TW202346346A - 抗ｄｌｌ３抗體、其抗體－藥物偶聯物及其醫藥用途 - Google Patents

Abstract

本揭露關於抗DLL3抗體、其抗體-藥物偶聯物及其醫藥用途。具體而言，本揭露關於如通式(Pc-L-D)所示的抗DLL3抗體-海鞘素類藥物偶聯物，其中Pc為抗DLL3抗體。

Description

抗DLL3抗體、其抗體-藥物偶聯物及其醫藥用途

本申請要求2021年12月23日提交的中國專利申請(CN202111592539.7)的優先權。

本揭露關於抗DLL3抗體、其藥物偶聯物，及其製備方法。同時，本揭露中所述的抗DLL3抗體或其ADC可用於製備治療疾病或病症的藥物。

這裡的陳述僅提供與本揭露有關的背景信息，而不必然地構成現有技術。

小細胞肺癌(Small Cell Lung Cancer，SCLC)屬於一種比較惡性的肺癌類型，占所有肺癌病例的10%-15%。小細胞肺癌的腫瘤生長速度快，容易轉移，5年生存率低於7%。對小細胞肺癌的治療，常採用鉑類/依託泊苷聯用的化療。小細胞肺癌病人對化療初期響應良好，但極易產生耐藥和復發。近幾年的免疫治療，如PD-L1抗體和PD1抗體，對小細胞患 者有一定的效果，但是有效率約為15%。目前仍然還沒有開發出特異性的靶向治療藥物。

DLL3是一種抑制Notch的配體。在正常狀態下，DLL3處於高爾基體上，在癌細胞(如小細胞肺癌細胞)中，DLL3會到細胞表面，以順式方式結合Notch，阻礙細胞和細胞結合以及Notch在目標細胞的內吞，從而抑制Notch信號通路，促進腫瘤細胞的生長。DLL3主要表達於神經或者神經內分泌腫瘤，包括SCLC、大細胞神經內分泌癌、胃腸道神經內分泌瘤、小細胞膀胱癌、多形性膠質細胞瘤、轉移性去勢性前列腺癌、黑色素瘤等。尤其是SCLC，超過80%的SCLC有DLL3的陽性表達，而在正常肺癌組織及癌旁組織中不表達。這種表達的差異性使得DLL3成為治療SCLC的一種極具潛力的治療靶點。

海鞘素衍生物，如盧比替定(Lurbinectedin)，是一類RNA聚合酶II的抑制劑，藉由與DNA雙螺旋結構上的小溝共價結合，可選擇性地抑制反式激活的RNA聚合酶II介導的轉錄過程，對RNA聚合酶I和線粒體RNA聚合酶活性無影響，也不影響mRNA正常轉錄過程。RNA聚合酶II在腫瘤細胞轉錄過程中往往過度活化，盧比替定可使腫瘤細胞在有絲分裂過程中畸變、凋亡、最終減少細胞增殖。腫瘤細胞依靠高速運轉的轉錄過程支持其增殖，這些腫瘤細胞對盧比替定尤為敏感，包括SCLC、BRCA1/2突變乳腺癌、鉑類耐藥卵巢癌及染色體易位所致肉瘤等。

抗體-藥物偶聯物(antibody drug conjugate，ADC)，將單株抗體或者抗體片段藉由接頭與具有生物活性的藥物相連，充分利用了抗體對正常細胞和腫瘤細胞表面抗原結合的特異性和藥物(如細胞毒性劑)的高效 性，同時又避免了抗體的療效偏低和藥物的毒副作用過大等缺陷。與以往傳統的化療藥物相比，抗體-藥物偶聯物能更精準地殺傷腫瘤細胞並降低將對正常細胞的影響。

本揭露關於抗DLL3抗體、其ADC，以及其醫藥用途。更具體的，本揭露提供多種序列全新的抗DLL3抗體，以及其與細胞毒性物質(例如海鞘素类衍生物)偶聯的ADC。

在一些實施方案中，本揭露提供一種抗DLL3抗體，其包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中，

i)該重鏈可變區包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO：22的胺基酸序列；HCDR2，其包含SEQ ID NO：23的胺基酸序列；和HCDR3，其包含SEQ ID NO：57的胺基酸序列；和

該輕鏈可變區包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO：25的胺基酸序列；LCDR2，其包含SEQ ID NO：26的胺基酸序列；和LCDR3，其包含SEQ ID NO：27的胺基酸序列；其中，SEQ ID NO：57如PLYX₁YGRSYNX₂VAY所示，其中X₁為Y或H；X₂為A或G；或

ii)該重鏈可變區包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO：16的胺基酸序列；HCDR2，其包含SEQ ID NO：17的胺基酸序列；和HCDR3，其包含SEQ ID NO：18的胺基酸序列；和

該輕鏈可變區包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO：19的胺基酸序列；LCDR2，其包含SEQ ID NO：20的胺基酸序列；和LCDR3，其包含SEQ ID NO：21的胺基酸序列。

在一些實施方案中，前述的抗DLL3抗體，其中，

該重鏈可變區包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO：22的胺基酸序列；HCDR2，其包含SEQ ID NO：23的胺基酸序列；和HCDR3，其包含SEQ ID NO：24、30或31的胺基酸序列；和

該輕鏈可變區包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO：25的胺基酸序列；LCDR2，其包含SEQ ID NO：26的胺基酸序列；和LCDR3，其包含SEQ ID NO：27的胺基酸序列。

在一些實施方案中，前述的抗DLL3抗體，其中，

該重鏈可變區包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO：22的胺基酸序列；HCDR2，其包含SEQ ID NO：23的胺基酸序列；和HCDR3，其包含SEQ ID NO：24的胺基酸序列；和

該輕鏈可變區包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO：25的胺基酸序列；LCDR2，其包含SEQ ID NO：26的胺基酸序列；和LCDR3，其包含SEQ ID NO：27的胺基酸序列。

在一些實施方案中，前述的抗DLL3抗體，其中，

該重鏈可變區包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO：22的胺基酸序列；HCDR2，其包含SEQ ID NO：23的胺基酸序列；和HCDR3，其包含SEQ ID NO：30的胺基酸序列；和

該輕鏈可變區包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO：25的胺基酸序列；LCDR2，其包含SEQ ID NO：26的胺基酸序列；和LCDR3，其包含SEQ ID NO：27的胺基酸序列。

在一些實施方案中，前述的抗DLL3抗體，其中，

該重鏈可變區包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO：22的胺基酸序列；HCDR2，其包含SEQ ID NO：23的胺基酸序列；和HCDR3，其包含SEQ ID NO：31的胺基酸序列；和

該輕鏈可變區包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO：25的胺基酸序列；LCDR2，其包含SEQ ID NO：26的胺基酸序列；和LCDR3，其包含SEQ ID NO：27的胺基酸序列。

在一些實施方案中，前述的抗DLL3抗體，其中，

i)該重鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：57所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，和該輕鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：27所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；

其中，SEQ ID NO：57如PLYX₁YGRSYNX₂VAY所示，其中X₁為Y或H；X₂為A或G；或

ii)該重鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，和該輕鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：21所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一些實施方案中，前述的抗DLL3抗體，其為鼠源 抗體、嵌合抗體或人源化抗體。在一些實施方案中，前述的抗DLL3抗體，較佳為人源化抗體。

在一些實施方案中，前述的抗DLL3抗體，其包含人免疫球蛋白框架區(FR區)。

在一個實施方案中，前述的抗DLL3抗體，其中，

該重鏈可變區包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO：22的胺基酸序列；HCDR2，其包含SEQ ID NO：23的胺基酸序列；和HCDR3，其包含SEQ ID NO：57的胺基酸序列；其中，SEQ ID NO：57如PLYX₁YGRSYNX₂VAY所示，其中X₁為Y或H；X₂為A或G；且該重鏈可變區的FR包含選自1E、49A和94S中的一個或多個回復突變；和

該輕鏈可變區包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO：25的胺基酸序列；LCDR2，其包含SEQ ID NO：26的胺基酸序列；和LCDR3，其包含SEQ ID NO：27的胺基酸序列；且該輕鏈可變區的FR包含43I回復突變；上述的回復突變位點依據Kabat編號規則。

在一個實施方案中，該抗DLL3抗體包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中，

該重鏈可變區包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO：16的胺基酸序列；HCDR2，其包含SEQ ID NO：17的胺基酸序列；和HCDR3，其包含SEQ ID NO：18的胺基酸序列；且該重鏈可變區的FR包含選自1E、27Y、30T、38K、43K、48I、67A、68A、69L、71V、73K、75S、76N和93A中的一個或多個回復突變；和

該輕鏈可變區包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO：19的胺基酸序列；LCDR2，其包含SEQ ID NO：20的胺基酸序列；和LCDR3，其包含SEQ ID NO：21的胺基酸序列；且該輕鏈可變區的FR包含選自36L、43S、44F、46G、69A、71Y和85D中的一個或多個回復突變。上述的回復突變位點依據Kabat編號規則。

在一個實施方案中，該抗DLL3抗體包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中，

該重鏈可變區包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO：16的胺基酸序列；HCDR2，其包含SEQ ID NO：17的胺基酸序列；和HCDR3，其包含SEQ ID NO：18的胺基酸序列；且該重鏈可變區的FR包含1E、68A、69L、71V、73K、75S、76N的回復突變；和

該輕鏈可變區包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO：19的胺基酸序列；LCDR2，其包含SEQ ID NO：20的胺基酸序列；和LCDR3，其包含SEQ ID NO：21的胺基酸序列；且該輕鏈可變區的FR包含36L、46G、69A、71Y和85D的回復突變，上述的回復突變位點依據Kabat編號規則。

在一個具體的實施方案中，該抗DLL3抗體包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中，

該重鏈可變區包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO：22的胺基酸序列；HCDR2，其包含SEQ ID NO：23的胺基酸序列；和HCDR3，其包含SEQ ID NO：24的胺基酸序列；且該重鏈可變區的FR包含1E和94S的回復突變；和

該輕鏈可變區包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO：25的胺基酸序列；LCDR2，其包含SEQ ID NO：26的胺基酸序列；和LCDR3，其包含SEQ ID NO：27的胺基酸序列，上述的回復突變位點依據Kabat編號規則。

在一個實施方案中，該抗DLL3抗體包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中，

該重鏈可變區包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO：22的胺基酸序列；HCDR2，其包含SEQ ID NO：23的胺基酸序列；和HCDR3，其包含SEQ ID NO：24、30或31的胺基酸序列；且該重鏈可變區的FR包含選自1E、49A和94S中的一個或多個回復突變；和

該輕鏈可變區包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO：25的胺基酸序列；LCDR2，其包含SEQ ID NO：26的胺基酸序列；和LCDR3，其包含SEQ ID NO：27的胺基酸序列；且該輕鏈可變區的FR包含431回復突變。上述的回復突變位點依據Kabat編號規則。

在一個實施方案中，該抗DLL3抗體包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中，

該重鏈可變區包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO：22的胺基酸序列；HCDR2，其包含SEQ ID NO：23的胺基酸序列；和HCDR3，其包含SEQ ID NO：24的胺基酸序列；且該重鏈可變區的FR包含選自1E、49A和94S中的一個或多個回復突變；和

該輕鏈可變區包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO：25的胺基酸序列；LCDR2，其包含SEQ ID NO：26的胺基酸序列；和LCDR3，其包含SEQ ID NO：27的胺基酸序列；且該輕鏈可變區的FR包含43I回復突變。上述的回復突變位點依據Kabat編號規則。

在一個實施方案中，該抗DLL3抗體包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中，

該重鏈可變區包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO：22的胺基酸序列；HCDR2，其包含SEQ ID NO：23的胺基酸序列；和HCDR3，其包含SEQ ID NO：30的胺基酸序列；且該重鏈可變區的FR包含選自1E、49A和94S中的一個或多個回復突變；和

該輕鏈可變區包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO：25的胺基酸序列；LCDR2，其包含SEQ ID NO：26的胺基酸序列；和LCDR3，其包含SEQ ID NO：27的胺基酸序列；且該輕鏈可變區的FR包含43I回復突變。上述的回復突變位點依據Kabat編號規則。

在一個實施方案中，該抗DLL3抗體包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中，

該重鏈可變區包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO：22的胺基酸序列；HCDR2，其包含SEQ ID NO：23的胺基酸序列；和HCDR3，其包含SEQ ID NO：31的胺基酸序列；且該重鏈可變區的FR包含選自1E、49A和94S中的一個或多個回復突變；和

該輕鏈可變區包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO：25的胺基酸序列；LCDR2，其包含SEQ ID NO：26的胺基酸序列；和LCDR3，其包含SEQ ID NO：27的胺基酸序列；且該輕鏈可變區的FR包含43I回復突變。上述的回復突變位點依據Kabat編號規則。

在一些實施方案中，前述的抗DLL3抗體，其中，

i)該重鏈可變區包含與SEQ ID NO：14、50、51、52、53或54具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列；和/或

該輕鏈可變區包含與SEQ ID NO：15、55或56具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的輕鏈可變區；或

ii)該重鏈可變區包含與SEQ ID NO：12、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43或44具有至少90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列；和/或

該輕鏈可變區包含與SEQ ID NO：13、45、46、47、48或49具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的輕鏈可變區。

在一些實施方案中，前述的抗DLL3抗體，其中，

i)該重鏈可變區包含與SEQ ID NO：14具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列；和/或

該輕鏈可變區包含與SEQ ID NO：15具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的輕鏈可變區；或

ii)該重鏈可變區包含與SEQ ID NO：50、51、52、53或54具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列；和/或

該輕鏈可變區包含與SEQ ID NO：55或56具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列；或

iii)該重鏈可變區包含與SEQ ID NO：12具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列；和/或

該輕鏈可變區包含與SEQ ID NO：13具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列；或

iv)該重鏈可變區包含與SEQ ID NO：32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43或44具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列；和/或

該輕鏈可變區包含與SEQ ID NO：45、46、47、48或49具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列。

在一些實施方案中，前述的抗DLL3抗體，其中，

i)該重鏈可變區包含與SEQ ID NO：50具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列；和/或

該輕鏈可變區包含與SEQ ID NO：55具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列；或

ii)該重鏈可變區包含與SEQ ID NO：43具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列；和/或

該輕鏈可變區包含與SEQ ID NO：48具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列。

在一些實施方案中，前述的抗DLL3抗體，其中，

i)該重鏈可變區包含SEQ ID NO：14的胺基酸序列，和/或該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：15的胺基酸序列；或

ii)該重鏈可變區包含選自SEQ ID NO：50、51、52、53和54中的任一胺基酸序列，和/或該輕鏈可變區包含55或56的胺基酸序列；或

iii)該重鏈可變區包含SEQ ID NO：12的胺基酸序列，和/或該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：13的胺基酸序列；或

iv)該重鏈可變區包含選自SEQ ID NO：43、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42和44中的任一胺基酸序列，和/或該輕鏈可變區包含選自SEQ ID NO：48、45、46、47和49中的任一胺基酸序列。

在一些實施方案中，前述的抗DLL3抗體，其中，

該重鏈可變區包含SEQ ID NO：50的胺基酸序列，和該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：55的胺基酸序列；

該重鏈可變區包含SEQ ID NO：43的胺基酸序列，和該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：48的胺基酸序列。

在一些實施方案中，前述的抗DLL3抗體，其中該抗DLL3抗體是抗體片段，其中該抗體片段為Fab、Fab'、F(ab')₂、Fab'-SH、Fd、Fv、scFv、dsFv、雙抗體或結構域抗體。

在一些實施方案中，前述的抗DLL3抗體，其包含輕鏈恆定區和重鏈恆定區。

在一些實施方案中，前述的抗DLL3抗體，其包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的恆定區。

在一些實施方案中，前述的抗DLL3抗體，其包含λ鏈或κ鏈的恆定區。

在一些實施方案中，前述的抗DLL3抗體，其包含IgG1的重鏈恆定區和κ鏈的輕鏈恆定區。

在一些實施方案中，前述的抗DLL3抗體，該重鏈恆定區包含SEQ ID NO：28的序列，和/或輕鏈恆定區包含SEQ ID NO：29的序列。

在一些實施方案中，前述的抗DLL3抗體，其包含重鏈和輕鏈，其中，

該重鏈包含與SEQ ID NO：60具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列，和/或該輕鏈包含與SEQ ID NO：61具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列；或

該重鏈包含與SEQ ID NO：58具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列，和/或該輕鏈包含與SEQ ID NO：59具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列。

在一些實施方案中，前述的抗DLL3抗體，該重鏈包含如SEQ ID NO：60所示的序列，和/或該輕鏈包含如SEQ ID NO：61所示的序列；或

該重鏈包含如SEQ ID NO：58所示的序列，和/或該輕鏈包含如SEQ ID NO：59所示的序列。

在另一方面，本揭露提供一種分離的抗DLL3的抗體，其與前述任一項所述的抗體競爭結合DLL3或其表位。

在一些實施方案中，前述的抗DLL3抗體，其中該抗體具有以下特性中的至少一種：

a)該抗DLL3抗體與人DLL3或其表位結合的KD值

3nM、

2nM、

1nM、

0.9nM、

0.8nM、

0.7nM、

0.6nM、

0.5nM、

0.4nM，該KD值藉由Biacore測定；

b)該抗DLL3抗體與表達DLL3的H1184細胞結合的EC50

3nM、EC50

2nM、EC50

1nM、EC50

0.5nM、EC50

0.2nM、EC50

0.1nM、EC50

0.09nM、EC50

0.08nM、EC50

0.07nM、EC50

0.06nM，該EC50藉由FACS檢測；和

c)該抗DLL3抗體能夠被表達DLL3的細胞內吞；和

d)該抗DLL3抗體與DLL3或其表位結合EC50

0.1nM(

0.09nM、

0.08nM、

0.07nM、

0.06nM、

0.05nM、

0.04nM)，該EC50藉由ELISA檢測；

e)該抗DLL3抗體和陽性抗體(例如BI-764532)識別不同的DLL3表位。

在另一方面，本揭露提供分離的核酸，其編碼如前任一項所述的抗DLL3抗體。

在另一方面，本揭露提供載體，其包含如前所述的分離的核酸。

在又一方面，本揭露提供宿主細胞，其包含如前所述的載體或表達前任一項所述的抗DLL3抗體。

在一個方面，本揭露提供製備結合DLL3的抗體的方法，其包括在適於表達該抗體的條件下培養前述的宿主細胞。

在又一個方面，本揭露提供一種抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其包含如前任一項所述的抗DLL3抗體。

在又一個方面，本揭露提供一種抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其包含如前任一項所述的抗DLL3抗體和藥物，其中該藥物偶聯至該抗DLL3抗體。

在一些實施方案中，前述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中該藥物選自細胞毒性劑、放射性標記物、螢光團、發色團、顯像劑、免疫調節劑、血管生成抑制劑、細胞增殖抑制劑、促細胞凋亡劑和細胞裂解酶中的一種或多種。

在一些實施方案中，其中該藥物是海鞘素Et-743(Trabectedin，曲貝替定)或其衍生物。在一些實施方案中，該藥物是海鞘素衍生物，如盧比替定(Lurbinectedin)。

在一些實施方案中，前述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其具有通式(Pc-L-Da)所示的結構：

其中，Pc為如前任一項所述的抗DLL3抗體；L為接頭；n為1至10(包括整數和小數)；較佳地，n為3至5。

在一些實施方案中，前述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其為通式(Pc-L-D)所示的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽：

其中，Pc為如前任一項所述的抗DLL3抗體；L為接頭；n為1至10；較佳地，n為3至5。

在一些實施方案中，如前所述的通式(Pc-L-Da)或(Pc-L-D)所示的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中n是每個抗體的平均藥物模塊數，可以是整數或小數。在一些實施方案中，n為1-10、或1-9、或2-10、或2-9、或1-8、或2-8、或2-7、或2-4、或1-4、或1-3、或3-8、或3-7、或3-6、或3-5、或4-7、或4-6、或4-5的平均值；在一些實施方案中，n為1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。

在一些實施方案中，如前任一項該通式(Pc-L-Da)或(Pc-L-D)所示的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中接頭-L-為-L¹-L²-L³-L⁴-，其中，

L¹選自-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-W-C(O)-、-CH₂-C(O)-NR³-W-C(O)-和-C(O)-W-C(O)-，其中W選自C_1-6亞(伸)烷基、C_1-6亞(伸)烷基-C_3-6環烷基，其中該C_1-6亞(伸)烷基、C_1-6亞(伸)烷基-C_3-6環烷基各自獨立地視需要進一步被選自鹵素、羥基、氰基、胺基、烷基、氯烷基、氘代烷基、烷氧基和環烷基的一個或多個取代基所取代；

L²選自-NR⁴(CH₂CH₂O)_pCH₂CH₂C(O)-、-NR⁴(CH₂CH₂O)_pCH₂C(O)-、-S(CH₂)_pC(O)-和化學鍵，其中p為1至20的整數；

L³為由2至7個胺基酸殘基構成的肽殘基，其中該胺基酸選自苯丙胺酸(F)、甘胺酸(G)、纈胺酸(V)、賴胺酸(K)、瓜胺酸、絲胺酸(S)、谷胺酸(E)和天冬胺酸(D)，並視需要進一步被選自鹵素、羥基、氰基、胺基、烷基、氯烷基、氘代烷基、烷氧基和環烷基中的一個或多個取代基所取代；

L⁴選自-NR⁵(CR⁶R⁷)_t-、-C(O)NR⁵、-C(O)NR⁵(CH₂)_t-和化學鍵，其中t為1至6的整數；

R³、R⁴和R⁵相同或不同，且各自獨立地選自氫原子、烷基、鹵烷基、氘代烷基和羥烷基；

R6和R⁷相同或不同，且各自獨立地選自氫原子、鹵素、烷基、鹵烷基、氘代烷基和羥烷基。

在一些實施方案中，如前任一項所述的通式(Pc-L-Da)或(Pc-L-D)所示的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中接頭-L-為-L¹-L²-L³-L⁴-，其中，

