JP2023535598A - 抗ｃｄ７９ｂ抗体薬物複合体、その調製方法及びその医薬用途 - Google Patents

抗ｃｄ７９ｂ抗体薬物複合体、その調製方法及びその医薬用途 Download PDF

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Abstract

抗ＣＤ７９Ｂ抗体薬物複合体、その調製方法及びその医薬用途に関する。具体的に、ＭＭＡＥ若しくはその誘導体、エキサテカン若しくはその誘導体、又はエリブリン若しくはその誘導体に抱合された抗ＣＤ７９Ｂ抗体を含む抗体薬物複合体（ＡＤＣ）、上記ＡＤＣを含む医薬組成物、及びそのＣＤ７９Ｂ仲介性の疾患又は病状を治療する薬剤の調製における用途、特に抗がん剤の調製における用途を提供する。

Description

本願は、２０２０年０７月２７日に提出された出願番号ＣＮ２０２０１０７３０８９９．８、及び２０２０年０７月２８日に提出されたＣＮ２０２０１０７３５９１０．Ｘの特許出願の優先権を主張する。
本願は、抗ＣＤ７９Ｂ抗体及び抗原結合断片、上記抗ＣＤ７９Ｂ抗体のＣＤＲ領域を含むキメラ抗体、ヒト化抗体、及びヒト抗ＣＤ７９Ｂ抗体又はその抗原結合断片を含む医薬組成物、並びにその抗がん剤としての用途に関する。
悪性腫瘍（がん）は、心臓病に次ぎ、全世界で２番目の死因となっている。そのうち、リンパ腫は、リンパ造血系の悪性腫瘍に由来するもので、全世界で最もよく見られる血液腫瘍である。リンパ腫は、非ホジキンリンパ腫（ｎｏｎ－Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ ｌｙｍｐｈｏｍａ、ＮＨＬ）とホジキンリンパ腫（Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ ｌｙｍｐｈｏｍａ、ＨＬ）という２種類に分けられている。非ホジキンリンパ腫は、１群の異質性の強いリンパ球異常増殖性疾患の総称であり、その発症率がホジキンリンパ腫よりも遥かに高く、リンパ腫の約８０％以上を占めている。そのうち、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）は、成人で最もよく見られるリンパ腫の種類であり、全非ホジキンリンパ腫の３２．５％程度を占めており、アジア人においては、この割合が４０％に近いともっと高い。高齢患者に発症することが多く、発症年齢中央値は６０～６４歳で、男性患者は女性患者よりやや多い。
現在、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）の第１選択の標準案は、リツキシマブ・化学療法併用案（Ｒ－ＣＨＯＰ）である。リツキシマブが発売される前に、アントラセン環系に基づくＣＨＯＰ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、プレドニゾン）案が、ＤＬＢＣＬの第１選択の標準的な治療案であった。Ｒ－ＣＨＯＰ治療案により、ＤＬＢＣＬ患者の長期生存率は明らかに改善されるようになる。臨床試験の結果によると、従来のＣＨＯＰ案と比べ、Ｒ－ＣＨＯＰ案によるＤＬＢＣＬの治療では、患者の全生存期間中央値が４．９年間と顕著に延長可能であり、無病生存期間中央値が６．６年間を超え、５年無増悪生存率が３０％から５４％に向上している。それでもなお、反応のない難治患者は１０％～１５％、再発した患者は２０％～３０％存在している。また、何れのＤＬＢＣＬ患者もＲ－ＣＨＯＰ案に適するわけではなく、例えば、８０歳以上の高齢患者は、身体能力によって標準的なＲ－ＣＨＯＰ治療が許容されない。侵襲性のより高いリンパ腫の種類、及び再発性リンパ腫に対して、Ｒ－ＣＨＯＰ案は無効になる恐れがある。
リンパ球の由来によって分類すると、ＤＬＢＣＬはＢ細胞リンパ腫に属する。Ｂ細胞抗原受容体（Ｂ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＢＣＲ）複合物は、Ｂ細胞表面で最も主要な分子である。ＢＣＲ複合物は、抗原を認識して結合する膜免疫グロブリン（ｍＩｇ）、及び抗原刺激シグナルを伝達するＩｇα（ＣＤ７９ａ）とＩｇβ（ＣＤ７９Ｂ）のヘテロ二量体からなる。ＩｇαとＩｇβは、それぞれ４７ ｋＤａと約３７ ｋＤａの糖タンパク質であり、免疫グロブリンスーパーファミリーメンバーに属し、Ｉｇα及びＩｇβをコードする遺伝子は、それぞれｍｂ－１及びＢ２９と呼ばれる。ＩｇαとＩｇβ細胞膜外領域のアミノ末端には、何れも１つのＩｇ様ドメインがある。ＩｇαとＩｇβは、何れもタンパク質チロシンキナーゼの基質として、ＢＣＲシグナル伝達に関与することができる。
ＢＣＲは、Ｂ細胞リンパ腫及び正常なＢ細胞に広く発現している。ＣＤ２０を標的とするリツキシマブの臨床的な成功と確実な安全性に鑑み、ＢＣＲを標的とする治療方法の開発も、良好な治療効果と安全性を持つはずである。ＣＤ７９Ｂ抗原に対する治療用抗体は有益なものであり、患者に投与される（特に長期治療に適用される）時に、最低限の抗原性が生じ、又は抗原性が生じない。本分野では、がんを治療し、又はがんの進行を遅延するために、効果的なＣＤ７９Ｂ抗体及びその抗体薬物複合体の開発が急務となっている。ＷＯ２０２０１５６４３９Ａは、抗ＣＤ７９Ｂ抗体及びその治療腫瘍の用途を開示し、その内容が全て本開示に援用されている。
本開示は、抗ＣＤ６９Ｂ抗体又は抗原結合断片及びその薬物との複合体（ＡＤＣ）と医薬用途に関し、そのうち、抗ＣＤ６９Ｂ抗体又は抗原結合断片と細胞毒性物質（ＭＭＡＥ若しくはその誘導体、エキサテカン若しくはその誘導体、エリブリン若しくはその誘導体）とカップリングしたＡＤＣ薬剤を提供する。
抗ＣＤ７９Ｂ抗体及びその抗原結合断片
ＷＯ２０２０１５６４３９Ａは、抗ＣＤ７９Ｂ抗体及びその治療腫瘍の用途を開示し、その内容が全て本開示に援用されている。
本開示は、
ＧＸ１Ｘ２ＦＸ３Ｘ４Ｙ（配列番号２４）で示される配列を含み、そのうち、Ｘ１がＳ又はＹ、Ｘ２がＳ又はＴ、Ｘ３がＴ又はＳ、Ｘ４がＳ又はＴである重鎖ＨＣＤＲ１と、
Ｘ５ＰＲＳＧＮ（配列番号２５）で示される配列を含み、そのうち、Ｘ５がＦ又はＹである重鎖ＨＣＤＲ２と、
Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０ＧＤＦＸ１１Ｙ（配列番号２６）を含み、そのうち、Ｘ６が存在せず又はＧであり、Ｘ７が存在せず又はＳであり、Ｘ８がＧ又はＤ、Ｘ９がＤ又はＹ、Ｘ１０がＬ又はＤ、Ｘ１１がＤ又はＡである重鎖ＨＣＤＲ３と、
ＲＳＳＱＳＩＶＨＸ１２ＧＮＴＹＸ１３Ｅ（配列番号２７）を含み、そのうち、Ｘ１２がＳ又はＨ、Ｘ１３がＦ又はＬである軽鎖ＬＣＤＲ１と、
配列番号１１又は１７で示される配列を含む軽鎖ＬＣＤＲ２と、
配列番号１２又は１８で示される配列を含む軽鎖ＬＣＤＲ３と、
を含む、
抗ＣＤ７９Ｂ抗体及びその抗原結合断片を提供する。
幾つかの実施形態において、上記抗ＣＤ７９Ｂ抗体又はその抗原結合断片は、
配列番号２３、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５から選ばれる少なくとも１つの配列で示されるＨＣＤＲを含む抗体重鎖可変領域、及び／又は
配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１６、配列番号１７又は配列番号１８から選ばれる少なくとも１つの配列で示されるＬＣＤＲを含む抗体軽鎖可変領域、
を含む。
幾つかの実施形態において、
（ａ）それぞれ配列番号２３、８、９で示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３、及びそれぞれ配列番号１０、１１、１２で示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３、
（ｂ）それぞれ配列番号７、８、９で示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３、及びそれぞれ配列番号１０、１１、１２で示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３、又は
（ｃ）それぞれ配列番号１３、１４、１５で示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３、及びそれぞれ配列番号１６、１７、１８で示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３、
を含む、抗ＣＤ７９Ｂ抗体又はその抗原結合断片を提供する。
幾つかの具体的な実施形態において、上記形態（ａ）（即ち、それぞれ配列番号２３、８、９で示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３、及びそれぞれ配列番号１０、１１、１２で示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３を含む抗ＣＤ７９Ｂ抗体又はその抗原結合断片）には、ＶＨが配列番号１９、ＶＬが配列番号２０である抗ＣＤ７９Ｂ抗体又はその抗原結合断片が含まれず、又は重鎖全長が配列番号２８、軽鎖全長が配列番号２９である抗ＣＤ７９Ｂ抗体又はその抗原結合断片が含まれない。
幾つかの実施形態において、上記抗ＣＤ７９Ｂ抗体又はその抗原結合断片はマウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体又はその断片であり、例えば、ヒト化抗体又はその断片である。
幾つかの実施形態において、重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、そのうち、
重鎖可変領域（ＶＨ）は、
配列番号３、５で示され、又は配列番号３、５と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有する配列を含み、
及び／又は、
軽鎖可変領域（ＶＬ）は、
配列番号４、６で示され、又は配列番号４、６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有する配列を含む、
抗ＣＤ７９Ｂ抗体又はその抗原結合断片を提供する。
幾つかの具体的な実施形態において、上記抗ＣＤ７９Ｂ抗体又は抗原結合断片は、ＶＨが配列番号３の配列で示され、ＶＬが配列番号４の配列で示され、又はＶＨが配列番号５の配列で示され、ＶＬが配列番号６の配列で示される。
別の幾つかの実施形態において、
ＶＨは、
配列番号１９、２１で示され、又は配列番号１９、２１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有する配列を含み、
及び／又は、ＶＬは、
配列番号２０、２２で示され、又は配列番号２０、２２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有する配列を含む、
抗ＣＤ７９Ｂ抗体又はその抗原結合断片を提供する。
幾つかの具体的な実施形態において、上記抗ＣＤ７９Ｂ抗体又は抗原結合断片は、ＶＨが配列番号１９の配列で示され、ＶＬが配列番号２０の配列で示され、又はＶＨが配列番号２１の配列で示され、ＶＬが配列番号２２の配列で示される。
幾つかの実施形態において、上記抗ＣＤ７９Ｂ抗体又はその抗原結合断片は、と軽鎖定常領域を含み、好ましくは、上記重鎖定常領域は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３とＩｇＧ４定常領域及びその通常の変異体から選ばれ、上記軽鎖定常領域は、ヒト抗体κとλ鎖定常領域及びその通常の変異体から選ばれる。
幾つかの具体的な実施形態において、上記重鎖定常領域はヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２である。
幾つかの実施形態において、
重鎖は配列番号２８又はその変異体配列で示され、上記変異体配列は重鎖において０～１０個のアミノ酸変化を含み、
軽鎖は配列番号２９又はその変異体配列で示され、上記変異体配列は軽鎖において０～１０個のアミノ酸変化を含む、
抗ＣＤ７９Ｂ抗体又はその断片を提供する。
幾つかの実施形態において、
重鎖は配列番号３０又はその変異体配列で示され、上記変異体配列は重鎖において０～１０個のアミノ酸変化を含み、
軽鎖は配列番号３１又はその変異体配列で示され、上記変異体配列は軽鎖において０～１０個のアミノ酸変化を含む、
抗ＣＤ７９Ｂ抗体又はその断片を提供する。
幾つかの具体的な実施形態において、上記抗ＣＤ７９Ｂ抗体又はその断片は変異体であってもよく、上記変異体は、ＶＬにおいて０～１０個（１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個）のアミノ酸変化を有し、及び／又はＶＨにおいて０～１０個（１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個）のアミノ酸変化を有する。
幾つかの具体的な実施形態において、上記変異体は、元の抗ＣＤ７９Ｂ抗体又はその断片と同様又は類似の生物学的機能又は効果を有する。
幾つかの実施形態において、上記抗ＣＤ７９Ｂ抗体の抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓＦｖ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、線形抗体、単鎖抗体、ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ、ｓｄＦｖ、ナノ抗体、ペプチド抗体ｐｅｐｔｉｂｏｄｙ、ドメイン抗体と多重特異性抗体（二重特異性抗体、ｄｉａｂｏｄｙ、ｔｒｉａｂｏｄｙとｔｅｔｒａｂｏｄｙ、タンデムジ－ｓｃＦｖ、タンデムトリ－ｓｃＦｖ）を含む。
幾つかの実施形態において、上記のような抗ＣＤ７９Ｂ抗体又はその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチド、例えばＤＮＡやＲＮＡを提供する。
幾つかの実施形態において、上記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、例えば、真核発現ベクター、原核発現ベクター、ウィルスベクターを提供する。
幾つかの実施形態において、上記発現ベクターから形質転換された宿主細胞、例えば、真核細胞、原核細胞を提供する。幾つかの具体的な実施形態において、宿主細胞は細菌（例えば、大腸菌）、酵母菌（例えば、ピキア酵母）、哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞やヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞）である。
幾つかの実施形態において、上記抗ＣＤ７９Ｂ抗体又はその抗原結合断片を調製する方法であって、上記のような宿主細胞に当該抗体又はその抗原結合断片を発現し、且つ当該宿主細胞から当該抗体又はその抗原結合断片を単離するステップを含む方法を提供する。
幾つかの実施形態において、増殖性疾患を治療又は予防し、又は増殖性疾患の進行を遅延する方法であって、
対象に治療又は疾患遅延有効量の上記抗ヒトＣＤ７９Ｂ抗体若しくはその抗原結合断片又はそのコードするポリヌクレオチド、医薬組成物を投与することを含み、上記増殖性疾患はがん又は腫瘍である、
方法を提供する。
幾つかの具体的な実施形態において、上記がん又は腫瘍はリンパ腫又は白血病であり、
上記リンパ腫は、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫から選ばれ、
上記非ホジキンリンパ腫は、攻撃性ＮＨＬ、再発性攻撃性ＮＨＬ、再発性無痛性ＮＨＬ、難治性ＮＨＬ、難治性無痛性ＮＨＬから選ばれ、
上記白血病は、慢性リンパ球性白血病、毛細胞白血病、急性リンパ球性白血病から選ばれる。
リガンド－薬物複合体
本開示は、
薬物はＭＭＡＥ若しくはその誘導体、エキサテカン若しくはその誘導体、エリブリン若しくはその誘導体から選ばれ、
リガンドは抗ＣＤ７９Ｂ抗体又はその抗原結合断片であり、上記抗ＣＤ７９Ｂ抗体又はその抗原結合断片は上記本開示に係る任意の抗ＣＤ７９Ｂ抗体又はその抗原結合断片である、
リガンド－薬物複合体又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物を提供する。
リガンド－薬物（エキサテカン若しくはその誘導体）の複合体
本開示は、式（Ｉ）で示されるリガンド－エキサテカン若しくはその誘導体の複合体又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物であり、
Figure 2023535598000001
 式（Ｉ）
そのうち、
Ｗは、Ｃ１－８アルキル基、Ｃ１－８アルキル－シクロアルキル基又は１～８個の原子の直鎖ヘテロアルキル基から選ばれ、上記ヘテロアルキル基は、Ｎ、Ｏ又はＳから選ばれる１～３個のヘテロ原子を含み、そのうち、上記Ｃ１－８アルキル基、シクロアルキル基及び直鎖ヘテロアルキル基は、それぞれ独立的に、任意選択的に更にハロゲン、ヒドロキシ基、シアノ基、アミノ基、アルキル基、クロロアルキル基、重水素化アルキル基、アルコキシ基及びシクロアルキル基から選ばれる１つ又は複数の置換基で置換され、
Ｌ２は、－ＮＲ４（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｐ１ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）－、－ＮＲ４（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｐ１ＣＨ２Ｃ（Ｏ）－、－Ｓ（ＣＨ２）ｐ１Ｃ（Ｏ）－又は化学結合から選ばれ、ｐ１は１～２０の整数であり、
Ｌ３は、２～７個のアミノ酸からなるペプチド残基であり、そのうち、アミノ酸は、任意選択的に更にハロゲン、ヒドロキシ基、シアノ基、アミノ基、アルキル基、クロロアルキル基、重水素化アルキル基、アルコキシ基及びシクロアルキル基から選ばれる１つ又は複数の置換基で置換され、
Ｒ１は、水素原子、ハロゲン、シクロアルキルアルキル基、重水素化アルキル基、シクロアルキル基、ヘテロシクリル基、アリール基又はヘテロアリール基から選ばれ、
Ｒ２は、水素原子、ハロゲン、ハロアルキル基、重水素化アルキル基、シクロアルキル基、ヘテロシクリル基、アリール基又はヘテロアリール基から選ばれ、
或いは、Ｒ１とＲ２は、それらに連結された炭素原子と共にシクロアルキル基又はヘテロシクリル基を形成し、
Ｒ４とＲ５は相同又は相異であり、且つそれぞれ独立的に水素原子、アルキル基、ハロアルキル基、重水素化アルキル基とヒドロキシアルキル基から選ばれ、
Ｒ６とＲ７は相同又は相異であり、且つそれぞれ独立的に水素原子、ハロゲン、アルキル基、ハロアルキル基、重水素化アルキル基とヒドロキシアルキル基から選ばれ、
ｍは、０～４の整数であり、
ｎは１～１０であり、整数でも小数でもよく、
Ｐｃは、本開示により提供される抗ＣＤ７９Ｂ抗体又はその抗原結合断片である、
リガンド－エキサテカン若しくはその誘導体の複合体又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物を提供する。
幾つかの実施形態において、本開示は、式（ＩＩ）で示されるリガンド－エキサテカン若しくはその誘導体の複合体又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物であり、
Figure 2023535598000002
 式（ＩＩ）
そのうち、
ｓ１は、２～８の整数で、好ましくは５であり、
Ｐｃ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５～Ｒ７、ｍ及びｎは、式（Ｉ）に定義された通りである、
リガンド－エキサテカン若しくはその誘導体の複合体又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物を提供する。
幾つかの実施形態において、本開示に係るリガンド－エキサテカン若しくはその誘導体の複合体の連結ユニット－Ｌ－Ｙ－は、下記を含むが、これらに限定されない：
Figure 2023535598000003

Figure 2023535598000004
幾つかの実施形態において、本開示により提供されるリガンド－エキサテカン若しくはその誘導体の複合体又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物は、下記を含むが、これらに限定されない：
Figure 2023535598000005

