CN115175737A - 结合her2的双特异性抗原结合分子及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本文提供了结合HER2的双特异性抗原结合分子及其使用方法。所述双特异性抗原结合分子包含第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域，其中所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域结合至人HER2的胞外结构域的两个不同的(优选地非重叠的)表位。所述双特异性抗原结合分子在HER2IHC2+和IHC3+细胞的表面上成簇，并且内化至细胞溶酶体中。还包括抗体‑药物缀合物(ADC)，所述抗体‑药物缀合物包含连接至细胞毒性剂、放射性核素或其他部分的本文提供的抗体或双特异性抗原结合分子，以及治疗受试者的癌症的方法，所述方法通过将双特异性抗原结合分子或其ADC施用于所述受试者来进行。

Description

结合HER2的双特异性抗原结合分子及其使用方法
技术领域
本发明涉及双特异性抗体及其抗原结合片段，以及此类抗体的抗体-药物缀合物，以及它们的使用方法，所述双特异性抗体及其抗原结合片段特异性结合人表皮生长因子受体2(HER2)并且调节HER2信号转导。
序列表
序列表的正式副本以ASCII格式的序列表与说明书同时通过EFS-Web以电子方式提交，文件名为10719WO01_Sequence_Listing_ST25.TXT，创建日期为2021年2月26日，大小为约64千字节。包含在该ASCII格式文档中的序列表是说明书的一部分，并通过引用整体并入本文。
背景技术
人表皮生长因子受体2(HER2)是一种酪氨酸激酶受体，由定位于人第17号染色体(17q12)长臂的ERBB2基因编码。该蛋白质涉及导致细胞生长和分化的信号转导通路。HER2是一个由1255个氨基酸组成的、185kD的跨膜糖蛋白，它由胞外配体结合结构域(虽然不存在已知的HER2的配体)、跨膜结构域和胞内结构域组成。HER2被认为是ErbB家族的其他成员(包括erbB-2、erbB-3和erbB-4)的优先二聚化配偶体。HER2还可以通过与其他膜受体(诸如胰岛素样生长因子受体1)复合来活化。二聚化(包括同源二聚化)导致受体的胞质结构域内的酪氨酸残基的自磷酸化，启动多种导致细胞增殖和肿瘤发生的信号传导通路。
HER2过表达导致诱导血管新生。该蛋白质在约30％的乳腺癌和约30％的胃癌/食管癌中过表达。HER2过表达还存在于在其他癌症(包括卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、子宫内膜癌、膀胱癌、肺癌、结肠癌和头颈癌)中。乳腺癌可以具有多达25-50个HER2基因拷贝，并且HER2蛋白增加多达40-100倍。HER2扩增是乳腺和胃肿瘤发生中的早期事件，与无疾病存活期的显著缩短相关。
临床前和临床结果均表明，过表达HER2的肿瘤对抗HER2疗法有反应，这证实了HER2是癌症驱动因子。用抗HER2疗法治疗HER2阳性肿瘤已经使早期存活和晚期疾病得到显著改善。各种单价HER2阻断性抗体正在各种癌症治疗的临床开发中(美国专利申请公开号2019/0076438和2015/0343058)。这些抗体包括曲妥珠单抗、帕妥珠单抗和玛格妥昔单抗。(Pemas和Tolaney，Therapeutic Advances in Medical Oncology，11：doi 10.1177/1758835919833519，2019)。其他HER2抗体是双特异性的或多特异性的，诸如PRS(PierisPharmaceuticals，Inc.，靶向HER2和CD137的单克隆抗体双特异性蛋白)、GBR1302(Glenmark Pharmaceuticals，HER2xCD3双特异性抗体)、ZW25(Zymeworks，Inc.，结合HER2的胞外结构域上的两个不同表位-ECD2和ECD4的双特异性抗体)和MCLA-128(Merus，针对HER2和HER3的双特异性抗体)。一些HER2抗体缀合至细胞毒性有效负载，包括MEDI4276(Medimmune，结合两个缀合至微管溶素的HER2结构域的双特异性ADC；参见U.S.10,160,812)、SYD985(Synthon Biopharmaceuticals BV，基于曲妥珠单抗和可切割的接头的ADC)和曲妥珠单抗德鲁替康(Daiichi Sankyo，Inc.，包括曲妥珠单抗、可切割的药物接头和拓扑异构酶I有效负载)。
由于新生或获得性耐受性，几乎所有转移性HER2阳性癌症患者最终都会进展到对抗HER2疗法产生耐受性。表达中等水平HER2的肿瘤(IHC 2+)仍然对某些疗法(包括曲妥珠单抗-DM1 ado-曲妥珠单抗恩丹宁(T-DM1)(微管破坏剂美坦辛))具有耐受性，这显然是由于T-DM1在溶酶体中的低效内化和加工。曲妥珠单抗-DMI仅对约25％的HER2乳腺癌患者有效。对于在表达HER2的癌症中，尤其是在表达中等水平的HER2的癌症中特别有效的改善的抗癌药物，仍然存在显著未满足的医学需求。
发明内容
本文提供了结合人HER2受体蛋白的双特异性抗体(HER2xHER2)。所述抗体尤其可用于靶向表达HER2的肿瘤细胞。抗HER2抗体及其抗原结合部分可以以未经修饰的形式单独使用，或者可以作为抗体-药物缀合物的一部分包括在内。
通过阅读随后的详细描述，其他实施方案将变得显而易见。
附图说明
图1A、图1B和图1C显示了CompAb1(空心圆圈)、BsAb1(灰色三角形)和BsAb2(黑色三角形)与MDAMB361细胞、JIMT1细胞和ZR751细胞的细胞表面结合。在三种细胞系中，两种双特异性抗体以大于曲妥珠单抗的亲和力和亲合力结合，而同种型对照抗体则显示出很少结合或不结合。
图2是描绘HER2双特异性抗体与HER2表达水平增加的细胞类型的结合效率的柱状图。两种双特异性抗体结合至表达中等HER2水平的细胞系的效率大于曲妥珠单抗。
图3A描绘了具有点击部分间隔基、组织蛋白酶B可切割的接头和微管溶素有效负载的单克隆抗体。图3B描绘了在抗体上进行位点特异性缀合的过程。
图4提供了HER2双特异性抗体-药物缀合物的SEC-HPLC分析。
图5描绘了随时间推移的切割的生物传感器的荧光，这表明HER2xHER2抗体BsAb2(实心圆圈)相对于CompAb1(空心圆圈)更快地诱导组织蛋白酶B可切割的接头的加工。
图6A和图6B描述了ADC在HER2 IHC2+JIMT1异种移植物模型中的功效。BsAb1-微管溶素1A-LP以剂量依赖性方式展示出细胞毒性(3mg/kg，黑色圆圈；1mg/kg，-x-；0.3mg/kg，黑色三角形)。
图7A和图7B描绘了在用HER2xHER2-M830 ADC治疗后的HER2 IHC2+JIMT1小鼠异种移植物模型的平均肿瘤大小。接受单个剂量的3mg/kg HER2xHER2双特异性ADC、BsAb1-微管溶素1A-LP(黑色圆圈)或BsAb2-微管溶素1A-LP(-x-)的小鼠显示出JIMT1异种移植物大小的显著和持续减小，而接受两个剂量的10mg/kg CompAb1-MCC-拟美坦辛A(黑色三角形)的小鼠则显示出很少的抗肿瘤作用或不显示出抗肿瘤作用。
图8A和图8B描绘了在用BsAb1-微管溶素1A-LP治疗后的HER2 IHC2+MDAMB361小鼠异种移植物模型的平均肿瘤大小。与CompAb1-MCC-拟美坦辛A相比，接受两个剂量的BsAb1-微管溶素1A-LP的小鼠显示出肿瘤大小的减小，这产生很少的抗肿瘤作用或不产生抗肿瘤作用。
图9描绘了在用HER2xHER2-M830ADC治疗后的HER2 IHC3+N87小鼠异种移植物模型的平均肿瘤大小。接受单个剂量的3mg/kg HER2xHER2双特异性ADC、BsAb1-微管溶素1A-LP(黑色圆圈)的小鼠显示出N87异种移植物大小的显著和持久减小。接受单个剂量的10mg/kgCompAb1-MCC-拟美坦辛A(空心三角形)的小鼠显示出N87异种移植物大小的显著减小，然而，与用BsAb1-微管溶素1A-LP治疗的那些小鼠相比，肿瘤逃脱更早。
图10A和图10B描绘了与用CompAb1-MCC-拟美坦辛A和CompAb1-L-喜树碱治疗相比，在用HER2xHER2-M830 ADC治疗后的HER2 IHC2+MDAMB361小鼠异种移植物模型的平均肿瘤大小。接受单个剂量的3mg/kg HER2xHER2双特异性ADC、BsAb1-微管溶素1A-LP(黑色圆圈)的小鼠显示出JIMT1异种移植物大小的显著和持久减小，而接受三个每周剂量的1mg/kgBsAb1-微管溶素1A-LP(-x-)的小鼠显示出JIMT1异种移植物的部分减小。相比之下，接受三个每周剂量的10mg/kg CompAb1-L-喜树碱(空心圆圈)的小鼠仅显示出肿瘤进展的减慢。
图11A和图11B描绘了与用CompAb1-MCC-拟美坦辛A治疗相比，在用HER2xHER2-M830 ADC治疗后的HER2 IHC2+CTG0807小鼠异种移植物模型的平均肿瘤大小。接受三个每周剂量的3mg/kg HER2xHER2双特异性ADC、BsAb1-微管溶素1A-LP(黑色圆圈)的小鼠显示出CTG0807 PDX肿瘤大小的完全和持久减小。接受三个每周剂量的1mg/kg BsAb1-微管溶素1A-LP(-x-)的小鼠显示出肿瘤生长的延迟，因为肿瘤大小保持小于300mm3达30天。接受三个每周剂量的10mg/kg CompAb1-MCC-拟美坦辛A(黑色三角形)的小鼠的肿瘤在治疗期间和之后继续生长。
图12A和图12B描绘了与用CompAb1-MCC-拟美坦辛A治疗相比，在用HER2xHER2-M830 ADC治疗后的HER2 IHC2+CTG1184小鼠异种移植物模型的平均肿瘤大小。接受三个每周剂量的3mg/kg(黑色圆圈)和1mg/kg(-x-)HER2xHER2双特异性ADC、BsAb1-微管溶素1A-LP的小鼠显示出CTG1184PDX肿瘤大小的显著和持久减小。接受三个每周剂量的3mg/kg IC1-微管溶素1A-LP(同型对照ADC)或10mg/kg CompAb1-MCC-拟美坦辛A(黑色三角形)的小鼠的肿瘤在治疗期间和之后继续生长。
图13A和图13B描绘了在用HER2xHER2 Camptl ADC治疗后的HER2IHC3+N87小鼠异种移植物模型的平均肿瘤大小。图板A：接受单个剂量的10mg/kg BsAb1-Campt1(图板A，x)或BsAb2-Campt1(图板A，实心圆圈)的小鼠显示出N87异种移植物大小的显著和持久减小。抗肿瘤反应与CompAb1-GGFG-Dxd(图板A，实心三角形)相当，但是显著大于针对CompAb1-MCC-拟美坦辛A (图板A，实心正方形)的反应。在用BsAb1-Campt1或BsAb2-Camp1治疗后的抗肿瘤反应与单个剂量的3mg/kg BsAb2-微管溶素1A-LP的抗肿瘤反应相当(图板B，实心圆圈)，但是大于3个每周剂量的1mg/kg BsAb2-微管溶素1A-LP(图板B，实心三角形)。出于说明目的，数据分为两个图板，但是所有数据均来自同一实验。
图14提供了Her2肽的氘吸收量数据，与单独的Her2相比，在形成Her2-亲本Ab1复合物时存在显著的保护作用。
图15提供了Her2肽的氘吸收量数据，与单独的Her2相比，在形成Her2-亲本Ab2复合物时存在显著的保护作用。
图16提供了Her2肽的氘吸收量数据，与单独的Her2相比，在形成Her2-亲本Ab3复合物时存在显著的保护作用。
图17提供了Her2肽的氘吸收量数据，与单独的Her2相比，在形成Her2-亲本Ab4复合物时存在显著的保护作用。
具体实施方式
在描述本发明前，应当理解，本发明不限于所述的特定方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变化。还应当理解，本文所用的术语仅用于描述具体实施方案的目的，而无意进行限制，因为本发明的范围将仅由所附权利要求书限制。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解相同的含义。本文中使用的术语“约”，当用于提及特定列举的数值时，意指所述值可以与列举的值相差不超过1％。例如，如本文中使用的，表述“约100”包括99和10l以及它们之间的所有值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
尽管与本文描述的那些类似或等同的任何方法和材料都可以用于实践或试验本发明，但现在描述优选的方法和材料。在本说明书中提及的所有专利、申请和非专利出版物通过引用整体并入本文。
HER2蛋白
如本文所用，表述“HER2”等是受体酪氨酸激酶的表皮生长因子(EGF)受体家族的成员。该蛋白质也称为NEU；NGL；HER2；TKR1；CD340；HER-2；MLN 19；HER-2/neu。HER2可以指如SEQ ID NO：51中所示的氨基酸序列，和/或具有如NCBI登录号NP_004439.2中所述的氨基酸序列。
本文对蛋白、多肽和蛋白片段的所有提及意图表示各种蛋白、多肽或蛋白片段的人类形式，除非明确指出其来自非人物种。因此，表述“HER2”意指人HER2，除非指定为来自非人物种，例如，“小鼠HER2”、“猴HER2”等。
本文中使用的表述“细胞表面表达的HER2”是指在体外或体内细胞表面上表达使得HER2蛋白的至少一部分暴露于细胞膜的细胞外侧并且可接近抗体的抗原结合部分的一种或多种HER2蛋白或其细胞外结构域。“细胞表面表达的HER2”可以包含在通常表达HER2蛋白的细胞表面上表达的HER2蛋白或由其组成。可替换地，“细胞表面表达的HER2”可以包含在细胞的表面上表达的HER2蛋白或由其组成，所述细胞通常在其表面上不表达人HER2，但是已经人工工程改造成在其表面上表达HER2。
HER2xHER2双特异性抗原结合分子
本文提供了双特异性抗原结合分子，所述双特异性抗原结合分子包含第一抗原结合结构域(本文也称为“D1”)和第二抗原结合结构域(本文也称为“D2”)双特异性抗原结合分子同时结合两个单独的HER2表位导致抗体在表达HER2的细胞表面上形成簇，并且导致HER2蛋白与结合抗体一起内化
双特异性抗原结合分子包含特异性结合人HER2的第一表位的第一抗原结合结构域(D1)和特异性结合人HER2的第二表位的第二抗原结合结构域(D2)，在本文中可以称为“HER2xHER2双特异性抗体”、“HER2xHER2”或其他相关术语。
在某些实施方案中，HER2xHER2双特异性抗体的D1和D2结构域彼此不竞争。D1和D2之间不竞争结合HER2意指衍生出D1和D2的各自的单特异性抗原结合蛋白不彼此竞争与人HER2的结合。示例性抗原结合蛋白竞争测定是本领域已知的，其非限制性实例在本文其他地方描述。
在某些实施方案中，如本文别处所述，D1和D2结合至HER2上的不同(例如，非重叠或部分重叠)表位。
HER2xHER2双特异性抗原结合分子可以使用两个单独的单特异性抗HER2抗体的抗原结合结构域来构建。例如，单克隆单特异性抗HER2抗体的集合可以使用本领域已知的标准方法来产生。这样产生的单独的抗体可以彼此针对与HER2蛋白的交叉竞争进行成对测试。如果两种不同的抗HER2抗体能够同时结合至HER2(即，不彼此竞争)，则第一抗HER2抗体的抗原结合结构域和第二非竞争性抗HER2抗体的抗原结合结构域可以根据本公开被工程化为单一的HER2xHER2双特异性抗体。
根据本公开内容，双特异性抗原结合分子可以是单个多功能多肽，或者它可以是两个或更多个彼此共价或非共价缔合的多肽的多聚体复合物。如将因本公开而变得明显，能够同时结合HER2分子的两个单独的、不相同的表位的任何抗原结合构建体都被视为双特异性抗原结合分子。如本领域普通技术人员已知的，使用标准的分子生物学技术(例如，重组DNA和蛋白表达技术)可以构建本文描述的任何双特异性抗原结合分子或其变体。
抗HER2双特异性抗体序列
如本文所用，术语“抗体”意指包含与特定抗原(例如，HER2)特异性地结合或相互作用的至少一个互补决定区(CDR)的任何抗原结合分子或分子复合物。术语“抗体”包括包含四条多肽链(即通过二硫键相互连接的两条重(H)链和两条轻(L)链)的免疫球蛋白分子，以及它们的多聚体(例如，IgM)。术语“抗体”还包括由通过二硫键相互连接的四条多肽链(两条重链(H)和两条轻链(L))组成的免疫球蛋白分子。每个重链包含重链可变区(在本文中缩写为HCVR或VH)和重链恒定区。重链恒定区包含三个结构域：CH1、CH2和CH3。每条轻链包含轻链可变区(在本文中缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域(CL1)。VH和VL区可以进一步细分为被称为互补决定区(CDR)的高变区，其散布有更保守的被称为框架区(FR)的区。每个VH和VL由从氨基末端到羧基末端按以下顺序排列的三个CDR和四个FR组成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在本发明的不同实施方案中，抗HER2抗体(或其抗原结合部分)的FR可以与人种系序列相同，或者可以是经天然或人工修饰的。可以基于两个或更多个CDR的并排分析来定义氨基酸共有序列。
同样，术语“抗体”包括包含通过二硫键相互连接的八条多肽链(四条重(H)链和四条轻(L)链)的免疫球蛋白分子，即双特异性抗体。术语“抗体”还包括由通过二硫键相互连接的八条多肽链(四条重(H)链和四条轻(L)链)组成的免疫球蛋白分子。
此外，术语“抗体”包括包含至少一个HC的官能化的免疫球蛋白分子，其中所述HC包含叠氮基-PEG3-胺。在一些方面，叠氮基-PEG3-胺定位于抗体HC上的Q295位点。在一些方面，叠氮基-PEG3-胺定位于抗体上的Q297位点。在一些方面，双特异性抗体具有被定位于HC中的两个Q295位点的叠氮基-PEG3-胺官能化的两个HC。在一些方面，双特异性抗体具有被定位于HC中的两个Q297位点的叠氮基-PEG3-胺官能化的两个HC。在一些方面，双特异性抗体具有被定位于HC中的两个Q295位点和两个Q297位点叠氮基-PEG3-胺官能化的两个HC。HC中的Q297位点通过将N297修饰为Q297来获得，在本文中也称为N297Q修饰。
根据一个方面，提供了HER2双特异性抗体。根据该方面的示例性HER2双特异性抗体在本文的表1和2中列出。表1列出了本文公开的双特异性抗原结合分子(在本文中可与双特异性抗原结合蛋白互换使用)的重链可变区(HCVR)、轻链可变区(LCVR)、重链互补决定区(HCDR1、HCDR2和HCDR3)和轻链互补决定区(LCDR1、LCDR2和LCDR3)的氨基酸序列标识符。表2列出了示例性抗体的HCVR、LCVR、HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3的核酸序列标识符。
本文提供了包含HCVR的特异性结合HER2的双特异性抗体，所述HCVR包含选自表1中列出的HCVR氨基酸序列中的任一者的氨基酸序列，或者与它们具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的它们的基本上相似的序列。
本文提供了包含LCVR的特异性结合HER2的双特异性抗体，所述LCVR包含选自表l中列出的LCVR氨基酸序列中的任一者的氨基酸序列，或者与它们具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的它们的基本上相似的序列。
本文提供了包含HCVR和LCVR氨基酸序列对(HCVR/LCVR)的特异性结合HER2的双特异性抗体，所述HCVR和LCVR氨基酸序列对包含与表1中列出的LCVR氨基酸序列中的任一者配对的表1中列出的所述HCVR氨基酸序列中的任一者。根据某些实施方案，双特异性抗体包括被包含在表1中列出的示例性HER2双特异性抗体中的任一者内的两个HCVR/LCVR氨基酸序列对。在某些实施方案中，HCVR/LCVR氨基酸序列对选自由以下各项组成的组：SEQ IDNO：2/18、10/18、32/18和40/18。
本文还提供了包含重链CDR1(HCDR1)的特异性结合HER2的双特异性抗体，所述重链CDR1包含选自表1中列出的HCDR1氨基酸序列中的任一者的氨基酸序列，或者与它们具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的它们的基本上相似的序列。
本文还提供了包含重链CDR2(HCDR2)的特异性结合HER2的双特异性抗体，所述重链CDR2包含选自表1中列出的HCDR2氨基酸序列中的任一者的氨基酸序列，或者与它们具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的它们的基本上相似的序列。
本文还提供了包含重链CDR3(HCDR3)的特异性结合HER2的双特异性抗体，所述重链CDR3包含选自表1中列出的HCDR3氨基酸序列中的任一者的氨基酸序列，或者与它们具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的它们的基本上相似的序列。
本文还提供了包含轻链CDR1(LCDR1)的特异性结合HER2的双特异性抗体，所述轻链CDR1包含选自表1中列出的LCDR1氨基酸序列中的任一者的氨基酸序列，或者与它们具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的它们的基本上相似的序列。
本文还提供了包含轻链CDR2(LCDR2)的特异性结合HER2的双特异性抗体，所述轻链CDR2包含选自表1中列出的LCDR2氨基酸序列中的任一者的氨基酸序列，或者与它们具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的它们的基本上相似的序列。
本文还提供了包含轻链CDR3(LCDR3)的特异性结合HER2的双特异性抗体，所述轻链CDR3包含选自表1中列出的LCDR3氨基酸序列中的任一者的氨基酸序列，或者与它们具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的它们的基本上相似的序列。
还提供了包含HCDR1和LCDR1氨基酸序列对(HCDR1/LCDR1)的特异性结合HER2的双特异性抗体，所述HCDR1和LCDR1氨基酸序列对包含与表1中列出的LCDR1氨基酸序列中的任一者配对的表1中列出的HCDR1氨基酸序列中的任一者。根据某些实施方案，双特异性抗体包括被包含在表l中列出的示例性抗HER2抗体中的任一者内的至少一个HCDR1/LCDR1氨基酸序列对。在某些实施方案中，HCDR1/LCDR1氨基酸序列对选自由以下各项组成的组：SEQID NO：4/20、12/20、34/20和42/20。
还提供了包含HCDR2和LCDR2氨基酸序列对(HCDR2/LCDR2)的特异性结合HER2的双特异性抗体，所述HCDR2和LCDR2氨基酸序列对包含与表1中列出的LCDR2氨基酸序列中的任一者配对的表1中列出的HCDR2氨基酸序列中的任一者。根据某些实施方案，双特异性抗体包括被包含在表1中列出的示例性抗HER2抗体中的任一者内的至少一个HCDR2/LCDR2氨基酸序列对。在某些实施方案中，HCDR2/LCDR2氨基酸序列对选自由以下各项组成的组：SEQID NO：6/22、14/22、36/22和44/22。
本文还提供了包含HCDR3和LCDR3氨基酸序列对(HCDR3/LCDR3)的特异性结合HER2的双特异性抗体，所述HCDR3和LCDR3氨基酸序列对包含与表1中列出的LCDR3氨基酸序列中的任一者配对的表1中列出的HCDR3氨基酸序列中的任一者。根据某些实施方案，双特异性抗体包括被包含在表1中列出的示例性双特异性抗体中的任一者内的至少一个HCDR3/LCDR3氨基酸序列对。在某些实施方案中，HCDR3/LCDR3氨基酸序列对选自由以下各项组成的组：SEQ ID NO：8/24、16/24、38/24和46/24。
本文还提供了特异性结合HER2的双特异性抗体，所述双特异性抗体包括被包含在表1中列出的示例性抗HER2抗体中的任一者内的两组六个CDR(即，HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)。在某些实施方案中，HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3氨基酸序列组选自由以下各项组成的组：SEQ ID NO：4-6-8-20-22-24、12-14-16-20-22-24、34-36-38-20-22-24和42-44-46-20-22-24。
在一个相关实施方案中，特异性结合HER2的双特异性抗体包含两组六个CDR(即，HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)，所述CDR被包含在表1中列出的示例性HER2双特异性抗体中的任一者所定义的两个HCVR/LCVR氨基酸序列对内。例如，HER2双特异性抗体包含HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3氨基酸序列组，所述氨基酸序列组被包含在选自由以下各项组成的组的HCVR/LCVR氨基酸序列对内：SEQ ID NO：2/18、10/18、32/18和40/18。
用于鉴别在HCVR和LCVR氨基酸序列内的CDR的方法和技术是本领域众所周知的，且可以用于鉴别在本文公开的指定HCVR和/或LCVR氨基酸序列内的CDR。可以用于鉴别CDR的边界的示例性惯例包括，例如，Kabat定义、Chothia定义和AbM定义。一般来说，Kabat定义基于序列差异，Chothia定义基于结构环区的位置，并且AbM定义是Kabat和Chothia方法之间的折衷方案。参见例如，Kabat，“Sequences ofProteins ofImmunological Interest，”National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1991)；Al-Lazikani等人，J.Mol.Biol.273：927-948(1997)；和Martin等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：9268-9272(1989)。公共数据库也可以用于鉴别抗体内的CDR序列。
本文提供了包含重链(HC)的特异性结合HER2的双特异性抗体，所述重链包含选自表3中列出的HC氨基酸序列中的任一者的氨基酸序列，或者与它们具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的它们的基本上相似的序列。例如，本文提供了包含HC的特异性结合HER2的双特异性抗体，所述HC包含选自表3中列出的HC氨基酸序列中的任一者的氨基酸序列，但是包含N297Q修饰或等同的修饰。示例性地，本文提供了具有重链的双特异性抗体，所述重链在HC氨基酸序列内包含N297Q修饰，所述HC氨基酸序列选自由以下各项组成的组：SEQ ID NO：26、28、48和50。在一些方面，双特异性抗体包括包含在SEQ IDNO：26的HC氨基酸序列内的N297Q修饰的HC。在一些方面，双特异性抗体包括包含在SEQ IDNO：28的HC氨基酸序列内的N297Q修饰的HC。在一些方面，双特异性抗体包括包含在SEQ IDNO：48的HC氨基酸序列内的N297Q修饰的HC。在一些方面，双特异性抗体包括包含在SEQ IDNO：50的HC氨基酸序列内的N297Q修饰的HC。在一些方面，双特异性抗体包括包含在SEQ IDNO：26的HC氨基酸序列内的N297Q修饰的HC以及包含在SEQ ID NO：28的HC氨基酸序列内的N297Q修饰的HC。在一些方面，双特异性抗体包括包含在SEQ ID NO：48的HC氨基酸序列内的N297Q修饰的HC以及包含在SEQ ID NO：50的HC氨基酸序列内的N297Q修饰的HC。
本文提供了包含轻链(LC)的特异性结合HER2的双特异性抗体，所述轻链包含选自表3中列出的LC氨基酸序列中的任一者的氨基酸序列，或者与它们具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的它们的基本上相似的序列。
本文提供了包含HC和LC氨基酸序列对(HC/LC)的特异性结合HER2的双特异性抗体，所述HC和LC氨基酸序列对包含与表3中列出的LC氨基酸序列中的任一者配对的表3中列出的所述HC氨基酸序列中的任一者。根据某些实施方案，双特异性抗体包括被包含在表3中列出的示例性HER2双特异性抗体中的任一者内的两个HC/LC氨基酸序列对。在某些实施方案中，HC/LC氨基酸序列对选自由以下各项组成的组：SEQ ID NO：26/30、28/30、48/30和50/30。在一些方面，HC包含如上文提供的N297Q修饰。
本文还提供了编码抗HER2抗体或其部分的核酸分子。例如，本发明提供了编码表1中列出的HCVR氨基酸序列中的任一者的核酸分子；在某些实施方案中，所述核酸分子包含选自表2中列出的HCVR核酸序列中的任一者的多核苷酸序列，或者与它们具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的它们的基本上相似的序列。
还提供了编码表1中列出的所述LCVR氨基酸序列中的任一者的核酸分子；在某些实施方案中，所述核酸分子包含选自表2中列出的所述LCVR核酸序列中的任一者的多核苷酸序列，或者与它们具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的它们的基本上相似的序列。
还提供了编码表1中列出的所述HCDR1氨基酸序列中的任一者的核酸分子；在某些实施方案中，所述核酸分子包含选自表2中列出的所述HCDRl核酸序列中的任一者的多核苷酸序列，或者与它们具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的它们的基本上相似的序列。
还提供了编码表1中列出的所述HCDR2氨基酸序列中的任一者的核酸分子；在某些实施方案中，所述核酸分子包含选自表2中列出的所述HCDR2核酸序列中的任一者的多核苷酸序列，或者与它们具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的它们的基本上相似的序列。
还提供了编码表1中列出的所述HCDR3氨基酸序列中的任一者的核酸分子；在某些实施方案中，所述核酸分子包含选自表2中列出的所述HCDR3核酸序列中的任一者的多核苷酸序列，或者与它们具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的它们的基本上相似的序列。
还提供了编码表1中列出的所述LCDR1氨基酸序列中的任一者的核酸分子；在某些实施方案中，所述核酸分子包含选自表2中列出的所述LCDR1核酸序列中的任一者的多核苷酸序列，或者与它们具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的它们的基本上相似的序列。
还提供了编码表1中列出的所述LCDR2氨基酸序列中的任一者的核酸分子；在某些实施方案中，所述核酸分子包含选自表2中列出的所述LCDR2核酸序列中的任一者的多核苷酸序列，或者与它们具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的它们的基本上相似的序列。
还提供了编码表1中列出的所述LCDR3氨基酸序列中的任一者的核酸分子；在某些实施方案中，所述核酸分子包含选自表2中列出的所述LCDR3核酸序列中的任一者的多核苷酸序列，或者与它们具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的它们的基本上相似的序列。
还提供了编码HCVR的核酸分子，其中所述HCVR包含一组三个CDR(即，HCDRl-HCDR2-HCDR3)，其中所述HCDR1-HCDR2-HCDR3氨基酸序列组如表1中列出的示例性HER2双特异性抗体中的任一者所定义。
还提供了编码LCVR的核酸分子，其中所述LCVR包含一组三个CDR(即，LCDR1-LCDR2-LCDR3)，其中所述LCDR1-LCDR2-LCDR3氨基酸序列组如表1中列出的示例性HER2双特异性抗体中的任一者所定义。
还提供了编码HCVR和LCVR二者的核酸分子，其中所述HCVR包含表1中列出的所述HCVR氨基酸序列中的任一者的氨基酸序列，并且其中所述LCVR包含表1中列出的所述LCVR氨基酸序列中的任一者的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述核酸分子包含选自表2中列出的HCVR核酸序列中的任一个的多核苷酸序列，或者与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的其基本上相似的序列，以及选自表2中列出的LCVR核酸序列中的任一个的多核苷酸序列，或者与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的其基本上相似的序列。在根据该方面的某些实施方案中，所述核酸分子编码HCVR和LCVR，其中所述HCVR和LCVR二者均衍生自表1中列出的相同的HER2双特异性抗体。
还提供了编码表3中列出的HC氨基酸序列中的任一者；或编码与它们具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的它们的基本上相似的序列的核酸分子。例如，核酸分子可以编码表3中列出的HC氨基酸序列中的任一者，其中所述HC具有N297Q修饰。
还提供了编码表3中列出的LC氨基酸序列中的任一者；或编码与它们具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的它们的基本上相似的序列的核酸分子。
本文还提供了能够表达包含HER2双特异性抗体的重链或轻链可变区的多肽的重组表达载体。例如，重组表达载体包含上述核酸分子中的任一者，即编码表1中列出的HCVR、LCVR和/或CDR序列中的任一者的核酸分子。在本公开的范围内还包括的是引入了此类载体的宿主细胞，以及通过在允许抗体或抗体片段产生的条件下培养宿主细胞，并且回收如此产生的抗体和抗体片段，来产生抗体或其部分的方法。
本文提供了具有经修饰的糖基化模式的HER2双特异性抗体。在某些实施方案中，可以使用修饰以除去不希望的糖基化位点，或者缺乏在寡糖链上存在的岩藻糖部分的抗体，例如，以增加抗体依赖性的细胞的细胞毒性(ADCC)功能(参见Shield等人(2002)JBC277：26733)。在其他应用中，可以进行半乳糖基化的修饰以改变补体依赖性的细胞毒性(CDC)。
抗原结合结构域
本公开的双特异性抗原结合分子包含两个单独的抗原结合结构域(D1和D2)。本文中使用的表述“抗原结合结构域”是指能够特异性结合特定目标抗原(例如，人HER2)的任何肽、多肽、核酸分子、支架型分子、肽展示分子或含多肽的构建体。本文中使用的术语“特异性结合”等意指抗原结合结构域与特定抗原形成复合物，其特征在于解离常数(KD)为500pM或更低，并且在普通测试条件下不结合其他不相关抗原。“不相关抗原”是彼此具有小于95％氨基酸同一性的蛋白、肽或多肽。
可以在本公开内容的上下文中使用的抗原结合结构域的示例性类别包括抗体、抗体的抗原结合部分、与特定抗原(例如，肽体)特异性相互作用的肽、与特定抗原特异性相互作用的受体分子、包含特异性结合特定抗原的受体的配体结合部分的蛋白、抗原结合支架(例如，DARPins、HEAT重复蛋白、ARM重复蛋白、三十四肽重复蛋白和基于天然存在的重复蛋白的其他支架等[参见，例如，Boersma和Pluckthun，2011，Curr.Opin.Biotechnol.22：849-857，和其中引用的参考文献])、以及适体或其部分。
用于确定两个分子是否彼此特异性结合的方法是本领域众所周知的，包括例如平衡透析、表面等离子共振等。例如，如在本公开内容的上下文中使用的，抗原结合结构域包括结合特定抗原(例如，靶分子[T]或内化效应蛋白[E])或其部分的多肽，其中如在表面等离子共振测定中所测得的，KD小于约500pM、小于约400pM、小于约300pM、小于约200pM、小于约100pM、小于约90pM、小于约80pM、小于约70pM、小于约60pM、小于约50pM、小于约40pM、小于约30pM、小于约20pM、小于约10pM、小于约5pM、小于约4pM、小于约2pM、小于约1pM、小于约0.5pM、小于约0.2pM、小于约0.1pM或小于约0.05pM。
本文中使用的术语“表面等离子共振”表示一种光学现象，其允许通过检测生物传感器基质内的蛋白浓度的改变来分析实时相互作用，例如使用BIAcoreTM系统(BiacoreLife Sciences division of GE Healthcare，Piscataway，NJ)。
本文中使用的术语“KD”是指特定蛋白-蛋白相互作用(例如，抗体-抗原相互作用)的平衡解离常数。除非另外指出，否则本文公开的KD值表示在25℃通过表面等离子共振测定确定的KD值。
如上面指出的，“抗原结合结构域”(D1和/或D2)可以包含抗体或抗体的抗原结合片段或由其组成。本文中使用的术语“抗体”是指包含至少一个与特定抗原(例如，人HER2)特异性结合或相互作用的互补决定区(CDR)的任何抗原结合分子或分子复合物。术语“抗体”包括包含通过二硫键相互连接的四个多肽链(两个重(H)链和两个轻(L)链)的免疫球蛋白分子及其多聚体(例如，IgM)。每个重链包含重链可变区(在本文中缩写为HCVR或VH)和重链恒定区。重链恒定区包含三个结构域：CH1、CH2和CH3。每条轻链包含轻链可变区(在本文中缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域(CL1)。VH区和VL区可以进一步细分为被称为互补决定区(CDR)的高变区，其散布有更保守的被称为框架区(FR)的区。每个VH和VL由从氨基末端到羧基末端按照以下次序排列的三个CDR和四个FR构成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在不同的实施方案中，本文提供的抗体(或其抗原结合部分)的FR可以与人种系序列相同，或可以是天然地或人工地修饰的。可以基于两个或更多个CDR的并排分析来定义氨基酸共有序列。
