WO2024008102A1 - Linker for conjugation - Google Patents

Linker for conjugation Download PDF

Info

Publication number
WO2024008102A1
WO2024008102A1 PCT/CN2023/105774 CN2023105774W WO2024008102A1 WO 2024008102 A1 WO2024008102 A1 WO 2024008102A1 CN 2023105774 W CN2023105774 W CN 2023105774W WO 2024008102 A1 WO2024008102 A1 WO 2024008102A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
integer
linker
drug
compound
mmol
Prior art date
Application number
PCT/CN2023/105774
Other languages
French (fr)
Inventor
Jun Wang
Ao JI
Mingzhi JIN
Jin Jin
Peiye ZOU
Tao Yu
Yingzhao HUANG
Li Yin
Original Assignee
Wuxi Xdc (Shanghai) Co., Ltd.
Wuxi Xdc Singapore Private Limited
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wuxi Xdc (Shanghai) Co., Ltd., Wuxi Xdc Singapore Private Limited filed Critical Wuxi Xdc (Shanghai) Co., Ltd.
Publication of WO2024008102A1 publication Critical patent/WO2024008102A1/en

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
    • A61K31/4738—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A61K31/4745—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems condensed with ring systems having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. phenantrolines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/68037—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a camptothecin [CPT] or derivatives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6855—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from breast cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6889—Conjugates wherein the antibody being the modifying agent and wherein the linker, binder or spacer confers particular properties to the conjugates, e.g. peptidic enzyme-labile linkers or acid-labile linkers, providing for an acid-labile immuno conjugate wherein the drug may be released from its antibody conjugated part in an acidic, e.g. tumoural or environment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/10—Tetrapeptides
    • C07K5/1002—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/1005—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/1008—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 0 or 1 carbon atoms, i.e. Gly, Ala
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Definitions

