KR101763559B1 - 생물학적 분자의 컨쥬게이팅을 위한 신규한 시약 및 방법 - Google Patents

생물학적 분자의 컨쥬게이팅을 위한 신규한 시약 및 방법

Info

Publication number
KR101763559B1
KR101763559B1 KR1020117003833A KR20117003833A KR101763559B1 KR 101763559 B1 KR101763559 B1 KR 101763559B1 KR 1020117003833 A KR1020117003833 A KR 1020117003833A KR 20117003833 A KR20117003833 A KR 20117003833A KR 101763559 B1 KR101763559 B1 KR 101763559B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
group
formula
peg
compounds
alkyl
Prior art date
Application number
KR1020117003833A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20110053430A (ko
Inventor
앤서니 고드윈
Original Assignee
폴리테릭스 리미티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GB0813339A external-priority patent/GB0813339D0/en
Priority claimed from GB0905762A external-priority patent/GB0905762D0/en
Application filed by 폴리테릭스 리미티드 filed Critical 폴리테릭스 리미티드
Publication of KR20110053430A publication Critical patent/KR20110053430A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101763559B1 publication Critical patent/KR101763559B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G65/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C317/00—Sulfones; Sulfoxides
    • C07C317/44—Sulfones; Sulfoxides having sulfone or sulfoxide groups and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton
    • C07C317/48—Sulfones; Sulfoxides having sulfone or sulfoxide groups and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton the carbon skeleton being further substituted by singly-bound nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C317/50—Sulfones; Sulfoxides having sulfone or sulfoxide groups and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton the carbon skeleton being further substituted by singly-bound nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups at least one of the nitrogen atoms being part of any of the groups, X being a hetero atom, Y being any atom
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C233/00—Carboxylic acid amides
    • C07C233/64—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings
    • C07C233/67—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by singly-bound oxygen atoms
    • C07C233/68—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by singly-bound oxygen atoms with the substituted hydrocarbon radical bound to the nitrogen atom of the carboxamide group by an acyclic carbon atom
    • C07C233/73—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by singly-bound oxygen atoms with the substituted hydrocarbon radical bound to the nitrogen atom of the carboxamide group by an acyclic carbon atom of a carbon skeleton containing six-membered aromatic rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C317/00—Sulfones; Sulfoxides
    • C07C317/26—Sulfones; Sulfoxides having sulfone or sulfoxide groups and nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups, bound to the same carbon skeleton
    • C07C317/32—Sulfones; Sulfoxides having sulfone or sulfoxide groups and nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups, bound to the same carbon skeleton with sulfone or sulfoxide groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings of the carbon skeleton
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C49/00—Ketones; Ketenes; Dimeric ketenes; Ketonic chelates
    • C07C49/20—Unsaturated compounds containing keto groups bound to acyclic carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D295/00—Heterocyclic compounds containing polymethylene-imine rings with at least five ring members, 3-azabicyclo [3.2.2] nonane, piperazine, morpholine or thiomorpholine rings, having only hydrogen atoms directly attached to the ring carbon atoms
    • C07D295/04—Heterocyclic compounds containing polymethylene-imine rings with at least five ring members, 3-azabicyclo [3.2.2] nonane, piperazine, morpholine or thiomorpholine rings, having only hydrogen atoms directly attached to the ring carbon atoms with substituted hydrocarbon radicals attached to ring nitrogen atoms
    • C07D295/14—Heterocyclic compounds containing polymethylene-imine rings with at least five ring members, 3-azabicyclo [3.2.2] nonane, piperazine, morpholine or thiomorpholine rings, having only hydrogen atoms directly attached to the ring carbon atoms with substituted hydrocarbon radicals attached to ring nitrogen atoms substituted by carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals
    • C07D295/155—Heterocyclic compounds containing polymethylene-imine rings with at least five ring members, 3-azabicyclo [3.2.2] nonane, piperazine, morpholine or thiomorpholine rings, having only hydrogen atoms directly attached to the ring carbon atoms with substituted hydrocarbon radicals attached to ring nitrogen atoms substituted by carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals with the ring nitrogen atoms and the carbon atoms with three bonds to hetero atoms separated by carbocyclic rings or by carbon chains interrupted by carbocyclic rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G65/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule
    • C08G65/02—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule from cyclic ethers by opening of the heterocyclic ring
    • C08G65/32—Polymers modified by chemical after-treatment

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Polyethers (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Addition Polymer Or Copolymer, Post-Treatments, Or Chemical Modifications (AREA)
  • Other Resins Obtained By Reactions Not Involving Carbon-To-Carbon Unsaturated Bonds (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Abstract

본 발명인 신규한 시약 및 생물학적 분자, 특히 단백질 및 펩타이드의 신규한 컨쥬게이팅 방법에 관한 것이다.
화학식 II의 화합물은 많이 적용된다. 예를 들면, 환자에게 직접 임상적용하는데 사용될 수 있고, 따라서 본 발명은 화학식 II의 신규한 화합물을 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 포함하는 약학적 조성물을 추가로 제공한다. 또한, 본 발명은 치료 용도의 화학식 II의 신규 화합물 및 화학식 II의 신규 화합물 또는 본 발명에 따른 약학적 조성물의 약학적으로 유효한 양을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 어떠한 원하는 약학적 효과, 예를 들어 트라우마 치료, 효소 대체, 단백질 대체, 상처 치료, 독소 제거, 항-염증, 항-감염, 면역조절, 예방접종 또는 항암 등을 적절한 생물학적 분자를 선택함으로써 얻을 수 있다. 화학식 II의 화합물은 방사성 뉴클레오티드와 같이 생체 내 화합물의 추적을 가능하게 하는 조영제를 포함할 수 있다.
화학식 II의 화합물은 비임상 적용에서도 사용될 수 있다. 예를 들면, 효소와 같은 많은 생리활성 화합물은 유기 용매에서 촉매 반응을 가능하게 하고, 화학식 II의 화합물은 이러한 적용에서 사용될 수 있다. 더욱이, 화학식 II의 화합물은 진단 도구로 사용될 수 있다.