L¹為

，s¹為2至8的整數，包括但不限於2，3，4，5，6，7和8；

L²為化學鍵；

L³為四肽殘基；較佳地，L³為包含甘胺酸-甘胺酸-苯丙胺酸-甘胺酸的四肽殘基；

L⁴為-NH(CH₂)t-，t為1或2；

其中該L¹端與Pc相連。

在一些實施方案中，如前任一項所述的通式(Pc-L-Da)或(Pc-L-D)所示的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中-L-為：

在一些實施方案中，如前任一項所述的通式(Pc-L-Da)或(Pc-L-D)所示的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，該抗體-藥物偶聯物具有選自如下的結構：

其中，Pc為如前任一項所述的抗DLL3抗體；n為1至10。

在一些實施方案中，如前任一項所述的通式(Pc-L-Da)或(Pc-L-D)所示的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，該抗體-藥物偶聯物具有如下結構：

其中，

n為1至10；

Pc為如前任一項所述的抗DLL3抗體；較佳地，Pc為抗DLL3抗體，其包含：

如SEQ ID NO：60所示的重鏈和如SEQ ID NO：61所示的輕鏈；或

如SEQ ID NO：58所示的重鏈和如SEQ ID NO：59所示的輕鏈。

在一些實施方案中，如前任一項所述的通式(Pc-L-Da)或(Pc-L-D)所示的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，該抗體-藥物偶聯物具有如下結構：

其中，

Pc為如前任一項所述的抗DLL3抗體；較佳地，Pc為抗DLL3抗體，其包含：

如SEQ ID NO：60所示的重鏈和如SEQ ID NO：61所示的輕鏈；或

如SEQ ID NO：58所示的重鏈和如SEQ ID NO：59所示的輕鏈；

n為1至8。

在一些實施方案中，如前任一項所述的通式(Pc-L-Da)或(Pc-L-D)所示的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，該抗體-藥物偶聯物具有如下結構：

其中，

Pc為如前任一項所述的抗DLL3抗體；較佳地，Pc為抗DLL3抗體，其包含：

如SEQ ID NO：60所示的重鏈和如SEQ ID NO：61所示的輕鏈；或

如SEQ ID NO：58所示的重鏈和如SEQ ID NO：59所示的輕鏈；

n為3至5。

在一些實施方案中，如前任一項所述的通式(Pc-L-Da)或(Pc-L-D)所示的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，該抗體-藥物偶聯物具有如下結構：

其中，

Pc為如前任一項所述的抗DLL3抗體；較佳地，Pc為抗DLL3抗體，其包含：

如SEQ ID NO：60所示的重鏈和如SEQ ID NO：61所示的輕鏈；或

如SEQ ID NO：58所示的重鏈和如SEQ ID NO：59所示的輕鏈；

n為3.73至4.27。

在一些實施方案中，如前任一項所述的通式(Pc-L-Da)或(Pc-L-D)所示的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，該抗體-藥物偶聯物具有如下結構：

其中，

Pc為如前任一項所述的抗DLL3抗體；較佳地，Pc為抗DLL3抗體，其包含：

如SEQ ID NO：60所示的重鏈和如SEQ ID NO：61所示的輕鏈；或

如SEQ ID NO：58所示的重鏈和如SEQ ID NO：59所示的輕鏈；

n為3.72至4.88。

本揭露進一步提供一種製備抗體-藥物偶聯物的方法，其包括將如前任一項所述的抗DLL3抗體還原，然後與(L-D)或(L-Da)所示的化合物進行偶聯反應，得到本揭露所述的抗體-藥物偶聯物。

另一方面，本揭露提供一種醫藥組成物，其包含如前任一項所述的抗DLL3抗體，或如前任一項所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，以及一種或多種藥學上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體。在一些實施方案中，該單位劑量的醫藥組成物中含有0.1-3000mg或1-1000mg如前所述的抗DLL3抗體或如前所述的抗體-藥物偶聯物。

另一方面，本揭露提供如前任一項所述的抗DLL3抗體，或如前任一項所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，或包含其的醫藥組成物作為藥物的用途。

另一方面，本揭露提供如前任一項所述的抗DLL3抗體，或如前任一項所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，或前述的醫藥組成物在製備用於治療DLL3介導的疾病或病症的藥物中的用途。在一些實施方案中，其中該DLL3介導的疾病或病症為腫瘤或癌症。在一些實施方案中，其中該DLL3介導的疾病或病症為表達DLL3的疾病或病症。

另一方面，本揭露提供如前任一項所述的抗DLL3抗體，或如前任一項所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，或前述的醫藥組成物在製備用於治療或預防腫瘤或癌症的藥物中的用途；較佳地，其中該腫瘤或癌症選自：

肺癌(例如小細胞肺癌、非小細胞肺癌、大細胞肺癌)、頭和頸鱗狀細胞癌、頭和頸癌、腦癌、神經膠質瘤、多形性成膠質細胞瘤、神經母細胞瘤、中樞神經系統癌、神經內分泌腫瘤、咽喉癌、咽鱗癌、口腔鱗癌、鼻咽癌、食管癌、甲狀腺癌(例如甲狀腺髓樣癌)、惡性胸膜間皮瘤、乳腺癌(例如三陰性乳腺癌)、肝癌、肝膽癌、胰腺癌、胃癌、胃腸道癌、腸癌、結直腸癌(例如結腸癌和直腸癌)、腎癌、透明細胞腎細胞癌、卵巢癌、子宮內膜癌、子宮頸癌、膀胱癌、前列腺癌、睾丸癌、腎上腺癌、膠質母細胞瘤、皮膚癌和黑色素瘤；更佳地，其中該腫瘤或癌症為小細胞肺癌。

更佳地，該腫瘤或癌症為表達DLL3的腫瘤或癌症。

另一方面，本揭露進一步涉及一種用於治療和/或預防腫瘤或癌症的方法，該方法包括向需要其的受試者施用治療有效劑量的如前任一項所述的抗DLL3抗體，或如前任一項所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，或前述的醫藥組成物；較佳地，其中該腫瘤或癌症為表達DLL3的腫瘤或癌症。

另一方面，本揭露進一步涉及一種用於治療或預防腫瘤或癌症的方法，該方法包括向需要其的受試者施用治療有效劑量的如前任一項所述的抗DLL3抗體，或如前任一項所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，或前述的醫藥組成物；其中該腫瘤或癌症選自：

肺癌(例如小細胞肺癌、非小細胞肺癌、大細胞肺癌)、頭和頸鱗狀細胞癌、頭和頸癌、腦癌、神經膠質瘤、多形性成膠質細胞瘤、神經母細胞瘤、中樞神經系統癌、神經內分泌腫瘤、咽喉癌、咽鱗癌、口腔鱗癌、鼻咽癌、食管癌、甲狀腺癌(例如甲狀腺髓樣癌)、惡性胸膜間皮瘤、乳腺癌(例如三陰性乳腺癌)、肝癌、肝膽癌、胰腺癌、胃癌、胃腸道癌、腸癌、 結直腸癌(例如結腸癌和直腸癌)、腎癌、透明細胞腎細胞癌、卵巢癌、子宮內膜癌、子宮頸癌、膀胱癌、前列腺癌、睾丸癌、腎上腺癌、膠質母細胞瘤、皮膚癌和黑色素瘤；較佳地，其中該腫瘤或癌症為小細胞肺癌。

另一方面，本揭露進一步提供前述的抗DLL3抗體，或前述的抗體-藥物偶聯物作為藥物，較佳作為治療癌症或腫瘤的藥物，更佳作為治療表達DLL3的癌症或腫瘤的藥物。

本揭露提供的抗DLL3抗體及抗體-藥物偶聯物與細胞表面抗原具有良好的親和力，可有效的被表達DLL3的細胞內吞，並具有很強的抑制腫瘤生長的效果，同時具有良好的安全性。

圖1A至圖1C顯示Hu6和Hu100抗體與不同種屬的DLL3的結合。其中，圖1A顯示Hu6和Hu100抗體對H1184細胞結合的FACS結果；圖1B顯示Hu6和Hu100抗體對cynoDLL3/CHO-s細胞結合的FACS結果；圖1C顯示Hu6和Hu100抗體對ratDLL3/CHO-s細胞結合的FACS結果。

圖2顯示不同的抗DLL3抗體競爭結合實驗結果。結果顯示，Hu6和Hu100與BI-764532不競爭，說明抗體Hu6和Hu100與BI-764532結合不同的表位。

圖3顯示Hu6和Hu100抗體被細胞內吞的結果；結果顯示，Hu6和Hu100均可被細胞內吞。

圖4A至圖4E顯示ADC-1和ADC-2對不同細胞的生長抑制作用。其中，圖4A顯示ADC-1和ADC-2對低表達DLL3的DMS53細胞的生長抑制結果；圖4B顯示ADC-1和ADC-2對高表達DLL3的H1184細胞的生長抑制結果；圖4C顯示ADC-1和ADC-2對不表達DLL3的HT-29細胞的生長抑制結果；圖4D顯示ADC-1和ADC-2對不表達DLL3的U-2OS細胞的生長抑制結果；圖4E顯示ADC-1和ADC-2對不表達DLL3的CHO-K1細胞的生長抑制結果。

圖5顯示ADC-1和ADC-2的旁觀者細胞毒性效應結果。

圖6顯示ADC-1和ADC-2抑制小鼠的DMS53細胞皮下移植腫瘤生長的結果。

圖7顯示ADC-1和ADC-2抑制小鼠的H1184細胞皮下移植腫瘤生長的結果。

一、術語

為了更容易理解本揭露，以下對某些技術和科學術語進行了描述。除非在本文中另有明確定義，本文使用的全部技術和科學術語具有與所屬技術領域具有通常知識者通常所理解的相同含義。

除非有相反陳述，在說明書和申請專利範圍中使用的術語具有下述含義。

說明書和申請專利範圍中所用的單數形式“一個”、“一種”和“該”包括複數指代，除非上下文清楚表明並非如此。

除非上下文另外清楚要求，否則在專利說明書和申請專利範圍中，應將詞語“包含”、“具有”、“包括”等理解為“包括但不僅限於”的意義，而不是排他性或窮舉性意義。

術語“和/或”，意指包含“和”與“或”兩種含義。例如短語“A、B和/或C”旨在涵蓋以下方面中的每一個：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(單獨)；B(單獨)；和C(單獨)。當本揭露中使用商品名時，旨在包括該商品名產品的製劑、該商品名產品的藥物和活性藥物部分。

本揭露所用胺基酸三字母代碼和單字母代碼如J.biol.chem，243，p3558(1968)中所述。

術語“胺基酸”是指天然存在的和合成的胺基酸，以及以與天然存在的胺基酸類似的方式起作用的胺基酸類似物和胺基酸模擬物。天然存在的胺基酸是由遺傳密碼編碼的那些胺基酸，以及後來修飾的那些胺基酸，例如羥脯胺酸、γ-羧基谷胺酸和O-磷酸絲胺酸。胺基酸類似物是指與天然存在的胺基酸具有相同的基本化學結構(即與氫、羧基、胺基和R基團結合的α碳)的化合物，例如高絲胺酸、正亮胺酸、甲硫胺酸亞碸、甲硫胺酸甲基鋶。此類類似物具有修飾的R基團(例如，正亮胺酸)或修飾的肽骨架，但保留與天然存在的胺基酸相同的基本化學結構。胺基酸模擬物是指具有與胺基酸的一般化學結構不同的結構，但是以與天然存在的胺基酸類似的方式起作用的化學化合物。

術語“胺基酸突變”包括胺基酸取代(也稱胺基酸替換)、缺失、插入和修飾。可以進行取代、缺失、插入和修飾的任意組合來實現最終構建體，只要最終構建體擁有期望的特性，例如降低或對Fc受體的結合。胺基酸序列缺失和插入包括在多肽鏈的胺基端和/或羧基端的缺失和插入。具 體的胺基酸突變可以是胺基酸取代。在一個實施方案中，胺基酸突變是非保守性的胺基酸取代，即將一個胺基酸用具有不同結構和/或化學特性的另一種胺基酸替換。胺基酸取代包括由非天然存在的胺基酸或由20種天然胺基酸的衍生物(例如4-羥脯胺酸、3-甲基組胺酸、鳥胺酸、高絲胺酸、5-羥賴胺酸)替換。可以使用本領域中公知的遺傳或化學方法生成胺基酸突變。遺傳方法可以包括定點誘變、PCR，基因合成等。預計基因工程以外的改變胺基酸側鏈基團的方法，如化學修飾也可能是可用的。本文中可使用各種名稱來指示同一胺基酸突變。本文中，可採用位置+胺基酸殘基的方式表示特定位點的胺基酸殘基，例如366W，表示在366位點上的胺基酸殘基為W。T366W則表示第366位點上的胺基酸殘基由W取代了原來的T。

術語“抗體”以最廣義使用，並且涵蓋各種抗體結構，包括但不限於單株抗體、多株抗體、單特異性抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、全長抗體和抗體片段(或抗原結合片段，或抗原結合部分)，只要它們展現出期望的抗原結合活性。完整抗體通常包含兩條輕鏈和兩條重鏈。從N至C端，每條重鏈具有一個可變區(VH)，又稱作可變重域、重鏈可變區，接著是三個恆定域(CH1、CH2和CH3)。類似地，從N至C端，每條輕鏈具有一個可變區(VL)，又稱作可變輕域，或輕鏈可變域，接著是一個恆定輕域(輕鏈恆定區、CL)。

術語“全長抗體”、“完整抗體”和“全抗體”在本文可互換使用，指具有與天然抗體結構基本類似的結構或重鏈具有Fc區的抗體。天然完整抗體輕鏈包括輕鏈可變區VL及恆定區CL，VL處於輕鏈的胺基末端，輕鏈恆定區包括κ鏈及λ鏈；重鏈包括可變區VH及恆定區(CH1、CH2及CH3)，VH處於重鏈的胺基末端，恆定區處於羧基末端，其中CH3最接近 羧基末端，重鏈可屬於任何同種型，包括IgG(包括IgG1、IgG2、IgG3及IgG4亞型)、IgA(包括IgA1及IgA2亞型)、IgM及IgE。

術語抗體“可變區”或“可變域”指抗體重鏈或輕鏈中參與抗體結合抗原的域。本文中，抗體重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)各包含四個保守的框架區(FR)和三個互補決定區(CDR)。其中，術語“互補決定區”或“CDR”指可變結構域內主要促成與抗原結合的區域；“框架”或“FR”是指除CDR殘基之外的可變結構域殘基。VH包含3個CDR區：HCDR1、HCDR2和HCDR3；VL包含3個CDR區：LCDR1、LCDR2和LCDR3。每個VH和VL由從胺基末端(也稱N末端)排到羧基末端(也稱C末端)按以下順序排列的三個CDR和四個FR構成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。

可以藉由各種公知方案來確定CDR的胺基酸序列邊界，例如：“Kabat”編號規則(參見Kabat等(1991)，“Sequences of Proteins of Immunological Interest”，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD)、“Chothia”編號規則、“ABM”編號規則、“contact”編號規則(參見Martin,ACR.Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains[J].2001)和ImMunoGenTics(IMGT)編號規則(Lefranc，M.P.等，Dev.Comp.Immunol.，27，55-77(2003)；Front Immunol.2018 Oct 16；9：2278)等；各種編號系統之間的對應關係是所屬技術領域具有通常知識者熟知的，示例性的，如下表1中所示。

除非另有說明，本揭露中的可變區和CDR序列均適用Kabat編號規則。

術語“抗體片段”指不同於完整抗體的分子，其包含完整抗體的部分，該部分與完整抗體所結合的抗原相結合。抗體片段的實例包括但不限於Fv、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab')₂、單域抗體、單鏈Fab(scFab)、雙抗體、線性抗體、單鏈抗體分子(例如scFv)；以及由抗體片段形成的多特異性抗體。

術語“Fc區”或“片段可結晶區”用於定義抗體重鏈的C末端區域，包括天然Fc區和改造的Fc區。在一些實施方案中，Fc區包含了相同或不同的兩個亞基。在一些實施方案中，人IgG重鏈的Fc區定義為從Cys226位置處的胺基酸殘基或從Pro230延伸至其羧基末端。用於本文所述抗體的合適Fc區包括人IgG1、IgG2(IgG2A、IgG2B)、IgG3和IgG4的Fc區。在一些實施方案中，Fc區的邊界還可以變化，例如缺失Fc區的C末端賴胺酸(根據EU編號系統的殘基447)或缺失Fc區的C末端甘胺酸和 賴胺酸(根據EU編號系統的殘基446和447)。除非另有說明，Fc區的編號規則為EU編號系統，又稱作EU索引。

術語“嵌合抗體”指抗體中的重和/或輕鏈的一部分由特定的來源或物種衍生，而重和/或輕鏈的剩餘部分由另外的不同來源或物種衍生的抗體。

術語“人源化抗體”是保留非人抗體的反應性同時在人中具有較低免疫原性的抗體。例如，可以藉由保留非人CDR區並用其人對應物(即，恆定區以及可變區的框架區部分)替換抗體的其餘部分來實現。

術語“人抗體”、“人源抗體”、“全人抗體”、“完全人抗體”可以互換使用，意指可變區及恆定區是人序列的抗體。該術語涵蓋源自人基因但具有，例如，降低可能的免疫原性、增加親和力、消除可能會引起不期望的折疊的半胱胺酸或糖基化位點等序列的抗體。該術語涵蓋這些在非人細胞(其可能會賦予不具人細胞特徵的糖基化)中重組產生的抗體。該術語亦涵蓋已在含有人免疫球蛋白重鏈及輕鏈基因座的轉基因小鼠中飼養的抗體。人抗體的含義明確排除包含非人抗原結合殘基的人源化抗體。

術語“親和力”是指分子(例如，抗體)的單個結合部位與其結合配體(例如，抗原)之間非共價相互作用的總體的強度。除非另外指明，如本文所用，結合“親和力”是指內部結合親和力，其反映出結合對(例如，抗體與抗原)的成員之間相互作用。分子X對其配體Y的親和力通常可以由解離常數(KD)表示。親和力可以藉由本領域已知的常規方法(包括本文所述的那些方法)測量。

如本文所使用的，術語“kassoc”或“ka”指特定抗體-抗原相互作用的締合速率，術語“kdis”或“kd”指特定抗體-抗原相互作用的解離速率。術語“KD”指解離常數，其獲得自kd與ka的比率(即kd/ka)並且表示 為莫耳濃度(M)。可以使用本領域公知的方法測定抗體的KD值。例如，使用生物傳感系統例如系統測量表面電漿共振，或藉由溶液平衡滴定法(SET)測量溶液中的親和力。

術語“效應子功能”指那些可歸於抗體Fc區(天然序列Fc區或胺基酸序列突變的Fc區)且隨抗體同種型而變化的生物學活性。抗體效應子功能的例子包括但不限於：C1q結合和補體依賴性細胞毒性、Fc受體結合、抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)、吞噬作用、細胞表面受體(例如B細胞受體)下調；和B細胞活化。

術語“單株抗體”指基本上均質的抗體的群，即在該群中包含的抗體分子的胺基酸序列是相同的，除了可能少量存在的天然突變以外。相比之下，多株抗體製劑通常包含在其可變結構域具有不同胺基酸序列的多種不同抗體，其通常特異性針對不同表位。“單株”不應解釋為要求藉由任何特定方法來生產抗體。

在一些實施方案中，本揭露提供的抗體是單株抗體。

術語“抗原”是指能夠由諸如抗原結合蛋白(包括例如抗體)的選擇性結合劑結合的分子或分子部分。抗原可具有一個或多個能夠與不同的抗原結合蛋白(例如抗體)相互作用的表位。

術語“表位”指能夠與抗體或其抗原結合片段特異性結合的抗原上的區域(area或region)。表位可以由連續胺基酸串(線性表位)形成或包含非連續胺基酸(構象表位)，例如因抗原的折疊(即藉由三級折疊)而變成空間接近。構象表位和線性表位的差別在於：在變性溶劑的存在下，不能檢測到抗體對構象表位的結合。表位包含處於獨特空間構象的至少3，至少4，至少5，至少6，至少7，或8-10個胺基酸。篩選結合特定表位的抗體(即那些結合相同表位的)可以使用本領域例行方法來進行，例如但不限於 丙胺酸掃描，肽印跡，肽切割分析，表位切除，表位提取，抗原的化學修飾(見Prot.Sci.9(2000)487-496)，和交叉阻斷。

術語“抗DLL3抗體”和“結合DLL3的抗體”是指能夠以足夠的親和力結合DLL3或其表位的抗體。在一個實施方案中，抗DLL3抗體與無關蛋白的結合程度小於該抗體與DLL3結合的至少約10%，該結合可藉由BIACORE®表面電漿共振測定法測量。

術語“能夠特異性結合”、“特異性結合”或“結合”是指相比其他抗原或表位，抗體能夠以更高的親和力結合至某個抗原或其表位。通常地，抗體以約1×10^-7M或更小(例如約1×10^-8M或更小)的平衡解離常數(KD)結合抗原或其表位。在一些實施方案中，抗體與抗原結合的KD為該抗體結合至非特異性抗原(例如BSA、酪蛋白)的KD的10%或更低(例如1%)。可使用已知的方法來測量KD，例如藉由BIACORE®表面電漿共振測定法所測量的。然而，特異性結合至抗原或其表位的抗體可能對其它相關的抗原具有交叉反應性，例如，對來自其它物種(同源)(諸如人或猴，例如食蟹獼猴(Macaca fascicularis)(cynomolgus，cyno)、黑猩猩(Pan troglodytes)(chimpanzee，chimp))或狨猴(Callithrix jacchus)(commonmarmoset，marmoset)的相應抗原具有交叉反應性。

