JP2023515941A - Ｈｅｒ２に結合する二重特異性抗原結合分子およびその使用方法 - Google Patents

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Abstract

ＨＥＲ２に結合する二重特異性抗原結合分子およびその使用方法が、本明細書に提供される。本二重特異性抗原結合分子は、第一および第二の抗原結合ドメインを含み、第一および第二の抗原結合ドメインは、ヒトＨＥＲ２の細胞外ドメインの二つの異なる（好ましくは重複しない）エピトープに結合する。本二重特異性抗原結合分子は、ＨＥＲ２ ＩＨＣ２＋細胞およびＩＨＣ３＋細胞の表面上にクラスター化し、細胞リソソーム内に内部移行される。また、細胞傷害剤、放射性核種、または他の部分に連結された本明細書に提供される抗体または二重特異性抗原結合分子を含む抗体－薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）、ならびに対象に二重特異性抗原結合分子またはそのＡＤＣを投与することによって対象においてがんを治療する方法も含まれる。【選択図】なし

Description

本発明は、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）に特異的に結合し、ＨＥＲ２シグナル伝達を調節する二重特異性抗体およびその抗原結合断片、ならびに当該抗体の抗体－薬剤コンジュゲート、ならびにその使用方法に関するものである。
配列表
配列表の公的な写しは、ファイル名「１０７１９ＷＯ０１＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ＴＸＴ」、作成日２０２１年２月２６日、およびサイズ約６４キロバイトのＡＳＣＩＩフォーマットの配列表として、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に本明細書と同時に提出されている。このＡＳＣＩＩフォーマット書面に含まれる配列表は、本明細書の一部であり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
背景
ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）は、ヒト１７番染色体の長腕（１７ｑ１２）に位置するＥＲＢＢ２遺伝子によってコードされるチロシンキナーゼ受容体である。タンパク質は、細胞の成長および分化につながるシグナル伝達経路に関与する。ＨＥＲ２は、１２５５アミノ酸、１８５ｋＤの膜貫通糖タンパク質であり、ＨＥＲ２に対する既知のリガンドは存在しないが細胞外リガンド結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内ドメインとからなる。ＨＥＲ２は、ＥｒｂＢファミリーの他のメンバーの優先的な二量体化パートナーであると考えられており、このファミリーはｅｒｂＢ－２、ｅｒｂＢ－３、およびｅｒｂＢ－４を含む。ＨＥＲ２はまた、インスリン様成長因子受容体１などの他の膜受容体と複合体化することによっても活性化され得る。ホモ二量体形成を含めた二量体形成は、受容体の細胞質ドメイン内のチロシン残基の自己リン酸化をもたらし、細胞増殖および腫瘍形成につながる様々なシグナル伝達経路を開始する。
ＨＥＲ２の過剰発現は、血管新生の誘導をもたらす。このタンパク質は、乳がんの約３０％、胃／食道がんの約３０％で過剰発現される。ＨＥＲ２の過剰発現は、卵巣がん、子宮がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、膀胱がん、肺がん、結腸がん、および頭頸部がんを含む他のがんでも見られる。乳がんは、最大２５～５０コピーのＨＥＲ２遺伝子を有し、最大４０～１００倍のＨＥＲ２タンパク質の増加を有し得る。ＨＥＲ２増幅は、乳房および胃の腫瘍形成における早期の事象であり、著しく短い無病生存期間と関連する。
前臨床結果と臨床結果のどちらでも、ＨＥＲ２を過剰発現する腫瘍は抗ＨＥＲ２療法に応答することが示されており、このことはＨＥＲ２をがんドライバーとして実証している。抗ＨＥＲ２療法によるＨＥＲ２陽性腫瘍の治療は、早期生存および進行疾患の劇的な改善に繋がっている。様々な一価のＨＥＲ２遮断抗体が、様々ながんの治療用に臨床開発中である（米国特許出願公開第２０１９／００７６４３８号（特許文献１）および第２０１５／０３４３０５８号（特許文献２））。これらの抗体には、トラスツズマブ、ペルツズマブ、およびマルゲツキシマブが含まれる。（Ｐｅｒｎａｓ ａｎｄ Ｔｏｌａｎｅｙ，Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，１１：ｄｏｉ １０．１１７７／１７５８８３５９１９８３３５１９，２０１９（非特許文献１））。他のＨＥＲ２抗体は、二重特異性または多重特異性、例えばＰＲＳ（Ｐｉｅｒｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社、ＨＥＲ２およびＣＤ１３７を標的とするモノクローナル抗体－二重特異性タンパク質）、ＧＢＲ１３０２（Ｇｌｅｎｍａｒｋ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社、ＨＥＲ２×ＣＤ３二重特異性抗体）、ＺＷ２５（Ｚｙｍｅｗｏｒｋｓ社、ＨＥＲ２－ＥＣＤ２およびＥＣＤ４の細胞外ドメイン上の二つの異なるエピトープに結合する二重特異性抗体）、およびＭＣＬＡ－１２８（Ｍｅｒｕｓ、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３に対する二重特異性抗体）などである。一部のＨＥＲ２抗体は、細胞毒性ペイロードにコンジュゲートされており、そのようなものとしては、ＭＥＤＩ４２７６（Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ社、ツブリシンとコンジュゲートされた二つのＨＥＲ２ドメインに結合する二重特異性ＡＤＣ；米国特許第１０，１６０，８１２号（特許文献３）を参照）、ＳＹＤ９８５（Ｓｙｎｔｈｏｎ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社、トラスツズマブおよび切断可能なリンカーに基づくＡＤＣ）、およびトラスツズマブ・デルクステカン（第一三共社、トラスツズマブ、切断可能な薬剤リンカー、およびトポイソメラーゼＩペイロードを含む）が挙げられる。
転移性ＨＥＲ２陽性がんを有するほぼすべての患者は、最終的には、新規のまたは後天的な抵抗性に起因して抗ＨＥＲ２療法を進める。中程度のレベルのＨＥＲ２（ＩＨＣ２＋）を発現する腫瘍は、トラスツズマブ－ＤＭ１アド・トラスツズマブ・エムタンシン（Ｔ－ＤＭ１）、微小管破壊因子メイタンシンを含めたある特定の療法に対して依然として抵抗性であり、これは明らかにリソソーム中のＴ－ＤＭ１の内部移行およびプロセシングが非効率的であることに起因する。トラスツズマブ－ＤＭＩは、ＨＥＲ２乳がん患者の約２５％に有効であるに過ぎない。ＨＥＲ２を発現するがん、特に中程度のレベルのＨＥＲ２を発現するがんに強力な有効性を有する、改良された抗がん剤に対する重大なアンメットメディカルニーズが依然として存在する。
米国特許出願公開第２０１９／００７６４３８号 米国特許出願公開第２０１５／０３４３０５８号 米国特許第１０，１６０，８１２号
Ｐｅｒｎａｓ ａｎｄ Ｔｏｌａｎｅｙ，Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，１１：ｄｏｉ １０．１１７７／１７５８８３５９１９８３３５１９，２０１９
簡単な概要
ヒトＨＥＲ２受容体タンパク質に結合する二重特異性抗体（ＨＥＲ２×ＨＥＲ２）が、本明細書に提供される。抗体は、特に、ＨＥＲ２を発現する腫瘍細胞を標的とするのに有用である。抗ＨＥＲ２抗体およびその抗原結合部分は、非改変の形態で単独で使用されてもよいし、抗体－薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）の一部として含まれていてもよい。
他の実施形態は、後に続く詳細な説明の検討から明らかになるものとなる。
図１Ａ、図１Ｂ、および図１Ｃは、ＭＤＡＭＢ３６１細胞、ＪＩＭＴ１細胞、およびＺＲ７５１細胞へのＣｏｍｐＡｂ１（白丸）、ＢｓＡｂ１（灰三角）、およびＢｓＡｂ２（黒三角）の細胞表面での結合を示す。どちらの二重特異性抗体も、三つの細胞株においてトラスツズマブよりも高い親和性およびアビディティで結合したが、アイソタイプ対照抗体は結合をほとんどまたは全く示さなかった。 同上。 同上。
図２は、ＨＥＲ２発現レベルの増加した細胞型に対するＨＥＲ２二重特異性抗体の結合効率を図示する棒グラフである。どちらの二重特異性抗体も、中程度のＨＥＲ２レベルを発現する細胞株にトラスツズマブよりも効率良く結合した。
図３Ａは、クリック部分スペーサー、カテプシンＢ切断可能リンカー、およびツブリシンペイロードを有するモノクローナル抗体を図示する。図３Ｂは、抗体上の部位特異的コンジュゲーションのプロセスを図示する。
図４は、ＨＥＲ２二重特異性抗体－薬剤コンジュゲートのＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析を示す。
図５は、切断されたバイオセンサーの蛍光を経時的に図示し、ＨＥＲ２×ＨＥＲ２抗体であるＢｓＡｂ２（黒丸）が、ＣｏｍｐＡｂ１（白丸）に比べて速やかにカテプシンＢ切断可能リンカーのプロセッシングを誘発したことを標示する。
図６Ａおよび図６Ｂは、ＨＥＲ２ ＩＨＣ２＋ ＪＩＭＴ１異種移植片モデルにおけるＡＤＣの有効性を図示する。ＢｓＡｂ１－ツブリシン１Ａ－ＬＰは、用量依存的に細胞毒性を示した（３ｍｇ／ｋｇは黒丸、１ｍｇ／ｋｇは－ｘ－、０．３ｍｇ／ｋｇは黒三角）。
図７Ａおよび図７Ｂは、ＨＥＲ２×ＨＥＲ２－Ｍ８３０ ＡＤＣを用いた処置後の、ＨＥＲ２ ＩＨＣ２＋ ＪＩＭＴ１マウス異種移植片モデルにおける平均腫瘍サイズを図示する。３ｍｇ／ｋｇのＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性ＡＤＣ、ＢｓＡｂ１－ツブリシン１Ａ－ＬＰ（黒丸）またはＢｓＡｂ２－ツブリシン１Ａ－ＬＰ（－ｘ－）の単回投与を受けたマウスでは、ＪＩＭＴ１異種移植片サイズが著しくかつ持続的に減少したのに対し、１０ｍｇ／ｋｇのＣｏｍｐＡｂ１－ＭＣＣ－メイタンシノイドＡの２回投与を受けたマウス（黒三角）では、抗腫瘍効果がほとんどまたは全くなかった。 同上。
図８Ａおよび図８Ｂは、ＢｓＡｂ１－ツブリシン１Ａ－ＬＰを用いた処置後の、ＨＥＲ２ ＩＨＣ２＋ ＭＤＡＭＢ３６１マウス異種移植片モデルの平均腫瘍サイズを図示する。ＢｓＡｂ１－ツブリシン１Ａ－ＬＰの２回投与を受けたマウスでは、抗腫瘍効果をほとんどまたは全く生じなかったＣｏｍｐＡｂ１－ＭＣＣ－メイタンシノイドＡと比較して腫瘍サイズが減少した。
図９は、ＨＥＲ２×ＨＥＲ２－Ｍ８３０ ＡＤＣを用いた処置後の、ＨＥＲ２ ＩＨＣ３＋ Ｎ８７マウス異種移植片モデルにおける平均腫瘍サイズを図示する。３ｍｇ／ｋｇのＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性ＡＤＣ、ＢｓＡｂ１－ツブリシン１Ａ－ＬＰの単回投与を受けたマウス（黒丸）では、Ｎ８７異種移植片サイズが著しくかつ持続的に減少した。１０ｍｇ／ｋｇのＣｏｍｐＡｂ１－ＭＣＣ－メイタンシノイドＡの単回投与を受けたマウス（白三角）では、Ｎ８７異種移植片サイズが著しく減少したが、ＢｓＡｂ１－ツブリシン１Ａ－ＬＰで処置したものよりも早期に腫瘍が回避した。
図１０Ａおよび図１０Ｂは、ＨＥＲ２×ＨＥＲ２－Ｍ８３０ ＡＤＣを用いた処置後のＨＥＲ２ ＩＨＣ２＋ ＭＤＡＭＢ３６１マウス異種移植片モデルにおける平均腫瘍サイズを、ＣｏｍｐＡｂ１－ＭＣＣ－メイタンシノイドＡおよびＣｏｍｐＡｂ１－Ｌ－カンプトテシンを用いた処置と比較して図示する。３ｍｇ／ｋｇのＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性ＡＤＣであるＢｓＡｂ１－ツブリシン１Ａ－ＬＰの単回投与を受けたマウス（黒丸）では、ＪＩＭＴ１異種移植片サイズが著しくかつ持続的に減少し、１ｍｇ／ｋｇのＢｓＡｂ１－ツブリシン１Ａ－ＬＰの毎週投与を３回受けたマウス（－ｘ－）では、ＪＩＭＴ１異種移植片が部分的に減少した。これに対し、１０ｍｇ／ｋｇのＣｏｍｐＡｂ１－Ｌ－カンプトテシンの毎週投与を３回受けたマウス（白丸）では、腫瘍の進行が減速したに過ぎなかった。
図１１Ａおよび図１１Ｂは、ＨＥＲ２×ＨＥＲ２－Ｍ８３０ ＡＤＣを用いた処置後のＨＥＲ２ ＩＨＣ２＋ ＣＴＧ０８０７マウス異種移植片モデルにおける平均腫瘍サイズを、ＣｏｍｐＡｂ１－ＭＣＣ－メイタンシノイドＡを用いた処置と比較して図示する。３ｍｇ／ｋｇのＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性ＡＤＣであるＢｓＡｂ１－ツブリシン１Ａ－ＬＰの毎週投与を３回受けたマウス（黒丸）では、ＣＴＧ０８０７ ＰＤＸ腫瘍が完全にかつ持続的に減少した。１ｍｇ／ｋｇのＢｓＡｂ１－ツブリシン１Ａ－ＬＰの毎週投与を３回受けたマウス（－ｘ－）では、腫瘍増殖が遅延し、腫瘍サイズが３０日間にわたって３００ｍｍ３未満のままであった。１０ｍｇ／ｋｇのＣｏｍｐＡｂ１－ＭＣＣ－メイタンシノイドＡの毎週投与を３回受けたマウス（黒三角）の腫瘍は、処置中および処置後に成長し続けた。
図１２Ａおよび図１２Ｂは、ＨＥＲ２×ＨＥＲ２－Ｍ８３０ ＡＤＣを用いた処置後のＨＥＲ２ ＩＨＣ２＋ ＣＴＧ１１８４マウス異種移植片モデルにおける平均腫瘍サイズを、ＣｏｍｐＡｂ１－ＭＣＣ－メイタンシノイドＡを用いた処置と比較して図示する。３ｍｇ／ｋｇ（黒丸）および１ｍｇ／ｋｇ（－ｘ－）のＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性ＡＤＣであるＢｓＡｂ１－ツブリシン１Ａ－ＬＰの毎週投与を３回受けたマウスでは、ＣＴＧ１１８４ ＰＤＸ腫瘍サイズが著しくかつ持続的に減少した。３ｍｇ／ｋｇのＩＣ１－ツブリシン１Ａ－ＬＰ（アイソタイプ対照ＡＤＣ）または１０ｍｇ／ｋｇのＣｏｍｐＡｂ１－ＭＣＣ－メイタンシノイドＡ（黒三角）の毎週投与を３回受けたマウスの腫瘍は、処置中および処置後に成長し続けた。
図１３Ａおよび図１３Ｂは、ＨＥＲ２×ＨＥＲ２ Ｃａｍｐｔ１ＡＤＣを用いた処置後のＨＥＲ２ ＩＨＣ３＋ Ｎ８７マウス異種移植片モデルにおける平均腫瘍サイズを図示する。パネルＡ：１０ｍｇ／ｋｇのＢｓＡｂ１－Ｃａｍｐｔ１（パネルＡ、ｘ）またはＢｓＡｂ２－Ｃａｍｐｔ１（パネルＡ、黒丸）の単回投与を受けたマウスでは、Ｎ８７異種移植片サイズが著しくかつ持続的に減少した。抗腫瘍応答は、ＣｏｍｐＡｂ１－ＧＧＦＧ－Ｄｘｄ（パネルＡ、黒三角）と同等であったが、ＣｏｍｐＡｂ１－ＭＣＣ－メイタンシノイドＡ（パネルＡ、黒正方形）に対する応答よりも有意に大きかった。ＢｓＡｂ１－Ｃａｍｐｔ１またはＢｓＡｂ２－Ｃａｍｐ１を用いた処置後の抗腫瘍応答は、３ｍｇ／ｋｇのＢｓＡｂ２－ツブリシン１Ａ－ＬＰの単回投与（パネルＢ、黒丸）の抗腫瘍応答と同等であったが、１ｍｇ／ｋｇのＢｓＡｂ２－ツブリシン１Ａ－ＬＰの３回の毎週投与（パネルＢ、黒三角）よりも大きかった。説明を目的としてデータを二つのパネルに分けているが、すべてのデータは同じ実験に由来する。
図１４は、Ｈｅｒ２－親Ａｂ１複合体の形成時に著しく保護されるＨｅｒ２ペプチドの重水素取込みデータを、Ｈｅｒ２単独と比較して示す。
図１５は、Ｈｅｒ２－親Ａｂ２複合体の形成時に著しく保護されるＨｅｒ２ペプチドの重水素取込みデータを、Ｈｅｒ２単独と比較して示す。
図１６は、Ｈｅｒ２－親Ａｂ３複合体の形成時に著しく保護されるＨｅｒ２ペプチドの重水素取込みデータを、Ｈｅｒ２単独と比較して示す。
図１７は、Ｈｅｒ２－親Ａｂ４複合体の形成時に著しく保護されるＨｅｒ２ペプチドの重水素取り込みデータを、Ｈｅｒ２単独と比較して示す。
詳細な説明
本発明を記載する前に、記載された特定の方法および実験条件に本発明が限定されず、それはこのような方法および条件が変化し得るためであることが理解されるべきである。本発明の範囲は添付の特許請求の範囲のみによって制限されるものとなることから、本明細書に使用される用語は、特定の実施形態のみを記載する目的で使用されており、制限することを意図しないことも理解されるべきである。
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。本明細書で使用される際に、「約」という用語は、特定の列挙される数値に関して使用される場合、当該値が、列挙される値から１％以下まで変動し得ることを意味する。例えば本明細書で使用される際に、「約１００」という表現には、９９および１０１、ならびにその間のすべての値（例えば、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４など）が含まれる。
本明細書に記載されたものと類似または均等な任意の方法および材料を本発明の実践または試験に使用することができるが、好適な方法および材料をこれから記載する。本明細書に言及されるすべての特許、特許出願、および非特許刊行物は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
ＨＥＲ２タンパク質
本明細書で使用される際に、「ＨＥＲ２」などの表現は、受容体チロシンキナーゼの上皮成長因子（ＥＧＦ）受容体ファミリーのメンバーを指す。このタンパク質はまた、ＮＥＵ、ＮＧＬ、ＨＥＲ２、ＴＫＲ１、ＣＤ３４０、ＨＥＲ－２、ＭＬＮ １９、ＨＥＲ－２／ｎｅｕとしても知られている。ＨＥＲ２は、配列番号５１に記載されるアミノ酸配列、および／またはＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００４４３９．２に記載されるアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を指し得る。
本明細書におけるタンパク質、ポリペプチド、およびタンパク質断片へのすべての言及は、非ヒト種由来であると明示的に指定されていない限り、ヒトバージョンのそれぞれのタンパク質、ポリペプチド、またはタンパク質断片を指すことが意図されている。したがって、「ＨＥＲ２」という表現は、例えば「マウスＨＥＲ２」、「サルＨＥＲ２」など、非ヒト種由来であると特定されていない限り、ヒトＨＥＲ２を意味する。
本明細書に使用される際に、「細胞表面発現ＨＥＲ２」という表現は、ＨＥＲ２タンパク質の少なくとも一部が、細胞膜の細胞外側に露出され、抗体の抗原結合部分にアクセス可能であるように、インビトロまたはインビボにおいて細胞の表面上に発現される、一つまたは複数のＨＥＲ２タンパク質またはその細胞外ドメインを意味する。「細胞表面発現ＨＥＲ２」は、ＨＥＲ２タンパク質を正常に発現する細胞の表面上に発現されるＨＥＲ２タンパク質を含み得るか、またはそれからなり得る。あるいは、「細胞表面発現ＨＥＲ２」は、正常にはその表面上にヒトＨＥＲ２を発現しないが人為的に工学的に操作されてその表面上にＨＥＲ２を発現する、細胞の表面上で発現されるＨＥＲ２タンパク質を含み得るか、またはそれからなり得る。
ＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子
本明細書では、第一の抗原結合ドメイン（本明細書では「Ｄ１」とも称される）および第二の抗原結合ドメイン（本明細書では「Ｄ２」とも称される）を含む、二重特異性抗原結合分子が提供される。二重特異性抗原結合分子による二つの別々のＨＥＲ２エピトープの同時結合は、ＨＥＲ２発現細胞表面上で抗体のクラスター形成をもたらし、結合抗体と共にＨＥＲ２タンパク質の内部移行をもたらす。
ヒトＨＥＲ２の第一のエピトープに特異的に結合する第一の抗原結合ドメイン（Ｄ１）と、ヒトＨＥＲ２の第二のエピトープに特異的に結合する第二の抗原結合ドメイン（Ｄ２）とを含む二重特異性抗原結合分子は、本明細書では「ＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗体」、「ＨＥＲ２×ＨＥＲ２」、または他の関連する用語として称され得る。
ある実施形態では、ＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗体のＤ１ドメインおよびＤ２ドメインは、互いに非競合的である。ＨＥＲ２への結合についてＤ１とＤ２との間で非競合的であるとは、Ｄ１およびＤ２が誘導されたそれぞれの単一特異性抗原結合タンパク質が、ヒトＨＥＲ２への結合について互いに競合しないことを意味する。抗原結合タンパク質の競合アッセイの例は当分野で既知であり、その非限定的な例は本明細書の別段に記載される。
ある実施形態では、Ｄ１およびＤ２は、本明細書において別段に記載されるように、ＨＥＲ２上の異なるエピトープ（例えば、非重複エピトープまたは部分重複エピトープ）に結合する。
ＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子は、二つの別々の単一特異性抗ＨＥＲ２抗体の抗原結合ドメインを使用して構築されてもよい。例えば、モノクローナルの単一特異性抗ＨＥＲ２抗体のコレクションが、当分野に公知の標準的な方法を使用して作製され得る。そのように作製された個々の抗体は、ＨＥＲ２タンパク質に対する交差競合について、互いに対し一対で試験され得る。二つの異なる抗ＨＥＲ２抗体が同時にＨＥＲ２に結合することができる（すなわち、互いに競合しない）場合、その第一の抗ＨＥＲ２抗体由来の抗原結合ドメイン、および第二の非競合抗ＨＥＲ２抗体由来の抗原結合ドメインは、本開示に従って単一のＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗体へと工学的に操作され得る。
本開示によれば、二重特異性抗原結合分子は、単一の多機能性ポリペプチドとすることもできるし、互いに共有結合的にまたは非共有結合的に結び付いた二つ以上のポリペプチドの多量体性の複合体とすることもできる。本開示によって明らかとなるように、ＨＥＲ２の二つの別々の同一ではないエピトープに同時に結合する能力を有する抗原結合構築物はいずれも、二重特異性抗原結合分子と考えられる。本明細書に記載の二重特異性抗原結合分子またはそのバリアントはいずれも、当業者に公知となるように、標準的な分子生物学的手法（例えば、組み換えＤＮＡおよびタンパク質発現技術）を使用して構築されてもよい。
抗ＨＥＲ２二重特異性抗体配列
「抗体」という用語は、本明細書で使用される際には、特定の抗原（例えば、ＨＥＲ２）と特異的に結合または相互作用する少なくとも一つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、任意の抗原結合分子または分子複合体を意味する。「抗体」という用語は、ジスルフィド結合によって相互に接続した四つのポリペプチド鎖、すなわち二つの重（Ｈ）鎖と二つの軽（Ｌ）鎖とを含む免疫グロブリン分子、ならびにそれらの多量体（例えば、ＩｇＭ）を含む。「抗体」という用語はまた、ジスルフィド結合によって相互に接続した四つのポリペプチド鎖、すなわち二つの重（Ｈ）鎖と二つの軽（Ｌ）鎖とからなる免疫グロブリン分子を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＨＣＶＲまたはＶＨと省略される）と重鎖定常領域とを含む。重鎖定常領域は、三つのドメインＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＬＣＶＲまたはＶＬと省略される）と軽鎖定常領域とを含む。軽鎖定常領域は、一つのドメイン（ＣＬ１）を含む。ＶＨ領域およびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる比較的保存された領域が間に配された、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域へとさらに細分することができる。各ＶＨおよびＶＬは、以下の順序でアミノ末端からカルボキシ末端に配置された三つのＣＤＲと四つのＦＲから構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。本発明の異なる実施形態において、抗ＨＥＲ２抗体（またはその抗原結合部分）のＦＲは、ヒトの生殖系列配列と同一であってもよいし、自然にまたは人為的に改変されていてもよい。アミノ酸コンセンサス配列は、二つ以上のＣＤＲの並列分析に基づいて定義され得る。
同様に、「抗体」という用語は、ジスルフィド結合によって相互に接続された八つのポリペプチド鎖、すなわち四つの重（Ｈ）鎖と四つの軽（Ｌ）鎖とを含む免疫グロブリン分子、つまり二重特異性抗体を含む。「抗体」という用語はまた、ジスルフィド結合によって相互に接続した八つのポリペプチド鎖、すなわち四つの重（Ｈ）鎖と四つの軽（Ｌ）鎖とからなる免疫グロブリン分子を含む。
さらに、用語「抗体」は、少なくとも一つのＨＣを含む官能基化された免疫グロブリン分子を含み、ＨＣはアジド－ＰＥＧ３－アミンを含む。一部の態様では、アジド－ＰＥＧ３－アミンは、抗体ＨＣ上のＱ２９５部位に位置する。一部の態様では、アジド－ＰＥＧ３－アミンは、抗体上のＱ２９７部位に位置する。一部の態様では、二重特異性抗体は、ＨＣの両方のＱ２９５部位に位置するアジド－ＰＥＧ３－アミンにより官能化された二つのＨＣを有する。一部の態様では、二重特異性抗体は、ＨＣの両方のＱ２９７部位に位置するアジド－ＰＥＧ３－アミンにより官能化された二つのＨＣを有する。一部の態様では、二重特異性抗体は、ＨＣの両方のＱ２９５部位と両方のＱ２９７部位とに位置するアジド－ＰＥＧ３－アミンにより官能化された二つのＨＣを有する。ＨＣ中のＱ２９７部位は、Ｎ２９７をＱ２９７に改変することによって得られ、本明細書ではＮ２９７Ｑ改変ともよばれる。
一態様によれば、ＨＥＲ２二重特異性抗体が提供される。この態様によるＨＥＲ２二重特異性抗体の例は、本明細書の表１および表２に列挙される。表１には、本明細書に開示される二重特異性抗原結合分子（本明細書では二重特異性抗原結合タンパク質と互換的に使用される）の重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）、重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３）、ならびに軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３）のアミノ酸配列識別子が記載されている。表２には、例示的な抗体のＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３の核酸配列識別子が記載されている。
本明細書では、表１に列挙されるいずれかのＨＣＶＲアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列、またはそれに少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列を含むＨＣＶＲを含む、ＨＥＲ２に特異的に結合する二重特異性抗体が提供される。
本明細書では、表１に列挙されるいずれかのＬＣＶＲアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列、またはそれに少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列を含むＬＣＶＲを含む、ＨＥＲ２に特異的に結合する二重特異性抗体が提供される。
本明細書では、表１に列挙されるいずれかのＬＣＶＲアミノ酸配列とペア形成される表１に列挙されるいずれかのＨＣＶＲアミノ酸配列を含む、ＨＣＶＲとＬＣＶＲとのアミノ酸配列ペア（ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ）を含む、ＨＥＲ２に特異的に結合する二重特異性抗体が提供される。ある実施形態によれば、二重特異性抗体は、表１に列挙されるいずれかの例示的なＨＥＲ２二重特異性抗体の含有する二つのＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列ペアを含む。ある実施形態では、ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列ペアは、以下からなる群から選択される：配列番号２／１８、１０／１８、３２／１８、および４０／１８。
さらに、表１に列挙されるいずれかのＨＣＤＲ１アミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を含む重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）を含む、ＨＥＲ２に特異的に結合する二重特異性抗体が提供される。
さらに、表１に列挙されるいずれかのＨＣＤＲ２アミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を含む重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）を含む、ＨＥＲ２に特異的に結合する二重特異性抗体が提供される。
さらに、表１に列挙されるいずれかのＨＣＤＲ３アミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を含む重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、ＨＥＲ２に特異的に結合する二重特異性抗体が提供される。
さらに、表１に列挙されるいずれかのＬＣＤＲ１アミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を含む軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）を含む、ＨＥＲ２に特異的に結合する二重特異性抗体が提供される。
さらに、表１に列挙されるいずれかのＬＣＤＲ２アミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を含む軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）を含む、ＨＥＲ２に特異的に結合する二重特異性抗体が提供される。
さらに、表１に列挙されるいずれかのＬＣＤＲ３アミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を含む軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含む、ＨＥＲ２に特異的に結合する二重特異性抗体が提供される。
さらに、表１に列挙されるいずれかのＬＣＤＲ１アミノ酸配列とペア形成される表１に列挙されるいずれかのＨＣＤＲ１アミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１とＬＣＤＲ１とのアミノ酸配列ペア（ＨＣＤＲ１／ＬＣＤＲ１）を含む、ＨＥＲ２に特異的に結合する二重特異性抗体が提供される。ある実施形態によれば、二重特異性抗体は、表１に列挙されるいずれかの例示的な抗ＨＥＲ２抗体の含有する少なくとも一つのＨＣＤＲ１／ＬＣＤＲ１アミノ酸配列ペアを含む。ある実施形態では、ＨＣＤＲ１／ＬＣＤＲ１アミノ酸配列ペアは、以下からなる群から選択される：配列番号４／２０、１２／２０、３４／２０、および４２／２０。
さらに、表１に列挙されるいずれかのＬＣＤＲ２アミノ酸配列とペア形成される表１に列挙されるいずれかのＨＣＤＲ２アミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２とＬＣＤＲ２とのアミノ酸配列ペア（ＨＣＤＲ２／ＬＣＤＲ２）を含む、ＨＥＲ２に特異的に結合する二重特異性抗体が提供される。ある実施形態によれば、二重特異性抗体は、表１に列挙されるいずれかの例示的な抗ＨＥＲ２抗体の含有する少なくとも一つのＨＣＤＲ２／ＬＣＤＲ２アミノ酸配列ペアを含む。ある実施形態では、ＨＣＤＲ２／ＬＣＤＲ２アミノ酸配列ペアは、以下からなる群から選択される：配列番号６／２２、１４／２２、３６／２２、および４４／２２。
さらに、表１に列挙されるいずれかのＬＣＤＲ３アミノ酸配列とペア形成される表１に列挙されるいずれかのＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３とＬＣＤＲ３とのアミノ酸配列ペア（ＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３）を含む、ＨＥＲ２に特異的に結合する二重特異性抗体が、本明細書に提供される。ある実施形態によれば、二重特異性抗体は、表１に列挙される例示的な二重特異性抗体のいずれかを含有する少なくとも一つのＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３アミノ酸配列ペアを含む。ある実施形態では、ＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３アミノ酸配列ペアは、以下からなる群から選択される：配列番号８／２４、１６／２４、３８／２４、および４６／２４。
さらに、表１に列挙されるいずれかの例示的な抗ＨＥＲ２抗体の含有する六つのＣＤＲ（すなわち、ＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３－ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３）のセットを含む、ＨＥＲ２に特異的に結合する二重特異性抗体が、本明細書に提供される。ある実施形態では、ＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３－ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列セットは、以下からなる群から選択される：配列番号４－６－８－２０－２２－２４、１２－１４－１６－２０－２２－２４、３４－３６－３８－２０－２２－２４、および４２－４４－４６－２０－２２－２４。
関連の実施形態では、ＨＥＲ２に特異的に結合する二重特異性抗体は、表１に列挙されるいずれかの例示的なＨＥＲ２二重特異性抗体により規定される二つのＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列ペアの含有する二つのセットの六つのＣＤＲ（すなわちＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３－ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３）を含む。例えば、ＨＥＲ２二重特異性抗体は、以下からなる群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列ペアの含有するＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３－ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３アミノ酸配列セットを含む：配列番号２／１８、１０／１８、３２／１８、および４０／１８。
ＨＣＶＲアミノ酸配列およびＬＣＶＲアミノ酸配列内のＣＤＲを同定するための方法および手法は、当技術分野で周知されており、本明細書に開示の特定のＨＣＶＲアミノ酸配列および／またはＬＣＶＲアミノ酸配列内のＣＤＲを同定するために使用することができる。ＣＤＲの境界を同定するために使用することができる例示的な規則としては、例えば、Ｋａｂａｔ定義、Ｃｈｏｔｈｉａ定義、およびＡｂＭ定義が挙げられる。一般的な条件では、Ｋａｂａｔ定義は配列変動性に基づき、Ｃｈｏｔｈｉａ定義は構造ループ領域の位置に基づき、ＡｂＭ定義はＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａ手法との折衷である。例えば、Ｋａｂａｔ，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，”Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）、Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７３：９２７－９４８（１９９７）、およびＭａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：９２６８－９２７２（１９８９）を参照されたい。パブリックデータベースもまた、抗体内のＣＤＲ配列を同定するために利用可能である。
表３に列挙されるいずれかのＨＣアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を含む重鎖（ＨＣ）を含む、ＨＥＲ２に特異的に結合する二重特異性抗体が、本明細書に提供される。例えば、表３に列挙されたいずれかのＨＣアミノ酸配列から選択されるがＮ２９７Ｑ改変または同等の改変を含むアミノ酸配列を含むＨＣを含む、ＨＥＲ２に特異的に結合する二重特異性抗体が、本明細書に提供される。例示的には、配列番号２６、２８、４８、および５０からなる群から選択されるＨＣアミノ酸配列内にＮ２９７Ｑ改変を含む重鎖を有する二重特異性抗体が、本明細書に提供される。一部の態様では、本二重特異性抗体は、配列番号２６のＨＣアミノ酸配列内にＮ２９７Ｑ改変を含むＨＣを含む。一部の態様では、本二重特異性抗体は、配列番号２８のＨＣアミノ酸配列内にＮ２９７Ｑ改変を含むＨＣを含む。一部の態様では、本二重特異性抗体は、配列番号４８のＨＣアミノ酸配列内にＮ２９７Ｑ改変を含むＨＣを含む。一部の態様では、本二重特異性抗体は、配列番号５０のＨＣアミノ酸配列内にＮ２９７Ｑ改変を含むＨＣを含む。一部の態様では、本二重特異性抗体は、配列番号２６のＨＣアミノ酸配列内にＮ２９７Ｑ改変を含むＨＣと、配列番号２８のＨＣアミノ酸配列内にＮ２９７Ｑ改変を含むＨＣとを含む。一部の態様では、本二重特異性抗体は、配列番号４８のＨＣアミノ酸配列内にＮ２９７Ｑ改変を含むＨＣと、配列番号５０のＨＣアミノ酸配列内にＮ２９７Ｑ改変を含むＨＣとを含む。