Description

생물학적 분자의 컨쥬게이팅을 위한 신규한 시약 및 방법{Novel Reagents and Method for Conjugating Biological Molecules}
본 발명은 생물학적 분자, 특히 단백질 및 펩타이드의 컨쥬게이팅을 위한 신규한 시약 및 신규한 방법에 관한 것이다.
많은 치료학적 활성 분자들 예를 들면, 단백질은 임상 의학적 사용에 있어서 효과를 달성하기 위해 요구되는 특성을 가지고 있지 않다. 예를 들면, 많은 천연 단백질은 환자에게 투여했을 때 하기를 포함하는 내재하는 몇 가지의 문제점이 있기 때문에 좋은 약으로 만들 수 없다: (1) 단백질은 많은 혈액 또는 세포 조직 내에 존재하는 많은 엔도- 및 엑소-펩티다아제에 의해 분해됨; (2) 많은 단백질들은 어느 정도의 면역성을 가짐; 및 (3) 단백질은 신장 초미세여과 및 엔도시토시스에 의해 빠르게 배설될 수 있음. 약물내 활성 치료제로의 효용성을 나타내는 몇몇 분자들은 조직적으로 독성이 있거나 최적의 생물학적 이용가능성 및 약물동태학적으로 결핍되어있다. 단백질이 혈액순환 중 빨리 사라지면 일반적으로 상기 단백질은 환자에게 자주 투여되어야 한다. 빈번한 투여는 추가적으로 독성, 특히 면역적으로 유도된 독성의 위험을 증가시킨다.
수용성, 합성 폴리머, 특히 폴리알킬렌 글라이콜은 단백질, 펩타이드 및 저분자량 약물과 같은 치료학적 활성 분자를 컨쥬게이트 하는데에 널리 사용되고 있다. 이러한 치료학적 컨쥬게이트는 순환 시간 연장 및 제거율 감소, 전신독성 감소, 및 몇몇 경우, 증가된 임상 효능을 나타냄에 의해 약물동태학적으로 유리한 쪽으로 변화하는 것이 나타나있다. 단백질에 폴리에틸렌 글리콜, PEG를 공유결합으로 컨쥬게이팅하는 방법을 일반적으로 "페길레이션"이라 한다.
최적의 효능 및 일관성있게 투여하기 위하여 단백질 당 컨쥬게이트된 폴리머 분자의 수는 각 분자별로 동일한 것이 중요하고, 특히 각각의 폴리머 분자는 각 단백질 분자내 동일 아미노산 잔기에 공유 결합으로 컨쥬게이트되는 것이 중요하다. 단백질 분자를 따른 사이트에 불특정 컨쥬게이션은 자주 컨쥬게이션 생성물 및 비컨쥬게이트 단백질의 분포를 초래하여 정제하기 어렵고 정제하는데 비용이 많이 드는 복합 혼합물을 형성한다.
티올의 특정 컨쥬게이션의 경우, PEG 사슬 말단에 말레이미드기가 치환된 페길레이션 시약이 주로 사용된다. 이러한 시약은, 많은 공개문헌 예를 들면 WO 2044/060965에 개시되어 있다. 말레이미드가 말단에 있는 시약은 상업적으로 이용가능하다. 그러나, 많은 PEG-말레이미드는 저장 및 약물 후보물질과의 컨쥬게이션하는 동안 가수분해의 위험이 있다. 특히, 상당한 정도의 말레이미드 고리의 가수분해가 컨쥬게이션 전후에 모두 발생한다.
이에, 우리는 티올기와 같은 단일 친핵체 잔기를 통해 폴리머에 단백질 및 펩타이드를 포함하는 분자들을 컨쥬게이트 하는데 사용될 수 있고, 현재 시판되고 있는 시약보다 이점을 가지고 있는 페길레이션 시약의 종류를 발견하였다.
본 발명의 목적은 폴리머에 티올 또는 아미노기를 포함하는 분자를 컨쥬게이트하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 신규한 화학식 (I)의 화합물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 신규한 화학식 (II)의 화합물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여,, 본 발명은 폴리머에 티올 또는 아미노기를 포함하는 분자를 컨쥬게이트하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 신규한 화학식 (I)의 화합물을 제공한다.
나아가, 본 발명은 신규한 화학식 (II)의 화합물을 제공한다.
화학식 II의 화합물은 많이 적용된다. 예를 들면, 환자에게 직접 임상적용하는데 사용될 수 있고, 따라서 본 발명은 화학식 II의 신규한 화합물을 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 포함하는 약학적 조성물을 추가로 제공한다. 또한, 본 발명은 치료 용도의 화학식 II의 신규 화합물 및 화학식 II의 신규 화합물 또는 본 발명에 따른 약학적 조성물의 약학적으로 유효한 양을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 어떠한 원하는 약학적 효과, 예를 들어 트라우마 치료, 효소 대체, 단백질 대체, 상처 치료, 독소 제거, 항-염증, 항-감염, 면역조절, 예방접종 또는 항암 등을 적절한 생물학적 분자를 선택함으로써 얻을 수 있다. 화학식 II의 화합물은 방사성 뉴클레오티드와 같이 생체 내 화합물의 추적을 가능하게 하는 조영제를 포함할 수 있다.
화학식 II의 화합물은 비임상 적용에서도 사용될 수 있다. 예를 들면, 효소와 같은 많은 생리활성 화합물은 유기 용매에서 촉매 반응을 가능하게 하고, 화학식 II의 화합물은 이러한 적용에서 사용될 수 있다. 더욱이, 화학식 II의 화합물은 진단 도구로 사용될 수 있다.
도 1은 실시예 1의 단계 1의 반응식(scheme)을 보여준다.
도 2는 실시예 1의 단계 2의 반응식을 보여준다.
도 3은 실시예 1의 단계 3의 반응식을 보여준다.
도 4는 실시예 1의 단계 4의 반응식을 보여준다.
도 5는 실시예 2의 생성물의 SDS-PAGE 분석 결과를 보여준다.
도 6은 실시예 3의 생성물의 SDS-PAGE 분석 결과를 보여준다.
도 7은 실시예 5의 생성물의 SDS-PAGE 분석 결과를 보여준다.
도 8은 실시예 6의 반응의 역상 크로마토그래피 결과를 보여준다.
도 9는 실시예 7의 생성물의 SDS-PAGE 분석 결과를 보여준다.
도 10은 실시예 8의 반응의 양이온 교환 크로마토그래피 결과를 보여준다.
도 11은 실시예 8의 ELISA 결과를 보여준다.
도 12는 실시예 9의 생성물의 SDS-PAGE 분석 결과를 보여준다.
도 13은 실시예 11의 시간 경로 페길레이션 크로마토그램을 보여준다.
도 14는 실시예 10 및 11에서의 화합물 9, 10 및 11의 상호 전환을 보여준다.
도 15는 실시예 11의 전환 결과를 보여준다.
도 16은 실시예 12의 역상 크로마토그래피 결과를 보여준다.
도 17은 실시예 13의 안정성 결과를 보여준다.
도 18은 실시예 17의 중간 생성물의 SDS-PAGE 분석 결과를 보여준다.
도 19는 실시예 17의 최종 생성물의 SDS-PAGE 분석 결과를 보여준다.
도 20은 실시예 17의 흡광도 결과를 보여준다.
도 21은 실시예 19의 반응식을 보여준다.
도 22는 실시예 20의 반응식을 보여준다.
따라서, 본 발명은 폴리머에 티올 또는 아미노기를 포함하는 분자를 컨쥬게이트하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 상기 분자에 하기 화학식의 화합물을 반응시키는 단계를 포함한다:
X-[Q-W-(CH=CH)n-(CH2)2-L]m (I)
여기서 X는 폴리머를 나타내고; Q는 연결기(linking group)를 나타내고; W는 전자당김기(electron-withdrawing group)를 나타내고; n은 0 또는 1 내지 4의 정수를 나타내고; L은 이탈기를 나타내고; 및 m은 1 내지 8의 정수를 나타낸다.
본 발명의 방법으로부터 결과로 나타나는 직접적인 생성물은 일반적으로 하기 화학식으로 나타낼 수 있다:
X-[Q-W-(CH=CH)n-(CH2)2-Z]m (IIa)
여기서, X, Q, W, n 및 m은 상기에서 정의한 바와 같고, Z는 티올 또는 아미노기를 통하여 컨쥬게이션된 상기 분자를 나타낸다. 원한다면, 이러한 결과로 나타나는 화학식 IIa의 화합물은 원하는 다른 생성물로 전환될 수 있다.
특히, 결과로 나타나는 화학식 IIa의 화합물은 화학식 II의 화합물로 전환될 수 있다:
X-[Q-W´-(CH=CH)n-(CH2)2-Z]m (II)
여기서, W´는 전자 당김 부분(moiety) 또는 전자 당김 부분의 환원에 의하여 형성된 부분을 나타낸다.
화학식 (I)의 화합물은 신규하므로, 본 발명은 또한 이러한 화합물 자체를 제공한다. 특히 바람직한 화학식 (I)의 신규한 화합물은 하기에 정의된 화학식 (Ia)의 화합물이다.
화학식 (II)의 화합물도 신규하므로, 본 발명은 또한 이러한 화합물 자체를 제공한다. 특히 바람직한 화학식 (II)의 신규한 화합물은 하기에 정의된 화학식 (IIb)의 화합물이다.
m은 1 내지 8, 예를 들면 1 내지 6, 바람직하게는 1 내지 4, 예를 들면 1의 정수이다. m이 1일 때, 단 분자가 폴리머에 컨쥬게이션된다. m이 1 이상일 때, 폴리머에 하나 이상의 분자의 컨쥬게이션이 성취될 수 있다. 2-8개의 기의 -Q-W´-(CH=CH)n-(CH2)2-Z 또는 -Q-W-(CH=CH)n-(CH2)2-L가, 폴리머에 결합되고 상기 다양한 Q, W, W´, n, L 및 Z는 각 기에 대하여 동일하거나 다를 수 있다. 다기능 폴리머 화합물이 이용될 수 있으며, 예를 들면 다중 기(group)들은 출발물질로서 상표명 "선브라이트(Sunbright)"의 NOF로 부터 사용가능한 다중-팔(multi-arm) 화합물을 사용하여 부착될 수 있다: 즉, 4개 팔을 가진 생성물은 화학식 C[CH2O(CH2CH2O)n-Y]4 여기서 Y는 많은 다른 말단 기 중 하나를 갖는다. 다중 컨쥬게이트는 상승적 및 부가적 이점을 가진 결과를 가져올 수 있다. 예를 들어, 만약 m이 1이라면, 결과로 나타나는 컨쥬게이트는 반드시 컨쥬게이션된 분자로부터 먼 PEG 사슬의 말단에 말단기를 가져야한다. 이는 일반적으로 알콕시 또는 유사기이고, 이러한 기들은 약학적 적용에 사용하였을 때 원치 않는 면역 효과를 유도할 수 있다고 제안되어 왔다. 만약 m이 1보다 크면, 컨쥬게이션된 분자는 PEG 사슬의 양쪽 말단 모두에 붙을 수 있고, 알콕시와 같은 말단기의 필요성이 없어진다.
폴리머 X는 예를 들면 폴리알킬렌 글라이콜, 폴리비닐피롤리돈, 폴리아크릴레이트, 예를 들면 폴리아크릴로일 몰폴린, 폴리메타크릴레이트, 폴리옥사졸린, 폴리비닐알코올, 폴리아크릴아미드 또는 폴리메타크릴아미드, 예를 들면 폴리카복시메타크릴아미드, 또는 HPMA 코폴리머가 될 수 있다. 추가적으로, X는 촉매 또는 가수 분해에 민감한 폴리머일 수 있다. 이러한 폴리머는 예를 들면, 폴리에스터, 폴리아세탈, 폴리(올소 에스터), 폴리카보네이트, 폴리(이미노 카보네이트), 및 폴리(아미노산)과 같은 폴리아미드를 포함한다. 폴리머 X는 호모폴리머, 랜덤 코폴리머 또는 블락 코폴리머와 같이 구조적으로 정의된 코폴리머일 수 있다. 예를 들어 X는 두개 이상의 알킬렌 옥사이드 또는 폴리(알킬렌 옥사이드) 및 폴리에스터, 폴리아세탈, 폴리(올소 에스터), 또는 폴리(아미노산)으로부터 유도된 블락 코폴리머일 수 있다. 사용될 수 있는 다 기능기를 가지는 폴리머는 디비닐에테르-말레인 무수물 및 스티렌-말레익 무수물의 코폴리머를 포함한다.
또한, 천연 고분자, 예를 들면 키틴, 덱스트란, 덱스트린, 키토산, 전분, 셀룰로스, 글리코겐, 폴리(시알릭산)과 같은 다당류 및 이들의 유도체가 사용될 수 있다. 단백질은 폴리머로 사용될 수 있다. 이는 하나의 단백질, 예를 들면, 항체 또는 항체 프레그먼트(fragment)를 두번째 단백질, 예를 들면 효소 또는 다른 활성 단백질에 컨쥬게이션할 수 있다. 또한, 만약 촉매 시퀀스(sequence)를 포함하는 펩타이드, 예를 들면 글리코실트랜스퍼라제의 O-글리칸 수용체 사이트가 사용된다면, 이는 차후의 효소반응을 위한 기질 또는 타켓의 융합을 가능하게 한다. 폴리글루탐산 또는 폴리글라이신과 같은 폴리(아미노산) 또한 사용될 수 있으며, 단당류 또는 아미노산과 같은 천연 모노머 및 에틸렌 옥사이드 또는 메타크릴산과 같은 합성 모노머로부터 유도된 혼성 폴리머일 수 있다.
만약 상기 폴리머가 폴리알킬렌 글라이콜이라면, 이는 C2 및/또는 C3 단위를 포함하는 것이고, 특히 폴리에틸렌 글라이콜인 것이 바람직하다. 폴리머, 특히 폴리알킬렌 글라이콜은 단일 선형 사슬을 포함하거나, 작거나 큰 많은 사슬로 구성된 분지 형태일 수 있다. 소위 플루로닉스(Pluronics)라 불리는 것은 PEG 블락 코폴리머의 분류에서 중요하다. 이는 에틸렌 옥사이드 및 프로필렌 옥사이드 블락으로부터 유도된다. 치환된 폴리알킬렌 글라이콜, 예를 들면 메톡시폴리에틸렌 글라이콜이 사용될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시형태에 있어서, 단일-사슬 폴리에틸렌 글라이콜은 적절한 기(group), 예를 들면 알콕시, 예를 들면 메톡시, 아릴옥시, 카복시 또는 하이드록실기에 의하여 개시되고, 상기 사슬의 다른 쪽 말단은 연결기 Q에 연결된다.
상기 폴리머 X는 선택적으로 어떠한 적절한 방법에 의해 유도되거나 기능화될 수 있다. 반응기는 펜던트(pendent) 연결기를 통해 폴리머 끝 또는 말단기에, 또는 폴리머 사슬을 따라 연결될 수 있으며; 이러한 경우, 상기 폴리머는 예를 들면 폴리아크릴아미드, 폴리메타크릴아미드, 폴리아크릴레이트, 폴리메타크릴레이트, 또는 말레인 무수 코폴리머이다. 이러한 기능화된 폴리머는 추가적으로 다중 컨쥬게이트를 제조할 수 있는 기회를 제공한다(즉, 상기 폴리머가 하나 이상의 분자와 컨쥬게이션되는 것). 만약 원한다면, 상기 폴리머는 종래 방법을 이용하여 고체 지지대에 결합될 수도 있다.
상기 폴리머의 최적의 분자량은 의도한 적용에 따라 달라질 것이다. 바람직하게, 수평균 분자량은 250 g/몰 내지 약 75,000 g/몰 정도의 범위를 가진다. 만일 화학식 II의 화합물이 의료용도이고, 순환을 떠나 세포 조직을 관통할 예정일 때, 예를 들면 악성 종양(malignancy)에 의한 염증, 전염병 또는 자기 면역 질환, 또는 트라우마에 의해 유발된 염증의 치료용일 때, 2000-30,000 g/몰의 범위 내의 저분자량의 폴리머를 사용하는 것이 좋을 것이다. 화학식 II의 화합물이 순환에 남아있도록 의도된 적용에서는 더 높은 분자량, 예를 들면 20,000-75,000 g/몰의 범위 내의 폴리머를 사용하는 것이 좋을 것이다.
사용할 폴리머는 의도된 용도를 위해, 상기 컨쥬게이션이 용매 배지에서 용해가능하도록 선택되어야 한다. 생물학적 적용, 특히 포유류의 임상 치료적 투여를 위한 진단적 적용 및 치료학적 적용에 있어서, 상기 컨쥬게이트는 수용성 배지에 용해되어야 할 것이다. 그러나, 많은 생물학적 분자, 예를 들면 효소와 같은 단백질은 산업상의 유용성, 예를 들면 화학 반응에서 촉매작용을 가진다. 이러한 적용에 컨쥬게이트를 사용하기 위하여, 상기 컨쥬게이트는 수용성 및 유기 배지 중 어느 하나 또는 모두에서 용해되어야 한다. 상기 폴리머는 물론 컨쥬게이션이 될 분자의 의도된 기능을 지나치게 손상시키지 않아야 한다.
바람직하게 상기 폴리머는 합성 폴리머이고, 수용성 폴리머이다. 많은 적용을 위해 수용성 폴리에틸렌 글라이콜의 사용이 특히 바람직하다.
연결기 Q는 예를 들면, 직접 결합 알킬렌기(바람직하게 C1-10 알킬렌기), 또는 선택적으로 치환된 아릴 또는 헤테로 아릴기일 수 있고, 이중 어느것도 하나 이상의 산소 원자, 황 원자, -NR기(여기서 R은 수소 원자 또는 알킬(바람직하게 C1-6 알킬), 아릴(바람직하게 페닐), 또는 알킬-아릴(바람직하게 C1-6 알킬-페닐)기), 케토기, -O-CO- 기, -CO-O- 기, -O-CO-O, -O-CO-NR-, -NR-CO-O-, -CO-NR- 및/또는 -NR-CO- 기에 의해 종결되거나 간섭될 수 있다. 이러한 아릴 및 헤테로 아릴기 Q는 본 발명의 바람직한 실시형태를 형성한다. 적합한 아릴기로는 페닐 및 나프틸기를 포함하는 반면, 적합한 헤테로아릴기는 피리딘, 피롤, 퓨란, 파이란, 이미다졸, 파이라졸, 옥사졸, 피리다진, 피리미딘 및 퓨린을 포함한다. 특히 적합한 연결기 Q는 -NR-CO 기에 의해 인접한 폴리머 X에 종결되는 헤테로아릴 또는, 특히, 아릴기, 특히 페닐기이다. 상기 폴리머에 연결은 가수분해를 일으키는 불안정한 결합 또는 안정한 결합 방법에 의해 이루어질 수 있다.
선택적으로 치환된 아릴 또는 헤테로 아릴기 상에 존재할 수 있는 치환체는 예를 들면 알킬(바람직하게는 C1-4 알킬, 특히 선택적으로 OH 또는 CO2H로 치환된 메틸, -CN, -NO2, -CO2R, -COH, CH2OH, COR, -OR, -OCOR, -OCO2R, -SR, -SOR, -SO2R, -NHCOR, -NRCOR, -NHCO2R, -NR-CO2R, -NO, -NHOH, -NR-OH, -C=N-NHCOR, -C=N-NR.COR, -N+R3, -N+H3, -N+HR2, -N+H2R, 할로겐, 예를 들면 플루오린 또는 클로린, -C≡CR, -C=CR2 및 -C=CHR, 여기서 각 R은 독립적으로 수소 원자 또는 알킬(바람직하게 C1-6 알킬), 아릴(바람직하게 페닐), 또는 알킬-아릴(바람직하게 C1-6 알킬-페닐)기를 나타낸다. 전자 당김 치환체의 존재가 특히 바람직하다. 바람직한 치환체는 예를 들면 CN, NO2, -OR, -OCOR, -SR, -NHCOR, -NH-COR, -NHOH 및 -NR-COR를 포함한다.
W는 예를 들면 케토기(-CO-), 에스터기 -O-CO- 또는 설폰기 -SO2- 를 나타내고, W'는 이런 기(group) 또는 이런 기의 환원에 의해 얻어진 기, 예를 들면, CH-OH 기, 에테르기 CH-OR, 에스터기 CH-O-C(O)R, 아민기 CH-NH2, CH-NHR 또는 CH-NR2, 또는 아미드 CH-NHC(O)R 또는 CH-N(C(O)R)2를 나타낼 수 있다.
바람직하게 n은 0이다.
이탈기 L은 예를 들면 -SR, -SO2R, -OSO2R, -N+R3, -N+HR2, -N+H2R, 할로겐, 또는 -OØ를 나타내며, 여기서 R은 상기에서 정의한 바와 같고, Ø은 치환된 아릴, 특히 적어도 하나의 전자 당김 치환체, 예를 들면 -CN,-NO2, -CO2R, -COH, -CH2OH, -COR, -OR, -OCOR, -OCO2R, -SR, -SOR, -SO2R, -NHCOR, -NRCOR, -NHCO2R, -NR’CO2R, -NO, -NHOH, -NR'-OH, -C=N-NHCOR, -C=N-NR’COR, -N+R3, -N+HR2, -N+H2R, 할로겐, 특히 클로린 또는 플루오린, -C≡CR, -C=CR2 및 -C=CHR(여기서 R은 각각 독립적으로 상기에서 정의한 바와 같다)를 포함하는 페닐기이다.
만약 m이 2 내지 8의 정수일 때, L기는 원한다면 달라질 수 있다. 이는 반응성이 다른 L을 선택함으로써 성공적인 반응으로 폴리머 X에 다른 분자를 컨쥬게이트하는 기회를 제공한다.
바람직하게 본 발명에 따른 방법에서 하기 화학식의 시약을 사용하여:
X-[NH-CO-Ar-W-(CH=CH)n-(CH2)2-SO2R’]m (Ia)
(여기서, Ar은 비치환 또는 치환된 아릴기, 특히 페닐기를 나타내고, 이때 선택적인 치환체는 연결기 Q에 포함되는 아릴기 중에서 선택되며; R’는 수소원자 또는 선택적으로 치환된 알킬(바람직하게는 C1 -6 알킬), 아릴(바람직하게는 페닐), 또는 알킬-아릴(바람직하게는 C1-6 알킬-페닐)기를 나타내고; 및 W 및 m은 상기에서 정의한 바와 같다.)하기 화학식의 신규 컨쥬게이트를 제조한다:
X-[NH-CO-Ar-W´-(CH=CH)n-(CH2)2-Z]m (IIb)
이러한 바람직한 화합물 Ia 및 IIb에 있어서, 바람직하게 n은 0이고, 바람직하게 m은 1 내지 4의 정수, 특히 1이다. 바람직하게 각 W는 CO기를 나타내고, W´는 CO 기 또는 CH-OH기를 나타낸다. 바람직하게 R’는 선택적으로 치환된 아릴기, 예를 들면 CH2CH2OH와 같은, 특히 C1 -4 알킬-아릴기, 특히 p-톨릴과 같이 선택적으로 하이드록시가 치환된 C1 -4 알킬기이거나 Ar은 바람직하게 비치환된 페닐기이다. 바람직하게 X는 폴리알킬렌 글라이콜, 특히 폴리에틸렌 글라이콜이다.
화학식 I의 화합물, 및 특히 화학식 Ia의 화합물은 놀랍게도 안정한 것으로 나타났고 또한 티올 또는 아미노기를 포함하는 분자에 대하여 높은 반응성을 가진다. 이는 본 발명에 따른 컨쥬게이션 방법이 하기 화학식의 중간체 화합물의 생성을 통하여 진행된다고 생각된다:
X-[Q-W-(CH=CH)n-CH=CH2]m V
(여기서, X, Q, W, n 및 m은 상기에서 정의한 바와 같다.)
본 발명에 따른 방법에 의해 컨쥬게이션이 되는 분자는 어떤 분자라도 가능하다. 이는 예를 들면 천연물 분자 또는 천연물 분자로부터 유도된 분자일 수 있고, 또는 생물학적 활성을 가지는 어떠한 분자, 예를 들면 티올(-SH) 또는 아미노기(-NHR)을 포함하는 어느 약물일 수 있다. 예를 들면, 이는 단백질 또는 펩타이드일 수 있다: 본 명세서에서, "단백질" 이라는 용어는 편의상 사용될 수 있고, 특별하게 정의되지 않는 한, "단백질"의 지칭은 "단백질 또는 펩타이드"라는 의미로 이해해야한다.
상기 분자를 연결하는 티올 또는 아미노기는 시약 I와 이탈기 L의 제거반응을 수행하는 능력이 있는 친핵제(nucleophile)이다. 이러한 기는 토종 생물학적 분자에 존재할 수 있고, 또는 컨쥬게이션 전에 생물학적 분자에 도입될 수 있다.
두개의 티올기는 천연 또는 합성된 디설파이드(시스테인) 브릿지(bridge)의 환원에 의하여 생성될 수 있으며, 이는 내부 사슬 또는 외부 사슬일 수 있다. 생물학적 분자는 하나 또는 다수의 디설파이드 브릿지를 포함할 수 있고, 자유 설프하이드릴 부분을 제공하는 환원은 하나 또는 다수의 디설파이드 브릿지를 줄이는 것으로 수행될 수 있다. 디설파이드의 환원 정도 및 사용되는 폴리머 컨쥬게이션 시약의 화학양론에 따라 상기 생물학적 분자에 하나 또는 다수의 폴리머 분자가 컨쥬게이션하는 것이 가능하다. 만일 전체 디설파이드의 수보다 적게 환원되기를 바란다면, 반응 조건을 달리하거나 변성제를 추가함으로써 부분적 환원이 가능한 것처럼 고정된 환원제가 사용될 수 있다.
대안적으로 티올기는 단일 시스테인 잔기 또는 디설파이드 브릿지로부터 유도된 것이 아닌 다른 티올기일 수 있다. 단일 시스테인은 부착물의 적합한 지점을 제공하기 위해 합성방법에 의해 도입될 수 있다. 이러한 방법은 펩타이드의 컨쥬게이션에 특히 유용하다.
아민기는 예를 들면 라이신 또는 히스티딘 잔기일 수 있다. 이는 토종 생물학적 분자에 존재하거나 합성에 의해 도입될 수 있다. 예를 들면, 히스티딘 잔기는 합성 방법에 의해 단백질에 부착된 히스-태그(his-tag)(인접한 히스티딘 잔여물의 짧은 사슬, 예를 들면, 12개까지의 히스티딘 잔기를 포함하나, 일반적으로 5-6개 잔기를 포함)의 방법에 의해 도입될 수 있다. 히스-태그는 니켈 및 코발트와 강하게 결합하여, 고정된 금속 친화성 크로마토그래피로서 알려진 분리 공정에 사용되는 니켈- 또는 코발트-포함 컬럼에 결합된다. 히스-태그는 단백질 및 펩타이드의 넓은 범위에 부착되어 널리 사용되거나 이로부터 유래된 생성물을 나중에 혼합물로부터 분리될 수 있게 한다.
분자가 단백질일 때, 이는 예를 들면 펩타이드, 폴리펩타이드, 항체, 항체 프레그먼트(fragment), 효소, 사이토카인, 키모카인, 수용체, 혈액 인자, 펩타이드 호르몬, 독소, 전이 단백질, 또는 다성분 단백질일 수 있다.
바람직한 적용에 따라, 본 발명에서 유용한 몇몇의 구체적인 단백질을 하기에 제공한다. 효소는 카보하이드레이트-특정 효소, 프로테오리틱 효소등을 포함한다. 특히, 일반적 및 치료학적 응용에서 산업상(유기 베이스 반응) 및 생물학적 응용 모두에서 흥미있는 효소는 US 4,179,337에 공개된 산화환원효소, 전이효소, 가수분해효소, 리아제, 이성화효소 및 리가아제를 포함한다. 흥미있는 구체적인 효소는 아스파라기나아제, 아르기나아제, 아데노신 데아미나아제, 과산화물 제거효소, 카탈라아제, 키모트립신, 리파아제, 우리카아제, 비리루빈 옥시다아제, 클루코스 옥시타아제, 글루쿠로니다아제, 갈락토시다아제, 글루코세르브로시다아제, 글루쿠로니다아제, 및 글루타미나아제를 포함한다.
화학식 I의 화합물에 사용되는 단백질은 예를 들면 알부민, 트렌스퍼링(transferring), 인자 VII, 인자 VIII 또는 인자 IX, 폰빌레브란트인자(von Willebrand factor), 인슐린(insulin), ACTH, 글루카겐(glucagen), 소마토스타틴(somatostatin), 소마토트로핀(somatotropins), 티모신(thymosin), 파라티로이드 호르몬(parathyroid hormone), 피그멘터리 호르몬(pigmentary hormones), 소마토메딘(somatomedins), 에리트로포이틴(erythropoietin), 루테나이징 호르몬(luteinizing hormone), 하이포탈라믹 릴리징 인자(hypothalamic releasing factors), 항이뇨 호르몬(antidiuretic hormones), 프로락틴(prolactin), 인터류킨(interleukins), 인터페론(interferons), 세포군 자극인자(colony stimulating factors), 헤모글로빈(hemoglobin), 사이토카인(cytokines), 항체, 항체 프레그먼트, 융모성 생식선 자극호르몬(chorionicgonadotropin), 여포자극 호르몬(follicle-stimulating hormone), 갑상선 자극 호르몬(thyroid stimulating hormone) 및 조직 플라스미노겐 활성인자(tissue plasminogen activator)와 같은 혈액 단백질을 포함한다.
또한, 상기 인터류킨, 인터페론 및 세포군 자극인자와 같은 상기 단백질 중 어떤 것은 보통 재조합 단백질 기술에 의하여 제조된 결과로서 비글리코실레이트 형태로 존재한다. 상기 비글리코실레이트 형태가 본 발명에서 사용될 수 있다.
흥미있는 다른 단백질은 폴리(알킬렌 옥사이드)와 같은 폴리머 컨쥬게이션이 될 때 알레르겐이 감소하고 그 결과 내성 유도인자로의 사용이 적합한 Dreborg et al Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Syst. (1990) 6 315-365에 개시된 알레르겐 단백질이다. 상기 알레르겐 중 개시된 것은 라그위드(Ragweed) 항원 E, 봉독(honeybee venom), 진드기 알레르겐 등이다.
면역글로불린 항체, 오브알부민, 리파아제, 글루코세레브로시다아제, 렉틴, 조직 플라즈미노겐 활성화인자 및 글리코실레이티트 인터류킨, 인터페론 및 세포군 자극인자와 같은 글리코폴리펩파이드는 IgG, IgE, IgM, IgA, IgD 및 이의 프레그먼트(fragment)와 같은 면역글로불린 항체와 같이 관심이 있다.