Figure 2023535598000006

Figure 2023535598000007

Figure 2023535598000008
そのうち、
ｎは１～１０であり、整数でも小数でもよく、
Ｐｃは、上記本開示に係る抗ＣＤ７９Ｂ抗体又はその抗原結合断片である。
幾つかの実施形態において、一般式（Ｐｃ－Ｌａ－Ｙ－Ｄ）で示されるリガンド－エキサテカン若しくはその誘導体の複合体又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物を調製する方法は、
Figure 2023535598000009
 Ｐｃを還元させた後、一般式（Ｌａ－Ｙ－Ｄ）とカップリング反応を行い、一般式（Ｐｃ－Ｌａ－Ｙ－Ｄ）で示される化合物を得るステップを含み、
そのうち、Ｐｃは、本開示の抗ＣＤ７９Ｂ抗体又はその抗原結合断片であり、Ｗ、Ｌ２、Ｌ３、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５～Ｒ７、ｍ及びｎは、式（Ｉ）に定義された通りである。
上記実施形態において、Ｐｃは、本開示に係る任意の抗ＣＤ７９Ｂ抗体又はその抗原結合断片であり、好ましくは、配列番号２８で示される重鎖と配列番号２９で示される軽鎖を含む抗体、又は配列番号３０で示される重鎖と配列番号３１で示される軽鎖を含む抗体である。
幾つかの具体的な実施形態において、本開示に係るリガンド－エキサテカン若しくはその誘導体の複合体は、その互変異性体、メソ体、ラセミ体、エナンチオマー、ジアステレオマー、重水素化物、又はその混合物の形態を含む。
ここで、ＷＯ２０２００６３６７３における化合物及びその調製方法が全て援用されている。
リガンド－薬物（エリブリン若しくはその誘導体）の複合体
本開示は、式Ｐｃ－（Ｌ－Ｄ）ｋで示される通りである：
そのうち、リガンドはＰｃで、上記Ｐｃは本開示に係る任意の抗ＣＤ７９Ｂ抗体又はその抗原結合断片であり、
ＬはＰｃをＤに共有結合するリンカーであり、且つｋは１～２０（１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又は何れか２つの数値間の任意数値を含む）であり、
Ｄは下記の式（ＩＩＩ）で示される通りである：
Figure 2023535598000010
 式（ＩＩＩ）
そのうち、Ｒ１ａは、水素、アルキル基（例えば、Ｃ１－６アルキル基であり、メチル基、エチル基、イソプロピル基を含むが、これらに限定されない）、シクロアルキル基（例えば、Ｃ３－８シクロアルキル基であり、シクロプロピル基、シクロペンチル基又はシクロヘキシル基を含むが、これらに限定されない）、アリール基とヘテロアリール基から選ばれ、上記アルキル基、シクロアルキル基、アリール基及びヘテロアリール基は、それぞれ独立して任意選択的にアルキル基（例えば、Ｃ１－６アルキル基であり、メチル基、エチル基、イソプロピル基を含むが、これらに限定されない）、アルコキシ基（例えば、Ｃ１－６アルコキシ基であり、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基を含むが、これらに限定されない）、ハロゲン（例えば、フッ素、塩素、臭素）、重水素、アミノ基、シアノ基、ニトロ基、ヒドロキシ基、ヒドロキシアルキル基、シクロアルキル基、ヘテロシクリル基、アリール基とヘテロアリール基から選ばれる１つ又は複数の置換基で置換され、好ましくは、Ｒ１ａはメチル基であり、
Ｒ１ｂは水素、アルキル基（例えば、Ｃ１－６アルキル基であり、メチル基、エチル基、イソプロピル基を含むが、これらに限定されない）、アルコキシ基、シクロアルキル基（例えば、Ｃ３－８シクロアルキル基であり、シクロプロピル基、シクロペンチル基又はシクロヘキシル基を含むが、これらに限定されない）、アリール基及びヘテロアリール基から選ばれ、上記アルキル基、シクロアルキル基、アリール基及びヘテロアリール基は、それぞれ独立して任意選択的にアルキル基（例えば、Ｃ１－６アルキル基であり、メチル基、エチル基、イソプロピル基を含むが、これらに限定されない）、アルコキシ基（例えば、Ｃ１－６アルコキシ基であり、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基を含むが、これらに限定されない）、ハロゲン（例えば、フッ素、塩素、臭素）、重水素、アミノ基、シアノ基、ニトロ基、ヒドロキシ基、ヒドロキシアルキル基、シクロアルキル基、ヘテロシクリル基、アリール基及びヘテロアリール基から選ばれる１つ又は複数の置換基で置換され、好ましくは、Ｒ１ｂは水素であり、又は
Ｒ１ａとＲ１ｂは、それらに連結された原子と共にＣ５－８ヘテロシクロアルキル基を形成し、上記ヘテロアルキル基は、任意選択的にアルキル基（例えば、Ｃ１－６アルキル基であり、メチル基、エチル基、イソプロピル基を含むが、これらに限定されない）、アルコキシ基（例えば、Ｃ１－６アルコキシ基であり、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基を含むが、これらに限定されない）、ハロゲン（例えば、フッ素、塩素、臭素）、重水素、アミノ基、シアノ基、ニトロ基、ヒドロキシ基、ヒドロキシアルキル基、シクロアルキル基（例えば、Ｃ３－８シクロアルキル基であり、シクロプロピル基、シクロペンチル基又はシクロヘキシル基を含むが、これらに限定されない）、ヘテロシクリル基、アリール基及びヘテロアリール基のうちの１つ又は複数の置換基で置換され、且つＲ１ａとＲ１ｂは同時に水素ではない、
リガンド－エリブリン若しくはその誘導体の複合体又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物を提供する。
幾つかの実施形態において、リガンド－エリブリン若しくはその誘導体の複合体は、ＤにおいてＲ１ａがメチル基である。
幾つかの実施形態において、リガンド－エリブリン若しくはその誘導体の複合体は、Ｄが
Figure 2023535598000011
で示される。
幾つかの実施形態において、Ｐｃ－（Ｌ－Ｄ）ｋで示されるリガンド－エリブリン若しくはその誘導体の複合体は、ｋが１～１０から選ばれ、整数でも小数でもよい。
幾つかの実施形態において、リンカーが細胞外で安定していることで、リガンド－エリブリン若しくはその誘導体の複合体は、細胞外環境において無傷のままにされるが、がん細胞に内在化される場合に切断可能である。
幾つかの実施形態において、リガンド薬物複合体が抗原を発現した細胞に入り込んだ時、複合体中の薬物部分はリガンド部分から切断され、且つ薬物（例えば、エリブリン若しくはその誘導体）を切断して放出する。
幾つかの実施形態において、リンカーは切断可能な部分を含み、そのうち、切断可能な部分の存在する位置により、切断後に薬物（例えばエリブリン誘導体）には、残ったリンカーとＰｃがなくなる。
幾つかの実施形態において、リンカー中の切断可能な部分は、切断可能なペプチド部分（ｍｏｉｅｔｙ）である。
幾つかの実施形態において、切断可能なペプチド部分を含むガンド薬物複合体は、比較的低い凝集レベル、改善されたリガンドと薬物の比率、向上したがん細胞のオンターゲット殺傷、低下した非がん細胞のオフターゲット殺傷、及び／又は比較的高い薬物負荷（ｐ）を示している。
幾つかの実施形態において、切断不可なリンカーに対して、切断可能な部分を追加することにより、細胞毒性及び／又は効果を増加させる。幾つかの実施形態において、中等レベルの抗原（例えば、ＣＤ７９Ｂ）を発現したがんにおいて効果及び／又は細胞毒性を増加させる。幾つかの実施形態において、切断可能なペプチド部分は酵素によって切断することができ、且つリンカーは酵素によって切断可能なものである。幾つかの実施形態において、リンカーはカテプシンによって切断可能なものである。幾つかの実施形態において、酵素によって切断可能なリンカー（例えば、カテプシンによって切断可能なリンカー）は、上記の改善された特性の１つ又は複数を示す。
幾つかの実施形態において、リンカーはアミノ酸ユニット（即ち、２～７個のアミノ酸からなるペプチド残基）を含み、上記アミノ酸は、好ましくはフェニルアラニン、グリシン、バリン、リジン、シトルリン、セリン、グルタミン酸、アスパラギン酸、より好ましくはバリン－シトルリン（Ｖａｌ－Ｃｉｔ）、アラニン－アラニン－アスパラギン（Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｓｎ）、グリシン－グリシン－リジン（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－ｌｙｓ）、バリン－リジン（Ｖａｌ－ｌｙｓ）、バリン－アラニン（Ｖａｌ－Ａｌａ）、バリン－フェニルアラニン（Ｖａｌ－Ｐｈｅ）又はグリシン－グリシン－フェニルアラニン－グリシン（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ）から選ばれる。
幾つかの実施形態において、本開示の複合体中のリンカーは、
Figure 2023535598000012
から選ばれる。
幾つかの実施形態において、アミノ酸ユニットはバリン－シトルリン（Ｖａｌ－Ｃｉｔ）を含む。
幾つかの実施形態において、Ｖａｌ－Ｃｉｔを含むＡＤＣは、向上した安定性、低下した細胞のオフターゲット殺傷、向上した細胞のオンターゲット殺傷、比較的低い凝集レベル、及び／又は比較的高い薬物負荷を示す。
一方、幾つかの実施形態により提供されたリンカーは、切断可能なスルホンアミド部分を含み、上記リンカーは還元条件下で切断可能である。
幾つかの実施形態において、上記リンカーは切断可能なジスルフィド部分を含み、上記リンカーは還元条件下で切断可能である。
一方、本開示に係るリンカーは、Ｄ（例えば、エリブリン誘導体）を、切断可能な部分に結合する少なくとも１つのスペーサーユニットを含む。
幾つかの実施形態において、上記スペーサーユニットは、ｐ－アミノベンジルオキシカルボニル（ＰＡＢ）、
Figure 2023535598000013
を含む。
一方、幾つかの実施形態により提供された複合体は、下記の式で示される：
Figure 2023535598000014
、ｋは１～１０から選ばれ、整数でも小数でもよく、ｐ１は２、４、６又は８から選ばれ、
Figure 2023535598000015
、ｋは１～１０から選ばれ、整数でも小数でもよく、ｐ１は２、４、６又は８から選ばれ、Ｐ３は０、１又は２から選ばれ、
Figure 2023535598000016
、ｋは１～１０から選ばれ、整数でも小数でもよく、ｐ１は２、４、６又は８から選ばれ、
Figure 2023535598000017
、ｋは１～１０から選ばれ、整数でも小数でもよく、ｐ１は２、４、６又は８から選ばれ、ｐ３は０、１又は２から選ばれ、
Figure 2023535598000018
、ｋは１～１０から選ばれ、整数でも小数でもよく、ｐ２は２、４、６又は８から選ばれ、
Figure 2023535598000019
、ｋは１～１０から選ばれ、整数でも小数でもよく、ｐ２は２、４、６又は８から選ばれ、
Figure 2023535598000020
、ｋは１～１０から選ばれ、整数でも小数でもよく、ｐ２は２、４、６又は８から選ばれ、
Figure 2023535598000021
、ｋは１～１０から選ばれ、整数でも小数でもよく、ｐ２は２、４、６又は８から選ばれ、
Figure 2023535598000022
、
ｋは１～１０から選ばれ、整数でも小数でもよく、ｐ２は２、４、６又は８から選ばれ、
Figure 2023535598000023
、ｋは１～１０から選ばれ、整数でも小数でもよく、Ｐ１は２、４、６又は８から選ばれ、Ｐ３は０、１又は２から選ばれ、
Figure 2023535598000024
、ｋは１～１０から選ばれ、整数でも小数でもよく、Ｐ１は２、４、６又は８から選ばれ、Ｐ３は０、１又は２から選ばれる。
幾つかの上記形態において、上記複合体は、
Figure 2023535598000025
で示され、そのうち、ｋは１～１０から選ばれ、整数でも小数でもよく、更に、Ｄにおいて、Ｒ１ａはメチル基から選ばれることが好ましく、Ｒ１ｂは水素から選ばれることが好ましい。
本開示は、式Ｄ（Ｅｒｉｂｕｌｉｎ）で示される化合物、
Figure 2023535598000026
 、又はその薬用可能な塩を更に提供し、
そのうち、
Ｒ１ａは水素、アルキル基（例えば、Ｃ１－６アルキル基であり、メチル基、エチル基、イソプロピル基を含むが、これらに限定されない）、シクロアルキル基（例えば、Ｃ３－８シクロアルキル基であり、シクロプロピル基、シクロペンチル基又はシクロヘキシル基を含むが、これらに限定されない）、アリール基及びヘテロアリール基から選ばれ、上記アルキル基、シクロアルキル基、アリール基及びヘテロアリール基は、それぞれ独立して任意選択的にアルキル基（例えば、Ｃ１－６アルキル基であり、メチル基、エチル基、イソプロピル基を含むが、これらに限定されない）、アルコキシ基（例えば、Ｃ１－６アルコキシ基であり、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基を含むが、これらに限定されない）、ハロゲン（例えば、フッ素、塩素、臭素）、重水素、アミノ基、シアノ基、ニトロ基、ヒドロキシ基、ヒドロキシアルキル基、シクロアルキル基、ヘテロシクリル基、アリール基及びヘテロアリール基から選ばれる１つ又は複数の置換基で置換され、好ましくは、Ｒ１ａはメチル基であり、
Ｒ１ｂは水素、アルキル基（例えば、Ｃ１－６アルキル基であり、メチル基、エチル基、イソプロピル基を含むが、これらに限定されない）、アルコキシ基、シクロアルキル基（例えば、Ｃ３－８シクロアルキル基であり、シクロプロピル基、シクロペンチル基又はシクロヘキシル基を含むが、これらに限定されない）、アリール基及びヘテロアリール基から選ばれ、上記アルキル基、シクロアルキル基、アリール基及びヘテロアリール基は、それぞれ独立して任意選択的にアルキル基（例えば、Ｃ１－６アルキル基であり、メチル基、エチル基、イソプロピル基を含むが、これらに限定されない）、アルコキシ基（例えば、Ｃ１－６アルコキシ基であり、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基を含むが、これらに限定されない）、ハロゲン（例えば、フッ素、塩素、臭素）、重水素、アミノ基、シアノ基、ニトロ基、ヒドロキシ基、ヒドロキシアルキル基、シクロアルキル基、ヘテロシクリル基、アリール基及びヘテロアリール基から選ばれる１つ又は複数の置換基で置換され、好ましくは、Ｒ１ｂは水素、メチル基であり、又は
Ｒ１ａとＲ１ｂは、それらに連結された炭素原子と共にＣ５－８ヘテロシクロアルキル基を形成し、上記ヘテロシクロアルキル基は、任意選択的にアルキル基（例えば、Ｃ１－６アルキル基であり、メチル基、エチル基、イソプロピル基を含むが、これらに限定されない）、アルコキシ基（例えば、Ｃ１－６アルコキシ基であり、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基を含むが、これらに限定されない）、ハロゲン（例えば、フッ素、塩素、臭素）、重水素、アミノ基、シアノ基、ニトロ基、ヒドロキシ基、ヒドロキシアルキル基、シクロアルキル基（例えば、Ｃ３－８シクロアルキル基であり、シクロプロピル基、シクロペンチル基又はシクロヘキシル基を含むが、これらに限定されない）、ヘテロシクリル基、アリール基及びヘテロアリール基のうちの１つ又は複数の置換基で置換され、且つＲ１ａとＲ１ｂは同時に水素になることはない。
幾つかの実施形態において、式Ｄ（Ｅｒｉｂｕｌｉｎ）で示される化合物において、Ｒ１ａとＲ１ｂはそれぞれ独立的にＣ１－６アルキル基から選ばれ、メチル基、エチル基、イソプロピル基を含むが、これらに限定されない。
幾つかの実施形態において、式Ｄ（Ｅｒｉｂｕｌｉｎ）で示される化合物において、Ｒ１ａはＣ１－６アルキル基から選ばれ、メチル基、エチル基、イソプロピル基を含むが、これらに限定されず、Ｒ１ｂは水素から選ばれる。
幾つかの実施形態において、式Ｄ（Ｅｒｉｂｕｌｉｎ）で示される化合物において、Ｒ１ａとＲ１ｂは、それらに連結された炭素原子と共にＣ６－８ヘテロシクロアルキル基を形成する。
幾つかの実施形態において、式Ｄ（Ｅｒｉｂｕｌｉｎ）で示される化合物は、
Figure 2023535598000027
 である。
幾つかの実施形態において、式Ｄ（Ｅｒｉｂｕｌｉｎ）で示される化合物は、
Figure 2023535598000028
 である。
幾つかの実施形態において、式Ｄ（Ｅｒｉｂｕｌｉｎ）で示される化合物は、
Figure 2023535598000029
 である。
本開示は、式ＤＺ（Ｅｒｉｂｕｌｉｎ）で示される化合物、
Figure 2023535598000030
 、又はその薬用可能な塩を更に提供し、
そのうち、Ｒ１ａは水素、アルキル基（例えば、Ｃ１－６アルキル基であり、メチル基、エチル基、イソプロピル基を含むが、これらに限定されない）、シクロアルキル基（例えば、Ｃ３－８シクロアルキル基であり、シクロプロピル基、シクロペンチル基又はシクロヘキシル基を含むが、これらに限定されない）、アリール基及びヘテロアリール基から選ばれ、上記アルキル基、シクロアルキル基、アリール基及びヘテロアリール基は、それぞれ独立して任意選択的にアルキル基（例えば、Ｃ１－６アルキル基であり、メチル基、エチル基、イソプロピル基を含むが、これらに限定されない）、アルコキシ基（例えば、Ｃ１－６アルコキシ基であり、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基を含むが、これらに限定されない）、ハロゲン（例えば、フッ素、塩素、臭素）、重水素、アミノ基、シアノ基、ニトロ基、ヒドロキシ基、ヒドロキシアルキル基、シクロアルキル基、ヘテロシクリル基、アリール基及びヘテロアリール基から選ばれる１つ又は複数の置換基で置換され、好ましくは、Ｒ１ａはメチル基であり、
Ｒ１ｂは水素、アルキル基（例えば、Ｃ１－６アルキル基であり、メチル基、エチル基、イソプロピル基を含むが、これらに限定されない）、シクロアルキル基（例えば、Ｃ３－８シクロアルキル基であり、シクロプロピル基、シクロペンチル基又はシクロヘキシル基を含むが、これらに限定されない）、アルコキシ基、アリール基及びヘテロアリール基から選ばれ、上記アルキル基、シクロアルキル基、アリール基及びヘテロアリール基は、それぞれ独立して任意選択的にアルキル基（例えば、Ｃ１－６アルキル基であり、メチル基、エチル基、イソプロピル基を含むが、これらに限定されない）、アルコキシ基（例えば、Ｃ１－６アルコキシ基であり、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基を含むが、これらに限定されない）、ハロゲン（例えば、フッ素、塩素、臭素）、重水素、アミノ基、シアノ基、ニトロ基、ヒドロキシ基、ヒドロキシアルキル基、シクロアルキル基、ヘテロシクリル基、アリール基及びヘテロアリール基から選ばれる１つ又は複数の置換基で置換され、好ましくは、Ｒ１ｂは水素であり、
或いは、Ｒ１ａとＲ１ｂは、それらに連結された炭素原子と共にＣ５－８ヘテロシクロアルキル基を形成し、上記ヘテロシクロアルキル基は、任意選択的にアルキル基（例えば、Ｃ１－６アルキル基であり、メチル基、エチル基、イソプロピル基を含むが、これらに限定されない）、アルコキシ基（例えば、Ｃ１－６アルコキシ基であり、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基を含むが、これらに限定されない）、ハロゲン（例えば、フッ素、塩素、臭素）、重水素、アミノ基、シアノ基、ニトロ基、ヒドロキシ基、ヒドロキシアルキル基、シクロアルキル基（例えば、Ｃ３－８シクロアルキル基であり、シクロプロピル基、シクロペンチル基又はシクロヘキシル基を含むが、これらに限定されない）、ヘテロシクリル基、アリール基及びヘテロアリール基のうちの１つ又は複数の置換基で置換され、且つＲ１ａとＲ１ｂは同時に水素になることはなく、
Ｙは、－Ｏ（ＣＲａＲｂ）ｍ２－ＣＲ８Ｒ９－Ｃ（Ｏ）－、－ＮＨ－（ＣＲａＲｂ）ｍ２－ＣＲ８Ｒ９－Ｃ（Ｏ）－、－Ｏ－ＣＲ８Ｒ９（ＣＲａＲｂ）ｍ２－、－ＯＣＲ８Ｒ９－Ｃ（Ｏ）－、－Ｏ（ＣＲａＲｂ）ｍ２Ｃ（Ｏ）－又は－Ｓ－（ＣＲａＲｂ）ｍ２－ＣＲ８Ｒ９－Ｃ（Ｏ）－から選ばれ、そのうち、ＲａとＲｂは相同又は相異であり、且つそれぞれ独立的に水素、重水素原子、ハロゲン又はアルキル基から選ばれ、Ｒ８は水素、Ｃ３－６シクロアルキル基アルキル基又はＣ３－６シクロアルキル基から選ばれ、Ｒ９は水素、ハロアルキル基又はＣ３－６シクロアルキル基から選ばれ、好ましくは水素であり、或いは、Ｒ８とＲ９は、それに連結された炭素原子と共にＣ３－６シクロアルキル基を形成し、ｍ２は０、１、２又は３から選ばれる。
幾つかの実施形態において、式ＤＺ（Ｅｒｉｂｕｌｉｎ）で示される化合物には、Ｒ１ａとＲ１ｂはそれぞれ独立的にＣ１－６アルキル基から選ばれ、メチル基、エチル基、イソプロピル基を含むが、これらに限定されない。
幾つかの実施形態において、式ＤＺ（Ｅｒｉｂｕｌｉｎ）で示される化合物には、Ｒ１ａはＣ１－６アルキル基から選ばれ、メチル基、エチル基、イソプロピル基を含むが、これらに限定されず、Ｒ１ｂは水素から選ばれる。
幾つかの実施形態において、式ＤＺ（Ｅｒｉｂｕｌｉｎ）で示される化合物には、Ｒ１ａとＲ１ｂは、それらに連結された炭素原子と共にＣ６－８ヘテロシクロアルキル基を形成する。
幾つかの実施形態において、ＤＺ（Ｅｒｉｂｕｌｉｎ）で示される化合物は、
Figure 2023535598000031
 、又はその薬用可能な塩であり、
そのうち、Ｒ８は水素、Ｃ３－６シクロアルキルアルキル基又はＣ３－６シクロアルキル基から選ばれ、Ｒ９は水素、ハロアルキル基又はＣ３－６シクロアルキル基から選ばれ、好ましくは水素であり、或いは、Ｒ８とＲ９は、それらに連結された炭素原子とともＣ３－６シクロアルキル基を形成し、ｍ２は０、１、２又は３から選ばれる。
幾つかの実施形態において、ＤＺ（Ｅｒｉｂｕｌｉｎ）で示される化合物は、
Figure 2023535598000032
から選ばれる。
一方、幾つかの実施形態により提供されるＤＺ（Ｅｒｉｂｕｌｉｎ）で示される化合物は、１つ又は複数の不斉中心を含んでもよく、例えば、
Figure 2023535598000033
であってもよい。
上記実施形態において、Ｐｃは、本開示に係る任意の抗ＣＤ７９Ｂ抗体又はその抗原結合断片であり、好ましくは、配列番号２８で示される重鎖と配列番号２９で示される軽鎖を含む抗体、又は配列番号３０で示される重鎖と配列番号３１で示される軽鎖を含む抗体である。
幾つかの具体的な実施形態において、本開示の複合体は、その互変異性体、メソ体、ラセミ体、エナンチオマー、ジアステレオマー、重水素化物、又はその混合物の形態を含む。
ここで、ＣＮ２０２０１００７３６７１．６における化合物及びその調製方法が全て援用されている。
リガンド－薬物（ＭＭＡＥ若しくはその誘導体）の複合体
本開示は、一般式（Ｄ（ＭＭＡＥ））で示される化合物、即ち、
Figure 2023535598000034
 、又はその薬用可能な塩であり、そのうち、
Ｒ１～Ｒ６は、水素原子、ハロゲン、ヒドロキシ基、シアノ基、アルキル基、アルコキシ基及びシクロアルキル基から選ばれ、
Ｒ７は水素原子、アルキル基、アルコキシ基及びシクロアルキル基から選ばれ、
Ｒ８～Ｒ１１のうちの何れか２つはシクロアルキル基を形成し、残りの２つの基は任意に水素原子、アルキル基及びシクロアルキル基から選ばれ、
Ｒ１２は、水素原子又はアルキル基から選ばれ、
Ｒ１３～Ｒ１５は、水素原子、ヒドロキシ基、アルキル基、アルコキシ基又はハロゲンから選ばれ、
Ｒ１６はアリール基又はヘテロアリール基から選ばれ、上記アリール基又はヘテロアリール基は、任意選択的に更に水素原子、ハロゲン、ヒドロキシ基、アルキル基、アルコキシ基とシクロアルキル基から選ばれる置換基で置換される、
ＭＭＡＥ類似体／誘導体を提供する。
本開示の幾つかの実施形態において、上記一般式（Ｄ（ＭＭＡＥ））で示される化合物は、一般式（Ｄ（ＭＭＡＥ）１）で示される化合物、即ち、
Figure 2023535598000035
 、又はその薬用可能な塩であり、
Ｒ９とＲ１０はシクロアルキル基を形成し、
Ｒ２～Ｒ８、Ｒ１１～Ｒ１６は、一般式（Ｄ）に定義された通りである。
本開示の幾つかの実施形態において、上記一般式（Ｄ（ＭＭＡＥ））で示される化合物は、
Figure 2023535598000036
 である。
本開示の別の態様は、リガンド－薬物複合体又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物に関し、そのうち、上記リガンド－薬物複合体は、式（－Ｄ（ＭＭＡＥ））で示される構造、即ち、
Figure 2023535598000037
 、又はその薬用可能な塩であり、
そのうち、
Ｒ２～Ｒ６は、水素原子、ハロゲン、ヒドロキシ基、シアノ基、アルキル基、アルコキシ基及びシクロアルキル基から選ばれ、
Ｒ７は水素原子、アルキル基、アルコキシ基及びシクロアルキル基から選ばれ、
Ｒ８～Ｒ１１のうちの何れか２つはシクロアルキル基を形成し、残りの２つの基は任意に水素原子、アルキル基及びシクロアルキル基から選ばれ、
Ｒ１２は、水素原子又はアルキル基から選ばれ、
Ｒ１３～Ｒ１５は、水素原子、ヒドロキシ基、アルキル基、アルコキシ基又はハロゲンから選ばれ、
Ｒ１６はアリール基又はヘテロアリール基から選ばれ、上記アリール基又はヘテロアリール基は、任意選択的に更に水素原子、ハロゲン、ヒドロキシ基、アルキル基、アルコキシ基及びシクロアルキル基から選ばれる置換基で置換され、
波線は水素原子を示し、或いは、リンカー又は抗体との共有結合を示す。
本開示の幾つかの実施形態において、上記リガンド－ＭＭＡＥ若しくはその誘導体の複合体又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物は、式（－Ｄ（ＭＭＡＥ）１）で示される構造を含む：
Figure 2023535598000038
 そのうち、
Ｒ９とＲ１０はシクロアルキル基を形成し、
波線、Ｒ２～Ｒ８、Ｒ１１～Ｒ１６は、一般式（Ｄ（ＭＭＡＥ））に定義された通りである。
本開示の幾つかの実施形態において、上記リガンド－ＭＭＡＥ若しくはその誘導体の複合体又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物であって、上記リガンド－ＭＭＡＥ若しくはその誘導体の複合体は、下記の式で示される構造を含む：
Figure 2023535598000039
 波線は水素原子を示し、或いは、リンカー又は抗体との共有結合を示す。
本開示の幾つかの実施形態において、上記リガンド－ＭＭＡＥ若しくはその誘導体の複合体又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物は、式（ＩＶ）で示される：
Figure 2023535598000040
 式（ＩＶ）
そのうち、Ｒ２はＣ１－Ｃ８アルキル基であり、
Ｒ３はＣ１－Ｃ８アルキル基であり、
Ｒ４はＣ１－Ｃ８アルキル基であり、
Ｒ５はＨであり、
Ｒ６はＣ１－Ｃ８アルキル基であり、
Ｒ７はＣ１－Ｃ８アルキル基であり、
Ｒ８は互いに独立的で、それぞれＯ－（Ｃ１－Ｃ８アルキル基）であり、
Ｒ９はＨであり、
Ｒ１０はフェニル基であり、
ＺはＯ又はＮＨであり、
Ｒ１１は、Ｈ、Ｃ１－Ｃ２０アルキル基又は－（Ｒ１３Ｏ）ｍ－Ｒ１４から選ばれ、
ｍは３であり、
Ｒ１３はＣ２－Ｃ８アルキル基であり、
Ｒ１４はＣ１－Ｃ８アルキル基であり、
Ｐｃは、本開示の抗ＣＤ７９Ｂ抗体又はその抗原結合断片であり、Ｌはリンカーであり、ｎは１～１０であり、整数でも小数でもよい。
幾つかの具体的な実施形態において、上記リガンド－ＭＭＡＥ若しくはその誘導体の複合体又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物は、
Figure 2023535598000041
 という構造を含む。
本開示の幾つかの実施形態において、上記リガンド－ＭＭＡＥ若しくはその誘導体の複合体又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物は、式（Ｐｃ－Ｌ－Ｄ（ＭＭＡＥ））で示される：
Figure 2023535598000042
 式（Ｖ）
そのうち、
Ｒ２～Ｒ１６は、一般式（Ｄ（ＭＭＡＥ））に定義された通りであり、
ｎは１～１０であり、整数でも小数でもよく、
Ｐｃは、本開示に係る抗ＣＤ７９Ｂ抗体又はその抗原結合断片であり、Ｌはリンカーである。
本開示の幾つかの実施形態において、上記リガンド－ＭＭＡＥ若しくはその誘導体の複合体又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物は、一般式（Ｐｃ－Ｌ－Ｄ１）で示されるリガンド－ＭＭＡＥ若しくはその誘導体の複合体又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物であり、
Figure 2023535598000043
 式（ＶＩ）
そのうち、
Ｒ２～Ｒ１６は、一般式（－Ｄ（ＭＭＡＥ））に定義された通りであり、
Ｐｃ、Ｌ、ｎは、一般式（Ｐｃ－Ｌ－Ｄ（ＭＭＡＥ））に定義された通りである。
本開示の幾つかの実施形態において、上記リガンド－ＭＭＡＥ若しくはその誘導体の複合体又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物は、下記の一般式で示される：
Figure 2023535598000044
 式（ＶＩＩ）
Ｐｃ、Ｌ、ｎは、一般式（Ｐｃ－Ｌ－Ｄ（ＭＭＡＥ））に定義された通りである。
本開示の幾つかの実施形態において、上記リガンド－ＭＭＡＥ若しくはその誘導体の複合体又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物には、ｎは１～８であり、整数でも小数でもよく、好ましくは１～６であり、整数でも小数でもよい。
本開示の幾つかの実施形態において、上記リガンド－ＭＭＡＥ若しくはその誘導体の複合体又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物には、リンカーは－Ｙ－Ｌ１－Ｌ２－Ｌ３－Ｌ４であり、
Ｙはストレッチユニット（ｓｔｒｅｔｃｈｅｒ ｕｎｉｔ）であり、
Figure 2023535598000045
又は化学結合から選ばれ、Ｘ１は水素原子、アルキル基、アルコキシ基、アリール基又はハロゲンから選ばれ、Ｘ２はアルキレン基から選ばれ、上記アルキレン基は、任意選択的に更にハロゲン、ヒドロキシ基、シアノ基、アミノ基、アルキル基、クロロアルキル基、重水素化アルキル基、アルコキシ基及びシクロアルキル基から選ばれる１つ又は複数の置換基で置換され、
Ｌ１はストレッチユニットであり、－（スクシンイミド－３－イル－Ｎ）－Ｗ－Ｃ（Ｏ）－、－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）－ＮＲ１７－Ｗ－Ｃ（Ｏ）－又は－Ｃ（Ｏ）－Ｗ－Ｃ（Ｏ）－から選ばれ、そのうち、ＷはＣ１－８アルキル基、Ｃ１－８アルキル－シクロアルキル基又は１～８個の原子の直鎖ヘテロアルキル基から選ばれ、上記ヘテロアルキル基は、Ｎ、Ｏ又はＳから選ばれる１～３個のヘテロ原子を含み、そのうち、上記Ｃ１－８アルキル基、シクロアルキル基及び直鎖ヘテロアルキル基はそれぞれ独立して任意選択的に更にハロゲン、ヒドロキシ基、シアノ基、アミノ基、アルキル基、クロロアルキル基、重水素化アルキル基、アルコキシ基及びシクロアルキル基から選ばれる１つ又は複数の置換基で置換され、
Ｌ２は－ＮＲ１８（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｐ１ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）－、－ＮＲ１８（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｐ１ＣＨ２Ｃ（Ｏ）－、－Ｓ（ＣＨ２）ｐ１Ｃ（Ｏ）－又は化学結合から選ばれ、そのうち、ｐ１は１～２０の整数であり、好ましくは化学結合であり、
Ｌ３は、２～７個のアミノ酸からなるペプチド残基であり、上記アミノ酸は、バリン、シトルリン、メチルバリンから選ばれることが好ましく、そのうち、アミノ酸は、任意選択的に更にハロゲン、ヒドロキシ基、シアノ基、アミノ基、アルキル基、クロロアルキル基、重水素化アルキル基、アルコキシ基及びシクロアルキル基から選ばれる１つ又は複数の置換基で置換され、
Ｒ１７とＲ１８は相同又は相異であり、且つそれぞれ独立的に水素原子、アルキル基、ハロアルキル基、重水素化アルキル基及びヒドロキシアルキル基から選ばれ、
Ｌ４は伸長ユニット（ｅｘｔｅｎｔｉｏｎ ｕｎｉｔ）であり、好ましくはＰＡＢである。
本開示の幾つかの実施形態において、上記リガンド－ＭＭＡＥ若しくはその誘導体の複合体又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物には、Ｙは
Figure 2023535598000046
から選ばれる。
本開示の幾つかの実施形態において、上記リガンド－ＭＭＡＥ若しくはその誘導体の複合体又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物には、Ｌ１は、－（スクシンイミド－３－イル－Ｎ）－（ＣＨ２）ｓ１－Ｃ（Ｏ）－から選ばれ、そのうち、ｓ１は２～８の整数であり、好ましくは
Figure 2023535598000047
である。
本開示の幾つかの実施形態において、上記リガンド－ＭＭＡＥ若しくはその誘導体の複合体又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物には、Ｌ３はジペプチドアミノ酸ユニットであり、好ましくはバリン－シトルリンから選ばれる。
本開示の幾つかの実施形態において、上記リガンド－ＭＭＡＥ若しくはその誘導体の複合体又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物には、リンカーは、
Figure 2023535598000048
から選ばれ、
そのうち、ａ末端はリガンドに連結され、ｂ末端は薬物に連結される。
本開示の幾つかの実施形態において、上記リガンド－ＭＭＡＥ若しくはその誘導体の複合体又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物は、
Figure 2023535598000049
又は
Figure 2023535598000050
という構造式から選ばれ、そのうち、
ｎは１～１０であり、整数でも小数でもよく、
Ｐｃは、本開示に係る抗ＣＤ７９Ｂ抗体又はその抗原結合断片であり、好ましくは、配列番号２８で示される重鎖と配列番号２９で示される軽鎖と含む抗体、又は配列番号３０で示される重鎖と配列番号３１で示される軽鎖を含む抗体である。
本開示の別の態様は、一般式（Ｄ（ＭＭＡＥ））で示される化合物、又はその薬用可能な塩を調製する方法であって、
Figure 2023535598000051
 一般式（－ＤＡ（ＭＭＡＥ））を脱保護反応させ、一般式（－Ｄ（ＭＭＡＥ））で示される化合物を得るステップを含み、
そのうち、Ｒ２～Ｒ１６は、一般式（Ｄ）に定義された通りである、
方法に関する。
本開示の別の態様は、本開示に係るリガンド－薬物複合体を調製する中間体とする可能な、下記のような化合物：
Figure 2023535598000052
、又はその薬用可能な塩に関する。
本開示の別の態様は、化合物２（ＭＭＡＥ）、又はその薬用可能な塩を調製する方法であって、
Figure 2023535598000053
化合物１（ＭＭＡＥ）と化合物２ａ（ＭＭＡＥ）を縮合反応させ、化合物２（ＭＭＡＥ）を得るステップを含む、
方法に関する。
本開示の別の態様は、一般式（Ｐｃ－Ｌ－Ｄ（ＭＭＡＥ））で示されるリガンド－薬物複合体又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物を調製する方法であって、
Figure 2023535598000054
 Ｐｃを還元した後、化合物２（ＭＭＡＥ）とカップリング反応させ、一般式（ＡＤＣ（ＭＭＡＥ）－１）で示される化合物を得るステップを含み、
そのうち、Ｐｃ、ｎは、一般式（Ｐｃ－Ｌ－Ｄ（ＭＭＡＥ））に定義された通りである、
方法に関する。
本開示のＭＭＡＥ及びその誘導体の合成という目的を達成するために、本開示は、以下の合成技術案を採用する。
技術案１：
本開示に係る一般式（Ｄ（ＭＭＡＥ））で示される化合物、又はその薬用可能な塩の方法であって、それは、
Figure 2023535598000055
 一般式（ＤＡ（ＭＭＡＥ））を塩基性条件下で脱保護反応させ、一般式（Ｄ（ＭＭＡＥ））で示される化合物を得るステップを含み、
そのうち、Ｒ２～Ｒ１６は、一般式（Ｄ（ＭＭＡＥ））に定義された通りである。
塩基性条件を提供する試薬は、有機塩基と無機塩基類を含み、上記有機塩基類は、トリエチルアミン、ジエチルアミン、Ｎ－メチルモルホリン、ピリジン、ヘキサヒドロピリジン、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン、ｎ－ブチルリチウム、リチウムジイソプロピルアミド、酢酸カリウム、ナトリウムｔｅｒｔ－ブトキシド又はカリウムｔｅｒｔ－ブトキシドを含むが、これらに限定されず、上記無機塩基類は、水素化ナトリウム、リン酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸セシウム、水酸化ナトリウムと水酸化カリウムを含むが、これらに限定されず、好ましくはジエチルアミンである。
技術案２：
本開示の化合物２（ＭＭＡＥ）若しくはその薬用可能な塩又は溶剤和物の調製方法であって、当該方法は、
Figure 2023535598000056
化合物（１（ＭＭＡＥ））と化合物（２ａ（ＭＭＡＥ））に塩基性条件下で縮合剤を加え、縮合反応を行い、化合物２を得ることを含む。
塩基性条件を提供する試薬は、有機塩基と無機塩基類を含み、上記有機塩基類は、トリエチルアミン、ジエチルアミン、Ｎ－メチルモルホリン、ピリジン、ヘキサヒドロピリジン、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン、ｎ－ブチルリチウム、リチウムジイソプロピルアミド、酢酸カリウム、ナトリウムｔｅｒｔ－ブトキシド又はカリウムｔｅｒｔ－ブトキシドを含むが、これらに限定されず、上記無機塩基類は、水素化ナトリウム、リン酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸セシウム、水酸化ナトリウム及び水酸化カリウムを含むが、これらに限定されず、好ましくはＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンである。
縮合剤は、４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド、１－ヒドロキシベンゾトリアゾールと１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド塩酸塩、Ｎ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド、Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド、Ｏ－ベンゾトリアゾール－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムテトラフルオロボラート、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール、１－ヒドロキシ－７－アザベンゾトリアゾール、Ｏ－ベンゾトリアゾール－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート、２－（７－アザベンゾトリアゾール）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート、ベンゾトリアゾール－１－イルオキシトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスファート又はベンゾトリアゾール－１－イル－オキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスファートから選ばれ、好ましくは４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド又は１－ヒドロキシベンゾトリアゾール及び１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド塩酸塩であり、好ましくは１－ヒドロキシベンゾトリアゾールである。
技術案３：
本開示に係る一般式（Ｐｃ－Ｌ－Ｄ）で示されるリガンド－薬物複合体又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物の方法であって、それは、
Figure 2023535598000057
 Ｐｃを還元した後、化合物２（ＭＭＡＥ）とカップリング反応させ、一般式（ＡＤＣ（ＭＭＡＥ）－１）で示される化合物を得るステップを含み、還元剤はＴＣＥＰが好ましく、特に、好ましくは還元抗体におけるジスルフィド結合であり、
そのうち、Ｐｃ、ｎは、一般式（Ｐｃ－Ｌ－Ｄ（ＭＭＡＥ））に定義された通りである、
方法に関する。
実施例の化合物
本開示は、下記から選ばれる：
Figure 2023535598000058