本文提供的双特异性抗原结合分子的D1和/或D2组分可包含全抗体分子的抗原结合片段或由其组成。本文中使用的术语抗体的“抗原结合部分”、抗体的“抗原结合片段”等包括特异性地结合抗原以形成复合物的任何天然存在的、酶促可获得的、合成的或遗传工程改造的多肽或糖蛋白。使用任意合适的标准技术诸如蛋白水解消化或重组基因工程技术(其涉及操作和表达编码抗体可变结构域和任选的恒定结构域的DNA)，可以从例如完整抗体分子衍生出抗体的抗原结合片段。这样的DNA是已知的，和/或可以容易地从例如商业来源、DNA文库(包括，例如噬菌体-抗体文库)获得，或者可以被合成。可以对DNA测序，并化学地或通过使用分子生物学技术进行操作，例如，以将一个或多个可变结构域和/或恒定结构域排列为合适的构型，或导入密码子，产生半胱氨酸残基，修饰、添加或删除氨基酸等。
抗原结合片段的非限制性实例包括：(i)Fab片段；(ii)F(ab′)2片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(v)单链Fv(scFv)分子；(vi)dAb片段；和(vii)由模拟抗体高变区的氨基酸残基组成的最小识别单位(例如，分离的互补决定区(CDR)诸如CDR3肽)或受限制的FR3-CDR3-FR4肽。其他经工程改造的分子，诸如结构域特异性抗体、单结构域抗体、结构域缺失的抗体、嵌合抗体、CDR-移植抗体、双体、三体、四体、微体、纳米抗体(例如单价纳米抗体、二价纳米抗体等)、小模块化免疫药物(SMIP)和鲨鱼可变IgNAR结构域也被包括在本文所用的表述“抗原结合片段”内。
抗体的抗原结合片段通常将包含至少一个可变结构域。可变结构域可以具有任何尺寸或氨基酸组成并且通常将包含与一个或多个框架序列毗邻或符合读框的至少一个CDR。在具有VH结构域与VL结构域缔合的抗原结合片段中，VH和VL结构域可相对于彼此以任何合适的布置定位。例如，可变区可以是二聚体并且含有VH-VH、VH-VL或VL-VL二聚体。可替代地，抗体的抗原结合片段可含有单体VH或VL结构域。
在某些实施方案中，抗体的抗原结合片段可以含有与至少一个恒定结构域共价连接的至少一个可变结构域。在本公开内容的抗体的抗原结合片段内可以发现的可变结构域和恒定结构域的非限制性示例性构型包括：(i)VH-CH1；(ii)VH-CH2；(iii)VH-CH3；(iv)VH-CH1-CH2；(v)VH-CH1-CH2-CH3；(vi)VH-CH2-CH3；(vii)VH-CL；(Viii)VL-CH1；(ix)VL-CH2；(x)VL-CH3；(xi)VL-CH1-CH2；(xii)VL-CH1-CH2-CH3；(xiii)VL-CH2-CH3；和(xiv)VL-CL。在可变结构域和恒定结构域的任何构型(包括上面列出的任何示例性构型)中，可变结构域和恒定结构域可以彼此直接连接或者可以通过全长或部分铰链或接头区相连。铰链区可以由至少2个(例如5、10、15、20、40、60或更多个)氨基酸组成，其导致在单个多肽分子中的相邻可变结构域和/或恒定结构域之间的柔性的或半柔性的连接。此外，抗原结合片段可以包含彼此非共价结合和/或与一个或多个单体VH或VL结构域非共价缔合(例如，通过二硫键)的上文列出的任何可变结构域和恒定结构域构型的同二聚体或异二聚体(或其他多聚体)。
本文提供的双特异性抗原结合分子可以包含人抗体和/或重组人抗体或其片段，或者由人抗体和/或重组人抗体或其片段组成。本文中使用的术语“人抗体”包括具有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。尽管如此，人抗体还可以包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过随机的或位点特异性的体外诱变或体内体细胞突变而导入的突变)，例如在CDR中且特别是在CDR3中。但是，本文中使用的术语“人抗体”不意图包括这样的抗体：其中从另一哺乳动物物种(诸如小鼠)的种系衍生出的CDR序列已经移植至人框架序列上。
本公开的双特异性抗原结合分子可以包含重组人抗体或其抗原结合片段，或者由重组人抗体或其抗原结合片段组成。本文中使用的术语“重组人抗体”意图包括通过重组方式制备、表达、建立或分离的所有人抗体，诸如使用转染进宿主细胞中的重组表达载体(在下面进一步描述)表达的抗体，从重组的组合人抗体文库(在下面进一步描述)分离的抗体，从人免疫球蛋白基因转基因的动物(例如小鼠)分离的抗体(参见例如，Taylor等人(1992)Nucl.Acids Res.20：6287-6295)，或通过涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列的任何其他方式制备、表达、建立或分离的抗体。这样的重组人抗体具有从人种系免疫球蛋白序列衍生出的可变区和恒定区。但是，在某些实施方案中，对这样的重组人抗体进行体外诱变(或，当使用人Ig序列转基因的动物时，体内体细胞诱变)，且因而重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是这样的序列：其尽管源自人种系VH和VL序列和与人种系VH和VL序列有关，但是不可能天然存在于体内人抗体种系谱系内。
用于制备双特异性抗体的方法是本领域已知的，并且可以用于构建本文公开的双特异性抗原结合分子。可以在本公开内容的上下文中使用的示例性双特异性形式包括、但不限于，例如，基于scFv的或双抗体双特异性形式、IgG-scFv融合体、双重可变结构域(DVD)-Ig、四源杂交瘤(quadroma)、凸起-进入-孔洞、共同轻链(例如，具有凸起-进入-孔洞的共同轻链等)、CrossMab、CrossFab、(SEED)body、亮氨酸拉链、Duobody、IgG1/IgG2、双重作用Fab(DAF)-IgG和Mab2双特异性形式(关于前述形式的综述，参见，例如，Klein等人.2012，mAbs4：6，1-11，和其中引用的参考文献)。
可以包含在本文提供的HER2xHER2双特异性抗原结合分子中的示例性抗原结合结构域(D1和D2)包括衍生自本文公开的抗HER2序列中的任一者的抗原结合结构域。例如，本公开包括HER2xHER2双特异性抗原结合分子，所述HER2xHER2双特异性抗原结合分子包含D1或D2抗原结合结构域，所述D1或D2抗原结合结构域包含HCVR，所述HCVR包含选自表l中列出的HCVR氨基酸序列中的任一者的氨基酸序列，或与它们具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的它们的基本上相似的序列。
本文还提供了HER2xHER2双特异性抗原结合分子，所述HER2xHER2双特异性抗原结合分子包含D1或D2抗原结合结构域，所述D1或D2抗原结合结构域包含LCVR，所述LCVR包含选自表1中列出的LCVR氨基酸序列中的任一者的氨基酸序列，或与它们具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的它们的基本上相似的序列。
本文提供了HER2xHER2双特异性抗原结合分子，所述HER2xHER2双特异性抗原结合分子包含D1或D2抗原结合结构域，所述D1或D2抗原结合结构域包含HCVR和LCVR氨基酸序列对(HCVR/LCVR)，所述HCVR和LCVR氨基酸序列对包含与表1中列出的LCVR氨基酸序列中的任一者配对的表1中列出的HCVR氨基酸序列中的任一者。根据某些实施方案，本发明提供了HER2xHER2双特异性抗原结合分子，所述HER2xHER2双特异性抗原结合分子包含D1或D2抗原结合结构域，所述D1或D2抗原结合结构域包含表1中列出的示例性抗HER2抗体中的任一者中所含有的HCVR/LCVR氨基酸序列对。
本文还提供了HER2xHER2双特异性抗原结合分子，所述HER2xHER2双特异性抗原结合分子包含D1或D2抗原结合结构域，所述D1或D2抗原结合结构域包含重链CDR1(HCDR1)，所述重链CDR1包含选自表1中列出的HCDR1氨基酸序列中的任一者的氨基酸序列，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的它们的基本上相似的序列。
还提供了HER2xHER2双特异性抗原结合分子，所述HER2xHER2双特异性抗原结合分子包含D1或D2抗原结合结构域，所述D1或D2抗原结合结构域包含重链CDR2(HCDR2)，所述重链CDR2包含选自表1中列出的HCDR2氨基酸序列中的任一者的氨基酸序列，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的它们的基本上相似的序列。
还提供了HER2xHER2双特异性抗原结合分子，所述HER2xHER2双特异性抗原结合分子包含D1或D2抗原结合结构域，所述D1或D2抗原结合结构域包含重链CDR3(HCDR3)，所述重链CDR3包含选自表1中列出的HCDR3氨基酸序列中的任一者的氨基酸序列，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的它们的基本上相似的序列。
还提供了HER2xHER2双特异性抗原结合分子，所述HER2xHER2双特异性抗原结合分子包含D1或D2抗原结合结构域，所述D1或D2抗原结合结构域包含轻链CDR1(LCDR1)，所述轻链CDR1包含选自表1中列出的LCDR1氨基酸序列中的任一者的氨基酸序列，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的它们的基本上相似的序列。
还提供了HER2xHER2双特异性抗原结合分子，所述HER2xHER2双特异性抗原结合分子包含D1或D2抗原结合结构域，所述D1或D2抗原结合结构域包含轻链CDR2(LCDR2)，所述轻链CDR2包含选自表1中列出的LCDR2氨基酸序列中的任一者的氨基酸序列，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的它们的基本上相似的序列。
还提供了HER2xHER2双特异性抗原结合分子，所述HER2xHER2双特异性抗原结合分子包含D1或D2抗原结合结构域，所述D1或D2抗原结合结构域包含轻链CDR3(LCDR3)，所述轻链CDR3包含选自表1中列出的LCDR3氨基酸序列中的任一者的氨基酸序列，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的它们的基本上相似的序列。
还提供了HER2xHER2双特异性抗原结合分子，所述HER2xHER2双特异性抗原结合分子包含D1或D2抗原结合结构域，所述D1或D2抗原结合结构域包含HCDR3和LCDR3氨基酸序列对(HCDR3/LCDR3)，所述HCDR3和LCDR3氨基酸序列对包含与表1中列出的LCDR3氨基酸序列中的任一者配对的表1中列出的HCDR3氨基酸序列中的任一者。根据某些实施方案，本公开内容提供了抗体或其抗原结合片段，其包含在表1中列出的示例性抗HER2抗体中的任一者内所含的HCDR3/LCDR3氨基酸序列对。
还提供了HER2xHER2双特异性抗原结合分子，所述HER2xHER2双特异性抗原结合分子包含D1或D2抗原结合结构域，所述D1或D2抗原结合结构域包含表1中列出的示例性抗HER2抗体中的任一者内所含的一组六个CDR(即，HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)。
在一个相关实施方案中，本公开提供了HER2xHER2双特异性抗原结合分子，所述HER2xHER2双特异性抗原结合分子包含D1或D2抗原结合结构域，所述D1或D2抗原结合结构域包含选自表1中列出的抗HER2序列的HCVR/LCVR氨基酸序列对内所含的一组六个CDR(即，HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)。
本文提供的HER2xHER2双特异性抗原结合分子可以包含衍生自表1的抗HER2序列中的任一者的D1抗原结合结构域和衍生自表1的任何其他抗HER2序列的D2抗原结合结构域。本公开的HER2xHER2双特异性抗体的非限制性实例在本文提供的实施例中有所描述。
作为一个非限制性示例性实例，本公开包括包含D1抗原结合结构域和D2抗原结合结构域的HER2xHER2双特异性抗原结合分子，其中所述D1抗原结合结构域包含SEQ ID NO：2/18的HCVR/LCVR氨基酸序列对，或包含SEQ ID NO：4-6-8-20-22-24的一组重链和轻链CDR(HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)，并且其中所述D2抗原结合结构域包含SEQ IDNO：10/18的HCVR/LCVR氨基酸序列对，或包含SEQ ID NO：12-14-16-20-22-24的一组重链和轻链CDR(HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)。具有这些序列特征的示例性HER2xHER2双特异性抗体是称为H4H17325D的双特异性抗体，也称为双特异性抗体1(bsAb1)。
作为另一个非限制性示例性实例，本公开包括包含D1抗原结合结构域和D2抗原结合结构域的HER2xHER2双特异性抗原结合分子，其中所述D1抗原结合结构域包含SEQ IDNO：32/18的HCVR/LCVR氨基酸序列对，或包含SEQID NO：34-36-38-20-22-24的一组重链和轻链CDR(HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)，并且其中所述D2抗原结合结构域包含SEQ ID NO：40/18的HCVR/LCVR氨基酸序列对，或包含SEQ ID NO：42-44-46-20-22-24的一组重链和轻链CDR(HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)。具有这些序列特征的示例性HER2xHER2双特异性抗体是称为H4H17087D的双特异性抗体，也称为双特异性抗体2(bsAb2)。
多聚化组分
在某些实施方案中，本文提供的双特异性抗原结合分子还可以包含一种或多种多聚化组分。多聚化组分可以起作用以维持抗原结合结构域(D1和D2)之间的缔合。本文中使用的“多聚化组分”是能够与具有相同或相似结构或构成的第二多聚化组分缔合的任何大分子、蛋白、多肽、肽或氨基酸。例如，多聚化组分可以是包含免疫球蛋白CH3结构域的多肽。多聚化组分的非限制性实例是免疫球蛋白的Fc部分，例如选自同种型IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的IgG以及每个同种型组内的任何同种异型的Fc结构域。在某些实施方案中，多聚化组分是Fc片段或长度为1至约200个氨基酸的氨基酸序列，其含有至少一个半胱氨酸残基。在其他实施方案中，多聚化组分是半胱氨酸残基或含半胱氨酸的短肽。其他多聚化结构域包括包含亮氨酸拉链、螺旋环基序或卷曲螺旋基序或由其组成的肽或多肽。
在某些实施方案中，本文提供的双特异性抗原结合分子包含两个多聚化结构域M1和M2，其中D1连接至M1并且D2连接至M2，并且其中M1与M2的缔合促进在单个双特异性抗原结合分子中D1和D2与彼此的物理连接。在某些实施方案中，M1和M2彼此相同。例如，M1可以是具有特定氨基酸序列的Fc结构域，且M2是具有与M1相同的氨基酸序列的Fc结构域。可替换地，M1和M2可以在一个或多个氨基酸位置彼此不同。例如，M1可以包含第一免疫球蛋白(Ig)CH3结构域，且M2可以包含第二Ig CH3结构域，其中第一和第二Ig CH3结构域彼此相差至少一个氨基酸，并且其中与具有相同M1和M2序列的参考构建体相比，至少一个氨基酸差异会降低靶向构建体与蛋白A的结合。在一个实施方案中，M1的Ig CH3结构域结合蛋白A并且M2的Ig CH3结构域含有降低或消除蛋白A结合的突变，例如H95R修饰(根据IMGT外显子编号；根据EU编号的H435R)。M2的CH3可进一步包含Y96F修饰(根据IMGT；根据EU的Y436F)。可以存在于M2的CH3中的另外的修饰包括：在IgG1 Fc结构域的情况下D16E、L18M、N44S、K52N、V57M和V82I(按照IMGT编号；按照EU编号为D356E、L358M、N384S、K392N、V397M和V422I)；在IgG2 Fc结构域的情况下N44S、K52N和V82I(按照IMGT编号；按照EU编号为N384S、K392N和V422I)；和在IgG4 Fc结构域的情况下Q15R、N44S、K52N、V57M、R69K、E79Q和V82I(按照IMGT编号；按照EU编号为Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q和V422I)。
本公开的双特异性抗原结合分子可以是“分离的”。本文中使用的“分离的双特异性抗原结合分子”是指已经从其自然环境的至少一种组分鉴定和分离和/或回收的双特异性抗原结合分子。例如，为了本公开内容的目的，已从生物体的至少一种组分或从在其中产生抗体的组织或细胞分离或移出的双特异性抗体是“分离的双特异性抗体”。分离的双特异性抗原结合分子还包括在重组细胞内的原位分子。分离的双特异性抗原结合分子是已经进行至少一个纯化或分离步骤的分子。根据某些实施方案，分离的双特异性抗原结合分子可以基本上不含其他细胞物质和/或化学物质。
与衍生出抗原结合蛋白或抗原结合结构域的相应的种系序列相比，本文公开的双特异性抗原结合分子或其抗原结合结构域(D1和/或D2)可以在重链和轻链可变结构域的框架和/或CDR区中包含一个或多个氨基酸置换、插入和/或缺失。通过将本文公开的氨基酸序列与可从例如公共抗体序列数据库获得的种系序列进行比较，可以容易地确定此类突变。本公开包括本文公开的双特异性抗原结合分子或其抗原结合结构域(D1和/或D2)，所述双特异性抗原结合分子或其抗原结合结构域衍生自本文公开的氨基酸序列中的任一者，其中一个或多个框架和/或CDR区内的一个或多个氨基酸被突变为衍生出抗体的种系序列的一个或多个相应的残基，或者被突变为另一个人种系序列的一个或多个相应的残基，或者被突变为一个或多个相应的种系残基的保守氨基酸置换(此类序列改变在本文中统称为“种系突变”)。
本领域普通技术人员从本文公开的重链和轻链可变区序列出发可容易地产生众多双特异性抗原结合分子或其抗原结合结构域(D1和/或D2)，其包含一个或多个个体种系突变或其组合。在某些实施方案中，在VH和/或VL结构域内的所有框架和/或CDR残基被回复突变为在衍生出所述抗体的原始种系序列中发现的残基。在其他实施方案中，仅某些残基被突变回原始种系序列，例如，仅存在于FR1的前8个氨基酸内或FR4的后8个氨基酸内的突变残基，或仅存在于CDR1、CDR2或CDR3内的突变残基。在其他实施方案中，框架和/或一个或多个CDR残基中的一个或多个突变为不同的种系序列(即，不同于最初衍生出抗体的种系序列的种系序列)的一个或多个对应残基。
此外，本公开的双特异性抗原结合分子或其抗原结合结构域(D1和/或D2)可以在框架和/或CDR区内含有两个或更多个种系突变的任何组合，例如，其中某些单独的残基被突变为特定种系序列的相应的残基，而某些不同于原始种系序列的其他残基得以维持或被突变为不同的种系序列的相应的残基。一旦获得，可以容易地测试含有一个或多个种系突变的双特异性抗原结合分子，或其抗原结合结构域(D1和/或D2)的一种或多种所需特性，例如提高的结合特异性、增加的结合亲和力、提高或增强的拮抗或激动生物学特性(视情况而定)、降低的免疫原性等。本公开内涵盖以这种一般方式获得的双特异性抗原结合分子或其抗原结合结构域(D1和/或D2)。
变体
本公开还包括包含本文公开的HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列中的任一者的变体的抗HER2抗体和双特异性抗原结合分子。在该方面内包括的示例性变体包括具有一个或多个置换(例如，保守置换)的本文公开的HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列中的任一者的变体。在一些方面，本公开包括具有相对于本文表1中列出的HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列中的任一者而言，具有例如10个或更少、8个或更少、6个或更少、4个或更少、3个或更少、2个或1个氨基酸置换的HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列的抗HER2抗体和HER2xHER2双特异性抗原结合分子，其中经修饰的抗体和双特异性抗原结合分子维持针对HER2的结合活性。
在本公开的该方面内包括的示例性变体还包括与本文公开的HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列中的任一者具有基本序列同一性的变体。如本文在氨基酸序列的上下文中所使用的，术语“实质同一性”或“实质相同的”是指，两个氨基酸序列，当最佳比对时，例如通过使用默认缺口权重的程序GAP或BESTFIT，共享至少95％、98％或99％序列同一性。在某些实施方案中，不相同的残基位置因保守氨基酸置换而不同。“保守氨基酸置换”是这样的置换：其中一个氨基酸残基被置换为另一个含有具有类似化学性质(例如，电荷或疏水性)的侧链(R基团)的氨基酸残基。一般而言，保守氨基酸置换不会实质上改变蛋白的功能性质。在两个或更多个氨基酸序列的保守置换彼此不同的情况下，可以向上调整序列同一性百分比或相似性程度以校正置换的保守性质。用于进行该调整的手段是本领域的技术人员熟知的。参见例如，Pearson(1994)Methods Mol.Biol.24：307-331，该文献以引用的方式并入本文。侧链具有类似化学特性的氨基酸组的实例包括(1)脂肪族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；(2)脂肪族羟基侧链：丝氨酸和苏氨酸；(3)含酰胺的侧链：天冬酰胺和谷氨酰胺；(4)芳香族侧链：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；(5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸和组氨酸；(6)酸性侧链：天冬氨酸和谷氨酸；和(7)含硫侧链：半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守氨基酸置换组是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸以及天冬酰胺-谷氨酰胺。可替代地，保守替代是在以下文献中公开的PAM250对数似然矩阵中具有正值的任何变化：Gonnet等人(1992)Science 256：1443-1445，该文献以引用的方式并入本文。“适度保守”替换是在PAM250 log似然矩阵中具有非负值的任何变化。
通常使用序列分析软件测量两个不同氨基酸序列之间的序列同一性。序列分析软件使用分配给各种置换、缺失和其他修饰(包括保守氨基酸置换)的相似性量度来匹配相似序列。例如，GCG软件含有程序诸如GAP和BESTFIT，其可以与默认参数一起用来确定密切相关的多肽(例如来自不同生物物种的同源多肽)之间或野生型蛋白和其突变蛋白之间的序列同源性或序列同一性。参见，例如，GCG 6.1版。还可以使用FASTA(GCG 6.1版中的程序)使用默认或推荐参数对多肽序列进行比较。FASTA(例如，FASTA2和FASTA3)提供查询与搜索序列之间的最佳重叠区的比对和序列同一性百分比(Pearson(2000)同上)。当将本文提供的序列与含有来自不同生物的大量序列的数据库进行对比时，另一种优选的算法是使用默认参数的计算机程序BLAST，尤其是BLASTP或TBLASTN。参见例如Altschul.等人.(1990)J.Mol.Biol.215：403-410和Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-402，每个文献均以引用的方式并入本文。
包含Fc变体的HER2xHER2双特异性抗原结合分子
根据本文提供的某些实施方案，提供了HER2xHER2双特异性抗原结合蛋白，所述HER2xHER2双特异性抗原结合蛋白包含Fc结构域，所述Fc结构域包含一个或多个突变，所述突变例如与中性pH相比在酸性pH下增强了或减少了抗体与FcRn受体的结合。例如，本公开包括HER2xHER2双特异性抗原结合蛋白，所述HER2xHER2双特异性抗原结合蛋白在Fc结构域的CH2或CH3区中包含突变，其中一个或多个突变在酸性环境下(例如，在pH范围为从约5.5至约6.0的胞内体中)增加了Fc结构域与FcRn的亲和力。当向动物施用时，此类突变可以导致抗体的血清半衰期增加。这样的Fc修饰的非限制性实例包括，例如，在位置250(例如，E或Q)；250和428(例如，L或F)；252(例如，L/Y/F/W或T)、254(例如，S或T)和256(例如，S/R/Q/E/D或T)处的修饰；或在位置428和/或433(例如，H/L/R/S/P/Q或K)和/或434(例如，H/F或Y)处的修饰；或在位置250和/或428处的修饰；或在位置307或308(例如，308F、V308F)和434处的修饰。在一个实施方案中，修饰包含428L(例如，M428L)和434S(例如，N434S)修饰；428L、259I(例如，V259I)和308F(例如，V308F)修饰；433K(例如，H433K)和434(例如，434Y)修饰；252、254和256(例如，252Y、254T和256E)修饰；250Q和428L修饰(例如，T250Q和M428L)；和307和/或308修饰(例如，308F或308P)。
例如，本公开包括HER2xHER2双特异性抗原结合蛋白，所述HER2xHER2双特异性抗原结合蛋白包含Fc结构域，所述Fc结构域包含一对或多对或者一组或多组选自由以下组成的组的突变：250Q和248L(例如，T250Q和M248L)；252Y、254T和256E(例如，M252Y、S254T和T256E)；428L和434S(例如，M428L和N434S)；以及433K和434F(例如，H433K和N434F)。前述Fc结构域突变的所有可能组合和本文公开的抗体可变结构域内的其他突变都涵盖在本公开的范围内。
本文提供的抗原结合分子的生物学特征
本文提供了以高亲和力结合人HER2(例如，hErbB2 ecto-mFc)的HER2xHER2双特异性抗原结合蛋白。例如，本公开包括抗HER2xHER2双特异性抗原结合蛋白，所述抗HER2xHER2双特异性抗原结合蛋白以小于约3nM的KD结合人HER2，所述KD如通过在25℃下的表面等离子共振，例如使用本文的实施例8中定义的测定法形式，或基本上相似的测定法所测量。根据某些实施方案，提供了抗HER2抗体，所述抗HER2抗体在25℃下以小于约1nM、小于约0.9nM、小于约0.8nM、小于约0.7nM、小于约0.6nM、小于约0.5nM、小于约0.4nM、小于约0.3nM、小于约0.25nM、小于约200pM、小于约150pM、小于约100nM或小于50pM的KD结合人HER2，所述KD如通过表面等离子共振，例如使用本文的实施例8中定义的测定法形式，或基本上相似的测定法所测量。
本文还提供了HER2xHER2双特异性抗原结合蛋白，所述HER2xHER2双特异性抗原结合蛋白以大于约20分钟的解离半衰期(t1/2)结合人HER2(例如，hErbB2 ecto-mFc)，如通过在25℃下的表面等离子共振，例如使用本文的实施例8中定义的测定法形式，或基本上相似的测定法所测量。根据某些实施方案，提供了HER2xHER2双特异性抗原结合蛋白，所述HER2xHER2双特异性抗原结合蛋白在25℃下以大于约20分钟、大于约25分钟、大于约30分钟、大于约40分钟、大于约50分钟、大于约60分钟、大于约70分钟、大于约80分钟、大于约90分钟、大于约100分钟、大于约200分钟、大于约300分钟、大于约400分钟、大于约500分钟、大于约600分钟、大于约700分钟、大于约800分钟、大于约900分钟、大于约1000分钟、大于约1100分钟或更长的t1/2结合人HER2，如通过表面等离子共振，例如使用本文的实施例8中定义的测定法形式，或基本上相似的测定法所测量。
本文还提供了HER2xHER2双特异性抗原结合蛋白，其在早期胞内体中表现出内化并从早期胞内体运输到溶酶体。本文还提供了形成表面簇并诱导HER2的内化的HER2xHER2双特异性抗原结合蛋白。
本公开的抗原结合蛋白可以具有一种或多种前述生物学特征，或它们的任何组合。所述抗体的生物学特征的前述列表并非旨在穷举。通过审阅本公开内容(包括本文中的工作实施例)，本领域普通技术人员会明白本文提供的抗体的其他生物学特征。
抗体-药物缀合物(ADC)
本文提供了抗体-药物缀合物(ADC)，其包含缀合至治疗部分(诸如细胞毒性剂、化学治疗药物或放射性同位素)的HER2xHER2双特异性抗原结合蛋白。
细胞毒性剂包括对细胞的生长、存活或繁殖有害的任何试剂，包括、但不限于微管蛋白相互作用剂和DNA损伤剂。在一些实施方案中，细胞毒性剂是微管蛋白抑制剂。在特定实施方案中，微管蛋白抑制剂抑制微管蛋白聚合。在一些实施方案中，细胞毒性有效负载是拓扑异构酶I抑制剂。在一些实施方案中，细胞毒性剂是拟美坦辛、澳瑞他汀(auristatin)、半甾林(hemiasterlin)、长春花碱、长春新碱、吡咯并苯并二氮杂草、紫杉醇、多西紫杉醇、念珠藻素(cryptophycin)、微管溶素或喜树碱。根据本公开的该方面，可以缀合至抗HER2抗体的合适的细胞毒性剂和化学治疗剂的实例还包括，例如，1-(2氯乙基)-1，2-二甲磺酰肼、1，8-二羟基-双环[7.3.1]三癸-4，9-二烯-2，6-二炔-13-酮、1-脱氢睾酮、5-氟尿嘧啶、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、9-氨基喜树碱、放线菌素D、鹅膏菌素(amanitin)、氨基蝶呤、蛇形菌素(anguidine)、蒽环、蒽霉素(AMC)、澳瑞他汀、博来霉素(bleomycin)、白消安(busulfan)、丁酸、加利车霉素(calicheamicin)(例如，加利车霉素1)、喜树碱、洋红霉素(carminomycin)、卡莫司汀(carmustine)、西马多丁(cemadotin)、顺铂、秋水仙素(colchicin)、考布他汀(combretastatin)、环磷酰胺、阿糖胞苷、细胞松弛素B(cytochalasin B)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、达卡巴嗪(decarbazine)、双乙酰氧基戊基多柔比星(diacetoxypentyldoxorubicin)、二溴甘露糖醇、二羟蒽二酮、双萨拉唑(disorazole)、多拉司他汀(dolastatin)(例如，多拉司他汀10)、多柔比星(doxorubicin)、倍癌霉素(duocarmycin)、棘霉素(echinomycin)、五加素(eleutherobin)、依米丁(emetine)、埃博霉素(epothilone)、埃斯波霉素(esperamicin)、雌莫司汀(estramustine)、溴化乙锭、依托泊苷(etoposide)、氟尿嘧啶、格尔德霉素(geldanamycin)、短杆菌肽D、糖皮质激素、伊立替康(irinotecan)、驱动蛋白纺锤体蛋白(KSP)抑制剂、细霉素(leptomycin)、洛诺生(leurosine)、利多卡因(lidocaine)、洛莫司汀(CCNU)、拟美坦辛、双氯乙基甲胺、美法仑(melphalan)、巯基嘌呤、甲基叶酸(methopterin)、氨甲蝶呤、光神霉素(mithramycin)、丝裂霉素(mitomycin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、N8-乙酰亚精胺、鬼臼毒素(podophyllotoxin)、普鲁卡因(procaine)、普萘洛尔(propranolol)、蝶啶、嘌呤霉素、吡咯并苯并二氮杂草(PBD)、根霉素(rhizoxin)、链脲佐菌素(streptozotocin)、太利苏霉素(tallysomycin)、紫杉醇、替诺泊苷(tenoposide)、丁卡因(tetracaine)、噻替派苯丁酸氮芥(thioepa chlorambucil)、托马霉素(tomaymycin)、托泊替康(topotecan)、微管溶素、长春花碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)、长春地辛(vindesine)、长春瑞滨(vinorelbine)以及前述中的任一者的衍生物。根据某些实施方案，缀合至抗HER2抗体的细胞毒性剂是拟美坦辛，诸如DM1或DM4、托马霉素衍生物或多拉司他汀衍生物。根据某些实施方案，缀合至抗HER2抗体的细胞毒性剂是澳瑞他汀，诸如MMAE、MMAF或其衍生物。在一些实施方案中，细胞毒性剂是Dxd或其衍生物。在一些实施方案中，细胞毒性剂是AZ13599185(参见例如，Li等人，2016Cancer Cell29，117-129)。本领域已知的其他细胞毒性剂被考虑在本公开的范围内，包括例如蛋白质毒素，例如蓖麻毒素、艰难梭菌毒素、假单胞菌外毒素、蓖麻毒素、白喉毒素、肉毒杆菌毒素、异株泻根毒蛋白、皂草素、商陆毒素(即，商陆皂苷(phytolaccatoxin)和商陆皂苷元(phytolaccigenin))，以及其他毒素，诸如Sapra等人，Pharmacol.&Therapeutics，2013，138：452-469所示的那些毒素。在一些实施方案中，细胞毒性剂是微管溶素、拟美坦辛或喜树碱。
在某些实施方案中，细胞毒性剂是微管溶素。合适的微管溶素包括在2019年12月20日提交的美国专利申请16/724,164中描述的那些。在一些实施方案中，微管溶素是来自2019年12月20日提交的美国专利申请号16/724,164的化合物IVa、IVa’、IVb、IVc、IVd、IVe、IVf、IVg、IVh、IVj、IVk、IV-l、IVm、IVn、IVo、IVp、IVq、IVr、IVs、IVt、IVu、IVvA、IVvB、IVw、IVx、IVy、Va、Va’、Vb、Vc、Vd、Ve、Vf、Vg、Vh、Vi、Vj、Vk、Via、VIb、VIc、VId、VIe、VIf、VIg、VIh、VI、VIi、VII、VIII、IX、X、D-5a或D-5c。在某些实施方案中，微管溶素是2019年12月20日提交的美国专利申请号16/724,164中的化合物Ve。在一些实施方案中，微管溶素具有以下结构：
Figure BDA0003817518590000321
微管溶素1A
微管溶素1A可以使用2019年12月20日提交的US16/724,164中公开的方法来制备。
在某些实施方案中，所述细胞毒性剂是拟美坦辛，例如美坦辛的衍生物。合适的拟美坦辛包括DM1、DM4或其衍生物、立体异构体或同位素体。合适的拟美坦辛也包括、但不限于在WO 2014/145090A1、WO 2015/031396A1、US 2016/0375147A1和US 2017/0209591A1(通过引用整体并入本文)中公开的那些。在一些实施方案中，拟美坦辛是DM1。
在某些实施方案中，所述拟美坦辛具有以下结构：
Figure BDA0003817518590000331
其中A是任选地被取代的亚芳基或亚杂芳基。
在某些实施方案中，所述拟美坦辛具有以下结构：
Figure BDA0003817518590000332
其中A是任选地被取代的亚芳基或亚杂芳基。
在某些实施方案中，所述拟美坦辛具有以下结构：
Figure BDA0003817518590000333
其中n是1-12的整数且R1是烷基。
在某些实施方案中，所述拟美坦辛是：
Figure BDA0003817518590000341
Figure BDA0003817518590000351
Figure BDA0003817518590000361
Figure BDA0003817518590000371
在某些实施方案中，所述拟美坦辛是：
Figure BDA0003817518590000372
在某些实施方案中，所述拟美坦辛是：
Figure BDA0003817518590000373
在一些实施方案中，细胞毒性剂是喜树碱，例如喜树碱的类似物或衍生物。在一些实施方案中，HER2xHER2双特异性抗原结合蛋白例如抗体缀合至依沙替康(cxatccan)、德鲁替康(dcruxtccan)、DX-8951、DXd、喜树碱或其衍生物或类似物。在特定实施方案中，细胞毒性剂是DXd。在特定实施方案中，细胞毒性剂是：
Figure BDA0003817518590000381
本文还提供了包含缀合至一种或多种放射性核素的抗HER2抗体的抗体-放射性核素缀合物(ARC)。可以在本公开内容的该方面的上下文中使用的示例性放射性核素包括、但不限于例如225Ac、212Bi、213Bi、131I、186Re、227Th、222Rn、223Ra、224Ra和90Y。
在本文提供的某些实施方案中，提供了包含通过接头分子缀合至细胞毒性剂(例如，上文公开的细胞毒性剂中的任一者)的HER2xHER2双特异性抗原结合蛋白的ADC。接头是将本文描述的抗体或抗原结合蛋白与治疗部分(例如细胞毒性剂)连接、联结或键合的任何基团或部分。例如，合适的接头可见于Antibody-Drug Conjugates and Immunotoxins；Phillips，G.L.编；Springer Verlag：New York，2013；Antibody-Drug Conjugates；Ducry，L.编；Humana Press，2013；Antibody-Drug Conjugates；Wang，J.，Shen，W.-C.和Zaro，J.L.编；Springer International Publishing，2015，每篇文献的内容均以引用的方式整体并入本文。通常，本文描述的抗体缀合物的合适的结合剂接头是这样的接头，其足够稳定以利用抗体的循环半衰期，并且同时能够在抗原介导的缀合物内化后释放其有效负载。接头可以是可切割的或不可切割的。可切割的接头包括在内化后被细胞内代谢切割的接头，例如通过水解、还原或酶促反应切割。不可切割的接头包括在内化后通过抗体的溶酶体降解而释放附着的有效负载的接头。合适的接头包括、但不限于酸不稳定的接头、水解不稳定的接头、酶可切割的接头、还原不稳定的接头、自降解的(self-immolative)接头和不可切割的接头。合适的接头还包括、但不限于为或包含以下的那些：肽、葡萄糖醛酸苷、琥珀酰亚胺-硫醚、聚乙二醇(PEG)单元、腙、马来酰亚胺基-已酰基(mal-caproyl)单元、二肽单元、缬氨酸-瓜氨酸单元和对-氨基苄基(PAB)单元。