術語“核酸”在本文中可與術語“多核苷酸”互換使用，並且是指呈單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。該術語涵蓋含有已知核苷酸類似物或修飾的骨架殘基或連接的核酸。該核酸是合成的、天然存在的和非天然存在的，具有與參考核酸相似的結合特性，並且以類似於參考核苷酸的方式代謝。此類類似物的實例包括但不限於硫代磷酸酯、胺基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性-甲基膦酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)。“分離的”核酸指已經與其天然環境的組分分開的核酸 分子。分離的核酸包括在下述細胞中含有的核酸分子，該細胞通常含有該核酸分子，但該核酸分子存在於染色體外或存在於不同於其天然染色體位置處。編碼多肽或融合蛋白的分離的核酸指編碼多肽或融合蛋白的一個或更多個核酸分子，包括在單一載體或分開的載體中的這樣的一個或更多個核酸分子，和存在於宿主細胞中一個或更多個位置的這樣的一個或更多個核酸分子。除非另有說明，否則特定的核酸序列還隱含地涵蓋其保守修飾的變體(例如，簡併密碼子取代)和互補序列以及明確指明的序列。具體地，如下詳述，簡併密碼子取代可以藉由產生如下序列而獲得，在這些序列中，一個或多個所選的(或全部)密碼子的第三位被混合鹼基和/或脫氧肌苷殘基取代。

術語“多肽”和“蛋白質”在本文中可互換使用，指胺基酸殘基的聚合物，其中一個或多個胺基酸殘基是相應天然存在的胺基酸的人工化學模擬物，以及適用於天然存在的胺基酸聚合物和非天然存在的胺基酸聚合物。除非另外說明，否則特定的多肽序列還隱含地涵蓋其保守修飾的變體。

術語序列“同一性”指兩條序列的胺基酸/核酸在等價位置相同的程度(百分比)；當對兩條序列進行最佳比對時，必要時引入間隙以獲取最大的同一性百分比，且不將任何保守性取代視為序列同一性的一部分。為測定序列同一性百分比，比對可以藉由本領域技術已知的技術來實現，例如使用公開可得到的計算機軟體，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign(DNASTAR)軟體。本領域技術人員可確定適用於測量比對的參數，包括在所比較的序列全長上達成最大比對所需的任何算法。

術語“載體”意指能夠轉運與其連接的另一多核苷酸的多核苷酸分子。一種類型的載體是“質粒”，其是指環狀雙鏈DNA環，其中可以連 接附加的DNA區段。另一種類型的載體是病毒載體，例如腺相關病毒載體(AAV或AAV2)，其中另外的DNA區段可以連接到病毒基因組中。某些載體能夠在引入它們的宿主細胞中自主複製(例如，具有細菌複製起點的細菌載體和附加型哺乳動物載體)。其他載體(例如，非附加型哺乳動物載體)可以在引入宿主細胞中後整合到宿主細胞的基因組中，從而與宿主基因組一起複製。術語“表達載體”或“表達構建體”是指可對宿主細胞進行轉化，且含有指導和/或控制與其可操作地連接的一個或多個異源編碼區的表達的核酸序列的載體。表達構建體可以包括但不限於影響或控制轉錄、翻譯且在存在內含子時影響與其可操作地連接的編碼區的RNA剪接的序列。

術語“宿主細胞”、“宿主細胞系”和“宿主細胞培養物”可互換使用，並且指已經導入外源核酸的細胞，包括此類細胞的後代。宿主細胞包括“轉化體”和“經轉化的細胞”，其包括原代的經轉化的細胞及其衍生的後代，而不考慮傳代的次數。後代在核酸內容物上可以與親本細胞不完全相同，可以含有突變。本文中包括這樣的突變體後代，其與初始轉化細胞中篩選或選擇的細胞具有相同的功能或生物學活性。宿主細胞包括原核和真核宿主細胞，其中真核宿主細胞包括但不限於哺乳動物細胞、昆蟲細胞系植物細胞和真菌細胞。示例性的宿主細胞如下：中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、NSO、SP2細胞、HeLa細胞、幼倉鼠腎(BHK)細胞、猴腎細胞(COS)、人肝細胞癌細胞(例如，HepG2)、A549細胞、3T3細胞和HEK-293細胞、巴氏畢赤酵母(Pichiapastoris)、芬蘭畢赤酵母(Pichia finlandica)、白色念珠菌(Candida albicans)、黑麯黴(Aspergillus niger)、米麯黴(Aspergillus oryzae)、裡氏木黴(Trichoderma reesei)。

“抗體-藥物偶聯物”(antibody drug conjugate，ADC)，是將抗體(或其抗原結合片段)直接或藉由接頭與藥物相連後得到的偶聯物。

“藥物(Drug，縮寫：D)”是任何具有生物或可檢測活性的物質(例如治療劑、可檢測標記、結合劑等)和在體內代謝成活性劑的前藥。治療劑的實例包括細胞毒性劑、化學治療劑、細胞生長抑制劑和免疫調節劑。化學治療劑是可用於治療癌症的化學化合物。代表性治療劑包括細胞毒素、細胞毒性劑和細胞生長抑制劑。

細胞毒性效應是指缺失、消除和/或殺死目標細胞。細胞毒性劑是指對細胞具有細胞毒性和/或細胞生長抑制效應的藥劑。細胞生長抑制效應是指抑制細胞增殖。細胞生長抑制劑是指對細胞具有細胞生長抑制效應、由此抑制細胞的特定亞組的生長和/或擴增的藥劑。

額外代表性治療劑包括放射性同位素、化學治療劑、免疫調節劑、抗血管生成劑、抗增殖劑、促細胞凋亡劑和細胞裂解酶(例如，RNAse)。這些藥物描述詞並不互斥，且因此，可使用一個或多個上述術語描述治療劑。例如，所選放射性同位素也是細胞毒素。治療劑可製備為上述任一種的藥學上可接受的鹽、酸或衍生物。通常，具有放射性同位素作為藥物的偶聯物被稱為放射性免疫偶聯物，具有化學治療劑作為藥物的那些被稱為化學免疫偶聯物。

細胞毒性劑的實例包括，但不限於，蒽環黴素、奧裡斯他汀、CC-1065、尾海兔素(dolastatin)、多卡米星、烯二炔、格爾德黴素(geldanamycin)、美登素(maytansine)、嘌呤黴素、紫杉烷、長春花生物鹼、SN-38、微管溶素(tubulysin)、半星芒體(hemiasterlin)、艾日布林、曲貝替定(Trabectedin)、盧比替定(Lurbinectedin)和其立體異構體、等排物、類似物或衍生物。也可使用化學治療劑、植物毒素、其他生物活性蛋白質、酶(即，ADEPT)、放射性同位素、光敏劑(即，用於光動力學治療)。

術語“標記”當本文中使用時是指直接或間接綴合至抗體以便生成“標記的”抗體的可檢測化合物或組成物。標記可以是自身可檢測(例如，放射性同位素標記或螢光標記)，或在酶促標記的情況下，標記可催化受質化合物或組成物可檢測的化學變化。放射性同位素標記包括，例如，I-131、I-123、I-125、Y-90、Re-188、Re-186、At-211、Cu-67、Bi-212、和Pd-109。標記也可以是不可檢測的實體，諸如毒素。

術語“接頭單員”、“接頭”是指一端與抗體連接而另一端與藥物相連的化學結構片段或鍵，也可以連接其他接頭後再與抗體或藥物相連。接頭附接至抗體可以多種方式完成，諸如經由表面賴胺酸、還原性偶聯至氧化碳水化合物、藉由還原鏈間二硫鍵釋放的半胱胺酸殘基、在特定位點處改造的反應性半胱胺酸殘基、和含有醯基供體穀胺醯胺的標簽或藉由在轉穀胺醯胺酶和胺存在下多肽改造使得具有反應性的內源性穀胺醯胺。多種ADC連接系統是本領域已知的，包括基於腙-、二硫化物-和肽-的連接。

接頭可以包含一種或多種接頭元件。示例性的接頭元件包括6-馬來醯亞胺基己醯基(“MC”)、馬來醯亞胺基丙醯基(“MP”)、纈胺酸-瓜胺酸(“val-cit”或“vc”)、丙胺酸-苯丙胺酸(“ala-phe”)、對胺基苄氧羰基(“PAB”)、N-琥珀醯亞胺基4-(2-吡啶基硫基)戊酸酯(“SPP”)、N-琥珀醯亞胺基4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1羧酸酯(“SMCC”，在本文中也稱作“MCC”)和N-琥珀醯亞胺基(4-碘-乙醯基)胺基苯甲酸酯(“SIAB”)。

接頭可以選自以下的員件或其組合：延伸物、間隔物和胺基酸單員。可以藉由本領域已知方法合成接頭，諸如US20050238649A1中所記載的。接頭可以是便於在細胞中釋放藥物的“可切割接頭”。例如，可 使用酸不穩定接頭(例如腙)、蛋白酶敏感(例如肽酶敏感)接頭、光不穩定接頭、二甲基接頭、或含二硫化物接頭(Chari等，Cancer Research 52：127-131(1992)；美國專利No.5,208,020)。

接頭元件包括但不限於：

MC=6-馬來醯亞胺基己醯基，結構如下：

Val-Cit或“vc”=纈胺酸-瓜胺酸(蛋白酶可切割接頭中的示例二肽)，

瓜胺酸=2-胺基-5-脲基戊酸，

PAB=對胺基苄氧羰基(“自我犧牲”接頭元件的示例)，

Me-Val-Cit=N-甲基-纈胺酸-瓜胺酸(其中接頭肽鍵已經修飾以防止其受到組織蛋白酶B的切割)，

MC(PEG)6-OH=馬來醯亞胺基己醯基-聚乙二醇(可附著於抗體半胱胺酸)，

SPP=N-琥珀醯亞胺基4-(2-吡啶基硫基)戊酸酯，

SPDP=N-琥珀醯亞胺基3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯，

SMCC=琥珀醯亞胺基-4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-羧酸酯，

IT=亞胺基硫烷。

“L-D”是藥物(D)連接至接頭(L)產生的接頭-藥物部分。

“載藥量”，也稱藥物抗體比例(Drug-to-Antibody Ratio，DAR)，即ADC中每個抗體所偶聯的藥物的平均數量。其可在例如每個抗 體偶聯約1至約10個藥物的範圍內，並且在某些實施例中，在每個抗體偶聯約1至約8個藥物的範圍內，較佳自2-8、2-7、2-6、2-5、2-4、1-3、3-4、3-5、5-6、5-7、5-8和6-8的範圍。本揭露的ADC通式包括前述一定範圍內的抗體-藥物偶聯物的集合。在本揭露的實施方案中，載藥量可表示為n，是小數或整數。可用常規方法如UV/可見光光譜法，質譜，ELISA試驗、HIC和RP-HPLC測定載藥量。

本揭露的一個實施方案中，藥物藉由接頭偶聯在抗體的反應性基團(如巰基)上。

可以用以下非限制性方法控制ADC的載藥量，包括：

(1)控制連接試劑和單抗的莫耳比，

(2)控制反應時間和溫度，

(3)選擇不同的反應試劑。

術語“烷基”指飽和的直鏈或帶有支鏈的脂肪族烴基，其具有1至20個(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個)碳原子(即C_1-20烷基)。該烷基較佳具有1至12個碳原子的烷基(即C_1-12烷基)，更佳具有1至6個碳原子的烷基(即C_1-6烷基)。非限制性的實例包括：甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、第三丁基、第二丁基、正戊基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、2,2-二甲基丙基、1-乙基丙基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、正己基、1-乙基-2-甲基丙基、1,1,2-三甲基丙基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2-乙基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、2,3-二甲基丁基、正庚基、2-甲基己基、3-甲基己基、4-甲基己 基、5-甲基己基、2,3-二甲基戊基、2,4-二甲基戊基、2,2-二甲基戊基、3,3-二甲基戊基、2-乙基戊基、3-乙基戊基、正辛基、2,3-二甲基己基、2,4-二甲基己基、2,5-二甲基己基、2,2-二甲基己基、3,3-二甲基己基、4,4-二甲基己基、2-乙基己基、3-乙基己基、4-乙基己基、2-甲基-2-乙基戊基、2-甲基-3-乙基戊基、正壬基、2-甲基-2-乙基己基、2-甲基-3-乙基己基、2,2-二乙基戊基、正癸基、3,3-二乙基己基、2,2-二乙基己基，及其各種支鏈異構體等。烷基可以是取代的或非取代的，當被取代時，其可以在任何可使用的連接點被取代，取代基較佳選自D原子、鹵素、烷氧基、鹵烷基、鹵烷氧基、環烷基氧基、雜環基氧基、羥基、羥烷基、氰基、胺基、硝基、環烷基、雜環基、芳基和雜芳基中的一個或多個。

術語“亞(伸)烷基”指二價烷基，其中烷基如上所定義，其具有1至20個(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個)碳原子(即C_1-20亞(伸)烷基)。該亞(伸)烷基較佳具有1至12個碳原子的亞(伸)烷基(即C_1-12亞(伸)烷基)，更佳具有1至6個碳原子的亞(伸)烷基(即C_1-6亞(伸)烷基)。非限制性的實例包括：-CH₂-、-CH(CH₃)-、-C(CH₃)₂-、-CH₂CH₂-、-CH(CH₂CH₃)-、-CH₂CH(CH₃)-、-CH₂C(CH₃)₂-、-CH₂CH₂CH₂-、-CH₂CH₂CH₂CH₂-等。亞(伸)烷基可以是取代的或非取代的，當被取代時，其可以在任何可使用的連接點被取代，取代基較佳選自D原子、鹵素、烷氧基、鹵烷基、鹵烷氧基、環烷基氧基、雜環基氧基、羥基、羥烷基、氰基、胺基、硝基、環烷基、雜環基、芳基和雜芳基中的一個或多個。

術語“烯基”指分子中含有至少一個碳碳雙鍵的烷基，其中烷基的定義如上所述，其具有2至12個(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個)碳原子(即C_2-12烯基)。該烯基較佳具有2至6個碳原子的烯基(即C_2-6烯基)。非限制性的實例包括：乙烯基、丙烯基、異丙烯基、丁烯基等。烯基可以是取代的或非取代的，當被取代時，其可以在任何可使用的連接點被取代，取代基較佳選自D原子、烷氧基、鹵素、鹵烷基、鹵烷氧基、環烷基氧基、雜環基氧基、羥基、羥烷基、氰基、胺基、硝基、環烷基、雜環基、芳基和雜芳基中的一個或多個。

術語“炔基”指分子中含有至少一個碳碳三鍵的烷基，其中烷基的定義如上所述，其具有2至12個(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個)碳原子(即C_2-12炔基)。該炔基較佳具有2至6個碳原子的炔基(即C_2-6炔基)。非限制性的實例包括：乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔基、己炔基等。炔基可以是取代的或非取代的，當被取代時，其可以在任何可使用的連接點被取代，取代基較佳選自D原子、烷氧基、鹵素、鹵烷基、鹵烷氧基、環烷基氧基、雜環基氧基、羥基、羥烷基、氰基、胺基、硝基、環烷基、雜環基、芳基和雜芳基中的一個或多個。

術語“烷氧基”指-O-(烷基)，其中烷基的定義如上所述。非限制性的實例包括：甲氧基、乙氧基、丙氧基和丁氧基等。烷氧基可以是取代的或非取代的，當被取代時，其可以在任何可使用的連接點被取代，取代基較佳選自D原子、鹵素、烷氧基、鹵烷基、鹵烷氧基、環烷基氧基、雜環基氧基、羥基、羥烷基、氰基、胺基、硝基、環烷基、雜環基、芳基和雜芳基中的一個或多個。

術語“環烷基”指飽和或部分不飽和的單環全碳環(即單環環烷基)或多環系統(即多環環烷基)，其具有3至20個(例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個)環原子(即3至20員環烷基)。該環烷基較佳具有3至12個環原子的環烷基(即3至12員環烷基)，更佳具有3至8個環原子的環烷基(即3至8員環烷基)，最佳具有3至6個環原子的環烷基(即3至6員環烷基)。

該單環環烷基，非限制性的實例包括：環丙基、環丁基、環戊基、環戊烯基、環己基、環己烯基、環己二烯基、環庚基、環庚三烯基和環辛基等。

該多環環烷基包括：螺環烷基、稠環烷基和橋環烷基。

術語“螺環烷基”指環之間共用一個碳原子(稱螺原子)的多環系統，其環內可以含有一個或多個雙鍵，或其環內可以含有一個或多個選自氮、氧和硫的雜原子(該氮可視需要被氧化，即形成氮氧化物；該硫可視需要被氧化，即形成亞碸或碸，但不包括-O-O-、-O-S-或-S-S-)，條件是至少含有一個全碳環且連接點在該全碳環上，其具有5至20個(例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個)環原子(即5至20員螺環烷基)。該螺環烷基較佳具有6至14個環原子的螺環烷基(即6至14員螺環烷基)，更佳具有7至10個環原子的螺環烷基(即7至10員螺環烷基)。該螺環烷基包括單螺環烷基和多螺環烷基(如雙螺環烷基等)，較佳單螺環烷基或雙螺環烷基，更佳3員/4員、3員/5員、3員/6員、4員/4員、4員/5員、4員/6員、5員/3員、5員/4員、5員/5員、5員/6員、5 員/7員、6員/3員、6員/4員、6員/5員、6員/6員、6員/7員、7員/5員或7員/6員單螺環烷基。非限制性的實例包括：

，其連接點可在任意位置；

等。

術語“稠環烷基”指環之間共享毗鄰的兩個碳原子的多環系統，其為單環環烷基與一個或多個單環環烷基稠合，或者單環環烷基與雜環基、芳基或雜芳基中的一個或多個稠合，其中連接點在單環環烷基上，其環內可以含有一個或多個雙鍵，且具有5至20個(例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個)環原子(即5至20員稠環烷基)。該稠環烷基較佳具有6至14個環原子的稠環烷基(即6至14員稠環烷基)，更佳具有7至10個環原子的稠環烷基(即7至10員稠環烷基)。該稠環烷基包括雙環稠環烷基和多環稠環烷基(如三環稠環烷基、四環稠環烷基等)，較佳雙環稠環烷基或三環稠環烷基，更佳3員/4員、3員/5員、3員/6員、4員/4員、4員/5員、4員/6員、5員/3員、5員/4員、5員/5員、5員/6員、5員/7員、6員/3員、6員/4員、6員/5員、6員/6員、6員/7員、7員/5員或7員/6員雙環稠環烷基。非限制性的實例包括：

其連接點可在任意位置；

等。

術語“橋環烷基”指環之間共用兩個不直接連接的碳原子的全碳多環系統，其環內可以含有一個或多個雙鍵，且具有5至20個(例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個)碳原子(即5至20員橋環烷基)。該橋環烷基較佳具有6至14個碳原子的橋環烷基(即6至14員橋環烷基)，更佳具有7至10個碳原子的橋環烷基(即7至10員橋環烷基)。該橋環烷基包括雙環橋環烷基和多環橋環烷基(如三環橋環烷基、四環橋環烷基等)，較佳雙環橋環烷基或三環橋環烷基。非限制性的實例包括：

其連接點可在任意位置。

環烷基可以是取代的或非取代的，當被取代時，其可以在任何可使用的連接點被取代，取代基較佳選自D原子、鹵素、烷基、烷氧基、鹵烷基、鹵烷氧基、環烷基氧基、雜環基氧基、羥基、羥烷基、側氧基、氰基、胺基、硝基、環烷基、雜環基、芳基和雜芳基中的一個或多個。

術語“雜環基”指飽和或部分不飽和的單環雜環(即單環雜環基)或多環雜環系統(即多環雜環基)，其環內至少含有一個(例如1、2、3或 4個)選自氮、氧和硫的雜原子(該氮可視需要被氧化，即形成氮氧化物；該硫可視需要被氧化，即形成亞碸或碸，但不包括-O-O-、-O-S-或-S-S-)，且具有3至20個(例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個)環原子(即3至20員雜環基)。該雜環基較佳具有3至12個環原子的雜環基(即3至12員雜環基)；進一步佳具有3至8個環原子的雜環基(即3至8員雜環基)；更佳具有3至6個環原子的雜環基(即3至6員雜環基)；最較佳具有5或6個環原子的雜環基(即5或6員雜環基)。

該單環雜環基，非限制性的實例包括：吡咯烷基、四氫吡喃基、1,2,3,6-四氫吡啶基、哌啶基、哌嗪基、嗎啉基、硫嗎啉基和高哌嗪基等。

該多環雜環基包括螺雜環基、稠雜環基和橋雜環基。

術語“螺雜環基”指環之間共用一個原子(稱螺原子)的多環雜環系統，其環內可以含有一個或多個雙鍵，且其環內至少含有一個(例如1、2、3或4個)選自氮、氧和硫的雜原子(該氮可視需要被氧化，即形成氮氧化物；該硫可視需要被氧化，即形成亞碸或碸，但不包括-O-O-、-O-S-或-S-S-)，條件是至少含有一個單環雜環基且連接點在該單環雜環基上，其具有5至20個(例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個)環原子(即5至20員螺雜環基)。該螺雜環基較佳具有6至14個環原子的螺雜環基(即6至14員螺雜環基)，更佳具有7至10個環原子的螺雜環基(即7至10員螺雜環基)。該螺雜環基包括單螺雜環基和多螺雜環基(如雙螺雜環基等)，較佳單螺雜環基或雙螺雜環基，更佳3員/4員、 3員/5員、3員/6員、4員/4員、4員/5員、4員/6員、5員/3員、5員/4員、5員/5員、5員/6員、5員/7員、6員/3員、6員/4員、6員/5員、6員/6員、6員/7員、7員/5員或7員/6員單螺雜環基。非限制性的實例包括：

等。

術語“稠雜環基”指環之間共享毗鄰的兩個原子的多環雜環系統，其環內可以含有一個或多個雙鍵，且其環內至少含有一個(例如1、2、3或4個)選自氮、氧和硫的雜原子(該氮可視需要被氧化，即形成氮氧化物；該硫可視需要被氧化，即形成亞碸或碸，但不包括-O-O-、-O-S-或-S-S-)，其為單環雜環基與一個或多個單環雜環基稠合，或者單環雜環基與環烷基、芳基或雜芳基中的一個或多個稠合，其中連接點在單環雜環基上，且具有5至20個(例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個)環原子(即5至20員稠雜環基)。該稠雜環基較佳具有6至14個環原子的稠雜環基(即6至14員稠雜環基)，更佳具有7至10個環原子的稠雜環基(即7至10員稠雜環基)。該稠雜環基包括雙環和多環稠雜環基(如三環稠雜環基、四環稠雜環基等)，較佳雙環稠雜環基或三環稠雜環基，更佳3員/4員、3員/5員、3員/6員、4員/4員、4員/5員、4員/6員、5員/3員、5員/4員、5員/5員、5員/6員、5員/7員、6員/3員、6員/4員、6員/5員、6員/6員、6員/7員、7員/5員或7員/6員雙環稠雜環基。非限制性的實例包括：