  • the present invention relates to the field of drug conjugates, and more particularly, antibody-drug conjugates.
  • ADCs Antibody-drug conjugates
  • An ADC is essentially a three component system comprising a potent drug substance linked via a degradable or non-degradable (cleavable/non-cleavable) linker to an antibody, usually monoclonal antibody mAb.
  • an ADC Upon binding to the antigen on a cell, an ADC usually is internalized, and then under the intracellular conditions, the drug is released from the antibody to take effects. Comparing to small molecules, number of ADC molecules reaching target cells are smaller, and internalization rate is also slower. Therefore a quick cleavage of the linker to release drug is desirable.
  • a linker plays a very important role in an ADC, such as in terms of ADC stability and drug release mechanism.
  • An enzyme-assisted cleavable linker such as the one in Trastuzumab deruxtecan usually comprises a short peptide (e.g., 2 ⁇ 4 amino acids) that is cleaved in lysosome once the ADC is internalized, allowing drug to be released for its cell-killing effects. How fast the linker is cleaved by an enzyme (or enzymes) thus determines how fast the drug takes effects in an already-slow ADC mechanism of action.
  • Cleavable linkers are used in most ADCs to date due to their ability of quick release of drugs in target cells.
  • brentuximab vedotin trastuzumab deruxtecan loncastuximab tesirine-lpyl all use peptidyl cleavage fragments, VC, GGFG, VA, respectively. These peptides are cleaved mainly by enzymes of the cathepsin family (cathepsin B mainly) in lysosome. The rates of cleavage vary, depending on multiple factors, including the nature of enzymes involved, the region-specification enzyme-substrate interaction, etc.
  • the linker of Trastuzumab deruxtecan contains a tetrapeptide GGFG, wherein the amide bond of the last amino acid glycine serves as the scissile bond for cleavage by lysosomal protease (e.g., cathepsin family) .
  • the rate of cleavage in the case of GGFG is not as fast as in VC.
  • the inventors designed a series of linkers, which are suitable for producing linker-payloads and ADCs with improved properties, such as increased cleavability (e.g., as demonstrated by an improved rate of cleavage) , DAR distribution, homogeneity, stability and/or therapeutically relevant efficacy.
  • the linkers and the linker-payloads comprising same allow for manufacturing ADCs via a process with improved operability and productivity, such as provision of cleaner ADC products with decreased level of leftover un-conjugated linker-payloads and/or easier removal of the leftover linker-payloads.
  • L 1 is - (CH 2 ) a -, wherein a is an integer from 0 to 10, or - (CH 2 CH 2 O) b -, wherein b is an integer from 1 to 36;
  • L 2 is - (CH 2 ) c -, wherein c is an integer from 1 to 10, or - (CH 2 CH 2 O) d -, wherein d is an integer from 1 to 36;
  • L 3 is absent, or is - (CH 2 ) e -, wherein e is an integer from 1 to 10, or - (CH 2 CH 2 O) f -, wherein f is an integer from 1 to 36;
  • R 2 is -H, -C 1-6 alkyl, or -O (CH 2 ) h CH 3 , wherein h is an integer from 0 to 3;
  • X is halo, -OR 3 or -NR 4 R 5 ;
  • R 3 is -H, -C 1-6 alkyl or halo
  • R 4 and R 5 are independently -H or -C 1-6 alkyl
  • n 0 or 1
  • an antibody-drug conjugate of formula III is provided herein:
  • a method of producing a linker-payload compound comprising conjugating a drug with a linker compound of the invention.
  • the drug is exatecan.
  • an antibody-drug-conjugate comprising
  • step (b) conjugating an antibody with the linker-payload compound obtained in step (a) .
  • Figure 1 A scheme of synthesizing linker-payload compound (also referred to as ′′Deruxtecan analog′′ in the figures) 1-7 according to a representative example of the invention.
  • Figure 2 A scheme of synthesizing linker-payload compound 3-1 according to another representative example of the invention.
  • Figure 3 A scheme of synthesizing linker-payload compound 1-1 according to another representative example of the invention.
  • Figure 4 A scheme of synthesizing linker-payload compound 1-2 according to another representative example of the invention.
  • Figure 5 A scheme of synthesizing linker-payload compound 1-3 according to another representative example of the invention.
  • Figure 6 A scheme of synthesizing linker-payload compound 1-4 according to another representative example of the invention.
  • Figure 7 A scheme of synthesizing linker-payload compound 1-8 according to another representative example of the invention.
  • Figure 8 A scheme of synthesizing linker-payload compound 3-4 according to another representative example of the invention.
  • Figure 9 (a) A schematic depiction of the site of modification (circled) and the site of cleavage (dash line) in a linker-payload compound of the invention in comparison with the native linker payload; and (b) percentage (%) of cleavage over time for the linker-payload of the invention in comparison with the native liker-payload.
  • Figure 10 (a) A schematic depiction of the site of modification (circled) and the site of cleavage (dash line) in an ADC comprising a linker-payload moiety of the invention in comparison with an ADC comprising the native linker payload moiety; and (b) percentage (%) of cleavage over time for the linker-payload moiety of the invention in ADC in comparison with cleavage of the native liker-payload moiety in ADC.
  • Figure 11 Binding affinity of ADCs comprising different linker-payload moieties to antigen Her2 on different cell lines.
  • Figure 12 Cytotoxicity of ADCs comprising different linker-payload moieties on different cell lines.
  • a value or value range with or without being preceded by the term “about” or “approximately” covers equivalents within a reasonable range of approximation as can be understood by an artisan in the related field, such as a range of ⁇ 10%, ⁇ 5%, ⁇ 3%, ⁇ 2%, ⁇ 1%or ⁇ 0.5%around the specified value.
  • the terms ′′substantially no′′ and ′′substantially free (of) ′′ with regard to presence of a scenario or a substance not only refers to absence (i.e., ′′no′′ , ′′zero′′ or ′′free (of) ′′ ) but also refers to a presence of insignificance or a presence or an amount below the limit of an assay and thus undetectable. This can be well understood by a skilled person in the art.
  • the cleavage rate of peptide linkers depends on multiple factors, such as the nature of enzymes as involved, region-specific enzyme-substrate interaction, etc.
  • linker-payloads of the invention comprising the designed linker moieties exhibited increased cathepsin B cleavage rate, either as a solitary compound or a moiety in an ADC, compared to a reference comprising an analogous existing linker moiety. It was observed that the designed linkers are more prone to enzyme cleavage, which helps to improve efficacy of ADCs.
  • ADCs comprising the linker-payload moieties of the invention may exhibit an increased stability (e.g., storage stability, such as freeze-thaw stability) and/or a comparable or even better therapeutically relevant efficacy (e.g., binding affinity and/or cytotoxicity) as compared to an existing analogous ADC.
  • stability e.g., storage stability, such as freeze-thaw stability
  • efficacy e.g., binding affinity and/or cytotoxicity
  • linker-payloads of the invention comprising the designed linker moieties can provide a cleaner product, for example, as compared with at a high drug-antibody ratio (DAR) .
  • DAR of is 7.5.
  • more linker-payload is needed in the conjugation reaction.
  • removal of the leftover linker-payloads can be onerous.
  • the linker-payloads of the invention can be more easily and completely removed, for example, as compared to deruxtecan in Enhertu, and thereby can yield cleaner ADC products. This might be explained by increased hydrophilicity of the linker-payloads of the invention.
  • linkers and linker-payloads of the present invention can provide ADC products with improved homogeneity.
  • ADCs prepared using the linker-payloads of the invention can be more easily purified.
  • the free linker-payloads left in the ADC products after conjugation are significantly decreased, for example, as compared to products produced using the linker-payload used in Accordingly, the linkers and the linker-payloads of the present invention allow for producing ADCs with improved purity, and also allow for manufacturing ADCs via a process with improved operability and productivity.
  • the term ′′linker′′ may refer to either a solitary linker compound of the invention or a linker moiety as incorporated into and thus as part of a linker-payload conjugate or an antibody-drug conjugate according to the present invention.
  • a linker moiety refers to the moiety derived from the corresponding linker compound when being incorporated in the conjugates via conjugation.
  • the present invention provides a linker compound having the structure of formula I:
  • L 1 is - (CH 2 ) a -, wherein a is an integer from 0 to10, preferably from 1 to 8, more preferably from 2 to 6 or from 4 to 5, or - (CH 2 CH 2 O) b -, wherein b is an integer from 1 to 36, preferably from 2 to 30, more preferably from 3 to 25 or from 4 to 20;
  • L 2 is - (CH 2 ) c -, wherein c is an integer from 1 to 10, preferably from 1 to 8 or 1 to 6, more preferably, from 1 to 2; or - (CH 2 CH 2 O) d -, wherein d is an integer from 1 to 36, preferably from 2 to 30, more preferably from 3 to 25 or from 4 to 20;
  • L 3 is absent, or is - (CH 2 ) e -, wherein e is an integer from 1 to 10, preferably from 1 to 8 or 1 to 6, more preferably from 1 to 2, or - (CH 2 CH 2 O) f -, wherein f is an integer from 1 to 36 preferably from 1 to 20, more preferably from 1 to 2, from 3 to 25 or from 4 to 20;
  • R 2 is -H, -C 1-6 alkyl, or -O (CH 2 ) h CH 3 , wherein h is an integer from 0 to 3, preferably R 2 is -H or -CH 3 ;
  • X is halo, -OR 3 or -NR 4 R 5 , preferably -OR 3;
  • R 3 is -H, -C 1-6 alkyl or halo, preferably -H, -CH 3 , t-butyl or Cl;
  • R 4 and R 5 are independently -H or -C 1-6 alkyl
  • n 0 or 1
  • linker compounds include Compounds L-1-1, L-1-2, L-1-3, L-1-4, L-1-7, L-1-8, L-3-1 and L-3-4 as shown below, or a pharmaceutically acceptable salt or ester thereof:
  • the designed linkers provide unique features and chemical properties.
  • a CF 3 group is introduced to the alpha position of an amine residue to generate a strong dipolar moiety at the N-side of the GGFG peptide.
  • This group most likely reduces Km of cathepsin B-GGFG interaction and thus accelerates the enzymatic catalysis rate of the hydrolysis of the peptide.
  • introduction of tetra-amine or acetyl amine at the similar position of the linker e.g., as in L-3-1 and L-3-4) also leads to the catalytic rate increase.
  • ′′linker-payload′′ (also referred to as ′′LP′′ for short herein below) , as can be understood from the context, may refer to either a solitary linker-payload compound of the invention or a linker-payload moiety as incorporated into and thus as part of an antibody-drug conjugate according to the present invention.
  • a linker-payload moiety may share the same numeral code with the corresponding linker-payload compound from which it derives via conjugation.
  • the term ′′linker-payload compound′′ refers to a conjugate compound composed of a linker moiety covalently conjugated to a drug moiety, wherein the drug moiety is also known as ′′payload′′ .
  • the linker-payload compound may further be conjugated to an antibody to thereby provide an ADC comprising the linker-payload moiety of the invention.
  • the present invention provides a linker-payload conjugate having the structure of formula II:
  • the linker-payload conjugate may be a compound having any one of the following formulae, or a pharmaceutically acceptable salt or ester thereof:
  • the Drug useful in the present invention is not particularly limited, as long as it possesses or can be modified to possess a functionality group for conjugation with the linker compound at the end opposite to the maleimide moiety.
  • the functionality group for conjugation may be -NHR, wherein R is an alkyl or H.
  • the term ′′drug′′ may refer to either a drug that forms the drug moiety covalently conjugated to the linker moiety in a linkier-payload compound or an ADC, or a drug that is released from a linker-payload or an ADC via enzymatic cleavage.
  • Drugs useful in the present invention include cytotoxic drugs, particularly those used in cancer therapy.
  • cytotoxic drugs include, but are not limited to, DNA damaging agents, DNA binding agents, nucleic acid synthesis inhibitors, transcription inhibitors, anti-metabolites, enzyme inhibitors such as thymidylate synthase inhibitors and topoisomerase inhibitors, tubulin inhibitors and toxins such as toxins of a bacterial, fungal, plant or animal origin.
  • taxol methotrexate, methopterin, dichloromethotrexate, 5-fluorouracil, 6-mercaptopurine, cytosine arabinoside, melphalan, leurosine, leurosideine, actinomycin, daunorubicin, doxorubicin, mitomycin C, mitomycin A, caminomycin, aminopterin, tallysomycin, podophyllotoxin and podophyllotoxin derivatives such as etoposide or etoposide phosphate, vinblastine, vincristine, vindesine, taxanes including taxol, taxotere retinoic acid, butyric acid, N8-acetyl spermidine, camptothecin, calicheamicin, esperamicin, ene-diynes, duocarmycin A, duocarmycin SA, calicheamicin, camptothecin, hemiasterlin
  • the drug is topoisomerase inhibitor, such as camptothecin, irinotecan, topotecan, exatecan, etoposide and derivatives thereof, like hodroxycamptothecin and Dxd.
  • the drug is Dxd.
  • the drug is exatecan.
  • the drug is Dxd, when being released from the linker-payload or the ADC.
  • the drug is exatecan, when being conjugated with the linker to form the drug moiety.
  • the linker-payload conjugate may be a compound having the structure of formulae IIa, an enantiomer, a diastereoisomer, a racemate, a solvate, a hydrate, or a pharmaceutically acceptable salt or ester thereof:
  • the linker-payload conjugate may be a compound selected from the group consisting of Compounds 1-1, 1-2, 1-3, 1-4, 1-7, 1-8, 3-1 or 3-4 as shown below, or a pharmaceutically acceptable salt or ester thereof:
  • a method of producing a linker-payload conjugate compound comprising conjugating a drug with a linker compound of the invention.
  • the drug is exatecan.
  • Conjugating a drug with a linker compound can be carried out via a coupling reation (e.g., esterification reaction or amidation reaction) or interesterification reaction as known in the art, depending on the type of the functional group (s) at the terminal end of the linker compound and the type of the functional group (s) on the drug.
  • the present invention provides an antibody-drug conjugate comprising an antibody conjugated with one or more drug molecules via a linker moiety of the invention, which may be represented by formula III:
  • p is 1 to 8, such as 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 and 8; in some embodiments, p is 2, 4 or 6; and in some embodiments, p is 4.
  • the antibody can be of any specificity, configuration and origins.
  • the antibody specifically binds to a tumor antigen (TA) , such as a tumor specific antigen (TSA) and a tumor-associated antigen (TAA) .
  • TSA tumor specific antigen
  • TAA tumor-associated antigen
  • tumor antigen examples include, but are not limited to, CD20, CD38, CD123, ROR1, ROR2, BCMA, PSMA, SSTR2, SSTR5, CD19, FLT3, CD33, PSCA, ADAM 17, CEA, Her2, EGFR, EGFR-vIII, CD30, FOLR1, GD-2, CA-IX, Trop2, CD70, CD38, mesothelin, EphA2, CD22, CD79b, GPNMB, CD56, CD138, CD52, CD74, CD30, CD123, RON, and ERBB2.
  • TA-specific antibodies include, but are not limited to, Trastuzumab, Rituximab, Cetuximab, Bevacizumab, Panitumumab, Alemtuzumab, Matuzumab, Gemtuzumab, Polatuzumab, Inotuzumab, etc.
  • the antibody (Ab) is Trastuzumab.
  • the term ′′antibody′′ includes fragments of antibody, such as Fab fragments, Fab′ fragments, F (ab′) 2 fragments, Fv fragments and scFv fragments. Further, the term ′′antibody′′ may extend to include functional equivalents such as ligands and binding proteins that specifically recognize and bind to a target molecule such as an antigen (e.g., tumor antigens) , a receptor or other surface molecules on a targeted cell, such as pathology-associated cells, like cancer or tumor cells, as long as the equivalent molecule possesses or can be modified to possess a functionality group that can react with the maleimide moiety of the linker and thereby covalently binding to the linker.
  • the functionality group is a thiol group, such as those released via reduction of inter-chain disulfides, so that the antibody can be conjugated to the linker moiety via a thio-maleimide linkage.
  • the present invention provides a method of producing an antibody-drug-conjugate, comprising conjugating an antibody with a linker-payload compound of the invention.
  • the method may comprises:
  • step (b) conjugating an antibody with a linker-payload compound obtained in step (a) .
  • Step (a) can be carried out via a coupling reation (e.g., esterification reaction or amidation reaction) or interesterification reaction as known in the art, depending on the type of the functional group (s) at the terminal end of the linker compound and the type of the functional group (s) on the drug.
  • a coupling reation e.g., esterification reaction or amidation reaction
  • interesterification reaction as known in the art, depending on the type of the functional group (s) at the terminal end of the linker compound and the type of the functional group (s) on the drug.
  • Step (b) can be carried out by reacting a maleimido moiety with a free thiol group from the antibody via Michael addition reaction.
  • the free thiol group (s) may come from the cysteine residue (s) , such as those released by reduction of an inter-chain disulfide bond, so that the antibody can be conjugated to the linker moiety via a thio-maleimide linkage.
  • the antibody-drug-conjugate of the invention can be formulated with a pharmaceutically acceptable excipient to provide a pharmaceutical composition.
  • the composition may comprise a therapeutically effective amount of the antibody-drug-conjugate.
  • the composition may comprise an effective amount of the antibody-drug-conjugate that allows for obtaining a dosage as desired.
  • the antibody-drug conjugate of the invention can be used for treating a disease, disorder or condition in a subject in need thereof, wherein the treatment may comprise administrating to the subject a therapeutically effective amount of the antibody drug-conjugate.
  • an antibody-drug conjugate according to the present invention for use in treatment of a disease, disorder or condition in a subject in need thereof.
  • the disease to be treated may include but are not be limited to cancers, including solid tumors and hematopoeitic malignancies.
  • cancers include but are not limited to breast cancers, gastric cancers, pancreatic cancers, hepatic cancers, lung cancers (e.g., NSCLC) , head and neck cancers, colorectal cancers, B cell lymphomas (e.g., non-Hodgkin’s lymphoma (NHL) ) and leukemia.
  • NSCLC non-Hodgkin’s lymphoma
  • the term “subject” refers to a human or a non-human animal subject.
  • Non-human animals may be mammals, such as primates.
  • Examples of non-human animal subjects include but are not limited to domestic animals, farm animals, and zoo, sports, or pet animals such as dogs, cats, guinea pigs, rabbits, rats, mice, horses, swine, cows, and bears.
  • the subject is a human.
  • a ′′subject in need thereof′′ refers to a subject in need of diagnosis, prognosis, amelioration, prevention and/or treatment of a disease, disorder or condition.
  • Step 1 methyl 2- (2- ( (tert-butyldimethylsilyl) oxy) ethoxy) acetate (a-1)
  • the intermediate was de-TBS at 1 M HCl (5.00 mL) .
  • Step 3 benzyl 1- (9H-fluoren-9-yl) -3, 6-dioxo-2, 9, 12-trioxa-4, 7-diazatetradecan-14-oate (a-4)
  • Step 4 1- (9H-fluoren-9-yl) -3, 6-dioxo-2, 9, 12-trioxa-4, 7-diazatetradecan-14-oic acid (a-5)
  • Step 5 (a-6, i.e., L-1-7)
  • Fmoc-Phe-OH (0.58g, 1.31 mmol) was added and mixed for 30 secs, then O-Benzotriazole-N, N, N, N-tetramethyl-uronium-hexafluorophosphate (HBTU) (0.54 g, 1.43 mmol) and N, N-diisopropylethylamine (0.25 g, 1.95 mmol) in N, N-Dimethylformamide were added, and bubbled by nitrogen for 30 mins. The resin was washed with N,N-Dimethylformamide for 3 times.
  • HBTU O-Benzotriazole-N, N, N, N-tetramethyl-uronium-hexafluorophosphate
  • HBTU O-Benzotriazole-N, N, N, N-tetramethyl-uronium-hexafluorophosphate
  • N, N-diisopropylethylamine (0.25 g, 1.95 mmol
  • Step 1 benzyl 1- (9H-fluoren-9-yl) -3, 6-dioxo-2, 9-dioxa-4, 7-diazadodecan-12-oate (b-3)
  • Step 2 1- (9H-fluoren-9-yl) -3, 6-dioxo-2, 9-dioxa-4, 7-diazadodecan-12-oic acid (a-3)
  • Step 3 (S) -2-amino-6- ( (tert-butoxycarbonyl) amino) hexanoic acid (b-6)
  • Step 4 (S) -6- ( (tert-butoxycarbonyl) amino) -2- (dimethylamino) hexanoic acid (b-7)
  • Step 5 (S) -2- (dimethylamino) -6- (2, 5-dioxo-2, 5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl) hexanoic acid (b-9)
  • the colorless oil was dissolved in saturation sodium bicarbonate (6.00 mL) at 0 °C, after, methyl 2, 5-dioxo-2, 5-dihydro-1H-pyrrole-1-carboxylate (407 mg, 2.62 mmol) was added to the reaction mixture and stirred for 0 °C at 1 hr and then kept at 25 °C for another 3 hrs.
  • LC-MS showed intermediate was consumed completely and one main peak with desired mass was detected.
  • the reaction mixture was acidized by addition 1 M HCl (5.00 mL) and purified by Flash (Eluent of 10 ⁇ 50%H 2 O (0.1%TFA) /CH 3 CN on C-18 column chromatography) .
  • Step 6 (3S, 12S) -12-benzyl-3- (4- (2, 5-dioxo-2, 5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl) butyl) -2-methyl-4, 7, 10, 13, 16-pentaoxo-19-oxa-2, 5, 8, 11, 14, 17-hexaazadocosan-22-oic acid (b-10, i.e., L-3-1)
  • Fmoc-Phe-OH (0.58g, 1.31 mmol) was added and mixed for 30 secs, then O-Benzotriazole-N, N, N, N-tetramethyl-uronium-hexafluorophosphate (HBTU) (0.54 g, 1.43 mmol) and N, N-diisopropylethylamine (DIEA) (0.25 g, 1.95 mmol) in N, N-Dimethylformamide were added and bubbled by N 2 for 30 mins. The resin was washed with N, N-Dimethylformamide for 3 times.
  • HBTU N, N-tetramethyl-uronium-hexafluorophosphate
  • DIEA N-diisopropylethylamine
  • cleavage buffer (20%HFIP/80%DCM) was added to the flask containing the resin of peptide, stirred for 2 mins for 2 times. The HFIP-mixture was removed in vacuum to give a residue. The residue was purified by Flash (Eluent of 10-50%H 2 O/CH 3 CN on C-18 column chromatography) .
  • Step 1 10-benzyl-23- (2, 5-dioxo-2, 5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl) -6, 9, 12, 15-tetraoxo-18- (trifluoromethyl) -3-oxa-5, 8, 11, 14, 17-pentaazatricosan-1-oic acid (c-1, i.e., L-1-1)
  • the peptide was synthesized using standard Fmoc chemistry.
  • the reaction mixture was purified by prep-HPLC (natural condition, pure water) directly, two peaks with desired mass was detected in perp-HPLC, separated and lyophilized to obtained Deruxtecan analog 1-1 (Peak 1: 1.4 mg, 85.97%purity, Peak 2: 7.1 mg, 90.32%purity, 22.3%yield) as a white solid.
  • Step 1 (S) -benzyl 1- (9H-fluoren-9-yl) -10-methyl-3, 6-dioxo-2, 9-dioxa-4, 7-diazaundecan-11-oate (d-3)
  • Step 2 (S) -1- (9H-fluoren-9-yl) -10-methyl-3, 6-dioxo-2, 9-dioxa-4, 7-diazaundecan-11-oic acid (d-4)
  • Step 3 (2S, 10S) -10-benzyl-23- (2, 5-dioxo-2, 5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl) -2-methyl-6, 9, 12, 15-tetraoxo-18- (trifluoromethyl) -3-oxa-5, 8, 11, 14, 17-pentaazatricosan-1-oic acid (d-5, i.e., L-1-2)
  • Fmoc-Phe-OH (1.50 mmol) was added and mixed for 30 secs, then O-Benzotriazole-N, N, N, N-tetramethyl-uronium-hexafluorophosphate (HBTU) (1.50 mmol) and N, N-diisopropylethylamine (DIEA) (3.00 mmol) in N, N-Dimethylformamide were added, and bubbled by N 2 for 30 mins. The resin was washed with N, N-Dimethylformamide for 3 times.
  • HBTU N, N-tetramethyl-uronium-hexafluorophosphate
  • DIEA N-diisopropylethylamine
  • Step 1 benzyl 1- (9H-fluoren-9-yl) -3, 6-dioxo-2, 9-dioxa-4, 7-diazadodecan-12-oate (e-3)
  • Step 2 1- (9H-fluoren-9-yl) -3, 6-dioxo-2, 9-dioxa-4, 7-diazadodecan-12-oic acid (e-4)
  • Step 3 (11S) -11-benzyl-24- (2, 5-dioxo-2, 5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl) -7, 10, 13, 16-tetraoxo-19- (trifluoromethyl) -4-oxa-6, 9, 12, 15, 18-pentaazatetracosan-1-oic acid (e-5, i.e., L-1-3)
  • Step 1 (S) -methyl 1- (9H-fluoren-9-yl) -11-methyl-3, 6-dioxo-2, 9-dioxa-4, 7-diazadodecan-12-oate (f-3)
  • Step 2 (S) -1- (9H-fluoren-9-yl) -11-methyl-3, 6-dioxo-2, 9-dioxa-4, 7-diazadodecan-12-oic acid (f-4)
  • Step 3 (11S) -11-benzyl-24- (2, 5-dioxo-2, 5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl) -2-methyl-7, 10, 13, 16-tetraoxo-19- (trifluoromethyl) -4-oxa-6, 9, 12, 15, 18-pentaazatetracosan-1-oic acid (f-5, i.e., L-1-4)
  • Step 1 benzyl 2- (2- (benzyloxy) ethoxy) propanoate (g-2)
  • the reaction mixture was quenched by addition water (1000 mL) at 0°C, and extracted with dichloromethane (200 mL x 3) .
  • the combined organic layers were washed with brine (200 mL) , dried over anhydrous sodium sulfate, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue.
  • Step 4 benzyl 1- (9H-fluoren-9-yl) -13-methyl-3, 6-dioxo-2, 9, 12-trioxa-4, 7-diazatetradecan-14-oate (g-6)
  • Step 5 1- (9H-fluoren-9-yl) -13-methyl-3, 6-dioxo-2, 9, 12-trioxa-4, 7-diazatetradecan-14-oic acid (g-7)
  • Step 6 (13S) -13-benzyl-26- (2, 5-dioxo-2, 5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl) -2-methyl-9, 12, 15, 18-tetraoxo-21- (trifluoromethyl) -3, 6-dioxa-8, 11, 14, 17, 20-pentaazahexacosan-1-oic acid (g-8, i.e., L-1-8)
  • the peptide was synthesized using standard Fmoc chemistry.
  • a cleavage buffer (20%HFIP /DCM) was added to the peptide Resin, and stirred for 0.5 hr for 3 times.
  • Step 1 (S) -2-acetamido-6- (2, 5-dioxo-2, 5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl) hexanoic acid (h-3)
  • Step 2 (19S) -10-benzyl-19- (4- (2, 5-dioxo-2, 5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl) butyl) -6, 9, 12, 15, 18, 21-hexaoxo-3-oxa-5, 8, 11, 14, 17, 20-hexaazadocosan-1-oic acid (h-4, i.e., L-3-4)
  • the peptide was synthesized using standard Fmoc chemistry.
  • ′′native linker-payload′′ (also referred to as ′′native-LP′′ or ′′nat-LP′′ herein below) refers to a compound having the following structure:
  • the native-LP has the same structure as Deruxtecan in Enhertu, both containing the maleimide-GGFG pepetide linker.
  • the native-LP was purchased under the name ′′Deruxtecan′′ from MedChemExpress.
  • Antibody-drug conjugates were synthesized according the following general procedure: an antibody in a pH7 PBS solution was first reduced by 2 ⁇ 20 equivalent of TCEP for a period of time raging from 0.5 to 18 hrs; with or without removal of residual TCEP by column or membrane, a linker-load in excess (15 ⁇ 18 molar excess) was introduced; the conjugation reaction was finished in half to several hours at a temperature ranging from 4°C to RT, followed by HPLC purification to provide the final ADC product.
  • Reaction buffer 40 mM H 3 PO 4 /H 3 BO 3 /HAc, 1 mM EDTA, pH 4.5
  • sample 0.015 ⁇ mol linker-payload compound
  • cathepsin B 16 U/ ⁇ mol linker-payload compound
  • cleavage site and modification on the linker moiety in Compound 1-1 were indicated in panel (a) , as in comparison with the native linker-payload; and percentages (%) of cleavage are shown in panel (b) , wherein the percentages were calculated based on the peak areas of released drugs as detected by reverse-phase HPLC (mixed mode) chromatogram.
  • the linker-payloads of the invention were digested faster.
  • reaction conditions were set the same as in Example 3 for hydrolysis of linker-payloads per se. Specifically, reaction buffer (40 mM H 3 PO 4 /H 3 BO 3 /HAc, 1 mM EDTA, pH 4.5) , 135 mM Cysteine, DMA (2%, v/v) , sample (0.015 ⁇ mol ADC) and cathepsin B (16 U/ ⁇ mol ADC) were added in sequence into a 1.5 mL EP vial. The final cysteine concentration in the 300 ⁇ L hydrolysis system was 10 mM. The EP vial was placed in a 37°C water bath.
  • cleavage site and modification in comparison with the native linker-payload moiety in ADC are indicated in panel (a) , and percentage (%) of cleavage of the linker-payloads in ADCs over time is shown in panel (b) , wherein the percentages were calculated based on the peak areas of released drugs (supra) .
  • the hydrolysis percentage was 18.5%for ADC-1-1 (i.e. ADC comprising linker-payload moiety 1-1) , while 15.5%for ADC-native LP.
  • ADC samples ( ⁇ 10mg/mL in 20 mM Histidine, 150mM NaCl, pH6.0) in Eppendorf tubes were taken out from a -80°C freezer and thawed at room temperature for 30 min. The ADC samples were then frozen at -80°C for 2 days and thawed at room temperature for 30 min; and the freeze/thaw process was repeated one more time. After that, 20 ⁇ l of each sample was subjected to SEC and MS to measure DAR and drug distribution.
  • the ADC comprising linker-payload moiety 1-8 exhibited the lightest DAR drop after two freeze-and-thaw cycles. Overall, the eight ADC analogs all contained less undesired H4 than Her-Dxd while maintained stable DAR after Freeze-and-thaw cycles.
  • ′′Her′′ ′′Herceptin′′ , aka. ′′Trastuzumab′′ ; and ′′Fresh′′ refers to the samples of newly synthesized ADCs that were not subjected to the freeze-and-thaw cycles yet.
  • ADCs were formulated in 20 mM Histidine buffer comprising 150mM NaCl, pH6.0.
  • the obtained ADC samples were subjected to LC-MS analysis to determine drug distribution on light and heavy chains. Ideally, only 5 species, L0, H0, L1, H1 and H2, can be found. Aggregation percentage was determined by HPLC.
  • Table 4 shows a comparison of the non-specific and unwanted H4%among ADCs.
  • H4%(molar ratio) was 3%after synthesis, while in the case of Her-1-8, the unwanted species was significantly decreased to 0.8%.
  • ADC products produced with the linker-payloads of the invention contain less unwanted species.
  • the ADCs were buffer exchanged into 20 mM Histidine buffer comprising 150mM NaCl (pH6.0) via spin desalting column (40 kDa) .
  • Table 5 is a comparison among ADCs using different linker-payloads on removal of free linker-payloads (i.e., un-conjugated linker-payloads) .
  • the free linker-payloads were removed via UFDF.
  • the conjugation product had an amount of residual free linker-payload approaching 5%, while in the case of products produced using the linker-payloads of the invention, the amount was 2%or less.
  • the linker-payloads of the invention provide improved operability in purification, for instance, by allowing for an easier and more complete removal of residual free linker-payloads from an ADC conjugation product.
  • introduction of the dipolar moiety to the linker moiety increases water solubility of the linker-payload and facilitates its removal, e.g., by UFDF. This property is meaningful for the process of ADC manufacturing.
  • Binding to human HER2 in vitro were assayed by FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting) .
  • FACS Fluorescence Activated Cell Sorting
  • tumor cells expressing HER-2 (1 ⁇ 10 5 cells/well) were incubated with serially-diluted ADCs for 1-2 hours at 4°C.
  • Her-Dxd, prepared as described in Example 2 was used as the reference ADC and positive control.
  • the buffer used to dissolve the ADCs (20 mM Histidine buffer comprisng 150mM NaCl (pH6.0) ) was used as the negative control.
  • the cells were washed with the FACS staining buffer, and then the secondary antibody Alexa647-conjugated goat anti-human IgG Fc (Jackson) diluted in the FACS staining buffer was added. The plates were incubated at 4°C for 20-60 minutes in dark. Then, fluorescence intensity was measured on flow cytometer (BD FACS Canto II) and data analyzed by FlowJo software. The EC 50 values were calculated using GraphPad Prism software.
  • results were shown in FIG. 11.
  • the test ADCs of the invention were observed with an EC 50 around 1nM, while 0.9 nM for Her-Dxd.
  • the test ADCs of the invention were observed with an EC 50 of 0.4 ⁇ 0.7nM, while 0.4 nM for Her-Dxd.
  • the test ADCs of the invention (except for Her3-1) were observed with an EC 50 of 0.5 ⁇ 0.7 nM, while 0.6 for Her-Dxd.
  • the ADCs of the invention featuring the linkers and the linker-payloads of the invention, provided at least comparable or even better binding affinity compared with trastuzumab deruxtecan.
  • Tumor cell lines purchased from ATCC
  • NCI-N87, HCC1954, MDA-MB-231 and JIMT-1 cells were routinely cultured in RPMI1640 medium or DMEM medium.
  • the day before the assay day cells were seeded into 96-well plates in the culture medium at appropriate cell densities.
  • ADCs were serially diluted in the culture medium and added to each well.
  • Her-Dxd prepared as described in Example 2 was used as the reference ADC and positive control.
  • the buffer to dissolve ADCs was used as the negative control.
  • the plates were then kept at 37°C and 5%CO 2 in incubator. After 4-6 days, cell viability was tested using CellTiter-Glo (Promega) .
  • the IC 50 values were calculated using GraphPad Prism software.
  • results are shown in FIG. 12. While neither the test ADCs of the invention nor Her-Dxd were observed with active cytotoxicity on JIMT-1 and MDA-MB-231 cells (IC 50 >1nM) , in N87 and HCC1954 cells, all the test ADCs of the invention showed cytotoxicity comparable to the native ADC, with IC 50 being around 0.1 nM. As seen, the ADCs of the invention, featuring the linkers and the linker-payloads of the invention, provided at least comparable cytotoxicity as compared to trastuzumab deruxtecan.

Abstract

Provided are a linker, and linker-payloads and ADCs comprising same.

Description

LINKER FOR CONJUGATION Field of the Invention
The present invention relates to the field of drug conjugates, and more particularly, antibody-drug conjugates.
Background
Antibody-drug conjugates (ADCs) refer to a group of macromolecular drugs that utilize specific binding of antibodies toward antigens (on the surface of cancer cells) to bring cytotoxic agents (drugs) to cells to kill them. They can be considered both a site-directed and site-specifically released macromolecular pro-drug. An ADC is essentially a three component system comprising a potent drug substance linked via a degradable or non-degradable (cleavable/non-cleavable) linker to an antibody, usually monoclonal antibody mAb.
Upon binding to the antigen on a cell, an ADC usually is internalized, and then under the intracellular conditions, the drug is released from the antibody to take effects. Comparing to small molecules, number of ADC molecules reaching target cells are smaller, and internalization rate is also slower. Therefore a quick cleavage of the linker to release drug is desirable.
A linker plays a very important role in an ADC, such as in terms of ADC stability and drug release mechanism. An enzyme-assisted cleavable linker, such as the one in Trastuzumab deruxtecanusually comprises a short peptide (e.g., 2～4 amino acids) that is cleaved in lysosome once the ADC is internalized, allowing drug to be released for its cell-killing effects. How fast the linker is cleaved by an enzyme (or enzymes) thus determines how fast the drug takes effects in an already-slow ADC mechanism of action. Cleavable linkers are used in most ADCs to date due to their ability of quick release of drugs in target cells. For example, brentuximab vedotin trastuzumab deruxtecan loncastuximab tesirine-lpyl all use peptidyl cleavage fragments, VC, GGFG, VA, respectively. These peptides are cleaved mainly by enzymes of the cathepsin family (cathepsin B mainly) in lysosome. The rates of cleavage vary, depending on multiple factors, including the nature of enzymes involved, the region-specification enzyme-substrate interaction, etc. For example, the linker of Trastuzumab deruxtecan contains a tetrapeptide GGFG, wherein the amide bond of the last amino acid glycine serves as the scissile bond for cleavage by lysosomal protease (e.g., cathepsin family) . The rate of cleavage in the case of GGFG is not as fast as in VC.
Fast cleavage of the linker at a desired site, e.g. in lysosome, is a desirable character for ADCs. There exists the need for linkers and linker-payloads that allow for providing ADC products with improved properties and manufacturing ADCs via a process with improved operability and productivity.
Summary of the Invention
The inventors designed a series of linkers, which are suitable for producing linker-payloads and ADCs with improved properties, such as increased cleavability (e.g., as demonstrated by an improved rate of cleavage) , DAR distribution, homogeneity, stability and/or therapeutically relevant efficacy. The linkers and the linker-payloads comprising same allow for manufacturing ADCs via a process with improved operability and productivity, such as provision of cleaner ADC products with decreased level of leftover un-conjugated linker-payloads and/or easier removal of the leftover linker-payloads.
In a first aspect, provided herein is a compound of formula I:
an enantiomer, a diastereoisomer, a racemate, a solvate, a hydrate, or a pharmaceutically acceptable salt or ester thereof;
wherein, ″*″ indicates a chiral center, which is S-or R-or racemic; and the hydrogen atom attached to the chiral carbon atom and the hydrogen atom attached to the carbon atom with a R2 substituent are omitted from the formula;
L1 is - (CH2) a-, wherein a is an integer from 0 to 10, or - (CH2CH2O) b-, wherein b is an integer from 1 to 36;
L2 is - (CH2) c-, wherein c is an integer from 1 to 10, or - (CH2CH2O) d-, wherein d is an integer from 1 to 36;
L3 is absent, or is - (CH2) e-, wherein e is an integer from 1 to 10, or - (CH2CH2O) f-, wherein f is an integer from 1 to 36;
R1 is -CF3, -NRaRb, -NRa (C=O) Rb, or -O (CH2) gCH3, wherein g is an integer from 0 to 3, Ra is H, or -C1-6 alkyl, Rb is H or -C1-6 alkyl;
R2 is -H, -C1-6 alkyl, or -O (CH2) hCH3, wherein h is an integer from 0 to 3;
X is halo, -OR3 or -NR4R5;
R3 is -H, -C1-6 alkyl or halo;
R4 and R5 are independently -H or -C1-6 alkyl;
n= 0 or 1; and 
m= 0 or 1.
In a further aspect, provided herein is a conjugate compound of formula II:
an enantiomer, a diastereoisomer, a racemate, a solvate, a hydrate, or a pharmaceutically acceptable salt or ester thereof; wherein, ″*″ , L1, L2, L3, R1, R2, n and m are define as in formula I; and ″DRUG″ is a drug moiety covalently conjugated to the linker moiety.
In a further aspect, provided herein is an antibody-drug conjugate of formula III:
an enantiomer, a diastereoisomer, a racemate, a solvate, a hydrate, or a pharmaceutically acceptable salt or ester thereof; wherein, ″*″ , L1, L2, L3, R1, R2, n and m and ″DRUG″ are define as in formula II, and p is 1 to 8, such as 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 and 8; Ab refers to an antibody.
In a further aspect, provided herein is a method of producing a linker-payload compound, comprising conjugating a drug with a linker compound of the invention. In some embodiments, the drug is exatecan.
In a further aspect, provided herein is a method of producing an antibody-drug-conjugate, comprising
 (a) conjugating a drug with the linker compound of the invention to obtain a linker-payload compound; wherein, preferably, the drug is exatecan; and 
(b) conjugating an antibody with the linker-payload compound obtained in step (a) .
Brief Description of the Figures
Figure 1: A scheme of synthesizing linker-payload compound (also referred to as ″Deruxtecan analog″ in the figures) 1-7 according to a representative example of the invention.
Figure 2: A scheme of synthesizing linker-payload compound 3-1 according to another representative example of the invention.
Figure 3: A scheme of synthesizing linker-payload compound 1-1 according to another representative example of the invention.
Figure 4: A scheme of synthesizing linker-payload compound 1-2 according to another  representative example of the invention.
Figure 5: A scheme of synthesizing linker-payload compound 1-3 according to another representative example of the invention.
Figure 6: A scheme of synthesizing linker-payload compound 1-4 according to another representative example of the invention.
Figure 7: A scheme of synthesizing linker-payload compound 1-8 according to another representative example of the invention.
Figure 8: A scheme of synthesizing linker-payload compound 3-4 according to another representative example of the invention.
Figure 9: (a) A schematic depiction of the site of modification (circled) and the site of cleavage (dash line) in a linker-payload compound of the invention in comparison with the native linker payload; and (b) percentage (%) of cleavage over time for the linker-payload of the invention in comparison with the native liker-payload.
Figure 10: (a) A schematic depiction of the site of modification (circled) and the site of cleavage (dash line) in an ADC comprising a linker-payload moiety of the invention in comparison with an ADC comprising the native linker payload moiety; and (b) percentage (%) of cleavage over time for the linker-payload moiety of the invention in ADC in comparison with cleavage of the native liker-payload moiety in ADC.
Figure 11: Binding affinity of ADCs comprising different linker-payload moieties to antigen Her2 on different cell lines.
Figure 12: Cytotoxicity of ADCs comprising different linker-payload moieties on different cell lines.
Detailed Description of the Invention
Other objects, features and advantages of the present invention will become apparent from the following detailed description. It should be understood, however, that the detailed description and the specific examples, while indicating preferred embodiments of the invention, are given by way of illustration only, since various changes and modifications within the spirit and scope of the invention will become apparent to those skilled in the art from the detailed description.
Nomenclature and Definitions
As used herein, singular forms preceded by “a” , “an” and “the” include plural reference unless the context clearly dictates otherwise. As well, the terms “a” (or “an” ) , “one or more” and “at least one” can be used interchangeably herein.
In the present disclosure, unless otherwise specified, a value or value range, with or without being preceded by the term “about” or “approximately” covers equivalents within a reasonable  range of approximation as can be understood by an artisan in the related field, such as a range of ±10%, ±5%, ±3%, ±2%, ±1%or ±0.5%around the specified value.
As used herein, the terms ″substantially no″ and ″substantially free (of) ″ with regard to presence of a scenario or a substance not only refers to absence (i.e., ″no″ , ″zero″ or ″free (of) ″ ) but also refers to a presence of insignificance or a presence or an amount below the limit of an assay and thus undetectable. This can be well understood by a skilled person in the art.
One or more features in one embodiment can be combined with any one or more features in another embodiment according to the present disclosure without departing from the spirit and concept of the present invention.
Unless defined otherwise, all technical and scientific terms used herein have the same meanings as commonly understood by one of ordinary skills in the fields to which this invention pertains. All publications and patents specifically mentioned herein are incorporated by reference for all purposes. All references cited herein are to be taken as indicative of the level of the skill in the art, which should not be construed as an admission that the invention is not entitled to antedate such disclosure by virtue of prior invention.
General
The cleavage rate of peptide linkers depends on multiple factors, such as the nature of enzymes as involved, region-specific enzyme-substrate interaction, etc. We designed a series of linkers based on the finding that by altering the structures flanking the tetrapeptide GGFG, enzyme binding properties of the linker can be altered, as demonstrated by an increase in the kcat/Km value of cathapsin B. Using these linkers, linker-payload compounds and ADCs with improved properties and performance can be obtained. As shown in the described examples herein below, linker-payloads of the invention comprising the designed linker moieties exhibited increased cathepsin B cleavage rate, either as a solitary compound or a moiety in an ADC, compared to a reference comprising an analogous existing linker moiety. It was observed that the designed linkers are more prone to enzyme cleavage, which helps to improve efficacy of ADCs. Further, it was observed that ADCs comprising the linker-payload moieties of the invention may exhibit an increased stability (e.g., storage stability, such as freeze-thaw stability) and/or a comparable or even better therapeutically relevant efficacy (e.g., binding affinity and/or cytotoxicity) as compared to an existing analogous ADC.
At the same time we observed that ADC manufacturing using linker-payloads of the invention comprising the designed linker moieties can provide a cleaner product, for example, as compared with at a high drug-antibody ratio (DAR) . DAR of is 7.5. For higher DAR, more linker-payload is needed in the conjugation reaction. As a result, removal of the leftover linker-payloads can be onerous. In the present invention, the linker-payloads of the invention can  be more easily and completely removed, for example, as compared to deruxtecan in Enhertu, and thereby can yield cleaner ADC products. This might be explained by increased hydrophilicity of the linker-payloads of the invention. Meanwhile, when large excess of linker-payload is used in conjugation to achieve a high DAR, nonspecific loading of linker-payloads onto the heavy chains of the antibody can occur, which forms 4-drug-conjugated heavy chains, while ideally the maximal number is 3. In the present invention, percentage of 4-drug-conjugated heavy chain can be decreased to as low as 1/3 of that in the case ofAccordingly, linkers and linker-payloads of the present invention can provide ADC products with improved homogeneity.
Further, we observed that ADCs prepared using the linker-payloads of the invention can be more easily purified. In some cases, after purification via UFDF (Ultra Filtration &Deep Filtration) , the free linker-payloads left in the ADC products after conjugation are significantly decreased, for example, as compared to products produced using the linker-payload used in Accordingly, the linkers and the linker-payloads of the present invention allow for producing ADCs with improved purity, and also allow for manufacturing ADCs via a process with improved operability and productivity.
Exemplary Embodiments of the Invention
1. Linker
In the present disclosure, the term ″linker″ , as can be understood from the context, may refer to either a solitary linker compound of the invention or a linker moiety as incorporated into and thus as part of a linker-payload conjugate or an antibody-drug conjugate according to the present invention. As can be understood, a linker moiety refers to the moiety derived from the corresponding linker compound when being incorporated in the conjugates via conjugation.
In one aspect, the present invention provides a linker compound having the structure of formula I:
an enantiomer, a diastereoisomer, a racemate, a solvate, a hydrate, or a pharmaceutically acceptable salt or ester thereof;
wherein, ″*″ indicates a chiral center, which is S-or R-or racemic; and the hydrogen atom attached to the chiral carbon atom and the hydrogen atom attached to the carbon atom with a R2 substituent are omitted from the formula;
L1 is - (CH2) a-, wherein a is an integer from 0 to10, preferably from 1 to 8, more preferably from 2 to 6 or from 4 to 5, or - (CH2CH2O) b-, wherein b is an integer from 1 to 36, preferably from 2 to 30, more preferably from 3 to 25 or from 4 to 20;
L2 is - (CH2) c-, wherein c is an integer from 1 to 10, preferably from 1 to 8 or 1 to 6, more preferably, from 1 to 2; or - (CH2CH2O) d-, wherein d is an integer from 1 to 36, preferably from 2 to 30, more preferably from 3 to 25 or from 4 to 20;
L3 is absent, or is - (CH2) e-, wherein e is an integer from 1 to 10, preferably from 1 to 8 or 1 to 6, more preferably from 1 to 2, or - (CH2CH2O) f-, wherein f is an integer from 1 to 36 preferably from 1 to 20, more preferably from 1 to 2, from 3 to 25 or from 4 to 20;
R1 is -CF3, -NRaRb, -NRa (C=O) Rb, or -O (CH2) gCH3, wherein g is an integer from 0 to 3, preferably from 1 to 2, Ra is H, or -C1-6 alkyl, preferably is -H, or -CH3; Rb is H or -C1-6 alkyl, preferably is -H, or -CH3; preferably R1 is -CF3, -N (CH3) 2, -NH (C=O) CH3, or -O (CH2) 2CH3;
R2 is -H, -C1-6 alkyl, or -O (CH2) hCH3, wherein h is an integer from 0 to 3, preferably R2 is -H or -CH3;
X is halo, -OR3 or -NR4R5, preferably -OR3;
R3 is -H, -C1-6 alkyl or halo, preferably -H, -CH3, t-butyl or Cl;
R4 and R5 are independently -H or -C1-6 alkyl;
n= 0 or 1; and
m= 0 or 1.
Specific examples of the linker compounds include Compounds L-1-1, L-1-2, L-1-3, L-1-4, L-1-7, L-1-8, L-3-1 and L-3-4 as shown below, or a pharmaceutically acceptable salt or ester thereof:

wherein ″*″ indicates a chiral center, which is racemic.
The designed linkers provide unique features and chemical properties. For example, in L-1-1, L-1-2, L-1-3, L-1-4, L-1-7, and L-1-8, a CF3 group is introduced to the alpha position of an amine residue to generate a strong dipolar moiety at the N-side of the GGFG peptide. This group most likely reduces Km of cathepsin B-GGFG interaction and thus accelerates the enzymatic catalysis rate of the hydrolysis of the peptide. Apparently, introduction of tetra-amine or acetyl amine at the similar position of the linker (e.g., as in L-3-1 and L-3-4) also leads to the catalytic rate increase.
We further explored modifications on the N-side of the tetrapeptide GGFG. We find that introduction of an extra methyl/methylene group (e.g., as in L-1-2, L-1-3, L-1-8) or ethyleneglycol group (e.g., as in L-1-7 and L-1-8) near the linkage to the drug moiety (e.g., exatecan or Dxd) resulted no compromise of cathepsin B cleavage rate.
2. Linker-payload
2.1. Linker-payload conjugates of the invention
In the present disclosure, the term ″linker-payload″ (also referred to as ″LP″ for short herein below) , as can be understood from the context, may refer to either a solitary linker-payload compound of the invention or a linker-payload moiety as incorporated into and thus as part of an antibody-drug conjugate according to the present invention. A linker-payload moiety may share the same numeral code with the corresponding linker-payload compound from which it derives via conjugation.
In the present disclosure, the term ″linker-payload compound″ refers to a conjugate compound composed of a linker moiety covalently conjugated to a drug moiety, wherein the drug moiety is also known as ″payload″ . The linker-payload compound may further be conjugated to an antibody to thereby provide an ADC comprising the linker-payload moiety of the invention.
Accordingly, in one aspect, the present invention provides a linker-payload conjugate having the structure of formula II:
an enantiomer, a diastereoisomer, a racemate, a solvate, a hydrate, or a pharmaceutically acceptable salt or ester thereof; wherein, ″*″ , L1, L2, L3, R1, R2, n and m are define as in formula I; and ″DRUG″ is a drug moiety covalently conjugated to the linker moiety.
In certain embodiments, the linker-payload conjugate may be a compound having any one of the following formulae, or a pharmaceutically acceptable salt or ester thereof:


wherein ″*″ indicates a chiral center, which is racemic.
The Drug useful in the present invention is not particularly limited, as long as it possesses or can be modified to possess a functionality group for conjugation with the linker compound at the end opposite to the maleimide moiety. In some embodiments, the functionality group for conjugation may be -NHR, wherein R is an alkyl or H.
As used herein, the term ″drug″ , as can be understood from the context, may refer to either a drug that forms the drug moiety covalently conjugated to the linker moiety in a linkier-payload compound or an ADC, or a drug that is released from a linker-payload or an ADC via enzymatic cleavage.
Drugs useful in the present invention include cytotoxic drugs, particularly those used in cancer therapy. Such drugs include, but are not limited to, DNA damaging agents, DNA binding agents, nucleic acid synthesis inhibitors, transcription inhibitors, anti-metabolites, enzyme inhibitors such as thymidylate synthase inhibitors and topoisomerase inhibitors, tubulin inhibitors and toxins such as toxins of a bacterial, fungal, plant or animal origin. Specific examples include, for example, taxol, methotrexate, methopterin, dichloromethotrexate, 5-fluorouracil, 6-mercaptopurine, cytosine arabinoside, melphalan, leurosine, leurosideine, actinomycin, daunorubicin, doxorubicin, mitomycin C, mitomycin A, caminomycin, aminopterin, tallysomycin, podophyllotoxin and podophyllotoxin derivatives such as etoposide or etoposide phosphate, vinblastine, vincristine, vindesine, taxanes including taxol, taxotere retinoic acid, butyric acid, N8-acetyl spermidine, camptothecin, calicheamicin, esperamicin, ene-diynes, duocarmycin A, duocarmycin SA, calicheamicin, camptothecin, hemiasterlins, maytansinoids (including DM1, DM2, DM3, DM4) , auristatins including monomethylauristatin E (MMAE) , monomethylauristatin F (MMAF) and monomethylauristatin D (MMAD) , camptothecin, irinotecan, topotecan, exatecan, etoposide and derivatives thereof. In some embodiments, the drug is topoisomerase inhibitor, such as camptothecin, irinotecan, topotecan, exatecan, etoposide and derivatives thereof, like hodroxycamptothecin and Dxd. In some embodiments, the drug is Dxd. In some other embodiments, the drug is exatecan. In some embodiments, the drug is Dxd, when being released from the linker-payload or the ADC. In some other embodiments, the drug is exatecan, when being conjugated with the linker to form the drug moiety.
Correspondingly, the linker-payload conjugate may be a compound having the structure of formulae IIa, an enantiomer, a diastereoisomer, a racemate, a solvate, a hydrate, or a pharmaceutically acceptable salt or ester thereof:
Wherein, ″*″ , L1, L2, L3, R1, R2, n and m are define as in formula II.
In some specific examples, the linker-payload conjugate may be a compound selected from the group consisting of Compounds 1-1, 1-2, 1-3, 1-4, 1-7, 1-8, 3-1 or 3-4 as shown below, or a pharmaceutically acceptable salt or ester thereof:


wherein ″*″ indicates a chiral center, which is racemic.
2.2. Synthesis of linker-payload conjugates
In an aspect of the invention, provided herein is a method of producing a linker-payload conjugate compound, comprising conjugating a drug with a linker compound of the invention. In some embodiments, the drug is exatecan.
Conjugating a drug with a linker compound can be carried out via a coupling reation (e.g., esterification reaction or amidation reaction) or interesterification reaction as known in the art, depending on the type of the functional group (s) at the terminal end of the linker compound and the type of the functional group (s) on the drug.
3. Antibody-Drug Conjugate
3.1. The antibody-drug conjugates of the invention
In one aspect, the present invention provides an antibody-drug conjugate comprising an antibody conjugated with one or more drug molecules via a linker moiety of the invention, which may be represented by formula III:


wherein ″*″ indicates a chiral center, which is racemic,
wherein p is 1 to 8, such as 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 and 8; in some embodiments, p is 2, 4 or 6; and in some embodiments, p is 4.
Basically, there are no limits on the antibodies that are usable in the present inbention. The antibody can be of any specificity, configuration and origins. In some embodiments, the antibody specifically binds to a tumor antigen (TA) , such as a tumor specific antigen (TSA) and a tumor-associated antigen (TAA) . Examples of the tumor antigen include, but are not limited to, CD20, CD38, CD123, ROR1, ROR2, BCMA, PSMA, SSTR2, SSTR5, CD19, FLT3, CD33, PSCA, ADAM 17, CEA, Her2, EGFR, EGFR-vIII, CD30, FOLR1, GD-2, CA-IX, Trop2, CD70, CD38, mesothelin, EphA2, CD22, CD79b, GPNMB, CD56, CD138, CD52, CD74, CD30, CD123, RON, and ERBB2. Examples of TA-specific antibodies include, but are not limited to, Trastuzumab, Rituximab, Cetuximab, Bevacizumab, Panitumumab, Alemtuzumab, Matuzumab, Gemtuzumab, Polatuzumab, Inotuzumab, etc. In some embodiments, the antibody (Ab) is Trastuzumab.
In context of the ADC according to the invention, the term ″antibody″ includes fragments of  antibody, such as Fab fragments, Fab′ fragments, F (ab′) 2 fragments, Fv fragments and scFv fragments. Further, the term ″antibody″ may extend to include functional equivalents such as ligands and binding proteins that specifically recognize and bind to a target molecule such as an antigen (e.g., tumor antigens) , a receptor or other surface molecules on a targeted cell, such as pathology-associated cells, like cancer or tumor cells, as long as the equivalent molecule possesses or can be modified to possess a functionality group that can react with the maleimide moiety of the linker and thereby covalently binding to the linker. In some embodiments, the functionality group is a thiol group, such as those released via reduction of inter-chain disulfides, so that the antibody can be conjugated to the linker moiety via a thio-maleimide linkage.
3.2. Preparation of antibody-drug conjugates
In an aspect, the present invention provides a method of producing an antibody-drug-conjugate, comprising conjugating an antibody with a linker-payload compound of the invention.
In some embodiments, the method may comprises:
(a) conjugating a drug with a linker compound of the invention to obtain a linker-payload compound; preferably, the drug is exatecan; and 
(b) conjugating an antibody with a linker-payload compound obtained in step (a) .
Step (a) can be carried out via a coupling reation (e.g., esterification reaction or amidation reaction) or interesterification reaction as known in the art, depending on the type of the functional group (s) at the terminal end of the linker compound and the type of the functional group (s) on the drug.
Step (b) can be carried out by reacting a maleimido moiety with a free thiol group from the antibody via Michael addition reaction. For example, the free thiol group (s) may come from the cysteine residue (s) , such as those released by reduction of an inter-chain disulfide bond, so that the antibody can be conjugated to the linker moiety via a thio-maleimide linkage.
4. Applications
The antibody-drug-conjugate of the invention can be formulated with a pharmaceutically acceptable excipient to provide a pharmaceutical composition. In some embodiments, the composition may comprise a therapeutically effective amount of the antibody-drug-conjugate. In some embodiments, the composition may comprise an effective amount of the antibody-drug-conjugate that allows for obtaining a dosage as desired.
The antibody-drug conjugate of the invention can be used for treating a disease, disorder or condition in a subject in need thereof, wherein the treatment may comprise administrating to the subject a therapeutically effective amount of the antibody drug-conjugate. Also provided herein is an antibody-drug conjugate according to the present invention for use in treatment of a disease,  disorder or condition in a subject in need thereof. The disease to be treated may include but are not be limited to cancers, including solid tumors and hematopoeitic malignancies. Examples of such cancers include but are not limited to breast cancers, gastric cancers, pancreatic cancers, hepatic cancers, lung cancers (e.g., NSCLC) , head and neck cancers, colorectal cancers, B cell lymphomas (e.g., non-Hodgkin’s lymphoma (NHL) ) and leukemia.
As used herein, the term “subject” refers to a human or a non-human animal subject. Non-human animals may be mammals, such as primates. Examples of non-human animal subjects include but are not limited to domestic animals, farm animals, and zoo, sports, or pet animals such as dogs, cats, guinea pigs, rabbits, rats, mice, horses, swine, cows, and bears. Preferably, the subject is a human. A ″subject in need thereof″ refers to a subject in need of diagnosis, prognosis, amelioration, prevention and/or treatment of a disease, disorder or condition.
Examples
The following Examples are provided merely for illustration, with no intent to limit scope of the invention.
Example 1: Synthesis of Linker-payloads
(a) Synthesis of Compound 1-7 (also called Deruxtecan analog 1-7 in FIG. 1)
The process of synthesis is schematically depicted in FIG. 1.
Step 1: methyl 2- (2- ( (tert-butyldimethylsilyl) oxy) ethoxy) acetate (a-1)
To a stirred solution of 2- ( (tert-butyldimethylsilyl) oxy) ethanol (6.51 g, 42.5 mmol) in anhydrous tert-butanol (50.0 mL) was added potassium tert-butoxide (3.18 g, 28.3 mmol) and stirred at 0 ℃ for 1 hr. And then methyl 2-bromoacetate (5.00 g, 28.3 mmol) in tert-butanol (50.0 mL) was added dropwise, the resulting solution was allowed to warm to 0 -25 ℃ and stirred for 2 hrs. TLC (Petroleum ether /Ethyl acetate = 10: 1, Rf = 0.2) showed the reaction was complete. The reaction mixture was quenched by addition of water (100 mL) at 0℃, and extracted with dichloromethane 50.0 mL (50.0 mL *3) . The combined organic layers were washed with brine (20.0 mL) , dried over anhydrous sodium sulfate, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by column chromatography (silica gel, Petroleum ether/Ethyl acetate = 50/1 to 2/1) to give methyl 2- (2- ( (tert-butyldimethylsilyl) oxy) ethoxy) acetate (3.00 g, 42.5%yield) as a colorless oil. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) : δ ppm 4.19 (s, 2 H) , 3.79 -3.84 (m, 2 H) , 3.76 (s, 2 H) , 3.62 -3.67 (m, 2 H) , 0.90 (s, 9 H) , 0.07 (s, 6 H) .
Step 2: benzyl 2- (2-hydroxyethoxy) acetate (a-2)
To a solution of methyl 2- (2- ( (tert-butyldimethylsilyl) oxy) ethoxy) acetate, a-1 (800 mg, 4.03 mmol) in mixture of tetrahydrofuran (10.0 mL) and water (10.0 mL) was added lithium hydroxide monohydrate (168 mg, 4.03 mmol) . The mixture was stirred at 25 ℃ for 2 hrs. TLC (Petroleum  ether /Ethyl acetate = 5: 1, Rf = 0.2) showed the reaction was complete. The reaction mixture was concentrated under reduced pressure to remove water and tetrahydrofuran to give a residue. The residue was dissolve in N, N-Dimethylformamide (5.00 mL) and added potassium carbonate (556 mg, 4.03 mmol) and benzyl bromide (1.38 g, 8.05 mmol) , the mixture was stirred at 25 ℃ for 16 hrs. TLC (Petroleum ether /Ethyl acetate = 10: 1, Rf = 0.5) indicated intermediate was consumed completely, the reaction was messy according to TLC. The reaction mixture was concentrated under reduced pressure to remove N, N-Dimethylformamide and purified by column chromatography (SiO2, Petroleum ether /Ethyl acetate=100/1 to 50/1) to give intermediate (1.30 g) as light yellow liquid. The intermediate was de-TBS at 1 M HCl (5.00 mL) . TLC (Petroleum ether /Ethyl acetate = 2: 1, Rf = 0.5) indicated intermediate was consumed completely, the reaction was messy according to TLC. The reaction mixture was purified by column chromatography (silica gel, Petroleum ether /Ethyl acetate=50/1 to 2/1) to give benzyl 2- (2-hydroxyethoxy) acetate (600 mg, 88.6%yield) as light yellow liquid. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) : δ ppm 7.28 -7.41 (m, 5 H) , 5.20 (s, 2 H) , 4.22 (s, 2 H) , 3.81 (t, g= 5.1 Hz, 3 H) , 3.64 -3.68 (m, 2 H) , 0.90 (s, 9 H) , 0.07 (s, 6 H) .
Step 3: benzyl 1- (9H-fluoren-9-yl) -3, 6-dioxo-2, 9, 12-trioxa-4, 7-diazatetradecan-14-oate (a-4)
To a mixture of benzyl 2- (2-hydroxyethoxy) acetate, a-2 (400 mg, 1.09 mmol) and (2- ( ( ( (9H-fluoren-9-yl) methoxy) carbonyl) amino) acetamido) methyl acetate a-3 (342 mg, 1.63 mmol) in tetrahydrofuran (4.00 mL) was added 4-methylbenzenesulfonic acid monohydrate (10.4 mg, 54.2 umol) , then the mixture was stirred at 25 ℃ for 1 hr. TLC (Petroleum ether /Ethyl acetate = 1: 1, Rf = 0.2) showed the reaction was complete. The mixture was diluted with sodium hydrogen carbonate (10.0 mL) and extracted with ethyl acetate (30.0 mL) . The combined organic layers were dried with anhydrous sodium sulfate, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by column chromatography on silica gel (100-200 mesh silica gel) eluted with (Petroleum ether /Ethyl acetate =50/1 to 1/1) to give benzyl 1- (9H-fluoren-9-yl) -3,6-dioxo-2, 9, 12-trioxa-4, 7-diazatetradecan-14-oate (0.40 g, 71.0 %yield) as a white solid. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) : δ ppm 7.77 (d, g= 7.5 Hz, 2 H) , 7.61 (d, g= 7.5 Hz, 2 H) , 7.30 -7.44 (m, 9 H) , 5.13 -5.22 (m, 2 H) , 4.81 (d, g= 6.8 Hz, 2 H) , 4.44 (d, g= 6.8 Hz, 2 H) , 4.15 -4.18 (m, 2 H) , 3.92 (d, g= 5.5 Hz, 2 H) , 3.73 -3.76 (m, 2 H) , 3.68 (d, g= 2.5 Hz, 2 H) .
Step 4: 1- (9H-fluoren-9-yl) -3, 6-dioxo-2, 9, 12-trioxa-4, 7-diazatetradecan-14-oic acid (a-5)
To a mixture of benzyl 1- (9H-fluoren-9-yl) -3, 6-dioxo-2, 9, 12-trioxa-4, 7-diazatetradecan-14-oate, a-4 (0.40 g, 771 umol) in ethanol (20.0 mL) and ethyl acetate (20.0 mL) was added dry Pd/C (0.80 g) , under hydrogen atmosphere (15 psi) stirred at 25 ℃ for 3 hrs. TLC (DCM/MeOH= 10: 1, Rf = 0.3) showed the reaction was complete. The reaction mixture was fileted through siliceous earth, and the filtrate was concentrated under reduced pressure to give 1- (9H-fluoren-9-yl) -3, 6- dioxo-2, 9, 12-trioxa-4, 7-diazatetradecan-14-oic acid (0.25 g, 75.6 %yield) as a colorless oil. The crude product was used for next step directly without purification. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) : δ ppm 8.64 -8.74 (m, 1 H) , 7.83 -7.95 (m, 2 H) , 7.73 (d, g= 7.4 Hz, 1 H) , 7.55 -7.62 (m, 1 H) , 7.26 -7.49 (m, 4 H) , 4.56 (d, g= 6.5 Hz, 2 H) , 4.26 -4.35 (m, 2 H) , 3.64 (d, g= 4.4 Hz, 2 H) , 3.49 -3.60 (m, 4 H) .
Step 5: (a-6, i.e., L-1-7)
To a mixture containing CTC-Resin (0.50 g, 14.1 mmol) and 1- (9H-fluoren-9-yl) -3, 6-dioxo-2,9, 12-trioxa-4, 7-diazatetradecan-14-oic acid, a-5 (0.20 g, 520 umol) , N, N-diisopropylethylamine (0.25 g, 1.95 mmol) , dichloromethane (10.0 mL) was added into swell. The resin was mixed for 2 hrs, then added with methanol (5.00 mL) and mixed for 30 mins. And then, the resin was washed with N, N-Dimethylformamide (10.0 mL) for 3 times. The resin was treated with 20%piperidine in N, N-Dimethylformamide for 30 mins for Fmoc deprotection. The resin was washed with N, N-Dimethylformamide for 5 times. Then Fmoc-Phe-OH (0.58g, 1.31 mmol) was added and mixed for 30 secs, then O-Benzotriazole-N, N, N, N-tetramethyl-uronium-hexafluorophosphate (HBTU) (0.54 g, 1.43 mmol) and N, N-diisopropylethylamine (0.25 g, 1.95 mmol) in N, N-Dimethylformamide were added, and bubbled by nitrogen for 30 mins. The resin was washed with N,N-Dimethylformamide for 3 times. The above step was repeated for next amino acid Fmoc-Gly-OH (0.53 g, 1.50 mmol) and 2- ( (7- (2, 5-dioxo-2, 5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl) -1, 1, 1-trifluoroheptan-2-yl) amino) acetic acid (0.20 g, 1.31 mmol) coupling at 25℃. The reaction was detected by ninhydrin test. The coupling reaction was monitored by ninhydrin color reaction. After washing with methanol 10.0 mL and drying under vacuum, 20.0 mL of cleavage buffer (20%HFIP/80%DCM) was added to the flask containing the resin of peptide, stirred for 2 mins for 2 times. The HFIP-mixture was removed in vacuum to give a residue. The residue was purified by Flash (Eluent of 10-50%H2O/CH3CN on C-18 column chromatography) . Then the resulting product was freeze-dried to give compound, a-6 (100 mg, crude, 90.0%purity) as a white solid. LCMS (ESI, m/z) : 713.68 [M+H] +: 715 (Xbrige C18, 3.5 um, 2.1 *30 mm column, Wavelength: UV 220 nm &254 nm;Column temperature: 30 ℃) eluting with 0.1%TFA in water : 0.1%TFA in acetonitrile (10-80_2 min) . HPLC (Gemini-NX C18 5um 110A 150 *4.6mm column, Wavelength: UV 220 nm &254 nm; Column temperature: 30 ℃) eluting with 0.1%TFA in water : 0.1%TFA in acetonitrile (10-80_20 min) 
Step 6: (Compound 1-7)
To a mixture of compound a-6 (59.7 mg, 79.2 umol, ) and 1-hydroxybenzotriazole (HOBt) (2.80 mg, 20.6 umol, ) in N, N-Dimethylformamide (1.00 mL) was added Exatecan mesylate (10.0 mg, 18.8 umol) and N, N-diisopropylcarbondiimide (DIC) (9.50 mg, 75.24 umol) , then the mixture was stirred at 40 ℃ for 2 hrs. TLC (DCM/MeOH = 10/1, Rf = 0.4) showed the reaction was complete. Traces of N, N-Dimethylformamide were removed in vacuum to give a residue. The  residue was purified by Flash (Eluent of 10-50%water/acetonitrile on C-18 column chromatography) . Then the resulting product was freeze-dried to give Compound 1-7 (8.00 mg, 37.4%yield, 95.7%purity) as a light yellow solid. LCMS (ESI, m/z) : 1131.1 [M+H] +: 1132.6 (Xbrige C18, 3.5 um, 2.1 *30 mm column, Wavelength: UV 220 nm &254 nm; Column temperature: 30 ℃) eluting with 0.1%TFA in water : 0.1%TFA in acetonitrile (10-80_2 min) . HPLC (Gemini-NX C18 5um 110A 150 *4.6mm column, Wavelength: UV 220 nm &254 nm; Column temperature: 30 ℃) eluting with 0.1%TFA in water : 0.1%TFA in acetonitrile (35-65_20+3 min) .
(b) Synthesis of Compound 3-1 (also called Deruxtecan analog 3-1 in in FIG. 2)
The process of synthesis is schematically depicted in FIG. 2.
Step 1: benzyl 1- (9H-fluoren-9-yl) -3, 6-dioxo-2, 9-dioxa-4, 7-diazadodecan-12-oate (b-3)
To a mixture of (2- ( ( ( (9H-fluoren-9-yl) methoxy) carbonyl) amino) acetamido) methyl acetate (500 mg, 1.36 mmol) and benzyl 3-hydroxypropanoate (366 mg, 2.04 mmol) in tetrahydrofuran (5.00 mL) was added 4-methylbenzenesulfonic acid monohydrate (12.9 mg, 67.8 umol) , then the mixture was stirred at 25 ℃ for 3 hrs. LC-MS showed raw material was consumed completely and one main peak with desired mass was detected. The mixture was diluted with saturation sodium bicarbonate (50.0 mL) and extracted with ethyl acetate (50.0 mL) . The combined organic layers were dried with anhydrous sodium sulfate, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by column chromatography on silica gel (100-200 mesh silica gel) eluted with (Petroleum ether/Ethyl acetate = 50/1 to 1/1) to give benzyl 1- (9H-fluoren-9-yl) -3, 6-dioxo-2, 9-dioxa-4, 7-diazadodecan-12-oate, b-3 (400 mg, 60.3%yield) as a white solid. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) : δ ppm 7.90 (d, g=7.4 Hz, 2 H) , 7.73 (d, g=7.0 Hz, 2 H) , 7.24 -7.64 (m, 9 H) , 5.05 -5.14 (m, 2 H) , 4.48 -4.62 (m, 4 H) , 4.16 -4.34 (m, 3 H) , 3.54 -3.72 (m, 4 H) .
Step 2: 1- (9H-fluoren-9-yl) -3, 6-dioxo-2, 9-dioxa-4, 7-diazadodecan-12-oic acid (a-3)
To a mixture of benzyl 1- (9H-fluoren-9-yl) -3, 6-dioxo-2, 9-dioxa-4, 7-diazadodecan-12-oate (400 mg, 818 umol) in ethanol (10.0 mL) and ethyl acetate (10.0 mL) was added dry Pd/C (0.05 g) , then the reaction mixture was stirred at 25 ℃ under hydrogen atmosphere (15 psi) for 5 hrs. TLC (DCM/MeOH= 10: 1, Rf = 0.2) showed raw material was consumed and one new spot was formed. The reaction mixture was filted through siliceous earth, and the filtrate was concentrated under reduced pressure to give 1- (9H-fluoren-9-yl) -3, 6-dioxo-2, 9-dioxa-4, 7-diazadodecan-12-oic acid, a-3 (300 mg, 91.9%yield) as a white solid. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) : δ ppm 7.90 (d, g=7.4 Hz, 2 H) , 7.73 (d, g=7.0 Hz, 2 H) , 7.24 -7.64 (m, 4 H) , 5.05 -5.14 (m, 2 H) , 4.48 -4.62 (m, 2 H) , 4.16 -4.34 (m, 3 H) , 3.54 -3.72 (m, 4 H) .
Step 3: (S) -2-amino-6- ( (tert-butoxycarbonyl) amino) hexanoic acid (b-6)
A solution of (S) -2- ( ( ( (9H-fluoren-9-yl) methoxy) carbonyl) amino) -6- ( (tert-butoxycarbonyl)  amino) hexanoic acid (5.00 g, 10.67 mmol) in mixture of N, N-Dimethylformamide (10.0 mL) and triethylamine (2.50 mL) was stirred at 25 ℃ for 16 hrs. TLC (DCM: MeOH = 10: 1, Rf = 0.2) showed the reaction was complete. The reaction mixture was added drop-wise to a solution of stirring isopropyl ether (100 mL) and the resulting solid was filtered, and the solid was washed with isopropyl ether (50 mL) . Traces of isopropyl ether were removed in vacuum to give (S) -2-amino-6- ( (tert-butoxycarbonyl) amino) hexanoic acid, b-6 (2.50 g, 95.1%yield) as a white solid. The crude product was used into the next step without further purification. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) : δ ppm 3.67 (t, g= 6.1 Hz, 1 H) , 3.03 (t, g= 6.7 Hz, 2 H) , 1.73 -1.90 (m, 2 H) , 1.23 -1.56 (m, 12 H) .
Step 4: (S) -6- ( (tert-butoxycarbonyl) amino) -2- (dimethylamino) hexanoic acid (b-7)
To a solution of (S) -2-amino-6- ( (tert-butoxycarbonyl) amino) hexanoic acid (2.00 g, 8.12 mmol) in trifluoroethanol (14.0 mL) was added dropwise with formaldehyde (1.32 g, 16.2 mmol, 37%purity) at 25 ℃ and stirred at this temperature for 30 mins, then sodium borohydride (614 mg, 16.2 mmol) was added dropwise over a period of 30 mins in the ice bath and then kept at 25 ℃ for another 30 mins. LC-MS showed raw material was consumed completely and one main peak with desired mass was detected. Traces of trifluoroethanol (14.0 mL) were removed in vacuum to give a residue and then diluted with 1%acetic acid (20.0 mL) . The mixture was purified by Flash (Eluent of 10～50%H2O (0.1%TFA /CH3CN on C-18 column chromatography) . Then the resulting product was freeze-dried to give (S) -6- ( (tert-butoxycarbonyl) amino) -2-(dimethylamino) hexanoic acid, b-7 (1.20 g, 53.8%yield) as a white solid. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) : δ ppm 3.16 (t, g= 7.0 Hz, 1 H) , 3.02 (t, g= 6.8 Hz, 2 H) , 2.52 (s, 6 H) , 1.66 -1.73 (m, 2 H) , 1.46 (ddd, g= 11.0, 7.0, 4.0 Hz, 2 H) , 1.38 (s, 9 H) , 1.22 -1.31 (m, 2 H) .
Step 5: (S) -2- (dimethylamino) -6- (2, 5-dioxo-2, 5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl) hexanoic acid (b-9)
A solution of (S) -6- ( (tert-butoxycarbonyl) amino) -2- (dimethylamino) hexanoic acid, b-7 (0.60 g, 2.19 mmol) in mixture of trifluoroacetic acid (0.60 mL) and dichloromethane (6.00 mL) , was stirred at 25 ℃ for 2 hrs. LC-MS showed raw material was consumed completely and one main peak with desired mass was detected. The reaction mixture was concentrated under reduced pressure to remove dichloromethane and trifluoroacetic acid to give de-Boc product as colorless oil. The colorless oil was dissolved in saturation sodium bicarbonate (6.00 mL) at 0 ℃, after, methyl 2, 5-dioxo-2, 5-dihydro-1H-pyrrole-1-carboxylate (407 mg, 2.62 mmol) was added to the reaction mixture and stirred for 0 ℃ at 1 hr and then kept at 25 ℃ for another 3 hrs. LC-MS showed intermediate was consumed completely and one main peak with desired mass was detected. The reaction mixture was acidized by addition 1 M HCl (5.00 mL) and purified by Flash (Eluent of 10～50%H2O (0.1%TFA) /CH3CN on C-18 column chromatography) . Then the resulting product was freeze-dried to give (S) -2- (dimethylamino) -6- (2, 5-dioxo-2, 5-dihydro-1H-pyrrol-1- yl)hexanoic acid, b-9 (500 mg, 89.9%yield) as a white solid. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) : δ ppm 6.80 (s, 2 H) , 3.79 (dd, g= 8.5, 4.4 Hz, 1 H) , 3.49 (t, g= 6.8 Hz, 2 H) , 2.88 (d, g= 13.4 Hz, 6 H) , 1.89 -2.00 (m, 2 H) , 1.56 -1.64 (m, 2 H) , 1.30 -1.40 (m, 2 H) .
Step 6: (3S, 12S) -12-benzyl-3- (4- (2, 5-dioxo-2, 5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl) butyl) -2-methyl-4, 7, 10, 13, 16-pentaoxo-19-oxa-2, 5, 8, 11, 14, 17-hexaazadocosan-22-oic acid (b-10, i.e., L-3-1)
To a mixture containing CTC-Resin (0.50 g, 14.1 mmol) and 1- (9H-fluoren-9-yl) -3, 6-dioxo-2, 9-dioxa-4, 7-diazadodecan-12-oic acid, a-3 (0.20 g, 520 umol) , N, N-diisopropylethylamine (DIEA) (0.25 g, 1.95 mmol) , dichloromethane (10.0 mL) were added into swell. The resin was mixed for 2 hrs, then added with methanol (5.00 mL) and mixed for 30 mins. And then, the resin was washed with N, N-Dimethylformamide (10.0 mL) for 3 times. The resin was treated with 20%piperidine in N, N-Dimethylformamide for 30 mins for Fmoc deprotection. The resin was washed with N, N-Dimethylformamide for 5 times. Then Fmoc-Phe-OH (0.58g, 1.31 mmol) was added and mixed for 30 secs, then O-Benzotriazole-N, N, N, N-tetramethyl-uronium-hexafluorophosphate (HBTU) (0.54 g, 1.43 mmol) and N, N-diisopropylethylamine (DIEA) (0.25 g, 1.95 mmol) in N, N-Dimethylformamide were added and bubbled by N2 for 30 mins. The resin was washed with N, N-Dimethylformamide for 3 times. The above step was repeated for next amino acid Fmoc-Gly-Gly-OH (0.53 g, 1.50 mmol) and special amino acid (S) -2- (dimethylamino) -6- (2, 5-dioxo-2, 5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl) hexanoic acid, b-9 (0.20 g, 1.31 mmol) coupling at 25℃. The reaction was detected by ninhydrin test. The coupling reaction was monitored by ninhydrin color reaction. After washing with methanol 10.0 mL and drying under vacuum, 20.0 mL of cleavage buffer (20%HFIP/80%DCM) was added to the flask containing the resin of peptide, stirred for 2 mins for 2 times. The HFIP-mixture was removed in vacuum to give a residue. The residue was purified by Flash (Eluent of 10-50%H2O/CH3CN on C-18 column chromatography) . Then the resulting product was freeze-dried to give (3S, 12S) -12-benzyl-3- (4- (2, 5-dioxo-2, 5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl)butyl) -2-methyl-4, 7, 10, 13, 16-pentaoxo-19-oxa-2, 5, 8, 11, 14, 17-hexaazadocosan-22-oic acid, b-10 (30.0 mg, 4.39%yield) as a white solid.
Step 7: Compound 3-1
To a mixture of (3S, 12S) -12-benzyl-3- (4- (2, 5-dioxo-2, 5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl) butyl) -2-methyl-4, 7, 10, 13, 16-pentaoxo-19-oxa-2, 5, 8, 11, 14, 17-hexaazadocosan-22-oic acid, b-10 (18.6 mg, 28.2 umol, ) and 1-hydroxybenzotriazole (HOBt) (2.80 mg, 20.6 umol, ) in N, N-Dimethylformamide (1.00 mL) was added Exatecan mesylate (10.0 mg, 18.8 umol) and N, N-diisopropylcarbondiimide (DIC) (9.50 mg, 75.24 umol) , then the mixture was stirred at 25 ℃ for 3 hrs. TLC (DCM: MeOH = 10: 1, Rf = 0.4) showed the reaction was complete. Traces of N, N-Dimethylformamide were removed in vacuum to give a residue. The residue was purified by Flash (Eluent of 10-50%H2O/CH3CN on C-18 column chromatography) . Then the resulting product  was freeze-dried to give compound 3-1 (7.20 mg, 35.4%yield) as a light yellow solid. LCMS (ESI, m/z) : 1077.1 [M+H] +: 1077.6 (Xbrige C18, 3.5 um, 2.1 *30 mm column, Wavelength: UV 220 nm &254 nm; Column temperature: 30 ℃) eluting with 0.1%TFA in water : 0.1%TFA in acetonitrile (10-80_2 min) . HPLC (Gemini-NX C18 5um 110A 150 *4.6mm column, Wavelength: UV 220 nm &254 nm; Column temperature: 30 ℃) eluting with 0.1%TFA in water: 0.1%TFA in acetonitrile (25-55_20+3 min) .
(c) Synthesis of Other Compounds
Synthesis of compound 1-1 (also called Deruxtecan analog 1-1 in FIG. 3)
Step 1: 10-benzyl-23- (2, 5-dioxo-2, 5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl) -6, 9, 12, 15-tetraoxo-18- (trifluoromethyl) -3-oxa-5, 8, 11, 14, 17-pentaazatricosan-1-oic acid (c-1, i.e., L-1-1)
Peptide Synthesis:
The peptide was synthesized using standard Fmoc chemistry.
1) Add DCM to the vessel containing CTC Resin (0.25 mmol, 0.44 g, Sub=0.57 mmol/g) and
5-benzyl-1- (9H-fluoren-9-yl) -3, 6, 9-trioxo-2, 12-dioxa-4, 7, 10-triazatetradecan-14-oic acid (0.10 g, 0.25 mmol, 1.0 eq) with N2 bubbling.
2) Add DIEA (6.0 eq) dropwise and mix for 2 hours.
3) Add MeOH (0.8 mL) and mix for 30 min.
4) Drain and wash with DMF for 5 times.
5) Add 20%piperidine/DMF and react on 30 min.
6) Drain and wash with DMF for 3 times.
7) Add Fmoc-amino acid solution and mix for 30 seconds, then add activation buffer, N2 bubbling for about 1 hour.
8) Repeat step 5 to 7 for next amino acid coupling.
Note:

20%piperidine in DMF was used for Fmoc deprotection for 30 min. The coupling reaction was monitored by ninhydrin test, and the resin was washed with DMF for 5 times.
Peptide Cleavage and Purification:
1) Cleavage buffer (20%HFIP /DCM) was added to the peptide Resin, stirring for 3 min for 3 times.
2) The DCM was concentrated under reduced pressure.
3) The peptide was dried in high vacuum for 2 hours.
4) The crude peptide was purified by Prep-HPLC (A: 0.075%TFA in H2O, B: ACN) to give compound c-1 (26.0 mg, 95.0%purity, 7.36%yield) .
Step 2: (Deruxtecan analog 1-1) 
To a solution of compound c-1 (21.0 mg, 31.3 umol, 1 eq) and EXATECAN MESYLATE (16.6 mg, 31.3 umol) in DMF (0.5 mL) was added HOAt (12.8 mg, 93.9 umol, 3 eq) , DIC (15.8 mg, 125.2 umol, 4 eq) and DIEA (12.14 mg, 93.9 umol, 3 eq) , then the reaction mixture was stirred at 25 ℃ for 16 hrs. LCMS showed compound c-1 was consumed and one main peak with desired mass was detected. The reaction mixture was purified by prep-HPLC (natural condition, pure water) directly, two peaks with desired mass was detected in perp-HPLC, separated and lyophilized to obtained Deruxtecan analog 1-1 (Peak 1: 1.4 mg, 85.97%purity, Peak 2: 7.1 mg, 90.32%purity, 22.3%yield) as a white solid.
Synthesis of compound 1-2 (also called Deruxtecan analog 1-2 in FIG. 4)
Step 1: (S) -benzyl 1- (9H-fluoren-9-yl) -10-methyl-3, 6-dioxo-2, 9-dioxa-4, 7-diazaundecan-11-oate (d-3) 
To a mixture of (2- ( ( ( (9H-fluoren-9-yl) methoxy) carbonyl) amino) acetamido) methyl acetate (5g, 13.57 mmol) and (S) -benzyl 2-hydroxypropanoate (d-2, 4.89 g, 27.15 mmol) in tetrahydrofuran (50.0 mL) was added 4-methylbenzenesulfonic acid hydrate (129.09 mg, 678.64 umol) , then the mixture was stirred at 25 ℃ for 5 hrs. LC-MS showed raw material was consumed completely and one main peak with desired mass was detected. The residue was purified by prep-HPLC (TFA condition) . Compound (S) -benzyl 1- (9H-fluoren-9-yl) -10-methyl-3, 6-dioxo-2,9-dioxa-4, 7-diazaundecan-11-oate, d-3 (4.10 g, 8.38 mmol, 61.77%yield) was obtained as a yellow oil.
Step 2: (S) -1- (9H-fluoren-9-yl) -10-methyl-3, 6-dioxo-2, 9-dioxa-4, 7-diazaundecan-11-oic  acid (d-4)
To a mixture of (S) -benzyl 1- (9H-fluoren-9-yl) -10-methyl-3, 6-dioxo-2, 9-dioxa-4, 7-diazaundecan-11-oate, d-3 (2.00 g, 4.09 mmol) in tetrahydrofuran (20.0 mL) was added dry Pd/C (200 mg) , then the reaction mixture was stirred at 25 ℃ under hydrogen atmosphere (15 psi) for 4 hrs. TLC (DCM/MeOH= 10: 1, Rf = 0.3) showed raw material was consumed and one new spot was formed. The reaction mixture was fileted through siliceous earth, and the filtrate was concentrated under reduced pressure to give (S) -1- (9H-fluoren-9-yl) -10-methyl-3, 6-dioxo-2, 9-dioxa-4, 7-diazaundecan-11-oic acid, d-4 (1.28 g, 3.21 mmol, 78.4%yield) as a white solid.
Step 3: (2S, 10S) -10-benzyl-23- (2, 5-dioxo-2, 5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl) -2-methyl-6, 9, 12, 15-tetraoxo-18- (trifluoromethyl) -3-oxa-5, 8, 11, 14, 17-pentaazatricosan-1-oic acid (d-5, i.e., L-1-2)
To a mixture containing CTC-Resin (0.50 g, 0.50 mmol) and (S) -1- (9H-fluoren-9-yl) -10-methyl-3, 6-dioxo-2, 9-dioxa-4, 7-diazaundecan-11-oic acid, d-4 (0.50 g, 500 umol) , N, N-diisopropylethylamine (DIEA) (2.00 mmol) , dichloromethane (10.0 mL) were added into swell. The resin was mixed for 2 hrs, then added with methanol (5.00 mL) and mixed for 30 mins. And then, the resin was washed with N, N-Dimethylformamide (10.0 mL) for 5 times. The resin was treated with 20%piperidine in N, N-Dimethylformamide for 30 mins for Fmoc deprotection. The resin was washed with N, N-Dimethylformamide for 3 times. Then Fmoc-Phe-OH (1.50 mmol) was added and mixed for 30 secs, then O-Benzotriazole-N, N, N, N-tetramethyl-uronium-hexafluorophosphate (HBTU) (1.50 mmol) and N, N-diisopropylethylamine (DIEA) (3.00 mmol) in N, N-Dimethylformamide were added, and bubbled by N2 for 30 mins. The resin was washed with N, N-Dimethylformamide for 3 times. The above step was repeated for next amino acid Fmoc-Gly-OH (1.50 mmol) and special amino acid, 2- ( (7- (2, 5-dioxo-2, 5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl) -1, 1, 1-trifluoroheptan-2-yl) amino) acetic acid (0.20 g, 1.31 mmol) coupling at 25℃. The reaction was detected by ninhydrin test. The coupling reaction was monitored by ninhydrin color reaction. After washing with methanol 10.0 mL and drying under vacuum, 20.0 mL of cleavage buffer (20%HFIP/80%DCM) was added to the flask containing the resin of peptide stirred for 2 mins for 2 times. The HFIP-mixture was removed in vacuum to give a residue. The residue was purified by Flash (Eluent of 10-50%H2O/CH3CN on C-18 column chromatography) . Then the resulting product was freeze-dried to give (2S, 10S) -10-benzyl-23- (2, 5-dioxo-2, 5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl) -2-methyl-6, 9, 12, 15-tetraoxo-18- (trifluoromethyl) -3-oxa-5, 8, 11, 14, 17-pentaazatricosan-1-oic acid, d-5 (55.0 mg, 9.98%yield) as a white solid.
Step 4: (Deruxtecan analog 1-2)
To a mixture of (2S, 10S) -10-benzyl-23- (2, 5-dioxo-2, 5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl) -2-methyl- 6,9, 12, 15-tetraoxo-18- (trifluoromethyl) -3-oxa-5, 8, 11, 14, 17-pentaazatricosan-1-oic acid, d-5 (20.0 mg, 29.2 umol) and 1-hydroxy-7-azabenzotriazole (HOAt) (7.95 mg, 58.4 umol) in N, N-Dimethylformamide (0.50 mL) was added Exatecan mesylate (15.5 mg, 29.2 umol) and N, N-diisopropylcarbondiimide (DIC) (22.1 mg, 175 umol, 27.1 uL) and N, N-diisopropylethylamine (DIEA) (7.55 mg, 58.4 umol, 10.1 uL, ) , then the mixture was stirred at 25 ℃ for 3 hrs. LC-MS showed raw material was consumed completely and one main peak with desired mass was detected. The reaction mixture was filtered to remove the undissolved residue. The residue was purified by prep-HPLC (TFA condition) . Then the resulting product was freeze-dried to give Deruxtecan analog 1-2 (18.8 mg, 17.0 umol, 58.4%yield, 96.3%purity) as a light yellow solid.
Synthesis of compound 1-3 (also called Deruxtecan analog 1-3 in FIG. 5)
Step 1: benzyl 1- (9H-fluoren-9-yl) -3, 6-dioxo-2, 9-dioxa-4, 7-diazadodecan-12-oate (e-3)
To a mixture of compound a-3 (500 mg, 1.36 mmol) and compound e-2 (366 mg, 2.04 mmol) in THF (5.00 mL) was added 4-methylbenzenesulfonic acid monohydrate (12.9 mg, 67.8 umol) , then the mixture was stirred at 25 ℃ for 3 hrs. LC-MS showed compound a-3 was consumed completely and one main peak with desired mass was detected. The mixture was diluted with NaHCO3 (50.0 mL) and extracted with EtOAc (50.0 mL) . The combined organic layers were dried with Na2SO4, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by column chromatography on silica gel (100-200 mesh silica gel) eluted with (Petroleum ether/Ethyl acetate = 50/1 to 1/1) to give compound e-3 (400 mg, 60.3%yield) as a white solid. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) : δ ppm 7.90 (d, J=7.4 Hz, 2 H) , 7.73 (d, J=7.0 Hz, 2 H) , 7.24 -7.64 (m, 9 H) , 5.05 -5.14 (m, 2 H) , 4.48 -4.62 (m, 4 H) , 4.16 -4.34 (m, 3 H) , 3.54 -3.72 (m, 4 H) .
Step 2: 1- (9H-fluoren-9-yl) -3, 6-dioxo-2, 9-dioxa-4, 7-diazadodecan-12-oic acid (e-4)
To a mixture of compound e-3 (400 mg, 818 umol) in ethanol (10.0 mL) and ethyl acetate (10.0 mL) was added dry Pd/C (0.05 g) , then the reaction mixture was stirred at 25 ℃ under H2 atmosphere (15 psi) for 5 hrs. TLC (DCM/MeOH= 10: 1, Rf = 0.2) showed compound e-3 was consumed and one new spot was formed. The reaction mixture was fileted through siliceous earth, and the filtrate was concentrated under reduced pressure to give compound e-4 (300 mg, 91.9%yield) as a white solid. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) : δ ppm 7.90 (d, J=7.4 Hz, 2 H) , 7.73 (d, J=7.0 Hz, 2 H) , 7.24 -7.64 (m, 4 H) , 5.05 -5.14 (m, 2 H) , 4.48 -4.62 (m, 2 H) , 4.16 -4.34 (m, 3 H) , 3.54 -3.72 (m, 4 H) .
Step 3: (11S) -11-benzyl-24- (2, 5-dioxo-2, 5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl) -7, 10, 13, 16-tetraoxo-19- (trifluoromethyl) -4-oxa-6, 9, 12, 15, 18-pentaazatetracosan-1-oic acid (e-5, i.e., L-1-3)
To a mixture containing CTC-Resin (0.50 g, 14.1 mmol) and compound e-4 (0.20 g, 520 umol) , DIEA (0.25 g, 1.95 mmol) , DCM (10.0 mL) were added into swell. The resin was mixed for 2 hrs, then MeOH (5.00 mL) was added and mixed for 30 mins. And then, the resin was washed with DMF (10.0 mL) for 3 times. The resin was treated with 20%piperidine in DMF for 30 min for Fmoc de-protection. The resin was washed with DMF for 5 times. Then Fmoc-Phe-OH (0.58g, 1.31 mmol) was added and mixed for 30 seconds, then HBTU (0.54 g, 1.43 mmol) and DIEA (0.25 g, 1.95 mmol) in DMF were added and bubbled by N2 for 30 mins. The resin was washed with DMF for 3 times. The above step was repeated for next amino acid Fmoc-Gly-OH (0.53 g, 1.50 mmol) and special amino acid, 2- ( (7- (2, 5-dioxo-2, 5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl) -1, 1, 1-trifluoroheptan-2-yl) amino) acetic acid (0.20 g, 1.31 mmol) coupling at 25 ℃. The reaction was detected by ninhydrin test. The coupling reaction was monitored by ninhydrin color reaction. After washing with MeOH 10.0 mL and drying under vacuum, 20.0 mL of cleavage buffer (20%HFIP/80%DCM) was added to the flask containing the resin of peptide stirred for 2 mins for 2 times. The HFIP-mixture was removed in vacuum to give a residue. The residue was purified by Flash (Eluent of 10-50%H2O/CH3CN on C-18 column chromatography) . Then the resulting product was freeze-dried to give compound e-5 (30.0 mg, 4.39%yield) as a white solid.
Step 4: (Deruxtecan analog 1-3)
To a mixture of compound e-5 (27.2 mg, 37.6 umol, ) in DMF (1.00 mL) was added HATU (9.30 mg, 24.4 umol) , the reaction mixture was stirred at 25 ℃ for 20 mins. EXATECAN MESYLATE (10.0 mg, 18.8 umol) and DIEA (4.86 mg, 37.6 umol) were added to the reaction mixture and kept at 40 ℃ for 2 hrs. TLC (DCM: MeOH = 10: 1, Rf = 0.4) showed the reaction was complete. Traces of DMF were removed in vacuum to give a residue. The residue was purified by Flash (Eluent of 10-50%H2O/CH3CN on C-18 column chromatography) . Then the resulting product was freeze-dried to give Deruxtecan analog 1-3 (7.20 mg, 34.7%yield) as a light yellow solid.
Synthesis of compound 1-4 (also called Deruxtecan analog 1-4 in FIG. 6)
Step 1: (S) -methyl 1- (9H-fluoren-9-yl) -11-methyl-3, 6-dioxo-2, 9-dioxa-4, 7-diazadodecan-12-oate (f-3)
To a mixture of (2- ( ( ( (9H-fluoren-9-yl) methoxy) carbonyl) amino) acetamido) methyl acetate (5g, 13.5 mmol) and (S) -methyl 3-hydroxy-2-methylpropanoate (3.21 g, 27.1 mmol) in tetrahydrofuran (50.0 mL) was added 4-methylbenzenesulfonic acid hydrate (129 mg, 678 umol) , then the mixture was stirred at 25 ℃ for 1 hrs. LC-MS showed raw material was consumed completely and one main peak with desired mass was detected. The residue was purified by prep- HPLC (TFA condition) . Compound (S) -methyl 1- (9H-fluoren-9-yl) -11-methyl-3, 6-dioxo-2, 9-dioxa-4, 7-diazadodecan-12-oate, f-3 (4.79 g, 11.2 mmol, 82.7%yield) was obtained as a yellow oil.
Step 2: (S) -1- (9H-fluoren-9-yl) -11-methyl-3, 6-dioxo-2, 9-dioxa-4, 7-diazadodecan-12-oic acid (f-4)
To a solution of (S) -methyl 1- (9H-fluoren-9-yl) -11-methyl-3, 6-dioxo-2, 9-dioxa-4, 7-diazadodecan-12-oate, f-3 (4.79 g, 11.2 mmol) in mixture of tetrahydrofuran (20.0 mL) and water (20.0 mL) was added lithium hydroxide monohydrate (942 mg, 22.4 mmol) , the mixture was stirred at 25 ℃ for 2 hrs. LC-MS showed raw material was consumed completely and one main peak with desired mass was detected. Acetic acid was added to acidic, then ammonium was added to base, then (2, 5-dioxopyrrolidin-1-yl) 9H-fluoren-9-ylmethyl carbonate (8.21 g, 24.3 mmol) and sodiu hydrogen carbonate (2.04 g, 24.3 mmol) were added. The mixture was stirred at 25 ℃ for 2 hr.LC-MS showed raw material was consumed completely and one main peak with desired mass was detected. TLC (Dichloromethane /Methanol = 10: 1, Rf = 0.3) showed raw material was consumed and one new spot was formed. The reaction mixture was concentrated under reduced pressure to remove water and tetrahydrofuran to give a residue. The crude product was purified by column chromatography (SiO2, Dichloromethane/Methanol=100/1 to 20/1) to give (S) -1- (9H-fluoren-9-yl) -11-methyl-3, 6-dioxo-2, 9-dioxa-4, 7-diazadodecan-12-oic acid, f-4 (1.25 g, 3.03 mmol, 12.45%yield) as light yellow liquid as light yellow oil.
Step 3: (11S) -11-benzyl-24- (2, 5-dioxo-2, 5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl) -2-methyl-7, 10, 13, 16-tetraoxo-19- (trifluoromethyl) -4-oxa-6, 9, 12, 15, 18-pentaazatetracosan-1-oic acid (f-5, i.e., L-1-4)
To a mixture containing CTC-Resin (1.5 g, 1.50 mmol) and (S) -1- (9H-fluoren-9-yl) -11-methyl-3, 6-dioxo-2, 9-dioxa-4, 7-diazadodecan-12-oic acid, f-4 (0.60 g, 1.50 mmol) , N, N-diisopropylethylamine (DIEA) (6.00 mmol) , dichloromethane (10.0 mL) were added into swell. The resin was mixed for 2 hrs, then methanol (5.00 mL) was added and mixed for 30 mins. And then, the resin was washed with N, N-Dimethylformamide (10.0 mL) for 5 times. The resin was treated with 20%piperidine in N, N-Dimethylformamide for 30 mins for Fmoc deprotection. The resin was washed with N, N-Dimethylformamide for 3 times. Then Fmoc-Phe-OH (4.50 mmol) was added and mixed for 30 secs, then O-Benzotriazole-N, N, N, N-tetramethyl-uronium-hexafluorophosphate (HBTU) (4.50 mmol) and N, N-diisopropylethylamine (DIEA) (9.00 mmol) in N, N-Dimethylformamide were added and bubbled by N2 for 30 mins. The resin was washed with N, N-Dimethylformamide for 3 times. The above step was repeated for next amino acid Fmoc-Gly-OH (4.50 mmol) and special  amino acid, 2- ( (7- (2, 5-dioxo-2, 5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl) -1, 1, 1-trifluoroheptan-2-yl) amino) acetic acid (0.20 g, 1.31 mmol) coupling at 25℃. The reaction was detected by ninhydrin test. The coupling reaction was monitored by ninhydrin color reaction. After washing with methanol 10.0 mL and drying under vacuum, 20.0 mL of cleavage buffer (20%HFIP/80%DCM) was added to the flask containing the resin of peptide stirred for 2 mins for 2 times. The HFIP-mixture was removed in vacuum to give a residue. The residue was purified by Flash (Eluent of 10-50%H2O/CH3CN on C-18 column chromatography) . Then the resulting product was freeze-dried to give (11S) -11-benzyl-24- (2, 5-dioxo-2, 5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl) -2-methyl-7, 10, 13, 16-tetraoxo-19- (trifluoromethyl) -4-oxa-6, 9, 12, 15, 18-pentaazatetracosan-1-oic acid, f-5 (167 mg, 9.80%yield) as a white solid.
Step 4: (Deruxtecan analog 1-4)
To a mixture of (11S) -11-benzyl-24- (2, 5-dioxo-2, 5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl) -2-methyl-7, 10, 13, 16-tetraoxo-19- (trifluoromethyl) -4-oxa-6, 9, 12, 15, 18-pentaazatetracosan-1-oic acid, f-5 (20.0 mg, 28.6 umol) and 1-hydroxy-7-azabenzotriazole (HOAt) (7.79 mg, 57.2 umol) in N, N-Dimethylformamide (0.50 mL) was added Exatecan mesylate (15.2 mg, 28.6 umol) and N, N-diisopropylcarbondiimide (DIC) (21.6 mg, 171 umol, 26.5 uL) and N, N-diisopropylethylamine (DIEA) (7.40 mg, 57.2 umol, 9.97 uL) , then the mixture was stirred at 25 ℃ for 3 hrs. LC-MS showed raw material was consumed completely and one main peak with desired mass was detected. The reaction mixture was filtered to remove the undissolved residue. The residue was purified by prep-HPLC (TFA condition) . Then the resulting product was freeze-dried to give Deruxtecan analog 1-4 (6 mg, 5.20 umol, 18.1%yield, 96.2%purity) as a light yellow solid.
Synthesis of compound 1-8 (also called Deruxtecan analog 1-8 in FIG. 7)
Step 1: benzyl 2- (2- (benzyloxy) ethoxy) propanoate (g-2)
To a stirred DMF (100 mL) was added NaH (3.33 g, 83.2 mmol, 60%purity) in batches at 0 ℃ under N2. Benzyl (2S) -2-hydroxypropanoate (d-2, 10.0 g, 55.5 mmol) was added to above solution dropwise at 0 ℃ and stirred at 25 ℃ for 0.5 hrs. Then, 2-bromoethoxymethylbenzene (14.3 g, 66.6 mmol) was added to above solution at 0 ℃. The reaction was stirred at 25 ℃ for 16 hrs. TLC (Petroleum ether /Ethyl acetate = 5: 1, Rf = 0.2) showed the reaction was complete. The reaction mixture was quenched by addition water (1000 mL) at 0℃, and extracted with dichloromethane (200 mL x 3) . The combined organic layers were washed with brine (200 mL) , dried over anhydrous sodium sulfate, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by column chromatography (silica gel, Petroleum ether/Ethyl acetate = 50/1 to 5/1) to give benzyl 2- (2- (benzyloxy) ethoxy) propanoate, g-2 (790 mg, 4.53%yield) as a  colorless oil. δ ppm 7.29 -7.43 (m, 10 H) , 5.10 -5.30 (m, 2 H) , 4.58 (d, g=2.01 Hz, 2 H) , 4.14 (q, g=6.86 Hz, 1 H) , 3.75 -3.87 (m, 1 H) , 3.60 -3.73 (m, 3 H) , 1.47 (d, g=7.03 Hz, 3 H) .
Step 2: 2- (2-hydroxyethoxy) propanoic acid (g-3)
The 100 mL round-bottom flask was purged with Ar for 3 times and added with dry Pd/C (160 mg) carefully. Then methanol (～10.0 mL) was added to infiltrate the Pd/C completely, followed by the solution benzyl (2S) -2- (2-benzyloxyethoxy) propanoate, g-2 (790 mg, 2.51 mmol) in MeOH (20.0 mL) slowly under Ar. The resulting mixture was degassed and purged with H2 for 3 times, and then the mixture was stirred at 25 ℃ for 4 hrs under H2 atmosphere. TLC (Petroleum ether /Ethyl acetate = 5: 1, Rf = 0.2) showed the reaction was complete. The reaction was filtered and concentrated under reduced pressure to give a product 2- (2-hydroxyethoxy) propanoic acid, g-3 (320 mg, crude) as light yellow liquid, the crude product was used for next step directly without purification. 1H NMR (400 MHz, DMSO) : δ ppm 4.02 (q, g=6.78 Hz, 1 H) , 3.66 -3.70 (m, 2 H) , 3.60 -3.66 (m, 1 H) , 3.49 -3.56 (m, 1 H) , 1.39 (d, g=7.03 Hz, 3 H) .
Step 3: benzyl 2- (2-hydroxyethoxy) propanoate (g-4)
To a solution of (2S) -2- (2-hydroxyethoxy) propanoic acid, g-3 (320 mg, 2.39 mmol) in MeOH (4 mL) and H2O (0.8 mL) was added Cs2CO3 (389 mg, 1.19 mmol) . The mixture was stirred at 25 ℃ for 0.5 hrs and concentrated. Then bromomethylbenzene (449 mg, 2.62 mmol) and DMF (2 mL) was added. The mixture was stirred at 25 ℃ for 16 hrs. TLC (Petroleum ether /Ethyl acetate = 3: 1, Rf = 0.4) showed the reaction was complete. The mixture was diluted with water (50.0 mL) and extracted with DCM (30 mL x 3) . The combined organic layers were dried with anhydrous sodium sulfate, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by column chromatography on silica gel (100-200 mesh silica gel) eluted with (Petroleum ether /Ethyl acetate =20/1 to 5/1) to give benzyl 2- (2-hydroxyethoxy) propanoate, g-4 (340 mg, 64%yield) as a white solid. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) : δ ppm 7.37 (s, 5 H) , 5.15 -5.26 (m, 2 H) , 4.04 -4.15 (m, 1 H) , 3.71 -3.76 (m, 2 H) , 3.60 -3.68 (m, 2 H) , 1.46 (d, g=7.03 Hz, 3 H) .
Step 4: benzyl 1- (9H-fluoren-9-yl) -13-methyl-3, 6-dioxo-2, 9, 12-trioxa-4, 7-diazatetradecan-14-oate (g-6)
To a solution of [ [2- (9H-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino) acetyl] amino] methyl acetate (a-3) (614 mg, 1.67 mmol) in THF (8 mL) was added TsOH. H2O (14.4 mg, 75.8 umol) and benzyl 2- (2-hydroxyethoxy) propanoate, g-4 (340 mg, 1.52 mmol) . The mixture was stirred at 25 ℃ for 6 hrs. The reaction mixture was concentrated under reduced pressure to remove solvent. The residue  was diluted with Sat. NaHCO3 (50 mL) and extracted with DCM (30 mL x 3) . The combined organic layers were washed with brine (30 mL) , dried over Na2SO4 filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. TLC (Petroleum ether /Ethyl acetate = 1: 1, Rf = 0.4) showed the reaction was complete. The residue was purified by column chromatography on silica gel (100-200 mesh silica gel) eluted with (Petroleum ether /Ethyl acetate =20/1 to 5/1) to give benzyl 1-(9H-fluoren-9-yl) -13-methyl-3, 6-dioxo-2, 9, 12-trioxa-4, 7-diazatetradecan-14-oate, g-6 (416 mg, 781 umol, 51.5%yield) as a white solid. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) : δ ppm 7.77 (d, g=7.53 Hz, 2 H) , 7.61 (br d, g=7.28 Hz, 2 H) , 7.39 -7.43 (m, 2 H) , 7.28 -7.38 (m, 7 H) , 7.21 (br s, 1 H) , 5.53 (br s, 1 H) , 5.19 (s, 2 H) , 4.93 -5.03 (m, 1 H) , 4.67 (br s, 1 H) , 4.44 (d, g=7.03 Hz, 2 H) , 4.22 -4.27 (m, 1 H) , 4.05 (q, g=7.03 Hz, 1 H) , 3.92 (br s, 2 H) , 3.76 (br s, 1 H) , 3.71 (br d, g=9.03 Hz, 2 H) , 3.55 (br d, g=8.53 Hz, 1 H) , 1.44 (d, g=6.78 Hz, 3 H) .
Step 5: 1- (9H-fluoren-9-yl) -13-methyl-3, 6-dioxo-2, 9, 12-trioxa-4, 7-diazatetradecan-14-oic acid (g-7)
The 100 mL round-bottom flask was purged with Ar for 3 times and added with dry Pd/C (60 mg) carefully. Then THF (5 mL) was added to infiltrate the Pd/C completely, followed by the solution of benzyl 1- (9H-fluoren-9-yl) -13-methyl-3, 6-dioxo-2, 9, 12-trioxa-4, 7-diazatetradecan-14-oate, g-6 (416 mg, 781 umol) in THF (10 mL) slowly under Ar. The resulting mixture was degassed and purged with H2 for 3 times, and then the mixture was stirred at 2 hrs 25 ℃ for 2 hrs under H2 (15 psi) . TLC (Petroleum ether /Ethyl acetate = 1: 1, Rf = 0.4) showed the reaction was complete. The reaction was filtered and concentrated under reduced pressure to give a product 1-(9H-fluoren-9-yl) -13-methyl-3, 6-dioxo-2, 9, 12-trioxa-4, 7-diazatetradecan-14-oic acid, g-7 (320 mg, 92.6%yield) as white gum, the crude product was used in next step without purification. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) : δ ppm 7.77 (d, g=7.53 Hz, 2 H) , 7.60 (br d, g=7.28 Hz, 2 H) , 7.38 -7.44 (m, 2 H) , 7.29 -7.35 (m, 2 H) , 5.48 -5.65 (m, 1 H) , 4.95 (br s, 1 H) , 4.70 (dd, g=10.54, 6.02 Hz, 1 H) , 4.42 -4.52 (m, 2 H) , 4.23 (t, g=6.78 Hz, 1 H) , 4.02 (q, g=6.86 Hz, 1 H) , 3.94 (br s, 1 H) , 3.83 -3.92 (m, 1 H) , 3.75 -3.82 (m, 2 H) , 3.73 (br d, g=6.78 Hz, 2 H) , 3.58 -3.67 (m, 1 H) , 1.42 -1.48 (m, 3 H) .
Step 6: (13S) -13-benzyl-26- (2, 5-dioxo-2, 5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl) -2-methyl-9, 12, 15, 18-tetraoxo-21- (trifluoromethyl) -3, 6-dioxa-8, 11, 14, 17, 20-pentaazahexacosan-1-oic acid (g-8, i.e., L-1-8)
Peptide Synthesis:
The peptide was synthesized using standard Fmoc chemistry.
1) Add DCM to the vessel containing CTC Resin (1.5 mmol, 1.5 g, Sub=1.01 mmol/g) and 1- (9H-fluoren-9-yl) -13-methyl-3, 6-dioxo-2, 9, 12-trioxa-4, 7-diazatetradecan-14-oic acid (0.6 g, 1.5 mmol 1.0 eq ) with N2 bubbling.
2) Add DIEA (4.0 eq) dropwise and mix for 2 hours.
3) Add MeOH (0.5 mL) and mix for 30 min.
4) Drain and wash with DMF for 5 times.
5) Add 20%piperidine/DMF and react on 30 min.
6) Drain and wash with DMF for 3 times.
7) Add Fmoc-amino acid solution and mix for 30 seconds, then add activation buffer, N2 bubbling for about 0.5hour.
8) Repeat step 5 to 7 for next amino acid coupling.
Note:
20%piperidine in DMF was used for Fmoc deprotection for 30 mins. The coupling reaction was monitored by ninhydrin test, and the resin was washed with DMF for 5 times.
Peptide Cleavage and Purification:
1) The resin was washed with MeOH for 3 times and dried by vacuum.
2) A cleavage buffer (20%HFIP /DCM) was added to the peptide Resin, and stirred for 0.5 hr for 3 times.
3) The DCM was concentrated under reduced pressure.
4) The peptide is dried in high vacuum for 2 hours to give the compound g-8 (100 mg, 90%) .
Step 7: (Deruxtecan analog 1-8)
To a solution of compound g-8 (20.0 mg, 27.5 umol) in DMF (200 uL) was added DIC (19.8 mg, 157 umol) , HOAT (7.12 mg, 52.3 umol) , (10S) -23-amino-10-ethyl-18-fluoro-10-hydroxy-19-methyl-8-oxa-4, 15-diazahexacyclo [14.7.1.02, 14.04, 13.06, 11.020, 24] tetracosa-1, 6 (11) , 12, 14, 16 (24) , 17, 19-heptaene-5, 9-dione (13.9 mg, 26.1 umol, MsOH) and DIEA (6.76  mg, 52.3 umol) . The mixture was stirred at 25 ℃ for 8 hrs. LC-MS showed compound g-8 was consumed completely and one main peak with desired m/z was detected. Traces of N, N-Dimethylformamide were removed in vacuum to give a residue. The residue was purified by Flash (Eluent of 10-50%water/acetonitrile on C-18 column chromatography) . Then the resulting product was freeze-dried to give compound Deruxtecan analog 1-8 (12 mg, 10.5 umol) as a yellow solid. LCMS (ESI, m/z) : 1145.4 [M+H] +: 1146.6 (Xbrige C18, 3.5 um, 2.1 x 30 mm column, Wavelength: UV 220 nm &254 nm; Column temperature: 30 ℃) eluting with 0.1%TFA in water : 0.1%TFA in acetonitrile (10-80_2 min) . HPLC (Gemini-NX C18 5um 110A 150 x 4.6mm column, Wavelength: UV 220 nm &254 nm; Column temperature: 30 ℃) eluting with 0.1%TFA in water : 0.1%TFA in acetonitrile (40-70_20+3 min) .
Synthesis of compound 3-4 (also called Deruxtecan analog 3-4 in FIG. 8)
Step 1: (S) -2-acetamido-6- (2, 5-dioxo-2, 5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl) hexanoic acid (h-3)
To a solution of (2S) -2-acetamido-6-amino-hexanoic acid (2.00 g, 10.6 mmol) in Sat NaHCO3 (50 mL) was added methyl 2, 5-dioxopyrrole-1-carboxylate (1.65 g, 10.6 mmol) . The mixture was stirred at 25 ℃ for 4 hrs. LC-MS showed compound h-1 was consumed completely and one main peak with desired m/z was detected. The reaction mixture was quenched by addition of H2SO4 at 0℃ to PH = 3-4, and then extracted with EA (100 mL x 3) . The combined organic layers were washed with brine (50 mL x 1) , dried over Na2SO4, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by column chromatography (silica gel, DCM/MeOH=100/1 to 20/1) to give (S) -2-acetamido-6- (2, 5-dioxo-2, 5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl) hexanoic acid, h-3 (460 mg, 1.71 mmol) . 1H NMR (400 MHz, CDCl3) : δ ppm 6.71 (s, 2 H) , 6.30 (br d, g=7.28 Hz, 1 H) , 4.48 -4.59 (m, 1 H) , 3.54 (t, g=6.78 Hz, 2 H) , 2.08 (s, 3 H) , 1.90 -2.00 (m, 1 H) , 1.75 -1.84 (m, 1 H) , 1.56 -1.70 (m, 2 H) , 1.31 -1.45 (m, 2 H) .
Step 2: (19S) -10-benzyl-19- (4- (2, 5-dioxo-2, 5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl) butyl) -6, 9, 12, 15, 18, 21-hexaoxo-3-oxa-5, 8, 11, 14, 17, 20-hexaazadocosan-1-oic acid (h-4, i.e., L-3-4) 
Peptide Synthesis:
The peptide was synthesized using standard Fmoc chemistry.
1) Add DCM to the vessel containing CTC Resin (0.5 mmol, 0.5 g, Sub=1.01 mmol/g) and 1- (9H-fluoren-9-yl) -3, 6-dioxo-2, 9-dioxa-4, 7-diazaundecan-11-oic acid (0.2 g, 0.5 mmol, 1.0 eq ) with N2 bubbling.
2) Add DIEA (4.0 eq) dropwise and mix for 2 hours.
3) Add MeOH (0.5 mL) and mix for 30 min.
4) Drain and wash with DMF for 5 times.
5) Add 20%piperidine/DMF and react on 30 min.
6) Drain and wash with DMF for 3 times.
7) Add Fmoc-amino acid solution and mix for 30 seconds, then add activation buffer, N2 bubbling for about 0.5hour.
8) Repeat step 5 to 7 for next amino acid coupling.
Note:
20%piperidine in DMF was used for Fmoc deprotection for 30 mins. The coupling reaction was monitored by ninhydrin test, and the resin was washed with DMF for 5 times.
Peptide Cleavage and Purification:
1) The resin was washed with MeOH for 3 times and dried by vacuum.
2) Added cleavage buffer (20%HFIP /DCM) to the peptide Resin stirring for 0.5 hr for 3 times.
3) The DCM was concentrated under reduced pressure.
4) The peptide is dried in high vacuum for 2 hours to give compound h-4 (100 mg, 95%) .
Step 3: (Deruxtecan analog 3-4)
To a solution of compound h-4 (20.0 mg, 29.7 umol) in DMF (500 uL) was added DIC (15.6 mg, 124 umol) , EXATECAN MESYLATE (13.2 mg, 24.7 umol) and HOBt (3.68 mg, 27.2 umol) . The mixture was stirred at 25 ℃ for 16 hrs. TLC (DCM/MeOH = 10/1, Rf = 0.4) showed the reaction was complete. Traces of N, N-Dimethylformamide were removed in vacuum to give a residue. The residue was purified by Flash (Eluent of 10-50%water/acetonitrile on C-18 column chromatography) . Then the resulting product was freeze-dried to give compound Deruxtecan analog 3-4 (7 mg, 6.42 umol, ) as a yellow solid. LCMS (ESI, m/z) : 1090.4 [M+H] +: 1091.4 (Xbrige C18, 3.5 um, 2.1 x 30 mm column, Wavelength: UV 220 nm &254 nm; Column temperature: 30 ℃) eluting with 0.1%TFA in water : 0.1%TFA  in acetonitrile (10-80_2 min) . HPLC (Gemini-NX C18 5um 110A 150 x 4.6mm column, Wavelength: UV 220 nm &254 nm; Column temperature: 30 ℃) eluting with 0.1%TFA in water : 0.1%TFA in acetonitrile (25-55_20+3 min) .
(d) Synthesis of the ″Native Linker-payload″
In the context of the present disclosure, the term ″native linker-payload″ (also referred to as ″native-LP″ or ″nat-LP″ herein below) refers to a compound having the following structure:
The native-LP has the same structure as Deruxtecan in Enhertu, both containing the maleimide-GGFG pepetide linker. In this example, the native-LP was purchased under the name ″Deruxtecan″ from MedChemExpress.
Example 2: Synthesis of Antibody-drug Conjugates
Antibody-drug conjugates were synthesized according the following general procedure: an antibody in a pH7 PBS solution was first reduced by 2～20 equivalent of TCEP for a period of time raging from 0.5 to 18 hrs; with or without removal of residual TCEP by column or membrane, a linker-load in excess (15～18 molar excess) was introduced; the conjugation reaction was finished in half to several hours at a temperature ranging from 4℃ to RT, followed by HPLC purification to provide the final ADC product.
Notes: 1: Expressed as Ab followed by the numeral code for each Linker-payload moiety 
2: Molar ratio 
3: Also termed ″Her-Dxd″ or ″Her-nat-LP″ herein below 
Example 3: Cleavage of Linker-payloads
Method 
Reaction buffer (40 mM H3PO4/H3BO3/HAc, 1 mM EDTA, pH 4.5) , 135 mM Cysteine, DMA (N, N’ -Dimethylacetamide, 2%, v/v) , sample (0.015 μmol linker-payload compound) and cathepsin B (16 U/μmol linker-payload compound) were added in sequence into a 1.5 mL EP vial. The final cysteine concentration in thus obtained 300 μL hydrolysis system was 10 mM. The EP vial was placed in a 37℃ water bath.
After hydrolysis for around 15min, 2 hr, 5 hr and 16 hr, the mixture was vortexed well and then sampled (25 μL) . Into the sampled mixture, Cathepsin B inhibitor E64 (2.5 equivalent to cathepsin B) was added to deactivate cathepsin B before analysis by RP-HPLC and RP-MS. Cleavage percentages were calculated from the peak area of the hydrolyzed linker-payload relative to the area sum of the non-hydrolyzed plus the hydrolyzed, as detected by RP-HPLC or RP-MS.
Results
Digestion (expressed in percentages) along a time period of around 16 hours (overnight) were summarized in Table 1, which showed a comparison of digestion efficiency by cathespin B among linker-payloads. As seen, all the tested linker-payloads of the invention were digested faster than  or at least comparable to (as observed with Compound 3-1) the native linker-payload.
Table 1
In FIG. 9, cleavage site and modification on the linker moiety in Compound 1-1 were indicated in panel (a) , as in comparison with the native linker-payload; and percentages (%) of cleavage are shown in panel (b) , wherein the percentages were calculated based on the peak areas of released drugs as detected by reverse-phase HPLC (mixed mode) chromatogram. In consistency with the results in Table 1, the linker-payloads of the invention were digested faster.
Example 4: Cleavage of Linker-payload moiety in ADC
Method
The reaction conditions were set the same as in Example 3 for hydrolysis of linker-payloads per se. Specifically, reaction buffer (40 mM H3PO4/H3BO3/HAc, 1 mM EDTA, pH 4.5) , 135 mM Cysteine, DMA (2%, v/v) , sample (0.015 μmol ADC) and cathepsin B (16 U/μmol ADC) were added in sequence into a 1.5 mL EP vial. The final cysteine concentration in the 300 μL hydrolysis system was 10 mM. The EP vial was placed in a 37℃ water bath.
After hydrolysis for 10min, 5 hr, 24 hr and 48 hr, the mixture was vortexed well and then 25 μL sampled. Into the sampled mixture, Cathepsin inhibitor E64 (2.5 equivalent to cathepsin B) was added to deactivate cathepsin B before analysis by reverse-phase LC-MS. The hydrolysis rate was calculated based on the decrease of DAR determined from MS spectra.
Results
Percentages of digestion over time were summarized in Table 2, which showed a comparison  of digestion efficiency by cathepsin B among different linker-payload moieties in ADCs. It is clear that ADCs comprising linker-payload moieties 1-2, 1-3, 3-1 and 3-4 had faster drug release rates in the presence of cathepsin B. Interestingly in a separated hydrolysis experiment where mixed mode column was used to quantitate the released drug via cleavage, we observed that the ADC comprising linker-payload moiety 1-1 released the drug slightly faster than the ADC comprising the native linker-payload.
Table 2
In FIG. 10, cleavage site and modification in comparison with the native linker-payload moiety in ADC are indicated in panel (a) , and percentage (%) of cleavage of the linker-payloads in ADCs over time is shown in panel (b) , wherein the percentages were calculated based on the peak areas of released drugs (supra) . At 48hr, the hydrolysis percentage was 18.5%for ADC-1-1 (i.e. ADC comprising linker-payload moiety 1-1) , while 15.5%for ADC-native LP.
Example 5: Freeze-Thaw Stability
Method
ADC samples (～10mg/mL in 20 mM Histidine, 150mM NaCl, pH6.0) in Eppendorf tubes were taken out from a -80℃ freezer and thawed at room temperature for 30 min. The ADC samples were then frozen at -80℃ for 2 days and thawed at room temperature for 30 min; and the freeze/thaw process was repeated one more time. After that, 20 μl of each sample was subjected to SEC and MS to measure DAR and drug distribution. Percentages (molar ratio) of each species (L0, L1, L2, H0, H1, H2, H4, etc., wherein ″L″ refers to light chain, ″H″ refers to heavy chain, and the numeral refers to the number of drug molecules linked onto the chain) in each sample were determined based on peak areas of the species.
Results
Changes in the unwanted species, i.e., L2 (ADCs with two drug molecules linked on the light chain) and H4 (ADCs with four drug molecules linked on the heavy chain) , and in DAR after two freeze-and-thaw (F/T) cycles were summarized in Table 3. As seen, for the ADCs comprising the linker-payload moieties according to the invention, the L2 species remained zero (0) after two freeze-and-thaw cycles, while for Her-Dxd (i.e., Trastuzumab deruxtecan) , the L2 species rose to 0.76%. The H4%in Her-Dxd was also the highest. The ADC comprising linker-payload moiety 1-8 exhibited the lightest DAR drop after two freeze-and-thaw cycles. Overall, the eight ADC analogs all contained less undesired H4 than Her-Dxd while maintained stable DAR after Freeze-and-thaw cycles.
Table 3
Note: ″Her″ = ″Herceptin″ , aka. ″Trastuzumab″ ; and ″Fresh″ refers to the samples of newly synthesized ADCs that were not subjected to the freeze-and-thaw cycles yet.
Example 6: Detection of H4 species in ADCs
Method
ADCs were formulated in 20 mM Histidine buffer comprising 150mM NaCl, pH6.0. The obtained ADC samples were subjected to LC-MS analysis to determine drug distribution on light and heavy chains. Ideally, only 5 species, L0, H0, L1, H1 and H2, can be found. Aggregation percentage was determined by HPLC.
Results
Table 4 shows a comparison of the non-specific and unwanted H4%among ADCs. In the case of Trastuzumab deruxtecan using the native linker-payload, i.e., the Her-Dxd control, H4%(molar ratio) was 3%after synthesis, while in the case of Her-1-8, the unwanted species was significantly decreased to 0.8%. As seen, ADC products produced with the linker-payloads of the invention contain less unwanted species.
Table 4