本领域已知的任何接头分子或接头技术均可用于产生或构建本公开的ADC。在某些实施方案中，所述接头是可切割的接头。根据其他实施方案，所述接头是不可切割的接头。可以在本公开内容的上下文中使用的示例性接头包括包含或由以下组成的接头：例如，MC(6-马来酰亚胺基己酰基)、MP(马来酰亚胺基丙酰基)、val-cit(缬氨酸-瓜氨酸)、val-ala(缬氨酸-丙氨酸)、蛋白酶可切割接头中的二肽位点、ala-phe(丙氨酸-苯丙氨酸)、蛋白酶可切割接头中的二肽位点、PAB(对氨基苄氧基羰基)、SPP(N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基硫基)戊酸酯)、SMCC(N-琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1甲酸酯)、SIAB(N-琥珀酰亚胺基(4-碘-乙酰基)氨基苯甲酸盐)及其变体和组合。可以在本公开内容的上下文中使用的接头的其他实例提供于，例如，US 7,754,681和Ducry，Bioconjugate Chem.，2010，21：5-13，和其中引用的参考文献，它们的内容通过引用整体并入本文。
在某些实施方案中，所述接头在生理条件下是稳定的。在某些实施方案中，所述接头是可切割的，例如，在酶存在下或在特定pH范围或值下能够释放至少有效负载部分。在某些实施方案中，接头包含酶可切割的部分。示例性的酶可切割部分包括、但不限于肽键、酯键、腙和二硫键。在某些实施方案中，接头包含组织蛋白酶可切割的接头。
在某些实施方案中，所述接头包含不可切割的部分。
合适的接头还包括、但不限于与单个结合剂(例如抗体)的两个半胱氨酸残基化学键合的那些。这样的接头可用于模仿由于缀合过程而被破坏的抗体的二硫键。
在某些实施方案中，所述接头包含一个或多个氨基酸。在一些实施方案中，接头包含两个氨基酸。在一些实施方案中，接头包含三个氨基酸。在一些实施方案中，接头包含四个氨基酸。合适的氨基酸包括天然的、非天然的、标准的、非标准的、蛋白原的、非蛋白原的氨基酸以及L-氨基酸或D-氨基酸。在某些实施方案中，所述接头包含丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸或瓜氨酸、其衍生物或其组合。在某些实施方案中，氨基酸的一个或多个侧链与侧链基团连接，如下所述。在某些实施方案中，所述接头包含缬氨酸和瓜氨酸。在某些实施方案中，所述接头包含赖氨酸、缬氨酸和瓜氨酸。在某些实施方案中，所述接头包含赖氨酸、缬氨酸和丙氨酸。在某些实施方案中，所述接头包含缬氨酸和丙氨酸。在一些实施方案中，接头包含二肽、三肽或四肽。在一些实施方案中，接头包含肽，其中肽是缬氨酸-瓜氨酸(val-cit或VC)、谷氨酸-缬氨酸-瓜氨酸(EVC)或甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸(GGFC)。
在某些实施方案中，所述接头包含自降解的基团。自降解的基团可以是技术人员已知的任何这样的基团。在特定的实施方案中，自降解的基团是对氨基苄基(PAB)或其衍生物。有用的衍生物包括对氨基苄氧基羰基(PABC)。在一些实施方案中，接头包含具有以下结构的部分：
Figure BDA0003817518590000401
技术人员将认识到，自降解的基团能够进行化学反应，所述反应从有效负载释放接头的剩余原子。
在一些实施方案中，所述接头是：
Figure BDA0003817518590000402
其中
Figure BDA0003817518590000403
是与抗体或抗原结合蛋白的键(例如，经由赖氨酸残基)且
Figure BDA0003817518590000404
是与细胞毒性剂(例如，DM1)的键。在一些实施方案中，所述接头是：
Figure BDA0003817518590000411
其中
Figure BDA0003817518590000412
是与抗体或抗原结合蛋白的键(例如，经由赖氨酸残基)且
Figure BDA0003817518590000413
是与细胞毒性剂(例如，DM1)的键。在某些实施方案中，所述接头是：
Figure BDA0003817518590000414
在某些实施方案中，所述接头是：
Figure BDA0003817518590000415
在一些实施方案中，所述接头衍生自马来酰亚胺基甲基-4-反式-环已烷羧基琥珀酸酯：
Figure BDA0003817518590000416
在一些实施方案中，所述接头是：
Figure BDA0003817518590000421
其中
Figure BDA0003817518590000422
是与抗体或抗原结合蛋白的键(例如，经由赖氨酸残基)且
Figure BDA0003817518590000423
是与细胞毒性剂(例如，具有下式的化合物)的键：
Figure BDA0003817518590000424
合适的接头还包括但不限于包含一个或多个环状部分的接头。在一些实施方案中，环状部分衍生自环加成反应。在某些实施方案中，环状部分衍生自叠氮化物和炔烃(例如环炔烃)之间的1-3-环加成反应。在一些实施方案中，环状部分是
Figure BDA0003817518590000425
在一些实施方案中，接头包含一个或多个间隔基。合适的间隔基包括连接，例如共价或通过离子相互作用连接两个接头部分的部分，一个接头部分具有有效负载，或另一个接头部分具有抗体。在某些实施方案中，间隔基是PEG基团。
本公开包括ADC，其中接头通过抗体或抗原结合分子内的特定氨基酸处的附接将HER2xHER2双特异性抗原结合蛋白连接至药物或细胞毒素。可以在该方面的上下文中使用的示例性氨基酸连接，例如，赖氨酸(参见，例如，US 5,208,020；US 2010/0129314；Hollander等人，Bioconjugate Chem.，2008，19：358-361；WO 2005/089808；US 5,714,586；US 2013/0101546；和US 2012/0585592)、半胱氨酸(参见，例如，US 2007/0258987；WO2013/055993；WO 2013/055990；WO 2013/053873；WO 2013/053872；WO 2011/130598；US2013/0101546；和US 7,750,116)、硒代半胱氨酸(参见，例如，WO 2008/122039；和Hofer等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，2008，105：12451-12456)、甲酰基甘氨酸(参见，例如，Carrico等人，Nat.Chem.Biol.，2007，3：321-322；Agarwal等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，2013，110：46-51，和Rabuka等人，Nat.Protocols，2012，10：1052-1067)、非天然氨基酸(参见，例如，WO 2013/068874，和WO 2012/166559)和酸性氨基酸(参见，例如，WO 2012/05982)。接头也可以通过与碳水化合物(参见，例如，US 2008/0305497，WO 2014/065661，和Ryan等人，Food&Agriculture Immunol.，2001，13：127-130)和二硫键接头(参见，例如，WO2013/085925，WO 2010/010324，WO 2011/018611，和Shaunak等人，Nat.Chem.Biol.，2006，2：312-313)的连接而缀合至抗原结合蛋白。还可以使用位点特异性的缀合技术来指导缀合至抗体或抗原结合蛋白的特定残基(参见，例如，Schumacher等人.J Clin Immunol(2016)36(增刊1)：100)。位点特异性缀合技术包括但不限于通过谷氨酰胺转胺酶进行的谷氨酰胺缀合(参见例如，Schibli，Angew Chemie Inter Ed.2010，49，9995)。
根据某些实施方案，本公开提供了ADC，其中如本文所述的HER2xHER2双特异性抗原结合蛋白缀合至如国际专利公开WO2014/145090中所示的接头-药物组合物(例如，化合物“7”，在本文中也称为“M0026”并且在下文中有所描述)，该专利的公开内容据此以引用的方式整体并入本文：
Figure BDA0003817518590000431
本文还提供了包含本文公开的单特异性抗HER2抗体和HER2xHER2双特异性抗体的抗体-药物缀合物，其中所述HER2xHER2双特异性抗体缀合至细胞毒性剂。在某些实施方案中，所述细胞毒性剂是拟美坦辛。在某些实施方案中，所述拟美坦辛是具有下式的化合物：
Figure BDA0003817518590000441
其中n是1-12的整数且R1是烷基。在某些实施方案中，所述拟美坦辛是
Figure BDA0003817518590000442
在某些实施方案中，所述细胞毒性剂是拟美坦辛，且所述拟美坦辛通过不可切割的接头共价连接至抗体。在某些实施方案中，所述细胞毒性剂是拟美坦辛，且所述拟美坦辛通过可切割的接头共价连接至双特异性抗体。
在一个实施方案中，双特异性抗体缀合至：
Figure BDA0003817518590000443
其中
Figure BDA0003817518590000444
是与抗体的键。
在一个实施方案中，双特异性抗体缀合至：
Figure BDA0003817518590000451
其中
Figure BDA0003817518590000452
是与抗体的键。
在一个实施方案中，双特异性抗体缀合至：
Figure BDA0003817518590000453
其中
Figure BDA0003817518590000454
是与抗体的键。
在一个实施方案中，双特异性抗体缀合至：
Figure BDA0003817518590000455
其中
Figure BDA0003817518590000456
是与抗体的键。
在一些实施方案中，双特异性抗体缀合至：
Figure BDA0003817518590000461
其中L是接头，并且
Figure BDA0003817518590000462
是与抗体连接的键。
在一些实施方案中，双特异性抗体缀合至：
Figure BDA0003817518590000463
或其区域异构体，其中SP是间隔基并且
Figure BDA0003817518590000464
是与抗体连接的键。
在一些实施方案中，双特异性抗体缀合至：
Figure BDA0003817518590000465
或
其区域异构体，其中
Figure BDA0003817518590000466
是与抗体的谷氨酰胺残基连接的键。在某些实施方案中，谷氨酰胺是重链Q295谷氨酰胺。在某些实施方案中，双特异性抗体缀合至重链Q295和Q297，其中所述Q297来源于N297Q突变。
在某个实施方案中，双特异性抗体缀合至：
Figure BDA0003817518590000471
其中
Figure BDA0003817518590000472
是与抗体的谷氨酰胺残基连接的键。在某些实施方案中，谷氨酰胺是重链Q295谷氨酰胺。在某些实施方案中，双特异性抗体缀合至重链Q295和Q297，其中所述Q297来源于N297Q突变。
在某些实施方案中，所述缀合物具有以下结构：
Ab-[L-Pay]n
其中：
Ab是如本文所述的HER2xHER2双特异性抗原结合蛋白；
L是接头；
Pay是细胞毒性剂；且
n为1-12的整数。
在一些实施方案中，n为2。在一些实施方案中，n为4。在某些实施方案中，Pay是：
Figure BDA0003817518590000481
(微管溶素1a)。
在某些实施方案中，L是可切割的接头。在一些实施方案中，L包含肽。在一些实施方案中，L包含val-cit。在一些实施方案中，L包含
Figure BDA0003817518590000482
在一些实施方案中，L包含PEG基团。在一些实施方案中，L包含环状部分。在某些实施方案中，环状部分是叠氮化物和环炔烃之间的1，3-环加成的产物。在一些实施方案中，-L-Pay是
Figure BDA0003817518590000483
其中SP1和SP2各自独立地是间隔基，
Figure BDA0003817518590000484
是环状部分，并且
Figure BDA0003817518590000485
是与重链谷氨酰胺连接的键。在一些实施方案中，谷氨酰胺是Q295谷氨酰胺。在一些实施方案中，n为2，其中两个L-Pay缀合至Q295。在一些实施方案中，n为4，其中两个L-Pay缀合至Q295，并且两个L-Pay缀合至Q297。在一些实施方案中，环状部分是环加成反应的产物。在某些实施方案中，环状部分是叠氮化物和环炔烃之间的环加成反应的产物。
在某些实施方案中，环状部分是
Figure BDA0003817518590000486
在某些实施方案中，SP1包含PEG部分。在某些实施方案中，Sp2包含二肽。在某些实施方案中，SP2包含val-cit。在某些实施方案中，SP2包含
Figure BDA0003817518590000491
在某些实施方案中，SP2包含PEG部分。在一些实施方案中，SP2-Pay是：
Figure BDA0003817518590000492
在某些实施方案中，
Figure BDA0003817518590000493
是
Figure BDA0003817518590000494
或其区域异构体。
在某些实施方案中，
Figure BDA0003817518590000495
是
Figure BDA0003817518590000501
(微管溶素1b)或其区域异构体，其中
Figure BDA0003817518590000502
是与抗体连接的键。
在一些实施方案中，Ab缀合至WO2015/157592中公开的接头-有效负载或有效负载，例如其中公开的化合物T32。在一些实施方案中，Ab缀合至德鲁替康(DXd)，任选地通过包含GGFG的接头缀合。
在一些实施方案中，Ab是HER2xHER2双特异性抗原结合蛋白，其包含SEQ ID NO：2的D1-HCVR氨基酸序列内的CDR和SEQ ID NO：10的D2-HCVR氨基酸序列内的CDR。在一些方面，HER2xHER2双特异性抗原结合蛋白还包含在SEQ ID NO：18的LCVR氨基酸序列内的CDR。在一些实施方案中，Ab是HER2xHER2双特异性抗原结合蛋白，其包含SEQ ID NO：2的D1-HCVR氨基酸序列和SEQ ID NO：10的D2-HCVR氨基酸序列。在一些方面，HER2xHER2双特异性抗原结合蛋白还包含在SEQ ID NO：18的LCVR氨基酸序列。
在一些实施方案中，Ab是HER2xHER2双特异性抗原结合蛋白，其包含SEQ ID NO：32的D1-HCVR氨基酸序列内的CDR和SEQ ID NO：40的D2-HCVR氨基酸序列内的CDR。在一些方面，HER2xHER2双特异性抗原结合蛋白还包含在SEQ ID NO：18的LCVR氨基酸序列内的CDR。在一些实施方案中，Ab是HER2xHER2双特异性抗原结合蛋白，其包含SEQ ID NO：32的D1-HCVR氨基酸序列和SEQ ID NO：40的D2-HCVR氨基酸序列。在一些方面，HER2xHER2双特异性抗原结合蛋白还包含在SEQ ID NO：18的LCVR氨基酸序列。
在某些实施方案中，L是可切割的接头。在某些实施方案中，L是不可切割的接头。在某些实施方案中，L包含二肽。在某些实施方案中，L包含PAB部分。
在某些实施方案中，L包含具有以下结构的部分：
Figure BDA0003817518590000511
在某些实施方案中，L包含具有以下结构的部分：
Figure BDA0003817518590000512
在某些实施方案中，L包含具有以下结构的部分：
Figure BDA0003817518590000513
在某些实施方案中，L包含具有以下结构的部分：
Figure BDA0003817518590000514
在一些实施方案中，Pay是微管溶素。
在某些实施方案中，Pay是拟美坦辛。
在某些实施方案中，Pay是：
Figure BDA0003817518590000521
其中R1是烷基。
在某些实施方案中，Pay是：
Figure BDA0003817518590000522
在某些实施方案中，Pay是：
Figure BDA0003817518590000523
在某些实施方案中，n是2至5的整数。
在某些实施方案中，-L-Pay是：
Figure BDA0003817518590000531
其中
Figure BDA0003817518590000532
是与抗体的键。
在某些实施方案中，-L-Pay是：
Figure BDA0003817518590000533
其中
Figure BDA0003817518590000534
是与抗体的键。
在某些实施方案中，-L-Pay是
Figure BDA0003817518590000535
其中
Figure BDA0003817518590000536
是与抗体的键。
在某些实施方案中，-L-Pay是：
Figure BDA0003817518590000541
其中
Figure BDA0003817518590000542
是与抗体的键。
在一些实施方案中，-Pay是：
Figure BDA0003817518590000543
在某些实施方案中，-L-Pay是：
Figure BDA0003817518590000544
在特定实施方案中，L-Pay是
Figure BDA0003817518590000545
并且n为2。
在一些实施方案中，
缀合物具有以下结构：
Ab-[L-Pay]n
其中：
Ab是HER2xHER2双特异性抗原结合蛋白，其包含SEQ ID NO：2的D1-HCVR氨基酸序列和SEQ ID NO：10的D2-HCVR氨基酸序列；
L-Pay是
Figure BDA0003817518590000551
其中
Figure BDA0003817518590000552
是与抗原结合蛋白的键；且n是2-5的整数。
在某些实施方案中，所述缀合物具有以下结构：
Ab-[L-Pay]n
其中：
Ab是HER2xHER2双特异性抗原结合蛋白，其包含SEQ ID NO：2的D1-HCVR氨基酸序列和SEQ ID NO：10的D2-HCVR氨基酸序列；
L-Pay是
Figure BDA0003817518590000561
其中
Figure BDA0003817518590000562
是与抗原结合蛋白的键；且n是2-5的整数。
在某些实施方案中，所述缀合物具有以下结构：
Ab-[L-Pay]n
其中：
Ab是HER2xHER2双特异性抗原结合蛋白，其包含SEQ ID NO：2的D1-HCVR氨基酸序列和SEQ ID NO：10的D2-HCVR氨基酸序列；
L-Pay是
Figure BDA0003817518590000563
其中
Figure BDA0003817518590000564
是与抗原结合蛋白的键；且n是2-5的整数。
在某些实施方案中，所述缀合物具有以下结构：
Ab-[L-Pay]n
其中：
Ab是HER2xHER2双特异性抗原结合蛋白，其包含SEQ ID NO：2的D1-HCVR氨基酸序列和SEQ ID NO：10的D2-HCVR氨基酸序列；
L-Pay是
Figure BDA0003817518590000571
其中
Figure BDA0003817518590000572
是与抗原结合蛋白的键；且n是2-5的整数。
在某些实施方案中，所述缀合物具有以下结构：
Ab-[L-Pay]n
其中：
Ab是HER2xHER2双特异性抗原结合蛋白，其包含SEQ ID NO：32的D1-HCVR氨基酸序列和SEQ ID NO：40的D2-HCVR氨基酸序列；
L-Pay是
Figure BDA0003817518590000573
其中
Figure BDA0003817518590000574
是与抗原结合蛋白的键；且n是2-5的整数。
在某些实施方案中，所述缀合物具有以下结构：
Ab-[L-Pay]n
其中：
Ab是HER2xHER2双特异性抗原结合蛋白，其包含SEQ ID NO：32的D1-HCVR氨基酸序列和SEQ ID NO：40的D2-HCVR氨基酸序列；
L-Pay是
Figure BDA0003817518590000581
其中
Figure BDA0003817518590000582
是与抗原结合蛋白的键；且n是2-5的整数。
在某些实施方案中，所述缀合物具有以下结构：
Ab-[L-Pay]n
其中：
Ab是HER2xHER2双特异性抗原结合蛋白，其包含SEQ ID NO：32的D1-HCVR氨基酸序列和SEQ ID NO：40的D2-HCVR氨基酸序列；
L-Pay是
Figure BDA0003817518590000583
其中
Figure BDA0003817518590000584
是与抗原结合蛋白的键；且n是2-5的整数。
在某些实施方案中，所述缀合物具有以下结构：
Ab-[L-Pay]n
其中：
Ab是HER2xHER2双特异性抗原结合蛋白，其包含SEQ ID NO：32的D1-HCVR氨基酸序列和SEQ ID NO：40的D2-HCVR氨基酸序列；
L-Pay是
Figure BDA0003817518590000591
其中
Figure BDA0003817518590000592
是与抗原结合蛋白的键；且n是2-5的整数。
在某些实施方案中，所述缀合物具有以下结构：
Ab-[L-Pay]n
其中：
Ab是HER2xHER2双特异性抗原结合蛋白，其包含SEQ ID NO：2的D1-HCVR氨基酸序列和SEQ ID NO：10的D2-HCVR氨基酸序列；Pay是
Figure BDA0003817518590000593
其中
Figure BDA0003817518590000594
是与抗原结合蛋白的键；且n是2-5的整数。
在某些实施方案中，所述缀合物具有以下结构：
Ab-[L-Pay]n
其中：
Ab是HER2xHER2双特异性抗原结合蛋白，其包含SEQ ID NO：32的D1-HCVR氨基酸序列和SEQ ID NO：40的D2-HCVR氨基酸序列；Pay是
Figure BDA0003817518590000601
其中
Figure BDA0003817518590000602
是与抗原结合蛋白的键；且n是2-5的整数。
在某些实施方案中，所述缀合物具有以下结构：
Ab-[L-Pay]n
其中：
Ab是HER2xHER2双特异性抗原结合蛋白，其包含SEQ ID NO：2的D1-HCVR氨基酸序列和SEQ ID NO：10的D2-HCVR氨基酸序列；
L-Pay是
Figure BDA0003817518590000603
其中
Figure BDA0003817518590000604
是与重链谷氨酰胺连接的键。在一些实施方案中，n为2。在某些实施方案中，n为2，并且L-Pay与Q295谷氨酰胺键合。在一些实施方案中，n为4。在某些实施方案中，n为4，并且L-Pay与Q295和Q297谷氨酰胺键合。
在某些实施方案中，所述缀合物具有以下结构：
Ab-[L-Pay]n
其中：
Ab是HER2xHER2双特异性抗原结合蛋白，其包含SEQ ID NO：32的D1-HCVR氨基酸序列和SEQ ID NO：40的D2-HCVR氨基酸序列；
L-Pay是
Figure BDA0003817518590000611
其中
Figure BDA0003817518590000612
是与重链谷氨酰胺连接的键。在一些实施方案中，n为2。在某些实施方案中，n为2，并且L-Pay与Q295谷氨酰胺键合。在一些实施方案中，n为4。在某些实施方案中，n为4，并且L-Pay与Q295和Q297谷氨酰胺键合。
在某些实施方案中，所述缀合物具有以下结构：
Ab-[L-Pay]n
其中：
Ab是HER2xHER2双特异性抗原结合蛋白，其包含SEQ ID NO：2的D1-HCVR氨基酸序列和SEQ ID NO：10的D2-HCVR氨基酸序列；Pay是
Figure BDA0003817518590000621
在某些实施方案中，所述缀合物具有以下结构：
Ab-[L-Pay]n
其中：
Ab是HER2xHER2双特异性抗原结合蛋白，其包含SEQ ID NO：32的D1-HCVR氨基酸序列和SEQ ID NO：40的D2-HCVR氨基酸序列；Pay是
Figure BDA0003817518590000622
在某些实施方案中，所述缀合物具有以下结构：
Ab-[L-Pay]n
其中：
Ab是HER2xHER2双特异性抗原结合蛋白，其包含SEQ ID NO：2的D1-HCVR氨基酸序列和SEQ ID NO：10的D2-HCVR氨基酸序列；
L-Pay是
Figure BDA0003817518590000631
其中
Figure BDA0003817518590000632
是与结合蛋白的重链谷氨酰胺连接的键。在一些实施方案中，n为2。在某些实施方案中，n为2，并且L-Pay与Q295谷氨酰胺键合。在一些实施方案中，n为4。在某些实施方案中，n为4，并且L-Pay与Q295和Q297谷氨酰胺键合。
在某些实施方案中，所述缀合物具有以下结构：
Ab-[L-Pay]n
其中：
Ab是HER2xHER2双特异性抗原结合蛋白，其包含SEQ ID NO：32的D1-HCVR氨基酸序列和SEQ ID NO：40的D2-HCVR氨基酸序列；
L-Pay是
Figure BDA0003817518590000633
其中
Figure BDA0003817518590000634
是与结合蛋白的重链谷氨酰胺连接的键。在一些实施方案中，n为2。在某些实施方案中，n为2，并且L-Pay与Q295谷氨酰胺键合。在一些实施方案中，n为4。在某些实施方案中，n为4，并且L-Pay与Q295和Q297谷氨酰胺键合。
本文所述的抗体药物缀合物可以使用本领域的普通技术人员已知的缀合条件来制备(参见，例如，Doronina等人Nature Biotechnology 2003，21，7，778，该文献以引用的方式整体并入本文)。在一些实施方案中，HER2xHER2双特异性抗原结合蛋白抗体药物缀合物通过使本文所述的HER2xHER2双特异性抗原结合蛋白接触包含所期望的接头和细胞毒性剂的化合物来制备，其中所述接头具有与抗体或抗原结合蛋白具有反应性的部分，例如，在抗体或抗原结合蛋白的所期望的残基处。
在一些实施方案中，本文提供的抗体药物缀合物在重链Q295或Q297谷氨酰胺处缀合。可以使用本领域已知的技术来制备包含重链Q297谷氨酰胺的抗体，例如通过N297Q突变。参见，例如，Bioconjugate Chem.2014，25，3，569(2014)。此类缀合方法可以提供具有2个或4个DAR的抗体药物缀合物。在一些实施方案中，此类方法包括通过在存在谷氨酰胺转胺酶的情况下使抗体与包含所述第一反应性部分的伯胺化合物反应来在重链谷氨酰胺处安装第一反应性部分，以产生在Q295和任选地Q297处包含第一反应性部分的抗体。该产物随后可以与具有接头和互补的第二反应性部分的有效负载反应，以产生本文提供的抗体-药物缀合物。在一些实施方案中，第一反应性部分是叠氮化物。在一些实施方案中，第二反应性部分是环炔烃。在一些实施方案中，具有接头和互补的第二反应性部分的有效负载是：
Figure BDA0003817518590000641
它可以使用2019年12月20日提交的美国专利申请号16/724,164中描述的方法来制备(例如，其中描述的化合物LP4)。在某些实施方案中，伯胺化合物是
Figure BDA0003817518590000651
在一些实施方案中，具有接头和互补的第二反应性部分的有效负载是：
Figure BDA0003817518590000652
在某些实施方案中，伯胺化合物是
Figure BDA0003817518590000653
在一些实施方案中，本文提供了用于制备抗体-药物缀合物的方法，所述方法包括使本文所述的HER2xHER2双特异性抗原结合蛋白接触具有下式A1的化合物：
Figure BDA0003817518590000654
A1
和水性稀释剂。
在某些实施方案中，式A1的化合物以化学计量过量存在。在某些实施方案中，式A1的化合物以5-6倍的化学计量过量存在。在某些实施方案中，水性稀释剂包含HEPES。在某些实施方案中，水性稀释剂包含DMA。
在某些实施方案中，式A1的化合物是式A2或A3的化合物：
Figure BDA0003817518590000661
A2
Figure BDA0003817518590000662
A3。
在一些实施方案中，式A2的化合物是A3立体异构纯的。在一些实施方案中，式A1化合物包括式A1或A2的化合物，其中A1或A2的化合物以超过50％的非对映异构体过量存在。在某些实施方案中，所述非对映异构体过量是超过70％。在某些实施方案中，所述非对映异构体过量是超过90％。在某些实施方案中，所述非对映异构体过量是超过95％。
术语“非对映异构体过量”表示期望的单一非对映异构体的摩尔分数与组合物中剩余的非对映异构体相比的差异。如下计算非对映异构体过量：(单一非对映异构体的量)-(其他非对映异构体的量)/l。例如，含有90％的1和10％的2、3、4或其混合物的组合物具有80％[(90-10)/1]的非对映异构体过量。含有95％的1和5％的2、3、4或其混合物的组合物具有90％[(95-5)/1]的非对映异构体过量。含有99％的1和1％的2、3、4或其混合物的组合物具有98％[(99-1)/1]的非对映异构体过量。对于1、2、3或4中的任何一种，可以类似地计算非对映异构体过量。
在某些实施方案中，式A1的化合物通过在存在硅胶和稀释剂的情况下使式(a)的化合物：
Figure BDA0003817518590000671
(a)
接触式(b)的化合物
Figure BDA0003817518590000672
(b)
来制备。在某些实施方案中，所述稀释剂包含有机溶剂和水。
本发明还提供了通过以下方法制备的产物：
(i)在存在硅胶和稀释剂的情况下使式(a)的化合物：
Figure BDA0003817518590000673
(a)
接触式(b)的化合物：
Figure BDA0003817518590000681
(b)
以合成中间体；以及
(ii)使本文所述的HER2xHER2双特异性抗原结合蛋白接触中间体和水性稀释剂。
在一些实施方案中，本文提供了用于制备抗体-药物缀合物的方法，所述方法包括使本文所述的HER2xHER2双特异性抗原结合蛋白接触具有下式B的化合物：
Figure BDA0003817518590000682
B
其中LG是离去基团。
在某些实施方案中，式B的化合物以化学计量过量存在。在某些实施方案中，式B化合物以5-6倍的化学计量过量存在。在某些实施方案中，水性稀释剂包含HEPES。在某些实施方案中，水性稀释剂包含DMA。在某些实施方案中，-C(O)-LG是酯，例如，NHS或三氟苯基酯。
在某些实施方案中，式B的化合物是式B1的化合物：
Figure BDA0003817518590000691
B1。
在某些实施方案中，如下制备式B1的化合物：使式C的化合物：
Figure BDA0003817518590000692
C
与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、肽偶联剂和有机稀释剂接触。合适的肽偶联剂包括对于与亲核体的反应而言激活(即，使具有反应性)羧酸部分的那些。在某些实施方案中，所述肽偶联剂是N-(3-二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)。在某些实施方案中，所述有机溶剂是二氯甲烷。
在某些实施方案中，如下制备式C的化合物：使式D的化合物：
Figure BDA0003817518590000693
D
与己二酸、肽偶联剂和有机溶剂接触。在某些实施方案中，所述肽偶联剂是2-乙氧基-1-乙氧基羰基-1，2-二氢喹啉(EEDQ)。在某些实施方案中，所述有机溶剂包含二氯甲烷。可以如在WO2014/145090中所述制备化合物D。
表位作图和有关的技术
抗体和抗原结合结构域结合的表位可以由3个或更多个(例如，3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个或更多个)HER2蛋白的氨基酸的单个邻接序列组成。或者，相关表位可以由多个HER2的非邻接氨基酸(或氨基酸序列)组成。
如本文别处，例如实施例21和22所述，HER2xHER2双特异性抗原结合分子的单独的抗原结合结构域(D1和D2)可以彼此相对结合至不同的、或非重叠的或部分重叠的表位。本文中使用的“部分重叠的表位”是指，通过本领域已知的任何表位作图方法(例如，X-射线晶体学、丙氨酸扫描诱变、氢/氘交换[HDX]、结构域切换等)所确定的，第一和第二表位共享少于5个、少于4个、少于3个或仅一个共同的氨基酸。D1和D2结构域可能彼此不具有竞争性。例如，在某些实施方案中，特定的HER2xHER2双特异性抗原结合分子的D1结构域与其在ErbB2上的表位的结合不抑制(或仅最低限度地抑制)HER2xHER2双特异性抗原结合分子的D2结构域与其在HER2上的表位的结合。由于D1和D2组分的各自的表位的非重叠(或至多部分重叠)性质，HER2xHER2双特异性抗原结合分子能够结合至细胞表面上的单个HER2分子。此外，HER2xHER2双特异性结合分子能够在细胞表面上的ErbB2处成簇，并且触发HER2内化。
可以使用本领域的普通技术人员已知的各种技术来确定与本公开的抗体和抗原结合结构域相互作用的HER2上的表位。可用于确定特定抗体或抗原结合结构域的表位或结合结构域的示例性技术包括例如点诱变(例如，丙氨酸扫描诱变、精氨酸扫描诱变等)、肽印迹分析(Reineke，2004，Methods Mol Biol 248：443-463)、蛋白酶保护和肽切割分析。此外，可以使用诸如表位切除、表位提取和抗原的化学修饰的方法(Tomer，2000，ProteinScience 9：487-496)。可用于鉴定与抗体相互作用的多肽内的氨基酸的另一种方法是通过质谱法检测的氢/氘交换。一般而言，氢/氘交换方法涉及对感兴趣的蛋白进行氘标记，然后使抗体与氘标记的蛋白结合。然后，将蛋白质/抗体复合物转移至水中，以允许氢-氘交换在除抗体保护的残基(仍然是氘标记的)之外的所有残基处发生。在抗体解离后，对靶蛋白进行蛋白酶裂解和质谱分析，从而揭示氘标记的残基，这些残基对应于与抗体相互作用的特定氨基酸。参见例如，Ehring(1999)Analytical Biochemistry 267(2)：252-259；Engen和Smith(2001)Anal.Chem.73：256A-265A。X-射线晶体结构分析也可用于鉴定抗体与之相互作用的多肽内的氨基酸。
本文还提供了HER2双特异性抗体，其结合至与本文所述的特定示例性抗体或抗原结合结构域中的任一者相同的表位(例如，包含本文的表1中列出的氨基酸序列中的任一者的抗体)。同样，本文还提供了HER2双特异性抗体，其与本文所述的特定示例性抗体中的任一者(例如，包含本文的表1中列出的氨基酸序列中的任一者的抗体)竞争与HER2的结合。
通过使用本领域已知的和本文示例的常规方法，可以容易地确定抗体是否结合至与参考抗HER2抗体相同的表位，或者竞争与参考抗LEPR抗体的结合。例如，为了确定测试抗体是否结合至与本文提供的参考抗HER2抗体相同的表位，使参考抗体结合至HER2蛋白。然后，评估测试抗体与HER2分子结合的能力。如果测试抗体在与参考抗HER2抗体饱和结合后能够结合至HER2，则可以得出以下结论：测试抗体结合至与参考抗HER2抗体不同的表位。在另一个方面，如果测试抗体在与参考抗HER2抗体饱和结合后不能与HER2分子结合，则测试抗体可以结合至与参考抗HER2抗体所结合的表位相同的表位。然后可以进行额外的例行实验(例如，肽突变和结合分析)以确认观察到的试验抗体的结合的缺乏是否实际上是由于与参考抗体结合相同的表位或者是否是空间阻断(或另一个现象)导致观察到的结合的缺乏。可以使用ELISA、RIA、Biacore、流式细胞计量术或本领域可获得的任何其他定量或定性抗体结合测定来进行这种实验。根据某些实施方案，如果在竞争性结合测定中测量到，例如一种抗体的1倍、5倍、10倍、20倍或100倍过量会使另一种抗体的结合抑制至少50％，但优选75％、90％或甚至99％，则两种抗体结合相同的(或重叠的)表位(参见，例如，Junghans等人，Cancer Res.1990：50：1495-1502)。可替换地，如果抗原中基本上所有的减少或消除一种抗体结合的氨基酸突变会减少或消除另一种抗体的结合，则认为这两种抗体结合相同的表位。如果减少或消除一种抗体结合的氨基酸突变的仅一个子集减少或消除另一种抗体的结合，则认为两种抗体具有“重叠的表位”。
为了确定抗体是否与参考抗HER2抗体竞争结合(或交叉竞争结合)，在两个方向上进行上述结合方法：在第一方向上，使参考抗体在饱和条件下结合至HER2蛋白，然后评估测试抗体与HER2分子的结合。在第二方向上，使测试抗体在饱和条件下与HER2分子结合，然后评估参考抗体与HER2分子的结合。如果在两个方向上只有第一(饱和)抗体能够与HER2分子结合，则可以得出以下结论：测试抗体和参考抗体竞争与HER2的结合。如本领域普通技术人员会理解的，与参考抗体竞争结合的抗体可能不一定与参考抗体结合相同的表位，但可能通过结合重叠或相邻的表位在空间上阻断参考抗体的结合。
人抗体的制备
本文提供的HER2xHER2双特异性抗体可以是完全人抗体。产生单克隆抗体(包括全人单克隆抗体)的方法是本领域已知的。任何此类已知的方法均可用于本公开的背景中，以制备特异性结合至人HER2的人抗体。
使用例如VELOCIMMUNETM技术，或用于产生完全人单克隆抗体的任何其他类似的已知方法，初始分离出具有人可变区和小鼠恒定区的针对HER2的高亲和力嵌合抗体。如下文实验部分所述，表征和选择抗体的所期望的特征，包括亲和力、二聚化阻断活性、选择性、表位等。如果需要，用所期望的人恒定区(例如野生型或经修饰的IgG1或IgG4)替换小鼠恒定区，以产生完全人抗HER2抗体。虽然所选择的恒定区可以根据具体用途而变化，但高亲和力抗原结合和目标特异性特征存在于可变区中。在某些情况下，直接从抗原阳性的B细胞中分离出完全人抗HER2抗体。
生物等效物