等。

術語“橋雜環基”指環之間共用兩個不直接連接的原子的多環雜環系統，其環內可以含有一個或多個雙鍵，並且其環內至少含有一個(例如1、2、3或4個)選自氮、氧和硫的雜原子(該氮可視需要被氧化，即形成氮氧化物；該硫可視需要被氧化，即形成亞碸或碸，但不包括-O-O-、-O-S-或-S-S-)，其具有5至20個(例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個)環原子(即5至20員橋雜環基)。該橋雜環基較佳具有6至14個環原子的橋雜環基(即6至14員橋雜環基)，更佳具有7至10個環原子的橋雜環基(即7至10員橋雜環基)。根據組成環的數目可以分為雙環橋雜環基和多環橋雜環基(如三環橋雜環基、四環橋雜環基等)，較佳雙環橋雜環基或三環橋雜環基。非限制性的實例包括：

等。

雜環基可以是取代的或非取代的，當被取代時，其可以在任何可使用的連接點被取代，取代基較佳選自D原子、鹵素、烷基、烷氧基、 鹵烷基、鹵烷氧基、環烷基氧基、雜環基氧基、羥基、羥烷基、側氧基、氰基、胺基、硝基、環烷基、雜環基、芳基和雜芳基中的一個或多個。

術語“芳基”指具有共軛的π電子體系的單環全碳芳環(即單環芳基)或多環芳環系統(即多環芳基)，其具有6至14個(例如6、7、8、9、10、11、12、13或14個)環原子(即6至14員芳基)。該芳基較佳具有6至10個環原子的芳基(即6至10員芳基)。該單環芳基，例如苯基。該多環芳基，非限制性的實例包括：萘基、蒽基、菲基等。該多環芳基還包括苯基與雜環基或環烷基中的一個或多個稠合，或萘基與雜環基或環烷基中的一個或多個稠合，其中連接點在苯基或萘基上，並且在這種情況下，環原子個數繼續表示多環芳環系統中的環原子個數，非限制性的實例包括：

等。

芳基可以是取代的或非取代的，當被取代時，其可以在任何可使用的連接點被取代，取代基較佳選自D原子、鹵素、烷基、烷氧基、鹵烷基、鹵烷氧基、環烷基氧基、雜環基氧基、羥基、羥烷基、側氧基、氰基、胺基、硝基、環烷基、雜環基、芳基和雜芳基中的一個或多個。

術語“雜芳基”指具有共軛的π電子體系的單環雜芳環(即單環雜芳基)或多環雜芳環系統(即多環雜芳基)，其環內至少含有一個(例如1、2、3或4個)選自氮、氧和硫的雜原子(該氮可視需要被氧化，即形成氮氧化物；該硫可視需要被氧化，即形成亞碸或碸，但不包括-O-O-、-O-S-或-S-S-)，其具有5至14個(例如5、6、7、8、9、10、11、12、13或14個)環原子(即5至14員雜芳基)。該雜芳基較佳具有5至10個環原子的雜芳 基(即5至10員雜芳基)，更佳具有5或6個環原子的雜芳基(即5或6員雜芳基)。

該單環雜芳基，非限制性的實例包括：呋喃基、噻吩基、噻唑基、異噻唑基、噁唑基、異噁唑基、噁二唑基、噻二唑基、咪唑基、吡唑基、三唑基、四唑基、呋咱基、吡咯基、N-烷基吡咯基、吡啶基、嘧啶基、吡啶酮基、N-烷基吡啶酮(如

等)、吡嗪基、噠嗪基等。

該多環雜芳基，非限制性的實例包括：吲哚基、吲唑基、喹啉基、異喹啉基、喹喔啉基、酞嗪基、苯并咪唑基、苯并噻吩基、喹唑啉基、苯并噻唑基、哢唑基等。該多環雜芳基還包括單環雜芳基與一個或多個芳基稠合，其中連接點在芳香環上，並且在這種情況下，環原子個數繼續表示多環雜芳環系統中的環原子個數。該多環雜芳基還包括單環雜芳基與環烷基或雜環基中的一個或多個稠合，其中連接點在單環雜芳環上，並且在這種情況下，環原子個數繼續表示多環雜芳環系統中的環原子個數。非限制性的實例包括：

等。

雜芳基可以是取代的或非取代的，當被取代時，其可以在任何可使用的連接點被取代，取代基較佳選自D原子、鹵素、烷基、烷氧基、 鹵烷基、鹵烷氧基、環烷基氧基、雜環基氧基、羥基、羥烷基、氰基、胺基、硝基、環烷基、雜環基、芳基和雜芳基中的一個或多個。

術語“胺基保護基”是指為了使分子其它部位進行反應時胺基保持不變，在胺基上引入的易於脫去的基團。非限制性的實例包括：(三甲基矽)乙氧基甲基、四氫吡喃基、第三丁氧羰基(Boc)、苄氧羰基(Cbz)、笏甲氧羰基(Fmoc)、烯丙氧羰基(Alloc)、三甲基矽乙氧羰基(Teoc)、甲氧羰基、乙氧羰基、鄰苯二甲醯基(Pht)、對甲苯磺醯基(Tos)、三氟乙醯基(Tfa)、三苯甲基(Trt)、2,4-二甲氧基苄基(DMB)、乙醯基、苄基、烯丙基、對甲氧苄基等。

術語“羥基保護基”是指在羥基上引入的易於脫去的基團，用於阻斷或保護羥基而在化合物的其它官能團上進行反應。非限制性的實例包括：三甲基矽基(TMS)、三乙基矽基(TES)、三異丙基矽基(TIPS)、第三丁基二甲基矽基(TBS)、第三丁基二苯基矽基(TBDPS)、甲基、第三丁基、烯丙基、苄基、甲氧基甲基(MOM)、乙氧基乙基、2-四氫吡喃基(THP)、甲醯基、乙醯基、苯甲醯基、對硝基苯甲醯基等。

術語“環烷基氧基”指環烷基-O-，其中環烷基如上所定義。

術語“雜環基氧基”指雜環基-O-，其中雜環基如上所定義。

術語“芳基氧基”指芳基-O-，其中芳基如上所定義。

術語“雜芳基氧基”指雜芳基-O-，其中雜芳基如上所定義。

術語“烷硫基”指烷基-S-，其中烷基如上所定義。

術語“鹵烷基”指烷基被一個或多個鹵素取代，其中烷基如上所定義。

術語“鹵烷氧基”指烷氧基被一個或多個鹵素取代，其中烷氧基如上所定義。

術語“氘代烷基”指烷基被一個或多個氘原子取代，其中烷基如上所定義。

術語“羥烷基”指烷基被一個或多個羥基取代，其中烷基如上所定義。

術語“甲叉基”指=CH₂。

術語“鹵素”指氟、氯、溴或碘。

術語“羥基”指-OH。

術語“巰基”指-SH。

術語“胺基”指-NH₂。

術語“氰基”指-CN。

術語“硝基”指-NO₂。

術語“側氧”或“側氧基”指“=O”。

術語“羰基”指C=O。

術語“羧基”指-C(O)OH。

術語“羧酸酯基”指-C(O)O(烷基)、-C(O)O(環烷基)、(烷基)C(O)O-或(環烷基)C(O)O-，其中烷基和環烷基如上所定義。

化學式中簡稱“Me”為甲基。

化學式中簡稱“Ph”為苯基。

術語“THF”指四氫呋喃。

術語“EtOAc”指乙酸乙酯。

術語“MeOH”指甲醇。

術語“DMF”指N,N-二甲基甲醯胺。

術語“DIPEA”指二異丙基乙胺。

術語“TFA”指三氟乙酸。

術語“MeCN”指乙腈。

術語“DMA”指N,N-二甲基乙醯胺。

術語“Et₂O”指乙醚。

術語“DCE”指1,2二氯乙烷。

術語“DIPEA”指N,N-二異丙基乙胺。

術語“NBS”指N-溴琥珀醯亞胺。

術語“NIS”指N-碘丁二醯亞胺。

術語“Cbz-Cl”指氯甲酸苄酯。

術語“Pd₂(dba)₃”指三(二亞苄基丙酮)二鈀。

術語“Dppf”指1,1’-雙二苯基膦二茂鐵。

術語“HATU”指2-(7-氧化苯并三唑)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸鹽。

術語“KHMDS”指六甲基二矽基胺基鉀。

術語“LiHMDS”指雙三甲基矽基胺基鋰。

術語“MeLi”指甲基鋰。

術語“n-BuLi”指正丁基鋰。

術語“NaBH(OAc)₃”指三乙醯氧基硼氫化鈉。

術語“DCM”指二氯甲烷。

術語“DMAP”指4-二甲胺基吡啶。

術語“DMBOH”指2,4-二甲氧基苄醇。

術語“EDCI”指1-(3-二甲基胺基丙基)-3-乙基碳二亞胺。

術語“MTBE”指甲基第三丁基醚。

術語“DMF”指N,N-二甲基甲醯胺。

術語“DMTMM”指4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基嗎啉鹽酸鹽。

術語“EtOAc”指乙酸乙酯。

本揭露的化合物可以存在特定的立體異構體形式。術語“立體異構體”是指結構相同但原子在空間中的排列不同的異構體。其包括順式和反式(或Z和E)異構體、(-)-和(+)-異構體、(R)-和(S)-對映異構體、非對映異構體、(D)-和(L)-異構體、互變異構體、阻轉異構體、構象異構體及其混合物(如外消旋體、非對映異構體的混合物)。本揭露化合物中的取代基可以存在另外的不對稱原子。所有這些立體異構體以及它們的混合物，均包括在本揭露的範圍內。可以藉由手性合成、手性試劑或者其他常規技術製備光學活性的(-)-和(+)-異構體、(R)-和(S)-對映異構體以及(D)-和(L)-異構體。本揭露某化合物的一種異構體，可以藉由不對稱合成或者手性助劑來製備，或者，當分子中含有鹼性官能團(如胺基)或酸性官能團(如羧基)時，與適當的光學活性的酸或鹼形成非對映異構體的鹽，然後藉由本領域所公知的常規方法進行非對映異構體拆分，得到純的異構體。此外，對映異構體和非對映異構體的分離通常是藉由色譜法完成。

本揭露所述化合物的化學結構中，鍵“

”表示未指定構型，即如果化學結構中存在手性異構體，鍵“

”可以為“

”或“

”或者同時包含“

”和“

”兩種構型。

本揭露的化合物可以以不同的互變異構體形式存在，並且所有這樣的形式包含在本揭露的範圍內。術語“互變異構體”或“互變異構體形式”是指平衡存在並且容易從一種異構形式轉化為另一種異構形式的結構異構體。其包括所有可能的互變異構體，即以單一異構體的形式或以該互變異構體的任意比例的混合物的形式存在。非限制性的實例包括：酮-烯醇、亞胺-烯胺、內醯胺-內醯亞胺等。內醯胺-內醯亞胺的平衡如下所示：

如當提及吡唑基時，應理解為包括如下兩種結構中的任何一種或兩種互變異構體的混合物：

所有的互變異構形式在本揭露的範圍內，且化合物的命名不排除任何互變異構體。

本揭露的化合物包括其化合物的所有合適的同位素衍生物。術語“同位素衍生物”是指至少一個原子被具有相同原子序數但原子質量不同的原子替代的化合物。可引入到本揭露化合物中的同位素的實例包括氫、碳、氮、氧、磷、硫、氟、氯、溴和碘等的穩定和放射性的同位素，例如分別為²H(氘，D)、³H(氚，T)、¹¹C、¹³C、¹⁴C、¹⁵N、¹⁷O、¹⁸O、³²p、³³p、³³S、³⁴S、³⁵S、³⁶S、¹⁸F、³⁶Cl、⁸²Br、¹²³I、¹²⁴I、¹²⁵I、¹²⁹I和¹³¹I等，較佳氘。

相比於未氘代藥物，氘代藥物有降低毒副作用、增加藥物穩定性、增強療效、延長藥物生物半衰期等優勢。本揭露的化合物的所有同位素組成的變換，無論放射性與否，都包括在本揭露的範圍之內。與碳原子連接的各個可用的氫原子可獨立地被氘原子替換，其中氘的替換可以是部分或完全的，部分氘的替換是指至少一個氫被至少一個氘替換。

當一個位置被特別地指定為“氘”或“D”時，該位置應理解為氘的豐度比氘的天然豐度(其為0.015%)大至少1000倍(即至少15%的氘摻入)。在一些實施方案中，每個被指定的氘原子的氘的豐度比氘的天然豐度大至少1000倍(即至少15%的氘摻入)。在一些實施方案中，每個被指定的氘原子的氘的豐度比氘的天然豐度大至少2000倍(即至少30%的氘摻入)。在一些實施方案中，每個被指定的氘原子的氘的豐度比氘的天然豐度大至少3000倍(即至少45%的氘摻入)。在一些實施方案中，每個被指定的氘原子的氘的豐度比氘的天然豐度大至少3340倍(即至少50.1%的氘摻入)。在一些實施方案中，每個被指定的氘原子的氘的豐度比氘的天然豐度大至少3500倍(即至少52.5%的氘摻入)。在一些實施方案中，每個被指定的氘原子的氘的豐度比氘的天然豐度大至少4000倍(即至少60%的氘摻入)。在一些實施方案中，每個被指定的氘原子的氘的豐度比氘的天然豐度大至少4500倍(即至少67.5%的氘摻入)。在一些實施方案中，每個被指定的氘原子的氘的豐度比氘的天然豐度大至少5000倍(即至少75%的氘摻入)。在一些實施方案中，每個被指定的氘原子的氘的豐度比氘的天然豐度大至少5500倍(即至少82.5%的氘摻入)。在一些實施方案中，每個被指定的氘原子的氘的豐度比氘的天然豐度大至少6000倍(即至少90%的氘摻入)。在一 些實施方案中，每個被指定的氘原子的氘的豐度比氘的天然豐度大至少6333.3倍(即至少95%的氘摻入)。在一些實施方案中，每個被指定的氘原子的氘的豐度比氘的天然豐度大至少6466.7倍(即至少97%的氘摻入)。在一些實施方案中，每個被指定的氘原子的氘的豐度比氘的天然豐度大至少6600倍(即至少99%的氘摻入)。在一些實施方案中，每個被指定的氘原子的氘的豐度比氘的天然豐度大至少6633.3倍(即至少99.5%的氘摻入)。

“取代”或“取代的”指基團中的一個或多個氫原子，較佳1至6個，更佳1至3個氫原子彼此獨立地被相應數目的取代基取代。所屬技術領域具有通常知識者能夠在不付出過多努力的情況下(藉由實驗或理論)確定可能或不可能的取代。例如，具有游離氫的胺基或羥基與具有不飽和鍵的碳原子(如烯)結合時可能是不穩定的。

本揭露還包括各種氘化形式的式(Pc-L-Da)或(Pc-L-D)抗體-藥物偶聯物。與碳原子連接的各個可用的氫原子可獨立地被氘原子替換。所屬技術領域具有通常知識者能夠參考相關文獻合成氘化形式的式(Pc-L-Da)或(Pc-L-D)抗體-藥物偶聯物。在製備氘代形式的式(Pc-L-Da)或(Pc-L-D)抗體-藥物偶聯物時可使用市售的氘代起始物質，或它們可使用常規技術採用氘代試劑合成，氘代試劑包括但不限於氘代硼烷、三氘代硼烷四氫呋喃溶液、氘代氫化鋰鋁、氘代碘乙烷和氘代碘甲烷等。

“視需要地”或“視需要”是指隨後所描述的事件或環境可以但不必然發生，其包括該事件或環境發生或不發生兩種情形。例如“視需要地(視需要)被鹵素或者氰基取代的烷基”包括烷基被鹵素或者氰基取代的情形和烷基不被鹵素和氰基取代的情形。

術語“醫藥組成物”表示含有一種或多種本文所述化合物或其生理學上/可藥用的鹽或前體藥物與其他化學組分的混合物，以及其他組分例如生理學/可藥用的載體和賦形劑。醫藥組成物的目的是促進對生物體的給藥，利於活性成分的吸收進而發揮生物活性。

醫藥組成物可以是無菌注射水溶液形式。可接受的溶媒和溶劑有水、林格氏液和等滲氯化鈉溶液。無菌注射製劑可以是其中活性成分溶於油相的無菌注射水包油微乳。例如將活性成分溶於大豆油和卵磷脂的混合物中。然後將油溶液加入水和甘油的混合物中處理形成微乳。可藉由局部大量注射，將注射液或微乳注入受試者的血流中。或者，按可保持本揭露化合物恆定循環濃度的方式給予溶液和微乳。為保持這種恆定濃度，可使用連續靜脈內遞藥裝置。這種裝置的示例是Deltec CADD-PLUS.TM.5400型靜脈注射泵。

醫藥組成物可以是用於肌內和皮下給藥的無菌注射水或油混懸液的形式。可按已知技術，用上述那些適宜的分散劑或濕潤劑和懸浮劑配製該混懸液。無菌注射製劑也可以是在無毒腸胃外可接受的稀釋劑或溶劑中製備的無菌注射溶液或混懸液，例如1,3-丁二醇中製備的溶液。此外，可方便地用無菌固定油作為溶劑或懸浮介質。為此目的，可使用包括合成甘油單或二酯在內的任何調和固定油。此外，脂肪酸例如油酸也可以製備注射劑。

術語“藥學上可接受的鹽”或“可藥用鹽”是指本揭露的抗體或抗體-藥物偶聯物的鹽，這類鹽用於受試者時具有安全性和有效性，且具有應有的生物活性。作為一個示例，本揭露抗體、或抗體-藥物偶聯物至少含有一個胺基，因此可以與酸形成鹽，可藥用鹽的非限制性示例包括：鹽酸 鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、硫酸鹽、硫酸氫鹽、檸檬酸鹽、乙酸鹽、琥珀酸鹽、抗壞血酸鹽、草酸鹽、硝酸鹽、梨酸鹽、磷酸氫鹽、磷酸二氫鹽、水楊酸鹽、檸檬酸氫鹽、酒石酸鹽、馬來酸鹽、富馬酸鹽、甲酸鹽、苯甲酸鹽、甲磺酸鹽、乙磺酸鹽、苯磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽。

術語“藥學上可接受的載體”指藥學配製劑中與活性成分不同的，且對受試者無毒的成分。藥學上可接受的載體包括但不限於緩衝劑、穩定劑或防腐劑。

術語“賦形劑”是在藥物製劑中除活性成分以外的附加物，也可稱為輔料。如片劑中的黏合劑、填充劑、崩解劑、潤滑劑；半固體製劑軟膏劑、霜劑中的基質部分；液體製劑中的防腐劑、抗氧劑、矯味劑、芳香劑、助溶劑、乳化劑、增溶劑、滲透壓調節劑、著色劑等均可稱為賦形劑。

術語“稀釋劑”又稱填充劑，其主要用途是增加片劑的重量和體積。稀釋劑的加入不僅保證一定的體積大小，而且減少主要成分的劑量偏差，改善藥物的壓縮成型性等。當片劑的藥物含有油性組分時，需加入吸收劑吸收油性物，使保持“乾燥”狀態，以利於製成片劑。如澱粉、乳糖、鈣的無機鹽、微晶纖維素等。

術語“受試者”或“個體”包括人類和非人類動物。非人動物包括所有脊椎動物(例如哺乳動物和非哺乳動物)例如非人靈長類(例如，食蟹猴)、羊、狗、牛、禽、兩棲動物和爬行動物。除非指出時，否則該術語“患者”或“受試者”在本文中可互換地使用。如本文所使用的，術語“食蟹猴(cyno)”或“食蟹猴(cynomolgus)”是指食蟹猴(Macaca fascicularis)。在某些實施方案中，個體或受試者是人。

“施用”或“給予”，當其應用於動物、人、實驗受試者、細胞、組織、器官或生物流體時，是指外源性藥物、治療劑、診斷劑或組成物與動物、人、受試者、細胞、組織、器官或生物流體的接觸。

術語“樣本”是指從受試者分離的流體、細胞、或組織的採集物，以及存在於受試者體內的流體、細胞或組織。示例性樣本為生物流體，諸如血液、血清和漿膜液、血漿、淋巴液、尿液、唾液、囊液、淚液、排泄物、痰、分泌組織和器官的黏膜分泌物、陰道分泌物、腹水、胸膜、心包、腹膜、腹腔和其它體腔的流體、由支氣管灌洗液收集的流體、滑液、與受試者或生物來源接觸的液體溶液，例如細胞和器官培養基(包括細胞或器官條件培養基)、灌洗液等，組織活檢樣本、細針穿刺、手術切除的組織、器官培養物或細胞培養物。

“治療(treatment或treat)”和“處理”(及其語法變型)指試圖改變所治療個體的病理過程的臨床干預，並且可以為了預防或者在臨床病理學的過程期間實施。治療的期望效果包括但不限於預防疾病的發生或再發生，減輕症狀，減輕/減少疾病的任何直接或間接病理後果，預防轉移，降低疾病進展速率，改善或減輕疾病狀態，和消退或改善的預後。在一些實施方案中，使用本揭露的抗體來延遲疾病的形成或減緩疾病的進展。

