WO2023125619A1 - 抗ror1抗体和抗ror1抗体药物偶联物及其医药用途 - Google Patents

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杨春鹏
林广�
金薪盛
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    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Definitions

  • ROR1 The expression of ROR1 was not detected in most normal tissues, including the heart, spleen, lung and liver, these important human organs, and only a certain expression was detected in the parathyroid gland, pancreatic islets and gastrointestinal tract tissues. In view of the huge difference in the expression of ROR1 in normal tissues and tumor tissues, and in various tumors (including hematological tumors and solid tumors), it can be used as an ideal target for ADC molecular development.
  • the light chain variable region comprises LCDR1, LCDR2 and LCDR3 shown in SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9, respectively;
  • the present disclosure also provides an immunoconjugate or a pharmaceutically acceptable salt thereof, comprising the anti-ROR1 antibody and an effector molecule as described in any one of the preceding items, wherein the effector molecule is coupled to The anti-ROR1 antibody.
  • the effector molecules are selected from radioisotopes, antineoplastic agents, immunomodulators, biological response modifiers, lectins, cytotoxic drugs, chromophores, fluorophores, chemiluminescent compounds, enzymes, metal ions, and the like any combination.
  • n is an integer or a decimal of 1 to 10; n is preferably an integer or a decimal of 1 to 8;
  • the aforementioned immunoconjugate or a pharmaceutically acceptable salt thereof, wherein the structure of the immunoconjugate is as follows:
  • L 1 is selected from -(succinimide-3-yl-N)-WC(O)-, -CH 2 -C(O)-NR 1 -WC(O)- or -C(O)-WC( O)-, wherein W is selected from C 1-8 alkyl or C 1-6 alkyl-cycloalkyl;
  • the immunoconjugate or the pharmaceutically acceptable salt thereof according to any one of the preceding items, wherein said L 4 is -NR 3 (CR 4 R 5 )t-, wherein, R 3 , R 4 or R 5 are the same or different, and are each independently a hydrogen atom or a C 1-6 alkyl group, and t is 1 or 2.
  • the immunoconjugate or a pharmaceutically acceptable salt thereof according to any one of the preceding items, wherein said L 4 is a PAB group.
  • the term "heavy chain” includes the variable region domain VH and the three constant region domains CH1, CH2 and CH3.
  • the VH is amino-terminal to the heavy chain, and the CH domain is carboxy-terminal, with CH3 closest to the carboxy-terminus of the polypeptide.
  • the heavy chain can be of any isotype, including IgG (including IgGl, IgG2, IgG3, and IgG4 subtypes), IgA (including IgAl and IgA2 subtypes), IgM, and IgE.
  • the term “specifically binds”, “specifically binds” or “binds” means that an antibody binds to a certain antigen or epitope thereof with a higher affinity than to another antigen or epitope.
  • the antibody binds the antigen or its antigen with an equilibrium dissociation constant (KD) of about 1 x 10 -7 M or less (e.g., about 1 x 10 -8 M or less, about 1 x 10 -9 M or less). gauge.
  • the antibody binds the antigen with a KD that is 10%, or less (eg, 1%) of the antibody's KD for binding to a non-specific antigen (eg, BSA, casein).
  • KD can be measured using methods known in the art, for example by Surface plasmon resonance measurements.
  • antibodies that specifically bind to an antigen or an epitope thereof may have cross-reactivity to other related antigens, e.g. , cyno), chimpanzee (Pan troglodytes) (chimpanzee, chimp) or marmoset (Callithrix jacchus) (commonmarmoset, marmoset)) are cross-reactive.
  • FcR expression on hematopoietic cells is summarized in Table 3 on page 464 of Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92 (1991).
  • an in vitro ADCC assay can be performed, such as those described in US Pat. No. 5,500,362 or 5,821,337.
  • Useful effector cells for such assays include peripheral blood mononuclear cells (PBMC) and natural killer (NK) cells.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • NK natural killer
  • ADCC activity of an antibody of interest can also be assessed in vivo, eg, in an animal model such as that disclosed in Clynes et al., (USA) 95:652-656 (1998).
  • ADCP antibody-dependent cellular phagocytosis
  • complement-dependent cytotoxicity refers to a cell death-inducing mechanism in which the Fc effector domain of a target-binding antibody binds and activates complement component C1q, which in turn activates the complement cascade, resulting in target cell death.
  • Activation of complement can also result in the deposition of complement components on the surface of target cells that promote CDC by binding to complement receptors (eg, CR3) on leukocytes.
  • complement receptors eg, CR3
  • isolated means free from its naturally occurring state, and in this context means that the specified molecule is substantially free of other biomolecules, such as nucleic acids, proteins, lipids, carbohydrates, or other materials, such as cellular debris and growth medium.
  • isolated is not intended to mean the complete absence of these materials or the absence of water, buffers or salts, unless they are present in amounts that significantly interfere with the experimental or therapeutic use of the compounds as described herein.
  • Alkyl may be substituted or unsubstituted, and when substituted, it may be substituted at any available point of attachment, substituents are preferably selected from D atoms, halogen, alkoxy, haloalkyl, haloalkoxy, ring One or more of alkyloxy, heterocyclyloxy, hydroxy, hydroxyalkyl, cyano, amino, nitro, cycloalkyl, heterocyclyl, aryl and heteroaryl.
  • the term "therapeutically effective amount” refers to a non-toxic but sufficient amount of the drug or agent to achieve the desired effect.
  • the determination of the effective amount varies from person to person, depending on the age and general condition of the subject, and also depends on the specific active substance. The appropriate effective amount in each case can be determined by those skilled in the art according to routine tests.
  • the pharmaceutical composition can be in the form of a sterile injectable aqueous or oily suspension for intramuscular and subcutaneous administration.
  • This suspension may be formulated according to the known art using those suitable dispersing or wetting agents and suspending agents which have been mentioned above.
  • the sterile injectable preparation can also be a sterile injectable solution or suspension prepared in a non-toxic parenterally acceptable diluent or solvent, for example a solution in 1,3-butanediol.
  • sterile fixed oils are conveniently employed as a solvent or suspending medium.
  • any bland fixed oil may be employed including synthetic mono- or diglycerides.
  • fatty acids such as oleic acid are prepared as injectables.
  • an “effective amount” is generally sufficient to reduce the severity and/or frequency of symptoms, eliminate those symptoms and/or their underlying causes, prevent the occurrence of symptoms and/or their underlying causes, and/or ameliorate or ameliorate the impairment caused by or associated with the disease state (e.g. lung disease).
  • the effective amount is a therapeutically or prophylactically effective amount.
  • a “therapeutically effective amount” is sufficient to treat a disease state or symptom, especially a state or symptom associated with the disease state, or otherwise prevent, hinder, delay or reverse the disease state or any other adverse effect in any way related to the disease state. The amount of progression of the desired symptoms.
  • the anti-ROR1 antibody Ab1 in WO2018237335 is used as a positive control, and its sequences are as follows:
  • Compound D1 (Hanxiang Biotechnology, CAS: 646502-53-6, 2.92mg, 2218nmol) was dissolved in 140 ⁇ L DMSO, added to the above reaction solution, placed in a water bath shaker, and shaken at 25°C for 3 hours. Stop responding.
  • the reaction solution was desalted and purified with Sephadex G25 gel column (elution phase: 0.05M PBS buffered aqueous solution with pH 6.5, containing 0.001M EDTA), to obtain the PBS buffer solution (2.25mg/mL, 13.5mL), stored in refrigerator at 4°C.
  • Embodiment 6 Preparation of ADC-4
  • Test Example 4 Cross-binding ability to rat/mouse ROR1 antigen
  • Test Example 5 In vivo drug efficacy evaluation of ADC molecule high expression CDX model
  • Tumor inhibition rate TGI(%) 1-T/C(%).
  • ADC samples were prepared into different concentrations with PBS, and diluted five times with PBS, a total of 8 concentrations. Take out the cell culture plate and add 15 ⁇ L of 10 ⁇ concentration solution to each well. 5% carbon dioxide and cultured at 37°C for 6 days.
  • NDG mice were subcutaneously inoculated with JEKO-1 cells (5 ⁇ 10 6 +50% matrigel/200 ⁇ L/mouse) on the right flank, and divided into groups 7 days later, 8 mice/group.
  • the average tumor volume of each group was 266.7mm 3 on the day of grouping.
  • the ADC compound was administered by intraperitoneal injection at a dose of 2.5mpk/5mpk, administered on the 1st day and 14th day of the grouping respectively, administered twice in total, and observed for 21 days.
  • ADC-3-35mpk MTD ⁇ 35mpk (animal died); toxicity manifested as: weight loss, bone marrow suppression, thymus atrophy, liver, lung, kidney and other organ functions were significantly affected.

