimetilhexila, 3,3-dimetilhexila, 4,4-dimetilhexila, 2-eti- lhexila, 3-etilhexila, 4-etilhexila, 2-metil-2-etilpentila, 2-metil-3-etilpentila, n-nonila, 2-metil-2-etilhexila, 2-metil-3-etilhexila, 2,2-dietilpentila, n-de- cila, 3,3-dietilhexila, 2,2-dietilhexila, e vários isômeros ramificados do mesmo. Mais preferivelmente, o grupo alquila é uma alquila inferior tendo 1 a 6 átomos de carbono, e exemplos não limitantes incluem me- tila, etila, n-propila, isopropila, n-butila, isobutila, terc-butila, sec-butila,
n-pentila, 1,1-dimetilpropila, 1,2-dimetilpropila, 2,2-dimetilpropila, 1-etil- propila, 2-metilbutila, 3-metilbutila, n-hexila, 1-etil-2-metilpropila, 1,1,2- trimetilpropila, 1,1-dimetilbutila, 1,2-dimetilbutila, 2,2-dimetilbutila, 1,3- dimetilbutila, 2-etilbutila, 2-metilpentila, 3-metilpentila, 4-metilpentila, 2,3-dimetilbutila e similares. A alquila pode ser substituída ou unsubsti- tunão substituída. Quando substituído, o grupo(s) substituinte pode ser substituído em qualquer ponto de conexão disponível. O grupo(s) subs- tituinte é preferivelmente um ou mais grupos independentemente sele- cionados a partir do grupo consistindo em alquila, alquenila, alquinila, alcóxi, alquiltio, alquilamino, halogênio, tiol, hidróxi, nitro, ciano, cicloal- quila, heterociclila, arila, heteroarila, cicloalcóxi, heterocicloalcóxi, ciclo- alquiltio, heterocicliltio e oxo.
[260] O termo “heteroalquila” refere-se a uma alquila contendo uma ou mais heteroátomo(s) selecionados a partir do grupo consistindo em N,OeS, em que a alquila é como definido acima.
[261] O termo “alquileno” refere-se a um grupo hidrocarboneto ali- fático linear ou ramificado saturado tendo dois resíduos derivados a par- tir da remoção de dois átomos de hidrogênio a partir ddo mesmo átomo de carbon ou dois átomos de carbono diferentes do alcano parental. O alquileno é um grupo linear ou ramificado tendo 1 a 20 átomos de car- bono, preferivelmente 1 a 12 átomos de carbono, e mais preferivelmente 1 a 6 átomos de carbono. Exemplos não limitantes de alquileno incluem, mas não são limitados a, metileno (-CH2-), 1,1-etileno (-CH(CH3)-), 1,2- etileno (-CH2CH2)-, 1,1-propileno (-CH(CH2CH3)-), 1,2-propileno (- CH2CH(CH3)-), — 1,3-propileno — (-CH2CH2CH2-), — 1,4-butileno — (- CH2CH2CH2C0H>2-), 1,5-pentileno (-CH2CH2CH20H2C0H>2-), e similares. O alquileno pode ser substituído ou não substituído. Quando substituído, o grupo(s) substituinte pode ser substituído em qualquer ponto de cone- xão disponível. O grupo(s) substituinte é preferivelmente um ou mais grupos independente e opcionalmente selecionados a partir do grupo consistindo em alquila, alquenila, alquinila, alcóxi, alquiltio, alquilamino, halogênio, tiol, hidróxi, nitro, ciano, cicloalquila, heterociclila, arila, hete- roarila, cicloalcóxi, heteroalcóxi, cicloalquiltio, heterocicliltio e oxo.
[262] O termo “alcóxi" refere-se a um grupo -O-(alquila) ou um -O- (cicloalquila não substituída), em que a alquila e cicloalquila são como definidos acima. Exemplos não limitantes de alcóxi incluem metóxi, etóxi, propóxi, butóxi, ciclopropilóxi, ciclobutilóxi, ciclopentilóxi, ciclohexilóxi. O alcóxi pode ser opcionalmente substituído ou não substituído. Quando substituído, o grupo(s) substituinte é preferivelmente um ou mais grupo(s) independentemente selecionados a partir do grupo consistindo em alquila, alquenila, alquinila, alcóxi, alquiltio, alquilamino, halogênio, tiol, hidróxi, nitro, ciano, cicloalquila, heterociclila, arila, heteroarila, ci- cloalcóxi, heterocicloalcóxi, cicloalquiltio e heterocicliltio.
[263] O termo “cicloalquila” refere-se a um grupo substituinte de hidrocarboneto monocíclico ou policíclico saturado ou parcialmente in- saturado tendo 3 a 20 átomos de carbono, preferivelmente 3 a 12 áto- mos de carbono, mais preferivelmente 3 a 10 átomos de carbono, e o mais preferivelmente 3 a 8 átomos de carbono. Exemplos não limitantes de cicloalquila monocíclica incluem ciclopropila, ciclobutila, ciclopentila, ciclopentenila, ciclohexila, ciclohexenila, ciclohexadienila, cicloheptila, cicloheptatrienila, ciclo-octila e similares. Cicloalquila policíclica inclui uma cicloalquila tendo um anel espiro, anel fundido ou anel em ponte.
[264] O termo “heterociclila”" refere-se a um um grupo hidrocarbo- neto monocíclico ou policíclico saturado ou parcialmente insaturado de 3 a 20 membros, em que um ou mais átomos do anel são heteroátomos selecionados a partir do grupo consistindo em N, O e S(O)m (em que m é um inteiro de O a 2), mas excluindo -O-O-, -O-S- ou -S-S- no anel, com os átomos do anel restantes sendo átomos de carbono. Preferivelmente, a a heterocíclila tem 3 a 12 átomos no anel em que 1 a 4 átomos são heteroátomos; e mais preferivelmente, 3 a 10 átomos no anel. Exemplos não limitantes de heterociclila monocíclica incluem pirrolidinila, piperi- dinila, piperazinila, morfolinila, tiomorfolinila, homopiperazinila e simila- res. Heterociclila policíclica inclui a heterociclila tendo um anel espiro, anel fundido ou anel em ponte.
[265] O termo “espiro heterociclila” refere-se a um grupo heteroci- clica policiclíca de 5 a 20 membros com aneis individuais conectados através de um átomo compartilhado (camado um átomo espiro), em que um ou mais átomos do anel são heteroátomos selecionados a partir do grupo consistindo em N, O e S(O)m (em que m é um inteiro de 0 a 2), com os átomos do anel restantes sendo átomos de carbono, onde os aneis podem conter uma ou mais ligações duplas, mas nenhum dos aneis tem um sistema conjugado completamente Tr-elétron. A espiro he- terociclila é preferivelmente uma espiro heterociclila de 6 a 14 membroa, e mais preferivelmente uma espiro heterociclila de 7 a 10 membros. De acordo com o número dos átomos espiro compartilhados entre os aneis, a espiro heterociclila pode ser dividida em um mono-espiro heterociclila, di-espiro heterociclila, ou poli-espiro heterociclila, e a espiro heterociclila é preferivelmente a mono-espiro heterociclila ou di-espiro heterociclila, e mais preferivelmente uma mono-espiro heterociclila de 4-membros/4- membros, 4-membros/5-membros, 4-membros/6-membros, 5-mem- bros/5-membros, ou 5-membros/6-membros. Exemplos não limitantes de espiro heterociclila incluem: Ex K No o nã
MISTA o o Ss o e N
[266] O termo “heterociclila fundida” refere-se a um grupo hetero- Ciclica policiclíca de 5 a 20 membros, em que cada anel no sistema com- partilha um par adjacente de átomos com outro anel, em que uma ou mais aneis podem conter uma ou mais ligações duplas, mas nenhum dos aneis tem um sistema conjugado completamente Ttr-elétron, e em que um ou mais átomos do anel são heteroátomos selecionados a partir do grupo consistindo em N, O e S(O)m (em que m é um inteiro de 0 a 2), com os átomos do anel restantes sendo átomos de carbono. A heteroci- clila fundida é preferivelmente uma heterociclila fundida de 6 a 14 mem- bros, e mais preferivelmente uma heterociclila fundida de 7 a 10 mem- bros. De acordo com o número de membros no anel, a heterociclila fun- dida pode ser dividida em uma heterociclila fundida bicíclica, tricíclica, tetracíclica ou policíclica, e a heterociclila fundida é preferivelmente uma heterociclila fundida bicíclica ou tricíclica, e mais preferivelmente um he- terociclila fundida bicíclica de 5-membros/5-membros ou 5-membros/6- membros. Exemplos não limitantes de heterociclila fundida incluem: x o Ss BRBaBRA
N o 4 No o Re e A o O R RA CO CO = Rs * 2 NO e fo)
[267] O termo “heterociclila em ponte” refere-se a um grupo hete- rociclila de 5 a 14 membros policíclico, em que cada dois aneis no sis- tema compartilha dois átomos desconectados, em que os aneis podem ter uma ou mais ligações duplas, mas nenhum dos aneis tem um sis- tema conjugado completamente Ttr-elétron, e em que um ou mais áto- mos do anel são heteroátomos selecionados a partir do grupo consis- tindo em N, O e S(O)m (em que m é um inteiro de O a 2), com os átomos do anel restantes sendo átomos de carbono. A heterociclila em ponte é preferivelmente uma heterociclila em ponte de 6 a 14 membros, e mais preferivelmente uma heterociclila em ponte de 7 to 10 membros. De acordo com o número de membros no anel, a heterocíclila em ponte pode ser dividida em uma heterociclila em ponte bicíclica, tricíclica, te- tracíclica ou policíclica, e a heterociclila em ponte é preferivelmente uma heterociclila em ponte bicíclica, tricíclica ou tetracíclica, e mais preferi- velmente uma heterocíclila em ponte bicíclica ou tricíclica. Exemplos não limitantes de heterociclila em ponte incluem: ds AH A Dr " & À O d& vd ec nto
[268] O anel heterociclila pode ser fundido ao anel de arila, hete- roarila ou cicloalquila, em que um anel ligado à estrutura parental é he- terociíclila. Exemplos não limitantes do mesmo incluem:
N N N
DEOTOÊO o oo e similares.
[269] A heterociclila pode ser opcionalmente substituída ou não substituída. Quando substituída, o grupo(s) substituinte é preferivel- mente um ou mais grupo(s) independentemente selecionados a partir do grupo consistindo em alquila, alquenila, alquinila, alcóxi, alquiltio, al- quilamino, halogênio, tiol, hidróxi, nitro, ciano, cicloalquila, heterociclila, arila, heteroarila, cicloalcóxi, heterocicloalcóxi, cicloalquiltio, heterociclil- tio e oxo.
[270] O termo “arila” refere-se a um anel monocíclico todo de car- bono de 6 a 14 membros ou anel fundido policíclico (i.e. cada anel no sistema compartilha um par adjacente de átomos de carbono com outro anel no sistema) tendo um sitema Ttr-elétron conjugado, preferivelmente uma arila de 6 a 10 membros, por exemplo, fenila e naftila, e preferivel- mente fenila. O anel arila pode ser fundido ao anel de heteroarila, hete- rociclila ou cicloalquila, em que um anel ligado à estrutura parental é anel arila. Exemplos não limitantes do mesmo incluem: OD ÉOOWDtoio o o o o
H H H OO DO TO oo o OS N s N oo e .
[271] The arila pode ser substituída ou não substituída. Quando substituída, o grupo(s) substituinte é preferivelmente um ou mais grupo(s) independentemente selecionados a partir do grupo consistindo em alquila, alquenila, alquinila, alcóxi, alquiltio, alguilamino, halogênio, tiol, hidróxi, nitro, ciano, cicloalquila, heterociclila, arila, heteroarila, ci- cloalcóxi, heterocicloalcóxi, cicloalquiltio e heterocicliltio.
[272] O termo “heteroarila” refere-se a um sistema heteroaromá- tico de 5 a 14 membros tendo 1 a 4 heteroátomos selecionados a partir do grupo consistindo em O, S e N. A heteroarila é preferivelmente uma heteroarila de 5 a 10 membros, mais preferivelmente uma heteroarila de ou 6 membros, por exemplo furila, tienila, piridila, pirrolila, N-alquilpir- rolila, pirimidinila, pirazinila, imidazolila, tetrazolila e similares. O anel heteroarila pode ser fundido ao anel de arila, heterociclila ou cicloalquila, em que um anel ligado à estrutura parental é anel heteroarila. Exemplos não limitantes do mesmo incluem: e SN o Es " nÔ ID TD 41 AA Ad, DS
[273] A heteroarila pode ser opcionalmente substituído ou não substituído. Quando substituído, o grupo(s) substituinte é preferivel- mente um ou mais grupo(s) independentemente selecionados a partir do grupo consistindo em alquila, alquenila, alquinila, alcóxi, alquiltio, al- quilamino, halogênio, tiol, hidróxi, nitro, ciano, cicloalquila, heterociclila, arila, heteroarila, cicloalcóxi, heterocicloalcóxi, cicloalquiltio e heteroci- cliltio.
[274] O termo “grupo protetor amino” refere-se a um grupo que previne um grupo amino da reação quando outras partes da molécula são submetidas a uma reação, e pode ser facilmente removido. Exem- plos não limitantes incluem 9-fluorenilmetiloxicarbonila, terc-butoxicar- bonila, acetila, benzila, allila, p-metoxibenzila e similares. Esses grupos podem ser opcionalmente substituídos por um a três substituintes(s) se- lecionados a partir do grupo consistindo em halogênio, alcóxi e nitro. O grupo protetor amino é preferivelmente 9-fluorenilmetiloxicarbonila.
[275] O termo “cicloalquilalquila” refere-se a um grupo alquila substituído por uma ou mais, preferivelmente uma, cicloalquila(s), em que a alquila e cicloalquila são como definidas acima.
[276] O termo “haloalquila” refere-se a um grupo alquila substituído por um ou mais halogênio(s), em que a alquila é como definida acima.
[277] O termo “alquila deuterada” refere-se a um grupo alquila substituído por um ou mais átomo de deutério(s), em que a alquila é como definido acima.
[278] O termo “hidróxi”" refere-se a um grupo -OH.
[279] O termo “halogênio” refere-se um flúor, cloro, bromo ou iodo.
[280] O termo “amino” refere-se a um grupo -NH>.
[281] O termo “nitro” refere-se a um grupo -NO;».
[282] O termo “amida” refere-se a um grupo -C(O)N(alquila) ou - C(O)N(cicloalquila), em que a alquila e cicloalquila são como definidas acima.
[283] O termo “alcoxicarbonila” refere-se a um grupo -C(O0)O(al- quila) ou -C(O)O(cicloalquila), em que a alquila e cicloalquila são como definidas acima.
[284] A presente invenção também compreende os compostos de fórmula (|) em várias formas deuteradas. Cada um dos átomos de hidro- gênio disponíveis ligados ao átomo de carbono pode ser substituído in- dependentemente por um átomo de deutério. Os versados na técnica podem sintetizar um composto de fórmula (|) em uma forma deuterada com referência às literaturas relevantes. O composto de fórmula (1) na forma deuterada pode ser preparado usando matérias-primas deutera- das disponíveis comercialmente, ou podem ser sintetizados por técnicas convencionais com reagentes deuterados incluindo, mas não se limi- tando a, borano deuterado, borano trideuterado em tetrahidrofuranoo, lítio de alumínio deuterado hidreto, iodoetano deuterado, iodometano deuterado e similares.
[285] “Opcional” ou “opcionalmente” significa que o evento ou cir- cunstância descrito subsequentemente pode, mas não precisa, ocorrer, e tal descrição inclui a situação na qual o evento ou circunstância ocorre ou não ocorre. Por exemplo, "a heterocíclila opcionalmente substituída por uma alquila" significa que um grupo alquila pode estar, mas não pre- cisa estar, presente, e tal descrição inclui a situação da heterociclila sendo substituída por uma alquila e a heterociclila não sendo substituída por um alquila.
[286] "Substituído" refere-se a um ou mais átomos de hidrogênio em um grupo, preferivelmente até 5, e mais preferivelmente 1 a 3 áto- mos de hidrogênio, independentemente substituídos por um número correspondente de substituintes. Nem é preciso dizer que os substituin- tes só existem em suas possíveis posições químicas. O especialista na técnica é capaz de determinar se a substituição é possível ou impossível por meio de experimentos ou teoria sem esforço excessivo. Por exem- plo, a combinação de amino ou hidróxi tendo hidrogênio livre e átomos de carbono tendo ligações insaturadas (tais como olefínicos) pode ser instável.
[287] O termo "composição farmacêutica" refere-se a uma mistura de um ou mais dos compostos descritos neste documento ou seus sais ou pró-fármacos fisiologicamente/farmaceuticamente aceitáveis com outros componentes químicos e outros componentes tais como veículos e excipientes fisiológica/farmaceuticamente aceitáveis. A finalidade da composição farmacêutica é facilitar a administração de um composto a um organismo, que conduza à absorção do ingrediente ativo de modo a apresentar atividade biológica.
[288] O termo "sal farmaceuticamente aceitável" ou "sal farmacêu- tico" refere-se a um sal do conjugado fármaco-ligante da presente in- venção ou um sal do composto da presente invenção, que é seguro e eficaz em mamíferos e tem a atividade biológica desejada. O conjugado fármaco-ligante da presente invenção contém pelo menos um amino, de modo que pode formar um sal com um ácido. Exemplos não limitativos de sais farmaceuticamente aceitáveis incluem cloridrato, hidrobrometo, hidroiodeto, sulfato, bisulfato, citrato, acetato, succinato, ascorbato, oxa- lato, nitrato, sorbato, hidrogênio fosfato, dihidrogênio fosfato, salicylato, hidrogênio citrato, tartrato, maleato, fumarato, formato, benzoato, meta- nossulfonato, etanossulfonato, benzenossulfonato, p-toluenossulfonato.
[289] O termo "solvato" refere-se a um solvato farmaceuticamente aceitável formado por um conjugado fármaco-ligante da presente inven- ção com uma ou mais moléculas de solvente. Exemplos não limitativos de moléculas de solvente incluem água, etanol, acetonitrila, isopropanol, DMSO, acetato de etila.
[290] O termo "carregamento de fármaco" refere-se ao número médio de fármacos citotóxicas carregadas em cada ligante no composto de fórmula (1) e também pode ser expresso como a razão entre o nú- mero de fármaco e o número de anticorpos. A carga do fármaco pode variar de O a 12, de preferência de 1 a 10 fármacos citotóxicas (D) por ligante (Pc). Em uma modalidade da presente invenção, a carga do fár- maco é expressa como n, e os valores exemplares podem ser uma mé- dia de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10. O número médio de fármacos por molécula de ADC após a reação de acoplamento pode ser determinado por métodos convencionais, tais como espectroscopia UV/visível, es- pectrometria de massa, teste ELISA e caracterização por HPLC.
[291] Em uma modalidade da presente invenção, o fármaco cito- tóxica é conjugada com o amino terminal N e/ou o e-amino de resíduos de lisina do ligante através de uma unidade de ligação. Normalmente, o número de moléculas de fármaco conjugadas ao anticorpo em uma re- ação de acoplamento será menor do que o máximo teórico.
[292] Os seguintes métodos não limitativos podem ser usados para controlar a carga dos conjugados fármaco-ligante citotóxica: (1) controlar a razão molar do reagente de ligação para o an- ticorpo monoclonal, (2) controlar o tempo de reação e a temperatura, (3) selecionar diferentes reagentes de reação.
[293] A preparação de composições farmacêuticas convencionais pode ser encontrada na Farmacopoeia Chinesa.
[294] O termo "veículo" usado na composição da presente inven- ção refere-se a um sistema que pode alterar a maneira como um fár- maco entra no corpo humano e distribuição, controle e taxa de clibera- ção do fármaco ao órgão alvo. Liberação de veículo de fármaco e os sistemas de direcionamento podem reduzir a degradação e a perda de fármaco, reduzir os efeitos colaterais e melhorar a biodisponibilidade. Por exemplo, os surfactantes poliméricos que podem ser usados como veículos podem ser automontados para formar várias formas de agre- gados devido à sua estrutura anfifílica única. Os exemplos preferidos incluem micelas, microemulsões, géis, cristais líquidos, vesículas e si- milares. Esses agregados têm a capacidade de encapsular moléculas de dorgas, embora tenham boa permeabilidade à membrana, e podem ser usados como um excelente veículo de fármaco.
[295] O termo “excipiente” é um adjunto em uma formulação far- macêutica diferente de um fármaco principal, que também pode ser re- ferido como um adjuvante, tais como adesivos, preenchedores, desin- tegrantes, lubrificantes em comprimidos; partes da matriz nas prepara- ções semissólidas, pomadas e cremes; conservantes, antioxidantes, agentes aromatizantes, fragrâncias, cossolventes, emulsionantes, solu- bilizantes, reguladores de pressão osmótica, corantes em preparações líquidas e similares.
[296] O termo "diluente", também conhecido como preenchedores, tem como objetivo principal aumentar o peso e o volume do comprimido. A adição de diluente garante um determinado volume, reduz o desvio de dose dos componentes principais e melhora o perfil de compressão do fármaco. Quando o comprimido contém um componente oleoso, um absorvente é adicionado para absorver a substância oleosa, mantendo assim o estado “seco” para facilitar a formação do comprimido. Por exemplo, o diluente inclui amido, lactose, sais inorgânicos de cálcio, ce- lulose microcristalina e similares.
[297] A composição farmacêutica pode estar na forma de uma so- lução aquosa injetável estéril. Os veículos ou solventes aceitáveis que podem ser utilizados são água, solução de Ringer ou solução isotônica de cloreto de sódio. A formulação injetável estéril pode ser uma microe- mulsão óleo em água injetável estéril em que o ingrediente ativo é dis- solvido na fase de óleo. Por exemplo, o ingrediente ativo é dissolvido em uma mistura de óleo de soja e lecitina. A solução de óleo é então adicionada a uma mistura de água e glicerina e processada para formar uma microemulsão. A solução injetável ou microemulsão pode ser intro- duzida na corrente sanguínea de um paciente por injeção em bolus local.
Alternativamente, a solução e a microemulsão são preferivelmente ad- ministradas de uma maneira que mantém uma concentração circulante constante do composto da presente invenção. Afim de manter essa con- centração constante, um dispositivo de administração intravenosa con- tínua pode ser usado. Um exemplo de tal dispositivo é Deltec CADD- PLUS. TM. Bomba de injeção intravenosa de 5400.
[298] A composição farmacêutica pode estar na forma de uma sus- pensão aquosa ou oleosa injetável estéril para administração intramus- cular e subcutânea. Tal suspensão pode ser formulada com dispersan- tes adequados ou agentes umectantes e agentes de suspensão como descrito acima de acordo com técnicas conhecidas. A formulação inje- tável estéril também pode ser uma solução ou suspensão injetável es- téril preparada em um diluente ou solvente não tóxico parentericamente aceitável, por exemplo, uma solução preparada em 1,3-butanodiol. Além disso, óleos fixos estéreis podem ser facilmente usados como um sol- vente ou meio de suspensão. Para este propósito, qualquer mistura de óleos fixos incluindo mono- ou di-glicerídeo sintético pode ser usada. Além disso, ácidos graxos, tais como ácido oleico, também podem ser usados na preparação de uma injeção.
[299] A presente invenção se refere a um braço ligador clivável com uma estrutura específica e uma substância ativa com uma estrutura específica e um conjugado anticorpo-fármaco (ADC) composto por um braço ligador, uma substância ativa e um anticorpo. Este ADC é um complexo formado pela ligação de uma substância tóxica a um anticorpo por meio de um espaçador. O conjugado anticorpo-fármaco (ADC) é de- gradado no corpo para liberar moléculas ativas, apresentando assim um efeito antitumoral. Método de Síntese da Presente invenção
[300] Afim de alcançar o objetivo da presente invenção, a presente invenção aplica as seguintes soluções técnicas:
[301] Esquema |:
[302] Um método para preparar o composto de Fórmula (D1) ou o sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo da presente in- venção, compreende a seguinte etapa de: o Rh ss e bx "oH O oH o) º o) º o) reagir o composto de Fórmula (Y1) e o composto de Fórmula (Dr) na presença de um agente de condensação e opcionalmente sob uma condição alcalina para obter o composto de Fórmula (D1), em que: R', RQ e m são como definidos na Fórmula (D1).
[303] O reagente que fornece uma condição alcalina inclui bases orgânicas e bases inorgânicas. As bases orgânicas incluem, mas não são limitadas a, trietilamina, dietilamina, N-metilmorfolina, piridina, he- xahidropiridina, N,N-diisopropiletilamina, n-butila lítio, lítio diisopropila- mida, acetato de potássio, terc-butóxido de sóido e terc-butóxido de po- tássio. As bases inorgânicas incluem, mas não são limitadas a, hidreto de sódio, fosfato de potássio, carbonato de sódio, carbonato de potássio, carbonato de césio, hidróxido de sódio e hidróxido de lítio.
[304] O agente de condensação pode ser selecionado a partir do grupo consistindo em cloreto de 4-(4,6-dimetóxi-1,3,5-triazin-2-il)-4-me- tilmorfolínio, 1-hidroxibenzotriazol, cloridrato de 1-(3-dimetilaminopro- pil)-3-etilcarbodiimida, N,N'-diciclohexilcarbodiimida, N,N'-diisopropil- carbodiimida, tetrafluoroborato de O-benzotriazol-N,N,N' N'-tetrametilu- reia, 1-hidroxibenzotriazol, 1-hidróxi-7-azobenzotriazol, hexafluorofos- fato de O-benzotriazol-N,N,N' N'-tetrametilureia, hexafluorofosfato de 2- (7-azobenzotriazol)-N,N,N' N'-tetrametilureia, hexafluorofosfato de ben- zotriazol-1-iloxitris(dimetilamino)pfosfônio e hexafluorofosfato de benzo- triazol-1-il-oxitripirrolidinila fosforoso, e preferivelmente cloreto de 4-
(4,6-dimetóxi-1,3,5-triazin-2-il)-4-metilmorfolínio, 1-hidroxibenzotriazol e cloridrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida.
Esquema |l:
[305] Um método para preparar o composto de Fórmula (Lv-Y-Dr) ou o sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo da presente invenção, compreende as seguintes etapas de: MAE a RSEAR NASAL, ma E ANDO. po k O fr Etapa 1 AS AA Etapa 2 PA B1) FÃ" (182) o (8 À » 1 | É 4 A R. hou Í " o ADO SAE E a. px” F (IA) ó tv (IB) o O Etapa 3 é “A 5 q 5 wo RE X A et ' VALA L,Y.DO) dd Ly Y-Dr JA
[306] Etapa 1: o composto de Fórmula (IB-1) e metanossulfonato de exatecano (1b) são reagidos na presença de um agente de conden- sação e opcionalmente sob uma condição alcalina para obter o com- posto de Fórmula (IB-2);
[307] Etapa 2: o composto de Fórmula (IB-2) é desprotegido para obter o composto de Fórmula (IB);
[308] Etapa 3: o composto de Fórmula (IA) e o composto de Fór- mula (IB) são reagidos na presença de um agente de condensação e opcionalmente sob uma condição alcalina para obter o composto de Fórmula (Ly-Y-Dr),
em que:
[309] Rº é um grupo protetor amino, e preferivelmente 9-fluorenil- metiloxicarbonila (Fmoc);
[310] R', R2à, R$-R7, s! e m são como definidos na Fórmula (Ly-Y- Dr).
[311] O reagente que fornece uma condição alcalina inclui bases orgânicas e bases inorgânicas. As bases orgânicas incluem, mas não são limitadas a, trietilamina, dietilamina, N-metilmorfolina, piridina, he- xahidropiridina, N,N-diisopropiletilamina, n-butila lítio, lítio diisopropila- mida, acetato de potássio, terc-butóxido de sóido e terc-butóxido de po- tássio. As bases inorgânicas incluem, mas não são limitadas a, hidreto de sódio, fosfato de potássio, carbonato de sódio, carbonato de potássio, carbonato de césio, hidróxido de sódio e hidróxido de lítio.
[312] O agente de condensação é selecionado a partir do grupo consistindo em cloreto de 4-(4,6-dimetóxi-1,3,5-triazin-2-il)-4-metilmor- folínio, 1-hidroxibenzotriazol, cloridrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3- etilcarbodiimida, N,N'-diciclohexilcarbodiimida, N,N'-diisopropilcarbodii- mida, tetrafluoroborato de O-benzotriazol-N,N,N' N'-tetrametilureia, 1-hi- droxibenzotriazol, 1-hidróxi-7-azobenzotriazol, hexafluorofosfato de O- benzotriazol-N,N,N' N'-tetrametilureia, hexafluorofosfato de 2-(7-azo- benzotriazol)-N,N,N' N'-tetrametilureia, hexafluorofosfato de benzo- triazol-1-iloxitris(dimetilamino)pfosfônio e hexafluorofosfato de benzo- triazol-1-il-oxitripirrolidinila fosforoso, e preferivelmente cloreto de 4- (4,6-dimetóxi-1,3,5-triazin-2-il)-4-metilmorfolínio, 1-hidroxibenzotriazol e cloridrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida. Esquema Ill:
[313] A método para preparar o composto de Fórmula (Pc-La-Y-Dr) da presente invenção, compreende a seguinte etapa de:
a o a BERNA : Á II — (Lax-dn ("OM AE 1 o Ro DOE,
SD N F
[314] Pc é reagido com o composto de Fórmula (La-Y-Dr) após re- dução para obter o composto de Fórmula (Pc-La-Y-Dr); o agente redutor é preferivelmente TCEP, particularmente, é preferível reduzir a ligação dissulfeto no anticorpo; em que:
[315] Pc é um ligante;
[316] W, L2, Lô, R1, RA, R5-R', m e n são como definidos na Fór- mula (Pc-La-Y-Dr).
[317] A presente invenção será ainda descrita com referência aos seguintes exemplos, mas os exemplos não devem ser considerados como limitantes do escopo da presente invenção.
[318] Os métodos experimentais nos exemplos da presente inven- ção para os quais as condições específicas não são indicadas foram realizados de acordo com as condições convencionais ou as condições recomendadas pelos fabricantes do material ou produto. Os reagentes para os quais as fontes específicas não são indicadas são reagentes convencionais adquiridos no mercado.
EXEMPLOS
[319] As estruturas dos compostos são identificadas por ressonân- cia magnética (RMN) ou espectrometria de massa (MS). A RMN é de- terminada por uma máquina Bruker AVANCE-400. Os solventes para determinação são dimetilsulfóxido deuterado (DMSO-ds), clorofórmio deuterado (CDCI3) e metanol deuterado (CD3OD), sendo que o padrão interno é tetrametilsilano (TMS). Os desvios químicos são dados em 10 $ (ppm).
[320] MS é determinada por um espectrômetro de massa FINNI- GAN LCQAd (ESI) (fabricante: Thermo, tipo: Finnigan LCQ Advantage MAX).
[321] UPLC é determinado por um cromatógrafo líquido/espectrô- metro de massa Waters Acquity UPLC SQD.
[322] Cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) é determi- nada em um cromatógrafo líquido de alta pressão Agilent 1200DAD (co- luna cromatográfica Sunfire C18 150 x 4,6 mm) e em um cromatógrafo líquido de alta pressão Waters 2695-2996 (coluna cromatográfica Gimini C18 150 x 4,6 mm).
[323] UV-HPLC é determinada em um espectrofotômetro Thermo nanodrop2000 UV.
[324] As taxas de inibição da proliferação e os valores de IC5o são determinados por um leitor de microplacas FERA starFS (BMG Co., Ale- manha).
[325] A placa de sílica gel Yantai Huanghai HSGF254 ou Qingdao GF254 é usada como a placa de cromatografia em sílica gel em camada de estanho (TLC). A dimensão da placa de sílica gel usada em TLC é de 0,15 mm a 0,2 mm, e a dimensão da placa de sílica gel usada na purificação do produto é de 0,4 mm a 0,5 mm.
[326] Gel de sílica Yantai Huanghai 200 a 300 mesh é geralmente usado como um veículo para cromatografia em coluna.
[327] Os materiais de partida conhecidos da presente invenção po- dem ser preparados pelos métodos conhecidos na técnica, ou podem ser adquiridos na ABCR GmbH & Co. KG, Acros Organnics, Aldrich Che- mical Company, Accela ChemBio Inc., Dari Chemical Company etc.
[328] Salvo indicação em contrário, as reações são realizadas sob atmosfera de argônio ou atmosfera de nitrogênio.
[329] "Atmosfera de argônio" ou "atmosfera de nitrogênio" significa que um frasco de reação é equipado com um frasco de argônio ou ni- trogênio (cerca de 1 L).
[330] “Atmosfera de hidrogênio” significa que um frasco de reação é equipado com um frasco de hidrogênio (cerca de 1 L).
[331] A reação de hidrogenação pressurizada é realizada em um instrumento de hidrogenação Parr 3916EKX e um gerador de hidrogênio Qinglan QL-500 ou instrumento de hidrogenação HC2-SS.
[332] Nas reações de hidrogenação, o sistema de reação é geral- mente aspirado e preenchido com hidrogênio, e a operação acima é re- petida três vezes.
[333] O reator de micro-ondas do tipo CEM Discover-S 908860 é usado em reações de micro-ondas.
[334] Salvo indicação em contrário, a solução da reação refere-se a uma solução aquosa.
[335] Salvo indicação em contrário, a temperatura de reação da reação é a temperatura ambiente.
[336] Atemperatura ambiente de 20 ºC a 30 ºC é a temperatura de reação mais adequada.
[337] Preparação de tampão PBS (pH = 6,5) nos exemplos: 8,5 g de KH2POa, 8,56 g de KHPO4.3H20O, 5,85 g de NaCl e 1,5g de EDTA são ajustados para 2 L em um frasco, a mistura é submetida a ultrasso- nicação para dissolver completamente e agitar bem para dar o tampão.
[338] O sistema eluente em cromatografia em coluna e o sistema solvente revelador em cromatografia em estanho para purificação dos compostos incluem: A: sistema diclorometano e isopropanol, B: sistema diclorometano e metanol, C: sistema éter de petróleo e acetato de etila.