Figure 2023535598000059

Figure 2023535598000060

Figure 2023535598000061

Figure 2023535598000062
そのうち、Ｐｃは、本開示に係る任意の抗ＣＤ７９Ｂ抗体又はその抗原結合断片であり、ｎは１～１０であり、整数でも小数でもよい、
リガンド－薬物複合体又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物を提供する。
幾つかの具体的な実施形態において、Ｐｃは、本開示の実施例における抗ＣＤ７９Ｂ抗体又はその抗原結合断片であり、例えば、配列番号２８で示される重鎖と配列番号２９で示される軽鎖を含む抗体、又は配列番号３０で示される重鎖と配列番号３１で示される軽鎖を含む抗体であり、ｎは１～６の間の整数又は小数である。
幾つかの具体的なの実施形態において、本開示に係る抗体薬物複合体の平均ＤＡＲ値は１～１０であってもよく、例えば、２～８、又は２～６、又は１～６、又は４～６の間の任意値である。
便宜上、上記構造式の全てを特定の異性体形態で表しているが、本開示は、互変異性体、回転異性体、幾何異性体、ジアステレオマー、ラセミ体及びエナンチオマーなどの全ての異性体を含んでもよい。
互変異性体は構造異性体であり、互変異性化と呼ばれる化学反応により容易に相互変換される。このような反応は、単結合と隣接する二重結合の変換を伴う水素原子又はプロトンの移動を引き起こすことがよくある。幾つかのよく見られる互変異性体対は、ケト－エノール、ラクタム－ラクチムである。ラクタム－ラクチム平衡の例は、以下に示すようなＡとＢの間である。
Figure 2023535598000063
本開示における全ての化合物は、Ａ型又はＢ型として示すことができる。全ての互変異性体形態は本開示の範囲にある。化合物の命名は、何れの互変異性体も排除しない。
医薬組成物
本開示は、上記のような複合体と、薬用可能な賦形剤、希釈又はベクターとを含む医薬組成物を更に提供する。
用途
本開示は、本開示による抗ＣＤ７９Ｂ抗体又はその抗原結合断片、本開示による複合体、本開示による医薬組成物から選ばれる何れか一項又は組み合わせの薬剤の調製における用途を更に提供し、そのうち、上記抗体又はその抗原結合断片又はその薬物複合体は、増殖性疾患を治療し、又は増殖性疾患の進行を遅延することに用いられ、上記増殖性疾患は、がん又は腫瘍であってもよく、上記がん又は腫瘍は、リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、攻撃性ＮＨＬ、再発性攻撃性ＮＨＬ、再発性無痛性ＮＨＬ、難治性ＮＨＬ、難治性無痛性ＮＨＬ、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、小リンパ球性リンパ腫、白血病、毛細胞白血病（ＨＣＬ）、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、及び／又はマントル細胞リンパ腫から選ばれる。
治療方法
本開示は、増殖性疾患を治療又は予防し、又は増殖性疾患の進行を遅延する方法を提供し、当該方法は、対象に治療又は疾患遅延有効量の本開示による抗ＣＤ７９Ｂ抗体又はその抗原結合断片、又は本開示による医薬組成物、又は本開示による抗体－薬物複合体を投与することを含み、そのうち、上記増殖性疾患はがん又は腫瘍である。
本開示は、必要のあるの対象においてＢ細胞増殖性疾患又は自己免疫疾患を治療し、或いはＢ細胞増殖性疾患又は自己免疫疾患の進行を遅延する方法を提供する。幾つかの実施形態において、Ｂ細胞増殖性疾患はがん又は腫瘍である。
本開示は、細胞増殖性疾患又は自己免疫疾患を有する対象において免疫機能を向上させる方法を提供する。幾つかの実施形態において、上記細胞増殖性疾患はがん又は腫瘍である。
上記技術案におけるがん又は腫瘍は、リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、攻撃性ＮＨＬ、再発性攻撃性ＮＨＬ、再発性無痛性ＮＨＬ、難治性ＮＨＬ、難治性無痛性ＮＨＬ、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、小リンパ球性リンパ腫、白血病、毛細胞白血病（ＨＣＬ）、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、及び／又はマントル細胞リンパ腫から選ばれてもよい。
ヒトＣＤ７９Ｂ ＥＣＤ－ｈＦｃタンパク質で免疫したＢａｌｂ／ｃマウスの血清力価のＥＬＩＳＡ検出結果である。 ヒトＣＤ７９Ｂ ＥＣＤ－ｈＦｃタンパク質で免疫したＢａｌｂ／ｃマウスの血清力価のＦＡＣＳ検出結果である。 ヒトＣＤ７９Ｂ ＥＣＤ－ｈＦｃタンパク質で免疫したＳＪＬマウスの血清力価のＥＬＩＳＡ検出結果である。 ヒトＣＤ７９Ｂ ＥＣＤ－ｈＦｃタンパク質で免疫したＳＪＬマウスの血清力価のＦＡＣＳ検出結果である。 ヒトＣＤ７９Ｂ ＥＣＤ－ｈｉｓタンパク質で免疫したＳＪＬマウスの血清力価のＥＬＩＳＡ検出結果である。 ヒトＣＤ７９Ｂ ＥＣＤ－ｈｉｓタンパク質で免疫したＳＪＬマウスの血清力価のＦＡＣＳ検出結果である。 サルＣＤ７９Ｂ ＥＣＤ－ｈｉｓタンパク質で免疫したＳＪＬマウスの血清力価のＥＬＩＳＡ検出結果である。 抗ヒトＣＤ７９Ｂマウスモノクローナル抗体のＥＬＩＳＡ検出結果である。 抗ヒトＣＤ７９Ｂマウスモノクローナル抗体のＦＡＣＳ検出結果である。 抗ヒトＣＤ７９Ｂマウスモノクローナル抗体ＦＡＣＳの検出結果であり、そのうち、ｈＩｇＧ１は陰性対照抗体、ＳＮ８は陽性対照抗体である。 抗ヒトＣＤ７９Ｂマウスモノクローナル抗体の交差反応性のＦＡＣＳ検出結果である。 抗サルＣＤ７９Ｂマウスモノクローナル抗体のＥＬＩＳＡ検出結果である。 抗サルＣＤ７９Ｂマウスモノクローナル抗体のサル末梢血単核細胞との結合のＦＡＣＳ検出である。図１２Ａはサル末梢血単核細胞のＦＡＣＳによるブランク対照の検出結果、図１２Ｂは陰性対照抗体とサル末梢血単核細胞のＦＡＣＳ検出結果、図１２Ｃは陽性対照抗体とサル末梢血単核細胞のＦＡＣＳ検出結果、図１２Ｄは抗ＣＤ７９Ｂ抗体ｍＡｂ０１８とサル末梢血単核細胞のＦＡＣＳ検出結果、図１２Ｅは抗ＣＤ７９Ｂ抗体ｍＡｂ０１９とサル末梢血単核細胞のＦＡＣＳ検出結果、図１２Ｆは抗ＣＤ７９Ｂ抗体ｍＡｂ０２０とサル末梢血単核細胞のＦＡＣＳ検出結果、図１２Ｇは抗ＣＤ７９Ｂ抗体ｍＡｂ０２１とサル末梢血単核細胞のＦＡＣＳ検出結果である。使用された陽性対照は、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ社のＳＮ８である。 それぞれのＡＤＣによるヒトびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２ヌードマウス皮下移植腫瘍への治療効果である。 それぞれのＡＤＣによる担腫瘍ヌードマウス体重への影響である。 それぞれのＡＤＣによるヒトびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２ヌードマウス皮下移植腫瘍への治療効果である。 それぞれのＡＤＣによるＷＳＵ－ＤＬＣＬ２担腫瘍ヌードマウス体重への影響である。 それぞれのＡＤＣによるヒトびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２ヌードマウス皮下移植腫瘍への治療効果の腫瘍写真である。 それぞれのＡＤＣによるヒト濾胞性リンパ腫ＤＯＨＨ－２ヌードマウス皮下移植腫瘍への治療効果である。 それぞれのＡＤＣによるＤＯＨＨ－２担腫瘍ヌードマウス体重への影響である。
用語
本願が更に容易に理解されるように、以下、幾つかの技術・科学用語を具体的に定義する。本明細書の別の箇所で別途明確に定義されていない限り、本明細書に使用される他の技術・科学用語の全ては、当業者に通常理解されている意味を有する。
本願に用いられるアミノ酸の３文字コードと１文字コードは、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ、２４３、ｐ３５５８（１９６８）に記載された通りである。
「抗体」は、所望の抗原結合活性を示せば、最も広い意味で使用され、種々の抗体構造をカバーしており、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単一特異性抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、全長抗体と抗体断片（又は抗原結合断片、又は抗原結合部分）を含むが、これらに限定されない。抗体は、２本の重鎖と２本の軽鎖が鎖間ジスルフィド結合で連結してなるテトラペプチド鎖構造である免疫グロブリンを指してもよい。免疫グロブリンは、重鎖定常領域のアミノ酸組成と配列順序が異なる。これにより、免疫グロブリンは、５種類、又は、免疫グロブリンのアイソタイプと呼ばれるＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥに分けることができ、その対応する重鎖は、それぞれμ鎖、δ鎖、γ鎖、α鎖及びε鎖である。そのヒンジ領域のアミノ酸組成及び重鎖ジスルフィド結合の数と位置の差によって、同一種類のＩｇは更に異なるサブクラスに分けることができ、例えば、ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４に分けられてもよい。軽鎖は、定常領域によって、κ鎖又はλ鎖に分けられる。各種類のＩｇは何れも、κ鎖又はλ鎖を有してもよい。
抗体重鎖及び軽鎖は、Ｎ末端に近い約１１０個のアミノ酸の配列の変化が大きくて、可変領域（Ｖ領域）となり、Ｃ末端に近い残りのアミノ酸配列が比較的に安定的で、定常領域（Ｃ領域）となる。可変領域は、３つの超可変領域（ＣＤＲ）と、配列が比較的に保存的な４つのフレームワーク領域（ＦＲ）とを含む。３つの超可変領域は、抗体の特異性を決定し、相補性決定領域（ＣＤＲ）とも称される。それぞれの軽鎖可変領域（ＶＬ）及び重鎖可変領域（ＶＨ）は、３つのＣＤＲ領域と、４つのＦＲ領域とからなり、アミノ末端からカルボキシル末端へ、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順に配列される。軽鎖の３つのＣＤＲ領域はＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を指し、重鎖の３つのＣＤＲ領域はＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を指す。
本願において、本願に記載の抗体軽鎖可変領域は、軽鎖定常領域を更に含んでもよく、上記軽鎖定常領域はヒト又はマウスのκ、λ鎖又はその変異体を含む。
本願において、本願に記載の抗体重鎖可変領域は、重鎖定常領域を更に含んでもよく、上記重鎖定常領域はヒト又はマウスのＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４又はその変異体を含む。
「マウス抗体」という用語は、本願において、本分野での知識と技術により調製されたヒトＣＤ７９Ｂ又はそのエピトープに対するモノクローナル抗体である。調製時にＣＤ７９Ｂ抗原を試験対象に注射した後、所望の配列又は機能特性を持つ抗体を発現したハイブリドーマを分離する。本願の一具体的な実施形態において、上記マウス抗ヒトＣＤ７９Ｂ抗体又はその抗原結合断片は、マウスκ、λ鎖若しくはその変異体の軽鎖定常領域を更に含み、又は、マウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４若しくはその変異体の重鎖定常領域を更に含んでもよい。
「完全ヒト抗体」という用語は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列の可変と定常領域を有する抗体を含む。本開示に係る完全ヒト抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列でコードされていないアミノ酸残基（例えば、体外のランダム又は部位特異的な変異誘発、又は体内の体細胞変異により導入された変異）を含むことができる。しかし、「完全ヒト抗体」という用語は、「ヒト化抗体」を含まない。
「ヒト化抗体（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」という用語は、ＣＤＲ移植抗体（ＣＤＲ－ｇｒａｆｔｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）とも呼ばれ、非ヒトＣＤＲ配列をヒトの抗体可変領域フレームワークに移植して産生された抗体を指す。キメラ抗体が大量の非ヒトタンパク質成分を持つことにより誘導された強い免疫応答反応を克服することができる。免疫原性の低下に伴う活性の低下を回避するために、上記完全ヒト抗体可変領域に対して最も少ない逆変異を行うことにより、活性を維持することができる。
「キメラ抗体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」という用語は、第１の種の抗体の可変領域を第２の種の抗体の定常領域と融合してなる抗体であり、第１の種の抗体により誘発される免疫応答反応を低減することができる。一例として、キメラ抗体を作成するには、まず、ウサギ特異的モノクローナル抗体を分泌するウサギを作成し、上記抗体を単離し、そして必要に応じて完全ヒト抗体の定常領域遺伝子をクローニングし、ウサギ可変領域遺伝子とヒト定常領域遺伝子とをキメラ遺伝子になるように連結した後、ヒトベクターに挿入し、最後に真核細胞系又は原核細胞系においてキメラ抗体分子を発現する。完全ヒト抗体の定常領域は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４又はその変異体の重鎖定常領域から選ばれてもよく、好ましくはヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ４重鎖定常領域を含み、又はアミノ酸変異した後にＡＤＣＣ（ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ、抗体依存性の細胞仲介性の細胞傷害作用）毒性のないＩｇＧ１を使用する。
「抗原結合断片」という用語は、単鎖抗体（即ち、全長重鎖と軽鎖）、Ｆａｂ、修飾されたＦａｂ、Ｆａｂ’、修飾されたＦａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆａｂ－Ｆｖ、Ｆａｂ－ｄｓＦｖ、単一ドメイン抗体（例えば、ＶＨ又はＶＬ又はＶＨＨ）、ｓｃＦｖ、２価又は３価又は４価抗体、Ｂｉｓ－ｓｃＦｖ、ｄｉａｂｏｄｙ、ｔｒｉｂｏｄｙ、ｔｒｉａｂｏｄｙ、ｔｅｔｒａｂｏｄｙ及び上記の何れか１つのエピトープ結合断片を含む（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ａｎｄ Ｈｕｄｓｏｎ、２００５、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３（９）：１１２６－１１３６、Ａｄａｉｒ ａｎｄ Ｌａｗｓｏｎ、２００５、Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ Ｒｅｖｉｅｗｓ－Ｏｎｌｉｎｅ ２（３）、２０９－２１７を参照する）。
これらの抗体断片を産生・調製する方法は、この分野において公知のものである（例えば、Ｖｅｒｍａ ｅｔ ａｌ．、１９９８、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、２１６、１６５－１８１を参照する）。Ｆａｂ－Ｆｖ形態は、ＷＯ２００９／０４０５６２に初めて開示され、そのジスルフィド結合の安定化形態であるＦａｂ－ｄｓＦｖは、ＷＯ２０１０／０３５０１２に初めて開示されている。本開示に係る抗原結合断片は、ＷＯ２００５／００３１６９、ＷＯ２００５／００３１７０とＷＯ２００５／００３１７１に記載されたＦａｂ及びＦａｂ’断片を更に含む。多価抗体は、多重特異性、例えば、二重特異性のものを含んでもよく、又は単一特異性のものであってもよく（例えば、ＷＯ９２／２２５８３とＷＯ０５／１１３６０５参照）、後者の一例としては、ＷＯ９２／２２５８３に記載されたＴｒｉ－Ｆａｂ（又はＴＦＭ）である。
「単鎖抗体」、「単鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」という用語は、リンカーにより接続された抗体重鎖可変ドメイン（又は領域、ＶＨ）と抗体軽鎖可変ドメイン（又は領域、ＶＬ）で形成された分子を含むことを意味する。このようなｓｃＦｖ分子は、ＮＨ２－ＶＬ－リンカー－ＶＨ－ＣＯＯＨ又はＮＨ２－ＶＨ－リンカー－ＶＬ－ＣＯＯＨという一般的な構造を有してもよい。好適な従来技術のリンカーは、反復のＧＧＧＧＳアミノ酸配列又はその変異体からなり、例えば、１～４個の反復変異体が用いられる（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９３）， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ９０： ６４４４－６４４８）。本開示に使用可能な他のリンカーは、Ａｌｆｔｈａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ． ８：７２５－７３１、Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．（２００１）， Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ ｌ． ３１：９４－１０６、Ｈｕ ｅｔ ａｌ．（１９９６）， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５６：３０５５－３０６１、Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．（１９９９）， Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ２９３：４１－５６及びＲｏｏｖｅｒｓ ｅｔ ａｌ．（２００１）， Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．により記載されている。
「ＣＤＲ」という用語は、抗体の可変ドメインにおいて抗原結合を促進する６つの主な超可変領域の１つである。通常、それぞれの重鎖可変領域には３つのＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）があり、それぞれの軽鎖可変領域には３つのＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）がある。上記６つのＣＤＲの最もよく使われた定義の１つは、Ｋａｂａｔ Ｅ． Ａ． ｅｔ ａｌ．， （１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ． ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１－３２４２）により提供されている。本願に用いられるように、ＣＤＲのＫａｂａｔ定義は、軽鎖可変ドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２とＣＤＲ３、及び重鎖可変ドメインのＣＤＲ２とＣＤＲ３にしか応用されない。
「Ｋａｂａｔ」番号付け規則（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（１９９１）、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤを参照）、「Ｃｈｏｔｈｉａ」番号付け規則（Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．、（１９９７）ＪＭＢ ２７３：９２７－９４８を参照）及びＩｍＭｕｎｏＧｅｎＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）番号付け規則（Ｌｅｆｒａｎｃ Ｍ．Ｐ．、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｓｔ、７、１３２－１３６（１９９９）；Ｌｅｆｒａｎｃ、Ｍ．Ｐ． ｅｔ ａｌ．、Ｄｅｖ． Ｃｏｍｐ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２７、５５－７７（２００３）を参照）などを含む種々の公知方法の何れか１つによって、ＣＤＲのアミノ酸配列境界を決定することができる。例えば、典型的な書式では、Ｋａｂａｔ規則によれば、上記重鎖可変領域（ＶＨ）におけるＣＤＲアミノ酸残基の番号は３１～３５（ＨＣＤＲ１）、５０～６５（ＨＣＤＲ２）及び９５～１０２（ＨＣＤＲ３）で、軽鎖可変領域（ＶＬ）におけるＣＤＲアミノ酸残基の番号は２４～３４（ＬＣＤＲ１）、５０～５６（ＬＣＤＲ２）及び８９～９７（ＬＣＤＲ３）である。Ｃｈｏｔｈｉａ規則によれば、ＶＨにおけるＣＤＲアミノ酸の番号は２６～３２（ＨＣＤＲ１）、５２～５６（ＨＣＤＲ２）及び９５～１０２（ＨＣＤＲ３）であり、且つ、ＶＬにおけるアミノ酸残基の番号は２６～３２（ＬＣＤＲ１）、５０～５２（ＬＣＤＲ２）及び９１～９６（ＬＣＤＲ３）である。ＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａの両方を組み合わせたＣＤＲ定義によって、ＣＤＲは、ヒトＶＨにおけるアミノ酸残基である２６～３５（ＨＣＤＲ１）、５０～６５（ＨＣＤＲ２）と９５～１０２（ＨＣＤＲ３）及びヒトＶＬにおけるアミノ酸残基である２４～３４（ＬＣＤＲ１）、５０～５６（ＬＣＤＲ２）と８９～９７（ＬＣＤＲ３）により構成される。ＩＭＧＴ規則によれば、ＶＨにおけるＣＤＲアミノ酸残基の番号は大体、２６～３５（ＣＤＲ１）、５１～５７（ＣＤＲ２）及び９３～１０２（ＣＤＲ３）で、ＶＬにおけるＣＤＲアミノ酸残基の番号は大体、２７～３２（ＣＤＲ１）、５０～５２（ＣＤＲ２）及び８９～９７（ＣＤＲ３）である。ＩＭＧＴ規則によれば、抗体のＣＤＲ領域は、プログラムＩＭＧＴ／ＤｏｍａｉｎＧａｐ Ａｌｉｇｎによって決定することができる。
「抗体フレームワーク」という用語は、可変ドメインＶＬ又はＶＨの一部を指し、当該可変ドメインの抗原結合ループ（ＣＤＲ）のステントとして用いられる。実質的に、それは、ＣＤＲを有しない可変ドメインである。
本願の「ＣＤ７９Ｂと結合する」という用語は、ＣＤ７９Ｂ又はそのエピトープと相互作用できることを意味し、上記ＣＤ７９Ｂ又はそのエピトープは、ヒト由来であってもよい。
「抗原」という用語は、抗原を認識する抗体が産生されるように、脊椎動物起源の免疫学的に活性な分子を指し、又は発現ライブラリー（例えば、特にファージ、酵母又はリボソームディスプレイライブラリー）を選別するためのものである。本開示において、抗原はより広義に定義されており、抗体により特異的に認識される標的分子を含み、且つ抗体を産生するための免疫化プロセス又は抗体を選択するためのライブラリーの選別に使用される分子の一部又は模倣体を含む。本開示に係るヒトＣＤ７９Ｂ及びヒトＣＤ７９Ｂの欠失変異体と他の変異体は、何れも抗原と呼ばれる。
「エピトープ」という用語は、抗原における免疫グロブリン又は抗体と特異的に結合する部位を指す。エピトープは、隣接するアミノ酸から、又はタンパク質の三次折畳により並列して隣接しないアミノ酸から形成されてもよい。隣接するアミノ酸から形成されたエピトープは、通常、変性溶媒に暴露された後に保持されるが、三次折畳により形成されたエピトープは通常、変性溶媒で処理された後に無くなる。エピトープは、通常、特別な空間配座で、少なくとも３～１５個のアミノ酸を含む。何のエピトープが所定の抗体により結合されるかを決定する方法は、この分野でよく知られているもので、免疫ブロット法と免疫沈降検出分析などを含む。エピトープの空間配座を決定する方法は、この分野における技術と本開示に記載される技術、例えば、Ｘ線結晶分析法と２次元核磁気共鳴などを含む。
「特異的結合」、「選択的結合」という用語は、抗体の所定の抗原におけるエピトープとの結合を指す。通常、ヒトＣＤ７９Ｂ又はそのエピトープを分析物として使用すると共に抗体をリガンドとして使用し、機器において表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術によって測定する場合、抗体は、約１０－７ Ｍ未満又は更にそれ以下の平衡解離定数（ＫＤ）で所定の抗原又はそのエピトープと結合し、且つ所定の抗原又はそのエピトープに対する結合親和性が、所定の抗原（又はそのエピトープ）又は密接に関連する抗原以外の非特異的抗原（例えば、ＢＳＡなど）に対する結合親和性の少なくとも２倍である。「抗原を識別する抗体」という用語は、本開示において「特異的に結合する抗体」という用語と互いに交換して使用されてもよい。
「核酸分子」という用語は、ＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子を指す。核酸分子は、単鎖又は二重鎖であってもよいが、好ましくは二重鎖ＤＮＡである。
「ベクター」という用語は、それに連結された別の核酸を輸送可能な核酸分子を指す。一実施形態において、ベクターは「プラスミド」であり、他のＤＮＡセグメントをそれに連結可能な環状二本鎖ＤＮＡ環を指す。別の実施形態において、ベクターはウィルスベクターである。本明細書に開示されたベクターは、宿主細胞において自己複製することができ（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーマル哺乳動物ベクター）、又は、宿主細胞のゲノムに整合されることで、宿主ゲノムと共に複製することができる（例えば、非エピソーマル哺乳動物ベクター）。
「宿主細胞」という用語は、その中に発現ベクターが導入された細胞を指す。宿主細胞は、細菌、微生物、植物又は動物の細胞を含んでもよい。形質転換しやすい細菌は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）やサルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）の菌株などの腸内細菌科（ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）のメンバー、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などのバシラス科（Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）、肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ）、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）及びインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）を含む。好適な微生物は、サッカロミセス酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）及びピキア酵母（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）を含む。好適な動物宿主細胞系は、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣細胞系）及びＮＳ０細胞を含む。
本開示に係る工学的な抗体又は抗原結合断片は、通常の方法により調製・精製することができる。例えば、重鎖及び軽鎖をコードするｃＤＮＡ配列は、クローンニングしてＧＳ発現ベクターに組換えることができる。組換えた免疫グロブリン発現ベクターは、ＣＨＯ細胞を安定してトランスフェクションすることができる。更に好ましい従来技術の一つとして、哺乳動物発現系は、抗体のグリコシル化を引き起こすことになる。陽性のクローンは、バイオリアクターの無血清培地において培養を拡大することで、抗体を産生する。抗体が分泌された培養液は、通常の技術により精製することができる。例えば、Ａ又はＧ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦカラムで精製する。非特異的に結合した成分を洗い流す。更にｐＨ勾配法により、結合した抗体を溶出し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで抗体断片を検出し、収集する。抗体は、通常の方法によりろ過濃縮することができる。可溶性の混合物及び多量体は、分子ふるい、イオン交換などの通常の方法により除去されてもよい。得られた生成物は、直ちに例えば、－７０℃で冷凍し、又は凍結乾燥しなければならない。
アミノ酸配列の「同一性」とは、アミノ酸配列のアライメント及び必要な場合に、配列同一性の百分率が最も大きく達成されるようにｇａｐを導入し（且つ、保存的置換が配列同一性の一部とは見なされない）、第１配列における第２配列中と同様のアミノ酸残基の百分率である。アミノ酸の配列同一性の百分率を測定するために、アラインメントは、この分野の技術的範囲における種々の方法、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ－２又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどのコンピュータソフトウェアにより、実現することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大アラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、測定アラインメントに適用されるパラメータを決定することができる。
「交差反応」という用語は、本願の抗体の異なる種由来のＣＤ７９Ｂとの結合能力を指す。例えば、ヒトＣＤ７９Ｂに結合する本願の抗体は、別の種のＣＤ７９Ｂに結合してもよい。交差反応性は、結合測定（例えばＳＰＲ及びＥＬＩＳＡ）において精製抗原との特異的反応性、又はＣＤ７９Ｂを発現した細胞との結合又は機能的相互作用を検出することによって測定される。交差反応性を決定する方法は、本明細書に記載されるような標準的な結合測定、例えば、表面プラズモン共鳴分析や、フローサイトメトリーを含む。
「抑制」又は「阻害」という用語は互いに交換して使用されてもよく、且つ部分的と完全な抑制／阻害の両方をカバーしている。ＣＤ７９Ｂに対する抑制／阻害は、抑制や阻害のない場合にＣＤ７９Ｂの結合が発生される時に活性が現れる正常なレベル又は種類を低減又は変更することが好ましい。抑制と阻害は、抗ＣＤ７９Ｂ抗体と接触した場合、抗ＣＤ７９Ｂ抗体と接触していないＣＤ７９Ｂに比べて、何れの測定可能なＣＤ７９Ｂ結合親和性も低減されることを含むことも意図する。
「成長の抑制」（例えば、細胞について）という用語は、細胞成長の何れの測定可能な低下も含むことを意図する。
「免疫応答の誘導」と「免疫応答の増強」という用語は、互いに交換して使用されてもよく、特定の抗原を刺激する（即ち、受動的又は適応的）免疫応答を指す。
本願に記載の「ＡＤＣＣ」、即ち、ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ、抗体依存性細胞仲介性細胞傷害は、Ｆｃ受容体を発現した細胞が抗体のＦｃ部分を認識することで抗体で被覆された標的細胞を直接傷害することを意味する。ＩｇＧにおけるＦｃ部分に対する修飾により、抗体のＡＤＣＣエフェクター機能を低減又は解消することができる。上記修飾は、抗体の重鎖定常領域で変異することを指し、例えば、ＩｇＧ１のＮ２９７Ａ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、ＩｇＧ２／４キメラ、ＩｇＧ４のＦ２３５Ｅ、又はＬ２３４Ａ／Ｅ２３５Ａ変異から選ばれる。
抗体及び抗原結合断片を産生・精製する方法は、従来技術でよく知られており、且つ、例えば冷泉港の抗体実験技術マニュアル（５～８章及び１５章）で見出すことができる。例えば、ヒトＣＤ７９Ｂ又はその断片により動物に免疫可能であり、得られた抗体は復元、精製されることができると共に、通常の方法によりアミノ酸シークエンシングを行うことができる。抗原結合断片は、同じく通常の方法により調製することができる。上記抗体又は抗原結合断片は、遺伝子工学的方法により、非ヒト由来のＣＤＲ領域に１つ又は複数のヒトＦＲ領域を追加したものである。ヒトＦＲ生殖細胞系列配列は、ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）から取得可能であり、又は免疫グロブリン雑誌、２００１ＩＳＢＮ０１２４４１３５１から得ることができる。
「薬剤」という用語は、細胞毒性薬剤又は免疫調節剤を指す。細胞毒性薬剤は、細胞内に、その正常な成長を比較的強く破壊する化学分子を有することができる。細胞毒性薬剤は、原則的に、濃度が十分であれば、細胞を死滅させることができるが、特異性が欠けているため、腫瘍細胞を傷害すると同時に、正常細胞のアポトーシスを引き起こし、重篤な副作用になることもある。当該用語は毒素（例えば、細菌、真菌、植物又は動物由来の小分子毒素や酵素活性毒素）、放射性同位体（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２及びＬｕの放射性同位体）、化学療法薬、抗生物質及び核酸分解酵素を含む。免疫調節剤は免疫チェックポイント分子の阻害剤である。
リンカーという用語は、一端がリガンドに連結され、他端が薬物に連結された断片又は結合を指し、他のリンカーに連結された上でリガンド又は薬物に連結されてもよい。
リンカーは、１種又は複数種のリンカー要素を含んでもよい。例示的なリンカー要素は、６－マレイミドカプロイル（「ＭＣ」）、マレイミドプロピオニル（「ＭＰ」）、バリン－シトルリン（「ｖａｌ－ｃｉｔ」又は「ｖｃ」）、アラニン－フェニルアラニン（「ａｌａ－ｐｈｅ」）、ｐ－アミノベンジルオキシカルボニル（「ＰＡＢ」）、及びＮ－スクシンイミジル４－（２－ピリジルチオ）ペンタノエート（「ＳＰＰ」）、Ｎ－スクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１カルボキシレート（「ＳＭＣＣ」、本明細書では、「ＭＣＣ」とも呼ばれる）及びＮ－スクシンイミジル（４－ヨード－アセチル）アミノベンゾエート（「ＳＩＡＢ」）のようなリンカー試薬とのカップリングに由来するものを含む。リンカーは、ストレッチユニット、スペーサーユニット、アミノ酸ユニット及び伸長ユニットを含んでもよく、ＵＳ２００５－０２３８６４９Ａ１に記載された方法のようなこの分野で知られている方法により合成することができる。リンカーは、細胞において薬物を放出しやすくする「切断可能リンカー」であってもよい。例えば、酸不安定性リンカー（例えば、ヒドラゾン）、プロテアーゼ感受性（例えば、ペプチダーゼ感受性）リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカー、又はジスルフィドを含むリンカー（Ｃｈａｒｉ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５２： １２７－１３１（１９９２）、米国特許Ｎｏ．５，２０８，０２０）を使用することができる。
「アミノ酸ユニット」という用語は、伸長ユニットのある場合に、以下の構造式ＹＲにおけるカルボニル基を伸長ユニットに連結することができ、伸長ユニットのない場合に、ＹＲを薬剤に直接連結することができるアミノ酸を指し、本開示の実施形態において、アミノ酸ユニットは－Ｋｋ－で示される：
Figure 2023535598000064
－Ｋｋ－はジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、ペンタペプチド、ヘキサペプチド、ヘプタペプチド、オクタペプチド、ノナペプチド又はデカペプチドであり、－Ｋ－ユニットは、それぞれ独立的に以下の構造式Ｋａ又はＫｂを有し、ｋは０～１０の間の１つの整数である：
Figure 2023535598000065
そのうち、
上記アミノ酸ユニットにおけるＲ２３は、－Ｈ又はメチル基であり、
Ｒ２４はＨ、メチル基、イソプロピル基、イソブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ベンジル基、ｐ－ヒドロキシベンジル基、－ＣＨ２ＯＨ、－ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３、－ＣＨ２ＣＨ２ＳＣＨ３、－ＣＨ２ＣＯＮＨ２、－ＣＨ２ＣＯＯＨ、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨ２、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ、－（ＣＨ２）３ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２、－（ＣＨ２）３ＮＨ２、－（ＣＨ２）３ＮＨＣＯＣＨ３、－（ＣＨ２）３ＮＨＣＨＯ、－（ＣＨ２）４ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２、－（ＣＨ２）４ＮＨ２、－（ＣＨ２）４ＮＨＣＯＣＨ３、－（ＣＨ２）４ＮＨＣＨＯ、－（ＣＨ２）３ＮＨＣＯＮＨ２、－（ＣＨ２）４ＮＨＣＯＮＨ２、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２ＮＨ２、２－ピリジルメチル－、３－ピリジルメチル－、４－ピリジルメチル－、フェニル基、シクロヘキシル基、