“有效量”一般是足以降低症狀的嚴重程度及/或頻率、消除這些症狀及/或潛在病因、預防症狀及/或其潛在病因出現及/或改良或改善由疾病狀態引起或與其相關的損傷的量。在一些實施方案中，有效量是治療有效量或預防有效量。“治療有效量”是足以治療疾病狀態或症狀、尤其與該疾病狀態相關的狀態或症狀，或者以其他方式預防、阻礙、延遲或逆轉該疾病狀態或以任何方式與該疾病相關的任何其他不理想症狀的進展的量。“預防有效量”是當給予受試者時將具有預定預防效應，例如預防或延 遲該疾病狀態的發作(或復發)，或者降低該疾病狀態或相關症狀的發作(或復發)可能性的量。完全治療或預防效未必在給予一個劑量之後便發生，可能在給予一系列劑量之後發生。因而，治療或預防有效量可以一次或多次給予的方式給予。“治療有效量”和“預防有效量”可取決於多種因素變化：諸如個體的疾病狀態、年齡、性別和體重，以及治療劑或治療劑組合在個體中引發期望的應答的能力。有效治療劑或治療劑組合的示例性指標包括例如患者改善的健康狀況。

二、具體實施方式的描述

A.示例性的抗DLL3的抗體

在一個方面中，本揭露提供結合DLL3的抗體。在一個方面中，提供結合DLL3的分離的抗體。在一個方面中，本揭露提供特異性結合DLL3的抗體。

在某些實施方案中，前述的抗DLL3抗體具有以下特性中的至少一種：

a)該抗DLL3抗體與人DLL3或其表位結合的KD值

3nM、

2nM、

1nM、

0.9nM、

0.8nM、

0.7nM、

0.6nM、

0.5nM、

0.4nM，該KD值藉由Biacore測定；

b)該抗DLL3抗體與表達DLL3的H1184細胞結合的EC50

3nM、EC50

2nM、EC50

1nM、EC50

0.5nM、EC50

0.2nM、EC50

0.1nM、EC50

0.09nM、EC50

0.08nM、EC50

0.07nM、EC50

0.06nM，該EC50藉由FACS檢測；和

c)該抗DLL3抗體能夠被表達DLL3的細胞內吞；和

d)該抗DLL3抗體與DLL3或其表位結合EC50

0.1nM(

0.09nM、

0.08nM、

0.07nM、

0.06nM、

0.05nM、

0.04nM)，該EC50藉由ELISA檢測；

e)該抗DLL3抗體和陽性抗體(例如BI-764532)識別不同的DLL3表位。

在一個方面中，本揭露提供一種抗DLL3的抗體，其包含選自以下的組：

(i)HCDR1，其包含SEQ ID NO：22的胺基酸序列；(ii)HCDR2，其包含SEQ ID NO：23的胺基酸序列；(iii)HCDR3，其包含SEQ ID NO：57的胺基酸序列；(iv)LCDR1，其包含SEQ ID NO：25的胺基酸序列；(v)LCDR2，其包含SEQ ID NO：26的胺基酸序列；和(vi)LCDR3，其包含SEQ ID NO：27的胺基酸序列；其中，SEQ ID NO：57如PLYX₁YGRSYNX₂VAY所示，其中X₁為Y或H；X₂為A或G；或

(i)HCDR1，其包含SEQ ID NO：16的胺基酸序列；(ii)HCDR2，其包含SEQ ID NO：17的胺基酸序列；(iii)HCDR3，其包含SEQ ID NO：18的胺基酸序列；(iv)LCDR1，其包含SEQ ID NO：19的胺基酸序列；(v)LCDR2，其包含SEQ ID NO：20的胺基酸序列；和(vi)LCDR3，其包含SEQ ID NO：21的胺基酸序列。

在一個方面中，本揭露提供一種抗DLL3的抗體，其包含選自以下的組：

(i)HCDR1，其包含SEQ ID NO：22的胺基酸序列；(ii)HCDR2，其包含SEQ ID NO：23的胺基酸序列；(iii)HCDR3，其包含SEQ ID NO：24的胺基酸序列；(iv)LCDR1，其包含SEQ ID NO：25的胺基酸序列； (v)LCDR2，其包含SEQ ID NO：26的胺基酸序列；和(vi)LCDR3，其包含SEQ ID NO：27的胺基酸序列；或

(i)HCDR1，其包含SEQ ID NO：22的胺基酸序列；(ii)HCDR2，其包含SEQ ID NO：23的胺基酸序列；(iii)HCDR3，其包含SEQ ID NO：30的胺基酸序列；(iv)LCDR1，其包含SEQ ID NO：25的胺基酸序列；(v)LCDR2，其包含SEQ ID NO：26的胺基酸序列；和(vi)LCDR3，其包含SEQ ID NO：27的胺基酸序列；或

(i)HCDR1，其包含SEQ ID NO：22的胺基酸序列；(ii)HCDR2，其包含SEQ ID NO：23的胺基酸序列：(iii)HCDR3，其包含SEQ ID NO：31的胺基酸序列；(iv)LCDR1，其包含SEQ ID NO：25的胺基酸序列；(v)LCDR2，其包含SEQ ID NO：26的胺基酸序列；和(vi)LCDR3，其包含SEQ ID NO：27的胺基酸序列。

在一個方面中，本揭露提供一種抗DLL3的抗體，其包含SEQ ID NO：14的重鏈可變區中的HCDRs和SEQ ID NO：15的輕鏈可變區中的LCDRs；或

其包含SEQ ID NO：12的重鏈可變區的HCDRs和SEQ ID NO：13的輕鏈可變區的LCDRs；或

其包含SEQ ID NO：52的重鏈可變區的HCDRs和SEQ ID NO：15的輕鏈可變區的LCDRs；或

其包含SEQ ID NO：53的重鏈可變區的HCDRs和SEQ ID NO：15的輕鏈可變區的LCDRs。

在一些實施方案中，該CDRs序列根據本領域內公知的編號方法獲得，該編號規則包括但不限於Kabat、Chothia、IMGT、AbM和Contact。

在一個方面中，本揭露提供一種抗DLL3的抗體，其包含：

HCDR1，其序列如SEQ ID NO：22所示，或與SEQ ID NO：22相比包含3、2或1個胺基酸突變；

HCDR2，其序列如SEQ ID NO：23所示，或與SEQ ID NO：23相比包含3、2或1個胺基酸突變；

HCDR3，其序列如SEQ ID NO：24所示，或與SEQ ID NO：24相比包含3、2或1個胺基酸突變；

LCDR1，其序列如SEQ ID NO：25所示，或與SEQ ID NO：25相比包含3、2或1個胺基酸突變；

LCDR2，其序列如SEQ ID NO：26所示，或與SEQ ID NO：26相比包含3、2或1個胺基酸突變；和

LCDR3，其序列如SEQ ID NO：27所示，或與SEQ ID NO：27相比包含3、2或1個胺基酸突變。

在一個方面中，本揭露提供一種抗DLL3的抗體，其包含：

HCDR1，其序列如SEQ ID NO：22所示，或與SEQ ID NO：22相比包含3、2或1個胺基酸突變；

HCDR2，其序列如SEQ ID NO：23所示，或與SEQ ID NO：23相比包含3、2或1個胺基酸突變；

HCDR3，其序列如SEQ ID NO：30所示，或與SEQ ID NO：30相比包含3、2或1個胺基酸突變；

LCDR1，其序列如SEQ ID NO：25所示，或與SEQ ID NO：25相比包含3、2或1個胺基酸突變；

LCDR2，其序列如SEQ ID NO：26所示，或與SEQ ID NO：26相比包含3、2或1個胺基酸突變；和

LCDR3，其序列如SEQ ID NO：27所示，或與SEQ ID NO：27相比包含3、2或1個胺基酸突變。

在一個方面中，本揭露提供一種抗DLL3的抗體，其包含：

HCDR1，其序列如SEQ ID NO：22所示，或與SEQ ID NO：22相比包含3、2或1個胺基酸突變；

HCDR2，其序列如SEQ ID NO：23所示，或與SEQ ID NO：23相比包含3、2或1個胺基酸突變；

HCDR3，其序列如SEQ ID NO：31所示，或與SEQ ID NO：31相比包含3、2或1個胺基酸突變；

LCDR1，其序列如SEQ ID NO：25所示，或與SEQ ID NO：25相比包含3、2或1個胺基酸突變；

LCDR2，其序列如SEQ ID NO：26所示，或與SEQ ID NO：26相比包含3、2或1個胺基酸突變；和

LCDR3，其序列如SEQ ID NO：27所示，或與SEQ ID NO：27相比包含3、2或1個胺基酸突變。

在一個方面中，本揭露提供一種抗DLL3的抗體，其包含：

HCDR1，其序列如SEQ ID NO：16所示，或與SEQ ID NO：16相比包含3、2或1個胺基酸突變；

HCDR2，其序列如SEQ ID NO：17所示，或與SEQ ID NO：17相比包含3、2或1個胺基酸突變；

HCDR3，其序列如SEQ ID NO：18所示，或與SEQ ID NO：18相比包含3、2或1個胺基酸突變；

LCDR1，其序列如SEQ ID NO：19所示，或與SEQ ID NO：19相比包含3、2或1個胺基酸突變；

LCDR2，其序列如SEQ ID NO：20所示，或與SEQ ID NO：20相比包含3、2或1個胺基酸突變；和

LCDR3，其序列如SEQ ID NO：21所示，或與SEQ ID NO：21相比包含3、2或1個胺基酸突變。

在一個方面中，本揭露提供一種抗DLL3的抗體，其包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中，

該重鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3：和

該輕鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：27所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。

在一個方面中，本揭露提供一種抗DLL3的抗體，其包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中，

該重鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：30所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；和

該輕鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：27所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。

在一個方面中，本揭露提供一種抗DLL3的抗體，其包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中，

該重鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：31所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；和

該輕鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：27所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。

在一個方面中，本揭露提供一種抗DLL3的抗體，其包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中，

該重鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；和

該輕鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：21所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。

在另一個方面，抗DLL3抗體的重鏈可變區包含與SEQ ID NO：14、50、51、52、53或54中的任一胺基酸序列分別具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的序列。在某些實施方案中，具有相對於參考序列的替代(例如保守替代)、插入或缺失，但是包含該序列的抗DLL3抗體保留結合DLL3的能力。在某些實施方案中，替代、插入或缺失發生在CDR以外的區域中(即，FR中)。

在另一個方面，抗DLL3抗體的輕鏈可變區包含與SEQ ID NO：15、55或56中的任一胺基酸序列分別具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的序列。在某些實施方案中，具有相對於參考序列的替代(例如保守替代)、插入或缺失，但是包含該序列的抗DLL3抗體保留結合DLL3的能力。在某些實施方案中，替代、插入或缺失發生在CDR以外的區域中(即，FR中)。

在另一個方面，抗DLL3抗體的重鏈可變區包含與SEQ ID NO：12、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43或44中的任一胺基酸序列分別具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的序列。在某些實施方案中，具有相對於參考序列的替代(例如保守替代)、插入或缺失，但是包含該序列的 抗DLL3抗體保留結合DLL3的能力。在某些實施方案中，替代、插入或缺失發生在CDR以外的區域中(即，FR中)。

在另一個方面，抗DLL3抗體的輕鏈可變區包含與SEQ ID NO：13、45、46、47、48或49中的任一胺基酸序列分別具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的序列。在某些實施方案中，具有相對於參考序列的替代(例如保守替代)、插入或缺失，但是包含該序列的抗DLL3抗體保留結合DLL3的能力。在某些實施方案中，替代、插入或缺失發生在CDR以外的區域中(即，FR中)。

在一些實施方案中，前述的抗DLL3抗體包含如SEQ ID NO：50、14、51、52、53或54任一所示的重鏈可變區，和/或如SEQ ID NO：55、15或56任一所示的輕鏈可變區。

在一些實施方案中，前述的抗DLL3抗體包含如SEQ ID NO：43、12、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42或44任一所示的重鏈可變區，和/或如SEQ ID NO：48、13、45、46、47或49任一所示的輕鏈可變區。

在一些實施方案中，前述的抗DLL3抗體包含如SEQ ID NO：14所示的重鏈可變區，和/或如SEQ ID NO：15任一所示的輕鏈可變區。

在一些實施方案中，前述的抗DLL3抗體包含選自SEQ ID NO：50、51、52、53和54中任一所示的重鏈可變區，和/或如SEQ ID NO：55或56任一所示的輕鏈可變區。

在一些實施方案中，前述的抗DLL3抗體包含如SEQ ID NO：12所示的重鏈可變區，和/或如SEQ ID NO：13所示的輕鏈可變區。

在一些實施方案中，前述的抗DLL3抗體包含選自SEQ ID NO：43、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42和44中任一所示的重鏈可變區，和/或選自SEQ ID NO：48、45、46、47和49中任一所示的輕鏈可變區。

在一些實施方案中，前述的抗DLL3抗體包含如SEQ ID NO：50所示的重鏈可變區，和如SEQ ID NO：55所示的輕鏈可變區。

在一些實施方案中，前述的抗DLL3抗體包含如SEQ ID NO：43所示的重鏈可變區，和如SEQ ID NO：48所示的輕鏈可變區。

在一些實施方案中，前述的抗DLL3抗體其包含重鏈恆定區和輕鏈恆定區。

在一些實施方案中，前述的抗DLL3抗體，其重鏈恆定區的序列如SEQ ID NO：28所示。

在一些實施方案中，前述的抗DLL3抗體，其輕鏈恆定區的序列如SEQ ID NO：29所示。

在一些實施方案中，前述的抗DLL3抗體，其包含重鏈和輕鏈，其中，

該重鏈包含與SEQ ID NO：60具有至少85%同一性的胺基酸序列，和/或該輕鏈包含與SEQ ID NO：61具有至少85%同一性的胺基酸序列；或

該重鏈包含與SEQ ID NO：58具有至少85%同一性的胺基酸序列，和/或該輕鏈包含與SEQ ID NO：59具有至少85%同一性的胺基酸序列。

在一些實施方案中，前述的抗DLL3抗體，其包含如SEQ ID NO：60所示的重鏈，和如SEQ ID NO：61所示的輕鏈。

在一些實施方案中，前述的抗DLL3抗體，其包含如SEQ ID NO：58所示的重鏈，和如SEQ ID NO：59所示的輕鏈。

B.抗體結構

在某些實施方案中，本文中提供的抗體是全長抗體。

在某些實施方案中，本文中提供的抗體是抗體片段。

在一個實施方案中，抗體片段是Fab、Fab'、Fab'-SH或F(ab')₂片段，特別是Fab片段。“Fab”，其是由VL、VH、CL和CH1結構域組成的單價片段。“Fab片段”可以是抗體經木瓜蛋白酶裂解產生的。“Fab'”含有VL、CL以及VH和CH1，還含有CH1和CH2結構域之間的區域，以使得在兩個Fab'片段的兩條重鏈之間可以形成鏈間二硫鍵，以形成F(ab')2分子。“Fab'-SH”是其中恆定區的半胱胺酸殘基具有游離巰基的Fab'片段。“F(ab')₂”包含在鉸鏈區藉由二硫鍵連接的兩個Fab片段的二價片段。

在另一個實施方案中，抗體片段是雙抗體，三抗體或四抗體。雙抗體是具有兩個抗原結合位點的抗體片段，該片段在同一條多肽鏈(VH-VL)中包含相連的VH和VL。藉由使用過短的接頭使得同一條鏈上的兩個結構域之間不能配對，迫使這些結構域與另一條鏈的互補結構域配對，從而產生兩個抗原結合位點，兩個抗原可以是相同或不同的。

在另一個實施方案中，抗體片段是單鏈Fab片段。“單鏈Fab片段”或“scFab”是由VH，CH1，VL，CL和接頭組成的多肽，其中該各結構域和該接頭在N端至C端方向具有以下順序之一：a)VH-CH1-接頭-VL-CL，b)VL-CL-接頭-VH-CH1，c)VH-CL-接頭-VL-CH1或d)VL-CH1-接頭-VH-CL。在一個實施方案中，該接頭是具有至少30個胺基酸的多肽。 在另一個實施方案中，該接頭是具有32至50個胺基酸之間的多肽。該單鏈Fab片段經由CL和CH1之間的天然二硫鍵而被穩定化。另外，藉由插入半胱胺酸殘基(例如在重鏈可變區中的位置44和輕鏈可變區中的位置100，根據Kabat編號)產生鏈間二硫鍵，這些單鏈Fab分子可以進一步被穩定化。

在另一個實施方案中，抗體片段是單鏈可變片段(scFv)。“scFv”是包含至少一個含有輕鏈可變區的抗體片段和至少一個含有重鏈可變區的抗體片段的融合蛋白，其中輕鏈可變區和重鏈可變區藉由短的柔性肽接頭連續連接，能夠表達為單鏈多肽，並且其中scFv保持其所源自的完整抗體的特異性。除非特別指出，否則在本文中scFv可以以任何一種順序具有VL和VH可變區，例如相對於多肽的N端和C端，scFv可以包含VL-接頭-VH或可以包含VH-接頭-VL。

在另一個實施方案中，抗體片段是由VH和CH1結構域組成的Fd片段。

在另一個實施方案中，抗體片段是由抗體的單臂的VH和VL結構域組成的Fv片段。

在另一個實施方案中，抗體片段是dsFv，dsFv是藉由將其中每個VH和VL中的一個胺基酸殘基被半胱胺酸殘基取代的多肽經由半胱胺酸殘基之間的二硫鍵相連而獲得的。可以按照已知方法(Protein Engineering.7：697(1994))基於抗體的三維結構預測來選擇被半胱胺酸殘基取代的胺基酸殘基。

在另一個實施方案中，抗體片段是單域抗體，單域抗體是包含抗體的整個或部分重鏈可變域或整個或部分輕鏈可變域的抗體片段。

在另一個實施方案中，抗體片段是結構域抗體(domain antibody,dAb)；參見例如美國專利No.6,248,516。結構域抗體(dAb)為抗體的功能結合結構域，其對應於人抗體的重(VH)或輕(VL)鏈的可變區。dAB具有約13kDa的分子量、或者為小於完整抗體大小十分之一。dAB良好地表達於包括細菌、酵母和哺乳動物細胞體系的各種宿主中。此外，即使經歷嚴厲條件下，例如凍乾或者熱變性，dAb高度穩定和保持活性。參見例如，美國專利6,291,158；6,582,915；6,593,081；6,172,197；美國系列No.2004/0110941；歐洲專利0368684；美國專利6,696,245；WO04/058821；WO04/003019和WO03/002609。

在某些實施方案中，本文中提供的抗體是嵌合抗體。在一個例子中，嵌合抗體包含非人可變區(例如自小鼠、大鼠、倉鼠、家兔、或非人靈長類，諸如猴衍生的可變區)和人恆定區。在又一個例子中，嵌合抗體是“類轉換的”抗體，其中類或亞類已經自親本抗體的類或亞類改變。

在某些實施方案中，抗體是人源化抗體。通常，將非人抗體藉由人源化以降低對人的免疫原性，同時保留親本非人抗體的特異性和親和力。一般地，人源化抗體包含一個或多個可變區，其中CDR或其部分衍生自非人抗體，而FR或其部分衍生自人抗體。視需要地，人源化抗體還會包含人恆定區的一部分。在一些實施方案中，可將人源化抗體中的一些FR殘基用來自非人抗體(例如提供CDR序列的抗體)的相應殘基替代。

人源化抗體及其生成方法綜述於如Almagro and Fransson,Front.Biosci.13：1619-1633(2008)，並且進一步記載於如Riechmann等，Nature 332：323-329(1988)；Queen等，Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 86：10029-10033(1989)；美國專利No.5,821,337,7,527,791,6,982,321和7,087,409；Kashmiri等，Methods 36：25-34(2005)(描述了特異性決定區(SDR)嫁接)；Padlan,Mol.Immunol.28：489-498(1991)(描述了“再表面”(resurfuacing))；Dall’Acqua等，Methods 36：43-60(2005)(描述了“FR改組”)；和Osbourn等，Methods 36：61-68(2005)和Klimka等，Br.J.Cancer 83：252-260(2000)(描述了FR改組的“引導選擇”方法)。

可以用於人源化的人框架區包括但不限於：使用“最佳擬合(best-fit)”方法選擇的框架區(見例如Sims等，J.Immunol.151：2296(1993))；衍生自輕鏈可變區或重鏈可變區的特定亞組的人抗體的共有序列的框架區(見例如Carter等Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89：4285(1992)；和Presta等，J.Immunol.,151：2623(1993))；人成熟的(體細胞突變的)框架區或人種系框架區(見例如Almagro and Fransson,Front.Biosci.13：1619-1633(2008))；和藉由篩選FR文庫獲得的框架區(見例如Baca 等，J.Biol.Chem.272：10678-10684(1997)和Rosok等，J.Biol.Chem.271：22611-22618(1996))。

C.抗體的修飾

在某些實施方案中，涵蓋本文中提供的抗體的胺基酸序列變體。例如，可以期望改善抗體的結合親和力和/或其它生物學特性。可以藉由將合適的修飾引入編碼抗體的核苷酸序列中，或者藉由肽合成來製備抗體的胺基酸序列變體。此類修飾包括例如對抗體的胺基酸序列內的殘基的 刪除、和/或插入、和/或替代。可以進行刪除、插入、和替代的任何組合以得到最終的構建體，只要最終的構建體擁有期望的特徵，例如抗原結合。

a)替代、插入和刪除變體

在某些實施方案中，提供了具有一處或多處胺基酸替代的抗體變體。替代誘變感興趣的位點包括CDR和FR。保守替代在表2中在“較佳的替代”的標題下顯示。更實質的變化在表2中在“示例性替代”的標題下提供，並且如下文參照胺基酸側鏈類別進一步描述的。可以將胺基酸替代引入感興趣的抗體中，並且對產物篩選期望的活性，例如保留/改善的抗原結合，降低的免疫原性，或改善的ADCC或CDC。

依照常見的側鏈特性，胺基酸可以如下分組：

(1)疏水性的：正亮胺酸，Met，Ala，Val，Leu，Ile；

(2)中性，親水性的：Cys，Ser，Thr，Asn，Gln；

(3)酸性的：Asp，Glu；

(4)鹼性的：His，Lys，Arg；

(5)影響鏈取向的殘基：Gly，Pro；

(6)芳香族的：Trp，Tyr，Phe。

非保守替代會需要用這些類別之一的成員替換另一個類別的成員。

在某些實施方案中，替代、插入或缺失可以在一個或多個CDR內發生，只要此類變化不實質性降低抗體結合抗原的能力。例如，可以對CDR做出保守變化(例如保守替代，如本文中提供的)，其不實質性降低結合親和力。此類變化可以例如在CDR中的抗原接觸殘基外部。在上文提供的變體VH和VL序列的某些實施方案中，每個CDR是未改變的，或者含有不超過1、2或3處胺基酸替代。