A razão do volume do solvente é ajustada de acordo com a polaridade dos compostos, e uma pequena quantidade de reagente ácido ou rea- gente alcalino tais como trietilamina também pode ser adicionada para ajuste.
[339] Alguns dos compostos da presente invenção são especifica- dos por Q-TOF LC/MS. Em relação a Q-TOF LC/MS, são usados espec- trômetro de massa Agilent 6530 Accurate-Mass Quadrupole-Time de Flight e o Agilent 1290-Infinity UHPLC (Agilent Poroshell 300SB-C8 5 um, coluna de 2,1 x 75 mm). Exemplo 1 N-((18,98)-9-Etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15- hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1- il)-1-hidroxiciclopropano-1-carboxamida 1 nº O, =ÓÉ
NT 6 Vas OH o 1 no nº o 2 o 2 x on NU NU voH o-£o F Qu 1a 1 1
[340] 1 mL de N N-dimetilformamida foi adicionado a metanossul- fonato de exatecano 1b (2,0 mg, 3,76 umol, preparado de acordo com o método descrito no pedido de patente “EP0737686A1”), e a solução foi resfriada a 0-5ºC em um banho de água gelada. Uma gota de trieti- lamina foi adicionada em gotas, e a solução de reação foi agitada até clarear. Ácido 1-Hidroxiciclopropilcarboxílico 1a (1,4 mg, 3,7 umol, pre- parado de acordo com o método conhecido descrito em “Tetrahedron Letters, 25(12), 1269-72; 1984”) e cloreto de 4-(4,6-dimetóxi-1,3,5-tria- zin-2-i1)-4-metilmorfolínio (3,8 mg, 13,7 umol) foram adicionados suces- sivamente à solução de reação. Após finalização da adição, a solução de reação foi agitada a 0-5ºC por 2 horas. 5 mL de água foram adicio- nados à solução de reação para arrefecer bruscamente a reação, e a solução de reação foi extraída com acetato de etila (8 mLx3). As fases orgânicas foram combinadas, lavadas com solução de cloreto de sódio saturada (5 mL*x2), secas sobre sulfato de sódio anidro e filtradas. O filtrado foi concentrado sob pressão reduzida, e os resíduos resultantes foram purificados por cromatografia de camada fina com desenvolvi- mento do sistema de solvente B para obter o produto do título 1 (1,6 mg, rendimento: 82,1%). MS m/z (ESI): 520,2 [M+1] 1H RMN (400 MHz, CDCI3): 5 7,90-7,84 (m, 1H), 7,80- 7,68(m, 1H), 5,80-5,70 (m, 1H), 5,62-5,54(m, 2H), 5,44-5,32 (m, 2H), 5,28-5,10(m, 2H), 3,40-3,15 (m, 3H), 2,44 (s, 3H), 2,23(t, 1H), 2,06-1,75 (m, 2H), 1,68-1,56 (m, 1H), 1,22-1,18 (m, 2H), 1,04-0,98 (m, 2H), 0,89 (t, 3H). Exemplo 2 (S)-2-Ciclopropil-N-((1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13- dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indo- lizino[1,2-b]quinolin-1-il)-2-hidroxiacetamida 2-A (R)-2-Ciclopropil-N-((1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13- dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indo- lizino[1,2-b]quinolin-1-il)-2-hidroxiacetamida 2-B
EE E eo 1a ER EE a ra mero ÇA O TA o E
[341] 2 mL de etanol e 0,4 mL de N,N-dimetilformamida foram adi- cionados a 1b (4 mg, 7,53 umol). A solução foi purgada com argônio três vezes, e resfriada a 0-5ºC em um banho de água gelada. 0,3 mL de N- metilmorfolina foi adicionado em gotas, e a solução de reação foi agitada até clarear. Ácido 2-ciclopropil-2-hidroxiacético 2a (2,3 mg, 19,8 umol, preparado de acordo com o método descrito no pedido de patente “WO2013106717”), 1-hidroxibenzotriazol (3 mg, 22,4 umol) e cloridrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida (4,3 mg, 22,4 umol) foram adicionados sucessivamente à solução de reação. Após finalização da adição, a solução de reação foi agitada a 0-5ºC por uma hora. O banho de água gelada foi removido, e a solução de reação foi aquecida a 30ºC e agitada por 2 horas. A solução de reação foi concentrada sob pressão reduzida, e o composto bruto resultante 2 foi purificado por cromatogra- fia líquida de alto desempenho (condições de separação: coluna: XBridge Prep C18 OBD 5 um 19*250 mm; fase móvel: A-water (10 mmol NHa0OAc), B-acetonitrila, eluição de gradiente, taxa de fluxo: 18 mL/min). As frações correspondentes foram coletadas, e concentradas sob pres- são reduzida para obter o produto do título (2-A: 1,5 mg, 2-B: 1,5 mg).
MS m/z (ESI): 534,0 [M+1].
[342] Composto 2-B com configuração única (tendo tempo de re- tenção mais curto)
[343] Análise UPLC: tempo de retenção: 1,06 minutos, pureza: 88% (coluna: ACQUITY UPLC BEHC18 1,7 um 2,1*50mm, fase móvel: A-wa- ter (5 mmol NH.OAc), B-acetonitrila).
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): 5 8,37 (d, 1H), 7,76 (d, 1H), 7,30 (s, 1H), 6,51 (s, 1H), 5,58-5,56 (m, 1H), 5,48 (d, 1H), 5,41 (s, 2H), 5,32-5,29 (m, 2H), 3,60 (t, 1H), 3,19-3,13 (m, 1H), 2,38 (s, 3H), 2,20- 2,14 (m, 1H), 1,98 (q, 2H), 1,87-1,83 (m, 1H), 1,50-1,40 (m, 1H), 1,34- 1,28 (m, 1H), 0,86 (t, 3H), 0,50-0,39 (m, 4H).
[344] Composto 2-A com configuração única (tendo tempo de re- tenção mais longo)
[345] Análise UPLC: tempo de retenção: 1,10 minutos, pureza: 86% (coluna: ACQUITY UPLC BEHC18 1,7 um 2,1*50mm, fase móvel: A-wa- ter (5 mmol NH.OAc), B-acetonitrila).
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): 5 8,35 (d, 1H), 7,78 (d, 1H), 7,31 (s, 1H), 6,52 (s, 1H), 5,58-5,53 (m, 1H), 5,42 (s, 2H), 5,37 (d, 1H), 5,32 (t, 1H), 3,62 (t, 1H), 3,20-3,15 (m, 2H), 2,40 (s, 3H), 2,25-2,16 (m, 1H), 1,98 (q, 2H), 1,87-1,82 (m, 1H), 1,50-1,40 (m, 1H), 1,21-1,14 (m, 1H), 0,87 (t, 3H), 0,47-0,35 (m, 4H). Exemplo 3 (S)-N-((1S,9S)-9-Etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13-dioxo- 2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indoli- zino[1,2-b]quinolin-1-i1)-3,3,3-trifluoro-2-hidroxipropanamida 3-A (R)-N-((1S,9S)-9-Etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13-dioxo- 2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indoli- zino[1,2-b]quinolin-1-i1)-3,3,3-trifluoro-2-hidroxipropanamida 3-B 1 1. ho o 7 “om F 7 “om e Ago AS = a om ra O E He A ROSA ROSS
[346] 2 mL de etanol e 0,4 mL de N,N-dimetilformamida foram adi- cionados a 1b (5,0 mg, 9,41 umol), e a solução foi resfriada a 0-5ºC em um banho de água gelada. 0,3 mL de N-metilmorfolina foi adicionada em gotas, e a solução de reação foi agitada até clarear. Ácido 3,3,3- Trifluoro-2-hidroxipropiônico 3a (4,1 mg, 28,4 umol, fornecedor: Alfa), 1-
hidroxibenzotriazol (3,8 mg, 28,1 umol) e cloridrato de 1-(3-dimetilami- nopropil)-3-etilcarbodiimida (5,4 mg, 28,2 umol) foram adicionados su- cessivamente à solução de reação. Após finalização da adição, a solu- ção de reação foi agitada a 0-5ºC por 10 minutos. O banho de água gelada foi removido, e a solução de reação foi aquecida a 30ºC e agi- tada por 8 horas. A solução de reação foi concentrada sob pressão re- duzida, e o composto bruto resultante 3 foi purificado por cromatografia líquida de alto desempenho (condições de separação: coluna: XBridge Prep C18 OBD 5 um 19*250 mm; fase móvel: A-water (10 mmol NHa0OAc), B-acetonitrila, eluição de gradiente, taxa de fluxo: 18 mL/min). As frações correspondentes foram coletadas, e concentradas sob pres- são reduzida para obter o produto do título (1,5 mg, 1,5 mg).
MS m/z (ESI): 561,9 [M+1].
[347] Composto com configuração única (tendo tempo de retenção mais curto)
[348] Análise UPLC: tempo de retenção: 1,11 minutos, pureza: 88% (coluna: ACQUITY UPLC BEHC18 1,7 um 2,1*50mm, fase móvel: A-wa- ter (5 mmol NH.OAc), B-acetonitrila).
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): 5 8,94 (d, 1H), 7,80 (d, 1H), 7,32 (s, 1H), 7,20 (d, 1H), 6,53 (s, 1H), 5,61-5,55 (m, 1H), 5,45-5,23 (m, 3H), 5,15-5,06 (m, 1H), 4,66-4,57 (m, 1H), 3,18-3,12 (m, 1H), 2,40 (s, 3H), 2,26-2,20 (m, 1H), 2,16-2,08 (m, 1H), 2,02-1,94 (m, 1H), 1,89-1,82 (m, 1H), 1,50-1,40 (m, 1H), 0,87 (t, 3H).
[349] Composto com configuração única (tendo tempo de retenção mais longo)
[350] Análise UPLC: tempo de retenção: 1,19 minutos, pureza: 90% (coluna: ACQUITY UPLC BEHC18 1,7 um 2,1*50mm, fase móvel: A-wa- ter (5 mmol NH.OAc), B-acetonitrila).
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): 5 8,97 (d, 1H), 7,80 (d, 1H), 7,31 (s, 1H), 7,16 (d, 1H), 6,53 (s, 1H), 5,63-5,55 (m, 1H), 5,45-5,20 (m,
3H), 5,16-5,07 (m, 1H), 4,66-4,57 (m, 1H), 3,18-3,12 (m, 1H), 2,40 (s, 3H), 2,22-2,14 (m, 1H), 2,04-1,95 (m, 2H), 1,89-1,82 (m, 1H), 1,50-1,40 (m, 1H), 0,87 (t, 3H). Exemplo 4 N-((18,98)-9-Etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15- hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1- il)-1-hidroxiciclopentano-1-carboxamida 4 4 2 A Ex NA ou d Jon 4a 1º 4
[351] 1 mL de N,N-dimetilformamida foi adicionado a 1b (3,0 mg, 5,64 umol), e a solução foi resfriada a 0-5ºC em um banho de água gelada. Uma gota de trietilamina foi adicionada em gotas, e a solução de reação foi agitada até clarear. Ácido 1-Hidróxi-ciclopentanocarboxí- lico 4a (2,2 mg, 16,9 umol, preparado de acordo com o método descrito no pedido de patente “WO2013106717”) e cloreto de 4-(4,6-dimetóxi- 1,3,5-triazin-2-i1)-4-metilmorfolínio (4,7 mg, 16,9 umol) foram adiciona- dos sucessivamente à solução de reação. Após finalização da adição, a solução de reação foi agitada a 0-5ºC por 1 hora. 5 mL de água foram adicionados à solução de reação para arrefecer bruscamente a reação, e a solução de reação foi extraída com acetato de etila (10 mLx3). As fases orgânicas foram combinadas, lavadas com solução de cloreto de sódio saturada (5 mL*2), secas sobre sulfato de sódio anidro e filtradas.
O filtrado foi concentrado sob pressão reduzida, e os resíduos resultan- tes foram purificados por cromatografia de camada fina com desenvol- vimento do sistema de solvente B para obter o produto do título 4 (2,5 mg, rendimento: 80,9%).
MS m/z (ESI): 548,0 [M+1].
1H RMN (400 MHz, CDCI3): 5 7,73-7,62 (m, 2H), 5,75-5,62 (m, 1H), 5,46-5,32 (m, 2H), 5,26-5,10 (m, 1H), 3,30-3,10 (m, 1H), 2,43 (s, 3H), 2,28-2,20 (m, 2H), 2,08-1,84 (m, 8H), 1,69-1,58 (m, 2H), 1,04- 1,00 (m, 2H), 0,89 (t, 3H). Exemplo 5 N-((18,98)-9-Etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15- hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1- il)-1-(hidroximetil)ciclopropano-1-carboxamida 5 es o g NO o-ãão & s F 5a 1 J 5
[352] 1 mL de N,N-dimetilformamida foi adicionado a 1b (2,0 mg, 3,76 umol), e a solução foi resfriada a 0-5ºC em um banho de água gelada. Uma gota de trietilamina foi adicionada em gotas, e a solução de reação foi agitada até clarear. Ácido 1-(Hidroximetil)-ciclopentanocar- boxílico 5a (0,87 mg, 7,5 umol, preparado de acordo com o método des- crito no pedido de patente “WO201396771”) e cloreto de 4-(4,6-dime- tóxi-1,3,5-triazin-2-il)-4-metilmorfolínio (2 mg, 7,24 umol) foram adicio- nados sucessivamente à solução de reação. Após finalização da adição, a solução de reação foi agitada a 0-5ºC por 2 horas. 5 mL de água foram adicionados à solução de reação para arrefecer bruscamente a reação, e a solução de reação foi extraída com acetato de etila (8 mLx3). As fases orgânicas foram combinadas, lavadas com solução de cloreto de sódio saturada (5 mL*2), secas sobre sulfato de sódio anidro e filtradas. O filtrado foi concentrado sob pressão reduzida, e os resíduos resultan- tes foram purificados por cromatografia de camada fina com desenvol- vimento do sistema de solvente B para obter o produto do título 5 (1,0 mg, rendimento: 50%).
MS m/z (ESI): 533,9 [M+1].
1H RMN (400 MHz, CDCI3): 5 8,07 (s, 1H), 7,23-7,18 (m, 2H), 6,71-6,64 (m, 1H), 6,55-6,51 (m, 1H), 5,36-5,27 (m, 2H), 4,67-4,61 (m, 2H), 3,53-3,48 (m, 1H), 3,30-3,22 (m, 2H), 3,18-3,13 (m, 1H), 2,71-2,61 (m, 2H), 2,35-2,28 (m, 1H), 2,04-1,91 (m, 4H), 1,53-1,40 (m, 3H), 0,91- 0,75 (m, 4H). Exemplo 6 N-((18,98)-9-Etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15- hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1- il)-1-(hidroximetil)ciclobutano-1-carboxamida 6 o ás DX
ANA 6 o “oH 6a 1 6
[353] 1 mL de N,N-dimetilformamida foi adicionado a 1b (3,0 mg, 5,64 umol), e a solução foi resfriada a 0-5ºC em um banho de água gelada. Uma gota de trietilamina foi adicionada em gotas, e a solução de reação foi agitada até clarear. Ácido 1-(Hidroximetil)ciclobutano-1- carboxílico 6a (2,2 mg, 16,9 umol, preparado de acordo com o método conhecido descrito em “Journal de the American Chemical Society, 2014, vol, 136, 722, p,8138-8142") e cloreto de 4-(4,6-dimetóxi-1,3,5-tri- azin-2-i1)-4-metilmorfolínio (4,7 mg, 16,9 umol) foram adicionados su- cessivamente à solução de reação. Após finalização da adição, a solu- ção de reação foi agitada a 0-5ºC por 1 hora. 5 mL de água foram adi- cionados à solução de reação para arrefecer bruscamente a reação, e a solução de reação foi extraída com acetato de etila (10 mLx3). As fa- ses orgânicas foram combinadas, lavadas com solução de cloreto de sódio saturada (5 mL*2), secas sobre sulfato de sódio anidro e filtradas. O filtrado foi concentrado sob pressão reduzida, e os resíduos resultan- tes foram purificados por cromatografia de camada fina com desenvol- vimento do sistema de solvente B para obter o produto do título 6 (2,1 mg, rendimento: 67,9%). MS m/z (ESI): 548,0 [M+1]. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): 5 7,85-7,62 (m, 1H), 6,88 (br ; 1H), 5,87-5,48 (m, 2H), 5,47-5,33 (m, 1H), 5,31-5,06 (m, 1H),4,25- 3,91 (m, 2H), 3,25 (br, 1H), 2,60-2,32 (m, 3H), 2,23 (t, 1H), 2,15-1,95 (m, 3H), 1,70-1,56 (m, 2H), 1,41-1,17 (m, 9H), 1,03 (s, 1H), 0,95-0,80 (m, 2H). Exemplo 7 N-((18,98)-9-Etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15- hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1- il)-1-hidroxiciclobutano-1-carboxamida 7 e.
HN +
IA 7 o Jon 7a 1% 7
[354] 2 mL de etanol e 0,4 mL de N,N-dimetilformamida foram adi- cionados a 1b (3,0 mg, 5,64 umol), e a solução foi resfriada a 0-5ºC em um banho de água gelada. 0,3 mL de N-metilmorfolina foi adicionada em gotas, e a solução de reação foi agitada até clarear. Ácido 1-hidroxi- ciclobutanocarboxílico 7a (2,0 mg, 17,22 umol, fornecedor: Pharma- Block Sciences), 1-hidroxibenzotriazol (2,3 mg, 17,0 umol) e cloridrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida (3,2 mg, 16,7 umol) foram adicionados sucessivamente à solução de reação. Após finalização da adição, a solução de reação foi agitada a 0-5ºC por 10 minutos. O banho de água gelada foi removido, e a solução de reação foi agitada à tem- peratura ambiente por 2 horas. A solução de reação foi concentrada sob pressão reduzida, e o resíduo resultante foi purificado por cromatografia de camada fina com desenvolvimento do sistema de solvente B para obter o produto do título 7 (2,5 mg, rendimento: 83,1%).
MS m/z (ESI): 534,0 [M+1].
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): 5 8,28 (d, 1H), 7,75 (d, 1H), 7,29 (s, 1H), 6,51 (s, 1H), 6,12 (s, 1H), 5,59-5,51 (m, 1H), 5,41 (s, 2H), 5,20-5,01 (m, 2H), 3,27-3,17 (m, 1H), 3,15-3,05 (m, 1H), 2,71-2,63 (m, 1H), 2,37 (s, 3H), 2,12-2,05 (m, 1H), 2,03-1,94 (m, 2H), 1,92-1,78 (m, 4H), 1,50-1,42 (m, 1H), 0,90-0,83 (m, 4H). Exemplo 8 1-(((S)-7-Benzil-20-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-11)-3,6,9,12,15- pentaoxo-2,5,8,11,14-penta-azaicosil)óxi)-N-((1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9- hidróxi-4-metil-10,13-dioxo0-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il)ciclopropano-1- carboxamida 8
FA IVO, Eos
DD 2, O mg a. fino => megas mito am TOA o A O Ss o q x *Y CHRO cORRO PL AAA, &s, Zi, : EE Etapa 1 1-((2-((((9H-Fluoren-9-il) metóxi)carbonil)amino)acetamido)metóxi)ciclo- propano-1-carboxilato de benzila 8c
[355] 1-hidroxiciclopropano-1-carboxilato de benzila 8a (104 mg, 0,54 mmol, preparado de acordo com o método descrito no pedido de patente “US2005/20645”) e acetato de (2-((((9H-fluoren-9-il) metóxi)carbonil)amino)acetamido)metil 8b (100 mg, 0,27 mmol, preparado de acordo com o método descrito no pedido de patente “CN105829346A”) foram adicionados ao frasco de reação, seguido pela adição de 5 mL de tetrahidrofurano. A solução de reação foi purgada com argônio três vezes e resíriada a 0-5ºC em um banho de água gelada, seguido pela adição de terc-butóxido de potássio (61 mg, 0,54 mmol). O banho de água gelada foi removido, e a solução de reação foi aquecida à temperatura ambiente e agitada por 10 minutos. mL de água gelada foram adicionados à solução de reação, que foi em seguida extraída com acetato de etila (5 mLx2) e clorofórmio (5 mL*5). As fases orgânicas foram combinadas e concentradas. Os resí- duos resultantes foram dissolvidos em 3 mL de 1,4-dioxano. 0,6 mL de água, bicarbonato de sódio (27 mg, 0,32 mmol) e cloroformiato de 9- fluoreno metila (70 mg, 0,27 mmol) foram adicionados, e a solução de reação foi agitada à temperatura ambiente por 1 hora. 20 mL de água foram adicionados, e a solução de reação foi extraída com acetato de etila (8 mLx3). A fase orgânica foi lavada com solução de cloreto de sódio saturada (20 mL), seca sobre sulfato de sódio anidro e filtrada. O filtrado foi concentrado sob pressão reduzida, e os resíduos resultantes foram purificados por cromatografia de coluna em sílica gel com desen- volvimento do sistema de solvente B para obter o produto do título 8c (100 mg, rendimento: 73,6%). MS m/z (ESI): 501,0 [M+1] Etapa 2 Ácido — 1-((2-((((9H-Fluoren-9-il)]metóxi)carbonil)amino)acetamido)me- tóxi)ciclopropano-1-carboxílico 8d
[356] 8c (50 mg, 0,10 mmol) foi dissolvido em 3 mL de um solvente misturado de tetrahidrofurano e acetato de etila (V:V=2:1), seguido pela adição de paládio sobre carbono (25 mg, teor: 10%). A solução de rea- ção foi purgada com hidrogênio três vezes e agitada à temperatura am- biente por 1 hora. A solução de reação foi filtrada através de celite, e o bolo do filtro foi lavado com tetrahidrofurano. O filtrado foi concentrado para obter o produto do título 8d (41 mg, rendimento: 100%). MS m/z (ESI): 411,0 [M+1]. Etapa 3 (9H-Fluoren-9-il)]metil/ (2-(((1-(((1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9I-hidróxi-4-metil- 10,13-dioxo0-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[del]pi- rano[3',4":6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il)carbamoil)ciclopropóxi)me- til)amino)-2-ox0etil)carbamato 8e
[357] 1b (7 mg, 0,013 mmol) foi adicionado ao frasco de reação, seguido pela adição de 1 mL de N,N-dimetilformamida. A solução foi purgada com argônio três vezes, e resfriada a 0-5ºC em um banho de água gelada. Uma gota de trietilamina, 8d (7 mg, 0,017 mmol) in 0,5 mL de N,N-dimetilformamida, e cloreto de 4-(4,6-dimetóxi-1,3,5-triazin-2-il)- 4-metilmorfolínio (7 mg, 0,026 mmol) foram adicionados, e a solução de reação foi agitada em um banho gelado por 35 minutos. 10 mL de água foram adicionados, e a solução de reação foi extraída com acetato de etila (5 mLx3). A fase orgânica foi lavada com solução de cloreto de sódio saturada (10 mL), seca sobre sulfato de sódio anidro e filtrada. O filtrado foi concentrado sob pressão reduzida, e os resíduos resultantes foram purificados por cromatografia de camada fina com desenvolvi- mento do sistema de solvente B para obter o produto do título 8e (8,5 mg, rendimento: 78,0%). MS m/z (ESI): 828,0 [M+1]. Etapa 4 1-((2-Aminoacetamido)metóxi)-N-((1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4- metil-10,13-diox0-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pi- rano[3',4":6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il)ciclopropano-1-carboxamida 8f
[358] 8e (4 mg, 4,84 umol) foi dissolvido em 0,2 mL de diclorome- tano, seguido pela adição de 0,1 mL de dietilamina. A solução de reação foi agitada à temperatura ambiente por 2 horas. A solução de reação foi concentrada sob pressão reduzida. 2 mL de tolueno foram adicionados e a solução foi concentrada sob pressão reduzida, o que foi repetido duas vezes. 3 mL de n-hexano foram adicionados para polpar, e a ca- mada de cima de hexano foi vertida, o que foi repetido três vezes. À solução foi concentrada sob pressão reduzida para obter o produto do título bruto 8f (2,9 mg), que foi usado diretamente na próxima etapa sem purificação. MS m/z (ESI): 606,0 [M+1]. Etapa 5 1-(((S)-7-Benzil-20-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-11)-3,6,9,12,15-
pentaoxo-2,5,8,11,14-penta-azaicosil)óxi)-N-((1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9- hidróxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il)ciclopropano-1- carboxamida 8
[359] O composto bruto 8f (2,9 mg, 4,84 umol) foi dissolvido em 0,5 mL de N,N-dimetilformamida. A solução foi purgada com argônio três vezes, e resíriada a 0-5ºC em um banho de água gelada. Ácido (S)-2(- 2-(-2-(6-(2,5-dioxo-1H-pirrol-1-il)hexanamido)acetamido)acetamido)-3- fenilpropiônico 8g (2,7 mg, 5,80 umol, preparado de acordo com o mé- todo descrito no pedido de patente “EP2907824”) in 0,3 mL de N,N-di- metilformamida, e cloreto de 4-(4,6-dimetóxi-1,3,5-triazin-2-i1)-4-metil- morfolínio (2,7 mg, 9,67 umol) foram adicionados, e a solução de reação foi agitada em um banho gelado por 30 minutos. O banho gelado foi removido, e a solução de reação foi aquecida à temperatura ambiente e agitada por 15 minutos. A solução de reação foi purificada por cromato- grafia líquida de alto desempenho (condições de separação: coluna: XBridge Prep C18 OBD 5 um 19*250 mm; fase móvel: A-water (10 mmol NHa0OAc), B-acetonitrila, eluição de gradiente, taxa de fluxo: 18 mL/min). As frações correspondentes foram coletadas, e concentradas sob pres- são reduzida para obter o produto do título 8 (2 mg, rendimento: 39,0%).
MS m/z (ESI): 1060,0 [M+1].
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6s): 5 9,01 (d, 1H), 8,77 (t, 1H), 8,21 (t, 1H), 8,08-7,92 (m, 2H), 7,73 (d, 1H), 7,28 (s, 1H), 7,24-7,07 (m, 4H), 6,98 (s, 1H), 6,50 (s, 1H), 5,61 (q, 1H), 5,40 (s, 2H), 5,32 (t, 1H), 5,12 (q, 2H), 4,62 (t, 1H), 4,52 (t, 1H), 4,40-4,32 (m, 1H), 3,73-3,47 (m, 8H), 3,16-3,04 (m, 2H), 2,89 (dd, 1H), 2,69-2,55 (m, 2H), 2,37-2,23 (m, 4H), 2,12-1,93 (m, 4H), 1,90-1,74 (m, 2H), 1,52-1,38 (m, 4H), 1,33-1,11 (m, 5H), 0,91-0,81 (m, 4H). Exemplo 9 N-((2R,10S)-10-Benzil-2-ciclopropil-1-(((1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-
4-metil-10,13-dioxo0-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pi- rano[3',4":6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il)amino)-1,6,9,12,15-penta- 0x0-3-0xa-5,8,11,14-tetra-azahexadecan-16-il)-6-(2,5-dioxo-2,5-dihi- dro-1H-pirrol-1-il)Dexanamida 9-A N-((28,10S)-10-Benzil-2-ciclopropil-1-(((1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi- 4-metil-10,13-dioxo0-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pi- rano[3',4":6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il)amino)-1,6,9,12,15-penta- 0x0-3-0xa-5,8,11,14-tetra-azahexadecan-16-il)-6-(2,5-dioxo-2,5-dihi- dro-1H-pirrol-1-il)hexanamida 9-B AA A, LX IA Fo d, ” AA Aros
AS ATX Se ae sa JS" ss JS" x, Etapa 1 x DO AA ÇA FePe2 sil, LO Fara? 7 DO AS ALSO Ao x AÁPIIX Etapa 4 x É Etapas SS ão - . NS a O nr v T” x E FA, A & ss ATA fx TE “o Etapa 6 Ar X » MA “ ' -. O 7 F e) 7 resoução Pd A Ms Ti o Li çà a JL y ' RX RX NO . A Etapa 1 2-Ciclopropil-2-hidroxiacetato de benzila 9a
[360] 2a (1,3 g, 11,2 mmol, preparado de acordo com o método descrito no pedido de patente “WO2013/106717”) foi dissolvido em 50 mL de acetonitrila, e em seguida adicionado com carbonato de potássio (6,18 g, 44,8 mmol), brometo de benzila (1,33 mL, 11,2 mmol) e iodeto de tetrabutilamônio (413 mg, 1,1 mmol) sucessivamente. A solução de reação foi agitada à temperatura ambiente por 48 horas, e filtrada atra- vés de celite. O bolo do filtro foi lavado com acetato de etila (10 ml), e os filtrados foram combinados e concentrados sob pressão reduzida. Os resíduos resultantes foram purificados por cromatografia de coluna em sílica gel com desenvolvimento do sistema de solvente C para obter o produto do título 9a (2 g, rendimento: 86,9%). Etapa 2 Benzila — 10-ciclopropil-1-(9H-fluoren-9-il)-3,6-dioxo-2,9-dioxa-4,7-dia- zaundecan-11-0ato 9b
[361] 9a (120,9 mg, 0,586 mmol) e 8b (180 mg, 0,489 mmol) foram adicionados ao frasco de reação, seguido pela adição de 4 mL de tetra- hidrofurano. A solução de reação foi purgada com argônio três vezes e resfriada a 0-5ºC em um banho de água gelada. Terc-butóxido de po- tássio (109 mg, 0,98 mmol) foi adicionado e o banho de água gelada foi removido. A solução de reação foi aquecida à temperatura ambiente e agitada por 40 minutos. 10 mL de água gelada foram adicionados à so- lução de reação, que foi em seguida extraída com acetato de etila (20 mL*2) e clorofórmio (10 mL*x5). As fases orgânicas foram combinadas e concentradas. Os resíduos resultantes foram dissolvidos em 4 mL de dioxano. 2 mL de água, bicarbonato de sódio (49,2 mg, 0,586 mmol) e cloroformiato de 9-fluoreno metila (126 mg, 0,49 mmol) foram adiciona- dos, e a solução de reação foi agitada à temperatura ambiente por 2 horas. 20 mL de água foram adicionados, e a solução de reação foi ex- traída com acetato de etila (10 mLx3). A fase orgânica foi lavada com solução de cloreto de sódio saturada (20 mL), seca sobre sulfato de só- dio anidro e filtrada. O filtrado foi concentrado sob pressão reduzida. Os resíduos resultantes foram purificados por cromatografia de coluna em sílica gel com desenvolvimento do sistema de solvente C para obter o produto do título 9b (48 mg, rendimento: 19%). MS m/z (ESI): 515,0 [M+1].
Etapa 3 Ácido 10-Ciclopropil-1-(9H-fluoren-9-il)-3,6-dioxo-2,9-dioxa-4,7-dia- zaundecan-11-0ico 9c
[362] 9b (20 mg, 0,038 mmol) foi dissolvido em 4,5 mL de um sol- vente misturado de tetrahidrofurano e acetato de etila (V:V=2:1), se- guido pela adição de paládio sobre carbono (12 mg, teor: 10%, seco). À solução de reação foi purgada com hidrogênio três vezes e agitada à temperatura ambiente por 1 hora. A solução de reação foi filtrada atra- vés de celite, e o bolo do filtro foi lavado com acetato de etila. O filtrado foi concentrado para obter o produto do título bruto 9c (13 mg), que foi usado diretamente na próxima etapa sem purificação. MS m/z (ESI): 424,9 [M+1]. Etapa 4 (9H-Fluoren-9-il)]metil (2-(((1-ciclopropil-2-(((1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hi- dróxi-4-metil-10,13-dioxo0-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il)amino)-2-0x0e- tóxi)Mmetil)amino)-2-0x0etil)carbamato 9d
[363] 1b (10 mg, 18,8 umol) foi adicionado ao frasco de reação, seguido pela adição de 1 mL de N,N-dimetilformamida. A solução foi purgada com argônio três vezes, e resfriada a 0-5ºC em um banho de água gelada. Uma gota de trietilamina, composto bruto 9c (13 mg, 30,6 upumol) e cloreto de 4-(4,6-dimetóxi-1,3,5-triazin-2-i1)-4-metilmorfolínio (16,9 mg, 61,2 umol) foram adicionados, e a solução de reação foi agi- tada em um banho gelado por 40 minutos. 10 mL de água foram adicio- nados, e a solução de reação foi extraída com acetato de etila (10 mL*x3). As fases orgânicas foram combinadas. A fase orgânica foi lavada com solução de cloreto de sódio saturada (10 mL*x2), seca sobre sulfato de sódio anidro e filtrada. O filtrado foi concentrado sob pressão reduzida. Os resíduos resultantes foram purificados por cromatografia de camada fina com desenvolvimento do sistema de solvente B para obter o produto do título 9d (19 mg, rendimento: 73,6%). MS m/z (ESI): 842,1[M+1]. Etapa 5 2-((2-Aminoacetamido)metóxi)-2-ciclopropil-N-((1S,9S)-9-etil-5-fluoro- 9-hidróxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il)acetamida 9e
[364] 9d (19 mg, 22,6 umol) foi dissolvido em 2 mL de diclorome- tano, seguido pela adição de 1 mL de dietilamina. A solução de reação foi agitada à temperatura ambiente por 2 horas. A solução de reação foi concentrada sob pressão reduzida. 1 mL de tolueno foram adicionados e a solução foi concentrada sob pressão reduzida, o que foi repetido duas vezes. 3 mL de n-hexano foram adicionados aos resíduos para polpar, e o sobrenadante foi vertido após permanecer para reter o sólido. Os resíduos sólidos foram concentrados sob pressão reduzida por uma bomba de óleo até secura para obter o produto do título bruto 9e (17 mg), que foi usado diretamente na próxima etapa sem purificação. MS m/z (ESI): 638,0[M+18]. Etapa 6 N-((2R,10S)-10-Benzil-2-ciclopropil-1-(((1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi- 4-metil-10,13-dioxo0-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pi- rano[3',4":6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il)amino)-1,6,9,12,15-penta- 0x0-3-0xa-5,8,11,14-tetra-azahexadecan-16-il)-6-(2,5-dioxo-2,5-dihi- dro-1H-pirrol-1-il)hexanamida 9-A N-((28,10S)-10-Benzil-2-ciclopropil-1-(((1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi- 4-metil-10,13-dioxo0-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pi- rano[3',4":6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il)amino)-1,6,9,12,15-penta- 0x0-3-0xa-5,8,11,14-tetra-azahexadecan-16-il)-6-(2,5-dioxo-2,5-dihi- dro-1H-pirrol-1-il)hexanamida 9-B
[365] O composto bruto 9e (13,9 mg, 22,4 umol) foi dissolvido em 0,6 mL de N,N-dimetilformamida. A solução foi purgada com argônio três vezes, e resfriada a 0-5ºC em um banho de água gelada. 8g (21,2 mg, 44,8 umol) em 0,3 mL de N,N-dimetilformamida, e cloreto de 4-(4,6-di- metóxi-1,3,5-triazin-2-il)-4-metilmorfolínio (18,5 mg, 67,3 umol) foram adicionados, e a solução de reação foi agitada em um banho gelado por minutos. O banho gelado foi removido, e a solução de reação foi aquecida à temperatura ambiente e agitada por 1 hora para obter com- posto 9. A solução de reação foi purificada por cromatografia líquida de alto desempenho (condições de separação: coluna: XBridge Prep C18 OBD 5 um 19*250 mm; fase móvel: A-water (10 mmol NH.OAc), B-ace- tonitrila, eluição de gradiente, taxa de fluxo: 18 mL/min). As frações cor- respondentes foram coletadas, e concentradas sob pressão reduzida para obter o produto do título (9-A: 2,4 mg, 9-B: 1,7 mg).