Figure 2023535598000066
であり、
Ｒ２５は、－アリール－、－アルキル－アリール－、－シクロアルキル－、－アルキル－シクロアルキル－、－シクロアルキル－アルキル－、－アルキル－シクロアルキル－アルキル－、－ヘテロシクリル－、－アルキル－ヘテロシクリル－、－ヘテロシクリル－アルキル－、－アルキル－ヘテロシクリル－アルキル－、－アリール－、－アルキル－アリール－、－アリール－アルキル－、－アルキル－アリール－アルキル－、－ヘテロアリール－、－アルキル－ヘテロアリール－、－ヘテロアリール－アルキル－、－アルキル－ヘテロアリール－アルキル－である。
一実施形態において、－Ｋｋ－はジペプチドであり、好ましくは－バリン－シトルリン－、－フェニルアラニン－リジン－又は－Ｎ－メチルバリン－シトルリン－で、更に好ましくは－バリン－シトルリン－である。
「ストレッチユニット」という用語は、一端が炭素原子を介してリガンドと共有結合し、他端が硫黄原子を介して薬物に（直接的又は間接的に）連結する化学構造断片を指す。
「スペーサーユニット」という用語は、リンカーと薬物をカップリングして最後にリガンド薬物複合体を形成するために利用可能な二官能性化合構造断片であり、このようなカップリング方式は、薬物をリンカーに選択的に連結することができる。
「アミノ酸」という用語は、分子構造にアミノ基とカルボキシ基が含まれ、且つアミノ基とカルボキシル基の両方が－ＣＨ－構造に直接結合している有機化合物を指す。一般式はＨ２ＮＣＨＲＣＯＯＨである。アミノ基のカルボン酸における炭素原子との結合位置によって、α、β、γ、δ、ε…－アミノ酸に分けることができる。生物界において、天然タンパク質を構成するアミノ酸は、その特定の構造特性を持っており、即ち、そのアミノ基がα－炭素原子に直接連結されており、即ち、α－アミノ酸である。
「伸長ユニット」という用語は、アミノ酸ユニットのある場合に、アミノ酸ユニットを薬物とカップリングすることができ、又はアミノ酸ユニットのない場合に、ＹＲにおけるカルボニル基を介して薬物とカップリングすることができる化学構造を指す。
本開示において伸長ユニットはＰＡＢであり、構造が４－イミノベンジルカルバモイル断片の通りで、その構造が下記の式に示されるように、Ｄに連結されている：
Figure 2023535598000067
略号
リンカー要素は、下記のものを含むが、これらに限定されない：
次のような構造を持つ、ＭＣ＝６－マレイミドカプロイル：
Figure 2023535598000068
Ｖａｌ－Ｃｉｔ又は「ｖｃ」＝バリン－シトルリン（プロテアーゼ切断可能なリンカーにおける例示的なジペプチド）、
シトルリン＝２－アミノ－５－ウレイドペンタン酸、
ＰＡＢ＝ｐ－アミノベンジルオキシカルボニル（「自己犠牲」リンカー要素の例示）、
Ｍｅ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ＝Ｎ－メチル－バリン－シトルリン（そのうち、リンカーペプチド結合は、カテプシンＢにより切断されないように修飾された）、
ＭＣ（ＰＥＧ）６－ＯＨ＝マレイミドカプロイル－ポリエチレングリコール（抗体システインに付着可能）、
ＳＰＰ＝Ｎ－スクシンイミジル４－（２－ピリジルチオ）ペンタノエ一卜、
ＳＰＤＰ＝Ｎ－スクシンイミジル３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート、
ＳＭＣＣ＝スクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート、
ＩＴ＝イミノチオラン、
ＰＢＳ＝リン酸塩緩衝液。
「抗体－薬物複合体」（ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、ＡＤＣ）という用語は、リガンドがリンカー（又は連結ユニット）を介して薬物に連結するものを指す。本開示において、「抗体－薬物複合体」は、モノクローナル抗体（又は抗原結合断片）を連結ユニットを介して毒性を有する薬物に連結するものを指す。
「薬物担持量」（Ｄｒｕｇ－ｔｏ－Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｒａｔｉｏ、ＤＡＲ）という用語は、抗体－薬物複合体群において、それぞれの抗体にカップリングされた薬物の平均数量を指し、薬物量と抗体量の比率で示してもよい。薬物担持量の範囲としては、各抗体（Ａｂ）が１～２０個、好ましくは１～１０個の薬物（Ｄ）に連結されてもよい。本開示の実施形態において、薬物担持量はｋ又はｎで示され、例示的に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又は何れか２つの数値の間の数値の平均値であってもよい。好ましくは１～１０であり、更に好ましくは１～８、又は２～８、又は２～７、又は３～８、又は３～７、又は３～６、又は４～７、又は４～６、又は４～５の平均値である。薬物担持量は、ＵＶ／可視分光法、質量分析、ＥＬＩＳＡ試験、モノクローナル抗体分子サイズ変異体アッセイ（ＣＥ－ＳＤＳ）とＨＰＬＣのような通常の方法により特性測定することができる。
本開示のモノクローナル抗体分子サイズ変異体アッセイ（ＣＥ－ＳＤＳ）は、ドデシル硫酸ナトリウムキャピラリー電気泳動（ＣＥ－ＳＤＳ）紫外線検出法により、還元及び非還元条件下で、分子量に応じて、キャピラリー電気泳動法（２０１５年版『中国薬局方』０５４２）に従って、組換えモノクローナル抗体製品の純度を定量的に測定することができる。
本開示の一実施形態において、薬物は、連結ユニットにより、リガンドのＮ末端アミノ基及び／又はリジン残基のε－アミノ基にカップリングされ、一般的に、カップリング反応では、抗体にカップリング可能な薬物の分子数は理論上の最大値より少ない。
リガンド薬物複合体の負荷量は、
（１）連結試薬とモノクローナル抗体とのモル比を制御することと、
（２）反応時間と温度を制御することと、
（３）異なる反応試薬を選択することと、
を含む非限定的な方法で制御することができる。
特定の複合体分子にとって、抗体に対する薬物の比率が厳密値（例えば、式（Ｉ）ではｎ）を有するものの、多くの分子を含むサンプルの説明に用いられる場合、当該値は常に平均値であると理解すべきであり、これは、典型的に抱合ステップに関連するある程度の不均質性によるものである。複合体の平均負荷量は、本明細書において抗体に対する薬物の比率又は「ＤＡＲ」と呼ばれる。幾つかの実施例において、ＤＡＲは約１～約６の間にあり、且つ典型的に約１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７．０、７．５、８．０である。幾つかの実施例において、重量で少なくとも５０％のサンプルは平均ＤＡＲ±２を有する化合物であり、且つ好ましくは、少なくとも５０％のサンプルは平均ＤＡＲ±１を含む複合体である。実施例は、ＤＡＲが約１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．４、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０である免疫複合体を含む。幾つかの実施例において、「約ｘである」ＤＡＲとは、ＤＡＲの測定値がｘの２０％内にあることを意味する。
ＤＡＲの検出方法は例えば、還元と脱グリコシル化されたサンプルのＬＣ－ＭＳデータからＤＡＲ値を推測することである。ＬＣ／ＭＳは、定量ＡＤＣにおける抗体に連結する有効負荷（薬物部分）分子の平均数の定量を許容する。ＨＰＬＣは、抗体を軽鎖と重鎖に分離し、且つ各鎖のリンカー－有効負荷基の数によって重鎖（ＨＣ）と軽鎖（ＬＣ）を分離する。質量分析データにより、混合物中の成分の種類、例えばＬＣ、ＬＣ＋１、ＬＣ＋２、ＨＣ、ＨＣ＋１、ＨＣ＋２などを同定することができる。ＬＣとＨＣ鎖の平均負荷量によって、ＡＤＣの平均ＤＡＲを算出することができる。所定の免疫複合体サンプルのＤＡＲは、２つの軽鎖と２つの重鎖を含む四量体抗体に連結する薬物（有効負荷）分子の平均数を示す。例えば、ＷＯ２０１８１４２３２２中のＤＡＲ検出方法である。
「アルキル基」という用語は、１～２０個の炭素原子を含む直鎖又は分岐鎖基である飽和脂肪族炭化水素基を指し、好ましくは１～１２個（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１と１２個）の炭素原子を含むアルキル基、より好ましくは１～１０個の炭素原子を含むアルキル基、最も好ましくは１～６個の炭素原子を含むアルキル基である。その非限定的な例は、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｎ－ペンチル基、１，１－ジメチルプロピル基、１，２－ジメチルプロピル基、２，２－ジメチルプロピル基、１－エチルプロピル基、２－メチルブチル基、３－メチルブチル基、ｎ－ヘキシル基、１－エチル－２－メチルプロピル基、１，１，２－トリメチルプロピル基、１，１－ジメチルブチル基、１，２－ジメチルブチル基、２，２－ジメチルブチル基、１，３－ジメチルブチル基、２－エチルブチル基、２－メチルペンチル基、３－メチルペンチル基、４－メチルペンチル基、２，３－ジメチルブチル基、ｎ－ヘプチル基、２－メチルヘキシル基、３－メチルヘキシル基、４－メチルヘキシル基、５－メチルヘキシル基、２，３－ジメチルペンチル基、２，４－ジメチルペンチル基、２，２－ジメチルペンチル基、３，３－ジメチルペンチル基、２－エチルペンチル基、３－エチルペンチル基、ｎ－オクチル基、２，３－ジメチルヘキシル基、２，４－ジメチルヘキシル基、２，５－ジメチルヘキシル基、２，２－ジメチルヘキシル基、３，３－ジメチルヘキシル基、４，４－ジメチルヘキシル基、２－エチルヘキシル基、３－エチルヘキシル基、４－エチルヘキシル基、２－メチル－２－エチルペンチル基、２－メチル－３－エチルペンチル基、ｎ－ノニル基、２－メチル－２－エチルヘキシル基、２－メチル－３－エチルヘキシル基、２，２－ジエチルペンチル基、ｎ－デシル基、３，３－ジエチルヘキシル基、２，２－ジエチルヘキシル基、及びその種々の分岐鎖異性体などを含む。より好ましくは、アルキル基は、１～６個の炭素原子を含む低級アルキル基であり、非限定的な実例は、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｎ－ペンチル基、１，１－ジメチルプロピル基、１，２－ジメチルプロピル基、２，２－ジメチルプロピル基、１－エチルプロピル基、２－メチルブチル基、３－メチルブチル基、ｎ－ヘキシル基、１－エチル－２－メチルプロピル基、１，１，２－トリメチルプロピル基、１，１－ジメチルブチル基、１，２－ジメチルブチル基、２，２－ジメチルブチル基、１，３－ジメチルブチル基、２－エチルブチル基、２－メチルペンチル基、３－メチルペンチル基、４－メチルペンチル基、２，３－ジメチルブチル基などを含む。アルキル基は置換されても、置換されなくてもよい。置換された場合に、置換基は任意の利用可能な連結点で置換されてもよく、上記置換基は、独立的に、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルキルアミノ基、ハロゲン、メルカプト基、ヒドロキシ基、ニトロ基、シアノ基、シクロアルキル基、ヘテロシクロアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、シクロアルコキシ基、ヘテロシクロアルコキシ基、シクロアルキルチオ基、ヘテロシクロアルキルチオ基、オキソ基から選ばれる１つ又は複数の基であることが好ましい。
「ヘテロアルキル基」という用語は、Ｎ、Ｏ又はＳから選ばれる１つ又は複数のヘテロ原子を含むアルキル基であり、そのうち、アルキル基は、上記に定義された通りである。
「アルキレン基」という用語は、飽和の直鎖又は分岐鎖の脂肪族炭化水素基を指し、親アルカンの同じ炭素原子又は２つの異なる炭素原子から２つの水素原子を除去して誘導された残基を有し、１～２０個の炭素原子を含む直鎖又は分岐鎖基であり、好ましくは１～１２個（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１と１２個）の炭素原子を含み、より好ましくは１～６個の炭素原子を含むアルキレン基である。アルキレン基の非限定的な例は、メチレン（－ＣＨ２－）、１，１－エチリデン（－ＣＨ（ＣＨ３）－）、１，２－エチリデン（－ＣＨ２ＣＨ２）－、１，１－プロピリデン（－ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）－）、１，２－プロピリデン（－ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）－）、１，３－プロピリデン（－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－）、１，４－ブチリデン（－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－）及び１，５－ブチリデン（－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－）などを含むが、これらに限定されない。アルキレン基は、置換されても、置換されなくてもよく、置換された場合に、置換基は任意の利用可能な連結点で置換されてもよく、上記置換基は、独立的に、任意選択的にアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルキルアミノ基、ハロゲン、メルカプト基、ヒドロキシ基、ニトロ基、シアノ基、シクロアルキル基、ヘテロシクリル基、アリール基、ヘテロアリール基、シクロアルコキシ基、ヘテロシクロアルコキシ基、シクロアルキルチオ基、ヘテロシクロアルキルチオ基及びオキソ基から選ばれる１つ又は複数の基で置換されることが好ましい。
「アルコキシ基」という用語は、－Ｏ－（アルキル基）及び－Ｏ－（シクロアルキル基）を指し、そのうち、アルキル基又はシクロアルキル基の定義は上記の通りである。アルコキシ基の非限定的な例は、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、ブトキシ基、シクロプロポキシ基、シクロブトキシ基、シクロペンチルオキシ基、シクロヘキシルオキシ基を含む。アルコキシ基は、任意選択的に置換されても、置換されなくてもよく、置換された場合に、置換基は、独立的にアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルキルアミノ基、ハロゲン、メルカプト基、ヒドロキシ基、ニトロ基、シアノ基、シクロアルキル基、ヘテロシクロアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、シクロアルコキシ基、ヘテロシクロアルコキシ基、シクロアルキルチオ基、ヘテロシクロアルキルチオ基から選ばれる１つ又は複数の基であることが好ましい。
「シクロアルキル基」という用語は、飽和又は部分的に不飽和の単環式又は多環式の環状炭化水素置換基を指し、シクロアルキル基環は３～２０個の炭素原子を含み、好ましくは３～１２個の炭素原子を含み、より好ましくは３～１０個の炭素原子を含み、最も好ましくは３～８個の炭素原子を含む。単環式シクロアルキル基の非限定的な例は、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロペンテニル基、シクロヘキシル基、シクロヘキセニル基、シクロヘキサジエニル基、シクロヘプチル基、シクロヘプタトリエニル基、シクロオクチル基などを含み、多環式シクロアルキル基は、スピロ環、縮合環又は架橋環のシクロアルキル基を含む。
「ヘテロシクリル基」という用語は、３～２０個の環原子を含む飽和又は部分的に不飽和の単環式又は多環式環状炭化水素置換基を指し、そのうち、１つ又は複数の環原子は、窒素、酸素又はＳ（Ｏ）ｍ（そのうち、ｍは０～２の整数である）から選ばれるヘテロ原子であるが、－Ｏ－Ｏ－、－Ｏ－Ｓ－又は－Ｓ－Ｓ－の環部分を含まず、残りの環原子は炭素である。好ましくは３～１２個の環原子を含み、そのうち、１～４個はヘテロ原子であり、より好ましいシクロアルキル基環は３～１０個の環原子を含む。単環式ヘテロシクリル基の非限定的な例は、ピロリジニル基、ピペリジニル基、ピペラジニル基、モルホリニル基、チオモルホリニル基、ホモピペラジニル基などを含む。多環式ヘテロシクリル基は、スピロ環、縮合環又は架橋環のヘテロシクリル基を含む。
「スピロヘテロシクリル基」という用語は、５～２０員の環同士が１つの原子（スピロ原子と称する）を共有する多環式ヘテロシクリル基を指し、そのうち、１つ又は複数の環原子は窒素、酸素又はＳ（Ｏ）ｍ（そのうち、ｍは０～２の整数である）から選ばれるヘテロ原子であり、残りの環原子は炭素である。それは、１つ又は複数の二重結合を含んでもよいが、完全に共役したπ電子系を有する環が１つもない。例えば、６～１４員、また例えば、７～１０員である。環同士の共有するスピロ原子の数によって、スピロヘテロシクリル基は、モノスピロヘテロシクリル基、ビススピロヘテロシクリル基又はポリスピロヘテロシクリル基に分けられ、好ましくはモノスピロヘテロシクリル基又はビススピロヘテロシクリル基である。例えば、４員／４員、４員／５員、４員／６員、５員／５員又は５員／６員のモノスピロヘテロシクリル基である。スピロヘテロシクリル基の非限定的な例は、
Figure 2023535598000069
「縮合ヘテロシクリル基」という用語は、５～２０員で、系内の各環が系内の他の環と、隣接する１対の原子を共有する多環式ヘテロシクリル基を指し、１つ又は複数の環は、１つ又は複数の二重結合を含んでもよいが、完全に共役したπ電子系を有する環は１つもなく、そのうち、１つ又は複数の環原子は、窒素、酸素又はＳ（Ｏ）ｍ（そのうち、ｍは０～２の整数である）から選ばれるヘテロ原子であり、残りの環原子は炭素である。例えば、６～１４員、また例えば、７～１０員である。構成する環の数によって二環式、三環式、四環式又は多環式の縮合ヘテロシクリル基に分けることができ、例えば二環式又は三環式であり、また例えば、５員／５員又は５員／６員の二環式縮合ヘテロシクリル基である。縮合ヘテロシクリル基の非限定的な例は、
Figure 2023535598000070
を含む。
「架橋ヘテロシクリル基」という用語は、５～１４員で、何れか２つの環が２つの直接的に連結されていない原子を共有する多環式ヘテロシクリル基を指し、１つ又は複数の二重結合を含んでもよいが、完全に共役したπ電子系を有する環は１つもなく、そのうち、１つ又は複数の環原子は窒素、酸素又はＳ（Ｏ）ｍ（そのうち、ｍは０～２の整数である）から選ばれるヘテロ原子であり、残りの環原子は炭素である。例えば、６～１４員、また例えば、７～１０員である。構成する環の数によって、二環式、三環式、四環式又は多環式の架橋ヘテロシクリル基に分けることができ、例えば、二環式、三環式又は四環式であり、より好ましくは二環式又は三環式である。架橋ヘテロシクリル基の非限定的な例は、
Figure 2023535598000071
を含む。
上記ヘテロシクリル基環は、アリール基、ヘテロアリール基又はシクロアルキル基環に縮合してもよく、そのうち、母体構造に接続された環はヘテロシクリル基であり、その非限定的な例は、
Figure 2023535598000072
などを含む。
ヘテロシクリル基は、任意選択的に置換されても、置換されなくてもよく、置換された場合に、置換基は、独立的に、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルキルアミノ基、ハロゲン、メルカプト基、ヒドロキシ基、ニトロ基、シアノ基、シクロアルキル基、ヘテロシクロアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、シクロアルコキシ基、ヘテロシクロアルコキシ基、シクロアルキルチオ基、ヘテロシクロアルキルチオ基、オキソ基から選ばれる１つ又は複数の基であることが好ましい。
「アリール基」という用語は、共役したπ電子系を有する６～１４員の全炭素単環式又は縮合多環式（即ち、隣接する炭素原子対を共有する環）基を指し、例えば、６～１０員、例えば、フェニル基とナフチル基、具体的に例えば、フェニル基である。上記アリール基環は、ヘテロアリール基、ヘテロシクリル基又はシクロアルキル基環に縮合してもよく、そのうち、母体構造に接続された環はアリール基環であり、その非限定的な例は、
Figure 2023535598000073
を含む。
アリール基は、置換されても、置換されなくてもよく、置換された場合に、置換基は、独立的にアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルキルアミノ基、ハロゲン、スルフヒドリル基、ヒドロキシ基、ニトロ基、シアノ基、シクロアルキル基、ヘテロシクリルアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、シクロアルコキシ基、ヘテロシクリルアルコキシ基、シクロアルキルチオ基、ヘテロシクリルアルキルチオ基から選ばれる１つ又は複数の基であることが好ましい。
「ヘテロアリール基」という用語は、１～４個のヘテロ原子、５～１４個の環原子を含む複素芳香族系を指し、そのうち、ヘテロ原子は酸素、硫黄及び窒素から選ばれる。ヘテロアリール基は、５～１０員であることが好ましく、５員又は６員であることがより好ましく、例えば、フラニル基、チエニル基、ピリジル基、ピロリル基、Ｎ－アルキルピロリル基、ピリミジニル基、ピラジニル基、イミダゾリル基、テトラゾリル基などである。上記ヘテロアリール基環は、アリール基、ヘテロシクリル基又はシクロアルキル基環に縮合してもよく、そのうち、母体構造に接続された環はへテロアリール基環であり、その非限定的な例は、
Figure 2023535598000074
を含む。
ヘテロアリール基は、任意選択的に置換されても、置換されなくてもよく、置換された場合に、置換基は、独立的にアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルキルアミノ基、ハロゲン、スルフヒドリル基、ヒドロキシ基、ニトロ基、シアノ基、シクロアルキル基、ヘテロシクリルアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、シクロアルコキシ基、ヘテロシクリルアルコキシ基、シクロアルキルチオ基、ヘテロシクリルアルキルチオ基から選ばれる１つ又は複数の基であることが好ましい。
「シクロアルキルアルキル基」という用語は、アルキル基上の水素が１つ又は複数のシクロアルキル基で置換され、好ましくは１つのシクロアルキル基で置換されたものを指し、そのうち、アルキル基は上記に定義された通りであり、そのうち、シクロアルキル基は上記に定義された通りである。
「ハロアルキル基」という用語は、アルキル基上の水素が１つ又は複数のハロゲンで置換されたものを指し、そのうち、アルキル基は、上記に定義された通りである。
「重水素化アルキル基」という用語は、アルキル基上の水素が１つ又は複数の重水素原子で置換されたものを指し、そのうち、アルキル基は、上記に定義された通りである。
「ヒドロキシ基」という用語は、－ＯＨ基を指す。
「ハロゲン」という用語は、フッ素、塩素、臭素又はヨウ素を指す。
「アミノ基」という用語は、－ＮＨ２を指す。
「ニトロ基」という用語は、－ＮＯ２を指す。
化学式における「Ｍｅ」という略称は、メチル基である。
「任意選択」又は「任意選択的に」は、その後に説明される事象又は状況が生じてもよいが、生じなくてもよいことを意味し、この説明は、当該事象又は状況が生じる場合と生じない場合を含む。例えば、「任意選択的にハロゲン又はシアノ基で置換されるＣ１－Ｃ６アルキル基」とは、ハロゲン又はシアノ基が存在してもよいが、存在しなくてもよいことを意味し、この説明は、アルキル基がハロゲン又はシアノ基で置換される場合と、アルキル基がハロゲン又はシアノ基で置換されない場合とを含む。
本開示における化合物は、１つ又は複数の不斉中心を含むことができるので、エナンチオマー、ジアステレオマーを形成可能であり、且つ絶対立体化学によって、（Ｒ）－若しくは（Ｓ）－又はアミノ酸に用いられる（Ｄ）－若しくは（Ｌ）－の別の立体異性体形態に定義することができる。本開示は、全ての可能な異性体及びそのラセミと光学的に純粋な形態を含む。光学活性の（＋）と（－）、（Ｒ）－と（Ｓ）－又は（Ｄ）－と（Ｌ）－異性体は、キラルシントン又はキラル試薬を使用して調製することができ、或いは、通常の方法、例えばクロマトグラフィーと分別結晶法で調製することができる。個々のエナンチオマーを調製／分離するための通常の方法は、適切な光学的に純粋な前駆体からのキラル合成、又は例えばキラル高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によるラセミ体（又は塩又は誘導体のラセミ体）の分割を含む。本明細書に記載の化合物がオレフィン性二重結合又はその他の幾何学的不斉中心を含む場合は、特に説明のない限り、上記化合物がＥとＺの幾何異性体を含むことを意味する。また、全ての互変異性体形態も含まれることを意味する。
Figure 2023535598000075
或いは２つの配置を同時に含んでもよい。例えば、
Figure 2023535598000076
であってもよい。
「立体異性体」とは、同じ結合により結合されるが、互換性のない異なる三次元構造を持つ同じ原子で構成される化合物である。本開示においては、様々な立体異性体及びそれらの混合物が予期され、且つその分子同士が互いに重畳できない鏡像である２つの立体異性体を指す「エナンチオマー」が含まれている。
本開示に記載の化合物若しくはその薬用可能な塩、又はその異性体の何れの同位体標識された誘導体も、本開示によってカバーされている。同位体で標識可能な原子は、水素、炭素、窒素、酸素、リン、フッ素、塩素、ヨウ素などを含むが、これらに限定されない。それらは、それぞれ同位素同位素２Ｈ（Ｄ）、３Ｈ、１１Ｃ、１３Ｃ、１４Ｃ、１５Ｎ、１８Ｆ、３１Ｐ、３２Ｐ、３５Ｓ、３６Ｃｌ及び１２５Ｉなどで置換可能である。特に説明のない限り、１つの位置が特に重水素（Ｄ）と指定される場合、当該位置は、重水素の天然存在度（０．０１５％）よりも少なくとも３０００倍高い存在比を有する重水素（即ち、少なくとも４５％の重水素が組み込まれる）であると理解すべきである。
「置換される」とは、基の中の１つ又は複数の水素原子、好ましくは５個以下、より好ましくは１～３個の水素原子が互いに独立的に置換基で置換されることを意味する。置換基は、それらの化学的に可能な部位にしか位置せず、当業者はそれほど努力せずに（実験又は理論により）可能又は不可能な置換を決定することができる。例えば、遊離水素を有するアミノ基又はヒドロキシ基は不飽和（例えば、オレフィン）結合を有する炭素原子と結合する場合、不安定になる可能性がある。
「医薬組成物」という用語は、１種又は複数種の本明細書に記載される化合物又はその生理学的に／薬学的に許容される塩又はプロドラッグと他の化学成分の混合物と、生理学的に／薬学可能なベクター及び賦形剤などの他の成分とを含むものを示す。医薬組成物は、生体への投与を促進し、活性成分の吸収に寄与して更に生物活性を発揮するためのものである。
「薬学的に許容される塩」又は「薬用可能な塩」という用語は、本開示に係るリガンド－薬物複合体の塩、又は本開示に記載される化合物の塩を指し、このような塩は、対象に用いられた場合、安全性及び有効性を有すると共に、所望の生物活性を有する。本開示に係る抗体薬物複合化合物は、少なくとも１つのアミノ基を含むため、酸と共に塩を形成することができ、薬用可能な塩の非限定的な例は、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硫酸塩、硫酸水素塩、クエン酸塩、酢酸塩、コハク酸塩、アスコルビン酸塩、シュウ酸塩、硝酸塩、ソルビン酸塩、リン酸水素塩、リン酸二水素塩、サリチル酸塩、クエン酸水素塩、酒石酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、ギ酸塩、安息香酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩を含む。
「溶剤和物」という用語は、本開示に係るリガンド－薬物複合化合物と１種又は複数種の溶剤分子で形成された薬用可能な溶剤和物を指し、溶剤分子の非限定的な例は水、エタノール、アセトニトリル、イソプロパノール、ＤＭＳＯ、酢酸エチルを含む。
本開示は、切断可能な特定構造の連結アームと特定構造の活性物、及び連結アーム、活性物と抗体からなる抗体薬物複合体（ＡＤＣ）に関する。このようなＡＤＣは、スペーサーを介して１種の毒性物質を抗体に連結してなる複合体である。当該ＡＤＣは、インビボで分解して活性分子を放出することで、抗腫瘍作用を果たす。
「ベクター」という用語は、本開示の医薬組成物に適用された場合、薬物の対象への入り方と体内での分布を変更し、薬物の放出速度を制御し、薬物を標的に輸送することができる系を指す。薬物ベクターの放出と標的系により、薬物の分解と損失を低減し、副作用を低下させ、生物学的利用能を向上させることができる。例えば、ベクターとされる高分子界面活性剤は、その独特な両親媒性構造のため、自己集合して様々な形態の凝集体を形成することができ、好ましい例は、例えば、ミセル、マイクロエマルジョン、ゲル、液晶、ベシクルなどである。これらの凝集体は、薬物分子を封入する能力を有すると共に、膜に対して良好な透過性を有し、良い薬物ベクターとすることができる。
「賦形剤」という用語は、医薬製剤における活性成分以外の付加物であり、添加物と呼ばれてもよい。例えば、錠剤中の結合剤、充填剤、崩壊剤、潤滑剤、半固体製剤である軟膏剤やクリーム剤中の基質部分、液体製剤中の防腐剤、酸化防止剤、矯味剤、芳香剤、共溶剤、乳化剤、可溶化剤、浸透圧調整剤、着色剤などは何れも、賦形剤と呼ぶことができる。
「希釈剤」という用語は充填剤とも呼ばれ、錠剤の重量及び体積を増加させることがその主な用途である。希釈剤の加入により、一定の体積の大きさが確保されるだけでなく、主成分の用量偏差が低減され、薬剤の圧縮成形性などが改善される。トローチ剤の薬物に油性成分が含まれた場合、「乾燥」状態を維持して錠剤への調製に寄与するために、吸収剤を加えて油性物質を吸収する必要がある。例えば、澱粉、乳糖、カルシウムの無機塩、微結晶セルロースなどである。
「与える」、「投与」及び「処理」は動物、ヒト、実験の対象、細胞、組織、器官や生物流体に適用される場合に、外因性薬剤、治療剤、診断薬又は組成物と、動物、ヒト、対象、細胞、組織、器官や生物流体との接触を意味する。「与える」、「投与」及び「処理」は例えば、治療、薬物動態、診断、研究と実験方法を意味してもよい。細胞の処理は、試薬の細胞との接触、及び試薬の流体との接触を含み、そのうち、上記流体は細胞と接触する。「与える」、「投与」及び「処理」は、また、試薬、診断、結合組成物により、又は別種の細胞を通じて、体外及びインビトロで例えば細胞を処理することを意味する。「処理」はヒト、獣医学又は研究対象に適用される場合に、治療的処理、予防又は予防的措置、研究と診断的応用を意味する。
「治療」は、対象に内用又は外用の治療剤、例えば、本願の何れか１つの抗体若しくはその抗原結合断片又はその複合体を含む組成物を投与することを意味し、上記対象は、１つ又は複数の疾患又はその症状を患っており、患っている恐れがあり、患う傾向がある者であるが、上記治療剤は、これらの症状に対して治療作用を有することが知られている。通常、このような症状の退行を誘導することによるにせよ、臨床的に測定可能な何れかの程度まで進行しないようにこのような症状を阻害することによるにせよ、治療される対象又は集団に、１種又は複数種の症状を効果的に緩和する量で治療剤を投与する。任意の具体的な疾患症状を効果的に緩和する治療剤の量（「治療有効量」とも呼ばれる）は、対象の疾患状態、年齢と体重、及び薬剤の対象に必要な治療効果を発生させる能力などの複数の要因によって、変化することができる。当該症状の重症度や進行状況を評価するために医者や他のプロのヘルスケアプロバイダによく用いられる何れかの臨床的検出方法により、疾患症状が低減されたか否かを評価することができる。本願の実施形態（例えば、治療方法又は製品）は、ある対象における目標疾患症状の緩和において無効になっている場合があるものの、本分野で知られている何れかの統計学的検定方法、例えば、Ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ検定、カイ二乗検定、Ｍａｎｎ及びＷｈｉｔｎｅｙによるＵ検定、Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定（Ｈ検定）、Ｊｏｎｃｋｈｅｅｒｅ－Ｔｅｒｐｓｔｒａ検定とＷｉｌｃｏｘｏｎ検定によると、統計学的に有意な数の対象において目標疾患症状が軽減されることが確認された。
以下、実施例と合わせて更に説明するが、これらの実施例は、範囲を限定するものではない。
実施例又は試験例において具体的な条件が明記されていない実験方法は、一般的に通常の条件、或いは原料又は商品メーカーにより推奨された条件に従う。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、分子クローニング、実験室マニュアル、冷泉港実験室、及び現代分子生物学方法、Ａｕｓｕｂｅｌら著、Ｇｒｅｅｎｅ出版協会、Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ＮＹが参照される。具体的な供給源が明示されていない試薬は、市販の一般的な試薬である。
一、抗体の調製：
実施例１－１． タンパク質抗原のクローニングと発現
抗体（軽・重鎖を含む）及び抗原は、この分野における公知のオーバーラップ伸長ＰＣＲ法によって構築され、オーバーラップ伸長ＰＣＲによって得られたＤＮＡ断片を、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＢｓｔＢＩという２つの酵素切断部位により発現ベクターｐＥＥ６．４（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）に挿入し、２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ＃ Ｒ７９０－０７）において発現して得た。得られた組換えタンパク質は、免疫又は選別に使用された。ヒトＣＤ７９Ｂアミノ酸配列はＮＣＢＩ（ＮＰ＿０００６１７．１）に由来し、その細胞外ドメイン（ＥＣＤ）には１５９個のアミノ酸（Ｍｅｔ１－Ａｓｐ１５９）が含まれている。
ヒトＣＤ７９Ｂ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）及びヒトＦｃ領域融合タンパク質（ｈｕｍａｎ ＣＤ７９Ｂ ＥＣＤ－ｈＦｃ）のアミノ酸配列は、配列番号１で示される：
ＡＲＳＥＤＲＹＲＮＰＫＧＳＡＣＳＲＩＷＱＳＰＲＦＩＡＲＫＲＧＦＴＶＫＭＨＣＹＭＮＳＡＳＧＮＶＳＷＬＷＫＱＥＭＤＥＮＰＱＱＬＫＬＥＫＧＲＭＥＥＳＱＮＥＳＬＡＴＬＴＩＱＧＩＲＦＥＤＮＧＩＹＦＣＱＱＫＣＮＮＴＳＥＶＹＱＧＣＧＴＥＬＲＶＭＧＦＳＴＬＡＱＬＫＱＲＮＴＬＫＤＧＩＩＭＩＱＴＬＬＩＩＬＦＩＩＶＰＩＦＬＬＬＤＫＤＤＳＫＡＧＭＥＥＤＨＴＹＥＧＬＤＩＤＱＴＡＴＹＥＤＩＶＴＬＲＴＧＥＶＫＷＳＶＧＥＨＰＧＱＥＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号１。
ヒトＣＤ７９Ｂ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）及びＨｉｓタグ融合タンパク質（ｈｕｍａｎ ＣＤ７９Ｂ ＥＣＤ－Ｈｉｓ）のアミノ酸配列は、配列番号２で示される：
ＡＲＳＥＤＲＹＲＮＰＫＧＳＡＣＳＲＩＷＱＳＰＲＦＩＡＲＫＲＧＦＴＶＫＭＨＣＹＭＮＳＡＳＧＮＶＳＷＬＷＫＱＥＭＤＥＮＰＱＱＬＫＬＥＫＧＲＭＥＥＳＱＮＥＳＬＡＴＬＴＩＱＧＩＲＦＥＤＮＧＩＹＦＣＱＱＫＣＮＮＴＳＥＶＹＱＧＣＧＴＥＬＲＶＭＧＦＳＴＬＡＱＬＫＱＲＮＴＬＫＤＧＩＩＭＩＱＴＬＬＩＩＬＦＩＩＶＰＩＦＬＬＬＤＫＤＤＳＫＡＧＭＥＥＤＨＴＹＥＧＬＤＩＤＱＴＡＴＹＥＤＩＶＴＬＲＴＧＥＶＫＷＳＶＧＥＨＰＧＱＥＨＨＨＨＨＨ
配列番号２。
実施例１－２． マウスモノクローナル抗体の調製
１、マウスの免疫と血清力価の検出