특히 관심있는 것은 진단 및 치료학적 목적의 임상 약물로 사용되는 수용체 및 리간드 결합 단백질 및 항체 및 항체 프래그먼트이다. 상기 항체는 단독 또는 방사성 동위원소 또는 세포독성/항감염성의 약물 같은 분자 또는 다른 원소와 공유결합으로 컨쥬게이션("적재")될 수 있다. 에피토프(Epitope)는 백신접종용 면역성 폴리머 - 단백질 컨쥬게이트 제조를 위해 사용될 수 있다.
생물학적 분자는 원한다면 유도되거나 기능화될 수 있다. 특히, 컨쥬게이션 전에 천연 단백질과 같은 분자는 그의 민감한 기를 보호하기 위해 다양한 블라킹기(blocking group)와 반응하거나; 또는 본 발명의 방법을 이용하거나 다른 방법을 이용하여 먼저 하나 이상의 폴리머 또는 다른 분자와 컨쥬게이션할 수 있다.
상기 분자는 상대적으로 적은 분자량을 가진 합성 분자일 수 있다. 예를 들면, 이는 컨쥬게이션이 이점을 제공하는 모든 약물이다. 이러한 많은 분자에 있어서, 본 발명에 따른 시약에 컨쥬게이션이 가능하도록 티올 또는 아미노기를 운반하는 적합한 연결기의 삽입이 필요할 것이다. 전형적인 약물은 예를 들면 캡토프릴, 암포테리신 B, 캠토테신, 택솔, 이리노테칸 및 SN38, 도세택솔(docetaxol), 및 리바비린과 같은 이들의 유도체를 포함한다.
본 발명의 방법을 사용하여 컨쥬게이트될 수 있는 흥미있는 다른 분자는 WO 2004.060965에 기재된 분자를 포함한다.
본 발명에 따른 방법은 모든 반응물이 용해되는 용매 또는 용매 혼합물에서 수행될 수 있다. 컨쥬게이션될 수 있는 상기 분자 예를 들면 단백질은 수용성 반응 매체에서 화학식 I의 화합물과 직접 반응될 수 있다. 이 반응 매체는 또한 친핵체(티올 또는 아민)의 pH 필요조건에 따라 완충될 수 있다. 상기 반응을 위한 최적의 pH는 많은 경우 최소 6.0, 일반적으로 약 6.0 내지 약 8.5 사이이고, 예를 들면 약 7.0 내지 8.0, 바람직하게는 약 7.5-8.0이나, 다른 경우 4.0과 같이 낮은 pH가 사용될 수 있으며, 특히 폴리히스티딘 태그에 컨쥬게이션이 요구될 때, 사용가능한 pH 범위는 4.0부터 8.5까지에 이른다. 만약, 컨쥬게이션이 될 상기 분자의 존재와 동시에 화학식 V의 화합물을 제조하는 것이 바람직하다면, 반응하는 동안 상대적으로 높은 pH가 적합하게 사용된다. 반대로, 만일 분리된 단계로 화학식 V의 화합물을 제조하고, 다음으로 컨쥬게이션이 될 상기 분자를 첨가하는 것이 바람직하다면, 첫번째 단계는 상대적으로 높은 pH(예를 들면 7.5-8.0)에서 적절히 수행되는 반면, 다음 단계는 낮은 pH(e.g. 6.0 내지 6.5)에서 적절하게 수행된다. 이와 같이, 본 발명에 따른 시약의 장점은 상대적으로 넓은 범위의 pH 조건에서 성공적으로 사용이 가능한 것이다.
일반적으로 3-37 ℃ 사이의 반응 온도가 적당하며: 만일 컨쥬게이션 반응이 이러한 공정이 일어날 수 있는 곳의 온도에서 수행된다면 단백질은 분해, 집합되거나 기능 손상 및/또는 반응 효율을 변성시킬 수 있다. 유기 매체(예를 들면 THF, 에틸 아세테이트, 아세톤)에서 수행된 반응은 일반적으로 상온까지의 온도에서 수행된다.
상기 분자는 많은 다른 시약들과 달리, 시약을 화학양론적 동량 또는 조금 과량 사용하여 원하는 시약과 효과적으로 컨쥬게이션할 수 있다. 그러나, 상기 시약이 예를 들면 단백질을 용해시키는데 사용되는 수용성 매체에서 경쟁반응이 수행되지 않을 때, 과량의 시약을 사용하여 컨쥬게이션 반응을 수행하는 것이 가능하다. 상기 과량의 시약 및 상기 생성물은 일반적인 정제과정 동안 이온 교환 크로마토그래피에 의해 쉽게 분리하거나 히스-태그가 존재시 니켈을 사용하는 분리에 의해 쉽게 분리될 수 있다.
상기 분자가 티올을 통하여 컨쥬게이션 될 때, 본 발명에 따른 방법은 생물학적 분자 내의 두 개의 시스테인 아미노산으로부터 유도된 디설파이드 결합을 부분적으로 환원시킴과 동시에 상기 환원된 생성물을 화학식 (I)의 화합물과 반응시킴으로써 수행될 수 있다. 예를 들어, 디설파이드는 일반적인 방법을 사용하여 디티오테레이티올(dithiothreitiol), 머캡토에타올(mercaptoethanol), 또는 트리스-카복시에틸포스핀에 의해 환원될 수 있다.
본 발명에 따른 방법의 중간체 생성물은 화학식 II의 화합물의 화합물이며, 이때 W´는 전자 당김기이다. 이러한 화합물은 그 자체로 유용성을 가지고 있다: 왜냐하면 본 발명의 방법은 적절한 조건 하에서 가역적이므로, W´가 전자 당김부분인 화학식 (II)의 화합물은 컨쥬게이트로부터 분자의 방출이 요구되는 적용, 예를 들면 임상학적 적용시 유용성을 갖는다다. 그러나, 전자 당김기 W´는 환원되어 상기 분자의 방출을 저해하는 부분을 생성할 수 있고, 또한 이러한 화합물은 많은 임상학적, 산업상 및 진단에의 적용시 유용성을 가질 것이다.
그러므로, 예를 들어 케토기를 포함하는 W´부분은 CH(OH) 기를 포함하는 W´부분으로 환원될 수 있고; 에테르기 CH.OR는 에테르화제(etherifying agent)와 하이드록시기의 반응에 의해 얻어질 수 있고; 에스테르기 CH.O.C(O)R는 아실화제(acylating agent)와 하이드록시기의 반응에 의해 얻어질 수 있고; 아민기 CH.NH2, CH.NHR 또는 CH.NR2는 환원적 아미노화반응에 의해 키톤 또는 알데하이드로부터 제조될 수 있고; 또는 아미드 CH.NHC(O)R 또는 CH.N(C(O)R)2는 아민의 아실화 반응에 의하여 생성될 수 있다. 환원제로서 소듐 보로하이드라이드, 소듐 시아노보로하이드라이드, 포타슘 보로하이드라이드 또는 소듐 트리아세톡시보로하이드라이드와 같은 보로하이드라이드의 사용이 특히 바람직하다. 사용될 수 있는 다른 환원제로는 틴(II) 클로라이드, 알루미늄 알콕사이드와 같은 알콕사이드, 및 리튬 알루미늄하이드라이드를 포함한다.
화학식 (I)의 화합물은, 하기 화학식의 화합물을
A-Q-W-(CH=CH)n-(CH2)2-L (III)
(Q, W, n 및 L이 상기에서 정의한 바와 같다.)
하기 화학식의 화합물의 반응에 의해 제조될 수 있다.
X - Bm (IV)
(이때, X는 폴리머를 나타내고;
A 및 B는 화학식 (III) 및 (IV)가 함께 반응하여 원하는 화학식 (I)의 화합물을 얻을 수 있는 기로부터 선택되는 기(group)이다.)
화학식 II의 화합물은 많이 적용된다. 예를 들면, 환자에게 직접 임상적용하는데 사용될 수 있고, 따라서 본 발명은 화학식 II의 신규한 화합물을 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 포함하는 약학적 조성물을 추가로 제공한다. 또한, 본 발명은 치료 용도의 화학식 II의 신규 화합물 및 화학식 II의 신규 화합물 또는 본 발명에 따른 약학적 조성물의 약학적으로 유효한 양을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 어떠한 원하는 약학적 효과, 예를 들어 트라우마 치료, 효소 대체, 단백질 대체, 상처 치료, 독소 제거, 항-염증, 항-감염, 면역조절, 예방접종 또는 항암 등을 적절한 생물학적 분자를 선택함으로써 얻을 수 있다. 화학식 II의 화합물은 방사성 뉴클레오티드와 같이 생체 내 화합물의 추적을 가능하게 하는 조영제를 포함할 수 있다.
화학식 II의 화합물은 비임상 적용에서도 사용될 수 있다. 예를 들면, 효소와 같은 많은 생리활성 화합물은 유기 용매에서 촉매 반응을 가능하게 하고, 화학식 II의 화합물은 이러한 적용에서 사용될 수 있다. 더욱이, 화학식 II의 화합물은 진단 도구로 사용될 수 있다.
실시예 1: PEG 시약 합성: 10 kDa PEG 시약 9 의 합성
단계 1, p- 카르복시 -3- 피페리디노프로프리오페논 하이드로클로라이드 2 의 합성
상기 단계의 반응 계획은 도 1에 나타내었다.
250 ml의 둥근 바닥 플라스크를 p-아세틸벤조익산(15.0 g, 1), 11.11 g의 피페리딘 하이드로클로라이드 및 8.23 g의 파라포름알데하이드를 넣었다. 그 후 순수 에탄올(90 ml) 및 농축된 염산(1 ml)을 추가하고, 결과 부유물을 아르곤 존재하에 교반하며 환류 조건에서 10시간 동안 가열하였다. 환류가 끝난 후, 아세톤(150 ml)을 가하고, 상기 반응 혼합물을 상온으로 낮추었다. 생성된 흰색 침전물은 유리 필터(G3)를 통해 분리하고 차가운 아세톤으로 두 번 씻어내었다. 상기 고체는 진공 하에서 건조시켜 흰색 결정 분말을 수득하였다(2, 9.72 g). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 1.79, 2.96, 3.45 (br m, 피페리딘 일부분의 CH2), 3.36 (t, 2H, COCH2), 3.74 (t, 2H, NCH2), 8.09 (m, 4H, ArH).
단계 2: 4-(3-(p- 톨릴티오 ) 프로파노일 ) 벤조익산 5 의 합성.
상기 단계의 반응 계획은 도 2에 나타내었다.
p-카르복시-3-피페리디노프로프리오페논 하이드로클로라이드 2 (1.0 g) 및 4-메틸벤젠티올(417 mg, 3)을 순수 에탄올(7.5 ml) 및 메탄올(5 ml)의 혼합액에 넣고 부유시켰다.
그 후 피페리딘(50 ㎕)을 가하고 상기 부유물을 아르곤 존재하에 교반하며 환류 조건에서 6시간 동안 가열하였다. 생성된 흰색 침전물을 상온으로 식힌 후 유리 필터(G3)를 통해 분리하고, 차가운 아세톤으로 조심스럽게 씻어내고 진공에서 건조시켜 5를 수득하였다(614 mg). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 2.27 (s, 3H, 페닐-CH3), 3.24, 3.39 (t, 2 x 2H, CH2), 7.14, 7.26 (d, 2 x 2H, 톨릴 부분의 ArH), 8.03 (m, 4H, 카르복실산 부분의 ArH).
단계 3, 4-(3- 토실프로파노일 ) 벤조익산 6 의 합성.
상기 단계의 반응 계획은 도 3에 나타내었다.
4-(2-(p-톨릴티오)프로파노일)벤조익산 5 (160 mg)을 물(10 ml) 및 메탄올(10 ml)의 혼합액에 부유시켰다. 얼음배스(ice bath)에서 식힌 후, 옥손(720 mg, 알드리치)을 가하고 밤샘(15 시간) 교반하며 상기 반응 혼합물을 상온까지 가온하였다. 생성된 부유물은 물(40 ml)을 추가해 묽혀 균일하게 만들고 상기 혼합물은 클로로포름(총 100 ml)으로 세 번 추출하였다. 상기 클로로포름 추출물은 소금물로 씻고 그 후 마그네슘설페이트(MgSO4)로 건조시켰다. 30 ℃ 진공하에서 휘발물질들을 기화시켜 흰색 고체 6을 수득하였다(149 mg). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 2.41 (s, 3H, 페닐-CH3), 3.42 (t, 2H, CO-CH2), 3.64 (t, 2H, SO2-CH2), 7.46, 7.82 (d, 2 x 2H, 톨릴 부분의 ArH), 8.03 (m, 4H, 카르복실산 부분의 ArH).
단계 4, PEGylated 4-(3- 포실프로파노일 ) 벤조익산 , PEG 시약 9 의 합성.
상기 단계의 반응 계획은 도 4에 나타내었다.
4-(3-토실프로파노일)벤조익산 6(133 mg) 및 O-(2-아미노에틸)-O'-메틸-PEG 8(MW 10 kDa, 502 mg, 바이오벡트라)를 무수(dry) 톨루엔(5 ml)에 용해시켰다. 상기 용매는 가열하지 않은 상태의 진공하에서 제거하였고 고체 건조 잔여물은 아르곤 하에서 무수 디클로로메탄(15 ml)에 재용해 시켰다. 얼음 배스에 넣어 차갑게 한 생성된 용액에, 디이소프로필카르보디이미드(DIPC, 60 mg)을 아르곤 하에서 천천히 가하였다. 그 후 상기 반응 혼합물은 상온에서 밤샘(15 시간) 교반시켰다. 휘발물질은 진공하에서(30 ℃, 물 배스) 제거하여 얻은 고체 잔여물은 조심스럽게 온도를 높이며(35 ℃) 아세톤(20 ml)에 재용해시켰다. 상기 용액은 비흡수면 모직상에서 여과하여 녹지 않는 물질을 제거하였다. 상기 용액은 건조한 얼음배스에서 차갑게 하여 얻은 하얀색 침전물을 원심분리기를 이용하여 분리하였다(4600 rpm, 30 min). 액상은 부어내고 상기 침전물 제조방법을 세 차례 반복하였다. 그 후 생성된 투명한 하얀색 고체는 진공에서 건조시켜 PEG 시약 9를 수득하였다(437 mg). 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 2.46 (s,3H, 페닐-CH3), 3.38 (s, 3H, PEG-OCH3), 3.44-3.82 (br m, PEG), 7.38, 7.83 (d, 2 x 2H, 톨릴 부분의 ArH), 7.95 (m, 4H, 카르복실산 부분의 ArH).
PEG 분자량이 다른 유사한 PEG 시약은 상기 일반적인 제조방법과 동일한 방법에 의해 수행되었다. 그러므로, 20 kDa PEG는 설폰 6(20.8 mg), O-(2-아미노에틸)-O´-메틸-PEG (20 kDa, 250 mg, 플루카) 및 DIPC(8.7 mg, 7)을 무수 디클로로메탄(15 ml)에서 반응시킨 후 아세톤으로 침전 정제과정을 통해 투명한 하얀색 고체를 수득하였다(245 mg). 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 2.46 (s,3H, 페닐-CH3), 3.38 (s, 3H, PEG-OCH3), 3.44-3.82 (br m, PEG), 7.38, 7.83 (d, 2 x 2H, 톨릴 부분의 ArH), 7.95 (m, 4H, 카르복실산 부분의 ArH).
실시예 2: 분자량 5, 10 및 20 kDa 인 PEG 시약 9 와 하나의 힌지 ( hinge ) 디설파이드( 두 개의 티올)를 가지는 Fab 항체 부분의 페길레이션( PEGylation) .
100 ㎕의 Fab 용액(앱캠 cat. no. AB6520, 1 mg/ml)을 5 ㎕의 DTT 스탁 용액(탈이온수 내의 100 mM)에 가하고 생성된 용액을 30 분간 상온으로 유지하였다. 상기 용액은 pH 7.8, 50 mM의 포스페이트 버퍼 95 ㎕과 0.15 M NaCl 및 10 mM EDTA로 200 ㎕까지 묽히고, 그 후 일러스트라 NAP-5 컬럼(GE Healthcare cat. No. 17-0854-01)에 미리 맞추어놓은 pH 7.8, 50 mM의 포스페이트 버퍼와 0.15 M의 NaCl 및 10 mM의 EDTA를 로딩하였다. 상기 NAP-5 컬럼은 새로운 pH 7.8의 포스페이트 버퍼 5 x 300 ㎕으로 묽혔다. 상기 280 nm에서의 UV 흡광도는 모든 분절에서 측정되므로 그 결과 감소된 Fab는 분절 3에서 주로 확인되고 상기 단백질 농도는 0.23 mg/ml로 측정되었다.
분자량이 5 kDa, 10 kDa 및 20 kDa인 세 가지 PEG 시약은 pH 7.8인 포스페이트 버퍼에 녹여 각각 0.5 mg/ml, 1 mg/ml 및 2 mg/ml 농도의 용액을 제조하였다.
각각의 페길레이션(PEGylation)을 위하여, 5.0 ㎕의 감소된 Fab 용액(0.23 mg/ml) 및 0.42 ㎕의 PEG 용액(감소한 힌지(hinge) 다이설파이드 티올과 동량)이 사용되었다. 또한, 상기 Fab 반응 용액은 pH 7.8 포스페이트 버퍼 4.6 ㎕으로 묽혀 최종 부피가 10 ㎕가 되게 하였다. 상기 반응 용액은 4 ℃에서 12시간 동안 배양하였다.
SDS-PAGE 분석은 NuPAGE? Novex 4-12% 비스-트리스 겔 인비트로젠 cat. No. NP0321BOX) 및 NuPAGE MES SDS 러닝(running) 버퍼(Invitrogen cat. No. NP002)를 이용하여 반응 용액 상에서 수행하였다. 상기 겔은 인스턴트블루(InstantBlue)(Expedeon cat. No. ISB1L)로 스테인(stain)하였다. 하기 도 5에 결과를 나타내었다. SDS-PAGE에서 PEG 분석은 단백질 마커에 붙여 이의 실제 크기의 약 두 배로 수행하여, 5 kDa PEG는 10 kDa 단백질과 비슷하게 나타났다. Fab는 약 50 kDa의 단백질이고 SDS-PAGE 겔상에서 측정할 때에는 감소하지 않을 때 약 50 kDa에서 단일 밴드를 나타내고 감소하는 형태일 때에는 25 kDa 쯤에서 하나 또는 두 개의 밴드를 나타낸다. 이러한 무겁고 가벼운 사슬들(chains)은 환원 및 SDS와의 배양시에 더 이상 힌지(hinge) 디설파이드에 의해 서로 잡히지 않는다. 그러므로, 상기 Fab은 단일 PEG이 환원된 힌지 디설파이드의 두개 시스틴 각각의 용액상에서의 결합에 의해 두번 페길레이션 될 지라도, SDS-PAGE 분석은 25 kDa의 무겁고 가벼운 사슬의 단일-페길레이션 결과만을 보여준다. 1이라고 부착된 레인(lane)은 단백질 마커이다(Novex sharp protein standards, Invitrogen cat. No. LC5800). 레인 2는 Fab 그 자체를 나타낸다. 4번 레인은 DTT(25 kDa 근처의)에 의해 환원된 Fab를 나타낸다. 5번 레인은 35 kDa의 페길레이션 된 Fab에서의 밴드인 상기 일차 생성물과 함께 5 kDa 페길레이션 결과를 나타낸다. 25 kDa에서 나타나는 매우 작은 양의 환원된 Fab은 대부분 페길레이션 되었다. 6번 레인은 10 kDa의 페길레이션 된 Fab과 일치하는 40 kDa 이상에서 나타나는 밴드인 상기 일차 생성물과 함께 10 kDa 페길레이션 결과를 나타낸다. 7번 레인은 20 kDa의 페길레이션 된 Fab과 일치하는 60 kDa 이상에서 나타나는 밴드인 상기 일차 생성물과 함께 20 kDa 페길레이션 결과를 나타낸다. 3번 레인은 이전의 환원 과정없이 페길레이션이 시도된 결과를 나타낸다: 상기 사실은, 페길레이션 반응사이트가 환원된 다이설파이드 결합인 페길레이션 결과물은 없다는 것을 말해준다.
실시예 3. 5 kDa PEG 시약 9로 수행하는 아스파라기나아제의 페길레이션
150 mM의 NaCl과 pH 7.8의 5 mM EDTA를 포함하는 20 mM의 소듐 포스페이트 버퍼에 담겨있는 1 mg/ml의 아스파라기나아제 용액 1 ml에 DTT(15.4 mg)을 가한 후, 몇 초간 볼텍싱(vortexing)한 용액을 40분 동안 상온에서 방치하였다. 상기 1 ml의 용액을 150 mM NaCl 및 5 mM EDTA를 포함하는 pH 7.8인 소듐 포스페이트 버퍼 20 mM로 미리 맞추어놓은 PD-10 컬럼(GE Healthcare cat. No. 17-0851-01)에 가하고, 로드 비율에 따라 이동상을 모았다. 그 후, 상기 컬럼은 5 x 1 ml의 새로운 포스페이트 버퍼로 씻어내었다. 3 및 4 부분을 결합하여 2 ml를 얻었다.
5 kDa PEG 시약 9의 10 mg/ml 용액은 정제수에서 준비하고 2.0 ㎕(PEG의 자유 티올의 1.5배)는 환원된 아스파라기나아제 100 ㎕에 가하였다. 상기 용액은 몇 초간 볼텍싱한 후 4 ℃에서 밤새 놔두었다. 그리고 샘플을 채취하여 SDS-PAGE 분석을 수행하였다. 그 결과는 도 6에 나타내었다. 1 레인은 MW 측정에 사용된 단백질 마커를 나타내고, 2 레인은 페길레이션되기 전의 아스파라기나아제를 나타내며 3레인은 5 kDa PEG 시약과 환원된 아스파라기나아제 반응 용액을 나타낸다. 시스틴의 페길레이션인 강한 밴드는 60 kDa 이상의 단백질 마커인 일차 생성물에 나타났다. 두번째로 낮은 MW의 밴드는 두개의 시스틴 중 오직 하나의 시스틴의 페길레이션과 동일한 50 kDa 이상의 단백질 마커에 나타났다. 30 내지 40 kDa 사이의 환원된 아스파라기나아제의 매우 희미한 밴드는 PEG 시약 9와 페길레이션된 모든 단백질을 나타낸다.
실시예 4, 분자량 5, 10 및 20 kDa 의 PEG 시약 9를 포함하는 자유( free ) 단일 시스틴을 가진 G-CSF( granulocyte - colony stimulating factor ) 및 말레이미드 기능기를 가진 5 kDa PEG 의 페길레이션 비교.
GCSF 스탁용액(pH 6.2인 50 mM 소듐 포스페이트 버퍼, 150 mM의 NaCl 및 10 mM EDTA와 함께 담긴 0.66 mg/ml)을 각각 100 ㎕씩 5 등분으로 나누었다(Native G-CSF and four fractions for the PEGylation reactions). 상기 부분들은 PEG 시약의 1 몰만큼의 G-CSF와 함께 4 ℃에서 밤샘 배양되었다. 5 kDa PEG 시약 9 및 5 kDa PEG 말레이미드(Fluka cat. no. 63187)에 정제수에 담긴 5 mg/ml PEG 용액 3.5 ㎕를 가하였다. 10 kDa PEG 시약 9에 정제수에 담긴 5 mg/ml PEG 용액 7 ㎕를 가하였다. 20 kDa PEG 시약 9에 정제수에 담긴 5 mg/ml PEG 용액 14.0 ㎕를 가하였다. 상기 페길레이션 반응은 SDS-PAGE(NuPAGE? Novex 4-12% Bis-Tris gels, MES buffer, all from Invitrogen, and Instant-Blue stain (Expedeon cat. No. ISB1L)). PEG 시약이 없는 G-CSF를 15 내지 20 kDa 단백질 마커 사이의 밴드로 나타난 곳에 가하였다. 9를 이용한 5 kDa 페길레이션에 있어서, 5 kDa 모노페길레이션된 GCSF에 대응하는 30 kDa 근처의 밴드가 보였다. 9를 이용한 10 kDa 페길레이션에 있어서, 10 kDa 모노페길레이션된 GCSF에 대응하는 40 kDa 이하의 밴드가 보였다. 20 kDa PEG 결과에 있어서 20 kDa 모노페길레이션된 G-CSF에 대응하는 50 내지 60 kDa 사이의 밴드가 나타났다. 5 kDa PEG 말레이미드 반응에 있어서 반응하지 않은 G-CSF 밴드가 나타나지 않았고, 상기 시약과 반응하지 않은 것이 보였다.
실시예 5. 10 kDa 및 20 kDa PEG 시약 9를 가진 C 말단(terminal)상의 8 히스티딘 시퀀스를 가진 IFN α-2b에서의 히스티딘 페길레이션 .
IFN α-2b (2 mM EDTA 및 150 mM NaCl을 포함하는 10 mM sodium phosphate buffer에 담긴 1.13 mg/ml, pH 7.5) 용액 20 ㎕에 1 몰의 10 kDa PEG 시약 9 (정제수에 담긴 6 mg/ml의 용액 1.8μl) 및 상온에서 밤샘 배양된 생성 용액을 가하였다. 또한, 20 kDa PEG 시약 9(정제수에 담긴 6.6 mg/ml 용액 3.3μl) 1몰을 사용하여 반복 수행하였다. 그 후, 상기 샘플들을 SDS-PAGE(NuPAGE? Novex 4-12% Bis-Tris gels, MES running buffer, all from Invitrogen, and InstantBlue stain (Expedeon cat. No. ISB1L))로 분석하였다. 그 결과는 도 7에 나타내었다. 1번으로 표기된 레인은 단백질 마커이다. 레인 2는 출발 IFN 자체이다. 레인 3은 10 kDa PEG 시약 9의 반응 결과를 보여준다. 30 내지 160 kDa 사이에 나타나는 뚜렷한 5개의 밴드는 1 내지 5개의 PEG 컨쥬게이션 된 사슬을 포함하는 IFN에 대응하는 단백질 마커이다. 레인 4는 20 kDa PEG 시약 9의 반응 결과를 보여준다. 60 내지 110 kDa 사이에 나타나는 뚜렷한 3개의 밴드는 1 내지 3개의 PEG 컨쥬게이션된 사슬을 포함하는 IFN에 대응하는 단백질 마커이다. 5로 표기된 레인은 스테인이 되지 않은 20 kDa PEG 시약이고, 어떠한 밴드도 나타나지 않는다. 6으로 표기된 레인은 스테인이 되지 않은 10 kDa PEG 시약이고, 어떠한 밴드도 나타나지 않는다.
실시예 6. 5 kDa PEG 시약 9와 펩타이드( leptin fragment , with a single free cysteine in the structure )의 페길레이션 .
렙틴(Leptin) 단편 116-130 아미드 마우스(Sigma cat. no. L6788) 1 mg을 150 mM NaCl 및 10 mM EDTA를 포함하는 pH 7.8의 50 mM 소듐 포스페이트 버퍼 1 ml에 녹였다. 5 kDa PEG 시약 9의 5 mg/ml 용액은 pH 7.8의 상기와 동일한 버퍼로 준비하였다. 상기 50 μl의 렙틴 단편 용액은 버퍼 50 μl 및 상기 PEG 용액(3 molar equivalents of PEG to free thiol on cysteine) 96.1 μl에 가하였다. 상기 용액은 몇 초간 보르텍싱하였고 4 ℃에서 밤새 놓아둔 후, 샘플은 RP-HPLC로 분석하였다. 상기 RP-HPLC는 분석 컬럼 소스(source) 5RPC 4.6/150 (Amersham bioscience cat. no. 17511601)가 JASCO HPLC 시스템에 부착된 형태로 구성된다. 버퍼 A는 물 + 0.05% 트리플루오르아세트산(Fisher scientific HPLC grade)이고 버퍼 B는 아세토나이트릴(Fisher scientific HPLC grade)이다. 상기 방법은 버퍼 A의 100% 내지 0%를 30 분 이상 1 ml/min의 속도로 흘려보내었다. 상기 HPLC 프로파일(profile)은 214 nm 및 280 nm 이하를 관찰하였다. 상기 렙틴 단편, PEG 시약 및 상기 반응용액의 결과는 도 8에 나타내었다.
상기 렙틴 단편의 머무름 시간(retention time)은 11.4 분이다. 상기 반응 혼합물에서 상기 피크가 사라지고 16.5 분에 피크가 나타나면, 상기 단편은 성공적으로 유도되었음을 나타내는 것이다.
실시예 7: 분자량 20 kDa 의 PEG 시약 9를 가지는 도메인 항체 단편이 붙여진 폴리히드티딘의 페길레이션 및 생물학적 활성.
항-TNF 알파 도메인 항체 단편 용액(protein sequence taken from patent WO 2005/035572 as the sequence listed as TAR1-5-19 in Figure 12 and expressed with a six-histidine tag on the C-terminus of the protein, 1.5 mg/ml in 50 mM sodium phosphate, 150 mM sodium chloride and 350 mM imidazole, pH 7.5) 2.7 ml에 정제수에 담겨있는 0.3 ml의 PEG 시약 용액을 가하였다(40 mg/ml, 1.9 molar equivalents to protein). 상기 용액은 D-TubeTM 투석기(Novagen, cat. No. 71508-3)로 옮기고 4 ℃에서 16시간 동안 pH 6.2 버퍼(50 mM 소듐 포스페이트, 150 mM 소듐 클로라이드, 20 mM EDTA)에 투석하였다. 상기 반응용액은 30분 동안 20 mM 소듐 아세테이트, pH 4.5로부터 700 mM 소듐클로라이드를 포함하는 20 mM 소듐아세테이트, pH 4.5까지 선형 구배를 사용한 Resource S 컬럼(GE Healthcare, cat. No.17-1178-01)으로 정제하였다.