MS m/z (ESI): 1074,4 [M+1].
[366] Composto 9-A com configuração única (tendo tempo de re- tenção mais curto):
[367] Análise UPLC: tempo de retenção: 1,14 minutos, pureza: 85% (coluna: ACQUITY UPLC BEHC18 1,7 um 2,1*50mm, fase móvel: A-wa- ter (5 mmol NH.OAc), B-acetonitrila).
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): 5 8,60 (t, 1H), 8,51-8,49 (d, 1H), 8,32-8,24 (m, 1H), 8,13-8,02 (m, 2H), 8,02-7,96 (m, 1H), 7,82-7,75 (m, 1H), 7,31 (s, 1H), 7,26-7,15 (m, 4H), 6,99 (s, 1H), 6,55-6,48 (m, 1H), 5,65-5,54 (m, 1H), 5,41 (s, 2H), 5,35-5,15 (m, 3H), 4,74-4,62 (m, 1H), 4,54-4,40 (m, 2H), 3,76-3,64 (m, 4H), 3,62-3,48 (m, 2H), 3,20-3,07 (m, 2H), 3,04-2,94 (m, 1H), 2,80-2,62 (m, 1H), 2,45-2,30 (m, 3H), 2,25-2,15 (m, 2H), 2,15-2,04 (m, 2H), 1,93-1,78 (m, 2H), 1,52-1,39 (m, 3H), 1,34- 1,12 (m, 5H), 0,87 (t, 3H), 0,64-0,38 (m, 4H).
[368] Composto 9-B com configuração única (tendo tempo de re- tenção mais longo):
[369] Análise UPLC: tempo de retenção: 1,16 minutos, pureza: 89%
(coluna: ACQUITY UPLC BEHC18 1,7 um 2,1*50mm, fase móvel: A-wa- ter (5 mmol NH.OAc), B-acetonitrila).
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6s): 5 8,68-8,60 (m, 1H), 8,58- 8,50 (m, 1H), 8,32-8,24 (m, 1H), 8,13-8,02 (m, 2H), 8,02-7,94 (m, 1H), 7,82-7,75 (m, 1H), 7,31 (s, 1H), 7,26-7,13 (m, 3H), 6,99 (s, 1H), 6,55- 6,48 (m, 1H), 5,60-5,50 (m, 1H), 5,41 (s, 2H), 5,35-5,15 (m, 2H), 4,78- 4,68 (m, 1H), 4,60-4,40 (m, 2H), 3,76-3,58 (m, 4H), 3,58-3,48 (m, 1H), 3,20-3,10 (m, 2H), 3,08-2,97 (m, 2H), 2,80-2,72 (m, 2H), 2,45-2,30 (m, 3H), 2,25-2,13 (m, 2H), 2,13-2,04 (m, 2H), 2,03-1,94 (m, 2H), 1,91-1,78 (m, 2H), 1,52-1,39 (m, 3H), 1,34-1,12 (m, 4H), 0,91-0,79 (m, 3H), 0,53- 0,34 (m, 4H). Exemplo 10 N-((28,10S)-10-Benzil-2-(((1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil- 10,13-dioxo0-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[del]pi- rano[3',4":6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il)carbamoil)-1,1,1-trifluoro- 6,9,12,15-tetraoxo-3-0xa-5,8,11,14-tetra-azahexadecan-16-i1)-6-(2,5- dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)nexanamida 10-A N-((2R,10S)-10-Benzil-2-(((1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil- 10,13-dioxo0-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[del]pi- rano[3',4":6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il)carbamoil)-1,1,1-trifluoro- 6,9,12,15-tetraoxo-3-0xa-5,8,11,14-tetra-azahexadecan-16-i1)-6-(2,5- dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)exanamida 10-B CORA, xe Ro CA 7 AÍ POTENTE, COTIA, VY FLY" « eo us e
Ãx PoÃo & ha Es? Gê ATO mn QA ço xo sema OVA pesos APS CANAS qo vo ES ” » o. Peas Pee : TX .s X Etapa 1 Benzila 3,3,3-trifluoro-2-hidroxipropanoate 10a
[370] 3a (1,80 g, 12,5 mmol) foi dissolvido em 100 mL de acetoni- trila, e em seguida adicionado com carbonato de potássio (5,17 g, 37,5 mmol), brometo de benzila (4,48 mL, 37,5 mmol) e iodeto de tetrabutila- mônio (231 mg, 0,63 mmol) sucessivamente. A solução de reação foi aquecida a 60ºC e agitada por 5 horas. A solução de reação foi resfriada à temperatura ambiente e filtrada. O filtrado foi concentrado sob pressão reduzida, e os resíduos resultantes foram purificados por cromatografia de coluna em sílica gel com desenvolvimento do sistema de solvente C para obter o produto do título 10a (980 mg, rendimento: 33,5%).
1H RMN (400 MHz, CDCI3): 5 7,43-7,36 (m, 5H), 5,34 (s, 2H), 4,53 (s, 1H), 3,44 (s, 1H). Etapa 2 Benzila — 1-(9H-fluoren-9-il)-3,6-dioxo-10-(trifluorometil)-2,9-dioxa-4,7- diazaundecan-11-0ato 10b
[371] 8b (63 mg, 0,17 mmol) e 10a (80 mg, 0,34 mmol) foram adi- cionados ao frasco de reação, seguido pela adição de 3 mL de tetrahi- drofurano. A solução de reação foi purgada com argônio três vezes e resfriada a 0-5ºC em um banho de água gelada. Terc-butóxido de po- tássio (38 mg, 0,34 mmol) foi adicionado e o banho de água gelada foi removido. A solução de reação foi aquecida à temperatura ambiente e agitada por 20 minutos. 10 mL de água gelada foram adicionados à so- lução de reação, que foi em seguida extraída com acetato de etila (20 mL*2) e clorofórmio (10 mL*x5). As fases orgânicas foram combinadas e concentradas, e os resíduos resultantes foram dissolvidos em 2 mL de dioxano. 0,4 mL de água, bicarbonato de sódio (19 mg, 0,23 mmol) e cloroformiato de 9-fluoreno metila (49 mg, 0,19 mmol) foram adiciona- dos, e a solução de reação foi agitada à temperatura ambiente por 1 hora. 20 mL de água foram adicionados, e a solução de reação foi ex- traída com acetato de etila (10 mLx3). A fase orgânica foi lavada com solução de cloreto de sódio saturada (20 mL), seca sobre sulfato de só- dio anidro e filtrada. O filtrado foi concentrado sob pressão reduzida. Os resíduos resultantes foram purificados por cromatografia de coluna em sílica gel com desenvolvimento do sistema de solvente C para obter o produto do título 10b (51 mg, rendimento: 55,3%). MS m/z (ESI): 559,9 [M+18]. Etapa 3 Ácido 1-(9H-Fluoren-9-il)-3,6-dioxo-10-(trifluorometil)-2,9-dioxa-4,7-dia- zaundecan-11-0ico 10c
[372] 10b (15 mg, 0,28 mmol) foi dissolvido em 3 mL de um sol- vente misturado de tetrahidrofurano e acetato de etila (V:V=2:1), se- guido pela adição de paládio sobre carbono (15 mg, teor: 10%). A solu- ção de reação foi purgada com hidrogênio três vezes e agitada à tem- peratura ambiente por 1 hora. A solução de reação foi filtrada através de celite, e o bolo do filtro foi lavado com tetrahidrofurano. O filtrado foi concentrado para obter o produto do título bruto 10c (13 mg). MS m/z (ESI): 452,9 [M+1]. Etapa 4 (9H-Fluoren-9-il)]metil (2-((((3-(((1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9I-hidróxi-4-metil-
10,13-dioxo0-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[del]pi- rano[3',4":6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il)amino)-1,1,1-trifluoro-3-0x0- propan-2-il)óxi)Metil)amino)-2-0x0etil)carbamato 10d
[373] 1b (10 mg, 18,8 umol) foi adicionado ao frasco de reação, seguido pela adição de 1 mL de N,N-dimetilformamida. A solução foi purgada com argônio três vezes, e resfriada a 0-5ºC em um banho de água gelada. Uma gota de trietilamina, 10c (13 mg, 28,7 umol) in 0,5 mL de N,N-dimetilformamida, e cloreto de 4-(4,6-dimetóxi-1,3,5-triazin-2-il)- 4-metilmorfolínio (11 mg, 39,7 umol) foram adicionados, e a solução de reação foi agitada em um banho gelado por 30 minutos. 10 mL de água foram adicionados, e a solução de reação foi extraída com acetato de etila (10 mLx3). A fase orgânica foi combinada, lavada com solução de cloreto de sódio saturada (10 mL*2), seca sobre sulfato de sódio anidro e filtrada. O filtrado foi concentrado sob pressão reduzida, e os resíduos resultantes foram purificados por cromatografia de camada fina com de- senvolvimento do sistema de solvente B para obter o produto do título 10d (16 mg, rendimento: 97,8%).
MS m/z (ESI): 870,0[M+1]. Etapa 5 2-((2-Aminoacetamido)metóxi)-N-((1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi- 10,13-dioxo0-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[del]pi- rano[3',4":6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-i1)-3,3,3-trifluoropropanamida 10e
[374] 10d (16 mg, 18,4 umol) foi dissolvido em 0,6 mL de dicloro- metano, seguido pela adição de 0,3 mL de dietilamina. A solução de re- ação foi agitada à temperatura ambiente por 2 horas. A solução de rea- ção foi concentrada sob pressão reduzida. 2 mL de tolueno foram adici- onados e a solução foi concentrada sob pressão reduzida, o que foi re- petido duas vezes. 3 mL de n-hexano foram adicionados ao resíduo para polpar, e o sobrenadante foi vertido após permanecer por um instante para reter o sólido, o que foi repetido três vezes. Os resíduos sólidos foram concentrados sob pressão reduzida por uma bomba de óleo até secura para obter o produto do título bruto 10e (12 mg), que foi usado diretamente na próxima etapa sem purificação. MS m/z (ESI): 647,9 [M+1]. Etapa 6 N-((28,10S)-10-Benzil-2-(((1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil- 10,13-dioxo0-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[del]pi- rano[3',4":6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il)carbamoil)-1,1,1-trifluoro- 6,9,12,15-tetraoxo-3-0xa-5,8,11,14-tetra-azahexadecan-16-i1)-6-(2,5- dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)nexanamida 10-A N-((2R,10S)-10-Benzil-2-(((1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil- 10,13-dioxo0-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[del]pi- rano[3',4":6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il)carbamoil)-1,1,1-trifluoro- 6,9,12,15-tetraoxo-3-0xa-5,8,11,14-tetra-azahexadecan-16-i1)-6-(2,5- dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)exanamida 10-B
[375] O composto bruto 10e (12 mg, 18,5 umol) foi dissolvido em 1,0 mL de N,N-dimetilformamida. A solução foi purgada com argônio três vezes, e resfriada a 0-5ºC em um banho de água gelada. 8g (14 mg, 29,6 umol) em 0,3 mL de N,N-dimetilformamida, e cloreto de 4-(4,6-di- metóxi-1,3,5-triazin-2-il)-4-metilmorfolínio (15 mg, 54,2 umol) foram adi- cionados, e a solução de reação foi agitada em um banho gelado por 30 minutos. O banho gelado foi removido, e a solução de reação foi aque- cida à temperatura ambiente e agitada por 1 hora para obter composto
10. A solução de reação foi purificada por cromatografia líquida de alto desempenho (condições de separação: coluna: XBridge Prep C18 OBD um 19*250 mm; fase móvel: A-water (10 mmol NH.OAc), B-acetoniítrila, eluição de gradiente, taxa de fluxo: 18 mL/min). As frações correspon- dentes foram coletadas, e concentradas sob pressão reduzida para ob- ter os produtos do título (2,7 mg, 2,6 mg).
MS m/z (ESI): 1102,0 [M+1].
[376] Composto com configuração única (tendo tempo de retenção mais curto):
[377] Análise UPLC: tempo de retenção: 1,18 minutos, pureza: 91% (coluna: ACQUITY UPLC BEHC18 1,7 um 2,1*50mm, fase móvel: A-wa- ter (5 mmol NH.OAc), B-acetonitrila).
1H RMN (400 MHz, DMSO-ds): 5 8,97 (d, 1H), 8,85-8,76 (m, 1H), 8,37-8,27 (m, 1H), 8,12-8,02 (m, 1H), 8,02-7,95 (m, 1H), 7,80 (d, 1H), 7,31 (s, 1H), 7,26-7,10 (m, 4H), 6,99 (s, 1H), 6,66 (br, 1H), 6,52 (s, 1H), 5,65-5,54 (m, 1H), 5,41 (s, 1H), 5,37-5,25 (m, 3H), 5,23-5,13 (m, 1H), 4,81-4,68 (m, 2H), 4,51-4,41 (m, 1H), 3,78-3,45 (m, 6H), 3,21-3,13 (m, 1H), 3,02-2,93 (m, 1H), 2,77-2,63 (m, 2H), 2,45-2,29 (m, 3H), 2,24- 2,05 (m, 3H), 2,04-1,93 (m, 5H), 1,90-1,75 (m, 2H), 1,52-1,38 (m, 4H), 0,90-0,78 (m, 5H).
[378] Composto com configuração única (tendo tempo de retenção mais longo):
[379] Análise UPLC: tempo de retenção: 1,23 minutos, pureza: 90% (coluna: ACQUITY UPLC BEHC18 1,7 um 2,1*50mm, fase móvel: A-wa- ter (5 mmol NH.OAc), B-acetonitrila).
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): 5 9,05 (d, 1H), 8,97-8,88 (m, 1H), 8,35-8,27 (m, 1H), 8,11-8,03 (m, 1H), 8,02-7,95 (m, 1H), 7,80 (d, 1H), 7,34 (s, 1H), 7,29-7,13 (m, 4H), 6,99 (s, 1H), 6,66 (br, 1H), 6,54 (s, 1H), 5,64-5,55 (m, 1H), 5,43 (s, 1H), 5,36-5,20 (m, 3H), 4,92-4,85 (m, 1H), 4,82-4,72 (m, 2H), 4,52-4,42 (m, 1H), 3,77-3,48 (m, 6H), 3,21-3,14 (m, 1H), 3,03-2,95 (m, 1H), 2,79-2,65 (m, 2H), 2,47-2,28 (m, 3H), 2,25- 2,05 (m, 3H), 2,05-1,94 (m, 5H), 1,91-1,76 (m, 2H), 1,52-1,37 (m, 4H), 0,92-0,77 (m, 5H). Exemplo 11 1-(((S)-7-Benzil-20-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-11)-3,6,9,12,15- pentaoxo-2,5,8,11,14-penta-azaicosil)óxi)-N-((1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-
hidróxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il)ciclobutano-1- carboxamida 11 CADA AA,
S O ADO " ZA mo Fel o fi A o fã ARS , Etapa 3 "“ AS - ARES . AAÃ 12 QU ess QD se Te " Te " Fel, FÃ As Fio, ' RE Etapa 1 1-((2-((((9H-Fluoren-9-il) metóxi)carbonil)amino)acetamido)metóxi)ciclo- butano-1-carboxilato de benzila 11b
[380] 1-Hidroxiciclobutano-carboxilato de benzila 11a (167 mg, 0,81 mmol, preparado de acordo com o método conhecido descrito em “Journal de Medicinal Chemistry, 2013, vol. 56, % 13, p. 5541 - 5552") e 8b (150 mg, 0,41 mmol) foram adicionados ao frasco de reação, seguido pela adição de 5 mL de tetrahidrofurano. A solução de reação foi pur- gada com argônio três vezes e resfriada a 0-5ºC em um banho de água gelada, seguido pela adição de terc-butóxido de potássio (92 mg, 0,82 mmol). O banho de água gelada foi removido, e a solução de reação foi aquecida à temperatura ambiente e agitada por 10 minutos. 20 mL de água gelada foram adicionados à solução de reação, que foi em seguida extraída com acetato de etila (5 mLx2) e clorofórmio (5 mL*5). As fases orgânicas foram combinadas e concentradas, e os resíduos resultantes foram dissolvidos em 3 mL de dioxano. 0,6 mL de água, bicarbonato de sódio (41 mg, 0,48 mmol) e cloroformiato de 9-fluoreno metila (105 mg, 0,41 mmol) foram adicionados, e a solução de reação foi agitada à tem- peratura ambiente por 1 hora. 20 mL de água foram adicionados, e a solução de reação foi extraída com acetato de etila (8 mLx3). A fase orgânica foi lavada com solução de cloreto de sódio saturada (20 mL), seca sobre sulfato de sódio anidro e filtrada. O filtrado foi concentrado sob pressão reduzida. Os resíduos resultantes foram purificados por cromatografia de coluna em sílica gel com desenvolvimento do sistema de solvente C para obter o produto do título 11b (37 mg, rendimento: 17,6%). MS m/z (ESI): 514,6 [M+1]. Etapa 2 Ácido 1-((2-((((9H-fluoren-9-il) metóxi)carbonil)amino)acetamido)me- tóxi)ciclobutano-1-carboxílico 1c
[381] 11b (37 mg, 71,9 umol) foi dissolvido em 3 mL de um sol- vente misturado de tetrahidrofurano e acetato de etila (V:V=2:1), se- guido pela adição de paládio sobre carbono (15 mg, teor: 10%). A solu- ção de reação foi purgada com hidrogênio três vezes e agitada à tem- peratura ambiente por 2 horas. A solução de reação foi filtrada através de celite, e o bolo do filtro foi lavado com tetrahidrofurano. O filtrado foi concentrado para obter o produto do título 11c (35 mg, rendimento: 82%), que foi usado diretamente na próxima etapa. Etapa 3 (9H-Fluoren-9-il)]metil/ (2-(((1-(((1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9I-hidróxi-4-metil- 10,13-dioxo0-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[del]pi- rano[3',4":6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il)carbamoil)ciclobutóxi)me- til)amino)-2-ox0etil)carbamato 11d
[382] 1b (10 mg, 0,018 mmol) foi adicionado ao frasco de reação, seguido pela adição de 1 mL de N,N-dimetilformamida. A solução foi purgada com argônio três vezes, e resfriada a 0-5ºC em um banho de água gelada. Uma gota de trietilamina, 11c (13 mg, 0,031 mmol) em 0,5 mL de N,N-dimetilformamida, e cloreto de 4-(4,6-dimetóxi-1,3,5-triazin- 2-i1)-4-metilmorfolínio (25 mg, 0,091 mmol) foram adicionados, e a solu- ção de reação foi agitada em um banho gelado por 40 minutos. 8 mL de água foram adicionados, e a solução de reação foi extraída com acetato de etila (5 mL*3). A fase orgânica foi lavada com solução de cloreto de sódio saturada (8 mL), seca sobre sulfato de sódio anidro e filtrada. O filtrado foi concentrado sob pressão reduzida, e os resíduos resultantes foram purificados por cromatografia de camada fina com desenvolvi- mento do sistema de solvente A para obter o produto do título 11d (19 mg, rendimento: 73,9%). MS m/z (ESI): 842,3 [M+1]. Etapa 4 1-((2-Aminoacetamido)metóxi)-N-((1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4- metil-10,13-diox0-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pi- rano[3',4":6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il)ciclobutano-1-carboxamida 11e
[383] 11d (19 mg, 22,6 umol) foi dissolvido em 2 mL de diclorome- tano, seguido pela adição de 1 mL de dietilamina. A solução de reação foi agitada à temperatura ambiente por 1,5 hora. A solução de reação foi concentrada sob pressão reduzida. 1 mL de tolueno foram adicionados e a solução foi concentrada sob pressão reduzida, o que foi repetido duas vezes. 4 mL de n-hexano foi adicionado para polpar, e a camada de cima de hexano foi vertida, o que foi repetido três vezes. A solução foi concentrada sob pressão reduzida para obter o produto do título bruto 11e (15 mg), que foi usado diretamente na próxima etapa sem purificação. Etapa 5 1-(((S)-7-Benzil-20-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-11)-3,6,9,12,15- pentaoxo-2,5,8,11,14-penta-azaicosil)óxi)-N-((1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-
hidróxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il)ciclobutano-1- carboxamida 11
[384] O composto bruto 11e (2 mg, 3,22 umol) foi dissolvido em 0,5 mL de N,N-dimetilformamida. A solução foi purgada com argônio três vezes, e resfriada a 0-5ºC em um banho de água gelada. 8g (1,5 mg, 3,17 umol) in 0,3 mL de N,N-dimetilformamida, e cloreto de 4-(4,6-dime- tóxi-1,3,5-triazin-2-il)-4-metilmorfolínio (2,7 mg, 9,67 umol) foram adici- onados, e a solução de reação foi agitada à temperatura ambiente por minutos. A solução de reação foi concentrada para secagem através de evaporação rotatória por uma bomba de óleo para remover DMF. Os resíduos foram dissolvidos em DCM, e purificados por cromatografia de camada fina duas vezes (desenvolvimento de polaridade de solvente: DCM/MeOH=10/1) para obter o produto do título 11 (1 mg, rendimento: 28,8%).
MS m/z (ESI): 1073,6 [M+1].
1H RMN (400 MHz, CDCI3): 5 8,70-8,60 (m, 1H), 8,28-8,19 (m, 1H), 8,13-7,91 (m, 3H), 7,79-7,71 (d, 1H), 7,29 (s, 1H), 7,25-7,09 (m, 4H), 6,98 (s, 1H), 6,71-6,62 (m, 1H), 6,55-6,47 (m, 1H), 5,64-5,54 (m, 2H), 5,40 (s, 1H), 5,35-5,27 (t, 2H), 5,17-5,10 (m, 2H), 4,60-4,51 (m, 1H), 4,51-4,35 (m, 2H), 3,93-3,78 (m, 3H), 3,71-3,59 (m, 3H), 3,01-2,88 (m, 3H), 2,70-2,64 (m, 2H), 2,44-2,30 (m, 3H), 2,28-2,14 (m, 3H), 2,11-1,92 (m, 6H), 1,90-1,76 (m, 3H), 1,51-1,39 (m, 4H), 0,92-0,75 (m, 6H). Exemplo 12 (S)-3-Ciclopropil-N-((1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13- dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indo- lizino[1,2-b]quinolin-1-il)-2-hidroxipropanamida 12-A (R)-3-Ciclopropil-N-((1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13- dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indo- lizino[1,2-b]quinolin-1-il)-2-hidroxipropanamida 12-B
LOU AOS 7 se > a É om É om Do e ho AS TS Gm RR DR ” = E) X RS E Etapa 1 Ácido 3-ciclopropil-2-hidroxipropanoico 12b
[385] 12a (0,5 g, 3,87 mmol, fornecedor: Adamas) foi dissolvido em mL de um solvente misturado de água e ácido acético (V:V=4:1), e a solução foi resfriada a 0-5ºC em um banho de água gelada. Solução aquosa a 2M de nitrito de sódio (0,53 g, 7,74 mmol) foi adicionada em gotas, e a solução de reação foi aquecida à temperatura ambiente e agitada por 3 horas. Cloreto de sódio sólido foi adicionado à solução de reação para saturar a fase aquosa. A solução foi extraída com acetato de etila (8 mL*x8), seca sobre sulfato de sódio anidro, e filtrada. O filtrado foi concentrado para obter o produto do título 12b (0,45 g, rendimento: 89,3%). Etapa 2 (S)-3-Ciclopropil-N-((1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13- dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indo- lizino[1,2-b]quinolin-1-il)-2-hidroxipropanamida 12-A (R)-3-Ciclopropil-N-((1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13- dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indo- lizino[1,2-b]quinolin-1-il)-2-hidroxipropanamida 12-B
[386] 1,5 mL de etanol e 1,5 mL de N,N-dimetilformamida foram adicionados a 1b (45 mg, 0,085 mmol). A solução foi purgada com ar- gônio três vezes. 0,1 mL de N-metilmorfolina foi adicionado em gotas, e a solução de reação foi agitada até clarear. 12b (90 mg, 0,691 mmol),
1-hidroxibenzotriazol (34 mg, 0,251 mmol) e cloridrato de 1-(3-dimetila- minopropil)-3-etilcarbodiimida (49 mg, 0,256 mmol) foram adicionados sucessivamente à solução de reação. Após finalização da adição, a so- lução de reação foi agitada à temperatura ambiente por 3 horas. A solu- ção de reação foi concentrada sob pressão reduzida, e o composto bruto resultante 12 foi purificado por cromatografia líquida de alto de- sempenho (condições de separação: coluna: Sharpsil-T C18 5 um 21,2*250 mm; fase móvel: A-water (10 mmol NH.OAc), B-acetonitrila, eluição de gradiente, taxa de fluxo: 18 mL/min) para obter o produto do título (7 mg, 15 mg).
MS m/z (ESI): 547,9 [M+1].
[387] Composto com configuração única (tendo tempo de retenção mais curto)
[388] Análise UPLC: tempo de retenção: 1,345 minutos, pureza: 72% (coluna: ZORBAX Ecliphase Plus C18 1,8 um 2,1*50mm, fase mó- vel: A-water (5 mmol NH.OAc), B-acetonitrila).
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): 5 8,42 (d, 1H), 7,78 (d, 1H), 7,30 (s, 1H), 6,51 (s, 1H), 5,60-5,50 (m, 2H), 5,42 (s, 1H), 5,19 (q, 2H), 4,02-4,00 (m, 1H), 3,21-3,11 (m, 2H), 2,39 (s, 3H), 2,21-2,07 (m, 2H), 2,05-1,95 (m, 1H), 1,92-1,68 (m, 4H), 1,53-1,41 (m, 1H),0,87 (t, 3H), 0,48-0,34 (m, 2H), 0,14-0,01 (m, 2H).
[389] Composto com configuração única (tendo tempo de retenção mais longo)
[390] Análise UPLC: tempo de retenção: 1,399 minutos, pureza: 88% (coluna: ZORBAX Ecliphase Plus C18 1,8 um 2,1*50mm, fase mó- vel: A-water (5 mmol NH.OAc), B-acetonitrila).
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): 5 8,36 (d, 1H), 7,77 (d, 1H), 7,31 (s, 1H), 6,51 (s, 1H), 5,58-5,51 (m, 1H), 5,48 (d, 1H), 5,42 (s, 1H),5,20 (q, 2H), 4,09-4,02 (m, 1H), 3,22-3,11 (m, 2H), 2,39 (s, 3H), 2,27-2,06 (m, 2H), 2,05-1,95 (m, 1H), 1,93-1,81 (m, 2H), 1,65-1,43 (m,
2H), 1,32-1,21 (m, 1H), 0,87 (t, 3H), 0,48-0,33 (m, 2H), 0,14-0,01 (m, 2H). Exemplo 13 (exemplo de referência) N-((18,9S)-9-Etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15- hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1- iI)-2-hidroxiacetamida Ho No nO 0 XVZN o Jon Ff 13
[391] O composto do título 13 foi preparado de acordo com o mé- todo descrito no Exemplo 76 na página 147 da descrição do pedido de patente EP2907824A1. Exemplo 14 N-((2R,10S)-10-Benzil-2-(ciclopropilmetil)-1-(((1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9- hidróxi-4-metil-10,13-dioxo0-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il)amino)- 1,6,9,12,15-pentaoxo-3-0xa-5,8,11,14-tetra-azahexadecan-16-il)-6- (2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanamida 14-A N-((28,10S)-10-Benzil-2-(ciclopropilmetil)-1-(((1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9- hidróxi-4-metil-10,13-dioxo0-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il)amino)- 1,6,9,12,15-pentaoxo-3-0xa-5,8,11,14-tetra-azahexadecan-16-il)-6- (2,5-dioxo-2,5-dihidro-1 H-pirrol-1-il)hexanamida 14-B us a us Fo
Ç tum) SO AAA A, NX LO Em? A rs dd Fes AA es o E “A. A AL ) q O. A Y ? x LA O esmo AAA, VE 4 ” " x do Dn PS " FA, PA - PEITO aee o OO FR mo . & Etapa 1 3-Ciclopropil-2-hidroxipropanoato de benzila 14a
[392] 12b (200 mg, 1,54 mmol) foi dissolvido em 20 mL de aceto- nitrila, e em seguida adicionado com carbonato de potássio (1,06 g, 7,68 mmol), brometo de benzila (0,16 mL, 1,34 mmol) e iodeto de tetrabutila- mônio (28 mg, 0,07 mmol) sucessivamente. A solução de reação foi agi- tada à temperatura ambiente por 48 horas, e filtrada através de celite. O bolo do filtro foi lavado com acetato de etila (10 ml), e os filtrados foram combinados e concentrados sob pressão reduzida. Os resíduos resultantes foram purificados por cromatografia de coluna em sílica gel com desenvolvimento do sistema de solvente C para obter o produto do título 14a (140 mg, rendimento: 41,3%). Etapa 2 10-(Ciclopropilmetil)-1-(9H-fluoren-9-i1)-3,6-dioxo-2,9-dioxa-4,7-dia- zaundecan-11-0ato de benzila 14b
[393] 14a (94 mg, 0,427 mmol) e 8b (130 mg, 0,353 mmol) foram adicionados ao frasco de reação, seguido pela adição de 10 mL de te- trahidrofurano. A solução de reação foi purgada com argônio três vezes e resfriada a 0-5ºC em um banho de água gelada, seguido pela adição de terc-butóxido de potássio (79 mg, 0,704 mmol). O banho de água gelada foi removido, e a solução de reação foi aquecida à temperatura ambiente e agitada por 10 minutos. 20 mL de água gelada foram adici- onados à solução de reação, que foi em seguida extraída com acetato de etila (10 mLx4). A fase orgânica foi lavada com solução de cloreto de sódio saturada (20 mL), seca sobre sulfato de sódio anidro, e filtrada. O filtrado foi concentrado sob pressão reduzida. Os resíduos resultantes foram purificados por cromatografia de coluna em sílica gel com desen- volvimento do sistema de solvente C para obter o produto do título 14b (50 mg, rendimento: 26,8%). MS m/z (ESI): 529,2 [M+1]. Etapa 3 Ácido — 10-(ciclopropilmetil)-1-(9H-fluoren-9-il)-3,6-dioxo-2,9-dioxa-4,7- diazaundecan-11-0ico 14c
[394] 14b (27 mg, 0,051 mmol) foi dissolvido em 3 mL de acetato de etila, seguido pela adição de paládio sobre carbono (7 mg, teor: 10%, seca). A solução de reação foi purgada com hidrogênio três vezes e agi- tada à temperatura ambiente por 1 hora. A solução de reação foi filtrada através de celite, e o bolo do filtro foi lavado com acetato de etila. O filtrado foi concentrado para obter o produto do título bruto 14c (23 mg), que foi usado diretamente na próxima etapa sem purificação. MS m/z (ESI): 439,1 [M+1]. Etapa 4 (9H-Fluoren-9-il)]metil (2-((((3-ciclopropil-1-(((1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hi- dróxi-4-metil-10,13-dioxo0-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il)amino)-1-0xopro- pan-2-il)óxi)Metil)amino)-2-0x0etil)carbamato 14d
[395] 1b (22 mg, 42,38 umol) foi adicionado ao frasco de reação, seguido pela adição de 3 mL de N,N-dimetilformamida. A solução foi purgada com argônio três vezes, e resfriada a 0-5ºC em um banho de água gelada. Trietilamina (4,3 mg, 42,49 umol) foi adicionada em gotas, e em seguida adicionada com composto bruto 14c (23 mg, 51,1 umol)
e cloreto de 4-(4,6-dimetóxi-1,3,5-triazin-2-il)-4-metilmorfolínio (17,6 mg, 63,6 umol). A solução de reação foi agitada em um banho gelado por 40 minutos. 15 mL de água foram adicionados, e a solução de reação foi extraída com acetato de etila (8 mLx3). As fases orgânicas foram com- binadas. A fase orgânica foi lavada com solução de cloreto de sódio sa- turada (15 mL), seca sobre sulfato de sódio anidro e filtrada. O filtrado foi concentrado sob pressão reduzida. Os resíduos resultantes foram purificados por cromatografia de camada fina com desenvolvimento do sistema de solvente B para obter o produto do título 14d (29 mg, rendi- mento: 79,9%). MS m/z (ESI): 856,1[M+1]. Etapa 5 2-((2-Aminoacetamido)metóxi)-3-ciclopropil-N-((1S,9S)-9-etil-5-fluoro- 9-hidróxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il)propanamida 14e
[396] 14d (29 mg, 33,9 umol) foi dissolvido em 0,8 mL de dicloro- metano, seguido pela adição de 0,4 mL de dietilamina. A solução de re- ação foi agitada à temperatura ambiente por 1,5 hora. A solução de re- ação foi concentrada sob pressão reduzida. 1 mL de tolueno foram adi- cionados e a solução foi concentrada sob pressão reduzida, o que foi repetido duas vezes. 3 mL de n-hexano foram adicionados aos resíduos para polpar, e o sobrenadante foi vertido após permanecer por um ins- tante, o que foi repetido três vezes. Os resíduos foram concentrados sob pressão reduzida por uma bomba de óleo até secura para obter o produto do título bruto 14e (22 mg), que foi usado diretamente na pró- xima etapa sem purificação. MS m/z (ESI): 634,1[M+1]. Etapa 6 N-((2R,10S)-10-Benzil-2-(ciclopropilmetil)-1-(((1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9- hidróxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-
benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il)amino)- 1,6,9,12,15-pentaoxo-3-0xa-5,8,11,14-tetra-azahexadecan-16-il)-6- (2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanamida 14-A N-((28,10S)-10-Benzil-2-(ciclopropilmetil)-1-(((1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9- hidróxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il)amino)- 1,6,9,12,15-pentaoxo-3-0xa-5,8,11,14-tetra-azahexadecan-16-il)-6- (2,5-dioxo-2,5-dihidro-1 H-pirrol-1-il)hexanamida 14-B
[397] O composto bruto 14e (22 mg, 33,9 umol) foi dissolvido em 2,5 mL de N,N-dimetilformamida. A solução foi purgada com argônio três vezes, e resfriada a 0-5ºC em um banho de água gelada. 8g (24 mg, 50,8 umo!l) e cloreto de 4-(4,6-dimetóxi-1,3,5-triazin-2-il)-4-metilmorfolí- nio (14 mg, 50,6 umol) foram adicionados sucessivamente. O banho de água gelada foi removido, e a solução de reação foi aquecida à tempe- ratura ambiente e agitada por 1 hora para obter composto 14. A solução de reação foi purificada por cromatografia líquida de alto desempenho (condições de separação: coluna: XBridge Prep C18 OBD 5 um 19*250 mm; fase móvel: A-water (10 mmol NH.OAc), B-acetonitrila, eluição de gradiente, taxa de fluxo: 18 mL/min) para obter os produtos do título (2 mg, 2 mg).