ヒトＣＤ７９Ｂ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）とヒトＦｃ領域融合タンパク質（ｈｕｍａｎ ＣＤ７９Ｂ ＥＣＤ－ｈＦｃ）及びヒトＣＤ７９Ｂ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）とＨｉｓタグ融合タンパク質（ｈｕｍａｎ ＣＤ７９Ｂ ＥＣＤ－Ｈｉｓ）をそれぞれ免疫原として、腹腔注射法によりＢａｌｂ／ｃ及びＳＪＬマウスに免疫し、体内でヒトＣＤ７９Ｂ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に対する抗体が産生されるようにマウスを刺激した。同時に、サルＣＤ７９Ｂ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）及びＨｉｓタグ融合タンパク質（ｃｙｎｏ ＣＤ７９Ｂ ＥＣＤ－Ｈｉｓ）を免疫原として、腹腔注射法によりＳＪＬマウスに免疫し、体内でサルＣＤ７９Ｂ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に対する抗体が産生されるようにマウスを刺激した。
実験の手順は下記の通りである：
１）腹腔注射免疫法。免疫プログラムにより、今回免疫に必要な抗原の量を算出した。タンパク質抗原を必要に応じてＰＢＳで対応する濃度に希釈した後、抗原の乳化を行った。乳化済みの抗原とアジュバントの混合物を２．０ ｍＬの滅菌注射器に移し、マウスの右側腹部内に注射した。
２）マウス血清の収集。それぞれのマウスに対応する血清管に標識を付け、マウスの下顎静脈から約１００ μＬの全血を採取し、収集された全血サンプルを室温で静置して約２ ｈ後に遠心分離して血清を収集した。抗体力価などの検出のために、血清を４℃の冷蔵庫に保存した。
３）免疫マウスのＥＬＩＳＡによる血清力価の測定。１ μｇ／ｍＬの抗原濃度で、１ウェルあたり５０ μＬで、４℃の冷蔵庫にて９６ウェルプレートを一晩被覆した。翌日、被覆されたプレートを１回洗浄した（洗浄液：１×ＰＢＳＴ）。洗浄後、１×ＰＢＳＴで調製された１％のＢＳＡブロッキング液により３７℃で１時間ブロッキングした。１×ＰＢＳＴでプレートを３回洗浄した後、異なる希釈濃度の検出待ちの血清を加え、３７℃のインキュベーターで１時間インキュベートした。１×ＰＢＳＴでプレートを３回洗浄した後、１：５０００で希釈されたヤギ抗マウス二次抗体１００ μＬを加え、３７℃のインキュベーターで０．５時間インキュベートした。プレートを洗浄した後、ＴＭＢ発色液であるＡ液とＢ液を取り、１：１の比率で混合してから発色させた。１５分間後に、１ Ｎの塩酸で発色反応を中止させた。Ｓｐｅｃｔｒａ Ｍａｘ Ｍ５プレートリーダーにおいて、４５０ ｎｍでの蛍光値を検出した。
４）免疫マウスのＦＡＣＳによる血清力価の測定。ＤｏＨＨ２細胞又はサル末梢血単核細胞懸濁液を遠心分離してから、０．１％のＢＳＡを含むＰＢＳで細胞を再懸濁した後にカウントし、各群の試験待ちの血清を加え、室温で６０分間インキュベートしてから細胞を３回洗浄した後、抗－Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（Ｆｃ 特異性）－ＦＩＴＣ二次抗体を加え、暗所で室温で３０分間インキュベートしてから細胞を３回洗浄し、０．１％のＢＳＡを含むＰＢＳで細胞を穏やかに再懸濁し、機器に載せて検出した。
各群のマウス血清力価のＥＬＩＳＡとＦＡＣＳ検出結果は、図１～図７に示されている。
ヒトＣＤ７９Ｂ ＥＣＤ－ｈＦｃタンパク質を、番号が５４９１、５４９２、５４９３、５４９４、５４９５である合計５匹のＢａｌｂ／ｃマウスに免疫した。血清力価のＥＬＩＳＡ検出結果は図１に示されている。結果によると、マウスの免疫血清力価は１：１００ Ｋ以上に達した。マウス血清のＦＡＣＳ検出結果は図２に示されており、マウス血清に発生された抗体は、ＤｏＨＨ２細胞表面のＣＤ７９Ｂタンパク質を特異的に識別することができる。
ヒトＣＤ７９Ｂ ＥＣＤ－ｈＦｃタンパク質を、番号が５４９６、５４９７、５４９８、５４９９、５５００である合計５匹のＳＪＬマウスに免疫した。血清力価のＥＬＩＳＡ検出結果は、図３に示されている。結果によると、マウスの免疫血清力価は１：１００ Ｋ以上に達した。マウス血清のＦＡＣＳ検出結果は図４に示されており、マウス血清に発生された抗体は、ＤｏＨＨ２細胞表面のＣＤ７９Ｂタンパク質を特異的に識別することができることが分かる。
ヒトＣＤ７９Ｂ ＥＣＤ－ｈｉｓタンパク質を、番号が５７２６、５７２７、５７２８、５７２９、５７３０である合計５匹のＳＪＬマウスに免疫した。血清力価のＥＬＩＳＡ検出結果は、図５に示されている。結果によると、マウスの免疫血清力価は１：１０ Ｋ以上に達した。マウス血清のＦＡＣＳ検出結果は図６に示されており、マウス血清に発生された抗体は、ＤｏＨＨ２細胞表面のＣＤ７９Ｂタンパク質を特異的に識別可能であることが分かる。
サルＣＤ７９Ｂ ＥＣＤ－ｈｉｓタンパク質を、番号が５５０１、５５０２、５５０３、５５０４、５５０５である合計５匹のＳＪＬマウスに免疫した。血清力価のＥＬＩＳＡ検出結果は、図７に示されている。結果によると、マウスの免疫血清力価は１：１０ Ｋ以上に達した。
上記の結果から、免疫のマウスにはＣＤ７９Ｂに対する特異的抗体が産生されたことが分かる。上記マウスは、ＣＤ７９Ｂに対する特異的抗体を分泌可能なハイブリドーマ細胞系が産生されるように、細胞融合に使用することができる。
２、ハイブリドーマの調製と抗体の選別
後続きの抗体選別のために、電気融合法により免疫群マウスのリンパ球及び骨髄腫細胞ＳＰ２／０（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ－１２１ＴＭ）を融合させた。
１）電気融合実験。融合の１週間前にＳＰ２／０細胞を１０％のＤＭＥＭ培地において拡大培養した。マウスの脾臓及びリンパ節を取り出し、洗浄し研磨してリンパ球を収集した。ＳＰ２／０とリンパ球を比例して混合し、電気融合装置により融合した。融合後、細胞を９６ウェルプレートに播種し、３７℃、５％のＣＯ２のインキュベーターで培養し、細胞の状態を毎日観察し、５日間融合した後に細胞融合率を統計した。融合の９～１４日後に、融合したハイブリドーマ細胞を選別し、陽性ウェルにおける細胞を選択して２４ウェルプレートにおいて拡大培養した。
２）限界希釈法によるサブクローニング。サブクローニングすべき細胞株を２４ウェルの培養ウェルで再懸濁し、カウントした。各細胞株の細胞濃度を５～１０個の細胞／ｍＬに希釈し、希釈された細胞懸濁液を９６ウェルの培養プレートに加え、各ウェルに０．２ ｍＬ加え、各ウェルに細胞が１～２個含まれていた。９６ウェルプレートを３７°、５％のＣＯ２のインキュベータに置いて培養した。７～１０日間後、陽性クローンを選択して２４ウェルにおいて更に確認した。
３）ＥＬＩＳＡ選別。１ μｇ／ｍＬの抗原濃度で、１ウェルあたり５０ μＬで、４℃の冷蔵庫にて９６ウェルプレートを一晩被覆した。翌日、被覆された抗原プレートを１回洗浄した（洗浄液：１×ＰＢＳＴ）。洗浄後、１×ＰＢＳＴで調製された１％のＢＳＡブロッキング液により３７℃で１時間ブロッキングした。１×ＰＢＳＴでプレートを３回洗浄した後、検出待ちの細胞上清５０ μＬを加え、３７℃のインキュベーターで１時間インキュベートした。１×ＰＢＳＴでプレートを３回洗浄した後、１：５０００で希釈されたヤギ抗マウス二次抗体１００ μＬを加え、３７℃のインキュベーターで０．５時間インキュベートした。プレートを洗浄した後、ＴＭＢ発色液であるＡ液とＢ液を取り、１：１の比率で混合してから発色させた。１５分間後に、１ Ｎの塩酸で発色反応を中止させた。Ｓｐｅｃｔｒａ Ｍａｘ Ｍ５プレートリーダーにおいて、４５０ ｎｍでの蛍光値を検出した。
４）ＦＡＣＳ選別。ＤｏＨＨ２細胞懸濁液を遠心分離した後、０．１％のＢＳＡを含むＰＢＳで細胞を再懸濁し、カウントし、試験待ちの上清を加え、室温で６０分間インキュベートし、細胞を洗浄した後、抗－マウスＩｇＧ（Ｆｃ特異性）－ＦＩＴＣ二次抗体を加え、暗所で室温で３０分間インキュベートし、細胞を３回洗浄し、０．１％のＢＳＡを含むＰＢＳで細胞を穏やかに再懸濁し、機器に載せて検出した。
５）ハイブリドーマ陽性クローンの同定。複数のヒトＣＤ７９Ｂ抗原に対する特異的抗体を取得し、そのうちの、ＥＬＩＳＡとＦＡＣＳ試験での結合力が最も良い１７株のハイブリドーマに対して抗体の産生と精製を行った。抗ヒトＣＤ７９Ｂハイブリドーマ陽性クローンのＥＬＩＳＡ検出結果は、表１に示されている。抗ヒトＣＤ７９Ｂハイブリドーマ陽性クローンのＦＡＣＳ検出結果は、表２に示されている。サルＣＤ７９Ｂ抗原に対する特異的抗体も取得し、そのうちの、ＥＬＩＳＡとＦＡＣＳ試験での結合力が最も良い４株のハイブリドーマに対して抗体の産生と精製を行った。抗サルＣＤ７９Ｂハイブリドーマ陽性クローン細胞のＥＬＩＳＡ検出結果は、表３に示されている。抗サルＣＤ７９Ｂハイブリドーマ陽性クローン細胞のＦＡＣＳ検出結果は、表４に示されている。何れもｍＩｇＧを陰性対照として使用した。
Figure 2023535598000077
Figure 2023535598000078
Figure 2023535598000079
Figure 2023535598000080
３、マウスモノクローナル抗体の産生、精製及び同定
１）マウスモノクローナル抗体の産生と精製。抗体を産生すべきハイブリドーマ細胞を顕微鏡で観察し、細胞状態が良くて≧７０％以上に成長すると、細胞を収集してＣｏｕｎｔｓｔａｒ ＩＣ１０００型セルカウンターによりカウントした。細胞濃度を１×１０５～５×１０５個／ｍＬに調整し、Ｒｏｌｌｅｒ Ｂｏｔｔｌｅに移した。Ｒｏｌｌｅｒ Ｂｏｔｔｌｅをインキュベータに入れて３７℃で１０～１５日間培養し、毎日細胞の成長状況を観察し、培地がオレンジイエローで透明になると、精製のために取り出した。通常の方法に従い、細胞上清はＰｒｏｔｅｉｎ Ａカラムを通じて抗体を精製した。
２）抗ヒトＣＤ７９Ｂマウスモノクローナル抗体のＥＬＩＳＡ検出。１ μｇ／ｍＬの抗原濃度で、１ウェルあたり５０ μＬで、４℃の冷蔵庫にて９６ウェルプレートを一晩被覆した。翌日、被覆された抗原プレートを１回洗浄した（洗浄液：１×ＰＢＳＴ）。洗浄後、１×ＰＢＳＴで調製された１％のＢＳＡブロッキング液により３７℃で１時間ブロッキングした。１×ＰＢＳＴでプレートを３回洗浄した後、１００ ｎＭ、１：１０で希釈された抗体５０ μＬを加え、３７℃のインキュベーターに入れ、１時間インキュベートした。１×ＰＢＳＴでプレートを３回洗浄した後、１：５０００で希釈されたヤギ抗マウス二次抗体１００ μＬを加え、３７℃のインキュベーターで０．５時間インキュベートした。プレートを洗浄した後、ＴＭＢ発色液であるＡ液とＢ液を取り、１：１の比率で混合してから発色させた。１５分間後に、１ Ｎの塩酸で発色反応を中止させた。Ｓｐｅｃｔｒａ Ｍａｘ Ｍ５プレートリーダーにおいて、４５０ ｎｍでの蛍光値を検出した。そのうち、４つの抗ヒトＣＤ７９Ｂマウスモノクローナル抗体は、ＥＬＩＳＡ結合力が最も強く（ｍＡｂ００８、ｍＡｂ０１５、ｍＡｂ０１６とｍＡｂ０１７）、具体的なデータは図８に示されている。
３）抗ヒトＣＤ７９Ｂマウスモノクローナル抗体のＦＡＣＳ検出。ＤｏＨＨ２細胞懸濁液を遠心分離してから、０．１％のＢＳＡを含むＰＢＳで細胞を再懸濁した後にカウントし、１００ ｎＭ、１：１０で希釈された抗体１００ μＬを加え、室温で１時間インキュベートした。細胞を３回洗浄した後、抗－マウスＩｇＧ（Ｆｃ特異性）－ＦＩＴＣ二次抗体を加え、暗所で室温で３０分間インキュベートしてから、細胞を３回洗浄し、０．１％のＢＳＡを含むＰＢＳで細胞を穏やかに再懸濁し、機器に載せて検出した。そのうち、４つの抗ヒトＣＤ７９Ｂマウスモノクローナル抗体はＦＡＣＳ結合力が最も強く（ｍＡｂ００８、ｍＡｂ０１５、ｍＡｂ０１６とｍＡｂ０１７）、具体的なデータは図９Ａと図９Ｂに示されている。そのうち、ｈＩｇＧ１は陰性対照抗体、ＳＮ８は陽性対照抗体である。ＳＮ８は、ロシュ製薬により開発された抗体複合薬物であるポラツズマブベドチン（ｐｏｌａｔｕｚｕｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ）に使用された抗体（配列参照配列の由来：ＵＳ２０１７０３６２３１８Ａ）である。ポラツズマブベドチンは、既にＦＤＡにより発売が承認された。結果から分かるように、ＦＡＣＳ実験において、本開示に係る好ましい３株の抗ヒトＣＤ７９Ｂマウスモノクローナル抗体でありｍＡｂ０１５、ｍＡｂ０１６とｍＡｂ０１７は、結合力が何れもＳＮ８よりも優れている。
４）抗ヒトＣＤ７９Ｂマウスモノクローナル抗体の交差反応性のＦＡＣＳ検出。一過性トランスフェクションの方法により２９３Ｆ－ｃｙｎｏＣＤ７９Ｂ細胞を取得し、細胞懸濁液を遠心分離してから、０．１％のＢＳＡを含むＰＢＳで細胞を再懸濁した後にカウントし、１００ μＬの抗体を加え、濃度はそれぞれ１０ μｇ／ｍＬと１ μｇ／ｍＬであった。室温で１時間インキュベートした。細胞を３回洗浄した後、抗－マウスＩｇＧ（Ｆｃ特異性）－ＦＩＴＣ二次抗体を加え、暗所で室温で３０分間インキュベートしてから、細胞を３回洗浄し、０．１％のＢＳＡを含むＰＢＳで細胞を穏やかに再懸濁し、機器に載せて検出した。抗ヒトＣＤ７９Ｂマウスモノクローナル抗体の交差反応性のＦＡＣＳ検出結果は、図１０に示されている。
５）抗サルＣＤ７９Ｂマウスモノクローナル抗体のＥＬＩＳＡ検出。μｇ／ｍＬの抗原濃度で、１ウェルあたり５０ μＬで、４℃の冷蔵庫にて一晩被覆した。翌日、被覆された抗原プレートを１回洗浄した（洗浄液：１×ＰＢＳＴ）。洗浄後、１×ＰＢＳＴで調製された１％のＢＳＡブロッキング液により３７℃で１時間ブロッキングした。１×ＰＢＳＴでプレートを３回洗浄した後、１００ ｎＭ、１：１０で希釈された抗体５０ μＬを加え、３７℃のインキュベーターに入れ、１時間インキュベートした。１×ＰＢＳＴでプレートを３回洗浄した後、１：５０００で希釈されたヤギ抗マウス二次抗体１００ μＬを加え、３７℃のインキュベーターで０．５時間インキュベートした。プレートを洗浄した後、ＴＭＢ発色液であるＡ液とＢ液を取り、１：１の比率で混合してから発色させた。１５分間後に、１ Ｎの塩酸で発色反応を中止させた。Ｓｐｅｃｔｒａ Ｍａｘ Ｍ５プレートリーダーにおいて、４５０ ｎｍでの蛍光値を検出した。検出結果は、図１１に示されている。
６）抗サルＣＤ７９Ｂマウスモノクローナル抗体のサル末梢血単核細胞との結合のＦＡＣＳ検出。新鮮なサル血からサル末梢血単核細胞を抽出し、細胞懸濁液を遠心分離してから、０．１％のＢＳＡを含むＰＢＳで細胞を再懸濁した後にカウントし、それぞれ抗－ＣＤ１９と抗－ｃｙｎｏＣＤ７９Ｂの抗体を加えた。室温で１時間インキュベートした。細胞を３回洗浄した後、抗－マウスＩｇＧ（Ｆｃ特異性）－ＦＩＴＣ二次抗体を加え、暗所で室温で３０分間インキュベートしてから、細胞を３回洗浄し、０．１％のＢＳＡを含むＰＢＳで細胞を穏やかに再懸濁し、機器に載せて検出した。抗サルＣＤ７９Ｂマウスモノクローナル抗体のサル末梢血単核細胞との結合のＦＡＣＳ検出結果は、図１２Ａ～図１２Ｇに示されている。ＣＤ１９はＢ細胞のマーカーである。結果から分かるように、４つの抗サルＣＤ７９Ｂマウスモノクローナル抗体は、何れもサルＢ細胞と結合することができる。
７）抗ヒトＣＤ７９Ｂマウスモノクローナル抗体のＳＰＲ検出。表面プラズモン共鳴法（ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ、ＳＰＲ）により、抗ヒトＣＤ７９Ｂ抗体とその抗原ヒトＣＤ７９Ｂ－Ｈｉｓとの親和性を検出した。抗原であるヒトＣＤ７９Ｂ－Ｈｉｓタンパク質をＣＭ５チップに固定化した。カップリングレベルを１００ＲＵに設定した。作動緩衝液はＨＢＳ－ＥＰ＋（１０ ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ ｍＭ ＮａＣｌ、３ ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ 界面活性剤Ｐ２０）であった。希釈された抗体を３０ μＬ／ｍｉｎの流速で実験チャンネルと対比チャンネルを３分間流し、５分間解離した。そして再生緩衝液（１０ ｍＭ グリシン、ｐＨ１．５）は、３０ μＬ／ｍｉｎの流速で３０秒間作動した。データをＢｉａｃｏｒｅ ８Ｋソフトウェアで分析した。
実施例１－３． マウスモノクローナル抗体可変領域のアミノ酸配列測定
実施例１－２で得られた高親和性のハイブリドーマモノクローナル細胞株に対して可変領域のアミノ酸配列測定を行い、次いで組換えてヒト－マウスキメラ抗体（ｃＡｂ）として発現し、更に、更なる抗体同定を行った。逆転写ＰＣＲにより重鎖可変領域と軽鎖可変領域の遺伝子を増幅してコードし、ベクターに連結し、シークエンシングにより軽重鎖配列を得た。まず、ＲＮＡ精製試薬キット（Ｑｉａｇｅｎ社、製品番号７４１３４）により、実施例１－２における活性のよい単細胞株の全ＲＮＡを抽出した。次に、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社の製品番号が１８０８０－０５１であるｃＤＮＡ合成試薬キットにより、ｃＤＮＡ単鎖を調製した。これをテンプレートとして、ＰＣＲ法で軽重鎖可変領域の配列を合成し、ＰＣＲ生成物をＴＡベクターｐＭＤ－１８Ｔにクローニングした後、シークエンシングに送った。得られた軽重鎖配列をそれぞれ発現ベクターにクローニングし、組換えモノクローナル抗体を発現した。活性を検証した後、ヒト化を行った。
抗ヒトＣＤ７９Ｂ抗体のＶＨ／ＶＬ ＣＤＲのアミノ酸残基は、Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けシステムによって決定されて注釈されている。
マウスハイブリドーマ細胞モノクローナル抗体ｍＡｂ０１５の配列：
重鎖可変領域：
ＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＡＲＰＧＡＳＶＫＬＳＣＫＡＳＧＳＳＦＴＳＹＧＩＮＷＶＫＱＲＴＧＱＧＬＥＷＩＧＥＩＦＰＲＳＧＮＴＹＹＮＥＫＦＥＧＫＡＴＬＴＡＤＫＳＳＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＦＣＡＫＧＤＬＧＤＦＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳ
配列番号３
軽鎖可変領域：
ＤＦＬＭＴＱＴＰＬＳＬＰＶＲＬＧＤＱＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＩＶＨＳＤＧＮＴＹＦＥＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＬＧＶＹＹＣＦＱＧＳＨＶＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ
配列番号４。
マウスハイブリドーマ細胞モノクローナル抗体ｍＡｂ０１７の配列：
重鎖可変領域：
ＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＡＲＰＧＡＳＶＫＬＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＴＹＧＩＮＷＶＫＱＲＴＧＱＧＬＥＷＩＧＥＩＹＰＲＳＧＮＩＹＹＮＥＫＦＫＧＫＡＴＬＴＡＤＫＳＳＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＦＣＡＲＧＳＤＹＤＧＤＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ
配列番号５
軽鎖可変領域：
ＤＶＬＭＴＱＴＰＬＳＬＰＶＳＬＧＤＱＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＩＶＨＨＤＧＮＴＹＬＥＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＬＧＶＹＹＣＦＱＧＳＨＶＰＷＴＦＧＧＧＴＱＬＥＩＫ
配列番号６。
マウスのＣＤＲ配列は、表５に示す通りである：
Figure 2023535598000081
 実施例１－４． 抗ヒトＣＤ７９Ｂ抗体のヒト化
実施例１－３で得られたマウス抗ＣＤ７９Ｂモノクローナル抗体の軽重鎖配列について、抗体データベースで相同性の比較を行ってから、ヒト化抗体モデルを確立した。モデルにより復帰変異を選択し、最適のヒト化抗ＣＤ７９Ｂモノクローナル抗体を選別した。マウスＦａｂ結晶構造モデルデータベース（例えば、ＰＤＢデータベース）から、得られたマウス候補分子の相同性と類似する結晶構造を調べ、高解像度（例えば、＜２．５ Å）のＦａｂ結晶構造を選択し、マウスＦａｂモデルを確立した。マウス抗体の軽重鎖配列をモデル中の配列とアラインメントし、マウス抗体の配列と一致する配列を保留し、マウス抗体の構造モデルを得た。一致しないアミノ酸は、可能な復帰変異部位である。Ｓｗｉｓｓ－ｐｄｂ ｖｉｅｗｅｒソフトウェアでマウス抗体の構造モデルを実行させ、エネルギーを最適化（最小化）した。モデル中のＣＤＲを除く異なるアミノ酸部位を復帰変異した。得られた変異抗体（ヒト化）をヒト化前の抗体と活性について比較した。活性のよいヒト化抗体を保留した。グリコシル化、脱アミド化、酸化部位などの回避を含め、ＣＤＲ領域の最適化を行った。
上記抗体をそれぞれクローン、発現、精製し、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ及びＳＰＲなどの検出により、活性が最も良いヒト化抗体ｈＡｂ０１５－１０及びｈＡｂ０１７－１０を選び出し、データは表６に示されている。ヒト化抗体ｈＡｂ０１５－１０及びｈＡｂ０１７－１０は、マウスモノクローナル抗体と類似の親和性と関連機能を保持している。
Figure 2023535598000082
 ヒト化抗体ｈＡｂ０１５－１０及びｈＡｂ０１７－１０の配列は以下の通りである。
ｈＡｂ０１５－１０ヒト化抗体重鎖可変領域（ＶＨ）：
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＳＳＦＳＳＹＧＩＮＷＶＫＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＥＩＦＰＲＳＧＮＴＹＹＮＥＫＦＥＧＲＡＴＬＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＧＤＬＧＤＦＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
配列番号１９、
ｈＡｂ０１５－１０ヒト化抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）：
ＤＦＶＭＴＱＴＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＩＶＨＳＤＧＮＴＹＦＥＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＦＱＧＳＨＶＰＷＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
配列番号２０、
ｈＡｂ０１７－１０ヒト化抗体重鎖可変領域（ＶＨ）：
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＴＹＧＩＮＷＶＫＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＥＩＹＰＲＳＧＮＩＹＹＮＥＫＦＫＧＫＡＴＬＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＳＤＹＤＧＤＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号２１、
ｈＡｂ０１７－１０ヒト化抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）：
ＤＶＶＭＴＱＴＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＩＶＨＨＤＧＮＴＹＬＥＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＦＱＧＳＨＶＰＷＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
配列番号２２、
ｈＡｂ０１５－１０ヒト化抗体重鎖：
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＳＳＦＳＳＹＧＩＮＷＶＫＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＥＩＦＰＲＳＧＮＴＹＹＮＥＫＦＥＧＲＡＴＬＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＧＤＬＧＤＦＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号２８、
ｈＡｂ０１５－１０ヒト化抗体軽鎖：
ＤＦＶＭＴＱＴＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＩＶＨＳＤＧＮＴＹＦＥＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＦＱＧＳＨＶＰＷＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
配列番号２９、
ｈＡｂ０１７－１０ヒト化抗体重鎖：
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＴＹＧＩＮＷＶＫＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＥＩＹＰＲＳＧＮＩＹＹＮＥＫＦＫＧＫＡＴＬＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＳＤＹＤＧＤＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号３０、
ｈＡｂ０１７－１０ヒト化抗体軽鎖：
ＤＶＶＭＴＱＴＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＩＶＨＨＤＧＮＴＹＬＥＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＦＱＧＳＨＶＰＷＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
配列番号３１。
ヒト化されたｍＡｂ０１５のＨＣＤＲ１配列にはＴ３０Ｓ変異があり、変異後のＨＣＤＲ１はＧＳＳＦＳＳＹ（配列番号２３）である。本開示の抗ＣＤ７９Ｂ抗体は、表７の一般式を有する：
Figure 2023535598000083
 実施例１－５． 抗ＣＤ７９Ｂ抗体のエンドサイトーシス作用
本開示におけるＣＤ７９Ｂ抗体がヒトＣＤ７９Ｂと結合した後、ヒトＣＤ７９Ｂと共に細胞内にエンドサイトーシスできるか否かを検出するために、ヒトＣＤ７９Ｂタンパク質を高く発現したＤＯＨＨ－２細胞（ＤＳＭＺ、ＡＣＣ４７）を利用して細胞エンドサイトーシス実験を行うことで抗体のエンドサイトーシス能力を評価した。
ＤＯＨＨ－２細胞を通常の細胞懸濁方法により培養し、完全培地の成分としては、ＲＰＭＩ １６４０培地（ＧＩＢＣＯ、Ｃａｔ Ｎｏ．：１１８３５－０３０）に、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（ＧＩＢＣＯ、Ｃａｔ Ｎｏ．：１００９９－１４１）とペニシリン／ストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ、Ｃａｔ Ｎｏ．：１５０７０－０６３）を加えた。
実験時に１０００ ｒｐｍ、５分間、４℃の低温で遠心分離して細胞を収集した。氷上で予冷されたＦＡＣＳ緩衝液１０～１５ ｍＬに細胞を再懸濁した。ＦＡＣＳ緩衝液の成分としては、ｐＨ７．４のリン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）に、２％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を加えた。実験の全過程において、ＦＡＣＳ緩衝液を氷上で予冷していた。細胞をカウントして遠心分離した後、３００，０００細胞／ウェルで９６ウェルプレートに加え、遠心分離して上清を捨てた後に１２．５ μｇ／ｍＬ（ＢＤ、Ｃａｔ Ｎｏ．：５６４２２０）、１００ μＬ／ウェルでＦｃブロッキング液を加えた。室温で１０分間ブロッキングした。その後、２０ μｇ／ｍＬの試験待ちのＣＤ７９Ｂ抗体を対応するウェルに加え、４℃で暗所で１時間インキュベートした。予冷されたＰＢＳ緩衝液により２回洗浄して未結合の抗体を除去した。細胞完全培地（１０％のウシ胎児血清を有するＲＰＭＩ １６４０培地）を加え、３７℃、５％のＣＯ２で０時間、１時間、２時間、４時間インキュベートした。遠心分離して上清を捨てた後、１００ μＬ／ウェルで２％のＰＦＡ緩衝液を加え、細胞を再懸濁してから１０分間放置した。その後、ＦＡＣＳ緩衝液により３回洗浄し、その後、１００ μＬの二次抗体溶液（蛍光で標識されたヤギ抗ヒト二次抗体：１：２５０で希釈され、濃度が２ μｇ／ｍＬで、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｃａｔ＃４０９３０４）を加え、４℃で暗所で半時間インキュベートした。予冷されたＰＢＳ緩衝液を加え、４℃で遠心分離して上清を捨て、３回繰り返した。細胞をＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、２００ μＬ／ウェルで、フローサイトメーター（ＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ）により検出した。
その結果、４℃でインキュベートする時に、ＳＮ８、ｈＡｂ０１５とｈＡｂ０１７という３つの抗体は、何れもＤＯＨＨ－２細胞にエンドサイトーシスされることができなかった。しかし、３７℃でインキュベートする時に、１時間後に抗体のほとんどは既にＤＯＨＨ－２細胞にエンドサイトーシスされ、４時間後に抗体のエンドサイトーシスは最大値に達した。３つの抗体は、何れもエンドサイトーシス作用が良い。
二、化合物の調製：
化合物の構造は、核磁気共鳴（ＮＭＲ）又は／及び質量分析（ＭＳ）によって決定される。ＮＭＲ変位（δ）は、１０－６（ｐｐｍ）の単位で示される。
ＮＭＲの測定には、核磁気共鳴装置Ｂｒｕｋｅｒ ＡＶＡＮＣＥ－４００が使用され、測定溶剤が重水素化ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ－ｄ６）、重水素化クロロホルム（ＣＤＣｌ３）、重水素化メタノール（ＣＤ３ＯＤ）であり、内部標準がテトラメチルシラン（ＴＭＳ）であった。
ＭＳの測定には、液体クロマトグラフ質量分析計Ａｇｉｌｅｎｔ １２００／１２９０ ＤＡＤ－ ６１１０／６１２０ Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ ＭＳ（メーカー：Ａｇｉｌｅｎｔ、ＭＳ型番：６１１０／６１２０ Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ ＭＳ）が使用された。
Ｗａｔｅｒｓ ＡＣＱｕｉｔｙ ＵＰＬＣ－ＱＤ／ＳＱＤ（メーカー：ｗａｔｅｒｓ、ＭＳ型番：ｗａｔｅｒｓ ＡＣＱｕｉｔｙ Ｑｄａ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ／ｗａｔｅｒｓ ＳＱ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ）、ＴＨＥＲＭＯ Ｕｌｔｉｍａｔｅ ３０００－Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ（メーカー：ＴＨＥＲＭＯ、ＭＳ型番：ＴＨＥＲＭＯ Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ）が使用された。
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析には、高速液体クロマトグラフＡｇｉｌｅｎｔ ＨＰＬＣ １２００ＤＡＤ、Ａｇｉｌｅｎｔ ＨＰＬＣ １２００ＶＷＤ及びＷａｔｅｒｓ ＨＰＬＣ ｅ２６９５－２４８９が使用された。
キラルＨＰＬＣ分析測定には、高速液体クロマトグラフＡｇｉｌｅｎｔ １２６０ ＤＡＤが使用された。
分取高速液体クロマトグラフィーには、分取クロマトグラフＷａｔｅｒｓ ２５４５－２７６７、Ｗａｔｅｒｓ ２７６７－ＳＱ Ｄｅｔｅｃｏｒ２、Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＬＣ－２０ＡＰ及びＧｉｌｓｏｎ ＧＸ－２８１が使用された。
キラル分取には、分取クロマトグラフＳｈｉｍａｄｚｕ ＬＣ－２０ＡＰが使用された。
ＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ高速分取クロマトグラフとしては、Ｃｏｍｂｉｆｌａｓｈ Ｒｆ２００（ＴＥＬＥＤＹＮＥ ＩＳＣＯ）が使用された。
薄層クロマトグラフィー用シリカゲル板としては、煙台黄海ＨＳＧＦ２５４又は青島ＧＦ２５４シリカゲル板が使用され、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）に使用されたシリカゲル板の仕様は０．１５ ｍｍ～０．２ ｍｍであり、薄層クロマトグラフィーにより生成物を分離精製する時に、採用された仕様は０．４ ｍｍ～０．５ ｍｍであった。
シリカゲルカラムクロマトグラフィーには、一般的に、煙台黄海シリカゲル製２００～３００メッシュのシリカゲルがベクターとして使用された。
本開示に係る既知の出発原料は、この分野における既知の方法により、又はそれに従って合成されてもよく、又はＡＢＣＲ ＧｍｂＨ ＆ Ｃｏ． ＫＧ、Ａｃｒｏｓ Ｏｒｇａｎｉｃｓ、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ、韶遠化学科技（Ａｃｃｅｌａ ＣｈｅｍＢｉｏ Ｉｎｃ）、達瑞化学品などの会社から購入されてもよい。
実施例において特に説明のない限り、反応は、何れもアルゴン雰囲気又は窒素雰囲気において行うことができる。水素雰囲気は、反応フラスコに容量が約１ Ｌの水素バルーンが連結されていることを指す。
加圧水素化反応には、Ｐａｒｒ ３９１６ＥＫＸ型水素化装置及び清藍ＱＬ－５００型水素発生器又はＨＣ２－ＳＳ型水素化装置が使用された。水素化反応は、一般的に、真空引きして水素を充填する操作を３回繰り返した。
マイクロ波反応には、ＣＥＭ Ｄｉｓｃｏｖｅｒ－Ｓ ９０８８６０型マイクロ波反応器が使用された。
実施例において、特に説明のない限り、溶液は水溶液を指す。
実施例において特に説明のない限り、反応温度は室温で、２０℃～３０℃である。
精製用のカラムクロマトグラフィーの溶離剤系及び薄層クロマトグラフィーの展開溶媒系は、Ａ：ジクロロメタン／メタノール系、Ｂ：ｎ－ヘキサン／酢酸エチル系、Ｃ：石油エーテル／酢酸エチル系を含み、溶剤の体積比は化合物の極性によって調節してもよく、塩基性又は酸性試薬（例えば、トリエチルアミンと酢酸など）を加えて調節してもよい。
本開示に係るＡＤＣ中の薬物部分については、ＷＯ２０２００６３６７６Ａ、ＵＳ７０９８３０８、ＵＳ６８８４８６９、ＣＮ２０２０１００７３６７１．６、ＣＮ２０１９１１３９０４２５．７が参照され、関連する化合物の合成と試験は全て本開示に援用されている。その中の非限定的な実施例は、以下の通りである：
実施例２－１． 化合物Ａ
Figure 2023535598000084
本実施例中の１（１０ ｍｇ、０．０１４ ｍｍｏｌ，１．０ ｅｑ）、本実施例中の２（２１ ｍｇ、０．０２１ ｍｍｏｌ、１．５ ｅｑ）及び触媒量のＨＯＢｔ（０．５ ｍｇ）を無水ＤＭＦ（２ ｍＬ）に溶け、アルゴンガスの保護で、撹拌し始め、２．７１ ｍｇのＤＩＥＡ及び０．０８ ｍＬのピリジンを加え、４０℃まで加熱反応し、２時間撹拌した。分取ＨＰＬＣにより精製してＡ（１２．４ ｍｇ）を取得し、収率６５．４％であった。ＬＣ／ＭＳ （ＥＳＩ）： ｍ／ｚ １３６３．４ ［Ｍ＋１］＋
ＨＮＭＲ （ＣＤＣｌ３， ４００ ＭＨｚ）： δ ０．６３－０．９５ （ｍ， ３２Ｈ）， １．０５－１．３６ （ｍ， ２７Ｈ）， １．６０－１．９８ （ｍ， ４Ｈ）， ２．１－２．５５ （ｍ， ４Ｈ）， ２．７８～３．０２ （ｍ， ３Ｈ）， ３．１７－３．７９ （ｍ， １３Ｈ）， ３．９３－４．２０ （ｍ， ２Ｈ）， ４．６０～４．９６ （ｍ， ３Ｈ）， ５．１４－５．３６ （ｍ， ２Ｈ）， ５．６７ （ｂｓ， １Ｈ）， ６．３１－６．５０ （ｍ， ２Ｈ）， ６．６４ （ｓ， ２Ｈ）， ６．９１ （ｄ， Ｊ ＝ １４．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．１９－７．３０ （ｍ， ７Ｈ）， ７．５５ （ｂｓ， ２Ｈ）， ８．９６ （ｂｓ， １Ｈ）， ９．１３ （ｂｓ， １Ｈ）。
実施例２－２－１． 化合物Ｂ
Figure 2023535598000085