表３に列挙されるいずれかのＬＣアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を含む軽鎖（ＬＣ）を含む、ＨＥＲ２に特異的に結合する二重特異性抗体が、本明細書に提供される。
表３に列挙されるいずれかのＬＣアミノ酸配列とペア形成される表３に列挙されるいずれかのＨＣアミノ酸配列を含むＨＣとＬＣとのアミノ酸配列ペア（ＨＣ／ＬＣ）を含む、ＨＥＲ２に特異的に結合する二重特異性抗体が、本明細書に提供される。ある実施形態によれば、二重特異性抗体は、表３に列挙されるいずれかの例示的なＨＥＲ２二重特異性抗体の含有する二つのＨＣ／ＬＣアミノ酸配列ペアを含む。ある実施形態では、ＨＣ／ＬＣアミノ酸配列ペアは、以下からなる群から選択される：配列番号２６／３０、２８／３０、４８／３０、および５０／３０。一部の態様では、ＨＣは、上記で提供されたＮ２９７Ｑ改変を含む。
また、抗ＨＥＲ２抗体またはその一部分をコードする核酸分子が、本明細書に提供される。例えば、本発明は、表１に列挙されるいずれかのＨＣＶＲアミノ酸配列をコードする核酸分子を提供し、ある実施形態では、この核酸分子は、表２に列挙されるいずれかのＨＣＶＲ核酸配列から選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を含む。
また、表１に列挙されるいずれかのＬＣＶＲアミノ酸配列をコードする核酸分子も提供され、ある特定の実施形態では、この核酸分子は、表２に列挙されるいずれかのＬＣＶＲ核酸配列から選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列を含む。
また、表１に列挙されるいずれかのＨＣＤＲ１アミノ酸配列をコードする核酸分子も提供され、ある特定の実施形態では、この核酸分子は、表２に列挙されるいずれかのＨＣＤＲ１核酸配列から選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列を含む。
また、表１に列挙されるいずれかのＨＣＤＲ２アミノ酸配列をコードする核酸分子も提供され、ある特定の実施形態では、この核酸分子は、表２に列挙されるいずれかのＨＣＤＲ２核酸配列から選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列を含む。
また、表１に列挙されるいずれかのＨＣＤＲ３アミノ酸配列をコードする核酸分子も提供され、ある特定の実施形態では、この核酸分子は、表２に列挙されるいずれかのＨＣＤＲ３核酸配列から選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列を含む。
また、表１に列挙されるいずれかのＬＣＤＲ１アミノ酸配列をコードする核酸分子も提供され、ある特定の実施形態では、この核酸分子は、表２に列挙されるいずれかのＬＣＤＲ１核酸配列から選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列を含む。
また、表１に列挙されるいずれかのＬＣＤＲ２アミノ酸配列をコードする核酸分子も提供され、ある特定の実施形態では、この核酸分子は、表２に列挙されるいずれかのＬＣＤＲ２核酸配列から選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列を含む。
また、表１に列挙されるいずれかのＬＣＤＲ３アミノ酸配列をコードする核酸分子も提供され、ある特定の実施形態では、この核酸分子は、表２に列挙されるいずれかのＬＣＤＲ３核酸配列から選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列を含む。
また、ＨＣＶＲをコードする核酸分子も提供され、ＨＣＶＲは、三つのＣＤＲ（すなわち、ＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３）のセットを含み、ＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３アミノ酸配列のセットは、表１に列挙されるいずれかの例示的なＨＥＲ２二重特異性抗体により定義されるとおりである。
また、ＬＣＶＲをコードする核酸分子も提供され、ＬＣＶＲは、三つのＣＤＲ（すなわち、ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３）のセットを含み、ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３アミノ酸配列のセットは、表１に列挙されるいずれかの例示的なＨＥＲ２二重特異性抗体により定義されるとおりである。
また、ＨＣＶＲとＬＣＶＲとの両方をコードする核酸分子も提供され、ＨＣＶＲは、表１に列挙されるいずれかのＨＣＶＲアミノ酸配列のアミノ酸配列を含み、ＬＣＶＲは、表１に列挙されるいずれかのＬＣＶＲアミノ酸配列のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、核酸分子は、表２に列挙されるいずれかのＨＣＶＲ核酸配列から選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列と、表２に列挙されるいずれかのＬＣＶＲ核酸配列から選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列とを含む。本態様による特定の実施形態では、核酸分子は、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲをコードし、ここでは、ＨＣＶＲとＬＣＶＲとの両方が、表１に列挙される同じＨＥＲ２二重特異性抗体から誘導される。
さらに、表３に列挙されるいずれかのＨＣアミノ酸配列をコードするか、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列をコードする、核酸分子も提供される。例えば、その核酸分子は、表３に列挙されるいずれかのＨＣアミノ酸配列をコードすることができ、ＨＣはＮ２９７Ｑ改変を有する。
さらに、表３に列挙されるいずれかのＬＣアミノ酸配列をコードするか、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列をコードする、核酸分子も提供される。
また、ＨＥＲ２二重特異性抗体の重鎖または軽鎖の可変領域を含むポリペプチドを発現することができる組換え発現ベクターも、本明細書に提供される。例えば、組換えベクターは、上述のいずれかの核酸分子、すなわち、表１に記載されるようないずれかのＨＣＶＲ配列、ＬＣＶＲ配列、および／またはＣＤＲ配列をコードする核酸分子を含む。このようなベクターが導入されている宿主細胞、ならびに抗体または抗体断片の産生を可能にする条件下で宿主細胞を培養することにより抗体またはその一部を産生する方法、およびそのように産生された抗体および抗体断片を回収する方法も、本開示の範囲内に含まれる。
改変されたグリコシル化パターンを有するＨＥＲ２二重特異性抗体が、本明細書に提供される。一部の実施形態では、例えば、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）機能を増大させるために、望ましくないグリコシル化部位を除去する改変、またはオリゴ糖鎖上に存在するフコース部分を欠損している抗体が有用であり得る（Ｓｈｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．（２００２）ＪＢＣ ２７７：２６７３３を参照）。他の適用では、補体依存性細胞傷害活性（ＣＤＣ）を改変するために、ガラクトシル化の修飾を行うことができる。
抗原結合ドメイン
本開示の二重特異性抗原結合分子は、二つの別々の抗原結合ドメイン（Ｄ１およびＤ２）を含む。本明細書に使用される際に、「抗原結合ドメイン」という表現は、特定の対象の抗原（例えばヒトＨＥＲ２）に特異的に結合することができる、任意のペプチド、ポリペプチド、核酸分子、スキャフォールド型分子、ペプチドディスプレイ分子、またはポリペプチド含有構築物を意味する。「特異的に結合する」などの用語は、本明細書に使用される際に、抗原結合ドメインが、５００ｐＭ以下の解離定数（ＫＤ）によって特徴付けられる特定の抗原と複合体を形成し、一般的な試験条件下でその他の無関係な抗原を結合しないことを意味する。「関連性のない抗原」とは、互いに９５％未満のアミノ酸同一性を有する、タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドである。
本開示の状況で使用され得る抗原結合ドメインの例示的な分類には、抗体、抗体の抗原結合部分、特定の抗原と特異的に相互作用するペプチド（例えば、ペプチボディ）、特定の抗原と特異的に相互作用する受容体分子、特定の抗原に特異的に結合する受容体のリガンド結合部分を含むタンパク質、抗原結合スキャフォールド（例えば、ＤＡＲＰｉｎｓ、ＨＥＡＴ反復タンパク質、ＡＲＭ反復タンパク質、テトラトリコペプチド反復タンパク質、および天然の反復タンパク質に基づく他のスキャフォールドなど［例えば、Ｂｏｅｒｓｍａ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，２０１１，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：８４９－８５７、およびそれらに引用される参考文献を参照されたい］）、ならびにそれらのアプタマーまたは部分が含まれる。
２個の分子が互いに特異的に結合するか否かを判定するための方法は、当技術分野では周知されており、例えば、平衡透析、表面プラズモン共鳴法、および同様の方法が挙げられる。例えば、本開示の状況で使用される際に、抗原結合ドメインには、表面プラズモン共鳴アッセイにて測定した場合に、約５００ｐＭ未満、約４００ｐＭ未満、約３００ｐＭ未満、約２００ｐＭ未満、約１００ｐＭ未満、約９０ｐＭ未満、約８０ｐＭ未満、約７０ｐＭ未満、約６０ｐＭ未満、約５０ｐＭ未満、約４０ｐＭ未満、約３０ｐＭ未満、約２０ｐＭ未満、約１０ｐＭ未満、約５ｐＭ未満、約４ｐＭ未満、約２ｐＭ未満、約１ｐＭ未満、約０．５ｐＭ未満、約０．２ｐＭ未満、約０．１ｐＭ未満、または約０．０５ｐＭ未満のＫＤを有する、特定の抗原（例えば、標的分子［Ｔ］もしくは内部移行エフェクタータンパク質［Ｅ］）またはその一部を結合するポリペプチドが含まれる。
用語「表面プラズモン共鳴法」は、本明細書で使用される際に、バイオセンサーマトリクス内のタンパク質濃度の変化を、例えばＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）システム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社内Ｂｉａｃｏｒｅライフサイエンス部門、ニュージャージー州ピスカタウェイ）内で検出することにより、リアルタイムの相互作用の分析を可能にする光学現象を指す。
用語「ＫＤ」は、本明細書で使用される際に、特定のタンパク質－タンパク質相互作用（例えば、抗体－抗原相互作用）の平衡解離定数を意味する。本明細書に開示されるＫＤ値は、表面プラズモン共鳴アッセイによって２５℃で測定されたＫＤ値を指す。
上記に示されるように、「抗原結合ドメイン」（Ｄ１および／またはＤ２）は、抗体または抗体の抗原結合断片を含んでいてもよいし、またはこれらからなっていてもよい。「抗体」という用語は、本明細書で使用される際に、特定の抗原（例えば、ヒトＨＥＲ２）と特異的に結合または相互作用する少なくとも一つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、任意の抗原結合分子または分子複合体を意味する。「抗体」という用語は、ジスルフィド結合によって相互に接続した四つのポリペプチド鎖、すなわち二つの重（Ｈ）鎖と二つの軽（Ｌ）鎖とを含む免疫グロブリン分子、ならびにそれらの多量体（例えば、ＩｇＭ）を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＨＣＶＲまたはＶＨと省略される）と重鎖定常領域とを含む。重鎖定常領域は、三つのドメインＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＬＣＶＲまたはＶＬと省略される）と軽鎖定常領域とを含む。軽鎖定常領域は、一つのドメイン（ＣＬ１）を含む。ＶＨ領域およびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる比較的保存された領域が間に配された、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域へとさらに細分することができる。各ＶＨおよびＶＬは、以下の順序でアミノ末端からカルボキシ末端に配置された三つのＣＤＲと四つのＦＲから構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。異なる実施形態では、本明細書に提供される抗体のＦＲ（またはその抗原結合部分）は、ヒトの生殖系列配列と同一であってもよいし、自然にまたは人為的に改変されていてもよい。アミノ酸コンセンサス配列は、二つ以上のＣＤＲの並列分析に基づいて定義され得る。
本明細書に提供される二重特異性抗原結合分子のＤ１構成要素および／またはＤ２構成要素は、完全抗体分子の抗原結合断片を含んでいてもよいし、これらからなっていてもよい。抗体の「抗原結合部分」、抗体の「抗原結合断片」などの用語は、本明細書で使用される際に、抗原に特異的に結合して複合体を形成するいずれか天然の、酵素処理により取得可能な、合成の、または遺伝子操作されたポリペプチドまたは糖タンパク質を含む。抗体の抗原結合断片は、例えば、抗体可変領域と任意選択的に定常ドメインとをコードするＤＮＡの操作および発現を伴う、タンパク質分解消化または組換え遺伝子工学技術などの、任意の適切な標準的方法を使用する、完全抗体分子に由来していてもよい。そのようなＤＮＡは公知であり、かつ／または例えば、市販の供給源、ＤＮＡライブラリ（例えば、ファージ抗体ライブラリを含む）から容易に入手可能であるか、もしくは合成することができる。ＤＮＡを配列決定し、化学的にまたは分子生物学手法を使用することによって操作して、例えば、一つまたは複数の可変ドメインおよび／もしくは定常ドメインを適切な構成に配置するか、またはコドンを導入する、システイン残基を作り出す、アミノ酸を修飾、付加、もしくは欠失させるなどが可能である。
抗原結合断片の非限定的な例としては、（ｉ）Ｆａｂ断片、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、（ｉｉｉ）Ｆｄ断片、（ｉｖ）Ｆｖ断片、（ｖ）一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子、（ｖｉ）ｄＡｂ断片、および（ｖｉｉ）抗体の超可変領域（例えば、ＣＤＲ３ペプチドなどの単離された相補性決定領域（ＣＤＲ））を模したアミノ酸残基、または拘束型ＦＲ３‐ＣＤＲ３‐ＦＲ４ペプチドからなる最小認識単位が挙げられる。他の工学的に操作された分子、例えば、ドメイン特異的抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン欠失抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、ナノボディ（例えば一価ナノボディ、二価ナノボディなど）、小モジュール免疫薬剤（ＳＭＩＰ）、およびサメ可変ＩｇＮＡＲドメインなども、本明細書で使用される際に、「抗原結合断片」という表現の内に包含される。
抗体の抗原結合断片は、典型的には、少なくとも一つの可変ドメインを含む。可変ドメインは、任意の大きさまたはアミノ酸組成であってもよく、一般的には、一つまたは複数のフレームワーク配列に隣接するかまたはインフレームである、少なくとも一つのＣＤＲを含むものとなる。ＶＬドメインに会合するＶＨドメインを有する抗原結合断片において、ＶＨドメインおよびＶＬドメインは、任意の適切な配置で互いに対して配置され得る。例えば、可変領域は、二量体であって、ＶＨ－ＶＨ、ＶＨ－ＶＬまたはＶＬ－ＶＬ二量体を含有してもよい。あるいは、抗体の抗原結合断片は、単量体のＶＨまたはＶＬドメインを含有してもよい。
ある実施形態では、抗体の抗原結合断片は、少なくとも一つの定常ドメインに共有結合された少なくとも一つの可変ドメインを含有していてもよい。本開示の抗体の抗原結合断片内で見出され得る可変ドメインおよび定常ドメインの非限定的な例示的な構成としては、（ｉ）ＶＨ－ＣＨ１、（ｉｉ）ＶＨ－ＣＨ２、（ｉｉｉ）ＶＨ－ＣＨ３、（ｉｖ）ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２、（ｖ）ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３、（ｖｉ）ＶＨ－ＣＨ２－ＣＨ３、（ｖｉｉ）ＶＨ－ＣＬ、（ｖｉｉｉ）ＶＬ－ＣＨ１、（ｉｘ）ＶＬ－ＣＨ２、（ｘ）ＶＬ－ＣＨ３、（ｘｉ）ＶＬ－ＣＨ１－ＣＨ２、（ｘｉｉ）ＶＬ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３、（ｘｉｉｉ）ＶＬ－ＣＨ２－ＣＨ３、および（ｘｉｖ）ＶＬ－ＣＬが挙げられる。上で列挙されたいずれかの例示的な構成を含む、可変ドメインおよび定常ドメインのいずれかの構成において、可変ドメインおよび定常ドメインは、互いに直接的に連結されていてもよいし、完全もしくは部分ヒンジまたはリンカー領域により連結されていてもよい。ヒンジ領域は、単一ポリペプチド分子における隣接する可変ドメインおよび／または定常ドメイン間の可撓性または準可撓性の連結をもたらす、少なくとも２個（例えば、５、１０、１５、２０、４０、６０個以上）のアミノ酸からなっていてもよい。さらに、抗原結合断片は、上記に列挙されたいずれかの可変領域および定常領域の構成のホモ二量体またはヘテロ二量体（またはその他の多量体）を、互いに非共有結合で、および／または一つまたは複数の単量体ＶＨドメインもしくはＶＬドメインとの非共有結合的な会合で（例えば、ジスルフィド結合により）、含んでいてもよい。
本明細書に提供される二重特異性抗原結合分子は、ヒト抗体および／もしくは遺伝子組換えヒト抗体、またはその断片を含んでいてもよいし、これらからなっていてもよい。「ヒト抗体」という用語は、本明細書において使用される際に、ヒト生殖系列イムノグロブリン配列由来の可変領域および定常領域を有する抗体を含む。それでもなお、ヒト抗体は、例えばＣＤＲにおいて、および特定のＣＤＲ３において、ヒト生殖系列イムノグロブリン配列によってコード化されていないアミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダムもしくは部位特異的な突然変異誘導により、またはインビボでの体細胞突然変異により導入された変異）を含んでもよい。しかし、「ヒト抗体」という用語は、本明細書で使用される際に、マウスなどの別の哺乳類種の生殖系列由来のＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列上に移植されている抗体を含むように意図されていない。
本開示の二重特異性抗原結合分子は、遺伝子組換えヒト抗体またはその抗原結合断片を含んでいてもよいし、これらからなっていてもよい。「組換えヒト抗体」という用語は、本明細書において使用される際に、組換え手段によって調製、発現、作製、または単離されるすべてのヒト抗体、例えば、宿主細胞（以下で詳述）にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを用いて発現された抗体、組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリ（以下で詳述）から単離された抗体、ヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックな動物（例えばマウス）から単離された抗体（例えば、Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：６２８７－６２９５を参照）、または他のＤＮＡ配列へヒト免疫グロブリン遺伝子配列のスプライシングを含む任意の他の手段によって調製、発現、作製、または単離される抗体などを含むことが意図される。その様な遺伝子組換えヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列由来の可変領域および定常領域を有する。しかし、ある実施形態では、その様な組換えヒト抗体は、インビトロでの突然変異誘発（または、ヒトＩｇ配列についてトランスジェニックな動物を使用する場合には、インビボでの体細胞の突然変異誘発）に供されるため、組換え抗体のＶＨ領域およびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列ＶＨ配列およびＶＬ配列に由来し関連する配列である一方で、インビボでのヒト抗体生殖系列レパートリー中には自然に存在し得ない。
二重特異性抗体を作製する方法は当分野に公知であり、この方法を使用して、本明細書に開示される二重特異性抗原結合分子を構築してもよい。本開示の状況で使用され得る例示的な二重特異性のフォーマットとしては、限定されないが、例えば、ｓｃＦｖベースまたはダイアボディの二重特異性フォーマット、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ融合体、二重可変ドメイン（ＤＶＤ）－Ｉｇ、クアドローマ（Ｑｕａｄｒｏｍａ）、ノブ・イントゥ・ホール（ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ）、共通軽鎖（例えば、ノブ・イントゥ・ホールを有する共通軽鎖など）、ＣｒｏｓｓＭａｂ、ＣｒｏｓｓＦａｂ、（ＳＥＥＤ）ボディ、ロイシンジッパー、デュオボディ（Ｄｕｏｂｏｄｙ）、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２、二重作用性Ｆａｂ（ＤＡＦ）－ＩｇＧ、およびＭａｂ２二重特異性フォーマット（前述のフォーマットの概説に関しては、例えばＫｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．２０１２，ｍＡｂｓ ４：６，１－１１、およびこの文献内に引用される参考文献を参照）が挙げられる。
本明細書に提供されるＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子に含まれ得る抗原結合ドメイン（Ｄ１およびＤ２）の例としては、本明細書に開示されるいずれかの抗ＨＥＲ２配列に由来する抗原結合ドメインが挙げられる。例えば、本開示は、表１に列挙されるいずれかのＨＣＶＲアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列を含むＨＣＶＲを含むＤ１またはＤ２抗原結合ドメインを含む、ＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子を含む。
また、表１に列挙されるいずれかのＬＣＶＲアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列を含むＬＣＶＲを含むＤ１またはＤ２抗原結合ドメインを含む、ＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子も提供される。
表１に列挙されるいずれかのＬＣＶＲアミノ酸配列とペア形成される表１に列挙されるいずれかのＨＣＶＲアミノ酸配列を含むＨＣＶＲとＬＣＶＲとのアミノ酸配列ペア（ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ）を含む、Ｄ１またはＤ２抗原結合ドメインを含むＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子が、本明細書に提供される。ある実施形態によれば、本発明は、表１に列挙されるいずれかの例示的な抗ＨＥＲ２抗体の含有するＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列ペアを含むＤ１またはＤ２抗原結合ドメインを含む、ＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子を提供する。
また、表１に列挙されるいずれかのＨＣＤＲ１アミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列を含む重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）を含む、Ｄ１またはＤ２抗原結合ドメインを含むＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子も、本明細書に提供される。
また、表１に列挙されるいずれかのＨＣＤＲ２アミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列を含む重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）を含む、Ｄ１またはＤ２抗原結合ドメインを含むＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子も提供される。
また、表１に列挙されるいずれかのＨＣＤＲ３アミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列を含む重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、Ｄ１またはＤ２抗原結合ドメインを含むＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子も提供される。
また、表１に列挙されるいずれかのＬＣＤＲ１アミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列を含む軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）を含む、Ｄ１またはＤ２抗原結合ドメインを含むＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子も提供される。
また、表１に列挙されるいずれかのＬＣＤＲ２アミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列を含む軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）を含む、Ｄ１またはＤ２抗原結合ドメインを含むＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子も提供される。
また、表１に列挙されるいずれかのＬＣＤＲ３アミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列を含む軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含む、Ｄ１またはＤ２抗原結合ドメインを含むＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子も提供される。
また、表１に列挙されるいずれかのＬＣＤＲ３アミノ酸配列とペア形成される表１に列挙されるいずれかのＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３とＬＣＤＲ３とのアミノ酸配列ペア（ＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３）を含む、Ｄ１またはＤ２抗原結合ドメインを含むＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子も提供される。ある実施形態によれば、本開示は、表１に列挙されたいずれかの例示的な抗ＨＥＲ２抗体の含有するＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３アミノ酸配列ペアを含む、抗体またはその抗原結合断片を提供する。
さらに、表１に列挙されるいずれかの例示的な抗ＨＥＲ２抗体の含有する六つのＣＤＲのセット（すなわち、ＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３－ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３）を含む、Ｄ１またはＤ２抗原結合ドメインを含むＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子が提供される。
関連の実施形態では、本開示は、表１に列挙される抗ＨＥＲ２配列から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列ペアの含有する六つのＣＤＲのセット（すなわちＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３－ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３）を含む、Ｄ１またはＤ２抗原結合ドメインを含むＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子を提供する。
本明細書に提供されるＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子は、表１のいずれかの抗ＨＥＲ２抗体に由来するＤ１抗原結合ドメインと、表１のいずれかの他の抗ＨＥＲ２抗体に由来するＤ２抗原結合ドメインとを含んでいてもよい。本開示のＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗体の非限定的な例を、本明細書に提供される実施例に図示する。
非限定的な例示として、本開示は、Ｄ１抗原結合ドメインとＤ２抗原結合ドメインとを含むＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子を含み、Ｄ１抗原結合ドメインは、配列番号２／１８のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列ペア、または配列番号４－６－８－２０－２２－２４を含む重鎖および軽鎖のＣＤＲのセット（ＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３－ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３）を含み、Ｄ２抗原結合ドメインは、配列番号１０／１８のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列ペア、または配列番号１２－１４－１６－２０－２２－２４を含む重鎖および軽鎖のＣＤＲのセット（ＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３－ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３）を含む。これらの配列の特徴を有する例示的なＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗体は、二重特異性抗体１（ｂｓＡｂ１）ともよばれるＨ４Ｈ１７３２５Ｄと称する二重特異性抗体である。
さらに別の非限定的な例示として、本開示は、Ｄ１抗原結合ドメインとＤ２抗原結合ドメインとを含むＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子を含み、Ｄ１抗原結合ドメインは、配列番号３２／１８のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列ペア、または配列番号３４－３６－３８－２０－２２－２４を含む重鎖および軽鎖のＣＤＲのセット（ＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３－ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３）を含み、Ｄ２抗原結合ドメインは、配列番号４０／１８のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列ペア、または配列番号４２－４４－４６－２０－２２－２４を含む重鎖および軽鎖のＣＤＲのセット（ＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３－ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３）を含む。これらの配列の特徴を有する例示的なＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗体は、二重特異性抗体２（ｂｓＡｂ２）ともよばれるＨ４Ｈ１７０８７Ｄと称する二重特異性抗体である。
多量体形成の構成成分
本明細書に提供される二重特異性抗原結合分子は、ある実施形態では、一つまたは複数の多量体形成の構成成分を含んでいてもよい。多量体形成の構成成分は、抗原結合ドメイン（Ｄ１およびＤ２）間の会合を維持するように機能することができる。本明細書に使用される際に、「多量体形成の構成成分」とは、同じもしくは類似の構造または構成の第二の多量体形成の構成成分と会合する能力を有する、任意の高分子、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、またはアミノ酸である。例えば、多量体形成の構成成分は、イムノグロブリンＣＨ３ドメインを含むポリペプチドであってもよい。多量体形成の構成成分の非限定的な例は、イムノグロブリンのＦｃ部分、例えば、アイソタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４、ならびに各アイソタイプ群内の任意のアロタイプから選択されるＩｇＧのＦｃドメインである。ある実施形態では、多量体形成の構成成分は、Ｆｃ断片であるか、または少なくとも一つのシステイン残基を含有する１～約２００アミノ酸の長さのアミノ酸配列である。その他の実施形態では、多量体形成の構成成分は、システイン残基、または短いシステイン含有ペプチドである。その他の多量体形成ドメインとしては、ロイシンジッパー、ヘリックスループモチーフ、またはコイルドコイルモチーフを含むかまたはこれらからなるペプチドまたはポリペプチドが挙げられる。
ある実施形態では、本明細書に提供される二重特異性抗原結合分子は、二つの多量体形成ドメインＭ１およびＭ２を含み、Ｄ１はＭ１に付加され、Ｄ２はＭ２に付加され、Ｍ１とＭ２との会合により、単一の二重特異性抗原結合分子におけるＤ１とＤ２との互いの物理的連結を促進する。ある実施形態において、Ｍ１およびＭ２は互いに同一である。例えば、Ｍ１は特定のアミノ酸配列を有するＦｃドメインとすることができ、Ｍ２はＭ１と同じアミノ酸配列を有するＦｃドメインとすることができる。あるいは、Ｍ１およびＭ２は、一つまたは複数のアミノ酸位置で互いに異なっていてもよい。例えば、Ｍ１は第一のイムノグロブリン（Ｉｇ）ＣＨ３ドメインを含んでいてもよく、Ｍ２は第二のＩｇ ＣＨ３ドメインを含んでいてもよく、第一および第二のＩｇ ＣＨ３ドメインは、少なくとも一つのアミノ酸が互いに異なっており、少なくとも一つのアミノ酸の差異は、同一のＭ１配列およびＭ２配列を有する参照構築物と比べて、標的指向性構築物とプロテインＡとの結合を減少させる。一実施形態では、Ｍ１のＩｇ ＣＨ３ドメインはプロテインＡと結合し、Ｍ２のＩｇ ＣＨ３ドメインは、例えばＨ９５Ｒ改変（ＩＭＧＴエクソン付番則による；ＥＵ付番則によればＨ４３５Ｒ）など、プロテインＡ結合を減少または消滅させる変異を含有する。Ｍ２のＣＨ３はさらに、Ｙ９６Ｆ改変（ＩＭＧＴによる；ＥＵによればＹ４３６Ｆ）を含んでいてもよい。Ｍ２のＣＨ３内に見出され得るさらに別の改変として、以下を挙げ得る：ＩｇＧ１ Ｆｃドメインの場合はＤ１６Ｅ、Ｌ１８Ｍ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによる；ＥＵによればＤ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、およびＶ４２２Ｉ）；ＩｇＧ２ Ｆｃドメインの場合はＮ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ；ＥＵによればＮ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、およびＶ４２２Ｉ）；ならびにＩｇＧ４ Ｆｃドメインの場合はＱ１５Ｒ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、Ｒ６９Ｋ、Ｅ７９Ｑ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによる；ＥＵによればＱ３５５Ｒ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、Ｒ４０９Ｋ、Ｅ４１９Ｑ、およびＶ４２２Ｉ）。
本開示の二重特異性抗原結合分子は、「単離されて」いてもよい。本明細書に使用される際に、「単離された二重特異性抗原結合分子」とは、その天然環境の少なくとも一つの構成成分から特定および分離され、および／または回収された二重特異性抗原結合分子を意味する。例えば、生物体の少なくとも一つの構成成分から、または本抗体が産生された組織もしくは細胞から分離されたかまたは取り出された二重特異性抗体は、本開示の目的で「単離された二重特異性抗体」である。単離された二重特異性抗原結合分子はまた、組換え細胞内でｉｎ ｓｉｔｕで分子を含む。単離された二重特異性抗原結合分子は、少なくとも一つの精製工程または単離工程に供されている分子である。ある実施形態によれば、単離された二重特異性抗原結合分子は、他の細胞性物質および／または化学物質を実質的に含まなくてもよい。