분획들을 모아 SDS-PAGE로 분석하고 상기 결과를 도 9에 나타내었다. NuPAGE? Novex 4-12% 비스-트리스 겔(Invitrogen cat. No. NP0321BOX) 및 NuPAGE MES SDS 러닝(running) 버퍼(Invitrogen cat. No. NP002)가 사용되었고 상기 겔은 인스턴트 블루(InstantBlue)(Expedeon cat. No. ISB1L)로 스테인되었다. SDS-PAGE 분석에서의 PEG는 단백질 마커에 대항하여 이의 실제 크기의 약 두 배 정도로 나타나므로, 20 kDa PEG는 40 kDa의 단백질로 나타난다. 상기 도메인 항체 단편은 약 12.7 kDa의 단백질이다. 1로 표시되는 레인은 단백질 마커이다(Novex sharp protein standards, Invitrogen cat. No. LC5800). 레인 2는 오직 단백질만 나타낸다. 3으로 표시된 레인은 반응 용액이다. 53 kDa의 밴드는 모노페길레이션된 단백질에 대응한다. 다이PEG-단백질은 약 80 kGa의 밴드에 의해 나타나고 레인의 상단에 멀티페길레이션된 단백질의 매우 소량이 포함된다. 레인 4는 페길레이션 되지 않은 단백질로부터 영향받지 않은 하나의 밴드로 나타나는 정제된 모노페길레이션된 도메인 항체 단편이 나타난다.
실시예 8. 20 kDa PEG 시약 9를 포함하는 항- TNF 알파 애피바디( Affibody )(1 free thiol cysteine )의 ELISA 바인딩 및 페길레이션 .
150 mM NaCl 및 20 mM EDTA를 포함하는 pH 7.8인 50 mM 소듐 포스페이트 버퍼에 담긴 항-TNF 알파 애피바디(Affibody AB cat. no 10.0841.01)의 1 mg/ml 용액 1 ml를 DTT(3.0 mg)에 가하여 다이설파이드 결합을 감소시키고 몇 초간 보르텍싱한 후 상기 생성되는 용액은 30분간 상온에 두었다. 상기 용액 1 ml는 pH 6.2인 포스페이트 버퍼(50 mM 포스페이트 버퍼, 150 mM NaCl 및 20 mM EDTA)로 미리 맞추어진 PD-10 컬럼(GE Healthcare cat. No. 17-0851-01)에 로딩하였다. 그 후, 상기 컬럼은 5 x 1 ml의 pH 6.2인 새로운 포스페이트 버퍼로 씻어내었다.
A280nm 수치는 감소된 단백질이 포함된 3 및 4 분획으로 나타났고 모두 2 ml이었다. 상기 단백질 용액에 10 μl의 포화된 하이드로퀴논 수용액을 가하고 잘 교반하였다. 20 kDa PEG 시약 9의 20 mg/ml 용액은 정제수에서 제조되었고 73 μl(1 molar equivalent of PEG to free cysteine thiol)를 DTT 처리된 애피바디에 가하였다. 상기 용액은 몇 초간 보르텍싱한 후 3시간 동안 상온에 두고 샘플은 SDS-PAGE로 분석하였다.
3시간 후, 상당한 양의 페길레이션 된 단백질이 형성되어 페길레이션 반응은 완료하는 과정없이 정제하였다. 정제는 선형 염 구배(0-700 mM NaCl)를 가지는 Resource S 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼(GE Healthcare, cat. No.17-1178-01)을 이용하고 pH 4.5의 20 mM 소듐 아세테이트를 이동상으로 사용하여 30 분 동안 수행하였다. 상기 결과는 도 10에 나타내었다. 도 10에 나타난 1로 표시된 레인은 MW 측정에 사용된 단백질 마커를 나타낸다. 2로 표시된 레인은 DTT를 처리하기 전의 애피바디 용액을 나타낸다. DTT가 존재할 때의 상기 애피바디는 레인 3에 나타나있다. 레인 4는 PD-10 컬럼에 의해 DTT가 제거된 후의 애피바디를 나타내고 두 개의 밴드는 애피바디 단량체(free thiol cysteine available for PEGylation) 및 애피바디 이량체(cysteines not available for PEGylation)에 대응하는 것이다. 상기 5로 표시된 레인은 페길레이션 반응 용액을 나타낸다. 50 kDa 단백질 마커 상단의 밴드는 페길레이션된 애피바디 하나를 나타낼 수 있다. 모노패길레이션된 애피바디가 정제된 상기 양이온 교환 크로마토그래피는 페길레이션되지 않은 단백질로 부터 오염되지 않은 하나의 밴드로 레인 6에 나타난다.
상기 정제된 모노 페길레이션된 생성물의 TNF-α에의 바인딩 활성은 ELISA 방법에 의해 분석되었다:
TNF-α (10 ug/ml in 15 mM Na2CO3, 34.9 mM NaHCO3, pH 9.6)를 96-웰 마이크로타이터 플레이트(Maxisorp, Nunc)에 100 μl/well을 첨가하고 4 ℃에서 밤샘 배양하였다. 그 후 TNF-α를 제거하고 PBS/1% BSA를 100 μl/well에 가하고 상온에서 1시간 동안 배양하였다. 그 후 PBS/1% BSA를 제거하고 상기 페길레이션된 항-TNF-α 애피바디(0.026, 0.13, 0.65, 3.25 ug/ml in PBS/1% BSA)를 첨가하고 상온에서 1시간 동안 배양하였다. 페길레이션이 되지 않은 애피바디는 대조 웰에 추가하였다. 상기 플레이트는 PBS/0.1% Tween 20 (PBS/T) 300 μl/well로 세 번 씻어내었다. 항-PEG 토끼 항체(Epitomics, cat no. 2061-1; 1:1000 in 1% BSA/PBS)를 100 μl/well에 추가하고 상온에서 1시간 동안 배양하였다. PBS/T로 세번 씻어낸 후, 홀스래디쉬 컨쥬게이션-과산화효소 항-토끼 항체(horseradish peroxidase-conjugated anti-rabbit antibody)(Abcam, cat no. ab6721; 1:1000 in PBS/1% BSA)를 100 μl/well에 추가하고 상온에서 1시간 동안 배양하였다. 웰은 PBS/T로 세번 씻어내고 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 기질(Sigma-Aldrich, cat no. T0440)을 100 μl/well에 추가하였다. 어두운 곳에서 15분 배양된 후, 정지 시약(Sigma-Aldrich, cat no. S5689)을 100 μl/well에 가하였고 650 nm에서 흡광도를 나타내었다.
도 11에 나타난 상기 ELISA 결과는 페길레이션된 애피바디에 의하여 TNF-α와 명확하게 바인딩을 함을 보여주고, 이는 상기 단백질은 페길레이션이 된 후의 활성을 유지하고 있음을 보여주었다. TNF-α가 없으면 항-PEG 항체의 바인딩은 존재하지 않았다.
실시예 9. 20 kDa PEG 시약 9를 이용한 N-말단에 8 히스티딘 시퀀스를 가진 인터페론 알파-2b( IFN α-2b)의 히스티딘 시퀀스에서의 페길레이션 . 소듐 보로하이 드라이드를 이용한 환원이 된 상기 20 kDa 페길레이션된 IFN 의 상기 항바이러스 활성 및 환원되지 않은 항바이러스 활성.
N-말단에 8 히스티딘 시퀀스를 가진 IFN α-2b(1.07 mg/ml in 50 mM sodium phosphate buffer containing 150 mM NaCl, pH 7.4) 용액 4.67 ml에 20 kDa PEG 시약 9 (217 μl of a 60 mg/ml solution in deionised water) 2.6 몰 당량을 가하고, 상기 결과 용액을 상온에서 밤새도록 배양하였다. SDS-PAGE (NuPAGE? Novex 4-12% Bis-Tris gels, MES running buffer, all from Invitrogen, and InstantBlue stain (Expedeon cat. No. ISB1L))에 의한 분석 후의 상기 반응 샘플은 고성능 음이온 교환 크로마토그래피(TOSOH DEAE column, S TSKgel DEAE-5PW, Supelco Cat No. 8-07164, connected to a Jasco HPLC system)를 수행하여 모노페길레이션된 IFN α-2b을 정제하였다. 상기 이온 교환 컬럼에서 얻어진 분획들(각각 1 ml)은 SDS-PAGE로 분석하였다. 상기 모노페길레이션된 IFN을 대부분 포함하는 분획들은 동결건조시켰다. 동결건조 후 얻어진 상기 결과 잔여물은 150 mM NaCl 및 2 mM 소듐 보로하이드라이드를 포함하는 50 mM 소듐 포스페이트 버퍼에 녹이고 상온에서 1시간 동안 놓아두었다. 상기 결과 용액은 크기 배재 크로마토그래피(HiLoad 16/60, Superdex 200, 50 mM PBS as eluent, 1.6 ml/min flow rate and detection at 214 nm)를 수행하여 모노페길레이션된 IFN을 분리하였다. 상기 분리된 샘플은 SDS-PAGE로 분석하였고 그 결과는 도 12에 나타내었다. 도 12에서 1번으로 표시된 레인은 단백질 마커이다. 2로 보시된 레인은 오로지 스타팅(starting) IFN을 나타낸다. 레인 3은 50 내지 60 kDa 단백질 마커 사이에 있는 정제한 20 kDa 모노 페길레이션된 IFN α-2b에 대응하는 단일 밴드를 나타낸다.
항바이러스 활성: 항바이러스 에쎄이(assay)는 페니실린 및 스프렙토마이신을 포함하는 DMEM/10% 페탈 칼프세럼(FCS)에서 배양된 A549 세포에서 수행하였다. A549 세포는 DMEM/10% FCS의 0.2 x 106 cells/ml 농도에서 재부유되었고 96-웰 마이크로타이터 플레이트 내의 50 μl/well에서 분취되었다. 다음 날, 페길레이션 된 IFN 샘플과 아무런 처리도 되지 않은 IFN 샘플을 2배 희석하여 준비하고 각 희석물의 50 μl를 상기 웰에 추가하였다. 상기 플레이트는 24시간 동안 배양하였다. 상기 배지를 제거하고 상기 세포는 엔세파로마이오카르디티스 바이러스(EMCV)와 함께 DMEM/5% FCS (50 μl/well)에서 배양하였다. 세포는 추가로 24시간 동안 배양한 후 300 μl/well만큼의 PBS로 씻어내고 4% 포름알데하이드/0.1% 메틸 바이올렛(50 μl/well; Sigma-Aldrich, cat no. 198099)를 이용하여 30분간 스테인하였다. 그 후 상기 플레이트를 300 μl/well만큼의 PBS로 두 번 씻어내고 공기 건조시켰다. 상기 염색은 2% SDS 용액(50 μl/well)으로 용해도를 높이고 상기 흡광도는 570 nm에서 측정되었다. 상기 20 kDa 페길레이션된 IFN-α2b에 소듐 보로하이드를 처리 하지 않은 (A) 또는 처리한 (B)의 활성은 각각 64 pg/ml 및 68 pg/ml로 측정되었다.
실시예 10. 말레이미드 기능기를 가지고 있는 상업화된 PEG 시약과 PEG 시약 9의 안정성 비교.
PEG 시약 9(5 kDa 및 20 kDa 샘플)의 안정성은 메톡시 폴리(에틸렌 글라이콜) 말레이미도-프로피온아미드(Chirotech Technology Ltd, cat.no. 008-008, lot no. 223126001) 및 α-메톡시-ω-에틸-말레인이미드 폴리에틸렌 글라이콜(Iris Biotech cat. no. PEG1146, lot no. 128512)과 핵 자기 공명(NMR) 분광법에 의해 pH 7.4에서 비교하였다. pH 7.4의 D2O 용액은 먼저 pH 7.4에서 150 mM NaCl 및 20 mM EDTA를 포함하는 50 mM의 소듐 포스페이트 수용액에서 동결건조시키고 듀트륨(deuterium) 옥사이드로 동일한 부피만큼 재구성하여 제조하였다. 아세톤은 버퍼에 표준용액으로 3 ml 당 1.0 μl 추가되었다. PEG 시약의 샘플은 0.75 ml의 버퍼에 1 μmol씩 녹이고 4시간 후 및 25.5 시간 후에 400 MHz NMR 분광법으로 분석하였다. 상기 PEG 말레이미드 샘플의 안정성은 2.17 ppm의 아세톤 기준 적분을 이용하여 표준화(normalising)된 후 6.86 ppm 적분과 비교하여 결정하였다. 상기 PEG 시약 9의 안정성은 2.21 ppm의 아세톤 기준 적분을 이용하여 표준화된 후 7.31, 7.40, 7.47, 7.73, 및 8.03 ppm에서의 신호 전체 적분과 비교하여 결정하였다. 상기 7.31, 7.47 및 8.03 피크는 PEG 시약 9로부터 형성된 단백질 활성 PEG 시약 10(도 14)에서 왔다. 상기 실험 가운데서, 상기 9 내지 10의 비율은 샘플 1 및 2에서 1.46 에서 1.77 내지 1의 범위를 가졌다. 상기 안정성 연구 결과는 표 1에 나타내었다. 상기 PEG 말레이미드 샘플은 pH 7.4에서 21.5 시간 동안 19 내지 55% 사이만큼 분해된 반면, 동일한 조건에서 상기 PEG 시약 9 샘플은 분해되지 않았다.
PEG 시약 9와 PEG 말레이미드의 NMR 안정성 비교 연구 결과
샘플 6.86 ppm 피크의 4 시간 적분 6.86 ppm 피크의 25.5 시간 적분 pH 7.4에서 21.5 시간 동안의 분해%
PEG 말레이미드 샘플 1 1.16 0.52 55
PEG 말레이미드 샘플 2 0.75 0.61 19
4 시간 전체 적분 7.31, 7.40, 7.47, 7.73, 8.03 ppm 피크 25.5 시간 전체 적분 7.31, 7.40, 7.47, 7.73, 8.03 ppm 피크
PEG 시약 9 샘플 1 4.85 4.82 <1
PEG 시약 9 샘플 2 3.93 4.01 0
실시예 11. 다양한 pH 에서 단일 자유( free ) 시스틴 티올을 포함하는 라미닌 단면 925-983( Lam ß1 925-933 )의 페길레이션 .
Lamß1925-933은 라미닌 B1 사슬의 925-933 잔여물에 대응하고 단일 시스틴 티올을 포함하는 합성 선형 노나펩타이드(Cys-Asp-Pro-Gly-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg-NH2) (Sigma cat. no. C0668)이다.
다양한 pH에서 PEG 시약 9의 페길레이션: 동결건조된 Lamß1925-933 펩타이드(1 mg)을 500 μl 정제수에 넣고 녹여 2 mg/ml의 모액을 만들었다. 보르텍싱 후, 상기 펩타이드 모액은 신선한 상태로 사용되거나 사용 전까지 -80 ℃에서 분취 및 저장하였다. 상기 Lamß1925-933 모액은 페길레이션 반응 혼합물의 최종 농도 1 mg/ml(1 mM)를 위하여 2 배로 묽혔다.
상기 5 kDa PEG 시약 9(5 mg)는 정제수 200 μl에 녹여 25 mg/ml의 모액을 제조하였다. 보르텍싱 후, 상기 PEG 시약 모액은 신선한 상태로 사용되거나 사용 전까지 -80 ℃에서 분취 및 저장하였다. 상기 PEG 모액은 페길레이션 반응 혼합물의 최종 농도 5 mg/ml(1 mM)를 위하여 5 배로 묽혔다.
상기 버퍼 모액은 pH 6.0-8.0의 1 M 소듐 포스페이트 버퍼 및 pH 8.5-10.0 범위의 1 M 소듐 카보네이트-바이카보네이트 버퍼를 포함한다. 또한 모든 범위의 pH 값에서, 상기 버퍼 모액은 10 mM EDTA 및 381 μM 하이드로퀴논을 포함한다. 상기 버퍼 모액은 100 mM 완충제(소듐 포스페이트 또는 소듐 카보네이트-바이카보네이트), 1 mM EDTA 및 38 μM 하이드로퀴논의 최종 농도를 위하여 10배로 붉혔다.
각 페길레이션 반응 혼합물은 전체 반응 부피 10 μl를 위하여 5 μl Lamß1925-933 모액, 1 μl 모액, PEG 시약 용액 2 μl(PEG 시약과 Lamß1925-933 모델 펩타이드의 1:1 몰비와 동일한) 및 2 μl 정제후를 포함한다. 몇 초간의 보르텍싱 후, 간단한 원심분리(30 s at 5,000×g)에 의하여 튜브 아랫쪽의 용액을 수집하고, 상기 반응 혼합물은 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 16 및 24 시간 동안 상온에서 세워서 배양하였다. 상온에서 배양한 후, 상기 반응 혼합물을 포함하는 튜브는 -80 ℃에 놓아두고 역상 크로마토그래피로 분석하기 전까지 보관하였다.
역상 크로마토그래피 어쎄이를 위하여 Source 5RPC ST 4.6/150 (GE Healthcare, cat. no. 17-5116-01) 컬럼이 사용되었다. 상기 컬럼은 Jasco PU-980 인텔리전트(Intelligent) HPLC 펌프, Jasco LG-980-02 테너리 그래디언트 구성단위, Jasco Degassys Populaire 가스배출 구성단위, Jasco UV-970 4-λ 인텔리전트 UV 디텍터, Jasco LC-NetII/ADC PC와의 연결을 위한 인터페이스 alc a Rheodyne 7725i 매뉴얼 인젝터 밸브로 이루어진 Jasco HPLC 시스템에 연결되어있다. 상기 HPLC 시스템은 EZchrom SI version 3.2.1 Build 3.2.1.34 크로마토그래피 소프트웨어 패키지(Agilent Technologies)를 사용하는 컴퓨터를 통하여 조절된다. 또한, 크로마토그램 분석 및 데이터 전송은 EZchrom SI 크로마토그래피 데이터 시스템을 이용하여 수행되었다.
세개-용리액 시스템이 사용되었다. 용리액 A는 정제수에 들어있는 5%의 아세토나이트릴(Far UV, HPLC grade, Fisher cat. no. A/0627/17) 및 0.065% 트리플루오르아세트산(TFA) (Acros cat. no. 139721000)을 포함한다. 용리액 B는 아세토나이트릴에 들어있는 0.075% TFA를 포함하고, 용리액 C는 100% 아세토나이트릴이다.
용리액은 사용하기 전에 초음파 분해를 통해서 가스를 제거하였다. 상기 용리 프로그램은 20 분 동안 0-64%의 B 구배를 한 후 100% 아세토나이트릴로 씻어내고 용리액 A에서 재평형화하였다(표 2). 1 ml/분의 변함없는 흐름 속도를 진행하는 동안 유지하였다. 상기 215, 250, 280 및 350 nm에서의 흡광도는 진행하는 동안 기록되었다. 각 샘플(10 μl)을 녹이고 상층액의 5 μl를 역상 크로마토그래피 컬럼에 주사하기 전에 즉시 간단히 원심분리하였다(1 min at 14,000 g).
역상 크로마토그래피 어쎄이에 사용되는 용출 용리 프로그램의 셋팅
시간 (분) 흐름 속도 (ml·min-1) A (%) B (%) C (%)
처음 1.00 100 0 0
20.00 1.00 36 64 0
20.20 1.00 0 0 100
24.00 1.00 0 0 100
24.20 1.00 100 0 0
30.00 1.00 100 0 0
상기 크로마토그램에서의 각각의 피크 특성은 기준 샘플(PEG reagent, reduced and oxidised unreacted peptide) 작동 및 상대적인 크기 측정(페길레이션을 위해: 펩타이드-PEG 컨쥬게이션)에 의한 크기 배재 크로마토그래피(SEC) 분석에 의해 확인되었다. SEC 분석에 사용된 상기 컬럼은 BioSep-SEC-S3000 (300 × 7.8 mm) 분석 컬럼(Phenomenex, cat. no. 00H-2146-KO)이다. 상기에 사용된 작동 용리액은 10%(v/v) 아세토나이트릴을 포함하는 10 mM 소듐 포스페이트 버퍼(pH 7.0)이고 작동하는 동안 상기 흐름 속도는 2 ml/min로 일정하게 유지하였다.
1 몰 당량의 5 kDa PEG 시약 9를 사용하여 pH 6.5에서 시간-과정ㅇ 페길레이션 실험의 크로마토그램을 도 13에서 나타내고 있다. 상온에서 15 분 배양 후, 다섯개의 피크나 나타났다: 상기 펩타이드 Lamß1925-933과 반응하는 PEG(피크 1); 디설파이드 형성을 통해 형성된 반응하지 않는 펩타이드 다이머(피크 2); 상기 PEG 시약 9 설폰산 이탈기(피크 3, 도 14에서의 화합물 11); 페길레이션된 펩타이드 생성물에 대응하는 피크(5 kDa PEG-Lamß1925-933 컨쥬게이션)(피크 4) 및 상기 PEG 시약 9(피크 6, 반응하지 않는 형태).
배양 4시간 후, 모든 자유(free) 펩타이드(피크 1)는 페길레이션이 완료되어 모두 사라졌다. 또한, 몇몇 펩타이드는 반응하지 않는 다이머(peak 2, note that the PEG reagent absorbs more strongly than the peptide at equivalent concentrations)로 형성이 되었기 때문에 과량의 활성화된 PEG 시약 피크(피크 5, 도 14의 화합물 10)는 남아있다. 상기 산화된 Lamß1925-933(피크 2)는 자유 티올기를 가지고 있지 않아 페길레이션되지 못하고 이에 상응하는 피크(피크 2)는 반응하는 동안 변하지 않고 남아있었다. 이 결과는 시스틴 티올 페길레이션은 펩타이드 환원과 함께 발생한다는 것이다.
pH 6.0 내지 pH 8.0 사이에서의 Lamß1925-933과 PEG 시약과의 반응성은 펩타이드(피크 1)가 5 kDa 페길레이션 된 Lamß1925- 933생성물(피크 4)로의 변환을 측정함으로써 알 수 있었다. 상기 펩타이드 피크 결과는 각 페길레이션 반응시 사용된 펩타이드의 총량과 대응하는 피크 면적을 계산하여 100으로 두어 표준화시키고, 상기 생성물 피크 결과는 모든 펩타이드가 생성물로 변환된 것에 대응하는 피크 면적을 최대 생성물로 가정하여 표준화시켰다. 변환(%)은 상기 반응에 사용된 펩타이드의 초기 량과 페길레이션 된 펩타이드의 비율로 정의하였다. 상기 결과는 도 15에 나타내었다. pH 6.0, 6.5, 7.0, 7.5 및 8.0에서 모든 펩타이드는 페길레이션 되었다. 반응이 완료되는 속도는 pHdp 의존하고, pH가 높을 수록 반응속도는 빨라지며, 다른 pH에서는 반응하는 구조 10(도 14)의 생성 속도가 달라지는 것을 말해준다.
실시예 12. 다양한 pH 에서 PEG 시약 9 및 상업화된 PEG 말레이미드의 반응성 비교.
실시예 11의 Lamß1925-933 펩타이드와 PEG 시약 9의 반응성은 PEG 시약, PEG 말레이미드(O-(2-말레이미도에틸)-Ω’-메틸-폴리에틸렌 글라이콜 5,000, Fluka cat. no. 63187)와 반응하는 상업화된 티올과의 비교이다. PEG 시약 9는 시간-단위의 실험에서 즉시 제조할 수 있고, 상기 시약은 pH 7.5에서의 배양 및 펩타이드 컨쥬게이션보다 RP 크로마토그래피에 의해 분리된 상기 시약 10으로 티올 반응 형태로 먼저 형성된다. PEG 시약 9가 시간 척도(time-scale)의 실험 반응에 즉시 이용가능함을 확인하기 위하여, 상기 시약은 먼저 pH 7.5(2 시간, 4 ℃)에서 배양하여 티올 반응 형태로 만들고 상기 시약 10은 펩타이드 컨쥬게이션에 앞서 RP 크로마토그래피하여 분리하였다. 모든 펩타이드 반응은 갓 용해시킨 PEG 시약과 함께 수행되었다. 간단히, 상기 페길레이션 반응 용액(반응 스케일 10 μl)은 100 mM 소듐 포스페이트 버퍼(pH 6.0-8.0) 또는 100 mM 소듐 카보네이트-바이카보네이트(pH 8.5-10.0) 및 1 mM EDTA에 담겨있는 10 μg의 Lamß1925-933, 50 μg 의 PEG (5 kDa)시약 (PEG 시약과 Lamß1925-933 모델 펩타이드가 1:1 몰비에 상응하는)을 포함한다. 상온에서의 배양 후, 상기 반응 혼합물은 상기 실시예 11에서 언급한 역상 크로마토그래피를 이용하여 분석하였다. 상기 결과는 도 16에 나타내었다. PEG 시약 9(pH 9.0 내지 10) 및 10(pH 6.0 to 8.0)의 경우, 상기 모든 펩타이드가 페길레이션된 형태로 전환되는 것은 pH 6.0 및 pH 10 사이에서 15 분내에 가능하다.
PEG 말레이미드 시약의 경우 15분이 지난 후에도 최대 78.9%의 전환율을 나타내었다. 더 높은 pH에서, 상기 전환율은 더 낮았다(pH 10에서 51.2). pH 8.5에서 상기 PEG 말레이미드 반응은 16시간 후에 다시 샘플을 측정하니 모든 펩타이드가 소모되어 있었다.
모든 pH 값에서 테스트하여 본 결과, PEG 시약 9 및 10은 PEG 말레이미드 시약보다 더 효율적이었다.
실시예 13. PEG 시약 9 펩타이드 컨쥬게이션 및 PEG 말레이미드 유도체 펩타이드 공액의 안정성 비교.
PEG 시약 9로부터 만들어진 정제된 Lamß1925-933 펩타이드 컨쥬게이션 및 실시예 12의 PEG 말레이미드를 12일 동안 비교하였다. 상기 컨쥬게이션의 안정성은 상기 실시예 11에 언급한 역상 크로마토그래피를 이용하여 PEG-펩타이트 피크의 면적을 모니터링하여 측정하였다.
PEG 시약 9와 함께 페길레이션된 Lamß1925-933의 합성: 상기 컨쥬게이션은 실시예 11을 수정하여 준비하였다. (pH 6.0 using a final peptide concentration of 1.6 mg/ml and 0.4 mg peptide). 상기 생성물은 RP-크로마토그래피에 의하여 분리하였다. 상기 Lamß1925-933-PEG 컨쥬게이션에 대응하는 용리 피크를 모아 동결건조시킨 후 정제수에서 재 부유시켰다. 마침내, 2 mM의 소듐 보로하이드라이드(Acros Organics, cat. no. 200050250)를 추가한 후 상기 샘플을 상온에서 30분간 배양하고, 50 mM의 소듐 포스페이트 버퍼(pH 7.5)를 추가하였다. 말레이미드를 이용한 페길레이션된 Lamß1925-933의 합성: Lamß1925-933(0.4 mg)을 5 kDa PEG 말레이미드(5 kDa, Fluka cat no. 63187)시약을 이용한 페길레이션에 사용하였다.
간단히, 20 μl의 10배 농축된 버퍼 모액(containing 1 M sodium phosphate buffer (pH 8.0) and 10 mM EDTA) 및 40 μl의 PEG 시약 모액(25 mg/ml in deionised water)을 200 μl의 펩타이드 모액(2 mg/ml in deionised water)에 가하였다. 상온에서의 배양 1.5시간 후, 상기 생성물은 실시예 11에 언급된 RP 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다. 상기 용리 피크 샘플은 동결건조시킨 후 정제수에서 재부유시키고 50 mM의 소듐 포스페이트 버퍼를 pH가 8.0 정도가 될 때까지 가하였다. RP 크로마토그래피는 두가지의 PEG-펩타이드 용액의 농도가 동일해지는 것을 확인하는 데 사용되었다.
안정성 샘플 두 가지는 상온에서 배양되었다. 12일이 지난 후, 샘플은 분석 RPC를 이용하여 분석하였고 상기 안정성은 도 17에 나타난 컨쥬게이션 피크의 적분 면적의 변화를 통하여 측정하였다. 상기 PEG 시약 9로부터 유도된 컨쥬게이션은 12일 이상 안정하였다. PEG 말레이미드로부터 유도된 컨쥬게이션은, 크로마토그램에서 63% 남아있음을 보여 PEG 시약 9가 더 안정한 생성물을 제조하는 것을 확인하였다.
실시예 14. 양 끝단이 기능화된 PEG 를 이용한 페길레이션 - PEG 시약 12
Figure 112011011857817-pct00001