本文提供的HER2双特异性抗体和抗体片段涵盖具有不同于所述抗体的氨基酸序列但保留结合人HER2的能力的蛋白质。当与亲本序列对比时，这样的变体抗体和抗体片段包含氨基酸的一个或多个添加、缺失或置换，但显示出与所述抗体的生物学活性基本上等效的生物学活性。同样，本公开的编码抗HER2抗体的DNA序列涵盖这样的序列，所述序列与所公开的序列相比包含一个或多个核苷酸的添加、缺失或置换，但是编码与本公开的抗HER2抗体或抗体片段基本上生物等效的抗HER2抗体或抗体片段。以上讨论了这样的变体氨基酸和DNA序列的实例。
例如，如果两种抗原结合蛋白或抗体是药物等效物或药物替代物，即，当在相似的实验条件下以相同的摩尔剂量(单剂量或多剂量)施用时，其吸收速率和吸收程度没有显示显著差异，则认为它们是生物等效的。如果一些抗体在吸收程度上相同而在吸收速率上不同，则可被视为等效物或药物替代物，但仍可被认为是生物等效的，因为吸收速率的这种差异是有意的并且反映在说明书中，对于有效体内药物浓度的达到而言不是必需的(例如在长期使用中)，并且对于所研究的特定药物产品而言被认为是医学上无关紧要的。
在一个实施方案中，如果两种抗原结合蛋白在它们的安全性、纯度和效力方面没有临床上有意义的差异，则它们是生物等效的。
在一个实施方案中，如果与不进行参考产品和生物产品之间的切换的连续疗法相比，患者可以进行此类切换一次或多次，而没有预期的不良反应风险的增加，包括免疫原性的临床上显著的变化、或减少的有效性，则两种抗原结合蛋白是生物等效的。
在一个实施方案中，如果两种抗原结合蛋白都通过针对一个或多个使用条件的一种或多种共同作用机制来发挥作用，以达到此类机制是已知的程度，则所述两种抗原结合蛋白是生物等效的。
可以通过体内和体外方法证明生物等效性。生物等效性测量包括，例如，(a)在人或其他哺乳动物中的体内试验，其中在血液、血浆、血清或其他生物流体中测量抗体或其代谢物的浓度随时间的变化；(b)与人体内生物利用度数据相关并可合理预测人体内生物利用度数据的体外试验；(c)在人或其他哺乳动物中的体内试验，其中测量抗体(或其靶标)的适当急性药理作用随时间的变化；(d)在良好控制的临床试验中，确定抗体的安全性、效力或生物利用度或生物等效性。
本文提供的HER2双特异性抗体的生物等效变体可以通过例如对残基或序列进行各种置换或者使生物学活性不需要的末端或内部残基或序列缺失来构建。举例来说，可以缺失不是生物活性必需的半胱氨酸残基或用其他氨基酸替换，以防止在复性时形成不必要的或不正确的分子内二硫桥键。在其他情况下，生物等效抗体可以包括HER2双特异性抗体变体，所述HER2双特异性抗体变体包含修饰抗体的糖基化特征的氨基酸改变，例如消除或除去糖基化的突变。
物种选择性和物种交叉反应性
根据某些实施方案，本公开提供了结合至人HER2但不结合至来自其他物种的HER2的抗HER2抗体(和包含抗HER2抗原结合结构域的抗原结合分子)。本公开还包括结合至人HER2和结合至来自一种或多种非人物种的HER2的抗HER2抗体(和包含抗HER2抗原结合结构域的抗原结合分子)。例如，抗HER2抗体和抗原结合分子可以结合至人HER2并且可以结合至或不结合至小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、沙鼠、猪、猫、狗、兔、山羊、绵羊、奶牛、马、骆驼、食蟹猕猴、狨猴、恒河猴或黑猩猩HER2中的一者或多者，视情况而定。
多特异性抗体
如本文别处所述，本公开提供了包含两个不同的抗原结合结构域的双特异性抗原结合分子，其中第一抗原结合结构域(D1)结合HER2上的第一表位，并且其中第二抗原结合结构域(D2)结合HER2上的第二表位。在某些实施方案中，第一表位和/或第二表位在HER2的胞外结构域内，例如在SEQ ID NO：54内。在某些实施方案中，D1和D2结构域所结合的HER2上的第一表位和第二表位是不同的、或非重叠的、或部分重叠的。根据该方面，D1结构域可以包含本文表1所列的HCVR/LCVR或CDR氨基酸序列中的任一者，并且D2结构域可以包含本文表1所列的任何其他HCVR/LCVR或CDR氨基酸序列(只要D1结构域的结合特异性不同于D2结构域的结合特异性，和/或获得D1的抗原结合蛋白不与获得D2的抗原结合蛋白竞争与HER2的结合即可)。
在一些实施方案中，抗HER2x抗HER2双特异性抗体所结合的人HER2表位包含SEQID NO：54的氨基酸9-23(SEQ ID NO：57)、氨基酸41-51(SEQ ID NO：58)、氨基酸64-77(SEQID NO：59)、氨基酸133-148(SEQ ID NO：61)、氨基酸141-145(SEQ ID NO：155)、氨基酸152-161(SEQ ID NO：64)、氨基酸166-182(SEQ ID NO：56)、氨基酸174-182(SEQ ID NO：162)、氨基酸194-200(SEQ ID NO：163)、氨基酸258-273(SEQ ID NO：65)和/或氨基酸353-359(SEQID NO：60)。在一些实施方案中，人HER2的第一表位包含SEQ ID NO：54的氨基酸141-145和/或166-182；并且人HER2的第二表位包含SEQ ID NO：54的氨基酸9-23、41-51、64-67和/或353-359。在一些实施方案中，人HER2的第一表位包含SEQ ID NO：54的氨基酸133-148、174-182和/或194-200；并且人HER2的第二表位包含SEQ ID NO：54的氨基酸152-161、258-273和/或194-200。
可以在本公开内容的上下文中使用的示例性双特异性抗体形式涉及使用第一免疫球蛋白(Ig)CH3结构域和第二Ig CH3结构域，其中第一和第二Ig CH3结构域彼此相差至少一个氨基酸，并且其中与不具有氨基酸差异的双特异性抗体相比，至少一个氨基酸差异降低双特异性抗体与蛋白A的结合。在一个实施方案中，第一Ig CH3结构域结合蛋白A并且第二Ig CH3结构域含有降低或消除蛋白A结合的突变，例如H95R修饰(根据IMGT外显子编号；根据EU编号的H435R)。第二CH3还可以包含Y96F修饰(按照IMGT；按照EU的Y436F)。在第二CH3内可能发现的其他修饰包括：在IgG1抗体的情况下，D16E、L18M、N44S、K52N、V57M和V82I(按照IMGT；按照EU的D356E、L358M、N384S、K392N、V397M和V422I)；在IgG2抗体的情况下，N44S、K52N和V82I(IMGT；按照EU的N384S、K392N和V422I)；以及在IgG4抗体的情况下，Q15R、N44S、K52N、V57M、R69K、E79Q和V82I(按照IMGT；按照EU的Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q和V422I)。上述双特异性抗体形式的变化被涵盖在本公开内容的范围内。
可以在本公开内容的上下文中使用的其他示例性双特异性形式包括、但不限于，例如，基于scFv的或双抗体双特异性形式、IgG-scFv融合体、双重可变结构域(DVD)-Ig、四源杂交瘤(quadroma)、凸起-进入-孔洞、共同轻链(例如，具有凸起-进入-孔洞的共同轻链等)、CrossMab、CrossFab、(SEED)body、亮氨酸拉链、Duobody、IgG1/IgG2、双重作用Fab(DAF)-IgG和Mab2双特异性形式(关于前述形式的综述，参见，例如，Klein等人.2012，mAbs4：6，1-11，和其中引用的参考文献)。还可以使用肽/核酸缀合构建双特异性抗体，例如，其中使用具有正交化学反应性的非天然氨基酸来产生位点特异性抗体-寡核苷酸缀合物，然后将其自组装成具有确定组成、价数和几何形状的多聚体复合物。(参见，例如，Kazane等人，J.Am.Chem.Soc.[Epub：2012年12月4日])。
治疗制剂和施用
本文提供了药物组合物，其包含本发明的抗HER2抗体或HER2xHER2双特异性抗原结合分子，包括HER2xHER2 ADC。所述药物组合物可以用合适的载剂、赋形剂和提供改进的转移、递送、耐受性等的其他试剂配制。
抗体的治疗用途
本文提供的方法包括将治疗组合物施用于有需要的受试者，所述治疗组合物包含HER2xHER2双特异性抗原结合分子，包括HER2xHER2 ADC，所述HER2xHER2 ADC包含本文所述的D1和D2组分中的任一者。治疗组合物可以包含本文公开的HER2xHER2双特异性抗原结合分子中的任一者，包括HER2xHER2 ADC，以及药学上可接受的载剂或稀释剂。
HER2xHER2双特异性抗原结合分子，包括HER2xHER2 ADC，尤其可用于治疗、预防和/或改善与HER2表达、信号传导或活性相关的或由HER2表达、信号传导或活性介导的任何疾病或障碍，或者可通过阻断HER2二聚化、或者抑制HER2活性和/或信号传导、以及/或者促进受体内化以及/或者减少细胞表面受体数量来治疗的任何疾病或障碍。
例如，本公开的HER2xHER2双特异性抗原结合分子，包括HER2xHER2ADC，可用于治疗表达(或过表达)HER2的肿瘤。在一些实施方案中，HER2xHER2双特异性抗原结合分子，包括HER2xHER2 ADC，结合表达高水平的HER2的细胞，例如IHC3+。在一些实施方案中，HER2xHER2双特异性抗原结合分子，包括HER2xHER2 ADC，结合表达中等水平的HER2的细胞，例如IHC2+。在一些实施方案中，HER2xHER2双特异性抗原结合分子，包括HER2xHER2ADC，以较弱的方式结合表达低水平的HER2的细胞，例如IHC1+。
在一些实施方案中，HER2xHER2双特异性抗原结合分子，包括HER2xHER2ADC，表现出对表达中等或高水平的HER2的细胞的细胞杀伤作用，而不是对表达低水平的HER2的细胞的细胞杀伤作用。在一些方面，细胞杀伤小于约5％、小于约4％、小于约3％或小于约2％的表达低水平的HER2的细胞。
在某些实施方案中，HER2xHER2双特异性抗原结合分子，包括HER2xHER2 ADC，被用于治疗以下癌症中的一者或多者：乳腺癌、宫颈癌、胃癌(例如，具有HER2扩增的胃癌)、食道癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、胶质母细胞瘤、头颈癌(例如，头颈鳞状细胞癌[HNSCC])、卵巢癌、肺癌(例如，非小细胞肺癌[NSCLC])、小细胞肺癌、急性粒细胞性白血病、成人T细胞白血病、星形细胞瘤、膀胱癌、胆管癌、慢性骨髓性白血病、卡波西氏肉瘤、肾癌、平滑肌肉瘤、肝癌、淋巴瘤、恶性胶质瘤、恶性间皮瘤、黑素瘤、间皮瘤、MFH/纤维肉瘤、多发性骨髓瘤、鼻咽癌、骨肉瘤、胰腺癌、前列腺癌、肾细胞癌、横纹肌肉瘤、滑膜肉瘤、甲状腺癌和维尔姆斯瘤。
在一些方面，HER2xHER2双特异性抗原结合分子，包括HER2xHER2 ADC，可用于治疗表达高水平或中等水平的HER2的原发性和/或转移性肿瘤，即在大脑和脑膜、口咽、肺和支气管树、胃肠道、男性和女性生殖道、肌肉、骨骼、皮肤和附属物、结缔组织、脾、免疫系统、造血细胞和骨髓、肝和泌尿道、以及特殊感觉器官诸如眼睛产生的肿瘤。
在本文所述的治疗方法的背景下，HER2xHER2双特异性抗原结合分子，包括HER2xHER2ADC，可以作为单药疗法(即，作为唯一的治疗剂)施用、与一种或多种另外的治疗剂(所述治疗剂的实例在本文别处有所描述)组合施用、或作为ADC施用(所述ADC的实例也在本文别处有所描述)。
组合疗法和制剂
本文提供了组合物和治疗制剂，所述组合物和治疗制剂包含本文描述的抗HER2抗体和HER2xHER2双特异性抗原结合分子中的任一者，包括HER2xHER2 ADC，与一种或多种另外的治疗活性组分的组合，以及治疗方法，所述治疗方法包括将此类组合施用于有需要的受试者。
抗HER2抗体和HER2xHER2双特异性抗原结合分子，包括HER2xHER2ADC，可以与一种或多种另外的治疗活性组分共配制和/或组合施用，所述治疗活性组分选自由以下各项组成的组：Her2/ErbB2的另一种拮抗剂(例如，抗ErbB2[例如，曲妥珠单抗或T-DM1
Figure BDA0003817518590000781
，或曲妥珠单抗德鲁替康{T-SXD；DNA拓扑异构酶1抑制剂}]，或ErbB2活性的小分子抑制剂)、另一个EGFR家族成员诸如ErbB3或ErbB4的拮抗剂(例如，抗ErbB3或抗ErbB4抗体或者ErbB3或ErbB4活性的小分子抑制剂)、MET拮抗剂(例如，抗MET抗体[例如，奥那妥珠单抗、依玛妥珠单抗和H4H14639D]或MET的小分子抑制剂)、EGFR拮抗剂(例如，抗EGFR抗体[例如，西妥昔单抗或帕尼单抗]或EGFR的小分子抑制剂[例如，吉非替尼或厄洛替尼])、EGFRvIII的拮抗剂(例如，抗EGFRvIII抗体)、IGF1R拮抗剂(例如，抗IGF1R抗体)、B-raf抑制剂(例如，威罗非尼、索拉非尼、GDC-0879、PLX-4720)、PDGFR-α抑制剂(例如，抗PDGFR-α抗体)、PDGFR-β抑制剂(例如，抗PDGFR-β抗体或小分子激酶抑制剂，例如，甲磺酸伊马替尼或苹果酸舒尼替尼)、PDGF配体抑制剂(例如，抗PDGF-A抗体、抗PDGF-B抗体、抗PDGF-C抗体或抗PDGF-D抗体、适体、siRNA等)、VEGF拮抗剂(例如，VEGF-Trap，诸如阿柏西普，参见例如US 7,087,411(本文也称为“VEGF-抑制融合蛋白”)、抗VEGF抗体(例如，贝伐单抗)、VEGF受体的小分子激酶抑制剂(例如，舒尼替尼、索拉非尼或帕唑帕尼))、DLL4拮抗剂(例如，US 2009/0142354中公开的抗DLL4抗体，诸如REGN421)、Ang2拮抗剂(例如，US 2011/0027286中公开的抗Ang2抗体，诸如H1H685P)、FOLH1拮抗剂(例如，抗FOLH1抗体)、STEAP1或STEAP2拮抗剂(例如，抗STEAP1抗体或抗STEAP2抗体)、TMPRSS2拮抗剂(例如，抗TMPRSS2抗体)、MSLN拮抗剂(例如，抗MSLN抗体)、CA9拮抗剂(例如，抗CA9抗体)、尿溶蛋白拮抗剂(例如，抗尿溶蛋白[例如，抗UPK3A]抗体)、MUC16拮抗剂(例如，抗MUC16抗体)、Tn抗原拮抗剂(例如，抗Tn抗体)、CLEC12A拮抗剂(例如，抗CLEC12A抗体)、TNFRSF 17拮抗剂(例如，抗TNFRSF17抗体)、LGR5拮抗剂(例如，抗LGR5抗体)、单价CD20拮抗剂(例如，单价抗CD20抗体，诸如利妥昔单抗)、CD20xCD3双特异性抗体、PD-1阻断剂(例如，抗PD-1抗体，诸如帕博利珠单抗或纳武单抗)等。可以与本文提供的抗体联合有益地施用的其他药剂包括例如他莫昔芬、芳香酶抑制剂和细胞因子抑制剂，包括小分子细胞因子抑制剂和与细胞因子诸如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12、IL-13、IL-17、IL-18或其各自的受体结合的抗体。
示例性地，PD-1抑制剂诸如抗PD-1抗体可以与如本文所述的HER2xHER2抗体-药物缀合物组合。目标患者群体具体包括那些患有过表达HER2突变(例如，IHC2+或IHC3+)的肿瘤的患者，诸如患有表达HER2的乳腺癌的患者。
本文提供了组合物和治疗制剂，所述组合物和治疗制剂包含本文所述的抗HER2抗体和HER2xHER2双特异性抗原结合分子中的任一者，包括HER2xHER2 ADC，与一种或多种化学治疗剂的组合。化学治疗剂的实例包括：烷化剂类，例如，塞替派和环磷酰胺(CytoxanTM)；磺酸烷基酯类，例如，白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类，例如，苯佐替派(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturedopa)和乌瑞替派(uredopa)；乙烯亚胺类和甲基三聚氰胺类，包括六甲蜜胺(altretamine)、曲他胺(triethylenemelamine)、三乙烯磷酰胺(triethylenephosphoramide)、三乙烯硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三羟甲基三聚氰胺(trimethylomelamine)；氮芥类，例如，苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlomaphazine)、胆磷酰胺(chlorophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxidehydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；硝基脲类，例如，卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素类，例如，阿克拉霉素(aclacinomysin)、放线菌素(actinomycin)、氨茴霉素(authramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、加利车霉素(calicheamicin)、卡柔比星(carabicin)、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycinis)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素(mitomycin)、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(porfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物类，例如，甲氨蝶呤(methotrexate)和5-氟尿嘧啶(fluorouracil)(5-FU)；叶酸类似物，例如，二甲叶酸(denopterin)、甲氨蝶呤、蝶酰三谷氨酸(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，例如，氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，例如，安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷，卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素类，例如，卡鲁睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、表硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺类，例如，氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，例如，亚叶酸(frolinic acid)；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamideglycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；安吖啶(amsacrine)；贝他布昔(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defofamine)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；依氟鸟氨酸(elfomithine)；依利醋铵(elliptinium acetate)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟脲；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidainine)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamnol)；二胺硝吖啶(nitraerine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼；丙卡巴肼(procarbazine)；PSKTM；雷佐生(razoxane)；西索菲兰(sizofuran)；螺旋锗(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2，2′，2″-三氯三乙胺；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；甲托辛(gacytosine)；阿糖胞苷(arabinoside)(“Ara-C”)；环磷酰胺；塞替派；紫杉烷类，例如，紫杉醇(TaxolTM，Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，N.J.)和多西紫杉醇(TaxotereTM；Aventis Antony，France)；苯丁酸氮芥(chloranmbucil)；吉西他滨(gemcitabine)；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物，例如，顺铂(cisplatin)和卡铂(carboplatin)；长春碱(Vinblastine)；铂(platinum)；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺(ifosfamide)；丝裂霉素C(mitomycin C)；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine)；长春瑞滨(vinorelbine)；诺维本(navelbine)；诺肖林(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；道诺霉素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；希罗达(xeloda)；伊班膦酸盐(ibandronate)；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；视黄酸(retinoic acid)；埃斯波霉素(esperamicins)；卡培他滨(capecitabine)；以及上述任一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。在该定义中还包括抗激素剂(其起作用以调节或抑制激素对肿瘤的作用)，诸如抗雌激素类包括例如他莫昔芬、雷洛昔芬、(raloxifene)、抑制芳香酶的4(5)-咪唑、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、盐酸雷洛昔芬(keoxifene)、LY 117018、奥那司酮(onapristone)和托瑞米芬(toremifene)(Fareston)和抗雄激素类诸如氟他胺(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比卡鲁胺(bicalutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin)；以及上述任一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
HER2xHER2双特异性抗原结合分子也可以与抗病毒剂、抗生素、镇痛剂、皮质类固醇、类固醇、氧、抗氧化剂、COX抑制剂、心脏保护剂、金属螯合剂、IFN-γ和/或NSAID组合施用和/或共配制。
一种或多种另外的治疗活性组分，例如上文列出的药剂中的任一者或它们的衍生物，可以在HER2xHER2双特异性抗原结合分子的施用之前、同时或不久之后立即施用；(出于本公开的目的，这些施用方案被视为抗体与另外的治疗活性组分“组合”施用)。本公开包括药物组合物，其中HER2xHER2双特异性抗原结合分子与如本文别处所述的一种或多种另外的治疗活性组分中的一种或多种共配制。
施用方案
根据某些实施方案，多剂量的HER2xHER2双特异性抗原结合分子，包括HER2xHER2ADC，(或者包含抗HER2抗体、HER2xHER2双特异性抗原结合分子或HER2xHER2 ADC和本文提及的另外的治疗活性剂中的任一者的组合的药物组合物)可以在规定的时间过程中施用于受试者。根据该方面的方法包括将多剂量的本文提供的HER2xHER2双特异性抗原结合分子按顺序施用于受试者。本文中使用的“依次施用”是指，将抗体的每个剂量在不同的时间点施用给受试者，例如在隔开预定间隔(例如，数小时、数天、数周或数月)的不同天。本公开包括这样的方法：所述方法包括将单一初始剂量的HER2xHER2双特异性抗原结合分子，然后是一个或多个第二剂量的HER2xHER2双特异性抗原结合分子，以及任选地随后是一个或多个第三剂量的HER2xHER2双特异性抗原结合分子按顺序施用于患者。
术语“初始剂量”、“第二剂量”和“第三剂量”是指施用HER2xHER2双特异性抗原结合分子的时间顺序。因此，“初始剂量”是在治疗方案开始时施用的剂量(也称为“基线剂量”)；“第二剂量”是在初始剂量后施用的剂量；“第三剂量”是在第二剂量后施用的剂量。初始剂量、第二剂量和第三剂量都可以含有相同量的HER2xHER2双特异性抗原结合分子，但是通常在施用频率方面可以彼此不同。但是，在某些实施方案中，在初始、第二和/或第三剂量中所含的抗体的量在治疗过程中彼此不同(例如，在适当时向上或向下调整)。在某些实施方案中，在治疗方案开始时施用两个或更多个(例如，2、3、4或5个)剂量作为“负荷剂量”，然后是以更低的频率施用的后续剂量(例如，“维持剂量”)。
抗体的诊断用途
本公开的HER2xHER2双特异性抗原结合分子还可以用于检测和/或测量样品中的HER2或表达HER2的细胞，例如用于诊断目的。例如，抗HER2抗体或其片段可以用于诊断以HER2的异常表达(例如，过表达、表达不足、表达缺乏等)为特征的病症或疾病。HER2的示例性诊断测定法可以包括，例如，使从患者获得的样品接触HER2xHER2双特异性抗原结合分子，其中所述抗体用可检测标记或报告分子来标记。或者，未标记的HER2xHER2双特异性抗原结合分子可以与本身可检测标记的二抗组合用于诊断应用。可检测标记物或报告分子可以是放射性同位素，诸如3H、14C、32P、35S或125I；荧光或化学发光部分诸如萤光素或罗丹明；或酶诸如碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶或萤光素酶。可以用于检测或测量样品中的HER2的具体示例性测定法包括酶联免疫吸附测定法(ELISA)、放射免疫测定法(RIA)、免疫PET(例如，89Zr、64Cu等)和荧光活化细胞分选(FACS)。在一些实施方案中，HER2xHER2双特异性抗原结合分子如WO2018/044540中所述被标记，该专利的全部内容以引用的方式整体并入本文。在一些实施方案中，HER2xHER2双特异性抗原被标记为：
Figure BDA0003817518590000841
生物传感器1。
在一些实施方案中，包含SEQ ID NO：2的D1-HCVR氨基酸序列和SEQ ID NO：10的D2-HCVR氨基酸序列的HER2xHER2双特异性抗原结合蛋白被标记为生物传感器1。
在一些实施方案中，包含SEQ ID NO：32的D1-HCVR氨基酸序列和SEQ ID NO：40的D2-HCVR氨基酸序列的HER2xHER2双特异性抗原结合蛋白被标记为生物传感器1。
可以用于根据本公开的HER2诊断测定法的样品包括可从患者获得的任何组织或流体样品。通常，将对从健康患者(例如，不患有与异常HER2水平或活性相关联的疾病或病症的患者)获得的特定样品中的HER2水平进行测量，以初步建立基线或标准HER2水平。然后可以将该HER2的基线水平与在从怀疑患有HER2相关疾病或病症的个体获得的样品中测量的HER2水平进行比较。
实施例
提出以下实施例以给本领域普通技术人员提供如何制备和使用本文提供的方法和组合物的完整公开和描述，且无意限制发明人视作其发明的内容的范围。已经做出努力来确保关于使用的数字(例如，量、温度等)的准确度，但是应当考虑一些实验误差和偏差。除非另外指明，否则份数是重量份，分子量是平均分子量，温度是按摄氏度计并且压力是大气压或接近大气压。
以下实施例中使用的比较抗体包括：
·曲妥珠单抗-MCC-DM1，即包含DM1有效负载的抗HER2 ADC。参见例如WO2015/031396A1。ADC在本文中称为CompAb1-MCC-拟美坦辛A。亲本抗HER2抗体赫赛汀(Herceptin)在本文中称为CompAb1。
·DS8201A，即包含DxD有效负载的抗HER2 ADC。参见例如，Ogitani等人(ClinicalCancer Research，2016年10月，22(20)：doi：10.1158/1078-0432.ccr-15-2822)和Tamura(Lancet 2019)。ADC在本文中称为CompAb1-喜树碱-LP。亲本抗体是赫赛汀，也称为CompAb1。
·MEDI4276，即包含AZ13599185有效负载的HER2xHER2双特异性抗体ADC。该抗体包含SEQ ID NO：52(结构域IV_VL.(G4S)4接头_v3.结构域IV_VH.(G4S)3)和SEQ ID NO：53(Bs2AB_VK.hKappa)。接头有效负载是如下文、WO2015/157592和Faria等人(Antibodies，2019，8(11)doi：10.3390/antib8010011)所示的化合物T32。亲本双特异性抗体在本文中称为CompAb2，并且ADC在本文中称为CompAb2-微管溶素2A-LP。
·同种型对照抗体在本文中称为IC1。IC1抗体可以缀合至微管溶素1A-LP、MCC-拟美坦辛A、喜树碱或微管溶素2A-LP。
化合物T32(微管溶素1508)
Figure BDA0003817518590000851
实施例1.抗HER2抗体的产生
抗HER2抗体通过用包含融合至小鼠Fc、hErbB2 ecto-mFc(公司，产品目录#，位置)的重组人HER2胞外结构域的免疫原对包含编码人免疫球蛋白重链和κ轻链可变区的DNA的基因工程小鼠进行免疫接种来获得。用于免疫接种的小鼠表达“通用轻链”。也就是说，在该小鼠中产生的抗体具有不同的重链可变区，但具有基本上相同的轻链可变结构域。
通过HER2特异性免疫测定法来监测抗体免疫应答。当达到期望的免疫应答时，收获脾细胞并与小鼠骨髓瘤细胞融合以保持其生存力并形成杂交瘤细胞系。筛选并选择杂交瘤细胞系以鉴定产生HER2特异性抗体的细胞系。使用该技术，获得了若干抗HER2嵌合抗体(即，具有人可变结构域和小鼠恒定结构域的抗体)。此外，如US2007/0280945A1中所述，直接从不与骨髓瘤细胞融合的抗原阳性的B细胞中分离出若干完全人抗HER2抗体。
根据本实施例的方法产生的示例性抗HER2抗体的某些生物学性质，以及由其构建的双特异性抗体，在下文所示的实施例中有所详细描述。
实施例2.构建具有两个不同的抗原结合结构域的双特异性抗体，该结构域对HER2的不同表位具有特异性
本实施例描述了包含两个不同的抗原结合结构域(D1和D2)的双特异性抗体的构建，其中D1和D2来源于不同的抗HER2抗体，因此与HER2胞外结构域上的不同表位结合。
用于构建本实施例的双特异性抗体的单独的抗HER2抗原结合结构域来源于根据本文的实施例1产生的各种二价单特异性抗HER2抗体。本文所述的所有HER2xHER2双特异性抗体包含相同的(“共同的”)轻链(包含SEQ ID NO：18的轻链可变区[LCVR]氨基酸序列，和SEQ ID NO：20、22和24的轻链CDR[LCDR1、LCDR2和LCDR3]氨基酸序列)。因此，本实施例中描述的所有双特异性抗体的两个抗原结合结构域(D1和D2)都包含这个共同的轻链可变区；然而，双特异性抗体在它们的D1重链可变区(HCVR)和重链CDR(HCDR)和D2重链可变区(HCVR)和重链CDR(HCDR)方面彼此不同。表1汇总了该实施例的双特异性抗体的组分。
在一些方面，双特异性抗体在一条或两条重链中含有N297Q修饰。重链中的297个残基根据Kabat编号定义进行鉴定。因此，表3中提供的HC链序列可以包含N297Q修饰。
表1：HER2xHER2双特异性抗体氨基酸序列
Figure BDA0003817518590000871
表2：HER2xHER2双特异性核酸序列
Figure BDA0003817518590000872
表3：HER2xHER2双特异性全长重链和轻链氨基酸序列
Figure BDA0003817518590000873
实施例3.HER2xHER2双特异性抗体的表面结合
在本实施例中，对CompAb1和HER2xHER2双特异性抗体与ZR751(ATCC产品目录#CRL-1500)、JIMT1(DSMZ产品目录#ACC589)和MDAMB361(ATCC产品目录#HTB-27)细胞的细胞表面结合能力进行测试。
对于该测定法，细胞在细胞培养物处理的75cm2烧瓶(Corning#430641U)在培养基中如上文所示在37C 5％CO2中生长。在测定当天，将细胞用胰蛋白酶消化并与紫色活力标志物(Biolegend#77477)在PBS中温育(10分钟，4℃，1ml)。此后，将细胞离心(1500RPM，5分钟，4℃)，重悬在DMEM+10％FBS中，以200,000个细胞/孔涂铺在U型底部96孔板中，并与指定稀释度的Alexa674标记的(Thermo，产品目录#A37573)抗体一起温育(20分钟，DMEM+10％FBS，4℃，50μl/孔)。然后将细胞离心并洗涤两次(5分钟，DMEM+10％FBS，4℃，200μl/孔)。此后，用PBS中的1％多聚甲醛(Electron Microcopy Sciences#15710)固定细胞(10分钟，4℃，50μl/孔)，再用150μl PBS稀释固定剂，并使用Fortessa X20仪器(BD Biosciences)对细胞进行流式细胞术分析。
如表4-6所示，在所测试的三种细胞系中，两种HER2xHER2双特异性抗体以大于CompAb1的亲和力和亲合力结合，而同种型对照抗体(IC1)则显示出很少结合或不结合。另外参见图1A、1B和1C。
表4：HER2xHER2双特异性抗体与MDAMB361细胞的细胞表面结合
Figure BDA0003817518590000881
表5：HER2xHER2双特异性抗体与JIMT1细胞的细胞表面结合
Figure BDA0003817518590000882
Figure BDA0003817518590000891
表6：HER2xHER2双特异性抗体与ZR751细胞的结合
Figure BDA0003817518590000892
实施例4.一组细胞系中的HER2xHER2表面结合
为了测试本发明的HER2xHER双特异性抗体与表达不同水平HER2的细胞系结合的能力，进行了高内涵成像测定法。对于该测定法，使用16种癌细胞系和4种正常原代培养物(参见表7)。通过蛋白质印迹分析将细胞系分类为HER2的相对表达。
表7：细胞系和相对HER2表达
Figure BDA0003817518590000893
Figure BDA0003817518590000901
将细胞以每孔2.5×105个细胞在其适当的培养基中涂铺在胶原蛋白涂覆的黑壁96孔光学板(Greiner，产品目录#655936)上，并在37C 5％CO2中温育过夜。第二天，将细胞与10μg/mL Alexa647标记的(Thermo，产品目录#A37573)抗体一起在50μL DMEM中4C下温育30分钟。此后，用冷DMEM+10％FBS洗涤细胞两次，并用4％多聚甲醛(Electron MicrocopySciences，产品目录#15710)+0.075％皂苷(Sigma，产品目录#S4521)+10μg/mL Hoechst(Lifetech，#H3569)在PBS中在室温下温育10分钟。此后，将溶液更换为PBS。
图像使用Image XpressMicro高内涵显微镜(Molecular Devices)获得，并通过使用ImageJ将AF647的平均强度荧光除以核信号来定量。
表8显示，CompAb1和HER2xHER2双特异性抗体(BsAb1和BsAb2)与表达中等和高水平的HER2的癌细胞系有效结合，但是与表达低水平的HER2的正常细胞的结合较弱。与实施例3的实验一致，HER2xHER2双特异性抗体与表达中等HER2水平的细胞系的结合比CompAb1更有效。也参见图2。
表8：HER2xHER2双特异性抗体与表达不同水平的HER2的癌细胞系的结合
Figure BDA0003817518590000902
Figure BDA0003817518590000911
实施例5：HER2xHER2内化和簇形成
本实施例测试了HER2xHER2双特异性抗体在T47D细胞上形成簇和内化的能力(ATCC产品目录#HTB-133)。对于2D单层测定法，将T47D细胞以25,000个细胞/孔在完全培养基中涂铺在胶原蛋白涂覆的96孔光学板(Greiner，产品目录#655936)上，并在37C 5％CO2中温育过夜。对于3D球形培养，将细胞以10,000个细胞/孔涂铺在低粘附性96孔板(Coming#4515)中并温育72小时。在测定当天，将细胞与含有10μg/mL Alexa647(Thermo，产品目录#A37573)标记抗体的冷(4℃)培养基一起温育30分钟。此后，将细胞洗涤两次(5分钟，100μl，4℃，完全培养基)并在完全培养基中在37℃温育60分钟。将细胞与含有4μg/mL Alexa488抗人Fab(Jackson#109-547-003)的冷(4℃)培养基一起温育30分钟。此后，洗涤细胞两次(5分钟，100μl，4℃，完全培养基)，并用4％多聚甲醛(Electron Microcopy Sciences，产品目录#15710)+0.075％皂苷(Sigma，产品目录#S4521)+10μg/mL Hoechst(Lifetech，#H3569)在PBS中在室温下温育10分钟。此后，将溶液更换为PBS。图像使用Zeiss旋转圆盘共聚焦显微镜获取，并使用Zeiss Zen Blue软件进行分析。在代表性图像的单个共焦切片中对胞内囊泡和表面簇的数量进行定量。
如表9和10所示，HER2xHER2双旁位抗体形成表面簇并且内化比CompAbl更有效。
表9：3D球形(SD55)
Figure BDA0003817518590000912
Figure BDA0003817518590000921
表10：2D单层(SD53)
Ab ID 内化囊泡％ 簇％
CompAb1 11％ 6％
BsAb1 29％ 100％
BsAb2 43％ 12％
CompAb2 100％ 28％
实施例6.DM1-抗体缀合和缀合物表征