本明細書に開示される二重特異性抗原結合分子、またはその抗原結合ドメイン（Ｄ１および／またはＤ２）は、抗原結合タンパク質または抗原結合ドメインの由来する対応の生殖系列配列と比較して、重鎖および／または軽鎖の可変ドメインのフレームワークおよび／またはＣＤＲ領域における一つまたは複数のアミノ酸の置換、挿入、および／または欠失を含みうる。そのような変異は、本明細書に開示されるアミノ酸配列を、例えば公開抗体配列データベースから入手可能な生殖系列配列と比較することによって容易に確認され得る。本発明は、本明細書に開示される二重特異性抗原結合分子またはその抗原結合ドメイン（Ｄ１および／もしくはＤ２）を含み、それらは本明細書に開示されるいずれかのアミノ酸配列に由来し、一つまたは複数のフレームワークおよび／またはＣＤＲ領域内の一つまたは複数のアミノ酸は、抗体の由来する生殖系列配列の対応する残基、または別のヒト生殖系列配列の対応する残基、または対応する生殖系列残基の保存的アミノ酸置換へ変異する（そのような配列変化は、本明細書においてまとめて「生殖系列変異」と称される）。
当業者であれば、本明細書に開示される重鎖可変領域配列および軽鎖可変領域配列から開始して、一つまたは複数の個々の生殖系列変異またはそれらの組合せを含む、多くの二重特異性抗原結合分子またはその抗原結合ドメイン（Ｄ１および／またはＤ２）を容易に作製することができる。ある特定の実施形態では、ＶＨドメインおよび／またはＶＬドメイン内のフレームワーク残基および／またはＣＤＲ残基のすべてが、抗体の由来する元の生殖系列配列に見出される残基に再び変異される。他の実施形態では、ある特定の残基のみ、例えば、ＦＲ１の最初の８アミノ酸内、もしくはＦＲ４の最後の８アミノ酸内に見出される変異残基のみ、またはＣＤＲ１、ＣＤＲ２、もしくはＣＤＲ３内に見出される変異残基のみが、元の生殖系列配列に再び変異される。他の実施形態では、一つまたは複数のフレームワーク残基および／またはＣＤＲ残基が、異なる生殖系列配列（すなわち、抗体の元々由来する生殖系列配列とは異なる生殖系列配列）の対応する残基に変異される。
さらに、本開示の二重特異性抗原結合分子、またはその抗原結合ドメイン（Ｄ１および／またはＤ２）は、フレームワーク領域および／またはＣＤＲ領域内に二つ以上の生殖系列変異の任意の組合せを含有していてもよく、例えば、ある特定の個々の残基が、特定の生殖系列配列の対応する残基に変異される一方で、元の生殖系列配列とは異なるある特定の他の残基は、維持されるか、または異なる生殖系列配列の対応する残基に変異される。一つまたは複数の生殖細胞系列変異を含有する二重特異性抗原結合分子、またはその抗原結合ドメイン（Ｄ１および／またはＤ２）は、取得されると、一つまたは複数の所望の特性、例えば、結合特異性の改善、結合アフィニティの増加、アンタゴニスト性もしくはアゴニスト性の生物学的特性の改善または強化（場合によっては）、免疫原性の低下などについて試験することができる。この一般的な様式で取得された二重特異性抗原結合分子またはその抗原結合ドメイン（Ｄ１および／またはＤ２）は、本開示に包含される。
バリアント
本発明はまた、本明細書に開示されるＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、および／またはＣＤＲアミノ酸配列のいずれかのバリアントを含む、抗ＨＥＲ２抗体および二重特異性抗原結合分子も含む。この態様に含まれる例示的なバリアントには、一つまたは複数の置換、例えば保存的置換を有する、本明細書に開示されるいずれかのＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、および／またはＣＤＲのアミノ酸配列のバリアントが含まれる。一部の態様では、本開示は、本明細書の表１に記載されるいずれかのＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、および／またはＣＤＲのアミノ酸配列に対して、例えば、１０個以下、８個以下、６個以下、４個以下、３個以下、２個、または１個のアミノ酸置換を含むＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、および／またはＣＤＲのアミノ酸配列を有する、抗ＨＥＲ２抗体およびＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子を含み、改変された抗体および二重特異性抗原結合分子は、ＨＥＲ２への結合活性を維持する。
本開示のこの態様に含まれる例示的なバリアントにはまた、本明細書に開示されるいずれかのＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、および／またはＣＤＲのアミノ酸配列と実質的な配列同一性を有するバリアントが含まれる。アミノ酸配列という文脈で本明細書で使用される際に、「実質的な同一性」または「実質的に同一」という用語は、二つのアミノ酸配列が、例えばデフォルトのギャップ重み付けを使用したプログラムであるＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴなどによって最適に整列したとき、少なくとも９５％、９８％または９９％の配列同一性を共有することを意味する。ある実施形態では、同一ではない残基位置は、保存的アミノ酸置換が異なっている。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が、類似の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を伴う側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基により置換されるものである。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能的特性を実質的に変化させないものとなる。二つ以上のアミノ酸配列が保存的置換により互いに異なる場合、配列同一性のパーセントまたは類似性の程度は、置換の保存的性質を補正するために上向きに調整されてもよい。この調整を行うための手段は、当業者に周知されている。例えば、参照により本明細書に組み込まれるＰｅａｒｓｏｎ（１９９４）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７－３３１を参照されたい。類似の化学的特性を備えた側鎖を有するアミノ酸の基の例としては、（１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン、（２）脂肪族－ヒドロキシル側鎖：セリンおよびトレオニン、（３）アミド含有側鎖：アスパラギンおよびグルタミン、（４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン、（５）塩基性側鎖：リジン、アルギニン、およびヒスチジン、（６）酸性側鎖：アスパラギン酸およびグルタミン酸、ならびに（７）含硫側鎖：システインおよびメチオニンが挙げられる。好適な保存的アミノ酸置換基は、バリン－ロイシン－イソロイシン、フェニルアラニン－チロシン、リジン－アルギニン、アラニン－バリン、グルタミン酸－アスパラギン酸、およびアスパラギン－グルタミンである。あるいは、保存的置換とは、参照により本明細書に組み込まれるＧｏｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：１４４３－１４４５に開示されるＰＡＭ２５０対数尤度マトリクスにおいて正の値を有する任意の変化である。「中程度に保存的な」置換は、ＰＡＭ２５０対数尤度マトリクスにおいて、負ではない値を有する任意の変化である。
二つの異なるアミノ酸配列間の配列同一性は、典型的には、配列解析ソフトウェアを使用して測定される。配列解析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換を含む種々の置換、欠失および他の修飾へ割り当てられた類似性の測定値を用いて類似の配列と一致させる。例えば、ＧＣＧソフトウェアは、ＧＡＰおよびＢＥＳＴＦＩＴなどのプログラムを含有しており、これらプログラムをデフォルトのパラメータにより使用して、異なる生物種に由来する相同ポリペプチド、または野生型タンパク質とその変異体との間の相同ポリペプチドなどの非常に近縁なポリペプチド間の配列相同性または配列同一性を決定することができる。例えば、ＧＣＧ第６．１版を参照されたい。ポリペプチド配列は、ＧＣＧ第６．１版におけるプログラムである、既定パラメータまたは推奨パラメータを備えたＦＡＳＴＡを使用して比較することもできる。ＦＡＳＴＡ（例えば、ＦＡＳＴＡ２およびＦＡＳＴＡ３）は、クエリ配列と検索配列との間の最も良好な重複の領域のアラインメントおよび配列同一性パーセントを提供する（Ｐｅａｒｓｏｎ（２０００）上述）。本明細書に提供される配列を異なる生物体由来の多数の配列を含むデータベースと比較する場合の別の好ましいアルゴリズムは、コンピュータプログラムのＢＬＡＳＴであり、特にデフォルトパラメータを使用したＢＬＡＳＴＰまたはＴＢＬＡＳＴＮである。例えば、それぞれ本明細書に参照により組み込まれるＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０およびＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－４０２を参照されたい。
Ｆｃバリアントを含むＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子
本明細書に提供されるある特定の実施形態によれば、例えば、中性ｐＨと比較して酸性ｐＨで、ＦｃＲｎ受容体への抗体結合を増強または減弱させる一つまたは複数の突然変異を含むＦｃドメインを含む、ＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗原結合タンパク質が提供される。例えば、本開示は、ＦｃドメインのＣＨ２またはＣＨ３領域に変異を含むＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗原結合タンパク質を含み、変異は、酸性環境において（例えば、ｐＨが約５．５～約６．０の範囲のエンドソームにおいて）ＦｃＲｎに対するＦｃドメインの親和性を増加させる。そのような変異は、動物に投与された際に抗体の血清半減期の増加をもたらし得る。そのようなＦｃ改変の非限定的な例としては、例えば、２５０位（例えば、ＥもしくはＱ）、２５０位および４２８位（例えば、ＬもしくはＦ）、２５２位（例えば、Ｌ／Ｙ／Ｆ／ＷもしくはＴ）、２５４位（例えば、ＳもしくはＴ）、および２５６位（例えば、Ｓ／Ｒ／Ｑ／Ｅ／ＤもしくはＴ）の改変、または４２８位および／もしくは４３３位（例えば、Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｐ／ＱもしくはＫ）および／もしくは４３４位（例えば、Ｈ／ＦもしくはＹ）の改変、または２５０位および／もしくは４２８位の改変、または３０７位もしくは３０８位（例えば、３０８Ｆ、Ｖ３０８Ｆ）および４３４位における改変が挙げられる。一実施形態では、改変は、４２８Ｌ（例えば、Ｍ４２８Ｌ）および４３４Ｓ（例えば、Ｎ４３４Ｓ）の改変、４２８Ｌ、２５９Ｉ（例えば、Ｖ２５９Ｉ）、および３０８Ｆ（例えば、Ｖ３０８Ｆ）の改変、４３３Ｋ（例えば、Ｈ４３３Ｋ）および４３４（例えば、４３４Ｙ）の改変、２５２、２５４、および２５６（例えば、２５２Ｙ、２５４Ｔ、および２５６Ｅ）の改変、２５０Ｑおよび４２８Ｌの改変（例えば、Ｔ２５０ＱおよびＭ４２８Ｌ）、ならびに３０７および／または３０８の改変（例えば、３０８Ｆおよび／または３０８Ｐ）を含む。
例えば、本開示は、以下からなる群から選択される一つまたは複数のペアまたは群の変異を含むＦｃドメインを含む、ＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗原結合タンパク質を含む：２５０Ｑおよび２４８Ｌ（例えば、Ｔ２５０ＱおよびＭ２４８Ｌ）；２５２Ｙ、２５４Ｔおよび２５６Ｅ（例えば、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４ＴおよびＴ２５６Ｅ）；４２８Ｌおよび４３４Ｓ（例えば、Ｍ４２８ＬおよびＮ４３４Ｓ）；ならびに４３３Ｋおよび４３４Ｆ（例えば、Ｈ４３３ＫおよびＮ４３４Ｆ）。前述のＦｃドメイン変異、および本明細書に開示される抗体可変ドメイン内の他の変異のあらゆる可能な組合せが、本開示の範囲内にあることが想定される。
本明細書に提供される抗原結合分子の生物学的特徴
高親和性でヒトＨＥＲ２（例えば、ｈＥｒｂＢ２ ｅｃｔｏ－ｍＦｃ）に結合するＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗原結合タンパク質が、本明細書に提供される。例えば、本開示は、例えば本明細書の実施例８に規定されるアッセイフォーマットまたは実質的に類似したアッセイを用いて、２５℃での表面プラズモン共鳴により測定された際に約３ｎＭ未満のＫＤでヒトＨＥＲ２に結合する、抗ＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗原結合タンパク質を含む。ある実施形態によれば、例えば本明細書の実施例８に規定されるアッセイフォーマットまたは実質的に類似したアッセイを用いて、表面プラズモン共鳴により測定された際に約１ｎＭ未満、約０．９ｎＭ未満、約０．８ｎＭ未満、約０．７ｎＭ未満、約０．６ｎＭ未満、約０．５ｎＭ未満、約０．４ｎＭ未満、約０．３ｎＭ未満、約０．２５ｎＭ未満、約２００ｐＭ未満、約１５０ｐＭ未満、約１００ｐＭ未満、または約５０ｐＭ未満のＫＤで２５℃でヒトＨＥＲ２に結合する、抗ＨＥＲ２抗体が提供される。
また、例えば本明細書の実施例８に規定されるアッセイフォーマットまたは実質的に類似したアッセイを用いて、２５℃での表面プラズモン共鳴により測定された際に約２０分を超える解離半減期（ｔ１／２）でヒトＨＥＲ２（例えば、ｈＥｒｂＢ２ ｅｃｔｏ－ｍＦｃ）に結合する、ＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗原結合タンパク質も、本明細書に提供される。ある実施形態によれば、例えば本明細書の実施例８に規定されるアッセイフォーマットまたは実質的に類似したアッセイを用いて、表面プラズモン共鳴により測定した際に約２０分を超える、約２５分を超える、約３０分を超える、約４０分を超える、約５０分を超える、約６０分を超える、約７０分を超える、約８０分を超える、約９０分を超える、約１００分を超える、約２００分を超える、約３００分を超える、約４００分を超える、約５００分を超える、約６００分を超える、約７００分を超える、約８００分を超える、約９００分を超える、約１０００分を超える、約１１００分を超える、またはそれらより長いｔ１／２で２５℃でヒトＨＥＲ２に結合する、ＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗原結合タンパク質が提供される。
また、早期エンドソームにおける内部移行、および早期エンドソームからリソソームへの輸送を呈するＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗原結合タンパク質も、本明細書に提供される。また、ＨＥＲ２の表面クラスターを形成し内部移行を誘導する、ＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗原結合タンパク質も、本明細書に提供される。
本開示の抗原結合タンパク質は、前述の生物学的特徴のうち一つまたは複数、またはそれらの任意の組合せを保有してもよい。抗体の生物学的特徴の前述のリストは、包括的であることを意図されない。本明細書に提供される抗体の他の生物学的特徴は、本明細書の実施例を含む本開示の検討から当業者に明らかになるものとなる。
抗体－薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）
本明細書では、細胞傷害剤、化学療法薬、または放射性同位体などの治療部分とコンジュゲートされたＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗原結合タンパク質を含む抗体－薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）が提供される。
細胞傷害剤としては、細胞の成長、生存能、または増殖に有害な任意の剤が挙げられ、以下に限定されないが、チューブリン相互作用剤およびＤＮＡ損傷剤が挙げられる。一部の実施形態では、細胞傷害剤は、チューブリン阻害剤である。特定の実施形態では、チューブリン阻害剤は、チューブリン重合を阻害する。一部の実施形態では、細胞傷害性ペイロードは、トポイソメラーゼＩ阻害剤である。一部の実施形態では、細胞傷害剤は、メイタンシノイド、アウリスタチン、ヘミアステリン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ピロロベンゾジアゼピン、パクリタキセル、ドセタキセル、クリプトフィシン、ツブリシン、またはカンプトテシンである。また、本開示のこの態様に従って抗ＨＥＲ２抗体にコンジュゲートされ得る適切な細胞傷害剤および化学療法剤の例としては、例えば、１－（２クロロエチル）－１，２－ジメタンスルホニルヒドラジド、１，８－ジヒドロキシ－ビシクロ［７．３．１］トリデカ－４，９－ジエン－２，６－ジイン－１３－オン、１－デヒドロテストステロン、５－フルオロウラシル、６－メルカプトプリン、６－チオグアニン、９－アミノカンプトテシン、アクチノマイシンＤ、アマニチン、アミノプテリン、アングイジン、アントラサイクリン、アントラマイシン（ＡＭＣ）、アウリスタチン、ブレオマイシン、ブスルファン、酪酸、カリケアミシン（例えば、カリケアミシンγ１）、カンプトテシン、カルミノマイシン、カルムスチン、セマドチン、シスプラチン、コルヒチン、コンブレタスタチン、シクロホスファミド、シタラビン、サイトカラシンＢ、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デカルバジン、ジアセトキシペンチルドキソルビシン、ジブロモマンニトール、ジヒドロキシアントラシンジオンン、ジソラゾール、ドラスタチン（例えば、ドラスタチン１０）、ドキソルビシン、デュオカルマイシン、エキノマイシン、エリュテロビン、エメチン、エポチロン、エスペラミシン、エストラムスチン、エチジウムブロマイド、エトポシド、フルオロウラシル、ゲルダナマイシン、グラミシジンＤ、グルココルチコイド、イリノテカン、キネシンスピンドルタンパク質（ＫＳＰ）阻害剤、レプトマイシン、ロイロシン、リドカイン、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、メイタンシノイド、メクロレタミン、メルファラン、メルカプトプリン、メトプテリン、メトトレキサート、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、Ｎ８－アセチルスペルミジン、ポドフィロトキシン、プロカイン、プロプラノロール、プテリジン、ピューロマイシン、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、リゾキシン、ストレプトゾトシン、タリソマイシン、タキソール、テノポシド、テトラカイン、チオエパクロラムブシル、トマイマイシン、トポテカン、ツブリシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、およびそれらのいずれかの誘導体が挙げられる。ある実施形態によれば、抗ＨＥＲ２抗体にコンジュゲートされる細胞傷害剤は、ＤＭ１またはＤＭ４などのメイタンシノイド、トマイマイシン誘導体、またはドラスタチン誘導体である。ある実施形態によれば、抗ＨＥＲ２抗体にコンジュゲートされる細胞傷害剤は、ＭＭＡＥ、ＭＭＡＦ、またはその誘導体などのオーリスタチンである。一部の実施形態では、細胞傷害剤は、Ｄｘｄまたはその誘導体である。一部の実施形態では、細胞傷害剤はＡＺ１３５９９１８５である（例えば、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１６ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ２９，１１７－１２９を参照）。当分野に公知の他の細胞傷害剤も本開示の範囲内にあることが想定され、例えばリシン、Ｃ．ディフィシル毒素、シュードモナス外毒素、リシン、ジフテリア毒素、ボツリヌス毒素、ブリオジン（ｂｒｙｏｄｉｎ）、サポニン、ヤマゴボウ毒素（すなわち、フィトラッカトキシンおよびフィトラッキゲニン）などのタンパク質毒素、およびＳａｐｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．＆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，２０１３，１３８：４５２－４６９に記載されるものなどの他の毒素が挙げられる。一部の実施形態では、細胞傷害剤は、ツブリシン、メイタンシノイド、またはカンプトテシンである。
ある実施形態では、細胞傷害剤はツブリシンである。適切なツブリシンは、２０１９年１２月２０日出願の米国特許出願第１６／７２４，１６４号に記載されるものを含む。一部の実施形態では、ツブリシンは、２０１９年１２月２０日出願の米国特許出願第１６／７２４，１６４号から引用される化合物ＩＶａ、ＩＶａ’、ＩＶｂ、ＩＶｃ、ＩＶｄ、ＩＶｅ、ＩＶｆ、ＩＶｇ、ＩＶｈ、ＩＶｊ、ＩＶｋ、ＩＶ－ｌ、ＩＶｍ、ＩＶｎ、ＩＶｏ、ＩＶｐ、ＩＶｑ、ＩＶｒ、ＩＶｓ、ＩＶｔ、ＩＶｕ、ＩＶｖＡ、ＩＶｖＢ、ＩＶｗ、ＩＶｘ、ＩＶｙ、Ｖａ、Ｖａ’、Ｖｂ、Ｖｃ、Ｖｄ、Ｖｅ、Ｖｆ、Ｖｇ、Ｖｈ、Ｖｉ、Ｖｊ、Ｖｋ、Ｖｉａ、ＶＩｂ、ＶＩｃ、ＶＩｄ、ＶＩｅ、ＶＩｆ、ＶＩｇ、ＶＩｈ、ＶＩ、ＶＩｉ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、Ｄ－５ａ、またはＤ－５ｃである。ある特定の実施形態では、ツブリシンは、２０１９年１２月２０日出願の米国特許出願第１６／７２４，１６４号の化合物Ｖｅである。一部の実施形態では、ツブリシンは、以下の構造を有する。
Figure 2023515941000001
ツブリシン１Ａは、２０１９年１２月２０日出願の米国特許出願第１６／７２４，１６４号に開示される方法を用いて調製することができる。
ある実施形態では、細胞傷害剤は、メイタンシノイド、例えばメイタンシンの誘導体である。適切なメイタンシノイドとしては、ＤＭ１、ＤＭ４、またはその誘導体、立体異性体、もしくはアイソトポログが挙げられる。また、適したメイタンシノイドとしては、以下に限定されないが、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＷＯ２０１４／１４５０９０Ａ１、ＷＯ２０１５／０３１３９６Ａ１、米国特許出願公開第２０１６／０３７５１４７号Ａ１、および米国特許出願公開第２０１７／０２０９５９１号Ａ１に開示されるものが挙げられる。一部の実施形態では、メイタンシノイドはＤＭ１である。
一部の実施形態では、メイタンシノイドは、以下の構造を有し：
Figure 2023515941000002
式中、Ａは、任意選択的に置換されるアリーレンまたはヘテロアリーレンである。
一部の実施形態では、メイタンシノイドは、以下の構造を有し：
Figure 2023515941000003
式中、Ａは、任意選択的に置換されるアリーレンまたはヘテロアリーレンである。
一部の実施形態では、メイタンシノイドは、以下の構造を有し：
Figure 2023515941000004
式中、ｎは１～１２の整数であり、Ｒ１はアルキルである。
一部の実施形態では、メイタンシノイドは、以下である。
Figure 2023515941000005
Figure 2023515941000006
Figure 2023515941000007
Figure 2023515941000008
一部の実施形態では、メイタンシノイドは、以下である。
Figure 2023515941000009
一部の実施形態では、メイタンシノイドは、以下である。
Figure 2023515941000010
一部の実施形態では、細胞傷害剤は、カンプトテシン、例えば、カンプトテシンの類似体または誘導体である。一部の実施形態では、ＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗原結合タンパク質、例えば抗体は、エキサテカン、デルクステカン、ＤＸ－８９５１、ＤＸｄ、カンプトテシン、またはその誘導体もしくは類似体にコンジュゲートされる。特定の実施形態では、細胞傷害剤はＤＸｄである。特定の実施形態では、細胞傷害剤は、以下である。
Figure 2023515941000011
また、一つまたは複数の放射性核種にコンジュゲートされた抗ＨＥＲ２抗体を含む抗体－放射性核種コンジュゲート（ＡＲＣ）が、本明細書に提供される。本開示の態様の状況で使用され得る放射性核種の例としては、以下に限定されないが、例えば、２２５Ａｃ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、１３１Ｉ、１８６Ｒｅ、２２７Ｔｈ、２２２Ｒｎ、２２３Ｒａ、２２４Ｒａ、および９０Ｙが挙げられる。
ある実施形態では、リンカー分子を介して細胞傷害剤（例えば、上記に開示されるいずれかの細胞傷害剤）とコンジュゲートされたＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗原結合タンパク質を含むＡＤＣが提供される。リンカーは、本明細書に記載される抗体または抗原結合タンパク質を、例えば細胞傷害剤などの治療部分と連結、接続、または結合する任意の群または部分である。適切なリンカーは、例えば、それぞれの内容が参照によりその全体を本明細書に組み込まれるＡｎｔｉｂｏｄｙ－Ｄｒｕｇ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎｓ；Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，Ｇ．Ｌ．，Ｅｄ．；Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２０１３；Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｄｒｕｇ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ；Ｄｕｃｒｙ，Ｌ．，Ｅｄ．；Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，２０１３；Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｄｒｕｇ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ；Ｗａｎｇ，Ｊ．，Ｓｈｅｎ，Ｗ．－Ｃ．，ａｎｄ Ｚａｒｏ，Ｊ．Ｌ．，Ｅｄｓ．；Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，２０１５に見出され得る。概して、本明細書に記載の抗体コンジュゲートに適した結合媒介リンカーは、抗体の循環半減期を活用するのに充分な安定性があると同時に、抗原により媒介されるこのコンジュゲートの内在化の後にペイロードを放出することができるリンカーである。リンカーは、切断可能であっても切断不可能であってもよい。切断可能なリンカーとしては、内在化後に例えば加水分解、還元または酵素反応を介した切断などの細胞内代謝により切断されるリンカーが挙げられる。切断不可能なリンカーとしては、内在化後の抗体のリソソーム分解を介して、付加されたペイロードを放出するリンカーが挙げられる。適切なリンカーとしては、以下に限定されないが、酸不安定性リンカー、加水分解不安定性リンカー、酵素切断可能なリンカー、還元不安定性リンカー、自己犠牲（ｓｅｌｆ－ｉｍｍｏｌａｔｉｖｅ）リンカー、および切断不可能なリンカーが挙げられる。また、適切なリンカーとしては、以下に限定されないが、ペプチド、グルクロニド、スクシンイミド－チオエーテル、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）単位、ヒドラゾン、マル－カプロイル（ｍａｌ－ｃａｐｒｏｙｌ）単位、ジペプチド単位、バリン－シトルリン単位、およびパラ－アミノベンジル（ＰＡＢ）単位であるかまたはそれらを含むリンカーが挙げられる。
当技術分野で公知の任意のリンカー分子またはリンカー技術を使用して、本開示のＡＤＣを作製または構築することができる。ある特定の実施形態では、リンカーは切断可能なリンカーである。他の実施形態によれば、リンカーは切断不可能なリンカーである。本開示の状況で使用され得る例示的なリンカーとしては、例えば、ＭＣ（６－マレイミドカプロイル）、ＭＰ（マレイミドプロパノイル）、ｖａｌ－ｃｉｔ（バリン－シトルリン）、ｖａｌ－ａｌａ（バリン－アラニン）、プロテアーゼ切断リンカー中のジペプチド部位、ａｌａ－ｐｈｅ（アラニン－フェニルアラニン）、プロテアーゼ切断リンカー中のジペプチド部位、ＰＡＢ（ｐ－アミノベンジルオキシカルボニル）、ＳＰＰ（Ｎ－スクシンイミジル ４－（２－ピリジルチオ）ペンタン酸塩）、ＳＭＣＣ（Ｎ－スクシンイミジル ４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１カルボン酸塩）、ＳＩＡＢ（Ｎ－スクシンイミジル（４－ヨード－アセチル）アミノ安息香酸塩）、ならびにそれらのバリアントおよび組合せを含むかまたはそれらからなるリンカーが挙げられる。本開示の状況で使用され得る追加の例示的リンカーは、例えば、その内容が参照により本明細書にその全体を組み込まれる米国特許第７，７５４，６８１号、およびＤｕｃｒｙ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，２０１０，２１：５－１３、ならびにそれらに引用される参照文献に提供される。
ある実施形態では、リンカーは、生理学的条件下で安定である。ある実施形態では、リンカーは切断可能であり、例えば、酵素の存在下、または特定のｐＨ範囲もしくはｐＨ値で、少なくともペイロード部分を放出することができる。一部の実施形態では、リンカーは、酵素切断可能な部分を含む。例示的な酵素切断可能な部分としては、以下に限定されないが、ペプチド結合、エステル結合、ヒドラゾン、およびジスルフィド結合が挙げられる。一部の実施形態では、リンカーは、カテプシン切断可能なリンカーを含む。
一部の実施形態では、リンカーは、切断不可能な部分を含む。
適切なリンカーとしてはまた、以下に限定されないが、例えば抗体など単一の結合剤の二つのシステイン残基に化学的に結合されるリンカーが挙げられる。そのようなリンカーは、コンジュゲーションプロセスの結果として破壊される抗体のジスルフィド結合を模倣する役目を果たすことができる。
一部の実施形態では、リンカーは、一つまたは複数のアミノ酸を含む。一部の実施形態では、リンカーは、２アミノ酸を含む。一部の実施形態では、リンカーは、３アミノ酸を含む。一部の実施形態では、リンカーは、４アミノ酸を含む。適したアミノ酸として、天然、非天然、標準、非標準、タンパク質を構成する、タンパク質を構成しない、およびＬ－またはＤ－αアミノ酸が挙げられる。一部の実施形態では、リンカーは、アラニン、バリン、グリシン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、トリプトファン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン、ヒスチジン、もしくはシトルリン、それらの誘導体、またはそれらの組合せを含む。ある実施形態では、一つまたは複数のアミノ酸側鎖が、以下に記載される側鎖群に連結される。一部の実施形態では、リンカーは、バリンおよびシトルリンを含む。一部の実施形態では、リンカーは、リシン、バリン、およびシトルリンを含む。一部の実施形態では、リンカーは、リシン、バリン、およびアラニンを含む。一部の実施形態では、リンカーは、バリンおよびアラニンを含む。一部の実施形態では、リンカーは、ジペプチド、トリペプチド、またはテトラペプチドを含む。一部の実施形態では、リンカーはペプチドを含み、ペプチドは、バリン－シトルリン（ｖａｌ－ｃｉｔまたはＶＣ）、グルタミン酸－バリン－シトルリン（ＥＶＣ）、またはグリシン－グリシン－フェニルアラニン－グリシン（ＧＧＦＣ）である。
一部の実施形態では、リンカーは、自己犠牲基を含む。自己犠牲基は、当業者に公知の任意のそのような基であり得る。特定の実施形態では、自己犠牲基は、ｐ－アミノベンジル（ＰＡＢ）、またはその誘導体である。有用な誘導体としては、ｐ－アミノベンジルオキシカルボニル（ＰＡＢＣ）が挙げられる。一部の実施形態では、リンカーは、以下の構造を有する部分を含む。
Figure 2023515941000012
当業者は、自己犠牲基が、ペイロードからリンカーの残存原子を放出する化学反応を行うことができることを認識するものとなる。
一部の実施形態では、リンカーは以下であり：
Figure 2023515941000013
式中、
Figure 2023515941000014
は、抗体または抗原結合タンパク質との（例えば、リシン残基を介した）結合であり、
Figure 2023515941000015
は、細胞傷害剤（例えば、ＤＭ１）との結合である。一部の実施形態では、リンカーは以下であり：
Figure 2023515941000016
式中、
Figure 2023515941000017
は、抗体または抗原結合タンパク質との（例えば、リシン残基を介した）結合であり、
Figure 2023515941000018
は、細胞傷害剤（例えば、ＤＭ１）との結合である。ある実施形態では、リンカーは以下である。
Figure 2023515941000019
ある実施形態では、リンカーは以下である。
Figure 2023515941000020
一部の実施形態では、リンカーは、マレイミジルメチル－４－トランス－シクロヘキサンカルボキシコハク酸塩から誘導される。
Figure 2023515941000021
一部の実施形態では、リンカーは以下であり：
Figure 2023515941000022
式中、
Figure 2023515941000023
は、抗体または抗原結合タンパク質との（例えばリシン残基を介した）結合であり、
Figure 2023515941000024
は、細胞傷害剤（例えば、以下の式を有する化合物）との結合である。
Figure 2023515941000025
適切なリンカーとしては、以下に限定されないが、一つまたは複数の環状部分を含むリンカーが挙げられる。一部の実施形態では、環状部分は、環状付加反応に由来する。ある実施形態では、環状部分は、アジドとアルキン、例えばシクロアルキンとの間の１－３－環化付加反応に由来する。一部の実施形態では、環状部分は以下である。
Figure 2023515941000026
一部の実施形態では、リンカーは、一つまたは複数のスペーサーを含む。適切なスペーサーは、例えば、共有結合的に、またはイオン相互作用を介して、二つのリンカー部分、ペイロードを有するリンカー部分、または抗体を有するリンカー部分を連結する部分を含む。ある実施形態では、スペーサーはＰＥＧ基である。
本開示は、リンカーがＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗原結合タンパク質を、本抗体または抗原結合分子内の特定のアミノ酸での付加を介して薬剤または細胞毒へと接続する、ＡＤＣを含む。この態様の状況で使用され得る例示的なアミノ酸付加は、例えば、リシン（例えば、米国特許第５，２０８，０２０号；米国特許出願公開第２０１０／０１２９３１４号；Ｈｏｌｌａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，２００８，１９：３５８－３６１；ＷＯ２００５／０８９８０８；米国特許第５，７１４，５８６号；米国特許出願公開第２０１３／０１０１５４６号；および米国特許出願公開第２０１２／０５８５５９２号を参照）、システイン（例えば、米国特許出願公開第２００７／０２５８９８７号；ＷＯ２０１３／０５５９９３；ＷＯ２０１３／０５５９９０；ＷＯ ２０１３／０５３８７３；ＷＯ２０１３／０５３８７２；ＷＯ２０１１／１３０５９８；米国特許出願公開第２０１３／０１０１５４６号；および米国特許第７，７５０，１１６号を参照）、セレノシステイン（例えば、ＷＯ２００８／１２２０３９；およびＨｏｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，２００８，１０５：１２４５１－１２４５６を参照）、ホルミルグリシン（例えば、Ｃａｒｒｉｃｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２００７，３：３２１－３２２；Ａｇａｒｗａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，２０１３，１１０：４６－５１、およびＲａｂｕｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，２０１２，１０：１０５２－１０６７を参照）、非天然アミノ酸（例えば、ＷＯ２０１３／０６８８７４およびＷＯ２０１２／１６６５５９を参照）、および酸性アミノ酸（例えば、ＷＯ２０１２／０５９８２を参照）である。リンカーはまた、炭水化物（例えば、米国特許出願公開第２００８／０３０５４９７号、ＷＯ２０１４／０６５６６１、およびＲｙａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｆｏｏｄ ＆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００１，１３：１２７－１３０を参照）およびジスルフィドリンカー（例えば、ＷＯ２０１３／０８５９２５、ＷＯ２０１０／０１０３２４、ＷＯ２０１１／０１８６１１、およびＳｈａｕｎａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２００６，２：３１２－３１３を参照）への付加を介して抗原結合タンパク質にコンジュゲートされてもよい。また、部位特異的なコンジュゲーション技法を採用して、抗体または抗原結合タンパク質の特定の残基へ直接的にコンジュゲートさせてもよい（例えば、Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ（２０１６）３６（Ｓｕｐｐｌ １）：１００を参照）。部位特異的なコンジュゲーション技法としては、以下に限定されないが、トランスグルタミナーゼを介したグルタミンコンジュゲーションが挙げられる（例えば、Ｓｃｈｉｂｌｉ，Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍｉｅ Ｉｎｔｅｒ Ｅｄ．２０１０，４９，９９９５を参照）。