Figure 2023535598000086
氷水浴で、本実施例中の１（５０ ｍｇ、０．０８ ｍｍｏｌ）を１．５ ｍＬのＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミドに溶けた後、ＤＩＰＥＡ（１８ ｍｇ、０．１４ ｍｍｏｌ）を加え、次にビス（ｐ－ニトロフェニル）カーボネート（４９ ｍｇ、０．１６ ｍｍｏｌ）を加え、そして室温で約２～４時間撹拌し、完全に反応したことがＨＰＬＣで監視された後、２０ ｍＬのメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルを加え、撹拌し、固体をろ過して収集し、固体を乾燥させた後に３６ ｍｇの粗製品を取得し、そのまま次の反応を行った。ＬＣ／ＭＳ （ＥＳＩ）： ｍ／ｚ ７８４．１ ［Ｍ＋Ｈ］＋。
Figure 2023535598000087
氷水浴で、本実施例中の化合物３（７２．９１ ｍｇ、０．１ ｍｍｏｌ）を１０ ｍＬのテトラヒドロフランに溶け、Ｆｍｏｃ－ＯＳｕ（４１ ｍｇ、０．１２ ｍｍｏｌ）を加え、その後に室温で３～５時間撹拌し、反応が完了したことがＨＰＬＣで監視された後、減圧濃縮して粗製品を取得し、そのまま次の反応に使用した。
Figure 2023535598000088
上記本実施例中の４の粗製品を１０ ｍＬの無水エーテルに溶け、酸化銀（３４．８ ｍｇ、０．１５ ｍｍｏｌ）を加え、次にヨードメタン（２８．４ ｍｇ、０．２ ｍｍｏｌ）を加え、そして室温で約１０～１６時間反応し、ほぼ完全に反応したことが監視された後、固体をろ過して除去し、その後、減圧濃縮して粗製品を取得し、そのまま次の反応を行った。
Figure 2023535598000089
上記本実施例中の５の粗製品を１０ ｍＬのテトラヒドロフランに溶け、２ ｍＬのジエチルアミンを加え、そして室温で約２～４時間撹拌し、反応が完了したことがＨＰＬＣで監視された後、そのまま減圧濃縮して粗製品を取得し、シリカゲルカラムにより精製した後、４０ ｍｇの生成物を得た。ＬＣ／ＭＳ （ＥＳＩ）： ｍ／ｚ ７４４．２ ［Ｍ＋Ｈ］＋。
Figure 2023535598000090
上記本実施例中の化合物６（１３．５ ｍｇ、０．０１８ ｍｍｏｌ）を１．５ ｍＬのＤＭＦに溶け、ＤＩＰＥＡ（７ ｍｇ、０．０５４ ｍｍｏｌ）を加え、次に数回に分けて本実施例中の化合物２（１８ ｍｇ、１．３ ｍｍｏｌ）を加え、約２４～３６時間撹拌した後、減圧濃縮して粗製品を取得し、ＨＰＬＣ分取により分離して１２．５ ｍｇの化合物Ｂを得て、純度９６．９５％であった。ＬＣ／ＭＳ （ＥＳＩ）： ｍ／ｚ １３８８．３ ［Ｍ＋Ｈ］＋。
ＨＮＭＲ （ＣＤＣｌ３， ４００ ＭＨｚ）： δ ０．８５～０．９０ （ｍ， ３Ｈ）， ０．９３～１．００ （ｍ， ３Ｈ）， １．０８～１．１０ （ｍ， ３Ｈ）， １．２０～１．５０ （ｍ， １５Ｈ）， １．７５～２．０４ （ｍ， ６Ｈ）， ２．１３～２．５５ （ｍ， １６Ｈ）， ２．７０～２．７７ （ｍ， １Ｈ）， ２．８０～２．９６ （ｍ， ２Ｈ）， ３．１６～３．９７ （ｍ， ２０Ｈ）， ３．９９～４．３９ （ｍ， ８Ｈ）， ４．６０～４．８０ （ｍ， ６Ｈ）， ４．８８～５．１０ （ｍ， ５Ｈ）， ５．２４～５．３７ （ｍ， ４Ｈ）， ６．７１ （ｓ， ２Ｈ）， ７．０３ （ｄ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．１８～７．３０ （ｍ， ３Ｈ）， ７．６３ （ｄ， Ｊ ＝ ８．０ Ｈｚ， ２Ｈ）， ８．９２ （ｂｓ， １Ｈ）。
試験例１：体外細胞傷害活性の選別：
１．１． 実験原理及び方法
本実験では、ＣＴＧを使用してＡＴＰの含有量を検出し、腫瘍細胞の生存状況を反映した。まず、異なる密度で細胞を播種して３日間及び５日間培養し、ＩＣ５０及び最大阻害率に基づいて最終的な培養条件を決定した。そして、この条件で毒素分子の傷害効果を検出した。
１．２． 細胞株の選択
実験の目的によって、文献報告を参考にして、前期に乳がん、ＮＳＣＬＣという２種類の疾患モデルを選択し、ＳＫＢＲ３（ＨＥＲ２＋）、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８（ＨＥＲ２－）とＡ５４９という３株の細胞を選び出して選別実験に使用した。
１．３． 細胞培養条件の確定
１）細胞の播種：Ａ５４９をトリプシンで消化した後、培地で中止させ、カウントしてからそれぞれ４．３×１０５、７．２×１０５、１１．５×１０５個の細胞を取り、最終体積を何れも２６ ｍＬとした。細胞密度がそれぞれ３ Ｋ、５ Ｋ、８ Ｋになるように、９６ウェルプレート（３９０３）の２列目～１１列目の各ウェルに１８０ μＬの細胞懸濁液を加えた。１２列目は２００ μＬの培地、残りのウェルはＰＢＳを加えた。ＳＫＢＲ３とＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞は、上記操作を繰り返した。平行サンプルを２部用意した。
２）薬剤の調製：円形底の９６ウェルプレート（３７８８）においてエリブリン（Ｅｒｉｂｕｌｉｎ）陽性対照を調製した。ウェルプレート１の１列目は２ ｍＭ（ＤＭＳＯで原液を１０倍希釈した）とし、その後１０列目まで勾配でＤＭＳＯにおいて１０倍希釈し、１１列目はＤＭＳＯであった。ウェルプレート２中の２列目～１１列目の各ウェルに対応する培地９５ μＬを加え、ウェルプレート１の２列目～１１列目から５ μＬの溶液をウェルプレート２に吸い取り、均一に混合した後、２０ μＬ吸い取り、播種された細胞に加え、３日間と５日間培養し続けた。
３）ＣＴＧ検出：それぞれ３日目と５日目にプレートを取り出し、室温まで平衡した。各ウェルに９０ μＬのＣＴＧを加え、暗所で室温で１０ ｍｉｎ反応させ、マイクロプレートリーダーで発光値を読み取ってＩＣ５０を算出した。
１．４． 薬効の検出
１）細胞の播種：Ａ５４９、ＳＫＢＲ３とＭＤＡ－ＭＢ－４６８をトリプシンで消化した後、それぞれ培地で再懸濁してカウントし、６．３３＊１０＾５ ｃｅｌｌｓを取り、培地を３８ ｍＬになるまで加え、各ウェルの細胞数が３ Ｋになるように、１ウェルあたり１８０ μＬで９６ウェルプレート（３９０３）に播種し、３７℃で２４ ｈ培養した。
２）薬剤の調製：円形底の９６ウェルプレート（３７８８）においてＥｒｉｂｕｌｉｎと化合物Ｄ－１（実施例２－２－１中の化合物６）を調製した。ウェルプレート１の１列目は２ ｍＭ（ＤＭＳＯで原液を１０倍希釈した）とし、その後１０列目まで勾配でＤＭＳＯにおいて１０倍希釈し、１１列目はＤＭＳＯであった。ウェルプレート２中の２列目～１１列目の各ウェルに対応する培地９５ μＬを加え、ウェルプレート１の２列目～１１列目から５ μＬの溶液をウェルプレート２に吸い取り、均一に混合した後、２０ μＬ吸い取り、播種された細胞に加え、平行サンプルを２部用意した。５日間培養し続けた。
３）ＣＴＧ検出：プレートを取り出し、室温まで平衡した。各ウェルに９０ μＬのＣＴＧを加え、暗所で室温で１０ ｍｉｎ反応させ、マイクロプレートリーダーで発光値を読み取ってＩＣ５０を算出した。
１．５． データ結果
Figure 2023535598000091
 結論：化合物Ｄ－１は、３つの腫瘍細胞系の何れにおいても優れた傷害効果を有し、且つ陽性薬であるエリブリンより明らかに優れている。
実施例２－２－２．
Figure 2023535598000092
室温で、０．３ ｍＬの１，４－ジオキサンと０．３ ｍＬの水を量り取り、化合物Ｅ－３０５（３１ ｍｇ、０．０４２ ｍｍｏｌ、文献Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔ． １４（２００４）５５５１-５５５４．に従って合成して得た）を溶解させ、更に９－フルオレニルメチルスクシンイミジルカルボネート（１７ ｍｇ、０．０５０ ｍｍｏｌ）と炭酸ナトリウム固体（１８ ｍｇ、０．１６８ ｍｍｏｌ）を順に加えた。室温で一晩撹拌し、原料がほぼ変換されたことを検出した。反応に水を加えてクエンチし、酢酸エチルで抽出し、減圧濃縮し、シリカゲルカラムで精製した後、１５ ｍｇの生成物を得た。ＬＣ／ＭＳ （ＥＳＩ）： ｍ／ｚ ９６５．６４ ［Ｍ＋Ｈ］＋。
Figure 2023535598000093
室温で、量り取ったジクロロメタンで前のステップで得られた生成物（７ ｍｇ、０．００７ ｍｍｏｌ）を溶解させ、更に４Ａ分子ふるい（１０ ｍｇ）、テトラフルオロホウ酸トリメチルオキソニウム（１１ ｍｇ、０．０７ ｍｍｏｌ）とプロトンスポンジ（１６ ｍｇ、０．０７ ｍｍｏｌ）を加え、室温で１ ｈ撹拌した。原料がほぼ完全に変換されたことを検出し、反応に水を加えてクエンチし、メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルで抽出し、更に１ Ｎの希塩酸で洗浄し、減圧濃縮し、シリカゲルカラムにより精製した後に７ ｍｇの生成物を得た。ＬＣ／ＭＳ （ＥＳＩ）： ｍ／ｚ ９７９．６８ ［Ｍ＋Ｈ］＋。
氷水浴で、１ ｍＬのテトラヒドロフランを量り取り、前のステップで得られた生成物（１０ ｍｇ、０．０１ ｍｍｏｌ）を溶解させ、更にＤＢＵ（６ μＬ、０．０４ ｍｍｏｌ）を滴下し、完全に反応するまで攪拌した。反応に水を加えてクエンチし、ジクロロメタンで抽出し、減圧濃縮し、ＨＰＬＣ分取により分離して５ ｍｇの生成物Ｄ－２を得た。ＬＣ／ＭＳ （ＥＳＩ）： ｍ／ｚ ７５７．８５ ［Ｍ＋Ｈ］＋。
実施例２－２－３．
Figure 2023535598000094
氷水浴で、２ ｍＬのテトラヒドロフランを量り取り、本実施例中の化合物３（６ ｍｇ、０．００８ ｍｍｏｌ、文献Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔ． ２１（２０１１）１６３９-１６４３．に従って合成して得た）を溶解させ、更に四水素化リチウムアルミニウム溶液（８０ μＬ、１ Ｍ ｉｎ ＴＨＦ、０．０８ ｍｍｏｌ）を滴下し、撹拌して反応温度を４０℃まで徐々に昇温し、ＬＣＭＳで検出原料がほぼ完全に変換されたことを検出し、反応を硫酸ナトリウム十水和物でクエンチし、氷水浴で半時間撹拌し、ろ過し、ろ液を減圧濃縮して粗製品を得て、そのまま次の反応に使用した。ＬＣ／ＭＳ （ＥＳＩ）： ｍ／ｚ ７５８．４ ［Ｍ＋Ｈ］＋。
Figure 2023535598000095
室温で、量り取ったジクロロメタンで前のステップで得られた生成物（７ ｍｇ、０．００７ ｍｍｏｌ）を溶解させ、更に４Ａ分子ふるい（１０ ｍｇ）、テトラフルオロホウ酸トリメチルオキソニウム（１１ ｍｇ、０．０７ ｍｍｏｌ）とプロトンスポンジ（１６ ｍｇ、０．０７ ｍｍｏｌ）を加え、室温で１ ｈ撹拌した。原料がほぼ完全に変換されたことを検出し、反応に水を加えてクエンチし、メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルで抽出し、更に１ Ｎの希塩酸で洗浄し、減圧濃縮し、シリカゲルカラムにより精製した後に７ ｍｇの生成物を得た。ＬＣ／ＭＳ （ＥＳＩ）： ｍ／ｚ ９７９．６８ ［Ｍ＋Ｈ］＋。
Figure 2023535598000096
室温で、０．５ ｍＬの１，４－ジオキサン及び０．５ ｍＬの水を量り取り、前のステップで得られた生成物を溶解させ、更に９－フルオレニルメチルスクシンイミジルカルボネート（６．５ ｍｇ、０．０１９ ｍｍｏｌ）及び炭酸ナトリウム（６．８ ｍｇ、０．０６４ ｍｍｏｌ）を順に加え、室温で一晩撹拌し、原料がほぼ完全に変換されたことを検出した。反応に水を加えてクエンチし、酢酸エチルで抽出し、減圧濃縮し、粗製品をシリカゲルカラムで精製した後、生成物１４ ｍｇを得た。ＬＣ／ＭＳ （ＥＳＩ）： ｍ／ｚ ９８０．４ ［Ｍ＋Ｈ］＋。
Figure 2023535598000097
氷水浴で、１ ｍＬのジクロロメタンを量り取り、前のステップで得られた生成物（１４ ｍｇ、０．０１４ ｍｍｏｌ）を溶解させ、更にデス・マーチン酸化剤（１８．２ ｍｇ、０．０４２ ｍｍｏｌ）を加え、撹拌しながら反応が室温まで徐々に昇温されるようにし、原料がほぼ完全に変換されたことがＬＣＭＳで検出されるまで撹拌した。炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて反応をクエンチし、ジクロロメタンで抽出し、濃縮し、粗製品をシリカゲルカラムにより精製した後、生成物８ ｍｇを得た。ＬＣ／ＭＳ （ＥＳＩ）： ｍ／ｚ ９７８．４ ［Ｍ＋Ｈ］＋。
Figure 2023535598000098
氷水浴で、１ ｍＬのテトラヒドロフランを量り取り、前のステップで得られた生成物（８ ｍｇ、０．００８ ｍｍｏｌ）を溶解させ、更にＤＢＵ（６ μＬ、０．０３２ ｍｍｏｌ）を滴下し、１時間撹拌し、原料がほぼ完全に変換されたことをセンターコンソールで検出し、反応に水を加えてクエンチし、ジクロロメタンで抽出し、濃縮し、粗製品をＨＰＬＣ分取により分離して目的生成物Ｄ－３（１．３ ｍｇ）を得た。ＬＣ／ＭＳ （ＥＳＩ）： ｍ／ｚ ７５５．９３ ［Ｍ＋Ｈ］＋。
試験例２：体外細胞傷害活性の選別
２．１． 実験原理及び方法
本実験では、ＣＴＧを使用してＡＴＰの含有量を検出し、腫瘍細胞の生存状況を反映した。
２．２． 細胞培養条件の確定
１）細胞の播種：
Ａ５４９、ＳＫＢＲ３及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８をトリプシンで消化した後、それぞれ培地で再懸濁してカウントし、細胞密度を２．２×１０４個／ｍＬに調整し、９６ウェルプレートの２列目～１１列目の各ウェルに１３５ μＬの細胞懸濁液を加え、１２列目はブランク対照であった。５％のＣＯ２の３７℃インキュベーターで２４ ｈ培養した。
２）薬剤の調製：
ａ）原液の用意：原液の濃度が５ ｍＭになるように、ＤＭＳＯで薬剤を溶解させた。
ｂ）ウェルプレート１：初列１は原液を４０倍希釈し、２列目～１１列目は順に３倍の勾配で希釈した。１２列目はＤＭＳＯであった。
ｃ）ウェルプレート２：２列目～１１列目に対応する培地１９６ μＬを加え、ウェルプレート１の３列目～１２列目から４ μＬ吸い取ってウェルプレート２の２列目～１１列目に入れた。均一に混合させた。
２．３． 細胞の処理
ウェルプレート２から１５ μＬ吸い取って細胞に加えた。５％のＣＯ２の３７℃インキュベーターで５日間培養し続けた。
２．４． ＣＴＧ検出：プレートを取り出し、室温まで平衡した。各ウェルに７５ μＬのＣＴＧを加え、暗所で室温で１０ ｍｉｎ反応させ、マイクロプレートリーダーで発光値を読み取ってＩＣ５０を算出した。
２．５． データの結果
Figure 2023535598000099
Figure 2023535598000100
実施例２－２－４．
Figure 2023535598000101
氷水浴で、エリブリン（９ ｍｇ、０．０１２ ｍｍｏｌ）を０．３ ｍＬのＤＭＦに溶け、ＤＩＰＥＡ（３．５ ｍｇ、０．０２８ ｍｍｏｌ）を加え、その後数回に分けて本実施例中の化合物２（７．８ ｍｇ、０．０１１ ｍｍｏｌ）を加え、ほぼ完全に反応するまで攪拌し、減圧濃縮して粗製品を得て、ＨＰＬＣ分取により分離して４．９５ ｍｇの化合物Ｌ－２を得て、純度９７％であった。ＬＣ／ＭＳ （ＥＳＩ）： ｍ／ｚ １３７４．３ ［Ｍ＋Ｈ］＋。
実施例２－２－５．
Figure 2023535598000102
本実施例中の化合物４（１３．４ ｍｇ、０．０３１６ ｍｍｏｌ、１．７ ｅｑ）とエリブリンメタンスルホン酸塩（１５ ｍｇ、０．０１８２ ｍｍｏｌ、１ ｅｑ）を秤量してＤＭＦ（０．５ ｍＬ）に溶け、氷浴で冷却しながらトリエチルアミン（１０ ｍｇ、０．０９８８ ｍｍｏｌ、５．４ ｅｑ）、ＤＭＴＭＭ（４－（４，６－ジメトキシトリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリン塩酸塩、９．８ ｍｇ、０．０３３２ ｍｍｏｌ、１．８ ｅｑ）を加え、反応液を自然に室温に昇温し、ほぼ完了するまで撹拌した。水（２ ｍＬ）と酢酸エチル（３ ｍＬ）を加えて希釈して分液し、酢酸エチルで水相を抽出し、有機相を合わせて無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮し、粗製品を分取プレートにより精製して１６ ｍｇ得て、収率８６．７％であった。ＬＣ／ＭＳ （ＥＳＩ）： ｍ／ｚ １１３６．３ ［Ｍ＋Ｈ］＋。
Figure 2023535598000103
氷浴で冷却しながら、前のステップで得られた生成物（１６ ｍｇ、０．０１４１ ｍｍｏｌ、１ ｅｑ）を秤量してＴＨＦ（０．４ ｍＬ）に溶け、トリエチルアミン（４．２ ｍｇ、０．０５７ ｍｍｏｌ、４ ｅｑ）を加え、氷浴のままでほぼ完了するまで撹拌した。ジクロロメタン（５ ｍＬ）を加えて希釈し、水（２ ｍＬ×３）で洗浄し、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して粗製品を取得し、そのまま次のステップに使用した。ＬＣ／ＭＳ （ＥＳＩ）： ｍ／ｚ ９１４．３ ［Ｍ＋Ｈ］＋。
Figure 2023535598000104
前のステップで得られた生成物（１６ ｍｇ、０．０１７５ ｍｍｏｌ、１ ｅｑ）と本実施例の化合物６（１１．６ ｍｇ、０．０２４６ ｍｍｏｌ、１．４ ｅｑ）を秤量してＤＭＦ（０．５ ｍＬ）に溶け、２－（７－酸化ベンゾトリアゾール）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（９．９ ｍｇ、０．０２６ ｍｍｏｌ、１．５ ｅｑ）とＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（５．５ ｍｇ、０．０４２６ ｍｍｏｌ、２．４ ｅｑ）を加え、氷浴のままでほぼ完了になるまで撹拌した。水（２ ｍＬ）と酢酸エチル（３ ｍＬ）を加えて希釈して分液し、酢酸エチルで水相を抽出し、有機相を合わせて無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮し、粗製品を分取ＨＰＬＣにより精製して１０ ｍｇの生成物Ｌ－３を得た。ＬＣ／ＭＳ （ＥＳＩ）： ｍ／ｚ １３６８．３ ［Ｍ＋Ｈ］＋。
実施例２－２－６．
Figure 2023535598000105
本実施例中の化合物４（１１．６ ｍｇ、０．０２７３ ｍｍｏｌ、１．５ ｅｑ）と実施例２－２－１中の化合物Ｄ－１（エリブリン誘導体、１３．５ ｍｇ、０．０１８１ ｍｍｏｌ、１ ｅｑ）を秤量してＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（０．５ ｍＬ）に溶け、氷浴で冷却しながらＤＭＴＭＭ（１０．１ ｍｇ、０．０３４３ ｍｍｏｌ、１．３ ｅｑ）を加え、反応液を反応がほぼ完了になるまでした。水（２ ｍＬ）と酢酸エチル（３ ｍＬ）を加えて反応を中止して希釈し、分液し、酢酸エチルで水相を抽出し、有機相を合わせて無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮し、粗製品を分取プレートにより精製して１０ ｍｇ得て、収率４７．９％であった。ＬＣ／ＭＳ （ＥＳＩ）： ｍ／ｚ １１５０．２ ［Ｍ＋Ｈ］＋。
Figure 2023535598000106
前のステップの生成物（１０ ｍｇ、０．００８７ ｍｍｏｌ、１ ｅｑ）を秤量してＴＨＦ（１ ｍＬ）に溶け、１，８－ジアザビシクロウンデカ－７－エン（５．２ ｍｇ、０．０３４ ｍｍｏｌ、４ ｅｑ）を加え、氷浴下で反応がほぼ完了するまで攪拌した。ジクロロメタン（５ ｍＬ）を加えて希釈し、水（２ ｍＬ×３）で洗浄し、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して粗製品を取得し、そのまま次のステップに使用した。ＬＣ／ＭＳ （ＥＳＩ）： ｍ／ｚ ９２８．２ ［Ｍ＋Ｈ］＋。
Figure 2023535598000107
前のステップの生成物（１６ ｍｇ、０．００８７ ｍｍｏｌ、１ ｅｑ）と化合物６（７．８ ｍｇ、０．０１６５ ｍｍｏｌ、１．９ ｅｑ）を秤量してＤＭＦ（０．５ ｍＬ）に溶け、２－（７－酸化ベンゾトリアゾール）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（６．２ ｍｇ、０．０１６３ ｍｍｏｌ、１．９ ｅｑ）とＤＩＥＡ（５．７ ｍｇ、０．０４４１ ｍｍｏｌ、５ ｅｑ）を加え、氷浴下で反応がほぼ完了になるまで撹拌した。水（２ ｍＬ）と酢酸エチル（３ ｍＬ）を加えて希釈して分液し、酢酸エチルで水相を抽出し、有機相を合わせて無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮し、粗製品を分取ＨＰＬＣにより精製して３．５ ｍｇの生成物Ｌ－４を得て、２ステップ収率２９．１％であった。ＬＣ／ＭＳ （ＥＳＩ）： ｍ／ｚ １３８２．２ ［Ｍ＋Ｈ］＋。
実施例２－３．
（Ｓ）－Ｎ－（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）－１－（（１Ｓ，３Ｓ，５Ｓ）－３－（（１Ｒ，２Ｒ）－３－（（（１Ｓ，２Ｒ）－１－ヒドロキシ－１－フェニルプロパン－２－イル）アミノ）－１－メトキシ－２－メチル－３－オキソプロピル）－２－ジアザビシクロ［３．１．０］ヘキシ－２－イル）－３－メトキシ－５－メチル－１－オキソヘプタン－４－イル）－Ｎ，３－ジメチル－２－（（Ｓ）－３－メチル－２－（メチルアミノ）ブチリルアミノ）ブタンアミド 本実施例の化合物１
Figure 2023535598000108
ステップ１
（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メチル（１Ｓ，３Ｓ，５Ｓ）－３－（（１Ｒ，２Ｒ）－３－（（（１Ｓ，２Ｒ）－１－ヒドロキシ－１－フェニルプロパン－２－イル）アミノ）－１－メトキシ－２－メチル－３－オキソプロピル）－２－ジアザビシクロ［３．１．０］ヘキサン－２－カルボン酸エステル 本実施例の化合物１ｃ
（２Ｒ，３Ｒ）－３－（（１Ｓ，３Ｓ，５Ｓ）－２－（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）－２－ジアザビシクロ［３．１．０］ヘキシ－３－イル）－３－メトキシ－２－メチルプロピオン酸 本実施例の化合物１ａ（１．０５ ｇ、２．４９ ｍｍｏｌ、特許出願「ＵＳ２０１９／５５２２３中の明細書の第２０ページのステップ７」に開示された方法により調製されて得られた）と（１Ｓ，２Ｒ）－２－アミノ－１－フェニルプロパン－１－オール 本実施例の化合物１ｂ（０．４２ ｇ、２．７８ ｍｍｏｌ、公知の方法「Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２０１２、ｖｏｌ． ７７、＃ １２、ｐ． ５４５４－５４６０」により調製されて得られた）を反応フラスコに入れ、１０ ｍＬのジクロロメタンと２ ｍＬのＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミドを加え、アルゴンガスで３回置換し、撹拌しながら２－（７－酸化ベンゾトリアゾール）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（１．１４ ｇ、３．００ ｍｍｏｌ）とＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（０．９７ ｇ、７．４７ ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間撹拌し、３０ ｍＬの水を加え、ジクロロメタン（１５ ｍＬ×４）で抽出し、有機相を飽和塩化ナトリウム溶液（３０ ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、ろ液を減圧濃縮し、得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより展開溶媒系Ａで精製し、表題生成物である本実施例の化合物１ｃ（１．３８ ｇ、収率：９９．８％）を得た。
ＭＳ ｍ／ｚ （ＥＳＩ）： ５５５．２ ［Ｍ＋１］
ステップ２
（２Ｒ，３Ｒ）－３－（（１Ｓ，３Ｓ，５Ｓ）－２－ジアザビシクロ［３．１．０］ヘキシ－３－イル）－Ｎ－（（１Ｓ，２Ｒ）－１－ヒドロキシ－１－フェニルプロパン－２－イル）－３－メトキシ－２－メチルプロパンアミド 本実施例の化合物１ｄ
本実施例の化合物１ｃ（１．３８ ｇ、２．４９ ｍｍｏｌ）を１０ ｍＬのジクロロメタンに溶け、２０ ｍＬのジエチルアミンを加え、アルゴンガスで３回置換し、室温で撹拌しながら１時間反応させた。反応液を濃縮し、得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより展開溶媒系Ａで精製し、表題生成物である本実施例の化合物１ｄ（８０５ ｍｇ、収率：９７．３％）を得た。
ＭＳ ｍ／ｚ （ＥＳＩ）： ３３３．２ ［Ｍ＋１］
ステップ３
（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メチル（（Ｓ）－１－（（（Ｓ）－１－（（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）－１－（（１Ｓ，３Ｓ，５Ｓ）－３－（（１Ｒ，２Ｒ）－３－（（（１Ｓ，２Ｒ）－１－ヒドロキシ－１－フェニルプロパン－２－イル）アミノ）－１－メトキシ－２－メチル－３－オキソプロピル）－２－ジアザビシクロ［３．１．０］ヘキシ－２－イル）－３－メトキシ－５－メチル－１－オキソヘプタン－４－イル）（メチル）アミノ）－３－メチル－１－オキソブタン－２－イル）アミノ）－３－メチル－１－オキソブタン－２－イル）（メチル）カルバメート 本実施例の化合物１ｆ
（５Ｓ，８Ｓ，１１Ｓ，１２Ｒ）－１１－（（Ｓ）－ｓｅｃ－ブチル）－１－（９Ｈ－フルオレン－９－イル）－５，８－ジイソプロピル－１２－メトキシ－４，１０－ジメチル－３，６，９－トリオキソ－２－オキサ－４，７，１０－トリアザミリスチン－１４－酸 本実施例の化合物１ｅ（１．５４ ｇ、２．４１ ｍｍｏｌ、供給元：皓員）を反応フラスコに入れ、３０ ｍＬのアセトニトリルを加え、アルゴンガスで３回置換し、氷水浴で０～５℃に降温し、２－（７－酸化ベンゾトリアゾール）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（１．１０ ｇ、２．８９ ｍｍｏｌ）とＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（０．９４ ｇ、７．２７ ｍｍｏｌ）を加え、氷浴で１０分間撹拌した。本実施例の化合物１ｄ（８０５ ｍｇ、２．４２ ｍｍｏｌ）のアセトニトリル懸濁液１０ ｍＬを加え、氷浴で４０分間撹拌しながら反応させた。６０ ｍＬの水を加え、酢酸エチル（２０ ｍＬ×４）で抽出し、有機相を飽和塩化ナトリウム溶液で（６０ ｍＬ）洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、ろ液を減圧濃縮し、得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより展開溶媒系Ａで精製し、粗製品生成物である本実施例の化合物１ｆ（２．９ ｇ）を得た。
ＭＳ ｍ／ｚ （ＥＳＩ）： ９５２．３ ［Ｍ＋１］
ステップ４
（Ｓ）－Ｎ－（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）－１－（（１Ｓ，３Ｓ，５Ｓ）－３－（（１Ｒ，２Ｒ）－３－（（（１Ｓ，２Ｒ）－１－ヒドロキシ－１－フェニルプロパン－２－イル）アミノ）－１－メトキシ－２－メチル－３－オキソプロピル）－２－ジアザビシクロ［３．１．０］ヘキシ－２－イル）－３－メトキシ－５－メチル－１－オキソヘプタン－４－イル）－Ｎ，３－ジメチル－２－（（Ｓ）－３－メチル－２－（メチルアミノ）ブチリルアミノ）ブタンアミド 本実施例の化合物１
粗製品である本実施例の化合物１ｆ（５１０ ｍｇ、０．５３ ｍｍｏｌ）を２ ｍＬのジクロロメタンに溶け、４ ｍＬのジエチルアミンを加え、アルゴンガスで３回置換し、室温で撹拌しながら１時間反応させた。反応液を濃縮し、得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより展開溶媒系Ａで精製し、表題生成物である本実施例の化合物１（２６６ ｍｇ、収率：６８．０％）を得た。
ＭＳ ｍ／ｚ （ＥＳＩ）： ７３０．４ ［Ｍ＋１］
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤ３ＯＤ）： δ ７．３６－７．４０ （ｍ， ２Ｈ）， ７．３１ （ｔ， ２Ｈ）， ７．２４ （ｄ， １Ｈ）， ４．６９ （ｄ， １Ｈ）， ４．５６ （ｄ， １Ｈ），４．１７－４．２８ （ｍ， ２Ｈ）， ４．０６－４．１４ （ｍ， １Ｈ）， ３．９１ （ｄ， １Ｈ）， ３．７８ （ｔ， １Ｈ）， ３．２７－３．４４ （ｍ， ７Ｈ）， ３．１５ （ｓ， ３Ｈ）， ２．８４－２．９３ （ｍ， １Ｈ）， ２．６０－２．６７ （ｍ， ２Ｈ）， ２．３０－２．３７ （ｍ， ３Ｈ）， ２．０２－２．１０ （ｍ， ２Ｈ），１．７９－１．９５ （ｍ， ４Ｈ）， １．３８－１．５３ （ｍ， ２Ｈ）， １．２５－１．３６ （ｍ， ２Ｈ）， １．２１ （ｄ， １Ｈ）， １．１３－１．１７ （ｍ， ２Ｈ）， １．０７－１．１１ （ｍ， ２Ｈ）， ０．９３－１．０５ （ｍ， １５Ｈ）， ０．８３－０．８９ （ｍ， ４Ｈ）， ０．７０－０．７９ （ｍ， １Ｈ）。
実施例２－４．
４－（（Ｓ）－２－（（Ｓ）－２－（６－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）ヘキサノイルアミノ）－３－メチルブチリルアミノ）－５－ウレイドペンタノイルアミノ）ベンジル（（Ｓ）－１－（（（Ｓ）－１－（（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）－１－（（１Ｓ，３Ｓ，５Ｓ）－３－（（１Ｒ，２Ｒ）－３－（（（１Ｓ，２Ｒ）－１－ヒドロキシ－１－フェニルプロパン－２－イル）アミノ）－１－メトキシ－２－メチル－３－オキソプロピル）－２－ジアザビシクロ［３．１．０］ヘキシ－２－イル）－３－メトキシ－５－メチル－１－オキソヘプタン－４－イル）（メチル）アミノ）－３－メチル－１－オキソブタン－２－イル）アミノ）－３－メチル－１－オキソブタン－２－イル）（メチル）カルバメート 本実施例の化合物２
Figure 2023535598000109