将50mM HEPES、150mM NaCl pH8.0和10-15％(v/v)DMA中的抗体(BsAb1、BsAb2和IC1；10-20mg/ml)与5-6倍过量的M1(SMCC-DM1)在环境温度下缀合2小时。将缀合物通过尺寸排阻色谱法或大量超滤进行纯化并无菌过滤。通过UV光谱分析测定蛋白浓度。尺寸排阻HPLC确定，所用的所有缀合物均>90％单体，并且RP-HPLC确定，存在<1％未缀合的接头有效负载。所有缀合抗体根据以下文献通过UV进行接头有效负载负荷值分析：Hamblett等人(American Association for Cancer Research.2004年10月15日；10(20)：7063-70)。有效负载与抗体的比率报告于表11中。
表11：每种抗体药物缀合物的产率百分比和有效负载与抗体的比率
抗体 产率(％) DAR(UV)
BsAb1-MCC-拟美坦辛A 80 3.4
BsAb2-MCC-拟美坦辛A 80 3.6
实施例6A：拟美坦辛B抗体缀合
在本实施例中，抗体(BsAb1、BsAb2)与拟美坦辛B缀合：
Figure BDA0003817518590000922
拟美坦辛B
形成
Figure BDA0003817518590000931
其中Ab是BsAb1或BsAB2。
抗体BsAbl和BsAb210-20mg/ml与过量的拟美坦辛-3-N-甲基-L-丙氨酸-N-Me-β-丙氨酸-氨甲酰-(对氨基)苄基-瓜氨酸-缬氨酸-己二酰-琥珀酸(化合物B1)缀合。将缀合物通过尺寸排阻色谱法或大量超滤进行纯化并无菌过滤。通过UV光谱分析测定蛋白浓度。所有缀合抗体根据以下文献通过UV进行接头有效负载负荷值分析：Hamblett等人(AmericanAssociation for Cancer Research.2004年10月15日；10(20)：7063-70)和/或通过质量差异进行天然与缀合分析。
化合物B1根据US 2018-0134794A1(US 15/814,095)中针对“化合物1”描述的方法合成，该专利以引用的方式整体并入本文。
Figure BDA0003817518590000932
B1。
实施例7.HER2xHER2双特异性抗体与微管溶素1A和Campt-1的位点特异性缀合
在本实施例中，双特异性抗体BsAb1和BsAb2与以下结构的2个或更多个LP进行位点特异性缀合：
Figure BDA0003817518590000941
其包含有效负载微管溶素1A。此外，双特异性抗体BsAb1和BsAb2与以下物质进行位点特异性缀合：
Figure BDA0003817518590000942
环辛炔-间隔基-有效负载与野生型抗体或其抗原结合片段的位点特异性缀合物分三个步骤产生。第一步是野生型抗体的去糖基化。第二步是基于微生物谷氨酰胺转胺酶(MTG)的小分子诸如叠氮基-PEG3-胺与去糖基化抗体的Q295位点的酶促连接(下文称为“基于MTG”的缀合)。第三步通过[2+3]环加成将环辛炔-间隔基-有效负载连接到叠氮基官能化的抗体上，例如，叠氮化物和环辛炔之间的1，3-偶极环加成(又称无铜点击化学)。参见，Baskin，J.M.；Prescher，J.A.，Laughlin，S.T；Agard，N.J.；Chang，P.V.；Miller，I.A.；Lo，A.；Codelli，J.A.；Bertozzi，CR.PNAS 2007，104(43)，16793-7。图3A是具有通过[2+3]环加成与叠氮基官能化的抗体缀合的DIBAC部分的接头-间隔基-有效负载的实例。该方法以约50-80％的分离产率提供了位点特异性和化学计量的缀合物。图3B是如下进行的3步位点特异性缀合的实施例：
第1步：去糖基化抗体的制备。
进行去糖基化以暴露缀合位点。将抗HER2人IgG4双特异性抗体(40mg，27mg/mL，在PBS中；pH5.5-8.0)与PNGaseF酶(New England BioLabs，500,000U/mL，每1mg抗体2μL酶，因此总共80μL)混合。将反应混合物在37℃温育过夜，同时轻轻振荡。通过ESI-MS监测去糖基化。反应完成后，反应混合物可直接用于下一步。
第2步：叠氮基官能化的抗体的制备。
在存在MTG(ACTIVA TI，Ajinomoto，Japan)(每mg抗体0.06mg MTG)的情况下，将1.5mL PBS(pH7.2)中的去糖基化的HER2xHER2双特异性抗体(40mg)与200摩尔当量的叠氮基-PEG3-胺(MW＝218.26g/mol)一起温育。将反应在37℃下温育4小时，然后在25℃下温育过夜，同时轻轻混合。通过ESI-MS监测反应。反应完成后，通过SEC(Superdex 200PG，GEHealthcare)除去过量的叠氮基-PEG3-胺和MTG，以产生叠氮基官能化的抗体。将叠氮基-PEG3-胺添加到抗体上的两个Q295位点，导致2DAR抗体-PEG3-叠氮化物缀合物增加404Da。
该方法也可以在一条或两条重链中具有N297Q修饰的抗体上进行。在这种情况下，将叠氮基-PEG3-胺添加到抗体上的两个Q295位点和至少一个297Q位点，产生3DAR或4DAR抗体-PEG3-叠氮化物缀合物。
第3步：通过叠氮官能化的谷氨酰胺修饰的抗体和含有环辛炔的接头-有效负载(LP)之间的[2+3]点击反应来制备位点特异性缀合物。
通常，叠氮基官能化的抗体-LP缀合物通过将叠氮基官能化的谷氨酰胺修饰的抗体与≥6摩尔当量的LP，例如具有以下结构的化合物：
Figure BDA0003817518590000961
(溶解于合适的有机溶剂(例如，DMSO、DMF或DMA；反应混合物含有10-20％有机溶剂，v/v)中)一起在25℃至37℃下温育3-24小时来制备。通过ESI-MS监测反应进程。叠氮基官能化的抗体(mAb-PEG3-N3)不存在表示缀合完成。通过脱盐色谱柱或尺寸排阻色谱法(SEC)除去过量的接头-有效负载(LP)和有机溶剂。通过SEC-HPLC和ESI-MS分析纯化的缀合物。通过SEC-HPLC分析，缀合物的单体纯度>99％。
在一个具体实例中，在30℃下，用六当量的微管溶素1A-LP(在DMA中浓度为10mg/mL)处理2.4mL PBS中的叠氮基官能化的HER2xHER2抗体(例如BsAb1 BsAb2(31mg))过夜。通过SEC(Superdex 200PG，GE Healthcare)除去过量的接头有效负载(LP)。最终产物通过UV、SEC-HPLC(参见图4)和ESI-MS进行表征。
以类似的方式，BsAb1和BsAb2(二者在Q295处被所述双叠氮烷基取代胺(bisSP1)叠氮基官能化)用具有以下结构的CAMPT-1-LP处理，以提供BsAbl-Campt1和BsAb2-Campt1，如下文所示。
Figure BDA0003817518590000962
bisSP1
Figure BDA0003817518590000971
CAMPT-1-LP
Figure BDA0003817518590000972
Ab＝BsAb1：BsAb1-Campt1；Ab-BsAb2：BsAb2-Campt1
CAMPT-1-LP(即，LP1)如方案1和下文实施例i-iii中所述合成。起始物料L1-1(CAS2226472-26-8)根据WO2018089373A2合成，该文献以引用的方式整体并入本文。
方案1.vcPAB-氨基甲酸酯接头-有效负载CAMPT-1-LP的合成
Figure BDA0003817518590000981
实施例i：N-[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰氨基)-l-{[4-(羟甲基)苯基]氨基甲酰基}丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-1-[2-(环辛-2-炔-1-基氧基)乙酰胺基]-3，6，9，12-四氧杂十五烷-15-酰胺(L1-2)
Figure BDA0003817518590000982
向化合物L1-1(0.17g，0.33mmol)的DMF(10mL)溶液中依次添加DIPEA(0.13g，1.0mmol)和vcPAB(0.13g，0.34mmol)，并将反应混合物在室温下搅拌一小时。反应完成通过LCMS监测。将所得混合物通过反相快速色谱法(0-80％乙腈的水溶液)直接纯化，得到化合物L1-2(0.18g，70％产率)无色油状物。ESIm/z：791.3(M+H)+。1H NMR(400MHz，DMSOd6)δ9.91(s，1H)，8.11(d，J＝8.4Hz，1H)，7.89(d，J＝8.8Hz，1H)，7.61(t，J＝5.6Hz，1H)，7.55(d，J＝8.4Hz，2H)，7.23(d，J＝8.4Hz，2H)，5.98(t，J＝5.6Hz，1H)，5.42(s，2H)，5.10(br s，1H)，)，4.43(s，2H)，4.39-4.37(m，1H)，4.30-4.21(m，2H)，3.87(d，J＝14.8Hz，1H)，3.75(d，J＝14.8Hz，1H)，3.62-3.58(m，2H)，3.50-3.46(m，12H)，3.43(t，J＝6.0Hz，2H)，3.27-3.22(m，2H)，3.06-2.92(m，2H)，2.41-2.32(m，2H)，2.26-2.05(m，3H)，1.99-1.66(m，6H)，1.62-1.55(m，3H)，1.44-1.35(m，3H)，0.89(d，J＝6.8Hz，3H)，0.83(d，J＝6.8Hz，3H)ppm。
实施例ii：碳酸{4-[(2S)-5-(氨基甲酰氨基)-2-[(2S)-2-{1-[2-(环辛-2-炔-1-基氧基)乙酰胺基]-3，6，9，12-四氧杂十五烷-15-酰胺基}-3-甲基丁酰胺基]戊酰胺基]苯基}甲基4-硝基苯基酯(L1-3)
Figure BDA0003817518590000991
将化合物L1-2(80mg，0.10mmol)、DMAP(12mg，0.10mmol)和DIPEA(26mg，0.20mmol)在无水DMF(5mL)中的悬浮液在室温下搅拌10分钟，然后添加碳酸双(4-硝基苯基)酯(61mg，0.20mmol)。将反应混合物在室温搅拌2小时。反应完成通过LCMS监测。将所得混合物通过反相快速色谱法(0-80％乙腈的水溶液)直接纯化，得到化合物L1-3(53mg，55％产率)白色固体。ESI m/z：956.3(M+H)+。
实施例iii：氨基甲酸{4-[(2S)-5-(氨基甲酰氨基)-2-[(2S)-2-{1-[2-(环辛-2-炔-1-基氧基)乙酰胺基]-3，6，9，12-四氧十五烷-15-酰胺基}-3-甲基丁酰胺基]戊酰胺基]苯基}甲基N-({[({[(10S，23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5，9-二氧代-8-氧杂-4，15-二氮杂六环[14.7.1.02，14.04，13.06，11.02024]二十四-1，6(11)，12，14，16，18，20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}甲氧基)甲基]氨基甲酰基}甲基)酯(LP1/CAMPT-1-LP)
Figure BDA0003817518590000992
(CAMPT-1-LP)。
向化合物L1-3(16mg，17μmol)和依沙替康甲磺酸盐(12mg，17μmol)在无水DMF(2mL)中的黄色溶液中添加DIPEA(6.5mg，51μmol)，将澄清的反应溶液在室温下搅拌2小时。反应完成通过LCMS监测。将所得混合物通过反相快速色谱法(0-60％乙腈的TFA水溶液(0.01％))直接纯化，得到接头-有效负载LP1(15mg，63％收率，TFA盐)白色固体。ESI m/z：698.8(M/2+H)+。1H NMR(400MHz，DMSOd6)δ9.99(s，1H)，8.80(t，J＝6.8Hz，1H)，8.50(d，J＝9.2Hz，1H)，8.12(d，J＝7.2Hz，1H)，7.87(d，J＝8.8Hz，1H)，7.79(d，J＝10.8Hz，1H)，7.62-7.58(m，3H)，7.42(t，J＝6.0Hz，1H)，7.31(s，1H)，7.28(d，J＝8.4Hz，2H)，6.53(br s，1H)，5.98(t，J＝5.2Hz，1H)，5.63-5.57(m，1H)，5.46-5.37(m，3H)，5.21(s，2H)，4.93(s，2H)，4.63(d，J＝6.4Hz，2H)，4.41-4.35(m，1H)，4.29-4.21(m，2H)，4.02(s，2H)，3.87(d，J＝14.4Hz，1H)，3.75(d，J＝14.8Hz，1H)，3.63-3.58(m，4H)，3.50-3.48(m，12H)，3.46-3.41(m，2H)，3.27-3.24(m，2H)，3.23-3.12(m，2H)，3.07-2.91(m，2H)，2.47-2.45(m，0.5H)，2.41-2.33(m，4.5H)，2.25-2.04(m，5H)，1.99-1.69(m，9H)，1.63-1.54(m，3H)，1.44-1.33(m，3H)，0.88-0.82(m，9H)ppm。(未观察到TFA的质子)。19FNMR(376MHz，DMSOd6)δ-74(TFA)，-111(Ar-F)ppm。
表12显示了合成抗体微管溶素和喜树碱缀合物(ADC)的DAR(ESI-MS)值列表。
通过SEC-HPLC和LC-ESI-MS进行的抗体和ADC表征
通过SEC-HPLC和ESI-MS以及代表性SEC和ESI-MS分析纯化的缀合物。
分析SEC实验使用Waters 1515仪器在SuperdexTM200增加(1.0×30cm)色谱柱上运行，流速为0.80mL/min，使用PBS pH7.2，并使用Waters 2998PDA在λ＝280nm处监测。分析样品由30-80μL测试样品组成。图4中的SEC结果表明了单体mAb及其缀合物的典型保留时间以及最小聚集或降解。
通过LC-ESI-MS测量ADC样品的完整质量以，确定药物-有效负载分布曲线，并计算平均DAR。每个测试样品(20-50ng，5μL)用DTT还原，然后上样到Acquity UPLC蛋白质BEH C4色谱柱(10K psi，
Figure BDA0003817518590001001
1.7μm，75μm×100mm；产品目录号186003810)。在脱盐3分钟后，将蛋白质洗脱出来，通过Waters Synapt G2-Si质谱仪获得质谱图。如表12中所汇总，大多数位点特异性ADC具有接近的2DAR。
表12.抗体药物缀合物DAR
Figure BDA0003817518590001011
本实验中生成的ADC用于以下实施例。
实施例8.HER2xHER2人双特异性单克隆抗体和缀合的HER2xHER2人双特异性单克隆抗体的表面等离子共振来源的结合亲和力和动力学常数
使用实时表面等离子共振在MASS-2仪器上进行生物传感器测定法，以确定hErbB2.mmh与缀合有M830或M1的抗HER2xHER2抗体结合的平衡解离常数(KD值)。MASS-2传感器表面通过胺缀合与单克隆小鼠抗人Fc抗体(REGN2567)一起衍生化，以捕获抗HER2xHER2 ADC和用人恒定区表达的未经修饰的亲本抗体。Biacore结合研究在HBS-EP运行缓冲液(0.01M HEPES pH7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.05％v/v表面活性剂P20)中进行。人hErbB2在内部制备，其表达C-末端myc-myc-六组氨酸标签(hErbB2-MMH)。不同浓度(3倍稀释)的hErbB2-MMH(范围为90nM至1.1nM)在HBS-EP运行缓冲液中制备，以30μL/min的流速注射到抗HER2xHER2 ADC或抗体捕获表面。监测hErbB2-MMH与每个捕获的ADC和单克隆抗体的结合3分钟。随后，在HBS-EP运行缓冲液中监测hErbB2-MMH解离10分钟。通过短暂注射20mMH3PO4再生抗-人Fc表面。所有结合动力学实验均在25℃进行。
通过使用Scrubber 2.0c曲线拟合软件将实时传感图拟合至1∶1结合模型，确定动力学缔合(ka)和解离(kd)速率常数。通过从相应的分析物传感图减去缓冲液注射传感图信号来双重参考所有传感图，从而除去由抗体从捕获表面解离引起的伪像。如下从动力学速率常数计算结合解离平衡常数(KD)和解离半衰期(t1/2)：
KD(M)＝kd/ka，和t1/2(min)＝ln2/(60xkd)
表13：在25℃下测量的双特异性抗HER2 mAb和ADC的Biacore结合亲和力
Figure BDA0003817518590001021
如表13所示，本文所述的双特异性HER2xHER2抗体表现出T1/2值最多大于1155分钟。
实施例9：组织蛋白酶B可切割的接头的加工
研究了CompAb1和BsAb2在T47D细胞(ATCC产品目录#HTB-133)上诱导组织蛋白酶B可切割的接头切割的能力。将T47D细胞以25,000个细胞/孔在完全培养基(RPMI 1640+10％FBS+5ml Pen/Strep/谷氨酰胺+1mM NaPyr+10mM Hepes+10μg/mL胰岛素)中涂铺在胶原蛋白涂覆的96孔光学板(Greiner，产品目录#655936)上，并在37C5％CO2中温育过夜。第二天，将细胞与含有10μg/mL荧光抗体(用生物传感器1标记的抗体，参见WO2018/044540，该专利以引用的方式并入本文)的冷(4℃)培养基一起温育30分钟。此后，将细胞洗涤两次(5分钟，100μl，4C，完全培养基)，添加记录培养基(DPBS+2％FBS+10mMHEPES)，然后立即开始共聚焦实时成像。图像使用Zeiss旋转圆盘共聚焦显微镜获取，并使用Zeiss Zen Blue软件进行分析。Alexa568(切割的生物传感器)的综合荧光定量在36个不同区域的单个共焦切片中进行。
当生物传感器完好无损时，它会发射AF647信号；在生物传感器缀合的抗体内化到胞内体/溶酶体以及组织蛋白酶B接头的切割后，AF647和AF568都发射信号。表14显示，HER2xHER2双特异性抗体比CompAb1更有效地诱导组织蛋白酶B可切割的生物传感器的加工。也参见图5。
表14：与BsAb2相比CompAb1的切割的生物传感器的荧光
Figure BDA0003817518590001031
实施例10.HER2+细胞系中的HER2xHER2缀合物的体外细胞杀伤
为了测试与拟美坦辛A或微管溶素A1-LP有效负载缀合的CompAb1和BsAb1杀伤生物测定细胞的能力，进行体外细胞毒性测定法。对用降低的ADC浓度处理6天的具有不同HER2表达水平的细胞进行测定法。在使用细胞滴定发光物(Promega#G7571)处理后测量细胞活力。对于测定法，细胞在它们各自的培养基中在37℃5％CO2中生长过夜。第二天，将与MCC-拟美坦辛A或微管溶素A1-LP有效负载缀合的CompAbl、HER2xHER2双特异性抗体或对照抗体以66.67nM至0.01nM的最终浓度范围在DMEM和10％FBS中添加到细胞中并温育6天。在温育后，向每个孔中添加100μL细胞滴定发光物并在室温下温育5分钟并以500RPM振荡。使用Envision 2105多节点读板器(Perkin Elmer)测量与每个孔中APT量成比例的发光信号。IC50值根据10点响应曲线(GraphPadPrism)上的两相衰减方程来确定。所有IC50值均以nM浓度表示。
表15显示，在表达中等HER2水平的细胞(ZR751和JIMT1)中，CompAb1-MCC-拟美坦辛A的作用与对照ADC无差异(IC50值为30-40nM)，BsAb1-MCC-拟美坦辛A显示出中等功效(IC50值为6-7nM)，CompAb1-微管溶素1A-LP显示出较好的功效(IC50值为0.15-0.2nM)，BsAb1-微管溶素1A-LP在所有测试的ADC中显示出最有效的细胞杀伤(IC50值为0.06-0.07nM)。在表达较高HER2水平的细胞(MDAMB361、MDAMB453和SKBR3)中，CompAb1-MCC-拟美坦辛A诱导有效的细胞杀伤(IC50值为0.04-0.5nM)，BsAb1-MCC-拟美坦辛A表现出较好的功效(IC50值为0.02-0.1nM)，CompAb1-微管溶素1A-LP表现出较好的功效(IC50值为0.006-0.008nM)，BsAb1-微管溶素1A-LP在所有测试的ADC中再次显示出最有效的细胞杀伤(IC50值为0.002-0.004nM)。
表15：ADC对表达不同HER2水平的细胞的功效
Figure BDA0003817518590001041
实施例11.低HER2表达的细胞系的体外细胞杀伤
为了测试BsAb1微管溶素1A-LP、BsAb2微管溶素1A-LP和Medimmune比较物HER2xHER2-微管溶素(CompAb2-微管溶素2A-LP)对生物测定细胞的杀伤效果，进行体外细胞毒性测定法。对正常原代培养物和表达低HER2水平的乳腺癌细胞进行测定法。用降低的ADC浓度处理细胞6天，并在处理后使用细胞滴定发光物(Promega#G7571)来测量细胞活力。
对于测定法，细胞在它们各自的培养基中在37℃ 5％CO2中生长过夜。第二天，将BsAbl-微管溶素1A-LP、BsAb2-微管溶素1A-LP、CompAb2-微管溶素2A-LP或它们各自的非结合对照抗体以66.67nM至0.01nM的最终浓度范围在DMEM和10％FBS中添加到细胞中并温育6天。在温育后，向每个孔中添加100μL细胞滴定发光物并在室温下温育5分钟并以500RPM振荡。使用Envision2105多节点读板器(Perkin Elmer)测量与每个孔中APT量成比例的发光信号。IC50值根据10点响应曲线(GraphPad Prism)上的两相衰减方程来确定。所有IC50值均以nM浓度表示。
表16显示，BsAb1-微管溶素1A-LP和BsAb2-微管溶素1A-LP在表达低HER2水平的细胞中具有很小的杀伤作用或无杀伤作用(IC50值为8->67nM)。这种令人惊讶的有益效果说明了ADC在杀死肿瘤细胞而不靶向正常组织方面的有用性。相比之下，CompAb2-微管溶素2A-LP(据报道在HER2 IHC 0+异种移植物中具有抗肿瘤作用并且在人体中具有毒性的ADC)在IC50低至0.3nM时诱导细胞杀伤。
表16：ADC对低HER2表达的细胞系的细胞毒性
Figure BDA0003817518590001051
实施例12.JIMT1异种移植物中的HER2xHER2双特异性抗体ADC的剂量依赖性
为了测试BsAb1-微管溶素1A-LP在HER2 IHC2+JIMT1异种移植物模型中的功效，进行体内肿瘤研究。对于测定法，使用6周龄雌性SCID小鼠(C.B-Igh-1b/IcrTac-Prkdcscid，Taconic Biosciences，n＝50)。对于移植，将JIMT1(DSMZ产品目录#ACC589)细胞与基质胶(Corning，产品目录#354234)混合，将150μL细胞和含有4×106个细胞的基质胶悬浮液注射到SCID小鼠中。在11天后，将指定剂量的指定ADC皮下注射到根据肿瘤大小随机分配的SCID小鼠中。使用卡尺(Roboz，产品目录#RS6466)测量每只小鼠的异种移植物大小。
对于每个测量的时间点，每个治疗组的平均肿瘤大小显示于表17中。HER2xHER2双特异性ADC，BsAb1-微管溶素1A-LP(DAR 2.1)，以剂量依赖性方式显示出肿瘤细胞杀伤。接受单个剂量的3mg/kg HER2xHER2双特异性ADC、BsAb1-微管溶素1A-LP的小鼠显示出JIMT1异种移植物大小的显著和持久减小，达到平均大小10mm3(在123天)。接受单个剂量的1mg/kg HER2xHER2双特异性ADC、BsAb1-微管溶素1A-LP的小鼠显示出JIMT1异种移植物大小的减小，达到平均大小74mm3(在28天)。相比之下，接受3、1或0.3mg/kg同种型对照ADC(IC1-微管溶素1A-LP；DAR 2)或生理盐水的小鼠显示出很少的抗肿瘤作用或不显示出抗肿瘤作用。另外参见图6A和图6B。
表17：HER2xHER2双特异性ADC和对照ADC治疗后的JIMT1异种移植物肿瘤大小(mm3)
Figure BDA0003817518590001071
实施例13.与CompAb1-MCC-拟美坦辛A相比，HER2xHER2双特异性ADC的体内功效
为了比较BsAb1-微管溶素1A-LP、BsAb2-微管溶素1A-LP和CompAb1-MCC-拟美坦辛A在HER2 IHC2+JIMT1异种移植物模型中的功效，进行体内肿瘤研究。对于测定法，使用6周龄雌性SCID小鼠(C.B-Igh-1b/IcrTac-Prkdcscid，Taconic Biosciences，n＝50)。对于移植，将JIMT1(DSMZ，ACC589)细胞与基质胶(Coming，产品目录#354234)混合，将150μL细胞和含有4×106个细胞的基质胶悬浮液注射到SCID小鼠中。在14和28天后，将指定ADC皮下注射到根据肿瘤大小随机分配的SCID小鼠中。使用卡尺(Roboz，产品目录#RS6466)测量每只小鼠的异种移植物大小。
对于每个测量的时间点，每个治疗组的平均肿瘤大小显示于表18中。接受单个剂量的3mg/kg BsAb1-微管溶素1A-LP或BsAb2-微管溶素1A-LP的小鼠显示出JIMT1异种移植物大小的显著和持久减小，分别达到平均大小18和6mm3(分别在83和97天)。相比之下，接受两个剂量的10mg/kg CompAb1-MCC-拟美坦辛A的小鼠显示出很少的抗肿瘤作用或不显示出抗肿瘤作用，类似于接受单个剂量的3mg/kgIC1-微管溶素1A-LP或两个剂量的10mg/kgIC1-MCC-拟美坦辛A的小鼠。另外参见图7A和图7B。
表18：指定ADC治疗后的JIMT1异种移植物肿瘤大小(mm3)
Figure BDA0003817518590001081
实施例14.与MDAMB361异种移植物中的CompAb1-MCC-拟美坦辛A相比，BsAb1-微管溶素1A-LP的功效
为了比较BsAb1-微管溶素1A-LP和CompAb1-MCC-拟美坦辛A在HER2IHC2+MDAMB361异种移植物模型中的功效，进行体内肿瘤研究。对于测定法，使用6周龄雌性SCID小鼠(C.B-Igh-1b/IcrTac-Prkdcscid，Taconic Biosciences，n＝50)。在细胞移植前一天，给小鼠皮下移植17b-雌二醇小丸剂(0.72mg，60天释放。Innovative research ofAmerica#SE-121)。第二天，将MDAMB361(DSMZ，ACC589)细胞与基质胶(Coming，产品目录#354234)混合，将150μL细胞和含有6×106个细胞的基质胶悬浮液注射到SCID小鼠中。在19天后，将指定剂量的指定ADC皮下注射到根据肿瘤大小随机分配的SCID小鼠中。在第52天向BsAb1-微管溶素1A-LP处理的队列施用第二剂量，以评估耐药性的发展。使用卡尺(Roboz，产品目录#RS6466)测量每只小鼠的异种移植物大小。
对于每个测量的时间点，每个治疗组的平均肿瘤大小显示于表19中。接受单个剂量的3mg/kg BsAb1-微管溶素1A-LP(DAR 2.1)的小鼠在第38天显示出MDAMB361异种移植物大小从平均大小202mm3部分减小到平均大小122mm3。在第52天施用的第二剂量导致异种移植物肿瘤大小在第76天时进一步消退至70mm3。相比之下，接受单个剂量的3mg/kg CompAbl-MCC-拟美坦辛A(DAR3.1)或对照ADC(IC1-MCC-拟美坦辛A，DAR 3.6或IC1-微管溶素1A-LP，DAR2)或生理盐水的小鼠显示出很少的抗肿瘤作用或不显示出抗肿瘤作用。另外参见图8A和图8B。
表19：指定ADC治疗后的MDAMB361异种移植物肿瘤大小(mm3)
Figure BDA0003817518590001091
Figure BDA0003817518590001101
实施例15.在N87异种移植物中，与CompAb1-MCC-拟美坦辛A相比，BsAb1-微管溶素1A-LP的功效
为了比较BsAb1-微管溶素1A-LP和CompAb1-MCC-拟美坦辛A在HER2IHC3+N87异种移植物模型中的功效，进行体内肿瘤研究。对于测定法，使用6周龄雌性SCID小鼠(CBySmn.CB17-Prkdcscid/J，Jackson Labs#001803，n＝50)。对于移植，将N87(ATCC，HTB-5822)细胞与基质胶(Coming，产品目录#354234)混合，将150μL细胞和含有3.6×106个细胞的基质胶悬浮液注射到SCID小鼠中。在12天后，将指定剂量的指定ADC皮下注射到根据肿瘤大小随机分配的SCID小鼠中。在第25天和第39天对用lmg/kg BsAb1-微管溶素1A-LP处理的队列施用两个附加剂量。使用卡尺(Roboz，产品目录#RS6466)测量每只小鼠的异种移植物大小。
对于每个测量的时间点，每个治疗组的平均肿瘤大小显示于表20中。接受单个剂量的3mg/kg BsAb1-微管溶素1A-LP(DAR 2.1)的小鼠显示出N87异种移植物大小的显著和持久减小，达到平均大小25mm3(第57天)。接受单个剂量的10mg/kg CompAb1-MCC-拟美坦辛A(DAR 3.1)的小鼠显示出N87异种移植物大小的显著减小，达到平均大小15mm3，然而(第29天)，与用BsAbl-微管溶素1A-LP治疗的那些小鼠相比，肿瘤逃脱更早(即对治疗产生耐受性)(第51天与第88天)。接受三个剂量的1mg/kg BsAbl-微管溶素1A-LP的小鼠显示出N87异种移植物大小的部分减小，达到平均大小109mm3(第35天)。相比之下，接受单个剂量的对照ADC(3mg/kg IC1-微管溶素1A-LP，DAR 2，或10mg/kg IC1-MCC-拟美坦辛A，DAR 3.6)的小鼠未显示出抗肿瘤作用。也参见图9。
表20：指定ADC治疗后的N87异种移植物肿瘤大小(mm3)
Figure BDA0003817518590001111
Figure BDA0003817518590001121
实施例16.JIMT1异种移植物中的三种ADC的体内比较
为了比较BsAb1-微管溶素1A-LP与CompAb1-MCC-拟美坦辛A(DAR 3.1)和CompAbl-L-喜树碱(DAR 8)在HER2 IHC2+JIMT1异种移植物模型中的疗效，进行体内肿瘤研究。对于测定法，使用6周龄雌性SCID小鼠(CBySmn.CB17-Prkdcscid/J，Jackson Labs#001803，n＝50)。对于移植，将JIMT1(DSMZ，ACC589)细胞与基质胶(Corning，产品目录#354234)混合，将150μL细胞和含有4×106个细胞的基质胶悬浮液注射到SCID小鼠中。在13、20和27天后，将指定剂量的指定ADC皮下注射到根据肿瘤大小随机分配的SCID小鼠中。一个队列在第13天接受单个剂量的3mg/kg BsAb1-微管溶素1A-LP。使用卡尺(Roboz，产品目录#RS6466)测量每只小鼠的异种移植物大小。对于每个测量的时间点，每个治疗组的平均肿瘤大小显示于表21中。
接受单个剂量的3mg/kg BsAb1-微管溶素1A-LP(DAR 2.1)的小鼠显示出JIMT1异种移植物大小的显著和持久减小，达到平均大小3mm3(第79天)，接受三个每周剂量的1mg/kg BsAb1-微管溶素1A-LP的小鼠在第44天显示出JIMTl异种移植物从平均大小179mm3部分减小到平均大小63mm3。相比之下，接受三个每周剂量的10mg/kg CompAb1-L-喜树碱的小鼠仅显示出肿瘤进展减慢，在第44天达到平均大小374mm3。相比之下，接受每周剂量的10mg/kg CompAb1-MCC-拟美坦辛A或对照ADC(3mg/kg IC1-微管溶素1A-LP、10mg/kg ICl-L-喜树碱或10mg/kg IC1-MCC-拟美坦辛A)的小鼠未显示出抗肿瘤作用。另外参见图10A和图10B。
表21：指定ADC治疗后的JIMT1异种移植物肿瘤大小(mm3)
Figure BDA0003817518590001131
实施例17.在JIMT1异种移植物中，与CompAb1-MCC-拟美坦辛A相比，HER2xHER2-M830双特异性抗体药物缀合物的功效
为了比较BsAb1-微管溶素1A-LP和CompAb1-MCC-拟美坦辛A(DAR 3.1)在HER2IHC2+CTG0807中的疗效，进行体内肿瘤研究。对于测定法，使用6-8周龄雌性无胸腺Nude-Foxlnu小鼠(Envifo，Indianapolis，Indiana)。
研究前动物：当足料饲养动物达到1.0-1.5cm3时，收获肿瘤以重新移植到研究前动物中。在研究前动物左侧单侧移植，肿瘤片段取自饲养动物。研究动物：在移植后七至十天开始记录每个实验的研究前肿瘤体积。当肿瘤达到150-300mm3的平均肿瘤体积时，将动物按肿瘤体积匹配到治疗组或对照组中，以用于给药和在第0天开始给药。每周测量肿瘤体积两次。
匹配的研究动物以指定剂量进行静脉内注射。对于每个测量的时间点，每个治疗组的平均肿瘤大小显示于表22中。
接受三个每周剂量的3mg/kg BsAb1-微管溶素1A-LP(DAR 2.1)的小鼠显示出CTG0807 PDX肿瘤大小的完全(0mm3)和持久减小。接受三个每周剂量的1mg/kg BsAb1-微管溶素1A-LP的小鼠显示出肿瘤生长的延迟，因为肿瘤大小保持小于300mm3达30天。接受三个每周剂量的10mg/kg CompAb1-MCC-拟美坦辛A(DAR 3.1)的小鼠在治疗期间和治疗后继续生长，虽然速率比用三个每周剂量的PBS或ADC对照(10mg/kg IC1-MCC-拟美坦辛A或3mg/kgIC1-微管溶素1A-LP)治疗的肿瘤稍慢。另外参见图11A和图11B。
表22：指定ADC治疗后的CTG0807 PDX肿瘤大小(mm3)
Figure BDA0003817518590001141
Figure BDA0003817518590001151
实施例18.在JIMT1异种移植物中，与CompAb1-MCC-拟美坦辛A相比，BsAb1-微管溶素1A-LP的功效
为了比较BsAb1-微管溶素1A-LP和CompAb1-MCC-拟美坦辛A在HER2IHC2+CTG1184中的疗效，进行体内肿瘤研究。对于测定法，使用6-8周龄雌性无胸腺Nude-Fox 1nu小鼠(Envifo，Indianapolis，Indiana)。
研究前动物：当足料饲养动物达到1.0-1.5cm3时，收获肿瘤以重新移植到研究前动物中。在研究前动物左侧单侧移植，肿瘤片段取自饲养动物。研究动物：在移植后七至十天开始记录每个实验的研究前肿瘤体积。当肿瘤达到150-300mm3的平均肿瘤体积时，将动物按肿瘤体积匹配到治疗组或对照组中，以用于给药和在第0天开始给药。每周测量肿瘤体积两次。
匹配的研究动物以指定剂量进行静脉内注射。对于每个测量的时间点，每个治疗组的平均肿瘤大小显示于表23中。
接受三个每周剂量的3mg/kg和1mg/kg BsAb1-微管溶素1A-LP(DAR 2.1)的小鼠显示出CTG1184PDX肿瘤大小的显著和持久减小，分别达到平均值6(第52天)和13mm3(第45天)。接受三个每周剂量的3mg/kg IC1-微管溶素1A-LP(对照ADC)或10mg/kg CompAb1-MCC-拟美坦辛A(DAR 3.1)的小鼠在治疗期间和治疗后继续生长，虽然速率比用三个每周剂量的PBS或10mg/kg IC1-MCC-拟美坦辛A(对照ADC)治疗的肿瘤缓慢。另外参见图12A和12B。
表23：指定ADC治疗后的CTG1l84 PDX肿瘤大小。
Figure BDA0003817518590001161
Figure BDA0003817518590001171
实施例19.评估肿瘤细胞系和患者来源的异种移植物中的HER2水平的免疫组织化学(IHC)染色。
实施例17和1中使用的PDX模型根据以下方法确认为CTG1184的HER IHC 2+/3+。组织样品在10％中性缓冲福尔马林中4℃避光固定12小时，用PBS洗涤3次，在分级乙醇系列中脱水(1×70％、80％、90％和4×100％、30分钟)，使用
Figure BDA0003817518590001172
在二甲苯和石蜡中处理(3次，每次30分钟)，然后包埋以获得4μm组织切片。使用HercepTestTM试剂盒提供的方案进行IHC染色。HER2 IHC评分通过组织切片和对照切片的目视比较来确定。
表24：细胞系和患者来源的异种移植物的IHC评分
样品 样品类型 HER2 IHC评分
MDAMB468 细胞系 0+
MDAMB231 细胞系 0+
T47D 细胞系 1+
JIMT-1 异种移植物 2+
MDAMB361 异种移植物 2+
N-87 异种移植物 3+
CTG0807 PDX 2+/3+
CTG1184 PDX 2+
总之，本发明人观察到HER2xHER2抗体的有效内化显著增加了胞内囊泡中的组织蛋白酶B可切割的接头的加工。据此，HER2xHER2-微管溶素杀伤的细胞系不仅表达高水平，而且还表达中等水平的HER2，具有亚纳摩尔IC50。此外，HER2xHER2-微管溶素在许多HER2IHC3+和2+肿瘤异种移植物和PDX模型中诱导完全和持久肿瘤消退。
实施例20.在N87异种移植物中，与Comp ADC相比，BsAb1-Campt1和BsAb2-Campt2的功效。
为了比较BsAb1-Camp1和BsAb2-Camp1 ADC与CompAb1-MCC-拟美坦辛A、COMPAb1-GGFG-Dxd和BsAb2-微管溶素1A-LP在HER2 IHC3+N87异种移植物模型中的功效，进行体内肿瘤研究。对于测定法，使用6周龄雌性SCID小鼠(CBySmn.CB17-Prkdcscid/J，Jackson Labs#001803，n＝50)。对于移植，将N87(ATCC，HTB-5822)细胞与基质胶(Corning，产品目录#354234)混合，将150μL细胞和含有4×106个细胞的基质胶悬浮液注射到SCID小鼠中。在7天后，将指定剂量的指定ADC皮下注射到根据肿瘤大小随机分配的SCID小鼠中。在第14天和第21天对用1mg/kg H4H17087D-微管溶素1A-LP处理的队列施用两个附加剂量。使用卡尺(Roboz，产品目录#RS6466)测量每只小鼠的异种移植物大小。