ある実施形態によれば、本開示は、参照により本明細書にその全体を組み込まれる国際特許出願公開ＷＯ２０１４／１４５０９０に記載されるリンカー－薬剤組成物（例えば、本明細書において「Ｍ００２６」とも呼ばれかつ以下に記載される化合物「７」）へ本明細書に記載のＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗原結合タンパク質がコンジュゲートされた、ＡＤＣを提供する。
Figure 2023515941000027
本明細書では、単一特異性抗ＨＥＲ２抗体およびＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗体を含む抗体－薬剤コンジュゲートも提供され、ここでは、前記ＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗体は、細胞傷害剤にコンジュゲートされている。ある実施形態では、細胞傷害剤は、メイタンシノイドである。ある実施形態では、メイタンシノイドは、以下の式を有する化合物である：
Figure 2023515941000028
式中、ｎは１～１２の整数であり、Ｒ１はアルキルである。ある実施形態では、メイタンシノイドは以下である。
Figure 2023515941000029
ある実施形態では、細胞傷害剤はメイタンシノイドであり、このメイタンシノイドは、切断不可能なリンカーを介して抗体に共有結合により付加される。ある実施形態では、細胞傷害剤はメイタンシノイドであり、このメイタンシノイドは、切断可能なリンカーを介して抗体に共有結合により付加される。
一実施形態では、二重特異性抗体は、以下にコンジュゲートされ：
Figure 2023515941000030
式中、
Figure 2023515941000031
は、抗体との結合である。
一実施形態では、二重特異性抗体は、以下にコンジュゲートされ：
Figure 2023515941000032
式中、
Figure 2023515941000033
は、抗体との結合である。
一実施形態では、二重特異性抗体は、以下にコンジュゲートされ：
Figure 2023515941000034
式中、
Figure 2023515941000035
は、抗体との結合である。
一実施形態では、二重特異性抗体は、以下にコンジュゲートされ：
Figure 2023515941000036
式中、
Figure 2023515941000037
は、抗体との結合である。
一部の実施形態では、二重特異性抗体は、以下にコンジュゲートされ：
Figure 2023515941000038
式中、Ｌはリンカーであり、
Figure 2023515941000039
は抗体との結合である。
一部の実施形態では、二重特異性抗体は、以下：
Figure 2023515941000040
またはその位置異性体にコンジュゲートされ、式中、ＳＰはスペーサーであり、
Figure 2023515941000041
は抗体との結合である。
一部の実施形態では、二重特異性抗体は、以下：
Figure 2023515941000042
またはその位置異性体にコンジュゲートされ、式中、
Figure 2023515941000043
は、抗体のグルタミン残基との結合である。ある実施形態では、グルタミンは、重鎖Ｑ２９５グルタミンである。ある実施形態では、二重特異性抗体は、重鎖Ｑ２９５およびＱ２９７にコンジュゲートされ、前記Ｑ２９７は、Ｎ２９７Ｑ変異に由来する。
一部の実施形態では、二重特異性抗体は、以下に結合され：
Figure 2023515941000044
式中、
Figure 2023515941000045
は、抗体のグルタミン残基との結合である。ある実施形態では、グルタミンは、重鎖Ｑ２９５グルタミンである。ある実施形態では、二重特異性抗体は、重鎖Ｑ２９５およびＱ２９７にコンジュゲートされ、前記Ｑ２９７は、Ｎ２９７Ｑ変異に由来する。
一部の実施形態では、コンジュゲートは、以下の構造を有し：
Ａｂ－［Ｌ－Ｐａｙ］ｎ
式中：
Ａｂは、本明細書に記載のＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗原結合タンパク質であり、
Ｌはリンカーであり、
Ｐａｙは細胞傷害剤であり、
ｎは１～１２の整数である。
一部の実施形態では、ｎは２である。一部の実施形態では、ｎは４である。一部の実施形態では、Ｐａｙは以下：
Figure 2023515941000046
である。
一部の実施形態では、Ｌは、切断可能なリンカーである。一部の実施形態では、Ｌはペプチドを含む。一部の実施形態では、Ｌはｖａｌ－ｃｉｔを含む。一部の実施形態では、Ｌは以下を含む。
Figure 2023515941000047
一部の実施形態では、ＬはＰＥＧ基を含む。一部の実施形態では、Ｌは環状部分を含む。ある実施形態では、環状部分は、アジドとシクロアルキンとの１，３－環化付加の生成物である。一部の実施形態では、－Ｌ－Ｐａｙは、
Figure 2023515941000048
であり、ＳＰ１およびＳＰ２はそれぞれ独立してスペーサーであり、
Figure 2023515941000049
は環状部分であり、
Figure 2023515941000050
は重鎖グルタミンとの結合である。一部の実施形態では、グルタミンは、Ｑ２９５グルタミンである。一部の実施形態では、ｎは２であり、式中、二つのＬ－ＰａｙはＱ２９５にコンジュゲートされている。一部の実施形態では、ｎは４であり、式中、二つのＬ－ＰａｙはＱ２９５にコンジュゲートされており、二つのＬ－ＰａｙはＱ２９７にコンジュゲートされている。一部の実施形態では、環状部分は、環状付加反応の産物である。ある実施形態では、環状部分は、アジドとシクロアルキンとの環化付加反応の産物である。ある実施形態では、環状部分は以下：
Figure 2023515941000051
である。ある実施形態では、ＳＰ１はＰＥＧ部分を含む。ある実施形態では、ＳＰ２はジペプチドを含む。ある実施形態では、ＳＰ２はｖａｌ－ｃｉｔを含む。ある実施形態では、ＳＰ２は以下：
Figure 2023515941000052
を含む。ある実施形態では、ＳＰ２はＰＥＧ部分を含む。一部の実施形態では、ＳＰ２－Ｐａｙは以下：
Figure 2023515941000053
である。ある実施形態では、
Figure 2023515941000054
は、
Figure 2023515941000055
またはその位置異性体である。
ある実施形態では、
Figure 2023515941000056
は、
Figure 2023515941000057
（ツブリシン１ｂ）またはその位置異性体であって、
Figure 2023515941000058
は前記抗体との結合である。
一部の実施形態では、Ａｂは、ＷＯ２０１５／１５７５９２に開示されるリンカーペイロードまたはペイロード、例えば、その中に開示される化合物Ｔ３２にコンジュゲートされている。一部の実施形態では、Ａｂは、任意選択的にＧＧＦＧを含むリンカーを介して、デルクステカン（ＤＸｄ）にコンジュゲートされている。
一部の実施形態では、Ａｂは、配列番号２のＤ１－ＨＣＶＲアミノ酸配列内のＣＤＲと、配列番号１０のＤ２－ＨＣＶＲアミノ酸配列内のＣＤＲとを含む、ＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗原結合タンパク質である。一部の態様では、ＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗原結合タンパク質はさらに、配列番号１８のＬＣＶＲアミノ酸配列内のＣＤＲを含む。一部の実施形態では、Ａｂは、配列番号２のＤ１－ＨＣＶＲアミノ酸配列と、配列番号１０のＤ２－ＨＣＶＲアミノ酸配列とを含む、ＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗原結合タンパク質である。一部の態様では、ＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗原結合タンパク質はさらに、配列番号１８のＬＣＶＲアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、Ａｂは、配列番号３２のＤ１－ＨＣＶＲアミノ酸配列内のＣＤＲと、配列番号４０のＤ２－ＨＣＶＲアミノ酸配列内のＣＤＲとを含む、ＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗原結合タンパク質である。一部の態様では、ＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗原結合タンパク質はさらに、配列番号１８のＬＣＶＲアミノ酸配列内のＣＤＲを含む。一部の実施形態では、Ａｂは、配列番号３２のＤ１－ＨＣＶＲアミノ酸配列と、配列番号４０のＤ２－ＨＣＶＲアミノ酸配列とを含む、ＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗原結合タンパク質である。一部の態様では、ＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗原結合タンパク質はさらに、配列番号１８のＬＣＶＲアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、Ｌは、切断可能なリンカーである。一部の実施形態では、Ｌは、切断不可能なリンカーである。一部の実施形態では、Ｌはジペプチドを含む。一部の実施形態では、ＬはＰＡＢ部分を含む。
一部の実施形態では、Ｌは、以下の構造を有する部分を含む。
Figure 2023515941000059
一部の実施形態では、Ｌは、以下の構造を有する部分を含む。
Figure 2023515941000060
一部の実施形態では、Ｌは、以下の構造を有する部分を含む。
Figure 2023515941000061
一部の実施形態では、Ｌは、以下の構造を有する部分を含む。
Figure 2023515941000062
一部の実施形態では、Ｐａｙはツブリシンである。
一部の実施形態では、Ｐａｙはメイタンシノイドである。
一部の実施形態では、Ｐａｙは以下であり：
Figure 2023515941000063
式中、Ｒ１はアルキルである。
一部の実施形態では、Ｐａｙは以下である。
Figure 2023515941000064
一部の実施形態では、Ｐａｙは以下である。
Figure 2023515941000065
一部の実施形態では、ｎは、２～５の整数である。
一部の実施形態では、－Ｌ－Ｐａｙは以下であり：
Figure 2023515941000066
式中、
Figure 2023515941000067
は、抗体との結合である。
一部の実施形態では、－Ｌ－Ｐａｙは以下であり：
Figure 2023515941000068
式中、
Figure 2023515941000069
は、抗体との結合である。
一部の実施形態では、－Ｌ－Ｐａｙは以下であり：
Figure 2023515941000070
式中、
Figure 2023515941000071
は、抗体との結合である。
一部の実施形態では、－Ｌ－Ｐａｙは以下であり：
Figure 2023515941000072
式中、
Figure 2023515941000073
は、抗体との結合である。
一部の実施形態では、－Ｐａｙは以下である。
Figure 2023515941000074
一部の実施形態では、－Ｌ－Ｐａｙは以下である。
Figure 2023515941000075
具体的な実施形態では、Ｌ－Ｐａｙは以下であり、
Figure 2023515941000076
ｎは２である。
一部の実施形態では、コンジュゲートは、以下の構造を有し：
Ａｂ－［Ｌ－Ｐａｙ］ｎ
式中：
Ａｂは、配列番号２のＤ１－ＨＣＶＲアミノ酸配列と、配列番号１０のＤ２－ＨＣＶＲアミノ酸配列とを含む、ＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗原結合タンパク質であり、
Ｌ－Ｐａｙは以下であり：
Figure 2023515941000077
式中、
Figure 2023515941000078
は、抗原結合タンパク質との結合であり、ｎは、２～５の整数である。
一部の実施形態では、コンジュゲートは、以下の構造を有し：
Ａｂ－［Ｌ－Ｐａｙ］ｎ
式中：
Ａｂは、配列番号２のＤ１－ＨＣＶＲアミノ酸配列と、配列番号１０のＤ２－ＨＣＶＲアミノ酸配列とを含む、ＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗原結合タンパク質であり、
Ｌ－Ｐａｙは以下であり：
Figure 2023515941000079
式中、
Figure 2023515941000080
は、抗原結合タンパク質との結合であり、ｎは、２～５の整数である。
一部の実施形態では、コンジュゲートは、以下の構造を有し：
Ａｂ－［Ｌ－Ｐａｙ］ｎ
式中：
Ａｂは、配列番号２のＤ１－ＨＣＶＲアミノ酸配列と、配列番号１０のＤ２－ＨＣＶＲアミノ酸配列とを含む、ＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗原結合タンパク質であり、
Ｌ－Ｐａｙは以下であり：
Figure 2023515941000081
式中、
Figure 2023515941000082
は、抗原結合タンパク質との結合であり、ｎは、２～５の整数である。
一部の実施形態では、コンジュゲートは、以下の構造を有し：
Ａｂ－［Ｌ－Ｐａｙ］ｎ
式中：
Ａｂは、配列番号２のＤ１－ＨＣＶＲアミノ酸配列と、配列番号１０のＤ２－ＨＣＶＲアミノ酸配列とを含む、ＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗原結合タンパク質であり、
Ｌ－Ｐａｙは以下であり：
Figure 2023515941000083
式中、
Figure 2023515941000084
は、抗原結合タンパク質との結合であり、ｎは、２～５の整数である。
一部の実施形態では、コンジュゲートは、以下の構造を有し：
Ａｂ－［Ｌ－Ｐａｙ］ｎ
式中：
Ａｂは、配列番号３２のＤ１－ＨＣＶＲアミノ酸配列と、配列番号４０のＤ２－ＨＣＶＲアミノ酸配列とを含む、ＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗原結合タンパク質であり、
Ｌ－Ｐａｙは以下であり：
Figure 2023515941000085
式中、
Figure 2023515941000086
は、抗原結合タンパク質との結合であり、ｎは、２～５の整数である。
一部の実施形態では、コンジュゲートは、以下の構造を有し：
Ａｂ－［Ｌ－Ｐａｙ］ｎ
式中：
Ａｂは、配列番号３２のＤ１－ＨＣＶＲアミノ酸配列と、配列番号４０のＤ２－ＨＣＶＲアミノ酸配列とを含む、ＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗原結合タンパク質であり、
Ｌ－Ｐａｙは以下であり：
Figure 2023515941000087
式中、
Figure 2023515941000088
は、抗原結合タンパク質との結合であり、ｎは、２～５の整数である。
一部の実施形態では、コンジュゲートは、以下の構造を有し：
Ａｂ－［Ｌ－Ｐａｙ］ｎ
式中：
Ａｂは、配列番号３２のＤ１－ＨＣＶＲアミノ酸配列と、配列番号４０のＤ２－ＨＣＶＲアミノ酸配列とを含む、ＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗原結合タンパク質であり、
Ｌ－Ｐａｙは以下であり：
Figure 2023515941000089
式中、
Figure 2023515941000090
は、抗原結合タンパク質との結合であり、ｎは、２～５の整数である。
一部の実施形態では、コンジュゲートは、以下の構造を有し：
Ａｂ－［Ｌ－Ｐａｙ］ｎ
式中：
Ａｂは、配列番号３２のＤ１－ＨＣＶＲアミノ酸配列と、配列番号４０のＤ２－ＨＣＶＲアミノ酸配列とを含む、ＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗原結合タンパク質であり、
Ｌ－Ｐａｙは以下であり：
Figure 2023515941000091
式中、
Figure 2023515941000092
は、抗原結合タンパク質との結合であり、ｎは、２～５の整数である。
一部の実施形態では、コンジュゲートは、以下の構造を有し：
Ａｂ－［Ｌ－Ｐａｙ］ｎ
式中：
Ａｂは、配列番号２のＤ１－ＨＣＶＲアミノ酸配列と、配列番号１０のＤ２－ＨＣＶＲアミノ酸配列とを含む、ＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗原結合タンパク質であり、Ｐａｙは以下であり：
Figure 2023515941000093
式中、
Figure 2023515941000094
は、抗原結合タンパク質との結合であり、ｎは、２～５の整数である。
一部の実施形態では、コンジュゲートは、以下の構造を有し：
Ａｂ－［Ｌ－Ｐａｙ］ｎ
式中：
Ａｂは、配列番号３２のＤ１－ＨＣＶＲアミノ酸配列と、配列番号４０のＤ２－ＨＣＶＲアミノ酸配列とを含む、ＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗原結合タンパク質であり、Ｐａｙは以下であり：
Figure 2023515941000095
式中、
Figure 2023515941000096
は、抗原結合タンパク質との結合であり、ｎは、２～５の整数である。
一部の実施形態では、コンジュゲートは、以下の構造を有し：
Ａｂ－［Ｌ－Ｐａｙ］ｎ
式中：
Ａｂは、配列番号２のＤ１－ＨＣＶＲアミノ酸配列と、配列番号１０のＤ２－ＨＣＶＲアミノ酸配列とを含む、ＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗原結合タンパク質であり、
Ｌ－Ｐａｙは以下であり：
Figure 2023515941000097
式中、
Figure 2023515941000098
は重鎖グルタミンとの結合である。一部の実施形態では、ｎは２である。ある実施形態では、ｎは２であり、Ｌ－ＰａｙはＱ２９５グルタミンに結合されている。一部の実施形態では、ｎは４である。ある実施形態では、ｎは４であり、Ｌ－ＰａｙはＱ２９５グルタミンおよびＱ２９７グルタミンに結合されている。
一部の実施形態では、コンジュゲートは、以下の構造を有し：
Ａｂ－［Ｌ－Ｐａｙ］ｎ
式中：
Ａｂは、配列番号３２のＤ１－ＨＣＶＲアミノ酸配列と、配列番号４０のＤ２－ＨＣＶＲアミノ酸配列とを含む、ＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗原結合タンパク質であり、
Ｌ－Ｐａｙは以下であり：
Figure 2023515941000099
式中、
Figure 2023515941000100
は重鎖グルタミンとの結合である。一部の実施形態では、ｎは２である。ある実施形態では、ｎは２であり、Ｌ－ＰａｙはＱ２９５グルタミンに結合されている。一部の実施形態では、ｎは４である。ある実施形態では、ｎは４であり、Ｌ－ＰａｙはＱ２９５グルタミンおよびＱ２９７グルタミンに結合されている。
一部の実施形態では、コンジュゲートは、以下の構造を有し：
Ａｂ－［Ｌ－Ｐａｙ］ｎ
式中：
Ａｂは、配列番号２のＤ１－ＨＣＶＲアミノ酸配列と、配列番号１０のＤ２－ＨＣＶＲアミノ酸配列とを含む、ＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗原結合タンパク質であり、Ｐａｙは以下である。
Figure 2023515941000101
一部の実施形態では、コンジュゲートは、以下の構造を有し：
Ａｂ－［Ｌ－Ｐａｙ］ｎ
式中：
Ａｂは、配列番号３２のＤ１－ＨＣＶＲアミノ酸配列と、配列番号４０のＤ２－ＨＣＶＲアミノ酸配列とを含む、ＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗原結合タンパク質であり、Ｐａｙは以下である。
Figure 2023515941000102
一部の実施形態では、コンジュゲートは、以下の構造を有し：
Ａｂ－［Ｌ－Ｐａｙ］ｎ
式中：
Ａｂは、配列番号２のＤ１－ＨＣＶＲアミノ酸配列と、配列番号１０のＤ２－ＨＣＶＲアミノ酸配列とを含む、ＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗原結合タンパク質であり、
Ｌ－Ｐａｙは以下であり：
Figure 2023515941000103
式中、
Figure 2023515941000104
は結合タンパク質の重鎖グルタミンとの結合である。一部の実施形態では、ｎは２である。ある実施形態では、ｎは２であり、Ｌ－ＰａｙはＱ２９５グルタミンに結合されている。一部の実施形態では、ｎは４である。ある実施形態では、ｎは４であり、Ｌ－ＰａｙはＱ２９５グルタミンおよびＱ２９７グルタミンに結合されている。
一部の実施形態では、コンジュゲートは、以下の構造を有し：
Ａｂ－［Ｌ－Ｐａｙ］ｎ
式中：
Ａｂは、配列番号３２のＤ１－ＨＣＶＲアミノ酸配列と、配列番号４０のＤ２－ＨＣＶＲアミノ酸配列とを含む、ＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗原結合タンパク質であり、
Ｌ－Ｐａｙは以下であり：
Figure 2023515941000105
式中、
Figure 2023515941000106
は結合タンパク質の重鎖グルタミンとの結合である。一部の実施形態では、ｎは２である。ある実施形態では、ｎは２であり、Ｌ－ＰａｙはＱ２９５グルタミンに結合されている。一部の実施形態では、ｎは４である。ある実施形態では、ｎは４であり、Ｌ－ＰａｙはＱ２９５グルタミンおよびＱ２９７グルタミンに結合されている。
本明細書に記載の抗体薬剤コンジュゲートは、当業者に公知のコンジュゲーション条件を使用して調製することができる（例えば、参照によりその全体を本明細書に組み込まれるＤｏｒｏｎｉｎａ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２００３，２１，７，７７８を参照）。一部の実施形態では、ＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗原結合タンパク質の抗体薬剤コンジュゲートは、本明細書に記載のＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗原結合タンパク質を、所望のリンカーおよび細胞傷害剤を含む化合物と接触させることにより調製され、前記リンカーは、例えば本抗体または抗原結合タンパク質の所望の残基で、本抗体または抗原結合タンパク質と反応性である部分を保有する。
一部の実施形態では、本明細書に提供される抗体薬剤コンジュゲートは、重鎖のＱ２９５グルタミンまたはＱ２９７グルタミンでコンジュゲートされる。重鎖Ｑ２９７グルタミンを含む抗体は、例えば、Ｎ２９７Ｑ変異を介して、当技術分野で公知の技術を用いて調製することができる。例えば、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．２０１４，２５，３，５６９（２０１４）を参照されたい。このようなコンジュゲーション方法は、２または４のＤＡＲを有する抗体薬剤コンジュゲートを提供することができる。一部の実施形態では、このような方法は、トランスグルタミナーゼの存在下で第一の反応性部分を含む一級アミン化合物と抗体を反応させることによって、重鎖グルタミンで第一の反応性部分を導入して、Ｑ２９５および任意選択的にＱ２９７で第一の反応性部分を含む抗体を生成することを含む。この生成物は、その後、リンカーおよび相補的な第二の反応性部分を有するペイロードと反応して、本明細書に提供される抗体－薬剤コンジュゲートを提供することができる。一部の実施形態では、第一の反応性部分はアジドである。一部の実施形態では、第二の反応性部分はシクロアルキンである。一部の実施形態では、リンカーおよび相補的な第二の反応性部分を有するペイロードは以下である。
Figure 2023515941000107
これは、２０１９年１２月２０日出願の米国特許出願第１６／７２４，１６４号に記載される方法を用いて調製することができる（例えば、その中に記載される化合物ＬＰ４）。ある実施形態では、一級アミン化合物は以下である。
Figure 2023515941000108
一部の実施形態では、リンカーおよび相補的な第二の反応性部分を有するペイロードは以下である。
Figure 2023515941000109
ある実施形態では、一級アミン化合物は以下である。
Figure 2023515941000110
一部の実施形態では、本明細書に記載のＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗原結合タンパク質を、以下の式Ａ１を有する化合物：
Figure 2023515941000111
および水性希釈剤と接触させることを含む、抗体－薬剤コンジュゲートを調製するプロセスが本明細書に提供される。
一部の実施形態では、式Ａ１の化合物は、化学量論的に過剰に存在する。一部の実施形態では、式Ａ１の化合物は、化学量論的に５～６倍過剰に存在する。一部の実施形態では、水性希釈剤はＨＥＰＥＳを含む。一部の実施形態では、水性希釈剤はＤＭＡを含む。
一部の実施形態では、式Ａ１の化合物は、以下の式Ａ２またはＡ３の化合物である。
Figure 2023515941000112
Figure 2023515941000113
一部の実施形態では、式Ａ２の化合物は、立体異性体的に純粋なＡ３である。一部の実施形態では、式Ａ１の化合物は、式Ａ１またはＡ２の化合物を含み、Ａ１またはＡ２の化合物は、５０％を超えるジアステレオマーの過剰を有して存在する。ある実施形態では、ジアステレオマーの過剰は、７０％を超える。ある実施形態では、ジアステレオマーの過剰は、９０％を超える。ある実施形態では、ジアステレオマーの過剰は、９５％を超える。
「ジアステレオマーの過剰」という用語は、組成物中の残りのジアステレオマーと比較した際の、所望の単一ジアステレオマーのモル分率の差異を指す。ジアステレオマーの過剰は、以下のように計算される：（単一ジアステレオマーの量）－（他のジアステレオマーの量）／１。例えば、９０％の１、および１０％の２、３、４またはそれらの混合物を含有する組成物は、８０％のジアステレオマーの過剰を有する［（９０－１０）／１］。９５％の１、および５％の２、３、４またはそれらの混合物を含有する組成物は、９０％のジアステレオマーの過剰を有する［（９５－５）／１］。９９％の１、および１％の２、３、４またはそれらの混合物を含有する組成物は、９８％のジアステレオマーの過剰を有する［（９９－１）／１］。ジアステレオマーの過剰は、１、２、３、または４のうちのいずれか一つについて同様に計算することができる。
一部の実施形態では、式Ａ１の化合物は、以下の式（ａ）の化合物：
Figure 2023515941000114
を、以下の式（ｂ）の化合物：
Figure 2023515941000115
と、シリカゲルおよび希釈剤の存在下で接触させることにより調製される。一部の実施形態では、希釈剤は、有機溶媒と水とを含有する。
また、以下のプロセスによって調製される生成物も本明細書に提供される：
（ｉ）式（ａ）の化合物：
Figure 2023515941000116
を、以下の式（ｂ）の化合物：
Figure 2023515941000117
と、シリカゲルおよび希釈剤の存在下で接触させて、中間体を合成すること、および
（ｉｉ）本明細書に記載のＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗原結合タンパク質を、上記中間体および水性希釈剤と接触させること。
一部の実施形態では、本明細書に記載のＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗原結合タンパク質を、以下の式Ｂを有する化合物、および水性希釈剤と接触させることを含む、抗体－薬剤コンジュゲートを調製するプロセスが本明細書に提供され：
Figure 2023515941000118
式中、ＬＧは脱離基である。
一部の実施形態では、式Ｂの化合物は、化学量論的に過剰に存在する。一部の実施形態では、式Ｂの化合物は、化学量論的に５～６倍過剰に存在する。一部の実施形態では、水性希釈剤はＨＥＰＥＳを含む。一部の実施形態では、水性希釈剤はＤＭＡを含む。一部の実施形態では、－Ｃ（Ｏ）－ＬＧはエステルであり、例えば、ＮＨＳまたはトリフルオロフェニルエステルである。
一部の実施形態では、式Ｂの化合物は、以下の式Ｂ１の化合物：
Figure 2023515941000119
である。
一部の実施形態では、式Ｂ１の化合物は、以下の式Ｃの化合物：
Figure 2023515941000120
を、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、ペプチドカップリング試薬、および有機希釈剤と接触させることにより調製される。適切なペプチドカップリング試薬としては、求核試薬との反応のためにカルボン酸部分を活性化させる、すなわち反応性を与える試薬が挙げられる。ある実施形態では、ペプチドカップリング試薬は、Ｎ－（３－ジメチルアミノプロピル）－Ｎ’－エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）である。一部の実施形態では、有機溶媒はジクロロメタンである。
一部の実施形態では、式Ｃの化合物は、以下の式Ｄの化合物：
Figure 2023515941000121
と、アジピン酸、ペプチドカップリング剤、および有機溶媒を接触させることにより調製される。ある実施形態では、ペプチドカップリング剤は、２－エトキシ－１－エトキシカルボニル－１，２－ジヒドロキノリン（ＥＥＤＱ）である。ある実施形態では、有機溶媒は、ジクロロメタンを含む。化合物Ｄは、ＷＯ２０１４／１４５０９０に記載されるように調製することができる。
エピトープマッピングおよびその関連技術
抗体または抗原結合ドメインが結合するエピトープは、ＨＥＲ２タンパク質の３個以上（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個以上）のアミノ酸の単一の連続配列からなっていてもよい。あるいはその関連エピトープは、ＨＥＲ２の複数の非連続的アミノ酸（またはアミノ酸配列）からなっていてもよい。
本明細書、例えば実施例２１または２２に別段に記載されるように、ＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子の個々の抗原結合ドメイン（Ｄ１およびＤ２）は、互いに対して別個であるか、または重複しないか、または部分的に重複するエピトープに結合し得る。本明細書に使用される際に、「部分的に重複するエピトープ」とは、当技術分野で公知の任意のエピトープマッピング法（例えば、Ｘ線結晶法、アラニンスキャニング突然変異誘導法、水素／重水素交換法［ＨＤＸ］、ドメインスワッピングなど）により決定された際に、第一のエピトープと第二のエピトープとが、共通アミノ酸を５個未満、４個未満、３個未満、または１個のみ共有することを意味する。Ｄ１ドメインおよびＤ２ドメインは、互いに非競合的であってもよい。例えば、ある実施形態では、特定のＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子のＤ１ドメインの、ＥｒｂＢ２上のそのエピトープへの結合は、上記ＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子のＤ２ドメインの、ＨＥＲ２上のそのエピトープへの結合を阻害しない（または最小限にのみ阻害する）。Ｄ１構成成分およびＤ２構成成分のそれぞれのエピトープが、非重複（または最大でも部分的重複）であることによって、ＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子は、細胞表面上の単一のＨＥＲ２分子に結合することができる。さらに、ＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性結合分子は、細胞表面上のＥｒｂＢ２でクラスター化し、ＨＥＲ２内部移行を惹起することができる。
当業者に公知の様々な技法を使用して、本開示の抗体および抗原結合ドメインが相互作用するＨＥＲ２上のエピトープを決定することができる。特定の抗体または抗原結合ドメインのエピトープまたは結合ドメインを決定するために使用できる例示的な手法としては、例えば、点突然変異誘導法（例えば、アラニンスキャニング突然変異誘導法、アルギニンスキャニング突然変異誘導法など）、ペプチドブロット分析（Ｒｅｉｎｅｋｅ、２００４、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２４８：４４３－４６３）、プロテアーゼ保護法、およびペプチド切断分析が挙げられる。さらに、抗原のエピトープ切り出し、エピトープ抽出、および化学修飾などの方法を採用することができる（Ｔｏｍｅｒ，２０００，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ９：４８７－４９６）。抗体と相互作用するポリペプチド内のアミノ酸の特定に使用できる別の方法は、質量分析法により検出される水素／重水素交換である。総称的な用語としては、水素／重水素交換は、対象タンパク質を重水素標識すること、次いで抗体をこの重水素標識タンパク質に結合させることを含む。次に、タンパク質／抗体複合体を水に移し、抗体によって保護された残基（重水素標識のまま残る）を除く全ての残基で、水素－重水素交換を生じさせる。抗体の解離後、標的タンパク質をプロテアーゼ切断および質量分析解析に供し、それによって、抗体が相互作用する特異的なアミノ酸に対応する重水素標識残基を明らかにする。例えば、Ｅｈｒｉｎｇ（１９９９）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６７（２）：２５２－２５９；Ｅｎｇｅｎ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ（２００１）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７３：２５６Ａ－２６５Ａを参照されたい。Ｘ線結晶構造解析を用いて、抗体が相互作用するポリペプチド内のアミノ酸を特定することもできる。
本明細書に記載されるいずれかの特定の例示的な抗体または抗原結合ドメイン（例えば、本明細書の表１に記載されるいずれかのアミノ酸配列を含む抗体）と同じエピトープに結合するＨＥＲ２二重特異性抗体が、本明細書にさらに提供される。同様に、本明細書に記載されるいずれかの特定の例示的な抗体（例えば、本明細書の表１に記載されるいずれかのアミノ酸配列を含む抗体）とＨＥＲ２への結合について競合するＨＥＲ２二重特異性抗体も、本明細書に提供される。
当技術分野に公知であり本明細書にて例証される定型的な方法を使用することにより、抗体が参照抗ＨＥＲ２抗体と同じエピトープに結合するか、または結合について参照抗ＨＥＲ２抗体と競合するかを容易に決定することができる。例えば、被験抗体が本明細書に提供される参照抗ＨＥＲ２抗体と同じエピトープに結合するかを決定するために、参照抗体をＨＥＲ２タンパク質に結合させる。次に、ＨＥＲ２分子に結合する被験抗体の能力が評価される。参照抗ＨＥＲ２抗体との飽和結合後に被験抗体がＨＥＲ２に結合できた場合、この被験抗体は参照抗ＨＥＲ２抗体とは異なるエピトープに結合するものと結論付けることができる。一方、参照抗ＨＥＲ２抗体との飽和結合後に被験抗体がＨＥＲ２分子に結合できない場合、この被験抗体は、参照抗ＨＥＲ２抗体により結合されるエピトープと同じエピトープに結合する可能性がある。次いで、追加の定型的な実験（例えば、ペプチド変異および結合分析）を実施して、観察された被験抗体の結合の欠落が実際に、参照抗体と同じエピトープに結合することに起因するのか、または立体遮断（または別の現象）が、観察された結合の欠落の原因であるのかを確認することができる。この種の実験は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、Ｂｉａｃｏｒｅ、フローサイトメトリー、または当技術分野で利用可能な任意の他の定量的または定性的な抗体結合アッセイを用いて実施することができる。ある実施形態によれば、競合結合アッセイにて測定した際に、例えば１倍、５倍、１０倍、２０倍、または１００倍過剰な一方の抗体が、他方の抗体の結合を少なくとも５０％、しかし好ましくは７５％、９０％、またはさらには９９％まで阻害する場合、二つの抗体は同じ（または重複する）エピトープに結合する（例えば、Ｊｕｎｇｈａｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９９０：５０：１４９５－１５０２を参照）。あるいは、一方の抗体の結合を低減または排除する抗原中の本質的にすべてのアミノ酸突然変異が、他方の抗体の結合を低減または排除する場合、二つの抗体は同じエピトープに結合するものと考えられる。一方の抗体の結合を低減または排除するアミノ酸変異のサブセットのみが、他方の抗体の結合を低減または排除する場合、二つの抗体は「重複エピトープ」を有するものと考えられる。