PEG 시약 12는 O,O’-비스(2-아미노에틸)폴리에틸렌글라이콜 6000(Fluka cat. no. 14504)를 이용하는 것 및 실시예 11(Lamß1925-933)의 모델 펩타이드와 반응하는 PEG 시약 9와 유사한 방법에 의하여 제조되었다. 물(6 μl), 2 μl의 10× 버퍼 모액(containing 1 M sodium phosphate buffer (pH 8.0), 381 μM hydroquinone and 10 mM EDTA) 및 2 μl의 PEG 시약 12(25 mg/ml) 시약을 10 μl의 Lamß1925-933 모액(2 mg/ml in deionised water)에 가하였다. 이는 모델 펩타이드와 PEG 시약의 몰 비율이 1:0.375임을 의미한다. 상기 반응 용액(5 μl)은 분석 RPC(실시예 11에서 언급한)에 의하여 상온에서 2.5시간 배양한 후에 분석하였다. 분리된 피크에 의해 용리된 상기 반응 용액의 모든 성분들: Lamß1925-933 단량체는 8.1 분에 용리되었고, 산화된 Lamß1925-933 이량체는 8.9분에 용리되었고, 활성화되지 않은 PEG 시약은 17.3분에 용리되었고, 활성화된 PEG 시약은 15.7분에 용리되었으며 상기 이탈기 11은 10.1 분에 용리되었다. 상기 생성물 피크는 14.2 분에 용리되었다. 2.5시간 후, 반응 용액상의 65%의 자유 Lamß1925-933은 반응이 진행되는 동안 PEG 시약 12의 반응성이 있는 양 끝이 컨쥬게이션됨을 보였고, 이러한 양쪽 기능 시약은 하나의 PEG 분자 양 끝에 하나의 펩타이드 분자가 성공적으로 붙을 수 있었다.
실시예 15. 폴리머 성분으로 폴리 (1-비닐-2- 피롤리돈 )( PVP ) 사용: Lam ß1 925-933 모델 펩타이드와 PVP 의 컨쥬게이션.
PVP 시약의 제조(3 단계):
단계 1: 끝쪽 아민기를 가진 PVP: 압력 튜브에 시스트아민(0.028 g), 디옥산(8 ml) 및 마그네틱 스터 바를 넣었다. 용액이 형성될 때까지 조심스럽게 가열한 후, 상기 용액에 5분 동안 상온에서 아르곤으로 퍼지하였다. 퍼징이 되는 동안, 1-비닐=2-피롤리돈(2.0 g)을 추가하고, 추가로 5분이 더 지난 후 2,2'-아조비스(2-메틸프로피오니트릴)(0.089 g)을 가하였다. 2분이 더 지난 후 상기 압력 튜브는 아르곤 하에서 스크류 덮개로 밀봉하고 교반하며 17시간 동안 60 ℃의 오일배스에 놓아두었다. 상기 튜브 및 내용물을 상온까지 식힌 후, 디에틸 에테르(15 ml)를가하여 폴리머 생성물의 침전물을 유도하였다. 상기 액상은 따라붓고 상기 고체 잔여물은 아세톤(3 ml)에 다시 녹였다. 상기 결과 아세톤 용액을 빠르게 교반되고 있는 디에틸 에테르(25 ml)에 한 방울씩 추가하고 진공으로 채워진 no. 2 소결된 유리 펀넬(funnel)에서 상기 침전물을 분리하였다. 상기 고체는 깨끗한 디에틸 에테르(10 ml)로 씻어낸 후 상온의 진공상태에서 건조시켰다(mass = 1.44 g, white solid).
단계 2 - 반응성이 있는 말단기로부터 PVP-아민으로의 단백질 컨쥬게이션: PVP-아민(500 mg), 4-(3-토실프로파노일)벤조익산(structure 6 in Figure 3, 166 mg), 및 4-디메틸아미노피리딘(6 mg)을 무수 디클로로메탄(10 ml)과 함께 아르곤 하에서 혼합 및 교반하고 1,3-디이소프로필카보디이미드(155 μl)를 가하였다. 생성된 혼합물은 상온에서 주말동안 교반하였다. 주말동안 휘발성 물질이 증발되어 생성된 고체 잔여물은 디클로로메탄(10 ml)에 다시 녹이고 비흡수면의 탈지면으로 여과하였다. 여과된 액체에 디에틸 에테르(30 ml)를 추가하고 상기 생성된 침전물은 원심분리기(4,600 rpm, -9 ℃, 10 min)에 의해 분리하였다. 상기 액상은 따라내고 남은 잔여물은 디클로로메탄(10 ml)에 다시 녹였다. 상기 디에틸 에테르 침절물의 정제 방법은 두번 반복하고 상기 잔여물을 진공 하에서 건조시켰다(513 mg). PVP 컨쥬게이션 링커기의 NMR 진단 신호는 CDCl3에서 7.97, 7.82, 7.59 및 7.38에 나타났다.
단계 3 - PVP 시약의 분류: 상기 단계에서 얻은 고체 물질의 일정 부분(120 mg)을 20 mM의 소듐 아세테이트 버퍼 수용액, 150 mM NaCl, pH 4.0 와 함께 혼합한 후 13,000 rpm에서 맑은 용액이 되어 보일 때까지 원심분리하고 상기 액상은 0.45 μm 로 여과하였다. 상기 여과된 액체는 20 mM 소듐 아세테이트 버퍼, 150 mM, pH 4.0를 1 ml/min 속도로 흘리는 HiLoad 16/60 SuperdexTM 200 프렙 그레이드 크기 배재(size exclusion) 컬럼(GE Healthcare)으로 피크 용리하는 동안 매 1분마다의 부분을 모아 분류하였다(1.9 ml loaded). 73.9 내지 74.9 분 사이의 용리 부분은 동결건조 후 단백질 컨쥬게이션에 사용되었다. 상기 펩타이드 반응은 1 mM의 EDTA, 38 μM의 하이드로퀴논, 1.03 mM의 Lamß1925-933 과량의 PVP 시약을 포함하는 100 mM 소듐 포스페이트 버퍼(pH 8.0)에서 수행하였다. 상기 반응 혼합물은 실시예 11에 언급된 분석 RPC에 의하여 분석하였다. 상온에서 한시간 배양한 후, 상기 반응 혼합물에 존재하는 자유 Lamß1925-933 모델 펩타이드의 약 60%는 Lamß1925-933-PVP 컨쥬게이션(RPC retention time of 11.3 min)으로 성공적으로 변환되었고 이는 PEG보다 폴리머가 사용될 수 있다는 것을 보여 주었다.
실시예 16. 아민-기반의 이탈기 L을 가진 PEG 시약의 합성 및 용도.
Figure 112011011857817-pct00002