Figure 2023535598000110
本実施例の化合物１（３０ ｍｇ、０．０４１ ｍｍｏｌ）を１ ｍＬのＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミドに入れ、４－（（Ｓ）－２－（（Ｓ）－２－（６－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）ヘキサノイルアミノ）－３－メチルブチリルアミノ）－５－ウレイドペンタノイルアミノ）ベンジル（４－ニトロフェニル）炭酸エステル 本実施例の化合物２ａ（４５ ｍｇ、０．０６１ ｍｍｏｌ、供給元：Ａｒｋ）を加え、そして０．２５ ｍＬのピリジンを加え、アルゴンガスで３回置換し、更に１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（１２ ｍｇ、０．０８９ ｍｍｏｌ）とＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（１６ ｍｇ、０．１２３ ｍｍｏｌ）を加え、室温で４時間撹拌しながら反応させた後、２ａ（４５ ｍｇ、０．０６１ ｍｍｏｌ）を補充し、１６時間撹拌し続けた。反応液を高速液体クロマトグラフィークロマトグラフィーにより精製し（分離条件：カラム：ＸＢｒｉｄｇｅ Ｐｒｅｐ Ｃ１８ ＯＢＤ ５ μｍ １９＊２５０ ｍｍ、移動相：Ａ－水（１０ ｍｍｏｌ ＮＨ４ＯＡｃ）：Ｂ－アセトニトリル、勾配溶離、流速：１８ ｍＬ／ｍｉｎ）、その対応する成分を収集し、減圧濃縮し、表題生成物である本実施例の化合物２（１８ ｍｇ、収率：３３．０％）を得た。
ＭＳ ｍ／ｚ （ＥＳＩ）： １３２９．３ ［Ｍ＋１］
１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤ３ＯＤ）： δ ７．５８ （ｄ， ２Ｈ）， ７．２９－７．４２ （ｍ， ６Ｈ）， ７．２０－７．２６ （ｍ， １Ｈ）， ６．７９ （ｓ， ２Ｈ）， ５．０４－５．２０ （ｍ， ４Ｈ）， ４．４７－４．６１ （ｍ， ３Ｈ）， ４．１３－４．２８ （ｍ， ３Ｈ）， ４．０６－４．１２ （ｍ， １Ｈ）， ３．９１ （ｄ， １Ｈ）， ３．７５－３．８２ （ｍ， １Ｈ）， ３．４８ （ｔ， ３Ｈ）， ３．２７－３．４１ （ｍ， ７Ｈ）， ３．１６－３．２５ （ｍ， ２Ｈ）， ３．１８ （ｓ， ３Ｈ）， ２．９１－２．９７ （ｍ， ２Ｈ）， ２．６０－２．６５ （ｍ， ２Ｈ）， ２．２７ （ｔ， ２Ｈ）， ２．２０ （ｔ， １Ｈ）， ２．０１－２．１０ （ｍ， ３Ｈ），１．６９－１．９４ （ｍ， ６Ｈ）， １．６３－１．６８ （ｍ， ６Ｈ）， １．４６－１．５１ （ｍ， １Ｈ）， １．２７－１．３７ （ｍ， ５Ｈ）， １．１２－１．２１ （ｍ， ３Ｈ）， １．０９ （ｄ， ２Ｈ）， ０．９３－１．０４ （ｍ， １１Ｈ）， ０．８０－０．９２ （ｍ， １１Ｈ）， ０．７０－０．７７ （ｍ， ２Ｈ）。
三、抗ＣＤ７９Ｂ抗体薬物複合体の調製：
ＡＤＣ薬物担持量分析の実験目的及び原理：
紫外線分光光度法（ＵＶ－Ｖｉｓ）によりＡＤＣ負荷量を測定した（Ｔｈｅｒｍｏ ｎａｎｏｄｒｏｐ２０００紫外分光光度計）。原理は、ある波長でのＡＤＣの全吸光値が、薬物と抗体の当該波長での吸光値の累積に等しいことである。
実験の方法
コハク酸ナトリウム緩衝液が入ったキュベットを、参照吸収セル及び試料測定吸収セルにそれぞれ置いてから、溶媒ブランクを差し引いた後、試験待ちの溶液が入ったキュベットを試料測定吸収セルに置き、２８０ ｎｍ及び３７０ ｎｍでの吸光度を測定した。
結果の算出：
Figure 2023535598000111
 εＤｒｕｇ－２８０：薬物の２８０ ｎｍでの平均モル吸光係数は５１００であり、
ＣＤｒｕｇ：薬物の濃度、
εｍａｂ－２８０：モノクローナル抗体の２８０ ｎｍでの平均モル吸光係数は２１４６００、
Ｃｍａｂ：モノクローナル抗体の濃度、
ｂ：光路長は１ ｃｍである。
同様に、試料の３７０ ｎｍでの全吸光値方程式を得ることができる：
Figure 2023535598000112
 εＤｒｕｇ－３７０：薬物の３７０ ｎｍでの平均モル吸光係数は１９０００であり、
ＣＤｒｕｇ：薬物の濃度、
εｍａｂ－３７０：モノクローナル抗体の３７０ ｎｍでの吸光係数は０であり、
Ｃｍａｂ：モノクローナル抗体の濃度、
ｂ：光路長は１ ｃｍである。
式（１）と式（２）という２つの方程式により、モノクローナル抗体及び薬物の２つの検出波長での吸光係数及び濃度のデータと合わせ、ＡＤＣの薬物担持量を算出することができる：薬物担持量＝ＣＤｒｕｇ／Ｃｍａｂ。
実施例３－１． ＡＤＣ－１
Figure 2023535598000113
３７℃の条件で、抗体ｈＡｂ０１５－１０のＰＢＳ緩衝水溶液（ｐＨ＝６．５の０．０５ ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、１０．０ ｍｇ／ｍＬ、１．５ ｍＬ、０．１０１ μｍｏｌ）に、調製されたトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）の水溶液（１０ ｍＭ、２５．３ μＬ、０．２５３ μｍｏｌ）を加え、水浴振とう機に置き、３７℃で３時間振とうしながら反応させ、反応を止めた。反応液を水浴で２５℃に降温した。
実施例２－２－１中的化合物Ｂ （１．４１ ｍｇ、１．０１５ μｍｏｌ）を５０ μＬのジメチルスルホキシドに溶け、上記反応液に加え、水浴振とう機に置き、２５℃で３時間振とうしながら反応させ、反応を止めた。反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５ゲルカラムで脱塩精製し（溶離相：ｐＨが６．５である０．０５ ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、０．００１ ＭのＥＤＴＡ含有）、本実施例の表題生成物ＡＤＣ－１（即ち、ｈＡｂ０１５－１０－ｃｙｓ－Ｂ）のＰＢＳ緩衝液（０．８４ ｍｇ／ｍＬ、１３．５ ｍＬ）を得て、４℃で冷凍貯蔵した。
ＨＩＣにより平均値を算出した：ｎ＝３．０６。
実施例３－２． ＡＤＣ－２
Figure 2023535598000114
３７℃の条件下で、抗体ｈＡｂ０１５－１０のＰＢＳ緩衝水溶液（ｐＨ＝６．５の０．０５ ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、１０．０ ｍｇ／ｍＬ、３．５ ｍＬ、０．２３６ μｍｏｌ）に、調製されたトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）の水溶液（１０ ｍＭ、５９．１ μＬ、０．５９１ μｍｏｌ）を加え、水浴振とう機に置き、３７℃で３時間振とうしながら反応させ、反応を止めた。反応液を水浴で２５℃に降温した。
化合物Ａ（３．２ ｍｇ、２．３４８ μｍｏｌ）を１５０ μＬのジメチルスルホキシドに溶け、上記反応液に加え、水浴振とう機に置き、２５℃で３時間振とうしながら反応させ、反応を止めた。反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５ゲルカラムで脱塩精製し（溶離相：ｐＨが６．５である０．０５ ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、０．００１ ＭのＥＤＴＡ含有）、本実施例の表題生成物ＡＤＣ－２（即ち、ｈＡｂ０１５－１０－ｃｙｓ－Ｍａｌｅｉ－ＰＥＧ２－ｖｃ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥ）のＰＢＳ緩衝液（２．１７ ｍｇ／ｍＬ、１６．４ ｍＬ）を得て、４℃で冷凍貯蔵した。
ＲＰ－ＨＰＬＣにより平均値を算出した：ｎ＝３．６８。
実施例３－３． ＡＤＣ－３
Figure 2023535598000115
３７℃の条件下で、抗体ｈＡｂ０１５－１０のＰＢＳ緩衝水溶液（ｐＨ＝６．５の０．０５ ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、１０．０ ｍｇ／ｍＬ、５．０ ｍＬ、０．３３８ μｍｏｌ）に、調製されたトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）の水溶液（１０ ｍＭ、８５．０ μＬ、０．８５０ μｍｏｌ）を加え、水浴振とう機に置き、３７℃で３時間振とうしながら反応させ、反応を止めた。反応液を水浴で２５℃に降温した。
化合物ＭＣ－ｖｃ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥ（４．４５ ｍｇ、３．３８０ μｍｏｌ）を２５０ μＬのジメチルスルホキシドに溶け、上記反応液に加え、水浴振とう機に置き、２５℃で３時間振とうしながら反応させ、反応を止めた。反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５ゲルカラムで脱塩精製し（溶離相：ｐＨが６．５である０．０５ ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、０．００１ ＭのＥＤＴＡ含有）、本実施例の表題生成物ＡＤＣ－３（即ち、ｈＡｂ０１５－１０－ｃｙｓ－ＭＣ－ｖｃ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥ）のＰＢＳ緩衝液（２．７９ ｍｇ／ｍＬ、１７．４ ｍＬ）を得て、４℃で冷凍貯蔵した。
ＣＥ－ＳＤＳにより平均値を算出した：ｎ＝３．０９。
実施例３－４． ＡＤＣ－４
Figure 2023535598000116
３７℃の条件下で、抗体ｈＡｂ０１５－１０のＰＢＳ緩衝水溶液（ｐＨ＝６．５の０．０５ ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、１０．０ ｍｇ／ｍＬ、１．８ ｍＬ、０．１２２ μｍｏｌ）に、調製されたトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）の水溶液（１０ ｍＭ、３０．４ μＬ、０．３０４ μｍｏｌ）を加え、水浴振とう機に置き、３７℃で３時間振とうしながら反応させ、反応を止めた。反応液を水浴で２５℃に降温した。
Figure 2023535598000117
化合物Ｃ（１．６２ ｍｇ、１．２２０ μｍｏｌ）を９０ μＬのジメチルスルホキシドに溶け、上記反応液に加え、水浴振とう機に置き、２５℃で３時間振とうしながら反応させ、反応を止めた。反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５ゲルカラムで脱塩精製し（溶離相：ｐＨが６．５である０．０５ ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、０．００１ ＭのＥＤＴＡ含有）、本実施例の表題生成物ＡＤＣ－４（即ち、ｈＡｂ０１５－１０－ｃｙｓ－Ｃ）のＰＢＳ緩衝液（１．３７ ｍｇ／ｍＬ、１２．０ ｍＬ）を得て、４℃で冷凍貯蔵した。
ＲＰ－ＨＰＬＣにより平均値を算出した：ｎ＝４．５２。
実施例３－５． ＡＤＣ－５
Figure 2023535598000118
３７℃の条件で、抗体ｈＡｂ０１５－１０のＰＢＳ緩衝水溶液（ｐＨ＝６．５の０．０５ ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、１０．０ ｍｇ／ｍＬ、１．５ ｍＬ、０．１０１ μｍｏｌ）に、調製されたトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）の水溶液（１０ ｍＭ、１６．２ μＬ、０．１６２ μｍｏｌ）を加え、水浴振とう機に置き、３７℃で３時間振とうしながら反応させ、反応を止めた。反応液を水浴で２５℃に降温した。
Figure 2023535598000119
本実施例の化合物Ｄ（０．８７ ｍｇ、０．８１０ μｍｏｌ）を３７ μＬのジメチルスルホキシドに溶け、上記反応液に加え、水浴振とう機に置き、２５℃で３時間振とうしながら反応させ、反応を止めた。反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５ゲルカラムで脱塩精製し（溶離相：ｐＨが６．５である０．０５ ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、０．００１ ＭのＥＤＴＡ含有）、本実施例の表題生成物ＡＤＣ－５（即ち、ＨＡＢ０１５－１０－ｃｙｓ－Ｄで、ＤＡＲ値は約２である）のＰＢＳ緩衝液（０．９０ ｍｇ／ｍＬ、１４．０ ｍＬ）を得て、４℃で冷凍貯蔵した。
化合物Ｄの調製方法はＷＯ２０２００６３６７６Ａから引用され、例えば、その実施例９である。
ＲＰ－ＨＰＬＣにより平均値を算出した：ｎ＝１．８１。
実施例３－６． ＡＤＣ－６
Figure 2023535598000120
３７℃の条件で、抗体ｈＡｂ０１５－１０のＰＢＳ緩衝水溶液（ｐＨ＝６．５の０．０５ ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、１０．０ ｍｇ／ｍＬ、１．５ ｍＬ、０．１０１ μｍｏｌ）に、調製されたトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）の水溶液（１０ ｍＭ、２５．３ μＬ、０．２５３ μｍｏｌ）を加え、水浴振とう機に置き、３７℃で３時間振とうしながら反応させ、反応を止めた。反応液を水浴で２５℃に降温した。
実施例３－５中の化合物Ｄ（１．０９ ｍｇ、１．０１５ μｍｏｌ）を４５ μＬのジメチルスルホキシドに溶け、上記反応液に加え、水浴振とう機に置き、２５℃で３時間振とうしながら反応させ、反応を止めた。反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５ゲルカラムで脱塩精製し（溶離相：ｐＨが６．５である０．０５ ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、０．００１ ＭのＥＤＴＡ含有）、本実施例の表題生成物ＡＤＣ－６（即ち、ｈＡｂ０１５－１０－ｃｙｓ－Ｄで、目標ＤＡＲ値は約４である）のＰＢＳ緩衝液（０．７１ ｍｇ／ｍＬ、１４．０ ｍＬ）を得て、４℃で冷凍貯蔵した。
ＲＰ－ＨＰＬＣにより平均値を算出した：ｎ＝３．４６。
実施例３－７． ＡＤＣ－７
Figure 2023535598000121
３７℃の条件で、抗体ｈＡｂ０１５－１０のＰＢＳ緩衝水溶液（ｐＨ＝６．５の０．０５ ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、１０．０ ｍｇ／ｍＬ、１．５ ｍＬ、０．１０１ μｍｏｌ）に、調製されたトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）の水溶液（１０ ｍＭ、５０．７ μＬ、０．５０７ μｍｏｌ）を加え、水浴振とう機に置き、３７℃で３時間振とうしながら反応させ、反応を止めた。反応液を水浴で２５℃に降温した。
実施例３－５中の化合物Ｄ（１．６３ ｍｇ、１．５１８ μｍｏｌ）を６８ μＬのジメチルスルホキシドに溶け、上記反応液に加え、水浴振とう機に置き、２５℃で３時間振とうしながら反応させ、反応を止めた。反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５ゲルカラムで脱塩精製し（溶離相：ｐＨが６．５である０．０５ ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、０．００１ ＭのＥＤＴＡ含有）、本実施例の表題生成物ＡＤＣ－７（即ち、ｈＡｂ０１５－１０－ｃｙｓ－Ｄで、ＤＡＲ値は約６である）のＰＢＳ緩衝液（０．８１ ｍｇ／ｍＬ、１３．５ ｍＬ）を得て、４℃で貯蔵した。
ＲＰ－ＨＰＬＣにより平均値を算出した：ｎ＝５．８４。
実施例３－８． ＡＤＣ－８
Figure 2023535598000122
３７℃の条件下で、抗体ＳＮ８のＰＢＳ緩衝水溶液（ｐＨ＝６．５の０．０５ ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、１０．０ ｍｇ／ｍＬ、７９ ｍＬ、５．３３８ μｍｏｌ）に、調製されたトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）の水溶液（１０ ｍＭ、１．３８８ ｍＬ、１３．８８ μｍｏｌ）を加え、水浴振とう機に置き、３７℃で３時間振とうしながら反応させ、反応を止めた。反応液を水浴で２５℃に降温した。
化合物ＭＣ－ＶＣ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥ（７０．３ ｍｇ、５３．４０ μｍｏｌ）を３．５ ｍＬのジメチルスルホキシドに溶け、上記反応液に加え、水浴振とう機に置き、２５℃で３時間振とうしながら反応させ、反応を止めた。反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５ゲルカラムで脱塩精製し（溶離相：ｐＨが６．５である０．０５ ＭのＰＢＳ緩衝水溶液、０．００１ ＭのＥＤＴＡ含有）、本実施例の表題生成物ＡＤＣ－８（即ち、ＳＮ８－ｃｙｓ－ＭＣ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥで、ＤＡＲ値は約４である）のＰＢＳ緩衝液（５．８３ ｍｇ／ｍＬ、１３２ ｍＬ）を得て、４℃で貯蔵した。
ＣＥ－ＳＤＳにより平均値を算出した：ｎ＝３．５９。
四、生物学的評価：
実施例４－１． Ｂｉａｃｏｒｅによる親和性実験
本実施例は、ＢｉａｃｏｒｅによりＣＤ７９Ｂ抗体（ｈＡｂ０１５－１０とＳＮ８）及びＡＤＣとＣＤ７９Ｂタンパク質との親和性を測定した。
実験機器、材料と試薬：Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００（ＧＥ）、バイオセンサチップＣＭ５（Ｃａｔ． ＃ ＢＲ－１００５－３０、ＧＥ）、アミンカップリング試薬キット（Ｃａｔ． ＃ ＢＲ－１０００－５０、ＧＥ）、ヒト抗捕捉試薬キット（Ｃａｔ． ＃ ＢＲ－１００８－３９、ＧＥ）、ヒトＣＤ７９Ｂ－Ｈｉｓタンパク質（Ｃａｔ． ＃ ２９７５０－Ｈ０８Ｈ、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）、Ｄ． Ｉ． Ｗａｔｅｒで１Ｘ（ｐＨ ７．４）に希釈されたＨＢＳ－ＥＰ＋ １０Ｘ緩衝溶液（Ｃａｔ． ＃ ＢＲ－１００６－６９、ＧＥ）、
実験の方法：ヒト抗捕捉試薬キットの取扱説明書における方法によりヒト抗捕捉抗体をＣＭ５バイオチップに共有結合することで、一定量のＣＤ７９Ｂ抗体を親和的に捕捉した。
データの統計と分析： ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｖｅｒｓｉｏｎ ４．１、ＧＥソフトウェアにより（１：１）Ｌａｎｇｍｕｉｒモデルでデータをフィッティングし、親和性の数値を得た。
実験の結果と結論：ＣＤ７９Ｂ抗体及びＡＤＣのＣＤ７９Ｂタンパク質と結合する親和性の検出結果は、表１０に示されている。ヒトＣＤ７９Ｂタンパク質に対して、裸の抗体及びそれぞれのＡＤＣは、類似の結合力を有し、且つ何れも陽性薬Ｐｏｌｉｖｙよりも優れている。
そのうち、ＳＮ８（即ち、Ｐｏｌｉｖｙ中の抗体）配列は下記の通りである：
＞ＳＮ８重鎖アミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＹＴＦＳＳＹＷＩＥＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＩＧＥＩＬＰＧＧＧＤＴＮＹＮＥＩＦＫＧＲＡＴＦＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＴＲＲＶＰＩＲＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号３２
＞ＳＮ８軽鎖アミノ酸配列
ＤＩＱＬＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＳＶＤＹＥＧＤＳＦＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＮＬＥＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＳＮＥＤＰＬＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
配列番号３３。
Figure 2023535598000123
 実施例４－２． 体外細胞エンドサイトーシス実験
ヒトＣＤ７９Ｂタンパク質を高く発現したＤＯＨＨ－２細胞（ＤＳＭＺ、ＡＣＣ ４７）を利用して細胞エンドサイトーシス実験を行い、ＡＤＣのエンドサイトーシス能力を評価した。
ＤＯＨＨ－２細胞を通常の細胞懸濁方法により培養し、完全培地の成分としては、ＲＰＭＩ １６４０培地（ＧＩＢＣＯ、Ｃａｔ Ｎｏ．：１１８３５－０３０）に、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（ＧＩＢＣＯ、Ｃａｔ Ｎｏ．：１００９９－１４１）とペニシリン／ストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ、Ｃａｔ Ｎｏ．：１５０７０－０６３）を加えた。実験時に１０００ ｒｐｍ、５分間、４℃の低温で遠心分離して細胞を収集した。氷上で予冷されたＦＡＣＳ緩衝液１０～１５ ｍＬに細胞を再懸濁した。ＦＡＣＳ緩衝液の成分としては、ｐＨ７．４のリン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）に、２％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を加えた。実験の全過程において、ＦＡＣＳ緩衝液を氷上で予冷していた。細胞をカウントして遠心分離した後、３００，０００細胞／ウェルで９６ウェルプレートに加え、遠心分離して上清を捨てた後に１２．５ μｇ／ｍＬ（ＢＤ、Ｃａｔ Ｎｏ．：５６４２２０）、１００ μＬ／ウェルでＦｃブロッキング液を加えた。室温で１０分間ブロッキングした。その後、２０ μｇ／ｍＬの試験待ちのＡＤＣを対応するウェルに加え、４℃で暗所で１時間インキュベートした。予冷されたＰＢＳ緩衝液により２回洗浄して未結合のＡＤＣを除去した。細胞完全培地（１０％のウシ胎児血清を有するＲＰＭＩ １６４０培地）を加え、３７℃、５％のＣＯ２で０時間と４時間インキュベートした。遠心分離して上清を捨てた後、１００ μＬ／ウェルで２％のＰＦＡ緩衝液を加え、細胞を再懸濁してから１０分間放置した。その後、ＦＡＣＳ緩衝液により３回洗浄し、その後、１００ μＬの二次抗体溶液（蛍光で標識されたヤギ抗ヒト二次抗体：１：２５０で希釈され、濃度が２ μｇ／ｍＬで、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｃａｔ＃４０９３０４）を加え、４℃で暗所で半時間インキュベートした。予冷されたＰＢＳ緩衝液を加え、４℃で遠心分離して上清を捨て、３回繰り返した。細胞をＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、２００ μＬ／ウェルで、フローサイトメーター（ＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ）により検出した。
その結果は、表１１に示されている。それぞれのＡＤＣは、ＤｏＨＨ２細胞と共に４ ｈインキュベートしたエンドサイトーシス率が何れも６５％よりも大きく、エンドサイトーシス能力が良い。各ＡＤＣのエンドサイトーシス率は、陽性薬Ｐｏｌｉｖｙと相当する。
Figure 2023535598000124
 実施例４－３． 細胞増殖実験
本実施例は、体外で培養されたＤｏＨＨ２、ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２とＲａｊｉ細胞の増殖に対するそれぞれのＡＤＣの影響を評価した。文献報告（Ｌｅｕｋｅｍｉａ． ２０１５ Ｊｕｌ； ２９（７）：１５７８－８６、Ｂｌｏｏｄ． ２００７ Ｊｕｌ １５； １１０（２）：６１６－２３）によると、ＤｏＨＨ２はＣＤ７９Ｂ高発現細胞、ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２はＣＤ７９Ｂ低発現細胞、ＲａｊｉはＣＤ７９Ｂ発現陰性細胞である。
実験の材料：
ＡＤＣ－１：無色透明な液体、濃度０．８４ ｍｇ／ｍＬ、純度９９．１７％、
ＡＤＣ－２：無色透明な液体、濃度２．１７ ｍｇ／ｍＬ、純度９７．９３％、
ＡＤＣ－３：無色透明な液体、濃度２．７９ ｍｇ／ｍＬ、純度９８．２８％、
ＡＤＣ－４：無色透明な液体、濃度１．３６ ｍｇ／ｍＬ、純度９８．４８％、
ＡＤＣ－５：無色透明な液体、濃度０．９ ｍｇ／ｍＬ、純度９８．４９％、
ＡＤＣ－６：無色透明な液体、濃度０．７１ ｍｇ／ｍＬ、純度９８．７１％、
ＡＤＣ－７：無色透明な液体、濃度０．８１ ｍｇ／ｍＬ、純度９８．２７％、
ＡＤＣ－８：無色透明な液体、濃度５．８３ ｍｇ／ｍＬ、純度９７．０７％。
実際の検出によると、ＡＤＣ－１のＤＡＲ＝３．０６、ＡＤＣ－２のＤＡＲ＝３．６８、ＡＤＣ－３のＤＡＲ＝３．０９、ＡＤＣ－４のＤＡＲ＝４．５２、ＡＤＣ－５のＤＡＲ＝１．８１、ＡＤＣ－６のＤＡＲ＝３．４６、ＡＤＣ－７のＤＡＲ＝５．８４、ＡＤＣ－８のＤＡＲ＝３．５９である。
以上の薬剤は何れも暗所で、４℃で密閉保存した。
細胞株：ＤｏＨＨ２はＤＳＭＺから購入され、ＷＳＵ－ＤＬＣＬ－２細胞はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から購入され、Ｒａｊｉ細胞はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から購入された。
細胞は、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ １６４０培養液で培養された。
試薬及び機器：ＲＰＭＩ １６４０とＦＢＳはＧｉｂｃｏ社から購入され、テトラメチルアゾール塩（３－（４，５－ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ－２－ｙｌ）－２，５－ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ、ＭＴＴ）は上海生工から購入された。マイクロプレートリーダーはＢｉｏＴｅｋ社から購入された。
実験の方法：
一定数量の対数増殖期の細胞を９６ウェル培養プレートに接種し、異なる濃度の薬剤を加えて７２時間作用した。薬剤による作用の終了後、ＭＴＴ作動液を加えて４時間作用し、その後、ＳＤＳ－イソブタノール－塩酸溶液を加えて青紫色の結晶であるホルマザンを溶解させた。マイクロプレートリーダーにより５７０ ｎｍと６９０ ｎｍの波長でＯＤ値を測定し、下記の式で細胞成長阻害率を算出した：
Figure 2023535598000125
各濃度の阻害率によって、ＰｒｉｓｍＧｒａｐｈ ８により半阻害濃度ＩＣ５０を算出した。
結果は表１２に示される。
Figure 2023535598000126
 実施例４－４． ＡＤＣによるヒトびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２ヌードマウス皮下移植腫瘍への治療効果
本実施例は、各ＡＤＣ薬剤によるヌードマウス皮下移植腫瘍への治療効果を評価して比較した。
ｈＩｇＧ１（ＨＲＰ００２５２）：無色透明な液体であり、濃度２２．７７ ｍｇ／ｍＬ、純度９９．０３％で、産生日は２０１８．７．２４で、使用期限は２０２０．０１．２４までで（一応１８ヶ月）、－７０℃で凍結保存した。
１． 薬剤：ＡＤＣ－１、ＡＤＣ－２、ＡＤＣ－３、ＡＤＣ－４、ＡＤＣ－６、ＡＤＣ－８は、実施例４－３と同様である。
２． 細胞とマウス：ヒトびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから購入された。ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞は１０－ｃｍの培養皿で培養され、培養条件としては、ＲＰＭＩ １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ）に１０％のウシ胎児血清及びペニシリンとストレプトマイシンを加え、３７℃で、５％のＣＯ２含有空気のインキュベーターで培養した。週に２～３回継代し、細胞が指数増殖期になると、細胞を収集し、カウントし、接種した。
３５日間で雌のＢＡＬＢ／ｃ－ｎｕヌードマウスは、
Figure 2023535598000127
から購入された。生産ライセンス番号：ＳＣＸＫ（京）２０１９－０００８、動物合格証明書番号：Ｎｏ．１１０３２２２０１１００４０１４。飼育環境：ＳＰＦ級。
３． 実験手順：それぞれのヌードマウスの皮下に２．１×１０７個のＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞を接種し、腫瘍が１００～１５０ ｍｍ３に成長すると、腫瘍体積によって動物を群分けした（Ｄ０）。マウスに静脈注射（ＩＶ）で投与し、投与体積は１０ ｍＬ／ｋｇで、具体的な投与量と投与計画は表Ｘに示されている。腫瘍体積を週に２回測定し、マウスの体重を秤量し、データを記録した。
４． 実験の指標及び統計学的分析：
実験の指標は、腫瘍成長に対する薬剤の影響を調べることであり、具体的な指標は、Ｔ／Ｃ％又は腫瘍阻害率ＴＧＩ（％）である。
ノギスで腫瘍の直径を週に２回測定し、腫瘍体積（Ｖ）の計算式は下記の通りである：
Ｖ＝１／２×ａ×ｂ２ そのうち、ａ、ｂはそれぞれ長さ、幅を示す。
Ｔ／Ｃ（％）＝（Ｔ－Ｔ０）／（Ｃ－Ｃ０）×１００で、そのうち、Ｔ、Ｃは実験終了時の腫瘍体積であり、Ｔ０、Ｃ０は実験開始時の腫瘍体積である。そのうち、ＴはＡＤＣが投与された腫瘍体積であり、ＣはＩｇＧ１が対照群として投与された腫瘍体積である。
腫瘍成長阻害率％（ＴＧＩ％）＝１００－Ｔ／Ｃ（％）、
腫瘍の退縮が現れる場合、腫瘍成長阻害率％（ＴＧＩ％）＝１００－（Ｔ－ Ｔ０）／Ｔ０×１００であり、
腫瘍が初期体積より小さくなると、つまり、Ｔ＜Ｔ０又はＣ＜Ｃ０になると、腫瘍が部分的に退縮された（ＰＲ）と定義し、腫瘍が完全に消えると、腫瘍が完全に退縮された（ＣＲ）と定義している。
実験が終了したり、実験のエンドポイントに達したり、溶剤群の平均腫瘍体積が１５００ ｍｍ３になったりすると、ＣＯ２麻酔で動物を殺した後、解剖して腫瘍を取って写真を撮った。
特に説明のない限り、２群の腫瘍体積間の比較には、２因子ＡＮＯＶＡ検定が採用され、Ｐ＜０．０５になると、統計学的に有意差があると定義している。
５、結果：
ＡＤＣ－１（３ ｍｇ／ｋｇ、１０ ｍｇ／ｋｇ、ＩＶ、Ｄ０）は、ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２ヌードマウス皮下移植腫瘍の成長を用量依存性的に阻害し、腫瘍阻害率がそれぞれ７５％と１３７％であり、１０ ｍｇ／ｋｇ用量群は全ての腫瘍が部分的に退縮され、
ＡＤＣ－２（３ ｍｇ／ｋｇ、１０ ｍｇ／ｋｇ、ＩＶ、Ｄ０）は、ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２への腫瘍阻害率がそれぞれ７６％と１２３％であり、１０ ｍｇ／ｋｇ用量群は全ての腫瘍が部分的に退縮され、
ＡＤＣ－３（３ ｍｇ／ｋｇ、ＩＶ、Ｄ０）は、ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２への腫瘍阻害率が７６％であり、１／６の腫瘍が部分的に退縮され、
ＡＤＣ－４（３ ｍｇ／ｋｇ、１０ ｍｇ／ｋｇ、ＩＶ、Ｄ０）は、ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２への腫瘍阻害率がそれぞれ９５％と１２９％であり、３ ｍｇ／ｋｇと１０ ｍｇ／ｋｇ用量群はそれぞれ１／６と６／６の腫瘍が部分的に退縮され、
ＡＤＣ－６（３ ｍｇ／ｋｇ、ＩＶ、Ｄ０）は、ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２への腫瘍阻害率が８６％であり、有２／６の腫瘍が部分的に退縮され、
ＡＤＣ－８（３ ｍｇ／ｋｇ、１０ ｍｇ／ｋｇ、ＩＶ、Ｄ０）は、ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２への腫瘍阻害率がそれぞれ３９％と９３％であり、１０ ｍｇ／ｋｇ用量群は４／６の腫瘍が部分的に退縮された。
担腫瘍マウスは、以上の薬剤の何れにも比較的良く耐えることができ、明らかな減量などの症状の発生がなかった。ＩｇＧ１を陰性対照として使用した。結果は、表１３及び図１３Ａ～図１３Ｃ、図１４を参照してください。
Figure 2023535598000128
６、結論
ＡＤＣ－１、ＡＤＣ－２、ＡＤＣ－３、ＡＤＣ－４、ＡＤＣ－６及びＡＤＣ－８の３ ｍｇ／ｋｇ又は１０ ｍｇ／ｋｇの単回静脈注射は、何れもＷＳＵ－ＤＬＣＬ２ヌードマウス皮下移植腫瘍に対して顕著な治療効果があり、腫瘍の部分的退縮が引き起こされ、薬剤に顕著な用量依存性があると共に、同じ用量で各ＡＤＣの薬効は何れも陽性薬ＡＤＣ－８（即ち、Ｐｏｌｉｖｙ）よりも優れている。担腫瘍マウスは、以上の薬剤の何れにも比較的良く耐えることができる。
実施例４－５． ＡＤＣによるヒトびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２ヌードマウス皮下移植腫瘍への治療効果
本実施例は、ＡＤＣ薬剤によるＷＳＵ－ＤＬＣＬ２ヌードマウス皮下移植腫瘍への治療効果を更に評価して比較した。
１． 薬剤：生理食塩水によりＡＤＣ－５、ＡＤＣ－６、ＡＤＣ－７、ＡＤＣ－１、ＡＤＣ－８薬剤を実施例４－３中の濃度に希釈した。
２． 細胞とマウス：実施例４－４と同様。
３． 実験手順：それぞれのヌードマウスの皮下に２×１０７個のＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞を接種し、腫瘍が１００～１５０ ｍｍ３に成長すると、腫瘍体積によって動物を群分けした（Ｄ０）。マウスに静脈注射（ＩＶ）で投与し、投与体積は１０ ｍＬ／ｋｇで、具体的な投与量と投与計画は、表１２に示されている。腫瘍体積を週に２回測定し、マウスの体重を秤量し、データを記録した。
４． 実験の指標は実施例４－４と同様で、統計学的分析は、下記の通りである：
特に説明のない限り、２群の腫瘍体積間の比較には、両側Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ検定が採用され、Ｐ＜０．０５になると、統計学的に有意差があると定義されている。
５． 結果
ＡＤＣ－５（３ ｍｇ／ｋｇ、６ ｍｇ／ｋｇ、１２ ｍｇ／ｋｇ、ＩＶ、Ｄ０）は、ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２ヌードマウス皮下移植腫瘍への腫瘍阻害率がそれぞれ６９％、８６％と８８％であり、そのうち、６ ｍｇ／ｋｇと１２ ｍｇ／ｋｇ用量群はそれぞれ１／６と１／６の腫瘍が部分的に退縮され、
ＡＤＣ－６（１．５ ｍｇ／ｋｇ、３ ｍｇ／ｋｇ、６ ｍｇ／ｋｇ、ＩＶ、Ｄ０）は、ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２皮下移植腫瘍への腫瘍阻害率がそれぞれ６６％、１０８％と１２５％であり、そのうち、３ ｍｇ／ｋｇと６ ｍｇ／ｋｇ用量群はそれぞれ５／６と６／６の腫瘍が部分的に退縮され、
ＡＤＣ－７（１ ｍｇ／ｋｇ、ＩＶ、Ｄ０）は、ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２皮下移植腫瘍への腫瘍阻害率が９１％であり、１／６の腫瘍が部分的に退縮され、
ＡＤＣ－１（３ ｍｇ／ｋｇ、ＩＶ、Ｄ０）は、ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２皮下移植腫瘍への腫瘍阻害率が４４％であり、
ＡＤＣ－８（３ ｍｇ／ｋｇ、ＩＶ、Ｄ０）は、ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２皮下移植腫瘍への腫瘍阻害率が１０％である。
担腫瘍マウスは、以上の薬剤の何れにも良く耐えることができ、明らかな減量などの症状の発生がなかった。
具体的な結果は、表１４と図１５～図１７を参照してください。
Figure 2023535598000129
 実施例４－６． ＡＤＣによるヒトＢ細胞リンパ腫ＤｏＨＨ２ヌードマウス皮下移植腫瘍への治療効果
本実施例は、ＡＤＣ薬剤によるＤｏＨＨ２ヌードマウス皮下移植腫瘍への治療効果を更に評価して比較した。
１． 薬剤：生理食塩水によりＡＤＣ－１、ＡＤＣ－６、ＡＤＣ－８薬剤を実施例４－３中の濃度に希釈した。
２． 細胞とマウス：ＤＯＨＨ－２細胞はドイツＤＳＭＺから購入された。ＤＯＨＨ－２細胞は１０－ｃｍの培養皿で培養され、培養条件としては、ＲＰＭＩ １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ）に１０％のウシ胎児血清及びペニシリンとストレプトマイシンを加え、３７℃で、５％のＣＯ２含有空気のインキュベーターで培養した。週に２～３回継代し、細胞が指数増殖期になると、細胞を収集し、カウントし、接種した。
４～５週間で雌のＢＡＬＢ／ｃ－ｎｕヌードマウスは、上海靈暢生物科技有限公司から購入された。生産ライセンス番号：ＳＣＸＫ（京）２０１８－０００３、動物合格証明書番号：２０１８０００３０１０２２２。飼育環境：ＳＰＦ級。
３． 実験手順：それぞれのヌードマウスの皮下に３×１０７個のＤＯＨＨ－２細胞を接種し、腫瘍が１００～１５０ ｍｍ３に成長すると、腫瘍体積によって動物を群分けした（Ｄ０）。マウスに静脈注射（ＩＶ）で投与し、投与体積は１０ ｍＬ／ｋｇで、具体的な投与量と投与計画は表１５に示されている。腫瘍体積を週に２回測定し、マウスの体重を秤量し、データを記録した。
４． 実験の指標及び統計学的分析：
実験の指標は、腫瘍成長に対する薬剤の影響を調べることであり、具体的な指標は、Ｔ／Ｃ％又は腫瘍阻害率ＴＧＩ（％）である。
ノギスで腫瘍の直径を週に２回測定し、腫瘍体積（Ｖ）の計算式は下記の通りである：
Ｖ＝１／２×ａ×ｂ２ そのうち、ａ、ｂはそれぞれ長さ、幅を示す。
Ｔ／Ｃ（％）＝（Ｔ－Ｔ０）／（Ｃ－Ｃ０）×１００ そのうち、Ｔ、Ｃは実験終了時の腫瘍体積であり、Ｔ０、Ｃ０は実験開始時の腫瘍体積である。ＴはＡＤＣが投与された腫瘍体積であり、ＣはＩｇＧ１が対照群として投与された腫瘍体積である。
腫瘍成長阻害率％（ＴＧＩ％）＝１００－Ｔ／Ｃ（％）、
腫瘍の退縮が現れる場合、腫瘍成長阻害率％（ＴＧＩ％）＝１００－（Ｔ－ Ｔ０）／Ｔ０×１００であり、
腫瘍が初期体積より小さくなると、つまり、Ｔ＜Ｔ０又はＣ＜Ｃ０になると、腫瘍が部分的に退縮された（ＰＲ）と定義し、腫瘍が完全に消えると、腫瘍が完全に退縮された（ＣＲ）と定義している。
実験が終了したり、実験のエンドポイントに達したり、溶剤群の平均腫瘍体積が１５００ ｍｍ３になったりすると、ＣＯ２麻酔で動物を殺した後、解剖して腫瘍を取って写真を撮った。
特に説明のない限り、２群の腫瘍体積間の比較には、２因子ＡＮＯＶＡ検定が採用され、Ｐ＜０．０５になると、統計学的に有意差があると定義している。
５、結果：
ＡＤＣ－１、ＡＤＣ－６、ＡＤＣ－８（１ ｍｇ／ｋｇ、ＩＶ、Ｄ０）は、ＤＯＨＨ－２ヌードマウス皮下移植腫瘍への腫瘍阻害率がそれぞれ８２％（１／６ ＰＲ）、１２７％（５／６ ＰＲ）、４１％であり、担腫瘍マウスは以上の薬剤の何れにもよく耐えることができ、明らかな減量などの症状の発生がなかった。
結果は、表１５及び図１８、図１９を参照してください。
Figure 2023535598000130
６、結論
ＡＤＣ－１とＡＤＣ－６の１ ｍｇ／ｋｇの単回静脈注射は何れも、ヒト濾胞型リンパ腫ＤｏＨＨ２ヌードマウス皮下移植腫瘍に対して顕著な治療効果があり、腫瘍の部分的退縮が引き起こされ、薬効は何れも陽性薬ＡＤＣ－８（即ち、Ｐｏｌｉｖｙ）よりも優れている。担腫瘍マウスは、以上の薬剤の何れにも比較的良く耐えることができる。
本開示中の実験動物の使用と福祉は、「国際実験動物ケア評価認証協会（ＡＡＡＬＡＣ）」の規定に従って実施された。毎日動物の健康状態と死亡状況を監視し、常例検査には、被験物と薬剤が、行動活動、体重変化、外観症状など動物の日常行動に対する影響の観察が含まれる。