抗体が結合について参照抗ＨＥＲ２抗体と競合する（または結合について交差競合する）か否かを決定するために、以下の二つの方針で上述の結合手順を実施する：第一の方針では、参照抗体を飽和条件下でＨＥＲ２タンパク質に結合させて、その後、ＨＥＲ２分子への被験抗体の結合を評価する。第二の方針では、被験抗体を飽和条件下でＨＥＲ２分子に結合させて、その後、ＨＥＲ２分子への参照抗体の結合を評価する。両方の方針で、第一の（飽和）抗体のみがＨＥＲ２分子に結合することができた場合に、被験抗体と参照抗体とは、ＨＥＲ２への結合について競合するものと結論付けられる。当業者によって理解されるように、参照抗体への結合について競合する抗体は、必ずしも参照抗体と同じエピトープに結合しないことがあるが、重複したエピトープまたは隣接するエピトープに結合することによって参照抗体の結合を立体的に遮断することがある。
ヒト抗体の調製
本明細書に提供されるＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗体は、完全ヒト抗体とすることができる。完全ヒトモノクローナル抗体を含むモノクローナル抗体の生成方法は、当技術分野に公知である。ヒトＨＥＲ２に特異的に結合するヒト抗体を作製するために、本開示の状況で任意のそのような公知の方法を使用することができる。
例えばＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（商標）技術、または完全ヒトモノクローナル抗体を作製するための任意の他の類似した公知の方法を使用して、ヒト可変領域とマウス定常領域とを有する、ＨＥＲ２に対する高親和性キメラ抗体が最初に単離される。以下の実験セクションのように、抗体は、親和性、二量体形成遮断活性、選択性、エピトープなどを含む望ましい特徴について特性解析され、選択される。必要であれば、マウス定常領域は、所望のヒト定常領域、例えば野生型または改変型のＩｇＧ１またはＩｇＧ４に置換されて、完全ヒト抗ＨＥＲ２抗体が生成される。選択される定常領域が、特定の用途に応じて変わり得る一方で、高親和性の抗原結合性および標的特異性の特徴は、可変領域に存在する。ある例では、完全ヒト抗ＨＥＲ２抗体は、抗原陽性Ｂ細胞から直接的に単離される。
生物学的等価物
本明細書に提供されるＨＥＲ２二重特異性抗体および抗体フラグメントは、記載される抗体のアミノ酸配列とは異なるがヒトＨＥＲ２に結合する能力を保持するアミノ酸配列を有する、タンパク質を包含する。このようなバリアント抗体および抗体断片は、親配列と比較して一つまたは複数のアミノ酸の付加、欠失、または置換を含むが、記載された抗体の生物学的活性と本質的に同等である生物学的活性を呈する。同様に、本開示の抗ＨＥＲ２抗体をコードするＤＮＡ配列は、開示される配列と比較して一つまたは複数のヌクレオチドの付加、欠失、または置換を含むが本開示の抗ＨＥＲ２抗体または抗体断片と本質的に生物学的に同等である抗ＨＥＲ２抗体または抗体断片をコードする配列を包含する。このようなバリアントのアミノ酸配列およびＤＮＡ配列の例は、上記に考察されている。
二つの抗原結合タンパク質または抗体が、例えば、類似した実験条件下で、単回投与または複数回投与のどちらかで同モル用量で投与されたときに、吸収の速度および範囲が有意な差を示さないという医薬的な同等物または医薬的な代替物である場合に、それらは生物学的に同等であると考えられる。一部の抗体は、その吸収の範囲が同等であるが吸収の速度が同等ではなく、それでも、その吸収速度の差異が意図的であってラベリングに反映されており、有効体内薬物濃度の獲得、例えば慢性使用での獲得に必須ではなく、試験された特定の医薬品にとって医学的に重要ではないと考えられるがゆえに、生物学的に同等であると考えられ得る場合に、同等物であるかまたは医薬的な代替物であると考えられるものとなる。
一実施形態では、二つの抗原結合タンパク質は、その安全性、純度、および効力において臨床的に意義のある差異が無ければ、生物学的に同等である。
一実施形態では、参照生成物と生物学的製品との間で１回または複数回の切り替えを行わない持続的療法と比較して、免疫原性の臨床的に有意な変化を含めた有害作用のリスクの上昇が予想されないか、または有効性が減退することなく、患者がそのような切り替えを行うことができる場合に、二つの抗原結合タンパク質は生物学的に同等である。
一実施形態では、二つの抗原結合タンパク質は、これらが両方とも、一つまたは複数の使用条件について一つまたは複数の共通の機序によって、このような機序の公知の程度まで作用する場合に、生物学的に同等である。
生物学的に同等であることは、インビボおよびインビトロの方法により実証され得る。生物学的同等性の測定方法としては例えば、（ａ）時間の関数として血液、血漿、血清または他の生体液中で抗体またはその代謝物の濃度が測定される、ヒトまたは他の哺乳動物におけるインビボ検査、（ｂ）ヒトのインビボ生体利用効率データと相関し、このデータを合理的に予測するインビトロ検査、（ｃ）抗体（またはその標的）の適切な急性薬理学的作用が時間の関数として計測される、ヒトまたは他の哺乳動物におけるインビボ検査、および（ｄ）抗体の安全性、有効性、または生体利用効率もしくは生物学的等価性を立証する、適切に管理された臨床試験が挙げられる。
本明細書に提供されるＨＥＲ２二重特異性抗体の生物学的に同等なバリアントは、例えば、残基もしくは配列の様々な置換を作製すること、または生物活性に必要とされない末端もしくは内部の残基もしくは配列を欠失することによって構築され得る。例えば、生物活性に必須ではないシステイン残基は、復元時の不必要または不正確な分子内ジスルフィド架橋の形成を防止するために欠失させることもできるし、他のアミノ酸で置換することもできる。他の状況では、生物学的に同等の抗体としては、抗体のグリコシル化特性を改変するアミノ酸変化、例えば、グリコシル化を排除または除去する変異を含む、ＨＥＲ２二重特異性抗体バリアントが挙げられ得る。
種選択性および種交差反応性
本開示は、ある実施形態によれば、ヒト抗ＨＥＲ２に結合するが他の種由来のＨＥＲ２には結合しない抗ＨＥＲ２抗体（および抗ＨＥＲ２抗原結合ドメインを含む抗原結合分子）を提供する。本開示はまた、ヒト抗ＨＥＲ２および一つまたは複数の非ヒト種に由来するＨＥＲ２に結合する抗ＨＥＲ２抗体（および抗ＨＥＲ２抗原結合ドメインを含む抗原結合分子）も含む。例えば、抗ＨＥＲ２抗体および抗原結合分子は、ヒトＨＥＲ２に結合し得るが、場合によっては、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、スナネズミ、ブタ、ネコ、イヌ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ラクダ、カニクイザル、マーモセット、アカゲザル、またはチンパンジーのＨＥＲ２のうちの一つまたは複数に結合することも結合しないこともある。
多特異性抗体
本明細書に別段に記載されるように、本開示は、二つの異なる抗原結合ドメインを含む二重特異性抗原結合分子を提供し、第一の抗原結合ドメイン（Ｄ１）は、ＨＥＲ２上の第一のエピトープに結合し、第二の抗原結合ドメイン（Ｄ２）は、ＨＥＲ２上の第二のエピトープに結合する。ある実施形態では、第一および／または第二のエピトープは、ＨＥＲ２の外部ドメイン内、例えば配列番号５４内にある。ある実施形態では、Ｄ１ドメインおよびＤ２ドメインの結合するＨＥＲ２上の第一および第二のエピトープは別個のものであるか、または重複しないか、または部分的に重複している。この態様によれば、Ｄ１ドメインは、本明細書の表１に記載されるいずれかのＨＣＶＲ／ＬＣＶＲまたはＣＤＲのアミノ酸配列を含み得、Ｄ２ドメインは、本明細書の表１に記載される他のいずれかのＨＣＶＲ／ＬＣＶＲまたはＣＤＲのアミノ酸配列を含み得る（Ｄ１ドメインの結合特異性が、Ｄ２ドメインの結合特異性とは異なっており、および／またはＤ１の取得された抗原結合タンパク質が、Ｄ２の取得された抗原結合タンパク質と、ＨＥＲ２への結合について競合しない限りにおいて）。
一部の実施形態では、抗ＨＥＲ２×抗ＨＥＲ２二重特異性抗体が結合するヒトＨＥＲ２エピトープは、配列番号５４のアミノ酸９～２３（配列番号５７）、アミノ酸４１～５１（配列番号５８）、アミノ酸６４～７７（配列番号５９）、アミノ酸１３３～１４８（配列番号６１）、アミノ酸１４１～１４５（配列番号１５５）、アミノ酸１５２～１６１（配列番号６４）、アミノ酸１６６～１８２（配列番号５６）、アミノ酸１７４～１８２（配列番号１６２）、アミノ酸１９４～２００（配列番号１６３）、アミノ酸２５８～２７３（配列番号６５）、および／またはアミノ酸３５３～３５９（配列番号６０）を含む。一部の実施形態では、ヒトＨＥＲ２の第一のエピトープは、配列番号５４のアミノ酸１４１～１４５および／または１６６～１８２を含み、ヒトＨＥＲ２の第二のエピトープは、配列番号５４のアミノ酸９～２３、４１～５１、６４～６７、および／または３５３～３５９を含む。一部の実施形態では、ヒトＨＥＲ２の第一のエピトープは、配列番号５４のアミノ酸１３３～１４８、１７４～１８２、および／または１９４～２００を含み、ヒトＨＥＲ２の第二のエピトープは、配列番号５４の１５２～１６１、２５８～２７３、および／または１９４～２００を含む。
本開示の状況で使用され得る例示的な二重特異性抗体のフォーマットは、第一の免疫グロブリン（Ｉｇ）ＣＨ３ドメインおよび第二のＩｇ ＣＨ３ドメインの使用を含み、第一および第二のＩｇ ＣＨ３ドメインは、少なくとも一つのアミノ酸によって互いに異なり、少なくとも一つのアミノ酸の差異は、アミノ酸の差異を欠く二重特異性抗体と比較して、二重特異性抗体のプロテインＡへの結合を低減する。一実施形態では、第一のＩｇ ＣＨ３ドメインはプロテインＡに結合し、第二のＩｇ ＣＨ３ドメインは、例えばＨ９５Ｒ改変（ＩＭＧＴエクソン付番則による；ＥＵ付番則によればＨ４３５Ｒ）など、プロテインＡ結合を低減または消失させる変異を含有する。第二のＣＨ３はさらに、Ｙ９６Ｆ改変（ＩＭＧＴによる、ＥＵによればＹ４３６Ｆ）を含んでいてもよい。第二のＣＨ３内に見出され得るさらに別の改変としては、以下が挙げられる：ＩｇＧ１抗体の場合は、Ｄ１６Ｅ、Ｌ１８Ｍ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによる；ＥＵではＤ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、およびＶ４２２Ｉ）；ＩｇＧ２抗体の場合は、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ；ＥＵではＮ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、およびＶ４２２Ｉ）；ならびにＩｇＧ４抗体の場合は、Ｑ１５Ｒ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、Ｒ６９Ｋ、Ｅ７９Ｑ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによる；ＥＵではＱ３５５Ｒ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、Ｒ４０９Ｋ、Ｅ４１９Ｑ、およびＶ４２２Ｉ）。上述の二重特異性抗体のフォーマットの変形も、本開示の範囲内にあることが想定される。
本開示の状況で使用され得る他の例示的な二重特異性のフォーマットとしては、限定はないが、例えば、ｓｃＦｖベースまたはダイアボディの二重特異性フォーマット、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ融合体、二重可変ドメイン（ＤＶＤ）－Ｉｇ、クアドローマ（Ｑｕａｄｒｏｍａ）、ノブ・イントゥ・ホール（ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ）、共通軽鎖（例えば、ノブ・イントゥ・ホールを有する共通軽鎖など）、ＣｒｏｓｓＭａｂ、ＣｒｏｓｓＦａｂ、（ＳＥＥＤ）ボディ、ロイシンジッパー、デュオボディ（Ｄｕｏｂｏｄｙ）、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２、二重作用Ｆａｂ（ＤＡＦ）－ＩｇＧ、およびＭａｂ２二重特異性フォーマットが挙げられる（前述のフォーマットを概観するには、例えば、Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．２０１２，ｍＡｂｓ ４：６，１－１１、およびその中に引用されている参考文献を参照）。二重特異性抗体はまた、ペプチド／核酸コンジュゲーションを用いて構築することもでき、例えば、直交型化学反応性を有する非天然アミノ酸を用いて、部位特異的抗体－オリゴヌクレオチドコンジュゲートを生成し、次いでこれを規定の組成、結合価および幾何学的配置を有する多量体性複合体へと自己組織化させる。（例えば、Ｋａｚａｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．［Ｅｐｕｂ：Ｄｅｃ．４，２０１２］を参照）。
治療用製剤および投与
本発明の抗ＨＥＲ２抗体またはＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子を含む医薬組成物が、ＨＥＲ２×ＨＥＲ２ ＡＤＣを含めて、本明細書に提供される。医薬組成物は、適切な担体、賦形剤とともに、および輸送、送達、忍容性などの改善をもたらす他の剤とともに製剤化されてもよい。
抗体の治療用途
本明細書に記載されるいずれかのＤ１成分およびＤ２成分を含む、ＨＥＲ２×ＨＥＲ２ ＡＤＣを含めたＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子を含む治療用組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む方法が、本明細書に提供される。治療用組成物は、ＨＥＲ２×ＨＥＲ２ ＡＤＣを含めた本明細書に開示されるいずれかのＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子、および医薬的に許容可能な担体または希釈剤を含むことができる。
ＨＥＲ２×ＨＥＲ２ ＡＤＣを含めたＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子は特に、ＨＥＲ２の発現、シグナル伝達もしくは活性に関連するかもしくは媒介されるか；またはＨＥＲ２の二量体化を遮断することによって、またはＨＥＲ２の活性および／もしくはシグナル伝達をその他阻害することによって、ならびに／または受容体内在化を促進することによって、ならびに／または細胞表面受容体の数を減少させることによって治療可能である、任意の疾患または障害の治療、予防および／または改善に有用である。
例えば、ＨＥＲ２×ＨＥＲ２ ＡＤＣを含めた本開示のＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子は、ＨＥＲ２を発現する（または過剰発現する）腫瘍の治療に有用である。一部の実施形態では、ＨＥＲ２×ＨＥＲ２ ＡＤＣを含めたＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子は、高レベルのＨＥＲ２を発現する細胞、例えばＩＨＣ３＋に結合する。一部の実施形態では、ＨＥＲ２×ＨＥＲ２ ＡＤＣを含めたＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子は、中程度のレベルのＨＥＲ２を発現する細胞、例えばＩＨＣ２＋に結合する。一部の実施形態では、ＨＥＲ２×ＨＥＲ２ ＡＤＣを含めたＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子は、低レベルのＨＥＲ２を発現する細胞、例えばＩＨＣ１＋に不十分に結合する。
一部の実施形態では、ＨＥＲ２×ＨＥＲ２ ＡＤＣを含めたＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子は、中程度のまたは高いＨＥＲ２発現の細胞の殺細胞性を呈するが、低いＨＥＲ２発現のものを示さない。一部の態様では、殺細胞性は、低レベルのＨＥＲ２を発現する細胞の約５％未満、約４％未満、約３％未満、または約２％未満である。
ある実施形態では、ＨＥＲ２×ＨＥＲ２ ＡＤＣを含めたＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子は、以下のがんのうち一つまたは複数を治療するために使用される：乳がん、子宮頸がん、胃がん（例えば、ＨＥＲ２増幅を伴う胃がん）、食道がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん、神経膠芽腫、頭頸部がん（例えば、頭頸部扁平上皮癌［ＨＮＳＣＣ］）、卵巣がん、肺がん（例えば、非小細胞肺がん［ＮＳＣＬＣ］）、小細胞肺がん、急性骨髄性白血病、成人Ｔ細胞白血病、星状細胞腫、膀胱がん、胆管細胞癌、慢性骨髄性白血病、カポジ肉腫、腎がん、平滑筋肉腫、肝がん、リンパ腫、悪性神経膠腫、悪性中皮腫、メラノーマ、中皮腫、ＭＦＨ／線維肉腫、多発性骨髄腫、上咽頭がん、骨肉腫、膵癌、前立腺がん、腎細胞癌、横紋筋肉腫、滑膜肉腫、甲状腺がんおよびウィルムス腫瘍。
一部の態様では、ＨＥＲ２×ＨＥＲ２ ＡＤＣを含めたＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子は、高レベルまたは中程度のレベルのＨＥＲ２を発現する原発性および／または転移性腫瘍、すなわち、脳および髄膜、中咽頭、肺および気管支樹、消化管、男性および女性の生殖管、筋肉、骨、皮膚および付属器、結合組織、脾臓、免疫系、血液形成細胞および骨髄、肝臓および尿路、ならびに眼などの特殊感覚器官に発生する腫瘍を治療するために使用され得る。
本明細書に記載される治療方法の状況では、ＨＥＲ２×ＨＥＲ２ ＡＤＣを含めたＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子は、単剤療法として（すなわち、唯一の治療剤として）投与されてもよいし、一つまたは複数の追加的な治療剤と組み合わされて（実施例は本明細書中、別の箇所に記載されている）、またはＡＤＣとして（実施例は本明細書中、別の箇所に記載されている）投与されてもよい。
併用療法および製剤
一つまたは複数の追加の治療活性成分と組み合わされた、本明細書に記載されるＨＥＲ２×ＨＥＲ２ ＡＤＣを含めたいずれかの抗ＨＥＲ２抗体およびＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子を含む組成物および治療用製剤と、そのような組成物をそれを必要とする対象に投与することを含む治療方法とが、本明細書に提供される。
ＨＥＲ２×ＨＥＲ２ ＡＤＣを含めた抗ＨＥＲ２抗体およびＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子は、以下からなる群から選択される一つまたは複数の追加の治療活性成分と組み合わされて共に製剤化されてもよく、および／または投与されてもよい：Ｈｅｒ２／ＥｒｂＢ２の別のアンタゴニスト（例えば、抗ＥｒｂＢ２ ［例えば、トラスツズマブもしくはＴ－ＤＭ１（ＫＡＤＣＹＬＡ（登録商標））、またはトラスツズマブ・デルクステカン（Ｔ－ＳＸＤ；ＤＮＡトポイソメラーゼ１ 阻害剤）］、またはＥｒｂＢ２活性の低分子阻害剤）、ＥｒｂＢ３またはＥｒｂＢ４などの別のＥＧＦＲ ファミリーメンバーのアンタゴニスト（例えば、抗ＥｒｂＢ３もしくは抗ＥｒｂＢ４抗体、またはＥｒｂＢ３活性もしくはＥｒｂＢ４活性の低分子阻害剤）、ＭＥＴアンタゴニスト（例えば、抗ＭＥＴ抗体［例えば、オナルツズマブ、エミベツズマブ、およびＨ４Ｈ１４６３９Ｄ］、またはＭＥＴの低分子阻害剤）、ＥＧＦＲアンタゴニスト（例えば、抗ＥＧＦＲ抗体［例えば、セツキシマブまたはパニツムマブ］またはＥＧＦＲの低分子阻害剤［例えば、ゲフィチニブまたはエルロチニブ］）、ＥＧＦＲｖＩＩＩのアンタゴニスト（例えば、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体）、ＩＧＦ１Ｒアンタゴニスト（例えば、抗ＩＧＦ１Ｒ抗体）、Ｂ－ｒａｆ阻害剤（例えば、ヴェムラフェニブ、ソラフェニブ、ＧＤＣ－０８７９、ＰＬＸ－４７２０）、ＰＤＧＦＲ－α阻害剤（例えば、抗ＰＤＧＦＲ－α抗体）、ＰＤＧＦＲ－β阻害剤（例えば、抗ＰＤＧＦＲ－β抗体、または例えばメシル酸イマチニブもしくはリンゴ酸スニチニブなどの低分子キナーゼ阻害剤）、ＰＤＧＦリガンド阻害剤（例えば、抗ＰＤＧＦ－Ａ、－Ｂ、－Ｃ、または－Ｄの抗体、アプタマー、ｓｉＲＮＡなど）、ＶＥＧＦアンタゴニスト（例えば、アフリベルセプトなどのＶＥＧＦ－Ｔｒａｐ、例えば、米国特許第７，０８７，４１１号を参照（本明細書では「ＶＥＧＦ－阻害融合タンパク質」とも称される）、抗ＶＥＧＦ抗体（例えば、ベバシズマブ）、ＶＥＧＦ受容体の低分子キナーゼ阻害剤（例えば、スニチニブ、ソラフェニブ、またはパゾパニブ）、ＤＬＬ４アンタゴニスト（例えば、ＲＥＧＮ４２１など、米国特許出願公開第２００９／０１４２３５４号に開示されている抗ＤＬＬ４抗体）、Ａｎｇ２アンタゴニスト（例えば、Ｈ１Ｈ６８５Ｐなど、米国特許出願公開第２０１１／００２７２８６号に開示されている抗Ａｎｇ２抗体）、ＦＯＬＨ１アンタゴニスト（例えば、抗ＦＯＬＨ１抗体）、ＳＴＥＡＰ１またはＳＴＥＡＰ２のアンタゴニスト（例えば、抗ＳＴＥＡＰ１抗体または抗ＳＴＥＡＰ２抗体）、ＴＭＰＲＳＳ２アンタゴニスト（例えば、抗ＴＭＰＲＳＳ２抗体）、ＭＳＬＮアンタゴニスト（例えば、抗ＭＳＬＮ抗体）、ＣＡ９アンタゴニスト（例えば、抗ＣＡ９抗体）、ウロプラキンアンタゴニスト（例えば、抗ウロプラキン［例えば、抗ＵＰＫ３Ａ］抗体）、ＭＵＣ１６アンタゴニスト（例えば、抗ＭＵＣ１６抗体）、Ｔｎ抗原アンタゴニスト（例えば、抗Ｔｎ抗体）、ＣＬＥＣ１２Ａアンタゴニスト（例えば、抗ＣＬＥＣ１２Ａ抗体）、ＴＮＦＲＳＦ１７アンタゴニスト（例えば、抗ＴＮＦＲＳＦ１７抗体）、ＬＧＲ５アンタゴニスト（例えば、抗ＬＧＲ５抗体）、一価ＣＤ２０アンタゴニスト（例えば、リツキシマブなどの一価抗ＣＤ２０抗体）、ＣＤ２０×ＣＤ３ 二重特異性抗体、ＰＤ－１遮断剤（例えば、ペムブロリズマブまたはニボルマブなどの抗ＰＤ－１抗体）など。本明細書に提供される抗体と組み合わせて有益に投与され得る他の剤としては例えば、タモキシフェン、アロマターゼ阻害剤、およびサイトカイン阻害剤が挙げられ、例えばＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８などのサイトカインに、またはそれらの各受容体に結合する低分子サイトカイン阻害剤および抗体が挙げられる。
例としては、抗ＰＤ－１抗体などのＰＤ－１阻害剤を、本明細書に記載されるＨＥＲ２×ＨＥＲ２抗体－薬剤コンジュゲートと組み合わせることができる。標的患者集団には、特に、ＨＥＲ２を発現する乳がんを有する患者など、ＨＥＲ２変異を過剰発現する（例えば、ＩＨＣ２＋またはＩＨＣ３＋）腫瘍を有する患者が含まれる。
ＨＥＲ２×ＨＥＲ２ ＡＤＣを含めた本明細書に記載されるいずれかの抗ＨＥＲ２抗体およびＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子を、一つまたは複数の化学療法剤と組み合わせて含む組成物および治療用製剤が、本明細書に提供される。化学療法剤の例としては、アルキル化剤、例えばチオテパおよびシクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ（商標））；スルホン酸アルキル、例えばブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファン；アジリジン、例えばベンゾドーパ（ｂｅｎｚｏｄｏｐａ）、カルボコン、メツレドーパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）およびウレドーパ（ｕｒｅｄｏｐａ）；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミドおよびトリメチロロメラミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｎｅ）を含むエチレンイミンおよびメチラメラミン；ナイトロジェンマスタード、例えばクロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベムビチン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードなど；ニトロソウレア、例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンなど；抗生物質、例えば、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリケアミシン、カラビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン（ｄｅｔｏｒｕｂｉｃｉｎ）、６－ジアゾ－５－オキソ－Ｌ－ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン、ケラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン（ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシンなど；代謝拮抗薬、例えば、メトトレキサートおよび５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）など；葉酸アナログ、例えば、デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサートなど；プリン類似体、例えば、フルダラビン、６－メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなど；ピリミジン類似体、例えば、アンシタビン、アザシチジン、６－アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジンなど；アンドロゲン、例えば、カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなど；抗副腎剤（ａｎｔｉ－ａｄｒｅｎａｌ）、例えば、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなど；葉酸補液（ｆｏｌｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｐｌｅｎｉｓｈｅｒ）、例えば、フォリン酸など；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド（ａｌｄｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ）；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル（ｂｅｓｔｒａｂｕｃｉｌ）；ビスアントレン；エダトラキサート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）；デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）；デメコルチン；ジアジクオン；エルホルニチン（ｅｌｆｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）；酢酸エリプチニウム；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダミン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ポドフィリン酸；２－エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（商標）；ラゾキサン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２’’－トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド（「Ａｒａ－Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキサン、例えば、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ社、ニュージャージー州プリンストン）およびドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ（商標）、Ａｖｅｎｔｉｓ社、フランス、アントニー）など；クロラムブシル；ゲムシタビン；６－チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；白金類似体、例えば、シスプラチンおよびカルボプラチンなど；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ－１６）；イホスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；ＣＰＴ－１１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸；エスペラミシン；カペシタビン；および上述のいずれかの医薬的に許容可能な塩、酸、または誘導体が挙げられる。この定義にはまた、腫瘍に対するホルモンの作用を制御または阻害するように作用する抗ホルモン剤も含まれ、例えばタモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害性４（５）－イミダゾール、４－ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン（ｋｅｏｘｉｆｅｎｅ）、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、およびトレミフェン（Ｆａｒｅｓｔｏｎ）を含めた抗エストロゲン剤；ならびにフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、およびゴセレリンなどの抗アンドロゲン剤；ならびに上述のいずれかの医薬的に許容可能な塩、酸、または誘導体が挙げられる。
ＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子はまた、抗ウイルス剤、抗生物質、鎮痛剤、コルチコステロイド、ステロイド、酸素、抗酸化剤、ＣＯＸ阻害剤、心臓保護剤、金属キレート剤、ＩＦＮ－ガンマ、および／またはＮＳＡＩＤと組み合わせて投与されてもよく、および／または共製剤化されてもよい。
例えば上記に列挙されるいずれかの剤またはその誘導体などの追加の治療活性成分は、ＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子の投与の直前に、投与と同時に、または投与の後すぐに投与されてもよい（本開示の目的のため、そのような投与レジメンは、追加の治療活性成分と「組み合わされた」抗体の投与と考えられる）。本開示は、ＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子が、本明細書の別の箇所に記載される一つまたは複数の追加の治療活性成分と共製剤化される、医薬組成物を含む。
投与レジメン
ある実施形態によれば、複数用量のＨＥＲ２×ＨＥＲ２ ＡＤＣを含めたＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子（または、抗ＨＥＲ２抗体、ＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子、またはＨＥＲ２×ＨＥＲ２ ＡＤＣと、本明細書に言及されるいずれかの追加の治療活性剤との組合せを含む医薬組成物）を、規定の時間経過で対象に投与してもよい。この態様による方法は、複数用量の本明細書に提供されるＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子を対象に順次投与することを含む。本明細書で使用される際に、「順次投与する」とは、抗体の各用量が、例えば所定の間隔（例えば、時間、日、週または月）を隔てた異なる日など、異なる時点で対象に投与されることを意味する。本発明は、単回の初回用量のＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子を、次に１回または複数回の二次用量のＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子を、その後に任意選択的に１回または複数回の三次用量のＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子を、患者に順次投与することを含む方法を含む。
「初回用量」、「二次用量」、および「三次用量」という用語は、ＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子の投与の時間的な順序を指す。したがって、「初回用量」とは、治療レジメンの開始時に投与される用量であり（「ベースライン用量」ともよばれる）、「二次用量」とは、初回用量の後に投与される用量であり、「三次用量」とは、二次用量の後に投与される用量である。初回用量、二次用量、および三次用量はすべて、同じ量のＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子を含有するが、投与頻度に関しては一般的に互いに異なっていてもよい。しかし、ある実施形態では、初回用量、二次用量、および／または三次用量の含有する抗体の量は、治療経過の間に（例えば、適宜調整により加減されて）互いに異なっている。ある実施形態では、２以上（例えば、２、３、４、または５）の用量が、治療レジメンの開始時に「負荷用量」として投与され、その後に続く用量はより少ない頻度ベースで投与される（例えば、「維持用量」）。
抗体の診断用途
また、本開示のＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子を用いて、例えば診断目的のために、試料中のＨＥＲ２もしくはＨＥＲ２発現細胞を検出および／または測定してもよい。例えば、抗ＨＥＲ２抗体またはその断片を用いて、ＨＥＲ２の異常発現（例えば過剰発現、過小発現、発現の欠如など）を特徴とする状態または疾患を診断してもよい。ＨＥＲ２に対する例示的な診断アッセイは、例えば、患者から得た試料をＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子と接触させることを含み、この抗体は、検出可能な標識またはレポーター分子により標識される。あるいは、非標識のＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子を、それ自体が検出可能に標識されている二次抗体と組み合わせて、診断アプリケーションに使用することができる。検出可能な標識またはレポーター分子は、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、もしくは１２５Ｉなどの放射性同位体；フルオレセインもしくはローダミンなどの蛍光部分もしくは化学発光部分；またはアルカリホスファターゼ、ベータ－ガラクトシダーゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、もしくはルシフェラーゼなどの酵素とすることができる。試料中のＨＥＲ２を検出または測定するために使用できる具体的なアッセイ例としては、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、イムノ－ＰＥＴ（例えば、８９Ｚｒ、６４Ｃｕなど）、および蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）が挙げられる。一部の実施形態では、ＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗原結合分子は、その全体が参照によりその全体を本明細書に組み込まれるＷＯ２０１８／０４４５４０に記載されるように標識される。一部の実施形態では、ＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗原は、以下に標識化される。
Figure 2023515941000122
一部の実施形態では、配列番号２のＤ１－ＨＣＶＲアミノ酸配列と配列番号１０のＤ２－ＨＣＶＲアミノ酸配列とを含むＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗原結合タンパク質が、バイオセンサー１に標識化される。
一部の実施形態では、配列番号３２のＤ１－ＨＣＶＲアミノ酸配列と配列番号４０のＤ２－ＨＣＶＲアミノ酸配列とを含むＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗原結合タンパク質が、バイオセンサー１に標識化される。
本開示によるＨＥＲ２診断アッセイで使用できる試料としては、対象から得られる任意の組織または体液試料が挙げられる。一般的に、健康な患者（例えば、異常なＨＥＲ２のレベルまたは活性に関連した疾患または状態に罹患していない患者）から得られた特定の試料中のＨＥＲ２レベルを測定して、最初にベースラインのまたは標準的なＨＥＲ２レベルを確立するものとなる。次いでＨＥＲ２の基準レベルを、ＨＥＲ２関連の疾患または状態を有すると疑われる個体から得られた試料において測定されたＨＥＲ２レベルと比較することができる。
以下の実施例は、当業者に、本明細書に提供される方法および組成物をどのように作製および使用するかに関する完全な開示と説明とを提供するように提示されており、本発明者らが自身の発明であると考える範囲を限定することを意図されていない。使用した数字（例えば、量、温度など）について正確性を確保するための努力がなされているが、いくらかの実験誤差および偏差を考慮に入れるべきである。別途標示のない限り、部は重量部、分子量は平均分子量、温度は摂氏、圧力は大気圧または大気圧付近である。