PEG 시약 13의 합성: PEG 시약 13(도 19)은 실시예 1과 유사한 방법으로 DIPC(11 mg)을 사용하고 DMSO(5 ml)에 담긴 5 kDa mPEG-NH2(40 mg)과 화합물 2(26 mg)의 직접 컨쥬게이션으로부터 제조하여 순백색의 고체를 얻었다(31 mg). 상기 생성물의 NMR 스펙트럼(in CDCl3)은 8.02 및 7.59 ppm에서 진단 신호를 나타내었다.
실시예 11의 Lamß1925-933 모델 펩타이드와의 반응: 상기 반응은 1 mM EDTA, 38 μM의 하이드로퀴논, 1.03 mM의 Lamß1925-933 및 3 몰의 PEG 시약 13을 포함한 100 mM의 소듐 포스페이트 버퍼(pH 7.5)에 담겨 수행되었다. 상기 반응 혼합물은 실시예 11에서 언급한 분석 RPC에 의하여 분석하였다. Lamß1925-933 단량체는 8.1분에 용리되고, Lamß1925-933 이량체는 8.9분에 용리되고, 상기 아민 이탈기는 9.3분에 용리되고, 아민 이탈기가 없는 PEG 시약 13은 15.2분, PEG 시약 13은 15.75분 및 상기 생성물 피크는 14.2분에 용리되었다. 상온에서 1시간 배양 후, 반응 혼합물에 존재하던 자유 Lamß1925-933 모델 펩타이드의 약 10%는 Lamß1925-933-PEG 컨쥬게이션으로 전환되었다.
실시예 17. 상기 티올의 페길레이션 및 PEG 시약 9를 사용한 IL -1- Ra 의 활성
인간의 인터류킨(interleukin)-1 수용체 길항제(IL-1-Ra)의 글리코실레이션 되지 않은 재조합형태가 모델 단백질로 사용되었다. 153개의 아미노산, 두 개의 디설파이드 결합(Cys69/Cys116 and Cys66/Cys122)으로 구성된 상기 IL-1-Ra은 17.3 kDa의 분자량을 가지고 있고 N-말단 헥사히스티딘 태그를 포함한다.
티올 페길레이션 시리즈는 50 mM 소듐 포스페이트 버퍼(pH 6.0 및 7.5)에 담긴 1-4 몰 당량의 10 kDa PEG 시약 9를 사용하여 수행하였다. 상기 단백질이 환원됨으로 나타났기 때문에, 페길레이션에 앞서 디설파이드의 환원이 필요하진 않았다. 상기 단백질의 농도는 0.1 mg/ml이었다. 4 ℃에서 1시간 배양 후, 샘플은 SDS-PAGE 분석을 하였고 상기 결과는 도 18에 나타내었다. pH 6.0 및 7.5 모두에서, 상기 페길레이션 반응의 주요 생성물은 PEG 시약이 1 몰 당량 사용되었을 때 모노 페길레이션된 IL-1-Ra이었다. 디-페길레이션된 생성물에 상응하는 희미한 밴드 뿐만 아니라 페길레이션되지 않은 IL-1-Ra 밴드 또한 나타났다. 반응에서 사용하는 PEG의 몰 당량을 증가시키면 디-, 트리- 및 테트라-페길레이션 된 종류가 증가하는 결과가 나타났다. pH 6.0 에서 더 큰 스케일의 페길레이션은 1.5 mg의 IL-1-Ra (0.2 mg/ml) 및 20 mM EDTA를 포함하는 pH 6.0의 50 mM 소듐 포스페이트 버퍼에 담긴 20 kDa의 PEG 시약 9 1.5 몰 당량을 사용하여 수행하였다. 상기 용액은 간단하게 보르텍싱하고 4 ℃에서 2시간 동안 놓아두었다. 상기 페길레이션 된 IL-1-Ra은 고정화된 메탈 어피니티 크로마토그래피(IMAC) 및 크기 배재 크로마토그래피에 의해 분리되었다. IMAC에 앞서, EDTA는 Amicon ultra-4 3,000 Da MWCO 초미세여과(ultrafiltration) 원심 장치(Millipore, cat. no. UFC 800324)를 사용하여 pH 7.4인 새로운 포스페이트 버퍼로 농축 및 희석을 반복하여 제거하였다. 마침내, 상기 샘플은 4 ml로 농축되었고 2 mM의 소듐 보로하이드라이드를 30 분간 상온에서 처리한 후 pH 7.4의 포스페이트 버퍼 살린(PBS)으로 미리 맞추어놓은 HisTrap HP (1 ml) column (GE Healthcare cat. no. 17-5247-01)에 로딩하였다. 상기 컬럼은 20 ml PBS로 씻어내고 40분 동안 PBS에서 500 mM의 이미다졸을 포함한 PBS로 구배하여 용리하였다. 용리된 분획(1 ml)은 모으고 각 분획들의 분취하여 SDS-PAGE로 분석하여 상기 페길레이션된 생성물이 포함된 분획을 확인하였다. 그 후, 상기 페길레이션 생성물을 포함하는 분획을 모두 모으고 초미세여과(Amicon ultra-4 3,000 Da MWCO)에 의하여 농축하여 최종 부피 0.6 ml를 만들었다. 상기 농축된 IMAC 분획들은 pH 7.4인 PBS로 미리 맞추어놓은 HiLoad Superdex 200 16/600 컬럼(GE Healthcare, cat. no. 17-1069-01)에 로딩하였다. 상기 흐름 속도는 1 ml/min으로 유지하며 흘리고 상기 모노-페길레이션된 생성물은 약 62분에 용리되었다. 분획(1 ml)은 상기 용리 피크 주위의 것으로 모으고 각 분획의 표본은 SDS-PAGE로 분석하였다. 정제된 모노-페길레이션된 생성물을 포함하는 상기 분획은 초미세여과에 의하여 농축되고 SDS-PAGE에 의하여 재-분석하여 순도를 측정하고 상기 결과는 도 19의 레인 2에 나타내었다. 상기 젤은 모노-페길레이션된 단백질에 상응하는 싱글 밴드로 나타났고 자유 단백질은 나타나지 않았다.
UV 스펙트로포토메트리(spectrophotometry)에 의한 정량화 이후, 상기 샘플은 MG-63 세포에서 IL-1β에 의존적인 IL-6 방출의 억제를 측정하여 생체 외 생물학적 활성으로 분석하였다. MG-63 세포는 DMEM/10% FCS의 100 μl에 담긴 20,000 세포/웰에 추가하였다. 다음 날, 배지를 제거하고 새로운 배지의 50 μl/웰을 추가하였다. 샘플은 5-단계 희석된 복제(25 μl/웰)에 추가하였고, 1시간 동안 미리 배양한 후 최종농도 0.3 ng/ml (25 μl/ml)가 되도록 IL-1β를 가하였다. 상기 플레이트는 24시간 더 배양하였다. 세포 생존 측정을 위하여, 10 μl의 티오졸릴 블루 테트라졸륨 브로마이드(MTT; 5 mg/ml in DMEM; Sigma-Aldrich cat no. M5655)를 각 웰에 가하고 3시간 동안 배양하였다. 상기 플레이트를 5분간 1,500 g에서 원심분리하고 상기 배지는 조심스레 흡입하였다. 상기 신진대사 활성 세포 내의 포르마잔 생성물은 DMSO(100 μl/웰)로 용해하고 상기 흡광도는 570 nm에서 측정되었다. 상기 결과는 도 20에 나타내었고 시약 9와 페길레이션 후 억제 활성을 유지하고 있는 페길레이션된 IL-1Ra를 확인하였다.
실시예 18. PEG 시약 9를 이용한 IL -1 Ra 의 폴리히스티딘 시퀀스에서의 페길 레이션, 및 페길레이션된 단백질의 활성
하기와 같이, 상기 실시예 17의 IL-1Ra은 페길레이션 반응에 앞서 카퍼(copper) 설페이트와 함께 상기 단백질의 자유(free) 시스틴이 디 설파이드로 산화된 후 폴리이스티딘 태그(tag)에 페길레이션되었다: 카퍼(copper) 설페이트(1 mM)를 200 mM의 NaCl을 포함하는 50 mM의 Tris·HCl (pH 8.0)에 담긴 IL-1Ra (0.6 mg/ml, 1.5 mg IL-1-Ra)용액 2.5 ml에 추가하였다. 4 ℃에서 16시간 동안 배양한 후, 25 mM EDTA를 추가하고 샘플을 20 mM EDTA를 포함하는 pH 7.5인 50 mM의 소듐 포스페이트 버퍼로 미리 맞추어놓은 PD-10 컬럼(GE Healthcare)에 로딩하였다. 그 후, 상기 컬럼을 3.5 ml의 새로운 포스페이트 버퍼로 용리하였다. 상기 페길레이션에 사용된 단백질의 농도는 0.43 mg.ml 및 pH 7.4이고 4 ℃에서 16시간 동안 배양되었다. PEG 시약 9(20 kDa)는 단백질의 1.5 몰 당량이다. 상기 반응은 4 ℃에서 16시간 동안 배양되었다. 상기 모노페길레이션된 종은 상기 실시예 17에서 언급한 것과 동일하게 소듐 보로 하이드라이드 처리를 통한 크로마토그래피를 이용하여 분리하였다. 상기 생성물의 SDS-PAGE 결과는 도 19의 레인 2에 나타내었고 자유 단백질은 관찰되지 않았다. 상기 생성물의 생물학적 활성은 실시예 17에서 언급한 바와 같이 MG-63 세포에서 IL-1β에 의존적인 IL-6 방출의 억제를 측정하여 평가하였고 그 결과는 도 20에 나타내었다. 상기 페길레이션된 IL-1Ra는 어쎄이(assay)에서 억제 활성을 가지고 있음을 확인하였다.
실시예 19: PEG 시약 합성: 10 kDa 의 PEG 시약 15의 합성.
페길레이션된 4-(3-(2-하이드록시에틸설포닐)프로파노일)벤조익산 시약 15는 도 21에 나타낸 바와 같이, 실시예 1의 페길레이션된 4-(3-토실프로파노일)벤조익산 9의 합성시 언급한 것과 유사한 방법에 의해 4-(3-(2-하이드록시에틸설포닐)프로파노일)벤조익산 14로부터 제조되었다. 먼저, 4-(3-(2-하이드록시에틸설포닐)프로파노일)벤조익산 14는 4-메틸벤젠티올(단계 2, 실시예 1) 대신 머캡토에탄올(mercaptoethanol)을 사용하는 것을 제외하고 4-(3-토실프로파노일)벤조익산과 유사한 방법에 의해 제조되었다. NMR 14 (400 MHz) δ 3.35 (t, 2H, COCH2), 3.5 (overlapping m, 4H, CH2SO2CH2), 3.8 (t, 2H, CH2OH), 5.2 (br s, CH2OH), 8.05 (m, 4H, aromatic CH), 13.4 (br s, 1H, COOH).
PEG 컨쥬게이션 단계는, 상기 설폰 14(143 mg) 및 o-(2-아미노에틸)-o'-메틸-PEG(MW 10 kDa, 1 g, BioVectra)는 무수 톨루엔(5 ml)에 용해시켰다. 상기 용매는 가열하지 않은 진공상태에서 제거하였고 상기 건조된 고체 잔여물은 아르곤 하에서 무수 디클로로메탄(10 ml)에 다시 용해시켰다. 아이스 배스에서 식혀진 생성된 용액에 아르곤 하에서 디이소프로필카르보디이미드(DIPC, 87 mg)를 천천히 가하였다. 상기 반응 혼합물은 상온에서 밤샘(15 시간) 교반시켰다. 휘발성 물질은 진공(30 ℃, water bath)하에서 제거하여 고체 잔여물을 얻었고 아세톤(45 ml)으로 조심스럽게 가열하며(35 ℃) 재용해시켰다. 상기 용액은 비흡수면의 탈지면으로 여과하여 녹지 않는 물질을 제거하였다. 상기 용액은 드라이아이스(dry ice) 배스에서 식혀 하얀색 침전물을 얻었고 이는 원심분리(4600 rpm, 30 min)하여 분리하였다. 상기 액상은 부어내고 상기 침전 과정을 세 번 반복하였다. 그 후 상기 황백색의 고체 생성물은 진공 하에서 건조시켜 상기 PEG 시약 15(1 g)를 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3.30 (t, 2H, COCH2), δ 3.40 (s, 3H, PEG-OCH3), δ 3.40 ~ 3.85 (br m, PEG), δ 3.50 (overlapping m, 2 x 2H, CH2SO2CH2), δ 3.80 (t, 2H, CH2OH), δ 7.95, δ 8.05 (2 x d, 2 x 2H, ArH of carboxylic acid moiety).
분자량이 다른 PEG의 비슷한 PEG 시약은 상기와 동일한 일반적인 제조방법에 의해 제조되었다. 따라서, 5 kDa의 PEG는 디클로로메탄(15 ml)에 담긴 설폰 14(256 mg), O-(2-아미노에틸)-O'-메틸-PEG(5 kdA, 1 g, Biovectra) 및 DIPC(174 mg)를 반응시켜 제조한 후 아세톤 침전 정제 과정을 통해 황백색 고체 15(1 g)를 얻었다.
실시예 20: PEG 시약 합성: 10 kDa 의 PEG 시약 17의 합성.
PEG 시약 17은 PEG 시약 9로부터 하기와 같이 제조되었다(도 22): PEG 시약 9(10 kDa, 75 mg)은 머캡토석시닉산(mercaptosuccinic acid) (6 mg) 및 정제수(2 ml)에 담긴 소듐 하이드로겐 카보네이트(20 mg)와 함께 약 18시간 동안 교반하였다. 휘발성 물질은 로터리 증발기(rotary evaporator)를 이용하여 제거하였고 고체 잔여물은 따뜻한 아세톤(4 ml)에 다시 용해시키고 녹지 않는 물질은 비흡수면의 탈지면으로 여과하여 제거하였다. 그 후 상기 생성물은 드라이아이스 배스에서 차갑게 한 아세톤 용액으로부터 침전시켰고 원심분리 후 액상을 따라 부어 분리하였다. 상기 아세톤 침전을 세 차례 반복하고 상기 고체는 진공하에서 건조시켜 16(51 mg)을 얻었다. 화합물 16(40 mg)은 1:1 메탄올:물(1 ml)에서 옥손과 18시간 정도 교반시켜 설폰 형태 17로 산화되었다. 상기 혼합물은 아세톤(10 ml)로 희석시키고 녹지 않는 물질은 비흡수면의 탈지면을 통해 중력하에서 여과하여 제거하였다. 상기 균일한 여과는 로터리 증발기로 증발시켜 건조하였고 2 방울의 1N HCl과 함께 아세톤(2 ml)에서 재용해시켰으며 16과 같이 싱글 아세톤 침전에 의해 분리하였다( mg). 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3.24-3.08 (overlapping m, CH2CH, COCH2), 3.38 (s, PEG-OCH3), 3.44 to 3.84 (br s, overlapping m, PEG & CH2SO2), 4.44 (dd, SO2CH), 7.45 (br s, NH), 7.98 & 8.06 (2 x d, 4H, ArH of carboxylic acid moiety).