接受单个剂量的10mg/kg BsAb1-Campt1或BsAb2-Camp1的小鼠在110天内显示出N87肿瘤完全消退。抗肿瘤活性与10mg/kg CompAb1-GGFG-Dxd和3mg/kg BsAb2-微管溶素1A-LP相当。接受单个剂量的10mg/kg CompAb1-MCC-拟美坦辛A的小鼠最初显示出N87异种移植物大小的显著减小，但是在第50天，5个肿瘤中有5个逃脱治疗。对于接受三个剂量的1mg/kg BsAb2-微管溶素1A-LP的小鼠，观察到类似的平均抗肿瘤反应，然而，5个肿瘤中只有2个逃脱治疗。相比之下，接受单个剂量的对照ADC的小鼠未显示出抗肿瘤作用。参见图13A和13B。
实施例21.BsAb2与Erbb2.mmH结合的表位作图数据。
进行氢-氘交换质谱(HDX-MS)以确定与二价亲本抗体相互作用的人表皮生长因子受体2的氨基酸残基，所述二价亲本抗体包含BsAb2的结合臂(亲本Ab1和亲本Ab2)。在该实验中，使用重组产生的具有6个组氨酸标签的HER2的胞外结构域(ECD)区(SEQ ID NO：54)。HDX-MS方法的一般描述在例如Ehring(1999)Analytical Biochemistry 267(2)：252-259；以及Engen和Smith(2001)Anal.Chem.73：256A-265A中有所阐述。
HDX-MS实验在定制平台上进行，该平台由用于氘标记和淬灭的定制HDX自动化系统、用于样品消化和捕集的Waters Acquity二元溶剂管理器、用于分析梯度的另一个Waters Acquity二元溶剂管理器和用于肽鉴定和质量测量的Thermo Q Exactive HF质谱仪组成。
D2O标记溶液在基于D2O的缓冲液(50mM磷酸盐、100mM氯化钠，pD7.0)中制备。对于氘标记，将10μL的0.93mg/mL Her2蛋白或与二价亲本中的任一者预混合(抗原与抗体摩尔比1∶0.7)的Her2蛋白在20℃下与90μL D2O标记溶液一起重复温育不同时间点(非氘化对照为0分钟；氘标记15秒、60秒、600秒、3600秒和6000秒)。通过向每个样品中添加100μL 4M盐酸胍、0.85M TCEP缓冲液(通过HCl酸化至pH2.3)在15℃下温育180秒来淬灭氘化反应。然后将淬灭的样品注入LC系统，在15℃下进行联机胃蛋白酶消化。消化的肽在-6℃下通过C8色谱柱(1mm×50mm，Novabioassays)捕获，溶剂B的12.5分钟梯度为2-32％。(流动相A：0.2％甲酸水溶液，流动相B：0.2％甲酸的乙腈溶液)。通过Thermo Q Exactive HF质谱法以LC-MS/MS或LC-MS模式分析洗脱的肽。
使用Byonic搜索引擎(Protein Metrics)针对包括Her2蛋白的氨基酸序列及其逆序列的数据库搜索未氘化的Her2样品的LC-MS/MS数据。使用非特异性酶消化和人糖基化作为常见的变量修饰，将搜索参数设置为默认值。然后将鉴定出的肽列表导入HDX WorkBench软件(3.3版)，以计算所有氘化样品的氘吸收量(D-吸收)和氘吸收量百分比(％D)。肽的残基编号来自包括标签在内的实际蛋白质序列(N-末端残基T作为第1个AA)。
Figure BDA0003817518590001191
从单独的Her2和与亲本Ab1样品复合的Her2中共鉴定出351个来自HER2的肽，这代表Her2的100％序列覆盖。任何表现出氘吸收量百分比减少大于5％的肽都被定义为显著保护(Δ％D<-5％)。Her2 ECD在序列AA141-145即YQDTI(SEQ ID NO：55)和AA166-182即RSRACHPCSPMCKGSRC(SEQ ID NO：56)处与mAb亲本Ab1结合后显示出氘吸收量显著减少，这些序列被指定为亲本Ab1靶向的人Her2 ECD上的表位。覆盖表位区I(AA141-145，YQDTI，SEQID NO：55)和表位区II(AA166-182，RSRACHPCSPMCKGSRC，SEQ ID NO：56)的肽的氘吸收量数据显示于图14中。
从单独的Her2和与亲本Ab2样品复合的Her2中共鉴定出366个来自HER2的肽，这代表Her2的100％序列覆盖。任何表现出氘吸收量百分比减少大于5％的肽都被定义为显著保护(Δ％D＜-5％)。Her2 ECD在序列AA9-23即MKLRLPASPETHLDM(SEQ ID NO：57)、AA41-51即TYLPTNASLSF(SEQ ID NO：58)、AA64-77即IAHNQVRQVPLQRL(SEQ ID NO：59)处与mAb亲本Ab2结合后显示出氘吸收量显著减少。此外，在序列AA353-359即AFLPESF(SEQ ID NO：60)处氘吸收量显著减少，这可以是由于变构效应。覆盖表位区I(AA9-23，MKLRLPASPETHLDM，SEQ IDNO：57)、表位区II(AA41-51，TYLPTNASLSF，SEQ ID NO：58)和表位区III(AA64-77，IAHNQVRQVPLQRL，SEQ ID NO：59)以及外周表位区IV(AA353-359，AFLPESF，SEQ ID NO：60)的肽的氘吸收量数据显示于图15中。
实施例22.BsAb1与Erbb2.mmH结合的表位作图数据。
进行氢-氘交换质谱(HDX-MS)以确定与二价亲本抗体相互作用的HER2的氨基酸残基，所述二价亲本抗体包括BsAb1的结合臂(亲本Ab3和亲本Ab4)。使用与实施例21中所述相同的重组HER2蛋白(SEQ ID NO：54)。
HDX-MS实验在定制平台上进行，该平台由用于氘标记和淬灭的定制HDX自动化系统、用于样品消化和捕集的Waters Acquity二元溶剂管理器、用于分析梯度的另一个Waters Acquity二元溶剂管理器和用于肽鉴定和质量测量的Thermo Q Exactive HF质谱仪组成。
D2O标记溶液在基于D2O的缓冲液(50mM磷酸盐、100mM氯化钠，pD7.0)中制备。对于氘标记，将10μL的0.93mg/mL Her2蛋白或与亲本Ab3或亲本Ab4中的任一者预混合(抗原与抗体摩尔比1∶0.7)的Her2蛋白在20℃下与90μL D2O标记溶液一起重复温育不同时间点(非氘化对照为0分钟；氘标记15秒、60秒、600秒、3600秒和6000秒)。通过向每个样品中添加100μL 4M盐酸胍、0.85M TCEP缓冲液(通过HCl酸化至pH2.3)在15℃下温育180秒来淬灭氘化反应。然后将淬灭的样品注入LC系统，在15℃下进行联机胃蛋白酶消化。消化的肽在-6℃下通过C8色谱柱(1mm×50mm，Novabioassays)捕获，溶剂B的12.5分钟梯度为2-32％。(流动相A：0.2％甲酸水溶液，流动相B：0.2％甲酸的乙腈溶液)。通过Thermo Q Exactive HF质谱法以LC-MS/MS或LC-MS模式分析洗脱的肽。
使用Byonic搜索引擎(Protein Metrics)针对包括Her2蛋白的氨基酸序列及其逆序列的数据库搜索未氘化的Her2样品的LC-MS/MS数据。使用非特异性酶消化和人糖基化作为常见的变量修饰，将搜索参数设置为默认值。然后将鉴定出的肽列表导入HDX WorkBench软件(3.3版)，以计算所有氘化样品的氘吸收量(D-吸收)和氘吸收量百分比(％D)。肽的残基编号来自包括标签在内的实际蛋白质序列(N-末端残基T作为第1个AA)。
Figure BDA0003817518590001211
从单独的Her2和与亲本Ab3样品复合的Her2中共鉴定出386个来自HER2的肽，这代表Her2的99.8％序列覆盖。任何表现出氘吸收量百分比减少大于5％的肽都被定义为显著保护(Δ％D<-5％)。Her2 ECD在序列AA133-148即IQRNPQLCYQDTILWK(SEQ ID NO：61)和AA174-182即SPMCKGSRC(SEQ ID NO：62)处与亲本Ab3结合后显示出氘吸收量显著减少，这些序列被指定为亲本Ab3靶向的人Her2 ECD上的表位。此外，人Her2 ECD在序列AA194-200即TRTVCAG(SEQ ID NO：63)处与亲本Ab3结合后显示出氘吸收量的适度减少。覆盖表位区I(AA133-148，IQRNPQLCYQDTILWK，SEQ ID NO：61)和表位区II(AA174-182，SPMCKGSRC，SEQID NO：62)以及外周表位区III(AA194-200，TRTVCAG，SEQ ID NO：63)的肽的氘吸收量数据显示于图16中。
从单独的Her2和与亲本Ab4样品复合的Her2中共鉴定出385个来自HER2的肽，这代表Her2的99.7％序列覆盖。任何表现出氘吸收量百分比减少大于5％的肽都被定义为显著保护(Δ％D<-5％)。Her2 ECD在序列AA152-161即HKNNQLALTL(SEQ ID NO：64)处与亲本Ab4结合后显示出氘吸收量显著减少，这些序列被指定为亲本Ab4靶向的人Her2 ECD上的主要表位。此外，人Her2ECD在序列AA194-200即TRTVCAG(SEQ ID NO：63)和AA258-273即ESMPNPEGRYTFGASC(SEQ ID NO：65)处与亲本Ab4结合后显示出氘吸收量的适度减少。覆盖表位区I(AA152-161，HKNNQLALTL，SEQ ID NO：64)、外周表位区II(AA194-200，TRTVCAG，SEQID NO：63)以及区III(AA258-273，ESMPNPEGRYTFGASC，SEQ ID NO：65)的肽的氘吸收量数据以及检测到的氘减少显示于图17中。
本发明在范围上不受本文所描述的具体实施例的限制。实际上，除了本文中所描述的那些内容之外，本领域的技术人员根据前述说明和附图将显而易知本发明的各种修改。此类修改旨在落在所附权利要求书的范围内。
序列表
<110> 瑞泽恩制药公司（Regeneron Pharmaceuticals, Inc.）
J·安德列夫（ANDREEV, Julian）
A·佩雷·贝（PEREZ BAY, Andres）
C·戴利（DALY, Christopher）
F·德尔菲诺（DELFINO, Frank）
A·韩（HAN, Amy）
T·尼特托里（NITTOLI, Thomas）
W·奥尔森（OLSON, William）
G·瑟斯顿（THURSTON, Gavin）
<120> 结合HER2的双特异性抗原结合分子
及其使用方法
<130> 10719WO01
<140> TBD
<141> 2021-02-26
<150> 62/982,989
<151> 2020-02-28
<160> 65
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 1
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggcacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt ctccatcagt gactacgaaa tacactgggt ccgccaagtt 120
ccaggaaaag gtctggagtg ggtctctggt attggttctg ctggtaacac atattatcca 180
ggcgccgtga agggccgatt caccatctcc agagaaaatg ccaagaactc cttgtatctt 240
caagtgaaca gcctgacagt cggggacacg gctgtctatt attgtgcaag ggtctggtcc 300
cctctttatt acttcggttt ggacgtctgg ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctca 360
<210> 2
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 2
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ala Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Ile Ser Asp Tyr
20 25 30
Glu Ile His Trp Val Arg Gln Val Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Gly Ser Ala Gly Asn Thr Tyr Tyr Pro Gly Ala Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Val Asn Ser Leu Thr Val Gly Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Val Trp Ser Pro Leu Tyr Tyr Phe Gly Leu Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 3
ggattctcca tcagtgacta cgaa 24
<210> 4
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 4
Gly Phe Ser Ile Ser Asp Tyr Glu
1 5
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 5
attggttctg ctggtaacac a 21
<210> 6
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 6
Ile Gly Ser Ala Gly Asn Thr
1 5
<210> 7
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 7
gcaagggtct ggtcccctct ttattacttc ggtttggacg tc 42
<210> 8
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 8
Ala Arg Val Trp Ser Pro Leu Tyr Tyr Phe Gly Leu Asp Val
1 5 10
<210> 9
<211> 375
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 9
gaagtgcagc tggtggagtc tgggggagac ttggtacagc ctggcaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacttttgat gaatatgcca tgcactgggt ccggcaagct 120
ccagggaagg gcctggagtg ggtctcacat attagttgga atagtcatca catagcctat 180
gcggactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaggaa ctccctatat 240
ctgcaaatga atagtctgag acctgaggac acggccttgt atttctgtgt aaaagattgg 300
ggattgggag caagcggggg ctactactac gttttggacg tctggggcca agggaccacg 360
gtcaccgtct cctca 375
<210> 10
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 10
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Glu Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser His Ile Ser Trp Asn Ser His His Ile Ala Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Phe Cys
85 90 95
Val Lys Asp Trp Gly Leu Gly Ala Ser Gly Gly Tyr Tyr Tyr Val Leu
100 105 110
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 11
ggattcactt ttgatgaata tgcc 24
<210> 12
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 12
Gly Phe Thr Phe Asp Glu Tyr Ala
1 5
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 13
attagttgga atagtcatca cata 24
<210> 14
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 14
Ile Ser Trp Asn Ser His His Ile
1 5
<210> 15
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 15
gtaaaagatt ggggattggg agcaagcggg ggctactact acgttttgga cgtc 54
<210> 16
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 16
Val Lys Asp Trp Gly Leu Gly Ala Ser Gly Gly Tyr Tyr Tyr Val Leu
1 5 10 15
Asp Val
<210> 17
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 17
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccgtca 180
aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240
gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacagta cccctccgat caccttcggc 300
caagggacac gactggagat taaa 324
<210> 18
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 18
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro
85 90 95
Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 19
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 19
cagagcatta gcagctat 18
<210> 20
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 20
Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
1 5
<210> 21
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 21
gctgcatcc 9
<210> 22
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 22
Ala Ala Ser
1
<210> 23
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 23
caacagagtt acagtacccc tccgatcacc 30
<210> 24
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 24
Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro Ile Thr
1 5 10
<210> 25
<211> 1344
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 25
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggcacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt ctccatcagt gactacgaaa tacactgggt ccgccaagtt 120
ccaggaaaag gtctggagtg ggtctctggt attggttctg ctggtaacac atattatcca 180
ggcgccgtga agggccgatt caccatctcc agagaaaatg ccaagaactc cttgtatctt 240
caagtgaaca gcctgacagt cggggacacg gctgtctatt attgtgcaag ggtctggtcc 300
cctctttatt acttcggttt ggacgtctgg ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctca 360
gccagcacaa aaggtcctag cgtttttcca cttgccccat gttcaaggtc aacctccgaa 420
agtaccgccg ctcttggctg tctcgtaaaa gattattttc ccgaacctgt aactgtctcc 480
tggaactccg gcgcactcac ttccggcgta cataccttcc ccgctgtcct ccaatcttcc 540
ggtctctact ccctgtcttc tgttgtcact gttccatcat cctcactcgg cacaaaaaca 600
tatacctgca acgttgatca caagccaagt aataccaaag ttgataagcg cgtcgaatcc 660
aaatacggtc ccccctgccc cccatgtccc gctccagagt ttctcggtgg cccctctgtt 720
ttcctttttc cccctaaacc caaagatacc ctcatgattt ccagaacccc cgaggtcacc 780
tgcgtcgtcg ttgatgtaag ccaagaagat cccgaagtcc agttcaattg gtatgtagac 840
ggtgttgaag tccataatgc aaaaacaaaa cccagagagg aacagtttaa ttcaacctat 900
cgtgtcgtta gcgtactcac cgttcttcat caagactggc tcaatggaaa agaatataaa 960
tgtaaagtta gcaacaaagg tctgcccagt tcaatcgaaa aaacaattag caaagccaaa 1020
ggccaacctc gcgaacccca agtctatacc ttgccccctt ctcaggaaga aatgaccaaa 1080
aaccaagttt cactcacatg cctcgtaaaa ggattctatc catcagacat tgcagtagaa 1140
tgggaatcta acggccaacc tgaaaataat tacaaaacca ctcctcctgt cctcgattct 1200
gacggctctt ttttccttta ctccagattg actgttgata aatcccgctg gcaggaaggt 1260
aacgtttttt cttgttctgt gatgcacgaa gccctccata acagattcac tcaaaaatct 1320
ctttctctct cccctggcaa ataa 1344
<210> 26
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 26
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ala Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Ile Ser Asp Tyr
20 25 30
Glu Ile His Trp Val Arg Gln Val Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Gly Ser Ala Gly Asn Thr Tyr Tyr Pro Gly Ala Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Val Asn Ser Leu Thr Val Gly Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Val Trp Ser Pro Leu Tyr Tyr Phe Gly Leu Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro
210 215 220
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 27
<211> 1359
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 27
gaagtgcagc tggtggagtc tgggggagac ttggtacagc ctggcaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacttttgat gaatatgcca tgcactgggt ccggcaagct 120
ccagggaagg gcctggagtg ggtctcacat attagttgga atagtcatca catagcctat 180
gcggactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaggaa ctccctatat 240
ctgcaaatga atagtctgag acctgaggac acggccttgt atttctgtgt aaaagattgg 300
ggattgggag caagcggggg ctactactac gttttggacg tctggggcca agggaccacg 360
gtcaccgtct cctcagcctc caccaagggc ccatcggtct tccccctggc gccctgctcc 420
aggagcacct ccgagagcac agccgccctg ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgaa 480
ccggtgacgg tgtcgtggaa ctcaggcgcc ctgaccagcg gcgtgcacac cttcccggct 540
gtcctacagt cctcaggact ctactccctc agcagcgtgg tgaccgtgcc ctccagcagc 600
ttgggcacga agacctacac ctgcaacgta gatcacaagc ccagcaacac caaggtggac 660
aagagagttg agtccaaata tggtccccca tgcccaccct gcccagcacc tgagttcctg 720
gggggaccat cagtcttcct gttcccccca aaacccaagg acactctcat gatctcccgg 780
acccctgagg tcacgtgcgt ggtggtggac gtgagccagg aagaccccga ggtccagttc 840
aactggtacg tggatggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 900
ttcaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaac 960
ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaaggcctcc cgtcctccat cgagaaaacc 1020
atctccaaag ccaaagggca gccccgagag ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccag 1080
gaggagatga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctaccccagc 1140
gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 1200
cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca ggctcaccgt ggacaagagc 1260
aggtggcagg aggggaatgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 1320
tacacacaga agtccctctc cctgtctctg ggtaaatga 1359
<210> 28
<211> 452
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 28
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Glu Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser His Ile Ser Trp Asn Ser His His Ile Ala Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Phe Cys
85 90 95
Val Lys Asp Trp Gly Leu Gly Ala Ser Gly Gly Tyr Tyr Tyr Val Leu
100 105 110
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
115 120 125
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser
130 135 140
Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
145 150 155 160
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
165 170 175
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
180 185 190
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys
195 200 205
Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu
210 215 220
Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu
225 230 235 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
245 250 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
260 265 270
Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
275 280 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
290 295 300
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
305 310 315 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser
325 330 335
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
340 345 350
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
355 360 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
370 375 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
385 390 395 400
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr
405 410 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
420 425 430
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
435 440 445
Ser Leu Gly Lys
450
<210> 29
<211> 648
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 29
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccgtca 180
aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240
gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacagta cccctccgat caccttcggc 300
caagggacac gactggagat taaacgaact gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 360
ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 420
tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 480
caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 540
acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 600
ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgttag 648
<210> 30
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 30
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro
85 90 95
Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 31
<211> 381
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 31
caggtgcagc tggtggagtc tgggggcggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgaag cctctggctt caccttcagt ggctatgccc tacactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtgacagtt atatcatatg atggaagtga taaattctat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtac 240
ctgcaaatga acagcctgag aactgaggac acggctctgt attactgtgc gaaagattgg 300
gggacatatc actggaacta cggccactac aattatgtta tggacgtctg gggccaaggg 360
accacggtca ccgtctcctc a 381
<210> 32
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 32
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Ala Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Thr Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asp Lys Phe Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Trp Gly Thr Tyr His Trp Asn Tyr Gly His Tyr Asn Tyr
100 105 110
Val Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 33
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 33
ggcttcacct tcagtggcta tgcc 24
<210> 34
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 34
Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr Ala
1 5
<210> 35
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 35
atatcatatg atggaagtga taaa 24