Example 7: Removal of un-conjugated linker-payloads
After conjugation as described in Example 2, the ADCs were buffer exchanged into 20 mM Histidine buffer comprising 150mM NaCl (pH6.0) via spin desalting column (40 kDa) . In Table 5, is a comparison among ADCs using different linker-payloads on removal of free linker-payloads (i.e., un-conjugated linker-payloads) . The free linker-payloads were removed via UFDF. In the case of Her-Dxd (i.e., Trastuzumab deruxtecan) , the conjugation product had an amount of residual free linker-payload approaching 5%, while in the case of products produced using the linker-payloads of the invention, the amount was 2%or less.
As seen, the linker-payloads of the invention provide improved operability in purification, for instance, by allowing for an easier and more complete removal of residual free linker-payloads from an ADC conjugation product. Without being limited to any particular theories, it is believed that introduction of the dipolar moiety to the linker moiety increases water solubility of the linker-payload and facilitates its removal, e.g., by UFDF. This property is meaningful for the process of ADC manufacturing.
Table 5
Example 8: Binding Assay
Method
Binding to human HER2 in vitro were assayed by FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting) . On the assay day, tumor cells expressing HER-2 (1×105 cells/well) were incubated with serially-diluted ADCs for 1-2 hours at 4℃. Her-Dxd, prepared as described in Example 2, was used as the reference ADC and positive control. The buffer used to dissolve the ADCs (20 mM Histidine buffer comprisng 150mM NaCl (pH6.0) ) was used as the negative control. After incubation, the cells were washed with the FACS staining buffer, and then the secondary antibody  Alexa647-conjugated goat anti-human IgG Fc (Jackson) diluted in the FACS staining buffer was added. The plates were incubated at 4℃ for 20-60 minutes in dark. Then, fluorescence intensity was measured on flow cytometer (BD FACS Canto II) and data analyzed by FlowJo software. The EC50 values were calculated using GraphPad Prism software.
Result
Results were shown in FIG. 11. As tested on N87 cells, the test ADCs of the invention were observed with an EC50 around 1nM, while 0.9 nM for Her-Dxd. As tested on JIMT-1 cells, the test ADCs of the invention were observed with an EC50 of 0.4～0.7nM, while 0.4 nM for Her-Dxd. As tested on MDA-MB-231 cells, the test ADCs of the invention (except for Her3-1) were observed with an EC50 of 0.5～0.7 nM, while 0.6 for Her-Dxd. As seen, the ADCs of the invention, featuring the linkers and the linker-payloads of the invention, provided at least comparable or even better binding affinity compared with trastuzumab deruxtecan.
Example 9: Cytotoxicity Assay
Method 
The ability to inhibit tumor cells growth was measured by cytotoxicity assay in vitro. Tumor cell lines (purchased from ATCC) , NCI-N87, HCC1954, MDA-MB-231 and JIMT-1 cells, were routinely cultured in RPMI1640 medium or DMEM medium. The day before the assay day, cells were seeded into 96-well plates in the culture medium at appropriate cell densities. On the next day, ADCs were serially diluted in the culture medium and added to each well. Her-Dxd prepared as described in Example 2 was used as the reference ADC and positive control. The buffer to dissolve ADCs was used as the negative control. The plates were then kept at 37℃ and 5%CO2 in incubator. After 4-6 days, cell viability was tested using CellTiter-Glo (Promega) . The IC50 values were calculated using GraphPad Prism software.
Result
Results are shown in FIG. 12. While neither the test ADCs of the invention nor Her-Dxd were observed with active cytotoxicity on JIMT-1 and MDA-MB-231 cells (IC50 ＞1nM) , in N87 and HCC1954 cells, all the test ADCs of the invention showed cytotoxicity comparable to the native ADC, with IC50 being around 0.1 nM. As seen, the ADCs of the invention, featuring the linkers and the linker-payloads of the invention, provided at least comparable cytotoxicity as compared to trastuzumab deruxtecan.

Claims (18)

  1. A compound of formula I:
    an enantiomer, a diastereoisomer, a racemate, a solvate, a hydrate, or a pharmaceutically acceptable salt or ester thereof;
    wherein, ″*″ indicates a chiral center, which is S-or R-or racemic; and the hydrogen atom attached to the chiral carbon atom and the hydrogen atom attached to the carbon atom with a R2 substituent are omitted from the formula;
    L1 is - (CH2) a-, wherein a is an integer from 0 to 10, or - (CH2CH2O) b-, wherein b is an integer from 1 to 36;
    L2 is - (CH2) c-, wherein c is an integer from 1 to 10, or - (CH2CH2O) d-, wherein d is an integer from 1 to 36;
    L3 is absent, or is - (CH2) e-, wherein e is an integer from 1 to 10, or - (CH2CH2O) f-, wherein f is an integer from 1 to 36;
    R1 is -CF3, -NRaRb, -NRa (C=O) Rb, or -O (CH2) gCH3, wherein g is an integer from 0 to 3, Ra is H, or -C1-6 alkyl, Rb is H or -C1-6 alkyl;
    R2 is -H, -C1-6 alkyl, or -O (CH2) hCH3, wherein h is an integer from 0 to 3;
    X is halo, -OR3 or -NR4R5;
    R3 is -H, -C1-6 alkyl or halo;
    R4 and R5 are independently -H or -C1-6 alkyl;
    n= 0 or 1; and
    m= 0 or 1.
  2. The compound of claim 1, wherein L1 is - (CH2) a-, wherein a is an integer from 2 to 6;
    L2 is - (CH2) c-, wherein c is an integer from 1 to 6;
    L3 is absent, or is - (CH2) e-, wherein e is an integer from 1 to 6, or - (CH2CH2O) f-, wherein f is an integer from 1 to 20;
    R1 is -CF3, -N (CH3) 2, -NH (C=O) CH3, or -O (CH2) 2CH3;
    R2 is -H, or -C1-6 alkyl; and/or
    R3 is -H, -CH3, t-butyl or Cl.
  3. The compound of claim 1, wherein L1 is - (CH2) a-, wherein a is an integer from 4 to 5;
    L2 is - (CH2) c-, wherein c is an integer from 1 to 2;
    L3 is absent, or is - (CH2) e-, wherein e is an integer from 1 to 2, or - (CH2CH2O) f-, wherein f is an integer from 1 to 2;
    R1 is -CF3, -N (CH3) 2, or -NH (C=O) CH3;
    R2 is -H, or -CH3; and/or
    R3 is -H, -CH3, t-butyl or Cl.
  4. The compound of claim 1, wherein the compound is selected from the groups consisting of L-1-1, L-1-2, L-1-3, L-1-4, L-1-7, L-1-8, L-3-1 and L-3-4 as shown below, or a pharmaceutically acceptable salt or ester thereof:

    wherein ″*″ indicates a chiral center, which is racemic.
  5. A conjugate compound of formula II:
    an enantiomer, a diastereoisomer, a racemate, a solvate, a hydrate, or a pharmaceutically acceptable salt or ester thereof;
    wherein, ″*″ indicates a chiral center, which is S-or R-or racemic; and the hydrogen atom attached to the chiral carbon atom and the hydrogen atom attached to the carbon atom with a R2 substituent are omitted from the formula;
    L1 is - (CH2) a-, wherein a is an integer from 0 to 10, or - (CH2CH2O) b-, wherein b is an integer from 1 to 36;
    L2 is - (CH2) c-, wherein c is an integer from 1 to 10, or - (CH2CH2O) d-, wherein d is an integer from 1 to 36;
    L3 is absent, or is - (CH2) e-, wherein e is an integer from 1 to 10, or - (CH2CH2O) f-, wherein f is an integer from 1 to 36;
    R1 is -CF3, -NRaRb, -NRa (C=O) Rb, or -O (CH2) gCH3, wherein g is an integer from 0 to 3, Ra is H, or -C1-6 alkyl, Rb is H or -C1-6 alkyl;
    R2 is -H, -C1-6 alkyl, or -O (CH2) hCH3, wherein h is an integer from 0 to 3;
    n= 0 or 1;
    m= 0 or 1; and
    ″DRUG″ is a drug moiety covalently conjugated to the linker moiety.
  6. The conjugate compound of claim 5, wherein L1 is - (CH2) a-, wherein a is an integer from 2 to 6;
    L2 is - (CH2) c-, wherein c is an integer from 1 to 6;
    L3 is absent, or is - (CH2) e-, wherein e is an integer from 1 to 6, or - (CH2CH2O) f-, wherein f is an integer from 1 to 20;
    R1 is -CF3, -N (CH3) 2, -NH (C=O) CH3, or -O (CH2) 2CH3; and/or
    R2 is -H, or -C1-6 alkyl.
  7. The conjugate compound of claim 5, wherein L1 is - (CH2) a-, wherein a is an integer from 4 to 5;
    L2 is - (CH2) c-, wherein c is an integer from 1 to 2;
    L3 is absent, or is - (CH2) e-, wherein e is an integer from 1 to 2, or - (CH2CH2O) f-, wherein f is an integer from 1 to 2;
    R1 is -CF3, -N (CH3) 2, or -NH (C=O) CH3; and/or
    R2 is -H, or -CH3.
  8. A conjugate compound according to claim 5, having the structure of formula IIa:
    an enantiomer, a diastereoisomer, a racemate, a solvate, a hydrate, or a pharmaceutically acceptable salt or ester thereof; wherein, ″*″ , L1, L2, L3, R1, R2, n and m are define as in claim 5.
  9. A conjugate compound according to claim 5, having a structure selected from the group consisting of:


    wherein ″*″ indicates a chiral center, which is racemic.
  10. An antibody-drug conjugate of formula III:
    an enantiomer, a diastereoisomer, a racemate, a solvate, a hydrate, or a pharmaceutically acceptable salt or ester thereof;
    wherein, ″*″ indicates a chiral center, which is S-or R-or racemic and the hydrogen atom attached to the chiral carbon atom and the hydrogen atom attached to the carbon atom with a R2 substituent are omitted from the formula;
    L1 is - (CH2) a-, wherein a is an integer from 0 to 10, or - (CH2CH2O) b-, wherein b is an integer from 1 to 36;
    L2 is - (CH2) c-, wherein c is an integer from 1 to 10, or - (CH2CH2O) d-, wherein d is an integer from 1 to 36;
    L3 is absent, or is - (CH2) e-, wherein e is an integer from 1 to 10, or - (CH2CH2O) f-, wherein f is an integer from 1 to 36;
    R1 is -CF3, -NRaRb, -NRa (C=O) Rb, or -O (CH2) gCH3, wherein g is an integer from 0 to 3, Ra is H, or -C1-6 alkyl, Rb is H or -C1-6 alkyl;
    R2 is -H, -C1-6 alkyl, or -O (CH2) hCH3, wherein h is an integer from 0 to 3;
    n= 0 or 1;
    m= 0 or 1;
    ″DRUG″ is a drug moiety covalently conjugated to the linker moiety;
    p is 1 to 8, and
    Ab is an antibody.
  11. The antibody-drug conjugate of claim 10, wherein L1 is - (CH2) a-, wherein a is an integer from 2 to 6;
    L2 is - (CH2) c-, wherein c is an integer from 1 to 6;
    L3 is absent, or is - (CH2) e-, wherein e is an integer from 1 to 6, or - (CH2CH2O) f-, wherein f is an integer from 1 to 20;
    R1 is -CF3, -N (CH3) 2, -NH (C=O) CH3, or -O (CH2) 2CH3;
    R2 is -H, or -C1-6 alkyl; and/or
    p is 2, 4, or 6.
  12. The antibody-drug conjugate of claim 10, wherein L1 is - (CH2) a-, wherein a is an integer from 4 to 5;
    L2 is - (CH2) c-, wherein c is an integer from 1 to 2;
    L3 is absent, or is - (CH2) e-, wherein e is an integer from 1 to 2, or - (CH2CH2O) f-, wherein f is an integer from 1 to 2;
    R1 is -CF3, -N (CH3) 2, or -NH (C=O) CH3;
    R2 is -H, or -CH3;
    ″DRUG″ is exatecan;
    p is 4; and/or
    Ab is Trastuzumab.
  13. The antibody-drug conjugate of claim 10, having a structure selected from the group consisting of:

    wherein ″*″ indicates a chiral center, which is racemic.
  14. The antibody-drug conjugate of claim 13, wherein p is 2 4, or 6; and/or Ab is Trastuzumab.
  15. A method of producing a linker-payload compound, comprising conjugating a drug with the compound according to claim 1.
  16. The method of claim 15, wherein the drug is exatecan.
  17. A method of producing an antibody-drug-conjugate, comprising:
    (a) conjugating a drug with the compound according to claim 1 to obtain a linker-payload compound; and
    (b) conjugating an antibody with the linker-payload compound obtained in step (a) .
  18. The method of claim 17, wherein the drug is exatecan.
PCT/CN2023/105774 2022-07-05 2023-07-04 Linker for conjugation WO2024008102A1 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CNPCT/CN2022/103893 2022-07-05
CN2022103893 2022-07-05

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2024008102A1 true WO2024008102A1 (en) 2024-01-11

Family

ID=88049575

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/CN2023/105774 WO2024008102A1 (en) 2022-07-05 2023-07-04 Linker for conjugation

Country Status (3)

Country Link
CN (1) CN116789733A (en)
TW (1) TW202402736A (en)
WO (1) WO2024008102A1 (en)

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104755494A (en) * 2012-10-11 2015-07-01 第一三共株式会社 Antibody-drug conjugate
CN105073139A (en) * 2013-02-14 2015-11-18 百时美施贵宝公司 Tubulysin compounds, methods of making and use
CN106163559A (en) * 2014-04-10 2016-11-23 第三共株式会社 Anti-HER3 antibody drug conjugates
WO2018066626A1 (en) * 2016-10-07 2018-04-12 第一三共株式会社 Therapy for drug-resistant cancer by administration of anti-her2 antibody/drug conjugate
CN111936169A (en) * 2018-04-06 2020-11-13 西雅图遗传学公司 Camptothecin peptide conjugates
CN112138171A (en) * 2019-06-28 2020-12-29 上海复旦张江生物医药股份有限公司 Antibody coupling drug, intermediate thereof, preparation method and application
WO2021190586A1 (en) * 2020-03-25 2021-09-30 江苏恒瑞医药股份有限公司 B7h3 antibody-exatecan analogue conjugate and pharmaceutical use thereof
WO2021249228A1 (en) * 2020-06-08 2021-12-16 四川百利药业有限责任公司 Camptothecin drug having high-stability hydrophilic connecting unit and conjugate thereof
WO2022099762A1 (en) * 2020-11-12 2022-05-19 博瑞生物医药（苏州）股份有限公司 Antibody conjugate intermediate and preparation method therefor

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA3108754A1 (en) * 2018-08-06 2020-02-13 Daiichi Sankyo Company, Limited Combination of antibody-drug conjugate and tubulin inhibitor
MX2021003382A (en) * 2018-09-26 2021-05-27 Jiangsu Hengrui Medicine Co Ligand-drug conjugate of exatecan analogue, preparation method therefor and application thereof.
AU2020214507A1 (en) * 2019-01-30 2021-08-19 Coherent Biopharma (Suzhou), Limited Bi-ligand drug conjugate and use thereof
CN111689980A (en) * 2019-05-26 2020-09-22 四川百利药业有限责任公司 Camptothecin drug and antibody conjugate thereof
WO2020259258A1 (en) * 2019-06-28 2020-12-30 上海复旦张江生物医药股份有限公司 Antibody-drug conjugate, intermediate thereof, preparation method therefor and application thereof
CN112125915A (en) * 2019-09-18 2020-12-25 四川百利药业有限责任公司 Camptothecin derivative and conjugate thereof
CN115515644A (en) * 2020-06-28 2022-12-23 昆山新蕴达生物科技有限公司 Antibody-drug conjugate, preparation method and application thereof

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104755494A (en) * 2012-10-11 2015-07-01 第一三共株式会社 Antibody-drug conjugate
CN105073139A (en) * 2013-02-14 2015-11-18 百时美施贵宝公司 Tubulysin compounds, methods of making and use
CN106163559A (en) * 2014-04-10 2016-11-23 第三共株式会社 Anti-HER3 antibody drug conjugates
WO2018066626A1 (en) * 2016-10-07 2018-04-12 第一三共株式会社 Therapy for drug-resistant cancer by administration of anti-her2 antibody/drug conjugate
CN111936169A (en) * 2018-04-06 2020-11-13 西雅图遗传学公司 Camptothecin peptide conjugates
CN112138171A (en) * 2019-06-28 2020-12-29 上海复旦张江生物医药股份有限公司 Antibody coupling drug, intermediate thereof, preparation method and application
WO2021190586A1 (en) * 2020-03-25 2021-09-30 江苏恒瑞医药股份有限公司 B7h3 antibody-exatecan analogue conjugate and pharmaceutical use thereof
WO2021249228A1 (en) * 2020-06-08 2021-12-16 四川百利药业有限责任公司 Camptothecin drug having high-stability hydrophilic connecting unit and conjugate thereof
WO2022099762A1 (en) * 2020-11-12 2022-05-19 博瑞生物医药（苏州）股份有限公司 Antibody conjugate intermediate and preparation method therefor

Also Published As

Publication number Publication date
CN116789733A (en) 2023-09-22
TW202402736A (en) 2024-01-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7014856B2 (en) Self-stabilizing linker conjugate
JP6328649B2 (en) Drug-protein conjugate
TWI811726B (en) Pegylated drug-linkers for improved ligand-drug conjugate pharmacokinetics
KR102076219B1 (en) Tridentate connexon and use thereof
KR102051503B1 (en) Stability-modulating linkers for use with antibody drug conjugates
KR20150119086A (en) Tubulysin compounds, methods of making and use
CA3075218A1 (en) Transglutaminase conjugation method and linker
EP3302570B1 (en) Trimaleimide linkers and uses thereof
WO2022218331A1 (en) Linkers, conjugates and applications thereof
US20220226490A1 (en) Glycoside-Containing Peptide Linkers for Antibody-Drug Conjugates
KR102493853B1 (en) Seco-cyclopropapyrroloindole compounds, antibody-drug conjugates thereof, and methods of manufacture and use
CN110575548A (en) Antibody-drug conjugate targeting CD73 and preparation method and application thereof
EP3801629A1 (en) Modified self-immolating moieties for use in prodrugs and conjugates and methods of using and making
EP3617221A1 (en) Cytotoxin and conjugate, uses of same, and preparation method therefor
WO2024008102A1 (en) Linker for conjugation
Hu et al. Synthesis, characterization, and targeted chemotherapy of SCT200-linker-monomethyl auristatin E conjugates
US20210393789A1 (en) Sulfatase-Cleavable Linkers for Antibody-Drug Conjugates
WO2024012569A9 (en) Linkers, conjugates and applications thereof
WO2024078612A1 (en) Linker-payload compound, conjugates and applications thereof
JP2023551203A (en) Glycosidic double cleavage linkers for antibody-drug conjugates
WO2023083900A1 (en) Conjugates comprising a phosphorus (v) and a drug moiety
CN116783208A (en) Glycoside double cleavage linker for antibody-drug conjugates

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 23834869

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1