Claims (51)

  1. リガンド－薬物複合体又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物であって、
    前記薬物は、チューブリン重合阻害剤、Ｔｏｐｏ Ｉ阻害剤、ＭＭＡＥ若しくはその誘導体から選ばれ、好ましくは、薬物はＭＭＡＥ若しくはその誘導体、エキサテカン若しくはその誘導体、エリブリン若しくはその誘導体から選ばれ、
    前記リガンドは、
    配列番号２４で示される配列を含む重鎖ＨＣＤＲ１と、
    配列番号２５で示される配列を含む重鎖ＨＣＤＲ２と、
    配列番号２６で示される配列を含む重鎖ＨＣＤＲ３と、
    配列番号２７で示される配列を含む軽鎖ＬＣＤＲ１と、
    配列番号１１又は配列番号１７で示される配列を含む軽鎖ＬＣＤＲ２と、
    配列番号１２又は配列番号１８で示される配列を含む軽鎖ＬＣＤＲ３と、
    を含む、
    抗ＣＤ７９Ｂ抗体又はその抗原結合断片である、リガンド－薬物複合体又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物。
  2. 前記抗ＣＤ７９Ｂ抗体又はその抗原結合断片は、
    ａ）それぞれ配列番号２３、８、９で示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３、及びそれぞれ配列番号１０、１１、１２で示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３、
    ｂ）それぞれ配列番号７、８、９で示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３、及びそれぞれ配列番号１０、１１、１２で示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３、又は
    ｃ）それぞれ配列番号１３、１４、１５で示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３、及びそれぞれ配列番号１６、１７、１８で示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３、
    を含む、
    請求項１に記載のリガンド－薬物複合体又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物。
  3. 前記抗ＣＤ７９Ｂ抗体又はその抗原結合断片はマウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体又はその断片であり、
    好ましくは、ヒト化抗体又はその断片である、
    請求項１～２の何れか一項に記載のリガンド－薬物複合体又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物。
  4. 前記抗ＣＤ７９Ｂ抗体又はその抗原結合断片は、
    配列番号３で示され、又はそれと少なくとも９０％の同一性を有する重鎖可変領域、及び
    配列番号４で示され、又はそれと少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖可変領域、
    又は
    配列番号５で示され、又はそれと少なくとも９０％の同一性を有する重鎖可変領域、及び
    配列番号６で示され、又はそれと少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖可変領域、
    又は
    配列番号１９で示され、又はそれと少なくとも９０％の同一性を有する重鎖可変領域、及び
    配列番号２０で示され、又はそれと少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖可変領域、
    又は
    配列番号２１で示され、又はそれと少なくとも９０％の同一性を有する重鎖可変領域、及び
    配列番号２２で示され、又はそれと少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖可変領域、
    を含む、
    前記請求項の何れか一項に記載のリガンド－薬物複合体又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物。
  5. 前記抗ＣＤ７９Ｂ抗体又はその抗原結合断片は、定常領域Ｆｃを含み、
    好ましくは、前記ＦｃはＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４であり、
    より好ましくは、前記ＦｃはＩｇＧ１、ＩｇＧ２である、
    前記請求項の何れか一項に記載のリガンド－薬物複合体又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物。
  6. 前記抗ＣＤ７９Ｂ抗体の抗原結合断片は、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆａｂ又はＦａｂ’断片である、
    前記請求項の何れか一項に記載のリガンド－薬物複合体又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物。
  7. 前記抗ＣＤ７９Ｂ抗体は、
    配列番号２８で示され、又はそれと少なくとも９０％の同一性を有する重鎖、及び
    配列番号２９で示され、又はそれと少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖、
    又は
    配列番号３０で示され、又はそれと少なくとも９０％の同一性を有する重鎖、及び
    配列番号３１で示され、又はそれと少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖、
    を含む、
    前記請求項の何れか一項に記載のリガンド－薬物複合体又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物。
  8. 式（Ｉ）で示されるリガンド－薬物複合体又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物であり、
    Figure 2023535598000131
     式（Ｉ）
    そのうち、
    Ｗは、Ｃ１－８アルキル基、Ｃ１－８アルキル－シクロアルキル基又は１～８個の原子の直鎖ヘテロアルキル基から選ばれ、前記ヘテロアルキル基は、Ｎ、Ｏ又はＳから選ばれる１～３個のヘテロ原子を含み、そのうち、前記Ｃ１－８アルキル基、シクロアルキル基及び直鎖ヘテロアルキル基は、それぞれ独立的に、任意選択的に更にハロゲン、ヒドロキシ基、シアノ基、アミノ基、アルキル基、クロロアルキル基、重水素化アルキル基、アルコキシ基及びシクロアルキル基から選ばれる１つ又は複数の置換基で置換され、
    Ｌ２は、－ＮＲ４（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｐ１ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）－、－ＮＲ４（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｐ１ＣＨ２Ｃ（Ｏ）－、－Ｓ（ＣＨ２）ｐ１Ｃ（Ｏ）－又は化学結合から選ばれ、ｐ１は１～２０の整数であり、
    Ｌ３は、２～７個のアミノ酸からなるペプチド残基であり、そのうち、アミノ酸は、任意選択的にハロゲン、ヒドロキシ基、シアノ基、アミノ基、アルキル基、クロロアルキル基、重水素化アルキル基、アルコキシ基及びシクロアルキル基から選ばれる１つ又は複数の置換基で置換され、
    Ｒ１は、水素原子、ハロゲン、シクロアルキルアルキル基、重水素化アルキル基、シクロアルキル基、ヘテロシクリル基、アリール基又はヘテロアリール基から選ばれ、
    Ｒ２は、水素原子、ハロゲン、ハロアルキル基、重水素化アルキル基、シクロアルキル基、ヘテロシクリル基、アリール基又はヘテロアリール基から選ばれ、
    或いは、Ｒ１とＲ２は、それらに連結された炭素原子と共にシクロアルキル基又はヘテロシクリル基を形成し、
    Ｒ４とＲ５は相同又は相異であり、且つそれぞれ独立的に水素原子、アルキル基、ハロアルキル基、重水素化アルキル基とヒドロキシアルキル基から選ばれ、
    Ｒ６とＲ７は相同又は相異であり、且つそれぞれ独立的に水素原子、ハロゲン、アルキル基、ハロアルキル基、重水素化アルキル基とヒドロキシアルキル基から選ばれ、
    ｍは、０～４の整数であり、
    ｎは１～１０であり、整数でも小数でもよく、
    Ｐｃは請求項１～７の何れか一項に限定された抗ＣＤ７９Ｂ抗体又はその抗原結合断片である、
    請求項１～７の何れか一項に記載のリガンド－薬物複合体又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物。
  9. 式（ＩＩ）で示されるリガンド－薬物複合体又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物であり、
    Figure 2023535598000132
     式（ＩＩ）
    そのうち、
    ｓ１は、２～８の整数で、好ましくは５であり、
    Ｐｃ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、ｍとｎは請求項８に定義された通りである、
    請求項８に記載のリガンド－薬物複合体又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物。
  10. －Ｌａ－Ｙ－又は－Ｌｂ－Ｙ－は、
    Figure 2023535598000133
    Figure 2023535598000134
    Figure 2023535598000135
    Figure 2023535598000136
     から選ばれる、
    請求項８又は９に記載のリガンド－薬物複合体又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物。
  11. Figure 2023535598000137
    Figure 2023535598000138
    Figure 2023535598000139
    Figure 2023535598000140
     から選ばれる構造式で示され、
    そのうち、
    ｎは１～１０で、整数でも小数でもよく、好ましくは、ｎは１～６の整数又は小数であり、
    Ｐｃは、請求項１～７の何れか一項に限定された抗ＣＤ７９Ｂ抗体又はその抗原結合断片である、
    請求項１～１０の何れか一項に記載のリガンド－薬物複合体又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物。
  12. 請求項１～１１の何れか一項に記載のリガンド－薬物複合体又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物を調製する方法であって、
    Figure 2023535598000141
     Ｐｃを還元した後、一般式Ｌａ－Ｙ－Ｄで示される化合物とカップリングし、一般式Ｐｃ－Ｌａ－Ｙ－Ｄで示されるリガンド－薬物複合体を得るステップを含み、
    そのうち、
    Ｐｃは、請求項１～７の何れか一項に限定された抗ＣＤ７９Ｂ抗体又はその抗原結合断片であり、
    Ｗ、Ｌ２、Ｌ３、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、ｍとｎは、請求項８に定義された通りである、
    方法。
  13. 一般式Ｐｃ－（Ｌ－Ｄ）ｋで示され、
    そのうち、
    Ｐｃは、請求項１～７の何れか一項に限定された抗ＣＤ７９Ｂ抗体又はその抗原結合断片であり、
    Ｌはリンカーであり、
    ｋは１～２０の整数又は小数であり、
    Ｄは式（ＩＩＩ）で示される：
    Figure 2023535598000142
     式（ＩＩＩ）
    そのうち、
    Ｒ１ａは、水素、アルキル基、シクロアルキル基、アリール基とヘテロアリール基から選ばれ、
    任意選択的に、前記アルキル基、シクロアルキル基、アリール基及びヘテロアリール基は、それぞれ独立的にアルキル基、アルコキシ基、ハロゲン、重水素、アミノ基、シアノ基、ニトロ基、ヒドロキシ基、ヒドロキシアルキル基、シクロアルキル基、ヘテロシクリル基、アリール基及びヘテロアリール基から選ばれる１つ又は複数の置換基で置換され、好ましくは、Ｒ１ａはメチルであり、
    Ｒ１ｂは、水素、アルキル基、アルコキシ基、シクロアルキル基、アリール基及びヘテロアリール基から選ばれ、
    任意選択的に、前記アルキル基、シクロアルキル基、アリール基及びヘテロアリール基は、それぞれ独立的にアルキル基、アルコキシ基、ハロゲン、重水素、アミノ基、シアノ基、ニトロ基、ヒドロキシ基、ヒドロキシアルキル基、シクロアルキル基、ヘテロシクリル基、アリール基及びヘテロアリール基被から選ばれる１つ又は複数の置換基で置換され、好ましくは、Ｒ１ｂは水素であり、又は
    Ｒ１ａとＲ１ｂは、それらに連結された原子と共にＣ５－８ヘテロシクロアルキル基を形成し、任意選択的に、前記ヘテロアルキル基は、アルキル基、アルコキシ基、ハロゲン、重水素、アミノ基、シアノ基、ニトロ基、ヒドロキシ基、ヒドロキシアルキル基、シクロアルキル基、ヘテロシクリル基、アリール基とヘテロアリール基のうちの１つ又は複数の置換基で置換され、且つＲ１ａとＲ１ｂは同時に水素になることはない、
    請求項１～７の何れか一項に記載のリガンド－薬物複合体又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物。
  14. ｋは１～１０から選ばれ、整数でも小数でもよい、
    請求項１３に記載のリガンド－薬物複合体又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物。
  15. 前記リンカーは、切断可能なペプチド部分を含む、
    請求項１３に記載のリガンド－薬物複合体又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物。
  16. 前記切断可能なペプチド部分は、酵素により切断可能であり、好ましくは、前記酵素はカテプシンであり、より好ましくはカテプシンＢである、
    請求項１５に記載のリガンド－薬物複合体又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物。
  17. 前記リンカーは、２～７個のアミノ酸からなるペプチド残基を含み、
    前記アミノ酸は、フェニルアラニン、グリシン、バリン、リジン、シトルリン、セリン、グルタミン酸、アスパラギン酸から選ばれ、
    より好ましくは、前記ペプチド残基は、バリン－シトルリン、アラニン－アラニン－アスパラギン、グリシン－グリシン－リジン、バリン－リジン、バリン－アラニン、バリン－フェニルアラニン、グリシン－グリシン－フェニルアラニン－グリシンから選ばれる、
    請求項１５又は１６に記載のリガンド－薬物複合体又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物。
  18. 前記リンカーは、切断可能なスルホンアミド部分又は切断可能なジスルフィド部分を含む、
    請求項１３に記載のリガンド－薬物複合体又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物。
  19. 前記リンカーは、還元条件下で切断可能である、
    請求項１８に記載のリガンド－薬物複合体又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物。
  20. 前記リンカーは、Ｄに結合されたスペーサーユニットを含む、
    請求項１３～１９の何れか一項に記載のリガンド－薬物複合体又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物。
  21. 前記スペーサーユニットは、ｐ－アミノベンジルオキシカルボニル（ＰＡＢ）を含む、
    請求項２０に記載のリガンド－薬物複合体又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物。
  22. 下記から選ばれる何れか１つの構造で示される：
    Figure 2023535598000143
     ｋは１～１０から選ばれ、整数でも小数でもよく、ｐ１は２、４、６又は８から選ばれ、
    Figure 2023535598000144
     ｋは１～１０から選ばれ、整数でも小数でもよく、ｐ１は２、４、６又は８から選ばれ、Ｐ３は０、１又は２から選ばれ、
    Figure 2023535598000145
     ｋは１～１０から選ばれ、整数でも小数でもよく、ｐ１は２、４、６又は８から選ばれ、
    Figure 2023535598000146
     ｋは１～１０から選ばれ、整数でも小数でもよく、ｐ１は２、４、６又は８から選ばれ、Ｐ３は０、１又は２から選ばれ、
    Figure 2023535598000147
     ｋは１～１０から選ばれ、整数でも小数でもよく、ｐ２は２、４、６又は８から選ばれ、
    Figure 2023535598000148
     ｋは１～１０から選ばれ、整数でも小数でもよく、ｐ２は２、４、６又は８から選ばれ、
    Figure 2023535598000149
     ｋは１～１０から選ばれ、整数でも小数でもよく、ｐ２は２、４、６又は８から選ばれ、
    Figure 2023535598000150
     ｋは１～１０から選ばれ、整数でも小数でもよく、ｐ２は２、４、６又は８から選ばれ、
    Figure 2023535598000151
     ｋは１～１０から選ばれ、整数でも小数でもよく、ｐ２は２、４、６又は８から選ばれ、
    Figure 2023535598000152
     ｋは１～１０から選ばれ、整数でも小数でもよく、ｐ１は２、４、６又は８から選ばれ、Ｐ３は０、１又は２から選ばれ、
    Figure 2023535598000153
     ｋは１～１０から選ばれ、整数でも小数でもよく、ｐ１は２、４、６又は８から選ばれ、Ｐ３は０、１又は２から選ばれる、
    請求項１３～２１の何れか一項に記載のリガンド－薬物複合体又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物。
  23. 下記から選ばれる何れか１つの構造で示される：
    Figure 2023535598000154
    Figure 2023535598000155
    Figure 2023535598000156
    Figure 2023535598000157
     そのうち、ｋは１～１０から選ばれ、整数でも小数でもよく、
    好ましくは、ＤにおいてＲ１ａはメチルで、Ｒ１ｂは水素である、
    請求項２２に記載のリガンド－薬物複合体又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物。
  24. 式（ＩＶ）で示される：
    Figure 2023535598000158
     式（ＩＶ）
    そのうち、
    Ｒ２はＣ１－Ｃ８アルキル基であり、
    Ｒ３はＣ１－Ｃ８アルキル基であり、
    Ｒ４はＣ１－Ｃ８アルキル基であり、
    Ｒ５はＨであり、
    Ｒ６はＣ１－Ｃ８アルキル基であり、
    Ｒ７はＣ１－Ｃ８アルキル基であり、
    Ｒ８は互いに独立的にＯ－（Ｃ１－Ｃ８アルキル基）であり、
    Ｒ９はＨであり、
    Ｒ１０はフェニル基であり、
    ＺはＯ又はＮＨであり、
    Ｒ１１は、Ｈ、Ｃ１－Ｃ２０アルキル基又は－（Ｒ１３Ｏ）３－Ｒ１４から選ばれ、
    Ｒ１３はＣ２－Ｃ８アルキル基であり、
    Ｒ１４はＣ１－Ｃ８アルキル基であり、
    Ｐｃは、請求項１～７に限定された抗ＣＤ７９Ｂ抗体又はその抗原結合断片であり、
    Ｌはリンカーであり、
    ｎは１～１０で、整数でも小数でもよい、
    請求項１～７の何れか一項に記載のリガンド－薬物複合体又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物。
  25. Figure 2023535598000159
     で示される構造を含む、
    請求項２４に記載のリガンド－薬物複合体又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物。
  26. 式（Ｖ）で示される構造を含む：
    Figure 2023535598000160
     式（Ｖ）
    そのうち、Ｒ２～Ｒ６は、水素原子、ハロゲン、ヒドロキシ基、シアノ基、アルキル基、アルコキシ基及びシクロアルキル基から選ばれ、
    Ｒ７は水素原子、アルキル基、アルコキシ基及びシクロアルキル基から選ばれ、
    Ｒ８～Ｒ１１のうちの何れか２つはシクロアルキル基を形成し、残りの２つは任意選択的に水素原子、アルキル基及びシクロアルキル基から選ばれ、
    Ｒ１２は、水素原子又はアルキル基から選ばれ、
    Ｒ１３～Ｒ１５は、水素原子、ヒドロキシ基、アルキル基、アルコキシ基又はハロゲンから選ばれ、
    Ｒ１６はアリール基又はヘテロアリール基から選ばれ、前記アリール基又はヘテロアリール基は、任意選択的に水素原子、ハロゲン、ヒドロキシ基、アルキル基、アルコキシ基及びシクロアルキル基から選ばれる置換基で置換され、
    ｎは１～１０であり、整数でも小数でもよく、
    Ｐｃは、請求項１～７の何れか一項に限定された抗ＣＤ７９Ｂ抗体又はその抗原結合断片であり、
    Ｌは、リンカーである、
    請求項１～７の何れか一項に記載のリガンド－薬物複合体又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物。
  27. 式（ＶＩ）で示される構造を含む：
    Figure 2023535598000161
     式（ＶＩ）
    そのうち、ｎ、Ｒ２～Ｒ１６は、請求項２６に定義された通りであり、
    Ｐｃは、請求項１～７の何れか一項に記載の抗ＣＤ７９Ｂ抗体又はその抗原結合断片であり、Ｌはリンカーである、
    請求項１～７の何れか一項に記載のリガンド－薬物複合体又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物。
  28. 式（ＶＩＩ）で示される：
    Figure 2023535598000162
     式（ＶＩＩ）
    ｎは１～１０であり、整数でも小数でもよく、
    Ｐｃは、請求項１～７の何れか一項に限定された抗ＣＤ７９Ｂ抗体又はその抗原結合断片であり、
    Ｌは、リンカーである、
    請求項１～７の何れか一項に記載のリガンド－薬物複合体又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物。
  29. ｎは１～８であり、整数でも小数でもよく、
    好ましくは、ｎは１～６であり、整数でも小数でもよい、
    請求項２４～２８の何れか一項に記載のリガンド－薬物複合体又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物。
  30. 前記リンカーは－Ｙ－Ｌ１－Ｌ２－Ｌ３－Ｌ４であり、
    Ｙは、
    Figure 2023535598000163
     又は化学結合から選ばれ、Ｘ１は水素原子、アルキル基、アルコキシ基、アリール基又はハロゲンから選ばれ、Ｘ２はアルキレン基から選ばれ、前記アルキレン基は、任意選択的にハロゲン、ヒドロキシ基、シアノ基、アミノ基、アルキル基、クロロアルキル基、重水素化アルキル基、アルコキシ基及びシクロアルキル基から選ばれる１つ又は複数の置換基で置換され、
    Ｌ１は、－（スクシンイミド－３－イル－Ｎ）－Ｗ－Ｃ（Ｏ）－、－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）－ＮＲ１７－Ｗ－Ｃ（Ｏ）－又は－Ｃ（Ｏ）－Ｗ－Ｃ（Ｏ）－から選ばれ、そのうち、Ｗは、Ｃ１－８アルキル基、Ｃ１－８アルキル－シクロアルキル基又は１～８個の原子の直鎖ヘテロアルキル基から選ばれ、前記ヘテロアルキル基は、Ｎ、Ｏ及びＳから選ばれる１～３個のヘテロ原子を含み、そのうち、前記Ｃ１－８アルキル基、シクロアルキル基及び直鎖ヘテロアルキル基は、任意選択的に、それぞれ独立的にハロゲン、ヒドロキシ基、シアノ基、アミノ基、アルキル基、クロロアルキル基、重水素化アルキル基、アルコキシ基及びシクロアルキル基から選ばれる１つ又は複数の置換基で置換され、
    Ｌ２は、－ＮＲ１８（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｐ１ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）－、－ＮＲ１８（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｐ１ＣＨ２Ｃ（Ｏ）－、－Ｓ（ＣＨ２）ｐ１Ｃ（Ｏ）－又は化学結合から選ばれ、そのうち、ｐ１は１～２０の整数であり、好ましくは、Ｌ２は化学結合であり、
    Ｌ３は、２～７個のアミノ酸からなるペプチド残基であり、前記アミノ酸は、バリン、シトルリン、メチルバリンから選ばれることが好ましく、そのうち、アミノ酸は、任意選択的にハロゲン、ヒドロキシ基、シアノ基、アミノ基、アルキル基、クロロアルキル基、重水素化アルキル基、アルコキシ基及びシクロアルキル基から選ばれる１つ又は複数の置換基で置換され、
    Ｒ１７とＲ１８は相同又は相異であり、且つそれぞれ独立的に水素原子、アルキル基、ハロアルキル基、重水素化アルキル基及びヒドロキシアルキル基から選ばれ、
    Ｌ４は伸長ユニットであり、好ましくは、Ｌ４はＰＡＢである、
    請求項２４～２９の何れか一項に記載のリガンド－薬物複合体又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物。
  31. Ｙは
    Figure 2023535598000164
     である、
    請求項３０に記載のリガンド－薬物複合体又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物。
  32. Ｌ１は、－（スクシンイミド－３－イル－Ｎ）－（ＣＨ２）ｓ１－Ｃ（Ｏ）－から選ばれ、そのうち、ｓ１は２～８の整数であり、
    好ましくは、Ｌ１は
    Figure 2023535598000165
     である、
    請求項３０に記載のリガンド－薬物複合体又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物。
  33. Ｌ３はジペプチドアミノ酸ユニットであり、好ましくは、Ｌ３はバリン－シトルリンである、
    請求項３０～３２の何れか一項に記載のリガンド－薬物複合体又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物。
  34. 前記リンカーは、
    Figure 2023535598000166
     又は
    Figure 2023535598000167
     から選ばれ、
    そのうち、ａ末端は前記Ｐｃに連結され、ｂ末端は前記薬物に連結される、
    請求項２４～３３の何れか一項に記載のリガンド－薬物複合体又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物。
  35. Figure 2023535598000168
     又は
    Figure 2023535598000169
    という構造式から選ばれ、
    そのうち、
    ｎは１～１０であり、整数でも小数でもよく、
    Ｐｃは、請求項１～７の何れか一項に限定された抗ＣＤ７９Ｂ抗体又はその抗原結合断片である、
    請求項２４～３４の何れか一項に記載のリガンド－薬物複合体又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物。
  36. 請求項３５に記載のリガンド－薬物複合体又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物を調製する方法であって、下記のステップを含む：
    Figure 2023535598000170
     そのうち、Ｐｃ、ｎは請求項３５に定義された通りである、
    方法。
  37. 下記から選ばれる何れか一項で示される：
    Figure 2023535598000171
    Figure 2023535598000172
    Figure 2023535598000173
    Figure 2023535598000174
    Figure 2023535598000175
     そのうち、Ｐｃは、請求項１～７に限定された抗ＣＤ７９Ｂ抗体又はその抗原結合断片であり、ｎは１～１０であり、整数でも小数でもよく、
    好ましくは、ｎは１～６の間の整数又は小数である、
    リガンド－薬物複合体又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物。
  38. 請求項１～１１、１３～３５、３７の何れか一項に記載のリガンド－薬物複合体の重水素化物、又はその混合物の形態である、
    リガンド－薬物複合体又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物。
  39. 薬学的に許容されるベクター、希釈剤又は賦形剤と、
    治療有効量の請求項１～１１、１３～３５、３７～３８の何れか一項に記載のリガンド－薬物複合体又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物と、
    を含む、
    医薬組成物。
  40. 請求項１～１１、１３～３５、３７～３８の何れか一項に記載のリガンド－薬物複合体又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物、或いは請求項３９に記載の医薬組成物の、薬剤の調製における用途であって、
    前記薬剤は、増殖性疾患を治療し、又は増殖性疾患の進行を遅延することに用いられ、
    好ましくは、前記増殖性疾患はがん又は腫瘍であり、
    より好ましくは、前記がん又は腫瘍は、リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、攻撃性ＮＨＬ、再発性攻撃性ＮＨＬ、再発性無痛性ＮＨＬ、難治性ＮＨＬ、難治性無痛性ＮＨＬ、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、小リンパ球性リンパ腫、白血病、毛細胞白血病（ＨＣＬ）、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、及び／又はマントル細胞リンパ腫から選ばれる、
    用途。
  41. 増殖性疾患を治療又は予防し、又は増殖性疾患の進行を遅延する方法であって、
    対象に治療有効量又は疾患遅延有効量の請求項１～１１、１３～３５、３７～３８の何れか一項に記載のリガンド－薬物複合体又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物、或いは請求項３９～４０に記載の医薬組成物を投与することを含み、
    好ましくは、前記増殖性疾患はがん又は腫瘍であり、
    より好ましくは、前記がん又は腫瘍は、リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、攻撃性ＮＨＬ、再発性攻撃性ＮＨＬ、再発性無痛性ＮＨＬ、難治性ＮＨＬ、難治性無痛性ＮＨＬ、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、小リンパ球性リンパ腫、白血病、毛細胞白血病（ＨＣＬ）、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、及び／又はマントル細胞リンパ腫から選ばれる、
    方法。
  42. Ｂ細胞増殖性疾患又は自己免疫疾患を有する対象において免疫機能を向上させる方法であって、
    対象に治療又は疾患遅延有効量の請求項１～１１、１３～３５、３７～３８の何れか一項に記載のリガンド－薬物複合体又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物、或いは請求項３９～４０に記載の医薬組成物を投与することを含み、
    好ましくは、当該Ｂ細胞増殖性疾患はがん又は腫瘍であり、
    より好ましくは、当該Ｂ細胞増殖性疾患は、リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、攻撃性ＮＨＬ、再発性攻撃性ＮＨＬ、再発性無痛性ＮＨＬ、難治性ＮＨＬ、難治性無痛性ＮＨＬ、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、小リンパ球性リンパ腫、白血病、毛細胞白血病（ＨＣＬ）、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、及び／又はマントル細胞リンパ腫である、
    方法。
  43. それぞれ配列番号２３、配列番号８と配列番号９で示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、
    それぞれ配列番号１０、配列番号１１と配列番号１２で示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、
    を含む、
    抗ＣＤ７９Ｂ抗体又はその抗原結合断片。
  44. 配列番号１９で示され、又はそれと少なくとも９０％の同一性を有する重鎖可変領域と、
    配列番号２０で示され、又はそれと少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖可変領域と、
    を含む、
    請求項４３に記載の抗ＣＤ７９Ｂ抗体又はその抗原結合断片。
  45. 定常領域Ｆｃを含み、
    好ましくは、前記ＦｃはＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４である、
    請求項４３又は４４に記載の抗ＣＤ７９Ｂ抗体又はその抗原結合断片。
  46. 配列番号２８で示され、又はそれと少なくとも９０％の同一性を有する重鎖と、
    配列番号２９で示され、又はそれと少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖と、
    を含む、
    請求項４３～４５の何れか一項に記載の抗ＣＤ７９Ｂ抗体又はその抗原結合断片。
  47. 請求項４３～４６の何れか一項に記載の抗ＣＤ７９Ｂ抗体又はその抗原結合断片をコードする、
    ポリヌクレオチド。
  48. 請求項４７に記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞であって、
    好ましくは、前記宿主細胞は、細菌、酵母、哺乳動物細胞であり、
    より好ましくは、前記宿主細胞は大腸菌、ピキア酵母、チャイニーズハムスター卵巣細胞又はヒト胎児腎臓２９３細胞である、
    宿主細胞。
  49. 抗ＣＤ７９Ｂ抗体又はその抗原結合断片を調製する方法であって、
    請求項４８に記載の宿主細胞において抗ヒトＣＤ７６Ｂ抗体又はその抗原結合断片を発現することと、培養物から前記抗ＣＤ７９Ｂ抗体又はその抗原結合断片を単離することと、を含む、
    方法。
  50. 請求項４３～４６の何れか一項に記載の抗ＣＤ７９Ｂ抗体又はその抗原結合断片、或いは請求項４７に記載のポリヌクレオチドから選ばれる何れか一項又はその任意の組み合わせと、
    任意選択的に、薬用可能な賦形剤、希釈剤又はベクターと、
    を含む、
    医薬組成物。
  51. 増殖性疾患を治療又は予防し、又は増殖性疾患の進行を遅延する方法であって、
    対象に治療又は疾患遅延有効量の請求項４３～４６の何れか一項に記載の抗ＣＤ７９Ｂ抗体又はその抗原結合断片、或いは請求項４７に記載のポリヌクレオチド、或いは請求項５０に記載の医薬組成物を投与することを含み、
    好ましくは、当該Ｂ細胞増殖性疾患はがん又は腫瘍であり、
    より好ましくは、当該Ｂ細胞増殖性疾患は、リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、攻撃性ＮＨＬ、再発性攻撃性ＮＨＬ、再発性無痛性ＮＨＬ、難治性ＮＨＬ、難治性無痛性ＮＨＬ、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、小リンパ球性リンパ腫、白血病、毛細胞白血病（ＨＣＬ）、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、及び／又はマントル細胞リンパ腫である、
    方法。
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