MS m/z (ESI): 1088,4 [M+1].
[398] Composto com configuração única (tendo tempo de retenção mais curto):
[399] Análise UPLC: tempo de retenção: 1,18 minutos, pureza: 88% (coluna: ACQUITY UPLC BEHC18 1,7 um 2,1*50mm, fase móvel: A-wa- ter (5 mmol NH.OAc), B-acetonitrila).
[400] Composto com configuração única (tendo tempo de retenção mais longo):
[401] Análise UPLC: tempo de retenção: 1,23 minutos, pureza: 96%
(coluna: ACQUITY UPLC BEHC18 1,7 um 2,1*50mm, fase móvel: A-wa- ter (5 mmol NH.OAc), B-acetonitrila). Exemplo 15 1-((S)-9-Benzil-22-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-11)-5,8,11,14,17- pentaoxo-2-0xa-4,7,10,13,16-penta-azadocosil)-N-((1S,9S)-9-etil-5-flu- oro-9-hidróxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H- benzo[de]pirano[3,4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il)ciclopropano-1- carboxamida 15 Fr A To ” O IA PUiddaçÃAAS E: * DO mA Fr xo OAK & A. 2 Ls MA ALAS o O
UR PANA ad : ô Os emo a a Ah - Fo À, AAA, AE Etapa 1 1-(10-(9H-Fluoren-9-il)-5,8-dioxo-2,9-dioxa-4,7-diazadecil)ciclopro- pano-1-carboxilato de benzila 15b
[402] 8b (500 mg, 1,35 mmol) foi adicionado ao frasco de reação,
seguido pela adição de 6 mL de tetrahidrofurano. 1-Hidroximetilciclopro- pano-1-carboxilato de benzila 15a (233 mg, 1,13 mmol; preparado de acordo com o método descrito no Exemplo 22-2 na página 262 da des- crição do pedido de patente “EP2862856A1”) foi adicionado ao frasco de reação. A solução de reação foi purgada com argônio três vezes e resfriada a 0-5ºC em um banho de água gelada, seguido pela adição de hidreto de sódio (54 mg, 1,35 mmol). O banho de água gelada foi remo- vido, e a solução de reação foi aquecida à temperatura ambiente e agi- tada por 40 minutos. A solução de reação foi resfriada a0ºC, à qual 20 mL de água gelada foram adicionados. A solução foi extraída com ace- tato de etila (5 mLx*2) e clorofórmio (5 mL*5). As fases orgânicas foram combinadas, lavadas com solução de cloreto de sódio saturada (20 mL), secas sobre sulfato de sódio anidro e filtradas. O filtrado foi concentrado sob pressão reduzida, e os resíduos resultantes foram purificados por cromatografia de coluna em sílica gel com desenvolvimento do sistema de solvente B para obter o produto do título 15b (15 mg, rendimento: 2,5%). MS m/z (ESI): 515,2 [M+1]. Etapa 2 Ácido 1-(10-(9H-Fluoren-9-il)-5,8-dioxo-2,9-dioxa-4,7-diazadecil)ciclo- propano-1-carboxílico 15c
[403] 15b (15 mg, 0,029 mmol) foi dissolvido em 2 mL de acetato de etila, seguido pela adição de paládio sobre carbono (3 mg, teor: 10%, seco). A solução de reação foi purgada com hidrogênio três vezes e agi- tada à temperatura ambiente por 4,5 horas. A solução de reação foi fil- trada através de celite, e o bolo do filtro foi lavado com acetato de etila. O filtrado foi concentrado para obter o produto do título 15c (11 mg, ren- dimento: 89%). MS m/z (ESI): 425,2 [M+1]. Etapa 3
(9H-Fluoren-9-il)]metil (2-((((1-(((1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9I-hidróxi-4-metil- 10,13-dioxo0-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[del]pi- rano[3',4":6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il)carbamoil)ciclopropil)me- tóxi)Mmetil)amino)-2-0x0etil)carbamato 15d
[404] 1b (10 mg, 0,021 mmol) foi adicionado ao frasco de reação, seguido pela adição de 1 mL de N,N-dimetilformamida. A solução foi purgada com argônio três vezes, e resfriada a 0-5ºC em um banho de água gelada. Uma gota de trietilamina, 15c (11 mg, 0,026 mmol) e clo- reto de 4-(4,6-dimetóxi-1,3,5-triazin-2-il)-4-metilmorfolínio (10,7 mg, 0,039 mmol) foram adicionados. Após finalização da adição, a solução de reação foi agitada à temperatura ambiente por 60 minutos. 10 mL de água foram adicionados, e a solução de reação foi extraída com acetato de etila (5 mLx*3). A fase orgânica foi lavada com solução de cloreto de sódio saturada (10 mL), seca sobre sulfato de sódio anidro e filtrada. O filtrado foi concentrado sob pressão reduzida, e os resíduos resultantes foram purificados por cromatografia de camada fina com desenvolvi- mento do sistema de solvente B para obter o produto do título 15d (19 mg, rendimento: 87,0%). MS m/z (ESI): 842,2 [M+1]. Etapa 4 1-(((2-Aminoacetamido)metóxi)metil)-N-((1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hi- dróxi-4-metil-10,13-dioxo0-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il)ciclopropano-1- carboxamida 15e
[405] 15d (19 mg, 22,56 umol) foi dissolvido em 2 mL de dicloro- metano, seguido pela adição de 1 mL de dietilamina. A solução de rea- ção foi agitada à temperatura ambiente por 1,5 horas. A solução de re- ação foi concentrada sob pressão reduzida a 0ºC. 1 mL de tolueno fo- ram adicionados e a solução foi concentrada sob pressão reduzida, o que foi repetido duas vezes. 3 mL de n-hexano foram adicionados para polpar, e a camada de cima de hexano foi vertida, o que foi repetido três vezes. A solução foi concentrada sob pressão reduzida para obter o pro- duto do título bruto 15e (13,9 mg), que foi usado diretamente na próxima etapa sem purificação.
MS m/z (ESI): 620,1 [M+1]. Etapa 5 1-((S)-9-Benzil-22-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-11)-5,8,11,14,17- pentaoxo-2-0xa-4,7,10,13,16-penta-azadocosil)-N-((1S,9S)-9-etil-5-flu- oro-9-hidróxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H- benzo[de]pirano[3,4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il)ciclopropano-1- carboxamida 15
[406] O composto bruto 15e (13,9 mg, 22,4 umol) foi dissolvido em 1 mL de N,N-dimetilformamida. A solução foi purgada com argônio três vezes, e resfriada a 0-5ºC em um banho de água gelada. 8g (15,8 mg, 33,4 umol) e cloreto de 4-(4,6-dimetóxi-1,3,5-triazin-2-il)-4-metilmorfolí- nio (9,3 mg, 33,6 umol) foram adicionados. A solução de reação foi aquecida à temperatura ambiente e agitada por 60 minutos. A solução de reação foi purificada por cromatografia líquida de alto desempenho (condições de separação: coluna: XBridge Prep C18 OBD 5 um 19*250 mm; fase móvel: A-water (10 mmol NH.OAc), B-acetonitrila, eluição de gradiente, taxa de fluxo: 18 mL/min). As frações correspondentes foram coletadas, e concentradas sob pressão reduzida para obter o produto do título 15 (2,5 mg, rendimento: 10,3%).
MS m/z (ESI): 1074,2 [M+1].
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): 5 8,51-8,37 (m, 1H), 8,22 (t, 1H), 8,14-8,02 (m, 2H), 8,011-7,94 (m, 1H), 7,82-7,73 (m, 1H), 7,29 (s, 1H), 7,26-7,10 (m, 3H), 6,98 (s, 1H), 6,53-6,47 (m, 1H), 5,62-5,50 (m, 1H), 5,45-5,36 (m, 1H), 5,35-5,23 (m, 2H), 5,13-5,02 (m, 2H), 4,61-4,50 (m, 2H), 4,42-4,28 (m, 2H), 3,76-3,61 (m, 3H), 3,60-3,45 (m, 3H), 3,27- 3,23 (m, 1H), 3,20-2,81 (m,7H), 2,75-2,61 (m, 3H), 241-2,28 (m, 3H),
2,23-2,13 (m, 2H), 2,11-2,01 (m, 1H), 2,03-1,94 (m, 1H), 1,90 (s, 1H), 1,87-1,74 (m, 2H), 1,53-1,36 (m, 3H), 1,29-1,08 (m, 4H), 0,90-0,68 (m, 4H). Exemplo 16 1-((S)-9-Benzil-22-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-11)-5,8,11,14,17- pentaoxo-2-0xa-4,7,10,13,16-penta-azadocosil)-N-((1S,9S)-9-etil-5-flu- oro-9-hidróxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il)ciclobutano-1- carboxamida 16 o O FA, gd O . or end EL ed o roma MAÇÃ ess yes do, em: AA "AO " mendo dio indo A . POOL eme NOIS o O ARA, - AEE Gn Mo - mo = YA PA IX 2
AT “ ES Etapa 1 Ácido 1-(hidroximetil)ciclobutano-1-carboxílico 16b
[407] 1-(Hidroximetil)ciclobutanocarboxilato de etila 16a (250 mg, 1,58 mmol, fornecedor: Alfa) foi dissolvido em metanol (2 mL) e água (1 mL), seguido pela adição de hidróxido de sódio (126 mg, 3,15 mmol). À solução de reação foi aquecida to 40ºC e agitada por 3 horas. A solução de reação foi resfriada à temperatura ambiente, e concentrada sob pres- são reduzida para remover o solvente orgânico. A solução foi extraída com éter (10 mL), e a camada aquosa foi coletada. A fase aquosa foi ajustada para pH 3-4 com ácido clorídrico aquoso a 6N, e concentrada sob pressão reduzida para obter um sólido. 3 mL de tolueno foram adi- cionados e a solução foi concentrada sob pressão reduzida até secura, o que foi repetido três vezes. Os resíduos foram secos por uma bomba de óleo para obter o produto do título bruto 16b (206 mg), que foi usado diretamente na próxima etapa sem purificação.
MS m/z (ESI, NEG):129,2 [M-1]. Etapa 2 1-(Hidroximetil)ciclobutano-1-carboxilato de benzila 16c
[408] O composto bruto 16b (206 mg, 1,58 mmol) foi dissolvido em acetonitrila (15 mL), seguido pela adição de carbonato de potássio ani- dro (1,09 g, 7,90 mmol), iodeto de tetrabutilamônio (29 mg, 78,51 umol) e brometo de benzila (216 mg, 1,26 mmol). A solução de reação foi agi- tada à temperatura ambiente durante a noite. A solução de reação foi filtrada, e o filtrado foi concentrado sob pressão reduzida. Os resíduos resultantes foram purificados por cromatografia de coluna em sílica gel com desenvolvimento do sistema de solvente C para obter o produto do título 16c (112 mg, rendimento: 32,1%).
MS m/z (ESI): 221,1 [M+1]. Etapa 3 Benzila 1-(10-(9H-fluoren-9-il)-5,8-dioxo-2,9-dioxa-4,7-diazadecil)ciclo- butano-1-carboxilato 16d
[409] 16c (77 mg, 0,35 mmol) e 8b (100 mg, 0,27 mmol) foram adicionados ao frasco de reação, seguido pela adição de 3 mL de tetra- hidrofurano. A solução de reação foi purgada com argônio três vezes e resfriada a 0-5ºC em um banho de água gelada, seguido pela adição de terc-butóxido de potássio (61 mg, 0,54 mmol). A solução de reação foi agitada no banho de água gelada por 10 minutos. 20 mL de água gelada foram adicionados à solução de reação, que foi em seguida extraída com acetato de etila (5 mL) e clorofórmio (5 mL*5). As fases orgânicas foram combinadas e concentradas. Os resíduos resultantes foram dis- solvidos em 3 mL de 1,4-dioxano. 0,5 mL de água, bicarbonato de sódio (27 mg, 0,32 mmol) e cloroformiato de 9-fluoreno metila (70 mg, 0,27 mmol) foram adicionados, e a solução de reação foi agitada à tempera- tura ambiente por 1 hora. 20 mL de água foram adicionados, e a solução de reação foi extraída com acetato de etila (10 mLx*3). A fase orgânica foi lavada com solução de cloreto de sódio saturada (20 mL), seca sobre sulfato de sódio anidro e filtrada. O filtrado foi concentrado sob pressão reduzida. Os resíduos resultantes foram purificados por cromatografia de coluna em sílica gel com desenvolvimento do sistema de solvente C para obter o produto do título 16d (24 mg, rendimento: 16,7%). MS m/z (ESI): 551,3 [M+23]. Etapa 4 1-(10-(9H-Fluoren-9-il)-5,8-dioxo-2,9-dioxa-4,7-diazadecil)ciclobutano- 1-carboxílico 16e
[410] 16d (12 mg, 22,7 umol) foi dissolvido em 1,5 mL de um sol- vente misturado de tetrahidrofurano e acetato de etila (V:V=2:1), se- guido pela adição de paládio sobre carbono (5 mg, teor: 10%). A solução de reação foi purgada com hidrogênio três vezes e agitada à tempera- tura ambiente por 2 horas. A solução de reação foi filtrada através de celite, e o bolo do filtro foi lavado com acetato de etila. O filtrado foi concentrado sob pressão reduzida para obter o produto do título bruto 16e (10 mg), que foi usado diretamente na próxima etapa sem purifica- ção. Etapa 5 (9H-Fluoren-9-il)]metil (2-((((1-(((1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9I-hidróxi-4-metil-
10,13-dioxo0-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[del]pi- rano[3',4":6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il)carbamoil)ciclobutil)me- tóxi)Mmetil)amino)-2-0x0etil)carbamato 16f
[411] 1b (7,5 mg, 0,014 mmol) foi adicionado ao frasco de reação, seguido pela adição de 1 mL de N,N-dimetilformamida. A solução foi purgada com argônio três vezes, e resfriada a 0-5ºC em um banho de água gelada. Uma gota de trietilamina, o composto bruto 16e (10 mg) in 0,5 mL de N,N-dimetilformamida, e cloreto de 4-(4,6-dimetóxi-1,3,5-tria- zin-2-i1)-4-metilmorfolínio (6 mg, 0,026 mmol) foram adicionados, e a so- lução de reação foi agitada em um banho gelado por 30 minutos. 10 mL de água foram adicionados, e a solução de reação foi extraída com ace- tato de etila (10 mLx3). A fase orgânica foi lavada com solução de clo- reto de sódio saturada (10 mL), seca sobre sulfato de sódio anidro e filtrada. O filtrado foi concentrado sob pressão reduzida, e os resíduos resultantes foram purificados por cromatografia de camada fina com de- senvolvimento do sistema de solvente B para obter o produto do título 16f (10,6 mg, rendimento: 87,8%).
MS m/z (ESI): 856,2 [M+1]. Etapa 6 1-(((2-Aminoacetamido)metóxi)metil)-N-((1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hi- dróxi-4-metil-10,13-dioxo0-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il)ciclobutano-1- carboxamida 16g
[412] 16f (10,6 mg, 12,4 umol) foi dissolvido em 0,6 mL de dicloro- metano, seguido pela adição de 0,3 mL de dietilamina. A solução de re- ação foi agitada à temperatura ambiente por 2 horas. A solução de rea- ção foi concentrada sob pressão reduzida. 2 mL de tolueno foram adici- onados e a solução foi concentrada sob pressão reduzida, o que foi re- petido duas vezes. 3 mL de n-hexano foram adicionados para polpar, e a camada de cima de hexano foi vertida, o que foi repetido três vezes.
A solução foi concentrada sob pressão reduzida para obter o produto do título bruto 16g (8 mg), que foi usado diretamente na próxima etapa sem purificação. MS m/z (ESI): 634,1 [M+1]. Etapa 7 1-((S)-9-Benzil-22-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-11)-5,8,11,14,17- pentaoxo-2-0xa-4,7,10,13,16-penta-azadocosil)-N-((1S,9S)-9-etil-5-flu- oro-9-hidróxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il)ciclobutano-1- carboxamida 16
[413] O composto bruto 16g (8 mg) foi dissolvido em 1 mL de N,N- dimetilformamida. 8g (8,8 mg, 18,6 umol) e cloreto de 4-(4,6-dimetóxi- 1,3,5-triazin-2-i1)-4-metilmorfolínio (5,2 mg, 18,8 umol) foram adiciona- dos. A solução de reação foi agitada à temperatura ambiente por 30 mi- nutos. A solução de reação foi purificada por cromatografia líquida de alto desempenho (condições de separação: coluna: XBridge Prep C18 OBD 5 um 19*250 mm; fase móvel: A-water (10 mmol NH.OAc), B-ace- tonitrila, eluição de gradiente, taxa de fluxo: 18 mL/min) para obter o produto do título 16 (1,0 mg, rendimento: 7,2%). MS m/z (ESI): 1088,0 [M+1]. Exemplo 17 (1r,4r)-N-((S)-7-Benzil-1-(1-(((1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil- 10,13-dioxo0-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[del]pi- rano[3',4":6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il)carbamoil)ciclopropóxi)- 3,6,9,12,15-pentaoxo-17,20,23,26,29,32,35,38,4 1-nonaoxa- 2,5,8,11,14-penta-azatritetracontan-43-il)-4-((2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H- pirrol-1-il) metil)ciclohexano-1-carboxamida 17 o Fã , CS PA a A a A aaa An FO ço 7 e OX
Etapa 1 AAA A. pb E É PESA AAA AAA AAA Epa 2, DOTADO En LAS AAA AAA AO FB 1 AA Ea AAA Fes PATA AA À, EI a 7 J « PA Pr o. AA *r IS : A P E. ss 38 Pr SS es AA, & A nReo PEA AA Pa ” % sei . . Ad x 2) Etapa 11 AAAAAAAAAAVAVATAS AA, O A ão S dO XP Etapa 1 1-fenil-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29-decaoxahentriacontan-31-0ato de terc-butila 17b
[414] 1-Fenil-2,5,8,11,14,17,20,23,26-nonaoxaoctacosan-28-ol 17a (0,34 g, 0,67 mmol, fornecedor: Bide Pharmatech Ltd.) foi dissolvido em 10 mL de diclorometano, e em seguida adicionado com silver óxido (0,24 g, 1,01 mmol), bromoacetato de terc-butila (0,16 9, 0,81 mmol) e iodeto de potássio (0,07 g, 0,40 mmol) sucessivamente. A solução de reação foi agitada à temperatura ambiente por 3 horas. A solução de reação foi filtrada, e o filtrado foi concentrado sob pressão reduzida. Os resíduos resultantes foram purificados por cromatografia de coluna em sílica gel com desenvolvimento do sistema de solvente B para obter o produto do título 17b (0,42 g, rendimento: 100%). MS m/z (ESI): 636,3 [M+18]. Etapa 2
29-hidróxi-3,6,9,12,15,18,21,24,27-nonaoxanonacosan-1-oato de terc- butila 17c
[415] 17b (417 mg, 0,67 mmol) foi dissolvido em 15 mL de tetrahi- drofurano, seguido pela adição de paládio sobre carbono (110 mg, teor: 10%, seco). A solução de reação foi purgada com hidrogênio três vezes, aquecida para 60ºC e agitada por 3 horas. A solução de reação foi fil- trada através de celite, e o bolo do filtro foi lavado com tetrahidrofurano. O filtrado foi concentrado para obter o produto do título bruto 17c (357 mg), que foi usado diretamente na próxima etapa sem purificação.
MS m/z (ESI): 546,2 [M+18].
Etapa 3 29-Azido-3,6,9,12,15,18,21,24,27-nonaoxanonacosan-1-o0ato 17d de terc-butila
[416] 170 (357 mg, 0,675 mmol) foi dissolvido em 10 mL de tolueno, seguido pela adição de difenil azide fosfato (279 mg, 1,014 mmol) e 1,8- diazabicicloundec-7-eno (206 mg, 1,353 mmol). A solução de reação foi purgada com argônio três vezes, e agitada à temperatura ambiente por 2 horas, seguida por agitação a 105ºC por 19 horas. A solução de rea- ção foi resfriada à temperatura ambiente e concentrada. 20 mL de água foram adicionados, e a solução foi extraída com acetato de etila (10 mL*4). A fase orgânica foi lavada com solução de cloreto de sódio sa- turada (20 mL), seca sobre sulfato de sódio anidro e filtrada. O filtrado foi concentrado sob pressão reduzida. Os resíduos resultantes foram purificados por cromatografia de coluna em sílica gel com desenvolvi- mento do sistema de solvente B para obter o produto do título bruto 17d (412 mg).
MS m/z (ESI): 571,3 [M+18].
Etapa 4 29-amino-3,6,9,12,15,18,21,24,27-nonaoxanonacosan-1-oato de terc- butila 17e
[417] 17d (230 mg, 0,415 mmol) foi dissolvido em 8 mL de tetrahi- drofurano, seguido pela adição de paládio sobre carbono (58 mg, teor: 10%, seco). A solução de reação foi purgada com hidrogênio três vezes, e agitada à temperatura ambiente por 2 horas. A solução de reação foi filtrada através de celite, e o bolo do filtro foi lavado com tetrahidrofurano. O filtrado foi concentrado para obter o produto do título bruto 17e (220 mg), que foi usado diretamente na próxima etapa sem purificação. MS m/z (ESI): 528,2 [M+1]. Etapa 5 1-((1r,4r7)-4-((2,5-dioxo-2,5-dihidro-1 H-pirrol-1-il)metil)ciclohexil)-1-0x0- 5,8,11,14,17,20,23,26,29-nonaoxa-2-azahentriacontan-31-0ato de terc- butila 17f
[418] Ácido (1r,4r)-4-((2,5-Dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)ÕMmetil) ci- clohexano-1-carboxílico (98,5 mg, 0,415 mmol) foi dissolvido em 10 mL de diclorometano, seguido pela adição de hexafluorofosfato de 2-(7- oxabenzotriazol)-N,N,N',N'-tetrametilureia (190 mg, 0,500 mmol) e N,N- diisopropiletilamina (162 mg, 1,253 mmol). A solução de reação foi pur- gada com argônio três vezes, e em seguida adicionado com o composto bruto 17e (220 mg, 0,417 mmol). A solução de reação foi agitada à tem- peratura ambiente por 1 hora. 15 mL de água foram adicionados, e a solução de reação foi extraída com diclorometano (8 mL*3). As fases orgânicas foram combinadas. A fase orgânica foi lavada com solução de cloreto de sódio saturada (15 mL), seca sobre sulfato de sódio anidro e filtrada. O filtrado foi concentrado sob pressão reduzida. Os resíduos resultantes foram purificados por cromatografia de coluna em sílica gel com desenvolvimento do sistema de solvente B para obter o produto do título 17f (122 mg, rendimento: 39,2%). MS m/z (ESI): 747,2[M+1]. Etapa 6 Ácido 1-((1r,4r)-4-((2,5-Dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)Mmetil)ciclohexil)-
1-0x0-5,8,11,14,17,20,23,26,29-nonaoxa-2-azahentriacontan-31-0ico 179
[419] 17f (122 mg, 0,163 mmol) foi dissolvido em 0,8 mL de diclo- rometano, seguido pela adição de 0,4 mL de ácido trifluoroacético. À solução de reação foi agitada à temperatura ambiente por 1 hora. 15 mL de diclorometano foram adicionados para diluir a solução de reação, e em seguida concentrados sob pressão reduzida. 10 mL de n-hexano foram adicionados e a solução foi concentrada sob pressão reduzida, o que foi repetido duas vezes. 10 mL de tolueno foram adicionados e a solução foi concentrada sob pressão reduzida. 10 mL de um solvente misturado de n-hexano: éter = 5:1 foi adicionado para polpar, o que foi repetido três vezes até o pH cehgar a 7. A solução foi concentrada por uma bomba de óleo até secura para obter o produto do título 17g (98 mg, rendimento: 86,8%).
MS m/z (ESI): 691,2[M+1].
Etapa 7 2,4-Dimetoxibenzil 1-((2-((((9H-fluoren-9-il) metóxi)carbonil)amino)ace- tamido)metóxi)ciclopropano-1-carboxilato 17h
[420] 8d (164 mg, 0,40 mmol) foi dissolvido em diclorometano (5 mL), e em seguida adicionado com álcool 2,4-dimetoxibenzílico (81 mg, 0,48 mmol), cloridrato de 1-etil-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (115 mg, 0,60 mmol) e 4-dimetilaminopiridina (5 mg, 0,041 mmol). Após fina- lização da adição, a solução de reação foi agitada à temperatura ambi- ente por 1 hora. 20 mL de água foram adicionados, e a solução foi par- ticionada após agitação. A fase aquosa foi extraída com diclorometano (8 mLx3), e as fases orgânicas foram combinadas. A fase orgânica foi lavada com solução de cloreto de sódio saturada (20 mL), seca sobre sulfato de sódio anidro e filtrada. O filtrado foi concentrado sob pressão reduzida. Os resíduos resultantes foram purificados por cromatografia de coluna em sílica gel com desenvolvimento do sistema de solvente C para obter o produto do título 17h (124 mg, rendimento: 55,4%). MS m/z (ESI): 583,1[M+23]. Etapa 8 2,4-Dimetoxibenzil (S)-1-((11-benzil-1-(9H-fluoren-9-i1)-3,6,9,12,15-pen- taoxo-2-0Xxa-4,7,10,13,16-penta-azaheptadecan-17-il)óxi)ciclopropano- 1-carboxilato 17)
[421] 17h (39 mg, 69,6 umol) foi dissolvido em 0,6 mL de dicloro- metano, seguido pela adição de 0,3 mL de dietilamina. A solução de re- ação foi agitada à temperatura ambiente por 1 hora. A solução de reação foi concentrada sob pressão reduzida. 2 mL de tolueno foram adiciona- dos e a solução foi concentrada sob pressão reduzida, o que foi repetido duas vezes. 3 mL de n-hexano foram adicionados para polpar, e a ca- mada de cima de hexano foi vertida, o que foi repetido três vezes. À solução foi concentrada sob pressão reduzida. O produto bruto resul- tante foi dissolvido em 2 mL de N,N-dimetilformamida, seguido pela adi- ção de (((9H-fluoren-9-il)metóxi)carbonil) glicilglicil-L-fenilalanina 17i (35 mg, 69,8 umol, preparado de acordo com o método descrito no Exemplo 7-12 na página 13 da descrição do pedido de patente “CN108853514A”) e cloreto de 4-(4,6-dimetóxi-1,3,5-triazin-2-il)-4-metilmorfolínio (23 mg, 83,1 umol). A solução de reação foi agitada à temperatura ambiente por 1 hora. 10 mL de água foram adicionados, e a solução foi extraída com acetato de etila (10 mLx3). As fases orgânicas foram combinadas. À fase orgânica foi lavada com solução de cloreto de sódio saturada (10 mL*2), seca sobre sulfato de sódio anidro e filtrada. O filtrado foi con- centrado sob pressão reduzida. Os resíduos resultantes foram purifica- dos por cromatografia de camada fina com desenvolvimento do sistema de solvente B para obter o produto do título 17j (48 mg, rendimento: 83,9%). MS m/z (ESI): 822,0[M+1]. Etapa 9
Ácido (S)-1-((11-Benzil-1-(9H-fluoren-9-il)-3,6,9,12,15-pentaoxo-2-0xa- 4,7,10,13,16-penta-azaheptadecan-17-il)óxi)ciclopropano-1-carboxílico 17k
[422] 17j (48 mg, 58,4 umol) foi dissolvido em 1,4 mL de ácido di- cloroacético a 3% (v/v) em diclorometano, e a solução foi resfriada a 0- 5ºC em um banho de água gelada. Trietilsilano (21 mg, 180,6 umol) foi adicionado, e a solução de reação foi agitada em um banho gelado por 3 horas. A solução de reação foi concentrada sob pressão reduzida no banho gelado para remover metade do solvente orgânico. 5 mL de éter foram adicionados, e a solução foi naturalmente aquecida até à tempe- ratura ambiente e polpada. Um sólido branco foi precipitado e filtrado. O bolo do filtro foi coletado e seco por uma bomba de óleo para obter o produto do título 17k (33 mg, rendimento: 84,1%). Etapa 10 (9H-Fluoren-9-il)]metil — ((S)-7-benzil-1-(1-(((1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hi- dróxi-4-metil-10,13-dioxo0-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il)carbamoil)ciclo- propóxi)-3,6,9,12-tetraoxo-2,5,8,11-tetra-azatridecan-13-il)carbamato 171
[423] 1b (20 mg, 42,4 umol) foi adicionado ao frasco de reação, seguido pela adição de 1 mL de metanol a 10% (v/v) em diclorometano. A solução foi purgada com argônio três vezes, e resfriada a 0-5ºC em um banho de água gelada. Uma gota de trietilamina foi adicionada, e a solução de reação foi agitada até 1b ser dissolvido. 17k (33 mg, 49,1 umol) foi dissolvido em 1 mL de metanol a 10% (v/v) em diclorometano. A solução resultante foi adicionada em gotas à solução de reação acima, seguido pela adição de cloreto de 4-(4,6-dimetóxi-1,3,5-triazin-2-il)-4- metilmorfolínio (17,6 mg, 63,6 umol). A solução de reação foi aquecida à temperatura ambiente e agitada por 1 hora. 10 mL de diclorometano e 5 mL de água foram adicionados, e a solução foi agitada por 5 minutos e deixada para particionamento. A fase orgânica foi coletada. A fase aquosa foi extraída com diclorometano (10 mL*3), e as fases orgânicas foram combinadas. A fase orgânica foi lavada com solução de cloreto de sódio saturada (10 mL*x2), seca sobre sulfato de sódio anidro e fil- trada. O filtrado foi concentrado sob pressão reduzida. Os resíduos re- sultantes foram purificados por cromatografia de camada fina com de- senvolvimento do sistema de solvente B para obter o produto do título 171 (37 mg, rendimento: 80,2%). MS m/z (ESI): 1090,1[M+1]. Etapa 11 (1r,4r)-N-((S)-7-Benzil-1-(1-(((1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil- 10,13-dioxo0-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[del]pi- rano[3',4":6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il)carbamoil)ciclopropóxi)- 3,6,9,12,15-pentaoxo-17,20,23,26,29,32,35,38,41-nonaoxa- 2,5,8,11,14-penta-azatritetracontan-43-il)-4-((2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H- pirrol-1-il) metil)ciclohexano-1-carboxamida 17
[424] 171 (15,5 mg, 14,23 umol) foi dissolvido em 0,6 mL de diclo- rometano, seguido pela adição de 0,3 mL de dietilamina. A solução de reação foi agitada à temperatura ambiente por 1,5 horas. A solução de reação foi concentrada sob pressão reduzida. 2 mL de tolueno foram adicionados e a solução foi concentrada sob pressão reduzida, o que foi repetido duas vezes. 3 mL de n-hexano foram adicionados para polpar, e a camada de cima de hexano foi vertida, o que foi repetido três vezes. A solução foi concentrada sob pressão reduzida e seca por uma bomba de óleo. O produto bruto resultante foi dissolvido em 1 mL de N,N-dime- tiformamida. 17g (11 mg, 15,92 umol) e cloreto de 4-(4,6-dimetóxi-1,3,5- triazin-2-i1)-4-metilmorfolínio (6,0 mg, 21,68 umol) foram adicionados. À solução de reação foi purgada com argônio três vezes, e agitada à tem- peratura ambiente por 30 minutos. A solução de reação foi purificada por cromatografia líquida de alto desempenho (condições de separação:
coluna: XBridge Prep C18 OBD 5 um 19*250 mm; fase móvel: A-water (10 mmol NH.OAc), B-acetonitrila, eluição de gradiente, taxa de fluxo: 18 mL/min). As frações correspondentes foram coletadas, e concentra- das sob pressão reduzida para obter o produto do título 17 (16 mg, ren- dimento: 27,4%).
MS m/z (ESI): 1556,4 [M+18].