<210> 36
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 36
Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asp Lys
1 5
<210> 37
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 37
gcgaaagatt gggggacata tcactggaac tacggccact acaattatgt tatggacgtc 60
<210> 38
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 38
Ala Lys Asp Trp Gly Thr Tyr His Trp Asn Tyr Gly His Tyr Asn Tyr
1 5 10 15
Val Met Asp Val
20
<210> 39
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 39
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtcaagc ctggcgggtc cctgagactc 60
tcctgcgcag cctctggatt caccttcagt gactactaca tgagctggat ccgtcaggct 120
ccagggaagg gactggaatg gatttcatac attagcgaca atcgtgatac cgtatactac 180
gcagactctg tgaagggccg attcaccatc tccagggaca acgcccagag tatactatat 240
ttgcaactga gaagcctgag agccgaggac acggccatat attattgtgc gagagtggca 300
tacggtgcta attcacggtt ttactttccc tactggggcc agggaaccct ggtcaccgtc 360
tcctca 366
<210> 40
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 40
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Asp Asn Arg Asp Thr Val Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Gln Ser Ile Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Arg Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val Ala Tyr Gly Ala Asn Ser Arg Phe Tyr Phe Pro Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 41
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 41
ggattcacct tcagtgacta ctac 24
<210> 42
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 42
Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Tyr
1 5
<210> 43
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> G F T F S D Y Y
<400> 43
attagcgaca atcgtgatac cgta 24
<210> 44
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 44
Ile Ser Asp Asn Arg Asp Thr Val
1 5
<210> 45
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 45
gcgagagtgg catacggtgc taattcacgg ttttactttc cctac 45
<210> 46
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 46
Ala Arg Val Ala Tyr Gly Ala Asn Ser Arg Phe Tyr Phe Pro Tyr
1 5 10 15
<210> 47
<211> 1365
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 47
caggtgcagc tggtggagtc tgggggcggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgaag cctctggctt caccttcagt ggctatgccc tacactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtgacagtt atatcatatg atggaagtga taaattctat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtac 240
ctgcaaatga acagcctgag aactgaggac acggctctgt attactgtgc gaaagattgg 300
gggacatatc actggaacta cggccactac aattatgtta tggacgtctg gggccaaggg 360
accacggtca ccgtctcctc agccagcaca aaaggtccta gcgtttttcc acttgcccca 420
tgttcaaggt caacctccga aagtaccgcc gctcttggct gtctcgtaaa agattatttt 480
cccgaacctg taactgtctc ctggaactcc ggcgcactca cttccggcgt acataccttc 540
cccgctgtcc tccaatcttc cggtctctac tccctgtctt ctgttgtcac tgttccatca 600
tcctcactcg gcacaaaaac atatacctgc aacgttgatc acaagccaag taataccaaa 660
gttgataagc gcgtcgaatc caaatacggt cccccctgcc ccccatgtcc cgctccagag 720
tttctcggtg gcccctctgt tttccttttt ccccctaaac ccaaagatac cctcatgatt 780
tccagaaccc ccgaggtcac ctgcgtcgtc gttgatgtaa gccaagaaga tcccgaagtc 840
cagttcaatt ggtatgtaga cggtgttgaa gtccataatg caaaaacaaa acccagagag 900
gaacagttta attcaaccta tcgtgtcgtt agcgtactca ccgttcttca tcaagactgg 960
ctcaatggaa aagaatataa atgtaaagtt agcaacaaag gtctgcccag ttcaatcgaa 1020
aaaacaatta gcaaagccaa aggccaacct cgcgaacccc aagtctatac cttgccccct 1080
tctcaggaag aaatgaccaa aaaccaagtt tcactcacat gcctcgtaaa aggattctat 1140
ccatcagaca ttgcagtaga atgggaatct aacggccaac ctgaaaataa ttacaaaacc 1200
actcctcctg tcctcgattc tgacggctct tttttccttt actccagatt gactgttgat 1260
aaatcccgct ggcaggaagg taacgttttt tcttgttctg tgatgcacga agccctccat 1320
aacagattca ctcaaaaatc tctttctctc tcccctggca aataa 1365
<210> 48
<211> 454
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 48
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Ala Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Thr Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asp Lys Phe Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Trp Gly Thr Tyr His Trp Asn Tyr Gly His Tyr Asn Tyr
100 105 110
Val Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala
115 120 125
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser
130 135 140
Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe
145 150 155 160
Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly
165 170 175
Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
180 185 190
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr
195 200 205
Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg
210 215 220
Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
225 230 235 240
Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
245 250 255
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
260 265 270
Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
275 280 285
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
290 295 300
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
305 310 315 320
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
325 330 335
Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
340 345 350
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn
355 360 365
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
370 375 380
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
385 390 395 400
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg
405 410 415
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys
420 425 430
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu
435 440 445
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
450
<210> 49
<211> 1350
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 49
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtcaagc ctggcgggtc cctgagactc 60
tcctgcgcag cctctggatt caccttcagt gactactaca tgagctggat ccgtcaggct 120
ccagggaagg gactggaatg gatttcatac attagcgaca atcgtgatac cgtatactac 180
gcagactctg tgaagggccg attcaccatc tccagggaca acgcccagag tatactatat 240
ttgcaactga gaagcctgag agccgaggac acggccatat attattgtgc gagagtggca 300
tacggtgcta attcacggtt ttactttccc tactggggcc agggaaccct ggtcaccgtc 360
tcctcagcct ccaccaaggg cccatcggtc ttccccctgg cgccctgctc caggagcacc 420
tccgagagca cagccgccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg 480
gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag 540
tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacg 600
aagacctaca cctgcaacgt agatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagagagtt 660
gagtccaaat atggtccccc atgcccaccc tgcccagcac ctgagttcct ggggggacca 720
tcagtcttcc tgttcccccc aaaacccaag gacactctca tgatctcccg gacccctgag 780
gtcacgtgcg tggtggtgga cgtgagccag gaagaccccg aggtccagtt caactggtac 840
gtggatggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gttcaacagc 900
acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa cggcaaggag 960
tacaagtgca aggtctccaa caaaggcctc ccgtcctcca tcgagaaaac catctccaaa 1020
gccaaagggc agccccgaga gccacaggtg tacaccctgc ccccatccca ggaggagatg 1080
accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctaccccag cgacatcgcc 1140
gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1200
gactccgacg gctccttctt cctctacagc aggctcaccg tggacaagag caggtggcag 1260
gaggggaatg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacacag 1320
aagtccctct ccctgtctct gggtaaatga 1350
<210> 50
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 50
Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser
1 5 10 15
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Tyr
20 25 30
Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Ser
35 40 45
Tyr Ile Ser Asp Asn Arg Asp Thr Val Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Gln Ser Ile Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Leu Arg Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Val Ala Tyr Gly Ala Asn Ser Arg Phe Tyr Phe Pro Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
<210> 51
<211> 863
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 51
Thr Gln Val Cys Thr Gly Thr Asp Met Lys Leu Arg Leu Pro Ala Ser
1 5 10 15
Pro Glu Thr His Leu Asp Met Leu Arg His Leu Tyr Gln Gly Cys Gln
20 25 30
Val Val Gln Gly Asn Leu Glu Leu Thr Tyr Leu Pro Thr Asn Ala Ser
35 40 45
Leu Ser Phe Leu Gln Asp Ile Gln Glu Val Gln Gly Tyr Val Leu Ile
50 55 60
Ala His Asn Gln Val Arg Gln Val Pro Leu Gln Arg Leu Arg Ile Val
65 70 75 80
Arg Gly Thr Gln Leu Phe Glu Asp Asn Tyr Ala Leu Ala Val Leu Asp
85 90 95
Asn Gly Asp Pro Leu Asn Asn Thr Thr Pro Val Thr Gly Ala Ser Pro
100 105 110
Gly Gly Leu Arg Glu Leu Gln Leu Arg Ser Leu Thr Glu Ile Leu Lys
115 120 125
Gly Gly Val Leu Ile Gln Arg Asn Pro Gln Leu Cys Tyr Gln Asp Thr
130 135 140
Ile Leu Trp Lys Asp Ile Phe His Lys Asn Asn Gln Leu Ala Leu Thr
145 150 155 160
Leu Ile Asp Thr Asn Arg Ser Arg Ala Cys His Pro Cys Ser Pro Met
165 170 175
Cys Lys Gly Ser Arg Cys Trp Gly Glu Ser Ser Glu Asp Cys Gln Ser
180 185 190
Leu Thr Arg Thr Val Cys Ala Gly Gly Cys Ala Arg Cys Lys Gly Pro
195 200 205
Leu Pro Thr Asp Cys Cys His Glu Gln Cys Ala Ala Gly Cys Thr Gly
210 215 220
Pro Lys His Ser Asp Cys Leu Ala Cys Leu His Phe Asn His Ser Gly
225 230 235 240
Ile Cys Glu Leu His Cys Pro Ala Leu Val Thr Tyr Asn Thr Asp Thr
245 250 255
Phe Glu Ser Met Pro Asn Pro Glu Gly Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ser
260 265 270
Cys Val Thr Ala Cys Pro Tyr Asn Tyr Leu Ser Thr Asp Val Gly Ser
275 280 285
Cys Thr Leu Val Cys Pro Leu His Asn Gln Glu Val Thr Ala Glu Asp
290 295 300
Gly Thr Gln Arg Cys Glu Lys Cys Ser Lys Pro Cys Ala Arg Val Cys
305 310 315 320
Tyr Gly Leu Gly Met Glu His Leu Arg Glu Val Arg Ala Val Thr Ser
325 330 335
Ala Asn Ile Gln Glu Phe Ala Gly Cys Lys Lys Ile Phe Gly Ser Leu
340 345 350
Ala Phe Leu Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp Pro Ala Ser Asn Thr Ala
355 360 365
Pro Leu Gln Pro Glu Gln Leu Gln Val Phe Glu Thr Leu Glu Glu Ile
370 375 380
Thr Gly Tyr Leu Tyr Ile Ser Ala Trp Pro Asp Ser Leu Pro Asp Leu
385 390 395 400
Ser Val Phe Gln Asn Leu Gln Val Ile Arg Gly Arg Ile Leu His Asn
405 410 415
Gly Ala Tyr Ser Leu Thr Leu Gln Gly Leu Gly Ile Ser Trp Leu Gly
420 425 430
Leu Arg Ser Leu Arg Glu Leu Gly Ser Gly Leu Ala Leu Ile His His
435 440 445
Asn Thr His Leu Cys Phe Val His Thr Val Pro Trp Asp Gln Leu Phe
450 455 460
Arg Asn Pro His Gln Ala Leu Leu His Thr Ala Asn Arg Pro Glu Asp
465 470 475 480
Glu Cys Val Gly Glu Gly Leu Ala Cys His Gln Leu Cys Ala Arg Gly
485 490 495
His Cys Trp Gly Pro Gly Pro Thr Gln Cys Val Asn Cys Ser Gln Phe
500 505 510
Leu Arg Gly Gln Glu Cys Val Glu Glu Cys Arg Val Leu Gln Gly Leu
515 520 525
Pro Arg Glu Tyr Val Asn Ala Arg His Cys Leu Pro Cys His Pro Glu
530 535 540
Cys Gln Pro Gln Asn Gly Ser Val Thr Cys Phe Gly Pro Glu Ala Asp
545 550 555 560
Gln Cys Val Ala Cys Ala His Tyr Lys Asp Pro Pro Phe Cys Val Ala
565 570 575
Arg Cys Pro Ser Gly Val Lys Pro Asp Leu Ser Tyr Met Pro Ile Trp
580 585 590
Lys Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala Cys Gln Pro Cys Pro Ile Asn Cys
595 600 605
Thr His Ser Cys Val Asp Leu Asp Asp Lys Gly Cys Pro Ala Glu Gln
610 615 620
Arg Ala Ser Pro Leu Thr Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys
625 630 635 640
Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
645 650 655
Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser
660 665 670
Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp
675 680 685
Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln
690 695 700
Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser
705 710 715 720
Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys
725 730 735
Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile
740 745 750
Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro
755 760 765
Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met
770 775 780
Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn
785 790 795 800
Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser
805 810 815
Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn
820 825 830
Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu
835 840 845
His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys
850 855 860
<210> 52
<211> 713
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 52
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu
115 120 125
Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser
130 135 140
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr
145 150 155 160
Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val Ala
165 170 175
Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys
180 185 190
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu
195 200 205
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser
210 215 220
Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
225 230 235 240
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
245 250 255
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
260 265 270
Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
275 280 285
Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
290 295 300
Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile
305 310 315 320
Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
325 330 335
Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
340 345 350
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Asp Ala Tyr Asn Tyr Tyr
355 360 365
Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
370 375 380
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser
385 390 395 400
Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe
405 410 415
Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly
420 425 430
Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
435 440 445
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr
450 455 460
Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg
465 470 475 480
Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
485 490 495
Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Cys Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
500 505 510
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
515 520 525
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
530 535 540
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
545 550 555 560
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
565 570 575
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
580 585 590
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
595 600 605
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
610 615 620
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
625 630 635 640
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
645 650 655
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
660 665 670
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
675 680 685
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
690 695 700
Lys Ser Leu Cys Leu Ser Pro Gly Lys
705 710
<210> 53
<211> 220
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 53
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Phe Phe Arg
20 25 30
Ser Asn Asn Lys Asn Ile Leu Ala Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Ser Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys
65 70 75 80
Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Phe Gly Ser Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile
100 105 110
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
115 120 125
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
130 135 140
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
145 150 155 160
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
165 170 175
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
180 185 190
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
195 200 205
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215 220
<210> 54
<211> 658
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 54
Thr Gln Val Cys Thr Gly Thr Asp Met Lys Leu Arg Leu Pro Ala Ser
1 5 10 15
Pro Glu Thr His Leu Asp Met Leu Arg His Leu Tyr Gln Gly Cys Gln
20 25 30
Val Val Gln Gly Asn Leu Glu Leu Thr Tyr Leu Pro Thr Asn Ala Ser
35 40 45
Leu Ser Phe Leu Gln Asp Ile Gln Glu Val Gln Gly Tyr Val Leu Ile
50 55 60
Ala His Asn Gln Val Arg Gln Val Pro Leu Gln Arg Leu Arg Ile Val
65 70 75 80
Arg Gly Thr Gln Leu Phe Glu Asp Asn Tyr Ala Leu Ala Val Leu Asp
85 90 95
Asn Gly Asp Pro Leu Asn Asn Thr Thr Pro Val Thr Gly Ala Ser Pro
100 105 110
Gly Gly Leu Arg Glu Leu Gln Leu Arg Ser Leu Thr Glu Ile Leu Lys
115 120 125
Gly Gly Val Leu Ile Gln Arg Asn Pro Gln Leu Cys Tyr Gln Asp Thr
130 135 140
Ile Leu Trp Lys Asp Ile Phe His Lys Asn Asn Gln Leu Ala Leu Thr
145 150 155 160
Leu Ile Asp Thr Asn Arg Ser Arg Ala Cys His Pro Cys Ser Pro Met
165 170 175
Cys Lys Gly Ser Arg Cys Trp Gly Glu Ser Ser Glu Asp Cys Gln Ser
180 185 190
Leu Thr Arg Thr Val Cys Ala Gly Gly Cys Ala Arg Cys Lys Gly Pro
195 200 205
Leu Pro Thr Asp Cys Cys His Glu Gln Cys Ala Ala Gly Cys Thr Gly
210 215 220
Pro Lys His Ser Asp Cys Leu Ala Cys Leu His Phe Asn His Ser Gly
225 230 235 240
Ile Cys Glu Leu His Cys Pro Ala Leu Val Thr Tyr Asn Thr Asp Thr
245 250 255
Phe Glu Ser Met Pro Asn Pro Glu Gly Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ser
260 265 270
Cys Val Thr Ala Cys Pro Tyr Asn Tyr Leu Ser Thr Asp Val Gly Ser
275 280 285
Cys Thr Leu Val Cys Pro Leu His Asn Gln Glu Val Thr Ala Glu Asp
290 295 300
Gly Thr Gln Arg Cys Glu Lys Cys Ser Lys Pro Cys Ala Arg Val Cys
305 310 315 320
Tyr Gly Leu Gly Met Glu His Leu Arg Glu Val Arg Ala Val Thr Ser
325 330 335
Ala Asn Ile Gln Glu Phe Ala Gly Cys Lys Lys Ile Phe Gly Ser Leu
340 345 350
Ala Phe Leu Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp Pro Ala Ser Asn Thr Ala
355 360 365
Pro Leu Gln Pro Glu Gln Leu Gln Val Phe Glu Thr Leu Glu Glu Ile
370 375 380
Thr Gly Tyr Leu Tyr Ile Ser Ala Trp Pro Asp Ser Leu Pro Asp Leu
385 390 395 400
Ser Val Phe Gln Asn Leu Gln Val Ile Arg Gly Arg Ile Leu His Asn
405 410 415
Gly Ala Tyr Ser Leu Thr Leu Gln Gly Leu Gly Ile Ser Trp Leu Gly
420 425 430
Leu Arg Ser Leu Arg Glu Leu Gly Ser Gly Leu Ala Leu Ile His His
435 440 445
Asn Thr His Leu Cys Phe Val His Thr Val Pro Trp Asp Gln Leu Phe
450 455 460
Arg Asn Pro His Gln Ala Leu Leu His Thr Ala Asn Arg Pro Glu Asp
465 470 475 480
Glu Cys Val Gly Glu Gly Leu Ala Cys His Gln Leu Cys Ala Arg Gly
485 490 495
His Cys Trp Gly Pro Gly Pro Thr Gln Cys Val Asn Cys Ser Gln Phe
500 505 510
Leu Arg Gly Gln Glu Cys Val Glu Glu Cys Arg Val Leu Gln Gly Leu
515 520 525
Pro Arg Glu Tyr Val Asn Ala Arg His Cys Leu Pro Cys His Pro Glu
530 535 540
Cys Gln Pro Gln Asn Gly Ser Val Thr Cys Phe Gly Pro Glu Ala Asp
545 550 555 560
Gln Cys Val Ala Cys Ala His Tyr Lys Asp Pro Pro Phe Cys Val Ala
565 570 575
Arg Cys Pro Ser Gly Val Lys Pro Asp Leu Ser Tyr Met Pro Ile Trp
580 585 590
Lys Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala Cys Gln Pro Cys Pro Ile Asn Cys
595 600 605
Thr His Ser Cys Val Asp Leu Asp Asp Lys Gly Cys Pro Ala Glu Gln
610 615 620
Arg Ala Ser Pro Leu Thr Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu
625 630 635 640
Gly Gly Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu His His His His
645 650 655
His His
<210> 55
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 55
Tyr Gln Asp Thr Ile
1 5
<210> 56
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 56
Arg Ser Arg Ala Cys His Pro Cys Ser Pro Met Cys Lys Gly Ser Arg
1 5 10 15
Cys
<210> 57
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 57
Met Lys Leu Arg Leu Pro Ala Ser Pro Glu Thr His Leu Asp Met
1 5 10 15
<210> 58
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 58
Thr Tyr Leu Pro Thr Asn Ala Ser Leu Ser Phe
1 5 10
<210> 59
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 59
Ile Ala His Asn Gln Val Arg Gln Val Pro Leu Gln Arg Leu
1 5 10
<210> 60
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 60
Ala Phe Leu Pro Glu Ser Phe
1 5
<210> 61
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 61
Ile Gln Arg Asn Pro Gln Leu Cys Tyr Gln Asp Thr Ile Leu Trp Lys
1 5 10 15
<210> 62
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 62
Ser Pro Met Cys Lys Gly Ser Arg Cys
1 5
<210> 63
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 63
Thr Arg Thr Val Cys Ala Gly
1 5
<210> 64
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 64
His Lys Asn Asn Gln Leu Ala Leu Thr Leu
1 5 10
<210> 65
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 65
Glu Ser Met Pro Asn Pro Glu Gly Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ser Cys
1 5 10 15

Claims (90)

1.一种双特异性抗原结合分子，所述双特异性抗原结合分子包含：
第一抗原结合结构域(D1)；和
第二抗原结合结构域(D2)；
其中D1特异性地结合人HER2的第一表位；并且
其中D2特异性地结合人HER2的第二表位。
2.如权利要求1所述的双特异性抗原结合分子，其中D1和D2不彼此竞争与人HER2的结合。
3.如权利要求1或2所述的双特异性抗原结合分子，其中所述双特异性抗原结合分子具有以下特征中的一者或多者：
(a)以小于约1nM的解离半衰期结合至ErbB2，如在表面等离子共振测定法中所测量；
(b)以至少约30分钟的t1/2结合至ErbB2，如在表面等离子共振测定法中所测量；
(c)与曲妥珠单抗相比，以更大的亲和力和/或亲合力结合至细胞表面HER2；
(d)与曲妥珠单抗相比，以更高的效率结合至表达HER2 IHC2+和IHC3+的细胞；
(e)与曲妥珠单抗相比，以更大的IC50结合至表达HER2 IHC1+的细胞；
(f)结合至表达中等或高HER2水平的细胞，但不结合至表达低HER2水平的细胞；
(g)在表达HER2的细胞表面上形成抗体簇；以及
(h)与曲妥珠单抗相比，被表达HER2的细胞更有效地内化。
4.如权利要求1至3中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中D1包含在重链可变区(HCVR)内的三个重链互补决定区(HCDR1、HCDR2和HCDR3)和在轻链可变区(LCVR)内的三个轻链互补决定区(LCDR1、LCDR2和LCDR3)，所述重链可变区包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列。
5.如权利要求4所述的双特异性抗原结合分子，其中HCDR1包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或与其具有至少95％同一性的氨基酸序列；HCDR2包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列或与其具有至少95％同一性的氨基酸序列；HCDR3包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列或与其具有至少95％同一性的氨基酸序列；LCDR1包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列或与其具有至少95％同一性的氨基酸序列；LCDR2包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列或与其具有至少95％同一性的氨基酸序列；并且LCDR3包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列或与其具有至少95％同一性的氨基酸序列。
6.如权利要求5所述的双特异性抗原结合分子，其中HCDR1包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列；HCDR2包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列；HCDR3包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列；LCDR1包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列；LCDR2包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列；并且LCDR3包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列。
7.如权利要求5所述的双特异性抗原结合分子，其中所述双特异性抗原结合分子包含HCVR和LCVR，所述HCVR包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或与其具有至少95％同一性的氨基酸序列；所述LCVR包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列或与其具有至少95％同一性的氨基酸序列。
8.如权利要求7所述的双特异性抗原结合分子，其中所述双特异性抗原结合分子包含HCVR和LCVR，所述HCVR包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列；所述LCVR包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列。
9.如权利要求1至8中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中D2包含在重链可变区(HCVR)内的三个重链互补决定区(HCDR1、HCDR2和HCDR3)和在轻链可变区(LCVR)内的三个轻链互补决定区(LCDR1、LCDR2和LCDR3)，所述重链可变区包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列。
10.如权利要求9所述的双特异性抗原结合分子，其中HCDR1包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列或与其具有至少95％同一性的氨基酸序列；HCDR2包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列或与其具有至少95％同一性的氨基酸序列；HCDR3包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列或与其具有至少95％同一性的氨基酸序列；LCDR1包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列或与其具有至少95％同一性的氨基酸序列；LCDR2包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列或与其具有至少95％同一性的氨基酸序列；并且LCDR3包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列或与其具有至少95％同一性的氨基酸序列。
11.如权利要求10所述的双特异性抗原结合分子，其中HCDR1包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列；HCDR2包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列；HCDR3包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列；LCDR1包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列；LCDR2包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列；并且LCDR3包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列。
12.如权利要求10所述的双特异性抗原结合分子，其中所述双特异性抗原结合分子包含HCVR和LCVR，所述HCVR包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列或与其具有至少95％同一性的氨基酸序列；所述LCVR包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列或与其具有至少95％同一性的氨基酸序列。
13.如权利要求12所述的双特异性抗原结合分子，其中所述双特异性抗原结合分子包含HCVR和LCVR，所述HCVR包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列；所述LCVR包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列。
14.如权利要求1至3中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中D1包含在重链可变区(HCVR)内的三个重链互补决定区(HCDR1、HCDR2和HCDR3)和在轻链可变区(LCVR)内的三个轻链互补决定区(LCDR1、LCDR2和LCDR3)，所述重链可变区包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列。
15.如权利要求14所述的双特异性抗原结合分子，其中HCDR1包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列或与其具有至少95％同一性的氨基酸序列；HCDR2包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列或与其具有至少95％同一性的氨基酸序列；HCDR3包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列或与其具有至少95％同一性的氨基酸序列；LCDR1包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列或与其具有至少95％同一性的氨基酸序列；LCDR2包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列或与其具有至少95％同一性的氨基酸序列；并且LCDR3包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列或与其具有至少95％同一性的氨基酸序列。
16.如权利要求15所述的双特异性抗原结合分子，其中HCDR1包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列；HCDR2包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列；HCDR3包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列；LCDR1包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列；LCDR2包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列；并且LCDR3包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列。
17.如权利要求15所述的双特异性抗原结合分子，其中所述双特异性抗原结合分子包含HCVR和LCVR，所述HCVR包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列或与其具有至少95％同一性的氨基酸序列；所述LCVR包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列或与其具有至少95％同一性的氨基酸序列。
18.如权利要求17所述的双特异性抗原结合分子，其中所述双特异性抗原结合分子包含HCVR和LCVR，所述HCVR包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列；所述LCVR包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列。
19.如权利要求14至18中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中D2包含在重链可变区(HCVR)内的三个重链互补决定区(HCDR1、HCDR2和HCDR3)和在轻链可变区(LCVR)内的三个轻链互补决定区(LCDR1、LCDR2和LCDR3)，所述重链可变区包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列。
20.如权利要求19所述的双特异性抗原结合分子，其中HCDR1包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列或与其具有至少95％同一性的氨基酸序列；HCDR2包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列或与其具有至少95％同一性的氨基酸序列；HCDR3包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列或与其具有至少95％同一性的氨基酸序列；LCDR1包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列或与其具有至少95％同一性的氨基酸序列；LCDR2包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列或与其具有至少95％同一性的氨基酸序列；并且LCDR3包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列或与其具有至少95％同一性的氨基酸序列。
21.如权利要求20所述的双特异性抗原结合分子，其中HCDR1包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列；HCDR2包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列；HCDR3包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列；LCDR1包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列；LCDR2包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列；并且LCDR3包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列。
22.如权利要求20所述的双特异性抗原结合分子，其中所述双特异性抗原结合分子包含HCVR和LCVR，所述HCVR包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列或与其具有至少95％同一性的氨基酸序列；所述LCVR包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列或与其具有至少95％同一性的氨基酸序列。
23.如权利要求22所述的双特异性抗原结合分子，其中所述双特异性抗原结合分子包含HCVR和LCVR，所述HCVR包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列；所述LCVR包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列。
24.如权利要求1所述的双特异性抗原结合分子，其中所述双特异性抗原结合分子缀合至细胞毒素。
25.如权利要求24所述的双特异性抗原结合分子，其中所述双特异性抗原结合分子具有以下特征中的一者或多者：
(a)相对于缀合至细胞毒素的曲妥珠单抗，以更低的剂量展示出更大的肿瘤杀伤力；
(b)相对于缀合至DM1的曲妥珠单抗，以更低的剂量展示出更大的肿瘤杀伤力；
(c)相对于缀合至细胞毒素的Medi-x，以更低的剂量展示出更大的肿瘤杀伤力；
(d)相对于缀合至微管溶素-x的Medi-x，以更低的剂量展示出更大的肿瘤杀伤力；
(e)抑制中等和高HER2表达水平的癌症的生长，但不抑制低HER2表达水平的组织的生长；以及
(f)促进中等和高HER2表达水平的癌症的肿瘤消退，但不促进低HER2表达水平的组织的肿瘤消退。
26.如权利要求25所述的双特异性抗原结合分子，其中所述细胞毒素选自由以下各项组成的组：生物毒素、化学治疗剂和放射性同位素。
27.如权利要求25所述的双特异性抗原结合分子，其中所述细胞毒素是微管溶素或拟美坦辛。
28.如权利要求1所述的双特异性抗原结合分子，其中所述双特异性抗原结合分子通过接头缀合至细胞毒素。
29.如权利要求28所述的双特异性抗原结合分子，其中所述细胞毒素是微管溶素。
30.如权利要求29所述的双特异性抗原结合分子，其中所述微管溶素是：
Figure FDA0003817518580000061
31.如权利要求28所述的双特异性抗原结合分子，其中所述双特异性抗原结合分子缀合至
Figure FDA0003817518580000071
或其区域异构体，其中
Figure FDA0003817518580000072
是与重链谷氨酰胺连接的键。
32.如权利要求29所述的双特异性抗原结合分子，其中所述双特异性抗原结合分子通过Q295缀合至微管溶素。
33.如权利要求29所述的双特异性抗原结合分子，其中所述双特异性抗原结合分子通过Q297缀合至微管溶素。
34.如权利要求29所述的双特异性抗原结合分子，其中所述接头是叠氮基-PEG3-胺。
35.如权利要求30所述的双特异性抗原结合分子，其中所述双特异性抗原结合分子包含在SEQ ID NO:2的D1-HCVR氨基酸序列内的CDR和在SEQ ID NO:10的D2-HCVR氨基酸序列内的CDR。
36.如权利要求30所述的双特异性抗原结合分子，其中所述双特异性抗原结合分子包含在SEQ ID NO:32的D1-HCVR氨基酸序列内的CDR和在SEQ ID NO:40的D2-HCVR氨基酸序列内的CDR。
37.如权利要求28所述的双特异性抗原结合分子，其中所述细胞毒性剂是拟美坦辛。
38.如权利要求37所述的双特异性抗原结合分子，其中所述双特异性抗原结合分子包含在SEQ ID NO:2的D1-HCVR氨基酸序列内的CDR和在SEQ ID NO:10的D2-HCVR氨基酸序列内的CDR。
39.如权利要求38所述的双特异性抗原结合分子，其中所述双特异性抗原结合分子包含在SEQ ID NO:32的D1-HCVR氨基酸序列内的CDR和在SEQ ID NO:40的D2-HCVR氨基酸序列内的CDR。
40.如权利要求37所述的双特异性抗原结合分子，其中所述拟美坦辛是：
Figure FDA0003817518580000081
其中
Figure FDA0003817518580000082
是与接头连接的键。
41.如权利要求40所述的双特异性抗原结合分子，其中所述接头是：
Figure FDA0003817518580000083
其中用
Figure FDA0003817518580000084
表示的键代表与所述双特异性抗原结合分子连接的键，并且用
Figure FDA0003817518580000085
表示的键代表与所述拟美坦辛连接的键。
42.如权利要求37所述的双特异性抗原结合分子，其中所述拟美坦辛是
Figure FDA0003817518580000086
其中
Figure FDA0003817518580000087
是与接头连接的键。
43.如权利要求42所述的双特异性抗原结合分子，其中所述接头是：
Figure FDA0003817518580000091
其中用
Figure FDA0003817518580000092
表示的键代表与所述双特异性抗原结合分子连接的键，并且用
Figure FDA0003817518580000093
表示的键代表与所述拟美坦辛连接的键。
44.一种药物组合物，所述药物组合物包含如权利要求1所述的双特异性抗原结合分子以及药学上可接受的载剂。
45.一种治疗患有过表达HER2的肿瘤的受试者的癌症的方法，所述方法包括将如权利要求24至43中任一项所述的双特异性抗原结合分子施用于所述受试者。
46.如权利要求36所述的方法，其中所述癌症选自由以下各项组成的组：乳腺癌、肺癌、胃癌、宫颈癌、胃癌、子宫内膜癌和卵巢癌。
47.如权利要求45所述的方法，还包括将第二抗癌治疗剂施用于所述受试者。
48.一种治疗受试者的癌症、减少受试者的肿瘤生长和/或引起受试者的肿瘤消退的方法，所述方法包括将包含双特异性抗原结合分子和细胞毒素的抗体-药物缀合物(ADC)施用于有需要的受试者，其中所述双特异性抗原结合分子包含：
第一抗原结合结构域(D1)；和
第二抗原结合结构域(D2)；
其中D1特异性地结合人HER2的第一表位；并且
其中D2特异性地结合人HER2的第二表位。
49.如权利要求48所述的方法，其中D1包含在重链可变区(HCVR)内的三个重链互补决定区(HCDR1、HCDR2和HCDR3)和在轻链可变区(LCVR)内的三个轻链互补决定区(LCDR1、LCDR2和LCDR3)，所述重链可变区包含SEQ ID NO:2或32的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列。
50.如权利要求48所述的方法，其中D2包含在重链可变区(HCVR)内的三个重链互补决定区(HCDR1、HCDR2和HCDR3)和在轻链可变区(LCVR)内的三个轻链互补决定区(LCDR1、LCDR2和LCDR3)，所述重链可变区包含SEQ ID NO:10或40的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列。
51.如权利要求48所述的方法，其中所述双特异性抗原结合分子包含在SEQ ID NO:2的D1-HCVR氨基酸序列内的CDR和在SEQ ID NO:10的D2-HCVR氨基酸序列内的CDR。
52.如权利要求48所述的方法，其中所述双特异性抗原结合分子包含在SEQ ID NO:32的D1-HCVR氨基酸序列内的CDR和在SEQ ID NO:40的D2-HCVR氨基酸序列内的CDR。
53.如权利要求48至52中任一项所述的方法，其中所述细胞毒素选自由以下各项组成的组：生物毒素、化学治疗剂和放射性同位素。
54.如权利要求48至52中任一项所述的方法，其中所述细胞毒素是微管溶素或拟美坦辛。
55.如权利要求48至52中任一项所述的方法，其中所述细胞毒素是微管溶素，并且所述微管溶素是
Figure FDA0003817518580000101
56.如权利要求55所述的方法，其中所述双特异性抗原结合分子缀合至
Figure FDA0003817518580000111
或其区域异构体，其中
Figure FDA0003817518580000112
是与重链谷氨酰胺连接的键。
57.如权利要求54至56中任一项所述的方法，其中所述细胞毒素通过接头缀合至所述双特异性抗原结合分子，其中所述接头是叠氮基-PEG3-胺。
58.如权利要求48所述的方法，其中所述细胞毒素通过接头缀合至所述双特异性抗原结合分子，并且其中所述细胞毒素是：
Figure FDA0003817518580000113
其中
Figure FDA0003817518580000114
是与接头连接的键。
59.如权利要求58所述的方法，其中所述接头是：
Figure FDA0003817518580000115
其中用
Figure FDA0003817518580000121
表示的键代表与所述双特异性抗原结合分子连接的键，并且用
Figure FDA0003817518580000122
表示的键代表与所述细胞毒素连接的键。
60.如权利要求48所述的方法，其中所述细胞毒素通过接头缀合至所述双特异性抗原结合分子，并且其中所述细胞毒素是：
Figure FDA0003817518580000123
其中
Figure FDA0003817518580000124
是与接头连接的键。
61.如权利要求60所述的方法，其中所述接头是
Figure FDA0003817518580000125
其中用
Figure FDA0003817518580000126
表示的键代表与所述双特异性抗原结合分子连接的键，并且用
Figure FDA0003817518580000127
表示的键代表与所述细胞毒素连接的键。
62.一种用于制备抗体-药物缀合物的方法，所述方法包括使抗HER2抗体或HER2xHER2双特异性抗原结合蛋白接触具有下式A1的化合物：
Figure FDA0003817518580000128
Figure FDA0003817518580000131
和水性稀释剂。
63.如权利要求62所述的方法，其中所述HER2xHER2双特异性抗原结合蛋白包含在SEQID NO:2的D1-HCVR氨基酸序列内的CDR和在SEQ ID NO:10的D2-HCVR氨基酸序列内的CDR。
64.如权利要求62所述的方法，其中所述HER2xHER2双特异性抗原结合蛋白包含在SEQID NO:32的D1-HCVR氨基酸序列内的CDR和在SEQ ID NO:40的D2-HCVR氨基酸序列内的CDR。
65.如权利要求63或64所述的方法，其中所述HER2xHER2双特异性抗原结合蛋白包含在SEQ ID NO:18的LCVR氨基酸序列内的CDR。
66.如权利要求62所述的方法，其中式A1的化合物以化学计量过量存在。
67.如权利要求62所述的方法，其中式A1的化合物包括式A2或A3的化合物，或它们的混合物：
Figure FDA0003817518580000132
68.如权利要求62所述的方法，其中式A2的化合物是立体异构纯的。
69.如权利要求62所述的方法，其中式A3的化合物是立体异构纯的。
70.如权利要求62所述的方法，其中A1或A2的化合物以大于50％、大于70％、大于90％或大于95％的非对映异构体过量存在。
71.如权利要求62所述的方法，其中式A1的化合物通过在存在硅胶和稀释剂的情况下使式(a)的化合物
Figure FDA0003817518580000141
接触式(b)的化合物
Figure FDA0003817518580000142
来制备。
72.一种通过以下方法来制备的抗体-药物缀合物：
(i)在存在硅胶和稀释剂的情况下使式(a)的化合物：
Figure FDA0003817518580000143
Figure FDA0003817518580000151
接触式(b)的化合物：
Figure FDA0003817518580000152
以合成中间体；以及
(ii)使HER2xHER2双特异性抗原结合蛋白接触所述中间体和水性稀释剂。
73.一种用于制备抗体-药物缀合物的方法，所述方法包括使抗HER2抗体或HER2xHER2双特异性抗原结合蛋白接触具有以下结构的化合物：
Figure FDA0003817518580000153
其中所述HER2xHER2双特异性抗原结合蛋白被叠氮基官能化。
74.如权利要求73所述的方法，其中被叠氮基官能化的所述HER2xHER2双特异性抗原结合蛋白通过使HER2xHER2双特异性抗原结合蛋白接触谷氨酰胺转胺酶和包含伯胺、PEG基团和叠氮基的化合物来制备。
75.如权利要求74所述的方法，其中所述包含伯胺、PEG基团和叠氮基的化合物是：
Figure FDA0003817518580000161
76.如权利要求73至75中任一项所述的方法的产物。
77.如权利要求28所述的双特异性抗原结合分子，其中所述细胞毒性剂是喜树碱。
78.如权利要求77所述的双特异性抗原结合分子，其中所述喜树碱是：
Figure FDA0003817518580000162
79.如权利要求28所述的双特异性抗原结合分子，其中所述双特异性抗原结合分子缀合至
Figure FDA0003817518580000163
其区域异构体，其中
Figure FDA0003817518580000164
是与重链谷氨酰胺连接的键。
80.如权利要求28所述的双特异性抗原结合分子，其中所述双特异性抗原结合分子缀合至
Figure FDA0003817518580000171
其中
Figure FDA0003817518580000172
是与接头连接的键。
81.一种用于制备抗体-药物缀合物的方法，所述方法包括使抗HER2抗体或HER2xHER2双特异性抗原结合蛋白接触具有以下结构的化合物：
Figure FDA0003817518580000173
其中所述HER2xHER2双特异性抗原结合蛋白被叠氮基官能化。
82.如权利要求81所述的方法，其中被叠氮基官能化的所述HER2xHER2双特异性抗原结合蛋白通过使HER2xHER2双特异性抗原结合蛋白接触谷氨酰胺转胺酶和包含伯胺、PEG基团和叠氮基的化合物来制备。
83.如权利要求82所述的方法，其中所述包含伯胺、PEG基团和叠氮基的化合物是：
Figure FDA0003817518580000174
84.如权利要求81至83中任一项所述的方法的产物。
85.如权利要求1所述的双特异性抗原结合分子，其中人HER2的第一表位包含SEQ IDNO:54的氨基酸141-145和/或166-182。
86.如权利要求85所述的双特异性抗原结合分子，其中人HER2的第二表位包含SEQ IDNO:54的氨基酸9-23、41-51、64-67和/或353-359。
87.如权利要求85所述的双特异性抗原结合分子，其中人HER2的第一表位包含SEQ IDNO:54的氨基酸141-145和/或166-182；并且其中人HER2的第二表位包含SEQ ID NO:54的氨基酸9-23、41-51、64-67和/或353-359。
88.如权利要求1所述的双特异性抗原结合分子，其中人HER2的第一表位包含SEQ IDNO:54的氨基酸133-148、174-182和/或194-200。
89.如权利要求88所述的双特异性抗原结合分子，其中人HER2的第二表位包含SEQ IDNO:54的氨基酸152-161、258-273和/或194-200。
90.如权利要求88所述的双特异性抗原结合分子，其中人HER2的第一表位包含SEQ IDNO:54的氨基酸133-148、174-182和/或194-200；并且其中人HER2的第二表位包含SEQ IDNO:54的氨基酸152-161、258-273和/或194-200。
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