WO2020063676A1 - 依喜替康类似物的配体-药物偶联物及其制备方法和应用 - Google Patents

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章瑛
蔡晓峰
屈博磊
梁金栋
张连山
贺峰
陶维康
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江苏恒瑞医药股份有限公司
上海恒瑞医药有限公司
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    • C07D491/22—Heterocyclic compounds containing in the condensed ring system both one or more rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms and one or more rings having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by groups C07D451/00 - C07D459/00, C07D463/00, C07D477/00 or C07D489/00 in which the condensed system contains four or more hetero rings
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    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
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    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin

Definitions

  • the present disclosure relates to a novel class of ligand-drug conjugates of ixetikon (or esatican) analogs. Specifically, the present disclosure relates to an antibody-drug conjugate containing an estetikon analogue of the structural unit Y, and a method for preparing the same, and a pharmaceutical composition including the conjugate and the conjugate Or use of a pharmaceutical composition.
  • Chemotherapy remains one of the most important anti-cancer methods including surgery, radiotherapy, and targeted therapies. Although there are many types of high-efficiency cytotoxins, the difference between tumor cells and normal cells is small, which limits the widespread clinical application of these anti-tumor compounds due to toxic side effects.
  • the specificity of anti-tumor monoclonal antibodies for tumor cell surface antigens, antibody drugs have become the front-line drugs for anti-tumor treatment, but when using antibodies alone as anti-tumor drugs, the efficacy is often unsatisfactory.
  • camptothecin derivative which has an antitumor effect by inhibiting topoisomerase I.
  • Report of camptothecin derivative Ixatecan (chemical name: (1S, 9S) -1-amino-9-ethyl-5-fluoro-2,3-dihydro-9-hydroxy-4-methyl-1H , 12H-benzo [de] pyrano [3 ', 4': 6,7] imidazo [1,2-b] quinoline-10,13 (9H, 15H) -dione) used in antibody couples
  • the literature of the combined drug (ADC) includes WO2014057687; Clinical Research (2016) 22 (20): 5097-5108; Cancer Sci (2016) 107: 1039-1046. However, further development of ADC drugs with better efficacy is still needed.
  • R a and R 2 together with the carbon atom to which they are attached form a cycloalkyl or heterocyclic group
  • the wavy line in -D represents a hydrogen atom, or is covalently linked to a linker unit or an antibody that binds to an antigen expressed by a target cell;
  • R 1 is cycloalkylalkyl or cycloalkyl; preferably C 3-6 cycloalkylalkyl or C 3-6 cycloalkyl;
  • the provided ligand-drug conjugate or a pharmaceutically acceptable salt or solvent compound thereof is a ligand-drug conjugate represented by the general formula (Pc-LY-Dr) Or a pharmaceutically acceptable salt or solvent compound thereof:
  • R a and R b together with the carbon atom to which they are attached form a cycloalkyl or heterocyclic group
  • R 1 and R 2 together with the carbon atom to which they are attached form a cycloalkyl or heterocyclic group
  • n is an integer from 0 to 4.
  • R a and R b are the same or different and are each independently selected from a hydrogen atom, a deuterium atom, a halogen or an alkyl group;
  • m 0 or 1.
  • R 1 is C 3-6 cycloalkylalkyl or C 3-6 cycloalkyl
  • m 0 or 1.
  • R 1 is C 3-6 cycloalkylalkyl or C 3-6 cycloalkyl
  • R 2 is a hydrogen atom
  • a ligand-drug conjugate or a pharmaceutically acceptable salt or solvate thereof, wherein the O-terminus of -Y- is connected to the linker unit L.
  • the provided ligand-drug conjugate or a pharmaceutically acceptable salt or solvent compound thereof is a ligand-drug conjugate represented by the general formula (Pc-L-D1) Or a pharmaceutically acceptable salt or solvate thereof:
  • R 1 and R 2 together with the carbon atom to which they are attached form a C 3-6 cycloalkyl group
  • n 1 to 10, which can be an integer or a decimal
  • Pc is a ligand
  • L is a linker unit.
  • n 2 to 8 and may be an integer or may be Is a decimal; preferably from 3 to 8, it can be an integer or a decimal.
  • the ligand-drug conjugate or a pharmaceutically acceptable salt or solvate thereof according to the present invention, wherein the linker unit -L- is -L 1 -L 2 -L 3 -L 4- ,
  • L 2 is selected from -NR 4 (CH 2 CH 2 O) p 1 CH 2 CH 2 C (O)-, -NR 4 (CH 2 CH 2 O) p 1 CH 2 C (O)-, -S (CH 2 ) p 1 C (O)-or chemical bond, wherein p 1 is an integer from 1 to 20; preferably a chemical bond;
  • L 3 is a peptide residue composed of 2 to 7 amino acids, wherein the amino acid is optionally further selected from the group consisting of halogen, hydroxy, cyano, amino, alkyl, chloroalkyl, deuterated alkyl, alkoxy, and cyclic Substituted with one or more substituents in the alkyl group;
  • L 4 is selected from -NR 5 (CR 6 R 7 ) t- , -C (O) NR 5 , -C (O) NR 5 (CH 2 ) t -or a chemical bond, where t is an integer from 1 to 6; preferably Is -NR 5 (CR 6 R 7 ) t-;
  • R 3 , R 4 and R 5 are the same or different and are each independently selected from a hydrogen atom, an alkyl group, a haloalkyl group, a deuterated alkyl group, and a hydroxyalkyl group;
  • R 6 and R 7 are the same or different, and are each independently selected from a hydrogen atom, a halogen, an alkyl group, a haloalkyl group, a deuterated alkyl group, and a hydroxyalkyl group.
  • the ligand-drug conjugate or a pharmaceutically acceptable salt or solvent compound thereof wherein the linker unit L 1 is selected from-(succinimid-3-yl-N)-( CH 2 ) s 1 -C (O)-,-(succinimid-3-yl-N) -CH 2 -cyclohexyl-C (O)-,-(succinimid-3-yl-N )-(CH 2 CH 2 O) s 2 -CH 2 CH 2 -C (O)-, -CH 2 -C (O) -NR 3- (CH 2 ) s 3 -C (O)-or -C (O)-(CH 2 ) s 4 C (O)-, where s 1 is an integer from 2 to 8, s 2 is an integer from 1 to 3, s 3 is an integer from 1 to 8, and s 4 is 1 to 8 An integer; s 1 is preferably 5.
  • the ligand-drug conjugate or a pharmaceutically acceptable salt or solvent compound thereof wherein the linker unit L 2 is selected from -NR 4 (CH 2 CH 2 O) p 1 CH 2 C (O)-or chemical bond, p 1 is an integer from 6 to 12.
  • a ligand-drug conjugate or a pharmaceutically acceptable salt or solvent compound thereof wherein L 4 is selected from -NR 5 (CR 6 R 7 ) t-, and R 5 is selected From a hydrogen atom or an alkyl group, R 6 and R 7 are the same or different and are each independently a hydrogen atom or an alkyl group, t is 1 or 2, preferably 2; L 4 is preferably -NR 5 CR 6 R 7- L 4 is more preferably -NHCH 2- .
  • the provided ligand-drug conjugate or a pharmaceutically acceptable salt or solvent compound thereof wherein the linker unit -L- is -L 1 -L 2 -L 3 -L 4- ,
  • L 1 is s 1 is an integer from 2 to 8;
  • L 2 is a chemical bond
  • L 3 is a tetrapeptide residue
  • L 4 is -NR 5 (CR 6 R 7 ) t-, R 5 is selected from a hydrogen atom or an alkyl group, R 6 and R 7 are the same or different, and are each independently a hydrogen atom or an alkyl group, and t is 1 or 2 .
  • the provided ligand-drug conjugate or a pharmaceutically acceptable salt or solvent compound thereof wherein the linker unit -L- is -L 1 -L 2 -L 3 -L 4- ,
  • L 1 is-(succinimide-3-yl-N) -CH 2 -cyclohexyl-C (O)-;
  • L 2 is -NR 4 (CH 2 CH 2 O) 9 CH 2 C (O)-;
  • L 3 is a tetrapeptide residue
  • L 4 is -NR 5 (CR 6 R 7 ) t-, R 5 is selected from a hydrogen atom or an alkyl group, R 6 and R 7 are the same or different, and are each independently a hydrogen atom or an alkyl group, and t is 1 or 2 .
  • the provided ligand-drug conjugate or a pharmaceutically acceptable salt or solvent compound thereof wherein the peptide residue of L 3 is composed of one, two or more Selected from phenylalanine (E), glycine (G), valine (V), lysine (K), citrulline, serine (S), glutamic acid (E), aspartic acid Amino acid residues formed from amino acids in (N); preferably amino acid residues formed from one, two or more amino acids selected from phenylalanine and glycine; more preferably tetrapeptide residues; most preferably GGFG (Glycine-glycine-phenylalanine-glycine) tetrapeptide residue.
  • a ligand-drug conjugate or a pharmaceutically acceptable salt or solvent compound thereof wherein the linker unit -L- is connected at its L 1 end to the ligand, L The 4 terminal is connected to Y.
  • a ligand-drug conjugate or a pharmaceutically acceptable salt or solvate thereof wherein -L-Y- is:
  • L 1 is selected from-(succinimid-3-yl-N)-(CH 2 ) s 1 -C (O)-or-(succinimid-3-yl-N) -CH 2 -cyclohexyl -C (O)-;
  • L 2 is -NR 4 (CH 2 CH 2 O) p 1 CH 2 C (O)-or a chemical bond, and p 1 is an integer from 6 to 12;
  • L 3 is a tetrapeptide residue of GGFG
  • R 1 is cycloalkylalkyl or cycloalkyl; preferably C 3-6 cycloalkylalkyl or C 3-6 cycloalkyl;
  • R 1 and R 2 together with the carbon atom to which they are attached form a C 3-6 cycloalkyl group
  • R 5 is selected from a hydrogen atom or an alkyl group
  • R 6 and R 7 are the same or different, and are each independently a hydrogen atom or an alkyl group
  • s 1 is an integer from 2 to 8; preferably 5;
  • n is an integer from 0 to 4.
  • a ligand-drug conjugate or a pharmaceutically acceptable salt or solvate thereof wherein -L-Y- is:
  • L 2 is -NR 4 (CH 2 CH 2 O) 9 CH 2 C (O)-;
  • L 3 is a tetrapeptide residue of GGFG
  • R 1 is cycloalkylalkyl or cycloalkyl; preferably C 3-6 cycloalkylalkyl or C 3-6 cycloalkyl;
  • R 2 is selected from a hydrogen atom, a haloalkyl group or a C 3-6 cycloalkyl group; preferably a hydrogen atom;
  • R 1 and R 2 together with the carbon atom to which they are attached form a C 3-6 cycloalkyl group
  • R 5 is selected from a hydrogen atom or an alkyl group
  • R 6 and R 7 are the same or different, and are each independently a hydrogen atom or an alkyl group
  • n is an integer from 0 to 4.
  • the provided ligand-drug conjugate or a pharmaceutically acceptable salt or solvent compound thereof represented by the general formula (Pc-L-Y-Dr), wherein -L-Y- is
  • L 2 is a chemical bond
  • L 3 is a tetrapeptide residue of GGFG
  • R 1 is cycloalkylalkyl or cycloalkyl; preferably C 3-6 cycloalkylalkyl or C 3-6 cycloalkyl;
  • R 2 is selected from a hydrogen atom, a haloalkyl group or a C 3-6 cycloalkyl group; preferably a hydrogen atom;
  • R 5 is selected from a hydrogen atom or an alkyl group
  • R 6 and R 7 are the same or different, and are each independently a hydrogen atom or an alkyl group
  • n is an integer from 0 to 4.
  • L 1 is selected from-(succinimid-3-yl-N)-(CH 2 ) s 1 -C (O)-or-(succinimid-3-yl-N) -CH 2 -cyclohexyl -C (O)-;
  • L 2 is -NR 4 (CH 2 CH 2 O) p 1 CH 2 C (O)-or a chemical bond, and p 1 is an integer from 1 to 20;
  • L 3 is a tetrapeptide residue of GGFG
  • L 3 is a tetrapeptide residue of GGFG
  • s 1 is an integer from 2 to 8;
  • n is an integer from 0 to 4.
  • a ligand-drug conjugate represented by the general formula (Pc-LY-Dr) or a pharmaceutically acceptable salt or solvent compound thereof is provided, which is the general formula (Pc-L a -Y-Dr) or a pharmaceutically acceptable salt or solvent compound thereof:
  • R 1 is selected from the group consisting of halogen, cycloalkylalkyl, deuterated alkyl, cycloalkyl, heterocyclyl, aryl or heteroaryl; preferably cycloalkylalkyl or cycloalkyl; more preferably C 3-6 Cycloalkylalkyl or C 3-6 cycloalkyl;
  • R 2 is selected from hydrogen, halo, haloalkyl, deuterated alkyl, cycloalkyl, heterocyclyl, aryl or heteroaryl; preferably a hydrogen atom; or, R 1 and R 2 carbon atoms connected thereto with Forming a cycloalkyl or heterocyclic group;
  • R 4 and R 5 are the same or different and are each independently selected from a hydrogen atom, an alkyl group, a haloalkyl group, a deuterated alkyl group, and a hydroxyalkyl group;
  • Pc is a ligand
  • the ligand-drug conjugate represented by the general formula (Pc-L-Y-Dr) of the present disclosure includes, but is not limited to:
  • the ligand-drug conjugate represented by the general formula (Pc-L-Y-Dr) of the present disclosure includes, but is not limited to, the following structural formula:
  • n is a non-zero integer or decimal from 0 to 10, preferably an integer or decimal from 1 to 10; more preferably from 2 to 8 and can be an integer or a decimal; most preferably from 3 to 8 can Is an integer or a decimal.
  • a compound represented by the general formula (D) or a tautomer, a racemate, a racemate, an enantiomer, a diastereomer thereof is provided. , Or a mixture thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof,
  • Y is selected from -O- (CR a R b ) m-CR 1 R 2 -C (O)-, -O-CR 1 R 2- (CR a R b ) m-, -O-CR 1 R 2- -NH- (CR a R b ) m-CR 1 R 2 -C (O)-or -S- (CR a R b ) m-CR 1 R 2 -C (O)-;
  • R a and R b are the same or different and are each independently selected from the group consisting of a hydrogen atom, a deuterium atom, a halogen, an alkyl group, a haloalkyl group, a deuterated alkyl group, an alkoxy group, a hydroxyl group, an amino group, a cyano group, a nitro group, and a hydroxyalkane Radical, cycloalkyl or heterocyclyl;
  • R a and R b together with the carbon atom to which they are attached form a cycloalkyl or heterocyclic group
  • R 1 is selected from halogen, cycloalkylalkyl, deuterated alkyl, cycloalkyl, alkoxyalkyl, heterocyclyl, aryl, or heteroaryl;
  • R 2 is selected from a hydrogen atom, halogen, haloalkyl, deuterated alkyl, cycloalkyl, cycloalkylalkyl, alkoxyalkyl, heterocyclyl, aryl, or heteroaryl;
  • R 1 and R 2 together with the carbon atom to which they are attached form a cycloalkyl or heterocyclic group
  • R a and R 2 together with the carbon atom to which they are attached form a cycloalkyl or heterocyclic group
  • n is an integer from 0 to 4.
  • a compound represented by the general formula (D) or a tautomer, a racemate, a racemate, an enantiomer, a diastereomer is provided.
  • a mixture thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof which is a compound represented by the general formula (D 1 ) or a tautomer, a racemate, a racemate, an enantiomer thereof , Diastereomers, or a mixture thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof,
  • R 1 is C 3-6 cycloalkylalkyl or C 3-6 cycloalkyl
  • R 2 is selected from a hydrogen atom, a halogenated alkyl group or a C 3-6 cycloalkyl group;
  • R 1 and R 2 together with the carbon atom to which they are attached form a C 3-6 cycloalkyl group
  • m 0 or 1.
  • the compound represented by the general formula (D) according to the present disclosure includes, but is not limited to:
  • a tautomer a racemate, a racemate, an enantiomer, a diastereomer, or a mixture thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • a compound represented by the general formula (L a -Y-Dr) or a tautomer, meso, racemate, or enantiomer thereof is provided.
  • W is selected from C 1-8 alkyl, C 1-8 alkyl-cycloalkyl, or 1 to 8 atom straight-chain heteroalkyl, said heteroalkyl containing 1 to 3 selected from N, O, or S Hetero atom, wherein the C 1-8 alkyl, cycloalkyl, and linear heteroalkyl are each optionally further selected from halogen, hydroxy, cyano, amino, alkyl, chloroalkyl, Deuterated alkyl, alkoxy and cycloalkyl substituted with one or more substituents;
  • L 2 is selected from -NR 4 (CH 2 CH 2 O) p 1 CH 2 CH 2 C (O)-, -NR 4 (CH 2 CH 2 O) p 1 CH 2 C (O)-, -S (CH 2 ) p 1 C (O)-or chemical bond, p 1 is an integer from 1 to 20;
  • L 3 is a peptide residue composed of 2 to 7 amino acids, wherein the amino acid is optionally further selected from the group consisting of halogen, hydroxy, cyano, amino, alkyl, chloroalkyl, deuterated alkyl, alkoxy, and cyclic
  • the amino acid is optionally further selected from the group consisting of halogen, hydroxy, cyano, amino, alkyl, chloroalkyl, deuterated alkyl, alkoxy, and cyclic
  • substituents in the alkyl group are substituted, and when substituted, the substituents may be substituted at any available point of attachment, the substituents being one or more independently selected from halogen, hydroxy, cyano Radical, amino, alkyl, chloroalkyl, deuterated alkyl, alkoxy and cycloalkyl;
  • R 1 is selected from halogen, cycloalkylalkyl, deuterated alkyl, cycloalkyl, alkoxyalkyl, heterocyclyl, aryl, or heteroaryl;
  • R 2 is selected from a hydrogen atom, halogen, haloalkyl, deuterated alkyl, cycloalkyl, cycloalkylalkyl, alkoxyalkyl, heterocyclyl, aryl, or heteroaryl; or, R 1 and R 2 forms a cycloalkyl or heterocyclic group together with the carbon atom to which it is attached;
  • R 4 and R 5 are the same or different and are each independently selected from a hydrogen atom, an alkyl group, a haloalkyl group, a deuterated alkyl group, and a hydroxyalkyl group;
  • R 6 and R 7 are the same or different, and are each independently selected from a hydrogen atom, a halogen, an alkyl group, a haloalkyl group, a deuterated alkyl group, and a hydroxyalkyl group;
  • n is an integer from 0 to 4.
  • a compound represented by the general formula (L a -Y-Dr) or a tautomer, meso, racemate, or enantiomer is provided.
  • Diastereomers, or a mixture thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof which is a compound represented by the general formula (L b -Y-Dr) or a tautomer, meso, Racemates, enantiomers, diastereomers, or a mixture thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof:
  • R 1 , R 2 , R 5 to R 7 , s 1 and m are as defined in the general formula (L a -Y-Dr).
  • a tautomer a racemate, a racemate, an enantiomer, a diastereomer, or a mixture thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • a method for preparing a compound represented by the general formula (D 1 ) or a tautomer, meso, racemate, enantiomer, diastereomer thereof comprising the following steps:
  • R 1 , R 2 and m are as defined in the general formula (D 1 ).
  • a method for preparing a compound represented by the general formula (L b -Y-Dr) or a tautomer, meso, racemate, enantiomer, A method of diastereomers, or a mixture thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, comprising the following steps:
  • R 1 , R 2 , R 5 to R 7 , s 1 and m are as defined in the general formula (L b -Y-Dr).
  • a method for preparing a compound represented by the general formula (L b -Y-Dr) or a tautomer, meso, racemate, enantiomer, A method of diastereomers, or a mixture thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, comprising the following steps:
  • R 1 , R 2 , R 5 to R 7 , s 1 and m are as defined in the general formula (L b -Y-Dr).
  • a method for preparing a ligand-drug conjugate represented by the general formula (Pc-L a -Y-Dr) or a pharmaceutically acceptable salt or solvate thereof includes the following steps:
  • the reducing agent is preferably TCEP;
  • Pc is a ligand
  • W, L 2 , L 3 , R 1 , R 2 , R 5 to R 7 , m and n are as defined in the general formula (Pc-L a -Y-Dr).
  • Another aspect of the present disclosure further relates to a pharmaceutical composition containing the compound represented by the general formula (D) according to the present disclosure or a tautomer, meso, racemate, Enantiomers, diastereomers, or a mixture thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, and one or more pharmaceutically acceptable carriers, diluents, or excipients.
  • D general formula
  • Another aspect of the present disclosure further relates to a ligand-drug conjugate, or a pharmaceutically acceptable salt or solvate thereof, comprising a ligand and a drug attached to the ligand, wherein the drug is selected from the present disclosure
  • the compound represented by the general formula (D), the compound represented by the general formula (L a -Y-Dr), or a tautomer, meso, racemate, enantiomer thereof Isomers, diastereomers, or a mixture thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof preferably the drug is linked to the ligand through a linker, and preferably the ligand is a monoclonal antibody.
  • Another aspect of the present disclosure further relates to a method for treating and / or preventing a tumor, the method comprising administering to a patient in need thereof a therapeutically effective dose of a ligand-drug conjugate or compound of the present disclosure, Or a pharmaceutically acceptable salt or solvate thereof or a pharmaceutical composition comprising the same; preferably wherein the tumor is a cancer associated with HER2, HER3 or EGFR expression.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may contain one or more excipients selected from the following ingredients: fillers (diluents), binders, wetting agents, disintegrating agents, or excipients Wait.
  • the composition may contain from 0.1 to 99% by weight of active compound.
  • Oil suspensions can be formulated by suspending the active ingredient in a vegetable oil.
  • the oil suspension may contain a thickener.
  • the sweeteners and flavoring agents described above can be added to provide a palatable formulation.
  • the pharmaceutical composition may also be a dispersible powder and granules used to prepare an aqueous suspension to provide the active ingredient, by adding one or more of a water mixed dispersant, wetting agent, suspending agent or preservative. Other excipients such as sweeteners, flavors and colorants can also be added. These compositions are preserved by the addition of an antioxidant such as ascorbic acid.
  • Figure IB Results of plasma stability experiments of ADC-18 of the present disclosure.
  • Figure 4 Results of a plasma stability experiment of ADC-25 of the present disclosure.
  • Figure 7 The curative effect of ADC of the present disclosure on human glioblastoma U87MG nude mice xenograft tumors.
  • drug refers to a cytotoxic drug, which is expressed as Dr. It has chemical molecules in tumor cells that strongly disrupt its normal growth. Cytotoxic drugs can, in principle, kill tumor cells at a sufficiently high concentration, but due to the lack of specificity, while killing tumor cells, it will also cause apoptosis in normal cells, leading to serious side effects.
  • the term includes toxins, such as small molecule toxins or enzymatically active toxins of bacterial, fungal, plant or animal origin, radioisotopes (e.g.
  • the antibodies of the present disclosure include murine antibodies, chimeric antibodies, humanized antibodies and fully human antibodies, preferably humanized antibodies and fully human antibodies.
  • humanized antibody also known as CDR-grafted antibody, refers to the transplantation of mouse CDR sequences into the human antibody variable region framework, that is, different types of human germline antibodies Antibodies produced in framework sequences. It can overcome the heterogeneous response induced by the chimeric antibody because it carries a large amount of murine protein components.
  • framework sequences can be obtained from a public DNA database including germline antibody gene sequences or published references. For example, germline DNA sequences of human heavy chain and light chain variable region genes can be found in the "VBase" human germline sequence database (available on the Internet www.mrccpe.com.ac.uk/vbase ), and in Kabat, EA, etc.
  • antigen-binding fragment refers to one or more fragments of an antibody that retain the ability to specifically bind an antigen. It has been shown that fragments of a full-length antibody can be used to perform the antigen-binding function of the antibody.
  • binding fragments included in the "antigen-binding fragment” include (i) a Fab fragment, a monovalent fragment composed of VL, VH, CL, and CH1 domains; (ii) a F (ab ') 2 fragment, which is included on the hinge region Bivalent fragment of two Fab fragments linked by a disulfide bridge, (iii) an Fd fragment composed of VH and CH1 domains; (iv) an Fv fragment composed of one-armed VH and VL domains; (v ) A single domain or dAb fragment (Ward et al.
  • the Fab ' can be produced by inserting DNA encoding a Fab' fragment of the antibody into a prokaryotic expression vector or a eukaryotic expression vector and introducing the vector into a prokaryote or eukaryote to express the Fab '.
  • Antigen-binding fragments can also be prepared by conventional methods.
  • the antibody or antigen-binding fragment according to the invention is genetically engineered to add one or more human-derived FR regions to a CDR region of non-human origin.
  • the human FR germline sequence can be obtained by aligning the IMGT human antibody variable region germline gene database with MOE software from the website of ImMunoGeneTics (IMGT) http://imgt.cines.fr, or from the Journal of Immunoglobulins, 2001ISBN012441351 obtain.
  • toxin refers to any substance that can have a deleterious effect on the growth or proliferation of cells, and can be small molecule toxins and their derivatives from bacteria, fungi, plants or animals, including camptothecin derivatives such as isatiate Kang, maytansinoids and their derivatives (CN101573384) such as DM1, DM3, DM4, auristatin F (AF) and their derivatives, such as MMAF, MMAE, 3024 (WO2016 / 127790A1, compound 7), diphtheria toxin , Exotoxin, ricin A chain, acacia A chain, modeccin, alpha-sarcin, sarcin, Aleutitesfordii, toxin, dianthin Toxin, Phytolaca americana Toxin (PAPI, PAPII and PAP-S), Momordica charantia inhibitor, curcin, crotin, sapaonaria officinalis inhibitors, gelonin,
  • the substituent When substituted, the substituent may be substituted at any available point of attachment, and the substituent is preferably independently optionally selected from alkyl, alkenyl, and alkynyl. , Alkoxy, alkylthio, alkylamino, halogen, mercapto, hydroxyl, nitro, cyano, cycloalkyl, heterocyclyl, aryl, heteroaryl, cycloalkoxy, heterocycloalkoxy , Cycloalkylthio, heterocycloalkylthio, and oxo.
  • cycloalkyl refers to a saturated or partially unsaturated monocyclic or polycyclic cyclic hydrocarbon substituent.
  • the cycloalkyl ring contains 3 to 20 carbon atoms, preferably 3 to 12 carbon atoms, and more preferably 3 to 10 carbon atoms. Carbon atoms, most preferably 3 to 8 carbon atoms.
  • spiroheterocyclyl refers to a 5- to 20-membered monocyclic polycyclic heterocyclic group sharing a single atom (called a spiro atom), wherein one or more ring atoms are selected from nitrogen, oxygen, or S (O ) m (where m is an integer from 0 to 2) and the remaining ring atoms are carbon. It can contain one or more double bonds, but none of the rings have a completely conjugated ⁇ -electron system. It is preferably 6 to 14 yuan, and more preferably 7 to 10 yuan.
  • bridged heterocyclyls include:
  • aryl refers to a 6 to 14 membered, all-carbon monocyclic or fused polycyclic (ie, rings that share adjacent pairs of carbon atoms) group having a conjugated pi-electron system, preferably 6 to 10 members, such as benzene And naphthyl, preferably phenyl.
  • the aryl ring may be fused to a heteroaryl, heterocyclic or cycloalkyl ring, wherein the ring connected to the parent structure is an aryl ring, and non-limiting examples thereof include:
  • Heteroaryl may be optionally substituted or unsubstituted.
  • the substituent is preferably one or more of the following groups independently selected from alkyl, alkenyl, alkynyl, alkoxy, alkane Thio, alkylamino, halogen, mercapto, hydroxyl, nitro, cyano, cycloalkyl, heterocycloalkyl, aryl, heteroaryl, cycloalkoxy, heterocycloalkoxy, cycloalkylthio , Heterocycloalkylthio.
  • cycloalkylalkyl refers to an alkyl group substituted with one or more cycloalkyl groups, preferably with a cycloalkyl group, wherein alkyl is as defined above, and cycloalkyl is as defined above.
  • deuterated alkyl refers to an alkyl group substituted with one or more deuterium atoms, wherein alkyl is as defined above.
  • hydroxy refers to the -OH group.
  • halogen refers to fluorine, chlorine, bromine or iodine.
  • nitro refers to -NO 2.
  • amido refers to -C (O) N (alkyl) or (cycloalkyl), wherein alkyl, cycloalkyl are as defined above.
  • carboxylate refers to -C (O) O (alkyl) or (cycloalkyl), wherein alkyl and cycloalkyl are as defined above.
  • the present disclosure also includes compounds of formula (I) in various deuterated forms. Each available hydrogen atom attached to a carbon atom can be independently replaced by a deuterium atom. Those skilled in the art can refer to the related literature to synthesize compounds of formula (I) in deuterated form. Commercially available deuterated starting materials can be used in the preparation of deuterated forms of compounds of formula (I), or they can be synthesized using conventional techniques using deuterated reagents, including but not limited to deuterated borane, trideuterated Borane tetrahydrofuran solution, lithium aluminum deuteride, deuterated iodoethane, and deuterated iodomethane.
  • an heterocyclic group optionally substituted with an alkyl group means that the alkyl group may but need not exist, and this description includes a case where the heterocyclic group is substituted with an alkyl group and a case where the heterocyclic group is not substituted with an alkyl group .
  • Substituted refers to one or more hydrogen atoms in a group, preferably up to 5 and more preferably 1 to 3 hydrogen atoms independently of one another by a corresponding number of substituents. It goes without saying that the substituents are only in their possible chemical positions, and those skilled in the art can determine (by experiment or theory) possible or impossible substitutions without undue effort. For example, an amino or hydroxyl group having free hydrogen may be unstable when combined with a carbon atom having an unsaturated (eg, olefinic) bond.
  • pharmaceutical composition means a mixture containing one or more of the compounds described herein or a physiological / pharmaceutically acceptable salt or prodrug thereof with other chemical components, as well as other components such as physiological / pharmaceutically acceptable Carriers and excipients.
  • the purpose of the pharmaceutical composition is to promote the administration to the organism, which is beneficial to the absorption of the active ingredient and then exerts the biological activity.
  • pharmaceutically acceptable salt refers to a salt of a ligand-drug conjugate of the present disclosure, or a salt of a compound described in the present disclosure, when such salts are used in mammals It is safe and effective, and has due biological activity.
  • the antibody-antibody drug coupling compounds of the present disclosure contain at least one amino group, so they can form salts with acids.
  • Non-limiting examples of pharmaceutically acceptable salts include: Acid salt, hydrobromide, hydroiodate, sulfate, hydrogen sulfate, citrate, acetate, succinate, ascorbate, oxalate, nitrate, citrate, hydrogen phosphate, Dihydrogen phosphate, salicylate, hydrogen citrate, tartrate, maleate, fumarate, formate, benzoate, mesylate, ethanesulfonate, benzenesulfonic acid Salt, p-toluenesulfonate.
  • solvate refers to a ligand-drug coupling compound of the present disclosure that forms a pharmaceutically acceptable solvate with one or more solvent molecules.
  • solvent molecules include water, ethanol, acetonitrile , Isopropanol, DMSO, ethyl acetate.
  • drug loading refers to the average number of cytotoxic drugs loaded on each ligand in a molecule of formula (I), and can also be expressed as the ratio of the amount of drug to the amount of antibody.
  • the range of drug loading can be per ligand (Pc) Connect 0-12, preferably 1-10 cytotoxic drugs (D).
  • the drug loading amount is expressed as n, and exemplary values may be the average of 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10.
  • Conventional methods such as UV / visible spectroscopy, mass spectrometry, ELISA, and HPLC can be used to identify the number of drugs per ADC molecule after the coupling reaction.
  • the cytotoxic drug is coupled to the N-terminal amino group of the ligand and / or the epsilon-amino group of the lysine residue through a linking unit.
  • the The number of drug molecules will be less than the theoretical maximum.
  • carrier refers to a system that can change the way a drug enters the body and its distribution in the body, control the rate of drug release, and deliver the drug to a targeted organ.
  • Drug carrier release and targeting systems can reduce drug degradation and loss, reduce side effects, and increase bioavailability.
  • polymer surfactants that can be used as carriers can self-assemble due to their unique amphiphilic structure to form various forms of aggregates.
  • Preferred examples are micelles, microemulsions, gels, liquid crystals, vesicles, etc. . These aggregates have the ability to encapsulate drug molecules, and at the same time have good permeability to the membrane, and can be used as excellent drug carriers.
  • excipient is an additive in a pharmaceutical formulation other than the main drug and may also be referred to as an excipient.
  • excipients such as adhesives, fillers, disintegrating agents, lubricants in tablets; matrix parts in semi-solid preparations ointments and creams; preservatives, antioxidants, flavoring agents, fragrances, auxiliary agents in liquid preparations Solvents, emulsifiers, solubilizers, osmotic pressure regulators, colorants, etc. can all be called excipients.
  • the term "diluent” is also called a bulking agent, and its main purpose is to increase the weight and volume of a tablet.
  • the addition of the diluent not only ensures a certain volume size, but also reduces the dose deviation of the main components and improves the compression moldability of the drug.
  • an absorbent to absorb the oily substance, so as to keep the "dry” state, so as to facilitate the preparation of the tablet.
  • the pharmaceutical composition may be in the form of a sterile injectable aqueous solution.
  • acceptable vehicles and solvents that may be employed are water, Ringer's solution and isotonic sodium chloride solution.
  • the sterile injectable preparation may be a sterile injectable oil-in-water microemulsion in which the active ingredient is dissolved in the oil phase.
  • the active ingredient is dissolved in a mixture of soybean oil and lecithin.
  • the oil solution is then added to a mixture of water and glycerol to form a microemulsion. Injections or microemulsions can be injected into a patient's bloodstream by local, large injections.
  • solutions and microemulsions are preferably administered in a manner that maintains a constant circulating concentration of the compounds of the present disclosure.
  • continuous intravenous drug delivery devices can be used.
  • An example of such a device is the Deltec CADD-PLUS.TM. 5400 intravenous pump.
  • the pharmaceutical composition may be in the form of a sterile injectable water or oily suspension for intramuscular and subcutaneous administration.
  • This suspension may be formulated according to the known art using those suitable dispersing or wetting agents and suspending agents which have been mentioned above.
  • the sterile injectable preparation may also be a sterile injectable solution or suspension prepared in a non-toxic parenterally acceptable diluent or solvent, for example, a solution prepared in 1,3-butanediol.
  • a sterile fixed oil can be conveniently used as a solvent or suspension medium.
  • any blended fixing oil including synthetic mono- or diesters can be used.
  • fatty acids such as oleic acid can also be prepared for injection.
  • the present disclosure relates to a class of cleavable linking arms with specific structures and actives with specific structures, and antibody drug conjugates (ADCs) composed of linking arms, actives, and antibodies.
  • ADCs antibody drug conjugates
  • This type of ADC is a complex formed by attaching a toxic substance to an antibody via a spacer.
  • the antibody-coupled drug (ADC) is degraded in the body to release active molecules, thereby playing an anti-tumor role.
  • a method for preparing a compound represented by general formula (D1) of the present disclosure, or a pharmaceutically acceptable salt or solvate thereof, the method includes:
  • a compound of the general formula (Y1) and a compound of the general formula (Dr) are reacted in the presence of a condensing agent, optionally under basic conditions, to obtain the general formula (D1),
  • R 1 , R 2 and m are as defined in the general formula (D1).
  • Reagents that provide basic conditions include organic bases and inorganic bases.
  • the organic bases include, but are not limited to, triethylamine, diethylamine, N-methylmorpholine, pyridine, hexahydropyridine, N, N-di Isopropylethylamine, n-butyllithium, lithium diisopropylamide, potassium acetate, sodium tert-butoxide or potassium tert-butoxide
  • the inorganic bases include, but are not limited to, sodium hydride, potassium phosphate, sodium carbonate, Potassium carbonate, cesium carbonate, sodium hydroxide and lithium hydroxide.
  • the condensing agent may be selected from 4- (4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl) -4-methyl chloride morpholine salt, 1-hydroxybenzotriazole and 1 -(3-dimethylaminopropyl) -3-ethylcarbodiimide hydrochloride, N, N'-dicyclohexylcarbodiimide, N, N'-diisopropylcarbodiimide , O-benzotriazole-N, N, N ', N'-tetramethylurea tetrafluoroborate, 1-hydroxybenzotriazole, 1-hydroxy-7-azobenzotriazole O-benzotriazole-N, N, N ', N'-tetramethylurea hexafluorophosphate, 2- (7-azobenzotriazole) -N, N, N', N ' -Tetramethylurea hexafluorophosphate, benzotriazol
  • a method for preparing a compound represented by the general formula (L b -Y-Dr) of the present disclosure, or a pharmaceutically acceptable salt or solvate thereof, the method includes:
  • a compound of the general formula (IB-1) and etheticacon mesylate (1b) are reacted in the presence of a condensing agent, optionally under basic conditions to obtain a compound of the general formula (IB-2);
  • the compound of the general formula (IA) and the compound of the general formula (IB) are reacted in the presence of a condensing agent, optionally under basic conditions, to obtain the general formula (L b -Y-Dr),
  • R c is an amino protecting group; preferably 9-fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc);
  • R 1 , R 2 , R 5 to R 7 , s 1 and m are as defined by the general formula (L b -Y-Dr).
  • Reagents that provide basic conditions include organic bases and inorganic bases.
  • the organic bases include, but are not limited to, triethylamine, diethylamine, N-methylmorpholine, pyridine, hexahydropyridine, N, N-di Isopropylethylamine, n-butyllithium, lithium diisopropylamide, potassium acetate, sodium tert-butoxide or potassium tert-butoxide
  • the inorganic bases include, but are not limited to, sodium hydride, potassium phosphate, sodium carbonate, Potassium carbonate, cesium carbonate, sodium hydroxide and lithium hydroxide.
  • the condensing agent is selected from the group consisting of 4- (4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl) -4-methylchloromorpholine, 1-hydroxybenzotriazole, and 1- (3-dimethylaminopropyl) -3-ethylcarbodiimide hydrochloride, N, N'-dicyclohexylcarbodiimide, N, N'-diisopropylcarbodiimide, O-benzotriazole-N, N, N ', N'-tetramethylurea tetrafluoroborate, 1-hydroxybenzotriazole, 1-hydroxy-7-azobenzotriazole, O-benzotriazole-N, N, N ', N'-tetramethylurea hexafluorophosphate, 2- (7-azobenzotriazole) -N, N, N', N'- Tetramethylurea hexafluorophosphate, benzotriazol-1-
  • the method of the compound represented by the general formula (Pc-L a -Y-Dr) of the present disclosure includes the following steps:
  • the reducing agent is preferably TCEP, and in particular, the disulfide bond on the antibody is preferably reduced;
  • Pc is a ligand
  • W, L 2 , L 3 , R 1 , R 2 , R 5 to R 7 , m and n are as defined in the general formula (Pc-L a -Y-Dr).
  • the experimental methods without specific conditions in the examples of the present disclosure generally follow the conventional conditions or the conditions recommended by the raw material or commodity manufacturers.
  • the reagents without specific sources are conventional reagents purchased on the market.
  • the structure of the compound is determined by nuclear magnetic resonance (NMR) or mass spectrometry (MS).
  • NMR nuclear magnetic resonance
  • MS mass spectrometry
  • the NMR measurement was performed using Bruker AVANCE-400 nuclear magnetic analyzer.
  • the measurement solvents were deuterated dimethyl sulfoxide (DMSO-d6), deuterated chloroform (CDCl 3 ), and deuterated methanol (CD 3 OD).
  • the internal standard was tetramethyl.
  • Silyl (TMS) chemical shifts are given in units of 10 -6 (ppm).
  • MS was measured using a FINNIGAN LCQAd (ESI) mass spectrometer (manufacturer: Thermo, model: Finnigan LCQ advantage MAX).
  • UV-HPLC was measured using a Thermonano2000 UV spectrophotometer.
  • the proliferation inhibition rate and IC 50 value were measured using a PHERAstarFS microplate reader (German BMG).
  • the thin layer chromatography silica gel plate uses Yantai Huanghai HSGF254 or Qingdao GF254 silica gel plate.
  • the silica gel plate used by thin layer chromatography (TLC) uses a size of 0.15mm to 0.2mm.
  • the thin layer chromatography purification product uses a size of 0.4mm ⁇ 0.5mm silicone board.
  • the known starting materials of the present disclosure can be synthesized by or in accordance with methods known in the art, or can be purchased from ABCR GmbH & Co. KG, Acros Organics, Aldrich Chemical Company, Accela ChemBio Inc., Darui Chemical companies.
  • reaction is performed under an argon atmosphere or a nitrogen atmosphere.
  • An argon or nitrogen atmosphere means that the reaction flask is connected to an argon or nitrogen balloon with a volume of about 1 L.
  • the hydrogen atmosphere means that a reaction balloon is connected to a hydrogen gas balloon with a volume of about 1 L.
  • Pressurized hydrogenation reaction uses Parr 3916EKX type hydrogenation instrument and clear blue QL-500 type hydrogen generator or HC2-SS type hydrogenation instrument.
  • the hydrogenation reaction is usually evacuated and charged with hydrogen, and the operation is repeated 3 times.
  • the solution in the reaction refers to an aqueous solution.
  • reaction temperature is room temperature.
  • Room temperature is the most suitable reaction temperature, and the temperature range is from 20 ° C to 30 ° C.
  • the eluent system for column chromatography and the eluent system for thin layer chromatography used to purify compounds include: A: dichloromethane and isopropanol system, B: dichloromethane and methanol system, C: petroleum ether and
  • C petroleum ether
  • the volume ratio of the solvent in the ethyl acetate system is adjusted according to the polarity of the compound, and it can also be adjusted by adding a small amount of triethylamine and acidic or basic reagents.
  • Q-TOF LC / MS Some compounds of this disclosure are characterized by Q-TOF LC / MS.
  • the Q-TOF LC / MS uses an Agilent 6530 accurate mass quadrupole-time of flight mass spectrometer and an Agilent 1290-Infinity ultra high performance liquid chromatograph (Agilent Poroshell 300SB-C8 5 ⁇ m, 2.1 ⁇ 75mm column).
  • reaction solution was purified by high performance liquid chromatography (separation conditions: column: XBridge Prep C18 OBD 5um 19 * 250mm; mobile phase: A-water (10mmol NH 4 OAc): B-acetonitrile, gradient elution, flow rate: 18mL / min), the corresponding components were collected and concentrated under reduced pressure to give the title product 8 (2 mg, yield: 39.0%).
  • the obtained residue was dissolved in 4 mL of dioxane, 2 mL of water was added, sodium bicarbonate (49.2 mg, 0.586 mmol) and 9-fluorenyl methyl chloroformate (126 mg, 0.49 mmol) were added, and the mixture was stirred at room temperature for 2 hours. 20 mL of water was added, extracted with ethyl acetate (10 mL ⁇ 3), and the organic phase was washed with a saturated sodium chloride solution (20 mL), dried over anhydrous sodium sulfate, filtered, and the filtrate was concentrated under reduced pressure. The obtained residue was purified by silica gel column chromatography as a developing system C to obtain the title product 9b (48 mg, yield: 19%).
  • reaction solution was purified by high performance liquid chromatography (separation conditions: column: XBridge Prep C18 OBD 5um 19 * 250mm; mobile phase: A-water (10mmol NH 4 OAc): B-acetonitrile, gradient elution, flow rate: 18mL / min), the corresponding components were collected and concentrated under reduced pressure to give the title product (9-A: 2.4 mg, 9-B: 1.7 mg).
  • reaction solution was purified by high performance liquid chromatography (separation conditions: column: XBridge Prep C18 OBD 5um 19 * 250mm; mobile phase: A-water (10mmol NH 4 OAc) B-acetonitrile, gradient elution, flow rate: 18mL / min ), The corresponding components were collected and concentrated under reduced pressure to give the title product (2.7 mg, 2.6 mg).
  • the reaction solution was concentrated under reduced pressure, and the obtained crude compound 12 was purified by high performance liquid chromatography (separation conditions: column: Sharpsil-T C18 5um 21.2 * 250mm; mobile phase: A-water (10mmol NH 4 OAc), B- Acetonitrile, gradient elution, flow rate: 18 mL / min) to give the title product (7 mg, 15 mg).
  • the title compound 13 was prepared by referring to the method disclosed in Patent "Example 2 of Example 147 of EP2907824A1".
  • reaction solution was purified by high performance liquid chromatography (separation conditions: column: XBridge Prep C18 OBD 5um 19 * 250mm; mobile phase: A-water (10mmol NH 4 OAc): B-acetonitrile, gradient elution, flow rate: 18mL / min) to give the title product (2 mg, 2 mg).
  • reaction solution was purified by high performance liquid chromatography (separation conditions: column: XBridge Prep C18 OBD 5um19 * 250mm; mobile phase: A-water (10mmol NH 4 OAc): B-acetonitrile, gradient elution, flow rate: 18mL / min ), The corresponding components were collected and concentrated under reduced pressure to give the title product 15 (2.5 mg, yield: 10.3%).
  • the crude 16b (206mg, 1.58mmol) was dissolved in acetonitrile (15mL), anhydrous potassium carbonate (1.09g, 7.90mmol) and tetrabutylammonium iodide (29mg, 78.51umol) were added, and benzyl bromide (216mg, 1.26) was added. mmol) and stirred at room temperature overnight. Filtration, the filtrate was concentrated under reduced pressure, and the resulting residue was purified by silica gel column chromatography using developing system C to obtain the title product 16c (112 mg, yield: 32.1%).
  • reaction solution was purified by high performance liquid chromatography (separation conditions: column: XBridge Prep C18 OBD 5um 19 * 250mm; mobile phase: A-water (10mmol NH 4 OAc): B-acetonitrile, gradient elution, flow rate: 18mL / min) to give the title product 16 (1.0 mg, yield: 7.2%).
  • 17f (122 mg, 0.163 mmol) was dissolved in 0.8 mL of dichloromethane, 0.4 mL of trifluoroacetic acid was added, and the reaction was stirred at room temperature for 1 hour.
  • Add 15 mL of dichloromethane to dilute and concentrate under reduced pressure; add 10 mL of n-hexane, concentrate under reduced pressure, and repeat twice; add 10 mL of toluene to concentrate under reduced pressure; beat three times with 10 mL of n-hexane: ether 5: 1 mixed solvent to pH Near 7, it was concentrated and the oil pump was dried to give 17 g (98 mg, yield: 86.8%) of the title product.
  • reaction solution was filtered and purified by high performance liquid chromatography (separation conditions: column: XBridge Prep C18 OBD 5um 19 * 250mm; mobile phase: A-water (10mmol NH 4 OAc): B-acetonitrile, gradient elution, flow rate: 18 mL / min), the corresponding components were collected and concentrated under reduced pressure to give the title product 18 (9.5 mg, yield: 56.2%).
  • reaction solution was diluted with 10 mL of dichloromethane, and then washed with water (10 mL ⁇ 1), saturated brine (10 mL ⁇ 2), dried over anhydrous sodium sulfate, and filtered to obtain a crude product.
  • the obtained residue was purified with thin layer chromatography as a developing system B to obtain the title product 19c (159 mg, yield: 51.0%)
  • reaction solution was filtered and purified by high performance liquid chromatography (separation conditions: column: XBridge Prep C18 OBD 5um 19 * 250mm; mobile phase: A-water (10mmol NH 4 OAc): B-acetonitrile, gradient elution, flow rate: 18 mL / min), the corresponding components were collected and concentrated under reduced pressure to give the title product 19 (2.1 mg, yield: 32.4%).
  • the following antibodies are prepared according to the conventional methods of antibodies. For example, after constructing a vector, transfection into eukaryotic cells such as HEK293 cells (Life Technologies Cat. No. 11625019), and purification and expression.
  • eukaryotic cells such as HEK293 cells (Life Technologies Cat. No. 11625019)
  • Compound 9- shorter retention time Compound 9-A (1.0 mg, 0.93 ⁇ mol) was dissolved in 0.10 mL of DMSO, added to the above 1.3 ml solution, placed in a water bath shaker, and shaken at 25 ° C for 3 hours to stop the reaction. .
  • the reaction solution was desalted and purified by using a Sephadex G25 gel column (eluent: 0.05M PBS buffer solution with pH 6.5, containing 0.001M EDTA) to obtain a PBS buffer, which is an exemplary product of the general formula FADC-4A. Solution (1.72 mg / mL, 2.36 mL), stored frozen at 4 ° C.
  • UV-Vis calculated average: n 6.25.
  • UV-Vis calculated average: n 7.03.
  • UV-Vis calculated average: n 6.93.
  • UV-Vis calculated average: n 6.53.
  • UV-Vis calculated average: n 7.61.
  • UV-Vis calculated average: n 7.89.
  • UV-Vis calculated average: n 7.43.
  • UV-Vis calculated average: n 5.42.
  • UV-Vis calculated average: n 7.23.
  • UV-Vis calculated average: n 6.26.
  • UV-Vis calculated average: n 7.43.

Abstract

本公开涉及依喜替康类似物的配体-药物偶联物及其制备方法和应用。具体而言，本公开提供了一种具有式(-D)所示结构的配体-药物偶联物，其制备方法，含有其的药物组合物，以及其通过受体调节在制备治疗癌症的药物中的用途。其中通式(-D)中的各取代基与说明书中的定义相同。

Description

依喜替康类似物的配体-药物偶联物及其制备方法和应用 技术领域
本公开涉及一类全新结构依喜替康(或依沙替康)类似物的配体-药物偶联物。具体地说，本公开涉及一种含有结构单元Y的依喜替康类似物的抗体-药物偶联物，及其制备方法，和包含所述偶联物的药物组合物以及所述偶联物或药物组合物的用途。
背景技术
化疗依然是包括手术、放疗、以及靶向治疗法在内的最重要的抗癌手段之一。尽管高效细胞毒素的种类很多，但是肿瘤细胞和正常细胞之间差别很小，限制了这些抗肿瘤化合物由于毒副作用在临床上的广泛应用。而抗肿瘤单克隆抗体对于肿瘤细胞表面抗原的特异性，抗体药物已成为抗肿瘤治疗的前线药物，但单独使用抗体作为抗肿瘤药物时，疗效经常不尽人意。
抗体药物偶联物(antibody drug conjugate，ADC)将单克隆抗体或者抗体片段通过稳定的化学接头化合物与具有生物活性的细胞毒素相连，充分利用了抗体对正常细胞和肿瘤细胞表面抗原结合的特异性和细胞毒素的高效性，同时又避免了前者疗效偏低和后者毒副作用过大等缺陷。这也就意味着，与以往传统的化疗药物相比，抗体药物偶联物能精准地结合肿瘤细胞并降低对正常细胞的影响(Mullard A,(2013)Nature Reviews Drug Discovery,12:329–332；DiJoseph JF,Armellino DC,(2004)Blood,103:1807-1814)。
2000年第一个抗体药物偶联物Mylotarg(吉妥珠单抗奥唑米星(gemtuzumab ozogamicin)，惠氏制药有限公司)被美国FDA批准上市，用于治疗急性髓细胞白血病(Drugs of the Future(2000)25(7):686；US4970198；US 5079233；US 5585089；US 5606040；US 5693762；US 5739116；US 5767285；US 5773001)。
2011年8月，Adcetris(brentuximab vedotin，西雅图基因遗传公司)通过美国FDA快速审评通道，用于治疗霍奇金淋巴瘤以及复发性间变性大细胞淋巴瘤(Nat.Biotechnol(2003)21(7):778-784；WO2004010957；WO2005001038；US7090843A；US7659241；WO2008025020)。
Figure PCTCN2019107873-appb-000001
是一种新型靶向ADC药物，能使药物直接作用于淋巴瘤细胞上的靶点CD30后发生内吞作用从而诱导肿瘤细胞的凋亡。
Mylotarg和Adcetris都是针对血液肿瘤进行靶向治疗，血液肿瘤和实体肿瘤相比组织结构相对简单。2013年2月，Kadcyla(ado-trastuzumab emtansine，T-DM1)获得美国FDA批准，用于治疗HER2阳性同时对曲妥珠单抗(Tratuzumab，商品名：Herceptin)和紫杉醇有抗药性的晚期或转移性乳腺癌患者(WO2005037992；US8088387)。Kadcyla是美国FDA批准的治疗实体肿瘤的第一个ADC药物。
用于抗体药物偶联物的具有细胞毒性的小分子有几类，其中有一类是喜树碱衍生物，它们通过抑制拓扑异构酶I而具有抗肿瘤作用。报道喜树碱衍生物依沙替康(化学名：(1S,9S)-1-氨基-9-乙基-5-氟-2,3-二氢-9-羟基-4-甲基-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3’,4’:6,7]咪唑并[1,2-b]喹啉-10,13(9H,15H)-二酮)应用于抗体偶联药物(ADC)的文献有WO2014057687；Clinical Cancer Research(2016)22(20)：5097-5108；Cancer Sci(2016)107:1039-1046。但仍需进一步开发疗效更好的ADC药物。
发明内容
为了改进配体，特别是抗体和药物的偶联效果，本公开提供一种配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中所述配体-药物偶联物包含式(-D)所示的结构：
Figure PCTCN2019107873-appb-000002
其中：
Y选自-O-(CR aR b)m-CR 1R 2-C(O)-、-O-CR 1R 2-(CR aR b)m-、-O-CR 1R 2-、-NH-(CR aR b)m-CR 1R 2-C(O)-或-S-(CR aR b)m-CR 1R 2-C(O)-；
R a和R b相同或不同，且各自独立地选自氢原子、氘原子、卤素、烷基、卤代烷基、氘代烷基、烷氧基、羟基、氨基、氰基、硝基、羟烷基、环烷基或杂环基；
或者，R a和R b与其相连接的碳原子一起形成环烷基或杂环基；
R 1选自卤素、氘代烷基、环烷基、环烷基烷基、杂环基、芳基或杂芳基；
R 2选自氢原子、卤素、卤代烷基、氘代烷基、环烷基、环烷基烷基、烷氧基烷基、杂环基、芳基或杂芳基；
或者，R 1和R 2与其相连接的碳原子一起形成环烷基或杂环基；
或者，R a和R 2与其相连的碳原子一起形成环烷基或杂环基；
其中，或-D中的波浪线表示氢原子，或与接头单元或与结合靶细胞所表达抗原的抗体共价连接；
m为0至4的整数。
本公开的一些实施方案中，提供的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其为具有通式(-D 1)所示的化合物或其配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物：
Figure PCTCN2019107873-appb-000003
其中：
R 1为环烷基烷基或环烷基；优选C 3-6环烷基烷基或C 3-6环烷基；
R 2选自氢原子、卤代烷基或C 3-6环烷基；优选氢原子；
或者，R 1和R 2与其相连接的碳原子一起形成C 3-6环烷基；
式-D 1中的波浪线表示氢原子，或与接头单元或与结合靶细胞所表达抗原的抗体共价连接；
m为0或1。
本公开的一些实施方案中，提供的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其为通式(Pc-L-Y-Dr)所示的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物：
Figure PCTCN2019107873-appb-000004
其中：
Y选自-O-(CR aR b) m-CR 1R 2-C(O)-、-O-CR 1R 2-(CR aR b) m-、-O-CR 1R 2-、-NH-(CR aR b) m-CR 1R 2-C(O)-或-S-(CR aR b) m-CR 1R 2-C(O)-；
R a和R b相同或不同，且各自独立地选自氢原子、氘原子、卤素、烷基、卤代烷基、氘代烷基、烷氧基、羟基、氨基、氰基、硝基、羟烷基、环烷基或杂环基；
或者，R a和R b与其相连接的碳原子一起形成环烷基或杂环基；
R 1选自卤素、卤代烷基、氘代烷基、环烷基、环烷基烷基、烷氧基烷基、杂环基、芳基或杂芳基；
R 2选自氢原子、卤素、卤代烷基、氘代烷基、环烷基、环烷基烷基、烷氧基烷基、杂环基、芳基或杂芳基；
或者，R 1和R 2与其相连接的碳原子一起形成环烷基或杂环基；
或者，R a和R 2与其相连的碳原子一起形成环烷基或杂环基；
m为0至4的整数；
n为1至10，可以为整数，也可以为小数；
Pc为配体；L为接头单元。
本公开的一些实施方案中，提供的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，
其中-Y-为-O-(CR aR b)m-CR 1R 2-C(O)-；
R a和R b相同或不同，且各自独立地选自氢原子、氘原子、卤素或烷基；
R 1为C 3-6环烷基烷基或C 3-6环烷基；
R 2选自氢原子、卤代烷基或C 3-6环烷基；优选氢原子；
或者，R 1和R 2与其相连接的碳原子一起形成C 3-6环烷基；
m为0或1。
本公开的一些实施方案中，提供的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其中结构单元-Y-为-O-(CH 2)m-CR 1R 2-C(O)-；
R 1为C 3-6环烷基烷基或C 3-6环烷基；
R 2选自氢原子、卤代烷基或C 3-6环烷基；
或者，R 1和R 2与其相连接的碳原子一起形成C 3-6环烷基；
m为0或1。
本公开的一些实施方案中，提供的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其中结构单元-Y-为-O-(CH 2)m-CR 1R 2-C(O)-；
R 1为C 3-6环烷基烷基或C 3-6环烷基；
R 2为氢原子；
或者，R 1和R 2与其相连接的碳原子一起形成C 3-6环烷基；
m为0或1。
本公开的一些实施方案中，提供的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其中结构单元-Y-为-O-(CH 2)m-CR 1R 2-C(O)-；
R 1为C 3-6环烷基烷基或C 3-6环烷基；
R 2为氢原子；
或者，R 1和R 2与其相连接的碳原子一起形成C 3-6环烷基；
m为0。
本公开的另一些实施方案中，提供的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其中结构单元-Y-选自：
Figure PCTCN2019107873-appb-000005
本公开的另一些实施方案中，提供的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐 或溶剂化物，其中-Y-的O端与接头单元L相连。
本公开的另一些实施方案中，提供的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其为通式(Pc-L-D1)所示的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物：
Figure PCTCN2019107873-appb-000006
其中：
R 1为环烷基烷基或环烷基；优选C 3-6环烷基烷基或C 3-6环烷基；
R 2选自氢原子、卤代烷基或C 3-6环烷基；优选氢原子；
或者，R 1和R 2与其相连接的碳原子一起形成C 3-6环烷基；
m为0或1；
n为1至10，可以为整数，也可以为小数；
Pc为配体；L为接头单元。
在本发明的另一个优选的实施方案中，根据本发明所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中n为2至8，可以为整数，也可以为小数；优选为3至8，可以为整数，也可以为小数。
在本发明的另一个优选的实施方案中，根据本发明所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中接头单元-L-为-L 1-L 2-L 3-L 4-，
L 1选自-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-W-C(O)-、-CH 2-C(O)-NR 3-W-C(O)-或-C(O)-W-C(O)-，其中W选自C 1-8烷基、C 1-8烷基-环烷基或1至8个原子的直链杂烷基，所述杂烷基包含1至3个选自N、O或S的杂原子，其中所述的C 1-8烷基、环烷基和直链杂烷基各自独立地任选进一步被选自卤素、羟基、氰基、氨基、烷基、氯代烷基、氘代烷基、烷氧基和环烷基的一个或多个取代基所取代；
L 2选自-NR 4(CH 2CH 2O)p 1CH 2CH 2C(O)-、-NR 4(CH 2CH 2O)p 1CH 2C(O)-、-S(CH 2)p 1C(O)-或化学键，其中p 1为1至20的整数；优选为化学键；
L 3为由2至7个氨基酸构成的肽残基，其中氨基酸任选进一步被选自卤素、羟基、氰基、氨基、烷基、氯代烷基、氘代烷基、烷氧基和环烷基中的一个或多个取代基所取代；
L 4选自-NR 5(CR 6R 7) t-、-C(O)NR 5、-C(O)NR 5(CH 2) t-或化学键，其中t为1至6的整数；优选为-NR 5(CR 6R 7)t-；
R 3、R 4和R 5相同或不同，且各自独立地选自氢原子、烷基、卤代烷基、氘代烷基和羟烷基；
R 6和R 7相同或不同，且各自独立地选自氢原子、卤素、烷基、卤代烷基、氘代烷基和羟烷基。
本公开的另一些实施方案中，配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其中接头单元L 1选自-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-(CH 2)s 1-C(O)-、-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH 2-环己基-C(O)-、-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-(CH 2CH 2O)s 2-CH 2CH 2-C(O)-、-CH 2-C(O)-NR 3-(CH 2)s 3-C(O)-或-C(O)-(CH 2)s 4C(O)-，其中s 1为2至8的整数，s 2为1至3的整数，s 3为1至8的整数，s 4为1至8的整数；s 1优选为5。
本公开的另一些实施方案中，配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其中接头单元L 2选自-NR 4(CH 2CH 2O)p 1CH 2C(O)-或化学键，p 1为6至12的整数。
本公开的另一些实施方案中，提供的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其中L 4选自-NR 5(CR 6R 7)t-，R 5选自氢原子或烷基，R 6和R 7相同或不同，且各自独立地为氢原子或烷基，t为1或2，优选为2；L 4优选为自-NR 5CR 6R 7-；L 4更优选-NHCH 2-。
本公开的另一些实施方案中，提供的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其中接头单元-L-为-L 1-L 2-L 3-L 4-，
L 1为
Figure PCTCN2019107873-appb-000007
s 1为2至8的整数；
L 2为化学键；
L 3为四肽残基；
L 4为-NR 5(CR 6R 7)t-，R 5选自氢原子或烷基，R 6和R 7相同或不同，且各自独立地为氢原子或烷基，t为1或2。
本公开的另一些实施方案中，提供的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其中接头单元-L-为-L 1-L 2-L 3-L 4-，
L 1为-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH 2-环己基-C(O)-；
L 2为-NR 4(CH 2CH 2O) 9CH 2C(O)-；
L 3为四肽残基；
L 4为-NR 5(CR 6R 7)t-，R 5选自氢原子或烷基，R 6和R 7相同或不同，且各自独立地为氢原子或烷基，t为1或2。
本公开本公开的另一些实施方案中，提供的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其中所述的L 3的肽残基为由一个、两个或多个选自苯丙氨酸(E)、甘氨酸(G)、缬氨酸(V)、赖氨酸(K)、瓜氨酸、丝氨酸(S)、谷氨酸(E)、天冬氨酸(N)中的氨基酸形成的氨基酸残基；优选为由一个、两个或多个选自苯丙氨酸和甘氨酸的氨基酸形成的氨基酸残基；更优选为四肽残基；最优选为GGFG(甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸)的四肽残基。
本公开的另一些实施方案中，提供的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其中所述的接头单元-L-，其L 1端与配体相连，L 4端与Y相连。
本公开的另一些实施方案中，提供的配体-药物偶联物或其可药用盐或溶剂合物，其中所述-L-Y-为：
Figure PCTCN2019107873-appb-000008
L 1选自-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-(CH 2)s 1-C(O)-或-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH 2-环己基-C(O)-；
L 2为-NR 4(CH 2CH 2O)p 1CH 2C(O)-或化学键，p 1为6至12的整数；
L 3为GGFG的四肽残基；
R 1为环烷基烷基或环烷基；优选C 3-6环烷基烷基或C 3-6环烷基；
R 2选自氢原子、卤代烷基或C 3-6环烷基；优选氢原子；
或者，R 1和R 2与其相连接的碳原子一起形成C 3-6环烷基；
R 5选自氢原子或烷基，R 6和R 7相同或不同，且各自独立地为氢原子或烷基；
s 1为2至8的整数；优选5；
m为0至4的整数。
本公开的另一些实施方案中，提供的配体-药物偶联物或其可药用盐或溶剂合物，其中所述-L-Y-为：
Figure PCTCN2019107873-appb-000009
优选为：
Figure PCTCN2019107873-appb-000010
L 2为-NR 4(CH 2CH 2O) 9CH 2C(O)-；
L 3为GGFG的四肽残基；
R 1为环烷基烷基或环烷基；优选C 3-6环烷基烷基或C 3-6环烷基；
R 2选自氢原子、卤代烷基或C 3-6环烷基；优选氢原子；
或者，R 1和R 2与其相连接的碳原子一起形成C 3-6环烷基；
R 5选自氢原子或烷基，R 6和R 7相同或不同，且各自独立地为氢原子或烷基；
m为0至4的整数。
本公开的另一些实施方案中，通式(Pc-L-Y-Dr)所示的提供的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其中所述-L-Y-为
Figure PCTCN2019107873-appb-000011
L 2为化学键；
L 3为GGFG的四肽残基；
R 1为环烷基烷基或环烷基；优选C 3-6环烷基烷基或C 3-6环烷基；
R 2选自氢原子、卤代烷基或C 3-6环烷基；优选氢原子；
或者，R 1和R 2与其相连接的碳原子一起形成C 3-6环烷基；
R 5选自氢原子或烷基，R 6和R 7相同或不同，且各自独立地为氢原子或烷基；
s 1为2至8的整数；优选5；
m为0至4的整数。
本公开的另一方面，提供一种配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中所述配体-药物偶联物包含式(-L-Y-)所示的结构：
Figure PCTCN2019107873-appb-000012
其可用于得到经由连接片段将药物与配体连接而成配体-药物偶联物；
其中：
L 1选自-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-(CH 2)s 1-C(O)-或-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH 2-环己基-C(O)-；
L 2为-NR 4(CH 2CH 2O)p 1CH 2C(O)-或化学键，p 1为1至20的整数；
L 3为GGFG的四肽残基；
R 1为环烷基烷基或环烷基；优选C 3-6环烷基烷基或C 3-6环烷基；
R 2选自氢原子、卤代烷基或C 3-6环烷基；优选氢原子；
或者，R 1和R 2与其相连接的碳原子一起形成C 3-6环烷基；
R 5、R 6或R 7相同或不同，且各自独立地为氢原子或烷基；
s 1为2至8的整数；
m为0至4的整数。
本公开的另一方面，提供一种配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中所述配体-药物偶联物包含式(-L-Y-)所示的结构：
Figure PCTCN2019107873-appb-000013
其中：
L 2为化学键；
L 3为GGFG的四肽残基；
R 1为环烷基烷基或环烷基；优选C 3-6环烷基烷基或C 3-6环烷基；
R 2选自氢原子、卤代烷基或C 3-6环烷基；优选氢原子；
或者，R 1和R 2与其相连接的碳原子一起形成C 3-6环烷基；
R 5选自氢原子或烷基，R 6和R 7相同或不同，且各自独立地为氢原子或烷基；
s 1为2至8的整数；
m为0至4的整数。
本公开的另一些实施方案中，提供的通式(Pc-L-Y-Dr)所示的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其为通式(Pc-L a-Y-Dr)所示的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物：
Figure PCTCN2019107873-appb-000014
其中：
W选自C 1-8烷基、C 1-8烷基-环烷基或1至8个原子的直链杂烷基，所述杂烷基包含1至3个选自N、O或S的杂原子，其中所述的C 1-8烷基、环烷基和直链杂烷基各自独立地任选进一步被选自卤素、羟基、氰基、氨基、烷基、氯代烷基、氘代烷基、烷氧基和环烷基的一个或多个取代基所取代；
L 2选自-NR 4(CH 2CH 2O)p 1CH 2CH 2C(O)-、-NR 4(CH 2CH 2O)p 1CH 2C(O)-、-S(CH 2)p 1C(O)-或化学键，p 1为1至20的整数；
L 3为由2至7个氨基酸构成的肽残基，氨基酸可以是取代的或非取代的，当被取代时，取代基可以在任何可使用的连接点上被取代，所述取代基为一个或多个独立地选自卤素、羟基、氰基、氨基、烷基、氯代烷基、氘代烷基、烷氧基和环烷基；
R 1选自卤素、环烷基烷基、氘代烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；；优选环烷基烷基或环烷基；更优选C 3-6环烷基烷基或C 3-6环烷基；
R 2选自氢原子、卤素、卤代烷基、氘代烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；优选氢原子；或者，R 1和R 2与其相连接的碳原子一起形成环烷基或杂环基；
R 4和R 5相同或不同，且各自独立地选自氢原子、烷基、卤代烷基、氘代烷基和羟烷基；
R 6和R 7相同或不同，且各自独立地选自氢原子、卤素、烷基、卤代烷基、氘 代烷基和羟烷基；
m为0至4的整数；
n为0至10的非零整数或小数，优选为1-10之间的整数或小数；
Pc为配体。
本公开的另一些实施方案中，提供的通式(Pc-La-Y-Dr)所示的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物，其为通式(Pc-L b-Y-Dr)所示的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物：
Figure PCTCN2019107873-appb-000015
其中：
s 1为2至8的整数；优选5；
Pc、R 1、R 2、R 5～R 7、m和n如通式(Pc-La-Y-Dr)中所定义。
本公开的配体-药物偶联物的连接单元-L-Y-包括，但不限于：
Figure PCTCN2019107873-appb-000016
Figure PCTCN2019107873-appb-000017
本公开通式(Pc-L-Y-Dr)所示的配体-药物偶联物包括，但不限于：
Figure PCTCN2019107873-appb-000018
Figure PCTCN2019107873-appb-000019
Figure PCTCN2019107873-appb-000020
Figure PCTCN2019107873-appb-000021
其中Pc和n如通式(Pc-La-Y-Dr)中所定义。
在本公开的另一些实施方案中，所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂合物，其中所述Pc为抗体或其抗原结合片段，所述抗体选自嵌合抗体、人源化抗体或全人源抗体；优选为单克隆抗体。
在本公开的另一些实施方案中，所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂合物，其中所述的抗体或其抗原结合片段选自抗HER2(ErbB2)抗体、抗EGFR抗体、抗B7-H3抗体、抗c-Met抗体、抗HER3(ErbB3)抗体、抗HER4(ErbB4)抗体、抗CD20抗体、抗CD22抗体、抗CD30抗体、抗CD33抗体、抗CD44抗体、抗CD56抗体、抗CD70抗体、抗CD73抗体、抗CD105抗体、抗CEA抗体、抗A33抗体、抗Cripto抗体、抗EphA2抗体、抗G250抗体、抗MUCl抗体、抗Lewis Y抗体、抗VEGFR抗体、抗GPNMB抗体、抗Integrin抗体、抗PSMA抗体、抗Tenascin-C抗体、抗SLC44A4抗体或抗Mesothelin抗体或其抗原结合片段。
在本公开的另一些实施方案中，所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂合物，其中所述的抗体或其抗原结合片段选自Trastuzumab、Pertuzumab、Nimotuzumab、Enoblituzumab、Emibetuzumab、Inotuzumab、Pinatuzumab、Brentuximab、Gemtuzumab、Bivatuzumab、Lorvotuzumab、cBR96和Glematumamab，或其抗原结合片段。
本公开通式(Pc-L-Y-Dr)所示的配体-药物偶联物包括，但不限于以下结构式：
Figure PCTCN2019107873-appb-000022
Figure PCTCN2019107873-appb-000023
Figure PCTCN2019107873-appb-000024
Figure PCTCN2019107873-appb-000025
Figure PCTCN2019107873-appb-000026
其中，n为0至10的非零整数或小数，优选为1-10之间的整数或小数；更优选为2至8，可以为整数，也可以为小数；最优选为3至8，可以为整数，也可以为小数。
本公开的另一方面，提供了一种通式(D)所示的化合物或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、或其混合物形式，或其可药用的盐，
Figure PCTCN2019107873-appb-000027
其中：
Y选自-O-(CR aR b)m-CR 1R 2-C(O)-、-O-CR 1R 2-(CR aR b)m-、-O-CR 1R 2-、-NH-(CR aR b)m-CR 1R 2-C(O)-或-S-(CR aR b)m-CR 1R 2-C(O)-；
R a和R b相同或不同，且各自独立地选自氢原子、氘原子、卤素、烷基、卤代烷基、氘代烷基、烷氧基、羟基、氨基、氰基、硝基、羟烷基、环烷基或杂环基；
或者，R a和R b与其相连接的碳原子一起形成环烷基或杂环基；
R 1选自卤素、环烷基烷基、氘代烷基、环烷基、烷氧基烷基、杂环基、芳基或杂芳基；
R 2选自氢原子、卤素、卤代烷基、氘代烷基、环烷基、环烷基烷基、烷氧基烷基、杂环基、芳基或杂芳基；
或者，R 1和R 2与其相连接的碳原子一起形成环烷基或杂环基；
或者，R a和R 2与其相连的碳原子一起形成环烷基或杂环基；
m为0至4的整数。
本公开另一方面的一个优选方案，提供的通式(D)所示的化合物或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、或其混合物形式，或其可药用的盐，其为通式(D 1)所示的化合物或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、 对映异构体、非对映异构体、或其混合物形式，或其可药用的盐，
Figure PCTCN2019107873-appb-000028
其中：R 1为C 3-6环烷基烷基或C 3-6环烷基；
R 2选自氢原子、卤代烷基或C 3-6环烷基；
或者，R 1和R 2与其相连接的碳原子一起形成C 3-6环烷基；
m为0或1。
本公开所述的通式(D)所示的化合物包括，但不限于：
Figure PCTCN2019107873-appb-000029
Figure PCTCN2019107873-appb-000030
Figure PCTCN2019107873-appb-000031
Figure PCTCN2019107873-appb-000032
或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、或其混合物形式，或其可药用的盐。
本公开另一方面的一个优选方案，提供了一种通式(L a-Y-Dr)所示的化合物或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、或其混合物形式，或其可药用的盐：
Figure PCTCN2019107873-appb-000033
其中
W选自C 1-8烷基、C 1-8烷基-环烷基或1至8个原子的直链杂烷基，所述杂烷基包含1至3个选自N、O或S的杂原子，其中所述的C 1-8烷基、环烷基和直链杂烷基各自独立地任选进一步被选自卤素、羟基、氰基、氨基、烷基、氯代烷基、氘代烷基、烷氧基和环烷基的一个或多个取代基所取代；
L 2选自-NR 4(CH 2CH 2O)p 1CH 2CH 2C(O)-、-NR 4(CH 2CH 2O)p 1CH 2C(O)-、-S(CH 2)p 1C(O)-或化学键，p 1为1至20整数；
L 3为由2至7个氨基酸构成的肽残基，其中氨基酸任选进一步被选自卤素、羟基、氰基、氨基、烷基、氯代烷基、氘代烷基、烷氧基和环烷基中的一个或多个取代基所取代，当被取代时，取代基可以在任何可使用的连接点上被取代，所述取代基为一个或多个独立地选自卤素、羟基、氰基、氨基、烷基、氯代烷基、氘代烷基、烷氧基和环烷基；
R 1选自卤素、环烷基烷基、氘代烷基、环烷基、烷氧基烷基、杂环基、芳基或杂芳基；
R 2选自氢原子、卤素、卤代烷基、氘代烷基、环烷基、环烷基烷基、烷氧基烷基、杂环基、芳基或杂芳基；或者，R 1和R 2与其相连接的碳原子一起形成环烷 基或杂环基；
R 4和R 5相同或不同，且各自独立地选自氢原子、烷基、卤代烷基、氘代烷基和羟烷基；
R 6和R 7相同或不同，且各自独立地选自氢原子、卤素、烷基、卤代烷基、氘代烷基和羟烷基；
m为0至4的整数。
本公开另一方面的一个优选方案，提供了的通式(L a-Y-Dr)所示的化合物或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、或其混合物形式，或其可药用的盐，其为通式(L b-Y-Dr)所示的化合物或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、或其混合物形式，或其可药用的盐：
Figure PCTCN2019107873-appb-000034
其中R 1、R 2、R 5～R 7、s 1和m如通式(L a-Y-Dr)中所定义。
本公开所述的通式(L a-Y-Dr)所示的化合物包括，但不限于：
Figure PCTCN2019107873-appb-000035
Figure PCTCN2019107873-appb-000036
Figure PCTCN2019107873-appb-000037
Figure PCTCN2019107873-appb-000038
或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、或其混合物形式，或其可药用的盐。
本公开的另一方面，提供了一种制备通式(D 1)所示的化合物或其互变异构 体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、或其混合物形式，或其可药用的盐的方法，其包括以下步骤：
Figure PCTCN2019107873-appb-000039
通式(Y 1)和通式(Dr)缩合反应，得到通式(D 1)所示的化合物，
其中：R 1、R 2和m如通式(D 1)中所定义。
本公开的另一方面，提供了一种制备通式(L b-Y-Dr)所示的化合物或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、或其混合物形式，或其可药用的盐的方法，其包括以下步骤：
Figure PCTCN2019107873-appb-000040
通式(IA)和通式(IB)缩合反应，得到通式(L b-Y-Dr)所示的化合物，
其中：R 1、R 2、R 5～R 7、s 1和m如通式(L b-Y-Dr)中所定义。
本公开的另一方面，提供了一种制备通式(L b-Y-Dr)所示的化合物或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、或其混合物形式，或其可药用的盐的方法，其包括以下步骤：
Figure PCTCN2019107873-appb-000041
通式(IA)和通式(IB)进行缩合反应，得到通式(L b-Y-Dr)所示的化合物，
其中：R 1、R 2、R 5～R 7、s 1和m如通式(L b-Y-Dr)中所定义。
本公开的另一方面，提供了一种制备如通式(Pc-L a-Y-Dr)所示的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂合物的方法，其包括如下步骤：
Figure PCTCN2019107873-appb-000042
还原Pc后，与通式(L a-Y-Dr)偶联反应，得到通式(Pc-L a-Y-Dr)；还原剂优选TCEP；
其中：
Pc为配体；
W、L 2、L 3、R 1、R 2、R 5～R 7、m和n如通式(Pc-L a-Y-Dr)中所定义。
本公开的另一方面，进一步涉及一种药物组合物，其含有治疗有效量的如本 公开所述的配体-药物偶联物或化合物、或其药学上可接受的盐或溶剂合物，以及一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
本公开的另一方面，进一步涉及一种药物组合物，其含有根据本公开所述的通式(D)所示的化合物或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、或其混合物形式，或其可药用的盐，以及一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
本公开的另一方面，进一步涉及一种配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其包含配体和连接至配体的药物，其中所述药物选自本公开所述的通式(D)所示的化合物、通式(L a-Y-Dr)所示的化合物、或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、或其混合物形式，或其可药用的盐，优选药物通过接头连接至配体，优选配体为单克隆抗体。
本公开的另一方面，进一步涉及一种配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物的制备方法，包含将本公开所述的通式(D)所示的化合物、通式(L a-Y-Dr)所示的化合物、或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、或其混合物形式，或其可药用的盐与配体连接的步骤，优选通过接头连接，优选配体为单克隆抗体。
本公开的另一方面，进一步涉及本公开所述的配体-药物偶联物或化合物、或其药学上可接受的盐或溶剂合物，或其药物组合物，其用作药物。
本公开的另一方面，进一步涉及本公开所述的配体-药物偶联物或化合物、或其药学上可接受的盐或溶剂合物，或其药物组合物在制备用于治疗或预防肿瘤的药物中的用途；优选其中所述的肿瘤为与HER2、HER3或EGFR表达相关的癌症。
本公开的另一方面，进一步涉及本公开所述的配体-药物偶联物或化合物、或其药学上可接受的盐或溶剂合物，或药物组合物在制备治疗和/或预防癌症的药物的用途，所述癌症优选选自乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫癌、前列腺癌、肾癌、尿道癌、、膀胱癌、肝癌、胃癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、食道癌、黑色素瘤、神经胶质瘤、神经母细胞瘤、肉瘤、肺癌(例如，小细胞肺癌和非小细胞肺癌)、结肠癌、直肠癌、结直肠癌、白血病(例如，急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性早幼粒细胞白血病、慢性髓细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病)、骨癌、皮肤癌、甲状腺癌、胰腺癌、前列腺癌或淋巴瘤(例如，霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤或复发性间变性大细胞淋巴瘤)。
本公开的另一方面，进一步涉及一种用于治疗和/或预防肿瘤的方法，该方法包括向需要其的患者施用治疗有效剂量的本公开所述的配体-药物偶联物或化合物、或其药学上可接受的盐或溶剂合物或包含其的药物组合物；优选其中所述的肿瘤为与HER2、HER3或EGFR表达相关的癌症。
本公开的另一方面，进一步涉及一种用于治疗或预防癌症的方法，该方法包括向需要其的患者施用治疗有效剂量的本公开所述的配体-药物偶联物或化合物、 或其药学上可接受的盐或溶剂合物或包含其的药物组合物；所述癌症优选选自乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫癌、前列腺癌、肾癌、尿道癌、、膀胱癌、肝癌、胃癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、食道癌、黑色素瘤、神经胶质瘤、神经母细胞瘤、肉瘤、肺癌(例如小细胞肺癌和非小细胞肺癌)、结肠癌、直肠癌、结直肠癌、白血病(例如，急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性早幼粒细胞白血病、慢性髓细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病)、骨癌、皮肤癌、甲状腺癌、胰腺癌或淋巴瘤(例如霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤或复发性间变性大细胞淋巴瘤)。
可将活性化合物制成适合于通过任何适当途径给药的形式，活性化合物优选是以单位剂量的方式，或者是以患者可以以单剂自我给药的方式。本发明化合物或组合物的单位剂量的表达方式可以是片剂、胶囊、扁囊剂、瓶装药水、药粉、颗粒剂、锭剂、栓剂、再生药粉或液体制剂。
本发明治疗方法中所用化合物或组合物的剂量通常将随疾病的严重性、患者的体重和化合物的相对功效而改变。不过，作为一般性指导，合适的单位剂量可以是0.1～1000mg。
本发明的药物组合物除活性化合物外，可含有一种或多种辅料，所述辅料选自以下成分：填充剂(稀释剂)、粘合剂、润湿剂、崩解剂或赋形剂等。根据给药方法的不同，组合物可含有0.1至99重量％的活性化合物。
含活性成分的药物组合物可以是适用于口服的形式，例如片剂、糖锭剂、锭剂、水或油混悬液、可分散粉末或颗粒、乳液、硬或软胶囊，或糖浆剂或酏剂。可按照本领域任何已知制备药用组合物的方法制备口服组合物，此类组合物可含有粘合剂、填充剂、润滑剂、崩解剂或药学上可接受的润湿剂等，此类组合物还可以含有一种或多种选自以下的成分：甜味剂、矫味剂、着色剂和防腐剂，以提供悦目和可口的药用制剂。
水悬浮液含有活性物质和用于混合的适宜制备水悬浮液的赋形剂。水混悬液也可以含有一种或多种防腐剂例、一种或多种着色剂、一种或多种矫味剂和一种或多种甜味剂。
油混悬液可通过使活性成分悬浮于植物油中配制而成。油悬浮液可含有增稠剂。可加入上述的甜味剂和矫味剂，以提供可口的制剂。
药物组合物还可以是用于制备水混悬液的可分散粉末和颗粒提供活性成分，通过加入水混合分散剂、湿润剂、悬浮剂或防腐剂中的一种或多种。也可加入其他赋形剂例如甜味剂、矫味剂和着色剂。通过加入抗氧化剂例如抗坏血酸保存这些组合物。
本公开的药物组合物也可以是水包油乳剂的形式。
药物组合物可以是无菌注射水溶液形式。可以使用的可接受的溶媒或溶剂有水、林格氏液和等渗氯化钠溶液。无菌注射制剂可以是其中活性成分溶于油相的无菌注射水包油微乳。例如将活性成分溶于大豆油和卵磷脂的混合物中。然后将 油溶液加入水和甘油的混合物中处理形成微乳。可通过局部大量注射，将注射液或微乳注入患者的血流中。或者，最好按可保持本公开化合物恒定循环浓度的方式给予溶液和微乳。为保持这种恒定浓度，可使用连续静脉内递药装置。这种装置的实例是Deltec CADD-PLUS.TM.5400型静脉注射泵。
药物组合物可以是用于肌内和皮下给药的无菌注射水或油混悬液的形式。可按已知技术，用上述那些适宜的分散剂或湿润剂和悬浮剂配制该混悬液。无菌注射制剂也可以是在肠胃外可接受的无毒稀释剂或溶剂中制备的无菌注射溶液或混悬液。此外，可方便地用无菌固定油作为溶剂或悬浮介质。
可按用于直肠给药的栓剂形式给予本公开化合物。可通过将药物与在普通温度下为固体但在直肠中为液体，因而在直肠中会溶化而释放药物的适宜的无刺激性赋形剂混合来制备这些药物组合物。此类物质包括可可脂、甘油明胶、氢化植物油、各种分子量的聚乙二醇和聚乙二醇的脂肪酸酯的混合物。
如本领域技术人员所熟知的，药物的给药剂量依赖于多种因素，包括但并非限定于以下因素：所用具体化合物的活性、患者的年龄、患者的体重、患者的健康状况、患者的行为、患者的饮食、给药时间、给药方式、排泄的速率、药物的组合等；另外，最佳的治疗方式如治疗的模式、通式化合物(I)的日用量或可药用的盐的种类可以根据传统的治疗方案来验证。
附图说明
图1A：本公开ADC-19的血浆稳定性实验结果。
图1B：本公开ADC-18的血浆稳定性实验结果。
图1C：本公开ADC-20的血浆稳定性实验结果。
图2：本公开ADC-21、ADC-24对JIMT-1荷瘤小鼠药效评价。
图3：本公开ADC对人乳腺癌细胞SK-BR-3移植瘤裸小鼠的疗效评价。
图4：本公开ADC-25的血浆稳定性实验结果。
图5：本公开ADC对人脑星形胶质母细胞瘤U87MG裸小鼠移植瘤的的疗效。
图6：本公开ADC对人咽头癌胸水转移细胞Detroit 562裸小鼠移植瘤的疗效。
图7：本公开ADC对人胶质细胞瘤U87MG裸小鼠移植瘤的的疗效。
具体实施方式
发明的详细说明
除非另有限定，本文所用的所有技术和科学术语均与本公开所属领域普通技术人员的通常理解一致。虽然也可采用与本文所述相似或等同的任何方法和材料实施或测试本公开，但本文描述了优选的方法和材料。描述和要求保护本公开时，依据以下定义使用下列术语。
当本公开中使用商品名时，申请人旨在包括该商品名产品的制剂、该商品名 产品的非专利药和活性药物部分。
除非有相反陈述，在说明书和权利要求书中使用的术语具有下述含义。
术语“配体”是能识别和结合目标细胞相关的抗原或受体的大分子化合物。配体的作用是将药物呈递给与配体结合的目标细胞群，这些配体包括但不限于蛋白类激素、凝集素、生长因子、抗体或其他能与细胞结合的分子。在本公开实施方式中，配体表示为Pc，配体可通过配体上的杂原子与连接单元形成连接键，优选为抗体或其抗原结合片段，所述抗体选自嵌合抗体、人源化抗体、全人抗体或鼠源抗体；优选为单克隆抗体。
术语“药物”是指细胞毒性药物，药物表示为Dr，能在肿瘤细胞内具有较强破坏其正常生长的化学分子。细胞毒性药物原则上在足够高的浓度下都可以杀死肿瘤细胞，但是由于缺乏特异性，在杀伤肿瘤细胞的同时，也会导致正常细胞的凋亡，导致严重的副作用。该术语包括毒素，如细菌、真菌、植物或动物来源的小分子毒素或酶活性毒素，放射性同位素(例如At 211、I 131、I 125、Y 90、Re 186、Re 188、Sm 153、Bi 212、P 32和Lu的放射性同位素)，毒性药物，化疗药物，抗生素和核溶酶，优选为毒性药物。
术语“接头单元”或“连接片段”或“连接单元”是指一端与配体连接而另一端与药物相连的化学结构片段或键，也可以连接其他接头后再与药物相连。本公开的优选方案表示为L和L 1至L 4，其中L 1端与配体相连，L 4端与结构单元Y相连后与药物(Dr)相连。
接头，包括延伸物、间隔物和氨基酸单元，可以通过本领域已知方法合成，诸如US2005-0238649A1中所记载的。接头可以是便于在细胞中释放药物的“可切割接头”。例如，可使用酸不稳定接头(例如腙)、蛋白酶敏感(例如肽酶敏感)接头、光不稳定接头、二甲基接头、或含二硫化物接头(Chari等,Cancer Research 52:127-131(1992)；美国专利No.5,208,020)。
术语“配体-药物偶联物”，指配体通过稳定的连接单元与具有生物活性的药物相连。在本公开中“配体-药物偶联物”优选为抗体-药物偶联物(antibody drug conjugate，ADC)，指把单克隆抗体或者抗体片段通过稳定的连接单元与具有生物活性的毒性药物相连。
本公开所用氨基酸三字母代码和单字母代码如J.biol.chem,243,p3558(1968)中所述。
术语“抗体”指免疫球蛋白，是由两条相同的重链和两条相同的轻链通过链间二硫键连接而成的四肽链结构。免疫球蛋白重链恒定区的氨基酸组成和排列顺序不同，故其抗原性也不同。据此，可将免疫球蛋白分为五类，或称为免疫球蛋白的同种型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相应的重链分别为μ链、δ链、γ链、α链、和ε链。同一类Ig根据其铰链区氨基酸组成和重链二硫键的数目和位置的差别，又可分为不同的亚类，如IgG可分为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。轻链 通过恒定区的不同分为κ链或λ链。五类Ig中每类Ig都可以有κ链或λ链。本公开所述的抗体优选为针对靶细胞上细胞表面抗原的特异性抗体，非限制性实施例为以下抗体：抗HER2(ErbB2)抗体、抗EGFR抗体、抗B7-H3抗体、抗c-Met抗体、抗HER3(ErbB3)抗体、抗HER4(ErbB4)抗体、抗CD20抗体、抗CD22抗体、抗CD30抗体、抗CD33抗体、抗CD44抗体、抗CD56抗体、抗CD70抗体、抗CD73抗体、抗CD105抗体、抗CEA抗体、抗A33抗体、抗Cripto抗体、抗EphA2抗体、抗G250抗体、抗MUCl抗体、抗Lewis Y抗体、抗VEGFR抗体、抗GPNMB抗体、抗Integrin抗体、抗PSMA抗体、抗Tenascin-C抗体、抗SLC44A4抗体或抗Mesothelin抗体中一个或多个；优选为曲妥珠单抗(Trastuzumab，商品名Herceptin)、帕妥珠单抗(Pertuzumab，也被称作2C4，商品名Perjeta)、尼妥珠单抗(Nimotuzumab，商品名泰欣生)、Enoblituzumab、Emibetuzumab、Inotuzumab、Pinatuzumab、Brentuximab、Gemtuzumab、Bivatuzumab、Lorvotuzumab、cBR96和Glematumamab。
抗体重链和轻链靠近N端的约110个氨基酸的序列变化很大，为可变区(Fv区)；靠近C端的其余氨基酸序列相对稳定，为恒定区。可变区包括3个高变区(HVR)和4个序列相对保守的骨架区(FR)。3个高变区决定抗体的特异性，又称为互补性决定区(CDR)。每条轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)由3个CDR区4个FR区组成，从氨基端到羧基端依次排列的顺序为：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。轻链的3个CDR区指LCDR1、LCDR2、和LCDR3；重链的3个CDR区指HCDR1、HCDR2和HCDR3。
本公开的抗体包括鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体和全人源抗体，优选人源化抗体和全人源抗体。
术语“鼠源抗体”在本公开中为根据本领域知识和技能用鼠制备抗体。制备时用特定抗原注射试验对象，然后分离表达具有所需序列或功能特性的抗体的杂交瘤。
术语“嵌合抗体(chimeric antibody)”，是将鼠源性抗体的可变区与人抗体的恒定区融合而成的抗体，可以减轻鼠源性抗体诱发的免疫应答反应。建立嵌合抗体，要先建立分泌鼠源性特异性单抗的杂交瘤，然后从鼠杂交瘤细胞中克隆可变区基因，再根据需要克隆人抗体的恒定区基因，将鼠可变区基因与人恒定区基因连接成嵌合基因后插入表达载体中，最后在真核系统或原核系统中表达嵌合抗体分子。
术语“人源化抗体(humanized antibody)”，也称为CDR移植抗体(CDR-grafted antibody)，是指将鼠的CDR序列移植到人的抗体可变区框架，即不同类型的人种系抗体框架序列中产生的抗体。可以克服嵌合抗体由于携带大量鼠蛋白成分，从而诱导的异源性反应。此类构架序列可以从包括种系抗体基因序列的公共DNA数据库或公开的参考文献获得。如人重链和轻链可变区基因的种系 DNA序列可以在“VBase”人种系序列数据库(在因特网 www.mrccpe.com.ac.uk/vbase可获得)，以及在Kabat，E.A.等人，1991Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版中找到。为避免免疫原性下降的同时，引起的活性下降，可对所述的人抗体可变区框架序列进行最少反向突变或回复突变，以保持活性。本公开的人源化抗体也包括进一步由噬菌体展示对CDR进行亲和力成熟后的人源化抗体。进一步描述参与人源化可使用小鼠抗体的方法的文献包括，例如Queen等，Proc.，Natl.Acad.Sci.USA，88，2869，1991和Winter及其同事的方法[Jones等，Nature，321，522(1986)，Riechmann，等，Nature，332，323-327(1988)，Verhoeyen，等，Science，239，1534(1988)]。
术语“全人源抗体”、“全人抗体”或“完全人源抗体”，也称“全人源单克隆抗体”，其抗体的可变区和恒定区都是人源的，去除免疫原性和毒副作用。单克隆抗体的发展经历了四个阶段，分别为：鼠源性单克隆抗体、嵌合性单克隆抗体、人源化单克隆抗体和全人源单克隆抗体。本公开为全人源单克隆抗体。全人抗体制备的相关技术主要有：人杂交瘤技术、EBV转化B淋巴细胞技术、噬菌体显示技术(phage display)、转基因小鼠抗体制备技术(transgenic mouse)和单个B细胞抗体制备技术等。
术语“抗原结合片段”是指抗体的保持特异性结合抗原的能力的一个或多个片段。已显示可利用全长抗体的片段来进行抗体的抗原结合功能。“抗原结合片段”中包含的结合片段的实例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab') 2片段，包含通过铰链区上的二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段，(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体的单臂的VH和VL结构域组成的Fv片段；(v)单结构域或dAb片段(Ward等人,(1989)Nature341：544-546)，其由VH结构域组成；和(vi)分离的互补决定区(CDR)或(vii)可任选地通过合成的接头连接的两个或更多个分离的CDR的组合。此外，虽然Fv片段的两个结构域VL和VH由分开的基因编码，但可使用重组方法，通过合成的接头连接它们，从而使得其能够产生为其中VL和VH区配对形成单价分子的单个蛋白质链(称为单链Fv(scFv)；参见，例如，Bird等人(1988)Science242:423-426；和Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci USA85:5879-5883)。此类单链抗体也意欲包括在术语抗体的“抗原结合片段”中。使用本领域技术人员已知的常规技术获得此类抗体片段，并且以与对于完整抗体的方式相同的方式就功用性筛选片段。可通过重组DNA技术或通过酶促或化学断裂完整免疫球蛋白来产生抗原结合部分。抗体可以是不同同种型的抗体，例如，IgG(例如，IgG1，IgG2，IgG3或IgG4亚型)，IgA1，IgA2，IgD，IgE或IgM抗体。
Fab是通过用蛋白酶木瓜蛋白酶(切割H链的224位的氨基酸残基)处理IgG抗体分子所获得的片段中的具有约50,000的分子量并具有抗原结合活性的抗体片段， 其中H链N端侧的约一半和整个L链通过二硫键结合在一起。
F(ab')2是通过用酶胃蛋白酶消化IgG铰链区中两个二硫键的下方部分而获得的分子量为约100,000并具有抗原结合活性并包含在铰链位置相连的两个Fab区的抗体片段。
Fab'是通过切割上述F(ab')2的铰链区的二硫键而获得的分子量为约50,000并具有抗原结合活性的抗体片段。
此外，可以通过将编码抗体的Fab'片段的DNA插入到原核生物表达载体或真核生物表达载体中并将载体导入到原核生物或真核生物中以表达Fab'来生产所述Fab'。
术语“单链抗体”、“单链Fv”或“scFv”意指包含通过接头连接的抗体重链可变结构域(或区域；VH)和抗体轻链可变结构域(或区域；VL)的分子。此类scFv分子可具有一般结构：NH 2-VL-接头-VH-COOH或NH 2-VH-接头-VL-COOH。合适的现有技术接头由重复的GGGGS氨基酸序列或其变体组成，例如使用1-4个重复的变体(Holliger等人(1993)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448)。可用于本公开的其他接头由Alfthan等人(1995)，Protein Eng.8:725-731，Choi等人(2001)，Eur.J.Immuno l.31:94-106，Hu等人(1996)，Cancer Res.56:3055-3061，Kipriyanov等人(1999)，J.Mol.Biol.293:41-56和Roovers等人(2001)，Cancer Immunol.描述。
术语“CDR”是指抗体的可变结构域内主要促成抗原结合的6个高变区之一。所述6个CDR的最常用的定义之一由Kabat E.A.等人，(1991)Sequences of proteins of immunological interest.NIH Publication91-3242)提供。如本文中使用的，CDR的Kabat定义只应用于轻链可变结构域的CDR1、CDR2和CDR3(CDR L1、CDR L2、CDR L3或L1、L2、L3)，以及重链可变结构域的CDR2和CDR3(CDR H2、CDR H3或H2、H3)。
术语“抗体框架”，是指可变结构域VL或VH的一部分，其用作该可变结构域的抗原结合环(CDR)的支架。从本质上讲，其是不具有CDR的可变结构域。
术语“表位”或“抗原决定簇”是指抗原上免疫球蛋白或抗体特异性结合的部位。表位通常以独特的空间构象包括至少3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14或15个连续或非连续的氨基酸。参见，例如，Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular B iology，第66卷，G.E.Morris，Ed.(1996)。
术语“特异性结合”、“选择性结合”、“选择性地结合”和“特异性地结合”是指抗体对预先确定的抗原上的表位的结合。通常，抗体以大约小于10 -7M，例如大约小于10 -8M、10 -9M或10 -10M或更小的亲和力(KD)结合。
术语“核酸分子”是指DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链或双链的，但优选是双链DNA。当将核酸与另一个核酸序列置于功能关系中时，核酸 是“有效连接的”。例如，如果启动子或增强子影响编码序列的转录，那么启动子或增强子有效地连接至所述编码序列。
术语“载体”是指能够运输已与其连接的另一个核酸的核酸分子。在一个实施方案中，载体是“质粒”，其是指可将另外的DNA区段连接至其中的环状双链DNA环。在另一个实施方案中，载体是病毒载体，其中可将另外的DNA区段连接至病毒基因组中。本文中公开的载体能够在已引入它们的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌的复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)或可在引入宿主细胞后整合入宿主细胞的基因组，从而随宿主基因组一起复制(例如，非附加型哺乳动物载体)。
现有技术中熟知生产和纯化抗体和抗原结合片段的方法，如冷泉港的抗体实验技术指南，5-8章和15章。抗原结合片段同样可以用常规方法制备。发明所述的抗体或抗原结合片段用基因工程方法在非人源的CDR区加上一个或多个人源FR区。人FR种系序列可以通过比对IMGT人类抗体可变区种系基因数据库和MOE软件，从ImMunoGeneTics(IMGT)的网站http://imgt.cines.fr得到，或者从免疫球蛋白杂志，2001ISBN012441351上获得。
术语“宿主细胞”是指已向其中引入了表达载体的细胞。宿主细胞可包括细菌、微生物、植物或动物细胞。易于转化的细菌包括肠杆菌科(enterobacteriaceae)的成员，例如大肠杆菌(Escherichia coli)或沙门氏菌(Salmonella)的菌株；芽孢杆菌科(Bacillaceae)例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)；肺炎球菌(Pneumococcus)；链球菌(Streptococcus)和流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)。适当的微生物包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和毕赤酵母(Pichia pastoris)。适当的动物宿主细胞系包括CHO(中国仓鼠卵巢细胞系)和NS0细胞。
本公开工程化的抗体或抗原结合片段可用常规方法制备和纯化。比如，编码重链和轻链的cDNA序列，可以克隆并重组至GS表达载体。重组的免疫球蛋白表达载体可以稳定地转染CHO细胞。作为一种更推荐的现有技术，哺乳动物类表达系统会导致抗体的糖基化，特别是在Fc区的高度保守N端位点。阳性的克隆在生物反应器的无血清培养基中扩大培养以生产抗体。分泌了抗体的培养液可以用常规技术纯化。比如，用含调整过的缓冲液的A或G Sepharose FF柱进行纯化。洗去非特异性结合的组分。再用PH梯度法洗脱结合的抗体，用SDS-PAGE检测抗体片段，收集。抗体可用常规方法进行过滤浓缩。可溶的混合物和多聚体，也可以用常规方法去除，比如分子筛、离子交换。得到的产物需立即冷冻，如-70℃，或者冻干。
术语“肽”是指介于氨基酸和蛋白质之间的化合物片段，由2个或2个以上氨基酸分子通过肽键相互连接而成，是蛋白质的结构与功能片段，如激素、酶类等本质上都是肽。
术语“糖”是指由C、H、O三种元素组成的生物大分子，可分为单糖、二糖 和多糖等。
术语“荧光探针”是指在紫外-可见-近红外区有特征荧光，并且其荧光性质(激发和发射波长、强度、寿命和偏振等)可随所处环境的性质，如极性、折射率、粘度等改变而灵敏地改变的一类荧光性分子，其与核酸(DNA或RNA)、蛋白质或其他大分子结构非共价相互作用而使一种或几种荧光性质发生改变，可用于研究大分子物质的性质和行为。
术语“毒性药物”是指抑制或防止细胞的功能和/或引起细胞死亡或破坏的物质。包括毒素和其他能用于肿瘤治疗的化合物。
术语“毒素”是指能够对细胞的生长或增殖产生有害效果的任何物质，可以是来自细菌、真菌、植物或动物的小分子毒素及其衍生物，包括喜树碱类衍生物如伊沙替康，美登木素生物碱及其衍生物(CN101573384)如DM1、DM3、DM4，auristatin F(AF)及其衍生物，如MMAF、MMAE、3024(WO 2016/127790A1，化合物7)，白喉毒素、外毒素、蓖麻毒蛋白(ricin)A链、相思豆毒蛋白(abrin)A链、modeccin、α-帚曲霉素(sarcin)、油桐(Aleutites fordii)毒蛋白、香石竹(dianthin)毒蛋白、美洲商陆(Phytolaca americana)毒蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(Momordica charantia)抑制物、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制物、白树毒蛋白(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)局限曲霉素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)和单端孢菌素(trichothecenes)。
术语“化疗药物”是可用于治疗肿瘤的化学化合物。该定义还包括起调节、降低、阻断或抑制可促进癌生长的激素效果作用的抗激素剂，且常常是系统或全身治疗的形式。它们自身可以是激素。化疗药物实例包括烷化剂，如噻替哌(thiotepa)；环磷酰胺(cyclosphamide)(CYTOXAN TM)；烷基磺酸脂如白消安(busulfan)，英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶(aziridine)如苯并多巴(benaodopa)，卡波醌(carboquone)，美妥替哌(meturedopa)和尿烷亚胺(uredopa)；氮丙啶和methylamelamine包括六甲蜜胺(altretamine)，三亚胺嗪(triethylenemelamine)，三亚乙基磷酰胺，三亚乙基硫代磷酰胺和三羟甲基蜜胺(trimethylolomelamine)；氮芥(nitrogen mustards)如苯丁酸氮芥，萘氮芥，胆磷酰胺(cholophosphamide)，雌氮芥(estramustine)，异环磷酰胺(ifosfamide)，氮芥(mechlorethamine)，盐酸氧氮芥；左旋苯丙氨酸氮芥(melphalan)，新氮芥(novembichin)，胆甾醇苯乙酸氮芥，松龙苯芥(prednimustine)，曲磷胺(trofosfamide)，尿嘧啶氮芥；亚硝基脲(nitrosureas)如亚硝基脲氮芥(carmustine)，氯脲菌素(chlorozotocin)，福莫司汀(fotemustine)，洛莫司汀(lomustine)，尼莫司汀(nimustine)，雷莫司汀(ranimustine)；抗生素如阿克拉霉素，放线菌素，authramycin，重氮丝氨酸，博来霉素，放线菌素C(cactinomycin)，加利车霉素(calicheamicin)，carabicin,洋红霉素(chromomycin)，嗜癌素(carzinophilin)，色霉素，放线菌素D，柔红菌素 (daunorubicin)，地托比星(detorubicin)，6-重氮-5-氧-L-正亮氨酸，阿霉素(doxorubicin)，表阿霉素(epirubicin)，依索比星(esorubicin)，伊达比星(idarubicin)，发波霉素(marcellomycin)，丝裂霉素，霉酚酸，诺加霉素(nogalamycin)，橄榄霉素(olivomycin)，培洛霉素(peplomycin)，potfiromycin,嘌呤霉素，三铁阿霉素(quelamycin)，罗多比星(rodorubicin)，链黑菌素；链脲霉素(streptozocin)，杀结核菌素，乌苯美司(ubenimex)，净司他丁(zinostatin)，佐柔比星(zorubicin)；抗代谢药如氨甲蝶吟，5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物如二甲叶酸(denopterin)，氨甲蝶呤，蝶罗呤，三甲曲沙(trimetrexate)；喋吟类似物氟达拉滨(f1udarabine)，6-巯基蝶呤，硫咪蝶呤，硫鸟蝶呤；嘧啶类似物如安西他滨(ancitabine)，阿扎胞苷(azacitidine)，6-氮尿苷，卡莫氟(carmofur)，阿糖胞苷，双脱氧尿苷，去氟氧尿苷(doxitluridine),依诺他滨(enocitabine)，氟尿苷，5-FU；雄激素类如二甲睾酮(calusterone),丙酸甲雄烷酮(dromostanolong propionate)，环硫雄醇(epitiostanol)，美雄氨(mepitiostane)，睾内酯(testolactone)；抗肾上腺类如氨鲁米特(aminoglutethimide)，米托坦(mitotane)，曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂如frolinic acid；醋葡内脂；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamideglycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(biasntrene)；依达曲沙(edatraxate)；defofamine；秋水仙胺；地吖醌(diaziquone)；elfomithine；依利醋铵(elliptinium acetate)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidamine)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)；硝呋旦(nitracrine)；喷司他丁(pintostatin)；phenamet；吡柔比星(pirarubicin)；鬼臼树酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼；丙卡巴肼(procarbazine)；
Figure PCTCN2019107873-appb-000043
雷佐生(razoxane)；西索菲兰(sizofiran)；锗螺胺(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2，2'，2"-三氯二乙胺(trichlorrotriethylamine)；乌拉坦(urethan)；长春碱酰胺；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇；哌溴烷坑(pipobroman)；gacytosine；阿拉伯糖苷("Ara-C")；环磷酰胺；三胺硫磷(thiotepa)；紫杉烷，如紫杉醇(
Figure PCTCN2019107873-appb-000044
Bristol-Myers Squibb Oncology,Princeton,NJ)和docetaxel(
Figure PCTCN2019107873-appb-000045
Rhone-Poulenc Rorer,Antony,France)；苯丁酸氮芥；吉西他滨(gemcitabine)；6-硫代鸟嘌呤；巯基嘌呤；氨甲蝶呤；铂类似物如顺铂和卡铂；长春花碱；铂；依托泊甙(etoposide)(VP-16)；异环磷航胶；丝裂霉素C；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞宾(vinorelbine)；新霉酰胺(navelbine)；novantrone；替尼泊甙(teniposide)；柔红霉素；氨基蝶呤；xeloda；伊拜磷酸盐(ibandronate)；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；维甲酸esperamicins；capecitabine；以及上述任何物质的药学上可接受的盐，酸或衍生物。此定义还包括能调节或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素制剂，如抗雌激素制剂包括他莫昔芬(tamoxifen)，雷洛昔芬(raloxifene)，芳香酶抑制剂4(5)-咪唑，4-羟基他莫昔芬，曲沃昔芬(trioxifene)，keoxifene，LY117018,onapristone，和托瑞米芬(Fareston)；和抗 雄激素制剂如氟他氨(flutamide)，尼鲁米特(nilutamide)，bicalutamide，亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin)；和上述任何物质的药学上可接受的盐，酸或衍生物。
术语“烷基”指饱和脂肪族烃基团，其为包含1至20个碳原子的直链或支链基团，优选含有1至12个碳原子的烷基，更优选含有1至10个碳原子的烷基，最优选含有1至6个碳原子的烷基。非限制性实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、正戊基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、2,2-二甲基丙基、1-乙基丙基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、正己基、1-乙基-2-甲基丙基、1,1,2-三甲基丙基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2-乙基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、2,3-二甲基丁基、正庚基、2-甲基己基、3-甲基己基、4-甲基己基、5-甲基己基、2,3-二甲基戊基、2,4-二甲基戊基、2,2-二甲基戊基、3,3-二甲基戊基、2-乙基戊基、3-乙基戊基、正辛基、2,3-二甲基己基、2,4-二甲基己基、2,5-二甲基己基、2,2-二甲基己基、3,3-二甲基己基、4,4-二甲基己基、2-乙基己基、3-乙基己基、4-乙基己基、2-甲基-2-乙基戊基、2-甲基-3-乙基戊基、正壬基、2-甲基-2-乙基己基、2-甲基-3-乙基己基、2,2-二乙基戊基、正癸基、3,3-二乙基己基、2,2-二乙基己基，及其各种支链异构体等。更优选的是含有1至6个碳原子的低级烷基，非限制性实施例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、正戊基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、2,2-二甲基丙基、1-乙基丙基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、正己基、1-乙基-2-甲基丙基、1,1,2-三甲基丙基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2-乙基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、2,3-二甲基丁基等。烷基可以是取代的或非取代的，当被取代时，取代基可以在任何可使用的连接点上被取代，所述取代基优选为一个或多个以下基团，其独立地选自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、卤素、巯基、羟基、硝基、氰基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、环烷氧基、杂环烷氧基、环烷硫基、杂环烷硫基、氧代基。
术语“杂烷基”指含有一个或多个选自N、O或S的杂原子的烷基，其中烷基如上所定义。
术语“亚烷基”指饱和的直链或支链脂肪族烃基，其具有2个从母体烷的相同碳原子或两个不同的碳原子上除去两个氢原子所衍生的残基，其为包含1至20个碳原子的直链或支链基团，优选含有1至12个碳原子，更优选含有1至6个碳原子的亚烷基。亚烷基的非限制性实例包括但不限于亚甲基(-CH 2-)、1,1-亚乙基(-CH(CH 3)-)、1,2-亚乙基(-CH 2CH 2)-、1,1-亚丙基(-CH(CH 2CH 3)-)、1,2-亚丙基(-CH 2CH(CH 3)-)、1,3-亚丙基(-CH 2CH 2CH 2-)、1,4-亚丁基(-CH 2CH 2CH 2CH 2-)和1,5-亚丁基(-CH 2CH 2CH 2CH 2CH 2-)等。亚烷基可以是取代的或非取代的，当被取代时，取代基可以在任何可使用的连接点上被取代，所述取代基优选独立地任选选自烷 基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、卤素、巯基、羟基、硝基、氰基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、环烷氧基、杂环烷氧基、环烷硫基、杂环烷硫基和氧代基中的一个或多个取代基所取代。
术语“烷氧基”指-O-(烷基)和-O-(非取代的环烷基)，其中烷基或环烷基的定义如上所述。烷氧基的非限制性实例包括：甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、环丙氧基、环丁氧基、环戊氧基、环己氧基。烷氧基可以是任选取代的或非取代的，当被取代时，取代基优选为一个或多个以下基团，其独立地选自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、卤素、巯基、羟基、硝基、氰基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、环烷氧基、杂环烷氧基、环烷硫基、杂环烷硫基。
术语“环烷基”指饱和或部分不饱和单环或多环环状烃取代基，环烷基环包含3至20个碳原子，优选包含3至12个碳原子，更优选包含3至10个碳原子，最优选包含3至8个碳原子。单环环烷基的非限制性实例包括环丙基、环丁基、环戊基、环戊烯基、环己基、环己烯基、环己二烯基、环庚基、环庚三烯基、环辛基等；多环环烷基包括螺环、稠环和桥环的环烷基。
术语“杂环基”指饱和或部分不饱和单环或多环环状烃取代基，其包含3至20个环原子，其中一个或多个环原子为选自氮、氧或S(O) m(其中m是整数0至2)的杂原子，但不包括-O-O-、-O-S-或-S-S-的环部分，其余环原子为碳。优选包含3至12个环原子，其中1～4个是杂原子；更优选环烷基环包含3至10个环原子。单环杂环基的非限制性实例包括吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、吗啉基、硫代吗啉基、高哌嗪基等。多环杂环基包括螺环、稠环和桥环的杂环基。
术语“螺杂环基”指5至20元的单环之间共用一个原子(称螺原子)的多环杂环基团，其中一个或多个环原子为选自氮、氧或S(O) m(其中m是整数0至2)的杂原子，其余环原子为碳。其可以含有一个或多个双键，但没有一个环具有完全共轭的π电子系统。优选为6至14元，更优选为7至10元。根据环与环之间共用螺原子的数目将螺杂环基分为单螺杂环基、双螺杂环基或多螺杂环基，优选为单螺杂环基和双螺杂环基。更优选为4元/4元、4元/5元、4元/6元、5元/5元或5元/6元单螺杂环基。螺杂环基的非限制性实例包括：
Figure PCTCN2019107873-appb-000046
术语“稠杂环基”指5至20元，系统中的每个环与体系中的其他环共享毗邻的一对原子的多环杂环基团，一个或多个环可以含有一个或多个双键，但没有一个环具有完全共轭的π电子系统，其中一个或多个环原子为选自氮、氧或S(O) m(其中m是整数0至2)的杂原子，其余环原子为碳。优选为6至14元，更优选为7至10元。根据组成环的数目可以分为双环、三环、四环或多环稠杂环基，优选为 双环或三环，更优选为5元/5元或5元/6元双环稠杂环基。稠杂环基的非限制性实例包括：
Figure PCTCN2019107873-appb-000047
术语“桥杂环基”指5至14元，任意两个环共用两个不直接连接的原子的多环杂环基团，其可以含有一个或多个双键，但没有一个环具有完全共轭的π电子系统，其中一个或多个环原子为选自氮、氧或S(O) m(其中m是整数0至2)的杂原子，其余环原子为碳。优选为6至14元，更优选为7至10元。根据组成环的数目可以分为双环、三环、四环或多环桥杂环基，优选为双环、三环或四环，更优选为双环或三环。桥杂环基的非限制性实例包括：
Figure PCTCN2019107873-appb-000048
所述杂环基环可以稠合于芳基、杂芳基或环烷基环上，其中与母体结构连接在一起的环为杂环基，其非限制性实例包括：
Figure PCTCN2019107873-appb-000049
等。
杂环基可以是任选取代的或非取代的，当被取代时，取代基优选为一个或多个以下基团，其独立地选自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、卤素、巯基、羟基、硝基、氰基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、环烷氧基、杂环烷氧基、环烷硫基、杂环烷硫基、氧代基。
术语“芳基”指具有共轭的π电子体系的6至14元全碳单环或稠合多环(也就是共享毗邻碳原子对的环)基团，优选为6至10元，例如苯基和萘基，优选苯基。所述芳基环可以稠合于杂芳基、杂环基或环烷基环上，其中与母体结构连接在一起的环为芳基环，其非限制性实例包括：
Figure PCTCN2019107873-appb-000050
芳基可以是取代的或非取代的，当被取代时，取代基优选为一个或多个以下基团，其独立地选自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、卤素、巯基、羟基、硝基、氰基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、环烷氧基、杂环烷氧基、环烷硫基、杂环烷硫基。
术语“杂芳基”指包含1至4个杂原子、5至14个环原子的杂芳族体系，其中杂原子选自氧、硫和氮。杂芳基优选为5至10元，更优选为5元或6元，例如呋喃基、噻吩基、吡啶基、吡咯基、N-烷基吡咯基、嘧啶基、吡嗪基、咪唑基、四唑基等。所述杂芳基环可以稠合于芳基、杂环基或环烷基环上，其中与母体结构连接在一起的环为杂芳基环，其非限制性实例包括：
Figure PCTCN2019107873-appb-000051
杂芳基可以是任选取代的或非取代的，当被取代时，取代基优选为一个或多个以下基团，其独立地选自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、卤素、巯基、羟基、硝基、氰基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、环烷氧基、杂环烷氧基、环烷硫基、杂环烷硫基。
术语“氨基保护基”是为了使分子其它部位进行反应时氨基保持不变，用易于脱去的基团对氨基进行保护。非限制性实施例包含9-芴甲氧羰基、叔丁氧羰基、乙酰基、苄基、烯丙基和对甲氧苄基等。这些基团可任选地被选自卤素、烷氧基或硝基中的1-3个取代基所取代。所述氨基保护基优选为9-芴甲氧羰基。
术语“环烷基烷基”指烷基被一个或多个环烷基取代，优选被一个环烷基取代，其中烷基如上所定义，其中环烷基如上所定义。
术语“卤代烷基”指烷基被一个或多个卤素取代，其中烷基如上所定义。
术语“氘代烷基”指烷基被一个或多个氘原子取代，其中烷基如上所定义。
术语“羟基”指-OH基团。
术语“卤素”指氟、氯、溴或碘。
术语“氨基”指-NH 2。
术语“硝基”指-NO 2。
术语“酰胺基”指-C(O)N(烷基)或(环烷基)，其中烷基、环烷基如上所定义。
术语“羧酸酯基”指-C(O)O(烷基)或(环烷基)，其中烷基、环烷基如上所定义。
本公开还包括各种氘化形式的式(I)化合物。与碳原子连接的各个可用的氢原子可独立地被氘原子替换。本领域技术人员能够参考相关文献合成氘化形式的式(I)化合物。在制备氘代形式的式(I)化合物时可使用市售的氘代起始物质，或它们可使用常规技术采用氘代试剂合成，氘代试剂包括但不限于氘代硼烷、三氘代硼烷四氢呋喃溶液、氘代氢化锂铝、氘代碘乙烷和氘代碘甲烷等。
“任选”或“任选地”意味着随后所描述的事件或环境可以但不必发生，该说明包括该事件或环境发生或不发生地场合。例如，“任选被烷基取代的杂环基团”意味着烷基可以但不必须存在，该说明包括杂环基团被烷基取代的情形和杂环基团不被烷基取代的情形。
“取代的”指基团中的一个或多个氢原子，优选为最多5个，更优选为1～3个氢原子彼此独立地被相应数目的取代基取代。不言而喻，取代基仅处在它们的可能的化学位置，本领域技术人员能够在不付出过多努力的情况下确定(通过实验或理论)可能或不可能的取代。例如，具有游离氢的氨基或羟基与具有不饱和(如烯属)键的碳原子结合时可能是不稳定的。
术语“药物组合物”表示含有一种或多种本文所述化合物或其生理学上/可药用的盐或前体药物与其他化学组分的混合物，以及其他组分例如生理学/可药用的载体和赋形剂。药物组合物的目的是促进对生物体的给药，利于活性成分的吸收进而发挥生物活性。
术语“药学上可接受的盐”或“可药用盐”是指本公开配体-药物偶联物的盐，或本公开中所述的化合物的盐，这类盐用于哺乳动物体内时具有安全性和有效性，且具有应有的生物活性，本公开抗体-抗体药物偶联化合物至少含有一个氨基，因此可以与酸形成盐，药学上可接受的盐的非限制性实例包括：盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、柠檬酸盐、乙酸盐、琥珀酸盐、抗坏血酸盐、草酸盐、硝酸盐、梨酸盐、磷酸氢盐、磷酸二氢盐、水杨酸盐、柠檬酸氢盐、酒石酸盐、马来酸盐、富马酸盐、甲酸盐、苯甲酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐。
术语“溶剂化物”或“溶剂化合物”指本公开的配体-药物偶联化合物与一种或多种溶剂分子形成可药用的溶剂化物，溶剂分子的非限制性实例包括水、乙醇、乙腈、异丙醇、DMSO、乙酸乙酯。
术语“载药量”是指式(I)分子中每个配体上加载的细胞毒性药物平均数量，也可以表示为药物量和抗体量的比值，药物载量的范围可以是每个配体(Pc)连接0-12个，优选1-10个细胞毒性药物(D)。在本发明的实施方式中，载药量表示为n，示例性的可以为1，2，3，4，5，6，7，8，9，10的均值。可用常规方法如UV/可见光光谱法，质谱，ELISA试验和HPLC特征鉴定偶联反应后每个ADC分 子的药物品均数量。
本公开的一个实施方式中，细胞毒性药物通过连接单元偶联在配体的N端氨基和/或赖氨酸残基的ε-氨基上，一般地，偶联反应中能与抗体偶联的药物分子数将小于理论上的最大值。
可以用以下非限制性方法控制配体细胞毒性药物偶联物的载量，包括：
(1)控制连接试剂和单抗的摩尔比，
(2)控制反应时间和温度，
(3)选择不同的反应试剂。
常规的药物组合物的制备见中国药典。
术语“载体”用于本公开的药物，是指能改变药物进入人体的方式和在体内的分布、控制药物的释放速度并将药物输送到靶向器官的体系。药物载体释放和靶向系统能够减少药物降解及损失，降低副作用，提高生物利用度。如可作为载体的高分子表面活性剂由于其独特的两亲性结构，可以进行自组装，形成各种形式的聚集体，优选的实例如胶束、微乳液、凝胶、液晶、囊泡等。这些聚集体具有包载药物分子的能力，同时又对膜有良好的渗透性，可以作为优良的药物载体。
术语“赋形剂”是在药物制剂中除主药以外的附加物，也可称为辅料。如片剂中的黏合剂、填充剂、崩解剂、润滑剂；半固体制剂软膏剂、霜剂中的基质部分；液体制剂中的防腐剂、抗氧剂、矫味剂、芳香剂、助溶剂、乳化剂、增溶剂、渗透压调节剂、着色剂等均可称为赋形剂。
术语“稀释剂”又称填充剂，其主要用途是增加片剂的重量和体积。稀释剂的加入不仅保证一定的体积大小，而且减少主要成分的剂量偏差，改善药物的压缩成型性等。当片剂的药物含有油性组分时，需加入吸收剂吸收油性物，使保持“干燥”状态，以利于制成片剂。如淀粉、乳糖、钙的无机盐、微晶纤维素等。
药物组合物可以是无菌注射水溶液形式。可在使用的可接受的溶媒和溶剂中有水、林格氏液和等渗氯化钠溶液。无菌注射制剂可以是其中活性成分溶于油相的无菌注射水包油微乳。例如将活性成分溶于大豆油和卵磷脂的混合物中。然后将油溶液加入水和甘油的混合物中处理形成微乳。可通过局部大量注射，将注射液或微乳注入患者的血流中。或者，最好按可保持本公开化合物恒定循环浓度的方式给予溶液和微乳。为保持这种恒定浓度，可使用连续静脉内递药装置。这种装置的实例是Deltec CADD-PLUS.TM.5400型静脉注射泵。
药物组合物可以是用于肌内和皮下给药的无菌注射水或油混悬液的形式。可按已知技术，用上述那些适宜的分散剂或湿润剂和悬浮剂配制该混悬液。无菌注射制剂也可以是在无毒肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中制备的无菌注射溶液或混悬液，例如1,3-丁二醇中制备的溶液。此外，可方便地用无菌固定油作为溶剂或悬浮介质。为此目的，可使用包括合成甘油单或二酯在内的任何调和固定油。此外，脂肪酸例如油酸也可以制备注射剂。
本公开涉及一类可裂解的特定结构的连接臂和特定结构的活性物，及由连接臂、活性物与抗体组成的抗体药物偶联物(ADC)。此类ADC是经由间隔物将一种毒性物质连于抗体而形成的复合物。该抗体偶联药物(ADC)在体内经降解而释放出活性分子，从而起到抗肿瘤的作用。
本公开的合成方法
为了完成本公开的合成目的，本公开采用如下的合成技术方案：
方案一：
本公开通式(D1)所示的化合物或其可药用盐或溶剂合物的制备方法，该方法包括：
Figure PCTCN2019107873-appb-000052
通式(Y1)化合物和通式(Dr)化合物在缩合剂存在下，任选在碱性条件下反应，得到通式(D1)，
其中：R 1、R 2和m如通式(D1)中所定义。
提供碱性条件的试剂包括有机碱和无机碱类，所述的有机碱类包括但不限于三乙胺、二乙胺、N-甲基吗啉、吡啶、六氢吡啶、N,N-二异丙基乙胺、正丁基锂、二异丙基氨基锂、醋酸钾、叔丁醇钠或叔丁醇钾，所述的无机碱类包括但不限于氢化钠、磷酸钾、碳酸钠、碳酸钾、碳酸铯、氢氧化钠和氢氧化锂。
缩合剂可以选自4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化吗啉盐、1-羟基苯并三唑和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N,N'-二环己基碳化二亚胺、N,N'-二异丙基碳二酰亚胺、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸酯、1-羟基苯并三唑、1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲脲六氟磷酸酯、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯、苯并三氮唑-1-基氧基三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸盐或六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷，优选4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化吗啉盐或1-羟基苯并三唑和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐。
方案二：
本公开通式(L b-Y-Dr)所示的化合物或其可药用盐或溶剂合物的制备方法，该方法包括：
Figure PCTCN2019107873-appb-000053
第一步，通式(IB-1)化合物和依喜替康甲磺酸盐(1b)在缩合剂存在下，任选在碱性条件下反应得到通式(IB-2)化合物；
第二步，通式(IB-2)化合物脱去保护基得到通式(IB)化合物；
第三步，通式(IA)化合物和通式(IB)化合物在缩合剂存在下，任选在碱性条件下反应，得到通式(L b-Y-Dr)，
其中：
R c为氨基保护基；优选为9-芴甲氧羰基(Fmoc)；
R 1、R 2、R 5～R 7、s 1和m如通式(L b-Y-Dr)所定义。
提供碱性条件的试剂包括有机碱和无机碱类，所述的有机碱类包括但不限于三乙胺、二乙胺、N-甲基吗啉、吡啶、六氢吡啶、N,N-二异丙基乙胺、正丁基锂、二异丙基氨基锂、醋酸钾、叔丁醇钠或叔丁醇钾，所述的无机碱类包括但不限于氢化钠、磷酸钾、碳酸钠、碳酸钾、碳酸铯、氢氧化钠和氢氧化锂。
缩合剂选自4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化吗啉盐、1-羟基苯并三唑和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N,N'-二环己基碳化二亚胺、N,N'-二异丙基碳二酰亚胺、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸酯、1-羟基苯并三唑、1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲脲六氟磷酸酯、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯、苯并三氮唑-1-基氧基三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸盐或六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷， 优选4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化吗啉盐或1-羟基苯并三唑和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐。
方案三：
本公开通式(Pc-L a-Y-Dr)所示的化合物的方法，其包括如下步骤：
Figure PCTCN2019107873-appb-000054
还原Pc后，与通式(L a-Y-Dr)反应，得到通式(Pc-L a-Y-Dr)；还原剂优选TCEP，特别地，优选还原抗体上的二硫键；
其中：
Pc为配体；
W、L 2、L 3、R 1、R 2、R 5～R 7、m和n如通式(Pc-L a-Y-Dr)中所定义。
以下结合实施例进一步描述本公开，但这些实施例并非限制本公开的范围。
本公开实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照原料或商品制造厂商所建议的条件。未注明具体来源的试剂，为市场购买的常规试剂。
实施例
化合物的结构是通过核磁共振(NMR)或质谱(MS)来确定的。NMR的测定是用Bruker AVANCE-400核磁仪，测定溶剂为氘代二甲基亚砜(DMSO-d6)、氘代氯仿(CDCl 3)、氘代甲醇(CD 3OD)，内标为四甲基硅烷(TMS)，化学位移是以10 -6(ppm)作为单位给出。
MS的测定用FINNIGAN LCQAd(ESI)质谱仪(生产商：Thermo,型号：Finnigan LCQ advantage MAX)。
UPLC的测定用Waters Acquity UPLC SQD液质联用仪。
HPLC的测定使用安捷伦1200DAD高压液相色谱仪(Sunfire C18 150×4.6mm色谱柱)和Waters 2695-2996高压液相色谱仪(Gimini C18 150×4.6mm色谱柱)。
UV-HPLC的测定使用Thermo nanodrop2000紫外分光光度计。
增殖抑制率及IC 50值的测定用PHERAstarFS酶标仪(德国BMG公司)。
薄层层析硅胶板使用烟台黄海HSGF254或青岛GF254硅胶板，薄层色谱法(TLC)使用的硅胶板采用的规格是0.15mm～0.2mm，薄层层析分离纯化产品采用的规格是0.4mm～0.5mm硅胶板。
柱层析一般使用烟台黄海200～300目硅胶为载体。
本公开的已知的起始原料可以采用或按照本领域已知的方法来合成，或可购买自ABCR GmbH&Co.KG，Acros Organnics，Aldrich Chemical Company，韶远化学科技(Accela ChemBio Inc)、达瑞化学品等公司。
实施例中如无特殊说明，反应均在氩气氛或氮气氛下进行。
氩气氛或氮气氛是指反应瓶连接一个约1L容积的氩气或氮气气球。
氢气氛是指反应瓶连接一个约1L容积的氢气气球。
加压氢化反应使用Parr 3916EKX型氢化仪和清蓝QL-500型氢气发生器或HC2-SS型氢化仪。
氢化反应通常抽真空，充入氢气，反复操作3次。
微波反应使用CEM Discover-S 908860型微波反应器。
实施例中如无特殊说明，反应中的溶液是指水溶液。
实施例中如无特殊说明，反应的温度为室温。
室温为最适宜的反应温度，温度范围是20℃～30℃。
实施例中pH＝6.5的PBS缓冲液的配制：取KH 2PO 4 8.5g，K 2HPO 4.3H 2O 8.56g，NaCl 5.85g，EDTA 1.5g置于瓶中，定容至2L，超声波使其全部溶解，摇匀即得。
纯化化合物采用的柱层析的洗脱剂的体系和薄层色谱法的展开剂的体系包括：A：二氯甲烷和异丙醇体系，B：二氯甲烷和甲醇体系，C：石油醚和乙酸乙酯体系，溶剂的体积比根据化合物的极性不同而进行调节，也可以加入少量的三乙胺和酸性或碱性试剂等进行调节。
本公开部分化合物是通过Q-TOF LC/MS来表征的。Q-TOF LC/MS使用安捷伦6530精确质量数四级杆-飞行时间质谱仪和安捷伦1290-Infinity超高效液相色谱仪(安捷伦Poroshell 300SB-C8 5μm,2.1×75mm色谱柱)。
实施例1
N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)-1-羟基环丙烷-1-甲酰胺1
Figure PCTCN2019107873-appb-000055
向依喜替康甲磺酸盐1b(2.0mg，3.76μmol，采用专利申请“EP0737686A1”公开的方法制备而得)中添加1mL N,N-二甲基甲酰胺，冰水浴冷却至0-5℃，滴加一滴三乙胺，搅拌至反应液变澄清。向反应液中依次加入1-羟基环丙基甲酸1a(1.4mg，3.7μmol，采用公知的方法“Tetrahedron Letters,25(12),1269-72；1984”制备而得)和4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化吗啉盐(3.8mg，13.7μmol)，加毕，在0-5℃搅拌反应2小时。向反应液中加入5mL水淬灭反应，用乙酸乙酯(8mL×3)萃取反应液，合并有机相，用饱和氯化钠溶液(5mL×2)洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，将滤液减压浓缩，用薄层层析以展开剂体系B纯化所得残余物，得到标题产物1(1.6mg，产率：82.1％)。
MS m/z(ESI):520.2[M+1]
1H NMR(400MHz,CDCl 3):δ7.90-7.84(m,1H),7.80-7.68(m,1H),5.80-5.70(m,1H),5.62-5.54(m,2H),5.44-5.32(m,2H),5.28-5.10(m,2H),3.40-3.15(m,3H),2.44(s,3H),2.23(t,1H),2.06-1.75(m,2H),1.68-1.56(m,1H),1.22-1.18(m,2H),1.04-0.98(m,2H),0.89(t,3H).
实施例2
(S)-2-环丙基-N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)-2-羟基乙酰胺2-A
(R)-2-环丙基-N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)-2-羟基乙酰胺2-B
Figure PCTCN2019107873-appb-000056
向1b(4mg，7.53μmol)中加入2mL乙醇和0.4mL N,N-二甲基甲酰胺，氩气置换三次，冰水浴冷却至0-5℃，滴加0.3mL N-甲基吗啉，搅拌至反应液变澄清。向反应液中依次加入2-环丙基-2-羟基乙酸2a(2.3mg，19.8μmol，采用专利申请“WO2013106717”公开的方法制备而得)、1-羟基苯并三唑(3mg，22.4μmol)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(4.3mg，22.4μmol)，加毕，在0-5℃搅拌反应1小时。撤去冰水浴，加热至30℃搅拌2小时。反应液减压浓缩，所得到的粗品化合物2用高效液相色谱法纯化(分离条件：色谱柱：XBridge Prep C18 OBD 5um 19*250mm；流动相：A-水(10mmol NH 4OAc)，B-乙腈，梯度洗脱，流速：18mL/min)，收集其相应组分，减压浓缩，得到标题产物(2-A：1.5mg，2-B：1.5mg)。
MS m/z(ESI):534.0[M+1]。
单一构型化合物2-B(较短保留时间)
UPLC分析：保留时间1.06分钟，纯度：88％(色谱柱：ACQUITY UPLC BEHC18 1.7um 2.1*50mm，流动相：A-水(5mmol NH 4OAc),B-乙腈)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6):δ8.37(d,1H),7.76(d,1H),7.30(s,1H),6.51(s,1H),5.58-5.56(m,1H),5.48(d,1H),5.41(s,2H),5.32-5.29(m,2H),3.60(t,1H),3.19-3.13(m,1H),2.38(s,3H),2.20-2.14(m,1H),1.98(q,2H),1.87-1.83(m,1H),1.50-1.40(m,1H),1.34-1.28(m,1H),0.86(t,3H),0.50-0.39(m,4H)。
单一构型化合物2-A(较长保留时间)
UPLC分析：保留时间1.10分钟，纯度：86％(色谱柱：ACQUITY UPLC BEHC18 1.7um 2.1*50mm，流动相：A-水(5mmol NH 4OAc),B-乙腈)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6):δ8.35(d,1H),7.78(d,1H),7.31(s,1H),6.52(s,1H),5.58-5.53(m,1H),5.42(s,2H),5.37(d,1H),5.32(t,1H),3.62(t,1H),3.20-3.15(m,2H),2.40(s,3H),2.25-2.16(m,1H),1.98(q,2H),1.87-1.82(m,1H),1.50-1.40(m,1H),1.21-1.14(m,1H),0.87(t,3H),0.47-0.35(m,4H)。
实施例3
(S)-N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢 -1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)-3,3,3-三氟-2-羟基丙酰胺3-A
(R)-N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)-3,3,3-三氟-2-羟基丙酰胺3-B
Figure PCTCN2019107873-appb-000057
向1b(5.0mg，9.41μmol)中添加2mL乙醇和0.4mL N,N-二甲基甲酰胺，冰水浴冷却至0-5℃，滴加0.3mL N-甲基吗啡啉，搅拌至反应液变澄清。向反应液中依次加入3,3,3-三氟-2-羟基丙酸3a(4.1mg，28.4μmol，供应商Alfa)、1-羟基苯并三唑(3.8mg，28.1μmol)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(5.4mg，28.2μmol)，加毕，在0-5℃搅拌反应10分钟。撤去冰水浴，加热至30℃搅拌8小时。反应液减压浓缩，所得到的粗品化合物3用高效液相色谱法纯化(分离条件：色谱柱：XBridge Prep C18 OBD 5um 19*250mm；流动相：A-水(10mmol NH 4OAc)：B-乙腈，梯度洗脱，流速：18mL/min)，收集其相应组分，减压浓缩，得到标题产物(1.5mg，1.5mg)。
MS m/z(ESI):561.9[M+1]。
单一构型化合物(较短保留时间)
UPLC分析：保留时间1.11分钟，纯度：88％(色谱柱：ACQUITY UPLC BEHC18 1.7um 2.1*50mm，流动相：A-水(5mmol NH 4OAc),B-乙腈)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6):δ8.94(d,1H),7.80(d,1H),7.32(s,1H),7.20(d,1H),6.53(s,1H),5.61-5.55(m,1H),5.45-5.23(m,3H),5.15-5.06(m,1H),4.66-4.57(m,1H),3.18-3.12(m,1H),2.40(s,3H),2.26-2.20(m,1H),2.16-2.08(m,1H),2.02-1.94(m,1H),1.89-1.82(m,1H),1.50-1.40(m,1H),0.87(t,3H)。
单一构型化合物(较长保留时间)
UPLC分析：保留时间1.19分钟，纯度：90％(色谱柱：ACQUITY UPLC BEHC18 1.7um 2.1*50mm，流动相：A-水(5mmol NH 4OAc),B-乙腈)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6):δ8.97(d,1H),7.80(d,1H),7.31(s,1H),7.16(d,1H),6.53(s,1H),5.63-5.55(m,1H),5.45-5.20(m,3H),5.16-5.07(m,1H),4.66-4.57 (m,1H),3.18-3.12(m,1H),2.40(s,3H),2.22-2.14(m,1H),2.04-1.95(m,2H),1.89-1.82(m,1H),1.50-1.40(m,1H),0.87(t,3H)。
实施例4
N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)-1-羟基环戊烷-1-甲酰胺4
Figure PCTCN2019107873-appb-000058
向1b(3.0mg，5.64μmol)中添加1mL N,N-二甲基甲酰胺，冰水浴冷却至0-5℃，滴加一滴三乙胺，搅拌至反应液变澄清。向反应液中依次加入1-羟基-环戊烷甲酸4a(2.2mg，16.9μmol，采用专利申请“WO2013106717”公开的方法制备而得)和4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化吗啉盐(4.7mg，16.9μmol)，加毕，在0-5℃搅拌反应1小时。向反应液中加入5mL水淬灭反应，用乙酸乙酯(10mL×3)萃取反应液，合并有机相，用饱和氯化钠溶液(5mL×2)洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，将滤液减压浓缩，用薄层层析以展开剂体系B纯化所得残余物，得到标题产物4(2.5mg，产率：80.9％)。
MS m/z(ESI):548.0[M+1]。
1H NMR(400MHz,CDCl 3):δ7.73-7.62(m,2H),5.75-5.62(m,1H),5.46-5.32(m,2H),5.26-5.10(m,1H),3.30-3.10(m,1H),2.43(s,3H),2.28-2.20(m,2H),2.08-1.84(m,8H),1.69-1.58(m,2H),1.04-1.00(m,2H),0.89(t,3H)。
实施例5
N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)-1-(羟甲基)环丙烷-1-甲酰胺5
Figure PCTCN2019107873-appb-000059
向1b(2.0mg，3.76μmol)中添加1mL N,N-二甲基甲酰胺，冰水浴冷却至0-5℃，滴加一滴三乙胺，搅拌至反应液变澄清。向反应液中依次加入1-(羟甲基)-环戊烷甲酸5a(0.87mg，7.5μmol，采用专利申请“WO201396771”公开的方法制备而得)和4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化吗啉盐(2mg，7.24μmol)，加毕，在0-5℃搅拌反应2小时。向反应液中加入5mL水淬灭反应，用乙酸乙酯(8mL×3)萃取反应液，合并有机相，用饱和氯化钠溶液(5mL×2)洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，将滤液减压浓缩，用薄层层析以展开剂体系B纯化所得残余物，得到标题产物5(1.0mg，产率：50％)。
MS m/z(ESI):533.9[M+1]。
1H NMR(400MHz,CDCl 3):δ8.07(s,1H),7.23-7.18(m,2H),6.71-6.64(m,1H),6.55-6.51(m,1H),5.36-5.27(m,2H),4.67-4.61(m,2H),3.53-3.48(m,1H),3.30-3.22(m,2H),3.18-3.13(m,1H),2.71-2.61(m,2H),2.35-2.28(m,1H),2.04-1.91(m,4H),1.53-1.40(m,3H),0.91-0.75(m,4H)。
实施例6
N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)-1-(羟基甲基)环丁烷-1-甲酰胺6
Figure PCTCN2019107873-appb-000060
Figure PCTCN2019107873-appb-000061
向1b(3.0mg，5.64μmol)中添加1mL N,N-二甲基甲酰胺，冰水浴冷却至0-5℃，滴加一滴三乙胺，搅拌至反应液变澄清。向反应液中依次加入1-(羟基甲基)环丁烷-1-甲酸6a(2.2mg，16.9μmol；采用文献“Journal of the American Chemical Society,2014,vol.136,#22,p.8138-8142”公开的方法制备而得)和4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化吗啉盐(4.7mg，16.9μmol)，加毕，在0-5℃搅拌反应1小时。向反应液中加入5mL水淬灭反应，用乙酸乙酯(10mL×3)萃取反应液，合并有机相，用饱和氯化钠溶液(5mL×2)洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，将滤液减压浓缩，用薄层层析以展开剂体系B纯化所得残余物，得到标题产物6(2.1mg，产率：67.9％)。
MS m/z(ESI):548.0[M+1]。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6):δ7.85-7.62(m,1H),6.88(br，1H),5.87-5.48(m，2H),5.47-5.33(m，1H),5.31-5.06(m，1H),4.25-3.91(m,2H),3.25(br,1H),2.60-2.32(m,3H),2.23(t,1H),2.15-1.95(m,3H),1.70-1.56(m,2H),1.41-1.17(m,9H),1.03(s,1H),0.95-0.80(m,2H)。
实施例7
N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)-1-羟基环丁烷-1-甲酰胺7
Figure PCTCN2019107873-appb-000062
Figure PCTCN2019107873-appb-000063
向1b(3.0mg，5.64μmol)中添加2mL乙醇和0.4mL N,N-二甲基甲酰胺，冰水浴冷却至0-5℃，滴加0.3mL N-甲基吗啡啉，搅拌至反应液变澄清。向反应液中依次加入1-羟基环丁烷甲酸7a(2.0mg，17.22μmol，供应商药石)，1-羟基苯并三唑(2.3mg，17.0μmol)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(3.2mg，16.7μmol)，加毕，在0-5℃搅拌反应10分钟。撤去冰水浴，常温搅拌2小时。反应液减压浓缩，用薄层层析以展开剂体系B纯化所得残余物，得到标题产物7(2.5mg，产率：83.1％)。
MS m/z(ESI):534.0[M+1]。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6):δ8.28(d,1H),7.75(d,1H),7.29(s,1H),6.51(s,1H),6.12(s,1H),5.59-5.51(m,1H),5.41(s,2H),5.20-5.01(m,2H),3.27-3.17(m,1H),3.15-3.05(m,1H),2.71-2.63(m,1H),2.37(s,3H),2.12-2.05(m,1H),2.03-1.94(m,2H),1.92-1.78(m,4H),1.50-1.42(m,1H),0.90-0.83(m,4H)。
实施例8
1-(((S)-7-苄基-20-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-3,6,9,12,15-五氧代
-2,5,8,11,14-五氮杂二十烷基)氧基)-N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)环丙烷-1-甲酰胺8
Figure PCTCN2019107873-appb-000064
Figure PCTCN2019107873-appb-000065
第一步
1-((2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰氨基)甲氧基)环丙烷-1-羧酸苄酯8c
将1-羟基环丙烷-1-羧酸苄酯8a(104mg，0.54mmol；采用专利申请“US2005/20645”公开的方法制备而得)和2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰氨基)甲基乙酸酯8b(100mg，0.27mmol；采用专利申请“CN105829346A”公开的方法制备而得)加入反应瓶，加入5mL四氢呋喃，氩气置换三次，冰水浴降温至0-5℃，加入叔丁醇钾(61mg，0.54mmol)，撤去冰浴，升至室温搅拌10分钟，加入20mL冰水，用乙酸乙酯(5mL×2)和氯仿(5mL×5)萃取，合并有机相并浓缩。所得残余物溶于3mL 1,4-二氧六环中，加入0.6mL水，加入碳酸氢钠(27mg，0.32mmol)和氯甲酸-9-芴甲酯(70mg，0.27mmol)，室温搅拌1小时。加入20mL水，用乙酸乙酯(8mL×3)萃取，有机相用饱和氯化钠溶液(20mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，用硅胶柱色谱法以展开剂体系B纯化所得残余物，得到标题产物8c(100mg，产率：73.6％)。
MS m/z(ESI):501.0[M+1]。
第二步
1-((2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰氨基)甲氧基)环丙烷-1-羧酸8d
将8c(50mg，0.10mmol)溶于3mL四氢呋喃和乙酸乙酯(V:V＝2:1)混合溶剂中，加入钯碳(25mg，含量10％)，氢气置换三次，室温搅拌反应1小时。反应液用硅藻土过滤，滤饼用四氢呋喃淋洗，滤液浓缩，得到标题产物8d(41mg，产率：100％)。
MS m/z(ESI):411.0[M+1]。
第三步
(9H-芴-9-基)甲基(2-(((1-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨 基羰基)环丙氧基)甲基)氨基)-2-氧代乙基)氨基甲酸酯8e
将1b(7mg，0.013mmol)加入反应瓶，加入1mL N,N-二甲基甲酰胺，氩气置换三次，冰水浴降温至0-5℃，滴加一滴三乙胺，加入8d(7mg，0.017mmol)的0.5mL N,N-二甲基甲酰胺溶液，加入4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化吗啉盐(7mg，0.026mmol)，冰浴搅拌反应35分钟。加入10mL水，用乙酸乙酯(5mL×3)萃取，有机相用饱和氯化钠溶液(10mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，用薄层层析以展开剂体系B纯化所得残余物，得到标题产物8e(8.5mg，产率78.0％)。
MS m/z(ESI):828.0[M+1]。
第四步
1-((2-氨基乙酰氨基)甲氧基)-N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)环丙烷-1-甲酰胺8f
将8e(4mg，4.84μmol)溶于0.2mL二氯甲烷中，加入0.1mL二乙胺，室温搅拌2小时。反应液减压浓缩，加入2mL甲苯减压浓缩，重复两次，加入3mL正己烷打浆，倾倒出上层正己烷，重复三次，减压浓缩得到粗品标题产物8f(2.9mg)，产品不经纯化直接用于下一步反应。
MS m/z(ESI):606.0[M+1]。
第五步
1-(((S)-7-苄基-20-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-3,6,9,12,15-五氧代-2,5,8,11,14-五氮杂二十烷基)氧基)-N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)环丙烷-1-甲酰胺8
将粗品8f(2.9mg，4.84μmol)溶于0.5mL N,N-二甲基甲酰胺，氩气置换三次，冰水浴降温至0-5℃，加入(S)-2(-2-(-2-(6-(2,5-二氧代-1H-吡咯-1-基)已酰氨基)乙酰氨基)乙酰氨基)-3-苯基丙酸8g(2.7mg，5.80μmol，采用专利申请“EP2907824”公开的方法制备而得)的0.3mL N,N-二甲基甲酰胺溶液，加入4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化吗啉盐(2.7mg，9.67μmol)，冰浴搅拌反应30分钟，撤去冰浴，升至室温搅拌15分钟。反应液进行高效液相色谱法纯化(分离条件：色谱柱：XBridge Prep C18 OBD 5um 19*250mm；流动相:A-水(10mmol NH 4OAc)：B-乙腈，梯度洗脱，流速：18mL/min)，收集其相应组分，减压浓缩得到标题产物8(2mg，产率：39.0％)。
MS m/z(ESI):1060.0[M+1]。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6):δ9.01(d,1H),8.77(t,1H),8.21(t,1H),8.08-7.92(m,2H),7.73(d,1H),7.28(s,1H),7.24-7.07(m,4H),6.98(s,1H),6.50(s,1H),5.61(q,1H),5.40(s,2H),5.32(t,1H),5.12(q,2H),4.62(t,1H),4.52(t,1H), 4.40-4.32(m,1H),3.73-3.47(m,8H),3.16-3.04(m,2H),2.89(dd,1H),2.69-2.55(m,2H),2.37-2.23(m,4H),2.12-1.93(m,4H),1.90-1.74(m,2H),1.52-1.38(m,4H),1.33-1.11(m,5H),0.91-0.81(m,4H)。
实施例9
N-((2R,10S)-10-苄基-2-环丙基-1-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨基)-1,6,9,12,15-五氧代-3-氧杂-5,8,11,14-四氮杂十六-16-基)-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺9-A
N-((2S,10S)-10-苄基-2-环丙基-1-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨基)-1,6,9,12,15-五氧代-3-氧杂-5,8,11,14-四氮杂十六-16-基)-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺9-B
Figure PCTCN2019107873-appb-000066
第一步
2-环丙基-2-羟基乙酸苄酯9a
将2a(1.3g，11.2mmol；采用专利申请“WO2013/106717”公开的方法制备而得)溶于50mL乙腈中，依次加入碳酸钾(6.18g，44.8mmol)，溴化苄(1.33mL，11.2 mmol)和四丁基碘化铵(413mg，1.1mmol)。将反应液室温搅拌48小时，通过硅藻土过滤，滤饼用乙酸乙酯(10ml)淋洗，合并滤液减压浓缩，用硅胶柱色谱法以展开剂体系C纯化所得残余物，得到标题产物9a(2g，产率：86.9％)。
第二步
10-环丙基-1-(9H-芴-9-基)-3,6-二氧代-2,9-二氧杂-4,7-二氮杂十一-11-酸苄酯9b
将9a(120.9mg,0.586mmol)和8b(180mg，0.489mmol)加入反应瓶，加入4mL四氢呋喃，氩气置换三次，冰水浴降温至0-5℃，加入叔丁醇钾(109mg，0.98mmol)，撤去冰浴，升至室温搅拌40分钟，加入10mL冰水，用乙酸乙酯(20mL×2)和氯仿(10mL×5)萃取，合并有机相并浓缩。所得残余物溶于4mL二氧六环中，加入2mL水，加入碳酸氢钠(49.2mg，0.586mmol)和氯甲酸-9-芴甲酯(126mg，0.49mmol)，室温搅拌2小时。加入20mL水，用乙酸乙酯(10mL×3)萃取，有机相用饱和氯化钠溶液(20mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩。用硅胶柱色谱法以展开剂体系C纯化所得残余物，得到标题产物9b(48mg，产率：19％)。
MS m/z(ESI):515.0[M+1]。
第三步
10-环丙基-1-(9H-芴-9-基)-3,6-二氧代-2,9-二氧杂-4,7-二氮杂十一-11-酸9c
将9b(20mg，0.038mmol)溶于4.5mL四氢呋喃和乙酸乙酯(V:V＝2:1)混合溶剂中，加入钯碳(12mg，含量10％，干型)，氢气置换三次，室温搅拌反应1小时。反应液用硅藻土过滤，滤饼用乙酸乙酯淋洗，滤液浓缩，得到粗品标题产物9c(13mg)，产品不经纯化直接进行下一步反应。
MS m/z(ESI):424.9[M+1]。
第四步
(9H-芴-9-基)甲基(2-(((1-环丙基-2-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨基)-2-氧代乙氧基)甲基)氨基)-2-氧代乙基)氨基甲酸酯9d
将1b(10mg，18.8μmol)加入反应瓶，加入1mL N,N-二甲基甲酰胺，氩气置换三次，冰水浴降温至0-5℃，滴加一滴三乙胺，加入粗品9c(13mg，30.6μmol)，加入4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化吗啉盐(16.9mg，61.2μmol)，冰浴搅拌反应40分钟。加入10mL水，用乙酸乙酯(10mL×3)萃取，合并有机相。有机相用饱和氯化钠溶液(10mL×2)洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩。用薄层层析以展开剂体系B纯化所得残余物，得到标题产物9d(19mg，产率：73.6％)。
MS m/z(ESI):842.1[M+1]。
第五步
2-((2-氨基乙酰氨基)甲氧基)-2-环丙基-N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉 -1-基)乙酰胺9e
将9d(19mg，22.6μmol)溶于2mL二氯甲烷中，加入1mL二乙胺，室温搅拌2小时。反应液减压浓缩，加入1mL甲苯并减压浓缩，重复两次。往残余物中加入3mL正己烷打浆，静置后倾倒出上层清液，保留固体。将固体残余物减压浓缩，油泵拉干得到粗品标题产物9e(17mg)，产品不经纯化直接用于下一步反应。
MS m/z(ESI):638.0[M+18]。
第六步
N-((2R,10S)-10-苄基-2-环丙基-1-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨基)-1,6,9,12,15-五氧代-3-氧杂-5,8,11,14-四氮杂十六-16-基)-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺9-A
N-((2S,10S)-10-苄基-2-环丙基-1-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨基)-1,6,9,12,15-五氧代-3-氧杂-5,8,11,14-四氮杂十六-16-基)-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺9-B
将粗品9e(13.9mg，22.4μmol)溶于0.6mL N,N-二甲基甲酰胺，氩气置换三次，冰水浴降温至0-5℃，加入8g(21.2mg，44.8μmol)的0.3mL N,N-二甲基甲酰胺溶液，加入4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化吗啉盐(18.5mg，67.3μmol)，冰浴搅拌反应10分钟，撤去冰浴，升至室温搅拌1小时，反应生成化合物9。反应液进行高效液相色谱法纯化(分离条件：色谱柱：XBridge Prep C18 OBD 5um 19*250mm；流动相:A-水(10mmol NH 4OAc)：B-乙腈，梯度洗脱，流速：18mL/min)，收集其相应组分，减压浓缩，得到标题产物(9-A：2.4mg，9-B：1.7mg)。
MS m/z(ESI):1074.4[M+1]。
单一构型化合物9-A(较短保留时间)：
UPLC分析:保留时间1.14分钟，纯度：85％(色谱柱：ACQUITY UPLC BEHC18 1.7um 2.1*50mm，流动相：A-水(5mmol NH 4OAc),B-乙腈)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6):δ8.60(t,1H),8.51-8.49(d,1H),8.32-8.24(m,1H),8.13-8.02(m,2H),8.02-7.96(m,1H),7.82-7.75(m,1H),7.31(s,1H),7.26-7.15(m,4H),6.99(s,1H),6.55-6.48(m,1H),5.65-5.54(m,1H),5.41(s,2H),5.35-5.15(m,3H),4.74-4.62(m,1H),4.54-4.40(m,2H),3.76-3.64(m，4H),3.62-3.48(m,2H),3.20-3.07(m,2H),3.04-2.94(m,1H),2.80-2.62(m,1H),2.45-2.30(m,3H),2.25-2.15(m,2H),2.15-2.04(m,2H),1.93-1.78(m,2H),1.52-1.39(m,3H),1.34-1.12(m,5H),0.87(t,3H),0.64-0.38(m,4H)。
单一构型化合物9-B(较长保留时间)：
UPLC分析:保留时间1.16分钟，纯度：89％(色谱柱：ACQUITY UPLC BEHC18 1.7um 2.1*50mm，流动相：A-水(5mmol NH 4OAc),B-乙腈)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6):δ8.68-8.60(m,1H),8.58-8.50(m,1H), 8.32-8.24(m,1H),8.13-8.02(m,2H),8.02-7.94(m,1H),7.82-7.75(m,1H),7.31(s,1H),7.26-7.13(m,3H),6.99(s,1H),6.55-6.48(m,1H),5.60-5.50(m,1H),5.41(s,2H),5.35-5.15(m,2H),4.78-4.68(m,1H),4.60-4.40(m,2H),3.76-3.58(m,4H),3.58-3.48(m,1H),3.20-3.10(m,2H),3.08-2.97(m,2H),2.80-2.72(m,2H),2.45-2.30(m,3H),2.25-2.13(m,2H),2.13-2.04(m,2H),2.03-1.94(m,2H),1.91-1.78(m,2H),1.52-1.39(m,3H),1.34-1.12(m,4H),0.91-0.79(m,3H),0.53-0.34(m,4H)。
实施例10
N-((2S,10S)-10-苄基-2-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨基羰基)-1,1,1-三氟-6,9,12,15-四氧代-3-氧杂-5,8,11,14-四氮杂十六-16-基)-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺10-A
N-((2R,10S)-10-苄基-2-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨基羰基)-1,1,1-三氟-6,9,12,15-四氧代-3-氧杂-5,8,11,14-四氮杂十六-16-基)-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺10-B
Figure PCTCN2019107873-appb-000067
第一步
3,3,3-三氟-2-羟基丙酸苄酯10a
将3a(1.80g，12.5mmol)溶于100mL乙腈中，依次加入碳酸钾(5.17g，37.5mmol)，溴化苄(4.48mL，37.5mmol)和四丁基碘化铵(231mg，0.63mmol)。将反应液加热至60℃搅拌5小时。将反应液冷却至室温，过滤，滤液减压浓缩，用硅胶柱色谱法以展开剂体系C纯化所得残余物，得到标题产物10a(980mg，产率：33.5％)。
1H NMR(400MHz,CDCl 3):δ7.43-7.36(m,5H),5.34(s,2H),4.53(s,1H),3.44(s,1H)。
第二步
1-(9H-芴-9-基)-3,6-二氧代-10-(三氟甲基)-2,9-二氧杂-4,7-二氮杂十一-11-酸苄酯10b
将8b(63mg,0.17mmol)和10a(80mg，0.34mmol)加入反应瓶，加入3mL四氢呋喃，氩气置换三次，冰水浴降温至0-5℃，加入叔丁醇钾(38mg，0.34mmol)，撤去冰浴，升至室温搅拌20分钟，加入10mL冰水，用乙酸乙酯(20mL×2)和氯仿(10mL×5)萃取，合并有机相并浓缩，所得残余物溶于2mL二氧六环中，加入0.4mL水，加入碳酸氢钠(19mg，0.23mmol)和氯甲酸-9-芴甲酯(49mg，0.19mmol)，室温搅拌1小时。加入20mL水，用乙酸乙酯(10mL×3)萃取，有机相用饱和氯化钠溶液(20mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，用硅胶柱色谱法以展开剂体系C纯化所得残余物，得到标题产物10b(51mg，产率：55.3％)。
MS m/z(ESI):559.9[M+18]。
第三步
1-(9H-芴-9-基)-3,6-二氧代-10-(三氟甲基)-2,9-二氧杂-4,7-二氮杂十一-11-酸10c
将10b(15mg，0.28mmol)溶于3mL四氢呋喃和乙酸乙酯(V:V＝2:1)混合溶剂中，加入钯碳(15mg，含量10％)，氢气置换三次，室温搅拌反应1小时。反应液用硅藻土过滤，滤饼用四氢呋喃淋洗，滤液浓缩，得到粗品标题产物10c(13mg)。
MS m/z(ESI):452.9[M+1]。
第四步
(9H-芴-9-基)甲基(2-((((3-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨基)-1,1,1-三氟-3-氧代丙-2-基)氧基)甲基)氨基)-2-氧代乙基)氨基甲酸酯10d
将1b(10mg，18.8μmol)加入反应瓶，加入1mL N,N-二甲基甲酰胺，氩气置换三次，冰水浴降温至0-5℃，滴加一滴三乙胺，加入10c(13mg，28.7μmol)的0.5mL N,N-二甲基甲酰胺溶液，加入4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化吗啉盐(11mg，39.7μmol)，冰浴搅拌反应30分钟。加入10mL水，用乙酸乙酯(10mL×3)萃取，合并有机相，有机相用饱和氯化钠溶液(10mL×2)洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，用薄层层析以展开剂体系B纯化所得残余 物，得到标题产物10d(16mg，产率97.8％)。
MS m/z(ESI):870.0[M+1]。
第五步
2-((2-氨基乙酰氨基)甲氧基)-N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)-3,3,3-三氟丙酰胺10e
将10d(16mg，18.4μmol)溶于0.6mL二氯甲烷中，加入0.3mL二乙胺，室温搅拌2小时。反应液减压浓缩，加入2mL甲苯并减压浓缩，重复两次。往残余物中加入3mL正己烷打浆，静置后倾倒出上层清液，保留固体；重复三次。将固体残余物减压浓缩，油泵拉干得到粗品标题产物10e(12mg)，产品不经纯化直接用于下一步反应。
MS m/z(ESI):647.9[M+1]。
第六步
N-((2S,10S)-10-苄基-2-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨基羰基)-1,1,1-三氟-6,9,12,15-四氧代-3-氧杂-5,8,11,14-四氮杂十六-16-基)-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺10-A
N-((2R,10S)-10-苄基-2-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨基羰基)-1,1,1-三氟-6,9,12,15-四氧代-3-氧杂-5,8,11,14-四氮杂十六-16-基)-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺10-B
将粗品10e(12mg，18.5μmol)溶于1.0mL N,N-二甲基甲酰胺，氩气置换三次，冰水浴降温至0-5℃，加入8g(14mg，29.6μmol)的0.3mL N,N-二甲基甲酰胺溶液，加入4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化吗啉盐(15mg，54.2μmol)，冰浴搅拌反应30分钟，撤去冰浴，升至室温搅拌1小时，反应生成化合物10。反应液进行高效液相色谱法纯化(分离条件：色谱柱：XBridge Prep C18 OBD 5um 19*250mm；流动相:A-水(10mmol NH 4OAc)B-乙腈，梯度洗脱，流速：18mL/min)，收集其相应组分，减压浓缩，得到标题产物(2.7mg，2.6mg)。
MS m/z(ESI):1102.0[M+1]。
单一构型化合物(较短保留时间)：
UPLC分析:保留时间1.18分钟，纯度：91％(色谱柱：ACQUITY UPLC BEHC18 1.7um 2.1*50mm，流动相：A-水(5mmol NH 4OAc),B-乙腈)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6):δ8.97(d,1H),8.85-8.76(m,1H),8.37-8.27(m,1H),8.12-8.02(m,1H),8.02-7.95(m,1H),7.80(d,1H),7.31(s,1H),7.26-7.10(m,4H),6.99(s,1H),6.66(br,1H),6.52(s,1H),5.65-5.54(m,1H),5.41(s,1H),5.37-5.25(m,3H),5.23-5.13(m,1H),4.81-4.68(m,2H),4.51-4.41(m,1H),3.78-3.45(m,6H),3.21-3.13(m,1H),3.02-2.93(m,1H),2.77-2.63(m,2H),2.45-2.29(m,3H),2.24-2.05 (m,3H),2.04-1.93(m,5H),1.90-1.75(m,2H),1.52-1.38(m,4H),0.90-0.78(m,5H)。
单一构型化合物(较长保留时间)：
UPLC分析:保留时间1.23分钟，纯度：90％(色谱柱：ACQUITY UPLC BEHC18 1.7um 2.1*50mm，流动相：A-水(5mmol NH 4OAc),B-乙腈)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6):δ9.05(d,1H),8.97-8.88(m,1H),8.35-8.27(m,1H),8.11-8.03(m,1H),8.02-7.95(m,1H),7.80(d,1H),7.34(s,1H),7.29-7.13(m,4H),6.99(s,1H),6.66(br,1H),6.54(s,1H),5.64-5.55(m,1H),5.43(s,1H),5.36-5.20(m,3H),4.92-4.85(m,1H),4.82-4.72(m,2H),4.52-4.42(m,1H),3.77-3.48(m,6H),3.21-3.14(m,1H),3.03-2.95(m,1H),2.79-2.65(m,2H),2.47-2.28(m,3H),2.25-2.05(m,3H),2.05-1.94(m,5H),1.91-1.76(m,2H),1.52-1.37(m,4H),0.92-0.77(m,5H)。
实施例11
1-(((S)-7-苄基-20-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-3,6,9,12,15-五氧代-2,5,8,11,14-五氮杂二十烷基)氧基)-N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)环丁烷-1-甲酰胺11
Figure PCTCN2019107873-appb-000068
第一步
1-((2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰氨基)甲氧基)环丁烷-1-羧酸苄酯11b
将1-羟基环丁烷-羧酸苄酯11a(167mg，0.81mmol，采用文献“Journal of Medicinal Chemistry,2013,vol.56,#13,p.5541-5552”公开的方法制备而得)和8b(150mg，0.41mmol)加入反应瓶，加入5mL四氢呋喃，氩气置换三次，冰水浴降 温至0-5℃，加入叔丁醇钾(92mg，0.82mmol)，撤去冰浴，升至室温搅拌10分钟，加入20mL冰水，用乙酸乙酯(5mL×2)和氯仿(5mL×5)萃取，合并有机相并浓缩，所得残余物溶于3mL二氧六环中，加入0.6mL水，加入碳酸氢钠(41mg，0.48mmol)和氯甲酸-9-芴甲酯(105mg，0.41mmol)，室温搅拌1小时。加入20mL水，用乙酸乙酯(8mL×3)萃取，有机相用饱和氯化钠溶液(20mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，用硅胶柱色谱法以展开剂体系C纯化所得残余物，得到标题产物11b(37mg，产率：17.6％)。
MS m/z(ESI):514.6[M+1]。
第二步
1-((2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰氨基)甲氧基)环丁烷-1-羧酸11c
将11b(37mg，71.9μmol)溶于3mL四氢呋喃和乙酸乙酯(V:V＝2:1)混合溶剂中，加入钯碳(15mg，含量10％)，氢气置换三次，室温搅拌反应2小时。反应液用硅藻土过滤，滤饼用四氢呋喃淋洗，滤液浓缩，得到标题产物11c(35mg，产率：82％)，直接进行下一步。
第三步
(9H-芴-9-基)甲基(2-(((1-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨基羰基)环丁氧基)甲基)氨基)-2-氧代乙基)氨基甲酸酯11d
将1b(10mg，0.018mmol)加入反应瓶，加入1mL N,N-二甲基甲酰胺，氩气置换三次，冰水浴降温至0-5℃，滴加一滴三乙胺，加入11c(13mg，0.031mmol)的0.5mL N,N-二甲基甲酰胺溶液，加入4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化吗啉盐(25mg，0.091mmol)，冰浴搅拌反应40分钟。加入8mL水，用乙酸乙酯(5mL×3)萃取，有机相用饱和氯化钠溶液(8mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，用薄层层析以展开剂体系A纯化所得残余物，得到标题产物11d(19mg，产率73.9％)。
MS m/z(ESI):842.3[M+1]。
第四步
1-((2-氨基乙酰氨基)甲氧基)-N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)环丁烷-1-甲酰胺11e
将11d(19mg，22.6μmol)溶于2mL二氯甲烷中，加入1mL二乙胺，室温搅拌1.5小时。反应液减压浓缩，加入1mL甲苯减压浓缩，重复两次，加入4mL正己烷打浆，倾倒出上层正己烷，重复三次，减压浓缩得到粗品标题产物11e(15mg)，产品不经纯化直接用于下一步反应。
第五步
1-(((S)-7-苄基-20-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-3,6,9,12,15-五氧代 -2,5,8,11,14-五氮杂二十烷基)氧基)-N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)环丁烷-1-甲酰胺11
将粗品11e(2mg，3.22μmol)溶于0.5mL N,N-二甲基甲酰胺，氩气置换三次，冰水浴降温至0-5℃，加入8g(1.5mg，3.17μmol)的0.3mL N,N-二甲基甲酰胺溶液，加入4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化吗啉盐(2.7mg，9.67μmol)，室温搅拌30分钟。反应液用油泵旋干，除掉DMF，残余物用DCM溶解后直接用薄层层析法纯化2次(展开剂极性：DCM/MeOH＝10/1)，得到标题产物11(1mg，产率：28.8％)。
MS m/z(ESI):1073.6[M+1]。
1H NMR(400MHz,CDCl 3):δ8.70-8.60(m,1H),8.28-8.19(m,1H),8.13-7.91(m,3H),7.79-7.71(d,1H),7.29(s,1H),7.25-7.09(m,4H),6.98(s,1H),6.71-6.62(m,1H),6.55-6.47(m,1H),5.64-5.54(m,2H),5.40(s,1H),5.35-5.27(t,2H),5.17-5.10(m,2H),4.60-4.51(m,1H),4.51-4.35(m,2H),3.93-3.78(m,3H),3.71-3.59(m,3H),3.01-2.88(m,3H),2.70-2.64(m,2H),2.44-2.30(m,3H),2.28-2.14(m,3H),2.11-1.92(m,6H),1.90-1.76(m,3H),1.51-1.39(m,4H),0.92-0.75(m,6H)。
实施例12
(S)-3-环丙基-N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)-2-羟基丙酰胺12-A
(R)-3-环丙基-N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)-2-羟基丙酰胺12-B
Figure PCTCN2019107873-appb-000069
第一步
3-环丙基-2-羟基丙酸12b
将12a(0.5g，3.87mmol，供应商Adamas)溶于35mL水和乙酸(V:V＝4:1)的混合溶剂中，冰水浴降温至0-5℃，滴加亚硝酸钠(0.53g，7.74mmol)的2M水溶液，升至室温搅拌反应3小时。向反应液中加入固体氯化钠，使水相饱和，用乙酸乙酯(8mL×8)萃取，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，得到标题产物12b(0.45g，产率： 89.3％)。
第二步
(S)-3-环丙基-N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)-2-羟基丙酰胺12-A
(R)-3-环丙基-N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)-2-羟基丙酰胺12-B
向1b(45mg，0.085mmol)中加入1.5mL乙醇和1.5mL N,N-二甲基甲酰胺，氩气置换三次，滴加0.1mL N-甲基吗啉，搅拌至反应液变澄清。向反应液中依次加入12b(90mg，0.691mmol)，1-羟基苯并三唑(34mg，0.251mmol)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(49mg，0.256mmol)，加毕，室温搅拌反应3小时。反应液减压浓缩，所得到的粗品化合物12用高效液相色谱法纯化(分离条件：色谱柱：Sharpsil-T C18 5um 21.2*250mm；流动相：A-水(10mmol NH 4OAc)，B-乙腈，梯度洗脱，流速：18mL/min)，得到标题产物(7mg，15mg)。
MS m/z(ESI):547.9[M+1]。
单一构型化合物(较短保留时间)
UPLC分析：保留时间1.345分钟，纯度：72％(色谱柱：ZORBAX Ecliphase Plus C18 1.8um 2.1*50mm，流动相：A-水(5mmol NH 4OAc),B-乙腈)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6):δ8.42(d,1H),7.78(d,1H),7.30(s,1H),6.51(s,1H),5.60-5.50(m,2H),5.42(s,1H),5.19(q,2H),4.02-4.00(m,1H),3.21-3.11(m,2H),2.39(s,3H),2.21-2.07(m,2H),2.05-1.95(m,1H),1.92-1.68(m,4H),1.53-1.41(m,1H),0.87(t,3H),0.48-0.34(m,2H),0.14-0.01(m,2H)。
单一构型化合物(较长保留时间)
UPLC分析：保留时间1.399分钟，纯度：88％(色谱柱：ZORBAX Ecliphase Plus C18 1.8um 2.1*50mm，流动相：A-水(5mmol NH 4OAc),B-乙腈)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6):δ8.36(d,1H),7.77(d,1H),7.31(s,1H),6.51(s,1H),5.58-5.51(m,1H),5.48(d,1H),5.42(s,1H),5.20(q,2H),4.09-4.02(m,1H),3.22-3.11(m,2H),2.39(s,3H),2.27-2.06(m,2H),2.05-1.95(m,1H),1.93-1.81(m,2H),1.65-1.43(m,2H),1.32-1.21(m,1H),0.87(t,3H),0.48-0.33(m,2H),0.14-0.01(m,2H)。
实施例13(参照例)
N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)-2-羟乙酰胺
Figure PCTCN2019107873-appb-000070
标题化合物13参照专利“EP2907824A1中说明书第147页的Example 76”公开的方法制备而得。
实施例14
N-((2R,10S)-10-苄基-2-(环丙基甲基)-1-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨基)-1,6,9,12,15-五氧代-3-氧杂-5,8,11,14-四氮杂十六-16-基)-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺14-A
N-((2S,10S)-10-苄基-2-(环丙基甲基)-1-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨基)-1,6,9,12,15-五氧代-3-氧杂-5,8,11,14-四氮杂十六-16-基)-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺14-B
Figure PCTCN2019107873-appb-000071
Figure PCTCN2019107873-appb-000072
第一步
3-环丙基-2-羟基丙酸苄酯14a
将12b(200mg，1.54mmol)溶于20mL乙腈中，依次加入碳酸钾(1.06g，7.68mmol)，溴化苄(0.16mL，1.34mmol)和四丁基碘化铵(28mg，0.07mmol)。将反应液室温搅拌48小时，通过硅藻土过滤，滤饼用乙酸乙酯(10ml)淋洗，合并滤液减压浓缩，用硅胶柱色谱法以展开剂体系C纯化所得残余物，得到标题产物14a(140mg，产率：41.3％)。
第二步
10-(环丙基甲基)-1-(9H-芴-9-基)-3,6-二氧代-2,9-二氧杂-4,7-二氮杂十一-11-酸苄酯14b
将14a(94mg,0.427mmol)和8b(130mg，0.353mmol)加入反应瓶，加入10mL四氢呋喃，氩气置换三次，冰水浴降温至0-5℃，加入叔丁醇钾(79mg，0.704mmol)，撤去冰浴，升至室温搅拌10分钟，加入20mL冰水，用乙酸乙酯(10mL×4)萃取，有机相用饱和氯化钠溶液(20mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩。用硅胶柱色谱法以展开剂体系C纯化所得残余物，得到标题产物14b(50mg，产率：26.8％)。
MS m/z(ESI):529.2[M+1]。
第三步
10-(环丙基甲基)-1-(9H-芴-9-基)-3,6-二氧代-2,9-二氧杂-4,7-二氮杂十一-11-酸14c
将14b(27mg，0.051mmol)溶于3mL乙酸乙酯，加入钯碳(7mg，含量10％，干型)，氢气置换三次，室温搅拌反应1小时。反应液用硅藻土过滤，滤饼用乙酸 乙酯淋洗，滤液浓缩，得到粗品标题产物14c(23mg)，产品不经纯化直接进行下一步反应。
MS m/z(ESI):439.1[M+1]。
第四步
(9H-芴-9-基)甲基(2-((((3-环丙基-1-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氧基)甲基)氨基)-2-氧代乙基)氨基甲酸酯14d
将1b(22mg，42.38μmol)加入反应瓶，加入3mL N,N-二甲基甲酰胺，氩气置换三次，冰水浴降温至0-5℃，滴加三乙胺(4.3mg，42.49μmol)，加入粗品14c(23mg，51.1μmol)，加入4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化吗啉盐(17.6mg，63.6μmol)，冰浴搅拌反应40分钟。加入15mL水，用乙酸乙酯(8mL×3)萃取，合并有机相。有机相用饱和氯化钠溶液(15mL)洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩。用薄层层析以展开剂体系B纯化所得残余物，得到标题产物14d(29mg，产率：79.9％)。
MS m/z(ESI):856.1[M+1]。
第五步
2-((2-氨基乙酰氨基)甲氧基)-3-环丙基-N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)丙酰胺14e
将14d(29mg，33.9μmol)溶于0.8mL二氯甲烷中，加入0.4mL二乙胺，室温搅拌1.5小时。反应液减压浓缩，加入1mL甲苯并减压浓缩，重复两次。往残余物中加入3mL正己烷打浆，静置后倾倒出上层清液，重复三次。将残余物减压浓缩，油泵拉干得到粗品标题产物14e(22mg)，产品不经纯化直接用于下一步反应。
MS m/z(ESI):634.1[M+1]。
第六步
N-((2R,10S)-10-苄基-2-(环丙基甲基)-1-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨基)-1,6,9,12,15-五氧代-3-氧杂-5,8,11,14-四氮杂十六-16-基)-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺14-A
N-((2S,10S)-10-苄基-2-(环丙基甲基)-1-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨基)-1,6,9,12,15-五氧代-3-氧杂-5,8,11,14-四氮杂十六-16-基)-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺14-B
将粗品14e(22mg，33.9μmol)溶于2.5mL N,N-二甲基甲酰胺，氩气置换三次，冰水浴降温至0-5℃，依次加入8g(24mg，50.8μmol)，和4-(4,6-二甲氧基-1,3,5- 三嗪-2-基)-4-甲基氯化吗啉盐(14mg，50.6μmol)，撤去冰浴，升至室温搅拌1小时，反应生成化合物14。反应液进行高效液相色谱法纯化(分离条件：色谱柱：XBridge Prep C18 OBD 5um 19*250mm；流动相：A-水(10mmol NH 4OAc)：B-乙腈，梯度洗脱，流速：18mL/min)，得到标题产物(2mg，2mg)。
MS m/z(ESI):1088.4[M+1]。
单一构型化合物(较短保留时间)：
UPLC分析:保留时间1.18分钟，纯度：88％(色谱柱：ACQUITY UPLC BEHC18 1.7um 2.1*50mm，流动相：A-水(5mmol NH 4OAc)，B-乙腈)。
单一构型化合物(较长保留时间)：
UPLC分析:保留时间1.23分钟，纯度：96％(色谱柱：ACQUITY UPLC BEHC18 1.7um 2.1*50mm，流动相：A-水(5mmol NH 4OAc)，B-乙腈)。
实施例15
1-((S)-9-苄基-22-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-5,8,11,14,17-五氧代-2-氧杂-4,7,10,13,16-五氮杂二十二烷基)-N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3,4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)环丙烷-1-甲酰胺15
Figure PCTCN2019107873-appb-000073
Figure PCTCN2019107873-appb-000074
第一步
1-(10-(9H-芴-9-基)-5,8-二氧代-2,9-二氧杂-4,7-二氮杂癸基)环丙烷-1-羧酸苄酯15b
将8b(500mg，1.35mmol)加入反应瓶，加入6mL四氢呋喃，将1-羟基甲基环丙烷-1-甲酸苄酯15a(233mg，1.13mmol；采用专利申请“EP2862856A1中说明书第262页的Example 22-2”公开的方法制备而得)加入瓶中，氩气置换三次，冰水浴降温至0-5℃，加入氢化钠(54mg，1.35mmol)，撤去冰浴，升至室温搅拌40分钟；降至零度加入20mL冰水，用乙酸乙酯(5mL×2)和氯仿(5mL×5)萃取，合并有机相，用饱和氯化钠溶液(20mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，用硅胶柱色谱法以展开剂体系B纯化所得残余物，得到标题产物15b(15mg，产率：2.5％)。
MS m/z(ESI):515.2[M+1]。
第二步
1-(10-(9H-芴-9-基)-5,8-二氧代-2,9-二氧杂-4,7-二氮杂癸基)环丙烷-1-羧酸15c
将15b(15mg，0.029mmol)溶于2mL乙酸乙酯中，加入钯碳(3mg，含量10％,干型)，氢气置换三次，室温搅拌反应4.5小时。反应液用硅藻土过滤，滤饼用乙酸乙酯淋洗，滤液浓缩，得到标题产物15c(11mg，产率：89％)。
MS m/z(ESI):425.2[M+1]。
第三步
(9H-芴-9-基)甲基(2-((((1-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨基羰基)环丙基)甲氧基)甲基)氨基)2-氧代乙基)氨基甲酸酯15d
将1b(10mg，0.021mmol)加入反应瓶，加入1mL N,N-二甲基甲酰胺，氩气置换三次，冰水浴降温至0-5℃，滴加一滴三乙胺，加入15c(11mg，0.026mmol)，加入4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化吗啉盐(10.7mg，0.039mmol)，加完后室温搅拌反应60分钟。加入10mL水，用乙酸乙酯(5mL×3)萃取，有机相用饱和氯化钠溶液(10mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，用薄层层析以展开剂体系B纯化所得残余物，得到标题产物15d(19mg，产率87.0％)。
MS m/z(ESI):842.2[M+1]。
第四步
1-(((2-氨基乙酰氨基)甲氧基)甲基)-N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)环丙烷-1-甲酰胺15e
将15d(19mg，22.56μmol)溶于2mL二氯甲烷中，加入1mL二乙胺，室温搅拌1.5小时。反应液在0℃下减压浓缩，加入1mL甲苯减压浓缩，重复两次；加入3mL正己烷打浆，倾倒出上层正己烷，重复三次；减压浓缩得到粗品标题产物15e(13.9mg)，产品不经纯化直接用于下一步反应。
MS m/z(ESI):620.1[M+1]。
第五步
1-((S)-9-苄基-22-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-5,8,11,14,17-五氧代-2-氧杂-4,7,10,13,16-五氮杂二十二烷基)-N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)环丙烷-1-甲酰胺15
将粗品15e(13.9mg，22.4μmol)溶于1mL N,N-二甲基甲酰胺，氩气置换三次，冰水浴降温至0-5℃，加入8g(15.8mg，33.4μmol)，加入4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化吗啉盐(9.3mg，33.6μmol)，升至室温搅拌反应60分钟。反应液进行高效液相色谱法纯化(分离条件：色谱柱：XBridge Prep C18 OBD 5um19*250mm；流动相:A-水(10mmol NH 4OAc)：B-乙腈，梯度洗脱，流速：18mL/min)，收集其相应组分，减压浓缩得到标题产物15(2.5mg，产率：10.3％)。
MS m/z(ESI):1074.2[M+1]。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6):δ8.51-8.37(m,1H),8.22(t,1H),8.14-8.02(m,2H),8.011-7.94(m,1H),7.82-7.73(m,1H),7.29(s,1H),7.26-7.10(m,3H),6.98(s,1H),6.53-6.47(m,1H),5.62-5.50(m,1H),5.45-5.36(m,1H),5.35-5.23(m,2H),5.13-5.02(m,2H),4.61-4.50(m,2H),4.42-4.28(m,2H),3.76-3.61(m,3H),3.60-3.45(m,3H),3.27-3.23(m,1H),3.20-2.81(m,7H),2.75-2.61(m,3H),241-2.28(m,3H), 2.23-2.13(m,2H),2.11-2.01(m,1H),2.03-1.94(m,1H),1.90(s,1H),1.87-1.74(m,2H),1.53-1.36(m,3H),1.29-1.08(m,4H),0.90-0.68(m,4H)。
实施例16
1-((S)-9-苄基-22-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-5,8,11,14,17-五氧代-2-氧杂-4,7,10,13,16-五氮杂二十二烷基)-N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)环丁烷-1-甲酰胺16
Figure PCTCN2019107873-appb-000075
第一步
1-(羟基甲基)环丁烷-1-羧酸16b
将1-(羟甲基)环丁烷羧酸乙酯16a(250mg，1.58mmol，供应商Alfa)溶于甲醇(2mL)和水(1mL)，加入氢氧化钠(126mg，3.15mmol)，升温至40℃，搅拌反应 3小时。冷却至常温，减压浓缩除去有机溶剂，用乙醚(10mL)反萃，收集水相。水相用6N盐酸水溶液调至pH 3-4，减压浓缩得到固体。加入3mL甲苯，减压浓缩旋干，重复三次。油泵拉干，得到粗品标题产物16b(206mg)，产品不经纯化直接用于下一步反应。
MS m/z(ESI，NEG):129.2[M-1]。
第二步
1-(羟基甲基)环丁烷-1-羧酸苄酯16c
将粗品16b(206mg，1.58mmol)溶于乙腈(15mL)，加入无水碳酸钾(1.09g，7.90mmol)和四丁基碘化铵(29mg，78.51umol)，加入溴化苄(216mg，1.26mmol)，室温搅拌过夜。过滤，滤液减压浓缩，用硅胶柱色谱法以展开剂体系C纯化所得残余物，得到标题产物16c(112mg，产率：32.1％)。
MS m/z(ESI):221.1[M+1]。
第三步
1-(10-(9H-芴-9-基)-5,8-二氧代-2,9-二氧杂-4,7-二氮杂癸基)环丁烷-1-羧酸苄酯16d
将16c(77mg，0.35mmol)和8b(100mg，0.27mmol)加入反应瓶，加入3mL四氢呋喃，氩气置换三次，冰水浴降温至0-5℃，加入叔丁醇钾(61mg，0.54mmol)，冰浴搅拌10分钟。加入20mL冰水，用乙酸乙酯(5mL)和氯仿(5mL×5)萃取，合并有机相并浓缩。所得残余物溶于3mL 1,4-二氧六环中，加入0.5mL水，加入碳酸氢钠(27mg，0.32mmol)和氯甲酸-9-芴甲酯(71mg，0.27mmol)，室温搅拌1小时。加入20mL水，用乙酸乙酯(10mL×3)萃取，有机相用饱和氯化钠溶液(20mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，用硅胶柱色谱法以展开剂体系C纯化所得残余物，得到标题产物16d(24mg，产率：16.7％)。
MS m/z(ESI):551.3[M+23]。
第四步
1-(10-(9H-芴-9-基)-5,8-二氧代-2,9-二氧杂-4,7-二氮杂癸基)环丁烷-1-羧酸16e
将16d(12mg，22.7μmol)溶于1.5mL四氢呋喃和乙酸乙酯(V:V＝2:1)混合溶剂中，加入钯碳(5mg，含量10％)，氢气置换三次，室温搅拌反应2小时。反应液用硅藻土过滤，滤饼用乙酸乙酯淋洗，滤液减压浓缩，得到粗品标题产物16e(10mg)，产品不经纯化直接用于下一步反应。
第五步
(9H-芴-9-基)甲基(2-((((1-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨基羰基)环丁基)甲氧基)甲基)氨基)-2-氧代乙基)氨基甲酸酯16f
将1b(7.5mg，0.014mmol)加入反应瓶，加入1mL N,N-二甲基甲酰胺，氩气置换三次，冰水浴降温至0-5℃，滴加一滴三乙胺，加入粗品16e(10mg)的0.5mL N,N-二甲基甲酰胺溶液，加入4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化吗啉盐 (6mg，0.026mmol)，冰浴搅拌反应30分钟。加入10mL水，用乙酸乙酯(10mL×3)萃取，有机相用饱和氯化钠溶液(10mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，用薄层色谱法以展开剂体系B纯化所得残余物，得到标题产物16f(10.6mg，产率87.8％)。
MS m/z(ESI):856.2[M+1]。
第六步
1-(((2-氨基乙酰氨基)甲氧基)甲基)-N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)环丁烷-1-甲酰胺16g
将16f(10.6mg，12.4μmol)溶于0.6mL二氯甲烷中，加入0.3mL二乙胺，室温搅拌2小时。反应液减压浓缩，加入2mL甲苯减压浓缩，重复两次；加入3mL正己烷打浆，倾倒出上层正己烷，重复三次。减压浓缩得到粗品标题产物16g(8mg)，产品不经纯化直接用于下一步反应。
MS m/z(ESI):634.1[M+1]。
第七步
1-((S)-9-苄基-22-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-5,8,11,14,17-五氧代-2-氧杂-4,7,10,13,16-五氮杂二十二烷基)-N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)环丁烷-1-甲酰胺16
将粗品16g(8mg)溶于1mL N,N-二甲基甲酰胺，加入8g(8.8mg，18.6μmol)，加入4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化吗啉盐(5.2mg，18.8μmol)，室温搅拌反应30分钟。反应液进行高效液相色谱法纯化(分离条件：色谱柱：XBridge Prep C18 OBD 5um 19*250mm；流动相:A-水(10mmol NH 4OAc)：B-乙腈，梯度洗脱，流速：18mL/min)，得到标题产物16(1.0mg，产率：7.2％)。
MS m/z(ESI):1088.0[M+1]。
实施例17
(1r,4r)-N-((S)-7-苄基-1-(1-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨基羰基)环丙氧基)-3,6,9,12,15-五氧代-17,20,23,26,29,32,35,38,41-九氧杂-2,5,8,11,14-五氮杂四十三-43-基)-4-((2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)甲基)环己烷-1-甲酰胺17
Figure PCTCN2019107873-appb-000076
Figure PCTCN2019107873-appb-000077
第一步
1-苯基-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29-十氧杂三十一-31-酸叔丁酯17b
将1-苯基-2,5,8,11,14,17,20,23,26-九氧杂二十八-28-醇17a(0.34g，0.67mmol，供应商毕得)溶于10mL二氯甲烷中，依次加入氧化银(0.24g，1.01mmol)、溴乙酸叔丁酯(0.16g，0.81mmol)和碘化钾(0.07g，0.40mmol)，室温搅拌反应3小时。过滤，滤液减压浓缩，用硅胶柱色谱法以展开剂体系B纯化所得残余物，得到标题产物17b(0.42g，产率：100％)。
MS m/z(ESI):636.3[M+18]。
第二步
29-羟基-3,6,9,12,15,18,21,24,27-九氧杂二十九-1-酸叔丁酯17c
将17b(417mg，0.67mmol)溶于15mL四氢呋喃，加入钯碳(110mg，含量10％，干型)，氢气置换三次，升至60℃搅拌反应3小时。反应液用硅藻土过滤，滤饼用四氢呋喃淋洗，滤液浓缩，得到粗品标题产物17c(357mg)，产品不经纯化直接进行下一步反应。
MS m/z(ESI):546.2[M+18]。
第三步
29-叠氮基-3,6,9,12,15,18,21,24,27-九氧杂二十九-1-酸叔丁酯17d
将17c(357mg,0.675mmol)溶于10mL甲苯，加入叠氮磷酸二苯酯(279mg，1.014mmol)和1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯(206mg，1.353mmol)，氩气置换三次，室温搅拌反应2小时，然后升至105℃反应19小时。反应液冷却至室温，浓缩，加入20mL水，用乙酸乙酯(10mL×4)萃取，有机相用饱和氯化钠溶液(20mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩。用硅胶柱色谱法以展开剂体系B纯化所得残余物，得到粗品标题产物17d(412mg)。
MS m/z(ESI):571.3[M+18]。
第四步
29-氨基-3,6,9,12,15,18,21,24,27-九氧杂二十九-1-酸叔丁酯17e
将17d(230mg，0.415mmol)溶于8mL四氢呋喃，加入钯碳(58mg，含量10％，干型)，氢气置换三次，室温搅拌反应2小时。反应液用硅藻土过滤，滤饼用四氢呋喃淋洗，滤液浓缩，得到粗品标题产物17e(220mg)，产品不经纯化直接进行下一步反应。
MS m/z(ESI):528.2[M+1]。
第五步
1-((1r,4r)-4-((2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)甲基)环己基)-1-氧代-5,8,11,14,17,20,23,26,29-九氧杂-2-氮杂三十一-31-酸叔丁酯17f
将(1r,4r)-4-((2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)甲基)环己烷-1-羧酸(98.5mg，0.415mmol)溶于10mL二氯甲烷，加入2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(190mg，0.500mmol)和N,N-二异丙基乙胺(162mg，1.253mmol)，氩气置换三次，加入粗品17e(220mg，0.417mmol)，室温搅拌反应1小时。加入15mL水，用二氯甲烷(8mL×3)萃取，合并有机相。有机相用饱和氯化钠溶液(15mL)洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩。用硅胶柱色谱法以展开剂体系B纯化所得残余物，得到标题产物17f(122mg，产率：39.2％)。
MS m/z(ESI):747.2[M+1]。
第六步
1-((1r,4r)-4-((2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)甲基)环己基)-1-氧代-5,8,11,14,17,20,23,26,29-九氧杂-2-氮杂三十一-31-酸17g
将17f(122mg，0.163mmol)溶于0.8mL二氯甲烷中，加入0.4mL三氟乙酸，室温搅拌反应1小时。加入15mL二氯甲烷稀释，减压浓缩；加入10mL正己烷，减压浓缩，重复两次；再加入10mL甲苯减压浓缩；用10mL正己烷：乙醚＝5:1的混合溶剂打浆三次，至pH接近7，浓缩，油泵抽干，得到标题产物17g(98mg，产率：86.8％)。
MS m/z(ESI):691.2[M+1]。
第七步
2,4-二甲氧基苄基1-((2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰氨基)甲氧基)环丙基-1-羧酸酯17h
将8d(164mg，0.40mmol)溶于二氯甲烷(5mL)，依次加入2,4-二甲氧基苄醇(81mg，0.48mmol)，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(115mg，0.60mmol)和4-二甲氨基吡啶(5mg，0.041mmol)，加毕，室温搅拌反应1小时。加入20mL水，震荡后分层，水相用二氯甲烷(8mL×3)萃取，合并有机相。有机相用饱和氯化钠溶液(20mL)洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩。用硅胶柱色谱法以展开剂体系C纯化所得残余物，得到标题产物17h(124mg，产率：55.4％)。
MS m/z(ESI):583.1[M+23]。
第八步
2,4-二甲氧基苄基(S)-1-((11-苄基-1-(9H-芴-9-基)-3,6,9,12,15-五氧代-2-氧杂-4,7,10,13,16-五氮杂十七-17-基)氧基)环丙基-1-羧酸酯17j
将17h(39mg，69.6umol)溶于0.6mL二氯甲烷中，加入0.3mL二乙胺，室温搅拌1小时。反应液减压浓缩，加入2mL甲苯减压浓缩，重复两次；加入3mL正己烷打浆，倾倒出上层正己烷，重复三次，减压浓缩。将所得到的粗品溶于2mL N,N-二甲基甲酰胺，加入(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)甘氨酰-L-苯丙氨酸17i(35mg，69.8μmol，采用专利申请“CN108853514A中说明书第13页的实施例7-12”公开的方法制备而得)，加入4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化吗啉盐(23mg，83.1μmol)，室温搅拌1小时。加入10mL水，用乙酸乙酯(10mL×3)萃取，合并有机相。有机相用饱和氯化钠溶液(10mL×2)洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩。用薄层层析以展开剂体系B纯化所得残余物，得到标题产物17j(48mg，产率：83.9％)。
MS m/z(ESI):822.0[M+1]。
第九步
(S)-1-((11-苄基-1-(9H-芴-9-基)-3,6,9,12,15-五氧代-2-氧杂-4,7,10,13,16-五氮杂十七-17-基)氧基)环丙烷-1-羧酸17k
将17j(48mg，58.4μmol)溶于1.4mL 3％(v/v)的二氯乙酸的二氯甲烷溶液，冰水浴降温至0-5℃，加入三乙基硅烷(21mg，180.6μmol)，冰浴搅拌反应3小时。冰浴下减压浓缩除去一半有机溶剂，加入5mL乙醚，自然升至室温打浆，析出白色固体，过滤，收集滤饼，油泵抽干，得到标题产物17k(33mg，产率：84.1％)。
第十步
(9H-芴-9-基)甲基((S)-7-苄基-1-(1-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨基羰基)环丙氧基)-3,6,9,12-四氧代-2,5,8,11-四氮杂十三-13-基)氨基甲酸酯17l
将1b(20mg，42.4μmol)加入反应瓶，加入1mL 10％(v/v)的甲醇的二氯甲烷 溶液，氩气置换三次，冰水浴冷却至0～5℃，滴加一滴三乙胺，搅拌至1b溶解。将17k(33mg，49.1μmol)溶于1mL 10％(v/v)的甲醇的二氯甲烷溶液，然后滴加入上述反应液中，再加入4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化吗啉盐(17.6mg，63.6μmol)。升至室温，搅拌反应1小时。加入10mL二氯甲烷和5mL水，搅拌5分钟，静置分层，收集有机相；水相用二氯甲烷(10mL×3)萃取，合并有机相。有机相用饱和氯化钠溶液(10mL×2)洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩。用薄层层析以展开剂体系B纯化所得残余物，得到标题产物17l(37mg，产率：80.2％)。
MS m/z(ESI):1090.1[M+1]。
第十一步
(1r,4r)-N-((S)-7-苄基-1-(1-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨基羰基)环丙氧基)-3,6,9,12,15-五氧代-17,20,23,26,29,32,35,38,41-九氧杂-2,5,8,11,14-五氮杂四十三-43-基)-4-((2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)甲基)环己烷-1-甲酰胺17
将17l(15.5mg，14.23μmol)溶于0.6mL二氯甲烷中，加入0.3mL二乙胺，室温搅拌1.5小时。反应液减压浓缩，加入2mL甲苯减压浓缩，重复两次；加入3mL正己烷打浆，倾倒出上层正己烷，重复三次。减压浓缩，然后用油泵抽干。将所得粗品溶于1mL N,N-二甲基甲酰胺，加入17g(11mg，15.92μmol)，加入4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化吗啉盐(6.0mg，21.68μmol)，氩气置换三次，室温搅拌反应30分钟。反应液进行高效液相色谱法纯化(分离条件：色谱柱：XBridge Prep C18 OBD 5um 19*250mm；流动相:A-水(10mmol NH 4OAc)：B-乙腈，梯度洗脱，流速：18mL/min)，收集其相应组分，减压浓缩得到标题产物17(6mg，产率：27.4％)。
MS m/z(ESI):1556.4[M+18]。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6):δ8.98(d,1H),8.76(s,1H),8.20(br,1H),8.12-7.95(m,3H),7.93-7.76(m,2H),7.75-7.66(m,2H),7.24(s,1H),7.20-7.05(m,6H),6.97(s,1H),6.64(br,1H),6.55(d,1H),6.47(s,1H),5.61-5.52(m,2H),5.37(s,1H),5.33-5.23(m,2H),5.18(s,1H),5.13(s,1H),5.05(s,1H),5.00(s,1H),4.65-4.55(m,2H),4.53-4.45(m,1H),4.38-4.28(m,2H),3.84(s,2H),3.67(d,3H),3.60-3.40(m,33H),3.18(d,1H),3.15-3.08(m,3H),2.28(s,3H),2.00-1.92(m,3H),1.85(s,2H),1.82-1.73(m,2H),1.68-1.52(m,4H),1.29-1.15(m,3H),0.86-0.76(m,5H)。
实施例18
(1r,4r)-N-((2R,10S)-10-苄基-2-环丙基-1-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨基)-1,6,9,12,15,18-六氧代-3,20,23,26,29,32,35,38,41,44-十氧杂-5,8,11,14,17-五 氮杂四十六-46-基)-4-((2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)甲基)环己烷-1-甲酰胺18
Figure PCTCN2019107873-appb-000078
第一步
(R)-2-环丙基-2-羟基乙酸苄酯18a
(S)-2-环丙基-2-羟基乙酸苄酯18b
将2a(7.4g，63.7mmol)溶于200mL乙腈中，依次加入碳酸钾(35g，253.6mmol)，溴化苄(9.3g，54.4mmol)和四丁基碘化铵(500mg，1.36mmol)。将反应液室温搅拌16小时，通过硅藻土过滤，滤饼用乙酸乙酯(10ml)淋洗，合并滤液减压浓缩，用硅胶柱色谱法以展开剂体系C纯化所得残余物4.1g，进一步手性拆分纯化，得到标题产物18a(1.1g)和18b(1.2g)。
第二步
(R)-10-环丙基-1-(9H-芴-9-基)-3,6-二氧代-2,9-二氧杂-4,7-二氮杂十一-11-酸苄酯18c
将8b(3.1g，8.41mmol)溶于四氢呋喃(55mL)中，加入18a(2.0g，9.70mmol)，冰水浴冷却至0～5℃，加入叔丁醇钾(1.89g，16.84mmol)，冰水浴下搅拌10分钟。加入乙酸乙酯(30mL)和水(20mL)，静置分层，水相用氯仿(30mL×5)萃取，合并有机相。有机相减压浓缩，所得残余物溶于1,4-二氧六环(32mL)和水(8mL)，加入碳酸钠(1.78g，16.79mmol)和氯甲酸-9-芴基甲酯(2.18g，8.42mmol)，室温搅拌2小时。反应液中加入水(30mL)，用乙酸乙酯(50mL×3)萃取，合并有机相。有机相用饱和氯化钠溶液(30mL×2)洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩。用柱层析以展开剂体系C纯化所得残余物，得到标题产物18c(1.3g，产率：30.0％)。
MS m/z(ESI):515.2[M+1]。
第三步
(R)-10-环丙基-1-(9H-芴-9-基)-3,6-二氧代-2,9-二氧杂-4,7-二氮杂十一-11-酸18d
将18c(1.29g，2.51mmol)溶于乙酸乙酯(15mL)中，加入钯碳(260mg，含量10％，干型)，氢气置换三次，室温搅拌反应5小时。反应液用硅藻土过滤，滤饼用乙酸乙酯(20mL)和甲醇(20mL)淋洗，滤液浓缩，得到粗品标题产物18d(980mg)，产品不经纯化直接进行下一步反应。
MS m/z(ESI):425.1[M+1]。
第四步
2,4-二甲氧基苄基(R)-10-环丙基-1-(9H-芴-9-基)-3,6-二氧代-2,9-二氧杂-4,7-二氮杂十一-11-酯18e
将粗品18d(980mg，2.31mmol)溶于二氯甲烷(15mL)中，加入2,4-二甲氧基苄醇(777mg，4.62mmol)，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(664mg，3.46mmol)和4-二甲氨基吡啶(28mg，0.23mmol)，室温搅拌一小时。减压浓缩除去有机溶剂，加入20mL水，用乙酸乙酯(50mL×3)萃取，合并有机相。有机相用饱和氯化钠溶液(30mL×2)洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩。用柱层析以展开剂体系C纯化所得残余物，得到标题产物18e(810mg，产率：61.1％)。
MS m/z(ESI):575.0[M+1]。
第五步
2,4-二甲氧基苄基(R)-2-((2-氨基乙酰氨基)甲氧基)-2-环丙基乙酸酯18f
将18e(33mg，57.4μmol)溶于0.6mL二氯甲烷中，加入0.3mL二乙胺，室温搅拌1小时。反应液减压浓缩，加入2mL甲苯减压浓缩，重复两次；加入3mL正己烷打浆，倾倒出上层正己烷，重复三次，减压浓缩得到粗品标题产物18f(21 mg)，产品不经纯化直接用于下一步反应。
第六步
2,4-二甲氧基苄基(11S,19R)-11-苄基-19-环丙基-1-(9H-芴-9-基)-3,6,9,12,15-五氧代-2,18-二氧杂-4,7,10,13,16-五氮杂二十-20-酸酯18g
将粗品18f(21mg，57.4μmol)溶于3mL N,N-二甲基甲酰胺，加入17i(29mg，57.8μmol)，加入4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化吗啉盐(19mg，68.7μmol)，室温搅拌1小时。加入10mL水，用乙酸乙酯(10mL×3)萃取，合并有机相。有机相用饱和氯化钠溶液(10mL×2)洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩。用薄层层析以展开剂体系B纯化所得残余物，得到标题产物18g(37mg，产率：77.1％)。
MS m/z(ESI):853.0[M+18]。
第七步
(11S,19R)-11-苄基-19-环丙基-1-(9H-芴-9-基)-3,6,9,12,15-五氧代-2,18-二氧杂-4,7,10,13,16-五氮杂二十-20-酸18h
将18g(37mg，44.3μmol)溶于1.4mL 3％(v/v)的二氯乙酸的二氯甲烷溶液，冰水浴降温至0-5℃，加入三乙基硅烷(15.4mg，132.4μmol)，冰浴搅拌反应3小时。冰浴下减压浓缩除去一半有机溶剂，加入5mL乙醚，自然升至室温打浆，析出白色固体，过滤，收集滤饼，油泵抽干，得到标题产物18h(24mg，产率：79.1％)。
MS m/z(ESI):708.2[M+23]。
第八步
(9H-芴-9-基)甲基((2R,10S)-10-苄基-2-环丙基-1-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨基)-1,6,9,12,15-五氧代-3-氧杂-5,8,11,14-四氮杂十六-16-基)氨基甲酸酯18i
将1b(30mg，63.6μmol)加入反应瓶，加入1mL 10％(v/v)的甲醇的二氯甲烷溶液，氩气置换三次，冰水浴降温至0-5℃，滴加一滴三乙胺，搅拌至1b溶解。将18h(65mg，94.8μmol)溶于1mL 10％(v/v)的甲醇的二氯甲烷溶液，然后滴加入上述反应液中，再加入4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化吗啉盐(27mg，97.6μmol)。升至室温，搅拌反应1小时。加入10mL二氯甲烷和5mL水，搅拌5分钟，静置分层，收集有机相；水相用二氯甲烷(10mL×3)萃取，合并有机相。有机相用饱和氯化钠溶液(10mL×2)洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩。用薄层层析以展开剂体系B纯化所得残余物，得到标题产物18i(25mg，产率：35.6％)。
MS m/z(ESI):1104.4[M+1]。
第九步
(S)-2-(2-(2-氨基乙酰氨基)乙酰氨基)-N-(2-((((R)-1-环丙基-2-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟 -9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨基)-2-氧代乙氧基)甲基)氨基)-2-氧代乙氧基)-3-苯基丙
酰胺18j
将18i(12mg，10.9μmol)溶于0.6mL二氯甲烷中，加入0.3mL二乙胺，室温搅拌1.5小时。反应液减压浓缩，加入2mL甲苯减压浓缩，重复两次，加入3mL正己烷打浆，倾倒出上层正己烷，重复三次，减压浓缩得到粗品标题产物18j(10mg)，产品不经纯化直接用于下一步反应。
MS m/z(ESI):881.0[M+1]。
第十步
(1r,4r)-N-((2R,10S)-10-苄基-2-环丙基-1-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨基)-1,6,9,12,15,18-六氧代-3,20,23,26,29,32,35,38,41,44-十氧杂-5,8,11,14,17-五氮杂四十六-46-基)-4-((2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)甲基)环己烷-1-甲酰胺18
将粗品18j(10mg)溶于1mL N,N-二甲基甲酰胺，加入17g(8.5mg，12.3μmol)，加入4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化吗啉盐(4.6mg，16.6μmol)，室温搅拌30分钟。反应液过滤，进行高效液相色谱法纯化(分离条件：色谱柱：XBridge Prep C18 OBD 5um 19*250mm；流动相:A-水(10mmol NH 4OAc)：B-乙腈，梯度洗脱，流速：18mL/min)，收集其相应组分，减压浓缩，得到标题产物18(9.5mg，产率：56.2％)。
MS m/z(ESI):1570.2[M+18]。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6):δ8.77(d,1H),8.59-8.55(m,1H),8.42(d,1H),8.37-8.28(m,1H),8.25-8.06(m,2H),7.96-7.86(m,1H),7.86-7.70(m,2H),7.32-7.28(m,1H),7.25-7.14(m,3H),6.67(m,1H),5.96(s,1H),5.80-5.72(m,1H),5.62-5.52(m,2H),5.43-5.30(m,3H),5.28-5.17(m,2H),5.12-5.08(m,1H),4.72-4.35(m,8H),3.95-3.70(m,13H),3.35-3.22(m,14H),2.42-2.32(m,3H),2.05-1.98(m,4H),1.88-1.82(m,12H),1.47-1.39(m,3H),1.32-1.18(m,11H),0.90-0.80(m,4H),0.52-0.37(m,3H),0.32-0.18(m,2H)。
实施例19
(1r,4r)-N-((2S,10S)-10-苄基-2-环丙基-1-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨基)-1,6,9,12,15,18-六氧代-3,20,23,26,29,32,35,38,41,44-十氧杂-5,8,11,14,17-五氮杂四十六-46-基)-4-((2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)甲基)环己烷-1-甲酰胺19
Figure PCTCN2019107873-appb-000079
第一步
(S)-10-环丙基-1-(9H-芴-9-基)-3,6-二氧代-2,9-二氧杂-4,7-二氮杂十一-11-酸苄酯19a
将18b(252mg,1.22mmol)加入反应瓶，加入4mL二氯甲烷，氩气置换三次，冰水浴降温至0-5℃，加入叔丁醇锂(98mg,1.22mmol)，冰水浴下搅拌反应15分钟，变澄清，加入8b(300mg,814.3μmol)，冰水浴下搅拌2.5小时。加水(10mL)，分液，水相用二氯甲烷(8mL×2)萃取，合并有机相后用水(10mL×1)洗，饱和食盐水(10mL×2)洗，无水硫酸钠干燥，过滤浓缩得粗品。用硅胶柱色谱法以展开剂体系C纯化所得残余物，得到标题产物19a(282mg，产率：67.2％)。
第二步
(S)-10-环丙基-1-(9H-芴-9-基)-3,6-二氧代-2,9-二氧杂-4,7-二氮杂十一-11-酸19b
将19a(280mg，0.554mmol)溶于8mL乙酸乙酯中，加入钯碳(84mg，含量10％，干型)，氢气置换三次，室温搅拌反应3小时。反应液用硅藻土过滤，滤饼用乙酸乙酯淋洗，滤液浓缩，得到粗品标题产物19b(230mg)，产品不经纯化直接进行下一步反应。
第三步
2,4-二甲氧基苄基(S)-10-环丙基-1-(9H-芴-9-基)-3,6-二氧代-2,9-二氧杂-4,7-二氮杂十一-11-酸酯19c
将粗品19b(230mg，541.8μmol)溶于7mL二氯甲烷中，依次加入2,4-二甲氧基苯甲醇(136.7mg,812.7μmol)，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(155mg,808.5umol)和4-二甲氨基吡啶(6.6mg,53.5umol)，室温搅拌16小时。反应液用10mL二氯甲烷稀释后，用水(10mL×1)洗，饱和食盐水(10mL×2)洗，无水硫酸钠干燥，过滤浓缩得粗品。用薄层层析以展开剂体系B纯化所得残余物，得到标题产物19c(159mg，产率：51.0％)
第四步
2,4-二甲氧基苄基(S)-2-((2-氨基乙酰氨基)甲氧基)-2-环丙基乙酸酯19d
将19c(60mg，104.4μmol)溶于1mL二氯甲烷中，加入0.5mL二乙胺，室温搅拌1小时。反应液减压浓缩，加入2mL甲苯减压浓缩，重复两次；加入3mL正己烷打浆，倾倒出上层正己烷，重复三次，减压浓缩得到粗品标题产物19d(21mg)，产品不经纯化直接用于下一步反应。
第五步
2,4-二甲氧基苄基(11S,19S)-11-苄基-19-环丙基-1-(9H-芴-9-基)-3,6,9,12,15-五氧代-2,18-二氧杂-4,7,10,13,16-五氮杂二十-20-酸酯19e
将粗品19d(36mg，102.2μmol)溶于4mL N,N-二甲基甲酰胺，加入17i(52mg，103.6μmol)，加入4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化吗啉盐(34.6mg，125.0μmol)，室温搅拌1小时。加入10mL水，用乙酸乙酯(10mL×3)萃取，合并有机相。有机相用饱和氯化钠溶液(10mL×2)洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩。用薄层层析以展开剂体系B纯化所得残余物，得到标题产物19e(70mg，产率：80.2％)。
第六步
(11S,19S)-11-苄基-19-环丙基-1-(9H-芴-9-基)-3,6,9,12,15-五氧代-2,18-二氧杂-4,7,10,13,16-五氮杂二十-20-酸19f
将19e(70mg，83.7μmol)溶于2.5mL 3％(v/v)的二氯乙酸的二氯甲烷溶液，冰水浴降温至0-5℃，加入三乙基硅烷(29mg，249.4μmol)，冰浴搅拌反应3小时。冰浴下减压浓缩除去一半有机溶剂，加入5mL乙醚，自然升至室温打浆，析出白色固体，过滤，收集滤饼，油泵抽干，得到标题产物19f(57mg，产率：99.2％)。
第七步
(9H-芴-9-基)甲基((2S,10S)-10-苄基-2-环丙基-1-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨基-1,6,9,12,15-五氧代-3-氧杂-5,8,11,14-四氮杂十六-16-基)氨基甲酸酯19g
将1b(30mg，63.6μmol)加入反应瓶，加入1mL 10％(v/v)的甲醇的二氯甲烷溶液，氩气置换三次，冰水浴降温至0-5℃，滴加一滴三乙胺，搅拌至1b溶解。将19f(57mg，83.1μmol)溶于1mL 10％(v/v)的甲醇的二氯甲烷溶液，然后滴加入上述反应液中，再加入4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化吗啉盐(26mg，93.9μmol)。升至室温，搅拌反应1小时。加入10mL二氯甲烷和5mL水，搅拌5分钟，静置分层，收集有机相；水相用二氯甲烷(10mL×3)萃取，合并有机相。有机相用饱和氯化钠溶液(10mL×2)洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩。用薄层层析以展开剂体系B纯化所得残余物，得到标题产物19g(56mg，产率：79.8％)。
MS m/z(ESI):1103.1[M+1]。
第八步
(S)-2-(2-(2-氨基乙酰氨基)乙酰氨基)-N-(2-((((S)-1-环丙基-2-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨基)-2-氧代乙氧基)甲基)氨基)-2-氧代乙基)-3-苯基丙酰胺19h
将19g(4.6mg，4.16μmol)溶于1.5mL二氯甲烷中，加入0.75mL二乙胺，室温搅拌1.6小时。反应液减压浓缩，加入2mL甲苯减压浓缩，重复两次，加入3mL正己烷打浆，倾倒出上层正己烷，重复三次，减压浓缩得到粗品标题产物19h(4.0mg)，产品不经纯化直接用于下一步反应。
第九步
(1r,4r)-N-((2S,10S)-10-苄基-2-环丙基-1-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)氨基)-1,6,9,12,15,18-六氧代-3,20,23,26,29,32,35,38,41,44-十氧杂-5,8,11,14,17-五氮杂四十六-46-基)-4-((2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)甲基)环己烷-1-甲酰胺19
将粗品19h(4.0mg)溶于1mL N,N-二甲基甲酰胺，加入17g(2.9mg，4.2μmol)，加入4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化吗啉盐(1.5mg，5.4μmol)，室温搅拌40分钟。反应液过滤，进行高效液相色谱法纯化(分离条件：色谱柱：XBridge Prep C18 OBD 5um 19*250mm；流动相:A-水(10mmol NH 4OAc)：B-乙腈，梯度洗脱，流速：18mL/min)，收集其相应组分，减压浓缩，得到标题产物19(2.1mg，产率：32.4％)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6):δ8.71-8.62(m,1H),8.59-8.51(m,1H),8.34-8.26(m,1H),8.14-8.02(m,2H),7.95-7.86(m,1H),7.83-7.69(m,2H),7.35-7.31(m,1H),7.29-7.11(m,3H),7.01(s,1H),6.72-6.50(m,3H),5.59-5.50(m,2H),5.42(s,2H),5.38-5.18(m,3H),4.79-4.69(m,2H),4.61-4.42(m,3H),3.91(s,2H),3.79-3.65(m,4H),3.63-3.44(m,13H),3.41-3.30(m,2H),3.26-3.09(m,5H),3.08-2.84(m,4H),2.81-2.64(m,3H),2.42-2.28(m,3H),2.24-2.12(m,2H),2.05-1.93(m,4H),1.89-1.77(m,2H),1.72-1.56(m,3H),1.53-1.38(m,3H),1.34-1.10(m,11H),0.94-0.78(m,5H),0.52-0.35(m,3H)。
实施例20(参照例)
Figure PCTCN2019107873-appb-000080
标题化合物20参照专利“CN104755494A中说明书第163页的实施例58”提供的方法合成。
以下抗体按抗体常规方法进行制备，例如可进行载体构建后，转染真核细胞如HEK293细胞(Life Technologies Cat.No.11625019)，纯化表达。
以下为Trastuzumab的序列：
轻链
Figure PCTCN2019107873-appb-000081
重链
Figure PCTCN2019107873-appb-000082
Figure PCTCN2019107873-appb-000083
以下为Pertuzumab的序列：
轻链
Figure PCTCN2019107873-appb-000084
重链
Figure PCTCN2019107873-appb-000085
以下为B7H3抗体1F9DS的序列：
轻链
Figure PCTCN2019107873-appb-000086
重链
Figure PCTCN2019107873-appb-000087
Figure PCTCN2019107873-appb-000088
实施例21 ADC-1
Figure PCTCN2019107873-appb-000089
在37℃条件下，向抗体Trastuzumab的PBS缓冲水溶液(pH＝6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液；2.5ml，9.96mg/ml，0.168μmol)加入配置好的三(2-羧乙基)膦的水溶液(10mM，0.082mL，0.82μmol)，置于水浴振荡器，于37℃振荡反应3小时，停止反应；将反应液用水浴降温至25℃，稀释至5.0mg/ml，并取出2.0ml溶液往下反应。
将化合物10-较短保留时间化合物(2.1mg，2.02μmol)溶解于0.10mL DMSO中，加入到上述2.0ml溶液中，置于水浴振荡器，于25℃振荡反应3小时，停止反应。将反应液用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH为6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液，含0.001M的EDTA)，得到FADC-1通式的示例性产物ADC-1的PBS缓冲液(5.0mg/mL，1.1mL)，于4℃冷冻储存。
UV-HPLC计算平均值：n＝5.09。
实施例22 ADC-2
Figure PCTCN2019107873-appb-000090
在37℃条件下，向抗体Trastuzumab的PBS缓冲水溶液(pH＝6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液；2.5ml，9.96mg/ml，0.168μmol)加入配置好的三(2-羧乙基)膦的水溶液(10mM，0.082mL，0.82μmol)，置于水浴振荡器，于37℃下振荡反应3小时，停止反应；将反应液用水浴降温至25℃，稀释至5.0mg/ml，并取出2.0ml溶液往下反应。
将化合物10-较长保留时间化合物(2.1mg，2.02μmol)溶解于0.10mL DMSO中，加入到上述2.0ml溶液中，置于水浴振荡器，于25℃振荡反应3小时，停止 反应。将反应液用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH为6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液，含0.001M的EDTA)，得到FADC-1通式的示例性产物ADC-2的PBS缓冲液(4.95mg/mL，1.1mL)，于4℃冷冻储存。
UV-HPLC计算平均值：n＝7.39。
实施例23 ADC-3
Figure PCTCN2019107873-appb-000091
在37℃条件下，向抗体Trastuzumab的PBS缓冲水溶液(pH＝6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液；2.5ml，9.96mg/ml，0.168μmol)加入配置好的三(2-羧乙基)膦的水溶液(10mM，0.082mL，0.82μmol)，置于水浴振荡器，于37℃振荡反应3小时，停止反应；将反应液用水浴降温至25℃，稀释至5.0mg/ml，并取出2.0ml溶液往下反应。
将化合物8(2.1mg，2.02μmol)溶解于0.10mL DMSO中，加入到上述2.0ml溶液中，置于水浴振荡器，于25℃振荡反应3小时，停止反应。将反应液用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH为6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液，含0.001M的EDTA)，得到FADC-3通式的示例性产物ADC-3的PBS缓冲液(5.24mg/mL，1.1mL)，于4℃冷冻储存。
UV-HPLC计算平均值：n＝7.36。
实施例24 ADC-4
Figure PCTCN2019107873-appb-000092
在37℃条件下，向抗体Trastuzumab的PBS缓冲水溶液(pH＝6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液；3.74ml，13.38mg/ml，0.338μmol)加入配置好的三(2-羧乙基)膦的水溶液(10mM，0.173mL，1.73μmol)，置于水浴振荡器，于37℃振荡反应3小时，停止反应；将反应液用水浴降温至25℃，稀释至6.7mg/ml，并取 出1.3ml溶液往下反应。
将化合物9-较短保留时间化合物9-A(1.0mg，0.93μmol)溶解于0.10mL DMSO中，加入到上述1.3ml溶液中，置于水浴振荡器，于25℃振荡反应3小时，停止反应。将反应液用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH为6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液，含0.001M的EDTA)，得到FADC-4A通式的示例性产物ADC-4的PBS缓冲液(1.72mg/mL，2.36mL)，于4℃冷冻储存。
UV-HPLC计算平均值：n＝7.39。
实施例25 ADC-5
Figure PCTCN2019107873-appb-000093
在37℃条件下，向抗体Trastuzumab的PBS缓冲水溶液(pH＝6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液；3.0ml，6.70mg/ml，0.136μmol)加入配置好的三(2-羧乙基)膦的水溶液(10mM，0.067mL，0.67μmol)，置于水浴振荡器，于37℃下振荡反应3小时，停止反应；将反应液用水浴降温至25℃，并取出0.614ml溶液往下反应。
将化合物9-较短保留时间化合物9-A(0.5mg，0.42μmol)溶解于0.031mL DMSO中，加入到上述0.614ml溶液中，置于水浴振荡器，于25℃下振荡反应3小时，停止反应。将反应液用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH为6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液，含0.001M的EDTA)，得到FADC-4A通式的示例性产物ADC-5的PBS缓冲液(3.08mg/mL，0.82mL)，于4℃冷冻储存。
UV-HPLC计算平均值：n＝3.16。
实施例26 ADC-6
Figure PCTCN2019107873-appb-000094
在37℃条件下，向抗体Trastuzumab的PBS缓冲水溶液(pH＝6.5的0.05M 的PBS缓冲水溶液；3.74ml，13.38mg/ml，0.338μmol)加入配置好的三(2-羧乙基)膦的水溶液(10mM，0.173mL，1.73μmol)，置于水浴振荡器，于37℃振荡反应3小时，停止反应；将反应液用水浴降温至25℃，稀释至6.7mg/ml，并取出0.75ml溶液往下反应。
将化合物9-较长保留时间化合物9-B(0.68mg，0.63μmol)溶解于0.10mL DMSO中，加入到上述0.75ml溶液中，置于水浴振荡器，于25℃振荡反应3小时，停止反应。将反应液用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH为6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液，含0.001M的EDTA)，得到FADC-4B通式的示例性产物ADC-6的PBS缓冲液(1.78mg/mL，1.78mL)，于4℃冷冻储存。
UV-HPLC计算平均值：n＝3.94。
实施例27 ADC-7
Figure PCTCN2019107873-appb-000095
在37℃条件下，向抗体Pertuzumab的PBS缓冲水溶液(pH＝6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液；5.0ml，10mg/ml，0.338μmol)加入配置好的三(2-羧乙基)膦的水溶液(10mM，0.173mL，1.73μmol)，置于水浴振荡器，于37℃振荡反应3小时，停止反应；将反应液用水浴降温至25℃，稀释至5.0mg/ml，并取出1.0ml溶液往下反应。
将化合物8(0.65mg，0.6μmol)溶解于0.1mL DMSO中，加入到上述1.0ml溶液中，置于水浴振荡器，于25℃振荡反应3小时，停止反应。将反应液用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH为6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液，含0.001M的EDTA)，得到FADC-7通式的示例性产物ADC-7的PBS缓冲液(1.42mg/mL，2.15mL)，于4℃冷冻储存。
UV-HPLC计算平均值：n＝6.91。
实施例28 ADC-8
Figure PCTCN2019107873-appb-000096
在37℃条件下，向抗体Pertuzumab的PBS缓冲水溶液(pH＝6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液；5.0ml，10mg/ml，0.338μmol)加入配置好的三(2-羧乙基)膦的水溶液(10mM，0.173mL，1.73μmol)，置于水浴振荡器，于37℃振荡反应3小时，停止反应；将反应液用水浴降温至25℃，稀释至5.0mg/ml，并取出1.6ml溶液往下反应。
将化合物10-较短保留时间化合物(1.04mg，1.0μmol)溶解于0.1mL DMSO中，加入到上述1.6ml溶液中，置于水浴振荡器，于25℃振荡反应3小时，停止反应。将反应液用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH为6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液，含0.001M的EDTA)，得到FADC-8通式的示例性产物ADC-8的PBS缓冲液(2.14mg/mL，2.31mL)，于4℃冷冻储存。
UV-HPLC计算平均值：n＝6.58。
实施例29 ADC-9
Figure PCTCN2019107873-appb-000097
在37℃条件下，向抗体Pertuzumab的PBS缓冲水溶液(pH＝6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液；5.0ml，10mg/ml，0.338μmol)加入配置好的三(2-羧乙基)膦的水溶液(10mM，0.173mL，1.73μmol)，置于水浴振荡器，于37℃振荡反应3小时，停止反应；将反应液用水浴降温至25℃，稀释至5.0mg/ml，并取出0.8ml溶液往下反应。
将化合物9-较短保留时间化合物9-A(0.55mg，0.5μmol)溶解于0.1mL DMSO中，加入到上述0.8ml溶液中，置于水浴振荡器，于25℃振荡反应3小时，停止反应。将反应液用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH为6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液，含0.001M的EDTA)，得到FADC-9A通式的示例性产物ADC-9的PBS缓冲液(2.27mg/mL，1.11mL)，于4℃冷冻储存。
UV-HPLC计算平均值：n＝3.16。
实施例30 ADC-10
Figure PCTCN2019107873-appb-000098
在37℃条件下，向抗体Trastuzumab的PBS缓冲水溶液(pH＝6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液；10.0mg/ml，0.574mL，38.78nmol)加入配置好的的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，19.76uL，197.6nmol)，置于水浴振荡器，于37℃振荡反应3小时，停止反应。将反应液用水浴降温至25℃。
将化合物14-较短保留时间化合物(0.64mg，588nmol)溶解于40ul DMSO中，加入到上述反应液中，置于水浴振荡器，于25℃振荡反应3小时，停止反应。将反应液用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH为6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液，含0.001M的EDTA)，得到FADC-10通式的示例性产物ADC-10的PBS缓冲液(5.48mg/mL，1.03mL)，于4℃冷冻储存。
UV-Vis计算平均值：n＝6.25。
实施例31 ADC-11
Figure PCTCN2019107873-appb-000099
在37℃条件下，向抗体Trastuzumab的PBS缓冲水溶液(pH＝6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液；10.0mg/ml，0.646mL，43.64nmol)加入配置好的的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，22.24uL，222.4nmol)，置于水浴振荡器，于37℃振荡反应3小时，停止反应。将反应液用水浴降温至25℃。
将化合物14-较长保留时间化合物(0.72mg，662nmol)溶解于40ul DMSO中，加入到上述反应液中，置于水浴振荡器，于25℃振荡反应3小时，停止反应。将反应液用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH为6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液，含0.001M的EDTA)，得到FADC-10通式的示例性产物ADC-11的PBS缓冲液(2.13mg/mL，1.87mL)，于4℃冷冻储存。
UV-Vis计算平均值：n＝7.03。
实施例32 ADC-12
Figure PCTCN2019107873-appb-000100
在37℃条件下，向抗体Trastuzumab的PBS缓冲水溶液(pH＝6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液；10.0mg/ml，0.726mL，49.05nmol)加入配置好的的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，25.0uL，250.0nmol)，置于水浴振荡器，于37℃振荡反应3小时，停止反应。将反应液用水浴降温至25℃。
将化合物15(0.81mg，754nmol)溶解于40ul DMSO中，加入到上述反应液中，置于水浴振荡器，于25℃振荡反应3小时，停止反应。将反应液用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH为6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液，含0.001M的EDTA)，得到FADC-12通式的示例性产物ADC-12的PBS缓冲液(3.34mg/mL，1.45mL)，于4℃冷冻储存。
UV-Vis计算平均值：n＝6.93。
实施例33 ADC-13
Figure PCTCN2019107873-appb-000101
在37℃条件下，向抗体Trastuzumab的PBS缓冲水溶液(pH＝6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液；10.0mg/ml，0.287mL，19.39nmol)加入配置好的的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，9.88uL，98.8nmol)，置于水浴振荡器，于37℃振荡反应3小时，停止反应。将反应液用水浴降温至25℃。
将化合物16(0.32mg，294nmol)溶解于20ul DMSO中，加入到上述反应液中，置于水浴振荡器，于25℃振荡反应3小时，停止反应。将反应液用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH为6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液，含0.001M的EDTA)，得到FADC-13通式的示例性产物ADC-13的PBS缓冲液(2.37mg/mL，0.88mL)，于4℃冷冻储存。
UV-Vis计算平均值：n＝6.53。
实施例34 ADC-14
Figure PCTCN2019107873-appb-000102
在37℃条件下，向抗体Trastuzumab的PBS缓冲水溶液(pH＝6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液；10.0mg/ml，0.592mL，40.0nmol)加入配置好的的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，20.38uL，203.8nmol)，置于水浴振荡器，于37℃振荡反应3小时，停止反应。将反应液用水浴降温至25℃。
将化合物17(0.92mg，598nmol)溶解于40ul DMSO中，加入到上述反应液中，置于水浴振荡器，于25℃振荡反应3小时，停止反应。将反应液用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH为6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液，含0.001M的EDTA)，得到FADC-14通式的示例性产物ADC-14的PBS缓冲液(0.30mg/mL，12.0mL)，于4℃冷冻储存。
UV-Vis计算平均值：n＝7.61。
实施例35 ADC-15
Figure PCTCN2019107873-appb-000103
在37℃条件下，向抗体Trastuzumab的PBS缓冲水溶液(pH＝6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液；10.0mg/ml，0.592mL，40.0nmol)加入配置好的的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，20.38uL，203.8nmol)，置于水浴振荡器，于37℃振荡反应3小时，停止反应。将反应液用水浴降温至25℃。
将化合物18(0.93mg，599nmol)溶解于40ul DMSO中，加入到上述反应液中，置于水浴振荡器，于25℃振荡反应3小时，停止反应。将反应液用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH为6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液，含0.001M的EDTA)，得到FADC-15通式的示例性产物ADC-15的PBS缓冲液(0.32mg/mL，11.8mL)，于4℃冷冻储存。
UV-Vis计算平均值：n＝7.89。
实施例36 ADC-16
Figure PCTCN2019107873-appb-000104
在37℃条件下，向抗体Trastuzumab的PBS缓冲水溶液(pH＝6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液；10.0mg/ml，0.53mL，35.8nmol)加入配置好的的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，18.25uL，182.5nmol)，置于水浴振荡器，于37℃振荡反应3小时，停止反应。将反应液用水浴降温至25℃。
将化合物19(0.83mg，534nmol)溶解于35ul DMSO中，加入到上述反应液中，置于水浴振荡器，于25℃振荡反应3小时，停止反应。将反应液用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH为6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液，含0.001M的EDTA)，得到FADC-16通式的示例性产物ADC-16的PBS缓冲液(0.32mg/mL，12.0mL)，于4℃冷冻储存。
UV-Vis计算平均值：n＝7.43。
实施例37 ADC-17
Figure PCTCN2019107873-appb-000105
在37℃条件下，向抗体Trastuzumab的PBS缓冲水溶液(pH＝6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液；10.0mg/ml，2.0mL，135.12nmol)加入配置好的的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，43.2uL，432nmol)，置于水浴振荡器，于37℃振荡反应3小时，停止反应。将反应液用水浴降温至25℃。
将化合物9-较短保留时间化合物9-A(2.22mg，2067nmol)溶解于175ul DMSO中，加入到上述反应液中，置于水浴振荡器，于25℃振荡反应3小时，停止反应。将反应液用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH为6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液，含0.001M的EDTA)，得到FADC-4A通式的示例性产物ADC-17的PBS缓冲液(1.32mg/mL，12.0mL)，于4℃冷冻储存。
UV-Vis计算平均值：n＝5.42。
实施例38 ADC-18(参照例)
Figure PCTCN2019107873-appb-000106
在37℃条件下，向抗体Trastuzumab的PBS缓冲水溶液(pH＝6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液；10.0mg/ml，1.5mL，101.3nmol)加入配置好的的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，51.7uL，517nmol)，置于水浴振荡器，于37℃振荡反应3小时，停止反应。将反应液用水浴降温至25℃。
将化合物20(2.0mg，1934nmol)溶解于100ul DMSO中，加入到上述反应液中，置于水浴振荡器，于25℃振荡反应3小时，停止反应。将反应液用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH为6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液，含0.001M的EDTA)，得到FADC-18通式的示例性产物ADC-18的PBS缓冲液(0.79mg/mL，13.0mL)，于4℃冷冻储存。
UV-Vis计算平均值：n＝7.23。
实施例39 ADC-19
Figure PCTCN2019107873-appb-000107
在37℃条件下，向抗体Trastuzumab的PBS缓冲水溶液(pH＝6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液；10.0mg/ml，1.36mL，91.9nmol)加入配置好的的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，46.9uL，469nmol)，置于水浴振荡器，于37℃振荡反应3小时，停止反应。将反应液用水浴降温至25℃。
将化合物9-较短保留时间化合物9-A(2.0mg，1862nmol)溶解于100ul DMSO中，加入到上述反应液中，置于水浴振荡器，于25℃振荡反应3小时，停止反应。将反应液用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH为6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液，含0.001M的EDTA)，得到FADC-4A通式的示例性产物ADC-19的PBS缓冲液(0.73mg/mL，13.0mL)，于4℃冷冻储存。
UV-Vis计算平均值：n＝6.26。
实施例40 ADC-20
Figure PCTCN2019107873-appb-000108
在37℃条件下，向抗体Trastuzumab的PBS缓冲水溶液(pH＝6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液；10.0mg/ml，1.5mL，101.3nmol)加入配置好的的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，51.7uL，517nmol)，置于水浴振荡器，于37℃振荡反应3小时，停止反应。将反应液用水浴降温至25℃。
将化合物10-较长保留时间化合物(2.0mg，1815nmol)溶解于100ul DMSO中，加入到上述反应液中，置于水浴振荡器，于25℃振荡反应3小时，停止反应。将反应液用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH为6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液，含0.001M的EDTA)，得到FADC-1通式的示例性产物ADC-20的PBS缓冲液(0.73mg/mL，13.0mL)，于4℃冷冻储存。
UV-Vis计算平均值：n＝7.43。
实施例41 ADC-21(参照例)
Figure PCTCN2019107873-appb-000109
在37℃条件下，向抗体Trastuzumab的PBS缓冲水溶液(pH＝6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液；10.0mg/ml，1.86mL，125.4nmol)加入配置好的的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，63.9uL，639nmol)，置于水浴振荡器，于37℃振荡反应3小时，停止反应。将反应液用水浴降温至25℃。
将化合物20(2.07mg，2001nmol)溶解于150ul DMSO中，加入到上述反应液中，置于水浴振荡器，于25℃振荡反应3小时，停止反应。将反应液用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH为6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液，含0.001M 的EDTA)，得到FADC-18通式的示例性产物ADC-21的PBS缓冲液(2.91mg/mL，4.44mL)，于4℃冷冻储存。
UV-Vis计算平均值：n＝7.23。
实施例42 ADC-22
Figure PCTCN2019107873-appb-000110
在37℃条件下，向抗体Trastuzumab的PBS缓冲水溶液(pH＝6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液；10.0mg/ml，1.88mL，127.2nmol)加入配置好的的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，64.9uL，649nmol)，置于水浴振荡器，于37℃振荡反应3小时，停止反应。将反应液用水浴降温至25℃。
将化合物9-较短保留时间化合物9-A(2.1mg，1955nmol)溶解于150ul DMSO中，加入到上述反应液中，置于水浴振荡器，于25℃振荡反应3小时，停止反应。将反应液用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH为6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液，含0.001M的EDTA)，得到FADC-4A通式的示例性产物ADC-22的PBS缓冲液(3.56mg/mL，3.98mL)，于4℃冷冻储存。
UV-Vis计算平均值：n＝6.79。
实施例43 ADC-23(参照例)
Figure PCTCN2019107873-appb-000111
在37℃条件下，向抗体Trastuzumab的PBS缓冲水溶液(pH＝6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液；10.0mg/ml，345mL，23.31umol)加入配置好的的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，11.89mL，118.9umol)，置于水浴振荡器，于37℃振荡反应3.5小时，停止反应。将反应液用水浴降温至25℃。
将化合物20(362mg，350umol)溶解于7.12ml MeCN和3.56mL DMSO中， 加入到上述反应液中，置于水浴振荡器，于25℃振荡反应3小时，停止反应。将反应液通过超滤膜包先后用含有2％(v/v)MeCN和1％(v/v)DMSO的PBS缓冲水溶液(pH＝6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液)、琥珀酸缓冲水溶液(pH＝5.3的0.01M的琥珀酸缓冲水溶液)脱盐纯化，之后加入蔗糖至60mg/mL、吐温20至0.2mg/mL，装瓶冻干后得到FADC-18通式的示例性产物ADC-23的冻干粉样品，于4℃冷冻储存。
UV-Vis计算平均值：n＝7.05。
实施例44 ADC-24
Figure PCTCN2019107873-appb-000112
在37℃条件下，向抗体Trastuzumab的PBS缓冲水溶液(pH＝6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液；10.0mg/ml，332mL，22.43umol)加入配置好的的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，11.44mL，114.4umol)，置于水浴振荡器，于37℃振荡反应3.5小时，停止反应。将反应液用水浴降温至25℃。
将化合物9-较短保留时间化合物9-A(241mg，224umol)溶解于13.76ml MeCN和6.88mL DMSO中，加入到上述反应液中，置于水浴振荡器，于25℃振荡反应3小时，停止反应。将反应液通过超滤膜包先后用含有4％(v/v)MeCN和2％(v/v)DMSO的PBS缓冲水溶液(pH＝6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液)、琥珀酸缓冲水溶液(pH＝5.3的0.01M的琥珀酸缓冲水溶液)脱盐纯化，之后加入蔗糖至60mg/mL、吐温20至0.2mg/mL，装瓶冻干后得到FADC-4A通式的示例性产物ADC-24的冻干粉样品，于4℃冷冻储存。
UV-Vis计算平均值：n＝7.07。
实施例45 ADC-25
Figure PCTCN2019107873-appb-000113
在37℃条件下，向抗体B7H3抗体1F9DS的PBS缓冲水溶液(pH＝6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液；10.0mg/ml，2.14mL，144.60nmol)加入配置好的的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，73.7uL，740nmol)，置于水浴振荡器，于37℃振荡反应3小时，停止反应。将反应液用水浴降温至25℃。
将化合物9-较短保留时间化合物9-A(3.0mg，2793nmol)溶解于150ul DMSO中，加入到上述反应液中，置于水浴振荡器，于25℃振荡反应3小时，停止反应。将反应液用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH为6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液，含0.001M的EDTA)，得到FADC-25通式的示例性产物ADC-25的PBS缓冲液(1.28mg/mL，13.0mL)，于4℃冷冻储存。
UV-Vis计算平均值：n＝6.87。
实施例46 ADC-26(参照例)
Figure PCTCN2019107873-appb-000114
在37℃条件下，向抗体B7H3抗体1F9DS的PBS缓冲水溶液(pH＝6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液；10.0mg/ml，0.89mL，60.14nmol)加入配置好的的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，30.1uL，300nmol)，置于水浴振荡器，于37℃振荡反应3小时，停止反应。将反应液用水浴降温至25℃。
将化合物20(1.0mg，967nmol)溶解于100ul DMSO中，加入到上述反应液中，置于水浴振荡器，于25℃振荡反应3小时，停止反应。将反应液用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH为6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液，含0.001M的EDTA)，得到FADC-26通式的示例性产物ADC-26的PBS缓冲液(1.61mg/mL，4.0mL)，于4℃冷冻储存。
UV-Vis计算平均值：n＝6.15。
实施例47 ADC-27
Figure PCTCN2019107873-appb-000115
在37℃条件下，向抗体B7H3抗体1F9DS的PBS缓冲水溶液(pH＝6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液；10.0mg/ml，0.89mL，60.14nmol)加入配置好的的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，30.1uL，300nmol)，置于水浴振荡器，于37℃振荡反应3小时，停止反应。将反应液用水浴降温至25℃。
将化合物9-较短保留时间化合物9-A(1.02mg，950nmol)溶解于100ul DMSO中，加入到上述反应液中，置于水浴振荡器，于25℃振荡反应3小时，停止反应。将反应液用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH为6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液，含0.001M的EDTA)，得到FADC-25通式的示例性产物ADC-27的PBS缓冲液(1.94mg/mL，3.5mL)，于4℃冷冻储存。
UV-Vis计算平均值：n＝6.11。
实施例48 ADC-28(参照例)
Figure PCTCN2019107873-appb-000116
在37℃条件下，向抗体B7H3抗体1F9DS的PBS缓冲水溶液(pH＝6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液；10.0mg/ml，2.36mL，159.47nmol)加入配置好的的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，81.3uL，810nmol)，置于水浴振荡器，于37℃振荡反应3小时，停止反应。将反应液用水浴降温至25℃。
将化合物20(3.0mg，2901nmol)溶解于150ul DMSO中，加入到上述反应液中，置于水浴振荡器，于25℃振荡反应3小时，停止反应。将反应液用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH为6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液，含0.001M的EDTA)，得到FADC-26通式的示例性产物ADC-28的PBS缓冲液(1.29mg/mL，13.0mL)，于4℃冷冻储存。
UV-Vis计算平均值：n＝7.46。
实施例49 ADC-29
Figure PCTCN2019107873-appb-000117
在37℃条件下，向抗体B7H3抗体1F9DS的PBS缓冲水溶液(pH＝6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液；10.0mg/ml，0.80mL，50.06nmol)加入配置好的的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，28.6uL，290nmol)，置于水浴振荡器，于37℃振荡反应3小时，停止反应。将反应液用水浴降温至25℃。
将化合物9-较短保留时间化合物9-A(1.29mg，1201nmol)溶解于100ul DMSO中，加入到上述反应液中，置于水浴振荡器，于25℃振荡反应3小时，停止反应。将反应液用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH为6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液，含0.001M的EDTA)，得到FADC-25通式的示例性产物ADC-29的PBS缓冲液(2.63mg/mL，2.4mL)，于4℃冷冻储存。
UV-Vis计算平均值：n＝7.24。
实施例50 ADC-30(参照例)
Figure PCTCN2019107873-appb-000118
在37℃条件下，向抗体B7H3抗体1F9DS的PBS缓冲水溶液(pH＝6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液；10.0mg/ml，0.86mL，58.4nmol)加入配置好的的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，29.1uL，290nmol)，置于水浴振荡器，于37℃振荡反应3小时，停止反应。将反应液用水浴降温至25℃。
将化合物20(1.0mg，967nmol)溶解于100ul DMSO中，加入到上述反应液中，置于水浴振荡器，于25℃振荡反应3小时，停止反应。将反应液用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH为6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液，含0.001M的EDTA)，得到FADC-26通式的示例性产物ADC-30的PBS缓冲液(1.61mg/mL，4.0mL)，于4℃冷冻储存。
UV-Vis计算平均值：n＝6.15。
实施例51 ADC-31
Figure PCTCN2019107873-appb-000119
在37℃条件下，向抗体B7H3抗体1F9DS的PBS缓冲水溶液(pH＝6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液；10.0mg/ml，0.89mL，60.14nmol)加入配置好的的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，30.1uL，300nmol)，置于水浴振荡器，于37℃振荡反应3小时，停止反应。将反应液用水浴降温至25℃。
将化合物8(1.0mg，943nmol)溶解于100ul DMSO中，加入到上述反应液中，置于水浴振荡器，于25℃振荡反应3小时，停止反应。将反应液用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH为6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液，含0.001M的EDTA)，得到FADC-31通式的示例性产物ADC-31的PBS缓冲液(1.47mg/mL，4.5mL)，于4℃冷冻储存。
UV-Vis计算平均值：n＝6.33。
ADC原液药物载量分析
实验目的及原理
ADC原液是一种抗体交联物类药物，其治疗疾病的机理是依赖抗体的靶向性将毒素分子运送到细胞中，进而将细胞杀死。药物的载量对药效起着决定性的作用。使用紫外法对ADC原液的药物载量进行了测定。
实验方法
将装有琥珀酸钠缓冲液的比色皿分别置于参比吸收池和样品测定吸收池中后，扣除溶剂空白后，再将装有供试品溶液的比色皿置于样品测定吸收池中，测定280nm和370nm处吸光度。
结果计算：采用紫外分光光度法(使用仪器：Thermo nanodrop2000紫外分光光度计)测定ADC原液载量，其原理是在某波长下ADC原液的总吸光值等于胞毒药物与单克隆抗体在该波长下吸光值的加和，即：
(1)A 280nm＝ε mab-280bC mab+ε Drug-280bC Drug
ε Drug-280：药物在280nm平均摩尔消光系数5100；
C Drug：药物的浓度；
ε mab-280：曲妥珠单抗原液或帕妥珠单抗原液在280nm平均摩尔消光系数214600；
C mab：曲妥珠单抗原液或帕妥珠单抗原液的浓度；
b：光程长度为1cm。
同理可以得到样品在370nm下的总吸光值方程：
(2)A 370nm＝ε mab-370bC mab+ε Drug-370bC Drug
ε Drug-370：药物在370nm平均摩尔消光系数19000；
C Drug：药物的浓度；
ε mab-370：曲妥珠单抗原液或帕妥珠单抗原液在370nm消光系数为0；
C mab：曲妥珠单抗原液的浓度；
b：光程长度为1cm。
由⑴和⑵两种方程结合单克隆抗体和药物在两个检测波长下的消光系数和浓度数据可以计算出药物的载量。
药物载量＝C Drug/C mab。
生物学评价
测试例1：通式(D)化合物对肿瘤细胞体外增殖抑制测试
一、测试目的
本实验的目的是为了检测本发明通式(D)药物化合物，对U87MG细胞(中科院细胞库，Catalog#TCHu138)和SK-BR-3肿瘤细胞(人乳腺癌细胞，ATCC，货号HTB-30)体外增殖的抑制活性。以不同浓度的化合物体外处理细胞，经6天培养后，采用CTG(
Figure PCTCN2019107873-appb-000120
Luminescent Cell Viability Assay，Promega，货号：G7573)试剂对细胞的增值进行检测，根据IC50值评价该化合物的体外活性。
二、实验方法
下面以对U87MG细胞体外增殖抑制测试方法为例，用于举例说明本发明中测试本发明化合物对肿瘤细胞进行体外增殖抑制活性测试的方法。本方法同样适用于，但不限于对其它肿瘤细胞进行体外增殖抑制活性测试。
1、细胞培养：U87MG和SK-BR-3细胞分别用10％FBS的EMEM培养基(GE，货号SH30024.01)和含10％FBS的McCoy's 5A培养基(Gibco，货号16600-108)培养。
2、细胞准备：取对数生长期的U87MG和SK-BR-3细胞，用PBS(磷酸盐缓冲液，上海源培生物科技股份有限公司)洗涤1次之后，加入2-3ml胰蛋白酶(0.25％Trypsin-EDTA(1x)，Gibico,Life Technologies公司)消化2-3min，待细胞消化完全后，加入10-15ml细胞培养液，将经过消化的细胞洗脱下来，1000rpm离心5min，弃上清，接着加入10-20ml细胞培养液将细胞重悬，制成单细胞悬液。
3、细胞铺板：将U87MG和SK-BR-3单细胞悬液混匀，用细胞培养液分别调整活细胞密度至2.75×10 3cells/ml和8.25×10 3cells/ml，将密度调整过后的细胞悬液混匀，以180μl/孔加入96孔细胞培养板。96孔板外周孔只加入200ul培养基。将培养板在培养箱培养24小时(37℃，5％CO 2)。
4、化合物准备：用DMSO(二甲基亚砜，上海泰坦科技股份有限公司)溶解化合物，配制成初始浓度为10mM的存储液。
小分子化合物的起始浓度为500nM，配药方法如下。
在96孔U型底配药板第一列中分别加入30μl不同待测样品，样品浓度为100uM；第2列至第11列每孔中加入20ul DMSO。取第一列样品10ul至第二列20ul DMSO中，混匀，取10ul至第三列中，以此类推至第10列。将配药板中的药每孔取5ul至95ul EMEM培养基中，混匀，待用。
ADC的起始浓度为10nM或500nM，配药方法如下。
在96孔板第一列中分别加入100μl不同待测样品，样品浓度为100nM或5uM；第2列至第11列每孔中加入100ul PBS。取第一列样品50ul至第二列100ul PBS中，混匀，取50ul至第三列中，以此类推3倍稀释至第10列。
5、加样操作：向培养板中加入20μl配置的不同浓度的待测样品，每个样品两复孔。将培养板在培养箱孵育6天(37℃，5％CO 2)。
6、显色操作：取出96孔细胞培养板，向每孔加入90μl CTG溶液，室温孵育10分钟。
7、读板操作：取出96孔细胞培养板，置于酶标仪(BMG labtech，PHERAstar FS)中，用酶标仪测定化学发光。
三、数据分析
用Microsoft Excel，Graphpad Prism 5对数据进行处理分析。实验结果参见下表。
表1本公开中的小分子片段对SK-BR-3细胞和U87细胞体外增殖抑制的IC 50值。
Figure PCTCN2019107873-appb-000121
Figure PCTCN2019107873-appb-000122
结论：本公开中的小分子片段对SK-BR-3细胞和U87细胞具有明显的增殖抑制活性，手性中心对化合物的抑制活性有一定影响。
测试例2：本公开抗体药物偶联物对HER2靶标的肿瘤细胞的体外增殖抑制测试
本实验的目的是为了检测本公开针对HER2靶标的抗体药物偶联物，对SK-BR-3(人乳腺癌细胞，ATCC，货号HTB-30)和MDA-MB-468(人乳腺癌细胞，ATCC，货号HTB-132)体外增殖的抑制活性。以不同浓度的化合物体外处理细胞，经6天培养后，采用CTG试剂对细胞的增值进行检测，根据IC 50值评价该化合物的体外活性。
按照测试例1的测试方法，测试细胞为SK-BR-3和MDA-MB-468，细胞培养液分别为含10％FBS的McCoy's 5A培养基(Gibco，货号16600-108)，含10％FBS的EMEM培养基(GE，货号SH30024.01),和含10％FBS的L-15培养基(ThermoFisher，货号11415-114)。用细胞培养液将三株细胞分别调整活细胞密度至8.33×10 3个细胞/ml、8.33×10 3个细胞/ml和1.39×10 4个细胞/ml，将密度调整过后的细胞悬液混匀，以180μl/孔加入96孔细胞培养板。对相关化合物进行测试，得到结果见下表。
表2公开抗体药物偶联物对HER2靶标的肿瘤细胞的体外增殖抑制的IC 50值。
Figure PCTCN2019107873-appb-000123
结论：本公开针对HER2靶标的抗体药物偶联物对HER2阳性细胞SK-BR-3具有明显的增殖抑制活性；同时，它们对HER2阴性细胞MDA-MB-468增殖抑制活性弱；具有良好的选择性。
测试例3：Her2-ADC血浆稳定性实验
将ADC-19样品、ADC-18样品、ADC-20样品、人血浆、猴血浆(上海美迪西生物医药股份有限公司)、和1％BSA(Sigma)PBS溶液(上海生工)分别用0.22μm的过滤器过滤除菌。将ADC-19、ADC-18、ADC-20分别以终浓度200ug/ml加入上述无菌血浆或1％BSA PBS溶液中，置于37℃细胞培养箱中孵育，将孵育当天记为第0天，随后分别在第7天、14天和21天取出样品，进行游离毒素的检测。
取25μl样品至96孔板中；加入50μL内标工作液(100ng/mL喜树碱乙腈溶液)及150μl乙腈；涡旋混合5分钟，离心10分钟(4000rpm)，5ul进行LC/MS/MS(美国应用生物系统公司)分析。
结果显示：ADC-19在人和猴血浆，以及1％BSA PBS溶液中都相当稳定，游离毒素的释放率最高不超过2.1％，且在第14天趋于稳定，见图1A。
ADC-18在人和猴血浆中稳定性差，游离毒素的释放率最高分别为14.5％和8.10％。在1％BSA PBS溶液中比较稳定，见图1B。
ADC-20在人血浆、猴血浆和1％BSA PBS溶液中稳定性均比较差，游离毒素的释放率最高分别为21.7％、29.7％和21.7％。，且在1％BSAPBS溶液中一直处于降解状态，见图1C。
测试例4：JIMT-1荷瘤小鼠药效评价
一、试验目的
以nunu裸鼠为受试动物，评价Her2-ADC抗体T-DM1、ADC-21、ADC-24腹腔注射给药后，对人乳腺癌细胞曲妥珠单抗耐药株(赫赛汀)JIMT-1移植瘤裸小鼠的疗效。
二、受试药物及材料
1、受试药物
T-DM1(参考US20050169933制备)
ADC-21：3mg/kg
ADC-21：10mg/kg
ADC-24：3mg/kg
ADC-24：10mg/kg
空白对照(Blank)：PBS
2、配制方法：均用PBS稀释配制。
3、试验动物
nunu裸鼠，购自北京维通利华。
三、试验方法
在小鼠右肋部皮下接种JIMT-1细胞(南京科佰)(5×10 6/只，具有50％人工基底膜)，肿瘤生长8天，长至203.09±11.94mm 3后将动物随机分组(d1)，8只/组，共6组。
采用腹腔注射给药，共给药2次。每周测量2次瘤体积和体重，记录数据。
数据统计使用Excel 2003统计软件：平均值以avg计算；SD值以STDEV计算；SEM值以STDEV/SQRT计算；组间差异P值以TTEST计算。
肿瘤体积(V)计算公式为：V＝1/2×L 长×L 短 2
相对体积(RTV)＝V T/V 0
抑瘤率(％)＝(C RTV-T RTV)/C RTV(％)
其中V 0、V T分别为实验开始时及实验结束时的肿瘤体积。C RTV、T RTV分别为实验结束时的空白对照组(Vehicle，PBS)及实验组的相对肿瘤体积。
四、试验结果
实验结果如图2显示，腹腔注射给药2次，观察至第34天时结束实验。T-DM1(10mg/kg)对肿瘤无抑制作用；ADC-21，3mg/kg的抑瘤率46.22％(P＜0.01)；ADC-21，10mg/kg的抑瘤率56.77％(P＜0.001)；ADC-24，3mg/kg的抑瘤率62.77％(P＜0.001)；ADC-24，10mg/kg的抑瘤率76.32％(P＜0.001)。在同等剂量情况下，ADC-24的抑瘤效果明显好于ADC-21。
测试例5：SK-BR-3荷瘤小鼠药效评价
一、试验目的
以nunu裸鼠为受试动物，评价Her2-ADC抗体ADC-21、ADC-22腹腔注射给药后对人乳腺癌细胞SK-BR-3移植瘤裸小鼠的疗效。
二、受试药物及材料
1、受试药物
ADC-21：1mg/kg
ADC-21：6mg/kg
ADC-22：1mg/kg
ADC-22：6mg/kg
空白对照(Blank)：PBS。
2、配制方法：均用PBS稀释配制。
3、试验动物
nunu裸鼠，购自北京维通利华。
三、试验方法
在小鼠右肋部皮下接种SK-BR-3细胞(ATCC)(5×10 6/只，具有50％人工基底膜)，肿瘤生长20天，长至153.34±11.73mm3后将动物随机分组(d0)，8只/组，共5组。
采用腹腔注射给药1次。每周测量2次瘤体积和体重，记录数据。
数据统计使用Excel 2003统计软件：平均值以avg计算；SD值以STDEV计算；SEM值以STDEV/SQRT计算；组间差异P值以TTEST计算。
肿瘤体积(V)计算公式为：V＝1/2×L 长×L 短 2
相对体积(RTV)＝V T/V 0
抑瘤率(％)＝(C RTV-T RTV)/C RTV(％)
其中V 0、V T分别为实验开始时及实验结束时的肿瘤体积。C RTV、T RTV分别为实验结束时的空白对照及实验组的相对肿瘤体积。
四、试验结果
实验结果如图3显示，腹腔注射给药1次，观察至第28天时结束实验，ADC-21 1mg/kg的抑瘤率15.01％；ADC-21 6mg/kg的抑瘤率77.4％，且和空白对照相比有非常显著差异(P＜0.001)。ADC-22 1mg/kg的抑瘤率19.82％；ADC-22 6mg/kg的抑瘤率98.38％(P＜0.001)。同为6mg/kg剂量情况下，ADC-22的抑瘤效果也明显好于ADC-21。
测试例6：血浆稳定性
将样品ADC-25，以100μg/ml的终浓度，分别与人血浆、猴血浆、和1％BSA PBS溶液混合均匀后，过滤除菌后置于37℃水浴锅内孵育，将孵育当天记为第0天，随后分别在第7天、14天和21天取出样品，进行游离毒素的检测。
不同时间点的样品取出后放至室温，涡旋混匀；取25μl样品至96孔板中；加入50μL内标工作液(100ng/mL喜树碱乙腈溶液)及150μl乙腈；涡旋混合5分钟，离心10分钟(4000rpm)，取上清液5μl进行LC/MS/MS分析。
结果如图4显示，ADC-25在人和猴血浆，以及1％BSA PBS溶液中都相当稳定，游离毒素的释放率最高不超过2％，且在第14天趋于稳定。
测试例7：ADC对人脑星形胶质母细胞瘤U87MG裸小鼠移植瘤的疗效评价
一、试验目的
本实验以BALB/cA-nude裸小鼠为受试动物，评价本公开ADC化合物对人脑星形胶质母细胞瘤U87MG裸小鼠移植瘤的的疗效。
二、受试药物及材料
1、受试药物
ADC-27(3mg/kg)
ADC-26(3mg/kg)
空白对照(Blank)：PH7.4的PBS缓冲液。
2、配制方法：PH7.4的PBS缓冲液。
3、试验动物
BALB/cA-nude裸小鼠：购自上海杰思捷实验动物有限责任公司。
三、试验方法
实验用BALB/cA-nude裸小鼠，雌性，6-7周，皮下接种人脑星形胶质母细胞瘤U87MG细胞(人脑星形胶质母细胞瘤，中科院细胞库，Catalog#TCHu138)。接种细胞后第十天，将动物随机分组(D0)，每组8只，开始腹腔注射给药1次/周，共给药3次，每周测2－3次瘤体积和体重，记录数据。肿瘤体积(V)计算公式为：
V＝1/2×a×b 2
其中a、b分别表示长、宽。
相对体积(RTV)＝V T/V 0
抑瘤率(％)＝(C RTV-T RTV)/C RTV(％)
其中V 0、V T分别为实验开始时及实验结束时的肿瘤体积。C RTV、T RTV分别为实验结束时的对照组(空白)及实验组的相对肿瘤体积。
四、试验结果
腹腔注射(i.p.)给药每周1次，共给药3次，观察至第22天时，ADC-27 3mg/kg的抑瘤率达到63.3％(P<0.0001)；ADC-26 3mg/kg的抑制率达到49.1％。ADC-27显示出比ADC-26更强的抗肿瘤疗效。
给药过程中各组动物体重正常，提示ADC无明显毒副作用。检测结果如表3和图5所示。所检测抗体能够有效抑制荷瘤裸鼠中U87MG移植瘤的生长，并且呈现出剂量依赖性。
表3给药抗体对人脑星形胶质母细胞瘤U87MG裸小鼠移植瘤的疗效(D22)
Figure PCTCN2019107873-appb-000124
测试例8：ADC对人咽头癌胸水转移细胞Detroit 562裸小鼠移植瘤的疗效评价
一、试验目的
本实验以BALB/cA-nude裸小鼠为受试动物，评价本公开ADC化合物对人咽头癌胸水转移细胞Detroit 562裸小鼠移植瘤的疗效。
二、受试药物及材料
1、受试药物
ADC-29(3mg/kg)
ADC-28(3mg/kg)
阴性对照ADC(3mg/kg)：非B7H3靶点与化合物20偶联形成的配体毒素偶联物。
2、配制方法：均用PBS稀释配制。
3、试验动物
BALB/cA-nude裸小鼠：购自常州卡文斯实验动物有限责任公司。
三、试验方法
实验用BALB/cA-nude裸小鼠，雌性，6-7周，皮下接种人咽头癌胸水转移细胞Detroit 562细胞(ATCC，
Figure PCTCN2019107873-appb-000125
CCL-138 TM)。接种细胞后第十天，将动物随机分组(D0)，每组8只，开始腹腔注射给药1次/周，共给药3次，每周测2－3次瘤体积和体重，记录数据。肿瘤体积(V)计算公式为：
V＝1/2×a×b 2
其中a、b分别表示长、宽。
相对体积(RTV)＝V T/V 0
抑瘤率(％)＝(C RTV-T RTV)/C RTV(％)
其中V 0、V T分别为实验开始时及实验结束时的肿瘤体积。C RTV、T RTV分别为实验结束时的对照组(阴性对照)及实验组的相对肿瘤体积。
四、试验结果
腹腔注射给药每周1次，共给药3次，观察至第28天时，受试ADC抑瘤率分别是：ADC-29 3mg/kg(3mpk)的抑瘤率达到72.27％(P<0.001)；ADC-28 3mg/kg(3mpk)的抑瘤率达到56.2％(P<0.001)。ADC-29均显示出比ADC-28更强的抗肿瘤疗效。
给药过程中各组动物体重正常，提示ADC无明显毒副作用。检测结果如表4和图6所示。所检测抗体能够有效抑制荷瘤裸鼠中Detroit 562移植瘤的生长，并且呈现出剂量依赖性。
表4.给药抗体对荷瘤裸鼠Detroit 562移植瘤的疗效(D28)
Figure PCTCN2019107873-appb-000126
Figure PCTCN2019107873-appb-000127
测试例9：U87-MG荷瘤小鼠药效评价
一、试验目的
以Balb/c裸鼠为受试动物，在其人胶质瘤细胞U87MG移植瘤模型上评价B7H3-抗体药物偶连物腹腔注射后的疗效。
二、受试药物及材料
1、受试药物
ADC-30 1mg/kg
ADC-30 3mg/kg
ADC-31 1mg/kg
ADC-31 3mg/kg
空白对照(Blank)：PBS
2、配制方法：均用PBS稀释配制。
3、试验动物
BALB/cA-nude裸小鼠：购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。
三、试验方法
在小鼠右肋部皮下接种U87MG细胞(人脑星形胶质母细胞瘤，中科院细胞库，Catalog#TCHu138)(2.5×10 6/只)，肿瘤生长14天，长至167.49mm3后将动物随机分组(d1)，8只/组，共5组。
采用腹腔注射给药1次/周，共给药3次。每周测量2次瘤体积和体重，记录数据。
数据统计使用Excel 2003统计软件：平均值以avg计算；SD值以STDEV计算；SEM值以STDEV/SQRT计算；组间差异P值以TTEST计算。
肿瘤体积(V)计算公式为：V＝1/2×L 长×L 短 2
相对体积(RTV)＝V T/V 0
抑瘤率(％)＝(C RTV-T RTV)/C RTV(％)
其中V 0、V T分别为实验开始时及实验结束时的肿瘤体积。C RTV、T RTV分别为实验结束时的空白对照组(Vehicle)及实验组的相对肿瘤体积。
四、试验结果
实验结果如图7显示，腹腔注射给药1次/周，共给药3次，观察至第18天时，受试ADC抑瘤率分别为：ADC-30 1mg/kg的抑瘤率为0.31％；ADC-30 3mg/kg的抑瘤率达到45.23％(P<0.0001)；ADC-31 1mg/kg的抑瘤率达到39.22％(P<0.01)；ADC-31 3mg/kg的抑瘤率达到80.24％(P<0.0001)。在同等剂量情况下，ADC-31的抑瘤效果明显好于ADC-30。

Claims (46)

  1. 一种配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中所述配体-药物偶联物包含式(-D)所示的结构：
    Figure PCTCN2019107873-appb-100001
    其中：
    Y选自-O-(CR aR b) m-CR 1R 2-C(O)-、-O-CR 1R 2-(CR aR b) m-、-O-CR 1R 2-、-NH-(CR aR b) m-CR 1R 2-C(O)-或-S-(CR aR b) m-CR 1R 2-C(O)-；
    R a和R b相同或不同，且各自独立地选自氢原子、氘原子、卤素、烷基、卤代烷基、氘代烷基、烷氧基、羟基、氨基、氰基、硝基、羟烷基、环烷基或杂环基；
    或者，R a和R b与其相连接的碳原子一起形成环烷基或杂环基；
    R 1选自卤素、氘代烷基、环烷基、环烷基烷基、烷氧基烷基、杂环基、芳基或杂芳基；
    R 2选自氢原子、卤素、卤代烷基、氘代烷基、环烷基、环烷基烷基、烷氧基烷基、杂环基、芳基或杂芳基；
    或者，R 1和R 2与其相连接的碳原子一起形成环烷基或杂环基；
    或者，R a和R 2与其相连的碳原子一起形成环烷基或杂环基；
    其中，式-D中的波浪线表示氢原子，或与接头单元或与结合靶细胞所表达抗原的抗体共价连接；
    m为0至4的整数。
  2. 根据权利要求1所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中所述配体-药物偶联物包含式(-D 1)所示的结构：
    Figure PCTCN2019107873-appb-100002
    其中：
    R 1为环烷基烷基或环烷基；优选C 3-6环烷基烷基或C 3-6环烷基；
    R 2选自氢原子、卤代烷基或C 3-6环烷基；优选氢原子；
    或者，R 1和R 2与其相连接的碳原子一起形成C 3-6环烷基；
    波浪线表示氢原子，或与接头单元或与结合靶细胞所表达抗原的抗体共价连接；
    m为0或1。
  3. 根据权利要求1所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其为通式(Pc-L-Y-Dr)所示的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物：
    Figure PCTCN2019107873-appb-100003
    其中：
    Y选自-O-(CR aR b) m-CR 1R 2-C(O)-、-O-CR 1R 2-(CR aR b) m-、-O-CR 1R 2-、-NH-(CR aR b) m-CR 1R 2-C(O)-或-S-(CR aR b) m-CR 1R 2-C(O)-；
    R a和R b相同或不同，且各自独立地选自氢原子、氘原子、卤素、烷基、卤代烷基、氘代烷基、烷氧基、羟基、氨基、氰基、硝基、羟烷基、环烷基或杂环基；
    或者，R a和R b与其相连接的碳原子一起形成环烷基或杂环基；
    R 1选自卤素、卤代烷基、氘代烷基、环烷基、环烷基烷基、烷氧基烷基、杂环基、芳基或杂芳基；
    R 2选自氢原子、卤素、卤代烷基、氘代烷基、环烷基、环烷基烷基、烷氧基烷基、杂环基、芳基或杂芳基；
    或者，R 1和R 2与其相连接的碳原子一起形成环烷基或杂环基；
    或者，R a和R 2与其相连的碳原子一起形成环烷基或杂环基；
    m为0至4的整数；
    n为1至10，可以为整数，也可以为小数；
    Pc为配体；L为接头单元。
  4. 根据权利要求3所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，
    其中：
    Y为-O-(CR aR b)m-CR 1R 2-C(O)-；
    R a和R b相同或不同，且各自独立地选自氢原子、氘原子、卤素或烷基；
    R 1为C 3-6环烷基烷基或C 3-6环烷基；
    R 2选自氢原子、卤代烷基或C 3-6环烷基；优选氢原子；
    或者，R 1和R 2与其相连接的碳原子一起形成C 3-6环烷基；
    m为0或1。
  5. 根据权利要求1至4中任一项所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中Y选自：
    Figure PCTCN2019107873-appb-100004
  6. 根据权利要求1至5中任一项所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中Y的O端与接头单元L相连。
  7. 根据权利要求1所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其为通式(Pc-L-D1)所示的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物：
    Figure PCTCN2019107873-appb-100005
    其中：
    R 1为C 3-6环烷基烷基或C 3-6环烷基；
    R 2选自氢原子、卤代烷基或C 3-6环烷基；优选氢原子；
    或者，R 1和R 2与其相连接的碳原子一起形成C 3-6环烷基；
    m为0或1；
    n为1至10，可以为整数，也可以为小数；
    Pc为配体；L为接头单元。
  8. 根据权利要求3至7中任一项所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的 盐或溶剂化物，其中n为2至8，可以为整数，也可以为小数；优选为3至8，可以为整数，也可以为小数。
  9. 根据权利要求3至8中任一项所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中接头单元-L-为-L 1-L 2-L 3-L 4-，
    L 1选自-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-W-C(O)-、-CH 2-C(O)-NR 3-W-C(O)-或-C(O)-W-C(O)-，其中W选自C 1-8烷基、C 1-8烷基-环烷基或1至8个原子的直链杂烷基，所述杂烷基包含1至3个选自N、O或S的杂原子，其中所述的C 1-8烷基、环烷基和直链杂烷基各自独立地任选进一步被选自卤素、羟基、氰基、氨基、烷基、氯代烷基、氘代烷基、烷氧基和环烷基的一个或多个取代基所取代；
    L 2选自-NR 4(CH 2CH 2O)p 1CH 2CH 2C(O)-、-NR 4(CH 2CH 2O)p 1CH 2C(O)-、-S(CH 2)p 1C(O)-或化学键，其中p 1为1至20的整数；优选为化学键；
    L 3为由2至7个氨基酸构成的肽残基，其中氨基酸任选进一步被选自卤素、羟基、氰基、氨基、烷基、氯代烷基、氘代烷基、烷氧基和环烷基中的一个或多个取代基所取代；
    L 4选自-NR 5(CR 6R 7) t-、-C(O)NR 5、-C(O)NR 5(CH 2) t-或化学键，其中t为1至6的整数；优选为-NR 5(CR 6R 7)t-；
    R 3、R 4和R 5相同或不同，且各自独立地选自氢原子、烷基、卤代烷基、氘代烷基和羟烷基；
    R 6和R 7相同或不同，且各自独立地选自氢原子、卤素、烷基、卤代烷基、氘代烷基和羟烷基。
  10. 根据权利要求9所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中L 1选自-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-(CH 2)s 1-C(O)-、-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH 2-环己基-C(O)-、-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-(CH 2CH 2O)s 2-CH 2CH 2-C(O)-、-CH 2-C(O)-NR 3-(CH 2)s 3-C(O)-或-C(O)-(CH 2)s 4C(O)-，其中s 1为2至8的整数，s 2为1至3的整数，s 3为1至8的整数，s 4为1至8的整数。
  11. 根据权利要求9或10所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中L 2选自-NR 4(CH 2CH 2O)p 1CH 2C(O)-或化学键，p 1为6至12的整数。
  12. 根据权利要求9至11中任一项所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中L 4选自-NR 5(CR 6R 7) t-，R 5选自氢原子或烷基，R 6和R 7相同或不同，且各自独立地为氢原子或烷基，t为1或2，优选为2。
  13. 根据权利要求9至12中任一项所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中L 3为由2至7个选自苯丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、赖氨酸、 瓜氨酸、丝氨酸、谷氨酸、天冬氨酸的氨基酸构成的肽残基；优选为四肽残基；更优选为甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸的四肽残基。
  14. 根据权利要求3至13中任一项所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中接头单元-L-为-L 1-L 2-L 3-L 4-，
    L 1为
    Figure PCTCN2019107873-appb-100006
    s 1为2至8的整数；
    L 2为化学键；
    L 3为四肽残基；
    L 4为-NR 5(CR 6R 7) t-，R 5选自氢原子或烷基，R 6和R 7相同或不同，且各自独立地为氢原子或烷基，t为1或2。
  15. 根据权利要求3至13中任一项所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中接头单元-L-为-L 1-L 2-L 3-L 4-，
    L 1为-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH 2-环己基-C(O)-；
    L 2为-NR 4(CH 2CH 2O) 9CH 2C(O)-；
    L 3为四肽残基；
    L 4为-NR 5(CR 6R 7)t-，R 5选自氢原子或烷基，R 6和R 7相同或不同，且各自独立地为氢原子或烷基，t为1或2。
  16. 根据权利要求9至15中任一项所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中所述的接头单元-L-，其L 1端与配体相连，L 4端与Y相连。
  17. 根据权利要求3至16中任一项所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中-L-Y-为：
    Figure PCTCN2019107873-appb-100007
    其中L 1选自-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-(CH 2)s 1-C(O)-或-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH 2-环己基-C(O)-；
    L 2为-NR 4(CH 2CH 2O)p 1CH 2C(O)-或化学键，p 1为6至12的整数；
    L 3为GGFG的四肽残基；
    R 1为C 3-6环烷基烷基或C 3-6环烷基；
    R 2选自氢原子、卤代烷基或C 3-6环烷基；
    或者，R 1和R 2与其相连接的碳原子一起形成C 3-6环烷基；
    R 5、R 6或R 7相同或不同，且各自独立地为氢原子或烷基；
    s 1为2至8的整数；
    m为0至4的整数。
  18. 根据权利要求17所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中所述-L-Y-为：
    Figure PCTCN2019107873-appb-100008
    L 2为-NR 4(CH 2CH 2O) 9CH 2C(O)-；
    L 3为GGFG的四肽残基；
    R 1为C 3-6环烷基烷基或C 3-6环烷基；
    R 2选自氢原子、卤代烷基或C 3-6环烷基；
    或者，R 1和R 2与其相连接的碳原子一起形成C 3-6环烷基；
    R 5、R 6或R 7相同或不同，且各自独立地为氢原子或烷基；
    m为0至4的整数。
  19. 根据权利要求17所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中所述-L-Y-为
    Figure PCTCN2019107873-appb-100009
    L 2为化学键；
    L 3为GGFG的四肽残基；
    R 1为C 3-6环烷基烷基或C 3-6环烷基；
    R 2选自氢原子、卤代烷基或C 3-6环烷基；
    或者，R 1和R 2与其相连接的碳原子一起形成C 3-6环烷基；
    R 5选自氢原子或烷基，R 6和R 7相同或不同，且各自独立地为氢原子或烷基；
    s 1为2至8的整数；优选5；
    m为0至4的整数。
  20. 一种配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中所述配体-药物偶联物包含式(-L-Y-)所示的结构：
    Figure PCTCN2019107873-appb-100010
    其中：
    L 2为化学键；
    L 3为GGFG的四肽残基；
    R 1为C 3-6环烷基烷基或C 3-6环烷基；
    R 2选自氢原子、卤代烷基或C 3-6环烷基；
    或者，R 1和R 2与其相连接的碳原子一起形成C 3-6环烷基；
    R 5选自氢原子或烷基，R 6和R 7相同或不同，且各自独立地为氢原子或烷基；
    s 1为2至8的整数；
    m为0至4的整数。
  21. 根据权利要求1至4中任一项所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其为通式(Pc-L a-Y-Dr)所示的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物：
    Figure PCTCN2019107873-appb-100011
    其中：
    W选自C 1-8烷基、C 1-8烷基-环烷基或1至8个原子的直链杂烷基，所述杂烷基包含1至3个选自N、O或S的杂原子，其中所述的C 1-8烷基、环烷基和直链杂烷基各自独立地任选进一步被选自卤素、羟基、氰基、氨基、烷基、氯代烷基、氘代烷基、烷氧基和环烷基的一个或多个取代基所取代；
    L 2选自-NR 4(CH 2CH 2O)p 1CH 2CH 2C(O)-、-NR 4(CH 2CH 2O)p 1CH 2C(O)-、-S(CH 2)p 1C(O)-或化学键，p 1为1至20的整数；
    L 3为由2至7个氨基酸构成的肽残基，其中氨基酸任选进一步被选自卤素、羟基、氰基、氨基、烷基、氯代烷基、氘代烷基、烷氧基和环烷基中的一个或多个取代基所取代；
    R 1选自卤素、环烷基烷基、氘代烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；
    R 2选自氢原子、卤素、卤代烷基、氘代烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；
    或者，R 1和R 2与其相连接的碳原子一起形成环烷基或杂环基；
    R 4和R 5相同或不同，且各自独立地选自氢原子、烷基、卤代烷基、氘代烷基和羟烷基；
    R 6和R 7相同或不同，且各自独立地选自氢原子、卤素、烷基、卤代烷基、氘代烷基和羟烷基；
    m为0至4的整数；
    n为1至10，可以为整数，也可以为小数；
    Pc为配体。
  22. 根据权利要求21所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其为通式(Pc-L b-Y-Dr)所示的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物：
    Figure PCTCN2019107873-appb-100012
    其中：
    s 1为2至8的整数；优选5；
    Pc、R 1、R 2、R 5～R 7、m和n如权利要求21中所定义。
  23. 根据权利要求3至20中任一项所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中-L-Y-选自：
    Figure PCTCN2019107873-appb-100013
    Figure PCTCN2019107873-appb-100014
  24. 根据权利要求1至23中任一项所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其选自以下结构式：
    Figure PCTCN2019107873-appb-100015
    Figure PCTCN2019107873-appb-100016
    Figure PCTCN2019107873-appb-100017
    其中：
    n为1至10，可以为整数，也可以为小数；
    Pc为配体。
  25. 根据权利要求3至24中任一项所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中所述Pc为抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体选自嵌合抗体、人源化抗体和全人源抗体。
  26. 根据权利要求25所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中所述的抗体或其抗原结合片段选自抗HER2(ErbB2)抗体、抗EGFR抗体、抗B7-H3抗体、抗c-Met抗体、抗HER3(ErbB3)抗体、抗HER4(ErbB4)抗体、抗CD20抗体、抗CD22抗体、抗CD30抗体、抗CD33抗体、抗CD44抗体、抗CD56抗体、抗CD70抗体、抗CD73抗体、抗CD105抗体、抗CEA抗体、抗A33抗体、抗Cripto抗体、抗EphA2抗体、抗G250抗体、抗MUCl抗体、抗Lewis Y抗体、抗VEGFR抗体、抗GPNMB抗体、抗Integrin抗体、抗PSMA抗体、抗Tenascin-C抗体、抗SLC44A4抗体、抗Mesothelin抗体或其抗原结合片段。
  27. 根据权利要求25所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中所述的抗体或其抗原结合片段选自Trastuzumab、Pertuzumab、Nimotuzumab、Enoblituzumab、Emibetuzumab、Inotuzumab、Pinatuzumab、Brentuximab、Gemtuzumab、Bivatuzumab、Lorvotuzumab、cBR96和Glematumamab，或其抗原结合片段。
  28. 根据权利要求3至27中任一项所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其选自以下结构式：
    Figure PCTCN2019107873-appb-100018
    Figure PCTCN2019107873-appb-100019
    Figure PCTCN2019107873-appb-100020
    Figure PCTCN2019107873-appb-100021
    其中n如权利要求3所定义。
  29. 一种通式(D)所示的化合物：
    Figure PCTCN2019107873-appb-100022
    或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、或其混合物形式，或其可药用的盐，其中：
    Y选自-O-(CR aR b) m-CR 1R 2-C(O)-、-O-CR 1R 2-(CR aR b) m-、-O-CR 1R 2-、-NH-(CR aR b) m-CR 1R 2-C(O)-或-S-(CR aR b) m-CR 1R 2-C(O)-；
    R a和R b相同或不同，且各自独立地选自氢原子、氘原子、卤素、烷基、卤代烷基、氘代烷基、烷氧基、羟基、氨基、氰基、硝基、羟烷基、环烷基或杂环基；
    或者，R a和R b与其相连接的碳原子一起形成环烷基或杂环基；
    R 1选自卤素、氘代烷基、环烷基、环烷基烷基、烷氧基烷基、杂环基、芳基或杂芳基；
    R 2选自氢原子、卤素、卤代烷基、氘代烷基、环烷基、环烷基烷基、烷氧基烷基、杂环基、芳基或杂芳基；
    或者，R 1和R 2与其相连接的碳原子一起形成环烷基或杂环基；
    或者，R a和R 2与其相连的碳原子一起形成环烷基或杂环基；
    m为0至4的整数。
  30. 根据权利要求29所述的通式(D)所示的化合物，其为通式(D 1)所示的化合物：
    Figure PCTCN2019107873-appb-100023
    或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、或其混合物形式，或其可药用的盐，
    其中：R 1为C 3-6环烷基烷基或C 3-6环烷基；
    R 2选自氢原子、卤代烷基或C 3-6环烷基；
    或者，R 1和R 2与其相连接的碳原子一起形成C 3-6环烷基；
    m为0或1。
  31. 根据权利要求29或30所述的通式(D)所示的化合物，其选自：
    Figure PCTCN2019107873-appb-100024
    Figure PCTCN2019107873-appb-100025
  32. 一种通式(L a-Y-Dr)所示的化合物：
    Figure PCTCN2019107873-appb-100026
    或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、或其混合物形式，或其可药用的盐，
    其中：
    W选自C 1-8烷基、C 1-8烷基-环烷基或1至8个原子的直链杂烷基，所述杂烷基包含1至3个选自N、O或S的杂原子，其中所述的C 1-8烷基、环烷基和直链杂烷基各自独立地任选进一步被选自卤素、羟基、氰基、氨基、烷基、氯代烷基、氘代烷基、烷氧基和环烷基的一个或多个取代基所取代；
    L 2选自-NR 4(CH 2CH 2O)p 1CH 2CH 2C(O)-、-NR 4(CH 2CH 2O)p 1CH 2C(O)-、-S(CH 2)p 1C(O)-或化学键，p 1为1至20整数；
    L 3为由2至7个氨基酸构成的肽残基，其中氨基酸任选进一步被选自卤素、羟基、氰基、氨基、烷基、氯代烷基、氘代烷基、烷氧基和环烷基中的一个或多个取代基所取代；
    R 1选自卤素、氘代烷基、环烷基、环烷基烷基、烷氧基烷基、杂环基、芳基或杂芳基；
    R 2选自氢原子、卤素、卤代烷基、氘代烷基、环烷基、环烷基烷基、烷氧基烷基、杂环基、芳基或杂芳基；或者，R 1和R 2与其相连接的碳原子一起形成环烷基或杂环基；
    R 4和R 5相同或不同，且各自独立地选自氢原子、烷基、卤代烷基、氘代烷基和羟烷基；
    R 6和R 7相同或不同，且各自独立地选自氢原子、卤素、烷基、卤代烷基、氘代烷基和羟烷基；
    m为0至4的整数。
  33. 根据权利要求32所述的通式(L a-Y-Dr)所示的化合物，其为通式(L b-Y-Dr)所示的化合物：
    Figure PCTCN2019107873-appb-100027
    或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、或其混合物形式，或其可药用的盐，
    其中R 1、R 2、R 5～R 7、s 1和m如权利要求32中所定义。
  34. 根据权利要求32或33所述的通式(L a-Y-Dr)所示的化合物，其选自：
    Figure PCTCN2019107873-appb-100028
    Figure PCTCN2019107873-appb-100029
  35. 一种制备如通式(D 1)所示的化合物或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、或其混合物形式，或其可药用的盐的方法，其包括以下步骤：
    Figure PCTCN2019107873-appb-100030
    通式(Y 1)和通式(Dr)进行缩合反应，得到通式(D 1)所示的化合物，
    其中：
    R 1、R 2和m如权利要求30中所定义。
  36. 一种制备如通式(L b-Y-Dr)所示的化合物或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、或其混合物形式，或其可药用的盐的方法，其包括以下步骤：
    Figure PCTCN2019107873-appb-100031
    通式(IA)和通式(IB)进行缩合反应，得到通式(L b-Y-Dr)所示的化合物，
    其中：R 1、R 2、R 5～R 7、s 1和m如权利要求32中所定义。
  37. 一种制备如通式(L b-Y-Dr)所示的化合物或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、或其混合物形式，或其可药用的盐的方法，其包括以下步骤：
    Figure PCTCN2019107873-appb-100032
    通式(IA)和通式(IB)进行缩合反应，得到通式(L b-Y-Dr)所示的化合物，
    其中：R 1、R 2、R 5～R 7、s 1和m如权利要求32中所定义。
  38. 一种制备如通式(Pc-L a-Y-Dr)所示的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物的方法，其包括以下步骤：
    Figure PCTCN2019107873-appb-100033
    还原Pc后，与通式(L a-Y-Dr)偶联反应，得到通式(Pc-L a-Y-Dr)所示的化合物；
    其中：
    Pc为配体；
    W、L 2、L 3、R 1、R 2、R 5～R 7、m和n如权利要求21中所定义。
  39. 一种配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其包含配体和连接至配体的药物，其中所述药物选自根据权利要求29至34中任一项所述的化合物，优选药物通过接头连接至配体。
  40. 根据权利要求39所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中所述配体为单克隆抗体。
  41. 根据权利要求39或40所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物的制备方法，其包含将选自29至34中任一项所述的化合物与配体连接的步骤，优选通过接头连接。
  42. 根据权利要求41所述的制备方法，其中所述配体为单克隆抗体。
  43. 一种药物组合物，其含有治疗有效量的根据权利要求1至28中任意一项所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，或根据权利要求29 至31中任意一项通式(D)所示所述的化合物、其可药用盐或溶剂合物，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
  44. 根据权利要求1至28中任一项所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，或根据权利要求29至31中任意一项所述的通式(D)所示的化合物或其可药用盐或溶剂合物，或根据权利要求43所述的药物组合物在制备用于治疗或预防肿瘤的药物中的用途。
  45. 根据权利要求44所述的用途，其中所述的肿瘤为与HER2、HER3、B7H3或EGFR表达相关的癌症。
  46. 根据权利要求1至28中任一项所述的配体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，或根据权利要求29至31中任意一项所述的通式(D)所示的化合物或其可药用盐或溶剂合物，或根据权利要求43所述的药物组合物在制备治疗和/或预防癌症的药物中的用途，其中所述癌症优选选自乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫癌、前列腺癌、肾癌、尿道癌、膀胱癌、肝癌、胃癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、食道癌、黑色素瘤、神经胶质瘤、神经母细胞瘤、肉瘤、肺癌、结肠癌、直肠癌、结直肠癌、白血病、骨癌、皮肤癌、甲状腺癌、胰腺癌和淋巴瘤。
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