一種可用於鑑定抗體中可以作為誘變靶位的殘基或區域的方法稱作“丙胺酸掃描誘變”，如由Cunningham and Wells(1989)Science,244：1081-1085所描述的。在這種方法中，鑑定一個殘基或殘基組(例如帶電荷的殘基，諸如Arg、Asp、His、Lys和Glu)，並且用中性或帶負電荷的胺基酸(例如，Ala或聚丙胺酸)替換以確定該抗體與抗原的相互作用是否受影響。可以在對初始替代顯示功能敏感性的胺基酸位置引入進一步的替代。此外，可藉由研究抗原-抗體複合物的晶體結構來鑑定抗體與抗原間的接觸點。這些接觸殘基及鄰近殘基可以作為替代候選物被打靶或消除。可以篩選變體以確定它們是否含有期望的特性。

胺基酸序列插入包括在胺基和/或羧基端融合長度範圍為1個殘基至100或更多個殘基的多肽，和單個或多個胺基酸殘基的序列內插入。末端插入的例子包括具有N端甲硫胺醯基殘基的抗體。抗體分子的其它插 入變體包括抗體的N或C端與酶或延長抗體的血清半衰期的多肽的融合物。

b)Fc區修飾

在某些實施方案中，可以將一個或多個胺基酸修飾引入本文所提供的抗體的Fc區中。

在一些實施方案中，該一個或多個胺基酸修飾可減少Fc與Fc受體的結合，例如其與Fcγ受體的結合，並且降低或消除效應子功能。在一些實施方案中，改造的Fc區與天然Fc區相比，對Fc受體的結合親和力下降50%、80%、90%或95%以上。在一些實施方案中，該Fc受體是人Fcγ受體，例如FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIB、FcγRIIIa。在一些實施方案中，改造的Fc區與天然Fc區相比，對補體，如C1q的結合親和力也降低。在一些實施方案中，改造的Fc區與天然Fc區相比，對新生兒Fc受體(FcRn)的結合親和力增強；比如在Fc區引入M252Y/S254T/T256E突變。在一些實施方案中，改造的Fc區具有降低的效應子功能，該降低的效應子功能可以包括但不限於以下中的一個或多個：降低的補體依賴性細胞毒性(CDC)、降低的抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)、降低的抗體依賴性細胞吞噬(ADCP)、減少的細胞因子分泌、減少的免疫複合物介導的抗原呈遞細胞的抗原攝取、減少的與NK細胞的結合、減少的與巨噬細胞的結合、減少的與單核細胞的結合、減少的與多形核細胞的結合、減少的直接信號傳導誘導性細胞凋亡、降低的樹突細胞成熟或減少的T細胞引發。對於IgG₁ Fc區，在238、265、269、270、297、327和329等位置的胺基酸殘基取代可降低的效應子功能。在一些實施方案中，該Fc區是人IgG₁ Fc區，並且在234和235位置的胺基酸殘基為A，編號依據為EU索引。對於IgG₄ Fc區，在228等位置的胺基酸殘基取代可降低的效應子功能。

在某些實施方案中，抗體包含具有改善ADCC的一處或多處胺基酸替代，例如在Fc區的位置298、333、和/或334(採用EU編號系統)的替代。

在某些實施方案中，本文中的抗體的Fc域包含“杵臼”突變。“杵臼”是一種用於工程化改造抗體重鏈同二聚體進行異二聚化(例如為了有效生成雙特異性抗體，多特異性抗體，或獨臂抗體)的設計策略。一般地，此類技術牽涉在第一多肽(諸如第一抗體重鏈中的第一CH3域)的界面處引入隆起(“杵”)和在第二多肽(諸如第二抗體重鏈中的第二CH3域)的界面對應處引入空腔(“臼”)，使得隆起能安置在空腔中從而促進異二聚體形成，並阻礙同二聚體形成。藉由將來自第一多肽(諸如第一抗體重鏈中的第一CH3域)的界面的較小胺基酸側鏈用較大側鏈(例如精胺酸，苯丙胺酸，酪胺酸或色胺酸)替換來構建隆起。藉由將較大胺基酸側鏈用較小側鏈(例如丙胺酸，絲胺酸，纈胺酸，或蘇胺酸)替換在第二多肽(諸如第二抗體重鏈中的第二CH3域)的界面中創建與隆起相同或相似尺寸的補償性空腔。可以藉由改變編碼多肽的核酸(例如藉由位點特異性誘變)或藉由肽合成來生成隆起和空腔。在一些實施方案中，杵修飾包含Fc域的兩個亞基之一中的胺基酸替代T366W，而臼修飾包含Fc域的兩個亞基之中的另一中的胺基酸替代T366S、L368A和Y407V。在一些實施方案中，Fc域的包含杵修飾的亞基另外包含胺基酸替代S354C，而且Fc域的包含臼修飾的亞基另外包含胺基酸替代Y349C。引入這兩個半胱胺酸殘基導致形成Fc區的兩個亞基之間的二硫橋，如此進一步穩定二聚體(Carter,J.Immunol.Method.s 248：7-15(2001))。杵臼突變的例示性組合包括但不限於表3中所述。

關於杵臼技術的細節描述於例如美國專利No.5,731,168；美國專利No.7,695,936；WO 2009/089004；US 2009/0182127：Marvin and Zhu,Acta Pharmacologica Sincia(2005)26(6)：649-658；Kontermann,Acta Pharmacologica Sincia(2005)26：1-9；Ridgway等，Prot Eng 9：617-621(1996)；和Carter,J Immunol Meth 248：7-15(2001)。

Fc區的C末端可以是以胺基酸殘基PGK結束的完整C末端；也可以是截短的C末端，例如在該截短的C末端中已經去除了一個或兩個C末端胺基酸殘基。在一個較佳的方面中，重鏈的C末端是以PG結束的截短的C末端。因此，在一些實施方案中，完整抗體的組成物可以包括去除了所有K447殘基和/或G446+K447殘基的抗體群體。在一些實施方案中，完整抗體的組成物可以包括沒有去除K447殘基和/或G446+K447殘基的抗體群體。在一些實施方案中，完整抗體的組成物包含帶有和不帶有K447殘基和/或G446+K447殘基的抗體混合物。

D.重組方法

抗DLL3抗體可以使用重組方法來產生。對於這些方法，提供編碼抗體的一個或更多個分離的核酸。

在一個實施方案中，本揭露提供了編碼如前所述的抗體的分離的核酸。此類核酸可以給自獨立的編碼前述的任一多肽鏈。在另一方面 中，本揭露提供了包含此類核酸的一種或多種載體(例如表達載體)。在另一方面中，本揭露提供了包含此類核酸的宿主細胞。在一個實施方案中，提供製備抗DLL3抗體的方法，其中該方法包括，在適合表達的條件下，培養包含編碼該抗體的核酸的宿主細胞，如上文所提供的，和視需要地從宿主細胞(或宿主細胞培養基)回收該抗體。

為了重組產生抗體，將編碼抗體的核酸分離並插入一個或更多個載體中，用於在宿主細胞中進一步選殖和/或表達。此類核酸可以使用常規程序容易地分離和測序，或者藉由重組方法產生或藉由化學合成獲得。

用於選殖或表達編碼抗體的載體的適當宿主細胞包括本文描述的原核或真核細胞。例如，可在細菌中產生，特別是當不需要糖基化和Fc效應子功能時。在表達後，可以在可溶級分中從細菌細胞糊狀物分離，並且可進一步純化。

E.測定

本文提供的多肽或偶聯物可以藉由本領域已知的多種測定法對其物理/化學特徵和/或生物學活性進行鑑定、篩選或表徵。在一個方面中，例如藉由已知方法如ELISA、蛋白印跡法等，測試本揭露的多肽或偶聯物活性。

F.治療方法與施用途徑

本文提供的前述任何抗DLL3抗體、包含其的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽可用於治療疾病。

在一個方面，本揭露提供抗DLL3抗體、包含其的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽在製備藥物中的用途。在一些實施方案中，本揭露提供的抗DLL3抗體、包含其的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受 的鹽在製備用於治療腫瘤或癌症的藥物中的用途。在一些實施方案中，其中該腫瘤或癌症包括但不限於肺癌(例如小細胞肺癌、非小細胞肺癌、大細胞肺癌)、頭和頸鱗狀細胞癌、頭和頸癌、腦癌、神經膠質瘤、多形性成膠質細胞瘤、神經母細胞瘤、中樞神經系統癌、神經內分泌腫瘤、咽喉癌、咽鱗癌、口腔鱗癌、鼻咽癌、食管癌、甲狀腺癌(例如甲狀腺髓樣癌)、惡性胸膜間皮瘤、乳腺癌(例如三陰性乳腺癌)、肝癌、肝膽癌、胰腺癌、胃癌、胃腸道癌、腸癌、結直腸癌(例如結腸癌和直腸癌)、腎癌、透明細胞腎細胞癌、卵巢癌、子宮內膜癌、子宮頸癌、膀胱癌、前列腺癌、睾丸癌、腎上腺癌、膠質母細胞瘤、皮膚癌和黑色素瘤；較佳地，其中該腫瘤或癌症為小細胞肺癌。

在一些實施方案中，本揭露提供的抗DLL3抗體、包含其的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽在製備用於治療DLL3相關的疾病的藥物中的用途。

在一個此類實施方案中，該用途進一步包括向受試者施用治療有效量的至少一種另外的治療劑(例如一種、兩種、三種、四種、五種或六種另外的治療劑)。

在又一個的方面，提供包含該抗DLL3抗體或其藥物偶聯物的醫藥組成物，例如，其用於以上任何製藥用途或治療方法。在一個實施方案中，醫藥組成物包含本文提供的任何多肽或藥物偶聯物和藥學上可接受的載體。在另一個實施方案中，醫藥組成物還包含至少一種另外的治療劑。

本揭露的抗DLL3抗體或其藥物偶聯物可單獨使用或與其他試劑聯合用於治療。例如，本揭露的抗體可與至少一種另外的治療劑共同施用。

本揭露的抗DLL3抗體或其藥物偶聯物可藉由任何合適的手段施用，包括腸胃外、肺內和鼻內，並且如果需要局部治療，則病灶內施用。腸胃外輸注包括肌肉內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下施用。給藥可以藉由任何適當的途徑，例如，藉由注射，諸如靜脈內或皮下注射，這部分取決於施用是短期的還是長期的。本文考慮多種給藥時間方案，包括但不限於，單次或在多個時間點多次施用，推注施用和脈衝輸注。

本揭露的抗DLL3抗體或其藥物偶聯物將以符合良好醫療實踐的方式配製、給藥和施用。在此背景下考慮的因素包括所治療的具體病症、所治療的具體哺乳動物、個體患者的臨床狀況、病症的起因、試劑的遞送部位、施用方法、施用時間安排以及醫學從業者已知的其他因素。抗DLL3抗體或其藥物偶聯物可以與一種或更其它試劑一起配製。此類其它試劑的有效量取決於醫藥組成物中存在的量、病症或治療的類型以及其它因素。這些通常以與本文所述相同的劑量和施用路徑使用，或以本文所述劑量的約1至99%使用，或以其它劑量使用，並藉由經驗/臨床確定為合適的任何途徑使用。

為了預防或治療疾病，本揭露的抗DLL3抗體或其藥物偶聯物(當單獨使用或與一種或更多種其他另外的治療劑組合使用時)的適當的劑量將取決於待治療的疾病的類型，治療分子的類型，疾病的嚴重性和病程，是為預防還是治療目的施用，之前的治療，患者的臨床病史和對治療分子的響應，和主治醫師的判斷。治療分子恰當地以一次或經過一系列治療施用於患者。

G.製品

在本揭露的另一方面中，提供一種製品(如藥盒)，該製品包含可用於治療、預防和/或診斷上述病症的材料。該製品包含容器和在容器上 或與容器聯合的標簽或包裝插頁(package insert)。合適的容器包括，例如，瓶子、管形瓶、注射器、IV溶液袋等。容器可以自各種材料諸如玻璃或塑料形成。

容器單獨裝有本揭露的抗DLL3抗體或其藥物偶聯物、或與另一種組成物組合。容器可具有無菌的存取口(例如，容器可以是具有塞子的靜脈內溶液袋或管形瓶)。組成物中的至少一種活性試劑是本揭露的抗DLL3抗體或其藥物偶聯物。標簽或包裝插頁指示使用該組成物是來治療選擇的病況。

此外，製品可以包含：(a)其中裝有抗DLL3抗體或其藥物偶聯物的第一容器；和(b)其中裝有組成物的第二容器，其中該組成物包含另外的細胞毒性劑或其他方面的治療劑。

備選地，或另外地，製品可進一步包含第二(或第三)容器，該第二(或第三)容器包含藥學上可接受的緩衝液。從商業和用戶立場，它可進一步包括所需的其他材料，包括其他緩衝劑、稀釋劑、濾器、針頭和注射器。

實施例

以下結合實施例進一步描述本揭露，但這些實施例並非限制本發明的範圍。

本揭露實施例或測試例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，或按照原料或商品製造廠商所建議的條件。參見Sambrook等，分子選殖，實驗室手冊，冷泉港實驗室；當代分子生物學方法，Ausubel等著，Greene出版協會，Wiley Interscience，NY。未註明具體來源的試劑，為市場購買的常規試劑。

一、抗體的製備

實施例1：DLL3抗原及檢測用蛋白和穩轉細胞株的製備

將不同種屬的DLL3基因和人DLL1、DLL4基因轉染中國倉鼠卵巢細胞CHO-s細胞(Invitrogen,R80007)，構建表達不同種屬的DLL3蛋白的CHO-s細胞株，用於後續抗體的篩選和鑑定。相關蛋白胺基酸序列如下：

人DLL3全長蛋白(Uniprot，Q9NYJ7)：

SEQ ID NO：1

食蟹猴DLL3全長蛋白(Uniprot，A0A2K5WSR4)：

SEQ ID NO：2

大鼠DLL3全長蛋白(Uniprot，O88671)：

SEQ ID NO：3

小鼠DLL3全長蛋白(Uniprot，O88516)：

SEQ ID NO：4

人DLL1全長蛋白(Uniprot，O00548)：

SEQ ID NO：5

人DLL4全長蛋白(Uniprot，Q9NR61)：

SEQ ID NO：6。

1.1高表達DLL3、DLL1和DLL4細胞株構建

包含SEQ ID NO：1-6的pCDH慢病毒表達載體質粒(由GENEWIZ公司合成)，pCDH質粒分別與pVSVG，pCMV慢病毒包裝載體用Lipofectamine 3000(Invitrogen,L3000015)轉染試劑轉染至293T細胞(中科院細胞庫，GNHu17)中，收集含有病毒的培養基上清，過濾並進行超高速離心，棄去上清後，用0.2mL無菌PBS重新懸浮。使用濃縮後的病毒分別感染中國倉鼠卵巢細胞CHO-s(Invitrogen,R80007)，DMS53(ATCC,CRL-2062)和H82(ATCC,HTB-175)，經嘌呤黴素篩選兩至三週，再進行FACS單細胞分選。將挑選出的單株細胞株擴大培養，凍存。

1.2抗原的製備

以人DLL3(Uniprot,Q9NYJ7)、食蟹猴DLL3(Uniprot,A0A2K5WSR4)和小鼠DLL3(Uniprot,O88516)序列為模板，設計含有不同標簽的DLL3 ECD融合蛋白，分別選殖到pTT5載體上，經293E細胞表達後，獲得抗原。相關蛋白胺基酸序列如下：

1)His-hDLL3(ECD)：

SEQ ID NO：7

註：點劃線為部分信號肽序列，單劃線部分為his標簽和連接子，雙劃線部分為DLL3胞外區。

2)Fc-hDLL3(ECD)：

SEQ ID NO：8

註：點劃線部分為信號肽序列，單劃線部分為Fc標簽和連接子，雙劃線部分為DLL3胞外區。

3)hDLL3(ECD)-strep twin：

SEQ ID NO：9

註：點劃線部分為信號肽序列，雙劃線部分為DLL3胞外區，單劃線部分為strep twin標簽。

4)cynoDLL3(ECD)-strep twin：

SEQ ID NO：10

註：點劃線部分為信號肽序列，雙劃線部分為DLL3胞外區，單劃線部分為strep twin標簽。

5)mouDLL3(ECD)-strep twin：

SEQ ID NO：11

註：點劃線部分為信號肽序列，雙劃線部分為DLL3胞外區，單劃線部分為strep twin標簽。

實施例2：小鼠抗人DLL3單株抗體的製備

1.免疫

抗人DLL3單株抗體藉由免疫小鼠產生。實驗用SJL小鼠，雌性，6-8週齡(上海斯萊克實驗動物有限公司，動物生產許可證號：SCXK(滬)2017-0005)。飼養環境：SPF級。小鼠購進後，實驗室環境飼養1週，12/12小時光/暗週期調節，溫度20-25℃；濕度40-60%。將已適應環境的小鼠按以下方案免疫。

免疫方案：

第一組小鼠的免疫抗原為His-hDLL3(ECD)(SEQ ID NO：7)。用TiterMax® Gold Adjuvant(Sigma Cat No.T2684)與Thermo Imject® Alum(Thermo Cat No.77161)佐劑交叉免疫。抗原與佐劑TiterMax® Gold Adjuvant比例為1：1，抗原與佐劑Thermo Imject® Alum比例為3：1，50μg/隻/次(首次免疫)，25μg/隻/次(加強免疫)。抗原乳化後進 行接種，免疫時間為0、7、14、21天。於第7、第21天取血，用ELISA方法確定小鼠血清中的抗體滴度。在第4次免疫以後，選擇血清中抗體滴度高並且滴度趨於平臺的小鼠進行脾細胞融合。在進行脾細胞融合前3天加強免疫，腹膜內(i.p.)注射25μg/隻的生理鹽水配製的抗原溶液。

第二組小鼠的免疫抗原為DLL3 CHO-s和Fc-hDLL3(ECD)(SEQ ID NO：8)，免疫方式為細胞和蛋白抗原交替免疫。首次免疫DLL3 CHO-s細胞前，提前用TiterMax^® Gold Adjuvant(Sigma Cat No.T2684)0.1mL/隻注射小鼠腹膜內，半小時後每隻小鼠腹膜內注射0.1mL用生理鹽水稀釋至10⁸/mL濃度的細胞液。細胞吹散均勻後進行接種，時間為第0、14、28、42天。Fc-hDLL3(ECD)抗原用TiterMax® Gold Adjuvant(Sigma Cat No.T2684)與Thermo Imject® Alum(Thermo Cat No.77161)佐劑交叉免疫。抗原與佐劑TiterMax® Gold Adjuvant比例為1：1，抗原與佐劑Thermo Imject® Alum比例為3：1，50μg/隻/次(首次免疫)，25μg/隻/次(加強免疫)。hDLL3-Fc免疫時間為7、21、35、49天。於第14、35、49天取血，用ELISA方法確定小鼠血清中的抗體滴度。在第8次免疫以後，選擇血清中抗體滴度高並且滴度趨於平臺的小鼠進行脾細胞融合。在進行脾細胞融合前3天加強免疫，腹膜內(i.p.)注射50μg/隻的生理鹽水配製的hDLL3-Fc蛋白抗原溶液。

2.脾細胞融合

採用優化的電融合方法將脾淋巴細胞與骨髓瘤細胞Sp2/0細胞(ATCC® CRL-8287^TM)進行融合得到融合瘤細胞。

融合的融合瘤細胞以3-4×10⁵/mL的密度用完全培養基(含20% FBS、1×HAT、1×OPI的IMDM培養基)重新懸浮，150μL/孔種於96孔板中。37℃，5%CO₂孵育3-4天後，去除上清，加入200μL/孔的HT完 全培養基(含20%FBS、1×HT和1×OPI的IMDM培養基)，37℃，5%CO₂培養3天後進行篩選檢測。

3.融合瘤細胞篩選及抗體序列測定

根據融合瘤細胞生長密度，用結合DLL3蛋白的ELISA方法和結合DLL3 CHO-s細胞FACS方法進行融合瘤培養上清檢測。選擇結合人DLL3蛋白，猴DLL3蛋白以及DLL3 CHO-s細胞，同時不結合野生型CHO-s細胞的株及時進行凍存、擴增、保種和一到二次亞選殖直至獲得單細胞株。藉由以上實驗篩選得到融合瘤株mAb100和mAb6。

將融合瘤株擴培養，提取RNA，利用mouse-Ig的簡併引子進行反轉錄擴增(RT-PCR)，最後得到抗體的可變區序列。

mAb6重鏈可變區：

SEQ ID NO：12

mAb6輕鏈可變區：

SEQ ID NO：13

mAb100重鏈可變區：

SEQ ID NO：14

mAb100輕鏈可變區：

SEQ ID NO：15。

將鼠抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區分別選殖到包含SEQ ID NO：28所示的人IgG1重鏈恆定區和SEQ ID NO：29所示的κ輕鏈恆 定區的pTT 5載體質粒，然後轉染HEK293細胞，得到了抗DLL3的嵌合抗體M6CHI和M100CHI。

人IgG1重鏈恆定區：

SEQ ID NO：28

人κ輕鏈恆定區：

SEQ ID NO：29。

實施例3：鼠源抗DLL3單株抗體的人源化

藉由比對Kabat人類抗體重輕鏈可變區種系基因數據庫，分別挑選同源性高的重、輕鏈可變區種系基因作為模板，將鼠源抗體的CDR分別嫁接(graft)到相應的人源模板中，形成次序為FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的可變區序列。並對可變區的胺基酸進行回復突變，再與恆定區重組(示例性的，與SEQ ID NO：28所示的人IgG1重鏈恆定區和SEQ ID NO：29所示的人κ輕鏈恆定區)，獲得全長抗體。

mAb6抗體的人種系輕鏈模板為IGKV1-16*01，人種系重鏈模板為IGHV1-3*01、IGHV7-4-1*02和IGHV3-73*01。H100抗體的人種系輕鏈模板為IGKV1-27*01，人種系重鏈模板為IGHV3-11*01。

此外，對mAb100重鏈可變區的HCDR3：PLYYYGRSYNAVAY(SEQ ID NO：24)中的第4位胺基酸殘基由Y突變為H，第11位由A突變為G，獲得新的HCDR3：PLY H YGRSYNAVAY(SEQ ID NO：30)和PLYYYGRSYN G VAY(SEQ ID NO：31)。

獲得的人源化抗體可變區的序列如下：

hAb6 VH1(Q1E,R71V,T73K)

SEQ ID NO：32

hAb6 VH2(Q1E,I69L,R71V,T73K,S76N)

SEQ ID NO：33

hAb6 VH3(Q1E,M48I,V67A,I69L,R71V,T73K,S76N)

SEQ ID NO：34

hAb6 VH4(Q1E,Q43K，I69L,R71V,T73K,S76N)

SEQ ID NO：35

hAb6 VH5(Q1E,L71V,T73K,F69L)

SEQ ID NO：36

hAb6 VH6(Q1E,F69L,L71V,T73K,V75S,S76N)

SEQ ID NO：37

hAb6 VH7(F27Y,S30T,I69L,R71V,D73K,T93A)

SEQ ID NO：38

hAb6VH8(Graft IGHV1-3*01)

SEQ ID NO：39

hAb6VH9(Graft IGHV7-4-1*02)

SEQ ID NO：40

hAb6VH10(Graft IGHV3-73*01)

SEQ ID NO：41

hAb6VH11(Q1E,F69L,L71V,T73K,V75S,S76N，R38K)

SEQ ID NO：42

hAb6VH12(Q1E，V68A，F69L,L71V,T73K,V75S,S76N)

SEQ ID NO：43

hAb6VH13(Q1E,R38K，V68A，F69L,L71V,T73K,V75S,S76N)

SEQ ID NO：44

hAb6 VL1(F36L,S46G)

SEQ ID NO：45

hAb6 VL2(F36L,S46G,T69A,F71Y)

SEQ ID NO：46

hAb6 VL3(F36L,A43S,P44F,S46G,T69A,F71Y)

SEQ ID NO：47

hAb6 VL4(F36L,S46G,T69A,F71Y,T85D)

SEQ ID NO：48

hAb6VL5(Graft IGKV1-16*01)

SEQ ID NO：49

hAb100 VH1(Q1E,R94S)

SEQ ID NO：50

hAb100 VH2(Q1E,S49A,R94S)

SEQ ID NO：51

hAb100 VH3(Q1E,S49A,R94S,Y98H)

SEQ ID NO：52

hAb100 VH4(Q1E,S49A,R94S,A100eG)

SEQ ID NO：53

hAb100VH5(Graft IGHV3-11*01)

SEQ ID NO：54

hAb100 VL1(Graft IGKV1-27*01)

SEQ ID NO：55

hAb100 VL2(V43I)

SEQ ID NO：56。

註：單劃線部分為CDR區，雙劃線處為突變位點。

其中，X₁為Y或H；X₂為A或G。

示例性的人源化抗體的重、輕鏈可變區組合如下：

分別選殖、表達、純化上述抗體，經蛋白結合實驗(測試例1)、細胞結合實驗(測試例2)、Biacore(測試例4)，最終選出活性較好的人源化抗體。示例性的人源化抗體的重、輕鏈胺基酸序列如下：

Hu6(也稱hAb6L4H12)重鏈：

註：序列中下劃線部分為可變區，斜體部分為恆定區。

SEQ ID NO：58

Hu6(也稱hAb6L4H12)輕鏈：

註：序列中下劃線部分為可變區，斜體部分為恆定區。

SEQ ID NO：59

Hu100(也稱hAb100L1H1)重鏈：

註：序列中下劃線部分為可變區，斜體部分為恆定區。

SEQ ID NO：60

Hu100(也稱hAb100L1H1)輕鏈：

註：序列中下劃線部分為可變區，斜體部分為恆定區。

SEQ ID NO：61。

本揭露中使用的陽性對照分子為BI-764532(參照WO2019234220A1構建)，陰性對照為C25，其序列分別如下：

BI-764532重鏈：

註：序列中下劃線部分為可變區，斜體部分為恆定區。

SEQ ID NO：62

BI-764532輕鏈：

註：序列中下劃線部分為可變區，斜體部分為恆定區。

SEQ ID NO：63

C25重鏈：

SEQ ID NO：64

C25輕鏈：

SEQ ID NO：65。

註：序列中下劃線部分為可變區，斜體部分為恆定區。

二、化合物的製備

本揭露實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，或按照原料或商品製造廠商所建議的條件。未註明具體來源的試劑，為市場購買的常規試劑。

化合物的結構是藉由核磁共振(NMR)或質譜(MS)確定。NMR的測定使用Bruker AVANCE-400核磁儀，測定溶劑為氘代二甲基亞碸(DMSO-d6)、氘代氯仿(CDCl₃)、氘代甲醇(CD₃OD)，內標為四甲基矽烷(TMS)，化學位移是以10^-6(ppm)作為單位給出。

MS的測定使用FINNIGAN LCQAd(ESI)質譜儀(Thermo，型號：Finnigan LCQ advantage MAX)。

UPLC的測定使用Waters Acquity UPLC SQD液質聯用儀。

HPLC的測定使用安捷倫1200DAD高壓液相色譜儀(Sunfire C18 150×4.6mm色譜管柱)和Waters 2695-2996高壓液相色譜儀(Gimini C18 150×4.6mm色譜管柱)。

UV-HPLC的測定使用Thermo nanodrop2000紫外分光光度計。

薄層層析矽膠板使用煙臺黃海HSGF254或青島GF254矽膠板，薄層色譜法(TLC)使用的矽膠板採用的規格是0.15mm至0.2mm，薄層層析分離純化產品採用的規格是0.4mm至0.5mm矽膠板。

管柱層析一般使用煙臺黃海200至300目矽膠為載體。

本揭露的已知的起始原料可以採用或按照本領域已知的方法來合成，或可購買自ABCR GmbH & Co.KG，Acros Organnics，Aldrich Chemical Company，韶遠化學科技(Accela ChemBio Inc)、達瑞化學品等公司。

實施例中如無特殊說明，反應均在氬氣氛或氮氣氛下進行。

氬氣氛或氮氣氛是指反應瓶連接一個約1L容積的氬氣或氮氣氣球。

氫氣氛是指反應瓶連接一個約1L容積的氫氣氣球。

加壓氫化反應使用Parr 3916EKX型氫化儀和清藍QL-500型氫氣發生器或HC2-SS型氫化儀。

氫化反應通常抽真空，充入氫氣，重複操作3次。

微波反應使用CEM Discover-S 908860型微波反應器。

實施例中如無特殊說明，反應中的溶液是指水溶液。

實施例中如無特殊說明，反應的溫度為室溫，溫度範圍是20℃至30℃。

實施例中pH=6.5的PBS緩衝液的配製：取KH₂PO₄ 8.5g，K₂HPO₄.3H₂O 8.56g，NaCl 5.85g，EDTA 1.5g置於瓶中，定容至2L，超聲波使其全部溶解，搖勻即得。

純化化合物採用的管柱層析的沖提劑的體系和薄層色譜法的展開劑的體系包括：A：二氯甲烷和異丙醇體系，B：二氯甲烷和甲醇體系，C：石油醚和乙酸乙酯體系，溶劑的體積比根據化合物的極性不同而進行調節，也可以加入少量的三乙胺和酸性或鹼性試劑等進行調節。

本揭露部分化合物是藉由Q-TOF LC/MS來表徵的。Q-TOF LC/MS使用安捷倫6530精確質量數四級杆-飛行時間質譜儀和安捷倫1290-Infinity超高效液相色譜儀(安捷倫Poroshell 300SB-C8 5μm,2.1×75mm色譜管柱)。

本揭露抗體-藥物偶聯物的藥物部分可選擇本領域公知的細胞毒性藥物，示例性的藥物為WO2021218896A1(申請號：PCT/CN2021089838)中記載的海鞘素類衍生物，藉由援引完整收入本文。

本揭露中示例性的抗體-藥物偶聯物的合成路線如下。

實施例4-1. 化合物7的合成(接頭)

將化合物7-1(1.3g，採用WO2013106717A1公開方法製備而得)溶於50mL乙腈中，依次加入碳酸鉀(6.2g)、溴化苄(1.35mL)和四丁基碘化銨(415mg)。室溫攪拌，過濾，濃縮，以石油醚/乙酸乙酯為展開劑，用矽膠管柱色譜法純化得化合物7-2。

將化合物7-2(121mg)和7-3(180mg)加入反應瓶中，加入4mL四氫呋喃。氮氣氛下，冰水浴降溫至0℃左右，加入第三丁醇鉀(109mg，0.98mmol)，升至室溫攪拌40分鐘。加入10mL冰水，用乙酸乙酯(20mL×2)和氯仿(10mL×5)萃取，合併有機相並濃縮。所得殘餘物溶於4mL二噁烷中，加入2mL水，加入碳酸氫鈉(49.2mg，0.586mmol)和氯甲酸-9-芴甲酯(126mg，0.49mmol)，室溫攪拌2小時。加入20mL水，用乙酸乙酯(10mL×3)萃取，有機相用飽和氯化鈉溶液(20mL)洗滌，無水硫酸 鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮。以石油醚/乙酸乙酯為展開劑，用矽膠管柱色譜法純化得到化合物7-4，MS m/z(ESI)：515.0[M+1]⁺。

將化合物7-4(20mg，0.038mmol)溶於4.5mL四氫呋喃和乙酸乙酯(V：V=2：1)混合溶劑中，加入鈀碳(12mg，含量10%，乾型)，氫氣置換三次，室溫攪拌反應1小時。反應液用矽藻土過濾，濾餅用乙酸乙酯淋洗，濾液濃縮，得到粗品標題化合物7-5(13mg)，產品不經純化直接進行下一步反應。

MS m/z(ESI)：424.9[M+1]。

將化合物7-5(8.00g,18.9mmol,1eq)置於250mL三口瓶中，氮氣保護下加入乾燥的二氯甲烷(100mL)，攪拌溶解並冷卻至0℃，依次加入4-二甲膠基吡啶(250mg,2.05mmol)，2,4-二甲氧基苄醇(4.45g,26.5mmol)，1-(3-二甲基膠基丙基)-3-乙基碳二亞胺(5.04g,28.6mmol)，保持0℃攪拌反應4小時，加水(50mL)淬滅反應並升至室溫，甲基第三丁基醚(100mL)萃取兩次，合併有機相，用飽和氯化鈉溶液(50mL)洗，無水硫酸鈉乾燥，減壓濃縮至乾，得到化合物7-6粗品(13.1g)。

MS Calc：574.2，觀測值：575.0[M+H]⁺。

將化合物7-6粗品(13.1g)置於500mL反應瓶中，加入DCM(160mL)，攪拌溶解，加入二乙胺(80mL)，保持室溫15~18℃反應3小時，減壓濃縮至乾，得到粗品，用矽膠管柱層析分離，收集所需組分後蒸乾(水溫<35℃)得到化合物7-7油狀物(5.47g)，兩步收率82.2%。

MS Calc：352.2，觀測值：353.1[M+H]⁺。

將化合物7-7(4.36g,12.4mmol)，化合物7-8(7.03g,14.9mmol，6-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基)甘胺醯甘胺醯-L-苯丙胺酸，採用專利申請“EP2907824B1”中的實施例73中的方法製備而得)置於250mL反應瓶中，氮氣保護下加入乾燥的N,N-二甲基甲醯胺(50mL)，攪拌溶解並冷卻至0℃，加入4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基嗎啉鹽酸鹽(4.80g,16.3mmol)，升溫至18℃攪拌反應1h。冰水浴降溫，加水(150mL)淬滅反應，乙酸乙酯(300mL)萃取2次，有機相合併用飽和氯化鈉水溶液(50mL)洗一次；無水硫酸鈉乾燥；過濾，減壓濃縮至乾，粗品用矽膠管柱層析純化得不純的淡黃色固體7-9(6.02g)，將上述固體用甲 基第三丁基醚(60mL)打漿純化，得到化合物7-9(5.08g)，類白色固體，收率50.8%。

MS Calc：806.4，觀測值：807.2[M+H]⁺。

將化合物7-9(150mg,0.186mmol)置於50mL單口瓶中，氮氣保護下加入乾燥的二氯甲烷(6mL)，苯甲醚(60mg,0.558mmol)，攪拌並冷至0℃，加入二氯乙酸(0.24mL,2.9mmol)，受質溶解，保持0℃攪拌反應3-4小時；在反應液中加入甲基第三丁基醚(18mL)，保持0℃打漿攪拌30分鐘，過濾抽乾，固體加入甲基第三丁基醚(18mL)，室溫打漿攪拌30分鐘，過濾，抽乾得到化合物7(120mg,0.183mmol)，收率98%。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d⁶)δ 12.56(brs,1H),8.50(t,J=6.8Hz,1H),8.28(t,J=6.0Hz,1H),8.20-8.05(m,2H),8.00(t,J=5.6Hz,1H),7.30-7.15(m,5H),6.99(s,2H),4.65-4.40(m,3H),3.80-3.55(m,7H),3.45(d,J=7.6Hz,2H),3.10-3.00(m,1H),2.85-2.75(m,1H),2.11(t,J=7.6Hz,2H),1.55-1.40(m,4H),1.25-1.15(m,2H),1.05-0.95(m,1H),0.55-0.40(m,2H),0.40-0.30(m,2H)。

MS Cale：656.3，觀測值：679.2[M+Na]⁺。

實施例4-2. L-9的合成

稱取化合物8-6(50mg，0.063mmol，按照WO2021218896A1中的實施例8中記載的方法合成)，化合物7(85mg，0.13mmol)於反應瓶中，將體系用氮氣保護。加入N-甲基咪唑(21mg，0.25mmol)的乾燥的MeCN(4mL)溶液。將體系用冰水浴冷卻，然後滴加入TCFH(45mg，0.16mmol，N,N,N',N'-四甲基氯甲脒六氟磷酸鹽)的乾燥的MeCN(1mL)溶液。冰水浴中反應80分鐘，取樣LCMS檢測原料消耗完全。反應液用砂芯漏 斗抽濾。濾餅用乾燥的MeCN洗滌。合併濾液，減壓濃縮得到粗品經過管柱層析(甲醇/二氯甲烷=1：25)得到白色固體L-8-6約83mg，收率：92.22%。

MS Calc：1430.6，觀測值：1431.4[M+H]。

稱取化合物L-8-6(81mg，0.057mmol)，溶於乾燥的MeCN(7mL)中。加入AgNO₃(781mg，4.60mmol)的水(4.7mL)溶液。氮氣保護，避光室溫反應21小時，取樣LCMS檢測原料消耗完全。向反應液中加入飽和NaHCO₃水溶液(11.7mL)和飽和NaCl溶液(11.7mL)，劇烈攪拌30分鐘，矽藻土過濾。濾液用(MeOH/CHCl₃=1/10，20mL×3)萃取。合併 有機相，加入Na₂SO₄乾燥，過濾，減壓濃縮至乾得粗品，用prop-HPLC純化，得到白色固體L-9約52mg，收率：64.6%。

¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ 7.32-7.18(m,7H),6.97(d,J=8.4Hz,1H),6.75(s,2H),6.66(s,1H),6.25(s,1H),6.07(s,1H),5.23(d,J=11.2Hz,1H),4.77(s,1H),4.62-4.56(m,4H),4.50(dd,J=6.0,8.4Hz,1H),4.41(s,1H),4.18(d,J=10.8Hz,1H),3.87-3.55(m,12H),3.45(t,J=6.8Hz,2H),3.27(s,3H),3.22-3.17(m,2H),3.05-2.88(m,3H),2.79(d,J=15.2Hz,1H),2.65-2.59(m,2H),2.39(s,3H),2.37(s,3H),2.29(s,3H),2.24(t,J=7.6Hz,2H),2.12(d,J=15.9Hz,1H),2.03(s,4H),1.63-1.50(m,4H),1.31-1.23(m,2H),1.01-0.95(m,1H),0.44-0.22(m,3H)，-0.09--0.14(m,1H)。

三、ADC的製備

實施例5-1. ADC-1的製備

在37℃條件下，向抗體Hu6的PBS緩衝水溶液(pH=6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液；10.0mg/mL，3.6mL，243.1nmol)加入配置好的三(2-羧乙基)膦(TCEP鹽酸鹽)的水溶液(10mM，67.5μL，675nmol)，置於水浴振盪器，於37℃下振盪反應3小時，停止反應。將反應液用水浴降溫至25℃。

將化合物L-9(3.46mg，2431nmol)溶解於170μL DMSO中，加入到上述反應液中，置於水浴振盪器，於25℃下振盪反應3小時，停止 反應。將反應液用Sephadex G25凝膠管柱脫鹽純化(沖提相：pH為6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液)，得到標題產物ADC-1的PBS緩衝液(2.83mg/mL，16.0mL)，於4℃儲存。

使用HIC的方法計算各批次ADC-1的藥物載藥量，其DAR值為：n=3.73-4.27。

實施例5-2. ADC-2的製備

在37℃條件下，向抗體Hu100的PBS緩衝水溶液(pH=6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液；10.0mg/mL，4.0mL，270.1nmol)加入配置好的三(2-羧乙基)膦(TCEP鹽酸鹽)的水溶液(10mM，75.1μL，751nmol)，置於水浴振盪器，於37℃下振盪反應3小時，停止反應。將反應液用水浴降溫至25℃。

將化合物L-9(3.84mg，2701nmol)溶解於190μL DMSO中，加入到上述反應液中，置於水浴振盪器，於25℃下振盪反應3小時，停止反應。將反應液用Sephadex G25凝膠管柱脫鹽純化(沖提相：pH為6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液)，得到標題產物ADC-2的PBS緩衝液(3.52mg/mL，16.0mL)，於4℃儲存。

使用HIC的方法計算各批次ADC-2的藥物載藥量，其DAR值為：n=3.72-4.88。

ADC原液藥物載藥量分析

ADC是一種抗體-藥物偶聯物，其治療疾病的機理是依賴抗體的靶向性將藥物運送到細胞中，進而將細胞殺死或抑制細胞生長。藥物的載藥量對藥效起著決定性的作用。

本揭露採用HIC法分析藥物載藥量，過程基本如下：

試劑和儀器：

硫酸銨：國藥生產，500mg/瓶；異丙醇：LC級，4L/瓶，Thermo Fisher生產；無水磷酸二氫鈉：國藥生產，500mg/瓶。

高效液相色譜儀：Agilent 1260。

溶液配製：

流動相A(50mM無水磷酸二氫鈉溶液，pH7.0)：量筒量取1000mL純化水，加入6.49g無水磷酸二氫鈉固體，攪拌混勻調節pH至7.0後過濾使用，2-8℃保存14天。

流動相B(2M硫酸銨溶解在50mM無水磷酸二氫鈉溶液中，pH7.0)：在配製好的50mM無水磷酸二氫鈉溶液裡加入264.3g硫酸銨固體，充分攪拌混勻後過濾使用，2-8℃保存14天。

流動相C(IPA)：1L異丙醇。

裸抗和供測試樣品(濃度為1mg/mL，約200μL)，待進樣使用。

色譜條件：

色譜管柱：TSKgel Butyl-NPR 4.6mm*10cm 2.5μm；

管柱溫：30℃；

DAD檢測器；檢測波長280nm(370nm)；

樣品室溫度：4℃；流速：0.5mL/min；進樣量為：40μL；

色譜梯度：A%(起始35%-15min 75%-20min75%)；C%(起始5%-15min 25%-20min25%)。

數據分析：

藉由樣品與裸抗的譜圖比對，區分DAR0、DAR2、DAR4、DAR6、DAR8的位置，然後對檢測樣品的譜圖進行積分，根據峰面積計算出DAR值。計算公式如下：

DAR=Σ(連接藥物數*峰面積百分比)/峰面積總和。

以下用生化測試方法驗證本揭露的抗體及ADC的活性。

測試例1：蛋白水平的ELISA結合實驗

將鏈酶親和素(abcam，ab136200，1μg/mL)包板，100μL/孔，4℃過夜。用PBST溶液(PBS含0.1%吐溫20)250μL/孔，洗板3次。5%牛奶封閉，250μL/孔，37℃封閉2小時。用PBST溶液250μL/孔，洗板3次。加入生物素化的DLL3抗原(1μg/mL)(SEQ ID NO：9)，37℃孵育1小時。使用PBST溶液250μL/孔，洗板3次。配製抗體Hu6，Hu100，BI- 764532和C25(陰性抗體)(最高濃度100nM，4倍梯度稀釋)，37℃孵育1小時。使用PBST溶液250μL/孔，洗板6次。加入工作濃度的human IgG(H+L)-HRP(Jackson,109-035-003，1：4000稀釋)抗體，100μL/孔，37℃孵育1小時。使用PBST溶液250μL/孔，洗板6次。加入TMB(KPL,5120-0077)顯色液100μL/孔，室溫顯色5-10分鐘。加入1M H₂SO₄，100μL/孔，中止顯色，酶標儀(Molecular Devices,VERSA max)450nm讀數。

結果顯示：抗體Hu6和Hu100均對DLL3具有優異的結合能力。

測試例2：細胞水平的FACS結合實驗

將表達DLL3的小細胞肺癌細胞系H1184(ATCC，貨號CRL-5858)、DLL3/H82、cynoDLL3/CHO-s和RatDLL3/CHO-s細胞用FACS緩衝液(1%BSA+pH 7.4 PBS)製備成1×10⁶/mL的細胞懸液，100μL/孔加入96孔圓底板(Corning，3795)中。300g離心5分鐘，去除上清。加入不同濃度待測抗體，100μL/孔。放於4℃冰箱中避光孵育1小時。300g離心洗滌3次後，加入工作濃度的APC抗人IgG Fc(BioLegend，410712)或者PE F(ab')2-羊抗人IgG(invitrogen,H10104)，放於4℃冰箱中避光孵育40分鐘。300g離心洗滌3次後，在Invitrogen流式細胞儀上檢測幾何平均數螢光強度，計算抗體對表達DLL3的細胞的結合EC50值。結果見表11- 1、表11-2、表11-3和圖1A至圖1C。

結果顯示：本揭露中的抗體均能與細胞表達的DLL3特異性結合，其中，Hu6與表達不同種屬的DLL3細胞均具有較高的結合能力。Hu100對表達人和食蟹猴的DLL3的細胞均具有優異的結合能力，但Hu100不結合表達大鼠DLL3的細胞。BI-764532僅與表達人和食蟹猴DLL3的細胞具有結合能力，且其結合活性比Hu6和Hu100弱。

測試例3：DLL1和DLL4結合實驗

將穩轉人DLL1/CHO-s和人DLL4/CHO-s細胞用FACS緩衝液(包含1%BSA和pH7.4 PBS)製備成1×10⁶/mL的細胞懸液，100μL/孔 加入96孔圓底板(Corning，3795)中。300g離心5分鐘，去除上清。加入待檢測的抗體，100μL/孔，放於4℃冰箱中避光孵育1小時。300g離心洗滌3次後，加入工作濃度的PE F(ab')2-羊抗人IgG Fc二抗(invitrogen,H10104)，放於4℃冰箱中避光孵育40分鐘。300g離心洗滌3次後，在Invitrogen流式細胞儀上檢測幾何平均數螢光強度。

結果顯示：抗體Hu6和Hu100均不結合人DLL1和DLL4。

測試例4：Biacore抗體親和力測定

用Protein A生物傳感芯片(Cat.# 29127556，Cytiva)親和捕獲待測抗體18秒，然後於芯片表面流經抗原人DLL3(ACRO，DLL3-H52H4)，食蟹猴DLL3(KACTUS，DLL-RM103)和小鼠DLL3(KACTUS，DLL-MM103)180秒，然後解離600秒。用Biacore 8K(Cytiva)儀器實時檢測反應信號獲得結合和解離曲線。在每個實驗循環解離完成後，用10mM甘胺酸-鹽酸溶液(pH 1.5)(Cat.# BR-1003-54，Cytiva)將生物傳感芯片洗淨再生。數據擬合模型採用1：1 Model。結果見表12-1、表12-2和表12-3。

結果顯示，mAb100和mAb6的人源化抗體和嵌合抗體可特異性結合人DLL3，且親和力較高。其中抗體Hu6與人、食蟹猴和小鼠的DLL3均具有較高的親和力；Hu100與人和食蟹猴DLL3具有較高的親和力，但不結合小鼠的DLL3。

測試例5：抗體的表位競爭結合實驗

將BI-764532抗體(1μg/mL)包板，100μL/孔，4℃過夜。PBST溶液250μL/孔，洗板3次。5%牛奶封閉，250μL/孔，37℃封閉2小時。PBST溶液250μL/孔，洗板3次。加入生物素化的DLL3-Strep(0.1μg/mL，SEQ ID NO：9)。配製競爭抗體，BI-764532、Hu6和Hu100(最高濃度100μg/mL，4倍梯度稀釋)，37℃孵育1小時。PBST溶液250μL/孔，洗板6次。加入鏈黴親和素-過氧化物酶(1：2000稀釋)(Jackson Immuno Research,016-030-084)，100μL/孔，37℃孵育1小時。PBST溶液250μL/孔，洗板6次。加入TMB(KPL,5120-0077)顯色液100μL/孔，室溫顯色 5-10min。加入1M H₂SO₄，100μL/孔，中止顯色，酶標儀450nm讀數。結果如圖2所示。

結果顯示，抗體Hu6和Hu100與BI-764532之間不競爭，說明抗體Hu6和Hu100與BI-764532結合的表位不同。

測試例6：抗DLL3抗體的內吞活性檢測

DT3C是重組表達的融合蛋白，由白喉毒素的片段A(僅毒素部分)和G群鏈球菌的3C片段(IgG結合部分)融合而成，該蛋白能夠與抗體的IgG部分高度親和，在抗體被內吞時一同進入細胞，在胞內弗林蛋白酶的作用下，釋放出具有毒性的DT，DT能夠抑制EF2-ADP核糖基化的活性，阻斷蛋白翻譯過程，最終導致細胞死亡。而未進入細胞的DT3C則不具有殺傷細胞的活性。根據對細胞殺傷情況評價抗體的被細胞內吞的活性。

實驗步驟

a.用含20% FBS的新鮮細胞培養基RPMI1640(GE，SH30809.01)製取DMS53/DLL3細胞懸液，以2000個細胞/50μL/孔加入96孔細胞培養板中，第1和12列不鋪細胞只加入50μL的培養基，5%二氧化碳37℃ 16小時培養。

b.用無血清培養基配製成4×濃度的DT3C(9600nM，由上海磐超生物科技有限公司表達純化)溶液，並使用0.22μm濾器過濾。用無血清培養基配製4×濃度的抗體(1600nM)，將80μL DT3C溶液和80μL抗體溶液按照1：1的體積混勻，室溫下靜置孵育30分鐘。

c.用無血清培養基5倍梯度稀釋該混合物，共9個濃度，第10個點為純培養基。

d.取50μL稀釋好的抗體加入細胞中，培養箱中孵育三天。

e.每孔加入50μL CTG(CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay，Promega，G7573)，室溫下避光孵育10分鐘，Victor3上讀取化學發光。

結果見下表13和圖3。

結果顯示：抗體Hu6和Hu100均可被細胞內吞。

測試例7：ADC對不同DLL3表達水平細胞毒性實驗

實驗步驟如下：

a.用含10% FBS的新鮮細胞培養基製取細胞懸液，以每孔135μL加入到96孔細胞培養板(Corning，3903)中，第1和第12列不鋪細胞，只加入135μL的培養基，5%二氧化碳37℃培養16小時。

b. ADC樣品用PBS配製成首孔工作液(10×濃度)，以此為首濃度，用PBS按相應的倍數進行梯度稀釋。每孔加入15μL的10×濃度ADC溶液，5%二氧化碳37℃培養6天。

c.每孔加入70μL CTG(Promega，G7573)，室溫下避光孵育10分鐘，Victor3上讀取化學發光，用GraphPad Prism5對數據處理，以抗體或ADC濃度為X軸，光強度值為Y軸作圖。

不同細胞的鋪板密度、首孔工作液濃度(10×濃度)，稀釋倍數見表14。

實驗使用的細胞如下：

DMS53(+)購於ATCC，CRL-2062；

H1184(+++)購於ATCC，CRL-5858；

U-2OS(-)購於ATCC，HTB-96，

HT-29(-)購於ATCC，HTB-38；

CHO-K1(-)購於ATCC，CCL-61。

其中“+”表示DLL3的表達量，“-”表示不表達DLL3。

結果見表15和圖4A至圖4E。

結果顯示，ADC-1和ADC-2有較強的靶細胞殺傷活性，可殺傷表達DLL3的DMA53和H1184，但對DLL3陰性的U-2OS、HT-29和CHO-K1細胞無殺傷。

測試例8：旁路殺傷活性實驗

DMS53/DLL3high(穩轉DLL3的DMS53細胞)和U-2OS(ATCC，HTB-96)細胞分別用RPMI1640+20%FBS+1×Glutamax和McCoy's 5A+10%FBS培養，細胞用胰酶消化，新鮮培養基中和，1000rpm離心3分鐘。棄上清，細胞用RPMI1640+20%FBS+1×Glutamax重新懸浮。細胞計數後，將DMS53/DLL3high細胞密度調整為9×10⁴個/mL，將U-2OS細胞密度調整為3×10⁴個/mL。12孔板對應孔中每孔加入500μL的DMS53/DLL3high細胞和500μL的U-2OS細胞。12孔板對應孔中加入500μL的U-2OS細胞和500μL的RPMI1640+20%FBS+1×Glutamax培養液。5%二氧化碳37℃培養24小時。將樣品配製成40×濃度的中間溶液(200nM)。各取25μL上述ADC樣品加入到12孔板相應孔中。設置溶劑對照組。5%二氧化碳37℃培養6天。12孔板中的細胞用胰酶消化，新鮮培養基中和，取20μL的細胞加入20μL的台盼藍，計數。細胞1000rpm離 心3分鐘，棄上清。細胞用100μL的FACS緩衝液洗一遍，1500rpm離心3分鐘，棄上清。用100μL的FACS緩衝液重新懸浮，加入2μg/mL的抗DLL3的陽性抗體，冰上孵育60min。FACS緩衝液洗1遍，1500rpm離心3分鐘，加入二抗APC anti-human IgG Fc(100x)孵育30分鐘，FACS緩衝液洗1遍。加入200μLFACS緩衝液重新懸浮細胞，用FACS檢測。用FlowJo對流式數據進行分析得到DMS53/DLL3high比例並計算出DMS53/DLL3high及U-2OS的總數量。用GraphPad Prism5對數據作圖，以不同樣品為X軸，計算得到的細胞數為Y軸作圖，結果見圖5。

結果顯示ADC-1和ADC-2具有明顯的旁觀者細胞毒性效應。

體內活性生物學評價

測試例9：DMS53細胞CDX小鼠模型體內藥效評價

將人小細胞肺癌DMS53細胞(5×10⁶個，含50%基質膠/隻；ATCC，CRL-2062)200μL/隻，接種Balb/c右肋部皮下。接種21天後，待腫瘤體積為約200mm³後，去除體重、腫瘤過大和過小的，按腫瘤體積將小鼠隨機分組，每組8隻，當天開始給藥。藉由腹腔注射ADC，劑量為1.8mg/kg，每週給藥1次，共給藥2次。每週測量2次瘤體積和體重，記錄數據。使用Excel統計軟體記錄數據：平均值以avg計算；SD值以STDEV計算；SEM值以STDEV/SQRT(每組動物數)計算；採用GraphPad Prism軟體作圖，採用Two-way ANOVA或One-way ANOVA對數據進行統計學分析。

腫瘤體積(V)計算公式為：V=1/2×L_長×L_短 ²

相對腫瘤增殖率T/C(%)=(T-T₀)/(C-C₀)×100%，其中T、C為實驗結束時治療組和對照組的腫瘤體積；T₀、C₀為實驗開始時的腫瘤體積。

抑瘤率TGI(%)=1-T/C(%)。

結果見表16和圖6。

結果顯示在1.8mpk劑量下，ADC-1和ADC-2均能顯著抑制DMS53細胞皮下移植腫瘤的生長。

測試例10：H1184細胞CDX小鼠模型體內藥效評價

將人小細胞肺癌NCI-H1184細胞(5×10⁶個，含50%基質膠；ATCC，CRL-5858)200μL/隻，接種於NDG小鼠右肋部皮下。接種18天後，待腫瘤體積為180mm³後，去除體重、腫瘤過大和過小的，按腫瘤體積將小鼠隨機分組，每組8隻，當天開始給藥。藉由腹腔注射ADC，給藥劑量1.8mg/kg。每週給藥1次，給藥3次。每週測2次瘤體積，稱體重，記錄數據。

使用Excel統計軟體記錄數據：平均值以avg計算；SD值以STDEV計算；SEM值以STDEV/SQRT(每組動物數)計算；採用GraphPad Prism軟體作圖，採用Two-way ANOVA或One-way ANOVA對數據進行統計學分析。

腫瘤體積(V)計算公式為：V=1/2×L_長×L_短 ²

相對腫瘤增殖率T/C(%)=(T-T₀)/(C-C₀)×100%，其中T、C為實驗結束時治療組和對照組的腫瘤體積；T₀、C₀為實驗開始時的腫瘤體積。

抑瘤率TGI(%)=1-T/C(%)。

結果見表17和圖7。

結果表明，在1.8mpk劑量下，ADC-1和ADC-2均能顯著抑制H1184移植腫瘤的生長。

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Claims (17)

1. 一種抗DLL3抗體，其包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中，

   i)該重鏈可變區包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO：22的胺基酸序列；HCDR2，其包含SEQ ID NO：23的胺基酸序列；和HCDR3，其包含SEQ ID NO：57的胺基酸序列；和

   該輕鏈可變區包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO：25的胺基酸序列；LCDR2，其包含SEQ ID NO：26的胺基酸序列；和LCDR3，其包含SEQ ID NO：27的胺基酸序列；

   其中，SEQ ID NO：57如PLYX₁YGRSYNX₂VAY所示，其中X₁為Y或H；X₂為A或G；或ii)該重鏈可變區包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO：16的胺基酸序列；HCDR2，其包含SEQ ID NO：17的胺基酸序列；和HCDR3，其包含SEQ ID NO：18的胺基酸序列；和

   該輕鏈可變區包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO：19的胺基酸序列；LCDR2，其包含SEQ ID NO：20的胺基酸序列；和LCDR3，其包含SEQ ID NO：21的胺基酸序列；

   較佳地，

   該重鏈可變區包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO：22的胺基酸序列；HCDR2，其包含SEQ ID NO：23的胺基酸序列；和HCDR3，其包含SEQ ID NO：24、30或31的胺基酸序列；和

   該輕鏈可變區包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO：25的胺基酸序列；LCDR2，其包含SEQ ID NO：26的胺基酸序列；和LCDR3，其包含SEQ ID NO：27的胺基酸序列。
2. 如請求項1所述的抗DLL3抗體，其為鼠源抗體、嵌合抗體或人源化抗體。
3. 如請求項1或2所述的抗DLL3抗體，其中，

   i)該重鏈可變區包含與SEQ ID NO：50、14、51、52、53或54具有至少90%同一性的胺基酸序列；和/或

   該輕鏈可變區包含與SEQ ID NO：55、15或56具有至少90%同一性的胺基酸序列；或

   ii)該重鏈可變區包含與SEQ ID NO：43、12、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42或44具有至少90%同一性的胺基酸序列；和/或

   該輕鏈可變區包含與SEQ ID NO：48、13、45、46、47或49具有至少90%同一性的胺基酸序列；

   較佳地，

   i)該重鏈可變區包含選自SEQ ID NO：50、51、52、53和54中的任一胺基酸序列，和/或該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：55或56的胺基酸序列；或

   ii)該重鏈可變區包含選自SEQ ID NO：43、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42和44中的任一胺基酸序列，和/或該輕鏈可變區包含選自SEQ ID NO：48、45、46、47和49中的任一胺基酸序列；或

   iii)該重鏈可變區包含SEQ ID NO：14的胺基酸序列，和/或該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：15的胺基酸序列；或

   iv)該重鏈可變區包含SEQ ID NO：12的胺基酸序列，和/或該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：13的胺基酸序列；

   更佳地，

   該重鏈可變區包含SEQ ID NO：50的胺基酸序列，和該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：55的胺基酸序列；或

   該重鏈可變區包含SEQ ID NO：43的胺基酸序列，和該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：48的胺基酸序列。
4. 如請求項1至3中任一項所述的抗DLL3抗體，其中該抗DLL3抗體是抗體片段；較佳地，其中該抗體片段為Fab、Fab'、F(ab')₂、Fab'-SH、Fd、Fv、scFv、dsFv、雙抗體或結構域抗體。
5. 如請求項1至3中任一項所述的抗DLL3抗體，其包含重鏈恆定區和輕鏈恆定區；較佳地，該重鏈恆定區包含SEQ ID NO：28的胺基酸序列，和/或該輕鏈恆定區包含SEQ ID NO：29的胺基酸序列。
6. 如請求項5所述的抗DLL3抗體，其包含重鏈和輕鏈，其中，

   該重鏈包含與SEQ ID NO：60具有至少85%同一性的胺基酸序列，和/或該輕鏈包含與SEQ ID NO：61具有至少85%同一性的胺基酸序列；或

   該重鏈包含與SEQ ID NO：58具有至少85%同一性的胺基酸序列，和/或該輕鏈包含與SEQ ID NO：59具有至少85%同一性的胺基酸序列；

   較佳地，

   該重鏈包含SEQ ID NO：60的胺基酸序列，和該輕鏈包含SEQ ID NO：61的胺基酸序列；或

   該重鏈包含SEQ ID NO：58的胺基酸序列，和該輕鏈包含SEQ ID NO：59的胺基酸序列。
7. 如請求項1至6中任一項所述的抗DLL3抗體，其具有以下特性中的至少一種：

   a)該抗DLL3抗體與人DLL3或其表位結合的KD值

   

   3nM、

   

   2nM或

   

   1nM，該KD值藉由Biacore測定；

   b)該抗DLL3抗體與表達DLL3的H1184細胞結合的EC50

   

   3nM，該EC50藉由FACS檢測；

   c)該抗DLL3抗體能夠被表達DLL3的細胞內吞；

   d)該抗DLL3抗體與DLL3或其表位結合的EC500.1nM，該EC₅₀藉由ELISA測定。
8. 一種分離的核酸，其編碼如請求項1至7中任一項所述的抗DLL3抗體。
9. 一種宿主細胞，其包含如請求項8所述的分離的核酸。
10. 一種製備抗DLL3抗體的方法，其包括在適於表達所述抗體的條件下培養如請求項9所述的宿主細胞。
11. 一種抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其包含：

    如請求項1至7中任一項所述的抗DLL3抗體、和

    藥物；

    較佳地，其中該藥物選自：細胞毒性劑、放射性標記物、螢光團、發色團、顯像劑、免疫調節劑、血管生成抑制劑、細胞增殖抑制劑、促細胞凋亡劑和細胞裂解酶中的一種或多種。
12. 如請求項11所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其具有通式(Pc-L-Da)所示的結構：

    

    其中，

    Pc為如請求項1至7中任一項所述的抗DLL3抗體；

    L為接頭；

    n為1至10；較佳地，n為3至5。
13. 如請求項11或12所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其具有通式(Pc-L-D)所示的結構：

    

    其中，

    Pc為如請求項1至7中任一項所述的抗DLL3抗體；

    L為接頭；

    n為1至10；較佳地，n為3至5。
14. 如請求項12或13所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中該接頭為-L¹-L²-L³-L⁴-，其中，

    L¹選自-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-W-C(O)-、-CH₂-C(O)-NR³-W-C(O)-和-C(O)-W-C(O)-，其中W選自C_1-6亞(伸)烷基、C_1-6亞(伸)烷基-C_3-6環烷基，其中該C_1-6亞(伸)烷基、C_1-6亞(伸)烷基-C_3-6環烷基各自獨立地視需要進一步被選自鹵素、羥基、氰基、胺基、烷基、氯烷基、氘代烷基、烷氧基和環烷基的一個或多個取代基所取代；

    L²選自-NR⁴(CH₂CH₂O)_pCH₂CH₂C(O)-、-NR⁴(CH₂CH₂O)_pCH₂C(O)-、-S(CH₂)_pC(O)-和化學鍵，其中p為1至20的整數；

    L³為由2至7個胺基酸殘基構成的肽殘基，其中該胺基酸選自苯丙胺酸、甘胺酸、纈胺酸、賴胺酸、瓜胺酸、絲胺酸、谷胺酸和天冬胺酸，並視 需要進一步被選自鹵素、羥基、氰基、胺基、烷基、氯烷基、氘代烷基、烷氧基和環烷基中的一個或多個取代基所取代；

    L⁴選自-NR⁵(CR⁶R⁷)_t-、-C(O)NR⁵、-C(O)NR⁵(CH₂)_t-和化學鍵，其中t為1至6的整數；

    R³、R⁴和R⁵相同或不同，且各自獨立地選自氫原子、烷基、鹵烷基、氘代烷基和羥烷基；

    R⁶和R⁷相同或不同，且各自獨立地選自氫原子、鹵素、烷基、鹵烷基、氘代烷基和羥烷基；

    較佳地，

    L¹為

    

    ，s¹為2至8的整數；

    L²為化學鍵；

    L³為四肽殘基；較佳地，L³為包含甘胺酸-甘胺酸-苯丙胺酸-甘胺酸的四肽殘基；

    L⁴為-NH(CH₂)t-，t為1或2；

    其中該L¹端與Pc相連；

    更佳地，該接頭為以下結構所示：

    
15. 如請求項11至14中任一項所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中該抗體-藥物偶聯物具有選自如下所示的結構：

    

    其中，

    Pc為如請求項1至7中任一項所述的抗DLL3抗體；n為1至10；

    較佳地，所述抗體-藥物偶聯物具有如下所示的結構：

    

    其中，

    Pc為如請求項6所述的抗DLL3抗體；

    其中n為1至8；更佳地，n為3至5。
16. 一種醫藥組成物，其包含：

    如請求項1至7中任一項所述的抗DLL3抗體，或如請求項11至15中任一項所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，以及

    一種或多種藥學上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體。
17. 一種如請求項1至7中任一項所述的抗DLL3抗體、或如請求項11至15中任一項所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽、或如請求項16所述的醫藥組成物在製備用於治療腫瘤或癌症的藥物中的用途；較佳地，其中該腫瘤或癌症選自：

    肺癌、小細胞肺癌、大細胞肺癌、頭和頸鱗狀細胞癌、頭和頸癌、腦癌、神經膠質瘤、多形性成膠質細胞瘤、神經母細胞瘤、中樞神經系統癌、神經內分泌腫瘤、咽喉癌、咽鱗癌、口腔鱗癌、鼻咽癌、食管癌、甲狀腺癌、甲狀腺髓樣癌、惡性胸膜間皮瘤、乳腺癌、三陰性乳腺癌、肝癌、肝膽癌、胰腺癌、胃癌、胃腸道癌、腸癌、結直腸癌、腎癌、透明細胞腎細胞癌、卵巢癌、子宮內膜癌、子宮頸癌、膀胱癌、前列腺癌、睾丸癌、腎上腺癌、膠質母細胞瘤、皮膚癌和黑色素瘤；更佳地，其中該腫瘤或癌症為小細胞肺癌。

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