下記の実施例で使用される比較用抗体には、以下が含まれる：
・ ＤＭ１ペイロードを含む抗ＨＥＲ２ ＡＤＣであるトラスツズマブ－ＭＣＣ－ＤＭ１。例えば、ＷＯ２０１５／０３１３９６Ａ１を参照されたい。このＡＤＣは、本明細書ではＣｏｍｐＡｂ１－ＭＣＣ－メイタンシノイドＡと称される。親抗ＨＥＲ２抗体であるハーセプチンは、本明細書ではＣｏｍｐＡｂ１と称される。
・ ＤｘＤペイロードを含む抗ＨＥＲ２ ＡＤＣであるＤＳ８２０１Ａ。例えば、Ｏｇｉｔａｎｉ ｅｔ ａｌ．（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０１６年１０月、２２（２０）：ｄｏｉ：１０．１１５８／１０７８－０４３２．ｃｃｒ－１５－２８２２）およびＴａｍｕｒａ（Ｌａｎｃｅｔ ２０１９）を参照されたい。このＡＤＣは、本明細書ではＣｏｍｐＡｂ１－カンプトテシン－ＬＰと称される。親抗体は、ＣｏｍｐＡｂ１とも称されるハーセプチンである。
・ ＡＺ１３５９９１８５ペイロードを含むＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗体ＡＤＣであるＭＥＤＩ４２７６。抗体は、配列番号５２（ＤｏｍａｉｎＩＶ＿ＶＬ．（Ｇ４Ｓ）４ Ｌｉｎｋｅｒ＿ｖ３．ＤｏｍａｉｎＩＶ＿ＶＨ．（Ｇ４Ｓ）３）および配列番号５３（Ｂｓ２ＡＢ＿ＶＫ．ｈＫａｐｐａ）を含む。リンカーペイロードは、ＷＯ２０１５／１５７５９２、およびＦａｒｉａ ｅｔ ａｌ．（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，２０１９，８（１１）ｄｏｉ：１０．３３９０／ａｎｔｉｂ８０１００１１）にある、下記に示される化合物Ｔ３２である。親二重特異性抗体は、本明細書ではＣｏｍｐＡｂ２と呼称され、ＡＤＣは、本明細書ではＣｏｍｐＡｂ２－ツブリシ２Ａ－ＬＰと称される。
・ アイソタイプ対照抗体は、本明細書ではＩＣ１と称される。ＩＣ１抗体は、ツブリシン１Ａ－ＬＰ、ＭＣＣ－メイタンシノイドＡ、カンプトテシン、またはツブリシン２Ａ－ＬＰにコンジュゲートすることができる。
Figure 2023515941000123
実施例１．抗ＨＥＲ２抗体の生成
抗ＨＥＲ２抗体は、マウスＦｃに融合された組換えヒトＨＥＲ２細胞外ドメインを含む免疫原であるｈＥｒｂＢ２ ｅｃｔｏ－ｍＦｃ（企業、カタログ番号、場所）を用いて、ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域およびカッパ軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを含む遺伝子操作されたマウスを免疫することにより取得した。免疫に使用されたマウスは、「ユニバーサル軽鎖」を発現する。すなわち、このマウスで産生される抗体は、異なる重鎖可変領域を有するが、本質的に同一の軽鎖可変ドメインを有する。
抗体の免疫応答を、ＨＥＲ２特異的な免疫アッセイによりモニタリングした。所望の免疫応答が得られたときに、脾細胞を採取し、マウスミエローマ細胞と融合させて、それらの生存性を維持し、ハイブリドーマ細胞株を形成させた。ハイブリドーマ細胞株をスクリーニングおよび選択して、ＨＥＲ２特異的抗体を産生する細胞株を特定した。この技術を用いて、数種の抗ＨＥＲ２キメラ抗体（すなわちヒト可変ドメインとマウス定常ドメインとを保有する抗体）を得た。さらに、米国特許出願公開第２００７／０２８０９４５号Ａ１に記載されるように、いくつかの完全ヒト抗ＨＥＲ２抗体を、ミエローマ細胞との融合を行わずに直接、抗原陽性Ｂ細胞から単離した。
本実施例の方法に従って生成された例示的な抗ＨＥＲ２抗体、およびこの抗体から構築された二重特異性抗体の特定の生物学的特性を、以下に記載される実施例において詳細に説明する。
実施例２．ＨＥＲ２の異なるエピトープに特異的な二つの異なる抗原結合ドメインを有する二重特異性抗体の構築
本実施例は、二つの異なる抗原結合ドメイン（Ｄ１およびＤ２）を含む二重特異性抗体の構築を記述する。Ｄ１およびＤ２は、異なる抗ＨＥＲ２抗体に由来し、その結果、ＨＥＲ２細胞外ドメイン上の別々のエピトープに結合する。
本実施例の二重特異性抗体を構築するために使用した個々の抗ＨＥＲ２抗原結合ドメインは、本明細書の実施例１に従って生成される様々な二価の単一特異性抗ＨＥＲ２抗体から誘導された。本明細書に記載されるすべてのＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗体は、同じ（「共通の」）軽鎖（配列番号１８の軽鎖可変領域［ＬＣＶＲ］アミノ酸配列、ならびに配列番号２０、２２、および２４の軽鎖ＣＤＲ［ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３］アミノ酸配列を含む）を含む。そのため、本実施例に記載されるすべての二重特異性抗体の抗原結合ドメイン（Ｄ１およびＤ２）はどちらも、この共通軽鎖可変領域を含むが、これらの二重特異性抗体は、そのＤ１重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）と重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ）、およびそのＤ２重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）と重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ）に関しては、互いに異なっている。本実施例の二重特異性抗体の構成部分を表１にまとめる。
一部の態様では、二重特異性抗体は、一方または両方の重鎖にＮ２９７Ｑ改変を含有する。重鎖内の２９７残基は、Ｋａｂａｔ付番則に従って識別される。そのため、表３に示されるＨＣ鎖配列は、Ｎ２９７Ｑ改変を含み得る。
（表１）ＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗体のアミノ酸配列
Figure 2023515941000124
（表２）ＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性核酸配列
Figure 2023515941000125
（表３）ＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性全長重鎖および軽鎖アミノ酸配列
Figure 2023515941000126
実施例３．ＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗体の表面結合
この実施例では、ＣｏｍｐＡｂ１およびＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗体のＺＲ７５１細胞（ＡＴＣＣカタログ番号ＣＲＬ－１５００）、ＪＩＭＴ１細胞（ＤＳＭＺカタログ番号ＡＣＣ５８９）、およびＭＤＡＭＢ３６１細胞（ＡＴＣＣカタログ番号ＨＴＢ－２７）の細胞表面への結合能力を試験した。
アッセイについては、細胞を、５％ＣＯ２、３７℃で、上記に指定された培地中、細胞培養用処理済み７５ｃｍ２フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社、番号４３０６４１Ｕ）にて増殖させた。アッセイ当日、細胞をトリプシン処理し、ＰＢＳ（１０分、４Ｃ、１ｍＬ）中でＶｉｏｌｅｔ生存性マーカー（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社、番号７７４７７）と共にインキュベートした。その後、細胞を遠心分離（１５００ＲＰＭ、５分、４℃）し、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中に再懸濁し、Ｕ字底９６ウェルプレートに２００，０００細胞個／ウェルで播種し、Ａｌｅｘａ ６７４－標識抗体（Ｔｈｅｒｍｏ社、カタログ番号Ａ３７５７３）の指示された希釈物と共にインキュベートした（２０分、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ、４℃、５０ｕＬ／ウェル）。次いで、細胞を遠心分離し、２回洗浄した（５分間、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ、４℃、２００ｕＬ／ウェル）。その後、細胞をＰＢＳ（１０分、４℃、５０ｕＬ／ウェル）中、１％パラホルムアルデヒド（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社、番号１５７１０）により固定し、固定液を、追加の１５０ｕｌのＰＢＳで希釈し、Ｆｏｒｔｅｓｓａ Ｘ２０機器（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いて細胞をフローサイトメトリー分析に供した。
表４～６に示されるように、試験した三つの細胞株において、ＣｏｍｐＡｂ１よりも大きな親和性およびアビディティで、両方のＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗体が結合したが、アイソタイプ対照抗体（ＩＣ１）は結合をほとんどまたは全く示さなかった。図１Ａ、図１Ｂ、および図１Ｃも参照されたい。
（表４）ＭＤＡＭＢ３６１細胞へのＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗体の細胞表面結合
Figure 2023515941000127
（表５）ＪＩＭＴ１細胞へのＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗体の細胞表面結合
Figure 2023515941000128
（表６）ＺＲ７５１細胞へのＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗体の結合
Figure 2023515941000129
実施例４．細胞株のパネルにおけるＨＥＲ２×ＨＥＲ２の表面結合
様々なレベルのＨＥＲ２を発現する細胞株への本発明のＨＥＲ２×ＨＥＲ二重特異性抗体の結合能力を試験するために、ハイコンテントイメージングアッセイを実施した。アッセイには、１６のがん細胞株および４つの正常な初代培養物を使用した（表７を参照）。ウェスタンブロット分析により、ＨＥＲ２の相対的な発現について細胞株を分類した。
（表７）細胞株および相対ＨＥＲ２発現
Figure 2023515941000130
細胞を、コラーゲン被覆された黒色壁の９６ウェル光学プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社、カタログ番号６５５９３６）上に、２．５×１０５細胞個／ウェルで、その適切な培養培地中に播種し、５％ＣＯ２中、３７℃で一晩インキュベートした。翌日、細胞を、１０ｕｇ／ｍＬのＡｌｅｘａ６４７標識（Ｔｈｅｒｍｏ社、カタログ番号Ａ３７５７３）抗体を用いて、５０ｕＬのＤＭＥＭ中で、４℃で３０分間インキュベートした。その後、細胞を、冷ＤＭＥＭ＋１０％のＦＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒド（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社、カタログ番号１５７１０）＋０．０７５％サポニン（Ｓｉｇｍａ社、カタログ番号Ｓ４５２１）＋１０ｕｇ／ｍｌヘキスト（Ｌｉｆｅｔｅｃｈ社、カタログ番号Ｈ３５６９）で１０分間、室温でインキュベートした。その後、溶液をＰＢＳで置換した。
Ｉｍａｇｅ ＸｐｒｅｓｓＭｉｃｒｏハイコンテント顕微鏡（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社）を用いて画像を取得し、ＩｍａｇｅＪを使用してＡＦ６４７の平均強度蛍光を核シグナルで除算することによって定量化した。
表８は、ＣｏｍｐＡｂ１およびＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗体（ＢｓＡｂ１およびＢｓＡｂ２）が、中程度および高レベルのＨＥＲ２を発現するがん細胞株に効率的に結合したが、低いＨＥＲ２レベルを発現する正常細胞には不十分に結合したことを示す。実施例３の実験と一致して、ＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗体は、中程度のＨＥＲ２レベルを発現する細胞株に、ＣｏｍｐＡｂ１よりも効率的に結合した。図２も参照されたい。
（表８）様々なレベルのＨＥＲ２を発現するがん細胞株へのＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗体の結合
Figure 2023515941000131
実施例５：ＨＥＲ２×ＨＥＲ２内部移行およびクラスター形成
本実施例は、ＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗体がクラスターを形成してＴ４７Ｄ細胞（ＡＴＣＣカタログ番号ＨＴＢ－１３３）上で内部移行する能力を試験した。２Ｄ単層アッセイについては、Ｔ４７Ｄ細胞を、コラーゲン被覆された９６ウェル光学プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社、カタログ番号６５５９３６）上に完全培地中で２５，０００細胞個／ウェルで播種し、５％ ＣＯ２、３７℃で一晩インキュベートした。３Ｄスフェロイドについては、細胞を低接着性９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社、番号４５１５）に１０，０００細胞個／ウェルで播種し、７２時間インキュベートした。アッセイ当日、細胞を、１０ｕｇ／ｍＬのＡｌｅｘａ６４７（Ｔｈｅｒｍｏ社、カタログ番号Ａ３７５７３）標識抗体を含有する冷（４℃）培地によりで３０分間インキュベートした。その後、細胞を２回洗浄し（５分、１００ｕｌ、４℃、完全培地）、３７℃で６０分間、完全培地中でインキュベートした。細胞を、４ｕｇ／ｍＬのＡｌｅｘａ４８８抗ヒトＦａｂ（Ｊａｃｋｓｏｎ社、番号１０９－５４７－００３）を含有する冷（４℃）培地により３０分間インキュベートした。その後、細胞を２回洗浄し（５分、１００ｕｌ、４℃、完全培地）、ＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒド（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社、カタログ番号１５７１０）＋０．０７５％サポニン（Ｓｉｇｍａ社、カタログ番号Ｓ４５２１）＋１０ｕｇ／ｍｌヘキスト（Ｌｉｆｅｔｅｃｈ社、カタログ番号Ｈ３５６９）で１０分間、室温でインキュベートした。その後、溶液をＰＢＳで置換した。画像をＺｅｉｓｓ Ｓｐｉｎｎｉｎｇ Ｄｉｓｃ Ｃｏｎｆｏｃａｌ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅにより取得し、Ｚｅｉｓｓ Ｚｅｎ Ｂｌｕｅソフトウェアを用いて分析した。細胞内小胞および表面クラスターの数の定量化を、代表的な画像の単一の共焦点切片にて行った。
表９および表１０に見られるように、ＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重異所性抗体は、表面クラスターを形成し、ＣｏｍｐＡｂ１よりも効率的に内部移行する。
（表９）３Ｄスフェロイド（ＳＤ５５）
Figure 2023515941000132
（表１０）２Ｄ単層（ＳＤ５３）
Figure 2023515941000133
実施例６．ＤＭ１抗体コンジュゲーションおよびコンジュゲートの特性解析
５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０、および１０～１５％（ｖ／ｖ）のＤＭＡ中の抗体（ＢｓＡｂ１、ＢｓＡｂ２、およびＩＣ１；１０～２０ｍｇ／ｍｌ）を、５～６倍過剰量のＭ１（ＳＭＣＣ－ＤＭ１）と、周囲温度で２時間コンジュゲートした。コンジュゲートを、サイズ排除クロマトグラフィーまたは大規模限外濾過により精製し、滅菌濾過した。タンパク質濃度を、ＵＶスペクトル分析によって決定した。サイズ排除ＨＰＬＣにより、使用したすべてのコンジュゲートが＞９０％単量体であることを確認し、ＲＰ－ＨＰＬＣにより、１％未満の非コンジュゲートリンカーペイロードであることを確認した。すべてのコンジュゲート抗体を、Ｈａｍｂｌｅｔｔ ｅｔ ａｌ．（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２００４ Ｏｃｔ １５；１０（２０）：７０６３－７０）に従って、リンカーペイロード積載値についてＵＶにより分析した。ペイロードと抗体との比率を表１１に報告する。
（表１１）各抗体薬剤コンジュゲートの収率パーセントおよびペイロードと抗体との比率
Figure 2023515941000134
実施例６Ａ メイタンシノイドＢと抗体とのコンジュゲーション
この例では、抗体（ＢｓＡｂ１、ＢｓＡｂ２）をメイタンシノイドＢ：
Figure 2023515941000135
にコンジュゲートして、
Figure 2023515941000136
を形成し、式中、ＡｂはＢｓＡｂ１またはＢｓＡＢ２である。
抗体ＢｓＡｂ１およびＢｓＡｂ２ １０～２０ｍｇ／ｍｌを、過剰なメイタンシン－３－Ｎ－メチル－Ｌ－アラニン－Ｎ－Ｍｅ－ベータ－アラニン－カルバミル－（ｐ－アミノ）ベンジル－シトルリン－バリン－アジポイル－スクシネート（化合物Ｂ１）とコンジュゲートした。コンジュゲートを、サイズ排除クロマトグラフィーまたは大規模限外濾過により精製し、滅菌濾過した。タンパク質濃度を、ＵＶスペクトル分析によって決定した。すべてのコンジュゲート抗体を、Ｈａｍｂｌｅｔｔ ｅｔ ａｌ．（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２００４ Ｏｃｔ １５；１０（２０）：７０６３－７０）に従ってリンカーペイロード積載値についてＵＶにより、および／または天然型とコンジュゲート型との質量差により分析した。
化合物Ｂ１は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１８／０１３４７９４号Ａ１（米国特許出願第１５／８１４，０９５号）の「化合物１」について記載されている方法に従って合成した。
Figure 2023515941000137
実施例７．ツブリシン１ＡおよびＣａｍｐｔ－１を用いたＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗体の部位特異的コンジュゲーション
この例では、二重特異性抗体ＢｓＡｂ１およびＢｓＡｂ２を、以下の構造の二つ以上のＬＰに部位特異的にコンジュゲートし：
Figure 2023515941000138
この構造はペイロードツブリシン１Ａを含む。さらに、二重特異性抗体ＢｓＡｂ１およびＢｓＡｂ２を、部位特異的に以下にコンジュゲートした。
Figure 2023515941000139
野生型抗体またはその抗原結合断片へのシクロオクチン－スペーサー－ペイロードの部位特異的コンジュゲートを、三つのステップで生産した。最初のステップは、野生型抗体の脱グリコシル化であった。第二のステップは、脱グリコシル化抗体のＱ２９５部位への、アジド－ＰＥＧ３－アミンなどの低分子の微生物トランスグルタミナーゼ（ＭＴＧ）ベースの酵素的付加（以下、「ＭＴＧベース」コンジュゲーション）であった。第三のステップでは、［２＋３］環化付加、例えば、アジドとシクロオクチンとの間の１，３－二極性環化付加（別名、銅不含クリックケミストリー）を介したアジド官能化抗体へのシクロオクチン－スペーサー－ペイロードの付加を採用した。Ｂａｓｋｉｎ，Ｊ．Ｍ．；Ｐｒｅｓｃｈｅｒ，Ｊ．Ａ．；Ｌａｕｇｈｌｉｎ，Ｓ．Ｔ．；Ａｇａｒｄ，Ｎ．Ｊ．；Ｃｈａｎｇ，Ｐ．Ｖ．；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｉ．Ａ．；Ｌｏ，Ａ．；Ｃｏｄｅｌｌｉ，Ｊ．Ａ．；Ｂｅｒｔｏｚｚｉ，Ｃ．Ｒ．ＰＮＡＳ ２００７，１０４（４３），１６７９３－７を参照されたい。図３Ａは、［２＋３］環化付加を介してアジド官能基抗体とコンジュゲートされたＤＩＢＡＣ部分を有するリンカー－スペーサー－ペイロードの例である。このプロセスは、約５０～８０％の単離収率で部位特異的および化学量論的コンジュゲートを提供する。図３Ｂは、以下のように実施される３ステップの部位特異的コンジュゲーションの一例である。
ステップ１：脱グリコシル化抗体の調製。
脱グリコシル化を実施して、コンジュゲーション部位を露出させた。抗ＨＥＲ２ヒトＩｇＧ４二重特異性抗体（４０ｍｇ、ＰＢＳ中２７ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ５．５～８．０）を、ＰＮＧａｓｅ Ｆ酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ社、５００，０００Ｕ／ｍＬ、１ｍｇ抗体当たり２ｕＬの酵素、合計８０ｕＬ）と混合した。反応混合物を、穏やかに撹拌しながら３７℃で一晩インキュベートした。脱グリコシル化をＥＳＩ－ＭＳによってモニタリングした。反応完了時に、反応混合物を次のステップで直接使用した。
ステップ２：アジド官能基化抗体の調製。
１．５ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ７．２）中の脱グリコシル化ＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗体（４０ｍｇ）を、ＭＴＧ（ＡＣＴＩＶＡ ＴＩ、味の素社、日本）の存在下で、２００モル当量のアジド－ＰＥＧ３－アミン（ＭＷ＝２１８．２６ｇ／ｍｏｌ）とインキュベートした（０．０６ｍｇのＭＴＧ／抗体ｍｇ）。反応物を、穏やかに混合しながら、３７℃で４時間、次いで２５℃で一晩インキュベートした。反応をＥＳＩ－ＭＳによってモニタリングした。反応完了時に、過剰なアジド－ＰＥＧ３－アミンおよびＭＴＧをＳＥＣ（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ＰＧ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）により除去して、アジド官能基抗体を生成した。アジド－ＰＥＧ３－アミンは、抗体上の二つのＱ２９５部位に添加され、その結果、２ＤＡＲの抗体－ＰＥＧ３－アジドコンジュゲートに４０４Ｄａの増加をもたらす。
このプロセスは、一方または両方の重鎖にＮ２９７Ｑ改変を有する抗体に対しても実施することができる。この例では、アジド－ＰＥＧ３－アミンは、抗体上の二つのＱ２９５部位および少なくとも一つの２９７Ｑ部位に添加され、３ＤＡＲまたは４ＤＡＲの抗体－ＰＥＧ３－アジドコンジュゲートをもたらす。
ステップ３：アジド官能基化されたグルタミニル修飾抗体とリンカーペイロード（ＬＰ）を含有するシクロオクチンとの間の［２＋３］クリック反応による部位特異的コンジュゲートの調製。
概して、アジド官能基化されたグルタミル修飾抗体を、適切な有機溶媒（例えば、ＤＭＳＯ、ＤＭＦまたはＤＭＡ；反応混合物は１０～２０％の有機溶媒ｖ／ｖを含有する）中に溶解された≧６モル当量のＬＰ、例えば、以下の構造の化合物：
Figure 2023515941000140
と共に２５℃～３７℃で３～２４時間インキュベートすることによって、アジド官能基化された抗体－ＬＰコンジュゲートを調製した。反応の進行をＥＳＩ－ＭＳによってモニタリングした。アジド官能基抗体（ｍＡｂ－ＰＥＧ３－Ｎ３）が存在しないことにより、コンジュゲーションの完了が示された。余剰のリンカー－ペイロード（ＬＰ）および有機溶媒を、脱塩カラムまたはサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって除去した。精製されたコンジュゲートを、ＳＥＣ－ＨＰＬＣおよびＥＳＩ－ＭＳにより分析した。コンジュゲートのモノマー純度は、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析により＞９９％であった。
具体的な一例として、２．４ｍＬのＰＢＳ中のアジド官能基化ＨＥＲ２×ＨＥＲ２抗体、例えばＢｓＡｂ１、ＢｓＡｂ２（３１ｍｇ）を、６当量のツブリシン１Ａ－ＬＰ（ＤＭＡ中、濃度１０ｍｇ／ｍＬ）と共に３０℃で一晩処理した。余剰のリンカーペイロード（ＬＰ）を、ＳＥＣ（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ＰＧ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）によって除去した。最終製品をＵＶ、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ（図４を参照）、およびＥＳＩ－ＭＳによって特性解析した。
同様の様式で、記載されるビスアジドアルキル置換アミン（ビスＳＰ１）によりＱ２９５でいずれもアジド官能化されたＢｓＡｂ１およびＢｓＡｂ２を、以下の構造を有するＣＡＭＰＴ－１－ＬＰにより処理し、以下に示されるＢｓＡｂ１－Ｃａｍｐｔ１およびＢｓＡｂ２－Ｃａｍｐｔ１を得た。
Figure 2023515941000141
ＣＡＭＰＴ－１－ＬＰ（すなわち、ＬＰ１）は、スキーム１および下記の実施例ｉ～ｉｉｉに記載されるように合成する。出発材料Ｌ１－１（ＣＡＳ ２２２６４７２－２６－８）を、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１８０８９３７３Ａ２に従って合成した。
スキーム１．ｖｃＰＡＢ－カルバメートリンカー－ペイロードＣＡＭＰＴ－１－ＬＰの合成
Figure 2023515941000142
実施例ｉ：Ｎ－［（１Ｓ）－１－｛［（１Ｓ）－４－（カルバモイルアミノ）－１－｛［４－（ヒドロキシメチル）フェニル］カルバモイル｝ブチル]カルバモイル｝－２－メチルプロピル］－１－［２－（シクロオクト－２－イン－１－イルオキシ）アセトアミド］－３，６，９，１２－テトラオキサペンタデカン－１５－アミド（Ｌ１－２）
Figure 2023515941000143
ＤＭＦ（１０ｍＬ）中の化合物Ｌ１－１（０．１７ｇ、０．３３ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＩＰＥＡ（０．１３ｇ、１．０ｍｍｏｌ）およびｖｃＰＡＢ（０．１３ｇ、０．３４ｍｍｏｌ）を連続的に添加し、反応混合物を室温で１時間撹拌した。反応完了をＬＣＭＳによってモニタリングした。得られた混合物を、逆相フラッシュクロマトグラフィー（水中０～８０％アセトニトリル）により直接精製して、化合物Ｌ１－２（０．１８ｇ、収率７０％）を無色油状物として得た。ＥＳＩ ｍ／ｚ：７９１．３（Ｍ＋Ｈ）＋。１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，ＤＭＳＯｄ６）δ ９．９１（ｓ，１Ｈ），８．１１（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．８９（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ），７．６１（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ），７．５５（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），７．２３（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），５．９８（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ），５．４２（ｓ，２Ｈ），５．１０（ｂｒ ｓ，１Ｈ），），４．４３（ｓ，２Ｈ），４．３９－４．３７（ｍ，１Ｈ），４．３０－４．２１（ｍ，２Ｈ），３．８７（ｄ，Ｊ＝１４．８Ｈｚ，１Ｈ），３．７５（ｄ，Ｊ＝１４．８Ｈｚ，１Ｈ），３．６２－３．５８（ｍ，２Ｈ），３．５０－３．４６（ｍ，１２Ｈ），３．４３（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ），３．２７－３．２２（ｍ，２Ｈ），３．０６－２．９２（ｍ，２Ｈ），２．４１－２．３２（ｍ，２Ｈ），２．２６－２．０５（ｍ，３Ｈ），１．９９－１．６６（ｍ，６Ｈ），１．６２－１．５５（ｍ，３Ｈ），１．４４－１．３５（ｍ，３Ｈ），０．８９（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ），０．８３（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ）ｐｐｍ。
実施例ｉｉ：｛４－［（２Ｓ）－５－（カルバモイルアミノ）－２－［（２Ｓ）－２－｛１－［２－（シクロオクト－２－イン－１－イルオキシ）アセトアミド］－３，６，９，１２－テトラオキサペンタデカン－１５－アミド｝－３－メチルブタナミド］ペンタナミド］フェニル｝メチル４－ニトロフェニルカーボネート（Ｌ１－３）
Figure 2023515941000144
乾燥ＤＭＦ（５ｍＬ）中の化合物Ｌ１－２（８０ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（１２ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）、およびＤＩＰＥＡ（２６ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）の懸濁液を、室温で１０分間撹拌した後、ビス（４－ニトロフェニル）カーボネート（６１ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を、室温で２時間撹拌した。反応完了をＬＣＭＳによってモニタリングした。得られた混合物を、逆相フラッシュクロマトグラフィー（水中の０～８０％アセトニトリル）により直接精製して、化合物Ｌ１－３（５３ｍｇ、収率５５％）を白色固形物として得た。ＥＳＩ ｍ／ｚ：９５６．３（Ｍ＋Ｈ）＋。
実施例ｉｉｉ：｛４－［（２Ｓ）－５－（カルバモイルアミノ）－２－［（２Ｓ）－２－｛１－［２－（シクロオクト－２－イン－１－イルオキシ）アセトアミド］－３，６，９，１２－テトラオキサペンタデカン－１５－アミド｝－３－メチルブタナミド］ペンタンアミド］フェニル｝メチルＮ－（｛[（｛［（１０Ｓ，２３Ｓ）－１０－エチル－１８－フルオロ－１０－ヒドロキシ－１９－メチル－５，９－ジオキソ－８－オキサ－４，１５－ジアザヘキサシクロ［１４．７．１．０２，１４．０４，１３．０６，１１．０２０，２４］テトラコサ－１，６（１１），１２，１４，１６，１８，２０（２４）－ヘプタエン－２３－イル］カルバモイル｝メトキシ）メチル］カルバモイル｝メチル）カルバメート（ＬＰ１／ＣＡＭＰＴ－１－ＬＰ）
Figure 2023515941000145
乾燥ＤＭＦ（２ｍＬ）中の化合物Ｌ１－３（１６ｍｇ、１７μｍｏｌ）およびエキサテカンメシル酸塩（１２ｍｇ、１７μｍｏｌ）の黄色溶液に、ＤＩＰＥＡ（６．５ｍｇ、５１μｍｏｌ）を加え、透明な反応溶液を室温で２時間撹拌した。反応完了をＬＣＭＳによってモニタリングした。得られた混合物を、逆相フラッシュクロマトグラフィー（水性 ＴＦＡ（０．０１％）中０～６０％アセトニトリル）により直接精製して、リンカーペイロードＬＰ１（１５ｍｇ、ＴＦＡ塩として収率６３％）を白色固体として得た。ＥＳＩ ｍ／ｚ：６９８．８（Ｍ／２＋Ｈ）＋。１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，ＤＭＳＯｄ６）δ ９．９９（ｓ，１Ｈ），８．８０（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，１Ｈ），８．５０（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，１Ｈ），８．１２（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），７．８７（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ），７．７９（ｄ，Ｊ＝１０．８Ｈｚ，１Ｈ），７．６２－７．５８（ｍ，３Ｈ），７．４２（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，１Ｈ），７．３１（ｓ，１Ｈ），７．２８（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），６．５３（ｂｒ ｓ，１Ｈ），５．９８（ｔ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，１Ｈ），５．６３－５．５７（ｍ，１Ｈ），５．４６－５．３７（ｍ，３Ｈ），５．２１（ｓ，２Ｈ），４．９３（ｓ，２Ｈ），４．６３（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ），４．４１－４．３５（ｍ，１Ｈ），４．２９－４．２１（ｍ，２Ｈ），４．０２（ｓ，２Ｈ），３．８７（ｄ，Ｊ＝１４．４Ｈｚ，１Ｈ），３．７５（ｄ，Ｊ＝１４．８Ｈｚ，１Ｈ），３．６３－３．５８（ｍ，４Ｈ），３．５０－３．４８（ｍ，１２Ｈ），３．４６－３．４１（ｍ，２Ｈ），３．２７－３．２４（ｍ，２Ｈ），３．２３－３．１２（ｍ，２Ｈ），３．０７－２．９１（ｍ，２Ｈ），２．４７－２．４５（ｍ，０．５Ｈ），２．４１－２．３３（ｍ，４．５Ｈ），２．２５－２．０４（ｍ，５Ｈ），１．９９－１．６９（ｍ，９Ｈ），１．６３－１．５４（ｍ，３Ｈ），１．４４－１．３３（ｍ，３Ｈ），０．８８－０．８２（ｍ，９Ｈ）ｐｐｍ。（ＴＦＡのプロトンは観察されなかった）。１９Ｆ ＮＭＲ（３７６ＭＨｚ、ＤＭＳＯｄ６）δ－７４（ＴＦＡ）、－１１１（Ａｒ－Ｆ）ｐｐｍ。
表１２は、合成された抗体ツブリシンおよびカンプトテシンコンジュゲート（ＡＤＣ）のＤＡＲ（ＥＳＩ－ＭＳ）値のリストである。
ＳＥＣ－ＨＰＬＣおよびＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳによる抗体およびＡＤＣの特性解析
精製したコンジュゲートを、代表的なＳＥＣおよびＥＳＩ－ＭＳを用いて、ＳＥＣ－ＨＰＬＣおよびＥＳＩ－ＭＳにより分析した。
分析的ＳＥＣ実験は、Ｗａｔｅｒｓ １５１５機器を使用して、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ（１．０×３０ｃｍ）カラム上、ＰＢＳ ｐＨ ７．２を用いた流量０．８０ｍＬ／分で実行し、Ｗａｔｅｒｓ ２９９８ ＰＤＡを使用してλ＝２８０ｎｍでモニタリングした。分析試料は３０～８０μＬの試験試料から構成されるものとした。図４のＳＥＣ結果は、凝集または分解が最小である単量体ｍＡｂおよびそのコンジュゲートの典型的な保持時間を示す。
ＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳによるＡＤＣ試料のインタクト質量の測定を実施して、薬剤－ペイロード分布プロファイルを決定し、平均ＤＡＲを計算した。各試験サンプル（２０～５０ｎｇ、５μＬ）を、ＤＴＴによって還元し、次いでＡｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＥＨ Ｃ４カラム（１０Ｋｐｓｉ、３００Å、１．７μｍ、７５μｍ×１００ｍｍ、カタログ番号１８６００３８１０）に装填した。３分間脱塩した後、タンパク質を溶出し、質量スペクトルをＷａｔｅｒｓ Ｓｙｎａｐｔ Ｇ２－Ｓｉ質量分析計によって取得した。表１２に要約されるように、ほとんどの部位特異的ＡＤＣは、ほぼ２ＤＡＲを有する。
（表１２）抗体－薬剤コンジュゲートＤＡＲ
Figure 2023515941000146
この実験で生成されたＡＤＣを以下の実施例で使用した。
実施例８．ＨＥＲ２×ＨＥＲ２ヒト二重特異性モノクローナル抗体およびコンジュゲートＨＥＲ２×ＨＥＲ２ヒト二重特異性モノクローナル抗体の表面プラズモン共鳴から得られた結合親和性および動力学定数
Ｍ８３０またはＭ１のどちらかとコンジュゲートされた抗ＨＥＲ２×ＨＥＲ２抗体とのｈＥｒｂＢ２．ｍｍｈ結合の平衡解離定数（ＫＤ値）を、ＭＡＳＳ－２機器にてリアルタイム表面プラズモン共鳴バイオセンサーアッセイを用いて決定した。ＭＡＳＳ－２センサー表面を、モノクローナルマウス抗ヒトＦｃ抗体（ＲＥＧＮ２５６７）とのアミンカップリングにより誘導体化し、ヒト定常領域を付して発現された抗ＨＥＲ２×ＨＥＲ２ ＡＤＣおよび非改変親抗体を捕捉した。Ｂｉａｃｏｒｅ結合試験を、ＨＢＳ－ＥＰランニング緩衝液（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ｖ／ｖ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０）中で実施した。Ｃ末端ｍｙｃ－ｍｙｃ－ヘキサヒスチジンタグを発現するヒトｈＥｒｂＢ２（ｈＥｒｂＢ２－ＭＭＨ）を社内で調製した。ＨＢＳ－ＥＰランニング緩衝液中で調製した異なる濃度（３倍希釈）のｈＥｒｂＢ２－ＭＭＨ（９０ｎＭ～１．１ｎＭの範囲）を、抗ＨＥＲ２×ＨＥＲ２ ＡＤＣまたは抗体捕捉表面の上に流速３０μＬ／分で注入した。ｈＥｒｂＢ２－ＭＭＨと、捕捉ＡＤＣおよびモノクローナル抗体のそれぞれとの結合を、３分間モニタリングした。続いて、ＨＢＳ－ＥＰランニング緩衝液中で１０分間、ｈＥｒｂＢ２－ＭＭＨの解離をモニタリングした。抗ヒトＦｃ表面を２０ｍＭ Ｈ３ＰＯ４の短時間注入により再生した。すべての結合動態実験を２５℃で実施した。
Ｓｃｒｕｂｂｅｒ２．０ｃ曲線フィッティングソフトウェアを用いて、リアルタイムセンサーグラムを１：１結合モデルにフィッティングさせることによって、動力学的結合速度定数（ｋａ）および解離速度定数（ｋｄ）を決定した。すべてのセンサグラムを、対応するアナライトセンサグラムから緩衝液注入センサグラムのシグナルを差し引くことにより二重参照とし、これにより捕捉表面から抗体が解離することにより生じるアーチファクトを除去した。結合解離平衡定数（ＫＤ）および解離半減期（ｔ１／２）を、以下のように動力学的速度定数から計算した：
ＫＤ（Ｍ）＝ｋｄ／ｋａ、およびｔ１／２（分）＝ｌｎ２／（６０×ｋｄ）
（表１３）２５℃での二重特異性抗ＨＥＲ２ ｍＡｂおよびＡＤＣのＢｉａｃｏｒｅ結合親和性
Figure 2023515941000147
表１３に示されるように、本明細書に記載の二重特異性ＨＥＲ２×ＨＥＲ２抗体は、最大１１５５分を超えるＴ１／２値を示した。
実施例９：カテプシンＢ切断可能リンカーのプロセッシング
ＣｏｍｐＡｂ１およびＢｓＡｂ２がＴ４７Ｄ細胞（ＡＴＣＣカタログ番号ＨＴＢ－１３３）上でカテプシンＢ切断可能リンカーの切断を誘発する能力を試験した。Ｔ４７Ｄ細胞を、完全培地（ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳ＋５ｍｌペニシリン／ストレプトマイシン／グルタミン＋１ｍＭ ＮａＰｙｒ＋１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ＋１０ｕｇ／ｍｌインスリン）中、コラーゲン被覆９６ウェル光学プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社、カタログ番号６５５９３６）上に２５，０００細胞個／ウェルで播種し、５％ ＣＯ２、３７℃で一晩インキュベートした。翌日、細胞を、１０ｕｇ／ｍＬの蛍光抗体（バイオセンサー１により標識された抗体、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１８／０４４５４０を参照）を含有する冷（４℃）培地で３０分間インキュベートした。その後、細胞を２回（５分間、１００ｕｌ、４Ｃ、完全培地）洗浄し、記録培地（ＤＰＢＳ＋２％ＦＢＳ＋１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ）を加え、その後すぐに共焦点ライブイメージングを開始した。画像をＺｅｉｓｓ Ｓｐｉｎｎｉｎｇ Ｄｉｓｃ Ｃｏｎｆｏｃａｌ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅにより取得し、Ｚｅｉｓｓ Ｚｅｎ Ｂｌｕｅソフトウェアを用いて分析した。Ａｌｅｘａ ５６８（切断されたバイオセンサー）の統合された蛍光の定量化を、３６個の異なるフィールドの単一の共焦点セクションで行った。
バイオセンサーは、無傷である場合にＡＦ６４７信号を放射する。バイオセンサーコンジュゲート抗体がエンド／リソソーム内に内部移行し、カテプシンＢリンカーが切断されると、ＡＦ６４７およびＡＦ５６８の両方のシグナルが放射される。表１４は、ＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗体が、ＣｏｍｐＡｂ１よりもより効率的にカテプシンＢ切断可能なバイオセンサーのプロセッシングを誘導することを示す。図５も参照されたい。
（表１４）ＢｓＡｂ２と比較したＣｏｍｐＡｂ１における切断されたバイオセンサーの蛍光
Figure 2023515941000148
実施例１０．ＨＥＲ２＋細胞株におけるＨＥＲ２×ＨＥＲ２コンジュゲートによるインビトロ殺細胞性
メイタンシノイドＡまたはツブリシンＡ１－ＬＰペイロードのどちらかとコンジュゲートされたＣｏｍｐＡｂ１およびＢｓＡｂ１がバイオアッセイ細胞を殺傷する能力を試験するために、インビトロ細胞傷害アッセイを実施した。低減したＡＤＣ濃度で６日間処理された様々なレベルのＨＥＲ２発現を有する細胞に対しアッセイを実施した。細胞生存率を、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏｗ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、番号Ｇ７５７１）を用いた処理後に測定した。アッセイについては、細胞を、５％ ＣＯ２、３７℃で一晩、それぞれの培地中で増殖させた。翌日、ＭＣＣ－メイタンシノイドＡまたはツブリシンＡ１－ＬＰペイロードのどちらかとコンジュゲートされたＣｏｍｐＡｂ１、ＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗体、または対照抗体のいずれかを、ＤＭＥＭおよび１０％ＦＢＳ中の６６．６７ｎＭ～０．０１ｎＭの範囲の最終濃度で細胞に添加し、６日間インキュベートした。インキュベーション後、各ウェルに１００ｕＬのＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏを加え、室温で５分間インキュベートして、５００ＲＰＭで振とうした。各ウェルのＡＰＴ量に比例する冷光シグナルを、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ ２１０５マルチノードプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社）を用いて測定した。ＩＣ５０値を、１０点の応答曲線にわたる２フェーズ減衰式から決定した（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ）。すべてのＩＣ５０値をｎＭ濃度で表している。
表１５は、中程度のＨＥＲ２レベルを発現する細胞（ＺＲ７５１およびＪＩＭＴ１）において、ＣｏｍｐＡｂ１－ＭＣＣ－メイタンシノイドＡの効果が対照ＡＤＣ（３０～４０ｎＭのＩＣ５０値）とは差がなく、ＢｓＡｂ１－ＭＣＣ－メイタンシノイドＡが中程度の有効性を示し（ＩＣ５０値６～７ｎＭ）、ＣｏｍｐＡｂ１－ツブリシン１Ａ－ＬＰがより良好な有効性を示し（ＩＣ５０値０．１５～０．２ｎＭ）、ＢｓＡｂ１－ツブリシン１Ａ－ＬＰがすべての試験したＡＤＣのうち最も高効率の殺細胞性を示した（ＩＣ５０値０．０６～０．０７ｎＭ）ことを示している。より高いＨＥＲ２レベルを発現する細胞（ＭＤＡＭＢ３６１、ＭＤＡＭＢ４５３、およびＳＫＢＲ３）では、ＣｏｍｐＡｂ１－ＭＣＣ－メイタンシノイドＡは効率的な殺細胞性を誘発し（ＩＣ５０値０．０４～０．５ｎＭ）、ＢｓＡｂ１－ＭＣＣ－メイタンシノイドＡはより高い有効性を示し（ＩＣ５０値０．０２～０．１ｎＭ）、ＣｏｍｐＡｂ１－ツブリシン１Ａ－ＬＰはさらに高い有効性を示し（ＩＣ５０値０．００６～０．００８ｎＭ）、ＢｓＡｂ１－ツブリシン１Ａ－ＬＰはすべての試験したＡＤＣのうち最も高効率の殺細胞性を示した（ＩＣ５０値０．００２～０．００４ｎＭ）。
（表１５）異なるＨＥＲ２レベルを発現する細胞に対するＡＤＣの有効性
Figure 2023515941000149
実施例１１．ＨＥＲ２低発現細胞株におけるインビトロ殺細胞性
バイオアッセイ細胞に対するＢｓＡｂ１ツブリシン１Ａ－ＬＰ、ＢｓＡｂ２ツブリシン１Ａ－ＬＰ、およびＭｅｄｉｍｍｕｎｅ社の比較物質であるＨＥＲ２×ＨＥＲ２－ツブリシン（ＣｏｍｐＡｂ２－ツブリシン２Ａ－ＬＰ）の殺傷効果を試験するために、インビトロ細胞傷害アッセイを実施した。アッセイを、正常な初代培養物と、低いＨＥＲ２レベルを発現する乳がん細胞に対し実施した。細胞を、減少濃度のＡＤＣで６日間処理し、細胞生存率を、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏｗ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、番号Ｇ７５７１）を用いた処理後に測定した。
アッセイについては、細胞を、５％ＣＯ２、３７℃で一晩、それぞれの培地中で増殖させた。翌日、ＢｓＡｂ１－ツブリシン１Ａ－ＬＰ、ＢｓＡｂ２－ツブリシン１Ａ－ＬＰ、ＣｏｍｐＡｂ２－ツブリシン２Ａ－ＬＰ、またはそれらのそれぞれの非結合対照抗体のいずれかを、ＤＭＥＭおよび１０％ＦＢＳ中の６６．６７ｎＭ～０．０１ｎＭの範囲の最終濃度で細胞に添加し、６日間インキュベートした。インキュベーション後、各ウェルに１００ｕＬのＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏｗを加え、室温で５分間インキュベートし、５００ＲＰＭで振とうした。各ウェルのＡＰＴ量に比例する冷光シグナルを、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ ２１０５マルチノードプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社）を用いて測定した。ＩＣ５０値を、１０点の応答曲線にわたる２フェーズ減衰式から決定した（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ）。すべてのＩＣ５０値をｎＭ濃度で表している。
表１６は、ＢｓＡｂ１－ツブリシン１Ａ－ＬＰおよびＢｓＡｂ２－ツブリシン１Ａ－ＬＰが、低いＨＥＲ２レベルを発現する細胞において、ほとんどまたは全く殺傷効果を有しなかったことを示す（ＩＣ５０値８～＞６７ｎＭ）。この驚くべき恩恵は、正常組織を標的とせずに腫瘍細胞を死滅させる上でＡＤＣの有用性を示す。これに対して、ＨＥＲ２ ＩＨＣ ０＋異種移植片における抗腫瘍効果とヒトにおける毒性とを有することが報告されているＡＤＣであるＣｏｍｐＡｂ２－ツブリシン２Ａ－ＬＰは、０．３ｎＭという低いＩＣ５０で殺細胞性を誘導した。
（表１６）ＨＥＲ２低発現細胞株に対するＡＤＣの細胞毒性
Figure 2023515941000150
実施例１２．ＪＩＭＴ１異種移植片におけるＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗体ＡＤＣの用量依存性
ＨＥＲ２ ＩＨＣ２＋ ＪＩＭＴ１異種移植片モデルにおけるＢｓＡｂ１－ツブリシン １Ａ－ＬＰの有効性を試験するために、インビボ腫瘍試験を実施した。アッセイには、６週齢のメスＳＣＩＤマウス（Ｃ．Ｂ－Ｉｇｈ－１ｂ／ＩｃｒＴａｃ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ、Ｔａｃｏｎｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、ｎ＝５０）を使用した。移植については、ＪＩＭＴ１（ＤＳＭＺカタログ番号ＡＣＣ５８９）細胞をマトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ社、カタログ番号３５４２３４）と混合し、４×１０６個の細胞を含む細胞とマトリゲルとの懸濁液１５０ｕＬをＳＣＩＤマウスに注射した。１１日後、指示されたＡＤＣを、腫瘍サイズに基づき無作為化されたＳＣＩＤマウスに、指示用量で皮下注射した。各マウスの異種移植片のサイズを、Ｃａｌｉｐｅｒ（Ｒｏｂｏｚ、カタログ番号ＲＳ６４６６）を用いて測定した。
測定された各時点について治療群当たりの平均腫瘍サイズを表１７に示す。ＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性ＡＤＣ、ＢｓＡｂ１－ツブリシン１Ａ－ＬＰ（ＤＡＲ２．１）は、用量依存的な様式で殺腫瘍細胞性を示した。３ｍｇ／ｋｇのＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性ＡＤＣであるＢｓＡｂ１－ツブリシン１Ａ－ＬＰの単回投与を受けたマウスでは、ＪＩＭＴ１異種移植片のサイズが平均サイズ１０ｍｍ３（１２３日目）に著しくかつ持続的に減少した。１ｍｇ／ｋｇのＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性ＡＤＣ、ＢｓＡｂ１－ツブリシン１Ａ－ＬＰの単回投与を受けたマウスでは、ＪＩＭＴ１異種移植片のサイズが平均サイズ７４ｍｍ３（２８日目）に減少した。これに対して、３、１、または０．３ｍｇ／ｋｇのアイソタイプ対照ＡＤＣ（ＩＣ１－ツブリシン１Ａ－ＬＰ；ＤＡＲ２）または生理食塩水を受けたマウスでは、抗腫瘍効果がほとんどまたは全くなかった。図６Ａおよび図６Ｂも参照されたい。
（表１７）ＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性ＡＤＣおよび対照ＡＤＣの処置後のＪＩＭＴ１異種移植片腫瘍サイズ（ｍｍ３）
Figure 2023515941000151
実施例１３．ＣｏｍｐＡｂ１－ＭＣＣ－メイタンシノイドＡと比較したＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性ＡＤＣのインビボ有効性
ＨＥＲ２ ＩＨＣ２＋ ＪＩＭＴ１異種移植片モデルにおけるＢｓＡｂ１－ツブリシン１Ａ－ＬＰ、ＢｓＡｂ２－ツブリシン１Ａ－ＬＰ、およびＣｏｍｐＡｂ１－ＭＣＣ－メイタンシノイドＡの有効性を比較するため、インビボ腫瘍試験を実施した。アッセイには、６週齢のメスＳＣＩＤマウス（Ｃ．Ｂ－Ｉｇｈ－１ｂ／ＩｃｒＴａｃ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ、Ｔａｃｏｎｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、ｎ＝５０）を使用した。移植には、ＪＩＭＴ１（ＤＳＭＺ、ＡＣＣ５８９）細胞をマトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ社、カタログ番号３５４２３４）と混合し、４×１０６個の細胞を含む細胞とマトリゲルとの懸濁液１５０ｕＬをＳＣＩＤマウスに注射した。１４日または２８日後、指示されたＡＤＣを、腫瘍サイズに基づき無作為化されたＳＣＩＤマウスに皮下注射した。各マウスの異種移植片のサイズを、Ｃａｌｉｐｅｒ（Ｒｏｂｏｚ、カタログ番号ＲＳ６４６６）を用いて測定した。
測定された各時点について治療群当たりの平均腫瘍サイズを表１８に示す。３ｍｇ／ｋｇのＢｓＡｂ１－ツブリシン１Ａ－ＬＰまたはＢｓＡｂ２－ツブリシン１Ａ－ＬＰの単回用量を受けたマウスでは、ＪＩＭＴ１異種移植片のサイズが、それぞれ平均サイズ１８および６ｍｍ３（それぞれ８３日目および９７日目）へと著しくかつ持続的に減少した。対照的に、１０ｍｇ／ｋｇのＣｏｍｐＡｂ１－ＭＣＣ－メイタンシノイドＡを２回用量受けたマウスでは、３ｍｇ／ｋｇのＩＣ１－ツブリシン１Ａ－ＬＰの単回用量、または１０ｍｇ／ｋｇのＩＣ１－ＭＣＣ－メイタンシノイドＡの２回用量を受けたマウスと同様に、抗腫瘍効果がほとんどまたは全くなかった。図７Ａおよび図７Ｂも参照されたい。
（表１８）指示されたＡＤＣ処置後のＪＩＭＴ１異種移植片腫瘍サイズ（ｍｍ３）
Figure 2023515941000152
実施例１４．ＭＤＡＭＢ３６１異種移植片におけるＣｏｍｐＡｂ１－ＭＣＣ－メイタンシノイドＡと比較したＢｓＡｂ１－ツブリシン１Ａ－ＬＰの有効性
ＨＥＲ２ ＩＨＣ２＋ ＭＤＡＭＢ３６１異種移植片モデルにおけるＢｓＡｂ１－ツブリシン１Ａ－ＬＰとＣｏｍｐＡｂ１－ＭＣＣ－メイタンシノイドＡの有効性を比較するため、インビボ腫瘍試験を実施した。アッセイには、６週齢のメスＳＣＩＤマウス（Ｃ．Ｂ－Ｉｇｈ－１ｂ／ＩｃｒＴａｃ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ、Ｔａｃｏｎｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、ｎ＝５０）を使用した。細胞移植の前日に、マウスに１７ｂ－エストラジオールペレット（０．７２ｍｇ、６０日間の放出、Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ社、番号ＳＥ－１２１）を皮下移植した。翌日、ＭＤＡＭＢ３６１細胞（ＤＳＭＺ、ＡＣＣ５８９）をマトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ社、カタログ番号３５４２３４）と混合し、６×１０６個の細胞を含む細胞とマトリゲルとの懸濁液１５０ｕＬをＳＣＩＤマウスに注射した。１９日後、指示されたＡＤＣを、腫瘍サイズに基づき無作為化されたＳＣＩＤマウスに、指示用量で皮下注射した。第二の用量を、５２日目にＢｓＡｂ１－ツブリシン１Ａ－ＬＰ処置コホートに投与し、薬剤抵抗性の発現を評価した。各マウスの異種移植片のサイズを、Ｃａｌｉｐｅｒ（Ｒｏｂｏｚ、カタログ番号ＲＳ６４６６）を用いて測定した。
測定された各時点について治療群当たりの平均腫瘍サイズを表１９に示す。３ｍｇ／ｋｇのＢｓＡｂ１－ツブリシン１Ａ－ＬＰ（ＤＡＲ ２．１）の単回投与を受けたマウスでは、３８日目までにＭＤＡＭＢ３６１異種移植片のサイズが平均サイズ２０２ｍｍ３から平均サイズ１２２ｍｍ３へと部分的に減少した。５２日目に投与された第二の用量により、７６日目までに異種移植片腫瘍サイズの７０ｍｍ３へのいっそうの退縮が引き起こされた。対照的に、３ｍｇ／ｋｇのＣｏｍｐＡｂ１－ＭＣＣ－メイタンシノイドＡ（ＤＡＲ ３．１）または対照ＡＤＣ（ＩＣ１－ＭＣＣ－メイタンシノイドＡ、ＤＡＲ ３．６、もしくはＩＣ１－ツブリシン１Ａ－ＬＰ、ＤＡＲ ２）または生理食塩水の単回投与を受けたマウスでは、抗腫瘍効果がほとんどまたは全くなかった。図８Ａおよび図８Ｂも参照されたい。
（表１９）指示されたＡＤＣ処置後のＭＤＡＭＢ３６１異種移植片腫瘍サイズ（ｍｍ３）
Figure 2023515941000153
実施例１５．Ｎ８７異種移植片におけるＣｏｍｐＡｂ１－ＭＣＣ－メイタンシノイドＡと比較したＢｓＡｂ１－ツブリシン１Ａ－ＬＰの有効性
ＨＥＲ２ ＩＨＣ３＋ Ｎ８７異種移植片モデルにおけるＢｓＡｂ１－ツブリシン１Ａ－ＬＰとＣｏｍｐＡｂ１－ＭＣＣ－メイタンシノイドＡの有効性を比較するため、インビボ腫瘍試験を実施した。アッセイには、６週齢のメスＳＣＩＤマウス（ＣＢｙＳｍｎ．ＣＢ１７－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ／Ｊ、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ、番号００１８０３、ｎ＝５０）を使用した。移植には、Ｎ８７（ＡＴＣＣ、ＨＴＢ－５８２２）細胞をマトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ社、カタログ番号３５４２３４）と混合し、３．６×１０６個の細胞を含む１５０ｕＬの細胞とマトリゲルとの懸濁液をＳＣＩＤマウスに注射した。１２日後、指示されたＡＤＣを、腫瘍サイズに基づき無作為化されたＳＣＩＤマウスに、指示用量で皮下注射した。１ｍｇ／ｋｇのＢｓＡｂ１－ツブリシン１Ａ－ＬＰで処置されたコホートに、２５日目および３９日目に２回の追加用量を投与した。各マウスの異種移植片のサイズを、Ｃａｌｉｐｅｒ（Ｒｏｂｏｚ、カタログ番号ＲＳ６４６６）を用いて測定した。
測定された各時点について治療群当たりの平均腫瘍サイズを表２０に示す。３ｍｇ／ｋｇのＢｓＡｂ１－ツブリシン１Ａ－ＬＰ（ＤＡＲ ２．１）の単回用量を受けたマウスでは、Ｎ８７異種移植片サイズが平均サイズ２５ｍｍ３（５７日目）へと著しくかつ持続的に減少した。１０ｍｇ／ｋｇのＣｏｍｐＡｂ１－ＭＣＣ－メイタンシノイド Ａ（ＤＡＲ ３．１）の単回投与を受けたマウスでは、Ｎ８７異種移植片のサイズが、平均サイズ１５ｍｍ３へと著しく減少したが（２９日目）、ＢｓＡｂ１－ツブリシン １Ａ－ＬＰにより処置されたマウスよりも早く（５１日目対８８日目）腫瘍が回避した（すなわち、治療に抵抗性となった）。１ｍｇ／ｋｇのＢｓＡｂ１－ツブリシン１Ａ－ＬＰの３回投与を受けたマウスでは、Ｎ８７異種移植片のサイズが平均サイズ１０９ｍｍ３（３５日目）へと部分的に減少した。これに対し、対照ＡＤＣ（３ｍｇ／ｋｇのＩＣ１－ツブリシン１Ａ－ＬＰ、ＤＡＲ２、または１０ｍｇ／ｋｇのＩＣ１－ＭＣＣ－メイタンシノイドＡ、ＤＡＲ３．６）の単回投与を受けたマウスでは、抗腫瘍効果がなかった。図９も参照されたい。
（表２０）指示されたＡＤＣ処置後のＮ８７異種移植片腫瘍サイズ（ｍｍ３）
Figure 2023515941000154
実施例１６．ＪＩＭＴ１異種移植片における三つのＡＤＣのインビボ比較
ＨＥＲ２ ＩＨＣ２＋ ＪＩＭＴ１異種移植片モデルにおけるＢｓＡｂ１－ツブリシン１Ａ－ＬＰとＣｏｍｐＡｂ１－ＭＣＣ－メイタンシノイドＡ（ＤＡＲ ３．１）およびＣｏｍｐＡｂ１－Ｌ－カンプトテシン（ＤＡＲ ８）の有効性を比較するため、インビボ腫瘍試験を実施した。アッセイには、６週齢のメスＳＣＩＤマウス（ＣＢｙＳｍｎ．ＣＢ１７－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ／Ｊ、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ、番号００１８０３、ｎ＝５０）を使用した。移植には、ＪＩＭＴ１（ＤＳＭＺ、ＡＣＣ５８９）細胞をマトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ社、カタログ番号３５４２３４）と混合し、４×１０６個の細胞を含む細胞とマトリゲルとの懸濁液１５０ｕＬをＳＣＩＤマウスに注射した。１３、２０、および２７日後、指示されたＡＤＣを、腫瘍サイズに基づき無作為化されたＳＣＩＤマウスに、指示用量で皮下注射した。一つのコホートは、１３日目に、３ｍｇ／ｋｇのＢｓＡｂ１－ツブリシン１Ａ－ＬＰの単回投与を受けた。各マウスの異種移植片のサイズを、Ｃａｌｉｐｅｒ（Ｒｏｂｏｚ、カタログ番号ＲＳ６４６６）を用いて測定した。測定された各時点について治療群当たりの平均腫瘍サイズを表２１に示す。
３ｍｇ／ｋｇのＢｓＡｂ１－ツブリシン１Ａ－ＬＰ（ＤＡＲ ２．１）の単回投与を受けたマウスでは、ＪＩＭＴ１異種移植片のサイズが平均サイズ３ｍｍ３（７９日目）へと著しくかつ持続的に減少した。１ｍｇ／ｋｇのＢｓＡｂ１－ツブリシン１Ａ－ＬＰの毎週投与を３回受けたマウスでは、４４日目までにＪＩＭＴ１異種移植片のサイズが平均サイズ１７９ｍｍ３から６３ｍｍ３へと部分的に減少した。これに対して、１０ｍｇ／ｋｇのＣｏｍｐＡｂ１－Ｌ－カンプトテシンの毎週投与を３回受けたマウスでは、腫瘍の進行が減速して４４日目までに平均サイズ３７４ｍｍ３に達したに過ぎなかった。これに対して、１０ｍｇ／ｋｇのＣｏｍｐＡｂ１－ＭＣＣ－メイタンシノイドＡまたは対照ＡＤＣ（３ｍｇ／ｋｇのＩＣ１－ツブリシン１Ａ－ＬＰ、１０ｍｇ／ｋｇのＩＣ１－Ｌ－カンプトテシン、または１０ｍｇ／ｋｇのＩＣ１－ＭＣＣ－メイタンシノイドＡ）の毎週用量を受けたマウスでは、抗腫瘍効果がなかった。図１０Ａおよび図１０Ｂも参照されたい。
（表２１）指示されたＡＤＣ処置後のＪＩＭＴ１異種移植片腫瘍サイズ（ｍｍ３）
Figure 2023515941000155
実施例１７．ＪＩＭＴ１異種移植片におけるＣｏｍｐＡｂ１－ＭＣＣ－メイタンシノイドＡと比較したＨＥＲ２×ＨＥＲ２－Ｍ８３０二重特異性抗体薬剤コンジュゲートの有効性
ＨＥＲ２ ＩＨＣ２＋ ＣＴＧ０８０７におけるＢｓＡｂ１－ツブリシン１Ａ－ＬＰとＣｏｍｐＡｂ１－ＭＣＣ－メイタンシノイドＡ（ＤＡＲ ３．１）の有効性を比較するため、インビボ腫瘍試験を実施した。アッセイには、６～８週齢のメスの無胸腺ヌードＦｏｘ１ｎｕマウス（Ｅｎｖｉｆｏ社、インディアナ州インディアナポリス）を使用した。
試験前の動物：十分な数のストック動物が１．０～１．５ｃｍ３に達した際に、試験前の動物に移植し替えるために腫瘍を採取した。試験前の動物に対し、ストック動物から採取された腫瘍片を左脇腹に一側性に移植した。試験動物：試験前の腫瘍体積を、移植の７～１０日後に開始する各実験について記録した。腫瘍の平均腫瘍体積が１５０～３００ｍｍ３に達した際に、動物を、用量投与に使用する治療群または対照群に腫瘍体積によって、および０日目に用量投与を開始することによって整合させた。腫瘍体積を週２回測定した。
整合させた試験動物に、指示された用量で静脈内に注射した。測定された各時点について治療群当たりの平均腫瘍サイズを表２２に示す。
３ｍｇ／ｋｇのＢｓＡｂ１－ツブリシン１Ａ－ＬＰ（ＤＡＲ ２．１）の毎週用量を３回受けたマウスでは、ＣＴＧ０８０７ ＰＤＸ腫瘍サイズが完全（０ｍｍ３）かつ持続的に減少した。１ｍｇ／ｋｇのＢｓＡｂ１－ツブリシン１Ａ－ＬＰの毎週用量を３回受けたマウスでは、腫瘍増殖が遅延し、腫瘍サイズが３０日間、３００ｍｍ３未満のままであった。１０ｍｇ／ｋｇのＣｏｍｐＡｂ１－ＭＣＣ－メイタンシノイドＡ（ＤＡＲ ３．１）の毎週用量を３回受けたマウスでは、治療中および治療後に成長が続いたが、ＰＢＳまたはＡＤＣ対照（１０ｍｇ／ｋｇのＩＣ１－ＭＣＣ－メイタンシノイドＡまたは３ ｍｇ／ｋｇのＩＣ１－ツブリシン１Ａ－ＬＰ）の３回の毎週用量により処置された腫瘍よりもわずかに遅い速度であった。図１１Ａおよび図１１Ｂも参照されたい。
（表２２）指示されたＡＤＣ処置後のＣＴＧ０８０７ ＰＤＸ腫瘍サイズ（ｍｍ３）
Figure 2023515941000156
Figure 2023515941000157
Figure 2023515941000158
実施例１８．ＪＩＭＴ１異種移植片におけるＣｏｍｐＡｂ１－ＭＣＣ－メイタンシノイドＡと比較したＢｓＡｂ１－ツブリシン１Ａ－ＬＰの有効性
ＨＥＲ２ ＩＨＣ２＋ ＣＴＧ１１８４におけるＢｓＡｂ１－ツブリシン１Ａ－ＬＰとＣｏｍｐＡｂ１－ＭＣＣ－メイタンシノイドＡの有効性を比較するため、インビボ腫瘍試験を実施した。アッセイには、６～８週齢のメスの無胸腺ヌードＦｏｘ１ｎｕマウス（Ｅｎｖｉｆｏ社、インディアナ州インディアナポリス）を使用した。
試験前の動物：十分な数のストック動物が１．０～１．５ｃｍ３に達した際に、試験前の動物に移植し替えるために腫瘍を採取した。試験前の動物に対し、ストック動物から採取された腫瘍片を左脇腹に一側性に移植した。試験動物：試験前の腫瘍体積を、移植の７～１０日後に開始する各実験について記録した。腫瘍の平均腫瘍体積が１５０～３００ｍｍ３に達した際に、動物を、用量投与に使用する治療群または対照群に腫瘍体積によって、および０日目に用量投与を開始することによって整合させた。腫瘍体積を週２回測定した。
整合させた試験動物に、指示された用量で静脈内に注射した。測定された各時点について治療群当たりの平均腫瘍サイズを表２３に示す。
３ｍｇ／ｋｇおよび１ｍｇ／ｋｇのＢｓＡｂ１－ツブリシン１Ａ－ＬＰ（ＤＡＲ ２．１）の毎週用量を３回受けたマウスでは、ＣＴＧ１１８４ ＰＤＸ腫瘍サイズがそれぞれ平均値６（５２日目）および１３ｍｍ３（４５日目）へと著しくかつ持続的に減少した。３ｍｇ／ｋｇのＩＣ１－ツブリシン１Ａ－ＬＰ（対照ＡＤＣ）または１０ｍｇ／ｋｇのＣｏｍｐＡｂ１－ＭＣＣ－メイタンシノイドＡ（ＤＡＲ ３．１）の毎週用量を３回受けたマウスでは、治療中および治療後に成長が続いたが、ＰＢＳまたは１０ｍｇ／ｋｇのＩＣ１－ＭＣＣ－メイタンシノイドＡ（対照ＡＤＣ）の３回の毎週用量により処置された腫瘍よりも遅い速度であった。図１２Ａおよび図１２Ｂも参照されたい。
（表２３）指示されたＡＤＣ処置後のＣＴＧ１１８４ ＰＤＸ腫瘍サイズ。
Figure 2023515941000159
実施例１９．腫瘍細胞株および患者由来の異種移植片におけるＨＥＲ２のレベルを評価するための免疫組織化学（ＩＨＣ）染色。
実施例１７および１で使用されるＰＤＸモデルを、以下の方法に従ってＣＴＧ１１８４に対するＨＥＲ ＩＨＣ ２＋／３＋であることを確認した。組織試料を、暗所内４℃で、１０％中性緩衝ホルマリン中で１２時間固定し、ＰＢＳで３回洗浄し、エタノール勾配系列中で脱水し（７０％、８０％、９０％で１回、および１００％で４回、各３０分）、Ｔｉｓｓｕｅ－Ｔｅｋ（登録商標）を用いてキシレンおよびパラフィン中で処理し（３回、各３０分）、その後、包埋して４μｍの組織切片を生成した。ＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔ（商標）キットに付属のプロトコールを使用してＩＨＣ染色を実施した。ＨＥＲ２ ＩＨＣスコアを、組織切片と対照切片との視覚的な比較によって決定した。
（表２４）細胞株および患者由来の異種移植片のＩＨＣスコア
Figure 2023515941000160
まとめると、本発明者らは、ＨＥＲ２×ＨＥＲ２抗体の効率的な内部移行が、細胞内小胞におけるカテプシンＢ切断可能リンカーのプロセッシングを劇的に増加させたことを観察した。それに従い、ＨＥＲ２×ＨＥＲ２－ツブリシンは、高いＨＥＲ２レベルのものだけでなく中程度のＨＥＲ２レベルを発現する細胞株を、サブナノモルのＩＣ５０で死滅させた。さらに、ＨＥＲ２×ＨＥＲ２－ツブリシンは、多数のＨＥＲ２ ＩＨＣ ３＋および２＋腫瘍異種移植片およびＰＤＸモデルにおいて、完全かつ持続的な腫瘍退縮を誘発した。
実施例２０．Ｎ８７異種移植片におけるＣｏｍｐ ＡＤＣと比較したＢｓＡｂ１－Ｃａｍｐｔ１およびＢｓＡｂ２－Ｃａｍｐｔ２の有効性。
ＨＥＲ２ ＩＨＣ３＋ Ｎ８７異種移植片モデルにおけるＢｓＡｂ１－Ｃａｍｐ１ ＡＤＣおよびＢｓＡｂ２－Ｃａｍｐ１ ＡＤＣと、ＣｏｍｐＡｂ１－ＭＣＣ－メイタンシノイドＡ、ＣＯＭＰＡｂ１－ＧＧＦＧ－Ｄｘｄ、およびＢｓＡｂ２－ツブリシン１Ａ－ＬＰの有効性を比較するために、インビボ腫瘍試験を実施した。アッセイには、６週齢のメスＳＣＩＤマウス（ＣＢｙＳｍｎ．ＣＢ１７－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ／Ｊ、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ、番号００１８０３、ｎ＝５０）を使用した。移植には、Ｎ８７（ＡＴＣＣ、ＨＴＢ－５８２２）細胞をマトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ社、カタログ番号３５４２３４）と混合し、４×１０６個の細胞を含む１５０ｕＬの細胞とマトリゲルとの懸濁液をＳＣＩＤマウスに注射した。７日後、指示されたＡＤＣを、腫瘍サイズに基づき無作為化されたＳＣＩＤマウスに、指示用量で皮下注射した。１ｍｇ／ｋｇのＨ４Ｈ１７０８７Ｄ－ツブリシン１Ａ－ＬＰで処置されたコホートに、１４日目および２１日目に２回の追加用量を投与した。各マウスの異種移植片のサイズを、Ｃａｌｉｐｅｒ（Ｒｏｂｏｚ、カタログ番号ＲＳ６４６６）を用いて測定した。
１０ｍｇ／ｋｇのＢｓＡｂ１－Ｃａｍｐｔ１またはＢｓＡｂ２－Ｃａｍｐ１の単回投与を受けたマウスでは、１１０日までにＮ８７腫瘍が完全に退縮した。抗腫瘍活性は、１０ｍｇ／ｋｇのＣｏｍｐＡｂ１－ＧＧＦＧ－Ｄｘｄおよび３ｍｇ／ｋｇのＢｓＡｂ２－ツブリシン１Ａ－ＬＰの活性と同等であった。１０ｍｇ／ｋｇのＣｏｍｐＡｂ１－ＭＣＣ－メイタンシノイドＡの単回投与を受けたマウスでは、初めにＮ８７異種移植片のサイズが著しく減少したが、５つの腫瘍のうち５つが５０日目までに処置を回避した。１ｍｇ／ｋｇのＢｓＡｂ２－ツブリシン１Ａ－ＬＰの用量を３回受けたマウスでは、同様の平均抗腫瘍応答が観察されたが、５つの腫瘍のうち２つのみが治療を回避した。これに対し、対照ＡＤＣの単回投与を受けたマウスでは、抗腫瘍効果がなかった。図１３Ａおよび図１３Ｂを参照されたい。
実施例２１：Ｅｒｂｂ２．ｍｍＨへのＢｓＡｂ２の結合のエピトープマッピングデータ。
水素－重水素交換質量分析（ＨＤＸ－ＭＳ）を実施して、ＢｓＡｂ２（親Ａｂ１および親Ａｂ２）の結合アームを含む二価の親抗体と相互作用するヒト上皮成長因子受容体２のアミノ酸残基を決定した。この実験では、６ヒスチジンタグを有するＨＥＲ２の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）領域の組換え生産バージョンを使用した（配列番号５４）。ＨＤＸ－ＭＳ法の概要説明は、例えば、Ｅｈｒｉｎｇ（１９９９）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６７（２）：２５２－２５９；およびＥｎｇｅｎ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ（２００１）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７３：２５６Ａ－２６５Ａに記載されている。
ＨＤＸ－ＭＳ実験を、カスタマイズされたプラットフォーム上で実施し、このプラットフォームは、重水素の標識およびクエンチのためのカスタムのＨＤＸ自動化システムと、試料の消化および捕捉のためのＷａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ Ｂｉｎａｒｙ Ｓｏｌｖｅｎｔ Ｍａｎａｇｅｒと、分析用勾配のための別のＷａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ Ｂｉｎａｒｙ Ｓｏｌｖｅｎｔ Ｍａｎａｇｅｒと、ペプチドの同定および質量測定のためのＴｈｅｒｍｏ Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＨＦ質量分析計とからなるものであった。
Ｄ２Ｏ標識溶液を、Ｄ２Ｏベースの緩衝液（５０ｍＭリン酸、１００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＤ ７．０）中で調製した。重水素標識のために、０．９３ｍｇ／ｍＬのＨｅｒ２タンパク質またはどちらかの二価の親と予め混合されたＨｅｒ２タンパク質（抗原と抗体とのモル比１：０．７）１０μＬを、９０μＬのＤ２Ｏ標識溶液と共に２０℃で、様々な時点（非重水素化対照は０分、重水素標識は１５秒、６０秒、６００秒、３６００秒、および６０００秒）について二連でインキュベートした。１００μＬの４Ｍ塩酸グアニジン、０．８５ＭのＴＣＥＰ緩衝液（ＨＣｌによりｐＨ２．３に酸性化）を各試料に加えて、１５℃で１８０秒間インキュベートすることによって、重水素化反応をクエンチした。次いで、クエンチされた試料をＬＣシステムに注入し、１５℃でオンラインペプシン消化に供した。消化されたペプチドを、２～３２％の溶媒Ｂの１２．５分の勾配により、－６℃でＣ８カラム（１ｍｍ×５０ｍｍ、Ｎｏｖａｂｉｏａｓｓａｙｓ社）によって捕捉した（移動相Ａ：水中０．２％ギ酸、移動相Ｂ：アセトニトリル中０．２％ギ酸）。溶出されたペプチドを、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳまたはＬＣ－ＭＳモードで、Ｔｈｅｒｍｏ Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＨＦ質量分析計により分析した。
非重水素化Ｈｅｒ２試料のＬＣ－ＭＳ／ＭＳデータを、Ｈｅｒ２タンパク質のアミノ酸配列とそのリバース配列とを含むデータベースに対して、Ｂｙｏｎｉｃ検索エンジン（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｒｉｃｓ社）を使用して検索に供した。検索パラメータを、共通可変修飾として非特異的酵素消化とヒトグリコシル化とを使用したデフォルトとして設定した。次いで、同定されたペプチドのリストを、ＨＤＸ ＷｏｒｋＢｅｎｃｈソフトウェア（バージョン３．３）にインポートして、すべての重水素化試料について重水素の取込み（Ｄ－取込み）および重水素の取込みのパーセンテージ（％Ｄ）を計算した。ペプチドの残基番号は、タグを含む実際のタンパク質配列（Ｎ末端残基Ｔは最初のアミノ酸）に由来する。
Figure 2023515941000161
Ｈｅｒ２由来の計３５１個のペプチドが、Ｈｅｒ２単独と、親Ａｂ１試料を含む複合体のＨｅｒ２との両方から同定され、Ｈｅｒ２の１００％配列カバレッジを表していた。重水素取込みのパーセンテージにおいて５％超の減少を呈した任意のペプチドを、有意に保護されたものとして定義した（Δ％Ｄ＜－５％）。Ｈｅｒ２ ＥＣＤは、親Ａｂ１により標的とされるヒトＨｅｒ２ ＥＣＤ上のエピトープとして割り当てられたアミノ酸１４１～１４５であるＹＱＤＴＩ配列（配列番号５５）およびアミノ酸１６６～１８２であるＲＳＲＡＣＨＰＣＳＰＭＣＫＧＳＲＣ配列（配列番号５６）でｍＡｂ親Ａｂ１に結合すると、重水素取り込みの著しい減少を示した。エピトープ領域Ｉ（アミノ酸１４１～１４５、ＹＱＤＴＩ、配列番号５５）およびＩＩ（アミノ酸１６６～１８２、ＲＳＲＡＣＨＰＣＳＰＭＣＫＧＳＲＣ、配列番号５６）をカバーするペプチドの重水素取込みデータを図１４に示す。
Ｈｅｒ２由来の計３６６個のペプチドが、Ｈｅｒ２単独と、親Ａｂ２試料を含む複合体のＨｅｒ２との両方から同定され、Ｈｅｒ２の１００％配列カバレッジを表していた。重水素取込みのパーセンテージにおいて５％超の減少を呈した任意のペプチドを、有意に保護されたものとして定義した（Δ％Ｄ＜－５％）。Ｈｅｒ２ ＥＣＤは、アミノ酸９～２３であるＭＫＬＲＬＰＡＳＰＥＴＨＬＤＭ配列（配列番号５７）、アミノ酸４１～５１であるＴＹＬＰＴＮＡＳＬＳＦ配列（配列番号５８）、アミノ酸６４～７７であるＩＡＨＮＱＶＲＱＶＰＬＱＲＬ（配列番号５９）で親Ａｂ２に結合すると、重水素取込みの著しい減少を示した。さらに、アミノ酸３５３～３５９であるＡＦＬＰＥＳＦ配列（配列番号６０）で重水素取込みの著しい減少があり、これはアロステリック効果に起因した可能性がある。エピトープ領域Ｉ（アミノ酸９～２３、ＭＫＬＲＬＰＡＳＰＥＴＨＬＤＭ、配列番号５７）、ＩＩ（アミノ酸４１～５１、ＴＹＬＰＴＮＡＳＬＳＦ、配列番号５８およびＩＩＩ（アミノ酸６４～７７、ＩＡＨＮＱＶＲＱＶＰＬＱＲＬ、配列番号５９）、および辺縁エピトープ領域ＩＶ（アミノ酸３５３～３５９、ＡＦＬＰＥＳＦ、配列番号６０）をカバーするペプチドの重水素取込みデータを図１５に示す。
実施例２２．Ｅｒｂｂ２．ｍｍＨへのＢｓＡｂ１の結合のエピトープマッピングデータ。
水素－重水素交換質量分析（ＨＤＸ－ＭＳ）を実施して、ＢｓＡｂ１（親Ａｂ３および親Ａｂ４）の結合アームを含む二価の親抗体と相互作用するＨＥＲ２のアミノ酸残基を決定した。実施例２１に記載されるものと同じ組換えＨＥＲ２タンパク質を使用した（配列番号５４）。
ＨＤＸ－ＭＳ実験を、カスタマイズされたプラットフォーム上で実施し、このプラットフォームは、重水素の標識およびクエンチのためのカスタムのＨＤＸ自動化システムと、試料の消化および捕捉のためのＷａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ Ｂｉｎａｒｙ Ｓｏｌｖｅｎｔ Ｍａｎａｇｅｒと、分析用勾配のための別のＷａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ Ｂｉｎａｒｙ Ｓｏｌｖｅｎｔ Ｍａｎａｇｅｒと、ペプチドの同定および質量測定のためのＴｈｅｒｍｏ Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＨＦ質量分析計とからなるものであった。
Ｄ２Ｏ標識溶液を、Ｄ２Ｏベースの緩衝液（５０ｍＭリン酸、１００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＤ ７．０）中で調製した。重水素標識のために、０．９３ｍｇ／ｍＬのＨｅｒ２タンパク質または親Ａｂ３と親Ａｂ４のどちらかと予め混合されたＨｅｒ２タンパク質（抗原と抗体とのモル比１：０．７）１０μＬを、９０μＬのＤ２Ｏ標識溶液と共に２０℃で、様々な時点（非重水素化対照は０分、重水素標識は１５秒、６０秒、６００秒、および３６００秒）について二連でインキュベートした。１００μＬの４Ｍ塩酸グアニジン、０．８５ＭのＴＣＥＰ緩衝液（ＨＣｌによりｐＨ２．３に酸性化）を各試料に加えて、１５℃で１８０秒間インキュベートすることによって、重水素化反応をクエンチした。次いで、クエンチされた試料をＬＣシステムに注入し、１５℃でオンラインペプシン消化に供した。消化されたペプチドを、２～３２％の溶媒Ｂの１２．５分の勾配により、－６℃でＣ８カラム（１ｍｍ×５０ｍｍ、Ｎｏｖａｂｉｏａｓｓａｙｓ社）によって捕捉した（移動相Ａ：水中０．２％ギ酸、移動相Ｂ：アセトニトリル中０．２％ギ酸）。溶出されたペプチドを、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳまたはＬＣ－ＭＳモードで、Ｔｈｅｒｍｏ Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＨＦ質量分析計により分析した。
非重水素化Ｈｅｒ２試料のＬＣ－ＭＳ／ＭＳデータを、Ｈｅｒ２タンパク質のアミノ酸配列とそのリバース配列とを含むデータベースに対して、Ｂｙｏｎｉｃ検索エンジン（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｒｉｃｓ社）を使用して検索に供した。検索パラメータを、共通可変修飾として非特異的酵素消化とヒトグリコシル化とを使用したデフォルトとして設定した。次いで、同定されたペプチドのリストを、ＨＤＸ ＷｏｒｋＢｅｎｃｈソフトウェア（バージョン３．３）にインポートして、すべての重水素化試料について重水素の取込み（Ｄ－取込み）および重水素の取込みのパーセンテージ（％Ｄ）を計算した。ペプチドの残基番号は、タグを含む実際のタンパク質配列（Ｎ末端残基Ｔは最初のアミノ酸）に由来する。
Figure 2023515941000162
Ｈｅｒ２由来の計３８６個のペプチドが、Ｈｅｒ２単独と、親Ａｂ３試料を含む複合体のＨｅｒ２との両方から同定され、Ｈｅｒ２の９９．８％配列カバレッジを表していた。重水素取込みのパーセンテージにおいて５％超の減少を呈した任意のペプチドを、有意に保護されたものとして定義した（Δ％Ｄ＜－５％）。Ｈｅｒ２ ＥＣＤは、親Ａｂ３により標的とされるヒトＨｅｒ２ ＥＣＤ上のエピトープとして割り当てられたアミノ酸１３３～１４８であるＩＱＲＮＰＱＬＣＹＱＤＴＩＬＷＫ配列（配列番号６１）およびアミノ酸１７４～１８２であるＳＰＭＣＫＧＳＲＣ配列（配列番号６２）で親Ａｂ３に結合すると、重水素取り込みの著しい減少を示した。さらに、ヒトＨｅｒ２ ＥＣＤは、アミノ酸１９４～２００であるＴＲＴＶＣＡＧ配列（配列番号６３）で親Ａｂ３に結合すると、重水素取り込みの中程度の減少を示した。エピトープ領域Ｉ（アミノ酸１３３～１４８、ＩＱＲＮＰＱＬＣＹＱＤＴＩＬＷＫ、配列番号６１）およびＩＩ（アミノ酸１７４～１８２、ＳＰＭＣＫＧＳＲＣ、配列番号６２）、ならびに辺縁エピトープ領域ＩＩＩ（アミノ酸１９４～２００、ＴＲＴＶＣＡＧ、配列番号６３）をカバーするペプチドの重水素取込みデータを図１６に示す。
Ｈｅｒ２由来の計３８５個のペプチドが、Ｈｅｒ２単独と、親Ａｂ４試料を含む複合体のＨｅｒ２との両方から同定され、Ｈｅｒ２の９９．７％配列カバレッジを表していた。重水素取込みのパーセンテージにおいて５％超の減少を呈した任意のペプチドを、有意に保護されたものとして定義した（Δ％Ｄ＜－５％）。Ｈｅｒ２ ＥＣＤは、親Ａｂ４により標的とされるヒトＨｅｒ２ ＥＣＤ上の主要エピトープとして割り当てられたアミノ酸１５２～１６１であるＨＫＮＮＱＬＡＬＴＬ配列（配列番号６４）で、親Ａｂ４に結合すると、重水素取り込みの著しい減少を示した。さらに、ヒトＨｅｒ２ ＥＣＤは、アミノ酸１９４～２００であるＴＲＴＶＣＡＧ配列（配列番号６３）およびアミノ酸２５８～２７３であるＥＳＭＰＮＰＥＧＲＹＴＦＧＡＳＣ配列（配列番号６５）で親Ａｂ４に結合すると、重水素取り込みの中程度の減少を示した。重水素減少の検出されたエピトープ領域Ｉ（アミノ酸１５２～１６１、ＨＫＮＮＱＬＡＬＴＬ、配列番号６４）、周縁エピトープ領域ＩＩ（アミノ酸１９４～２００、ＴＲＴＶＣＡＧ、配列番号６３）、ならびに領域ＩＩＩ（アミノ酸２５８～２７３、ＥＳＭＰＮＰＥＧＲＹＴＦＧＡＳＣ、配列番号６５）をカバーするペプチドの重水素取込みデータを図１７に示す。
本発明は、本明細書に記載の特定の実施形態による範囲に限定されるものではない。実際に、本発明の種々の改変は、本明細書に記載されるものに加えて、上記の記述および付随する図から、当業者に明らかとなるであろう。そのような変更は、添付される特許請求の範囲内にあることが意図される。

Claims (90)

  1. 第一の抗原結合ドメイン（Ｄ１）と、
    第二の抗原結合ドメイン（Ｄ２）と
    を含み、
    Ｄ１がヒトＨＥＲ２の第一のエピトープに特異的に結合し、
    Ｄ２がヒトＨＥＲ２の第二のエピトープに特異的に結合する、
    二重特異性抗原結合分子。
  2. Ｄ１とＤ２が、ヒトＨＥＲ２への結合について互いに競合しない、請求項１に記載の二重特異性抗原結合分子。
  3. 以下の特徴：
    （ａ）表面プラズモン共鳴アッセイで測定した際に、約１ｎＭ未満の解離半減期でＥｒｂＢ２に結合すること；
    （ｂ）表面プラズモン共鳴アッセイで測定した際に、少なくとも約３０分のｔ１／２でＥｒｂＢ２に結合すること；
    （ｃ）トラスツズマブと比較した際に、より大きな親和性および／またはアビディティで細胞表面ＨＥＲ２に結合すること；
    （ｄ）トラスツズマブよりも高い効率でＨＥＲ２ ＩＨＣ２＋およびＩＨＣ３＋発現細胞に結合すること；
    （ｅ）トラスツズマブよりも大きなＩＣ５０でＨＥＲ２ ＩＨＣ１＋発現細胞に結合すること；
    （ｆ）中程度または高いＨＥＲ２レベルを発現する細胞に結合するが、低いＨＥＲ２レベルを発現する細胞には結合しないこと；
    （ｇ）ＨＥＲ２発現細胞の表面上に抗体クラスターを形成すること；ならびに
    （ｈ）トラスツズマブよりも高い効率でＨＥＲ２発現細胞によって内部移行されること
    のうちの一つまたは複数を有する、請求項１または２に記載の二重特異性抗原結合分子。
  4. Ｄ１が、配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）内の三つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３）、ならびに配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）内の三つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３）を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
  5. ＨＣＤＲ１が、配列番号４のアミノ酸配列またはそれと少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ２が、配列番号６のアミノ酸配列またはそれと少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ３が、配列番号８のアミノ酸配列またはそれと少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ１が、配列番号２０のアミノ酸配列またはそれと少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ２が、配列番号２２のアミノ酸配列またはそれと少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含み、かつＬＣＤＲ３が、配列番号２４のアミノ酸配列またはそれと少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の二重特異性抗原結合分子。
  6. ＨＣＤＲ１が、配列番号４のアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ２が、配列番号６のアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ３が、配列番号８のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ１が、配列番号２０のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ２が、配列番号２２のアミノ酸配列を含み、かつＬＣＤＲ３が、配列番号２４のアミノ酸配列を含む、請求項５に記載の二重特異性抗原結合分子。
  7. 配列番号２のアミノ酸配列またはそれと少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲと、配列番号１８のアミノ酸配列またはそれと少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲとを含む、請求項５に記載の二重特異性抗原結合分子。
  8. 配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲと、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲとを含む、請求項７に記載の二重特異性抗原結合分子。
  9. Ｄ２が、配列番号１０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）内の三つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３）、ならびに配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）内の三つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３）を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
  10. ＨＣＤＲ１が、配列番号１２のアミノ酸配列またはそれと少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ２が、配列番号１４のアミノ酸配列またはそれと少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ３が、配列番号１６のアミノ酸配列またはそれと少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ１が、配列番号２０のアミノ酸配列またはそれと少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ２が、配列番号２２のアミノ酸配列またはそれと少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含み、かつＬＣＤＲ３が、配列番号２４のアミノ酸配列またはそれと少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項９に記載の二重特異性抗原結合分子。
  11. ＨＣＤＲ１が、配列番号１２のアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ２が、配列番号１４のアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ３が、配列番号１６のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ１が、配列番号２０のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ２が、配列番号２２のアミノ酸配列を含み、かつＬＣＤＲ３が、配列番号２４のアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の二重特異性抗原結合分子。
  12. 配列番号１０のアミノ酸配列またはそれと少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲと、配列番号１８のアミノ酸配列またはそれと少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲとを含む、請求項１０に記載の二重特異性抗原結合分子。
  13. 配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲと、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲとを含む、請求項１２に記載の二重特異性抗原結合分子。
  14. Ｄ１が、配列番号３２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）内の三つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３）、ならびに配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）内の三つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３）を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
  15. ＨＣＤＲ１が、配列番号３４のアミノ酸配列またはそれと少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ２が、配列番号３６のアミノ酸配列またはそれと少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ３が、配列番号３８のアミノ酸配列またはそれと少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ１が、配列番号２０のアミノ酸配列またはそれと少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ２が、配列番号２２のアミノ酸配列またはそれと少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含み、かつＬＣＤＲ３が、配列番号２４のアミノ酸配列またはそれと少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載の二重特異性抗原結合分子。
  16. ＨＣＤＲ１が、配列番号３４のアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ２が、配列番号３６のアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ３が、配列番号３８のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ１が、配列番号２０のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ２が、配列番号２２のアミノ酸配列を含み、かつＬＣＤＲ３が、配列番号２４のアミノ酸配列を含む、請求項１５に記載の二重特異性抗原結合分子。
  17. 配列番号３２のアミノ酸配列またはそれと少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲと、配列番号１８のアミノ酸配列またはそれと少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲとを含む、請求項１５に記載の二重特異性抗原結合分子。
  18. 配列番号３２のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲと、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲとを含む、請求項１７に記載の二重特異性抗原結合分子。
  19. Ｄ２が、配列番号４０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）内の三つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３）、ならびに配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）内の三つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３）を含む、請求項１４～１８のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
  20. ＨＣＤＲ１が、配列番号４２のアミノ酸配列またはそれと少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ２が、配列番号４４のアミノ酸配列またはそれと少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ３が、配列番号４６のアミノ酸配列またはそれと少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ１が、配列番号２０のアミノ酸配列またはそれと少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ２が、配列番号２２のアミノ酸配列またはそれと少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含み、かつＬＣＤＲ３が、配列番号２４のアミノ酸配列またはそれと少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１９に記載の二重特異性抗原結合分子。
  21. ＨＣＤＲ１が、配列番号４２のアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ２が、配列番号４４のアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ３が、配列番号４６のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ１が、配列番号２０のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ２が、配列番号２２のアミノ酸配列を含み、かつＬＣＤＲ３が、配列番号２４のアミノ酸配列を含む、請求項２０に記載の二重特異性抗原結合分子。
  22. 配列番号４０のアミノ酸配列またはそれと少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲと、配列番号１８のアミノ酸配列またはそれと少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲとを含む、請求項２０に記載の二重特異性抗原結合分子。
  23. 配列番号４０のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲと、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲとを含む、請求項２２に記載の二重特異性抗原結合分子。
  24. 細胞毒にコンジュゲートされている、請求項１に記載の二重特異性抗原結合分子。
  25. 以下の特徴：
    （ａ）細胞毒にコンジュゲートされたトラスツズマブと比較して、より低い投与量でより大きな殺腫瘍性を示すこと；
    （ｂ）ＤＭ１にコンジュゲートされたトラスツズマブと比較して、より低い投与量でより大きな殺腫瘍性を示すこと；
    （ｃ）細胞毒にコンジュゲートされたＭｅｄｉ－ｘと比較して、より低い投与量でより大きな殺腫瘍性を示すこと；
    （ｄ）ツブリシン－ｘにコンジュゲートされたＭｅｄｉ－ｘと比較して、より低い投与量でより大きな殺腫瘍性を示すこと；
    （ｅ）中程度および高いＨＥＲ２発現のがんの成長を阻害するが、低いＨＥＲ２発現の組織の成長を阻害しないこと；および
    （ｆ）中程度および高いＨＥＲ２発現のがんの腫瘍退縮を促進するが、低いＨＥＲ２発現の組織の腫瘍退縮を促進しないこと
    のうちの一つまたは複数を有する、請求項２４に記載の二重特異性抗原結合分子。
  26. 前記細胞毒が、生物毒素、化学療法剤、および放射性同位体からなる群から選択される、請求項２５に記載の二重特異性抗原結合分子。
  27. 前記細胞毒が、ツブリシンまたはメイタンシノイドである、請求項２５に記載の二重特異性抗原結合分子。
  28. リンカーを介して細胞毒にコンジュゲートされている、請求項１に記載の二重特異性抗原結合分子。
  29. 前記細胞毒がツブリシンである、請求項２８に記載の二重特異性抗原結合分子。
  30. 前記ツブリシンが、
    Figure 2023515941000163
    である、請求項２９に記載の二重特異性抗原結合分子。
  31. 前記二重特異性抗原結合分子が、
    Figure 2023515941000164
    またはその位置異性体にコンジュゲートされており、式中、
    Figure 2023515941000165
    は重鎖グルタミンとの結合である、請求項２８に記載の二重特異性抗原結合分子。
  32. Ｑ２９５を介してツブリシンにコンジュゲートされている、請求項２９に記載の二重特異性抗原結合分子。
  33. Ｑ２９７を介してツブリシンにコンジュゲートされている、請求項２９に記載の二重特異性抗原結合分子。
  34. 前記リンカーがアジド－ＰＥＧ３－アミンである、請求項２９に記載の二重特異性抗原結合分子。
  35. 配列番号２のＤ１－ＨＣＶＲアミノ酸配列内のＣＤＲ、および配列番号１０のＤ２－ＨＣＶＲアミノ酸配列内のＣＤＲを含む、請求項３０に記載の二重特異性抗原結合分子。
  36. 配列番号３２のＤ１－ＨＣＶＲアミノ酸配列内のＣＤＲ、および配列番号４０のＤ２－ＨＣＶＲアミノ酸配列内のＣＤＲを含む、請求項３０に記載の二重特異性抗原結合分子。
  37. 前記細胞傷害剤がメイタンシノイドである、請求項２８に記載の二重特異性抗原結合分子。
  38. 配列番号２のＤ１－ＨＣＶＲアミノ酸配列内のＣＤＲ、および配列番号１０のＤ２－ＨＣＶＲアミノ酸配列内のＣＤＲを含む、請求項３７に記載の二重特異性抗原結合分子。
  39. 配列番号３２のＤ１－ＨＣＶＲアミノ酸配列内のＣＤＲ、および配列番号４０のＤ２－ＨＣＶＲアミノ酸配列内のＣＤＲを含む、請求項３８に記載の二重特異性抗原結合分子。
  40. 前記メイタンシノイドが、
    Figure 2023515941000166
    であり、式中、
    Figure 2023515941000167
    は、前記リンカーとの結合である、請求項３７に記載の二重特異性抗原結合分子。
  41. 前記リンカーが、
    Figure 2023515941000168
    であり、式中、
    Figure 2023515941000169
    で記される結合は、前記二重特異性抗原結合分子との結合を表し、
    Figure 2023515941000170
    で記される結合は、前記メイタンシノイドとの結合を表す、請求項４０に記載の二重特異性抗原結合分子。
  42. 前記メイタンシノイドが、
    Figure 2023515941000171
    であり、式中、
    Figure 2023515941000172
    は、前記リンカーとの結合である、請求項３７に記載の二重特異性抗原結合分子。
  43. 前記リンカーが、
    Figure 2023515941000173
    であり、式中、
    Figure 2023515941000174
    で記される結合は、前記二重特異性抗原結合分子との結合を表し、
    Figure 2023515941000175
    で記される結合は、前記メイタンシノイドとの結合を表す、請求項４２に記載の二重特異性抗原結合分子。
  44. 請求項１に記載の二重特異性抗原結合分子と、医薬的に許容可能な担体とを含む、医薬組成物。
  45. ＨＥＲ２を過剰発現する腫瘍を患う対象においてがんを治療する方法であって、請求項２４～４３のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子を前記対象に投与することを含む、方法。
  46. 前記がんが、乳がん、肺がん、胃がん、子宮頸がん、胃がん、子宮内膜がん、および卵巣がんからなる群から選択される、請求項３６に記載の方法。
  47. 前記対象に第二の抗がん治療剤を投与することをさらに含む、請求項４５に記載の方法。
  48. 対象においてがんを治療し、腫瘍の成長を低減し、および／または腫瘍退縮を引き起こす方法であって、
    二重特異性抗原結合分子と細胞毒とを含む抗体－薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）を、それを必要とする対象に投与することを含み、
    前記二重特異性抗原結合分子が、
    第一の抗原結合ドメイン（Ｄ１）と、
    第二の抗原結合ドメイン（Ｄ２）と
    を含み、
    Ｄ１がヒトＨＥＲ２の第一のエピトープに特異的に結合し、かつ
    Ｄ２がヒトＨＥＲ２の第二のエピトープに特異的に結合する、
    方法。
  49. Ｄ１が、配列番号２または３２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）内の三つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３）、ならびに配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）内の三つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３）を含む、請求項４８に記載の方法。
  50. Ｄ２が、配列番号１０または４０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）内の三つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３）、ならびに配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）内の三つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３）を含む、請求項４８に記載の方法。
  51. 前記二重特異性抗原結合分子が、配列番号２のＤ１－ＨＣＶＲアミノ酸配列内のＣＤＲ、および配列番号１０のＤ２－ＨＣＶＲアミノ酸配列内のＣＤＲを含む、請求項４８に記載の方法。
  52. 前記二重特異性抗原結合分子が、配列番号３２のＤ１－ＨＣＶＲアミノ酸配列内のＣＤＲ、および配列番号４０のＤ２－ＨＣＶＲアミノ酸配列内のＣＤＲを含む、請求項４８に記載の方法。
  53. 前記細胞毒が、生物毒素、化学療法剤、および放射性同位体からなる群から選択される、請求項４８～５２のいずれか一項に記載の方法。
  54. 前記細胞毒が、ツブリシンまたはメイタンシノイドである、請求項４８～５２のいずれか一項に記載の方法。
  55. 前記細胞毒がツブリシンであり、前記ツブリシンが、
    Figure 2023515941000176
    である、請求項４８～５２のいずれか一項に記載の方法。
  56. 前記二重特異性抗原結合分子が、
    Figure 2023515941000177
    またはその位置異性体にコンジュゲートされており、式中、
    Figure 2023515941000178
    は重鎖グルタミンとの結合である、請求項５５に記載の方法。
  57. 前記細胞毒が、リンカーを介して前記二重特異性抗原結合分子にコンジュゲートされ、前記リンカーがアジド－ＰＥＧ３－アミンである、請求項５４～５６のいずれか一項に記載の方法。
  58. 前記細胞毒が、リンカーを介して前記二重特異性抗原結合分子にコンジュゲートされ、前記細胞毒が、
    Figure 2023515941000179
    であり、式中、
    Figure 2023515941000180
    は、リンカーとの結合である、請求項４８に記載の方法。
  59. 前記リンカーが、
    Figure 2023515941000181
    であり、式中、
    Figure 2023515941000182
    で記される結合は、前記二重特異性抗原結合分子との結合を表し、
    Figure 2023515941000183
    で記される結合は、前記細胞毒との結合を表す、請求項５８に記載の方法。
  60. 前記細胞毒が、リンカーを介して前記二重特異性抗原結合分子にコンジュゲートされ、前記細胞毒が、
    Figure 2023515941000184
    であり、式中、
    Figure 2023515941000185
    は、前記リンカーとの結合である、請求項４８に記載の方法。
  61. 前記リンカーが、
    Figure 2023515941000186
    であり、式中、
    Figure 2023515941000187
    で記される結合は、前記二重特異性抗原結合分子との結合を表し、
    Figure 2023515941000188
    で記される結合は、前記細胞毒との結合を表す、請求項６０に記載の方法。
  62. 抗ＨＥＲ２抗体またはＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗原結合タンパク質を、以下の式Ａ１：
    Figure 2023515941000189
    を有する化合物、および水性希釈剤と接触させることを含む、抗体－薬剤コンジュゲートを調製するための方法。
  63. 前記ＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗原結合タンパク質が、配列番号２のＤ１－ＨＣＶＲアミノ酸配列内のＣＤＲ、および配列番号１０のＤ２－ＨＣＶＲアミノ酸配列内のＣＤＲを含む、請求項６２に記載の方法。
  64. 前記ＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗原結合タンパク質が、配列番号３２のＤ１－ＨＣＶＲアミノ酸配列内のＣＤＲ、および配列番号４０のＤ２－ＨＣＶＲアミノ酸配列内のＣＤＲを含む、請求項６２に記載の方法。
  65. 前記ＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗原結合タンパク質が、配列番号１８のＬＣＶＲアミノ酸配列内のＣＤＲを含む、請求項６３または６４に記載の方法。
  66. 前記式Ａ１の化合物が、化学量論的に過剰に存在する、請求項６２に記載の方法。
  67. 前記式Ａ１の化合物が、式Ａ２もしくはＡ３の化合物：
    Figure 2023515941000190
    またはそれらの混合物を含む、請求項６２に記載の方法。
  68. 前記式Ａ２の化合物が、立体異性体的に純粋である、請求項６２に記載の方法。
  69. 前記式Ａ３の化合物が、立体異性体的に純粋である、請求項６２に記載の方法。
  70. 前記Ａ１またはＡ２の化合物が、５０％超、７０％超、９０％超、または９５％超のジアステレオマー過剰で存在する、請求項６２に記載の方法。
  71. 前記式Ａ１の化合物が、式（ａ）の化合物：
    Figure 2023515941000191
    を、式（ｂ）の化合物：
    Figure 2023515941000192
    と、シリカゲルおよび希釈剤の存在下で接触させることにより調製される、請求項６２に記載の方法。
  72. 以下のプロセス：
    （ｉ）式（ａ）の化合物：
    Figure 2023515941000193
    を、式（ｂ）の化合物：
    Figure 2023515941000194
    と、シリカゲルおよび希釈剤の存在下で接触させて、中間体を合成すること、および
    （ｉｉ）ＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗原結合タンパク質を、前記中間体、および水性希釈剤と接触させること
    によって調製される、抗体－薬剤コンジュゲート。
  73. 抗ＨＥＲ２抗体またはＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗原結合タンパク質を、以下の構造：
    Figure 2023515941000195
    を有する化合物と接触させることを含む、抗体－薬剤コンジュゲートを調製するためのプロセスであって、
    前記ＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗原結合タンパク質が、アジド基により官能化される、プロセス。
  74. アジド基により官能化された前記ＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗原結合タンパク質が、ＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗原結合タンパク質を、トランスグルタミナーゼと、一級アミン、ＰＥＧ基、およびアジド基を含む化合物とに接触させることによって調製される、請求項７３に記載のプロセス。
  75. 一級アミン、ＰＥＧ基、およびアジド基を含む前記化合物が、
    Figure 2023515941000196
    である、請求項７４に記載のプロセス。
  76. 請求項７３～７５のいずれか一項に記載のプロセスの生成物。
  77. 前記細胞傷害剤がカンプトテシンである、請求項２８に記載の二重特異性抗原結合分子。
  78. 前記カンプトテシンが、
    Figure 2023515941000197
    である、請求項７７に記載の二重特異性抗原結合分子。
  79. 前記二重特異性抗原結合分子が、
    Figure 2023515941000198
    その位置異性体とコンジュゲートされており、
    Figure 2023515941000199
    は重鎖グルタミンとの結合である、請求項２８に記載の二重特異性抗原結合分子。
  80. 前記二重特異性抗原結合分子が、
    Figure 2023515941000200
    にコンジュゲートされており、式中、
    Figure 2023515941000201
    は、リンカーとの結合である、請求項２８に記載の二重特異性抗原結合分子。
  81. 抗ＨＥＲ２抗体またはＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗原結合タンパク質を、以下の構造：
    Figure 2023515941000202
    を有する化合物と接触させることを含む、抗体－薬剤コンジュゲートを調製するためのプロセスであって、
    前記ＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗原結合タンパク質が、アジド基により官能化される、プロセス。
  82. アジド基により官能化された前記ＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗原結合タンパク質が、ＨＥＲ２×ＨＥＲ２二重特異性抗原結合タンパク質を、トランスグルタミナーゼと、一級アミン、ＰＥＧ基、およびアジド基を含む化合物とに接触させることによって調製される、請求項８１に記載のプロセス。
  83. 一級アミン、ＰＥＧ基、およびアジド基を含む前記化合物が、
    Figure 2023515941000203
    である、請求項８２に記載のプロセス。
  84. 請求項８１～８３のいずれか一項に記載のプロセスの生成物。
  85. ヒトＨＥＲ２の前記第一のエピトープが、配列番号５４のアミノ酸１４１～１４５および／または１６６～１８２を含む、請求項１に記載の二重特異性抗原結合分子。
  86. ヒトＨＥＲ２の前記第二のエピトープが、配列番号５４のアミノ酸９～２３、４１～５１、６４～６７、および／または３５３～３５９を含む、請求項８５に記載の二重特異性抗原結合分子。
  87. ヒトＨＥＲ２の前記第一のエピトープが、配列番号５４のアミノ酸１４１～１４５および／または１６６～１８２を含み、ヒトＨＥＲ２の前記第二のエピトープが、配列番号５４のアミノ酸９～２３、４１～５１、６４～６７、および／または３５３～３５９を含む、請求項８５に記載の二重特異性抗原結合分子。
  88. ヒトＨＥＲ２の前記第一のエピトープが、配列番号５４のアミノ酸１３３～１４８、１７４～１８２、および／または１９４～２００を含む、請求項１に記載の二重特異性抗原結合分子。
  89. ヒトＨＥＲ２の前記第二のエピトープが、配列番号５４のアミノ酸１５２～１６１、２５８～２７３、および／または１９４～２００を含む、請求項８８に記載の二重特異性抗原結合分子。
  90. ヒトＨＥＲ２の前記第一のエピトープが、配列番号５４のアミノ酸１３３～１４８、１７４～１８２、および／または１９４～２００を含み、ヒトＨＥＲ２の前記第二のエピトープが、配列番号５４のアミノ酸１５２～１６１、２５８～２７３、および／または１９４～２００を含む、請求項８８に記載の二重特異性抗原結合分子。
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