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Abstract

抗ROR1抗体和抗ROR1抗体药物偶联物及其医药用途。

Description

抗ROR1抗体和抗ROR1抗体药物偶联物及其医药用途
本申请要求2021年12月28日提交的中国专利申请(申请号CN202111623091.0)和2022年03月10日提交的中国专利申请(申请号CN202210230033.X)的优先权。
技术领域
本披露涉及抗ROR1抗体、抗ROR1免疫偶联物，其制备方法，包含其的药物组合物，以及其用于制备治疗ROR1介导的疾病或病症的药物中的用途；尤其在用于制备抗癌药物中的用途。
背景技术
这里的陈述仅提供与本披露有关的背景信息，而不必然地构成现有技术。
受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)属于受体酪氨酸激酶(RTK)家族。ROR1在细胞膜上为典型的I型单次跨膜蛋白，胞外含有三个不同的结构域，分别为免疫球蛋白样(Ig-like)结构域，富含半胱氨酸的卷曲样结构域(frizzled domain,FZD)和环状结构域(kringle domain,KD)。胞内则是由酪氨酸激酶结构域组成，主要参与下游的RTK信号传递。作为一种RTK蛋白，ROR1的胞浆内激活需要两个步骤：1.内在催化活性的增加；2.下游信号通路蛋白的结合位点形成。这两个步骤是通过配体介导的寡聚化后导致胞内酪氨酸残基的自磷酸化完成的。目前的研究表明，在胚胎发育的不同阶段，ROR1可在骨骼、呼吸和心脏系统以及中枢神经元的神经突触细胞中表达，而出生后，其表达则明显下调。在肿瘤细胞中ROR1可以与WNT5a蛋白结合并激活非经典WNT通路，维持肿瘤细胞的干细胞特性，包括增殖、迁移和分化，是一种肿瘤干细胞(CSC)的表面标志物。ROR1的表达情况与肿瘤的相关性最早是在B细胞慢性淋巴瘤白血病(CLL)中确定的。研究发现，在多种血液肿瘤中，ROR1均为高表达，包括套细胞淋巴瘤(MCL)、边缘区淋巴瘤(MZL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡型淋巴瘤(FL)等。进一步的ROR1表达谱研究拓展到了实体肿瘤上。研究表明，三阴性乳腺癌(TNBC)、肺癌的不同分型、卵巢癌的不同分型、胰腺癌等一系列实体肿瘤均呈现不同程度的ROR1表达。
在大部分的正常组织，包括心脏、脾脏、肺和肝脏这些重要的人体器官均未检测到ROR1的表达，只在甲状旁腺、胰岛和胃肠道组织上检测到一定的表达。鉴于ROR1在正常组织和肿瘤组织上表达的巨大差异，且在多种肿瘤中有不同程度的表达(包括血液肿瘤和实体肿瘤)，其可作为ADC分子开发的理想靶标。
发明内容
本披露涉及一种分离的抗ROR1抗体，其包含：
SEQ ID NO：2所示的重链可变区中所包含的HCDR1，HCDR2和HCDR3；和
SEQ ID NO：3所示的轻链可变区中所包含的LCDR1，LCDR2和LCDR3。
在一些实施方案中，如上所述的抗ROR1抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中：
所述重链可变区包含分别如SEQ ID NO：4、16或22所示的HCDR1，SEQ ID NO：5、17或23所示的HCDR2和SEQ ID NO：6、18或24所示的HCDR3；
所述轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：7、19或25所示的LCDR1，SEQ ID NO：8、20或26所示的LCDR2和SEQ ID NO：9、21或27所示的LCDR3；
如上所述的CDR区按Kabat、IMGT或Chothia编号规则确定。
在一些实施方案中，如上所述的抗ROR1抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中：
所述重链可变区包含分别如SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示的HCDR1，HCDR2和HCDR3；
所述轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9所示的LCDR1，LCDR2和LCDR3；
如上所述的CDR区按Kabat编号规则确定。
在一些实施方案中，如上任一项所述的抗ROR1抗体，其中所述抗ROR1抗体是全长人抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，如上任一项所述的抗ROR1抗体，其包含重链可变区和轻链可变区，其中：
所述重链可变区，其氨基酸序列与SEQ ID NO：2具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，和/或
所述轻链可变区，其氨基酸序列与SEQ ID NO：3具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。
在一些实施方案中，如上任一项所述的抗ROR1抗体，其包含重链可变区和轻链可变区，其中：
所述重链可变区，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，和
所述轻链可变区，其氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
在一些实施方案中，如上任一项所述的抗ROR1抗体，其中所述抗体进一步包含抗体重链恒定区和轻链恒定区。优选地，所述重链恒定区选自人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4恒定区，所述轻链恒定区选自人抗体κ和λ链恒定区。更优选地，所述抗体包含如SEQ ID NO：10所示的重链恒定区和如SEQ ID NO：11所示的轻链恒定区。
在一些实施方案中，如上任一项所述的抗ROR1抗体，其包含：
与SEQ ID NO：12具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、 97％、98％、99％或100％序列同一性的重链，和/或
与SEQ ID NO：13具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链。
在一些实施方案中，如上任一项所述的抗ROR1抗体，其包含：
如SEQ ID NO：12所示的重链和如SEQ ID NO：13所示的轻链。
在一些实施方案中，如上任一项所述的抗ROR1抗体，其中所述抗ROR1抗体以小于1×10 -8M的KD结合人ROR1或其表位，所述KD是通过表面等离子体共振法测量。
在一些实施方案中，本披露还提供一种分离的抗ROR1抗体，其中所述抗体与如前任一项所述的抗ROR1抗体竞争性结合人ROR1。
在一些实施方案中，本披露还提供一种分离的核酸分子，其编码如前任一项所述的抗ROR1抗体。
在一些实施方案中，本披露还提供一种宿主细胞，其包含如前任一项所述的核酸分子。
在一些实施方案中，本披露还提供一种药物组合物，其含有治疗有效量的如前任一项所述的抗ROR1抗体，或如前所述的核酸分子，以及一种或更多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
在一些实施方案中，本披露还提供一种免疫检测或测定ROR1的方法，所述方法包括使用如前任一项所述的抗ROR1抗体接触受试者或来自受试者的样品的步骤。
在一些实施方案中，本披露还提供一种免疫偶联物或其药学上可接受的盐，其包含如前任一项所述的抗ROR1抗体和效应分子，其中，所述效应分子偶联至所述抗ROR1抗体。优选地，所述效应分子选自放射性同位素、抗肿瘤剂、免疫调节剂、生物反应修饰剂、凝集素、细胞毒性药物、发色团、荧光团、化学发光化合物、酶、金属离子，以及其任何组合。
在一些实施方案中，如前所述的免疫偶联物或其药学上可接受的盐，其中所述的免疫偶联物结构如下：
Figure PCTCN2022142644-appb-000001
其中：
n为1至10的整数或小数；n优选为1至8的整数或小数；
Pc为如前任一项所述的抗ROR1抗体；和
L为接头单元。
在一些实施方案中，如前所述的免疫偶联物或其药学上可接受的盐，其中所 述的免疫偶联物结构如下：
Figure PCTCN2022142644-appb-000002
其中：
n为1至10的整数或小数；n优选为1至8的整数或小数；
Pc为如前任一项所述的抗ROR1抗体；和
L为接头单元。
在一些实施方案中，如前任一项所述的免疫偶联物或其药学上可接受的盐，其中n为3至5的整数或小数，优选为4。
在一些实施方案中，如前任一项所述的免疫偶联物或其药学上可接受的盐，其中n为6至8的整数或小数，例如但不限于7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0或前述任意两个数值间的范围。
在一些具体的实施方案中，如前任一项所述的免疫偶联物或其药学上可接受的盐，其中n为8。
技术人员理解，在一些具体的实施方案中n以DAR值的形式体现。DAR值是一个测算值，因而当本公开中提及具体的n值(或DAR值)时，应当理解为包含适当的误差范围，技术人员根据测量系统能够确定该误差范围的大小。
在一些具体的实施方案中，如前任一项所述的免疫偶联物或其药学上可接受的盐，其中n为7.39±误差。
在一些实施方案中，如前任一项所述的免疫偶联物或其药学上可接受的盐，其中接头单元-L-为-L 1-L 2-L 3-L 4-，
L 1选自-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-W-C(O)-、-CH 2-C(O)-NR 1-W-C(O)-或-C(O)-W-C(O)-，其中W选自C 1-8烷基或C 1-6烷基-环烷基；
L 2选自-NR 2(CH 2CH 2O)p 1CH 2CH 2C(O)-、-NR 2(CH 2CH 2O)p 1CH 2C(O)-、-S(CH 2)p 1C(O)-或化学键，其中p 1为1至20的整数；优选为化学键；
L 3为由2至7个氨基酸残基构成的肽残基，其中所述的氨基酸残基选自苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、缬氨酸(V)、赖氨酸(K)、瓜氨酸、丝氨酸(S)、谷氨酸(E)和天冬氨酸(D)中的氨基酸形成的氨基酸残基；
L 4选自-NR 3(CR 4R 5) t-、-C(O)NR 3-、-C(O)NR 3(CH 2) t-或PAB基团，其中t为1至6的整数；
R 1、R 2和R 3相同或不同，且各自独立地选自氢原子、烷基、卤代烷基、氘代 烷基和羟烷基；
R 4和R 5相同或不同，且各自独立地选自氢原子、卤素、烷基、卤代烷基、氘代烷基和羟烷基。
在一些实施方案中，如前任一项所述的免疫偶联物或其药学上可接受的盐，其中所述的L 3为二肽残基；优选为缬氨酸-瓜氨酸(VC)。
在一些实施方案中，如前任一项所述的免疫偶联物或其药学上可接受的盐，其中所述的L 3为四肽残基；优选为GGFG。
在一些实施方案中，如前任一项所述的免疫偶联物或其药学上可接受的盐，其中所述的L 4为-NR 3(CR 4R 5)t-，其中，R 3、R 4或R 5相同或不同，且各自独立地为氢原子或C 1-6烷基，t为1或2。
在一些实施方案中，如前任一项所述的免疫偶联物或其药学上可接受的盐，其中所述的L 4为PAB基团。
在一些实施方案中，如前任一项所述的免疫偶联物或其药学上可接受的盐，其中所述的免疫偶联物结构选自：
Figure PCTCN2022142644-appb-000003
其中：
n和Pc如前所定义。
在一些实施方案中，如前任一项所述的免疫偶联物或其药学上可接受的盐结构如下：
Figure PCTCN2022142644-appb-000004
其中：
n为1至10的整数或小数；n优选为1至8的整数或小数；
Pc为抗ROR1抗体，其包含如SEQ ID NO：12所示的重链和如SEQ ID NO：13所示的轻链。
在一些实施方案中，如前任一项所述的免疫偶联物或其药学上可接受的盐结构如下：
Figure PCTCN2022142644-appb-000005
其中：
n为1至10的整数或小数；n优选为1至8的整数或小数；
Pc为抗ROR1抗体，其包含如SEQ ID NO：12所示的重链和如SEQ ID NO：13所示的轻链。
在一些实施方案中，如前任一项所述的免疫偶联物或其药学上可接受的盐，n为3至5的整数或小数。
在一些实施方案中，n选自1-10，或1-8，或2-8，或2-7，或2-4，或3-8，或3-7，或3-6，或4-7，或4-6，或4-5的平均值。在一些实施方案中，n为从1，2，3，4，5，6，7，8，9，10中的一个或多个计算所得的平均值。在一些实施方案中，n优选为6-8，更优选为平均值8。
在一些实施方案中，本披露还提供一种药物组合物，其包含如前任一项所述的抗ROR1抗体，或如前任一项所述的核酸分子，或如前任一项所述的免疫偶联物或其药学上可接受的盐，以及一种或多种药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。
在一些实施方案中，本披露还提供如前任一项所述的抗ROR1抗体，或如前任一项所述的核酸分子，或如前任一项所述的免疫偶联物或其药学上可接受的盐，或如前任一项所述的药物组合物在制备用于治疗ROR1介导的疾病或病症的药物 中的用途。
另一方面，本披露提供了如前任一项所述的免疫偶联物或其药学上可接受的盐或包含其的药物组合物在制备用于治疗ROR1介导的疾病或病症的药物中的用途。在一些实施方案中，所述ROR1介导的疾病或病症为ROR1高表达癌症，中表达癌症或低表达癌症。
在一些实施方案中，本披露还提供如前任一项所述的抗ROR1抗体，或如前任一项所述的核酸分子，或如前任一项所述的免疫偶联物或其药学上可接受的盐，或如前任一项所述的药物组合物在制备用于治疗肿瘤或癌症的药物中的用途，其中所述肿瘤和癌症选自乳腺癌、胰腺癌、肺癌、食道癌、非小细胞肺癌、喉部肿瘤、肉瘤、咽部肿瘤、口腔肿瘤、胃癌、卵巢癌、前列腺癌、膀胱癌、结肠直肠癌、淋巴瘤和白血病。
在一些实施方案中，本披露还提供一种试剂盒，其包含如前任一项所述的抗ROR1抗体，或如前任一项所述的核酸分子，或如前任一项所述的免疫偶联物或其药学上可接受的盐，或如前任一项所述的药物组合物。
另一方面，本披露提供了一种药物组合物，其包含如前任一项所述的抗ROR1抗体、免疫偶联物或其药学上可接受的盐，以及一种或多种药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。在一些实施方案中，所述单位剂量的药物组合物中含有0.1mg-3000mg或1mg-1000mg如前所述的抗ROR1抗体或如前所述的免疫偶联物。
另一方面，本披露提供了如前任一项所述的免疫偶联物或其药学上可接受的盐或包含其的药物组合物作为药物的用途。
在一些实施方案中，本披露还提供一种预防或治疗疾病或病症的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的如前任一项所述的抗ROR1抗体，或如前任一项所述的核酸分子，或如前任一项所述的免疫偶联物或其药学上可接受的盐，或如前任一项所述的药物组合物。在一些实施方案中，所述疾病或病症为与ROR1有关的疾病或病症。
另一方面，本披露进一步涉及一种用于治疗肿瘤的方法，该方法包括向需要其的受试者施用治疗有效剂量的如前任一项所述的免疫偶联物或其药学上可接受的盐或包含其的药物组合物；在一些实施方案中，其中所述的肿瘤为与ROR1高表达相关的癌症，中表达相关的癌症或低表达相关的癌症。
另一方面，本披露进一步涉及一种用于治疗肿瘤或癌症的方法，该方法包括向需要其的受试者施用治疗有效剂量的如前任一项所述的免疫偶联物或其药学上可接受的盐或包含其的药物组合物；在一些实施方案中，其中所述肿瘤和癌症选自乳腺癌、胰腺癌、肺癌、食道癌、非小细胞肺癌、喉部肿瘤、肉瘤、咽部肿瘤、口腔肿瘤、胃癌、卵巢癌、前列腺癌、膀胱癌、结肠直肠癌、淋巴瘤和白血病。
另一方面，本披露进一步提供如前任一项所述的抗ROR1抗体或其免疫偶联物作为药物。在一些实施方案中，作为治疗癌症或肿瘤的药物，优选作为治疗ROR1 介导的癌症的药物。
可将活性化合物(如本披露的抗ROR1抗体或其免疫偶联物)制成适合于通过任何适当途径给药的形式。本披露化合物或组合物的单位剂量的表达方式可以是片剂、胶囊、扁囊剂、瓶装药水、药粉、颗粒剂、锭剂、栓剂、再生药粉或液体制剂。
本披露治疗方法中所用化合物或组合物的剂量通常将随疾病的严重性、受试者的体重和化合物的相对功效而改变。不过，作为一般性指导，合适的单位剂量可以是0.1mg至1000mg。
本披露的药物组合物除活性化合物外，可含有一种或多种辅料，所述辅料选自以下成分：填充剂、稀释剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂或赋形剂等。根据给药方法的不同，组合物可含有0.1％至99％重量的活性化合物。
本披露提供的抗ROR1抗体具有与细胞表面抗原良好的亲和力和良好的细胞内吞效率。本披露提供的抗ROR1抗体免疫偶联物有很强的肿瘤抑制效率，并且在动物体内具有更好的药效和更低的毒副作用。
发明详述
术语
除非另有限定，本文所用的所有技术和科学术语均与本披露所属领域普通技术人员的通常理解一致。虽然也可采用与本文所述相似或等同的任何方法和材料实施或测试本披露，但本文描述了优选的方法和材料。描述和要求保护本披露时，依据以下定义使用下列术语。
当本披露中使用商品名时，旨在包括该商品名产品的制剂、该商品名产品的药物和活性药物部分。
除非有相反陈述，在说明书和权利要求书中使用的术语具有下述含义。
本披露所用氨基酸三字母代码和单字母代码如J.biol.chem，243，p3558(1968)中所述。
术语“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及以与天然存在的氨基酸类似的方式发挥作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那些氨基酸，以及后来修饰的那些氨基酸，例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指与天然存在的氨基酸具有相同基本化学结构(即与氢、羧基、氨基和R基团结合的α碳)的化合物，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。此类类似物具有修饰的R基团(例如，正亮氨酸)或修饰的肽骨架，但保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指具有与氨基酸的一般化学结构不同的结构，但是以与天然存在的氨基酸类似的方式发挥作用的化学化合物。
本文中的术语“抗体”以最广义使用，并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体，多克隆抗体，多特异性抗体(例如双特异性抗体)，全长抗体和抗体 片段(或抗原结合片段，或抗原结合部分)，只要展现出期望的抗原结合活性。
“天然抗体”指天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是约150，000道尔顿的异四聚糖蛋白，由二硫键结合的两条轻链和两条重链构成。从N至C端，每条重链具有一个可变区(VH)，又称作可变重域，或重链可变域，接着是三个恒定域(CH1、CH2和CH3)。类似地，从N至C端，每条轻链具有一个可变区(VL)，又称作可变轻域，或轻链可变域，接着是一个恒定轻域(也称轻链恒定区，CL)。
术语“全长抗体”、“完整抗体”和“全抗体”在本文可互换使用，指包含与天然抗体结构基本类似的结构，或重链含有如本文中定义的Fc区的抗体。
“分离的抗体”是已经与其天然环境的组分分开的抗体。本披露中，在一些实施方案中，抗体可纯化至大于90％或99％的纯度。在一些实施方案中，抗体通过例如电泳(例如，SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或层析(例如，离子交换或反相HPLC)方法进行纯化和测定。
术语“可变区”或“可变域”或“可变结构域”指抗体重链和/或轻链中涉及抗体结合抗原的域。天然IgG抗体VH和VL各包含四个保守的框架区(FR)和三个互补决定区(CDR)。其中，术语“互补决定区”或“CDR”指可变结构域内主要促成与抗原结合的区域；“框架”或“FR”是指可变结构域中除CDR残基之外的可变结构域残基。VH包含3个CDR区：HCDR1、HCDR2和HCDR3；VL包含3个CDR区：LCDR1、LCDR2和LCDR3。每个VH和VL由从氨基末端排到羧基末端按以下顺序排列的三个CDR和四个FR构成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。单个VH或VL可能足以赋予抗原结合特异性。
可以通过各种公知方案来确定CDR的氨基酸序列的边界，例如：“Kabat”编号规则(参见Kabat等(1991)，“Sequences of Proteins of Immunological Interest”，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD)、“Chothia”编号规则、“ABM”编号规则、“contact”编号规则(参见Martin，ACR.Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains[J].2001)和ImMunoGenTics(IMGT)编号规则(Lefranc，M.P.等，Dev.Comp.Immunol.，27，55-77(2003)；Front Immunol.2018 Oct 16；9:2278)等；各种编号系统之间的对应关系是本领域技术人员熟知的。示例性地，如下表1中所示。
表1.CDR编号系统之间的关系
CDR IMGT Kabat AbM Chothia Contact
HCDR1 27-38 31-35 26-35 26-32 30-35
HCDR2 56-65 50-65 50-58 52-56 47-58
HCDR3 105-117 95-102 95-102 95-102 93-101
LCDR1 27-38 24-34 24-34 24-34 30-36
LCDR2 56-65 50-56 50-56 50-56 46-55
LCDR3 105-117 89-97 89-97 89-97 89-96
术语“轻链”包括可变区结构域VL及恒定区结构域CL。VL处于轻链的氨 基末端。轻链包括κ链及λ链。
术语“重链”包括可变区结构域VH及三个恒定区结构域CH1、CH2及CH3。VH处于重链的氨基末端，且CH结构域处于羧基末端，其中CH3最接近多肽的羧基末端。重链可属于任何同种型，包括IgG(包括IgG1、IgG2、IgG3及IgG4亚型)、IgA(包括IgA1及IgA2亚型)、IgM及IgE。
术语“抗体片段”指不同于完整抗体的分子，其包含完整抗体的部分，所述部分与完整抗体所结合的抗原相结合。抗体片段的包括但不限于Fv、Fab、Fab′、Fab′-SH、F(ab′) 2、单域抗体、单链Fab(scFab)、双抗体、线性抗体、单链抗体分子(例如scFv)；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。
术语“Fc区”或“片段可结晶区”用于定义抗体重链的C末端区域，包括天然序列Fc区和经改造的Fc区。在一些实施方案中，人IgG重链的Fc区定义为从Cys226位置处的氨基酸残基或从Pro230延伸至其羧基末端。抗体重链的Fc区的边界还可以变化，例如缺失Fc区的C末端赖氨酸(根据EU编号系统的残基447)或缺失Fc区的C末端甘氨酸和赖氨酸(根据EU编号系统的残基446和447)。因此，在一些实施方案中，完整抗体的组合物可以包括去除了所有K447残基和/或G446+K447残基的抗体群体。在一些实施方案中，完整抗体的组合物可以包括没有去除K447残基和/或G446+K447残基的抗体群体。在一些实施方案中，完整抗体的组合物具有带有和不带有K447残基和/或G446+K447残基的抗体混合物。用于本文所述抗体的合适天然序列Fc区包括人IgG1、IgG2(IgG2A、IgG2B)、IgG3和IgG4。除非本文中另有规定，Fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号方式依照EU编号系统，又称作EU索引，如记载于Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD，1991。
术语“人抗体”意指可变区及恒定区是人序列的抗体。该术语涵盖源自人基因但具有，例如，降低可能的免疫原性、增加亲和力、消除可能会引起不期望的折叠的半胱氨酸或糖基化位点等序列已发生改变的抗体。该术语涵盖这些在非人细胞(其可能会赋予不具人细胞特征的糖基化)中重组产生的抗体。该术语亦涵盖在含有人免疫球蛋白重链及轻链基因座的转基因小鼠中产生的抗体。人抗体的含义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
术语“亲和力成熟的”抗体指在抗体的一个或多个CDR中具有一处或多处改变、导致该抗体对抗原的亲和力与亲本抗体相比有所改进的抗体。在一些实施方案中，亲和力成熟的抗体将具有纳摩尔或甚至皮摩尔量级的对靶抗原的亲和力。亲和力成熟的抗体可通过本领域已知方法生成。Marks等，Bio/Technology10:779-783(1992)记载了通过VH和VL结构域改组进行的亲和力成熟。以下文献记载了CDR和/或框架残基的随机诱变：Barbas等，PNAS，91:3809-3813(1994)；Schier等，Gene 169:147-155(1995)；Yelton等，J.Immunol.155:1994-2004(1995)； Jackson等，J.Immunol.154(7):3310-9(1995)及Hawkins等，J.Mol.Biol.226:889-896(1992)。
术语“单克隆抗体”指基本上均质的抗体的群，即在该群中包含的抗体分子的氨基酸序列是相同的，除了可能少量存在的天然突变以外。相比之下，多克隆抗体制剂通常包含在其可变结构域具有不同氨基酸序列的多种不同抗体，其通常特异性针对不同表位。“单克隆”表示从基本上均质的抗体群体获得的抗体的特征，并且不应解释为要求通过任何特定方法来生产抗体。例如，单克隆抗体可以由Kohler等，(1975)Nature 256:495描述的杂交瘤方法制备，或者由重组DNA方法制备(参见例如美国专利号4，816，567)。或者使用Clackson等，(1991)Nature 352:624-628和Marks等，(1991)J.Mol.Biol.222:581-597中描述的技术，从噬菌体抗体文库中分离“单克隆抗体”。亦可参见Presta(2005)J.Allergy Clin.Immunol.116:731，或利用含有所有或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法制备“单克隆抗体”。
术语“抗原”是指能够由抗体选择性结合的分子或分子部分。抗原可具有一个或多个能够与不同的抗体相互作用的表位。
术语“表位”指能够与抗体特异性结合的抗原上的区域(area或region)。表位可以由连续氨基酸串(线性表位)形成或包含非连续氨基酸(构象表位)，例如因抗原的折叠(即通过抗原的三级折叠)而变成空间接近。构象表位和线性表位的差别在于：在变性溶剂的存在下，检测不到抗体对构象表位的结合。表位包含处于独特空间构象的至少3，至少4，至少5，至少6，至少7，或8-10个氨基酸。
筛选结合特定表位的抗体(即那些结合相同表位的抗体)可以使用本领域公知方法来进行，包括但不限于：丙氨酸扫描、肽印迹(见Meth.Mol.Biol.248(2004)443-463)、肽切割分析、表位切除、表位提取、抗原的化学修饰(见Prot.Sci.9(2000)487-496)和交叉阻断(见“Antibodies”，Harlow and Lane(Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harb.，NY))。
与参照抗体“结合相同表位的抗体”或与参照抗体“竞争结合的抗体”指在竞争测定法中，将参照抗体对抗原的结合阻断50％或更多的抗体，或其对抗原的结合被参照抗体阻断50％或更多的抗体。还例如，为了测定待测抗体是否与参照抗体结合相同表位，在饱和条件下容许参照抗体结合抗原。在去除过量的参照抗体后，评估待测抗体结合抗原的能力。为了确认待测抗体是否结合相同表位或仅仅受到空间原因阻碍结合，可以使用常规实验(例如，肽突变和使用ELISA、RIA、表面等离子共振、流式细胞术或本领域可获得的任何其它定量或定性抗体结合测定的结合分析)。这种测定法应当以两种设置进行，即两种抗体均作为饱和抗体。如果在两种设置中，均只有第一(饱和)抗体能够结合抗原，那么可以得出结论，该待测抗体和参照抗体竞争结合该抗原。
在一些实施方案中，如在竞争性结合测定中所测量的(参见例如，Junghans等，Cancer Res.50(1990)1495-1502)，如果一个抗体的1倍、5倍、10倍、20倍 或100倍过量抑制另一个抗体的结合至少50％、至少75％、至少90％或甚至99％或更多，则认为两个抗体结合相同或重叠的表位。
在一些实施方案中，对于抗原中那些能减少或消除一种抗体结合的氨基酸突变，如果其基本上全部能减少或消除另一种抗体的结合，则认为两种抗体结合“相同表位”；如果其仅有一部分能减少或消除另一种抗体的结合，则认为两种抗体具有“重叠表位”。
术语“亲和力”是指分子(例如，抗体)的单个结合部位与其结合配体(例如，抗原)之间非共价相互作用的总体的强度。除非另外指明，如本文所用，结合“亲和力”是指内部结合亲和力，其反映出结合对(例如，抗体与抗原)的成员之间1:1相互作用。分子X对其配体Y的亲和力通常可以由平衡解离常数(KD)表示。亲和力可以通过本领域已知的常规方法(包括本文所述的那些方法)测量。
如本文所使用的，术语“kassoc”或“ka”指特定抗体-抗原相互作用的缔合速率，术语“kdis”或“kd”指特定抗体-抗原相互作用的解离速率。术语“KD”指平衡解离常数，其获得自kd与ka的比率(即kd/ka)并且表示为摩尔浓度(M)。可以使用本领域公知的方法测定抗体的KD值。例如，使用生物传感系统例如系统测量表面等离子体共振，或通过溶液平衡滴定法(SET)测量溶液中的亲和力。
术语“特异性地结合”、“特异性结合”或“结合”是指抗体以比针对其他抗原或表位更高的亲和力结合至某个抗原或其表位。通常，抗体以约1×10 -7M或更小(例如约1×10 -8M或更小、约1×10 -9M或更小)的平衡解离常数(KD)结合抗原或其表位。在一些实施方案中，抗体与抗原结合的KD为该抗体结合至非特异性抗原(例如BSA、酪蛋白)的KD的10％，或更少(例如1％)。可使用本领域已知的方法来测量KD，例如通过
Figure PCTCN2022142644-appb-000006
表面等离子体共振测定法测量。然而，特异性结合至抗原或其表位的抗体可能对其它相关的抗原具有交叉反应性，例如，对来自其它物种(同源)(诸如人或猴，例如食蟹猕猴(Macaca fascicularis)(cynomolgus，cyno)、黑猩猩(Pan troglodytes)(chimpanzee，chimp)或狨猴(Callithrix jacchus)(commonmarmoset，marmoset))的相应抗原具有交叉反应性。
术语“抗ROR1抗体”和“结合ROR1的抗体”是指能够以足够的亲和力结合ROR1的抗体。在某些实施方案中，与ROR1结合的抗体具有以下平衡解离常数(KD)<约1μM、<约100nM、<约10nM、<约1nM、<约0.1nM、<约0.01nM或<约0.001nM(例如10 -8M或更小、例如10 -8M至10 -9M、例如10 -9M或更小)。在某些实施例中，抗ROR1抗体结合来自不同物种的ROR1中保守的ROR1表位。
术语“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”是指一种细胞毒性形式，其中分泌的Ig结合到某些细胞毒性细胞(例如，自然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)上的Fc受体(FcR)，使这些细胞毒性效应细胞与带有抗原的靶细胞特异性结合，随后用细胞毒素杀死靶细胞。抗体“武装”细胞毒性细胞，并且是此 类杀伤作用所必需的。介导ADCC的主要细胞NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血细胞上的FcR表达总结在Ravetch和Kinet，《免疫学年评》(Annu.Rev.Immunol.)9:457-92(1991)的第464页的表3中。为评估目标分子的ADCC活性，可进行体外ADCC分析，分析方法例如美国专利No.5500362或5821337中所述。用于此类测定的有用效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。可选地，目的抗体的ADCC活性也可以在体内评估，例如，在动物模型(诸如在Clynes等人，(USA)95:652-656(1998)中所公开的)中评估。
术语“抗体依赖性细胞吞噬作用”(“ADCP”)是指通过吞噬细胞(诸如巨噬细胞或树突状细胞)的内化作用消除抗体包被的靶细胞的机制。
术语“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”是指诱导细胞死亡的机制，其中靶标结合抗体的Fc效应子结构域结合并活化补体成分C1q，继而激活补体级联，导致靶细胞死亡。补体的活化也可导致补体成分沉积在靶细胞表面上，这些补体成分通过结合白细胞上的补体受体(例如，CR3)来促进CDC。
术语“核酸”与术语“多核苷酸”在本文中可互换使用，并且是指呈单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。所述术语涵盖含有已知核苷酸类似物或修饰的骨架残基或连接的核酸，所述核酸是合成的、天然存在的和非天然存在的，具有与参考核酸相似的结合特性，并且以类似于参考核苷酸的方式代谢。此类类似物的示例包括但不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性-甲基膦酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)。“分离的”核酸指已经与其天然环境的组分分开的核酸分子。分离的核酸包括在下述细胞中含有的核酸分子，所述细胞通常含有该核酸分子，但该核酸分子存在于染色体外或存在于不同于其天然染色体位置的染色体位置处。“编码抗ROR1抗体的核酸”指编码抗体重链和轻链(或其片段)的一个或更多个核酸分子。
除非另有说明，否则特定的核酸序列还隐含地涵盖其保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)和互补序列以及明确指明的序列。具体地，如下详述，简并密码子取代可以通过产生如下序列而获得，在这些序列中，一个或多个所选的(或全部)密码子的第三位被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代(Batzer等，Nucleic Acid Res.19:5081，1991；Ohtsuka等，J.Biol.Chem.260:2605-2608，1985；和Rossolini等，Mol.Cell.Probes8:91-98，1994)。
术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学模拟物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。
术语“裸抗体”指未与异源模块(例如细胞毒性模块)或放射性标记物缀合的抗体。裸抗体可以存在于药学制剂中。
术语“同一性”、“序列同一性”或“氨基酸序列同一性”是指，当对两条序列进行最佳比对时(必要时引入间隙，以获取最大序列同一性百分比，且不将任何保守性取代视为序列同一性的一部分)，两条序列的氨基酸/核酸在等价位置相同的程度(百分比)。为测定序列同一性百分比，比对可以通过属于本领域公知的多种方法来实现，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign(DNASTAR)等。本领域技术人员可确定适用于测量比对的参数，包括在所比较的序列全长上达成最大比对所需的任何算法。
术语“保守修饰的变体”或“保守性取代”指使用具有相似特征(例如，电荷、侧链尺寸、亲水性/疏水性、骨架构型和刚性等)的其他氨基酸置换蛋白中的氨基酸，使得通常可以做出这样的变化而不改变蛋白的生物活性。本领域技术人员知晓，在通常情况下，在多肽的非必需区域中的单氨基酸置换基本上不改变生物活性(参见例如，Watson等，(1987)Molecular Biology of the Gene，The Benjamin/Cummings Pub.Co.，p.224(4th Ed.))。术语“保守修饰的变体”当适用核酸序列时，保守修饰的变体是指那些编码相同或基本上相同的氨基酸序列的核酸，或在该核酸不编码氨基酸序列的情况下，是指基本相同的序列。由于遗传密码的简并性，任何给定的蛋白质均可以由多个功能相同的核酸编码。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此，在密码子指定丙氨酸的每个位置，该密码子可以改变为任何所述相应密码子而不改变编码的多肽。此类核酸变异是“沉默变异”，它们是保守修饰变异中的一种。本文中编码多肽的每个核酸序列也描述了核酸的每种可能的沉默变异。技术人员将认识到，核酸中的每个密码子(除了AUG--通常是甲硫氨酸的唯一密码子；和TGG--通常是色氨酸的唯一密码子)均可以被修饰以产生功能相同的分子。因此，在每个所述序列中均隐含了编码多肽的核酸的每一种沉默变异。
术语“表达载体”或“表达构建体”是指适用于对宿主细胞进行转化，且含有指导及/或控制与其可操作地连接的一个或多个异源编码区的表达的核酸序列的载体。表达构建体可以包括但不限于影响或控制转录、翻译且在存在内含子时影响与其可操作地连接的编码区的RNA剪接的序列。
如本文中所使用，“可操作地连接”意指该术语所适用的组分允许其在适合条件下执行其固有功能的关系。举例而言，表达载体中与蛋白质编码序列“可操作地连接”的控制序列是与其连结，从而在与该控制序列的转录活性兼容的条件下，达成该蛋白质编码序列的表达。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且指已经导入外源核酸的细胞，包括此类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“经转化的细胞”，其包括原代的经转化的细胞及自其衍生的后代，而不考虑传代的次数。后代在核酸内容物上可以与亲本细胞不完全相同，可以含有突变。该术语包括这样的突变体后代，其与初始转化细胞中筛选或选择的细胞具有相同功能或生物学活 性。宿主细胞包括原核和真核宿主细胞，其中真核宿主细胞包括但不限于哺乳动物细胞、昆虫细胞系植物细胞和真菌细胞。示例性的宿主细胞如下：中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NSO、SP2细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如，Hep G2)、A549细胞、3T3细胞和HEK-293细胞、巴氏毕赤酵母(Pichiapastoris)、芬兰毕赤酵母(Pichia finlandica)、白色念珠菌(Candida albicans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、里氏木霉(Trichoderma reesei)。
如在本申请中所使用的，表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可以互换使用，包括此类细胞的后代。因而，词语“转化体”和“转化的细胞”包括原代受试者细胞和来源于其的培养物，而与传代的次数无关。还应理解的是，由于有意或无意的突变，使得并非所有子代均具有完全相同的DNA内容物。包括与筛选出其的原始转化细胞具有相同功能或生物活性的突变子代。
现有技术中熟知生产、纯化抗体和抗原结合片段的方法，如冷泉港的抗体实验技术指南，5-8章和15章。公开所述的抗体或抗原结合片段用基因工程方法在非人源的CDR区加上一个或更多个人源FR区。人FR种系序列可以通过比对IMGT人类抗体可变区种系基因数据库和MOE软件，从ImMunoGeneTics(IMGT)的网站得到，或者从免疫球蛋白杂志，2001ISBN012441351上获得。
本披露工程化的抗体或抗原结合片段可用常规方法制备和纯化。比如，编码重链和轻链的cDNA序列，可以克隆并重组至表达载体。重组的免疫球蛋白表达载体可以稳定地转染宿主细胞。作为一种更推荐的现有技术，哺乳动物类表达系统会导致抗体的糖基化，特别是在Fc区的N端位点。通过表达与人ROR1特异性结合的抗体得到稳定的克隆。阳性的克隆在生物反应器的培养基中扩大培养以生产抗体。分泌了抗体的培养液可以用常规技术纯化。比如，用A或G Sepharose FF柱进行纯化。洗去非特异性结合的组分。再用pH梯度法洗脱结合的抗体，用SDS-PAGE检测抗体片段，收集。抗体可用常规方法进行过滤浓缩。可溶的混合物和多聚体，也可以用常规方法去除，比如分子筛、离子交换。得到的产物需立即冷冻，如-70℃，或者冻干。
“分离的”指脱离其天然存在的状态，并且在这种情况下意味着在指定的分子基本上不含其他生物分子，例如核酸、蛋白质、脂质、碳水化合物或其他材料，例如细胞碎片和生长培养基。通常，术语“分离的”并不意图指完全不存在这些材料或不存在水、缓冲液或盐，除非它们以显著干扰如本文所述的化合物的实验或治疗用途的量存在。
术语“药物”是指可以改变机体的生理功能及病理状态，可用以预防，治疗疾病的化学物质。药物包括细胞毒性药物。药物和毒物之间并无严格界限，毒物是指在较小剂量即对机体产生毒害作用，损害人体健康的化学物质，任何药物剂量过大都可产生毒性反应。
细胞毒性药物，即抑制或防止细胞的功能和/或引起细胞死亡或破坏的物质。细胞毒性药物原则上在足够高的浓度下都可以杀死肿瘤细胞，但是由于缺乏特异性，在杀伤肿瘤细胞的同时，也会导致正常细胞的凋亡，导致严重的副作用。细胞毒性药物包括毒素，如细菌、真菌、植物或动物来源的小分子毒素或酶活性毒素，放射性同位素(例如At 211、I 131、I 125、Y 90、Re 186、Re 188、Sm 153、Bi 212、P 32和Lu的放射性同位素)，化疗药物，抗生素和核溶酶。
“抗体药物偶联物(antibody drug conjugate，ADC)或免疫偶联物”是把抗体通过连接单元与具有生物活性或具有细胞杀伤活性的药物相连。
本披露所描述的抗体或抗体片段可以通过任何方式偶联至效应分子。举例来说，抗体或抗体片段可以通过化学或重组方式附接至细胞毒性药物。制备融合物或偶联物的化学方式在本领域中是已知的并且可以用于制备免疫偶联物。用于偶联抗体或抗体片段和药物的方法必须能够连接抗体与药物而不会干扰抗体或抗体片段结合至标靶分子的能力。
在一个实施方案中，抗体和细胞毒性药物都是蛋白质并且可以使用本领域中熟知的技术偶联。本领域中所公开的数百种交联剂，其可以偶联两种蛋白质。交联剂一般基于在抗体或细胞毒性药物上可用或插入的反应官能团来选择。另外，如果不存在反应基团，那么可以使用光可活化交联剂。在某些情况下，可能需要在抗体与细胞毒性药物之间包括间隔子。本领域中已知的交联剂包括同型双功能剂：戊二醛、二甲基己二亚酰胺化物和双(重氮基联苯胺)，以及异型双功能剂：间马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺和磺基-间马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺。
可以用于使效应分子偶合至抗体片段的交联剂包括例如TPCH(S-(2-硫代吡啶基)-L-半胱氨酸酰肼)和TPMPH(S-(2-硫代吡啶基)巯基-丙酰肼)。TPCH和TPMPH在先前已经通过温和高碘酸盐处理而氧化的糖蛋白的碳水化合物部分反应，由此在交联剂的酰肼部分与高碘酸盐产生的醛之间形成腙键。异型双功能交联剂GMBS(N-(γ-马来酰亚胺基丁酰氧基)-琥珀酰亚胺)和SMCC(琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基-甲基)环己烷)与伯胺反应，由此将马来酰亚胺基引入组分上。这个马来酰亚胺基随后可以与另一种组分上的可以由交联剂引入的硫氢基反应，由此在组分之间形成稳定的硫醚键。如果组分之间的位阻干扰任一种组分的活性，那么可以使用交联剂，将长的间隔臂引入组分之间，诸如3-(2-吡啶基二硫基)丙酸n-琥珀酰亚胺酯(SPDP)。因此，存在许多适合的交联剂，其可以被使用并且各自取决于其对最佳免疫偶联物产量的影响来选择。
载药量，也称药物抗体比例(Drug-to-Antibody Ratio，DAR)，即ADC中每个抗体所偶联的药物的平均数量。其可在例如每个抗体偶联约1至约10个药物的范围内。在某些实施例中，在每个抗体偶联约1至约8个药物的范围内，优选自2-8，2-7，2-6，2-5，2-4，3-4，3-5，5-6，5-7，5-8和6-8的范围。示例性地，载药量 可以为1，2，3，4，5，6，7，8，9，10中的一个或多个计算所得的均值。本披露的ADC通式包括与前述一定范围内的免疫偶联物的集合。在本披露的实施方案中，载药量可表示为n，是小数或整数。可用常规方法如UV/可见光光谱法，质谱，ELISA试验和HPLC测定载药量。
术语“接头单元”或“连接片段”或“连接单元”是指一端与抗体或其抗原结合片段连接而另一端与药物相连的化学结构片段或键，也可以连接其他接头后再与药物相连。
术语接头可以包含一种或多种接头构件。示例性的接头构件包括6-马来酰亚氨基己酰基(“MC”)、马来酰亚氨基丙酰基(“MP”)、缬氨酸-瓜氨酸(“val-cit”或“vc”)、丙氨酸-苯丙氨酸(“ala-phe”)、对氨基苄氧羰基(“PAB”)、N-琥珀酰亚氨基4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯(“SPP”)、N-琥珀酰亚氨基4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1羧酸酯(“SMCC”，在本文中也称作“MCC”)和N-琥珀酰亚氨基(4-碘-乙酰基)氨基苯甲酸酯(“SIAB”)。接头可以包括延伸物、间隔物和氨基酸单元，可以通过本领域已知方法合成，诸如US2005-0238649A1中所记载的。接头可以是便于在细胞中释放药物的“可切割接头”。例如，可使用酸不稳定接头(例如腙)、蛋白酶敏感(例如肽酶敏感)接头、光不稳定接头、二甲基接头、或含二硫化物接头(Chari等，Cancer Research 52:127-131(1992)；美国专利No 5208020)。
接头组件包括但不限于：
MC＝6-马来酰亚氨基己酰基，结构如下：
Figure PCTCN2022142644-appb-000007
Val-Cit或“vc”＝缬氨酸-瓜氨酸(蛋白酶可切割接头中的示例二肽)，
瓜氨酸＝2-氨基-5-脲基戊酸，
PAB基团为对氨基苄氧羰基(“自我牺牲”接头组件的示例)，其结构如下：
Figure PCTCN2022142644-appb-000008
Me-Val-Cit＝N-甲基-缬氨酸-瓜氨酸(其中接头肽键已经修饰以防止其受到组织蛋白酶B的切割)，
MC(PEG)6-OH＝马来酰亚氨基己酰基-聚乙二醇(可附着于抗体半胱氨酸)，
SPP＝N-琥珀酰亚氨基4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯，
SPDP＝N-琥珀酰亚氨基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯，
SMCC＝琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸酯，
IT＝亚氨基硫烷。
本披露的一个实施方案中，细胞毒性药物通过连接单元偶联在抗体上。
可以用以下非限制性方法控制偶联物的载药量，包括：
(1)控制药物连接子片段和单抗的摩尔比，
(2)控制反应时间和温度，
(3)选择不同的反应试剂。
术语“烷基”指饱和的直链或支链的脂肪族烃基，其具有1至20个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个)碳原子(即C 1-20烷基)。所述烷基优选具有1至12个碳原子的烷基(即C 1-12烷基)，更优选具有1至6个碳原子的烷基(即C 1-6烷基)。非限制性的实例包括：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、正戊基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、2,2-二甲基丙基、1-乙基丙基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、正己基、1-乙基-2-甲基丙基、1,1,2-三甲基丙基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2-乙基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、2,3-二甲基丁基、正庚基、2-甲基己基、3-甲基己基、4-甲基己基、5-甲基己基、2,3-二甲基戊基、2,4-二甲基戊基、2,2-二甲基戊基、3,3-二甲基戊基、2-乙基戊基、3-乙基戊基、正辛基、2,3-二甲基己基、2,4-二甲基己基、2,5-二甲基己基、2,2-二甲基己基、3,3-二甲基己基、4,4-二甲基己基、2-乙基己基、3-乙基己基、4-乙基己基、2-甲基-2-乙基戊基、2-甲基-3-乙基戊基、正壬基、2-甲基-2-乙基己基、2-甲基-3-乙基己基、2,2-二乙基戊基、正癸基、3,3-二乙基己基、2,2-二乙基己基，及其各种支链异构体等。烷基可以是取代的或非取代的，当被取代时，其可以在任何可使用的连接点被取代，取代基优选选自D原子、卤素、烷氧基、卤代烷基、卤代烷氧基、环烷基氧基、杂环基氧基、羟基、羟烷基、氰基、氨基、硝基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基中的一个或多个。
术语“环烷基”指饱和或部分不饱和的单环全碳环(即单环环烷基)或多环系统(即多环环烷基)，其具有3至20个(例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个)环原子(即3至20元环烷基)。所述环烷基优选具有3至12个环原子的环烷基(即3至12元环烷基)，更优选具有3至8个环原子的环烷基(即3至8元环烷基)，最优选具有3至6个环原子的环烷基(即3至6元环烷基)或具有5个环原子的环烷基(即5元环烷基)。
所述的单环环烷基，非限制性的实例包括：环丙基、环丁基、环戊基、环戊烯基、环己基、环己烯基、环己二烯基、环庚基、环庚三烯基和环辛基等。
术语“卤代烷基”指烷基上的氢被一个或多个卤素取代，其中烷基如上所定义。
术语“氘代烷基”指烷基上的氢被一个或多个氘原子取代，其中烷基如上所定义。
术语“卤代烷氧基”指烷氧基上的氢被一个或多个卤素取代，其中烷氧基如 上所定义。
术语“羟烷基”指烷基被一个或多个羟基取代，其中烷基如上所定义。
术语“卤素”指氟、氯、溴或碘。
术语“羟基”指-OH。
术语“氨基”指-NH 2。
术语“氰基”指-CN。
“任选地”或“任选”是指意味着随后所描述的事件或环境可以但不必发生，该说明包括该事件或环境发生或不发生的场合。例如“任选的被卤素或者氰基取代的C 1-6烷基”是指卤素或者氰基可以但不必须存在，该说明包括烷基被卤素或者氰基取代的情形和烷基不被卤素和氰基取代的情形。
“取代的”指基团中的一个或多个氢原子，优选为1至6个，更优选为1至3个氢原子彼此独立地被相应数目的取代基取代。本领域技术人员能够在不付出过多努力的情况下(通过实验或理论)确定可能或不可能的取代。例如，具有游离氢的氨基或羟基与具有不饱和(如烯属)键的碳原子结合时可能是不稳定的。
“可药用盐”是指本披露化合物的盐，可选自无机盐或有机盐。这类盐用于哺乳动物体内时具有安全性和有效性，且具有应有的生物活性。可以在化合物的最终分离和纯化过程中，或通过使合适的基团与合适的碱或酸反应来单独制备盐。通常用于形成药学上可接受的盐的碱包括无机碱，例如氢氧化钠和氢氧化钾，以及有机碱，例如氨。通常用于形成药学上可接受的盐的酸包括无机酸以及有机酸。
本披露中的免疫偶联物浓度以蛋白的浓度计，即以免疫偶联物中抗体部分的浓度计。
针对药物或药理学活性剂而言，术语“治疗有效量”是指无毒的但能达到预期效果的药物或药剂的足够用量。有效量的确定因人而异，取决于受试者的年龄和一般情况，也取决于具体的活性物质，个案中合适的有效量可以由本领域技术人员根据常规试验确定。
本披露的化合物和中间体还可以以不同的互变异构体形式存在，并且所有这样的形式包含于本披露的范围内。术语“互变异构体”或“互变异构体形式”是指可经由低能垒互变的不同能量的结构异构体。例如，质子互变异构体(也称为质子转移互变异构体)包括经由质子迁移的互变，如酮-烯醇及亚胺-烯胺、内酰胺-内酰亚胺异构化。内酰胺-内酰亚胺平衡示例是在如下所示的A和B之间。
Figure PCTCN2022142644-appb-000009
本披露中的所有化合物可以被画成A型或B型。所有的互变异构形式在本披 露的范围内。化合物的命名不排除任何互变异构体。
“前药”是指可以在生理条件下，例如通过在血液中水解，在体内转化以产生活性原药化合物。
本文所用的术语“药学上可接受的”是指这些化合物、材料、组合物和/或剂型，在合理的医学判断范围内，适用于与受试者组织接触而没有过度毒性、刺激性、过敏反应或其他问题或并发症，具有合理的获益/风险比，并且对预期的用途有效。
常规的药物组合物的制备见中国药典。
本文所使用的，单数形式的“一个”、“一种”和“该”包括复数引用，反之亦然，除非上下文另外明确指出。
“约”是指处于如本领域的普通技术人员所确定的特定值的可接受误差范围之内，其将部分取决于所述值是如何测量或测定的，即所述测量系统的限制。在特定测定、结果或实施方案的上下文中，除非实施例或说明书其它地方内另有明确说明，否则“约”意指在根据本领域惯例的一个标准偏差之内。
术语“药学上可接受的载体”或“可药用的载体”指药学配制剂中与活性成分不同的，且对受试者无毒的成分。药学上可接受的载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
术语“包装插页”用于指通常包括在治疗产品的商业包装中的说明书，其包含关于适应症、用法、剂量、施用、组合疗法、禁忌症的信息和/或关于使用这样的治疗产品的警告。
术语“受试者”或“个体”包括人类和非人类动物。非人动物包括所有脊椎动物(例如哺乳动物和非哺乳动物)、非人灵长类(例如，食蟹猴)、绵羊、狗、牛、鸡、两栖动物和爬行动物。除非指出时，否则所述术语“患者”或“受试者”在本文中可互换地使用。如本文所使用的，术语“食蟹猴(cyno)”或“食蟹猴(cynomolgus)”是指食蟹猴(Macaca fascicularis)。在某些实施方案中，个体或受试者是人。
术语“赋形剂”是在药物制剂中除活性成分以外的附加物，也可称为辅料。如片剂中的粘合剂、填充剂、崩解剂、润滑剂；半固体制剂软膏剂、霜剂中的基质部分；液体制剂中的防腐剂、抗氧剂、矫味剂、芳香剂、助溶剂、乳化剂、增溶剂、渗透压调节剂、着色剂等均可称为赋形剂。
术语“稀释剂”又称填充剂，其主要用途是增加片剂的重量和体积。稀释剂的加入不仅保证一定的体积大小，而且减少主要成分的剂量偏差，改善药物的压缩成型性等。当片剂的药物含有油性组分时，需加入吸收剂吸收油性物，使保持“干燥”状态，以利于制成片剂。如淀粉、乳糖、钙的无机盐、微晶纤维素等。
术语“药物组合物”表示含有一种或多种本文所述化合物或其生理学上/可药用的盐或前体药物与其他化学组分的混合物，以及其他组分例如生理学/可药用的载体和赋形剂。药物组合物的目的是促进对生物体的给药，利于活性成分的吸收 进而发挥生物活性。
药物组合物可以是无菌注射水溶液形式。可在使用的可接受的溶媒和溶剂中有水、林格氏液和等渗氯化钠溶液。无菌注射制剂可以是其中活性成分溶于油相的无菌注射水包油微乳。例如将活性成分溶于大豆油和卵磷脂的混合物中。然后将油溶液加入水和甘油的混合物中处理形成微乳。可通过局部大量注射，将注射液或微乳注入受试者的血流中。或者，最好按可保持本披露化合物恒定循环浓度的方式给予溶液和微乳。为保持这种恒定浓度，可使用连续静脉内递药装置。这种装置的示例是Deltec CADD-PLUS.TM.5400型静脉注射泵。
药物组合物可以是用于肌内和皮下给药的无菌注射水或油混悬液的形式。可按已知技术，用上述那些适宜的分散剂或湿润剂和悬浮剂配制该混悬液。无菌注射制剂也可以是在无毒肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中制备的无菌注射溶液或混悬液，例如1，3-丁二醇中制备的溶液。此外，可方便地用无菌固定油作为溶剂或悬浮介质。为此目的，可使用包括合成甘油单酯或二酯在内的任何调和固定油。此外，脂肪酸例如油酸也可以制备注射剂。
“施用”或“给予”，当其应用于动物、人、实验受试者、细胞、组织、器官或生物流体时，是指外源性药物、治疗剂、诊断剂或组合物与动物、人、受试者、细胞、组织、器官或生物流体的接触。
术语“样本”是指从受试者分离的流体、细胞、或组织的采集物，以及存在于受试者体内的流体、细胞或组织。示例性样本为生物流体，诸如血液、血清和浆膜液、血浆、淋巴液、尿液、唾液、囊液、泪液、排泄物、痰、分泌组织和器官的粘膜分泌物、阴道分泌物、腹水、胸膜、心包、腹膜、腹腔和其它体腔的流体、由支气管灌洗液收集的流体、滑液、与受试者或生物来源接触的液体溶液，例如细胞和器官培养基(包括细胞或器官条件培养基)、灌洗液等，组织活检样本、细针穿刺、手术切除的组织、器官培养物或细胞培养物。
术语“药学上可接受的盐”或“可药用盐”是指本披露免疫偶联物的盐，或本披露中所述的化合物的盐，这类盐用于哺乳动物体内时具有安全性和有效性，且具有应有的生物活性，本披露抗体药物偶联物至少含有一个氨基，因此可以与酸形成盐。
“治疗(treatment或treat)/处理”(及其语法变型)指试图改变所治疗个体的天然过程的临床干预，并且可以为了预防或者在临床病理学的过程期间实施。治疗的期望效果包括但不限于预防疾病的发生或再发生，减轻症状，减轻/减少疾病的任何直接或间接病理后果，预防转移，降低疾病进展速率，改善或减轻疾病状态，和消退或改善的预后。在一些实施方案中，使用本披露的抗体来延迟疾病的形成或减缓疾病的进展。
“有效量”一般是足以降低症状的严重程度及/或频率、消除这些症状及/或潜在病因、预防症状及/或其潜在病因出现及/或改良或改善由疾病状态引起或与其相关 的损伤(例如肺病)的量。在一些实施例中，有效量是治疗有效量或预防有效量。“治疗有效量”是足以治疗疾病状态或症状、尤其与该疾病状态相关的状态或症状，或者以其他方式预防、阻碍、延迟或逆转该疾病状态或以任何方式与该疾病相关的任何其他不理想症状的进展的量。“预防有效量”是当给予受试者时将具有预定预防效应，例如预防或延迟该疾病状态的发作(或复发)，或者降低该疾病状态或相关症状的发作(或复发)可能性的量。完全治疗或预防未必在给予一个剂量之后便发生，可能在给予一系列剂量之后发生。因而，治疗或预防有效量可以一次或多次给予的方式给予。“治疗有效量”和“预防有效量”可取决于以下因素变化：诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重，以及治疗剂或治疗剂组合在个体中引发期望的应答的能力。有效治疗剂或治疗剂组合的示例性指标包括例如受试者改善的健康状况。
在以上说明书中提出了本披露一种或多种实施方案的细节。虽然可使用与本文所述类似或相同的任何方法和材料来实施或测试本披露，但是以下描述优选的方法和材料。通过说明书和权利要求书，本披露的其他特点、目的和优点将是显而易见的。在说明书和权利要求书中，除非上下文中有清楚的另外指明，单数形式包括复数指代物的情况。除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语都具有本披露所属领域普通技术人员所理解的一般含义。说明书中引用的所有专利和出版物都通过引用纳入。提出以下实施例是为了更全面地说明本披露的优选实施方案。这些实施例不应以任何方式理解为限制本披露的范围，本披露的范围由权利要求书限定。
具体实施方式
以下结合实施例用于进一步描述本发明，但这些实施例并非限制本发明的范围。
本披露实施例或测试例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照原料或商品制造厂商所建议的条件。参见Sambrook等，分子克隆，实验室手册，冷泉港实验室；当代分子生物学方法，Ausubel等著，Greene出版协会，Wiley Interscience，NY。未注明具体来源的试剂，为市场购买的常规试剂。
I.抗体实施例
实施例1：ROR1高表达细胞株构建
将PBABE-ROR1慢病毒表达载体质粒与pVSV-G、pGag-pol慢病毒系统包装载体用Lipofectamine 3000(ThermoFisher,L3000001)转染试剂转染至病毒包装细胞293T(中国科学院细胞库，SCSP-502)中，收集含有病毒的培养基上清，过滤并进行超高速离心，使用浓缩后的病毒感染中国仓鼠卵巢细胞CHO-K1(中国科学院细胞库，SCSP-507)，经嘌呤霉素筛选两至三周，再进行FACS单细胞分选。
通过FACS检测慢病毒感染的CHO-K1细胞表面的ROR1表达，挑选出ROR1表达量高的单克隆细胞株并命名为ROR1-CHO-K1。将挑选出的单克隆细胞株扩大培养，冻存备库以便后续实验。
人ROR1氨基酸序列(UniProtKB-Q01973)
Figure PCTCN2022142644-appb-000010
实施例2：抗人ROR1单克隆抗体的筛选
用全人源半合成噬菌体抗体库和抗原生物素化的人ROR1(恺佧生物科技有限公司，货号：ROR-HM401B)，经过三轮淘选后，采用ELISA方法进行噬菌体检测，获得阳性克隆。将阳性克隆测序，获得序列后，将阳性克隆序列插入蛋白表达载体Phr-IgG中，并在HEK293和Expi-CHO-S上进行表达。纯化后进行FACS和内吞活性验证实验，获得ROR1全人源抗体分子347。
全人源ROR1抗体分子347重链可变区：
Figure PCTCN2022142644-appb-000011
全人源ROR1抗体分子347轻链可变区：
Figure PCTCN2022142644-appb-000012
Figure PCTCN2022142644-appb-000013
以下为本披露抗ROR1抗体347按Kabat编号规则确定的CDR区：
表2-1.抗ROR1抗体347的Kabat编号CDR区
抗体347 序列 序号
HCDR1 DYYIS SEQ ID NO：4
HCDR2 GINAGNGNTNYAQKFQG SEQ ID NO：5
HCDR3 PGWDVFDI SEQ ID NO：6
LCDR1 QASQDISNYLN SEQ ID NO：7
LCDR2 DASNLET SEQ ID NO：8
LCDR3 QQHEDLPIT SEQ ID NO：9
本披露抗ROR1抗体347按Chothia规则和按IMGT规则编号确定的CDR区：
表2-2.抗ROR1抗体347按Chothia规则和按IMGT规则编号确定的CDR区
Figure PCTCN2022142644-appb-000014
上述抗ROR1抗体，可以进一步包含抗体重链恒定区和轻链恒定区；所述重链恒定区可以选自人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4恒定区，所述轻链恒定区可选自人抗体κ和λ链恒定区。本披露中，所述抗体包含序列如SEQ ID NO：10所示的重链恒定区，和序列如SEQ ID NO：11所示的轻链恒定区：
人IgG1的重链恒定区：
Figure PCTCN2022142644-appb-000015
人κ轻链恒定区：
Figure PCTCN2022142644-appb-000016
Figure PCTCN2022142644-appb-000017
本披露抗ROR1抗体347序列：
全人源ROR1抗体347重链：
Figure PCTCN2022142644-appb-000018
全人源ROR1抗体347轻链：
Figure PCTCN2022142644-appb-000019
本披露中使用WO2018237335中的抗ROR1抗体Ab1作为阳性对照，其序列分别如下所示：
Ab1重链：
Figure PCTCN2022142644-appb-000020
Ab1轻链：
Figure PCTCN2022142644-appb-000021
Figure PCTCN2022142644-appb-000022
II.ADC实施例
ADC的DAR值测定
本披露的ADC的DAR值计算方法采用了RP-HPLC(反相高效液相色谱)，具体如下：
1、测定方法：
在裸抗体和供测试ADC样品(浓度为1mg/mL)中，加入4μL DDT(sigma)还原，37℃水浴1小时，结束后取出到内插管中。使用高效液相色谱仪Agilent 1200进行检测，色谱柱选用Agilent PLRP-S 1000A 8μm 4.6*250mm，柱温：80℃；DAD检测器波长280nm；流速1mL/min；进样量为40μL；之后通过样品与裸抗体的谱图比对，区分出轻重链的位置，然后对检测样品的谱图进行积分，计算DAR值。
2、溶液配制
1)0.25M DTT溶液：
配制示例：取DTT 5.78mg，加入150μL纯化水充分溶解后，配得0.25M DTT溶液，-20℃保存。
2)流动相A(0.1％TFA水溶液)：
配制示例：量筒量取1000mL纯化水，加入1mL TFA(sigma)，充分混匀后使用，2-8℃保存14天。
3)流动相B(0.1％TFA乙腈溶液)：
配制示例：量筒量取1000mL乙腈，加入1mLTFA，充分混匀后使用，2-8℃保存14天。
3、数据分析
通过样品与裸抗体的谱图比对，区分出轻重链的位置，然后对检测样品的谱图进行积分，计算出DAR值。
计算公式如下：
Figure PCTCN2022142644-appb-000023
LC峰面积总和＝LC峰面积+LC+1峰面积
HC峰面积总和＝HC峰面积+HC+1峰面积+HC+2峰面积+HC+3峰面积
LC DAR＝Σ(连接药物数*峰面积百分比)/LC峰面积总和
HC DAR＝Σ(连接药物数*峰面积百分比)/HC峰面积总和
DAR＝LC DAR+HC DAR。
实施例3：制备ADC-1
Figure PCTCN2022142644-appb-000024
在37℃条件下，向抗体347的PBS缓冲水溶液(pH＝6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液；10.0mg/mL，3.14mL，212nmol)加入配置好的三(2-羧乙基)膦(TCEP)盐酸盐的水溶液(10mM，55.2μL，552nmol)，置于水浴振荡器，于37℃下振荡反应3小时，停止反应。将反应液用水浴降温至25℃。
将化合物D1(瀚香生物科技，CAS:646502-53-6,2.92mg，2218nmol)溶解于140μL DMSO中，加入到上述反应液中，置于水浴振荡器，于25℃下振荡反应3小时，停止反应。将反应液用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH为6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液，含0.001M的EDTA)，得到标题产物ADC-1的PBS缓冲液(2.25mg/mL，13.5mL)，于4℃冷藏储存。
RP-HPLC计算载药量平均值：n＝4.04。
实施例4：制备ADC-2
Figure PCTCN2022142644-appb-000025
在37℃条件下，向抗体Ab1的PBS缓冲水溶液(pH＝6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液；10.0mg/mL，1.44mL，97.3nmol)加入配置好的三(2-羧乙基)膦(TCEP)盐酸盐的水溶液(10mM，25.3μL，253nmol)，置于水浴振荡器，于37℃下振荡反应3小时，停止反应。将反应液用水浴降温至25℃。
将化合物D1(1.28mg，972nmol)溶解于65μL DMSO中，加入到上述反应液 中，置于水浴振荡器，于25℃下振荡反应3小时，停止反应。将反应液用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH为6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液，含0.001M的EDTA)，得到标题产物ADC-2的PBS缓冲液(1.24mg/mL，11mL)，于4℃冷藏储存。
RP-HPLC计算载药量平均值：n＝4.43。
实施例5：制备ADC-3
Figure PCTCN2022142644-appb-000026
在37℃条件下，向抗体Ab1的PBS缓冲水溶液(pH＝6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液；10.0mg/mL，6mL，405nmol)加入配置好的的三(2-羧乙基)膦(TCEP)盐酸盐的水溶液(10mM，101.4μL，1014nmol)，置于水浴振荡器，于37℃下振荡反应3小时，停止反应。将反应液用水浴降温至25℃。
将化合物D1(5.34mg，4058nmol)溶解于300μL DMSO中，加入到上述反应液中，置于水浴振荡器，于25℃下振荡反应3小时，停止反应。将反应液用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH为6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液，含0.001M的EDTA)，得到标题产物ADC-3的PBS缓冲液(3.33mg/mL，18mL)，于4℃冷藏储存。
RP-HPLC计算载药量平均值：n＝4.76。
实施例6：制备ADC-4
Figure PCTCN2022142644-appb-000027
在37℃条件下，向抗体347的PBS缓冲水溶液(pH＝6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液；10.0mg/mL，30mL，2027nmol)加入配置好的的三(2-羧乙基)膦(TCEP)盐酸盐的水溶液(10mM，1.145mL，11.45μmol)，置于水浴振荡器，于37℃下振 荡反应3.5小时，停止反应。将反应液用水浴降温至25℃。
将9A(参考WO2020063676，实施例9的化合物9-A制备所得，该申请的全部内容引入本披露)(32.7mg，30.45μmol)溶解于1.7mL二甲亚砜中，逐滴加入到上述反应液中，置于水浴振荡器，于25℃下振荡反应3小时，停止反应。将反应液用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH为6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液，含0.001M的EDTA)，得到标题产物ADC-4的PBS缓冲液(2.6mg/mL，80mL)，于4℃冷藏储存。
RP-HPLC计算载药量平均值：n＝7.39。
实施例7：制备ADC-5
Figure PCTCN2022142644-appb-000028
在37℃条件下，向抗体347的PBS缓冲水溶液(pH＝6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液；10.0mg/mL，10mL，675nmol)加入配置好的三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP.HCl)的水溶液(10mM，169μL，1690nmol)，置于水浴振荡器，于37℃下振荡反应3.5小时，停止反应。将反应液用水浴降温至25℃。
将化合物9A(7.26mg，6.76μmol)溶解于500μL二甲亚砜中，逐滴加入到上述反应液中，置于水浴振荡器，于25℃下振荡反应3小时，停止反应。将反应液用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH为6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液，含0.001M的EDTA)，得到标题产物ADC-5的PBS缓冲液(1.92mg/mL，48mL)，于4℃储存。
RP-HPLC计算载药量平均值：n＝3.99。
测试例
生物学评价
测试例1：抗体蛋白水平亲和力和动力学实验
通过Biacore T200(Cytiva)分析抗ROR1抗体表征亲和力及结合动力学。用Protein A生物传感芯片(Cat.#29127556，Cytiva)亲和捕获IgG抗体，然后于芯片表面流经稀释在HBS-EP缓冲液(pH 7.4，Cat.#BR-1006-69，Cytiva)中的一系列浓度梯度的人ROR1His(Cat.#19771-H08H，义翘神州)抗原。追踪抗原-抗体结合动 力学3分钟并追踪解离动力学10分钟，用Biacore T200仪器实时检测反应信号获得结合和解离曲线。在每个实验循环解离完成后，用10mM Gly-HCl pH 1.5(Cat.#BR-1003-54,Cytiva)将生物传感芯片洗净再生。使用Cytiva的BIAevaluation软件以1:1(Langmuir)结合模型分析所得数据，以此法测定的ka(kon)、kd(koff)和KD值显示于下表。
表3.亲和力
抗体 Immo水平/RU ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M)
Ab1 175 6.00E+05 5.46E-02 9.10E-08
347 175 2.31E+06 2.73E-03 1.18E-09
测试例2：抗体体外细胞结合实验
将ROR1-CHO-K1细胞(实施例1)，Jeko-1细胞(ATCC,CRL-3006)，或MDA-MB-231细胞(ATCC,CRM-HTB-26)，分别用FACS缓冲液(2％胎牛血清(Gibco，10099141)pH7.4 PBS(Sigma,P4417-100TAB)制备成1×10 6/mL的细胞悬液，100μL/孔加入96孔圆底板中。离心去除上清后加入50μL/孔用FACS缓冲液稀释的不同浓度待测抗体，放于4℃冰箱中避光孵育1小时。以FACS缓冲液500g离心洗涤3次后，加入工作浓度的荧光二抗，放于4℃冰箱中避光孵育40分钟。以FACS缓冲液500g离心洗涤3次后，在BD FACSCantoII流式细胞仪上检测几何平均数荧光强度，计算抗体对表达ROR1的细胞结合EC 50值。
表4.抗体与细胞结合活性
  ROR1-CHO-K1细胞 Jeko-1细胞 MDA-MB-231细胞
抗体 347 347 347
最大荧光值 19611 3554 2739
EC 50(nM) 0.502 0.098 0.094
测试例3：DT3C抗体内吞实验
本实验的目的是根据DT3C蛋白进入细胞后，活化的白喉毒素(DT)对细胞进行杀伤，间接反映了ROR1抗体的内吞情况。根据IC 50和最大杀伤值来评价抗ROR1抗体的体外内吞活性。
DT3C是重组表达的融合蛋白，由白喉毒素的Fragment A(仅毒素部分)和G群链球菌的3C片段(IgG结合部分)融合而成，该蛋白能够与抗体的IgG部分高度亲和，在抗体发生内吞时一同进入细胞，在胞内弗林蛋白酶的作用下，释放出具有毒性的DT，DT能够抑制EF2-ADP核糖基化的活性，阻断蛋白翻译过程，最终导致细胞死亡。而未进入细胞的DT3C则不具有杀伤细胞的活性。根据细胞杀伤情况来评价抗体的内吞活性。
用含20％low IgG FBS的新鲜细胞培养基配制ROR1-CHOK1细胞悬液，细胞 密度为2×10 4细胞/mL，以50μL/孔加入细胞培养板中，5％二氧化碳37℃16小时培养。用无血清培养基将DT3C稀释成1.6μM,用无血清培养基将抗ROR1抗体稀释成266.4nM，将80μL DT3C和80μL抗ROR1抗体按照1:1的体积混匀，室温下静置孵育30分钟。DT3C摩尔浓度为抗ROR1抗体摩尔浓度的6倍。
用无血清培养基4倍梯度稀释DT3C和抗ROR1抗体混合物，共8个梯度，第9和10个点为纯培养基。取50μL稀释好的混合物加入50μL的细胞中，培养箱中孵育三天。每孔加入50μL CTG，室温下避光孵育10分钟，将白色底膜贴在细胞培养板底部，置于酶标仪Victor 3上读取化学发光值。
表5.在ROR1-CHOK1上DT3C内吞杀伤实验结果
抗体 347
最大杀伤值 87.39％
IC 50(nM) 0.596
测试例4：与大鼠/小鼠ROR1抗原的交叉结合能力
通过Biacore T200(Cytiva)分析抗ROR1抗体表征亲和力及结合动力学。用Protein A生物传感芯片(Cat.#29127556,Cytiva)亲和捕获IgG抗体，然后于芯片表面流经稀释在HBS-EP缓冲液(pH 7.4,Cat.#BR-1006-69,Cytiva)中的一系列浓度梯度的小鼠ROR1-His(Cat.#RO1-M522，Acro)抗原和大鼠ROR1-His(Cat.#RO1-R5221,Acro)抗原。追踪抗原-抗体结合动力学3分钟并追踪解离动力学15分钟，用Biacore T200仪器实时检测反应信号获得结合和解离曲线。在每个实验循环解离完成后，用10mM Gly-HCl pH 1.5(Cat.#BR-1003-54,Cytiva)将生物传感芯片洗净再生。使用Cytiva的BIAevaluation软件以1:1(Langmuir)结合模型分析所得数据，以此法测定的ka(kon)、kd(koff)和KD值显示于下表。
表6.347和Ab1与大鼠/小鼠ROR1抗原的结合能力
Figure PCTCN2022142644-appb-000029
结论：
347抗体与大鼠/小鼠的ROR1有较强的交叉结合。
测试例5：ADC分子高表达CDX模型体内药效评价
NDG鼠在右肋部皮下接种JEKO-1细胞(人套细胞淋巴瘤，MCL，5×10 6个+50％基质胶/只/200μL)，8天后分组，8只/组。分组当天平均每组肿瘤体积为223.09mm 3。ADC化合物按照5mpk剂量腹腔注射给药，一周一次，共给药1次， 观察21天。
每周测量2次瘤体积和体重，记录数据。使用Excel 2003统计软件：平均值以avg计算；SD值以STDEV计算；SEM值以STDEV/SQRT计算；组间差异P值以TTEST计算。
肿瘤体积(V)计算公式为：V＝1/2×L 长×L 短 2
相对肿瘤增殖率T/C(％)＝(T-T0)/(C-C0)×100％
抑瘤率TGI(％)＝1-T/C(％)。
其中T、C为实验结束时治疗组和对照组的肿瘤体积；T0、C0为实验开始时的肿瘤体积。
表7.ADC对荷瘤裸鼠Jeko-1移植瘤的疗效
抗体 抑瘤率TGI(％)
ADC-2 5mpk 85.6
ADC-1 5mpk 93.4
结论：
本实验中，受试ADC-1(5mpk)的抑瘤率达到93.4％(P<0.0001vs空白对照)；阳性对照ADC-2(5mpk)的抑瘤率为85.6％(p<0.0001vs空白对照)。从抑瘤率来看，ADC-1(5mpk)的抑瘤率优于阳性对照ADC-2(5mpk)。
测试例6：ADC分子的细胞活性评价
本实验的目的是检测ROR1-ADC样品ADC-4和ADC-5对细胞杀伤作用，根据IC 50和最大杀伤值来评价ROR1-ADC的体外活性。
HCC827/ROR1(ROR1过表达细胞系)，Jeko-1，MDA-MB-231和CHO-K1细胞用胰酶消化，新鲜培养基中和，1000rpm离心后用培养液重悬，计数后将细胞悬液调整到合适的密度，以每孔135μL加入到96孔细胞培养板中，剩下的外周孔只加入150μL培养基。将培养板在培养箱培养24小时，5％二氧化碳37℃。
ADC样品用PBS配制成不同浓度，并用PBS五倍稀释，共8个浓度。取出细胞培养板每孔加入15μL的10×浓度溶液。5％二氧化碳37℃培养6天。
每孔加入70μL CTG，室温下避光孵育10分钟，将白色底膜贴在细胞培养板底部，置于Victor3上读取化学发光。本实验的数据使用了数据处理软件GraphPad prism5.0。
表8.待测药物在多种细胞系上的杀伤效果
Figure PCTCN2022142644-appb-000030
注：“+++”表示ROR1高表达，“+”表示ROR1低表达，“-”表示不表达ROR1。结论：ADC-4和ADC-5对不同细胞系的抑制活性与抗原表达量呈正相关，即抗原 表达越高，药物的抑制活性越强。
测试例7：ADC分子在CDX模型中体内活性评价
1.人套细胞淋巴瘤(MCL)小鼠皮下移植瘤模型
NDG鼠在右肋部皮下接种JEKO-1细胞(5×10 6个+50％基质胶/只/200μL/小鼠)，7天后分组，8只/组。分组当天平均每组肿瘤体积为266.7mm 3。ADC化合物按照2.5mpk/5mpk剂量腹腔注射给药，分别在分组的第1天和第14天给药，共给药2次，观察21天。
每周测量2次肿瘤体积和体重，记录数据。使用Excel 2003统计软件：平均值以avg计算；SD值以STDEV计算；SEM值以STDEV/SQRT计算；组间差异P值以TTEST计算。
肿瘤体积(V)计算公式为：V＝1/2×L 长×L 短 2
相对肿瘤增殖率T/C(％)＝(T-T0)/(C-C0)×100％
抑瘤率TGI(％)＝1-T/C(％)。
其中T、C为实验结束时治疗组和对照组的肿瘤体积；T0、C0为实验开始时的肿瘤体积。
表9.受试药物对荷瘤NDG鼠Jeko-1移植瘤的疗效(D21)
受试药物 剂量 抑瘤率TGI(％)
ADC-4 2.5mpk 86.28
ADC-4 5mpk 100
ADC-5 2.5mpk 45.03
ADC-5 5mpk 63.60
结论：
在Jeko-1小鼠皮下移植瘤CDX模型中，ADC-4的抑瘤活性优于ADC-5，且受试ADC-4(5mpk)的抑瘤率达到100％(P<0.0001vs空白对照)。
2.三阴性乳腺癌(TNBC)小鼠皮下移植瘤模型
60只NOD-SCID鼠在右肋部皮下接种MDA-MB-231细胞(3×10 6细胞/200μL/小鼠)，9天后分组，7只/组。分组当天平均每组肿瘤体积为184.85mm 3。ADC化合物按照2.5mpk/5mpk剂量腹腔注射给药，仅在分组的第1天给药，观察21天。
每周测量2次肿瘤体积和体重，记录数据。使用Excel 2003统计软件：平均值以avg计算；SD值以STDEV计算；SEM值以STDEV/SQRT计算；组间差异P值以TTEST计算。
肿瘤体积(V)计算公式为：V＝1/2×L 长×L 短 2
相对肿瘤增殖率T/C(％)＝(T-T0)/(C-C0)×100％
抑瘤率TGI(％)＝1-T/C(％)。
其中T、C为实验结束时治疗组和对照组的肿瘤体积；T0、C0为实验开始时的肿瘤体积。
表10.受试药物对荷瘤NOD-SCID鼠MDA-MB-231移植瘤的疗效(D20)
受试药物 剂量 抑瘤率TGI(％)
ADC-4 2.5mpk 74.53
ADC-4 5mpk 100
ADC-3 5mpk 75.79
ADC-5 2.5mpk 77.31
ADC-5 5mpk 92.21
结论：
在MDA-MB-231小鼠皮下移植瘤CDX模型中，观察至20天时，受试ADC-4(5mpk)的抑瘤率达到100％(P<0.0001vs空白对照)；阳性ADC-3(5mpk)的抑瘤率为75.79％(p<0.0001vs空白对照)；受试ADC-5(5mpk)的抑瘤率达到92.21％(p<0.0001vs空白对照)。从抑瘤率来看，ADC-4(5mpk)的抑瘤率优于阳性ADC-3(5mpk)和ADC-5(5mpk)，且体重变化方面均未表现出明显毒性。
测试例8：ADC分子的PK评价
在成年SD大鼠(浙江维通利华)和NDG C57小鼠(Balbc)中研究ROR1-ADC(ADC-4)的单剂量药代动力学。大鼠一个分子随机分成一组，静脉注射ROR1-ADC分子10mpk(n＝4/组)，小鼠一个分子随机分成二组，静脉注射ROR1-ADC分子10mpk(n＝3/组)。大鼠在静脉注射后0.083、8、24、48、96、168、240、336、504和672小时收集血清进行生物分析测量，一组小鼠在静脉注射后0.083、8、48、168、336、和672小时收集血清进行生物分析测量，另一组在静脉注射后1、24、96、240、504小时收集血清进行生物分析测量。采用HTRF的方法进行大鼠/小鼠血清样品的测定，通过标准品的四参数模型曲线进行待测品含量的定量分析。
药代参数使用WinNonlin软件(6.4)的标准非房室模型进行分析。
实验结果如下：
表11.受试药物在大鼠或小鼠体内的药代动力学参数
Figure PCTCN2022142644-appb-000031
结论：
在大鼠和小鼠体内，ADC-4均有较好的血浆稳定性。
测试例9：ADC分子大鼠体内毒性评价
ADC化合物(用生理盐水配制)尾静脉注射SD大鼠(雄性，浙江维通利华实验动物技术有限公司)，每组6只，每周给药一次，共给药2次，每只按体重注射5mL/kg。具体实验设计和实验结果如下：
表12.毒性测试给药方案
分组 ADC化合物 给药剂量(mg/kg)
溶媒 生理盐水 0
A ADC-4 35
B ADC-4 70
C ADC-3 35
结果表明：阳性对照ADC-3在单次给药后即出现大鼠死亡的情况，ADC-4在35mpk&70mpk剂量下，分别两次给药后均未出现大鼠死亡的情况。给药期间C组(ADC-3-35mpk)在第一次给药后出现严重的弓背奓毛消瘦，明显的后肢乏力、行动迟缓、后肢瘫痪等明显临床不良反应，正常摄食饮水受到影响；部分动物已出现死亡，为避免数据删失(censored)，C组其余动物于药后第6天提前解剖。A和B组动物给药后，未见明显异常。
表13.ADC化合物对SD大鼠毒性实验结果
Figure PCTCN2022142644-appb-000032
注：WBC(白细胞)、PLT(血小板)、RET#(网织红细胞)、ALT(甘氨酸氨基转移酶)。
结论：
ADC-4-35/70mpk:最大耐受剂量(MTD)＞70mpk；毒性表现为：体重增长减缓，胸腺萎缩等；
ADC-3-35mpk：MTD＜35mpk(动物发生死亡)；毒性表现为：体重下降，骨髓抑制，胸腺明显萎缩，肝、肺，肾等器官功能有明显的影响。
实验结果提示，ADC-4相较于对照分子ADC-3有更好的体内安全性，更低的毒副作用。

Claims (15)

  1. 一种分离的抗ROR1抗体，其包含：
    SEQ ID NO：2所示的重链可变区中所包含的HCDR1，HCDR2和HCDR3；和
    SEQ ID NO：3所示的轻链可变区中所包含的LCDR1，LCDR2和LCDR3。
  2. 一种分离的抗ROR1抗体，其包含重链可变区和轻链可变区，其中：
    所述重链可变区包含分别如SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示的HCDR1，HCDR2和HCDR3；
    所述轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9所示的LCDR1，LCDR2和LCDR3。
  3. 根据权利要求1或2所述的分离的抗ROR1抗体，其包含重链可变区和轻链可变区，其中：
    所述重链可变区，其氨基酸序列与SEQ ID NO：2具有至少90％的序列同一性，和/或所述轻链可变区，其氨基酸序列与SEQ ID NO：3具有至少90％的序列同一性；
    优选地，
    所述重链可变区，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；和
    所述轻链可变区，其氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
  4. 根据权利要求1至3中任一项所述的分离的抗ROR1抗体，其包含：
    与SEQ ID NO：12具有至少85％序列同一性的重链，和/或
    与SEQ ID NO：13具有至少85％序列同一性的轻链；
    优选地，所述的分离的抗ROR1抗体，其包含：
    如SEQ ID NO：12所示的重链和如SEQ ID NO：13所示的轻链。
  5. 根据权利要求1至4中任一项所述的分离的抗ROR1抗体，其以小于1×10 -8M的KD结合人ROR1或其表位，所述KD是通过表面等离子体共振法测量。
  6. 一种分离的核酸分子，其编码权利要求1至5中任一项所述的分离的抗ROR1抗体。
  7. 一种宿主细胞，其包含如权利要求6所述的分离的核酸分子。
  8. 一种免疫检测或测定ROR1的方法，所述方法包括使用权利要求1至5中 任一项所述的分离的抗ROR1抗体接触受试者或来自受试者的样品的步骤。
  9. 一种免疫偶联物或其药学上可接受的盐，其包含：
    权利要求1至5中任一项所述的分离的抗ROR1抗体和效应分子，
    其中，所述效应分子偶联至所述抗ROR1抗体；
    优选地，所述效应分子选自：放射性同位素、抗肿瘤剂、免疫调节剂、生物反应修饰剂、凝集素、细胞毒性药物、发色团、荧光团、化学发光化合物、酶、金属离子，以及其任何组合。
  10. 根据权利要求9所述的免疫偶联物或其药学上可接受的盐，其中,
    所述免疫偶联物的结构选自：
    Figure PCTCN2022142644-appb-100001
    其中：
    n为1至10的整数或小数；优选为1至8的整数或小数，更优选为8；
    L为连接单元，Pc是权利要求1至5中任一项所述的抗ROR1抗体。
  11. 根据权利要求10所述的免疫偶联物或其药学上可接受的盐，其中接头单元-L-为-L 1-L 2-L 3-L 4-，
    L 1选自-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-W-C(O)-、-CH 2-C(O)-NR 1-W-C(O)-或-C(O)-W-C(O)-，其中W选自C 1-8烷基或C 1-6烷基-环烷基；
    L 2选自-NR 2(CH 2CH 2O)p 1CH 2CH 2C(O)-、-NR 2(CH 2CH 2O)p 1CH 2C(O)-、-S(CH 2)p 1C(O)-或化学键，其中p 1为1至20的整数；优选为化学键；
    L 3为由2至7个氨基酸残基构成的肽残基，其中所述氨基酸残基选自苯丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、赖氨酸、瓜氨酸、丝氨酸、谷氨酸和天冬氨酸形成的氨基酸残基；
    L 4选自-NR 3(CR 4R 5) t-、-C(O)NR 3-、-C(O)NR 3(CH 2) t-或PAB基团，其中t为1至6的整数；
    R 1、R 2和R 3相同或不同，且各自独立地选自氢原子、烷基、卤代烷基、氘代烷基和羟烷基；
    R 4和R 5相同或不同，且各自独立地选自氢原子、卤素、烷基、卤代烷基、氘代烷基和羟烷基。
  12. 根据权利要求10所述的免疫偶联物或其药学上可接受的盐，其中所述的免疫偶联物的结构选自：
    Figure PCTCN2022142644-appb-100002
    其中：
    n和Pc如权利要求10所限定。
  13. 一种药物组合物，其包含：
    权利要求1至5中任一项所述的分离的抗ROR1抗体，或权利要求6所述的分离的核酸分子，或权利要求9至12中任一项所述的免疫偶联物或其药学上可接受的盐；以及
    一种或多种药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。
  14. 权利要求1至5中任一项所述的分离的抗ROR1抗体，或权利要求6所述的分离的核酸分子，或权利要求9至12中任一项所述的免疫偶联物或其药学上可接受的盐，或权利要求13所述的药物组合物在制备用于治疗ROR1介导的疾病或病症的药物中的用途。
  15. 权利要求1至5中任一项所述的分离的抗ROR1抗体，或权利要求6所述的分离的核酸分子，或权利要求9至12中任一项所述的免疫偶联物或其药学上可接受的盐，或权利要求13所述的药物组合物在制备用于治疗肿瘤或癌症的药物中的用途；
    优选地，所述肿瘤或癌症选自乳腺癌、胰腺癌、肺癌、食道癌、非小细胞肺癌、喉部肿瘤、肉瘤、咽部肿瘤、口腔肿瘤、胃癌、卵巢癌、前列腺癌、膀胱癌、结肠直肠癌、淋巴瘤和白血病。
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