Claims (20)

  1. 하기 화학식의 화합물:
    X-[NR-CO-Ar-W-(CH=CH)n-(CH2)2-L]m (I)
    (여기서 X는 폴리알킬렌 글라이콜, 폴리비닐피롤리돈, 폴리아크릴레이트, 폴리메타크릴레이트, 폴리옥사졸린, 폴리비닐알코올, 폴리아크릴아미드, 폴리메타크릴아미드, HPMA 코폴리머, 폴리에스터, 폴리아세탈, 폴리(올소 에스터), 폴리카보네이트, 폴리(이미노 카보네이트), 폴리아미드, 디비닐에테르-말레인 무수물 및 스티렌-말레익 무수물의 코폴리머, 다당류 또는 단백질을 나타내고; R은 수소 원자, 알킬기, 아릴기 또는 알킬-아릴기를 나타내고; Ar은 비치환 또는 치환된 헤테로아릴기 또는 아릴기를 나타내고; W는 케토기(-CO-)를 나타내고; n은 0 또는 1 내지 4의 정수를 나타내고; L은 이탈기를 나타내고; 및 m은 1 내지 8의 정수를 나타낸다).
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 X는 폴리알킬렌 글라이콜인 화합물.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 X는 폴리에틸렌 글라이콜인 화합물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 n은 0인 화합물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 L은 -SR, -SO2R, -OSO2R, -N+R3, -N+HR2, -N+H2R, 할로겐, 또는 -OØ이고, 여기서 R은 수소 원자, 알킬기, 아릴기 또는 알킬-아릴기이고 Ø는 치환된 적어도 하나의 전자당김 치환기를 포함하는 아릴기인 화합물.
  7. 제1항에 있어서,
    하기 화학식을 가지는 화합물:
    X-[NH-CO-Ar-W-(CH=CH)n-(CH2)2-SO2R’]m (Ia)
    (여기서, X, W, n 및 m은 제1항에서 정의한 바와 같고,
    Ar은 비치환 또는 치환된 아릴기이고, R'은 수소 원자, 비치환 또는 치환된 알킬기, 아릴기 또는 알킬-아릴기이다).
  8. 제7항에 있어서,
    상기 Ar은 알킬, CN, -NO2, -CO2R, -COH, -CH2OH, -COR, -OR, -OCOR, -OCO2R, -SR, -SOR, -SO2R, -NHCOR, -NRCOR, -NHCO2R, -NR.CO2R, -NO, -NHOH, -NR.OH, -C=N-NHCOR, -C=N-NR.COR, -N+R3, -N+H3, -N+HR2, -N+H2R, 할로겐, -C≡CR, -C=CR2 및 -C=CHR, (여기서 R은 각각 독립적으로 수소 원자, 알킬기, 아릴기, 또는 알킬-아릴기이다) 중에서 선택되는 하나 또는 그 이상의 같거나 다른 치환기로 치환되는 페닐기인 화합물.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 R’는 p-톨릴기인 화합물.
  10. 하기 화학식을 가지는 화합물:
    X-[NR-CO-Ar-W-(CH=CH)n-CH=CH2]m (Ｖ)
    (여기서, X, R, Ar, W, n 및 m은 제1항에서 정의한 바와 같다).
  11. 티올 또는 아미노기를 함유하는 분자를 폴리머에 컨쥬게이션하는 방법에 있어서, 상기 방법은 상기 분자와 제1항의 화합물을 반응시키는 것을 포함하는 방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 분자는 펩타이드 또는 단백질인 방법.
  13. 화학식 II의 화합물:
    X-[NR-CO-Ar-W´-(CH=CH)n-(CH2)2-Z]m (II)
    (여기서, X, R, Ar, n 및 m은 제1항에서 정의한 바와 같고, Z는 티올 또는 아미노기를 통해 컨쥬게이션된 분자이고, 및 W´는 케토기(-CO-) 또는 CH-OH기이다).
  14. 삭제
  15. 제13항에 있어서,
    하기 화학식을 가진 화합물:
    X-[NH-CO-Ar-W'-(CH=CH)n-(CH2)2-Z]m (IIa)
    (여기서, X, W', Z, n 및 m은 제13항에서 정의한 바와 같고, Ar은 비치환 또는 치환된 아릴기이다).
  16. 제15항에 있어서,
    상기 Ar은 알킬, CN, -NO2, -CO2R, -COH, -CH2OH, -COR, -OR, -OCOR, -OCO2R, -SR, -SOR, -SO2R, -NHCOR, -NRCOR, -NHCO2R, -NR.CO2R, -NO, -NHOH, -NR.OH, -C=N-NHCOR, -C=N-NR.COR, -N+R3, -N+H3, -N+HR2, -N+H2R, 할로겐, -C≡CR, -C=CR2 및 -C=CHR(여기서 R은 각각 독립적으로 수소 원자, 알킬, 아릴, 또는 알킬-아릴기이다) 중에서 선택되는 하나 또는 그 이상의 같거나 다른 치환기로 치환되는 페닐기인 화합물.
  17. 삭제
  18. 제16항에 있어서,
    상기 Z는 펩타이드 또는 단백질인 화합물.
  19. 삭제
  20. 삭제
KR1020117003833A 2008-07-21 2009-07-17 생물학적 분자의 컨쥬게이팅을 위한 신규한 시약 및 방법 KR101763559B1 (ko)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB0813339A GB0813339D0 (en) 2008-07-21 2008-07-21 Novel reagents and method for conjugating biological molecules
GB0813339.9 2008-07-21
GB0905762A GB0905762D0 (en) 2009-04-02 2009-04-02 Novel reagents and method for conjugating biological molecules
GB0905762.1 2009-04-02
PCT/GB2009/001764 WO2010010324A1 (en) 2008-07-21 2009-07-17 Novel reagents and method for conjugating biological molecules