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6s): 5 8,98 (d, 1H), 8,76 (s, 1H), 8,20 (br, 1H), 8,12-7,95 (m, 3H), 7,93-7,76 (m, 2H), 7,75-7,66 (m, 2H), 7,24 (s, 1H), 7,20-7,05 (m, 6H), 6,97 (s, 1H), 6,64 (br, 1H), 6,55 (d, 1H), 6,47 (s, 1H), 5,61-5,52 (m, 2H), 5,37 (s, 1H), 5,33-5,23 (m, 2H), 5,18 (s, 1H), 5,13 (s, 1H), 5,05 (s, 1H), 5,00 (s, 1H), 4,65-4,55 (m, 2H), 4,53-4,45 (m, 1H), 4,38-4,28 (m, 2H), 3,84 (s, 2H), 3,67 (d, 3H), 3,60-3,40 (m, 33H), 3,18 (d, 1H), 3,15-3,08 (m, 3H), 2,28 (s, 3H), 2,00-1,92 (m, 3H), 1,85 (s, 2H), 1,82-1,73 (m, 2H), 1,68-1,52 (m, 4H), 1,29-1,15 (m, 3H), 0,86-0,76 (m, 5H). Exemplo 18 (1r,4r)-N-((2R,10S)-10-Benzil-2-ciclopropil-1-(((1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9- hidróxi-4-metil-10,13-dioxo0-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il)amino)- 1,6,9,12,15,18-hexaox0-3,20,23,26,29,32,35,38,41,44-decaoxa- 5,8,11,14,17-penta-azahexatetracontan-46-il)-4-((2,5-dioxo-2,5-dihidro- 1H-pirrol-1-il)]metil)ciclohexano-1-carboxamida 18 3 It & tr IO o o A o A NA A NA A A, o 1" JS
V VA V Pr Epa 1 nO e O LO mA Ã PLA DO el CTT EL AA A SO EEE in AS A O AO RPE fe PO Etapa o PA A Ao E 7 Pre AA A nã Q. 7 "| Q Y Esso mA AA O s-.. rapa, TATO, o FIRE : ÁAEIE mo da : : OQ: V Etapa 10 DUPDOPOLAOO AO A io, EA O dO RX í “ A Etapa 1 (R)-2-Ciclopropil-2-hidroxiacetato de benzila 18a (S)-2-Ciclopropil-2-hidroxiacetato de benzila 18b
[425] 2a (7,4 9, 63,7 mmol) foi dissolvido em 200 mL de acetoniítrila, e em seguida adicionado com carbonato de potássio (35 g, 253,6 mmol), brometo de benzila (9,3 g, 54,4 mmol) e iodeto de tetrabutilamônio (500 mg, 1,36 mmol) sucessivamente. A solução de reação foi agitada à tem- peratura ambiente por 16 horas, e filtrada através de celite. O bolo do filtro foi lavado com acetato de etila (10 ml), e os filtrados foram combi- nados e concentrados sob pressão reduzida. 4,1 g de os resíduos re- sultantes foram purificados por cromatografia de coluna em sílica gel com desenvolvimento do sistema de solvente C. Resoluçõ quiral foi ainda realizada para obter os produtos do título 18a (1,1 g) e 18b (1,2 9). Etapa 2
(R)-10-Ciclopropil-1-(9H-fluoren-9-il)-3,6-dioxo-2,9-dioxa-4,7-diazaun- decan-11-0ato de benzila 18c
[426] 8b (3,1 g, 8,41 mmol) foi dissolvido em tetrahidrofurano (55 mL), seguido pela adição de 18a (2,0 g, 9,70 mmol). A solução de reação foi resfriada a 0-5ºC em um banho de água gelada, seguido pela adição de terc-butóxido de potássio (1,89 g, 16,84 mmol). A solução de reação foi agitada no banho de água gelada por 10 minutos. Acetato de etila (30 mL) e água (20 mL) foram adicionados, e a solução foi deixada para particionamento. A fase aquosa foi extraída com clorofórmio (30 mL*5), e as fases orgânicas foram combinadas. A fase orgânica foi concentrada sob pressão reduzida, e os resíduos resultantes foram dissolvidos em 1,4-dioxano (32 mL) e água (8 mL). Carbonato de sódio (1,78 g, 16,79 mmol) e cloroformiato de 9-fluoreno metila (2,18 g, 8,42 mmol) foram adicionados, e a solução de reação foi agitada à temperatura ambiente por 2 horas. Água (30 mL) foi adicionada à solução de reação, a qual foi extraída com acetato de etila (50 mL*x3). As fases orgânicas foram com- binadas. A fase orgânica foi lavada com solução de cloreto de sódio sa- turada (30 mL*2), secas sobre sulfato de sódio anidro e filtradas. O fil- trado foi concentrado sob pressão reduzida. Os resíduos resultantes fo- ram purificados por cromatografia de coluna com desenvolvimento do sistema de solvente C para obter o produto do título 18c (1,3 g, rendi- mento: 30,0%).
MS m/z (ESI): 515,2[M+1].
Etapa 3 Ácido (R)-10-ciclopropil-1-(9H-fluoren-9-il)-3,6-dioxo-2,9-dioxa-4,7-dia- zaundecan-11-0ico 18d
[427] 18c (1,29 g, 2,51 mmol) foi dissolvido em acetato de etila (15 mL), seguido pela adição de paládio sobre carbono (260 mg, teor: 10%, seco). A solução de reação foi purgada com hidrogênio três vezes e agi- tada à temperatura ambiente por 5 horas. A solução de reação foi filtrada através de celite, e o bolo do filtro foi lavado com acetato de etila (20 mL) e metanol (20 mL). O filtrado foi concentrado para obter o produto do título bruto 18d (980 mg), que foi usado diretamente na próxima etapa sem purificação. MS m/z (ESI): 425,1 [M+1]. Etapa 4 2,4-Dimetoxibenzil (R)-10-ciclopropil-1-(9H-fluoren-9-il)-3,6-dioxo-2,9- dioxa-4,7-diazaundecan-11-0ato 18e
[428] O composto bruto 18d (980 mg, 2,31 mmol) foi dissolvido em diclorometano (15 mL), e em seguida adicionado com álcool 2,4-dime- toxibenzico (777 mg, 4,62 mmol), cloridrato de 1-etil-(3-dimetilaminopro- pil)carbodiimida (664 mg, 3,46 mmol) e 4-dimetilaminopiridina (28 mg, 0,23 mmol). A solução de reação foi agitada à temperatura ambiente por 1 hora. A solução de reação foi concentrada sob pressão reduzida para remover o solvente orgânico. 20 mL de água foram adicionados, e a solução foi extraída com acetato de etila (50 mLx*3). As fases orgânicas foram combinadas. A fase orgânica foi lavada com solução de cloreto de sódio saturada (30 mLx*2), secas sobre sulfato de sódio anidro e fil- tradas. O filtrado foi concentrado sob pressão reduzida. Os resíduos re- sultantes foram purificados por cromatografia de coluna com desenvol- vimento do sistema de solvente C para obter o produto do título 18e (810 mg, rendimento: 61,1%). MS m/z (ESI): 575,0[M+1]. Etapa 5 (R)-2-((2-aminoacetamido)metóxi)-2-ciclopropilacetato de 2,4-dimetoxi- benzila 18f
[429] 18e (33 mg, 57,4 umol) foi dissolvido em 0,6 mL de dicloro- metano, seguido pela adição de 0,3 mL de dietilamina. A solução de re- ação foi agitada à temperatura ambiente por 1 hora. A solução de reação foi concentrada sob pressão reduzida. 2 mL de tolueno foram adiciona- dos e a solução foi concentrada sob pressão reduzida, o que foi repetido duas vezes. 3 mL de n-hexano foram adicionados para polpar, e a ca- mada de cima de hexano foi vertida, o que foi repetido três vezes. À solução foi concentrada sob pressão reduzida para obter o produto do título bruto 18f (21 mg), que foi usado diretamente na próxima etapa sem purificação. Etapa 6 (118,19R)-11-benzil-19-ciclopropil-1-(9H-fluoren-9-il)-3,6,9,12,15-pen- taoxo-2,18-dioxa-4,7,10,13,16-penta-azaicosan-20-0ato de 2,4-dimeto- xibenzila 18g
[430] O composto bruto 18f (21 mg, 57,4 umol) foi dissolvido em 3 mL de N,N-dimetilformamida. 17i (29 mg, 57,8 umol) e cloreto de 4-(4,6- dimetóxi-1,3,5-triazin-2-il)-4-metilmorfolínio (19 mg, 68,7 umol) foram adicionados. A solução de reação foi agitada à temperatura ambiente por 1 hora. 10 mL de água foram adicionados, e a solução de reação foi extraída com acetato de etila (10 mL*x3). As fases orgânicas foram com- binadas. A fase orgânica foi lavada com solução de cloreto de sódio sa- turada (10 mL*2), seca sobre sulfato de sódio anidro e filtrada. O filtrado foi concentrado sob pressão reduzida. Os resíduos resultantes foram purificados por cromatografia de camada fina com desenvolvimento do sistema de solvente B para obter o produto do título 18g (37 mg, rendi- mento: 77,1%). MS m/z (ESI): 853,0[M+18]. Etapa 7 Ácido (118,19R)-11-Benzil-19-ciclopropil-1-(9H-fluoren-9-il)- 3,6,9,12,15-pentaoxo-2,18-dioxa-4,7,10,13,16-penta-azaicosan-20- oico 18h
[431] 18g (37 mg, 44,3 umol) foi dissolvido em 1,4 mL de 3% (v/v) dicloroacético acid em diclorometano, e a solução foi resfriada a 0-5ºC em um banho de água gelada. Trietilsilano (15,4 mg, 132,4 umol) foi adicionado, e a solução de reação foi agitada em um banho gelado por 3 horas. A solução de reação foi concentrada sob pressão reduzida no banho gelado para remover metade do solvente orgânico. 5 mL de éter foram adicionados, e a solução foi naturalmente aquecida até à tempe- ratura ambiente e polpada. Um sólido branco foi precipitado e filtrado. O bolo do filtro foi coletado e seco por uma bomba de óleo para obter o produto do título 18h (24 mg, rendimento: 79,1%). MS m/z (ESI): 708,2[M+23]. Etapa 8 (9H-Fluoren-9-il)]metil — ((2R,10S)-10-benzil-2-ciclopropil-1-(((1S8,9S)-9- etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro- 1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il)amino)- 1,6,9,12,15-pentaoxo-3-0xa-5,8,11,14-tetra-azahexadecan-16-il)carba- mato 18i
[432] 1b (30 mg, 63,6 umol) foi adicionado ao frasco de reação, seguido pela adição de 1 mL de metanol a 10% (v/v) em diclorometano. A solução foi purgada com argônio três vezes, e resfriada a 0-5ºC em um banho de água gelada. Uma gota de trietilamina foi adicionada, e a solução de reação foi agitada até 1b ser dissolvido. 18h (65 mg, 94,8 umol) foi dissolvido em 1 mL de metanol a 10% (v/v) em diclorometano, e a solução resultante foi adicionada em gotas à solução de reação acima, seguido pela adição de cloreto de 4-(4,6-dimetóxi-1,3,5-triazin-2- il)-4-metilmorfolínio (27 mg, 97,6 umol). A solução de reação foi aque- cida à temperatura ambiente e agitada por 1 hora. 10 mL de diclorome- tano e 5 mL de água foram adicionados, e a solução foi agitada por 5 minutos e deixada para particionamento. A fase orgânica foi coletada. À fase aquosa foi extraída com diclorometano (10 mL*3), e as fases orgâà- nicas foram combinadas. A fase orgânica foi lavada com solução de clo- reto de sódio saturada (10 mLx*2), seca sobre sulfato de sódio anidro e filtrada. O filtrado foi concentrado sob pressão reduzida. Os resíduos resultantes foram purificados por cromatografia de camada fina com de- senvolvimento do sistema de solvente B para obter o produto do título 18i (25 mg, rendimento: 35,6%). MS m/z (ESI): 1104,4[M+1]. Etapa 9 (S)-2-(2-(2-Aminoacetamido)acetamido)-N-(2-((((R)-1-ciclopropil-2- (((18,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15- hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1- il)>amino)-2-0x0etóxi)metil)amino)-2-0x0etil)-3-fenilpropanamida 18j
[433] 18i (12 mg, 10,9 umol) foi dissolvido em 0,6 mL de dicloro- metano, seguido pela adição de 0,3 mL de dietilamina. A solução de re- ação foi agitada à temperatura ambiente por 1,5 hora. A solução de re- ação foi concentrada sob pressão reduzida. 2 mL de tolueno foram adi- cionados e a solução foi concentrada sob pressão reduzida, o que foi repetido duas vezes. 3 mL de n-hexano foram adicionados para polpar, e a camada de cima de hexano foi vertida, o que foi repetido três vezes. A solução foi concentrada sob pressão reduzida para obter o produto do título bruto 18j (10 mg), que foi usado diretamente na próxima etapa sem purificação. MS m/z (ESI): 881,0 [M+1]. Etapa 10 (1r,4r)-N-((2R,10S)-10-Benzil-2-ciclopropil-1-(((1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9- hidróxi-4-metil-10,13-dioxo0-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il)amino)- 1,6,9,12,15,18-hexaox0-3,20,23,26,29,32,35,38,41,44-decaoxa- 5,8,11,14,17-penta-azahexatetracontan-46-il)-4-((2,5-dioxo-2,5-dihidro- 1H-pirrol-1-il)]metil)ciclohexano-1-carboxamida 18
[434] O composto bruto 18j (10 mg) foi dissolvido em 1 mL de N,N- dimetilformamida. 17g (8,5 mg, 12,3 umol) e cloreto de 4-(4,6-dimetóxi-
1,3,5-triazin-2-i1)-4-metilmorfolínio (4,6 mg, 16,6 umol) foram adiciona- dos. A solução de reação foi agitada à temperatura ambiente por 30 mi- nutos. A solução de reação foi filtrada, e purificada por cromatografia líquida de alto desempenho (condições de separação: coluna: XBridge Prep C18 OBD 5 um 19*250 mm; fase móvel: A-water (10 mmol NHa0OAc), B-acetonitrila, eluição de gradiente, taxa de fluxo: 18 mL/min). As frações correspondentes foram coletadas, e concentradas sob pres- são reduzida para obter o produto do título 18 (9,5 mg, rendimento: 56,2%).
MS m/z (ESI): 1570,2 [M+18]. 1H RMN (400 MHz, DMSO-ds): 5 8,77 (d, 1H), 8,59-8,55 (m, 1H), 8,42 (d, 1H), 8,37-8,28 (m, 1H), 8,25-8,06 (m, 2H), 7,96-7,86 (m, 1H), 7,86-7,70 (m, 2H), 7,32-7,28 (m, 1H), 7,25-7,14 (m, 3H), 6,67 (m, 1H), 5,96 (s, 1H), 5,80-5,72 (m, 1H), 5,62-5,52 (m, 2H), 5,43-5,30 (m, 3H), 5,28-5,17 (m, 2H), 5,12-5,08 (m, 1H), 4,72-4,35 (m, 8H), 3,95-3,70 (m, 13H), 3,35-3,22 (m, 14H), 2,42-2,32 (m, 3H), 2,05-1,98 (m, 4H), 1,88-1,82 (m, 12H), 1,47-1,39 (m, 3H), 1,32-1,18 (m, 11H), 0,90-0,80 (m, 4H), 0,52-0,37 (m, 3H), 0,32-0,18 (m, 2H). Exemplo 19 (1r,4r)-N-((2S8,10S)-10-Benzil-2-ciclopropil-1-(((1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9- hidróxi-4-metil-10,13-dioxo0-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il)amino)- 1,6,9,12,15,18-hexaox0-3,20,23,26,29,32,35,38,41,44-decaoxa- 5,8,11,14,17-penta-azahexatetracontan-46-il)-4-((2,5-dioxo-2,5-dihidro- 1H-pirrol-1-il)]metil)ciclohexano-1-carboxamida 19 O 7 Ad ps AA Add | E ATT, » 2"
; 12 O mA dA El SADO Etapa 2 dh Pinda e.
A O msi O Etapa 5 mA A, O Esso o RÃ QI a EI Te AA Xy mn Esmi Sa ma fiÃ, Rir. Xs CPA TATA Aa À, eo EO . Pa. e. o AX aa Etapa 1 (S)-10-ciclopropil-1-(9H-fluoren-9-il)-3,6-dioxo-2,9-dioxa-4,7-diazaun- decan-11-0ato de benzila 19a
[435] 18b (252 mg, 1,22 mmol) foi adicionado ao frasco de reação, seguido pela adição de 4 mL de diclorometano. A solução de reação foi purgada com argônio três vezes e resfriada a 0-5ºC em um banho de água gelada, seguido pela adição de terc-butóxido de lítio (98 mg, 1,22 mmol). A solução de reação foi agitada no banho de água gelada por 15 minutos e se tornou clara. 8b (300 mg, 814,3 umol) foi adicionado, e a solução de reação foi agitada no banho de água gelada por 2,5 horas. Água (10 mL) foi adicionada, e a solução foi particionada. A fase aquosa foi extraída com diclorometano (8 mL*2). As fases orgânicas foram com- binadas, lavadas com água (10 mL*1) e salmoura saturada (10 mL*2), secas sobre sulfato de sódio anidro e filtradas. O filtrado foi concentrado para obter o produto bruto. Os resíduos resultantes foram purificados por cromatografia de coluna em sílica gel com desenvolvimento do sis- tema de solvente C para obter o produto do título 19a (282 mg, rendi- mento: 67,2%). Etapa 2 Ácido (S)-10-ciclopropil-1-(9H-fluoren-9-il)-3,6-dioxo-2,9-dioxa-4,7-dia- zaundecan-11-0ico 19b
[436] 19a (280 mg, 0,554 mmol) foi dissolvido em 8 mL de acetato de etila, seguido pela adição de paládio sobre carbono (84 mg, teor: 10%, seco). A solução de reação foi purgada com hidrogênio três vezes e agitada à temperatura ambiente por 3 horas. A solução de reação foi filtrada através de celite, e o bolo do filtro foi lavado com acetato de etila. O filtrado foi concentrado para obter o produto do título bruto 19b (230 mg), que foi usado diretamente na próxima etapa sem purificação. Etapa 3 (S)-10-ciclopropil-1-(9H-fluoren-9-il)-3,6-dioxo-2,9-dioxa-4,7-diazaun- decan-11-0ato de 2,4-dimetoxibenzila 19c
[437] O composto bruto 19b (230 mg, 541,8 umol) foi dissolvido em 7 mL de diclorometano, e em seguida adicionado com álcool 2,4- dimetoxibenzílico (136,7 mg, 812,7 umol), cloridrato de 1-etil-(3-dimeti- laminopropil)carbodiimida (155 mg, 808,5 umol) e 4-dimetilaminopiridina (6,6 mg, 53,5 umol) sucessivamente. A solução de reação foi agitada à temperatura ambiente por 16 horas. A solução de reação foi diluída com mL de diclorometano, lavada com água (10 mL*1) e salmoura satu- rada (10 mL*2), seca sobre sulfato de sódio anidro e filtrada. O filtrado foi concentrado para obter o produto bruto. Os resíduos resultantes fo- ram purificados por cromatografia de camada fina com desenvolvimento do sistema de solvente B para obter o produto do título 19c (159 mg, rendimento: 51,0%). Etapa 4
(S)-2-((2-aminoacetamido)metóxi)-2-ciclopropilacetato de 2,4-dimetoxi- benzila 19d
[438] 19c (60 mg, 104,4 umol) foi dissolvido em 1 mL de dicloro- metano, seguido pela adição de 0,5 mL de dietilamina. A solução de re- ação foi agitada à temperatura ambiente por 1 hora. A solução de reação foi concentrada sob pressão reduzida. 2 mL de tolueno foram adiciona- dos e a solução foi concentrada sob pressão reduzida, o que foi repetido duas vezes. 3 mL de n-hexano foram adicionados para polpar, e a ca- mada de cima de hexano foi vertida, o que foi repetido três vezes. À solução foi concentrada sob pressão reduzida para obter o produto do título bruto 19d (21 mg), que foi usado diretamente na próxima etapa sem purificação.
Etapa 5 (118,198S)-11-benzil-19-ciclopropil-1-(9H-fluoren-9-il)-3,6,9,12,15-pen- taoxo-2,18-dioxa-4,7,10,13,16-penta-azaicosan-20-0ato de 2,4-dimeto- xibenzila 19e
[439] O composto bruto 19d (36 mg, 102,2 umol) foi dissolvido em 4 mL de N,N-dimetilformamida. 17i (52 mg, 103,6 umol) e cloreto de 4- (4,6-dimetóxi-1,3,5-triazin-2-il)-4-metilmorfolínio (34,6 mg, 125,0 umol) foram adicionados. A solução de reação foi agitada à temperatura am- biente por 1 hora. 10 mL de água foram adicionados, e a solução de reação foi extraída com acetato de etila (10 mLx3). As fases orgânicas foram combinadas. A fase orgânica foi lavada com solução de cloreto de sódio saturada (10 mL*x2), seca sobre sulfato de sódio anidro e fil- trada. O filtrado foi concentrado sob pressão reduzida. Os resíduos re- sultantes foram purificados por cromatografia de camada fina com de- senvolvimento do sistema de solvente B para obter o produto do título 19e (70 mg, rendimento: 80,2%). Etapa 6 Ácido (118,19S)-11-benzil-19-ciclopropil-1-(9H-fluoren-9-il)-3,6,9,12,15-
pentaoxo-2,18-dioxa-4,7,10,13,16-penta-azaicosan-20-oico 19f
[440] 19e (70 mg, 83,7 umol) foi dissolvido em 2,5 mL de ácido dicloroacético a 3% (v/v) em diclorometano, e a solução foi resfriada a 0-5ºC em um banho de água gelada. Trietilsilano (29 mg, 249,4 umol) foi adicionado, e solução de reação foi agitada em um banho gelado por 3 horas. A solução de reação foi concentrada sob pressão reduzida no banho gelado para remover metade do solvente orgânico. 5 mL de éter foram adicionados, e a solução foi naturalmente aquecida até à tempe- ratura ambiente e polpada. Um sólido branco foi precipitado e filtrado. O bolo do filtro foi coletado e seco por uma bomba de óleo para obter o produto do título 19f (57 mg, rendimento: 99,2%). Etapa 7 ((28,10S)-10-benzil-2-ciclopropil-1-(((1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4- metil-10,13-diox0-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pi- rano[3',4":6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il)amino)-1,6,9,12,15-penta- 0x0-3-0xa-5,8,11,14-tetra-azahexadecan-16-il)carbamato de (9H-Fluo- ren-9-il)metila 19g
[441] 1b (30 mg, 63,6 umol) foi adicionado ao frasco de reação, seguido pela adição de 1 mL de metanol a 10% (v/v) em diclorometano. A solução foi purgada com argônio três vezes, e resfriada a 0-5ºC em um banho de água gelada. Uma gota de trietilamina foi adicionado, e a solução de reação foi agitada até 1b ser dissolvido. 19f (57 mg, 83,1 umol) foi dissolvido em 1 mL de metanol a 10% (v/v) em diclorometano, e a solução resultante foi adicionada em gotas à solução de reação acima, seguido pela adição de cloreto de 4-(4,6-dimetóxi- 1,3,5-triazin- 2-i1)-4-metilmorfolínio (26 mg, 93,9 umol). A solução de reação foi aque- cida à temperatura ambiente e agitada por 1 hora. 10 mL de diclorome- tano e 5 mL de água foram adicionados, e a solução foi agitada por 5 minutos e deixada para particionamento. A fase orgânica foi coletada. À fase aquosa foi extraída com diclorometano (10 mL*3), e as fases orgâà- nicas foram combinadas. A fase orgânica foi lavada com solução de clo- reto de sódio saturada (10 mLx*2), seca sobre sulfato de sódio anidro e filtrada. O filtrado foi concentrado sob pressão reduzida. Os resíduos resultantes foram purificados por cromatografia de camada fina com de- senvolvimento do sistema de solvente B para obter o produto do título 19g (56 mg, rendimento: 79,8%). MS m/z (ESI): 1103,1[M+1] Etapa 8 (S)-2-(2-(2-Aminoacetamido)acetamido)-N-(2-((((S)-1-ciclopropil-2- (((18,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15- hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1- il)>amino)-2-o0x0etóxi)metil)amino)-2-0x0etil)-3-fenilpropanamida 19h
[442] 19g (4,6 mg, 4,16 umol) foi dissolvido em 1,5 mL de dicloro- metano, seguido pela adição de 0,75 mL de dietilamina. A solução de reação foi agitada à temperatura ambiente por 1,6 hora. A solução de reação foi concentrada sob pressão reduzida. 2 mL de tolueno foram adicionados e a solução foi concentrada sob pressão reduzida, o que foi repetido duas vezes. 3 mL de n-hexano foram adicionados para polpar, e a camada de cima de hexano foi vertida, o que foi repetido três vezes. A solução foi concentrada sob pressão reduzida para obter o produto do título bruto 19h (4,0 mg), que foi usado diretamente na próxima etapa sem purificação. Etapa 9 (1r,4r)-N-((2S8,10S)-10-Benzil-2-ciclopropil-1-(((1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9- hidróxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il)amino)- 1,6,9,12,15,18-hexaox0-3,20,23,26,29,32,35,38,41,44-decaoxa- 5,8,11,14,17-penta-azahexatetracontan-46-il)-4-((2,5-dioxo-2,5-dihidro- 1H-pirrol-1-il)]metil)ciclohexano-1-carboxamida 19
[443] O composto bruto 19h (4,0 mg) foi dissolvido em 1 mL de N N-dimetilformamida. 17g (2,9 mg, 4,2 umol) e cloreto de 4-(4,6-dime- tóxi-1,3,5-triazin-2-il)-4-metilmorfolínio (1,5 mg, 5,4 umol) foram adicio- nados. A solução de reação foi agitada à temperatura ambiente por 40 minutos. A solução de reação foi filtrada, e purificada por cromatografia líquida de alto desempenho (condições de separação: coluna: XBridge Prep C18 OBD 5 um 19*250 mm; fase móvel: A-water (10 mmol NHa0OAc), B-acetonitrila, eluição de gradiente, taxa de fluxo: 18 mL/min). As frações correspondentes foram coletadas, e concentradas sob pres- são reduzida para obter o produto do título 19 (2,1 mg, rendimento: 32,4%).
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6s): 5 8,71-8,62 (m, 1H), 8,59- 8,51 (m, 1H), 8,34-8,26 (m, 1H), 8,14-8,02 (m, 2H), 7,95-7,86 (m, 1H), 7,83-7,69 (m, 2H), 7,35-7,31 (m, 1H), 7,29-7,11 (m, 3H), 7,01 (s, 1H), 6,72-6,50 (m, 3H), 5,59-5,50 (m, 2H), 5,42 (s, 2H), 5,38-5,18 (m, 3H), 4,79-4,69 (m, 2H), 4,61-4,42 (m, 3H), 3,91 (s, 2H), 3,79-3,65 (m, 4H), 3,63-3,44 (m, 13H), 3,41-3,30 (m, 2H), 3,26-3,09 (m, 5H), 3,08-2,84 (m, 4H), 2,81-2,64 (m, 3H), 2,42-2,28 (m, 3H), 2,24-2,12 (m, 2H), 2,05-1,93 (m, 4H), 1,89-1,77 (m, 2H), 1,72-1,56 (m, 3H), 1,53-1,38 (m, 3H), 1,34- 1,10 (m, 11H), 0,94-0,78 (m, 5H), 0,52-0,35 (m, 3H). Exemplo 20 (exemplo de referência) FÃ o uso E o ' FAÇO,
SI o |
[444] O composto do título 20 foi preparado baseado no método descrito no Exemplo 58 na página 163 da descrição do pedido de pa- tente CN104755494A.
[445] Os seguintes anticorpos foram preparados de acordo com métodos convencionais, por exemplo, construção de vetor, transfecção de célula eucariótica tal como transfecção, purificação e expressão de célula HEK293 (Life Technologies Cat. No. 11625019).
[446] A seguir está a sequência de Trastuzumab: Cadeia leve DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTA- VAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPS-
RFSGSRSGTDFTLTISSLOPEDFATYYCQQHYTTPPTFGOGTKVEIKR TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL- QSGNSQESVTEQDSK-
DSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHOQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO, 1 Cadeia pesada EVOLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVR- QAPGKGLEWVA-
RIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYC SRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAP- SSKSTSGGTAALGCLVK- DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLG TQTYICNVWNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG- PSVFLFPPKPKDTLMIS- RTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTY RVVSVLTVLHQODWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPRE- PQVYTLPPSREEMTKN- QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS
KLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO,2
[447] A seguir está a sequência de Pertuzumab:
[448] Cadeia leve DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSIGVAWYQQK-
PGKAPKLLIYSASYRYTGVPS- RFSGSGSGTDFTLTISSLOPEDFATYYCQQYYIYPYTFGAGTKVEIKR TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL- QSGNSQESVTEQDSK-
DSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHOQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO,3 Cadeia pesada EVOLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYTMDWVR- QAPGKGLEWVADVNPNSGGSIYN-
QRFKGRFTLSVDRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPSFYFD YWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK- DYFPEPVTVSWNSGAL- TSGVHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQOTYICNVNHKPSNTK VDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMIS- RTPEVTCVVVDVSHED- PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKN- QVSLTCLVKGFYPSDI- AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNV
FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO 4
[449] A seguir está a sequência de B7H3 anticorpo 1F9DS: Cadeia leve DTVVTQEPSFSVSPGG- TVTLTCGLSSGSVSTSHYPSWYQQTPGQAPRMLIYNTNTRSSGVP-
DRFSGSILGNKAALTITGAQADDESDYYCAIHVDRDIWVFGGGTKLTV LGQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKAD- GSPVKAGVETTK- PSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPT EC
SEQ ID NO,5 Cadeia pesada QVALVASGGGVVQPGTSLRLSCAASGFIFSSSAMHWVR- QAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYV-
DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSARLYASFDY WGQGALVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK- DYFPEPVTVSWNSGAL- TSGVHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQOTYICNVNHKPSNTK VDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMIS- RTPEVTCVVVDVSHED- PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKN- QVSLTCLVKGFYPSDI- AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNV
FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO,6 Exemplo 21 ADC-1 " y > Desses send! | o Yt O, JaoH dn
[450] Uma solução aquosa formulada de tris(2-carboxietil)fosfina (10 MM, 0,082 mL, 0,82 umol) foi adicionado a uma solução aquosa tamponada com PBS de anticorpo Trastuzumab (solução aquosa tam- ponada com PBS a 0,05 M com pH=6,5; 2,5 ml, 9,96 mg/ml, 0,168 umol) a 37ºC. A solução de reação foi colocada em um agitador de banho de água, e agitada a 37ºC por 3 horas antes de parar a reação. A solução de reação foi resfriada a 25ºC em um banho gelado, e diluída para 5,0 mg/ml. 2,0 ml da solução foram tomados para a próxima reação.
[451] Composto 10, o composto tendo tempo de retenção mais curto (2,1 mg, 2,02 umol) foi dissolvido em 0,10 mL de DMSO, e em seguida adicionado a 2,0 ml da solução acima. A solução de reação foi colocada em um agitador de banho de água, e agitada a 25ºC por 3 horas antes de parar a reação. A solução de reação foi dessalgada e purificada com uma coluna em gel Sephadex G25 (fase de eluição: so- lução aquosa tamponada com PBS a 0,05 M com pH=6,5, contendo EDTA a 0,001 M) para obter a solução tamponada com PBS do produto exemplar ADC-1 de Fórmula FADC-1 (5,0 mg/mL, 1,1 mL), que foi ar- mazenado a 4ºC.
[452] O valor médio calculado por UV-HPLC: n=5,09. Exemplo 22 ADC-2 [ o Nro, o “o “o. ' O, ES, XY" L des , FADC-1 o
[453] Uma solução aquosa formulada de tris(2-carboxietil)fosfina (10 MM, 0,082 mL, 0,82 umol) foi adicionada a uma solução aquosa tamponada com PBS de anticorpo Trastuzumab (solução aquosa tam- ponada com PBS a 0,05 M com pH=6,5; 2,5 ml, 9,96 mg/ml, 0,168 umol) a 37ºC. A solução de reação foi colocada em um agitador de banho de água, e agitada a 37ºC por 3 horas antes de parar a reação. A solução de reação foi resfriada a 25ºC em um banho gelado, e diluída para 5,0 mg/ml. 2,0 ml da solução foram tomados para a próxima reação.
[454] Composto 10, o composto tendo tempo de retenção mais longo (2,1 mg, 2,02 umol) foi dissolvido em 0,10 mL de DMSO, e em seguida adicionado a 2,0 ml da solução acima. A solução de reação foi colocada em um agitador de banho de água, e agitada a 25ºC por 3 horas antes de parar a reação. A solução de reação foi dessalgada e purificada com uma coluna em gel Sephadex G25 (fase de eluição: so- lução aquosa tamponada com PBS a 0,05 M com pH=6,5, contendo EDTA a 0,001 M) para obter a solução tamponada com PBS do produto exemplar ADC-2 de Fórmula FADC-1 (4,95 mg/mL, 1,1 mL), que foi ar- mazenado a 4ºC.
[455] O valor médio calculado por UV-HPLC: n=7,39. Exemplo 23 ADC-3 r w vesamos AA ZA | 2» HI ONÇA es
AN | Des Jo Fados Vs
[456] Uma solução aquosa formulada de tris(2-carboxietil)fosfina (10 MM, 0,082 mL, 0,82 umol) foi adicionada a uma solução aquosa tamponada com PBS de anticorpo Trastuzumab (solução aquosa tam- ponada com PBS a 0,05 M com pH=6,5; 2,5 ml, 9,96 mg/ml, 0,168 umol) a 37ºC. A solução de reação foi colocada em um agitador de banho de água, e agitada a 37ºC por 3 horas antes de parar a reação. A solução de reação foi resfriada a 25ºC em um banho gelado, e diluída para 5,0 mg/ml. 2,0 ml da solução foram tomados para a próxima reação.
[457] Composto 8 (2,1 mg, 2,02 umol) foi dissolvido em 0,10 mL de DMSO, e em seguida adicionado a 2,0 ml da solução acima. A solu- ção de reação foi colocada em um agitador de banho de água, e agitada a 25ºC por 3 horas antes de parar a reação. A solução de reação foi dessalgada e purificada com uma coluna em gel Sephadex G25 (fase de eluição: solução aquosa tamponada com PBS a 0,05 M com pH=6,5, contendo EDTA a 0,001 M) para obter a solução tamponada com PBS do produto exemplar ADC-3 de Fórmula FADC-3 (5,24 mg/mL, 1,1 mL), que foi armazenado a 4ºC.
[458] O valor médio calculado por UV-HPLC: n=7,36. Exemplo 24 ADC-4
- mastnma Á RAHAA vs e” 1 FO NA DAE í De tow )n L yY - FADC-4A "
[459] Uma solução aquosa formulada de tris(2-carboxietil)fosfina (10 MM, 0,173 mL, 1,73 umol) foi adicionada a uma solução aquosa tamponada com PBS de anticorpo Trastuzumab (solução aquosa tam- ponada com PBS a 0,05 M com pH=6,5; 3,74 ml, 13,38 mg/ml, 0,338 upmol) a 37ºC. A solução de reação foi colocada em um agitador de ba- nho de água, e agitada a 37ºC por 3 horas antes de parar a reação. À solução de reação foi resfriada a 25ºC em um banho gelado, e diluída para 6,7 mg/ml. 1,3 ml da solução foram tomados para a próxima reação.
[460] Composto 9-tendo tempo de retenção mais curto, o com- posto 9-A (1,0 mg, 0,93 umol) foi dissolvido em 0,10 mL de DMSO, e em seguida adicionado a 1,3 ml da solução acima. A solução de reação foi colocada em um agitador de banho de água, e agitada a 25ºC por 3 horas antes de parar a reação. A solução de reação foi dessalgada e purificada com uma coluna em gel Sephadex G25 (fase de eluição: so- lução aquosa tamponada com PBS a 0,05 M com pH=6,5, contendo EDTA a 0,001 M) para obter a solução tamponada com PBS do produto exemplar ADC-4 de Fórmula FADC-4A (1,72 mg/mL, 2,36 mL), que foi armazenado a 4ºC.
[461] O valor médio calculado por UV-HPLC: n=7,39. Exemplo 25 ADC-5 O x o V Trastuzumab A AAA Ao Oo 7 < o Ho Ho H AS r
NS AF L o JD FADC-4A o!
[462] Uma solução aquosa formulada de tris(2-carboxietil)fosfina
(10 MM, 0,067 mL, 0,67 umol) foi adicionado a uma solução aquosa tamponada com PBS de anticorpo Trastuzumab (solução aquosa tam- ponada com PBS a 0,05 M com pH=6,5; 3,0 ml, 6,70 mg/ml, 0,136 umol) a 37ºC. A solução de reação foi colocada em um agitador de banho de água, e agitada a 37ºC por 3 horas antes de parar a reação. A solução de reação foi resfriada a 25ºC em um banho gelado, e 0,614 ml da so- lução foram tomados para a próxima reação.
[463] Composto 9-tendo tempo de retenção mais curto, o com- posto 9-A (0,5 mg, 0,42 umol) foi dissolvido em 0,031 mL de DMSO, e em seguida adicionado a 0,614 ml da solução acima. A solução de rea- ção foi colocada em um agitador de banho de água, e agitada a 25ºC por 3 horas antes de parar a reação. A solução de reação foi dessalgada e purificada com uma coluna em gel Sephadex G25 (fase de eluição: solução aquosa tamponada com PBS a 0,05 M com pH=6,5, contendo EDTA a 0,001 M) para obter a solução tamponada com PBS do produto exemplar ADC-5 de Fórmula FADC-4A (3,08 mg/mL, 0,82 mL), que foi armazenado a 4ºC.
[464] O valor médio calculado por UV-HPLC: n=3,16. Exemplo 26 ADC-6 [o o | A o o o | Des ). FADCB o
[465] Uma solução aquosa formulada de tris(2-carboxietil)fosfina (10 MM, 0,173 mL, 1,73 umol) foi adicionada a uma solução aquosa tamponada com PBS de anticorpo Trastuzumab (solução aquosa tam- ponada com PBS a 0,05 M com pH=6,5; 3,74 ml, 13,38 mg/ml, 0,338 upmol) a 37ºC. A solução de reação foi colocada em um agitador de ba- nho de água, e agitada a 37ºC por 3 horas antes de parar a reação. À solução de reação foi resfriada a 25ºC em um banho gelado, e diluída para 6,7 mg/ml. 0,75 ml da solução foram tomados para a próxima rea- ção.
[466] Composto 9-tendo tempo de retenção mais longo, o com- posto 9-B (0,68 mg, 0,63 umol) foi dissolvido em 0,10 mL de DMSO, e em seguida adicionado a 0,75 ml da solução acima. A solução de reação foi colocada em um agitador de banho de água, e agitada a 25ºC por 3 horas antes de parar a reação. A solução de reação foi dessalgada e purificada com uma coluna em gel Sephadex G25 (fase de eluição: so- lução aquosa tamponada com PBS a 0,05 M com pH=6,5, contendo EDTA a 0,001 M) para obter a solução tamponada com PBS do produto exemplar ADC-6 de Fórmula FADC-4B (1,78 mg/mL, 1,78 mL), que foi armazenado a 4ºC.
[467] O valor médio calculado por UV-HPLC: n=3,94. Exemplo 27 ADC-7 o mem É RIA o |
NS FADC-7 ê
[468] Uma solução aquosa formulada de tris(2-carboxietil)fosfina (10 MM, 0,173 mL, 1,73 umol) foi adicionada a uma solução aquosa tamponada com PBS de anticorpo Pertuzumab (solução aquosa tampo- nada com PBS a 0,05 M com pH=6,5; 5,0 ml, 10 mg/ml, 0,338 umol) a 37ºC. A solução de reação foi colocada em um agitador de banho de água, e agitada a 37ºC por 3 horas antes de parar a reação. A solução de reação foi resfriada a 25ºC em um banho gelado, e diluída para 5,0 mg/ml. 1,0 ml da solução foram tomados para a próxima reação.
[469] Composto 8 (0,65 mg, 0,6 umol) foi dissolvido em 0,1 mL de DMSO, e em seguida adicionado a 1,0 ml da solução acima. A solução de reação foi colocada em um agitador de banho de água, e agitada a
25ºC por 3 horas antes de parar a reação. A solução de reação foi des- salgada e purificada com uma coluna em gel Sephadex G25 (fase de eluição: solução aquosa tamponada com PBS a 0,05 M com pH=6,5, contendo EDTA a 0,001 M) para obter a solução tamponada com PBS do produto exemplar ADC-7 de Fórmula FADC-7 (1,42 mg/mL, 2,15 mL), que foi armazenado a 4ºC.
[470] O valor médio calculado por UV-HPLC: n=6,91. Exemplo 28 ADC-8 r y FOSCO LOCO ESA > | % NS L Des Jo FADC-8 7
[471] Uma solução aquosa formulada de tris(2-carboxietil)fosfina (10 MM, 0,173 mL, 1,73 umol) foi adicionado a uma solução aquosa tamponada com PBS de anticorpo Pertuzumab (solução aquosa tampo- nada com PBS a 0,05 M com pH=6,5; 5,0 ml, 10 mg/ml, 0,338 umol) a 37ºC. A solução de reação foi colocada em um agitador de banho de água, e agitada a 37ºC por 3 horas antes de parar a reação. A solução de reação foi resfriada a 25ºC em um banho gelado, e diluída para 5,0 mg/ml. 1,6 ml da solução foram tomados para a próxima reação.
[472] Composto 10, o composto tendo tempo de retenção mais curto (1,04 mg, 1,0 umol) foi dissolvido em 0,1 mL de DMSO, e em se- guida adicionado a 1,6 ml da solução acima. A solução de reação foi colocada em um agitador de banho de água, e agitada a 25ºC por 3 horas antes de parar a reação. A solução de reação foi dessalgada e purificada com uma coluna em gel Sephadex G25 (fase de eluição: so- lução aquosa tamponada com PBS a 0,05 M com pH=6,5, contendo EDTA a 0,001 M) para obter a solução tamponada com PBS do produto exemplar ADC-8 de Fórmula FADC-8 (2,14 mg/mL, 2,31 mL), que foi armazenado a 4ºC.
[473] O valor médio calculado por UV-HPLC: n=6,58. Exemplo 29 ADC-9 mca CÁ AIN RA, Cl hr 4d “O Ng ONÇA LISA | ae. Pe ja
[474] Uma solução aquosa formulada de tris(2-carboxietil)fosfina (10 MM, 0,173 mL, 1,73 umol) foi adicionada a uma solução aquosa tamponada com PBS de anticorpo Pertuzumab (solução aquosa tampo- nada com PBS a 0,05 M com pH=6,5; 5,0 ml, 10 mg/ml, 0,338 umol) a 37ºC. A solução de reação foi colocada em um agitador de banho de água, e agitada a 37ºC por 3 horas antes de parar a reação. A solução de reação foi resfriada a 25ºC em um banho gelado, e diluída para 5,0 mg/ml. 0,8 ml da solução foram tomados para a próxima reação.
[475] Composto 9-tendo tempo de retenção mais curto, o com- posto 9-A (0,55 mg, 0,5 umol) foi dissolvido em 0,1 mL de DMSO, e em seguida adicionado a the above 0,8 ml de solution. A solução de reação foi colocada em um agitador de banho de água, e agitada a 25ºC por 3 horas antes de parar a reação. A solução de reação foi dessalgada e purificada com uma coluna em gel Sephadex G25 (fase de eluição: so- lução aquosa tamponada com PBS a 0,05 M com pH=6,5, contendo EDTA a 0,001 M) para obter a solução tamponada com PBS do produto exemplar ADC-9 de Fórmula FADC-9A (2,27 mg/mL, 1,11 mL), que foi armazenado a 4ºC.
[476] O valor médio calculado por UV-HPLC: n=3,16. Exemplo 30 ADC-10 F o | y AO, | o Ho Ho H o o. ( a.
au L taDeo FS )n
[477] Uma solução aquosa formulada de tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) (10 mM, 19,76 uL, 197,6 umol) foi adicionada a uma solução aquosa tamponada com PBS de anticorpo Trastuzumab (solução aquosa tamponada com PBS a 0,05 M com pH=6,5; 10,0 mg/ml, 0,574 mL, 38,78 nmol) a 37ºC. A solução de reação foi colocada em um agita- dor de banho de água, e agitada a 37ºC por 3 horas antes de parar a reação. A solução de reação foi resfriada a 25ºC em um banho gelado.
[478] Composto 14, o composto tendo tempo de retenção mais curto (0,64 mg, 588 nmol) foi dissolvido em 40 ul de DMSO, e em se- guida adicionado à solução de reação acima. A solução de reação foi colocada em um agitador de banho de água, e agitada a 25ºC por 3 horas antes de parar a reação. A solução de reação foi dessalgada e purificada com uma coluna em gel Sephadex G25 (fase de eluição: so- lução aquosa tamponada com PBS a 0,05 M com pH=6,5, contendo EDTA a 0,001 M) para obter a solução tamponada com PBS do produto exemplar ADC-10 de Fórmula FADC-10 (5,48 mg/mL, 1,03 mL), que foi armazenado a 4ºC.
[479] O valor médio calculado por UV-Vis: n=6,25. Exemplo 31 ADC-11 mn LA AI ORE AA | | ro EO Yo L taDCÃo A dn
[480] Uma solução aquosa formulada de tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) (10 mM, 22,24 uL, 222,4 nmol) foi adicionada a uma solução aquosa tamponada com PBS de anticorpo Trastuzumab (solução aquosa tamponada com PBS a 0,05 M com pH=6,5; 10,0 mg/ml, 0,646 mL, 43,64 nmol) a 37ºC. A solução de reação foi colocada em um agita- dor de banho de água, e agitada a 37ºC por 3 horas antes de parar a reação. A solução de reação foi resfriada a 25ºC em um banho gelado.
[481] Composto 14, o composto tendo tempo de retenção mais longo (0,72 mg, 662 nmol) foi dissolvido em 40 ul de DMSO, e em se- guida adicionado à solução de reação acima. A solução de reação foi colocada em um agitador de banho de água, e agitada a 25ºC por 3 horas antes de parar a reação. A solução de reação foi dessalgada e purificada com uma coluna em gel Sephadex G25 (fase de eluição: so- lução aquosa tamponada com PBS a 0,05 M com pH=6,5, contendo EDTA a 0,001 M) para obter a solução tamponada com PBS do produto exemplar ADC-11 de Fórmula FADC-10 (2,13 mg/mL, 1,87 mL), que foi armazenado a 4ºC.
[482] O valor médio calculado por UV-Vis: n=7,03. Exemplo 32 ADC-12 + o o o o o F TAN | ” FADC-12 od
[483] Uma solução aquosa formulada de tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) (10 mM, 25,0 uL, 250,0 nmol) foi adicionada a uma solução aquosa tamponada com PBS de anticorpo Trastuzumab (solução aquosa tamponada com PBS a 0,05 M com pH=6,5; 10,0 mg/ml, 0,726 mL, 49,05 nmol) a 37ºC. A solução de reação foi colocada em um agita- dor de banho de água, e agitada a 37ºC por 3 horas antes de parar a reação. A solução de reação foi resfriada a 25ºC em um banho gelado.
[484] Composto 15 (0,81 mg, 754 nmol) foi dissolvido em 40 ul de DMSO, e em seguida adicionado à solução de reação acima. A solução de reação foi colocada em um agitador de banho de água, e agitada a 25ºC por 3 horas antes de parar a reação. A solução de reação foi des- salgada e purificada com uma coluna em gel Sephadex G25 (fase de eluição: solução aquosa tamponada com PBS a 0,05 M com pH=6,5, contendo EDTA a 0,001 M) para obter a solução tamponada com PBS do produto exemplar ADC-12 de Fórmula FADC-12 (3,34 mg/mL, 1,45 mL), que foi armazenado a 4ºC.
[485] O valor médio calculado por UV-Vis: n=6,93. Exemplo 33 ADC-13 . o o C o o ke | mu LI, y ALA AO | “ f > | Te» S FADCA3 o,
[486] Uma solução aquosa formulada de tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) (10 mM, 9,88 uL, 98,8 nmol) foi adicionada a uma solução aquosa tamponada com PBS de anticorpo Trastuzumab (solução aquosa tamponada com PBS a 0,05 M com pH=6,5; 10,0 mg/ml, 0,287 mL, 19,39 nmol) a 37ºC. A solução de reação foi colocada em um agita- dor de banho de água, e agitada a 37ºC por 3 horas antes de parar a reação. A solução de reação foi resfriada a 25ºC em um banho gelado.
[487] Composto 16 (0,32 mg, 294 nmol) foi dissolvido em 20 ul de DMSO, e em seguida adicionado à solução de reação acima. A solução de reação foi colocada em um agitador de banho de água, e agitada a 25ºC por 3 horas antes de parar a reação. A solução de reação foi des- salgada e purificada com uma coluna em gel Sephadex G25 (fase de eluição: solução aquosa tamponada com PBS a 0,05 M com pH=6,5, contendo EDTA a 0,001 M) para obter a solução tamponada com PBS do produto exemplar ADC-13 de Fórmula FADC-13 (2,37 mg/mL, 0,88 mL), que foi armazenado a 4ºC.
[488] O valor médio calculado por UV-Vis: n=6,53. Exemplo 34 ADC-14
[489] Uma solução aquosa formulada de tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) (10 mM, 20,38 uL, 203,8 nmol) foi adicionada a uma solução aquosa tamponada com PBS de anticorpo Trastuzumab (solução aquosa tamponada com PBS a 0,05 M com pH=6,5; 10,0 mg/ml, 0,592 mL, 40,0 nmol) a 37ºC. A solução de reação foi colocada em um agitador de banho de água, e agitada a 37ºC por 3 horas antes de parar a reação. A solução de reação foi resfriada a 25ºC em um banho gelado.
[490] Composto 17 (0,92 mg, 598 nmol) foi dissolvido em 40 ul de DMSO, e em seguida adicionado à solução de reação acima. A solução de reação foi colocada em um agitador de banho de água, e agitada a 25ºC por 3 horas antes de parar a reação. A solução de reação foi des- salgada e purificada com uma coluna em gel Sephadex G25 (fase de eluição: solução aquosa tamponada com PBS a 0,05 M com pH=6,5, contendo EDTA a 0,001 M) para obter a solução tamponada com PBS do produto exemplar ADC-14 de Fórmula FADC-14 (0,30 mg/mL, 12,0 mL), que foi armazenado a 4ºC.
[491] O valor médio calculado por UV-Vis: n=7,61. Exemplo 35 ADC-15 mama Lc í + ST XL b Y o
[492] Uma solução aquosa formulada de tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) (10 mM, 20,38 uL, 203,8 nmol) foi adicionada a uma solução aquosa tamponada com PBS de anticorpo Trastuzumab (solução aquosa tamponada com PBS a 0,05 M com pH=6,5; 10,0 mg/ml, 0,592 mL, 40,0 nmol) a 37ºC. A solução de reação foi colocada em um agitador de banho de água, e agitada a 37ºC por 3 horas antes de parar a reação. A solução de reação foi resfriada a 25ºC em um banho gelado.
[493] Composto 18 (0,93 mg, 599 nmol) foi dissolvido em 40 ul de DMSO, e em seguida adicionado à solução de reação acima. A solução de reação foi colocada em um agitador de banho de água, e agitada a 25ºC por 3 horas antes de parar a reação. A solução de reação foi des- salgada e purificada com uma coluna em gel Sephadex G25 (fase de eluição: solução aquosa tamponada com PBS a 0,05 M com pH=6,5, contendo EDTA a 0,001 M) para obter a solução tamponada com PBS do produto exemplar ADC-15 de Fórmula FADC-15 (0,32 mg/mL, 11,8 mL), que foi armazenado a 4ºC.
[494] O valor médio calculado por UV-Vis: n=7,89. Exemplo 36 ADC-16 S o"
[495] Uma solução aquosa formulada de tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) (10 mM, 18,25 uL, 182,5 nmol) foi adicionada a uma solução aquosa tamponada com PBS de anticorpo Trastuzumab (solução aquosa tamponada com PBS a 0,05 M com pH=6,5; 10,0 mg/ml, 0,53 mL, 35,8 nmol) a 37ºC. A solução de reação foi colocada em um agitador de banho de água, e agitada a 37ºC por 3 horas antes de parar a reação. A solução de reação foi resfriada a 25ºC em um banho gelado.
[496] Composto 19 (0,83 mg, 534 nmol) foi dissolvido em 35 ul de DMSO, e em seguida adicionado à solução de reação acima. A solução de reação foi colocada em um agitador de banho de água, e agitada a 25ºC por 3 horas antes de parar a reação. A solução de reação foi des- salgada e purificada com uma coluna em gel Sephadex G25 (fase de eluição: solução aquosa tamponada com PBS a 0,05 M com pH=6,5, contendo EDTA a 0,001 M) para obter a solução tamponada com PBS do produto exemplar ADC-16 de Fórmula FADC-16 (0,32 mg/mL, 12,0 mL), que foi armazenado a 4ºC.
[497] O valor médio calculado por UV-Vis: n=7,43. Exemplo 37 ADC-17
RN mm O Yao) Trastuzu Et, ET, FADCA4A o
[498] Uma solução aquosa formulada de tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) (10 MM, 43,2 uL, 432 nmol) foi adicionada a uma solução aquosa tamponada com PBS de anticorpo Trastuzumab (solução aquosa tamponada com PBS a 0,05 M com pH=6,5; 10,0 mg/ml, 2,0 mL, 135,12 nmol) a 37ºC. A solução de reação foi colocada em um agitador de banho de água, e agitada a 37ºC por 3 horas antes de parar a reação. A solução de reação foi resfriada a 25ºC em um banho gelado.
[499] Composto 9-tendo tempo de retenção mais curto, o com- posto 9-A (2,22 mg, 2067 nmol) foi dissolvido em 175 ul de DMSO, e em seguida adicionado à solução de reação acima. A solução de reação foi colocada em um agitador de banho de água, e agitada a 25ºC por 3 horas antes de parar a reação. A solução de reação foi dessalgada e purificada com uma coluna em gel Sephadex G25 (fase de eluição: so- lução aquosa tamponada com PBS a 0,05 M com pH=6,5, contendo EDTA a 0,001 M) para obter a solução tamponada com PBS do produto exemplar ADC-17 de Fórmula FADC-4A (1,32 mg/mL, 12,0 mL), que foi armazenado a 4ºC.
[500] O valor médio calculado por UV-Vis: n=5,42. Exemplo 38 ADC-18 (exemplo de referência) f q » FIN pEcss | NE, FADC-18 DD :
[501] Uma solução aquosa formulada de tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) (10 MM, 51,7 uL, 517 nmol) foi adicionado a uma solução aquosa tamponada com PBS de anticorpo Trastuzumab (solução aquosa tamponada com PBS a 0,05 M com pH=6,5; 10,0 mg/ml, 1,5 mL, 101,3 nmol) a 37ºC. A solução de reação foi colocada em um agitador de banho de água, e agitada a 37ºC por 3 horas antes de parar a reação. A solução de reação foi resfriada a 25ºC em um banho gelado.
[502] Composto 20 (2,0 mg, 1934 nmol) foi dissolvido em 100 ul de DMSO, e em seguida adicionado à solução de reação acima. A solu- ção de reação foi colocada em um agitador de banho de água, e agitada a 25ºC por 3 horas antes de parar a reação. A solução de reação foi dessalgada e purificada com uma coluna em gel Sephadex G25 (fase de eluição: solução aquosa tamponada com PBS a 0,05 M com pH=6,5, contendo EDTA a 0,001 M) para obter a solução tamponada com PBS do produto exemplar ADC-18 de Fórmula FADC-18 (0,79 mg/mL, 13,0 mL), que foi armazenado a 4ºC.
[503] O valor médio calculado por UV-Vis: n=7,23. Exemplo 39 ADC-19 ' | men A Ao, Ny AF | Der j n i tavosa 2»
[504] Uma solução aquosa formulada de tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) (10 mM, 46,9 uL, 469 nmol) foi adicionada a uma solução aquosa tamponada com PBS de anticorpo Trastuzumab (solução aquosa tamponada com PBS a 0,05 M com pH=6,5; 10,0 mg/ml, 1,36 mL, 91,9 nmol) a 37ºC. A solução de reação foi colocada em um agitador de banho de água, e agitada a 37ºC por 3 horas antes de parar a reação. A solução de reação foi resfriada a 25ºC em um banho gelado.
[505] Composto 9-tendo tempo de retenção mais curto, o com- posto 9-A (2,0 mg, 1862 nmol) foi dissolvido em 100 ul de DMSO, e em seguida adicionado à solução de reação acima. A solução de reação foi colocada em um agitador de banho de água, e agitada a 25ºC por 3 horas antes de parar a reação. A solução de reação foi dessalgada e purificada com uma coluna em gel Sephadex G25 (fase de eluição: so- lução aquosa tamponada com PBS a 0,05 M com pH=6,5, contendo EDTA a 0,001 M) para obter a solução tamponada com PBS do produto exemplar ADC-19 de Fórmula FADC-4A (0,73 mg/mL, 13,0 mL), que foi armazenado a 4ºC.
[506] O valor médio calculado por UV-Vis: n=6,26. Exemplo 40 ADC-20 r y Trestuzumeb a A q Ao o Ho Ho H o EAÁSS nO
[507] Uma solução aquosa formulada de tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) (10 MM, 51,7 uL, 517 nmol) foi adicionada a uma solução aquosa tamponada com PBS de anticorpo Trastuzumab (solução aquosa tamponada com PBS a 0,05 M com pH=6,5; 10,0 mg/ml, 1,5 mL, 101,3 nmol) a 37ºC. A solução de reação foi colocada em um agitador de banho de água, e agitada a 37ºC por 3 horas antes de parar a reação. A solução de reação foi resfriada a 25ºC em um banho gelado.
[508] Composto 10, o composto tendo tempo de retenção mais longo (2,0 mg, 1815 nmol) foi dissolvido em 100 ul de DMSO, e em se- guida adicionado à solução de reação acima. A solução de reação foi colocada em um agitador de banho de água, e agitada a 25ºC por 3 horas antes de parar a reação. A solução de reação foi dessalgada e purificada com uma coluna em gel Sephadex G25 (fase de eluição: so- lução aquosa tamponada com PBS a 0,05 M com pH=6,5, contendo EDTA a 0,001 M) para obter a solução tamponada com PBS do produto exemplar ADC-20 de Fórmula FADC-1 (0,73 mg/mL, 13,0 mL), que foi armazenado a 4ºC.
[509] O valor médio calculado por UV-Vis: n=7,43. Exemplo 41 ADC-21 (exemplo de referência) o msm ANITA OA | <o Ho Ho n o ES, | FADC-18 FS ”
[510] Uma solução aquosa formulada de tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) (10 mM, 63,9 uL, 639 nmol) foi adicionada a uma solução aquosa tamponada com PBS de anticorpo Trastuzumab (solução aquosa tamponada com PBS a 0,05 M com pH=6,5; 10,0 mg/ml, 1,86 mL, 125,4 nmol) a 37ºC. A solução de reação foi colocada em um agita- dor de banho de água, e agitada a 37ºC por 3 horas antes de parar a reação. A solução de reação foi resfriada a 25ºC em um banho gelado.
[511] Composto 20 (2,07 mg, 2001 nmol) foi dissolvido em 150 ul de DMSO, e em seguida adicionado à solução de reação acima. A solu- ção de reação foi colocada em um agitador de banho de água, e agitada a 25ºC por 3 horas antes de parar a reação. A solução de reação foi dessalgada e purificada com uma coluna em gel Sephadex G25 (fase de eluição: solução aquosa tamponada com PBS a 0,05 M com pH=6,5, contendo EDTA a 0,001 M) para obter a solução tamponada com PBS do produto exemplar ADC-21 de Fórmula FADC-18 (2,91 mg/mL, 4,44 mL), que foi armazenado a 4ºC.
[512] O valor médio calculado por UV-Vis: n=7,23. Exemplo 42 ADC-22 o O Trastuzumab- GIAL na | o 8 HO H o AS, FADC-4A Es
[513] Uma solução aquosa formulada de tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) (10 mM, 64,9 uL, 649 nmol) foi adicionada a uma solução aquosa tamponada com PBS de anticorpo Trastuzumab (solução aquosa tamponada com PBS a 0,05 M com pH=6,5; 10,0 mg/ml, 1,88 mL, 127,2 nmol) a 37ºC. A solução de reação foi colocada em um agita- dor de banho de água, e agitada a 37ºC por 3 horas antes de parar a reação. A solução de reação foi resfriada a 25ºC em um banho gelado.
[514] Composto 9-tendo tempo de retenção mais curto, o com- posto 9-A (2,1 mg, 1955 nmol) foi dissolvido em 150 ul de DMSO, e em seguida adicionado à solução de reação acima. A solução de reação foi colocada em um agitador de banho de água, e agitada a 25ºC por 3 horas antes de parar a reação. A solução de reação foi dessalgada e purificada com uma coluna em gel Sephadex G25 (fase de eluição: so- lução aquosa tamponada com PBS a 0,05 M com pH=6,5, contendo EDTA a 0,001 M) para obter a solução tamponada com PBS do produto exemplar ADC-22 de Fórmula FADC-4A (3,56 mg/mL, 3,98 mL), que foi armazenado a 4ºC.
[515] O valor médio calculado por UV-Vis: n=6,79. Exemplo 43 ADC-23 (exemplo de referência) O o 2 | | Trasnima 1 AA ; so Ho Ho H SO L Des n FADC-18 ô
[516] Uma solução aquosa formulada de tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) (10 mM, 11,89 mL, 118,9 umol) foi adicionada a uma solução aquosa tamponada com PBS de anticorpo Trastuzumab (solução aquosa tamponada com PBS a 0,05 M com pH=6,5; 10,0 mg/ml, 345 mL, 23,31 umol) a 37ºC. A solução de reação foi colocada em um agita- dor de banho de água, e agitada a 37ºC por 3,5 horas antes de parar a reação. A solução de reação foi resfriada a 25ºC em um banho gelado.
[517] Composto 20 (362 mg, 350 umol) foi dissolvido em 7,12 ml de MeCN e 3,56 mL de DMSO, e em seguida adicionado à solução de reação acima. A solução de reação foi colocada em um agitador de ba- nho de água, e agitada a 25ºC por 3 horas antes de parar a reação. À solução de reação foi dessalgada e purificada por um pacote ultrafiltra- ção com solução aquosa tamponada com PBS contendo MeCN a 2% (v/v) e DMSO a 1% (v/v) (solução aquosa tamponada com PBS a 0,05 M com pH=6,5) e solução aquosa tamponada com ácido succínico (so- lução aquosa tamponada com ácido succínico a 0,01 M com pH=5,3). Sacarose foi adicionado a 60 mg/mL, e Tween 20 foi adicionado a 0,2 mg/mL. A solução foi engarrafada e liofilizada para obter a amostra de pó liofilizado do produto exemplar ADC-23 de Fórmula FADC-18, que foi armazenado a 4ºC.
[518] O valor médio calculado por UV-Vis: n=7,05. Exemplo 44 ADC-24 o ir a ] don n . FADC-4A Es
[519] Uma solução aquosa formulada de tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) (10 MM, 11,44 mL, 114,4 umol) foi adicionada a uma solução aquosa tamponada com PBS de anticorpo Trastuzumab (solução aquosa tamponada com PBS a 0,05 M com pH=6,5; 10,0 mg/ml, 332 mL, 22,43 umol) a 37ºC. A solução de reação foi colocada em um agita- dor de banho de água, e agitada a 37ºC por 3,5 horas antes de parar a reação. A solução de reação foi resfriada a 25ºC em um banho gelado.
[520] Composto 9-tendo tempo de retenção mais curto, o com- posto 9-A (241 mg, 224 umol) foi dissolvido em 13,76 ml de MeCN e
6,88 mL de DMSO, e em seguida adicionado à solução de reação acima. A solução de reação foi colocada em um agitador de banho de água, e agitada a 25ºC por 3 horas antes de parar a reação. A solução de reação foi dessalgada e purificada por um pacote ultrafiltração com solução aquosa tamponada com PBS contendo MeCN a 4% (v/v) e DMSO a 2% (v/v) (solução aquosa tamponada com PBS a 0,05 M com pH=6,5) e solução aquosa tamponada com ácido succínico (solução aquosa tam- ponada com ácido succínico a 0,01 M com pH=5,3). Sacarose foi adici- onado a 60 mg/mL, e Tween 20 foi adicionado a 0,2 mg/mL. A solução foi engarrafada e liofilizada para obter a amostra de pó liofilizado do pro- duto exemplar ADC-24 de Fórmula FADC-4A, que foi armazenado a 4ºC.
[521] O valor médio calculado por UV-Vis: n=7,07. Exemplo 45 ADC-25 [ + o nH o e [o] Y H | 1F9DS- FPA, SIN TSDA FADC-25 FT C
[522] Uma solução aquosa formulada de tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) (10 MM, 73,7 uL, 740 nmol) foi adicionada a uma solução aquosa tamponada com PBS de anticorpo B7H3 anticorpo 1F9DS (so- lução aquosa tamponada com PBS a 0,05 M com pH=6,5; 10,0 mg/ml, 2,14 mL, 144,60 nmol) a 37ºC. A solução de reação foi colocada em um agitador de banho de água, e agitada a 37ºC por 3 horas antes de parar a reação. A solução de reação foi resfriada a 25ºC em um banho gelado.
[523] Composto 9-tendo tempo de retenção mais curto, o com- posto 9-A (3,0 mg, 2793 nmol) foi dissolvido em 150 ul de DMSO, e em seguida adicionado à solução de reação acima. A solução de reação foi colocada em um agitador de banho de água, e agitada a 25ºC por 3 horas antes de parar a reação. A solução de reação foi dessalgada e purificada com uma coluna em gel Sephadex G25 (fase de eluição: so- lução aquosa tamponada com PBS a 0,05 M com pH=6,5, contendo EDTA a 0,001 M) para obter a solução tamponada com PBS do produto exemplar ADC-25 de Fórmula FADC-25 (1,28 mg/mL, 13,0 mL), que foi armazenado a 4ºC.
[524] O valor médio calculado por UV-Vis: n=6,87. Exemplo 46 ADC-26 (exemplo de referência) o O Ear O Ho Ho H 27 FADC-26 TT =
[525] Uma solução aquosa formulada de tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) (10 mM, 30,1 uL, 300 nmol) foi adicionada a uma solução aquosa tamponada com PBS de anticorpo B7H3 anticorpo 1F9DS (so- lução aquosa tamponada com PBS a 0,05 M com pH=6,5; 10,0 mg/ml, 0,89 mL, 60,14 nmol) a 37ºC. A solução de reação foi colocada em um agitador de banho de água, e agitada a 37ºC por 3 horas antes de parar a reação. A solução de reação foi resfriada a 25ºC em um banho gelado.
[526] Composto 20 (1,0 mg, 967 nmol) foi dissolvido em 100 ul de DMSO, e em seguida adicionado à solução de reação acima. A solução de reação foi colocada em um agitador de banho de água, e agitada a 25ºC por 3 horas antes de parar a reação. A solução de reação foi des- salgada e purificada com uma coluna em gel Sephadex G25 (fase de eluição: solução aquosa tamponada com PBS a 0,05 M com pH=6,5, contendo EDTA a 0,001 M) para obter a solução tamponada com PBS do produto exemplar ADC-26 de Fórmula FADC-26 (1,61 mg/mL, 4,0 mL), que foi armazenado a 4ºC.
[527] O valor médio calculado por UV-Vis: n=6,15. Exemplo 47 ADC-27
RN o rito, L
NS EN
[528] Uma solução aquosa formulada de tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) (10 mM, 30,1 uL, 300 nmol) foi adicionada a uma solução aquosa tamponada com PBS de anticorpo B7H3 anticorpo 1F9DS (so- lução aquosa tamponada com PBS a 0,05 M com pH=6,5; 10,0 mg/ml, 0,89 mL, 60,14 nmol) a 37ºC. A solução de reação foi colocada em um agitador de banho de água, e agitada a 37ºC por 3 horas antes de parar a reação. A solução de reação foi resfriada a 25ºC em um banho gelado.
[529] Composto 9-tendo tempo de retenção mais curto, o com- posto 9-A (1,02 mg, 950 nmol) foi dissolvido em 100 ul de DMSO, e em seguida adicionado à solução de reação acima. A solução de reação foi colocada em um agitador de banho de água, e agitada a 25ºC por 3 horas antes de parar a reação. A solução de reação foi dessalgada e purificada com uma coluna em gel Sephadex G25 (fase de eluição: so- lução aquosa tamponada com PBS a 0,05 M com pH=6,5, contendo EDTA a 0,001 M) para obter a solução tamponada com PBS do produto exemplar ADC-27 de Fórmula FADC-25 (1,94 mg/mL, 3,5 mL), que foi armazenado a 4ºC.
[530] O valor médio calculado por UV-Vis: n=6,11. Exemplo 48 ADC-28 (exemplo de referência) - y ms A AAA A | ag L 9 or n FADC-26 o |
[531] Uma solução aquosa formulada de tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) (10 mM, 81,3 uL, 810 nmol) foi adicionada a uma solução aquosa tamponada com PBS de anticorpo B7H3 anticorpo 1F9DS (so- lução aquosa tamponada com PBS a 0,05 M com pH=6,5; 10,0 mg/ml, 2,36 mL, 159,47 nmol) a 37ºC. A solução de reação foi colocada em um agitador de banho de água, e agitada a 37ºC por 3 horas antes de parar a reação. A solução de reação foi resfriada a 25ºC em um banho gelado.
[532] Composto 20 (3,0 mg, 2901 nmol) foi dissolvido em 150 ul de DMSO, e em seguida adicionado à solução de reação acima. A solu- ção de reação foi colocada em um agitador de banho de água, e agitada a 25ºC por 3 horas antes de parar a reação. A solução de reação foi dessalgada e purificada com uma coluna em gel Sephadex G25 (fase de eluição: solução aquosa tamponada com PBS a 0,05 M com pH=6,5, contendo EDTA a 0,001 M) para obter a solução tamponada com PBS do produto exemplar ADC-28 de Fórmula FADC-26 (1,29 mg/mL, 13,0 mL), que foi armazenado a 4ºC.
[533] O valor médio calculado por UV-Vis: n=7,46. Exemplo 49 ADC-29 - y me LA IDA, |
Y A SLI FADC-25 dd
[534] Uma solução aquosa formulada de tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) (10 mM, 28,6 uL, 290 nmol) foi adicionado a uma solução aquosa tamponada com PBS de anticorpo B7H3 anticorpo 1F9DS (so- lução aquosa tamponada com PBS a 0,05 M com pH=6,5; 10,0 mg/ml, 0,80 mL, 50,06 nmol) a 37ºC. A solução de reação foi colocada em um agitador de banho de água, e agitada a 37ºC por 3 horas antes de parar a reação. A solução de reação foi resfriada a 25ºC em um banho gelado.
[535] Composto 9-tendo tempo de retenção mais curto, o com- posto 9-A (1,29 mg, 1201 nmol) foi dissolvido em 100 ul de DMSO, e em seguida adicionado à solução de reação acima. A solução de reação foi colocada em um agitador de banho de água, e agitada a 25ºC por 3 horas antes de parar a reação. A solução de reação foi dessalgada e purificada com uma coluna em gel Sephadex G25 (fase de eluição: so- lução aquosa tamponada com PBS a 0,05 M com pH=6,5, contendo EDTA a 0,001 M) para obter a solução tamponada com PBS do produto exemplar ADC-29 de Fórmula FADC-25 (2,63 mg/mL, 2,4 mL), que foi armazenado a 4ºC.
[536] O valor médio calculado por UV-Vis: n=7,24. Exemplo 50 ADC-30 (exemplo de referência) r <o Ho Ho H ES
O L Dex % dor dn
[537] Uma solução aquosa formulada de tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) (10 mM, 29,1 uL, 290 nmol) foi adicionada a uma solução aquosa tamponada com PBS de anticorpo B7H3 anticorpo 1F9DS (so- lução aquosa tamponada com PBS a 0,05 M com pH=6,5; 10,0 mg/ml, 0,86 mL, 58,4 nmol) a 37ºC. A solução de reação foi colocada em um agitador de banho de água, e agitada a 37ºC por 3 horas antes de parar a reação. A solução de reação foi resfriada a 25ºC em um banho gelado.
[538] Composto 20 (1,0 mg, 967 nmol) foi dissolvido em 100 ul de DMSO, e em seguida adicionado à solução de reação acima. A solução de reação foi colocada em um agitador de banho de água, e agitada a 25ºC por 3 horas antes de parar a reação. A solução de reação foi des- salgada e purificada com uma coluna em gel Sephadex G25 (fase de eluição: solução aquosa tamponada com PBS a 0,05 M com pH=6,5, contendo EDTA a 0,001 M) para obter a solução tamponada com PBS do produto exemplar ADC-30 de Fórmula FADC-26 (1,61 mg/mL, 4,0 mL), que foi armazenado a 4ºC.
[539] O valor médio calculado por UV-Vis: n=6,15.
Exemplo 51 ADC-31 me LI RAIA ho) | à RE RO E LST | AT.
[540] Uma solução aquosa formulada de tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) (10 mM, 30,1 uL, 300 nmol) foi adicionada a uma solução aquosa tamponada com PBS de anticorpo B7H3 anticorpo 1F9DS (so- lução aquosa tamponada com PBS a 0,05 M com pH=6,5; 10,0 mg/ml, 0,89 mL, 60,14 nmol) a 37ºC. A solução de reação foi colocada em um agitador de banho de água, e agitada a 37ºC por 3 horas antes de parar a reação. A solução de reação foi resfriada a 25ºC em um banho gelado.
[541] Composto 8 (1,0 mg, 943 nmol) foi dissolvido em 100 ul de DMSO, e em seguida adicionado à solução de reação acima. A solução de reação foi colocada em um agitador de banho de água, e agitada a 25ºC por 3 horas antes de parar a reação. A solução de reação foi des- salgada e purificada com uma coluna em gel Sephadex G25 (fase de eluição: solução aquosa tamponada com PBS a 0,05 M com pH=6,5, contendo EDTA a 0,001 M) para obter a solução tamponada com PBS do produto exemplar ADC-31 de Fórmula FADC-31 (1,47 mg/mL, 4,5 mL), que foi armazenado a 4ºC.
[542] O valor médio calculado por UV-Vis: n=6,33. Análise de Carga do fármaco da Solução Estoque de ADC Objetivo experimental e princípio
[543] A solução estoque de ADC é um tipo de fármaco conjugada com anticorpo. Seu mecanismo para o tratamento de doenças é entre- gar moléculas de toxina nas células por meio do direcionamento de an- ticorpos, matando assim as células. A carga do fármaco desempenha um papel decisivo na eficácia do fármaco. A carga do fármaco da solu- ção estoque de ADC foi determinada pelo método ultravioleta.
Método experimental
[544] Uma cubeta contendo tampão de succinato de sódio foi co- locada na célula de absorção de referência e na célula de absorção de medição da amostra, respectivamente. Após a dedução do branco do solvente, uma cubeta contendo a solução de teste foi colocada na célula de absorção de medição da amostra e a absorbância a 280 nm e 370 nm foi medida.
[545] Cálculo dos resultados: A carga do fármaco da solução esto- que de ADC foi determinada por espectrofotometria ultravioleta (instru- mento: espectrofotômetro ultravioleta Thermo nanodrop2000). Seu prin- cípio é que a absorbância total da solução estoque de ADC em um de- terminado comprimento de onda é igual à soma da absorbância do fár- maco citotóxica e a absorbância do anticorpo monoclonal naquele com- primento de onda, ou seja: (1) A2sonm = Emab-280bCmab + Efármaco-280b Cfármaco Efármaco-280: O Valor médio do coeficiente de abrsorção molar do fármaco a 280 nm é 5100; Crármaco: concentração do fármaco; Emab-280: O valor médio do coeficiente de abrsorção molar da solução estoque de trastuzumab ou da solução estoque de pertuzumab a 280 nm é 214600; Cmav: concentração da solução estoque de trastuzumab ou solução estoque de pertuzumab; b: o comprimento do caminho óptico é de 1 cm.
[546] Da mesma forma, a equação de absorbância total da amos- tra a 370 nm pode ser obtida: (2) Aszonm = Emab-arobCmab + EFármaco-arobCrFármaco EFármaco-370o: O valor médio do coeficiente de abrsorção molar do fármaco em 370 nm é 19000; CrFármaco: concentração do fármaco;
Emab-370: O valor médio do coeficiente de abrsorção molar da solução estoque de trastuzumab ou da solução estoque de pertuzumab a3/70nméo; Cmav: concentração da solução estoque de trastuzumab; b: o comprimento do caminho óptico é de 1 cm.
[547] A carga do fármaco pode ser calculada pelas duas equações (1) e (2) em combinação com o coeficiente de extinção e os dados de concentração do anticorpo monoclonal e o fármaco nos dois compri- mentos de onda de detecção.
Carga do fármaco = Crármaco/Cmab- Ensaio Biológico Exemplo de Teste 1: Teste in vitro da inibição do composto de fórmula (D) na proliferação de células tumorais |. Objetivo do teste
[548] O objetivo deste teste é testar o efeito de inibição in vitro do composto de fármaco de fórmula (D) da presente invenção na prolifera- ção de células U87MG (banco de células da Academia Chinesa de Ci- ências, Catálogo % TCHu138) e células tumorais SK-BR-3 (células de câncer de mama humano, ATCC, artigo número HTB-30). As células fo- ram tratadas com diferentes concentrações do composto in vitro. Após 6 dias de cultivo, a proliferação celular foi determinada pelo reagente CTG (Ensaio de Viabilidade Celular de Luminescência CellTiter-GloO, Promega, número do artigo: G7573), e a atividade in vitro do composto foi avaliada de acordo com o valor ICs5o.
Il. Método de teste
[549] O método de teste para o teste de inibição da proliferação in vitro dos presentes compostos em células tumorais é descrito abaixo tomando o método de teste de inibição da proliferação in vitro em células U87MG como exemplo. Este método é também aplicável, mas não limi-
tado a, testes de inibição da proliferação in vitro em outras células tu- morais.
[550] 1. Cultivo celular: células U87MG e células SK-BR-3 foram cultivadas em meio EMEM contendo 10% de FBS (GE, artigo número SH30024,01) e meio McCoy's 5A contendo 10% de FBS (Gibco, artigo número 16600-108), respectivamente.
[551] 2. Preparação de células: células U87MG e células SK-BR- 3 em fase de crescimento logarítmico foram lavadas com PBS (tampão fosfato, Shanghai Basal Media Technologies Co., Ltd.) uma vez e, em seguida, adicionadas com 2-3 ml de tripsina (0,25 % Tripsina-EDTA (1 x), Gibico, Life Technologies) para digerir por 2-3 min. 10-15 ml de meio de cultura de células foram adicionados após as células terem sido com- pletamente digeridas. As células digeridas foram eluídas e centrifugadas a 1000 rpm durante 5 min. O sobrenadante foi descartado e 10-20 ml de meio de cultura de células foram adicionados para ressuspender as células para obter uma suspensão de uma única célula.
[552] 3. Plaqueamento de células: as suspensões de células úni- cas U87MG e SK-BR-3 foram bem misturadas e as densidades celula- res foram ajustadas para 2,75 x 10º células/ml e 8,25 x 10º células/ml com o meio de cultura de células, respectivamente. A suspensão de cé- lulas com densidade ajustada foi bem misturada e adicionada a uma placa de cultura de células de 96 poços a 180 ul/poço. 200 ul de meio de cultura foram adicionados aos poços periféricos da placa de 96 poços. A placa foi incubada em uma incubadora por 24 horas (37 ºC, 5% de CO;>).
[553] 4. Formulação do composto: o composto foi dissolvido com DMSO (dimetilsulfóxido, Shanghai Titan Technology Co., Ltd.) para ob- ter uma solução estoque com uma concentração inicial de 10 mM.
[554] A concentração inicial do composto de molécula pequena foi de 500 nM, e o método de formulação é o seguinte.
[555] 30 ul de diferentes amostras de teste foram respectivamente adicionados à primeira coluna da placa de formulação de fundo em forma de U de 96 poços com uma concentração de amostra de 100 uM. ul de DMSO foram adicionados a cada poço da segunda coluna até a 11º coluna. 10 ul da amostra da primeira coluna foram adicionados aos 20 ul de DMSO na segunda coluna e bem misturados, dos quais 10 ul foram retirados e adicionados à terceira coluna, e assim por diante até a 10º coluna. 5 ul de fármaco de cada poço da placa de formulação foram adicionados a 95 ul de meio de cultura EMEM e bem misturados para uso posterior.
[556] A concentração inicial de ADC foi de 10 nM ou 500 nM, e o método de formulação é o seguinte.
[557] 100 ul de diferentes amostras de teste foram respectiva- mente adicionados à primeira coluna da placa de 96 poços com uma concentração de amostra de 100 nM ou 5 uM. 100 ul de PBS foram adicionados a cada poço da segunda coluna à 11º coluna. 50 ul da amostra da primeira coluna foram adicionados aos 100 ul de PBS na segunda coluna e bem misturados, dos quais 50 ul foram retirados e adicionados à terceira coluna, e assim por diante até a 10º coluna com uma diluição.
[558] 5. Carga da amostra: 20 ul das amostras de teste formuladas de diferentes concentrações foram adicionados à placa de cultura, cada amostra foi testada em duplicata. A placa foi incubada em uma incuba- dora por 6 dias (37 ºC, 5% de CO;>).
[559] 6. Operação de coloração: a placa de cultura de células de 96 poços foi retirada e 90 ul de solução de CTG foram adicionados a cada poço e incubados em temperatura ambiente por 10 minutos.
[560] 7. Leitura da placa: a placa de cultura de células de 96 poços foi retirada e colocada em um leitor de microplacas (BMG labtech, FE- RAstar FS) para medir a quimiluminiscência.
III. Análise de dados
[561] Dados foram analisados com Microsoft Excel e Graphpad Prism 5. Os resultados são apresentados na seguinte tabela. Tabela 1 Valor de IC5o de inibição in vitro dos fragmentos de moléculas pequenas da presente invenção na proliferação de células SK-BR-3 e células U87 pe Ego No. do Composto Rss 0,33 2-B 2-A Fo EE
[562] Conclusão: O fragmento de molécula pequena da presente invenção tem atividade inibitória óbvia na proliferação de células SK- BR-3 e células U87, e o centro quiral tem certa afecção na atividade inibidora do composto.
Exemplo de teste 2: Teste in vitro da inibição do presente conjugado fármaco-anticorpo direcionado a HER2 na proliferação de cé- lulas tumorais
[563] O objetivo deste teste é testar o efeito de inibição in vitro do presente conjugado fármaco-anticorpo direcionado a HER2 na prolife- ração de células SK-BR-3 (células de câncer de mama humano, ATCC, artigo número HTB-30) e células MDA-MB-468 (células de câncer de mama humano, ATCC, artigo número HTB-132). As células foram trata- das com diferentes concentrações dos compostos in vitro. Após 6 dias de cultivo, a proliferação celular foi determinada pelo reagente CTG, e a atividade in vitro dos compostos foi avaliada de acordo com o valor
IC50.
[564] De acordo com o método de teste do Exemplo de Teste 1, as células de teste eram células SK-BR-3 e células MDA-MB-468, e o meio de cultura de células era meio 5A de McCoy contendo 10% de FBS (Gibco, artigo número 16600-108), meio EMEM contendo 10% de FBS (GE, artigo número SH30024,01) e meio L-15 contendo 10% de FBS (ThermorFisher, artigo número 11415-114). As densidades de células vi- áveis das três linhagens de células foram ajustadas para 8,33 x 10º cé- lulas/ml, 8,33 x 103º células/ml e 1,39 x 10º células/ml com o meio de cultura de células, respectivamente. A suspensão de células com densi- dade ajustada foi bem misturada e adicionada a uma placa de cultura de células de 96 poços a 180 ul/poço. Compostos relacionados foram testados e os resultados são mostrados na tabela abaixo. Tabela 2 Valor de IC”º de inibição in vitro do presente conjugado fár- maco-anticorpo direcionado a HER2 na proliferação de células tumorais sem Fc No. do Composto
[565] Conclusão: o conjugado anticorpo-fármaco direcionado a HER?2 da presente invenção tem atividade inibitória óbvia na prolifera- ção de células SK-BR-3 positivas para HER2. Enquanto isso, tem baixa atividade inibitória na proliferação de células MDA-MB-468 negativas para HER2. Portanto, tem boa seletividade.
Exemplo de teste 3: Teste de estabilidade de plasma Her2-
ADC
[566] Amostra ADC-19, amostra ADC-18, amostra ADC-20, plasma humano, plasma de macaco (Shanghai Medicilon Inc.) e solução de BSA (Sigma) PBS a 1% (Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.) foram filtrados respectivamente através de um filtro de 0,22 um para esterili- zação. ADC-19, ADC-18 e ADC-20 foram adicionados ao plasma estéril acima ou solução de BSA PBS a 1% a uma concentração final de 200 pg/ml, respectivamente, que foi então incubado em uma incubadora de células a 37 ºC, e o dia inicial da incubação foi registrado como Dia O. As amostras foram coletadas no Dia 7, Dia 14 e Dia 21 para detecção de toxina livre cção.
[567] 25 ul de amostra foram adicionados a uma placa de 96 poços. 50 uL de solução de trabalho de padrão interno (100 ng/mL de campto- tecina em acetonitrila) e 150 ul de acetonitrila foram adicionados. A so- lução foi agitada com vórtex por 5 minutos e centrifugada por 10 minutos (4000 rpm). 5 ul da solução foram retirados para análise LC/MS/MS (Ap- plied Biosystems, Inc., EUA).
[568] Os resultados mostram que ADC-19 é bastante estável em plasma humano, plasma de macaco e solução de BSA PBS a 1%. Ataxa de liberação de toxina livre não excedeu 2,1% e tornou-se estável no Dia 14. Os resultados são mostrados na Figura 1A.
[569] ADC-18 tem baixa estabilidade em plasma humano e plasma de macaco, e a maior taxa de liberação de toxina livre foi de 14,5% e 8,10%, respectivamente. É estável em solução de PBS BSA a 1%. Os resultados são mostrados na Figura 1B.
[570] ADC-20 tem baixa estabilidade em plasma humano, plasma de macaco e solução de BSA PBS a 1%, e a maior taxa de liberação de toxina livre foi de 21,7%, 29,7% e 21,7%, respectivamente. Ele estava sempre em um estado de degradação em solução BSA PBS a 1%. Os resultados são mostrados na Figura 1C.
Exemplo de Teste 4: Avaliação da eficácia em camundongos com tumor JIMT-1 |. Objetivo do teste
[571] Camundongos nus Nunu foram usados como o animal de teste para avaliar a eficácia do anticorpo Her2-ADC T-DM1, ADC-21 e ADC-24 em camundongos nus de tumor de mama humano resistentes a trastuzumab (Herceptina) da cepa de tumor transplantado JIMT-1 após injeção intraperitoneal.
Il. Fármacos e materiais de teste
1. Teste de fármacos T-DM1 (preparado com referência ao pedido de patente US20050169933) ADC-21: 3 mg/kg ADC-21: 10 mg/kg ADOC-24: 3 mg/kg ADOC-24: 10 mg/kg Branco: PBS
2. Método de formulação: as drgas foram todas diluídas e formuladas com PBS.
3. Animais de teste
[572] Camundongos nus Nunu, adquiridos de Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.
Il. Método de teste
[573] Células JIMT-1 (Nanjing Cobioer Biosciences Co., Ltd.) (5 x 106 células/camundongo, tendo 50% de matrigel) foram inoculadas por via subcutânea na costela direita do camundongo. Após o tumor crescer por 8 dias e atingir 203,09 + 11,94 mm3, os animais foram agrupados aleatoriamente em 6 grupos com 8 animais por grupo (d1).
[574] Os fármacos foram administradas por injeção intraperitoneal por um total de 2 vezes. O volume do tumor e o peso corporal foram medidos duas vezes por semana e os dados foram registrados.
[575] O software estatístico Excel 2003 foi usado para estatísticas de dados: o valor médio foi calculado como média; O valor SD foi calcu- lado como STDEV; O valor SEM foi calculado como STDEV/SQRT; O valor P entre os diferentes grupos foi calculado como TTEST.
Volume do Tumor (V) foi calculado como: V=1/2xLCompri- mentoxLcurto? Volume relativo (RTV) = Vr/Vo
[576] Taxa de inibição do tumor (%) = (Crtv-Trtv)/Crtv (%), em que Vo e Vr representam o volume do tumor no início e no final do teste, respectivamente. Crtv e Trrv representam o volume relativo do tumor do grupo de controle em branco (Veículo, PBS) e o grupo de teste no final do teste, respectivamente.
4. Resultado dos testes
[577] Os resultados do teste são mostrados na Figura 2. Os fár- macos foram administradas por injeção intraperitoneal por 2 vezes, e o teste terminou no Dia 34 de observação. T-DM1 (10 mg/kg) não mostra nenhum efeito de inibição no tumor; ADC-21 (3 mg/kg) mostra uma taxa de inibição do tumor de 46,22% (P < 0,01); ADC-21 (10 mg/kg) mostra uma taxa de inibição do tumor de 56,77% (P < 0,001); ADC-24 (3 mg/kg) mostra uma taxa de inibição do tumor de 62,77% (P < 0,001); e ADC-24 (10 mg/kg) mostra uma taxa de inibição do tumor de 76,32% (P < 0,001). Com a mesma dose, o efeito de inibição tumoral do ADC-24 é significa- tivamente melhor do que o do ADC-21.
Exemplo de teste 5: Avaliação da eficácia em camundongos portadores de tumor SK-BR-3 |. Objetivo do teste
[578] Camundongos nus Nunu foram usados como o animal de teste para avaliar a eficácia do anticorpo Her2-ADC ADC-21 e ADC-22 em camundongos nus de tumor transplantado da cepa de células de câncer de mama humano SK-BR-3 após injeção intraperitoneal.
Il. Fármacos e materiais de teste
1. Teste de fármacos ADC-21: 1 mg/kg ADC-21: 6 mg/kg ADC-22: 1 mg/kg ADC-22: 6 mg/kg Branco: PBS
2. Método de formulação: os fármacos foram todas diluídas e formuladas com PBS.
3. Animais de teste
[579] Camundongos nus Nunu, adquiridos de Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.
111. Método de teste
[580] Células SK-BR-3 (ATCC) (5 x 1086 células/camundongo, tendo 50% de matrigel) foram inoculadas por via subcutânea na costela direita de camundongo. Após o tumor crescer por 20 dias e atingir 153,34 + 11,73 mm?, os animais foram agrupados aleatoriamente em 5 grupos com 8 animais por grupo (dO).
[581] Os fármacos foram administradas por injeção intraperitoneal uma vez. O volume do tumor e o peso corporal foram medidos duas vezes por semana e os dados foram registrados.
[582] O software estatístico Excel 2003 foi usado para estatísticas de dados: o valor médio foi calculado como média; O valor SD foi calcu- lado como STDEV; O valor SEM foi calculado como STDEV/SQRT; O valor P entre os diferentes grupos foi calculado como TTEST.
[583] O volume do tumor (V) foi calculado como: V=1/2xLCompri- mentoxLcurto?
Volume relativo (RTV) = Vr/Vo Taxa de inibição do tumor (%) = (Crtv-Trtv)/Crtv (%), em que Vo e Vr representam o volume do tumor no início e no final do teste, respectivamente. Crtv e Trrv representam o volume de tumor relatico do grupo de controle em branco e do grupo de teste no final do experimento, respectivamente.
4. Resultado dos testes
[584] Os resultados do teste são mostrados na Figura 3. Os fár- macos foram administradas por injeção intraperitoneal uma vez e o teste terminou no Dia 28 de observação. ADC-21 (1 mg/kg) mostra uma taxa de inibição do tumor de 15,01%; e ADC-21 (6 mg/kg) mostra uma taxa de inibição do tumor de 77,4%, que difere significativamente do controle em branco (P < 0,001). ADC-22 (1 mg/kg) mostra uma taxa de inibição do tumor de 19,82%; e ADC-22 (6 mg/kg) mostra uma taxa de inibição do tumor de 98,38% (P < 0,001). Com a mesma dose de 6 mg/kg, o efeito de inibição tumoral do ADC-22 é significativamente melhor do que o do ADC-21.
Exemplo de Teste 6: Teste de estabilidade do plasma
[585] A amostra de ADC-25 foi bem misturada com plasma hu- mano, plasma de macaco e solução de BSA PBS a 1%, respectivamente, a uma concentração final de 100 pg/ml e filtrada para esterilização. A mistura foi incubada em banho-maria a 37 ºC e o dia inicial da incubação foi registrada como Dia 0. As amostras foram coletadas no Dia 7, Dia 14 e Dia 21 para detecção de toxina livre.
[586] As amostras coletadas em diferentes pontos de tempo foram resfriadas à temperatura ambiente e bem misturadas por vórtice. 25 ul de amostra foram adicionados a uma placa de 96 poços. 50 uL de solu- ção de trabalho de padrão interno (100 ng/mL de camptotecina em ace- tonitrila) e 150 ul de acetonitrila foram adicionados. A solução foi agitada com vórtex por 5 minutos e centrifugada por 10 minutos (4000 rpm). 5 ul da solução foram retirados para análise LC/MS/MS.
[587] Os resultados são mostrados na Figura 4. ADC-25 é bas- tante estável em plasma humano, plasma de macaco e solução de BSA PBS a 1%. A taxa de liberação de toxina livre não excedeu 2% e tornou- se estável no Dia 14.
Exemplo de teste 7: Avaliação da eficácia de ADC em tumor de xenoenxerto de astroblastoma U87MG de cérebro humano em ca- mundongos nus |. Objetivo do teste
[588] Camundongos nus BALB/cA foram usados como o animal de teste para avaliar a eficácia do composto ADC da presente invenção no tumor de xenoenxerto de astroblastoma U87MG de cérebro humano em camundongos nus.
Il. Fármacos e materiais de teste
1. Teste de fármacos ADC-27 (3 mg/kg) ADOC-26 (3 mg/kg) Branco: solução tampão PBS (pH 7,4)
2. Método de formulação: solução tampão PBS (pH 7,4).
3. Animais de teste Camundongos nus BALB/cA, adquiridos de Shanghai JieSi- Jie Laboratory Animal Co., Ltd.
111. Método de teste
[589] Camundongos nus BALB/cA (fêmeas, 6 a 7 semanas de idade) foram usados no teste. Células de astroblastoma de cérebro hu- mano U87MG (astroblastoma de cérebro humano, banco de células da Academia Chinesa de Ciências, Catálogo % TCHu138) foram inoculadas por via subcutânea. No dia 10 após a inoculação, os animais foram agru- pados aleatoriamente em 8 animais por grupo (DO), e os fármacos foram administradas por injeção intraperitoneal uma vez por semana por 3 ve- zes. O volume do tumor e o peso corporal foram medidos 2 a 3 vezes por semana, e os dados foram registrados. A fórmula de cálculo do vo- lume do tumor (V) é a seguinte: V=1/2xaxb? em que a e b representam comprimento e largura, respecti- vamente.
Volume relativo (RTV) = Vr/Vo Taxa de inibição do tumor (%) = (Crtv — Trtvy)/Crtv (%) em que Vo e Vr representam o volume do tumor no início e no final do teste, respectivamente. Crtv e Trrv representam o volume do tumor relativo do grupo de controle (branco) e do grupo de teste no final do teste, respectivamente.
4. Resultado dos testes
[590] A administração por injeção intraperitoneal (i.p.) foi realizada uma vez por semana por 3 vezes. No Dia 22 da observação, a taxa de inibição do tumor de ADC-27 (3 mg/kg) atingiu 63,3% (P < 0,0001) e a taxa de inibição tumoral de ADC-26 (3 mg/kg) atingiu 49,1%. ADC-27 mostra eficácia antitumoral mais forte do que ADC-26.
[591] Durante a administração, os animais em cada grupo apre- sentam pesos corporais normais, sugerindo que a ADC não tem efeitos colaterais óbvios. Os resultados do teste são mostrados na Tabela 3 e Figura 5. Os anticorpos testados podem inibir efetivamente o cresci- mento do tumor de xenoenxerto U87MG em camundongos nus porta- dores de tumor e mostram uma maneira dependente da dose. Tabela 3 Eficácia do anticorpo administrado no tumor de xenoenxerto de astroblastoma U87MG de cérebro humano em camundongos nus (D22) PE pr pa pre pe Er e e es e e e |
FF Fr FrFFEFE Fr) Exemplo de teste 8: Avaliação da eficácia de ADC em tumor de xenoenxerto de células metastáticas Detroit 562 de carcinoma da faringe humano em células metastáticas de camundongos nus |. Objetivo do teste
[592] Camundongos nus BALB/cA foram usados como o animal de teste para avaliar a eficácia do composto ADC da presente invenção no tumor xenoenxerto de células metastáticas Detroit 562 de carcinoma da faringe humana em células metastáticas de camundongos nus.
Il. Fármacos e materiais de teste
1. Teste de fármacos ADC-29 (3mg/kg) ADC-28 (3mg/kg) Controle negativo ADC (3mg/kg): conjugado ligante-toxina formado por acoplamento de alvo não B7H3 com o composto 20.
2. Método de formulação: os medicamentos foram todos di- luídos e formulados com PBS.
3. Animais de teste
[593] BALB/cA-nude ratos nus, adquiridos de Changzhou Cavens Laboratory Animal Co., Ltd.
111. Método de teste
[594] Camundongos nus BALB/cA (fêmeas, 6 a 7 semanas de idade) foram usados no teste. Células metastáticas do fluido pleural de carcinoma da faringe humana Células Detroit 562 (ATCC, Catálogo t ATCCO CCL-138 TY) foram inoculadas por via subcutânea. No dia 10 após a inoculação, os animais foram agrupados aleatoriamente em 8 animais por grupo (DO), e os fármacos foram administradas por injeção intraperitoneal uma vez por semana por 3 vezes. O volume do tumor e o peso corporal foram medidos 2 a 3 vezes por semana, e os dados foram registrados. A fórmula de cálculo do volume do tumor (V) é a se- guinte: V=1/2xaxb? em que a e b representam comprimento e largura, respecti- vamente.
Volume relativo (RTV) = Vr/Vo Taxa de inibição do tumor (%) = (Crtv — Trtvy)/Crtv (%) em que Vo e Vr representam o volume do tumor no início e no final do teste, respectivamente. Crtv e Trrv representam o volume relativo do tumor do grupo de controle (controle negativo) e do grupo de teste no final do teste, respectivamente.
4. Resultado dos testes
[595] A administração por injeção intraperitoneal foi realizada uma vez por semana por 3 vezes. No Dia 28 da observação, a taxa de inibi- ção do tumor de ADC-29 (3 mg/kg, 3 mpk) atingiu 72,27% (P < 0,001); e a taxa de inibição tumoral de ADC-28 (3 mg/kg, 3mpk) atingiu 56,2% (P < 0,001). ADC-29 mostra eficácia antitumoral mais forte do que ADC-
28.
[596] Durante a administração, os animais em cada grupo apre- sentaram pesos corporais normais, sugerindo que a ADC não tem efei- tos colaterais óbvios. Os resultados do teste são mostrados na Tabela 4 e Figura 6. Os anticorpos testados podem inibir efetivamente o cresci- mento do tumor de xenoenxerto Detroit 562 em camundongos nus por- tadores de tumor e mostram uma maneira dependente da dose. Tabela 4. Eficácia do anticorpo administrado no tumor de xenoenxerto Detroit 562 em camundongos nus com tumor (D28) Eme EEE r EL
Exemplo de teste 9: Avaliação da eficácia em camundongos com tumor U87-MG |. Objetivo do teste
[597] Camundongos nus BALB/c foram usados como o animal de teste para avaliar a eficácia do conjugado B7H3-anticorpo-fármaco ad- ministrado por injeção intraperitoneal em modelo de tumor de xenoen- xerto de células de glioma humano U87MG.
Il. Fármacos e materiais de teste
1. Teste de fármacos ADC-30 1 mg/kg ADC-30 3 mg/kg ADC-31 1 mg/kg ADC-31 3 mg/kg Branco: PBS
2. Método de formulação: os medicamentos foram todos di- luídos e formulados com PBS.
3. Animais de teste Camundongos nus BALB/cA, adquiridos de Shanghai Slac Laboratory Animal Co. Ltd.
Il. Método de teste
[598] Células U87MG (astroblastoma de cérebro humano, banco de células da Academia Chinesa de Ciências, Catálogo tt TOHu138) (2,5 x 106 células/camundongo) foram inoculadas por via subcutânea na costela direita do camundongo. Após o tumor crescer por 14 dias e atin- gir 167,49 mm3, os animais foram agrupados aleatoriamente em 5 gru- pos com 8 animais por grupo (d1).
[599] Os fármacos foram administradas por injeção intraperitoneal uma vez por semana em um total de 3 vezes. O volume do tumor e o peso corporal foram medidos duas vezes por semana e os dados foram registrados.
[600] O software estatístico Excel 2003 foi usado para estatísticas de dados: o valor médio foi calculado como média; O valor SD foi calcu- lado como STDEV; O valor SEM foi calculado como STDEV/SQRT; O valor P entre os diferentes grupos foi calculado como TTEST.
[601] O volume do tumor (V) foi calculado como: V=1/2xLCompri- mentox*Lcurto? Volume relativo (RTV) = Vr/Vo Taxa de inibição do tumor (%) = (Crtv — Trtvy)/Crtv (%) em que Vo e Vr representam o volume do tumor no início e no final do teste, respectivamente. Crtv e Trrv representam o volume relativo do tumor do grupo de controle em branco (Veículo) e o grupo de teste no final do teste, respectivamente.
4. Resultado dos testes
[602] Os resultados do teste são mostrados na Figura 7. A admi- nistração por injeção intraperitoneal foi realizada uma vez por semana por um total de 3 vezes. No Dia 18 da observação, a taxa de inibição tumoral de ADC-30 (1 mg/kg) atingiu 0,31%; a taxa de inibição tumoral de ADC-30 (3 mg/kg) atingiu 45,23% (P < 0,0001); a taxa de inibição tumoral de ADC-31 (1 mg/kg) atingiu 39,22% (P < 0,01); e a taxa de inibição tumoral de ADC-31 (3 mg/kg) atingiu 80,24% (P < 0,0001). Com a mesma dose, o efeito de inibição do tumor do ADC-31 é significativa- mente melhor do que o do ADC-30.
REIVINIDICAÇÕES
1. Conjugado fármaco-ligante ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo, caracterizado pelo fato de que o conju- gado fármaco-ligante compreende uma estrutura de Fórmula (-D): e CH NT ; SS A) Ao (D) em que: Y é selecionado a partir do grupo consistindo em -O- (CRºRP)Mm-CRIR2-C(0)-, -O-CRIR2-= (CRºRP)m-, -O-CRIR2-, -NH- (CRºR?)n-CRIR2-C(O)- e -S-(CRºRP)m-CR!R2-C(O)-; Rº e RP são idênticos ou diferentes e são, cada um, indepen- dentemente selecionados a partir do grupo consistindo em átomo de hidrogênio, átomo de deutério, halogênio, alquila, haloalquila, alquila deuterada, alcóxi, hidróxi, amino, ciano, nitro, hidroxialquila, cicloalquila e heterociclila; ou, Re Rº juntos com o átomo de carbono ao qual eles es- tão ligados formam uma cicloalquila ou heterociclila; R' é selecionado a partir do grupo consistindo em halogênio, alquila deuterada, cicloalquila, cicloalquilalquila, alcoxialquila, heteroci- clila, arila e heteroarila; R? é selecionado a partir do grupo consistindo em átomo de hidrogênio, halogênio, haloalquila, alquila deuterada, cicloalquila, ciclo- alquilalquila, alcoxialquila, heterociclila, arila e heteroarila; ou, R' e R? juntos com o átomo de carbono ao qual eles es- tão ligados formam uma cicloalquila ou heterociclila; ou, Re R? juntos com o átomo de carbono ao qual eles es- tão ligados formam uma cicloalquila ou heterociclila; em que, a linha ondulada na Fórmula -D representa um átomo de hidrogênio, ou uma ligação covalente a uma unidade ligadora ou um anticorpo que se liga ao antígeno expresso pela célula alvo; m é um inteiro de 0 a 4.
2. Conjugado fármaco-ligante ou o sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo de acordo com a reivinidicação 1, carac- terizado pelo fato de que o conjugado fármaco-ligante compreende uma estrutura de Fórmula (-D1): o t Fe o
A F A-mOH o, em que: R' é uma cicloalquilalquila ou cicloalquila, e preferivelmente C3-6 cicloalquilalquila ou Ca-6 cicloalquila; R? é selecionado a partir do grupo consistindo em átomo de hidrogênio, haloalquila e C3. cicloalquila, e preferivelmente átomo de hidrogênio; ou, R'e R? juntos com o átomo de carbono ao qual eles es- tão ligados formam uma Cz.6 cicloalquila; a linha ondulada representa um átomo de hidrogênio, ou uma ligação covalente a uma unidade ligadora ou um anticorpo que se liga ao antígeno expresso pela célula alvo; mébOou1.
3. Conjugado fármaco-ligante ou o sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo de acordo com a reivinidicação 1, carac- terizado pelo fato de que é um conjugado fármaco-ligante de Fórmula (Pc-L-Y-Dr) ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo:
(PL Y-DN em que: Y é selecionado a partir do grupo consistindo em -O- (CRºRP)Mm-CRIR2-C(O0)-, — -O-CRIR2-(CRºR?)m-, — -O-CRIR2, — -NH- (CRºR?)n-CRIR2-C(O)- e -S-(CRºRP)m-CR!R2-C(O)-; Rº e RP são idênticos ou diferentes e são, cada um, indepen- dentemente selecionados a partir do grupo consistindo em átomo de hidrogênio, átomo de deutério, halogênio, alquila, haloalquila, alquila deuterada, alcóxi, hidróxi, amino, ciano, nitro, hidroxialquila, cicloalquila e heterociclila; ou, Re Rº juntos com o átomo de carbono ao qual eles es- tão ligados formam uma cicloalquila ou heterociclila; R' é selecionado a partir do grupo consistindo em halogênio, haloalquila, alquila deuterada, cicloalquila, cicloalquilalquila, alcoxial- quila, heterociclila, arila e heteroarila; R? é selecionado a partir do grupo consistindo em átomo de hidrogênio, halogênio, haloalquila, alquila deuterada, cicloalquila, ciclo- alquilalquila, alcoxialquila, heterociclila, arila e heteroarila; ou, R' e R? juntos com o átomo de carbono ao qual eles es- tão ligados formam uma cicloalquila ou heterociclila; ou, Re R? juntos com o átomo de carbono ao qual eles es- tão ligados formam uma cicloalquila ou heterociclila; m é um inteiro de 0 a 4; n é 1 a 10, que pode ser um inteiro ou um decimal; Pc é um ligante; e L é uma unidade ligadora.
4. Conjugado fármaco-ligante ou o sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo de acordo com a reivinidicação 3,
caracterizado pelo fato de que: Y é -O-(CRºRP)M-CRIR2-C(O)-; Rº e R? são idênticos ou diferentes e são, cada um, indepen- dentemente selecionados a partir do grupo consistindo em átomo de hidrogênio, átomo de deutério, halogênio e alquila; R' é uma C3.6 cicloalquilalquila ou C3-6 cicloalquila; R? é selecionado a partir do grupo consistindo em átomo de hidrogênio, haloalquila e C3. cicloalquila, e preferivelmente átomo de hidrogênio; ou, R' e R? juntos com o átomo de carbono ao qual eles es- tão ligados formam uma Cz.6 cicloalquila; mébOou1.
5. Conjugado fármaco-ligante ou o sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que Y é selecionado a partir do grupo consistindo em: o o to, de DE 1d 0X ax Ra ; ; OMAN o, O e o.
6. Conjugado fármaco-ligante ou o sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o terminal O de Y é co- nectado à unidade ligadora L.
7. Conjugado fármaco-ligante ou o sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo de acordo com a reivinidicação 1, carac- terizado pelo fato de que é um conjugado fármaco-ligante de Fórmula (Pc-L-D1) ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo:
(Pel-D1) em que: R' é uma C3.6 cicloalquilalquila ou C3-6 cicloalquila; R? é selecionado a partir do grupo consistindo em átomo de hidrogênio, haloalquila e C3. cicloalquila, e preferivelmente átomo de hidrogênio; ou, R' e R? juntos com o átomo de carbono ao qual eles es- tão ligados formam uma Cz.6 cicloalquila; mébou; n é 1 a 10, que pode ser um inteiro ou um decimal; Pc é um ligante; e L é uma unidade ligadora.
8. Conjugado fármaco-ligante ou o sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 3 a 7, caracterizado pelo fato de que n é 2 a 8, que pode ser um inteiro ou um decimal; e preferivelmente n é 3 a 8, que pode ser um inteiro ou um decimal.
9. Conjugado fármaco-ligante ou o sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 3 a 8, caracterizado pelo fato de que a unidade ligadora -L- é LI-L2-L3-L-, L' é selecionado a partir do grupo consistindo em -(succini- mida-3-il-N)-W-C(O)-, -CH2-C(O)-NRº$-W-C(O)- e -C(O)-W-C(O)-, em que W é selecionado a partir do grupo consistindo em C1-8 alquila, C1-8 alquil-cicloalquila e heteroalquila linear compreendendo 1 a 8 átomo(s), a heteroalquila compreende 1 a 3 heteroátomo(s) selecionados a partir do grupo consistindo em N, O e S, em que a C1.6 alquila, cicloalquila e heteroalquila linear são cada uma independente, opcional e ainda subs- tituídas por um ou mais substituinte(s) selecionados a partir do grupo consistindo em halogênio, hidróxi, ciano, amino, alquila, cloroalquila, al- quila deuterada, alcóxi e cicloalquila; L? é selecionado a partir do grupo consistindo em - NR*(CH2CH20)p! CH2CH2C(O)-, -NR*(CH2CH20)p? CH2C(O)-, - S(CH2)p'C(O)- e uma ligação química, em que p'* é um inteiro de 1 a 20; e L? é preferivelmente uma ligação química; Lô é um resíduo de peptídeo composto de 2 a 7 aminoácidos, em que os aminoácidos são opcional e ainda substituídos por um ou mais substituinte(s) selecionados a partir do grupo consistindo em halo- gênio, hidróxi, ciano, amino, alquila, cloroalquila, alquila deuterada, alcóxi e cicloalquila; L* é selecionado a partir do grupo consistindo em - NR%(CR6Rº).-, -C(O)NRS, -C(O)NR%(CH2):- e uma ligação química, em que t é um inteiro de 1 a 6; e Lº é preferivelmente -NRº(CRºR”)t-; R3, Rº e Rº são idênticos ou diferentes e são, cada um, inde- pendentemente selecionados a partir do grupo consistindo em átomo de hidrogênio, alquila, haloalquila, alquila deuterada e hidroxialquila; R$ e R7 são idênticos ou diferentes e são, cada um, indepen- dentemente selecionados a partir do grupo consistindo em átomo de hidrogênio, halogênio, alquila, haloalquila, alquila deuterada e hidroxial- quila.
10. Conjugado fármaco-ligante ou o sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo de acordo com a reivinidicação 9, carac- terizado pelo fato de que L' é selecionado a partir do grupo consistindo em -(succinimida-3-il-N)-(CH2)s!-C(O)-, -(succinimida-3-il-N)-CH>-ciclo- hexil-C(O)-, -(succinimida-3-il-N)-(CH2CH20)s?-CH2CH2-C(O0)-, -CHa- C(O)-NRº-(CH2)s?*-C(O)- e -C(O0)-(CH2)s*C(O)-, em que s' é um inteiro de 2 a 8, sº é um inteiro de 1 a 3, sº é um inteiro de 1 a 8, e st é um inteiro de 1 a 8.
11. Conjugado fármaco-ligante ou o sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo de acordo com a reivinidicação 9 ou 10, caracterizado pelo fato de que L? é selecionado a partir do grupo con- sistindo em -NR*(CH2CH2O0)p' CH2C(O)- e uma ligação química, em que p' é um inteiro de 6 a 12.
12. Conjugado fármaco-ligante ou o sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 9 a 11, caracterizado pelo fato de que Lº é selecionado a partir de -NRº(CR6ºR”).-, Rº é selecionado a partir do grupo consistindo em átomo de hidrogênio e alquila, R$ e R7 são idênticos ou diferentes e são, cada um, independentemente selecionados a partir do grupo consis- tindo em átomo de hidrogênio e alquila, t é 1 ou 2, e preferivelmente 2.
13. Conjugado fármaco-ligante ou o sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 9 a 12, caracterizado pelo fato de que Lº é um resíduo de pep- tídeo composto de 2 a 7 aminoácidos selecionados a partir do grupo consistindo em fenilalanina, glicina, valina, lisina, citrulina, serina, ácido glutâmico e ácido aspártico, preferivelmente o resíduo de tetrapeptídeo, e mais preferivelmente o resíduo de tetrapeptídeo de glicina-glicina-fe- nilalanina-glicina.
14. Conjugado fármaco-ligante ou o sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 3 a 13, caracterizado pelo fato de que a unidade ligadora -L- é LI-L2-L3-L-, o XÁ, de Liis O * estéuminteirode2a8; L? é uma ligação química; Lô é um resíduo de tetrapeptídeo;
Lº é -NR(CRºR”):-, Rº é selecionado a partir do grupo con- sistindo em átomo de hidrogênio e alquila, R$ e R7 são idênticos ou di- ferentes e são, cada um, independentemente selecionados a partir do grupo consistindo em átomo de hidrogênio e alquila, e té 1 ou 2.
15. Conjugado fármaco-ligante ou o sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 3 a 13, caracterizado pelo fato de que a unidade ligadora -L- é LI-L2-L3-L-, L' é -(succinimida-3-il-N)-CH>a-ciclohexil-C(O)-; L? é -NR(CH2CH20)aCH2C(O)-; Lô é um resíduo de tetrapeptídeo; Lº é -NRS(CR6R)t-, Rº é selecionado a partir do grupo con- sistindo em átomo de hidrogênio e alquila, Rô e R7 são idênticos ou di- ferentes e são, cada um, independentemente selecionados a partir do grupo consistindo em átomo de hidrogênio e alquila, e té 1 ou 2.
16. Conjugado fármaco-ligante ou o sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 9 a 15, caracterizado pelo fato de que o L' terminal de uma unidade ligadora -L- é conectado ao ligante, e the Lº terminal de uma unidade ligadora -L- é conectado a Y.
17. Conjugado fármaco-ligante ou o sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 3 a 16, caracterizado pelo fato de que -L-Y- é: 6 RI o epa
R em que L' é selecionado a partir do grupo consistindo em - (succinimida-3-il-N)-(CH2)s'-C(O)- e -(succinimida-3-il-N)-CH2-ciclohe- xil-C(O)-; L? é -NR*(CH2CH20)p! CH2C(O)- ou uma ligação química, e p' é um inteiro de 6 a 12;
Lô é um resíduo de tetrapeptídeo de GGFG; R' é uma Ca.6 cicloalquilalquila ou C3.6 cicloalquila; R? é selecionado a partir do grupo consistindo em átomo de hidrogênio, haloalquila e C3.6 cicloalquila; ou, R'e R? juntos com o átomo de carbono ao qual eles es- tão ligados formam uma Cz.6 cicloalquila; R5, Rº e R7 são idênticos ou diferentes e são, cada um, inde- pendentemente selecionados a partir do grupo consistindo em átomo de hidrogênio e alquila; s! é um inteiro de 2a 8; m é um inteiro de 0 a 4.
18. Conjugado fármaco-ligante ou o sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo de acordo com a reivinidicação 17, ca- racterizado pelo fato de que -L-Y- é: 9 ua SE ond, o RR
SO o L? é -NR(CH2CH20)aCH2C(O)-; Lô é um resíduo de tetrapeptídeo de GGFG; R' é uma Ca.6 cicloalquilalquila ou C3.6 cicloalquila; R? é selecionado a partir do grupo consistindo em átomo de hidrogênio, haloalquila e C3.6 cicloalquila; ou, R' e R? juntos com o átomo de carbono ao qual eles es- tão ligados formam uma Cz.6 cicloalquila; R5, Rº e R7 são idênticos ou diferentes e são, cada um, inde- pendentemente selecionados a partir do grupo consistindo em átomo de hidrogênio e alquila; m é um inteiro de 0 a 4.
19. Conjugado fármaco-ligante ou o sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo de acordo com a reivinidicação 17, ca- racterizado pelo fato de que -L-Y- é o RR? o
ÍA E fá À R
O R L? é uma ligação química; Lô é um resíduo de tetrapeptídeo de GGFG; R' é uma C3.6 cicloalquilalquila ou C3-6 cicloalquila; R? é selecionado a partir do grupo consistindo em átomo de hidrogênio, haloalquila e C3.6 cicloalquila; ou, R' e R? juntos com o átomo de carbono ao qual eles es- tão ligados formam uma Cz.6 cicloalquila; Rº é selecionado a partir do grupo consistindo em átomo de hidrogênio e alquila, e Rô e R? são idênticos ou diferentes e são, cada um, independentemente selecionados a partir do grupo consistindo em átomo de hidrogênio e alquila; s! é um inteiro de 2 a 8, e preferivelmente 5; m é um inteiro de 0 a 4.
20. Conjugado fármaco-ligante ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo, caracterizado pelo fato de que um con- jugado fármaco-ligante compreende uma estrutura de Fórmula (-L-Y-): o R$ R? o AA do o Ró (EL-Y-) em que: L? é uma ligação química; Lô é um resíduo de tetrapeptídeo de GGFG; R' é uma Ca.6 cicloalquilalquila ou C3.6 cicloalquila; R? é selecionado a partir do grupo consistindo em átomo de hidrogênio, haloalquila e C3.6 cicloalquila;
ou, R'e R? juntos com o átomo de carbono ao qual eles es- tão ligados formam uma Cz.6 cicloalquila; R$ é selecionado a partir do grupo consistindo em átomo de hidrogênio e alquila, e Rô e R? são idênticos ou diferentes e são, cada um, independentemente selecionados a partir do grupo consistindo em átomo de hidrogênio e alquila; s! é um inteiro de 2a 8; m é um inteiro de 0 a 4.
21. Conjugado fármaco-ligante ou o sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que é um conjugado fármaco- ligante de Fórmula (Pc-La-Y-Dr) ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo: ros wo , "OH (Pe-L,y-Y-D) o em que: W é selecionado a partir do grupo consistindo em C1-8 alquila, C'1-8 alquil-cicloalquila e heteroalquila linear compreendendo 1 a 8 átomo(s), a heteroalquila compreende 1 a 3 heteroátomo(s) seleciona- dos a partir do grupo consistindo em N, O e S, em que a C1.68 alquila, cicloalquila e heteroalquila linear são cada uma independente, opcional e ainda substituídas por um ou mais substituinte(s) selecionados a partir do grupo consistindo em halogênio, hidróxi, ciano, amino, alquila, cloro- alquila, alquila deuterada, alcóxi e cicloalquila; L? é selecionado a partir do grupo consistindo em - NR*(CH2CH20)p?' CH2CH2C(O)-, -NR$(CH2CH20)p?' CH2C(O)-, - S(CH2)p'C(O)- e uma ligação química, em que p' é um inteiro de 1 a 20; Lô é um resíduo de peptídeo composto de 2 a 7 aminoácidos,
em que os aminoácidos são opcional e ainda substituídos por um ou mais substituinte(s) selecionados a partir do grupo consistindo em halo- gênio, hidróxi, ciano, amino, alquila, cloroalquila, alquila deuterada, alcóxi e cicloalquila; R' é selecionado a partir do grupo consistindo em halogênio, cicloalquilalquila, alquila deuterada, cicloalquila, heterociclila, arila e he- teroarila; R? é selecionado a partir do grupo consistindo em átomo de hidrogênio, halogênio, haloalquila, alquila deuterada, cicloalquila, hete- rociclila, arila e heteroarila; ou, R'e R? juntos com o átomo de carbono ao qual eles es- tão ligados formam uma cicloalquila ou heterociclila; Rº e R5 são idênticos ou diferentes e são, cada um, indepen- dentemente selecionados a partir do grupo consistindo em átomo de hidrogênio, alquila, haloalquila, alquila deuterada e hidroxialquila; Rô e R? são idênticos ou diferentes e são, cada um, indepen- dentemente selecionados a partir do grupo consistindo em átomo de hidrogênio, halogênio, alquila, haloalquila, alquila deuterada e hidroxial- quila; m é um inteiro de 0 a 4; n é 1 a 10, que pode ser um inteiro ou um decimal; Pc é um ligante.
22. Conjugado fármaco-ligante ou o sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo de acordo com a reivinidicação 21, ca- racterizado pelo fato de que é um conjugado fármaco-ligante de Fórmula (Pc-Ly-Y-Dr) ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo: | IS, |
E em que: s! é um inteiro de 2 a 8, e preferivelmente 5; Pc, R1, R2, R5-R7, m e n são como definidos na reivindicação
21.
23. Conjugado fármaco-ligante ou o sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 3 a 20, caracterizado pelo fato de que -L-Y- é selecionado a partir do grupo consistindo em: o o H o K o A RA ÇA Rd o o no no n o o o o o Hindy A h : ú AA LA o o n Oo H o 4 o o o H o úK o A Ny, % o H o H Oo 4 o o à o no Oo V A AA A ço o nO no 4 o o o H o K o NA No o no no 4 o o o H o K o NA Ny o H Oo H o H o o o H o K o o WA Ao NA o o o o o H o K o o AA Ny O H o H o H o A o o H Oo vw o -
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24. Conjugado fármaco-ligante ou o sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 1 a 23, caracterizado pelo fato de que é selecionado a partir do grupo consistindo em:
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25. Conjugado fármaco-ligante ou o sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 3 a 24, caracterizado pelo fato de que Pc é um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo, e o anticorpo é seleci- onado a partir do grupo consistindo em anticorpo quimérico, anticorpo humanizado e anticorpo completamente humanizado.
26. Conjugado fármaco-ligante ou o sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo de acordo com a reivinidicação 25, ca- racterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação a antí- geno do mesmo é selecionado a partir do grupo consistindo em anti- corpo anti-HER2 (ErbB2), anticorpo anti-EGFR, anticorpo anti-B7-H3, anticorpo anti-c-Met, anticorpo anti-HER3 (ErbB3), anticorpo anti-HER4 (ErbB4), anticorpo anti-CD20, anticorpo anti-CD22, anticorpo anti-CD30,
anticorpo anti-CD33, anticorpo anti-CD44, anticorpo anti-CD56, anti- corpo anti-CD70, anticorpo anti-CD73, anticorpo anti-CD105, anticorpo anti-CEA, anticorpo anti-A33, anticorpo anti-Cripto, anticorpo anti- EphA?2, anticorpo anti-G250, anticorpo anti-MUCI, anticorpo anti-Lewis Y, anticorpo anti-VEGFR, anticorpo anti- GPNMB;, anticorpo antiintegrina, anticorpo anti-PSMA, anticorpo anti-Tenascin-C, anticorpo anti- SLC44AA, anticorpo anti-Mesotelina e fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos.
27. Conjugado fármaco-ligante ou o sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo de acordo com a reivinidicação 25, ca- racterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação a antí- geno do mesmo é selecionado a partir do grupo consistindo em Tras- tuzumab, Pertuzumab, Nimotuzumab, Enoblituzumab, Emibetuzumab, Inotuzumab, Pinatuzumab, Brentuximab, Gemtuzumab, Bivatuzumab, Lorvotuzumab, cBR96 e Glematumamab, ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos.
28. Conjugado fármaco-ligante ou o sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 3 a 27, caracterizado pelo fato de que é selecionado a partir do grupo consistindo em: O x O o Hu o q o H Trastuzumab IPA, Pro O L
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O LC A Jd" / A o à o & o ' mens LAÇO,
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R o o Ho vw o H Trastuzumab: No NAN TO N o no no n 27 F O, No SN
Q O, OH n o o 9 HO H O V H Trastuzumab' No NA NA No Ô HO HS H o > O, F N sn E) O, OH n o o o Hp o Y Oo n Pertuzumab No NA AN Õ Ho HQ H o O, F N = NA) O, sSOoH n o o o "no a O nu Pertuzumal A NA ÇA E HD HD H o o, F
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FA OH n o Oo o ) o o [ dA TA aa aa rara NA no 7 o H Ho o o o Trastuzamab: AE Fases TS 6 f om | ' Jo oro Y o V ( PATA aaa rara No 7 o H Ho o o o Trasiszumab) dE IDO, L o Í | 2" do e o o 8 q H y IT on o gn on o A A A NA ÇA A. Ps Õ H H o Ho Ho. Ex
A N Trastuzumab-) [ É Ç A . | É Jo em que n é como definido na reivindicação 3.
29. Composto de Fórmula (D): " ny en, o. AZ '
D N
RR 6 won o (0) ou um tautômero, mesômero, racemato, enantiômero, dias- tereômero do mesmo, ou mistura dos mesmos, ou um sal farmaceutica- mente aceitável dos mesmos, caracterizado pelo fato de que: Y é selecionado a partir do grupo consistindo em -O-
(CRºRP)Mm-CRIR2-C(O0)-, -O-CRIR2-= (CRºRº)m -, -O-CRIR2-, -NH- (CRºR?)m-CR'R2-C(O)- e -S-(CRºRP)m-CR!R2-C(O)-; Rº e R? são idênticos ou diferentes e são, cada um, indepen- dentemente selecionados a partir do grupo consistindo em átomo de hidrogênio, átomo de deutério, halogênio, alquila, haloalquila, alquila deuterada, alcóxi, hidróxi, amino, ciano, nitro, hidroxialquila, cicloalquila e heterociclila; ou, Re Rº juntos com o átomo de carbono ao qual eles es- tão ligados formam uma cicloalquila ou heterociclila; R' é selecionado a partir do grupo consistindo em halogênio, alquila deuterada, cicloalquila, cicloalquilalquila, alcoxialquila, heteroci- clila, arila e heteroarila; R? é selecionado a partir do grupo consistindo em átomo de hidrogênio, halogênio, haloalquila, alquila deuterada, cicloalquila, ciclo- alquilalquila, alcoxialquila, heterociclila, arila e heteroarila; ou, R'e R? juntos com o átomo de carbono ao qual eles es- tão ligados formam uma cicloalquila ou heterociclila; ou, Re R? juntos com o átomo de carbono ao qual eles es- tão ligados formam uma cicloalquila ou heterociclila; m é um inteiro de 0 a 4.
30. Composto de Fórmula (D) de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que é um composto de Fórmula (D1): o Ho TNH RR NÓ) CH; S/A ' 9 PD) ou um tautômero, mesômero, racemato, enantiômero, dias- tereômero do mesmo, ou mistura dos mesmos, ou um sal farmaceutica- mente aceitável dos mesmos,
em que: R' é uma C3.6 cicloalquilalquila ou Ca.6 cicloalquila; R? é selecionado a partir do grupo consistindo em átomo de hidrogênio, haloalquila e C3.6 cicloalquila; ou, R'e R? juntos com o átomo de carbono ao qual eles es- tão ligados formam uma Cz.6 cicloalquila; mébOou1.
31. Composto de Fórmula (D) de acordo com a reivindicação 29 ou 30, caracterizado pelo fato de que é selecionado a partir do grupo consistindo em: o F o ” X Ho v o F HN. 2 Ho O, 7 A N x NA a f
N F N SL / oA, oH o X voH = == oH > o o o o 1 ; 2 ; 2A Oo ; o o F ro ão HO. N Ho: fe) HN, H 2N HN, o o N = N nO= X N Sw o VÁ 9H or Ss N N ã í F fo, F o oH o OH o 2-B Oo 4 5 Ho. Oo HAN HO' O o é HN, N o 0 NA SN NE o, F O YXZN o oH / F o jon 6 7 , ,
o OE F o O» A F mo A AL A HO. Ag 1
E J H Í NM A (É A (CT Az oH Az OH
CS CAD bA OA 12-A E.) e 12-B o
32. Composto de Fórmula (La-Y-Dr): o sw O A o nl RE NH e EN o R NOS rs NE NA Ç “OH (LQY-DN O ou um tautômero, mesômero, racemato, enantiômero, dias- tereômero do mesmo, ou mistura dos mesmos, ou um sal farmaceutica- mente aceitável dos mesmos, caracterizado pelo fato de que: W é selecionado a partir do grupo consistindo em C1-8 alquila, C'1-8 alquil-cicloalquila e heteroalquila linear compreendendo 1 a 8 átomo(s), a heteroalquila compreende 1 a 3 heteroátomo(s) seleciona- dos a partir do grupo consistindo em N, O e S, em que a C1.68 alquila, cicloalquila e heteroalquila linear são cada uma independente, opcional e ainda substituídas por um ou mais substituinte(s) selecionados a partir do grupo consistindo em halogênio, hidróxi, ciano, amino, alquila, cloro- alquila, alquila deuterada, alcóxi e cicloalquila; L? é selecionado a partir do grupo consistindo em - NR*(CH2CH20)p?' CH2CH2C(O)-, -NR$(CH2CH20)p?' CH2C(O)-, - S(CH2)p'C(O)- e uma ligação química, em que p' é um inteiro de 1 a 20; Lô é um resíduo de peptídeo composto de 2 a 7 aminoácidos, em que os aminoácidos são opcional e ainda substituídos por um ou mais substituinte(s) selecionados a partir do grupo consistindo em halo- gênio, hidróxi, ciano, amino, alquila, cloroalquila, alquila deuterada, alcóxi e cicloalquila; R' é selecionado a partir do grupo consistindo em halogênio, alquila deuterada, cicloalquila, cicloalquilalquila, alcoxialquila, heteroci- clila, arila e heteroarila; R? é selecionado a partir do grupo consistindo em átomo de hidrogênio, halogênio, haloalquila, alquila deuterada, cicloalquila, ciclo- alquilalquila, alcoxialquila, heterociclila, arila e heteroarila; ou, R' e R? juntos com o átomo de carbono ao qual eles estão ligados formam uma cicloalquila ou heterociclila; Rº e Rº são idênticos ou diferentes e são, cada um, indepen- dentemente selecionados a partir do grupo consistindo em átomo de hidrogênio, alquila, haloalquila, alquila deuterada e hidroxialquila; Rô e R? são idênticos ou diferentes e são, cada um, indepen- dentemente selecionados a partir do grupo consistindo em átomo de hidrogênio, halogênio, alquila, haloalquila, alquila deuterada e hidroxial- quila; m é um inteiro de 0 a 4.
33. Composto de Fórmula (La-Y-Dr) de acordo com a reivin- dicação 32, caracterizado pelo fato de que é um composto de Fórmula (Lv-Y-Dr):
JF Dener EN ) aa (Ly Y-D) E ou um tautômero, mesômero, racemato, enantiômero, dias- tereômero do mesmo, ou mistura dos mesmos, ou um sal farmaceutica- mente aceitável dos mesmos,
em que R', R?à, R5-R”, s' e m são como definidos na reivin- dicação 32.
34. Composto de Fórmula (La-Y-Dr) de acordo com a reivin- dicação 32 ou 33, caracterizado pelo fato de que é selecionado a partir do grupo consistindo em: [ad 2 nel oe o Y A A A A a CA AA A AA AA ad
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EX QI NT ai o A o o o Y A o o o Cod AA LA io o RA A AAA AA a d s À H 3 õ E s H 3 AO N F E NE pn F sa ES ss X OH ad 4 no x o w PA AA o IX. o no no 4 o ZÉ O, FP = F " YY"
OO O, L.oH no ma 2 no o & yu ma 2 no x o yu Ge A AA AL AA no A Go A A AL AA no A
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35. Método para preparar o composto de Fórmula (D1:) ou o tautômero, mesômero, racemato, enantiômero, diastereômero do mesmo, ou mistura dos mesmos, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende a seguinte etapa de: [) H2N, NH i Aa “O o CH; E)
E ES no PI ou 2 ASI, — AN A Ae RIR? QN r Tm. À fon À mon o) o on) º e) condensar o composto de Fórmula (Y1) e o composto de Fór- mula (Dr) para obter o composto de Fórmula (D1), em que: R', Re m são como definidos na reivindicação 30.
36. Método para preparar o composto de Fórmula (Lv-Y-Dr) ou o tautômero, mesômero, racemato, enantiômero, diastereômero do mesmo, ou mistura dos mesmos, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende a seguinte etapa de: : IX DEI 7 OS (IA) o (IB) é o = NA RA Am VU AA, W/ (LyY-DO) & mom condensar o composto de Fórmula (IA) e o composto de Fór- mula (IB) para obter o composto de Fórmula (Lv-Y-Dr), em que: R', R?à, R5-R7, s' e m são como definidos na reivin- dicação 32.
37. Método para preparar o composto de Fórmula (Lv-Y-Dr) ou o tautômero, mesômero, racemato, enantiômero, diastereômero do mesmo, ou mistura dos mesmos, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende a seguinte etapa de: - HA, A = A" FÃ o un o à ORR o %WNT ) Y Faria Y Ao + VILA A % .moH (10) Õ (Dr) o e.
CASA SEA 8 S 1 PAI de No o. OO (6Y-Dr) E NANA O A oH
E condensar o composto de Fórmula (IA) e o composto de Fór- mula (IB) para obter o composto de Fórmula (Lv-Y-Dr),

Claims (1)

  1. em que: R', R?, Rº-R”, s' e m são como definidos na reivin- dicação 32.
    38. Método para preparar o conjugado fármaco-ligante de Fórmula (Pc-La-Y-Dr) ou o sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende a seguinte etapa de:
    É O RQOAAS LDA NANA, usmtniaa| o E & * CH, Pc é acoplado ao composto de Fórmula (La-Y-Dr) após redu- ção para obter o composto de Fórmula (Pc-La-Y-Dr); em que: Pc é um ligante; W, L2, Lô, R1, R2, RR”, m e n são como definidos na reivin- dicação 21.
    39. Conjugado fármaco-ligante ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo, caracterizado pelo fato de que compre- ende um ligante e um fármaco ligado ao ligante, em que um fármaco é selecionado a partir do composto como definido em qualquer uma das reivindicações 29 a 34, e o fármaco está preferivelmente ligado ao |i- gante via um ligador.
    40. Conjugado fármaco-ligante ou o sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo de acordo com a reivinidicação 39, ca- racterizado pelo fato de que um ligante é um anticorpo monoclonal.
    41. Método para preparar o conjugado fármaco-ligante ou o sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo de acordo com a reivindicação 39 ou 40, caracterizado pelo fato de que compreende uma etapa de ligar o composto como definido em qualquer uma das reivindi- cações 29 a 34 ao ligante, e preferivelmente via um ligador.
    42. Método de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que o ligante é um anticorpo monoclional.
    43. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz do conju- gado fármaco-ligante ou o sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 28 ou o composto de de Fórmula (D) ou o sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo como definido em qualquer uma das reivindica- ções 29 a 31, e veículo(s), diluente(s) ou excipiente(s) farmaceutica- mente aceitáveis.
    44. Uso do conjugado fármaco-ligante ou o sal farmaceutica- mente aceitável ou solvato do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 28, o composto de de Fórmula (D) ou o sal far- maceuticamente aceitável ou solvato do mesmo como definido em qual- quer uma das reivindicações 29 a 31, ou a composição farmacêutica como definida na reivindicação 43, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de medicamentos para tratar ou prevenir um tumor.
    45. Uso de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pelo fato de que o tumor é um câncer relacionado à expressão de HER?2, HER3, B7H3 ou EGFR.
    46. Uso do conjugado fármaco-ligante ou o sal farmaceutica- mente aceitável ou solvato do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 28, o composto de de Fórmula (D) ou o sal far- maceuticamente aceitável ou solvato do mesmo como definido em qual- quer uma das reivindicações 29 a 31, ou a composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de medicamentos para tratar e/ou prevenir um câncer, em que o câncer é preferivelmente selecionado a partir do grupo consistindo em câncer de mama, câncer de ovário, câncer cervical, câncer uterino, câncer de próstata, câncer de rim, câncer de uretra, câncer de bexiga, câncer de fígado, câncer de estômago, câncer de endométrio, câncer de glândula salivar, câncer de esôfago, melanoma, glioma, neuroblas- toma, sarcoma, câncer de pulmão, câncer de cólon, câncer retal, câncer colorretal, leucemia, câncer ósseo, câncer de pele, câncer de tireoide, câncer de pâncreas e linfoma.
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