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20110053430A KR20110053430A (ko) 2011-05-23
KR101763559B1 true KR101763559B1 (ko) 2017-08-14

Family

ID=41226122

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020117003833A KR101763559B1 (ko) 2008-07-21 2009-07-17 생물학적 분자의 컨쥬게이팅을 위한 신규한 시약 및 방법

Country Status (10)

Country Link
US (4) US8969626B2 (ko)
EP (2) EP2374481B1 (ko)
JP (2) JP5622117B2 (ko)
KR (1) KR101763559B1 (ko)
CN (1) CN102099058B (ko)
AU (1) AU2009275358C1 (ko)
DK (2) DK2326349T3 (ko)
ES (2) ES2560807T3 (ko)
PL (1) PL2326349T3 (ko)
WO (1) WO2010010324A1 (ko)

Families Citing this family (54)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB0316294D0 (en) * 2003-07-11 2003-08-13 Polytherics Ltd Conjugated biological molecules and their preparation
JP5876208B2 (ja) 2006-12-15 2016-03-02 バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッドＢａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃｏｒｐ０Ｒａｔｅｄ 延長されたｉｎｖｉｖｏ半減期を有する第ＶＩＩａ因子−（ポリ）シアル酸結合体
DK2326349T3 (en) * 2008-07-21 2015-05-26 Polytherics Ltd Novel Reagents and Methods for Conjugation of Biological Molecules
EP2403538B1 (en) 2009-03-04 2017-10-04 Polytherics Limited Conjugated proteins and peptides
US8642737B2 (en) 2010-07-26 2014-02-04 Baxter International Inc. Nucleophilic catalysts for oxime linkage
KR101759300B1 (ko) 2009-07-27 2017-07-31 리폭센 테크놀로지즈 리미티드 비혈액 응고 단백질의 글리코폴리시알화
PL2459224T3 (pl) 2009-07-27 2017-08-31 Baxalta GmbH Koniugaty białka związanego z krzepnięciem krwi
US8809501B2 (en) 2009-07-27 2014-08-19 Baxter International Inc. Nucleophilic catalysts for oxime linkage
RU2533619C2 (ru) 2009-07-27 2014-11-20 Лайпоксен Текнолоджиз Лимитед Гликополисиалирование белков, не являющихся белками свертывания крови
GB201007357D0 (en) * 2010-04-30 2010-06-16 Leverton Licence Holdings Ltd Conjugated factor VIII
GB201007356D0 (en) 2010-04-30 2010-06-16 Leverton Licence Holdings Ltd Conjugated factor VIIa
JP5934221B2 (ja) * 2010-09-21 2016-06-15 クリスタル・デリバリー・ビー・ブイ 薬物送達系の構成成分の一時的コンジュゲーションのための調整可能な生分解性リンカー分子、及びそれを用いて調製される薬物送達系
EA032056B1 (ru) 2010-12-22 2019-04-30 Баксалта Инкорпорейтид Конъюгат терапевтического белка и производного жирной кислоты, способы получения конъюгата терапевтического белка и производного жирной кислоты (варианты)
EP3808378A1 (en) * 2011-05-27 2021-04-21 Baxalta GmbH Therapeutic proteins with increased half-life and methods of preparing same
JP5841768B2 (ja) * 2011-08-05 2016-01-13 花王株式会社 脂肪蓄積抑制剤
EA033469B1 (ru) 2012-04-16 2019-10-31 Cantab Biopharmaceuticals Patents Ltd Подкожное введение конъюгатов факторов крови с полиэтиленгликолем
GB201210770D0 (en) * 2012-06-18 2012-08-01 Polytherics Ltd Novel conjugation reagents
US9650331B2 (en) 2012-06-18 2017-05-16 Polytherics Limited Conjugation reagents
MX2015011348A (es) 2013-03-15 2016-01-15 Regeneron Pharma Moleculas biologicamente activas, conjugados de las mismas, y usos terapeuticos.
MX368258B (es) 2013-03-15 2019-09-25 Zymeworks Inc Compuestos citotoxicos y antimitoticos y metodos de uso de los mismos.
BR112016004023A2 (pt) 2013-08-26 2022-11-16 Regeneron Pharma Composição, métodos para preparar uma composição e para tratar uma doença, e, composto
MX2016008444A (es) 2013-12-27 2017-01-11 Zymeworks Inc Sistemas de enlace que contienen sulfonamida para conjugados de farmacos.
KR102399005B1 (ko) 2014-03-11 2022-05-17 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 항-egfrviii 항체 및 그것의 용도
EP3194421B1 (en) 2014-09-17 2021-11-03 Zymeworks Inc. Cytotoxic and anti-mitotic compounds, and methods of using the same
ES2885854T3 (es) 2014-10-14 2021-12-15 Polytherics Ltd Proceso para la conjugación de un péptido o proteína con un reactivo que comprende un grupo saliente que incluye una porción de PEG
EP3273998B1 (en) 2015-03-27 2019-09-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Maytansinoid derivatives, conjugates thereof, and methods of use
MY189159A (en) 2015-07-06 2022-01-29 Regeneron Pharma Multispecific antigen-binding molecules and uses thereof
CA3007644A1 (en) 2015-12-11 2017-06-15 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for reducing or preventing growth of tumors resistant to egfr and/or erbb3 blockade
KR20180099892A (ko) 2016-01-25 2018-09-05 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. 메이탄시노이드 유도체, 그의 접합체, 및 사용 방법
CA3054286A1 (en) * 2016-03-01 2017-09-08 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois L-asparaginase variants and fusion proteins with reduced l-glutaminase activity and enhanced stability
WO2017190079A1 (en) 2016-04-28 2017-11-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of making multispecific antigen-binding molecules
EP3478324A1 (en) 2016-07-01 2019-05-08 GlaxoSmithKline Intellectual Property (No.2) Limited Antibody-drug conjugates and therapeutic methods using the same
CA3037732A1 (en) 2016-09-23 2018-03-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-steap2 antibodies, antibody-drug conjugates, and bispecific antigen-binding molecules that bind steap2 and cd3, and uses thereof
IL265309B2 (en) 2016-09-23 2024-04-01 Regeneron Pharma Bispecific antibodies against MUC16 and antibodies against MUC16 for use in cancer treatment
JP7330101B2 (ja) 2016-11-08 2023-08-21 レゲネロン ファーマシューティカルス，インコーポレーテッド ステロイド及びそのタンパク質コンジュゲート
TWI782930B (zh) 2016-11-16 2022-11-11 美商再生元醫藥公司 抗ｍｅｔ抗體，結合ｍｅｔ之雙特異性抗原結合分子及其使用方法
AU2018270784B2 (en) 2017-05-18 2024-05-16 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Cyclodextrin protein drug conjugates
MA54673A1 (fr) 2018-01-08 2022-08-31 Regeneron Pharma Stéroïdes et leurs conjugués-anticorps
MX2020011487A (es) 2018-04-30 2020-12-07 Regeneron Pharma Anticuerpos y moleculas biespecificas de union al antigeno que se unen a her2 y/o aplp2, conjugados y usos de estos.
KR20210008008A (ko) 2018-05-09 2021-01-20 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 항-msr1 항체 및 이의 사용 방법
AU2019269685A1 (en) 2018-05-17 2020-12-03 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-CD63 antibodies, conjugates, and uses thereof
US11666658B2 (en) 2018-12-21 2023-06-06 Regeneran Pharmaceuticals, Inc. Rifamycin analogs and antibody-drug conjugates thereof
WO2020172475A1 (en) 2019-02-21 2020-08-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating ocular cancer using anti-met antibodies and bispecific antigen binding molecules that bind met
EP4031574A1 (en) 2019-09-16 2022-07-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Radiolabeled met binding proteins for immuno-pet imaging
US11814428B2 (en) 2019-09-19 2023-11-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-PTCRA antibody-drug conjugates and uses thereof
CN115175737A (zh) 2020-02-28 2022-10-11 瑞泽恩制药公司 结合her2的双特异性抗原结合分子及其使用方法
CN115968304A (zh) 2020-04-16 2023-04-14 瑞泽恩制药公司 狄尔斯-阿尔德缀合方法
KR20230038738A (ko) 2020-07-13 2023-03-21 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 단백질에서 글루타민 잔기에 접합된 캄토테신 유사체 및 그의 용도
CN116615251A (zh) 2020-09-14 2023-08-18 瑞泽恩制药公司 包含glp1肽模拟物的抗体-药物缀合物及其用途
CA3190569A1 (en) 2020-10-22 2022-04-28 Christopher Daly Anti-fgfr2 antibodies and methods of use thereof
CN113461929B (zh) * 2021-07-13 2023-04-21 浙江倍合德制药有限公司 一种tpgs系列产品的精制提纯方法
US20230287138A1 (en) 2022-01-12 2023-09-14 Regneron Pharmaceuticals, Inc. Protein-drug conjugates comprising camptothecin analogs and methods of use thereof
US20230330254A1 (en) 2022-03-11 2023-10-19 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-glp1r antibody-tethered drug conjugates comprising glp1 peptidomimetics and uses thereof
WO2024020164A2 (en) 2022-07-21 2024-01-25 Firefly Bio, Inc. Glucocorticoid receptor agonists and conjugates thereof

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5414135A (en) 1991-12-30 1995-05-09 Sterling Winthrop Inc. Vinyl sulfone coupling of polyoxyalkylenes to proteins
WO1995034326A1 (en) 1994-06-14 1995-12-21 Tadahiko Kohno Pegylation reagents and compounds formed therewith

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US147443A (en) * 1874-02-10 Improvement in lamp-extinguishers
US5446090A (en) * 1993-11-12 1995-08-29 Shearwater Polymers, Inc. Isolatable, water soluble, and hydrolytically stable active sulfones of poly(ethylene glycol) and related polymers for modification of surfaces and molecules
US5877224A (en) 1995-07-28 1999-03-02 Rutgers, The State University Of New Jersey Polymeric drug formulations
GB9713979D0 (en) 1997-07-03 1997-09-10 Univ Nottingham Method for attaching peg to macromolecules
US6958212B1 (en) * 1999-02-01 2005-10-25 Eidgenossische Technische Hochschule Zurich Conjugate addition reactions for the controlled delivery of pharmaceutically active compounds
US6828412B1 (en) 1999-09-03 2004-12-07 School Of Pharmacy, University Of London Degradable polymers
ATE297954T1 (de) 1999-09-08 2005-07-15 Polytherics Ltd Polymere mit uniformem molekulargewicht
ATE444984T1 (de) 2002-12-31 2009-10-15 Nektar Therapeutics Al Corp Hydrolysestabile maleimidendgruppen-enthaltende polymere
JP4009721B2 (ja) * 2003-05-23 2007-11-21 独立行政法人産業技術総合研究所 イオン結合性ポリマー含有基板、該基板を含有する検出用センサー及び病原菌又は病原菌が生産する毒素の検出方法
GB0316294D0 (en) * 2003-07-11 2003-08-13 Polytherics Ltd Conjugated biological molecules and their preparation
WO2006067221A2 (en) 2004-12-22 2006-06-29 Kuros Biosurgery Ag Michael-type addition reaction functionalised peg hydrogels with factor xiiia incorporated biofactors
JP5933923B2 (ja) 2007-10-09 2016-06-22 ポリテリクス リミテッド 新規な複合タンパク質及びペプチド
DK2326349T3 (en) * 2008-07-21 2015-05-26 Polytherics Ltd Novel Reagents and Methods for Conjugation of Biological Molecules
EP2403538B1 (en) * 2009-03-04 2017-10-04 Polytherics Limited Conjugated proteins and peptides
GB0912485D0 (en) 2009-07-17 2009-08-26 Polytherics Ltd Improved conjugation method

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5414135A (en) 1991-12-30 1995-05-09 Sterling Winthrop Inc. Vinyl sulfone coupling of polyoxyalkylenes to proteins
WO1995034326A1 (en) 1994-06-14 1995-12-21 Tadahiko Kohno Pegylation reagents and compounds formed therewith

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A. Hunter et al. Reactive dyes for textile fibers: chapter 1, 1999, Society of dyers and colourists.
Paul Messinger et al. Archiv der Pharmazie, 316(8), 1983, pp. 657-663.

Also Published As

Publication number Publication date
DK2374481T3 (en) 2016-02-01
US8618333B2 (en) 2013-12-31
KR20110053430A (ko) 2011-05-23
AU2009275358B2 (en) 2015-05-28
WO2010010324A1 (en) 2010-01-28
JP2011252167A (ja) 2011-12-15
AU2009275358C1 (en) 2015-09-24
JP5626655B2 (ja) 2014-11-19
PL2326349T3 (pl) 2015-08-31
JP5622117B2 (ja) 2014-11-12
ES2536882T3 (es) 2015-05-29
US8969626B2 (en) 2015-03-03
US9896412B2 (en) 2018-02-20
AU2009275358A1 (en) 2010-01-28
CN102099058A (zh) 2011-06-15
US20110136723A1 (en) 2011-06-09
EP2326349B1 (en) 2015-02-25
CN102099058B (zh) 2014-10-22
US20140081047A1 (en) 2014-03-20
US20150148544A1 (en) 2015-05-28
EP2326349A1 (en) 2011-06-01
ES2560807T3 (es) 2016-02-22
EP2374481B1 (en) 2015-11-04
JP2011528706A (ja) 2011-11-24
EP2374481A2 (en) 2011-10-12
US20110262994A1 (en) 2011-10-27
DK2326349T3 (en) 2015-05-26
EP2374481A3 (en) 2012-06-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101763559B1 (ko) 생물학적 분자의 컨쥬게이팅을 위한 신규한 시약 및 방법
EP2209494B1 (en) Novel conjugated proteins and peptides
JP4958549B2 (ja) 複合生物学的分子及びそれらの調製
AU2013279079B2 (en) Conjugation reagents
WO2010100430A1 (en) Conjugated proteins and peptides
US10174125B2 (en) Conjugation reagents
Ko et al. Safety and Biodistribution Profile of Poly (styrenyl acetal trehalose) and Its Granulocyte Colony Stimulating Factor Conjugate

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant