CN115968304A - 狄尔斯-阿尔德缀合方法 - Google Patents

狄尔斯-阿尔德缀合方法 Download PDF

Info

Publication number
CN115968304A
CN115968304A CN202180043012.0A CN202180043012A CN115968304A CN 115968304 A CN115968304 A CN 115968304A CN 202180043012 A CN202180043012 A CN 202180043012A CN 115968304 A CN115968304 A CN 115968304A
Authority
CN
China
Prior art keywords
compound
moiety
formula
antibody
certain embodiments
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202180043012.0A
Other languages
English (en)
Inventor
T·尼托利
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Regeneron Pharmaceuticals Inc
Original Assignee
Regeneron Pharmaceuticals Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Regeneron Pharmaceuticals Inc filed Critical Regeneron Pharmaceuticals Inc
Publication of CN115968304A publication Critical patent/CN115968304A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/545—Heterocyclic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/535—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one oxygen as the ring hetero atoms, e.g. 1,2-oxazines
    • A61K31/5375—1,4-Oxazines, e.g. morpholine
    • A61K31/5383—1,4-Oxazines, e.g. morpholine ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/55—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having seven-membered rings, e.g. azelastine, pentylenetetrazole
    • A61K31/551—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having seven-membered rings, e.g. azelastine, pentylenetetrazole having two nitrogen atoms, e.g. dilazep
    • A61K31/5513—1,4-Benzodiazepines, e.g. diazepam or clozapine
    • A61K31/5517—1,4-Benzodiazepines, e.g. diazepam or clozapine condensed with five-membered rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. imidazobenzodiazepines, triazolam
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/07—Tetrapeptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A61K38/1729—Cationic antimicrobial peptides, e.g. defensins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/542—Carboxylic acids, e.g. a fatty acid or an amino acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/55—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound the modifying agent being also a pharmacologically or therapeutically active agent, i.e. the entire conjugate being a codrug, i.e. a dimer, oligomer or polymer of pharmacologically or therapeutically active compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/65—Peptidic linkers, binders or spacers, e.g. peptidic enzyme-labile linkers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6855—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from breast cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6889—Conjugates wherein the antibody being the modifying agent and wherein the linker, binder or spacer confers particular properties to the conjugates, e.g. peptidic enzyme-labile linkers or acid-labile linkers, providing for an acid-labile immuno conjugate wherein the drug may be released from its antibody conjugated part in an acidic, e.g. tumoural or environment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/005—Fluorescence in vivo characterised by the carrier molecule carrying the fluorescent agent
    • A61K49/0052—Small organic molecules
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/005—Fluorescence in vivo characterised by the carrier molecule carrying the fluorescent agent
    • A61K49/0058—Antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
    • A61K51/1093—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody conjugates with carriers being antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Abstract

本文描述了蛋白质有效负载缀合物及其组合物，其可用于例如靶向特异性递送治疗部分和/或成像剂部分。在某些实施方案中，提供了利用转谷氨酰胺酶和狄尔斯‑阿尔德技术的组合生产蛋白质‑有效负载构建体(例如抗体‑药物缀合物)的特定和有效方法。提供了包含谷氨酰胺修饰的抗体、狄尔斯‑阿尔德加合物和反应性有效负载的抗体‑药物缀合物和组合物。

Description

狄尔斯-阿尔德缀合方法
相关申请的交叉引用
根据美国的35 U.S.C.§119(e)，本申请要求于2020年4月16日提交的美国临时申请号63/010,903的权益，其全部内容通过引用并入本文，用于所有目的。
发明领域
本申请涉及蛋白质-有效负载(payload)缀合物(例如抗体-药物缀合物)、药物组合物和用其治疗疾病的方法。还提供了利用转谷氨酰胺酶和狄尔斯-阿尔德(Diels-Alder)技术的组合制备蛋白质-有效负载构建体的特异性的和有效的方法。在某些实施方案中，提供了用于谷氨酰胺酰基修饰的抗体和反应性有效负载的特异性的和有效的反应的方法。
序列表
序列表的正式拷贝通过EFS-Web与本说明书同时提交，作为ASCII格式的序列表的纸质拷贝，文件名为250298-000130_ST25.txt，大小约为173千字节。ASCII格式文档的该纸质拷贝中包含的序列表是本说明书的组成部分，并且通过引用以其整体并入本文。
发明背景
蛋白质缀合物，例如抗体缀合物利用结合剂的选择性结合将有效负载递送至受试者组织内的靶标。有效负载可以是能够在靶标处起作用的治疗部分，或成像剂部分，例如能够增加体内结构或流体的对比度以用于诊断或治疗目的。
用于将接头(linker)和有效负载与抗体缀合的几种技术是可获得的。许多缀合物通过与抗体中的半胱氨酸或赖氨酸残基的非选择性共价连接来制备。这种非选择性技术可以产生在不同位点具有缀合并且每个抗体具有不同数目的缀合的产物的异质混合物。因此，本领域需要提供位点选择性的抗体缀合的方法和技术。
本领域需要另外的安全且有效的靶向药物，其可以结合各种抗原以提供用于单一疗法和联合疗法的增强的疾病治疗，所述疾病例如癌症、感染性疾病、炎性疾病和免疫系统病症。在某些实施方案中，本申请满足了这些需求并且提供了额外的优点。
上述讨论仅是为了更好地理解本领域面临的问题的性质，并且不应以任何方式解释为承认现有技术，也不应将本文中任何参考文献的引用解释为承认这类参考文献构成本申请的“现有技术”。
发明概述
下面描述各种非限制性的方面和实施方案。
在一个方面，本申请提供了具有式(I)的结构的化合物：
Figure BDA0004000531960000021
其中：BA为结合剂；Gln为谷氨酰胺残基；SP不存在或为间隔基；Z为狄尔斯-阿尔德加合物；L为接头；D为治疗部分和/或成像剂部分；n为1-3的整数；其中当n为2或3时，Z、L和D可以相同或不同；且d为1-6的整数。
在一个实施方案中，D为治疗部分；其中所述治疗部分为美登素类化合物、tubulysin、澳瑞他汀(auristatin)、多拉司他汀(dolastatin)、喜树碱(camptothesin)、吡咯并苯并二氮杂卓、抗生素、抗病毒剂、抗炎剂、免疫调节剂、抗真菌剂、类固醇或它们的类似物或衍生物，或D为成像剂部分。
在一个实施方案中，D为治疗部分；其中所述治疗部分为美登素类化合物、tubulysin、澳瑞他汀、多拉司他汀、喜树碱、吡咯并苯并二氮杂卓、抗生素、抗病毒剂、抗炎剂、免疫调节剂、抗真菌剂或它们的类似物或衍生物。
在一个方面，本申请提供了具有式(I)的结构的化合物：
Figure BDA0004000531960000022
其中：BA为结合剂；Gln为谷氨酰胺残基；SP不存在或为间隔基；Z为狄尔斯-阿尔德加合物；L为接头；D为治疗部分；其中所述治疗部分为美登素类化合物、tubulysin、澳瑞他汀、多拉司他汀、喜树碱、吡咯并苯并二氮杂卓、抗生素、抗病毒剂、抗炎剂、免疫调节剂、抗真菌剂、类固醇或它们的类似物或衍生物，或D为成像剂部分；n为1-3的整数；其中当n为2或3时，Z、L和D可以相同或不同；且d为1-6的整数。
在一个实施方案中，所述化合物为式(1A)：
Figure BDA0004000531960000031
在一个实施方案中，所述化合物为式(1B)：
Figure BDA0004000531960000032
在一个实施方案中，n为1或2。在一个实施方案中，其中n为2，两个部分D相同。在一个实施方案中，其中n为2，两个部分D不同。在一个实施方案中，其中n为2，两个狄尔斯-阿尔德加合物Z相同。在一个实施方案中，其中n为2，两个狄尔斯-阿尔德加合物Z不同。
在一个方面，本申请提供了具有式(II)的结构的化合物：
Figure BDA0004000531960000033
其中：BA为结合剂；Gln为谷氨酰胺残基；SP不存在或为间隔基；Q为CHR、(CHR)2或O桥；R在每次出现时独立地为H或给电子基团(例如C1-3烷基、-OC1-3烷基或-NHC1-3烷基)；L为接头；D为治疗部分：其中所述治疗部分为美登素类化合物、tubulysin、澳瑞他汀、多拉司他汀、喜树碱、吡咯并苯并二氮杂卓、抗生素、抗病毒剂、抗炎剂、免疫调节剂、抗真菌剂、类固醇或它们的类似物或衍生物，或D为成像剂部分；n为1-3的整数；且d为1-6的整数。
在一个实施方案中，所述化合物为式(IIA)：
Figure BDA0004000531960000041
在一个实施方案中，所述化合物为式(IIB)：
Figure BDA0004000531960000042
在一个实施方案中，两个部分D相同。在一个实施方案中，两个部分D不同。
在一个实施方案中，所述化合物为式(IIIA)：
Figure BDA0004000531960000043
在一个实施方案中，所述化合物为式(IIIB)：
Figure BDA0004000531960000044
在一个实施方案中，所述化合物为式(IIIC)：
Figure BDA0004000531960000045
在上述任一项的一个实施方案中，R在每次出现时为H。
在另一个实施方案中，至少一个R不为H。在一个实施方案中，至少一个R为C1-3烷基。在一个实施方案中，至少一个R为OC1-3烷基。在一个实施方案中，至少一个R为-NH-C1-3烷基。在一个实施方案中，至少一个R为甲基。在一个实施方案中，至少一个R为OCH3。
在一个方面，本申请提供了具有式(IV)的结构的化合物：
Figure BDA0004000531960000051
其中：BA为结合剂；Gln为谷氨酰胺残基；SP不存在或为间隔基；L为接头；D为治疗部分；其中所述治疗部分为美登素类化合物、tubulysin、澳瑞他汀、多拉司他汀、喜树碱、吡咯并苯并二氮杂卓、抗生素、抗病毒剂、抗炎剂、免疫调节剂、抗真菌剂、类固醇或它们的类似物或衍生物，或D为成像剂部分；且d为1-6的整数。
在上述式的任一个的化合物的一个实施方案中，BA为抗体或其抗原结合片段。在另一个实施方案中，BA为单克隆人源化抗体。在另一个实施方案中，BA为HER-2抗体、其抗原结合片段、MSR1抗体或其抗原结合片段。
在上述式的任一个的化合物的一个实施方案中，Gln每次出现时独立地为Q295或N297Q。
在上述化合物的任一项的一个实施方案中，d为2、4或6。在某一实施方案中，d为2。在某一实施方案中，d为4。
在上述化合物的任一项的一个实施方案中，D为治疗部分；其中所述治疗部分为澳瑞他汀、吡咯并苯并二氮杂卓(PBD)、美登素类化合物、安沙霉素抗生素或其类似物或衍生物。
在上述化合物的任一项的一个实施方案中，D为治疗部分，其中所述治疗部分为一甲基澳瑞他汀E(MMAE)、PBD-1、利福霉素或其类似物或衍生物。
在上述化合物的任一项的一个实施方案中，D为成像剂部分，其中成像剂包含染料(例如荧光染料)、螯合剂、放射性核素或寡核苷酸。在一个实施方案中，D包含荧光染料。
在一个实施方案中，D为Alexa Fluor荧光染料，其选自Alexa Fluor 647、AlexaFluor 488、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 555和Alexa Fluor 568。在一个具体的实施方案中，D为Alexa Fluor 647。
在上述化合物的任一项的一个实施方案中，SP包含如下的一个或多个：-(CH2)u-、C(O)-、-NH-、-(CH2)u-NH-C(O)-、-(CH2)u-C(O)-NH-、-(CH2)u-C(O)-NH-(CH2)v-、-(CH2-CH2-O)v-、-(CH2)u-(O-CH2-CH2)v-C(O)-NH-、-(CH2-CH2-O)v-(CH2)u-C(O)-NH-(CH2)u-、-NH-(CH2)u-、-NH-(CH2)u-C(O)-、-NH-(CH2)u-C(O)-NH-(CH2)v-、-NH-(CH2-CH2-O)v-、-NH-(CH2-CH2-O)v-C(O)-、-NH-(CH2-CH2-O)v-(CH2)u-、-NH-(CH2-CH2-O)v-(CH2)u-C(O)-、-NH-(CH2-CH2-O)v-(CH2)u-C(O)-NH-(CH2)u-、-(CH2)u-NH-C(O)-、-(CH2)u-C(O)-NH-(CH2-CH2-O)v-C(O)-NH-、-NH-(CH2)u-C(O)-NH-、
Figure BDA0004000531960000061
Figure BDA0004000531960000062
或其组合，且其中下标u、v、w和x独立地为1-20的整数。在一个实施方案中，下标u、v、w和x独立地为1-12的整数。在另一个实施方案中，SP为-(CH2)u-；其中下标u为1-5的整数。
在一个实施方案中，SP为
Figure BDA0004000531960000063
Figure BDA0004000531960000064
Figure BDA0004000531960000065
其中下标u、v、w和x独立地为1-12的整数。在一个实施方案中，SP为
Figure BDA0004000531960000066
在上述任一项的一个实施方案中，两个部分D相同。在上述任一项的一个实施方案中，两个部分D不同。
上述式的任一个的化合物，其中z为式2a的部分：
Figure BDA0004000531960000071
其中R′独立地为H、C1-3烷基或两个R′一起构成CHR、(CHR)2或O桥，且其中R每次出现时独立地为H、C1-3烷基或-OC1-3烷基或-NH-C1-3烷基。
在上述化合物的任一项的一个实施方案中，Z为式2a的部分：
Figure BDA0004000531960000072
其中R′独立地为H、C1-3烷基或两个R′一起构成CH2、CH2CH2或O桥。
在另一个实施方案中，Z为式2a-1至2a-3的任意一个的部分：
Figure BDA0004000531960000073
在另一个实施方案中，Z为式2a-1的部分：
Figure BDA0004000531960000074
在一个实施方案中，至少一个R不为H。在一个实施方案中，Z为式2a-4至2a-6的任意一个的部分：
Figure BDA0004000531960000075
其中至少一个R不为H。在一个实施方案中，Z为式2a-7至2a-12的任意一个的部分：
Figure BDA0004000531960000081
Figure BDA0004000531960000082
在一个实施方案中，部分Z每次出现时独立地选自2a-1至2a-12。
在一个实施方案中，其中化合物包含两个部分z，一个部分Z为2a-7，而另一个部分Z为2a-11。在一个实施方案中，其中化合物包含两个部分Z，一个部分Z为2a-7，而另一个部分Z为2a-12。
在一个实施方案中，片段-SP-Z-选自
Figure BDA0004000531960000083
Figure BDA0004000531960000084
其中两个部分Z相同。
在一个实施方案中，片段-SP-Z-选自
Figure BDA0004000531960000085
Figure BDA0004000531960000086
其中两个部分Z不同。
在上述化合物的任一项的一个实施方案中，L包含一个或多个氨基酸。在另一个实施方案中，L还包含一个或多个下述基团：-NH-、-S-、-O-、-(CH2)n-、-(CH2-CH2-O-)m-、-C(O)-、-NH-CH2-O-CH2-C(＝o)-NH-、
Figure BDA0004000531960000091
其中下标m和n每次出现时独立地为0-20的整数。在一个实施方案中，所述一个或多个氨基酸为甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸或瓜氨酸。在另一个实施方案中，所述一个或多个氨基酸为缬氨酸-瓜氨酸(-VC-)或缬氨酸-丙氨酸(-VA-)。
在上述化合物的任一项的一个实施方案中，L为：
Figure BDA0004000531960000092
其中l、m和n每次出现时独立地为0-20的整数；且p为0-4的整数。
在上述化合物的任一项的一个实施方案中，L为：
Figure BDA0004000531960000093
其中n为1-6的整数；m为2-10的整数；p为1-3的整数，且氨基酸每次出现时独立地为缬氨酸、瓜氨酸或丙氨酸。
在上述化合物的任一项的一个实施方案中，治疗部分和/或成像剂部分D通过叔氨基连接至接头L。
在式I的化合物的一个实施方案中，片段
Figure BDA0004000531960000094
具有式(I-DA)：
Figure BDA0004000531960000101
其中
Figure BDA0004000531960000102
为与间隔基或结合剂的键，且其中治疗部分和/或成像剂部分D通过氨基连接。在另一个实施方案中，D为如本文所述的美登素类化合物或美登素类化合物类似物。
在式I的化合物的一个实施方案中，片段
Figure BDA0004000531960000103
具有式(I-A1)：
Figure BDA0004000531960000104
其中
Figure BDA0004000531960000105
为与间隔基或结合剂的键。
在式I的化合物的一个实施方案中，片段
Figure BDA0004000531960000106
具有式(I-A11)：
Figure BDA0004000531960000107
其中
Figure BDA0004000531960000108
为与间隔基或结合剂的键。
在式I的化合物的一个实施方案中，片段
Figure BDA0004000531960000111
具有式(I-DB)：
Figure BDA0004000531960000112
其中
Figure BDA0004000531960000113
为与间隔基或结合剂的键，且其中部分D通过氨基连接。在式I-B的化合物的一个实施方案中，D为如本文所述的吡咯并苯并二氮杂卓(PBD)或其类似物或衍生物。在式I-B的化合物的一个实施方案中，D为如本文所述的PBD-1或其类似物或衍生物：
Figure BDA0004000531960000114
在式I的化合物的一个实施方案中，片段
Figure BDA0004000531960000115
具有式(I-B1)：
Figure BDA0004000531960000116
其中
Figure BDA0004000531960000117
为与间隔基或结合剂的键。
在式I的化合物的一个实施方案中，片段
Figure BDA0004000531960000118
具有式(I-DC)：
Figure BDA0004000531960000119
Figure BDA00040005319600001112
其中
Figure BDA00040005319600001110
为与间隔基或结合剂的键，且其中部分D通过氨基连接。在另一个实施方案中，D为利福霉素或其类似物或衍生物。
在式I的化合物的一个实施方案中，片段
Figure BDA00040005319600001111
具有式(I-C1)：
Figure BDA0004000531960000121
Figure BDA0004000531960000127
其中
Figure BDA0004000531960000122
为与间隔基或结合剂的键。
在式I的化合物的一个实施方案中，片段
Figure BDA0004000531960000123
具有式(I-C2)：
Figure BDA0004000531960000124
Figure BDA0004000531960000128
其中
Figure BDA0004000531960000125
为与间隔基或结合剂的键。
在上述式(II)的化合物的任一项的一个实施方案中，BA为HER-2抗体、其抗原结合片段、MSR1抗体或其抗原结合片段；且D为治疗部分，其中所述治疗部分为一甲基溴瑞他汀E(MMAE)、PBD-1、利福霉素或它们的类似物或衍生物，或D为成像剂部分Alexa Fluor 647。
在上述化合物的任一项的一个实施方案中，所述化合物具有式(I-A1’)至(I-A10’)的任一个的结构：
Figure BDA0004000531960000126
Figure BDA0004000531960000131
Figure BDA0004000531960000141
Figure BDA0004000531960000151
其中d为1-6的整数。
在上述化合物的任一项的一个实施方案中，所述化合物具有式(I-A11’)的结构：
Figure BDA0004000531960000152
Figure BDA0004000531960000164
其中d为1-6的整数。
在上述化合物的任一项的一个实施方案中，所述化合物具有式(I-B)的结构：
Figure BDA0004000531960000161
Figure BDA0004000531960000165
其中d为1-6的整数。
在上述化合物的任一项的一个实施方案中，所述化合物具有式(I-C)的结构
Figure BDA0004000531960000162
Figure BDA0004000531960000166
其中d为1-6的整数。
在一个方面，本申请提供了一种组合物，其包含上述化合物的任一项的化合物群，所述化合物具有约0.5至约8.0的药物-抗体比(DAR)。在另一个实施方案中，所述组合物包含具有约1.0至约2.5的DAR的化合物群。在另一个实施方案中，所述组合物包含具有约2的DAR的化合物群。在另一个实施方案中，所述组合物包含具有约3.0至约4.5的DAR的化合物群。在另一个实施方案中，所述组合物包含具有约4的DAR的化合物群。
本申请的一个方面提供了生产上述实施方案任一项的化合物的方法，该方法包含下列步骤：
a.)使：i)具有式(V-x)的结构的化合物：
Figure BDA0004000531960000163
其中：
BA为结合剂；
SP不存在或为间隔基；
X为包含二烯的部分；
l为1-6的整数；且
n为1-3的整数；其中当n为2或3时，Z、L和D可以相同或不同；
接触ii)式(VI-y)的化合物：
Y-L-D  (VI-y)；
其中：
Y为包含亲双烯体的部分；
L为接头；且
D为治疗部分，其中治疗部分为美登素类化合物、tubulysin、澳瑞他汀、多拉司他汀、喜树碱、吡咯并苯并二氮杂卓、抗生素、抗病毒剂、抗炎剂、免疫调节剂、抗真菌剂、类固醇或它们的类似物或衍生物，或D为成像剂部分；并且
b.)分离产生的化合物。
在一个实施方案中，n为1或2。在一个实施方案中，n为1，即所述化合物具有结构
Figure BDA0004000531960000171
在一个实施方案中，n为2，即所述化合物具有结构
Figure BDA0004000531960000172
在一个实施方案中，上述方法包含制备具有式(V-x)的结构的化合物，该方法包含下列步骤：
1.)使i)具有至少一个受体谷氨酰胺残基的结合剂和ii)式V-x2的化合物在转谷氨酰胺酶(TG)存在下接触：
Figure BDA0004000531960000173
其中：
SP不存在或为间隔基；且
X为包含二烯的部分，其中两个X部分相同；并且
2.)分离产生的化合物。
在一个实施方案中，上述方法包含制备具有式(V-x)的结构的化合物，该方法包含下列步骤：
1.)使i)具有至少一个受体谷氨酰胺残基的结合剂和ii)式V-x2的化合物在转谷氨酰胺酶(TG)存在下接触：
Figure BDA0004000531960000181
其中：
SP不存在或为间隔基；且
X为包含二烯的部分，其中两个X部分不同；并且
2.)分离产生的化合物。
在一个实施方案中，X每次出现时独立地选自
Figure BDA0004000531960000182
其中R每次出现时独立地为H或给电子基团(例如C1-3烷基、-OC1-3烷基或-NHC1-3烷基)。
在上述方法的一个实施方案中，R每次出现时为H。
在上述方法的一个实施方案中，至少一个R不为H。在上述方法的一个实施方案中，至少一个R为C1-3烷基。在上述方法的一个实施方案中，至少一个R为OC1-3烷基。在上述方法的一个实施方案中，至少一个R为-NHC1-3烷基。在上述方法的一个实施方案中，至少一个R为甲基。在上述方法的一个实施方案中，至少一个R为OCH3。
在一个实施方案中，X为
Figure BDA0004000531960000183
且Y为
Figure BDA0004000531960000184
在另一个方面，本申请提供了一种方法，包含下列步骤：
a.)使：i)具有式(V-x)的结构的化合物：
Figure BDA0004000531960000185
其中：
BA为结合剂；
SP不存在或为间隔基；
X为包含二烯的部分；
l为1-6的整数；
接触ii)式(VI-y)的化合物：
Y-L-D  (VI-y)；
其中：
Y为包含亲双烯体的部分；
L为接头；且
D为治疗部分，其中治疗部分为美登素类化合物、tubulysin、澳瑞他汀、多拉司他汀、喜树碱、吡咯并苯并二氮杂卓、抗生素、抗病毒剂、抗炎剂、免疫调节剂、抗真菌剂、类固醇或D为成像剂部分，或其类似物或衍生物；
产生具有式(V-x’z)的结构的化合物：
Figure BDA0004000531960000191
b.)使式(V-x’z)的化合物接触式(VI-y)的化合物：Y-L-D(VI-y)；并且
c.)分离产生的式(1B)的化合物。
在一个实施方案中，两个X部分相同。在另一个实施方案中，两个X部分不同。
在一个实施方案中，步骤a.)的D部分与步骤b.)的D部分不同。在一个实施方案中，步骤a.)的D部分与步骤b.)的D部分相同。
在一个实施方案中，步骤a.)在约7.0-约7.6的pH下进行。在一个实施方案中，步骤a.)在约7.2-约7.4的pH下进行。在一个实施方案中，步骤a.)在约7.2的pH下进行。
在一个实施方案中，步骤b.)在约5.0-约6.0的pH下进行。在一个实施方案中，步骤b.)在约5.3-约5.7的pH下进行。在一个实施方案中，步骤b.)在约5.5的pH下进行。
在一个实施方案中，该方法在步骤a.)之后和步骤b.)之前还包含缓冲液交换步骤。
在一个实施方案中，X每次出现时独立地选自
Figure BDA0004000531960000192
其中R每次出现时独立地为H或给电子基团(例如C1-3烷基、-OC1-3烷基或-NHC1-3烷基)。
在上述方法的一个实施方案中，R每次出现时为H。
在上述方法的一个实施方案中，至少一个R不为H。在上述方法的一个实施方案中，至少一个R为C1-3烷基。在上述方法的一个实施方案中，至少一个R为OC1-3烷基。在上述方法的一个实施方案中，至少一个R为-NHC1-3烷基。在上述方法的一个实施方案中，至少一个R为甲基。在上述方法的一个实施方案中，至少一个R为OCH3。
在一个实施方案中，上述方法包含制备具有式(IV-x)的结构的化合物，该方法包含下列步骤：
1.)使i)具有至少一个受体谷氨酰胺残基的结合剂和ii)式IV-x1的化合物在转谷氨酰胺酶(TG)存在下接触：
NH2-SP-X  (IV-x1)，其中：
SP不存在或为间隔基；且
X为包含二烯的部分；且
2.)分离产生的化合物。
在上述方法的另一个实施方案中，X为
Figure BDA0004000531960000201
且Y为
Figure BDA0004000531960000202
在本申请的一个方面，提供了生产上述实施方案任一项的化合物的方法，该方法包含下列步骤：
a.)使：i)具有式(IV-y)的结构的化合物：
Figure BDA0004000531960000203
其中：
BA为结合剂；
SP不存在或为间隔基；
Y为包含亲双烯体的部分；
l为1-6的整数；且
n为1-3的整数；
接触ii)式(VI-x)的化合物：
X-L-D  (V-x)，其中：
X为包含二烯的部分；
L为接头；且
D为治疗部分，其中治疗部分为美登素类化合物、tubulysin、澳瑞他汀、多拉司他汀、喜树碱、吡咯并苯并二氮杂卓、抗生素、抗病毒剂、抗炎剂、免疫调节剂、抗真菌剂、类固醇或D为成像剂部分，或其类似物或衍生物；并且
b.)分离产生的化合物。
在一个实施方案中，上述方法包含制备具有式(V-y)的结构的化合物，其包含下列步骤：
1.)使i)具有至少一个受体谷氨酰胺残基的结合剂和ii)式V-y1的化合物在转谷氨酰胺酶(TGase)存在下接触：
NH2-SP-Y  (V-y1)，其中：
SP不存在或为间隔基；
Y为包含亲双烯体的部分；并且
2.)分离产生的化合物。
在一个实施方案中，上述方法包含制备具有式(V-y)的结构的化合物，其包含下列步骤：
1.)使i)具有至少一个受体谷氨酰胺残基的结合剂和ii)式V-y2的化合物在转谷氨酰胺酶(TGase)存在下接触：
Figure BDA0004000531960000211
其中：
SP不存在或为间隔基；
Y为包含亲双烯体的部分，其中两个Y部分相同；并且
2.)分离产生的化合物。
在一个实施方案中，上述方法包含制备具有式(V-y)的结构的化合物，其包含下列步骤：
1.)使i)具有至少一个受体谷氨酰胺残基的结合剂和ii)式V-y2的化合物在转谷氨酰胺酶(TGase)存在下接触：
Figure BDA0004000531960000212
其中：
SP不存在或为间隔基；
Y为包含亲双烯体的部分，其中两个Y部分不同；并且
2.)分离产生的化合物。
在上述方法的另一个实施方案中，X为
Figure BDA0004000531960000221
且Y为
Figure BDA0004000531960000222
在上述方法任一项的一个实施方案中，所述结合剂是无糖基化的。
在上述方法任一项的一个实施方案中，所述结合剂在步骤1之前被去糖基化。
在上述方法的一个实施方案中，BA为HER-2抗体、其抗原结合片段、MSR1抗体或其抗原结合片段。
在上述方法的一个实施方案中，Gln每次出现时独立地为Q295或N297Q。
在上述方法的一个实施方案中，d为2或4。在另一个实施方案中，d为2。在另一个实施方案中，d为4。
在上述方法的一个实施方案中，SP为-(CH2)u-、-((CH2)u-O-)v-、-NH-、-C(O)-的一个或多个或其组合，其中下标u和v每次出现时独立地为1-20的整数。在另一个实施方案中，SP为-(CH2)u-、C(O)-、-NH-、-(CH2)u-NH-C(O)-、-(CH2)u-C(O)-NH-、-(CH2)u-C(O)-NH-(CH2)v-、-(CH2-CH2-O)v-、-(CH2)u-(O-CH2-CH2)v-C(O)-NH-、-(CH2-CH2-O)v-(CH2)u-C(O)-NH-(CH2)u-、-NH-(CH2)u-、-NH-(CH2)u-C(O)-、-NH-(CH2)u-C(O)-NH-(CH2)v-、-NH-(CH2-CH2-O)v-、-NH-(CH2-CH2-O)v-C(O)-、-NH-(CH2-CH2-O)v-(CH2)u-、-NH-(CH2-CH2-O)v-(CH2)u-C(O)-、-NH-(CH2-CH2-O)v-(CH2)u-C(O)-NH-(CH2)u-、-(CH2)u-NH-C(O)-、-(CH2)u-C(O)-NH-(CH2-CH2-O)v-C(O)-NH-、-NH-(CH2)u-C(O)-NH-的一个或多个或其组合；其中下标u和v独立地为0-20的整数。在另一个实施方案中，SP为-(CH2)u-；其中下标u为1-5的整数。
在一个实施方案中，SP为
Figure BDA0004000531960000223
Figure BDA0004000531960000224
Figure BDA0004000531960000231
其中下标u、v、w和x独立地为1-12。
在一个实施方案中，SP为
Figure BDA0004000531960000232
Figure BDA0004000531960000233
其中下标u、v、w和x独立地为1-12。
在一个实施方案中，SP为
Figure BDA0004000531960000234
Figure BDA0004000531960000235
在一个实施方案中，
Figure BDA0004000531960000236
为
Figure BDA0004000531960000237
Figure BDA0004000531960000238
Figure BDA0004000531960000241
在上述方法的一个实施方案中，X为下式3或4的二烯部分：
Figure BDA0004000531960000242
其中R为H或C1-3烷基；且Q为CH2、CH2CH2或O。在另一个实施方案中，X为下式4a的二烯部分：
Figure BDA0004000531960000243
在上述方法的一个实施方案中，Y为式5或6的亲双烯体部分：
Figure BDA0004000531960000244
其中：R′为H或C1-3烷基；J每次出现时独立地为CH或N；且K为CH、N、
Figure BDA0004000531960000245
或NH-N。在另一个实施方案中，Y为式6a的亲双烯体部分：
Figure BDA0004000531960000246
在上述方法的一个实施方案中，L包含一个或多个氨基酸。在另一个实施方案中，L还包含-NH-、-S-、-O-、-(CH2)n-、-(CH2-O-)m-、-C(O)-、
Figure BDA0004000531960000247
的一个或多个。在一个具体的实施方案中，所述氨基酸为甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸或瓜氨酸。
在上述方法的一个实施方案中，L包含
Figure BDA0004000531960000248
且D包含叔胺，其共价连接至L的亚甲基部分，形成季铵部分。
在上述方法的一个实施方案中，D为治疗部分；其中所述治疗部分为澳瑞他汀、吡咯并苯并二氮杂卓(PBD)、安沙霉素抗生素或其类似物或衍生物。
在上述方法的一个实施方案中，D为治疗部分；其中所述治疗部分为一甲基澳瑞他汀E(MMAE)、PBD-1、利福霉素或其类似物或衍生物。
在上述方法的一个实施方案中，BA为HER-2抗体、其抗原结合片段、MSR1抗体或其抗原结合片段；X为下式4a的二烯部分：
Figure BDA0004000531960000251
Y为式6a的亲双烯体部分：
Figure BDA0004000531960000252
且D为治疗部分；其中所述治疗部分为一甲基澳瑞他汀E(MMAE)、PBD-1、利福霉素；及其类似物或衍生物，或D为成像剂部分Alexa Fluor 647。
在上述方法的一个实施方案中，包含下列步骤：
a.)通过下列步骤生产化合物：
1.)使i)具有至少一个受体谷氨酰胺残基的结合剂和ii)式V-x1a的化合物在转谷氨酰胺酶(TGase)存在下接触：
Figure BDA0004000531960000253
其中结合剂为去糖基化HER-2抗体、其抗原结合片段、MSR1抗体或其抗原结合片段；
2.)分离产生的化合物；且
b.)使步骤a.)的化合物接触下式(VI-A)、(VI-B)或(VI-C)的化合物：
Figure BDA0004000531960000254
Figure BDA0004000531960000261
Figure BDA0004000531960000262
其中D为治疗部分；其中所述治疗部分为通过治疗部分的氨基连接的一甲基澳瑞他汀E(MMAE)、PBD-1、利福霉素或其类似物或衍生物；并且
c.)分离产生的化合物。
在一个方面，本申请提供了通过上述方法的任意一种生产的化合物。
在一个方面，本申请提供了药物组合物，其包含上述实施方案任一项的化合物或所提供的实施方案任一项的组合物和稀释剂、载体和/或赋形剂。在一个实施方案中，所述组合物为胃肠外制剂。
在一个方面，本申请提供了在有需要的受试者中治疗病症的方法，包含向所述受试者施用治疗有效量的组合物，所述组合物包含根据所提供的实施方案的任一项的化合物、所提供的实施方案的任一项的组合物或所提供的实施方案的任一项的药物组合物。在前述方法的一个实施方案中，所述病症是癌症。在上述方法的另一个实施方案中，所述病症为HER2+乳腺癌。在上述方法的一个实施方案中，BA为HER2抗体或其抗原结合片段。在上述方法的一个实施方案中，D为细胞毒性剂。
在上述治疗受试者的病症的方法的一个实施方案中，所述癌症的特征在于在前列腺、膀胱、子宫颈、肺、结肠、肾、乳腺、胰腺、胃、子宫和卵巢中的一处或多处发生的原发性和/或转移性肿瘤。在上述方法的一个实施方案中，所述癌症为前列腺癌、膀胱癌、宫颈癌、肺癌、结肠癌、肾癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌、子宫癌或卵巢癌。
在上述治疗受试者的病症的方法的一个实施方案中，D选自：多拉司他汀、澳瑞他汀、美登素类化合物、吡咯并苯并二氮杂卓和tubulysin相互作用剂。在另一个实施方案中，D为MMAE或PDB。
在上述治疗受试者的病症的方法的一个实施方案中，所述病症为感染。在另一个实施方案中，BA为MSR1抗体或其抗原结合片段。在另一个实施方案中，D为利福霉素或其类似物或衍生物。在另一个实施方案中，所述病症为细菌感染。在另一个实施方案中，所述病症为病毒感染。
在上述治疗受试者的病症的方法的一个实施方案中，所述病症为炎性病症。在另一个实施方案中，BA为MSR1抗体或其抗原结合片段。在另一个实施方案中，所述病症为免疫系统病症。在另一个实施方案中，所述炎性病症为：因癌症导致的高钙血症、梅尼埃病、偏头痛、丛集性头痛、严重口疮性溃疡、喉头炎、严重肺结核、对梅毒的赫克斯海默反应、代偿失调的心力衰竭、过敏性鼻炎或鼻息肉。
在阅读了包括所附权利要求的以下详细描述之后，本申请的这些和其他方面对于本领域技术人员将变得很清楚。
详细描述
本文公开了本申请的详细实施方案；然而，应当理解，所公开的实施方案仅是可以以各种形式体现的本申请的示例。另外，结合本申请的各种实施方案给出的每个示例旨在是示例性的而非限制性的。因此，本文公开的具体结构和功能细节不应被解释为限制性的，而仅是作为教导本领域技术人员以不同方式采用本申请的代表性基础。应当理解，本申请不限于所描述的特定方法和实验条件，因此这些方法和条件可以改变。还应理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并不旨在限制，因为本申请的范围将仅由所附权利要求限定。
定义
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。如本文所用，术语“约”当用于提及特定列举的数值时，意指该值可以从列举的值变化不超过1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101以及其间的所有值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
尽管在本申请的实施或测试中可以使用与本文描述的那些类似或等同的任何方法和材料，但是现在描述特定的方法和材料。本说明书中提及的所有专利、申请和非专利出版物通过引用整体并入本文。
范围在本文中可以表示为从“约”或“大约”一个特定值和/或到“约”或“大约”另一个特定值。当表达这样的范围时，另一个实施方案包括从一个特定值和/或到另一个特定值。
所谓“包含”或“含有”或“包括”是指至少指定的化合物、要素、品种或方法步骤存在于组合物或制品或方法中，但不排除其他化合物、材料、品种或方法步骤的存在，即使其他这样的化合物、材料、品种或方法步骤具有与所命名的相同的功能。
状态、障碍或病症的术语“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”包括：(1)预防、延迟或降低在可能罹患或易患该状态、障碍或病症但尚未经历或显示该状态、障碍或病症的临床或亚临床症状的受试者中出现该状态、障碍或病症的至少一种临床或亚临床症状的发生率和/或可能性；或(2)抑制状态、障碍或病症，即阻止、减少或延迟疾病的发展或其复发或其至少一种临床或亚临床症状；或(3)缓解疾病，即引起状态、障碍或病症或其至少一种临床或亚临床症状的消退。对待治疗的受试者的益处是统计学上显著的或至少对于患者或临床医师是可感知的。
如本文所用，“受试者”或“患者”或“个体”或“动物”是指人、兽医动物(例如猫、狗、牛、马、绵羊、猪等)和疾病的实验动物模型(例如小鼠、大鼠)。在一个实施方案中，受试者为人。
如本文所用，用于剂量或量的术语“有效”是指化合物或药物组合物的量，其在施用于有需要的受试者时足以产生期望的活性。注意，当施用活性成分的组合时，组合的有效量可以包括或可以不包括如果单独施用将有效的每种成分的量。所需的确切量将因受试者而异，这取决于受试者的物种、年龄和一般状况、所治疗病症的严重程度、所用的一种或多种特定药物、施用模式等。
与本申请的组合物结合使用的短语“药学上可接受的”是指这样的组合物的分子实体和其他成分，其是生理上可耐受的，并且当施用于哺乳动物(例如人)时通常不产生不良反应。优选地，如本文所用，术语“药学上可接受的”是指由联邦或州政府的管理机构批准的或在美国药典或其他公认的药典中列出的用于哺乳动物，更特别是人的。
与本申请的组合物结合使用的短语“药学上可接受的盐”是指适于对患者施用的任何盐。适合的盐包括但不限于公开于以下文献中的那些：Berge等人，″PharmaceuticalSalts″，J.Pharm.Sci.，1977，66：1，其通过引用并入本文。盐的实例包括但不限于酸衍生的盐、碱衍生的盐、有机盐、无机盐、胺盐和碱金属盐或碱土金属盐，包括但不限于钙盐、镁盐、钾盐、钠盐、盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、马来酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸等的盐。在一些实例中，本文所述的有效负载(例如本文所述的利福霉素类似物)包含叔胺，其中叔胺中的氮原子是有效负载通过其与接头或接头-间隔基键合的原子。在这种情况下，与有效负载的叔胺键合在接头-有效负载分子中产生季胺。季胺上的正电荷可以被抗衡离子(例如氯、溴、碘或任何其他合适带电的部分，例如本文所述的那些)平衡。
本文所用的短语“治疗有效量”是指施用时产生期望的效果的量。确切的量将取决于治疗的目的，并且将由本领域技术人员使用已知技术确定(参见，例如，Lloyd(1999)TheArt，Science and Technology of Pharmaceutical Compounding)。
术语“最小抑制浓度”(“MIC”)是指在过夜孵育后抑制微生物可见生长的抗微生物剂的最低浓度。用于测定MIC的测定法是已知的。一种方法如以下实施例中所述。
某些基团、部分、取代基和原子用波状线描绘。波状线可以与一个或多个键相交或覆盖一个或多个键。波状线表示基团、部分、取代基或原子通过其键合的原子。例如，苯基基团，其被丙基取代，描述为：
Figure BDA0004000531960000291
其具有如下结构：
Figure BDA0004000531960000292
某些基团、部分、取代基和原子被描述为与另一个基团或部分(例如环部分)的漂浮键连接。与另一个键相交的漂浮键表示基团、部分、取代基或原子可以连接到其他基团或部分(例如环部分)的任何未指定的原子，其中其为化学上可能的。例如，在如下结构中：
Figure BDA0004000531960000293
取代基SP可以在化学上可能的环上的任一位置连接至该环。
如本文所用，术语“给电子基团”具有其在本领域中的普通含义，即通过共振(内消旋)或诱导效应(或诱导)将其一些电子密度提供给共轭π体系从而使π体系更具亲核性的原子或官能团。作为这些电子效应的结果，与这种基团连接的芳环更可能参与亲电取代反应。给电子基团的非限制性实例包括取代和未取代的胺、羟基、烷氧基、烷基、乙烯基、芳基、酰氨基、酰氧基、烷硫基、烷基膦基和氟基团。
如本文所用，术语“烷基”具有其在本领域中的普通含义，并且可包括饱和脂族基团，包括直链烷基、支链烷基、环烷基、烷基取代的环烷基和环烷基取代的烷基。在某些实施方案中，直链或支链烷基在其主链中具有约1-20个碳原子(例如，对于直链为C1-C20，对于支链为C2-C20)，或者约1-10个碳原子，或约1至6个碳原子。在一些实施方案中，环烷基环在其环结构中具有约3-10个碳原子，其中此类环是单环或双环的，或者在环结构中具有约5、6或7个碳。在一些实施方案中，烷基基团可以是低级烷基基团，其中低级烷基基团包含1-4个碳原子(例如，对于直链低级烷基，C1-C4)。
如本文所用，术语“烯基是指具有一个或多个双键的如本文所定义的烷基。
如本文所用，术语“炔基”是指具有一个或多个三键的如本文所定义的烷基。
术语“杂烷基”具有其在本领域中的普通含义，并且是指其中一个或多个碳原子被杂原子(例如，卤素、氧、氮、硫等)替代的如本文所述的烷基。杂烷基的实例包括但不限于烷氧基、聚(乙二醇)-、烷基取代的氨基、四氢呋喃基、哌啶基、吗啉基等。
如本文所用，“芳族基团”是指单环或多环、芳族或杂芳族环，其可具有5至20个环原子，并且任选地可具有1至20个杂原子取代基。在一些实施方案中，芳族基团可任选地具有1至10个杂原子取代基。在一些实施方案中，芳族基团可任选地具有1至5个杂原子取代基。在一些实施方案中，芳族基团是单环或多环芳族环，例如环戊二烯基、苯基、萘基或蒽基。在一些实施方案中，芳族基团是具有5至10个环原子的单环或多环芳族环。在一些实施方案中，芳族基团是含有5至6个碳原子的单环芳族环，例如苯基和环戊二烯基。在一个具体实施方案中，芳族基团为苯基。
单独使用或作为较大部分如“芳烷基”、“芳烷氧基”或“芳氧基烷基”的一部分使用的术语“芳基”是指具有总共5-14个环成员的单环或双环系统，其中该系统中的至少一个环是芳族的，并且其中该系统中的每个环含有3-7个环成员。在本申请的某些实施方案中，“芳基”是指芳族环系统，其包括但不限于苯基、联苯基、萘基、联萘基、蒽基等，其可带有一个或多个取代基。如本文所用，术语“芳基”的范围内还包括其中芳族环与一个或多个非芳族环稠合的基团，例如茚满基、邻苯二甲酰亚胺基、萘酰亚胺基、菲啶基或四氢萘基等。
如本文所用，表述“MSR1”、“HMSR1”等是指人单程、三聚化II型跨膜糖蛋白模式识别受体，其包含(i)NCBI登录号NP_002436.1中所述的氨基酸序列，(ii)NCBI登录号NP_619729.1中所述的氨基酸序列，和/或(iii)NCBI登录号NP_619730.1中所述的氨基酸序列，它们代表A类巨噬细胞清道夫受体的各种类型和同种型。表述“MSR1”包括单体和多聚体MSR1分子。如本文所用，表述“单体人MSR1”是指MSR1蛋白或其部分，其不含有或具有任何多聚化结构域，并且在正常条件下作为单个MSR1分子存在，而不与另一MSR1分子直接物理连接。
表述“HER2”或“人表皮生长因子受体2”是指人表皮生长因子受体家族的成员。该癌基因的扩增或过度表达已显示在某些侵袭性类型的乳腺癌的发展和进展中起重要作用。近年来，该蛋白质已成为约30％乳腺癌患者的重要生物标志物和治疗靶标。HER2的氨基酸序列如SEQ ID NO：49所示。本文中对蛋白质、多肽和蛋白质片段的所有提及旨在指相应蛋白质、多肽或蛋白质片段的人形式，除非明确指定为来自非人物种。因此，表述“HER2”意指人HER2，除非指定为来自非人物种，例如“小鼠HER2”、“猴HER2”等。
短语“结合HER2的抗体”或“抗HER2抗体”包括特异性识别HER2的抗体及其抗原结合片段。
本申请中使用的所有氨基酸缩写均为美国专利商标局接受的那些，如在37C.F.R.§1.822(B)(J)中举出的。
术语“蛋白质”是指具有超过约20个通过酰胺键共价连接的氨基酸的任何氨基酸聚合物。如本文所用，“蛋白质”包括生物治疗蛋白、用于研究或治疗的重组蛋白、捕获蛋白和其他Fc融合蛋白、嵌合蛋白、抗体、单克隆抗体、人抗体、双特异性抗体、抗体片段、纳米抗体、重组抗体嵌合体、scFv融合蛋白、细胞因子、趋化因子、肽激素等。蛋白质可以使用基于重组细胞的生产系统产生，例如昆虫杆状病毒系统、酵母系统(例如毕赤酵母属(Pichiasp.)物种)、哺乳动物系统(例如CHO细胞和CHO衍生物如CHO-K1细胞)。
本文中对蛋白质、多肽和蛋白质片段的所有提及旨在指相应蛋白质、多肽或蛋白质片段的人形式，除非明确说明为来自非人物种。因此，表述“MSR1”是指人MSR1，除非另有说明为来自非人物种，例如“小鼠MSR1”、“猴MSR1”等。
可以使用任意已知的编号方案给抗体的氨基酸序列编号，包括如下文献中所述的那些：Kabat等人，(″Kabat″编号方案)；Al-Lazikani等人，1997，J.Mol.Biol.，273：927-948(″Chothia″编号方案)；MacCallum等人，1996，J.Mol.Biol.262：732-745(″Contact″编号方案)；Lefranc等人，Dev.Comp.Immunol.，2003，27：55-77(″IMGT″编号方案)；和Honegge andPluckthun，J.Mol.Biol.，2001，309：657-70(″AHo″编号方案)。除非另有说明，否则本文使用的编号方案是Kabat编号方案。然而，编号方案的选择不旨在暗示不存在的序列差异，并且本领域技术人员可以通过检查一种或多种抗体的氨基酸序列容易地确认序列位置。除非另有说明，否则当提及抗体重链恒定区中的残基时，通常使用“EU编号方案”(例如，如Kabat等人同上中所报道的)。
术语“谷氨酰胺酰基修饰的抗体”是指具有至少一个从谷氨酰胺侧链到本申请的伯胺化合物的共价键的抗体。在具体实施方案中，伯胺化合物通过谷氨酰胺侧链上的酰胺键连接。在某些实施方案中，谷氨酰胺是内源性谷氨酰胺。在其他实施方案中，谷氨酰胺是由多肽工程化(例如，通过多肽上的氨基酸缺失、插入、取代或突变)产生反应性的内源性谷氨酰胺。在另外的实施方案中，谷氨酰胺是用含有酰基供体谷氨酰胺的标记(例如，含有谷氨酰胺的肽标记、Q-标记或TGase识别标记)进行工程化的多肽。
术语“转谷氨酰胺酶识别标记”是指包含受体谷氨酰胺残基的氨基酸序列，当在适合的条件下掺入(例如附加到)多肽序列时，其被转谷氨酰胺酶识别，并通过氨基酸序列内的氨基酸侧链和反应配偶体之间的反应导致转谷氨酰胺酶交联。识别标记可以是不天然存在于包含TGase识别标记的多肽中的肽序列。在一些实施方案中，Tgase识别标记包含至少一个Gln。在一些实施方案中，Tgase识别标记包含氨基酸序列XXQX(SEQ ID NO：467)，其中X为任意的氨基酸(例如常见的氨基酸Leu、Ala、Gly、Ser、Val、Phe、Tyr、His、Arg、Asn、Glu、Asp、Cys、Gin、He、Met、Pro、Thr、Lys或Trp或不常见的氨基酸)。在一些实施方案中，包含酰基供体谷氨酰胺的标记包含氨基酸序列，其选自LLQGG(SEQ ID NO：468)、LLQG(SEQ ID NO：469)、LSLSQG(SEQ ID NO：470)、GGGLLQGG(SEQ ID NO：471)、GLLQG(SEQ ID NO：472)、LLQ、GSPLAQSHGG(SEQ ID NO：473)、GLLQGGG(SEQ ID NO：474)、GLLQGG(SEQ ID NO：475)、GLLQ(SEQ ID NO：476)、LLQLLQGA(SEQ ID NO：477)、LLQGA(SEQ ID NO：478)、LLQYQGA(SEQ IDNO：479)、LLQGSG(SEQ ID NO：480)、LLQYQG(SEQ ID NO：481)、LLQLLQG(SEQ ID NO：482)、SLLQG(SEQ ID NO：483)、LLQLQ(SEQ ID NO：484)、LLQLLQ(SEQ ID NO：485)和LLQGR(SEQ IDNO：486)。参见，例如WO2012059882，该文献的全部内容通过引用并入。
在一些实施方案中，TGase识别标记衍生自myc肽，所述myc肽可被导入多种多肽，包括但不限于抗体。参见例如US10036010，其全部内容并入本文。在一些实施方案中，Myc-Tag序列为：EQKLISEEDL(N-Glu-Gln-Lys-Leu-Ile-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu-C，SEQ ID NO：487)。
如本文所用，术语“抗体”是指包含至少一个特异性结合特定抗原或与特定抗原相互作用的互补决定区(CDR)的任何抗原结合分子或分子复合物。术语“抗体”包括包含四条多肽链(通过二硫键相互连接的两条重(H)链和两条轻(L)链)的免疫球蛋白分子，以及其多聚体(例如IgM)。每条重链包含重链可变区(本文缩写为HCVR或VH)和重链恒定区。重链恒定区包含三个结构域CH1、CH2和CH3。每条轻链包含轻链可变区(在本文中缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域(CL1)。VH和VL区可以进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDR)散布有更保守的区域，称为框架区(FR)。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，从氨基末端到羧基末端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在不同的实施方案中，抗体(或其抗原结合部分)的FR可以与人种系序列相同，或者可以是天然或人工修饰的。可以基于两个或更多个CDR的并排分析来定义氨基酸共有序列。
如本文所用，术语“抗体”还包括完整抗体分子的抗原结合片段。如本文所用，术语抗体的“抗原结合部分”、抗体的“抗原结合片段”等包括特异性结合抗原以形成复合物的任何天然存在的、可酶促获得的、合成的或遗传改造的多肽或糖蛋白。抗体的抗原结合片段可以使用任何适合的标准技术例如蛋白水解消化或涉及操纵和表达编码抗体可变结构域和任选地恒定结构域的DNA的重组遗传改造技术从例如完整抗体分子衍生。这类DNA是已知的和/或易于从例如商业来源、DNA文库(包括例如噬菌体-抗体文库)获得，或可以合成。可以以化学方式或通过使用分子生物学技术对DNA进行测序和操作，例如将一个或多个可变和/或恒定结构域排列成适合的构型，或导入密码子，产生半胱氨酸残基，修饰、添加或缺失氨基酸等。
抗原结合片段的非限制性实例包括：(i)Fab片段；(ii)F(ab′)2片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(v)单链Fv(scFv)分子；(vi)dAb片段；和(vii)由模拟抗体的高变区的氨基酸残基组成的最小识别单元(例如，分离的互补决定区(CDR)，如CDR3肽)或受约束的FR3-CDR3-FR4肽。其他工程化分子，例如结构域特异性抗体、单结构域抗体、结构域缺失抗体、嵌合抗体、CDR移植抗体、双体、三抗体、四抗体、微型抗体、纳米抗体(例如，单价纳米抗体、二价纳米抗体等)、小模块化免疫药物(SMIP)和鲨鱼可变IgNAR结构域，也包括在如本文所用的表述“抗原结合片段”内。
抗体的抗原结合片段通常包含至少一个可变结构域。可变结构域可以具有任何大小或氨基酸组成，并且通常将是包含至少一个与一个或多个框架序列相邻或同框的CDR。在具有与VL结构域结合的VH结构域的抗原结合片段中，VH和VL结构域可以相对于彼此以任何适合的排列定位。例如，可变区可以是二聚体并且含有VH-VH、VH-VL或VL-VL二聚体。
或者，抗体的抗原结合片段可以包含单体VH或VL结构域。
在某些实施方案中，抗体的抗原结合片段可以包含与至少一个恒定结构域共价连接的至少一个可变结构域。可以在本说明书的抗体的抗原结合片段内发现的可变结构域和恒定结构域的非限制性示例性构型包括：(i)VH-CH1；(ii)VH-CH2；(iii)VH-CH3；(iv)VH-CH1-CH2；(V)VH-CH1-CH2-CH3；(vi)VH-CH2-CH3；(vii)VH-CL；(viii)VL-CH1；(ix)VL-CH2；(x)VL-CH3；(xi)VL-CH1-CH2；(xii)VL-CH1-CH2-CH3；(xiii)VL-CH2-CH3；和(xiv)VL-CL。在可变结构域和恒定结构域的任何构型中，包括本文列出的任何示例性构型，可变结构域和恒定结构域可以彼此直接连接或可以通过完全或部分铰链或接头区连接。铰链区可由至少2个(例如5、10、15、20、40、60或更多个)氨基酸组成，其在单个多肽分子中的相邻可变结构域和/或恒定结构域之间产生柔性或半柔性连接。
此外，本说明书的抗体的抗原结合片段可以包含本文所列的任何可变和恒定结构域构型的同型二聚体或异二聚体(或其他多聚体)，其彼此非共价结合和/或与一个或多个单体VH或VL结构域非共价结合(例如，通过二硫键)。
与完整抗体分子一样，抗原结合片段可以是单特异性的或多特异性的(例如，双特异性的)。抗体的多特异性抗原结合片段通常包含至少两个不同的可变结构域，其中每个可变结构域能够特异性结合单独的抗原或相同抗原上的不同表位。任何多特异性抗体形式，包括本文公开的示例性双特异性抗体形式，可以使用本领域可利用的常规技术适用于本说明书的抗体的抗原结合片段的情况。
本说明书的抗体可通过补体依赖性细胞毒性(CDC)或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)起作用。“补体依赖性细胞毒性”(CDC)是指在补体存在下本说明书的抗体对抗原表达细胞的裂解。“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”(ADCC)是指细胞介导的反应，其中表达Fc受体(FcR)非特异性细胞毒性细胞(例如自然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)识别结合在靶细胞上的抗体，从而导致靶细胞的裂解。CDC和ADCC可以使用本领域众所周知和可利用的测定法来测量。(参见，例如美国专利NO.5,500,362和5,821,337，和Clynes等人(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)95：652-656)。抗体的恒定区在抗体固定补体和介导细胞依赖性细胞毒性的能力中是重要的。因此，可以基于抗体是否需要介导细胞毒性来选择抗体的同种型。
在某些实施方案中，本说明书的抗体，例如抗-HER2抗体或抗-MSR1抗体，是人抗体。如本文所用，术语“人抗体”旨在包括具有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本说明书的人抗体可以包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变导入的突变)，例如在CDR中，特别是在CDR3中。然而，如本文所用，术语“人抗体”不旨在包括其中衍生自另一哺乳动物物种(例如小鼠)的种系的CDR序列已经移植到人框架序列上的抗体。
在一些实施方案中，抗体可以为重组人抗体。如本文所用，术语“重组人抗体”旨在包括通过重组手段制备、表达、产生或分离的所有人抗体，例如使用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体(下文进一步描述)、从重组组合人抗体文库分离的抗体(下文进一步描述)、从人免疫球蛋白基因转基因的动物(例如小鼠)分离的抗体(参见，例如Taylor等人(1992)Nucl.Acids Res.20：6287-6295)，或通过涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列的任何其他方式制备、表达、产生或分离的抗体。这类重组人抗体具有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。然而，在某些实施方案中，对此类重组人抗体进行体外诱变(或者，当使用针对人Ig序列转基因的动物时，进行体内体细胞诱变)，因此重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是这样的序列，其虽然衍生自人种系VH和VL序列并且与人种系VH和VL序列相关，但可能不天然存在于体内的人抗体种系库中。
人抗体可以以与铰链异质性相关的两种形式存在。在一种形式中，免疫球蛋白分子包含约150-160kDa的稳定四链构建体，其中二聚体通过链间重链二硫键保持在一起。在第二种形式中，二聚体不通过链间二硫键连接，并且形成由共价偶联的轻链和重链(半抗体)组成的约75-80kDa的分子。即使在亲和纯化后，这些形式也极难分离。在各种完整IgG同种型中出现第二种形式的频率是由于但不限于与抗体的铰链区同种型相关的结构差异。人IgG4铰链的铰链区中的单个氨基酸取代可以将第二种形式的出现(Angal等人(1993)Molecular Immunology 30：105)显著减少至使用人IgG1铰链典型地观察到的水平。本说明书涵盖在铰链、CH2或CH3区中具有一个或多个突变的抗体，所述突变例如在生产中可能是期望的，以提高所需抗体形式的收率。
本说明书的抗体可以是分离的或纯化的抗体。如本文所用，“分离的抗体”或“纯化的抗体”意指已经从其天然环境的至少一种组分中鉴定和分离和/或回收的抗体。例如，出于本说明书的目的，已经从生物体的至少一种组分或从抗体天然存在或天然产生的组织或细胞中分离或去除的抗体是“分离的抗体”。例如，已经从反应或反应序列的至少一种组分中纯化的抗体是“纯化的抗体”或由纯化抗体产生。分离的抗体还包括重组细胞内的原位抗体。分离的抗体是已经经历至少一个纯化或分离步骤的抗体。根据某些实施方案，分离的抗体或纯化的抗体可以基本上不含其他细胞材料和/或化学物质。
与衍生抗体的相应种系序列相比，本文公开的抗体可以在重链和轻链可变结构域的框架区和/或CDR区中包含一个或多个氨基酸取代、插入和/或缺失。通过将本文公开的氨基酸序列与可从例如公共抗体序列数据库获得的种系序列进行比较，可以容易地确定此类突变。本说明书包括衍生自本文公开的任何氨基酸序列的抗体及其抗原结合片段，其中一个或多个框架和/或CDR区内的一个或多个氨基酸突变为衍生抗体的种系序列的相应残基，或突变为另一种人种系序列的相应残基，或突变为相应种系残基的保守氨基酸取代(此类序列变化在本文中统称为“种系突变”)。本领域普通技术人员从本文公开的重链和轻链可变区序列开始，可以容易地产生许多抗体和抗原结合片段，它们包含一个或多个单独的种系突变或其组合。在某些实施方案中，VH和/或VL结构域内的所有框架和/或CDR残基突变回在衍生抗体的原始种系序列中发现的残基。在其他实施方案中，仅某些残基突变回原始种系序列，例如，仅在FRI的前8个氨基酸内或在FR4的最后8个氨基酸内发现的突变残基，或仅在CDR1、CDR2或CDR3内发现的突变残基。在其他实施方案中，一个或多个框架和/或CDR残基突变为不同种系序列(即，与最初衍生抗体的种系序列不同的种系序列)的相应残基。
此外，本说明书的抗体可以在框架区和/或CDR区内含有两个或更多个种系突变的任何组合，例如，其中某些单个残基突变为特定种系序列的相应残基，而与原始种系序列不同的某些其他残基保持或突变为不同种系序列的相应残基。一旦获得，则可以便利地测试包含一个或多个种系突变的抗体和抗原结合片段的一种或多种期望的特性，例如抗体-药物缀合物的改善的结合特异性、增加的结合亲和力、改善或增强的拮抗或激动生物学特性(视情况而定)、降低的免疫原性、改善的药物-抗体比(DAR)等。
抗体的氨基酸序列可以使用任何已知的编号方案编号，包括Kabat等人，(“Kabat”编号方案)；A1-Lazikani等人，1997，J.Mol.Biol.，273：927-948(“Chothia”编号方案)；MacCallum等人，1996，J.Mol.Biol.262：732-745(“Contact”编号方案)；Lefranc等人，Dev.Comp.Immunol.，2003，27：55-77(“IMGT”编号方案)；和Honegge and Plückthun，J.Mol.Biol.，2001，309：657-70(“AHo”编号方案)所述的那些。除非另有说明，否则本文使用的编号方案是Kabat编号方案。然而，编号方案的选择不旨在暗示不存在的序列差异，并且本领域技术人员可以通过检查一种或多种抗体的氨基酸序列容易地确认序列位置。除非另有说明，否则当提及抗体重链恒定区中的残基时，通常使用“EU编号方案”(例如，如Kabat等人，同上中所报道的)。
术语“无糖基化抗体”是指不包含可能干扰转谷氨酰胺化反应的糖基化序列的抗体，例如在一条或多条重链上的N297处不具有糖基的抗体。在具体实施方案中，抗体重链具有N297突变。换句话说，根据Kabat等人公开的EU编号系统，抗体被突变为在297位不再具有天冬酰胺残基。在具体的实施方案中，抗体重链具有N297Q或N297D突变。这样的抗体可以通过定点诱变以去除糖基化序列或使糖基化序列失活或通过定点诱变以在除了任何干扰糖基化位点或任何其他干扰结构之外的位点插入谷氨酰胺残基来制备。这样的抗体也可以从天然或人工来源分离。
术语“去糖基化抗体”是指其中N297处的糖基被除去，从而促进Q 295转谷氨酰胺化的抗体。在特定实施方案中，本文提供了包括使抗体(例如N297抗体)去糖基化的额外步骤的方法。
术语“表位”是指与抗体分子可变区中称作互补位的特异性抗原结合位点相互作用的抗原决定簇。单一抗原可以具有一个以上表位。因此，不同的抗体可以结合抗原上的不同区域，并且可以具有不同的生物学效应。表位可以是构象的或线性的。构象表位由来自线性多肽链的不同区段的空间并置的氨基酸产生。线性表位是由多肽链中的相邻氨基酸残基产生的表位。在某些情况下，表位可以包括抗原上的糖、磷酰基或磺酰基的部分。
本文所用的术语“缀合的蛋白质”或“缀合的抗体”是指与一个或多个化学部分共价连接的蛋白质或抗体。化学部分可以包括本申请的胺化合物。本文详细描述了适用于本申请的接头(L)和有效负载(D)。在特定实施方案中，包含治疗部分的缀合抗体为抗体-药物缀合物(ADC)，也称作抗体-有效负载缀合物或抗体-接头-有效负载缀合物。
术语“药物-抗体比”或(DAR)为与本申请的结合剂缀合的治疗部分(例如药物)的平均数。
术语“接头抗体比”或(LAR)在一些实施方案中也表示为小写字母i，是与本发明的结合剂缀合的反应性伯胺化合物的平均数。这类结合剂，例如抗体可以与包含适合的二烯或亲二烯体的伯胺化合物缀合。所得的用二烯或亲双烯体官能化的结合剂随后可以通过狄尔斯-阿尔德反应与包含相应的二烯或亲双烯体的治疗剂反应。
术语“谷氨酰胺酰基修饰的抗体”是指具有至少一个从谷氨酰胺侧链到化学部分的共价连接的抗体。化学部分可以是本领域技术人员认为适合的任何部分，例如本申请的胺化合物。在具体实施方案中，化学部分通过谷氨酰胺侧链上的酰胺键连接。
短语“药学上可接受的量”是指在有需要的受试者中有效或足够治疗、减轻、缓解或调节至少一种健康问题的作用或症状的量。例如，抗体或抗体-药物缀合物的药学上可接受的量是使用本文提供的抗体或抗体-药物-缀合物有效调节生物靶标的量。适合的药学上可接受的量包括但不限于本文提供的抗体或抗体-药物-缀合物的约0.001％-约10％和其中的任一量，例如约0.01％、约0.02％、约0.03％、约0.04％、约0.05％、约0.06％、约0.07％、约0.08％、约0.09％、约0.1％、约0.2％、约0.3％、约0.4％、约0.5％、约0.6％、约0.7％、约0.8％、约0.9％、约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％或约10％。
短语“初始pH”是指在将组分或反应物加入反应混合物之前，用于反应的成分或反应物的pH。例如，在将缓冲溶液加入反应混合物之前，缓冲溶液的初始pH为7.74。
短语“反应pH”是指加入所有反应组分或反应物后反应的pH。
术语“药学上可接受的”是指由美国联邦或州政府的管理机构批准的，或在美国药典或其它公认的药典中列出的，其用于动物，更特别是人。
当涉及核酸或其片段时，术语“基本相同”或“基本上相同”表示，当以适合的核苷酸插入或缺失与另一核酸(或其互补链)进行最佳比对时，通过任何众所周知的序列同一性算法，例如如下所述的FASTA、BLAST或GAP测量的，至少约95％，更优选至少约96％，97％，98％或99％的核苷酸碱基存在核苷酸序列相同性。在某些情况下，与参比核酸分子具有基本上同一性的核酸分子可以编码与由参比核酸分子编码的多肽具有相同或基本上相似的氨基酸序列的多肽。
当应用于多肽时，术语“基本相似”或“基本上相似”意指当例如通过程序GAP或BESTFIT使用默认空位权重进行最佳比对时，两个肽序列共享至少95％的序列同一性，甚至更优选至少98％或99％的序列同一性。优选地，不相同的残基位置因保守氨基酸取代而不同。“保守氨基酸取代”是其中氨基酸残基被具有相似化学性质(例如电荷或疏水性)的侧链(R基团)的另一个氨基酸残基取代的氨基酸取代。通常，保守氨基酸取代基本上不会改变蛋白质的功能特性。在两个或更多个氨基酸序列因保守取代而彼此不同的情况下，可以向上调整序列同一性百分比或相似性程度以校正取代的保守性质。进行这种调节的方法是本领域技术人员公知的。参见，例如Pearson(1994)Methods Mol.Biol.24：307-331。具有类似化学特性的侧链的氨基酸组的实例包括(1)脂肪族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；(2)脂肪族-羟基侧链：丝氨酸和苏氨酸；(3)含酰胺侧链：天冬酰胺和谷氨酰胺；(4)芳族侧链：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；(5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸和组氨酸；(6)酸性侧链：天冬氨酸和谷氨酸，和(7)含硫侧链是半胱氨酸和甲硫氨酸。在一些实施方案中，保守氨基酸取代组为：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。
或者，保守置换是在Gonnet等人(1992)Science 256：1443-1445中公开的PAM250对数似然矩阵中具有正值的任何改变。“中等保守”置换是在PAM250对数似然矩阵中具有非负值的任何改变。
通常使用序列分析软件测量多肽的序列相似性，也称为序列同一性。蛋白质分析软件使用分配给各种取代、缺失和其他修饰(包括保守氨基酸取代)的相似性度量来匹配相似的序列。例如，GCG软件包含例如GAP和BESTFIT这样的程序，其可以与默认参数一起使用以确定密切相关的多肽(例如来自不同物种的生物体的同源多肽)之间或野生型蛋白质与其突变蛋白之间的序列同源性或序列同一性。参见例如GCG版本6.1。还可以使用FASTA使用默认或推荐参数(GCG版本6.1中的程序)比较多肽序列。FASTA(例如，FASTA2和FASTA3)提供查询和搜索序列之间最佳重叠区域的比对和序列同一性百分比(Pearson(2000)，同上)。另一个当将描述的序列与含有来自不同生物体的大量序列的数据库进行比较时，特定算法是使用默认参数的计算机程序BLAST，特别是BLASTP或TBLASTN。参见，例如Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215：403-410和Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-402。
如本文所用，“治疗有效量”是指足以在疾病或病症的治疗或控制中为患者提供治疗益处，或延迟或最小化与疾病或病症相关的一种或多种症状的(化合物的)量。
本申请的化合物
蛋白质-有效负载缀合化合物
根据上述目的和其它目的，本发明提供了蛋白质-有效负载缀合化合物，例如蛋白质-药物缀合化合物、其前体和中间体，药物组合物，以及在需要这种治疗的受试者中治疗某些疾病的方法。根据本申请，本文提供的蛋白质-有效负载缀合物化合物包含与连接至治疗剂或成像剂部分的伯胺化合物缀合的谷氨酰胺酰基修饰的结合剂，其中接头包含狄尔斯-阿尔德加合物，其为如本文所述的取代的环己烯衍生物。
如本文所用，术语“蛋白质-有效负载缀合物”是指包含本申请的结合剂(例如，抗体或其片段)的化合物，其具有与一种或多种本申请的化合物缀合的一个或多个谷氨酰胺残基，所述本申请的化合物包含i)狄尔斯-阿尔德加合物和ii)治疗剂或成像剂部分。示例性的非限制性实例包括本文所述的式(IA)、(IB)和(IC)。
如本文所用，术语“蛋白质-药物缀合物”是指包含本申请的结合剂的化合物(例如，抗体或其片段)，其具有与一种或多种本申请的化合物缀合的一个或多个谷氨酰胺残基，所述本申请的化合物包含i)狄尔斯-阿尔德加合物和ii)治疗部分。示例性的非限制性实例包括本文所述的式(IA)、(IB)和(IC)。在蛋白质-药物缀合物的具体实施方案中，其中结合剂为抗体(例如，单克隆抗体)，任选使用术语“抗体-药物缀合物”或ADC。
根据本申请，提供了蛋白质-有效负载缀合物化合物，其包含式(A)的结构所示例的要素：
Figure BDA0004000531960000401
其中：BA为如本文所述的结合剂；Gln为谷氨酰胺残基；Z包含如本文所述的狄尔斯-阿尔德加合物；D为如本文所述的治疗部分或成像剂部分，n为1-4的整数，且d为1-10的整数。在某些实施方案中，式A的蛋白质-药物缀合化合物还可以包括本领域技术人员公知的另外的接头和间隔基。
通常，狄尔斯-阿尔德反应是共轭二烯与烯烃或炔烃(通常称作亲双烯体(也称为亲二烯体))之间的化学反应，形成环己烯衍生物，在本文中也称作“狄尔斯-阿尔德加合物”。
虽然不受理论的约束，但狄尔斯-阿尔德反应被视为共轭二烯和亲双烯体(烯烃或炔烃)的[4+2]-环加成，这是一种涉及二烯的4π-电子和亲二烯体的2π-电子的电环化反应。认为反应的驱动力为形成新的σ-键，其在能量上比π-键更稳定。狄尔斯-阿尔德反应和所得加合物的非限制性实例在方案I中示例。
方案I.
Figure BDA0004000531960000402
本申请的术语“狄尔斯-阿尔德加合物”Z包括任何二价环己烯衍生物，与生产取代的环己烯衍生物所采取的合成步骤无关。也就是说，如本文所用的狄尔斯-阿尔德加合物术语不限于狄尔斯-阿尔德反应的字面产物，而是包括可以通过狄尔斯-阿尔德反应产生(或预期会产生)的结构。
在某些实施方案中，狄尔斯-阿尔德加合物Z包含式1或2的部分：
Figure BDA0004000531960000411
其中R′每次出现时独立地为H、C1-3烷基或两个R′一起构成CHR、(CHR)2或O桥；J每次出现时独立地为CH；且K为N、
Figure BDA0004000531960000412
或NH-N；且R每次出现时独立地为H或给电子基团。
在某些实施方案中，本申请提供了具有式(I)的结构的蛋白质-药物缀合化合物：
Figure BDA0004000531960000413
其中：BA为如本文所述的结合剂；Gln为谷氨酰胺残基；SP为如本文所述的任选的间隔基；Z包含如本文所述的狄尔斯-阿尔德加合物；L为本申请的接头；D为如本文所述的治疗部分和/或成像剂部分，n为1-4的整数，且d为1-10的整数。
在某些实施方案中，本申请提供了具有式(IA)的结构的蛋白质-药物缀合化合物：
Figure BDA0004000531960000414
其中：BA为如本文所述的结合剂；Gln为谷氨酰胺残基；SP为如本文所述的任选的间隔基；Z包含如本文所述的狄尔斯-阿尔德加合物；L为本申请的接头；D为如本文所述的治疗部分和/或成像剂部分，且d为1-10的整数。
在某些实施方案中，提供了具有式(II)的结构的蛋白质-药物缀合化合物：
Figure BDA0004000531960000415
其中：BA为如本文所述的结合剂；Gln为谷氨酰胺残基；SP不存在或为如本文所述的间隔基；Q为CHR、(CHR)2或O桥；R每次出现时独立地为H或给电子基团；L为本申请的接头；D为如本文所述的治疗部分和/或成像剂部分，n为1-4的整数，且d为1-10的整数。
在某些实施方案中，提供了具有式(II)的结构的蛋白质-药物缀合化合物：
Figure BDA0004000531960000421
其中：BA为如本文所述的结合剂；Gln为谷氨酰胺残基；SP不存在或为如本文所述的间隔基；L为本申请的接头；D为如本文所述的治疗部分和/或成像剂部分，且d为1-10的整数。
结合剂
在一个实施方案中，本文所述的蛋白质-药物缀合物实施方案的有效性取决于结合剂结合其结合配偶体的选择性。在本申请的一个实施方案中，结合剂是能够以一定特异性结合给定结合配偶体的任何分子。在一个实施方案中，结合剂在哺乳动物内，其中相互作用可产生治疗用途。在一个替代实施方案中，结合剂在体外，其中相互作用可产生诊断用途。在一些方面，结合剂能够结合细胞或细胞群。
本申请的适合的结合剂包括与结合配偶体结合的蛋白质，其中所述结合剂包含一个或多个谷氨酰胺残基。适合的结合剂包括但不限于抗体、淋巴因子、激素、生长因子、病毒受体、白细胞介素或任何其他细胞结合或肽结合分子或物质。
在一个实施方案中，结合剂为抗体。在某些实施方案中，抗体选自单克隆抗体、多克隆抗体、抗体片段(Fab、Fab′和F(ab)2、小体、双体、三抗体等)。本文的抗体可以使用No.6,596,541和美国公布号US 2012/0096572中所述的方法人源化，其各自通过引用整体并入。在本申请的蛋白质-药物缀合化合物的某些实施方案中，BA为人源化单克隆抗体。例如，BA可以为结合HER2或MSR1的单克隆抗体。
在本申请中，抗体可以为本领域技术人员认为适合的任何抗体。在一些实施方案中，抗体在至少一个多肽链序列中包含至少一个谷氨酰胺残基。在某些实施方案中，抗体包含一个或多个Gln295残基。在某些实施方案中，所述抗体包含两条重链多肽，每条重链多肽具有一个Gln295残基。在进一步的实施方案中，抗体在重链295以外的位点包含一个或多个谷氨酰胺残基。这类抗体可从天然来源分离或改造以包含一个或多个谷氨酰胺残基。用于将谷氨酰胺残基改造入抗体多肽链中的技术在本领域技术人员的技能范围内。在某些实施方案中，抗体为无糖基化的。
抗体可以是本领域技术人员已知的任何形式。在某些实施方案中，抗体包含轻链。在某些实施方案中，轻链为κ轻链。在某些实施方案中，轻链为λ轻链。
在某些实施方案中，抗体包含重链。在一些方面，重链为IgA。在一些方面，重链为IgD。在一些方面，重链为IgE。在一些方面，重链为IgG。在一些方面，重链为IgM。在一些方面，重链为IgG1。在一些方面，重链为IgG2。在一些方面，重链为IgG3。在一些方面，重链为IgG4。在一些方面，重链为IgA1。在一些方面，重链为IgA2。
在一些实施方案中，抗体为抗体片段。在一些方面，抗体片段为Fv片段。在一些方面，抗体片段为Fab片段。在一些方面，抗体片段为F(ab′)2片段。在一些方面，抗体片段为Fab′片段。在一些方面，抗体片段为scFv(sFv)片段。在一些方面，抗体片段为scFv-Fc片段。
在一些实施方案中，抗体为单克隆抗体。在一些实施方案中，抗体为多克隆抗体。
在一些实施方案中，抗体为嵌合抗体。在一些实施方案中，抗体为人源化抗体。在一些实施方案中，抗体为人抗体。
抗体可以对本领域技术人员认为适合的任何抗原具有结合特异性。在某些实施方案中，抗原为跨膜分子(例如受体)或生长因子。示例性抗原包括但不限于分子，例如肾素；生长激素，包括人生长激素和牛生长激素；生长激素释放因子；甲状旁腺激素；促甲状腺激素；脂蛋白；α1-抗胰蛋白酶；胰岛素A链；胰岛素B链；胰岛素原；促卵泡激素；降钙素；促黄体激素；胰高血糖素；凝血因子，如因子VmC、因子IX、组织因子(TF)和von Willebrands因子；抗凝血因子如蛋白C；心房利钠因子；肺表面活性剂；纤溶酶原激活物，如尿激酶或人尿或组织型纤溶酶原激活物(t-PA)；铃蟾肽；凝血酶；造血生长因子；肿瘤坏死因子-α和-β；脑啡肽酶；RANTES(调节活化正常T细胞表达和分泌)；人巨噬细胞炎性蛋白(MIP-1-α)；血清白蛋白，如人血清白蛋白；Muellerian抑制物质；松弛素A链；松弛素B链；松弛素原；小鼠促性腺激素相关肽；微生物蛋白，如β内酰胺酶；DNase；19E；细胞毒性T淋巴细胞相关抗原(CTLA)，如CTLA-4；抑制素；激活素；血管内皮生长因子(VEGF)；激素或生长因子的受体；蛋白A或D；类风湿因子；神经营养因子，如骨源性神经营养因子(BDNF)、神经营养因子-3、-4、-5或-6(NT-3、NT4、NT-5或NT-6)，或神经生长因子，如NGF-β；血小板衍生生长因子(PDGF)；成纤维细胞生长因子如aFGF和bFGF；成纤维细胞生长因子受体2(FGFR2)、表皮生长因子(EGF)；转化生长因子(TGF)如TGF-α和TGF-β，包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4或TGF-β5；胰岛素样生长因子-1和-2(IGF-1和IGF-2)；des(1-3)-IGF-1(脑IGF-I)、胰岛素样生长因子结合蛋白、EpCAM、GD3、FLT3、PSMA、PSCA、MUCI、MUCI6、STEAP、CEA、TENB2、EphA受体、EphB受体、叶酸受体、FOLRI、间皮素、cripto、αVβ6、整联蛋白、VEGF、VEGFR、EGFR、转铁蛋白受体、1RTAI、1RTA2、1RTA3、1RTA4、1RTA5；CD蛋白，例如CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD8、CDII、CDI4、CDI9、CD20、CD21、CD22、CD25、CD26、CD28、CD30、CD33、CD36、CD37、CD38、CD40、CD44、CD52、CD55、CD56、CD59、CD70、CD79、CD80、CD81、CD103、CD105、CD134、CD137、CD138、CDI52或美国公布号US 2008/0171040或美国公布号US 2008/0305044中公开的结合一种或多种肿瘤相关抗原或细胞表面受体的抗体，其全部内容通过引用并入本文；促红细胞生成素；骨诱导因子；免疫毒素；骨形态发生蛋白(BMP)；干扰素，如干扰素-α、-β和-γ；集落刺激因子(CSFs)，例如M-CSF、GM-CSF和G-CSF；白细胞介素(IL)，例如IL-1至IL-10；超氧化物歧化酶；T细胞受体；表面膜蛋白；衰变加速因子；病毒抗原，例如HIV包膜的部分；转运蛋白；归巢受体；地址素；调节蛋白；整联蛋白，如CDlla、CDllb、CDllc、CDI8、ICAM、VLA-4和VCAM；肿瘤相关抗原，如AFP、ALK、B7H4，BAGE蛋白、β-连环蛋白、brc-abl、BRCA1、BORIS、CA9(碳酸酐酶IX)、胱天蛋白酶-8、CD20、CD40、CD123、CDK4、CEA、CLEC12A、c-Kit、cMET、CTLA4、细胞周期蛋白-B1、CYP1B1、EGFR、EGFRvIII、内皮因子、Epcam、EphA2、ErbB2/HER2、ErbB3/HER3、ErbB4/HER4、ETV6-AML、Fra-1、FolRl、GAGE蛋白(例如，GAGE-1、GAGE-2)、GD2、GD3、GloboH、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3；GM3、gp100、Her2、HLA/B-raf、HLA/EBNA1、HLA/k-ras、HLA/MAGE-A3、hTERT、IGF1R、LGR5、LMP2、MAGE蛋白(例如MAGE-1、-2、-3、-4、-6和-12)、MART-1、间皮素、ML-IAP、Muc1、Muc16(CA-125)、MUM1、NA17、NGEP、NY-BR1、NY-BR62、NY-BR85、NY-ESO1、OX40、p15、p53、PAP、PAX3、PAX5、PCTA-1、PDGFR-α、PDGFR-β、PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C，PDGF-D，PLAC1，PRLR、PRAME、PSCA、PSGR、PSMA(FOLH1)、RAGE蛋白、Ras、RGS5、Rho、SART-1、SART-3、STEAP1、STEAP2、STn、存活素、TAG-72、TGF-β、TMPRSS2、Tn、TNFRSF17、TRP-1、TRP-2、酪氨酸酶和尿溶蛋白-3和本文列出的多肽的任一种的片段。
示例性抗原还包括、但不限于BCMA、SLAMF7、B7H4、GPNMB、UPK3A和LGR5。示例性抗原还包括、但不限于MUC16、PSMA、STEAP2和HER2。
在一些实施方案中，抗原包括促乳素受体(PRLR)或前列腺特异性膜抗原(PSMA)。在一些实施方案中，抗原包括MUC16。在一些实施方案中，抗原包括STEAP2。在一些实施方案中，抗原包括PSMA。在一些实施方案中，抗原包括HER2。在一些实施方案中，抗原为促乳素受体(PRLR)或前列腺特异性膜抗原(PSMA)。在一些实施方案中，抗原为MUC16。在一些实施方案中，抗原包括PSMA。在一些实施方案中，抗原为HER2。在一些实施方案中，抗原为STEAP2。
结合剂还包括锚蛋白复制蛋白、干扰素、淋巴因子如IL-2或IL-3、激素如胰岛素和糖皮质激素、生长因子如EGF、转铁蛋白、纤连蛋白III型等。
本文的一些实施方案是治疗或诊断用途的靶向特异性的。在一个实施方案中，制备结合剂以与定义为肿瘤抗原的抗原相互作用并结合，所述抗原包括对一种类型的肿瘤具有特异性的抗原或在特定类型的肿瘤上共享、过表达或修饰的抗原。实例包括：具有肺癌的α-辅肌动蛋白-4、具有黑素瘤的ARTC1、具有慢性骨髓性白血病的BCR-ABL融合蛋白、具有黑素瘤的B-RAF、CLPP或Cdc27、具有鳞状细胞癌的CASP-8和具有肾细胞癌的HSP70-2以及以下共有的肿瘤特异性抗原，例如：BAGE-1、GAGE、GNTV、KK-LC-1、MAGE-A2、NA88-A、TRP2-INT2。在一些实施方案中，抗原为PRLR或HER2。在一些实施方案中，所述抗体结合STEAP2、MUC16、EGFR、EGFRVIII、FGR2或PRLR。
适合于蛋白质-药物缀合物的抗-HER2抗体
在一些实施方案中，抗体为抗-HER2抗体。在一些实施方案中，抗体为曲妥珠单抗、培妥珠单抗(2C4)或马吉妥昔单抗(MGAH22)。在一些实施方案中，抗体为曲妥珠单抗。根据某些实施方案，本申请的蛋白质-药物缀合物(例如ADC)包含抗-HER2抗体。在一些实施方案中，抗体结合HER2，包括WO 2019/212965 A1中描述的那些。
适合于蛋白质-药物缀合物的抗-MSR1抗体
本申请的蛋白质-药物缀合物任选地包含抗-MSR1抗体，例如全长(例如IgG1或IgG4抗体)或抗原结合部分(例如Fab、F(ab′)2或scFv片段)，并且任选地被修饰以影响功能性，例如消除残留的效应子功能(Reddy等人，2000，J.Immunol.164：1925-1933)。
本文所述的抗体-药物缀合物的实施方案可以包含表1和2中列出的抗-MSR1抗体。表1列出了示例性抗-MSR1抗体的重链可变区(HCVR)、轻链可变区(LCVR)、重链互补决定区(HCDR1、HCDR2和HCDR3)和轻链互补决定区(LCDR1、LCDR2和LCDR3)的氨基酸序列标识符。表2列出了示例性抗-MSR1抗体的HCVR、LCVR、HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3的核酸序列识别符。
特异性结合MSR1的其它适合的抗体或其抗原结合片段包含HCVR和LCVR氨基酸序列对(HCVR/LCVR)，所述HCVR/LCVR包含与表1中列出的任何LCVR氨基酸序列配对的表1中列出的任何HCVR氨基酸序列。某些实施方案涉及包含抗体或其抗原结合片段的抗体-药物缀合物，所述抗体或其抗原结合片段包含表1中列出的任何示例性抗-MSR1抗体内所含的HCVR4LCVR氨基酸序列对。在一些实施方案中，HCVR/LCVR氨基酸序列对选自：2/10、23/42、50/58；90/98和282/290。
用于本文所述的抗体-药物缀合物的适合的抗体或其抗原结合片段包括特异性结合MSR1并包含重链CDR1(HCDR1)的那些抗体或其抗原结合片段，所述重链CDR1(HCDR1)包含选自表1中列出的任何HCDR1氨基酸序列的氨基酸序列或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上相似的序列。
特异性结合MSR1的其他适合的抗体或其抗原结合片段包含重链CDR2(HCDR2)，所述重链CDR2(HCDR2)包含选自以下的氨基酸序列：与表1中列出的任何HCDR2氨基酸序列或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上相似的序列。
特异性结合MSR1的其它适合的抗体或其抗原结合片段包含重链CDR3(HCDR3)，其包含选自表1中列出的任何HCDR3氨基酸序列的氨基酸序列或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本相似的序列。
用于本文所述的抗体-药物缀合物的适合的抗体或其抗原结合片段包括特异性结合MSR1并包含轻链CDR1(LCDR1)的那些，所述轻链CDR1(LCDR1)包含选自表1中列出的任何LCDR1氨基酸序列的氨基酸序列或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上相似的序列。
特异性结合MSR1的其他适合的抗体或其抗原结合片段包含轻链CDR2(LCDR2)，所述轻链CDR2(LCDR2)包含选自表1中列出的任何LCDR2氨基酸序列的氨基酸序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上相似的序列。
特异性结合MSR1的其它适合的抗体或其抗原结合片段包含轻链CDR3(LCDR3)，所述轻链CDR3(LCDR3)包含选自表1中列出的任何LCDR3氨基酸序列的氨基酸序列或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上相似的序列。
特异性结合MSR1的其它适合的抗体或其抗原结合片段包含HCDR3和LCDR3氨基酸序列对(HCDR3/LCDR3)，其包含与表1中列出的任何LCDR3氨基酸序列配对的表1中列出的任何HCDR3氨基酸序列。某些实施方案涉及抗体或其抗原结合片段，其包含在表1中列出的任何示例性抗-MSR1抗体内包含的HCDR3/LCDR3氨基酸序列对。在一些实施方案中，HCDR3/LCDR3氨基酸序列对选自：8/16、40/48、56/64；96/104和288/296。
用于本文所述的抗体-药物缀合物的适合的抗体或其抗原结合片段包括特异性结合MSR1并包含表1中列出的任何示例性抗-MSR1抗体中所含的一组六个CDR(即HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)的那些抗体或其抗原结合片段。在某些实施方案中，HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3氨基酸序列组选自：4-6-8-12-14-16；36-38-40-44-46-48；52-54-56-60-62-64；92-94-96-100-102-104和284-286-288-292-294-296。
在一个相关实施方案中，特异性结合MSR1的合适抗体或其抗原结合片段包含一组六个CDR(即，HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)，所述CDR包含在由表1中列出的任何示例性抗-MSR1抗体定义的HCVR/LCVR氨基酸序列对内。例如，本申请包括适合的抗体或其抗原结合片段，其特异性结合MSR1并且包含选自如下的HCVR/LCVR氨基酸序列对内包含的HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3氨基酸序列组：2/10、23/42、50/58、90/98和282/290。用于鉴定HCVR和LCVR氨基酸序列内的CDRs的方法和技术是本领域众所周知的，并且可以用于鉴定本文公开的指定HCVR和/或LCVR氨基酸序列内的CDR。可用于鉴定CDR边界的示例性规则包括例如Kabat定义、Chothia定义和AbM定义。一般而言，Kabat定义基于序列变异性，Chothia定义基于结构环区域的位置，且AbM定义是Kabat与Chothia方法之间的折衷。参见，例如Kabat，″Sequences ofProteins ofImmunological Interest，″NationalInstitutes of Health，Bethesda，Md.(1991)；A1-Lazikani等人，J.Mol.Biol.273：927-948(1997)；和Martin等人，Proc.Natl.Acad..Sci.USA86：9268-9272(1989)。公共数据库也可利用于鉴定抗体内的CDR序列。
本文还提供了编码抗-MSR1抗体或其部分的核酸分子，其用于制备本文所述的抗体-药物缀合物。例如，本文提供了编码表1中列出的任何HCVR氨基酸序列的核酸分子；在某些实施方案中，核酸分子可以包含选自表2中列出的任何HCVR核酸序列的多核苷酸序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性基本上相似的序列。
本文还提供了编码表1中列出的任何LCVR氨基酸序列的核酸分子；在某些实施方案中，核酸分子可以包含选自表2中列出的任何LCVR核酸序列的多核苷酸序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性基本上相似的序列。
本文还提供了编码表1中列出的任何HCDR1氨基酸序列的核酸分子；在某些实施方案中，核酸分子可以包含选自表2中列出的任何HCDR1核酸序列的多核苷酸序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少98％或至少99％的序列同一性基本上相似的序列。
本文还提供了编码表1中列出的任何HCDR2氨基酸序列的核酸分子；在某些实施方案中，核酸分子可以包含选自表2中列出的任何HCDR2核酸序列的多核苷酸序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性基本上相似的序列。
本文还提供了编码表1中列出的任何HCDR3氨基酸序列的核酸分子；在某些实施方案中，核酸分子可以包含选自表2中列出的任何HCDR3核酸序列的多核苷酸序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性基本上相似的序列。
本文还提供了编码表1中列出的任何LCDR1氨基酸序列的核酸分子；在某些实施方案中，核酸分子可以包含选自表2中列出的任何LCDR1核酸序列的多核苷酸序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性基本上相似的序列。
本文还提供了编码表1中列出的任何LCDR2氨基酸序列的核酸分子；在某些实施方案中，核酸分子可以包含选自表2中列出的任何LCDR2核酸序列的多核苷酸序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性基本上相似的序列。
本文还提供了编码表1中列出的任何LCDR3氨基酸序列的核酸分子；在某些实施方案中，核酸分子可以包含选自表2中列出的任何LCDR3核酸序列的多核苷酸序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性基本上相似的序列。
本文还提供了编码HCVR的核酸分子，其中HCVR可以包含一组三个CDR(即HCDR1-HCDR2-HCDR3)，其中HCDR1-HCDR2-HCDR3氨基酸序列组如表1中列出的任何示例性抗-MSR1抗体所定义。
本文还提供了编码LCVR的核酸分子，其中LCVR可以包含一组三个CDR(即LCDR1-LCDR2-LCDR3)，其中LCDR1-LCDR2-LCDR3氨基酸序列组如表1中列出的任何示例性抗-MSR1抗体所定义。
本文还提供了编码HCVR和LCVR的核酸分子，其中HCVR可以包含表1中列出的任何HCVR氨基酸序列的氨基酸序列，并且其中LCVR可以包含表1中列出的任何LCVR氨基酸序列的氨基酸序列。在某些实施方案中，核酸分子可以包含选自表2中列出的任何HCVR核酸序列的多核苷酸序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性基本上相似的序列，以及选自表2中列出的任何LCVR核酸序列的多核苷酸序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其基本上相似的序列。在根据本申请的此方面的某些实施方案中，核酸分子编码HCVR和LCVR，其中HCVR和LCVR均来源于表1中列出的相同抗-MSR1抗体，例如H1H21234N。
本文还提供了重组表达载体，其能够表达包含HER2或抗-MSR1抗体的重链或轻链可变区的多肽，用于制备本文所述的抗体-药物缀合物。例如，实施方案包括重组表达载体，其包含本文提及的任何核酸分子，即编码表1中列出的任何HCVR、LCVR和/或CDR序列的核酸分子。本申请的范围内还包括已导入这类载体的宿主细胞，以及通过在允许产生抗体或抗体片段的条件下培养宿主细胞并回收如此产生的抗体和抗体片段来产生用于制备本文所述的抗体-药物缀合物的抗体或其部分的方法。
用于本文所述的抗体-药物缀合物的适合的抗-MSR1抗体包括具有修饰的糖基化模式的那些。在一些实施方案中，修饰抗体以去除不期望的糖基化位点。在替代实施方案中，抗体缺乏寡糖链上存在的岩藻糖部分，例如，以增加抗体依赖性细胞毒性(ADCC)功能(参见Shield等人(2002)JBC 277：26733)。在其他实施方案中，改变半乳糖基化以改变补体依赖性细胞毒性(CDC)。
根据某些实施方案，本申请的抗体-药物缀合物包含抗-MSR1抗体，所述抗-MSR1抗体包含Fc结构域，所述Fc结构域包含一个或多个突变，所述突变例如在酸性pH下与中性pH相比增强或减少抗体与FcRn受体的结合。例如，本文提供了包含抗-MSR1抗体的抗体-药物缀合物，所述抗-MSR1抗体包含Fc结构域的CH2或CH3区中的突变，其中所述突变增加了在酸性环境中(例如内涵体中，其中pH范围约5.5-约6.0)Fc结构域对FcRn的亲和力。当施用于动物时，这类突变可以导致抗体的血清半衰期增加。这类Fc修饰的非限制性实例包括，例如在250(例如E或Q)；250和428(例如L或F)；252(例如L/Y/F/W或T)、254(例如S或T)和256(例如S/R/Q/E/D或T)位上的修饰；或在428和/或433(例如H/L/R/S/P/Q或K)和/或434(例如H/F或Y)位上的修饰；或在250和/或428位上的修饰；或在307或308(例如308F、V308F)和434位上的修饰。在一个实施方案中，修饰可以包含428L(例如M428L)和434S(例如N434S)修饰：428L、259I(例如V259I)和308F(例如V308F)修饰；433K(例如H433K)和434(例如434Y)修饰；252、254和256(例如252Y、254T和256E)修饰；250Q和428L修饰(例如T250Q和M428L)；和307和/或308修饰(例如308F或308P)。
例如，实施方案包括包含抗-MSR1抗体的抗体-药物缀合物，所述抗-MSR1抗体包含Fc结构域，所述Fc结构域包含选自如下的一对或多对突变或突变组：250Q和248L(例如T250Q和M248L)；252Y、254T和256E(例如M252Y、S254T和T256E)；428L和434S(例如M428L和N434S)；和433K和434F(例如H433K和N434F)。前述Fc结构域突变和本文公开的抗体可变结构域内的其他突变的所有可能组合都涵盖在本申请的范围内。
重链和轻链可变区氨基酸和核酸序列
表1列出了本文所述的所选抗-MSR1抗体的重链和轻链可变区和CDR的氨基酸序列标识符。相应的核酸序列标识符如表2中所示。
表1：氨基酸序列识别符
Figure BDA0004000531960000501
Figure BDA0004000531960000511
表2：核酸序列识别符
Figure BDA0004000531960000512
Figure BDA0004000531960000521
Figure BDA0004000531960000531
抗体在本文中典型地根据以下命名法提及：Fc前缀(例如″H1H，″″H2aM″等)，随后是数字识别符(例如″21227″、″21228″、″21231″等)，随后是″P″、″N″或″P2″后缀，如表1和2中所示。因此，根据该命名法，抗体在本文中可以称作例如“H1H21227N”、“H2aM21228N”、“H1H27729P”、“H1H27760P2”等。本文使用的抗体名称上的前缀表示抗体的特定Fc区同种型。特别地，“H1H”抗体具有人IgG1 Fc(所有可变区均为完全人的，如抗体名称中的第一个“H”所示)，而″H2aM″抗体具有小鼠IgG2a Fc。如本领域普通技术人员可以理解的，具有特定Fc同种型的抗体可以转化为具有不同Fc同种型的抗体(例如，具有小鼠IgG4Fc的抗体可以转化为具有人IgG1的抗体等)，但在任何情况下，可变结构域(包括CDR)-其由表1和2中所示的数字标识符指示-保持相同，并且无论Fc结构域的特性如何，预期结合特性是相同的或基本上相似的。
抗体修饰.本文所述的抗-MSR1抗体(例如，H1H21234N)用原始人Fcγ部分以及具有所有三种抗-MSR1抗体的N297Q单点突变的形式产生。本文所述的所有其他抗体均用人Fcγ部分中的N297Q单点突变制备。
在一些实施方案中，根据已知方法生产蛋白质药物缀合物，得到包含如式(B)中所示的要素的缀合物：
Figure BDA0004000531960000532
其中：BA为如本文所述的结合剂；Z包含如本文所述的狄尔斯-阿尔德加合物；D为如本文所述的治疗部分和/或成像剂部分，且d为1-10的整数。在某些实施方案中，式B的蛋白质-药物缀合化合物还可以包括本领域技术人员已知的另外的接头和间隔基。
在某些实施方案中，本申请提供了具有式(BI)的结构的蛋白质-药物缀合化合物：
Figure BDA0004000531960000533
其中：BA为如本文所述的结合剂；SP为如本文所述的任选的间隔基；Z包含如本文所述的狄尔斯-阿尔德加合物；L为本申请的接头；D为如本文所述的治疗部分和/或成像剂部分，且d为1-10的整数。
在某些实施方案中，本申请提供了具有式(BII)的结构的蛋白质-药物缀合化合物：
Figure BDA0004000531960000541
其中：BA为如本文所述的结合剂；SP不存在或为如本文所述的间隔基；L为本申请的接头；D为如本文所述的治疗部分和/或成像剂部分，且d为1-10的整数。
用于缀合至抗体残基或其抗原结合片段的技术和接头为本领域公知的。抗原用于本方面上下文中的示例性氨基酸，例加赖氨酸(参见例如US 5,208,020；US 2010/0129314；Hollander等人，Bioconjugate Chem.，2008，19：358-361；WO 2005/089808；US 5,714,586；US 2013/0101546；和US 2012/0585592)、半胱氨酸(参见例如US 2007/0258987；WO 2013/055993；WO 2013/055990；WO 2013/053873；WO 2013/053872；WO 2011/130598；US 2013/0101546；和US 7,750,116)、硒代半胱氨酸(参见例如WO 2008/122039；和Hofer等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，2008，105：12451-12456)、甲酰基甘氨酸(参见例如Carrico等人，Nat.Chem.Biol.，2007，3：321-322；Agarwal等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，2013，110：46-51，和Rabuka等人，Nat.Protocols，2012，10：1052-1067)、非天然氨基酸(参见例如WO 2013/068874和WO 2012/166559)和酸性氨基酸(参见例如WO 2012/05982)。赖氨酸缀合也可以通过NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)进行。接头还可以通过在硫醇之间形成碳桥而缀合至半胱氨酸残基，包括裂解的链间二硫键的半胱氨酸残基(参见例如US 9,951,141和US 9,950,076)。接头也可以通过与碳水化合物(参见例如US 2008/0305497，WO 2014/065661和Ryan等人，Food&Agriculture Immunol.，2001，13：127-130)和二硫化物接头(参见例如WO2013/085925、WO 2010/010324、WO 2011/018611和Shaunak等人，Nat.Chem.Biol.，2006，2：312-313)连接缀合至抗原-结合蛋白。位点特异性缀合技术也可用于指导与抗体或抗原结合蛋白的特定残基的缀合(参见例如Schumacher等人J Clin Immunol(2016)36(增刊1)：100)。在下文更详细讨论的具体实施方案中，位点特异性缀合技术包括通过转谷氨酰胺酶的谷氨酰胺缀合(参见例如Schibli，Angew Chemie Inter Ed.2010，49，9995)。
转谷酰胺酶介导的位点特异性缀合
在一些实施方案中，根据提供谷氨酰胺酰基修饰的蛋白质的已知方法产生蛋白质药物缀合物。用于缀合伯胺化合物的技术是本领域已知的。本文采用位点特异性缀合技术来使用通过转谷氨酰胺酶的谷氨酰胺缀合来指导与谷氨酰胺的缀合(参见，例如Schibli，Angew Chemie Inter Ed.2010，49，9995)。
本申请的含伯胺化合物可以通过基于转谷氨酰胺酶的化学-酶促缀合与一个或多个谷氨酰胺残基缀合(参见，例如Dennler等人，Protein Conjugate Chem.2014，25，569-578和WO 2017/147542)。例如，在转谷氨酰胺酶存在下，抗体的一个或多个谷氨酰胺残基可以与伯胺接头化合物偶联。简言之，在一些实施方案中，在酶转谷氨酰胺酶存在下，用伯胺化合物处理具有谷氨酰胺残基(例如Gln295，即Q295残基)的结合剂，下文更详细地描述。在某些实施方案中，结合剂是无糖基化的。在某些实施方案中，结合剂是去糖基化的。
在某些实施方案中，结合剂在至少一个多肽链序列中包含至少一个谷氨酰胺残基。在某些实施方案中，结合剂包含两条重链多肽，每条重链多肽具有一个Gln295残基。在进一步的实施方案中，结合剂在重链295以外的位点包含一个或多个谷氨酰胺残基。在一些实施方案中，结合剂(例如抗体)可以通过定向诱变的方法制备，以便在不导致抗体功能或结合丧失的位点插入谷氨酰胺残基的诱变。例如，本文包括携带如本文所述的Asn297Gln(N297Q)突变的抗体。在一些实施方案中，具有Gln295残基和/或N297Q突变的抗体在其可变区中包含一个或多个另外的天然存在的谷氨酰胺残基，其可以是转谷氨酰胺酶可及的，因此能够与接头或接头-有效负载缀合。示例性天然存在的谷氨酰胺残基可以在例如轻链的Q55处找到。在此类情况下，通过转谷氨酰胺酶缀合的结合剂(例如抗体)可以具有高于预期的DAR值(例如DAR高于4)。任何这样的抗体可以从天然或人工来源分离。
在本申请的某些实施方案中，DAR为1、2、3、4、5、6、7或8个药物分子/抗体。在一些实施方案中，DAR为1-8。在一些实施方案中，DAR为1-6。在某些实施方案中，DAR为2-4。在一些情况中，DAR为2-3。在某些情况中，DAR为0.5-3.5。在一些实施方案中，DAR约为1或约1.5或约2或约2.5或约3或约3.5。
伯胺化合物
可以用于转谷氨酰胺酶介导的包含谷氨酰胺残基的结合剂(例如抗体或抗原结合化合物)的偶联的伯胺化合物可以为本领域普通技术人员认为有用的任何伯胺。
反应性伯胺化合物
在某些实施方案中，伯胺化合物包含能够在转谷氨酰胺化后进一步反应的反应性基团。在这些实施方案中，谷氨酰胺酰基修饰的蛋白质(例如抗体)能够与如本文所公开的反应性有效负载化合物或反应性接头-有效负载化合物进一步反应，以形成蛋白质-有效负载缀合物。更具体地，反应性有效负载化合物或反应性连接体-有效负载化合物包含能够与伯胺化合物的反应性基团反应的反应性基团。在某些实施方案中，本申请的反应性基团包含能够进行狄尔斯-阿尔德环加成的部分。在某些实施方案中，反应性基团为二烯。在某些实施方案中，反应性基团为亲双烯体。在本申请的某些实施方案中，反应性基团与结合剂和转谷氨酰胺化反应条件相容。
在本申请的某些实施方案中，提供了反应性伯胺化合NH2-SP-W，其中SP为任选的并且包含间隔基；且W包含二烯或亲双烯体。在某些实施方案中，W包含如本文所定义的二烯(X)或亲双烯体(Y)。
二烯X
本申请的某些实施方案包含下式3或4的二烯部分X：
Figure BDA0004000531960000561
其中R为H或C1-3烷基；且Q为CH2，CH2CH2或O。
本申请的某些实施方案包含选自如下的结构的二烯部分X：
Figure BDA0004000531960000562
其中R为H或给电子基团。
本申请的某些非限制性实施方案包含选自如下的结构的含二烯部分X：
Figure BDA0004000531960000571
本申请的某些实施方案包含选自如下的结构的二烯部分X：
Figure BDA0004000531960000572
其中R每次出现时独立地为H或给电子基团。
本申请的某些实施方案包含选自如下的结构的二烯部分X：
Figure BDA0004000531960000573
本申请的某些实施方案包含选自如下的结构的二烯部分X：
Figure BDA0004000531960000574
本申请的某些实施方案包含如下结构之一的环戊二烯或甲基取代的环戊二烯：
Figure BDA0004000531960000581
在本申请的实施方案中，提供了反应性伯胺化合物NH2-SP-X，其中SP为任选的，且包含间隔基；且X为包含二烯的部分。
在本申请的某些实施方案中，提供了如下结构的反应性伯胺化合物：
Figure BDA0004000531960000582
其中R为H或C1-3烷基；且Q为CH2、CH2CH2或O。
在本申请的某些实施方案中，提供了如下结构的反应性伯胺化合物：
Figure BDA0004000531960000583
其中R为H或C1-3烷基，且Q为CH2、CH2CH2或O。
在本申请的某些实施方案中，提供了如下结构的反应性伯胺化合物：
Figure BDA0004000531960000591
在某些实施方案中，反应性伯胺化合物为如下结构之一或其混合物：
Figure BDA0004000531960000592
亲双烯体Y
本申请的某些实施方案包含下式5或6的亲双烯体部分：
Figure BDA0004000531960000593
其中：R′为H或C1-3烷基；J每次出现时独立地为CH或N；且K为CH、N、
Figure BDA0004000531960000594
或NH-N。
本申请的某些非限制性实施方案包含如下结构之一的亲双烯体部分Y：
Figure BDA0004000531960000595
本申请的某些实施方案包含如下结构之一的亲双烯体部分Y：
Figure BDA0004000531960000596
其中K为CH、N、
Figure BDA0004000531960000597
或NH-N.
本申请的某些实施方案包含如下结构之一的亲双烯体部分Y：
Figure BDA0004000531960000601
其中：J每次出现时独立地为CH或N。
本申请的某些非限制性实施方案包含如下结构之一的亲双烯体部分Y：
Figure BDA0004000531960000602
在某些实施方案中，亲双烯体部分包含式6a的马来酰亚胺：
Figure BDA0004000531960000603
在其他实施方案中，提供了反应性伯胺化合物NH2-SP-Y，其中SP为任选的，且包含间隔基；且Y为包含亲双烯体的部分。
在某些实施方案中，反应性伯胺化合物包含如下结构之一的亲双烯体：
Figure BDA0004000531960000604
其中：R′为H或C1-3烷基；J每次出现时独立地为CH或N；且K为CH、N、
Figure BDA0004000531960000605
或NH-N。
在某些实施方案中，反应性伯胺化合物包含如下结构之一的亲双烯体：
Figure BDA0004000531960000611
其中K为CH、N、
Figure BDA0004000531960000612
或NH-N.
在某些实施方案中，反应性伯胺化合物包含如下结构之一的亲双烯体：
Figure BDA0004000531960000613
在某些实施方案中，反应性伯胺化合物包含如下结构的马来酰亚胺：
Figure BDA0004000531960000614
间隔基SP
在本文所述的某些实施方案中，SP任选地存在并且包含间隔基，其选自-(CH2)u-、-((CH2)u-O-)v-、-NH-、-C(O)-及其组合，其中下标u和v每次出现时独立地为1-20的整数，且其中间隔基连续性可以正向配置，例如H2N-((CH2)u-O-)v-W，或反向配置，例如H2N-(-O-(CH2)u)v-W。
在某些实施方案中，SP包含一个连接基团，其与一个二烯或一个亲双烯体或一个狄尔斯-阿尔德加合物共价键合。这类SP称作“直链的”。
在其他实施方案中，SP包含两个连接基团，它们与两个二烯或亲双烯体或两个狄尔斯-阿尔德加合物共价键合。在其他实施方案中，SP包含三个连接基团，它们与三个二烯或亲双烯体或三个狄尔斯-阿尔德加合物共价键合。这类SP称作“支链的”。
在一个实施方案中，SP共价键合至一个二烯。在一个实施方案中，SP共价键合至一个狄尔斯-阿尔德加合物。
在一个实施方案中，SP共价键合至两个二烯。在一个实施方案中，SP共价键合至两个狄尔斯-阿尔德加合物。在这种情况下，SP可以键合至两个二烯或狄尔斯-阿尔德加合物，它们彼此可以相同或不同。在一个实施方案中，SP键合至两个不同二烯。在另一个实施方案中，SP键合至两个不同狄尔斯-阿尔德加合物。
支链SP的实例包括、但不限于
Figure BDA0004000531960000621
Figure BDA0004000531960000622
Figure BDA0004000531960000623
其中下标u、v、w和x独立地为0-20的整数。
在本申请的某些实施方案中，SP包含选自如下的间隔基：-(CH2)u-、C(O)-、-NH-、-(CH2)u-NH-C(O)-、-(CH2)u-C(O)-NH-、-(CH2)u-C(O)-NH-(CH2)v-、-(CH2-CH2-O)v-、-(CH2)u-(O-CH2-CH2)v-C(O)-NH-、-(CH2-CH2-O)v-(CH2)u-C(O)-NH-(CH2)u-、-NH-(CH2)u-、-NH-(CH2)u-C(O)-、-NH-(CH2)u-C(O)-NH-(CH2)v-、-NH-(CH2-CH2-O)v-、-NH-(CH2-CH2-O)v-C(O)-、-NH-(CH2-CH2-O)v-(CH2)u-、-NH-(CH2-CH2-O)v-(CH2)u-C(O)-、-NH-(CH2-CH2-O)v-(CH2)u-C(O)-NH-(CH2)u-、-(CH2)u-NH-C(O)-、-(CH2)u-C(O)-NH-(CH2-CH2-O)v-C(O)-NH-、-NH-(CH2)u-C(O)-NH-、
Figure BDA0004000531960000631
Figure BDA0004000531960000632
及其组合；其中下标u、v、w和x独立地为0-20的整数。
在本申请的某些实施方案中，SP为-(CH2)2-。
在具体的实施方案中，SP为具有1-20个PEG单体的二价聚乙二醇(PEG)基团。如本文所用，“PEG#”是指通过末端氧原子和末端碳原子理解的二价乙二醇部分，其中#为1-100。例如，当#为1时，PEG 1为-OCH2CH2-或-CH2CH2O-；当#为2时，PEG 2为-OCH2CH2-OCH2CH2-或-CH2CH2O-CH2CH2O-；且当#为3时，PEG 3为-OCH2CH2-OCH2CH2-OCH2CH2-或-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-。在某些实施方案中，SP为包含8个PEG单体的PEG 8。
在某些实施方案中，伯胺-间隔基化合物为下式之一：
H2N-(CH2)u-W；H2N-(CH2CH2O)v-(CH2)u-W；H2N-(CH2)u-N(H)C(O)-(CH2)u’-W；
H2N-(CH2CH2O)v-N(H)C(O)-(CH2CH2O)v’-(CH2)u-W；H2N-(CH2)u-C(O)N(H)-(CH2)u’-W；H2N-(CH2CH2O)v-C(O)N(H)-(CH2CH2O)v-(CH2)u-W；H2N-(CH2)u-N(H)C(O)-(CH2CH2O)v-(CH2)u’-W；
H2N-(CH2CH2O)v-N(H)C(O)-(CH2)u-W；H2N-(CH2)u-C(O)N(H)-(CH2CH2O)v-(CH2)u’-W；和H2N-(CH2CH2O)v-C(O)N(H)-(CH2)u-W；其中下标u、u’、v和v’各自独立地为选自1-12的整数，且W包含如上文所定义的二烯(X)或亲双烯体(Y)。
在某些实施方案中，伯胺-间隔基化合物选自如下：
H2N-(CH2)(1-8)-W；H2N-(CH2CH2O)(1-8)-(CH2)(0-2)-W；
H2N-(CH2)(1-8)-N(H)C(O)-(CH2)(0-8)-W；H2N-(CH2CH2O)(1-8)-N(H)C(O)-(CH2CH2O)(0-8)-(CH2)(0-2)-W；H2N-(CH2)(1-8)-C(O)N(H)-(CH2)(0-8)-W；H2N-(CH2CH2O)(1-8)-C(O)N(H)-(CH2CH2O)(0-8)-(CH2)(0-2)-W；H2N-(CH2)(1-8)-N(H)C(O)-(CH2CH2O)(0-8)-(CH2)(0-2)-W；H2N-(CH2CH2O)(0-8)-N(H)C(O)-(CH2)(0-8)-W；H2N-(CH2)(0-8)-C(O)N(H)-(CH2CH2O)(0-8)-(CH2)(0-2)-W；和
H2N-(CH2CH2O)(0-8)-C(O)N(H)-(CH2)(0-8)-W；
其中W包含如上文所定义的二烯(X)或亲双烯体(Y)。
在某些实施方案中，任一的烷基或亚烷基(即-CH2-)可以任选地被例如C1-8烷基、甲基甲酰基或-SO3H取代。在某些实施方案中，烷基未被取代。
谷氨酰胺酰基-修饰的蛋白质
本文提供了谷氨酰胺酰基-修饰的蛋白质，例如抗体，其包含与一种或多种如本文所定义的反应性伯胺化合物缀合的结合剂。
在某些实施方案中，使无糖基化抗体接触本申请的反应性伯胺化合物，以产生如本文更详细描述的谷氨酰胺酰基-修饰的抗体。在某些实施方案中，去糖基化抗体与反应性伯胺化合物反应，产生谷氨酰胺酰基-修饰的抗体。出于本说明书的目的。可以从任何来源或通过本领域技术人员认为适合的任何技术得到或生产去糖基化抗体。在某些实施方案中，根据如下步骤(1)使抗体去糖基化。在其他实施方案中，去糖基化或无糖基化抗体包含至少一个谷氨酰胺残基是足够的，其完全不含干扰糖基化或其他结构，可利用于与转谷氨酰胺酶反应，如下所述。
反应性伯胺化合物可以为伯胺，其能够与谷氨酰胺残基在转谷酰胺酶存在下形成共价键，并且包含反应性基团W(包括X和z)，如下所述。有用的伯胺如本文章节中所述。
在某些实施方案中，本申请的谷氨酰胺酰基-修饰的蛋白质(例如抗体)具有式(V-W)的结构：
Figure BDA0004000531960000641
其中：BA为结合剂；SP不存在或为间隔基；W为包含亲双烯体的部分，且l为1-10的整数。
在某些实施方案中，本申请的反应性谷氨酰胺酰基-修饰的蛋白质(例如抗体)具有式(V-X)的结构：
Figure BDA0004000531960000651
其中：BA为结合剂；SP不存在或为间隔基；X为包含二烯的部分，且l为1-10的整数。
在某些实施方案中，本申请的反应性谷氨酰胺酰基-修饰的蛋白质(例如抗体)具有式(V-Y)的结构：
Figure BDA0004000531960000652
其中：BA为结合剂；SP不存在或为间隔基；Y为包含亲双烯体的部分，且l为1-10的整数。
在某些实施方案中，本申请的反应性谷氨酰胺酰基-修饰的蛋白质(例如抗体)具有式(V-X1)的结构：
Figure BDA0004000531960000653
其中：BA为结合剂；且l为1-10的整数。在某些实施方案中，BA为曲妥珠单抗。在某些实施方案中，BA为抗-MSR1抗体，例如H1H21234N。
在某些实施方案中，本申请的反应性谷氨酰胺酰基-修饰的蛋白质(例如抗体)具有式(V-X2)的结构：
Figure BDA0004000531960000654
其中：BA为结合剂，且l和n独立地为1-10的整数。在某些实施方案中，BA为曲妥珠单抗。在某些实施方案中，BA为抗-MSR1抗体，例如H1H21234N。
在某些实施方案中，本申请的反应性谷氨酰胺酰基-修饰的蛋白质(例如抗体)具有式(V-X3)的结构：
Figure BDA0004000531960000661
其中：BA为结合剂，且l和n独立地为1-10的整数。在某些实施方案中，BA为曲妥珠单抗。在某些实施方案中，BA为抗-MSR1抗体，例如H1H21234N。
在某些实施方案中，本申请的反应性谷氨酰胺酰基-修饰的蛋白质(例如抗体)具有式(V-X4)的结构：
Figure BDA0004000531960000662
其中：BA为结合剂，且l和n独立地为1-10的整数。在某些实施方案中，BA为曲妥珠单抗。在某些实施方案中，BA为抗-MSR1抗体，例如H1H21234N。
在本申请的某些实施方案中，接头-抗体比或LAR(例如在如下情况中缩写为字母“l”，例如在上述式V-W、V-X和V-Y中)为1、2、3、4、5、6、7或8个药物分子/抗体。在一些实施方案中，LAR为1-8。在一些实施方案中，LAR为1-6。在某些实施方案中，LAR为2-4。在一些情况中，LAR为2-3。在某些情况中，LAR为0.5-3.5。在一些实施方案中，LAR约为1或约1.5或约2或约2.5或约3或约3.5。
在本申请的某些实施方案中，l为1-10、1-9、1-8、1-7、1-6、1-5、1-4、1-3、1-2、2-10、2-9、2-8、2-7、2-6、2-5、2-4、2-3、3-10、3-9、3-8、3-7、3-6、3-5、3-4、4-10、4-9、4-8、4-7、4-6或4-5的整数。在某些实施方案中，l为1-4、1-3、1-2、2-4、2-3或3-4的整数。在某些实施方案中，l为2。在某些实施方案中，d为3。在某些实施方案中，l为4。在一些实施方案中，l为4。
在某些实施方案中，BA可以包含两个或四个谷氨酰胺残基。在某些实施方案中，BA可以包含Q295残基。在某些实施方案中，BA可以包含N297Q突变。在某些实施方案中，BA可以包含Q295和N297Q。在这类实施方案中，因为BA可以为二聚化的，所以对于具有反应性伯胺化合物的转谷酰胺酶，BA具有四个谷氨酰胺残基。在这类实施方案中，l为1-4。在某些实施方案中，l为2。在某些实施方案中，l为3。在某些实施方案中，l为4。
式(IV-X)的反应性谷氨酰胺酰基-修饰的蛋白质(例如抗体)是有用的，例如用于与反应性接头-有效负载分子，例如Y-L-D进行狄尔斯-阿尔德环加成反应，形成蛋白质-药物缀合物。
式(IV-Y)的反应性谷氨酰胺酰基-修饰的蛋白质(例如抗体)是有用的，例如用于与反应性接头-有效负载分子，例如X-L-D进行狄尔斯-阿尔德环加成反应，形成蛋白质-药物缀合物。
反应性接头-有效负载化合物
在一些实施方案中，反应性接头-有效负载化合物为式W-L-D的化合物，其中反应性接头-有效负载化合物包含二价接头L、反应性基团W和有效负载D，其中W能够与如本文所述的谷氨酰胺酰基-修饰的蛋白质(例如抗体)的反应性基团反应。如所述的，本申请包括包含下列步骤的方法，使反应性谷氨酰胺酰基-修饰的蛋白质(例如BA-[Gln-NH-SP-W]l)与反应性接头-有效负载化合物(例如W-L-D)接触，形成如本文所述的蛋白质-药物缀合物(例如BA-[Gln-NH-SP-Z-L-D]d)。
在某些实施方案中，本申请的反应性接头-有效负载化合物包含如本文部分中所定义的二烯(X)。在某些实施方案中，反应性接头-有效负载化合物包含亲双烯体(Y)如本文部分中所定义。
在本申请的某些实施方案中，反应性接头-有效负载具有如下结构：
Figure BDA0004000531960000671
其中R为H或给电子基团；且Q为CH2，CH2CH2或O；其中L为如本文所定义的接头，且D为如本文所定义的治疗部分和/或成像剂部分。
在本申请的某些实施方案中，反应性接头-有效负载具有如下结构：
Figure BDA0004000531960000672
其中R为H或C1-3烷基，且Q为CH2、CH2CH2或O；其中L为如本文所定义的接头，且D为如本文所定义的治疗部分和/或成像剂部分。
在某些实施方案中，反应性接头-有效负载化合物为如下结构之一：
Figure BDA0004000531960000681
其中L为如本文所定义的接头，且D为如本文所定义的治疗部分和/或成像剂部分。
在某些实施方案中，反应性接头-有效负载化合物为如下结构之一或其混合物：
Figure BDA0004000531960000682
其中L为如本文所定义的接头，且D为如本文所定义的治疗部分和/或成像剂部分。
在某些实施方案中，反应性接头-有效负载化合物为如下结构之一：
Figure BDA0004000531960000683
其中：R′为H或C1-3烷基；J每次出现时独立地为CH或N；且K为CH、N、
Figure BDA0004000531960000684
或NH-N；其中L为如本文所定义的接头，且D为如本文所定义的治疗部分和/或成像剂部分，
在某些实施方案中，反应性接头-有效负载化合物为如下结构之一：
Figure BDA0004000531960000685
其中K为CH、N、
Figure BDA0004000531960000686
或NH-N；其中L为如本文所定义的接头，且D为如本文所定义的治疗部分和/或成像剂部分，
在某些实施方案中，反应性接头-有效负载化合物为如下结构之一：
Figure BDA0004000531960000692
其中L为如本文所定义的接头，且D为如本文所定义的部分。
在某些实施方案中，反应性接头-有效负载化合物包含马来酰亚胺部分。在某些实施方案中，反应性接头-有效负载化合物为如下结构：
Figure BDA0004000531960000693
其中L为如本文所定义的接头，且D为如本文所定义的部分。
接头
如本文所用，“接头”或“连接单元”是指如本文所述，使反应性基团，例如W、X或Y或狄尔斯-阿尔德加合物Z共价连接至一个或多个治疗部分D的任何二价部分-L-。通常，用于本文所述的抗体缀合物和治疗部分的合适接头为足够稳定以利用抗体的循环半衰期并且同时能够在抗原介导的缀合物摄入后释放其有效负载的那些。通常，接头还可以包括本文所述的任何间隔基。
接头可以是可裂解的或不可裂解的。可裂解的接头包括在摄入后通过胞内代谢裂解的接头，例如通过水解、还原或酶促反应裂解。不可裂解的接头包括在摄入后通过抗体的溶酶体降解释放连接的有效负载的接头。
在一些实施方案中，适合的接头包括但不限于酸不稳定接头、水解不稳定接头、酶可裂解接头、还原不稳定接头、自分解接头和不可裂解接头。在某些实施方案中，接头为可裂解接头。根据其他实施方案，接头为不可裂解的接头。
适合的接头还包括但不限于是或包含一个或多个氨基酸、葡糖醛酸苷、琥珀酰亚胺-硫醚、聚乙二醇(PEG)单元、腙、马来酰基单元、二肽单元、缬氨酸-瓜氨酸单元、缬氨酸-丙氨酸单元和对氨基苄基单元的那些。本领域已知的任何接头分子或接头技术可用于产生或构建本申请的ADC。可在本申请的上下文中使用的示例性接头包括包含以下或由以下组成的接头：例如，MC(6-马来酰亚胺基己酰基)、MP(马来酰亚胺基丙酰基)、val-cit(缬氨酸-瓜氨酸)、val-ala(缬氨酸-丙氨酸)、val-gly(缬氨酸-甘氨酸)、蛋白酶可切割的接头中的二肽位点、Ala-Phe(丙氨酸-苯丙氨酸)、蛋白酶可切割的接头中的二肽位点、对氨基苄基、对氨基苄氧基羰基、SPP(N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶硫基)戊酸酯)、SMCC(N-琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯)、SIAB(N-琥珀酰亚胺基(4-碘-乙酰基)氨基苯甲酸酯)及其变体和组合。在例如US 7,754,881和Ducry，Bioconjugate Chem.，2010，21：5-13以及其中引用的参考文献中提供了可以在本申请的上下文中使用的接头的另外的实例，其内容通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，接头包含一种或多种氨基酸。适合的氨基酸包括天然的、非天然的、标准的、非标准的、蛋白原的、非蛋白原的和L-或D-α-氨基酸。在一些实施方案中，接头包含丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸或瓜氨酸、其衍生物或其组合。
在一些实施方案中，接头包含两个或多个氨基酸，也称作肽。在某些实施方案中，接头包含两个氨基酸，也称作二肽，其选自缬氨酸-瓜氨酸、瓜氨酸-缬氨酸、赖氨酸-苯丙氨酸、苯丙氨酸-赖氨酸、缬氨酸-天冬酰胺、天冬酰胺-缬氨酸、苏氨酸-天冬酰胺、丝氨酸-天冬酰胺、天冬酰胺-丝氨酸、苯丙氨酸-天冬酰胺、天冬酰胺-苯丙氨酸、亮氨酸-天冬酰胺、天冬酰胺-亮氨酸、异亮氨酸-天冬酰胺、天冬酰胺-异亮氨酸、甘氨酸-天冬酰胺、天冬酰胺-甘氨酸、谷氨酸-天冬酰胺、天冬酰胺-谷氨酸、瓜氨酸-天冬酰胺、天冬酰胺-瓜氨酸、丙氨酸-天冬酰胺和天冬酰胺-丙氨酸。在某些实施方案中，肽是缬氨酸-瓜氨酸；瓜氨酸-缬氨酸；缬氨酸-丙氨酸；丙氨酸-缬氨酸：缬氨酸-甘氨酸或甘氨酸-缬氨酸。在一些实施方案中，接头包含缬氨酸和瓜氨酸。在一些实施方案中，接头包含缬氨酸和丙氨酸。
在某些实施方案中，接头包含氨基酸或肽和一个或多个选自如下的基团：-NH-、-S-、-O-、-(CH2)n-、-(CH2-CH2-O-)m-、-C(O)-、-NH-CH2-O-CH2-C(＝O)-NH-、
Figure BDA0004000531960000711
Figure BDA0004000531960000712
其中下标n和m独立地为0-20的整数。
在其他实施方案中，接头包含氨基酸或肽和选自如下的一个或多个基团：-(CH2)n-NH-C(O)-、-(CH2)n-C(O)-NH-、-(CH2-CH2-O)m-、-(CH2)n-(O-CH2-CH2)m-C(O)-NH-、-NH-(CH2)n-、-NH-(CH2)n-C(O)-、-NH-(CH2-CH2-O)m-、-NH-(CH2-CH2-O)m-C(O)-、-NH-(CH2-CH2-O)m-(CH2)n-、-NH-(CH2-CH2-O)m-(CH2)n-C(O)-、-(CH2)n-NH-C(O)-、-NH-(CH2)n-C(O)-NH-、-NH-CH2-O-CH2-C(＝O)-NH-及其组合；其中下标n和m独立地为0-20的整数。在某些实施方案中，下标n和m独立地为1-10的整数。在某些实施方案中，下标n和m独立地为1-5的整数。
在一些实施方案中，接头包含自裂解基团。自裂解基团可以为本领域技术人员公知的任何这类基团。在具体的实施方案中，自裂解基团为
Figure BDA0004000531960000713
(对-氨基苄基或PAB)或其衍生物。有用的衍生物包括
Figure BDA0004000531960000714
(对-氨基苄氧基羰基或PABC)。本领域技术人员认识到自裂解基团能够进行化学反应，所述化学反应从有效负载(即，治疗部分或成像剂部分)释放接头的剩余原子。如本文所用，术语“自裂解接头”是指能够将两个化学部分共价连接在一起的化学部分。在一些实施方案中，如果其与第一部分的键被裂解，则接头将与治疗部分或成像剂部分分离。在某些实施方案中，自裂解部分连接治疗部分(例如药物)和接头的二肽单元。在胞内酶裂解肽序列时，自裂解部分使其自身从药物部分裂解，使得药物部分处于未衍生和活性形式。
PAB和PABC接头单元也称作电子级联间隔基。连接肽单元的羧基末端和PAB的对氨基苄基的酰胺键可以为底物并且可被某些蛋白酶裂解。芳族胺变成给电子的并引发导致离去基排出的电子级联，其在消除二氧化碳后释放游离药物(de Groot等人(2001)Journalof Organic Chemistry 66(26)：8815-8830)。在与PAB/PABC相邻的肽键裂解(即通过胞内酶)后，药物从配体释放，由此不结合接头的剩余部分(de Groot等人(2002)MolecularCancer Therapeutics 1(11)：901-911；de Groot等人(1999)J.Med.Chem.42(25)：5277-5283)。
在一些实施方案中，包含氨基酸或肽的接头可以被一种或多种酶(包括癌症或肿瘤相关蛋白酶)酶促裂解，以释放部分(-D)，其在一个实施方案中在释放时在体内质子化以提供治疗部分。在某些实施方案中，所述一种或多种氨基酸或肽包含天然氨基酸。在其他实施方案中，氨基酸或肽包含非天然氨基酸。
在某些实施方案中，接头包含选自如下的结构：
Figure BDA0004000531960000721
Figure BDA0004000531960000731
在某些实施方案中，接头包含选自如下的结构：
Figure BDA0004000531960000732
在某些实施方案中，部分D包含氨基，该氨基是与接头L的连接点。这类部分可以表示为DN。在本申请包含DN的某些实施方案中，氨基与接头中的自裂解部分连接。
在本申请的某些实施方案中，反应性接头-有效负载化合物为如下结构，其中表示为DN的部分包含作为与接头的连接点的氨基：
Figure BDA0004000531960000733
在式(III-A)的反应性接头-有效负载化合物的另外的实施方案中，DN为美登素类化合物、或美登素类化合物类似物。
在本申请的某些实施方案中，反应性接头-有效负载化合物为如下结构，其中表示为DN的部分包含作为与接头的连接点的氨基：
Figure BDA0004000531960000741
在式(III-B)的反应性接头-有效负载化合物的另外的实施方案中，DN为吡咯并苯并二氮杂卓(PBD)或其类似物或衍生物。在一个实施方案中，DN为PBD-1。
在本申请的某些实施方案中，反应性接头-有效负载化合物为如下结构，其中表示为DN的部分包含作为与接头的连接点的氨基：
Figure BDA0004000531960000742
在式(III-C)的反应性接头-有效负载化合物的另外的实施方案中，DN为利福霉素或其类似物或衍生物。
在一些实施方案中，本文所述的有效负载DN(例如利福霉素类似物)包含叔胺，其中叔胺中的氮原子为有效负载通过其与接头键合的原子。在这种情况下，与有效负载的叔胺键合在接头-有效负载分子中产生季胺。季胺上的正电荷可以通过抗衡离子(例如氯、溴、碘或任何其他合适带电的部分，例如本文所述的那些)平衡。
这样的实例包括这样的实施方案，其中反应性接头-有效负载分子包含利福霉素类似物并且具有下式(III-C1)：
Figure BDA0004000531960000743
Figure BDA0004000531960000744
本文也称作mal-PEG8-VC-PABQ-Rifanalog。
在某些实施方案中，当PAB部分连接至对于形成季铵的治疗部分和/或成像剂部分有利的仲胺氮时，如(III-C1)中所示例的，接头称作PABQ接头。
在具有本文所述的有效负载DN(例如MMAE)的一些实施方案中，反应性接头-有效负载分子具有下式(III-A1)：
Figure BDA0004000531960000751
在具有本文所述的有效负载DN(例如PBD-1)的一些实施方案中，反应性接头-有效负载分子具有下式(III-B1)：
Figure BDA0004000531960000752
在某些实施方案中，本申请提供了具有式(I-N)的结构的蛋白质-药物缀合物：
Figure BDA0004000531960000753
其中：BA为如本文所述的结合剂；Gln为谷氨酰胺残基；SP为如本文所述的任选的间隔基；Z包含如本文所述的狄尔斯-阿尔德加合物；L为本申请的接头；DN为包含作为与接头L的连接点的氨基的治疗部分和/或成像剂部分，且d为1-10的整数。
在某些实施方案中，本申请提供了具有式(IV-N)的结构的蛋白质-药物缀合物：
Figure BDA0004000531960000754
其中：BA为如本文所述的结合剂；Gln为谷氨酰胺残基；SP为如本文所述的任选的间隔基；Z包含如本文所述的狄尔斯-阿尔德加合物；L为本申请的接头；DN为包含作为与接头L的连接点的氨基的治疗部分和/或成像剂部分，且d为1-10的整数。
在一些实施方案中，片段
Figure BDA0004000531960000755
具有式(IV-NA)：
Figure BDA0004000531960000761
其中
Figure BDA0004000531960000762
为与任选的间隔基或结合剂片段的键。
在式(IV-NA)反应性接头-有效负载化合物的另外的实施方案中，DN为美登素类化合物或如本文所述的美登素类化合物类似物
在一些实施方案中，片段
Figure BDA0004000531960000763
具有式(IV-NA1)：
Figure BDA0004000531960000764
在一些实施方案中，片段
Figure BDA0004000531960000765
具有式(IV-NB)：
Figure BDA0004000531960000766
其中
Figure BDA0004000531960000767
为与任选的间隔基或结合剂片段的键。
在式(IV-NB)反应性接头-有效负载化合物的另外的实施方案中，DN为吡咯并苯并二氮杂卓(PBD)或其如本文所述的类似物或衍生物。在一个实施方案中，DN为PBD-1。
在一些实施方案中，片段
Figure BDA0004000531960000768
具有式(IV-NB1)：
Figure BDA0004000531960000769
Figure BDA00040005319600007611
其中
Figure BDA00040005319600007610
为与任选的间隔基或结合剂片段的键。
在一些实施方案中，片段
Figure BDA0004000531960000771
具有式(IV-NC)：
Figure BDA0004000531960000772
Figure BDA00040005319600007710
其中
Figure BDA0004000531960000773
为与任选的间隔基或结合剂片段的键。
在式(IV-NC)反应性接头-有效负载化合物的另外的实施方案中，DN为利福霉素或其如本文所述的类似物或衍生物。
在一些实施方案中，片段
Figure BDA0004000531960000774
具有式(IV-NC1)：
Figure BDA0004000531960000775
其中
Figure BDA0004000531960000776
为与间隔基或结合剂的键。
在一些实施方案中，片段
Figure BDA0004000531960000777
具有式(IV-NC2)：
Figure BDA0004000531960000778
其中
Figure BDA0004000531960000779
为与间隔基或结合剂的键。
治疗部分-D
在本申请的实施方案中，D可以是被认为有用的任何治疗剂和/或显像剂部分。在一个方面，治疗部分为导致抑制、延迟、减少和/或阻止细胞生长的化合物。治疗部分还可以通过坏死或凋亡导致细胞死亡。
用于本文所述缀合物化合物的示例性治疗部分包括：多拉司他汀及其肽类似物和衍生物，奥瑞他汀，其为已经显示具有抗癌和抗真菌活性的高效抗有丝分裂剂。参见，例如，美国专利号No.5,663,149和Pettit等人，Antimicrob.Agents Chemother.42：2961-2965(1998)。示例性多拉司他汀和溴瑞他汀包括但不限于溴瑞他汀E、溴瑞他汀EB(AEB)、澳瑞他汀EFP(AEFP)、一甲基澳瑞他汀F(MMAF)、一甲基澳瑞他汀-D(MMAD)、单甲基澳瑞他汀E(MMAE)和5-苯甲酰基戊酸-AE酯(AEVB)。在某些实施方案中，所述多拉司他汀衍生物或类似物为MMAF。
用于本文所述缀合物化合物的示例性治疗部分包括：美登素类化合物(例如DM1、DM4等)、澳瑞他汀(例如MMAE、MMAD、MMAF等)、多卡米星(例如MGBA)、多拉司他汀、类毒素和其他化学治疗有效的药物。
在一个实施方案中，治疗部分为美登素类化合物或美登素类化合物类似物。用于本文的示例性美登素类化合物描述在Widdison等人，J.Med.Chem.，2006，49，4392-4408中，其出于所有目的通过引用并入本文。
在某些实施方案中，所述治疗部分为DM1(含硫醇的美登素类化合物抗微管剂)。
可以在所提供的蛋白质-药物缀合物的上下文中使用的治疗部分D的其他具体实例包括例如1-脱氢睾酮、2-吡咯烷多柔比星、5-氟尿嘧啶、6-巯嘌呤、6-硫鸟嘌呤、放线菌素D、蒽环霉素、安曲霉素(AMC)、博来霉素、白消安、加利车霉素、卡莫司汀、顺铂、秋水仙素、氰基吗啉代-多柔比星、环磷酰胺、阿糖胞苷、细胞松弛素B、更生霉素、柔红霉素、达卡巴嗪、二溴甘露醇、二羟基蒽二酮、多柔比星、依米丁、表柔比星、溴化乙锭、依托泊苷、短杆菌肽D、糖皮质激素、利多卡因、洛莫司汀(CCNU)、氮芥、美法仑、甲氨蝶呤、光辉霉素、丝裂霉素、米托蒽醌、吗啉代-多柔比星、普鲁卡因、普萘洛尔、嘌呤霉素、吡咯并苯并二氮杂吖庚因(pyrrolobenzodiazapine)、西伯利亚霉素、链脲霉素、紫杉醇、替尼泊苷、丁卡因、塞替派苯丁酸氮芥、单端孢霉烯、tubulysin、长春新碱，以及上述任何化合物的立体异构体、电子等排体、类似物或衍生物。
在本申请的某些实施方案中，治疗部分D包含细胞毒性剂。细胞毒性剂包括对细胞的生长、活力或繁殖有害的任何活性剂，包括但不限于微管蛋白相互作用剂和DNA损伤剂。根据本申请内容的该方面，可以与抗-HER2抗体或抗-MSR1抗体缀合的适合的细胞毒性剂和化学治疗剂的实例包括例如1-(2-氯乙基)-1，2-二甲磺酰肼、1，8-二羟基-双环[7.3.1]十三碳-4，9-二烯-2，6-二炔-13-酮、1-脱氢睾酮、5-氟尿嘧啶、6-巯嘌呤、6-硫鸟嘌呤、9-氨基喜树碱、放线菌素D、鹅膏亭、氨基蝶呤、安吉苷、蒽环霉素、安曲霉素(AMC)、澳瑞他汀、博来霉素、白消安、丁酸、加利车霉素(例如，加利车霉素g1)、喜树碱、洋红霉素、卡莫司汀、西马多丁、顺铂、秋水仙碱、考布他汀、环磷酰胺、阿糖胞苷、细胞松弛素B、柔红霉素、达卡巴嗪、二乙酰氧基戊基多柔比星、二溴甘露醇、二羟基蒽二酮、地索拉唑、多拉司他汀(例如多拉司他汀10)、多柔比星、多卡米星、棘霉素、eleutherobins、依米丁、埃坡霉素、埃斯波霉素、雌莫司汀、溴化乙锭、依托泊苷、氟尿嘧啶、格尔德霉素、短杆菌肽D、糖皮质激素、伊立替康、驱动蛋白纺锤体蛋白(KSP)抑制剂、来普霉素、亮氨酸、利多卡因、洛莫司汀(CCNU)、美登素类化合物、氮芥、美法仑、巯基嘌呤、甲蝶呤、甲氨蝶呤、光辉霉素、丝裂霉素、米托蒽醌、N8-乙酰基亚精胺、鬼臼毒素、普鲁卡因、普萘洛尔、蝶啶、嘌呤霉素、吡咯并苯并二氮杂卓(PBD)、根霉素、链脲霉素、太利苏霉素、泰素、替尼泊苷、丁卡因、塞替派苯丁酸氮芥、托马霉素、托泊替康、tubulysin、长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨和任一上述化合物的衍生物。
在某些实施方案中，D为选自美登素类化合物、tubulysin、澳瑞他汀、多拉司他汀、喜树碱、吡咯并苯并二吖庚因、抗生素、抗病毒剂、抗炎剂、免疫调节剂、抗真菌剂、类固醇或其类似物或衍生物的治疗部分。在某些实施方案中，D为成像剂部分。在一些实施方案中，成像剂部分包含染料、螯合剂、放射性核素或寡核苷酸。
在一些实施方案中，染料为荧光染料。在一些实施方案中，D可以为选自AlexaFluor 647、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 555和Alexa Fluor 568的染料。在一个实施方案中，D为Alexa Fluor 647。
在一些实施方案中，D包含放射性核素。在一个实施方案中，D包含89Zr、64Cu、86Y、11C、18F、68Ga、52Mn、55Co、152Tb、90Nb、66Ga、72As或69Ge的一种或多种。
在某些实施方案中，本申请提供了抗体-药物缀合物(ADC)，其包含抗-HER2抗体或其抗原结合片段和治疗部分和/或成像剂部分D(即“有效负载”)(例如细胞毒性剂)，例如、但不限于DM1。在一些实施方案中，抗-HER2抗体或其抗原结合片段和细胞毒性剂(例如、但不限于DM1)通过接头(“L”)共价连接。在某些实施方案中，ADC包含为曲妥珠单抗的抗-HER2抗体。在不同的实施方案中，ADC包含抗-HER2抗体或其抗原结合片段(其包含具有WO 2019/212965 A1中所示的氨基酸序列的HCVR和LCVR的CDR)和美登素类化合物，任选地DM1，任选地其中抗-HER2抗体或其抗原结合片段和美登素类化合物通过接头(例如SMCC)共价连接。
在不同的实施方案中，ADC包含抗-HER2抗体抗或其抗原结合片段，其包含具有WO2019/212965 A1中所示氨基酸序列的HCVR和LCVR的CDR。
根据另一个方面，本申请提供了抗体-药物缀合物，其包含抗-HER2抗体或其抗原结合片段，例如曲妥珠单抗，和治疗部分和/或成像剂部分(例如细胞毒性剂)。在一些实施方案中，如本文所讨论的，抗体或抗原结合片段和细胞毒性剂通过接头共价连接。在不同的实施方案中，抗-HER2抗体或抗原结合片段可以为本文所述的任何抗-HER2抗体或片段。在特定的实施方案中，抗-HER2抗体包含曲妥珠单抗。
根据某些实施方案，与抗-HER2抗体如曲妥珠单抗缀合的细胞毒性剂为美登素类化合物，例如DM1或DM4、茅层霉素衍生物或多拉司他汀衍生物。根据某些实施方案，与抗-HER2抗体缀合的细胞毒性剂为澳瑞他汀，例如MMAE、MMAF或其衍生物。在本申请的范围内涵盖本领域已知的其他细胞毒性剂，包括例如蛋白质毒素，例如蓖麻毒素白、艰难梭菌毒素、假单胞菌外毒素、蓖麻毒素、白喉毒素、肉毒杆菌毒素、牛血清蛋白、皂草素、美洲商陆毒素(即商陆毒素和商陆皂甙元)，以及其他例如Sapra等人，Pharmacol.&Therapeutics，2013，138：452-469中所述的那些。
在某些实施方案中，细胞毒性剂为溴瑞他汀。适合的溴瑞他汀包括MMAE、MMAF及其衍生物。在一个实施方案中，所述溴瑞他汀为MMAE。在一个实施方案中，MMAE或其衍生物具有如下结构：
Figure BDA0004000531960000801
在某些实施方案中，细胞毒性剂为美登素类化合物，例如美登素的衍生物。适合的美登素类化合物包括DM1、DM4或其衍生物、立体异构体或同位素体。适合的美登素类化合物还包括但不限于WO 2014/145090 A1、WO 2015/031396 A1、US 2016/0375147 A1和US2017/0209591 A1中公开的那些，其通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，美登素类化合物具有如下结构：
Figure BDA0004000531960000811
其中A为任选取代的亚芳基或亚杂芳基。
在一些实施方案中，美登素类化合物具有如下结构：
Figure BDA0004000531960000812
其中A，美登素类化合物具有如下结构
在一些实施方案中，美登素类化合物具有如下结构：
Figure BDA0004000531960000813
其中n为1-12的整数，且R1为烷基。
在一些实施方案中，美登素类化合物具有如下结构：
Figure BDA0004000531960000821
在某些实施方案中，治疗部分包括小分子，其提供通过MSR1或HER2递送的治疗有益性。在某些实施方案中，D为分子残余物，其选自类固醇、LXR调节剂或利福霉素类似物。在一些情况中，D为类固醇。在一些情况中，D为LXR调节剂。在一些情况中，D为LXR激动剂。在一些实施方案中，D为LXR拮抗剂。描述了示例性LXR调节剂有效负载，例如在2017年5月18日提交的美国申请号No.62/508,327，Bis-Octahydrophenanthrene Carboxamides AndProtein Conjugates中，作为US 2018/0334426公布，其通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，治疗部分D为利福霉素类似物，包括2018年12月21日提交的美国申请NO.62/783,506和2019年12月20日提交的NO.16/722,958中所述的任意利福霉素类似物，其通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，治疗部分D为具有如下结构的利福霉素类似物或衍生物：
Figure BDA0004000531960000822
在一个实施方案中，治疗部分为tubulysin。首先从分枝杆菌培养肉汤中分离的tubulysin是一组非常有效的微管蛋白聚合抑制剂，其快速分解正在分裂的细胞的细胞骨架并诱导细胞凋亡。tubulysin由N-甲基-D-哌啶酸(Mep)、L-异亮氨酸(Ile)和微管缬氨酸(Tuv)组成，其包含罕见的N，O-缩醛和仲醇或乙酰氧基。Tubulysin A、B、C、G和I包含C-末端tubutyrosine(Tut)α-氨基酸，而D、E、F和H在该位置具有微管苯丙氨酸(Tup)(Steinmetz，H.，等人(2004)，Isolation，Crystal and Solution Structure Determination.andBiosynthesis of tubulysins-Powerful Inhibitors of Tubulin Polymerization fromMyxobacteria.Angewandte Chemie International Edition，43：4888-4892)。
在其他实施方案中，所述治疗部分选自吡咯并苯并二氮杂卓(PBD)。PBD具有识别和结合特异性DNA序列的能力；在某些实施方案中，所述序列为PuGPu。第一种PBD抗肿瘤抗生素安曲霉素在1965年被发现(Leimgmber，等人，J.Am.Chem.Soc，87，5793-5795(1965)；Leimgruber，等人，J.Am.Chem.Soc，87，5791-5793(1965))。从那时起，已经报道了许多天然存在的PBD，并且已经开发了多种类似物的超过10种合成途径(Thurston等人，Chem.Rev.1994，433-465(1994)；Antonow，D.和Thurston，D.E.，Chem.Rev.2011 11 1(4)，2815-2864)。家族成员包括阿巴霉素(Hochlowski，等人，J.Antibiotics，40，145-148(1987))、奇卡霉素(Konishi，等人，J.Antibiotics，37，200-206(1984))、DC-81(JapanesePatent 58-180487；Thurston，等人，Chem.Brit，26，767-772(1990)；Bose等人，Tetrahedron，48，751-758(1992))、甲基氨茴霉素(Kuminoto，等人，J.Antibiotics，33，665-667(1980))、新茴霉素A和B(Takeuchi，等人，J.Antibiotics，29，93-96(1976))、门霉素(Tsunakawa，等人，J.Antibiotics，41，1366-1373(1988))、prothracarcin(Shimizu等人，J.Antibiotics，29，2492-2503(1982)；Langley和Thurston，J.Org.Chem.，52，91-97(1987))、西班米星(DC-102)(Hara等人，J.Antibiotics，41，702-704(1988)；Itoh等人，J.Antibiotics，41，1281-1284(1988))、西伯利亚霉素(Leber等人，J.Am.Chem.Soc，110，2992-2993(1988))和托马霉素(Arima等人，J.Antibiotics，25，437-444(1972))。
在一些实施方案中，本申请的PBD具有下式：
Figure BDA0004000531960000831
PBD的不同之处在于取代基的数目、类型和位置，它们的芳族A环和吡咯并C环，以及G环的饱和度。在B环中，在N10-C11位置处存在亚胺(N＝C)、甲醇胺(NH-CH(OH))或甲醇胺甲基醚(NH-CH(OME))，所述N10-C11位置是负责烷基化DNA的亲电中心。所有已知的天然产物在手性C11a位置具有(S)-构型，当从C环朝向A环观察时，这为它们提供了右旋扭曲。这使它们具有与B型DNA的小沟等渗性的适当的三维形状，导致在结合位点处的紧密配合(Kohn，In Antibiotics III.Springer-Verlag，New York，pp.3-11(1975)；Hurley和Needham-VanDevanter，Acc.Chem.Res.，19，230-237(1986))。它们在小沟中形成加合物的能力使它们能够干扰DNA加工，因此它们用作抗肿瘤剂。
在一个具体实施方案中，治疗部分D为式PBD-1的PBD化合物：
Figure BDA0004000531960000841
或其类似物或衍生物。
在某些实施方案中，所述治疗部分为溴瑞他汀、PBD或安沙霉素，例如利福霉素或其类似物或衍生物。
在某些实施方案中，所述治疗部分为MMAE、PBD-1或抗生素，例如利福霉素或其类似物或衍生物。
在本申请的某些实施方案中，反应性接头-有效负载化合物为如下结构，其中表示为D的治疗部分通过氨基连接接头：
Figure BDA0004000531960000842
在式(V-A)的反应性接头-有效负载化合物的其他实施方案中，D为美登素类化合物或美登素类化合物类似物。
在本申请的某些实施方案中，反应性接头-有效负载化合物为如下结构，其中表示为D的治疗部分通过氨基连接接头：
Figure BDA0004000531960000843
在式(V-B)的反应性接头-有效负载化合物的其他实施方案中，D为吡咯并苯并二氮杂卓(PBD)或其类似物或衍生物。在一个具体的实施方案中，D为PBD-1。
在本申请的某些实施方案中，反应性接头-有效负载化合物为如下结构，其中表示为D的治疗部分通过氨基连接接头：
Figure BDA0004000531960000851
在式(V-C)的反应性接头-有效负载化合物的其他实施方案中，D为利福霉素或其类似物或衍生物。
在一些实施方案中，本文所述的有效负载D(例如利福霉素类似物)包含叔胺，其中叔胺中的氮原子是有效负载通过其与接头键合的原子。在这种情况下，与有效负载的叔胺键合在接头-有效负载分子中产生季胺。季胺上的正电荷可以通过抗衡离子(例如氯、溴、碘或任何其他合适带电的部分，例如本文所述的那些)平衡。这样的实例包括这样的实施方案，其中反应性接头-有效负载分子具有下式(V-C1)：
Figure BDA0004000531960000852
Figure BDA0004000531960000853
本文也称作mal-PEG8-VC-PABQ-Rif类似物。
在具有本文所述的有效负载D(例如MMAE)的一些实施方案中，反应性接头-有效负载分子具有下式(V-A1)：
Figure BDA0004000531960000854
Figure BDA0004000531960000855
本文也称作mc-VC-PABC-MMAE.
在具有本文所述的有效负载D的一些实施方案中，反应性接头-有效负载分子具有下式(V-A11)：
Figure BDA0004000531960000861
在具有本文所述的有效负载D(例如PBD，例如PBD-1)的一些实施方案中，反应性接头-有效负载分子具有下式(V-B1)：
Figure BDA0004000531960000862
Figure BDA0004000531960000863
本文也称作mc-VA-PBD。
在一些实施方案中，片段
Figure BDA0004000531960000864
具有式(I-DA)：
Figure BDA0004000531960000865
其中
Figure BDA0004000531960000866
为与间隔基或结合剂的键。
式(I-DA)的反应性接头-有效负载化合的另外的实施方案中，D为美登素类化合物或如本文所述的美登素类化合物类似物
在一些实施方案中，片段
Figure BDA0004000531960000867
具有式(I-A1)：
Figure BDA0004000531960000871
Figure BDA0004000531960000872
其中
Figure BDA0004000531960000873
为与间隔基或结合剂的键。
在一些实施方案中，片段
Figure BDA0004000531960000874
具有式(I-A11)：
Figure BDA0004000531960000875
Figure BDA0004000531960000876
其中
Figure BDA0004000531960000877
为与间隔基或结合剂的键。
在一些实施方案中，片段
Figure BDA0004000531960000878
具有式(I-DB)：
Figure BDA0004000531960000879
其中
Figure BDA00040005319600008710
为与间隔基或结合剂的键。
在式(I-DB)的反应性接头-有效负载化合物的另外的实施方案中，D为如本文所述的吡咯并苯并二氮杂卓(PBD)或其类似物或衍生物。在一个具体的实施方案中，D为PBD-1。
在一些实施方案中，片段
Figure BDA00040005319600008711
具有式(I-B1)：
Figure BDA00040005319600008712
在一些实施方案中，片段
Figure BDA00040005319600008713
具有式(I-DC)：
Figure BDA0004000531960000881
Figure BDA00040005319600008810
其中
Figure BDA0004000531960000882
为与间隔基或结合剂的键。
在式(I-DC)的反应性接头-有效负载化合物的另外的实施方案中，D为利福霉素或其如本文所述的类似物或衍生物。
在一些实施方案中，片段
Figure BDA0004000531960000883
具有式(I-C1)：
Figure BDA0004000531960000884
其中
Figure BDA0004000531960000885
为与间隔基或结合剂的键。
在一些实施方案中，片段
Figure BDA0004000531960000886
具有式(I-C2)：
Figure BDA0004000531960000887
其中
Figure BDA0004000531960000888
为与间隔基或结合剂的键。
在某些实施方案中，提供了蛋白质-药物缀合物，其具有式(I-A1’)-(I-A11’)的结构：
Figure BDA0004000531960000889
(I-A1’或BA-3-mc-VC-PABC-MMAE)；
Figure BDA0004000531960000891
(I-A2’或BA-9-mc-VC-PABC-MMAE)；
Figure BDA0004000531960000892
(I-A3’或BA-10-mc-VC-PABC-MMAE)；
Figure BDA0004000531960000893
(I-A4’或BA-13-mc-VC-PABC-MMAE)；
Figure BDA0004000531960000894
(I-A5’或BA-16-mc-VC-PABC-MMAE)；
Figure BDA0004000531960000901
(I-A6’、I-A6”和I-A6”’或BA-38-mc-VC-PABC-MMAE)；
Figure BDA0004000531960000902
(I-A7’和I-A7”或BA-44-mc-VC-PABC-MMAE)；
Figure BDA0004000531960000903
(I-A8’或BA-48-mc-VC-PABC-MMAE)；
Figure BDA0004000531960000911
(I-A9’和I-A9”或BA-46-mc-VC-PABC-MMAE)；
Figure BDA0004000531960000912
(I-A10’或BA-27-mc-VC-PABC-MMAE-Alexa)；和
Figure BDA0004000531960000921
Figure BDA0004000531960000922
其中d为1-6的整数。在某些实施方案中，BA为抗体。在某些实施方案中，BA人单克隆抗体。在某些实施方案中，BA为人源化单克隆抗体。在某些实施方案中，BA为MSR1抗体或其抗原结合片段。在某些实施方案中，BA为HER2抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中，提供了蛋白质-药物缀合物，其具有式(I-B1’)的结构：
Figure BDA0004000531960000923
Figure BDA0004000531960000924
其中d为1-4的整数。其中d为1-6的整数。在某些实施方案中，BA为抗体。在某些实施方案中，BA人单克隆抗体。在某些实施方案中，BA为人源化单克隆抗体。在某些实施方案中，BA为MSR1抗体或其抗原结合片段。在某些实施方案中，BA为HER2抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中，提供了蛋白质-药物缀合物，其具有式(I-C1’)的结构：
Figure BDA0004000531960000925
Figure BDA0004000531960000926
其中d为1-6的整数。在某些实施方案中，BA为抗体。在某些实施方案中，BA人单克隆抗体。在某些实施方案中，BA为人源化单克隆抗体。在某些实施方案中，BA为MSR1抗体或其抗原结合片段。在某些实施方案中，BA为HER2抗体或其抗原结合片段。在某些实施方案中，BA为曲妥珠单抗。
使用方法
在另一个方面，本文公开的蛋白质-药物缀合物(例如ADC)尤其可用于治疗、预防和/或改善需要这种治疗的疾病、障碍或病症。
在一个实施方案中，本文公开的蛋白质-药物缀合物(例如ADC)可用于治疗癌症。在另一个实施方案中，本文公开的蛋白质-药物缀合物(例如ADC)可用于治疗感染。在一个实施方案中，本文公开的蛋白质-药物缀合物(例如ADC)可用于治疗细菌感染。在另一个实施方案中，本文公开的蛋白质-药物缀合物(例如ADC)可用于治疗病毒感染。在另一个实施例中，本文公开的蛋白质-药物缀合物(例如ADC)可用于治疗真菌感染。在另一个实施例中，本文公开的蛋白质-药物缀合物(例如ADC)可用于治疗炎性病症。在另一个实施例中，本文公开的蛋白质-药物缀合物(例如ADC)可用于治疗免疫系统障碍。
在另一个方面，本文公开的蛋白质-有效负载缀合物尤其用于诊断和/或成像。在一个实施方案中，本申请的蛋白-有效负载缀合物包含成像剂部分。这样的抗体可用于例如可视化样品内(例如在治疗的受试者内)的靶蛋白的分布。
在一些实施方案中，本申请的蛋白质-药物缀合物可以包含治疗部分和成像剂部分。在一些实施方案中，这类缀合物可同时用于治疗疾病和可视化蛋白质靶标在体内的位置。在一个非限制性实施方案中，这类抗体具有式(I-A10’)的结构：
Figure BDA0004000531960000931
Figure BDA0004000531960000932
其中d为1-6的整数。
抗-HER2抗体-药物缀合物
在某些实施方案中，本文公开的蛋白质-药物缀合物(例如ADC)尤其可用于治疗、预防和/或改善与HER2表达或活性相关或由HER2表达或活性介导的任何疾病或病症，或可通过结合HER2而不与经修饰的LDL竞争，或/或促进HER2受体摄入和/或减少细胞表面受体数量来治疗的任何疾病或病症。
本申请的蛋白质-药物缀合物(和包含它们的治疗组合物)尤其可用于治疗其中免疫应答的刺激、活化和/或靶向将是有益的任何疾病或病症。特别地，本申请的抗HER2抗体蛋白质-药物缀合物可用于治疗、预防和/或改善与HER2表达或活性或HER2+细胞增殖相关或介导的任何疾病或病症。作用机制实现本申请的治疗方法的方法包括在效应细胞存在下杀伤表达HER2的细胞，例如通过CDC、细胞凋亡、ADGC、吞噬作用或通过这些机制中的两种或多种的组合。可以使用本申请的蛋白质-药物缀合物抑制或杀伤的表达HER2的细胞包括，例如乳腺肿瘤细胞。
本申请的蛋白质-药物缀合物可用于治疗例如前列腺、膀胱、子宫颈、肺、结肠、肾、乳腺、胰腺、胃、子宫和/或卵巢中出现的原发性和/或转移性肿瘤。在某些实施方案中，本申请的蛋白质-药物缀合物用于治疗以下癌症中的一种或多种：前列腺癌、膀胱癌、宫颈癌、肺癌、结肠癌、肾癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌、子宫癌和卵巢癌。根据本申请的某些实施方案，抗-HER2抗体或抗-HER2可用于治疗患有IHC2+或更高的乳腺癌细胞的患者。根据本申请的其他相关实施方案，提供了方法，其包含向患有IHC2+或更高的乳腺癌细胞的患者施用如本文所公开的抗-HER2抗体。本领域已知的分析/诊断方法，例如肿瘤扫描等，可用于确定患者是否具有为去势抗性的肿瘤。
在某些实施方案中，本申请还包括治疗受试者中残留癌症的方法。术语“残留癌症”意指在用抗癌疗法治疗后受试者中一种或多种癌细胞的存在或持久性。
本申请的蛋白质-药物缀合物(和包含它们的治疗组合物)尤其可用于治疗其中免疫应答的刺激、活化和/或靶向将是有益的任何疾病或病症。特别地，包含本申请的抗-HER2抗体的蛋白质-药物缀合物可用于治疗、预防和/或改善与HER2表达或活性或HER2+细胞增殖相关或由其介导的任何疾病或病症。实现本申请的治疗方法的作用机制包括在效应细胞存在下杀伤表达HER2的细胞，例如通过CDC、细胞凋亡、ADCC、吞噬作用或通过这些机制中的两种或更多种的组合。可以使用本申请的蛋白质-药物缀合物抑制或杀伤的表达HER2的细胞包括，例如乳腺肿瘤细胞。
根据某些方面，本申请提供了用于治疗与HER2表达相关的疾病或病症(例如乳腺癌)的方法，包含在已经确定受试者患有乳腺癌(例如IHC2+乳腺癌)之后，向受试者施用一种或多种本文另外部分所述的抗-HER2蛋白-药物缀合物。例如，本申请包括用于治疗乳腺癌的方法，包含在受试者接受激素疗法(例如，抗雄激素药疗法)后1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周或4周、2个月、4个月、6个月、8个月、1年或更长时间向患者施用包含抗-HER2抗体或抗原结合分子的蛋白质-药物缀合物。
在某些实施方案中，本申请还包括本申请的抗-HER2抗体在制备用于治疗与HER2表达细胞相关或由其引起的疾病或病症(例如癌症)的药物中的用途。在一个方面，本申请涉及包含如本文所公开的抗-HER2抗体或抗原结合片段的蛋白质-药物缀合物，其用于药物。在一个方面，本申请涉及包含如本文所公开的抗体-药物缀合物(ADC)的化合物，其用于药物。
抗-MSR1抗体-药物缀合物
在某些实施方案中，本文公开的蛋白质-药物缀合物(例如ADC)尤其可用于治疗、预防和/或改善与MSR1表达或活性相关或由其介导的任何疾病或病症，或可通过结合MSR1而不与修饰的LDL竞争，或/或促进MSR1受体内化和/或减少细胞表面受体数量来治疗的任何疾病或病症。例如，本文公开的抗体和ADC可用于通过靶向表达MSR1和/或响应于MSR1介导的信号传导的细胞(例如巨噬细胞)来治疗、减弱或改善动脉粥样硬化、增殖性病症、神经变性病症和炎症。在一些实施方案中，当有效载荷是类固醇时，疾病、障碍或病症为过敏状态，包括但不限于哮喘、特应性皮炎、接触性皮炎、过敏性皮炎、药物超敏反应、过敏性鼻炎、常年性或季节性过敏性鼻炎和血清病；皮肤病和病症，包括但不限于皮肤瘙痒、脂溢性皮炎、神经性皮炎、湿疹、疱疹样大疱性皮炎、剥脱性红皮病、蕈样真菌病、天疱疮和严重多形性红斑(斯-约二氏综合征)；内分泌障碍，包括但不限于原发性或继发性肾上腺皮质功能不全、先天性肾上腺增生、与癌症相关的高钙血症和非化脓性甲状腺炎；胃肠疾病；血液学失调，包括但不限于获得性(自身免疫性)溶血性贫血、先天性(红细胞系统)再生不良性贫血(戴-布二氏贫血)、成人特发性血小板减少性紫癜、单纯红细胞再生障碍和继发性血小板减少；旋毛虫病；结核性脑膜炎伴蛛网膜下腔阻滞或悬挂性斑块；肿瘤病，包括但不限于白血病和淋巴瘤；神经系统障碍，包括但不限于多发性硬化、与原发性或转移性脑肿瘤相关的脑水肿、穿颅术或头部损伤的急性加重；眼科疾病，包括但不限于交感性眼炎、颞动脉炎、葡萄膜炎、干眼症和对局部皮质类固醇无反应的眼部炎性病症；肾病，包括但不限于用于诱导特发性肾病综合征或由红斑狼疮引起的蛋白尿的利尿或缓解；呼吸系统疾病，包括但不限于铍中毒、暴发性或播散性肺结核(当与适当的抗结核化疗同时使用时)、特发性嗜酸性粒细胞性肺炎、症状性结节病；和风湿病，包括但不限于在急性痛风性关节炎、急性风湿性心脏炎、强直性脊柱炎、银屑病关节炎、类风湿性关节炎(包括幼年型类风湿性关节炎)中用作短期施用的辅助疗法(以使患者在急性发作或恶化中潮解)，以及用于皮肌炎、多发性肌炎、口腔炎和系统性红斑狼疮。在某些实施方案中，本文提供了治疗或预防关节炎的方法。
在一些实施方案中，本文列出了治疗疾病、障碍或病症的方法，所述疾病、障碍或病症选自自身免疫疾病、变态反应、关节炎、哮喘、呼吸障碍、血液病症、癌症、胶原病、结缔组织障碍、皮肤病、眼病、内分泌问题、免疫性疾病、炎性疾病、肠障碍、胃肠疾病、神经障碍、器官移植病症、类风湿性障碍、皮肤障碍、肿胀病症、伤口愈合病症及其组合，所述方法包含施用本文所述的类固醇有效负载或其缀合物。
在一些实施方案中，自身免疫性疾病选自多发性硬化、自身免疫性肝炎、带状疱疹、系统性红斑狼疮(即狼疮)、重症肌无力、杜兴肌营养不良和结节病。在一些实施方案中，所述呼吸障碍选自哮喘、慢性呼吸疾病、慢性阻塞性肺病、支气管炎症和急性支气管炎。在一些实施方案中，所述癌症选自白血病、成淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、慢性成淋巴细胞性白血病，在一些实施方案中，所述胶原病是系统性红斑狼疮。在一些实施方案中，眼病是角膜炎。在一些实施方案中，内分泌问题选自艾迪生病、肾上腺功能不全、肾上腺皮质功能障碍、肾上腺皮质和先天性肾上腺增生。在一些实施方案中，所述炎性疾病选自白内障手术后炎症、关节炎症、免疫炎症、腱膜炎性疾病。炎症、滑囊炎、上髁炎、克罗恩病、炎性肠病、脂质性肺炎甲状腺炎、荨麻疹(荨麻疹)、心包炎、肾病综合征和葡萄膜炎。在一些实施方案中，所述肠病症选自胶原性结肠炎、se。在一些实施方案中，类风湿性障碍选自类风湿性关节炎、风湿性多肌痛、银屑病关节炎、强直性脊柱炎和系统性红斑狼疮。在一些实施方案中，皮肤病症选自银屑病、湿疹和毒葛。在一些实施方案中，神经障碍为慢性炎性脱髓鞘性多发性神经根神经病。
在一些实施方案中，将本文所述的化合物施用于患者以治疗急性炎性事件，包括但不限于休克、脑水肿和移植物抗宿主病。在一些实施方案中，施用本文所述的化合物以治疗破坏淋巴细胞作用，包括但不限于与血液恶性肿瘤相关的那些，例如白血病、淋巴瘤和骨髓瘤。
在一些实施方案中，本文提供了在有需要的受试者中减轻炎症的方法，所述方法包含向有此需要的受试者施用治疗有效量的本发明所述的类固醇或其缀合物。在一些实施方案中，本文提供了一种用于调节有需要的受试者的免疫系统的方法，其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本文所述的类固醇或其缀合物。在一些实施方案中，本发明提供了一种调节有需要的受试者的皮质醇水平的方法，其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本发明所述的类固醇或其缀合物。在一些实施方案中，本文提供了一种减少有需要的受试者的淋巴细胞迁移的方法，其包含向有此需要的受试者施用治疗有效量的本文所述的类固醇或其缀合物。在一些实施方案中，本发明提供了一种治疗由癌症、梅尼埃病、偏头痛、丛集性头痛、严重阿弗他溃疡、喉炎、严重结核病、对梅毒的赫氏反应、失代偿性心力衰竭、过敏性鼻炎或鼻息肉引起的高钙血症的方法，包含向有此需要的受试者施用本发明所述的类固醇有效负载或其缀合物。在一些实施方案中，本文公开的化合物可用于治疗炎性肠病、克罗恩病或溃疡性结肠炎。在一些实施方案中，所述疾病、障碍或病症为慢性炎性病状，包括但不限于哮喘、皮肤感染和眼部感染。在一些实施方案中，本文所述的化合物用于经历器官移植的患者中的免疫抑制。
在一些实施方案中，将本文所述的类固醇有效负载及其缀合物施用于患者以治疗与GR信号传导相关的神经障碍，包括但不限于精神障碍如精神分裂症、药物成瘾、创伤后精神紧张性障碍(PTSD)和情绪障碍、物质滥用、应激和焦虑。
在一些实施方案中，将本文所述的类固醇有效负载及其缀合物施用于患者以治疗视觉系统病症，包括但不限于眼部炎症(例如结膜炎、角膜炎、葡萄膜炎)、黄斑水肿和黄斑变性。在一些实施方案中，将本文所述的类固醇有效负载及其缀合物施用于患者以治疗心血管病症。在一些实施方案中，将本文所述的类固醇有效负载及其缀合物施用于患者以治疗葡萄糖和/或肝代谢病症。在一些实施方案中，将本文所述的类固醇有效负载及其缀合物施用于患者以治疗肌肉骨骼系统病症。在一些实施方案中，将本文所述的类固醇有效负载及其缀合物施用于患者以治疗皮肤炎性病症，例如湿疹和银屑病。
本文所述的蛋白质缀合物提供了将其类固醇有效负载靶向递送至特定细胞或器官系统的方式，从而减少或防止了由施用游离的未缀合类固醇有效负载引起的副作用。待减少或预防的这类潜在副作用的实例包括在批准的
Figure BDA0004000531960000971
(地塞米松)的药物标签中列出的那些，其通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，待减少或预防的副作用选自血压升高；钠潴留；水/液体潴留(水肿、血管性水肿、肺水肿)；钾排泄增加；可逆性下丘脑-垂体肾上腺(HPA)轴抑制；退出治疗后潜在的皮质类固醇不足；对感染的易感性；全身性真菌感染恶化；儿童和成人患者水痘严重程度的恶化；儿童和成人患者中麻疹严重程度的恶化：后囊下白内障；可能损害视神经的青光眼；增强由于细菌、真菌或诱导的继发性肾上腺皮质功能减退症引起的继发性眼部感染的建立；当存在活动性或潜伏性消化性溃疡、憩室炎、新鲜肠吻合和非特异性溃疡性结肠炎时穿孔的风险增加；胃肠道穿孔后的腹膜刺激；骨形成减少；骨吸收增加；成骨细胞功能的抑制；儿科患者中骨生长的抑制；在任何年龄发生骨质疏松症；急性肌病(可能涉及眼肌和呼吸肌，并且可能导致四肢轻瘫)；肌酸酐激酶升高；精神错乱，包括欣快、失眠、情绪波动、性格改变和严重抑郁症至明显的精神病表现；现有情绪不稳定或精神病倾向加重；眼内压升高；心动过缓；心脏骤停；心律失常；心脏增大；循环衰竭；充血性心力衰竭；脂肪栓塞；高血压；早产儿肥厚型心肌病；近期心肌梗塞后心肌破裂；晕厥；心动过速；血栓栓塞；血栓性静脉炎；血管炎；痤疮；过敏性皮炎；干性鳞状皮肤；瘀斑和瘀点；红斑；伤口愈合受损；出汗增加；皮疹；纹；抑制对皮肤测试的反应；薄而脆弱的皮肤；稀疏的头皮毛发；荨麻疹；碳水化合物和葡萄糖耐量降低；库欣样状态的发展；高血糖症；糖尿：多毛症；毛过多；糖尿病中对胰岛素或口服降血糖剂的需求增加(胰岛素抵抗)；潜伏性糖尿病的表现；月经不调；继发性肾上腺皮质和垂体无反应性(特别是在应激时，如在创伤、手术或疾病中)；儿科患者生长的抑制；易感患者的充血性心力衰竭；液体潴留；低钾性碱中毒；钾损失；钠潴留；腹胀；血清肝酶水平升高(通常在停药后可逆)；肝肿大；食欲增加；恶心；胰腺炎；具有可能穿孔和出血的消化性溃疡；小肠和大肠穿孔(特别是在患有炎性肠病的患者中)；溃疡性食管炎；由于蛋白质分解代谢引起的负氮平衡；股骨头和肱骨头的无菌性坏死；肌肉质量损失；肌无力；骨质疏松症；长骨病理性骨折；类固醇肌病；肌腱断裂；椎体压缩性骨折；惊厥；抑郁症；情绪不稳定；欣快；头痛；通常在停止治疗后颅内压升高，伴有乳头水肿(假性脑瘤)；失眠；情绪波动；神经炎；神经病；感觉异常；人格改变；精神障碍；眩晕；眼球突出症；青光眼；眼内压升高；后囊下白内障；异常脂肪沉积；对感染的抵抗性降低；呃逆；精子的运动性和数量增加或减少：不适；满月脸；和体重增加；以及与药物-药物相互作用相关的那些副作用。在一些实施方案中，待减少或预防的副作用是与药物-药物相互作用相关的副作用。在一些实施方案中，待减少或预防的副作用与来自与氨鲁米特一起使用皮质类固醇的药物-药物相互作用相关，包括减少皮质类固醇的肾上腺抑制；两性霉素B注射剂和钾消耗剂，包括低钾血症、心脏扩大和充血性心力衰竭的发展；抗生素，包括皮质类固醇清除率的显著降低；抗胆碱酯酶剂，包括在重症肌无力患者中产生严重虚弱；口服抗凝剂包括抑制对华法林的反应；抗糖尿病药，包括增加血糖浓度；抗结核药物，包括降低异烟肼的血清浓度：消胆胺，包括增加的皮质类固醇清除率；环孢菌素，包括环孢菌素和皮质类固醇的活性增加以及惊厥发生率；地塞米松抑制测试(DST)干扰，包括用吲哚美辛治疗的患者中的假阴性结果；洋地黄糖苷，包括由于低钾血症引起的心律失常的增加的风险；麻黄碱，包括增强皮质类固醇的代谢清除，导致血液水平降低和生理活性减弱；雌激素，包括口服避孕药，包括某些皮质类固醇的肝代谢减少及其作用的相关增加；肝酶诱导剂、抑制剂和底物(诱导细胞色素P450 3A4(CYP 3A4)酶活性的药物，例如巴比妥酸盐、苯妥英、卡马西平、利福平)，包括增强皮质类固醇的代谢；抑制CYP3A4的药物(例如酮康唑、大环内酯类抗生素如红霉素)，包括可能增加皮质类固醇的血浆浓度；由CYP 3A4代谢的药物(例如茚地那韦、红霉素)，包括增加其清除率，导致血浆浓度降低；酮康唑，其包括使某些皮质类固醇的代谢减少高达60％，导致皮质类固醇副作用的风险增加，并且抑制肾上腺皮质类固醇合成可能在皮质类固醇戒断期间引起肾上腺功能不全；非甾体抗炎剂(NSAIDS)，包括胃肠道副作用的风险增加和水杨酸盐的清除增加；苯妥英，包括苯妥英水平的增加或减少，癫痫发作控制改变；皮肤测试，包括抑制对皮肤测试的反应；沙利度胺，包括中毒性表皮坏死松解症；和疫苗，包括由于抑制抗体应答或增强减毒活疫苗中包含的一些生物体的复制而对类毒素和活的或灭活疫苗的应答减弱的疫苗)。
因此，本文提供了治疗与糖皮质激素受体相关的疾病、障碍或病症的方法，包含向患有所述疾病、障碍或病症的患者施用上述任何式的缀合物，其中与施用所述缀合物的游离类固醇有效负载相关的副作用降低。此外，本文提供了将如上所述的任何式的化合物递送至细胞的方法，包含使所述细胞与如上所述的任何式的化合物的蛋白质缀合物接触，其中所述蛋白质缀合物包含结合所述细胞的表面抗原的抗体或其抗原结合片段。
在一些实施例中，当所述有效负载为LXR调节剂时，本发明提供了治疗疾病、障碍或病症的方法，包含向患有所述障碍的患者施用治疗有效量的化合物和/或ADC(例如，上述任何式的ADC)或其药物组合物。
在一些实施例中，本文提供了预防疾病、障碍或病症的方法，包含向患有所述障碍的患者施用预防有效量的化合物和/或ADC(例如，上述任何式的ADC)或其药物组合物。
增殖性疾病可以为本领域技术人员已知的任何增殖性疾病。在某些实施方案中，增殖性病症包括但不限于肿瘤学病症，其中肿瘤学病症可以为本领域技术人员已知的任何癌症病症。在某些实施方案中，本文提供治疗或预防黑素瘤的方法。在某些实施方案中，本文提供了治疗或预防转移性黑素瘤的方法。在某些实施方案中，本文提供了治疗或预防肺癌的方法。在某些实施方案中，本文提供了治疗或预防EGFR-酪氨酸激酶抑制剂抗性肺癌的方法。在某些实施方案中，本文提供了治疗或预防口腔癌的方法。在某些实施方案中，本文提供了治疗或预防口腔鳞状细胞癌的方法。在某些实施方案中，本文提供了治疗或预防前列腺癌的方法。在某些实施方案中，本文提供了治疗或预防乳腺癌的方法。
代谢病可以是本领域技术人员已知的任何代谢病。在一些实施方案中，所述代谢病为血脂异常。血脂异常可以为本领域技术人员已知的任何血脂异常。在某些实施方案中，血脂异常选自高脂血症、高胆固醇血症、高甘油三酯血症、高脂蛋白血症、HDL缺乏、ApoA-1缺乏和心血管疾病如冠状动脉疾病(包括例如治疗和预防心绞痛、心肌梗塞和心源性猝死)；动脉粥样硬化(包括例如动脉粥样硬化的治疗和预防)；和再狭窄(包括例如预防或治疗由于例如球囊血管成形术的医疗操作而发生的动脉粥样硬化斑块)。在某些实施方案中，本文提供了治疗或预防糖尿病的方法。
心血管疾病可以是本领域技术人员已知的任何心血管疾病。在某些实施方案中，本文提供了治疗或预防动脉粥样硬化的方法。在某些实施方案中，本文提供了治疗或预防源自异常巨噬细胞加工的动脉粥样硬化的方法。在某些实施方案中，本文提供了治疗或预防源自氧化低密度脂蛋白(OxLDL)形成的动脉粥样硬化的方法，其中巨噬细胞不能加工OxLDL。在某些情况下在一些实施方案中，本文提供了治疗或预防缺血性心脏病的方法。在某些实施方案中，本文提供了治疗或预防中风的方法。在某些实施方案中，本文提供了治疗或预防高血压性心脏病的方法。在某些实施方案中，本文提供了治疗或预防主动脉瘤的方法。在某些实施方案中，本文提供了治疗或预防心内膜炎的方法。在某些实施方案中，本文提供了治疗或预防外周动脉疾病的方法。在某些实施方案中，本文提供了治疗或预防本段中提供的任何疾病的组合的方法。
在一些实施例中，本文提供了调节核受体功能的方法。作为非限制性实例，功能可以选自炎症介体(例如细胞因子、趋化因子)的表达/分泌、胆固醇调节、胆固醇摄入、胆固醇流出、胆固醇氧化、迁移、趋化性、细胞凋亡和坏死、炎症活性、脂质调节、细胞凋亡、迁移、趋化性、基因转录和蛋白质表达。
在一些实施例中，本文提供了预防疾病、障碍或病症的方法，包含给患有所述障碍的患者施用治疗有效量的如上所述的任何式的化合物和/或ADC或其药物组合物。
金黄色葡萄球菌(S.aureus)是一种兼性胞内细菌，其可以在巨噬细胞和其他细胞类型的吞噬作用下存活(Horn，J.，等人，Inside job：Staphylococcus aureus host-pathogen interactions.Int J Med Microbiol，2018.308(6)：p.607-624；Jubrail，J.，等人，Inability to sustain intraphagolysosomal killing of Staphylococcus aureuspredisposes to bacterial persistence in macrophages.Cell Microbiol，2016.18(1)：p.80-96)。活体成像已经证明巨噬细胞可以用作金黄色葡萄球菌复制的储库，然后在感染期间接种其他器官(Surewaard，B.G.，等人，Identification and treatment of theStaphylococcus aureus reservoir in vivo.J Exp Med，2016.213(7)：p.1141-51)。大部分抗生素不能很好地穿透细胞(包括巨噬细胞)，表明胞内金黄色葡萄球菌储库可以逃避用标准护理抗生素的治疗(Lehar，S.M.，等人，Novel antibody-antibiotic conjugateeliminates intracellular S.aureus.Nature，2015.527(7578)：p.3238)。然而，万古霉素的脂质体制剂比标准护理万古霉素更有效地增加抗生素向巨噬细胞中的渗透并降低金黄色葡萄球菌器官负荷(Surewaard，B.G.等人，Identification and treatment of theStaphylococcus aureus reservoir in vivo.J Exp Med，2016.213(7)：p.1141-51)。总之，这些数据表明，将抗生素递送至巨噬细胞可以是消除胞内金黄色葡萄球菌储库的有效方法。
抗生素抗性金黄色葡萄球菌仍然是公共健康问题，在美国大约40％的血流感染是由甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(MRSA)引起的。对于MRSA血流感染几乎没有FDA批准的治疗选择，万古霉素仍然是抗生素的选择。尽管进行了适当的抗生素治疗，但金黄色葡萄球菌血流感染的死亡率为～18％，这促使了对可以改善治疗的组合的研究。
利福霉素类抗生素抑制细菌RNA聚合酶(RNAP)并具有抗金黄色葡萄球菌的有效活性。然而，使用这类抗生素的单一疗法可在治疗期间导致选择抗性群体。因此，利福霉素抗生素可以与一线抗生素组合使用以改善结果，通常在涉及假体或外来装置的感染中。
本文所述的包含利福霉素类似物的ADC可用于预防或治疗受试者中细菌的生长和/或细菌感染。在一些情况下，细菌是革兰氏阳性细菌(革兰氏阳性细菌是细菌感染的原因)。在一些情况下，细菌是耐青霉素细菌(耐青霉素细菌是细菌感染的原因)。在一些情况下，细菌是金黄色葡萄球菌、甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(MRSA)细菌(MRSA细菌是细菌感染的原因)。在一些情况下，细菌是甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌(MSSA)细菌(MSSA细菌是细菌感染的原因)。在一些情况下，细菌是耐万古霉素金黄色葡萄球菌(VRSA)细菌(VRSA细菌是细菌感染的原因)。在一些情况下，细菌是多重耐药性结核分枝杆菌(多重耐药性结核分枝杆菌细菌是细菌感染的原因)。在另外的情况下，细菌是对例如阿奇霉素具有抗性的沙眼衣原体(对例如阿奇霉素具有抗性的沙眼衣原体是细菌感染的原因)。在更多情况下，细菌是对例如甲硝唑、万古霉素和/或非达米星具有抗性的艰难梭菌(对例如甲硝唑、万古霉素和/或非达米星具有抗性的艰难梭菌是细菌感染的原因)。
本文提供了一种在受试者中预防或治疗蜂窝织炎、菌血症、真皮坏死、眼睑感染、眼感染、新生儿结膜炎、骨髓炎、脓疱病、疖、皮肤烫伤综合征、食物中毒、肺炎、手术感染、尿道感染、烧伤感染、脑脊膜炎、心内膜炎、败血症、中毒性休克综合征、脓毒性关节炎、乳腺炎、与假体关节相关的感染、与导管相关的感染或与植入物相关的感染的方法，包含向受试者施用有效治疗量的包含利福霉素类似物的抗体-药物缀合物。本文还提供了预防或治疗受试者的胞内细菌感染的方法，包含向所述受试者施用有效治疗量的包含利福霉素类似物的抗体-药物缀合物。
在一些情况下，本文提供了治疗方法，包含将抗-MSR1抗体、抗-MSR1抗体的抗原结合部分或包含抗-MSR1抗体或其MSR1抗原结合片段的ADC施用于有需要的受试者，其可用于治疗和/或预防受试者中的细菌感染和/或与葡萄球菌感染(例如金黄色葡萄球菌感染)相关的疾病或障碍或病症和/或用于改善与此类疾病、障碍或病症状相关的至少一种症状。这样的疾病、障碍或病症可以为蜂窝织炎、菌血症、真皮坏死、眼睑感染、眼感染、新生儿结膜炎、骨髓炎、脓疱病、疖、皮肤烫伤综合征、食物中毒、肺炎、手术感染、尿道感染、烧伤感染、脑脊膜炎、心内膜炎、败血症、中毒性休克综合征或脓毒性关节炎。在一些情况下，受试者具有假关节，并且本文公开的抗体用于治疗和/或预防假关节周围组织的金黄色葡萄球菌感染。在一些情况下，受试者具有导管，并且本文公开的抗体用于治疗和/或预防导管和/或导管周围组织的金黄色葡萄球菌感染。在一些情况下，受试者存在导管，并且本文公开的抗体用于治疗和/或预防导管和/或导管周围组织的金黄色葡萄球菌感染。在一些情况下，受试者患有乳腺炎，并且本文公开的抗体可用于治疗乳腺炎。
在某些情况下，利福霉素类似物和/或其抗-MSR1 ADC与一种或多种另外的抗生素(例如，可用于MRSA感染的抗生素)组合施用，所述抗生素例如万古霉素、甲氧苄氨嘧啶-磺胺甲基异噁唑、四环素、多西环素/米诺环素、克林霉素、头孢菌素(例如头孢氨苄)、纳西林、非达米星、利奈唑胺等，和/或任何其他适合的抗生素。在一些情况下，本文所述的包含利福霉素类似物的ADC以组合方式施用。
本文还提供了预防或抑制细菌生长的方法，包含施用有效量的包含抗-MSR1抗体或其MSR1抗原结合片段和利福霉素类似物的抗体-药物缀合物(ADC)。
本文还提供了治疗方法，包含向有此需要的受试者施用有效量的包含抗-MSR1抗体或其MSR1抗原结合片段和利福霉素类似物的ADC。所述治疗方法包含施用治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包含针对受试者的抗-MSR1抗体或其MSR1抗原结合片段和利福霉素类似物的ADC。所治疗的病症为通过靶向MSR1和/或通过施用抗生素剂而改善、减轻、抑制或预防的任何疾病或病症。在一些实施方案中，所述疾病或病症为增殖性疾病、代谢病、炎症、神经变性疾病或与糖皮质激素受体信号传导相关的疾病、障碍或病症。在一些这样的实施方案中，与施用未缀合利福霉素类似物相关的副作用减少。本文提供了本文所述的抗-MSR1抗体、抗-MSR1抗体的抗原结合部分或包含抗-MSR1抗体或其MSR1抗原结合片段(如H1H21234N)的ADC在治疗本文所述的任何疾病、障碍或病症中的用途。
本文还提供了用于治疗、减弱或改善与葡萄球菌感染(例如金黄色葡萄球菌感染)相关的疾病或障碍或病症和/或用于改善与此类疾病、障碍或病症相关的至少一种症状的治疗方法，其包括向有此需要的受试者施用利福霉素类似物或包含抗-MSR1抗体(例如H1H21234N)或其MSR1抗原结合片段和利福霉素类似物的ADC。这样的疾病、障碍或病症可以是蜂窝织炎、菌血症、真皮坏死、眼睑感染、眼感染、新生儿结膜炎、骨髓炎、脓疱病、疖、皮肤烫伤综合征、食物中毒、肺炎、手术感染、尿道感染、烧伤感染、脑脊膜炎、心内膜炎、败血症、中毒性休克综合征或脓毒性关节炎。在一些实施方案中，受试者具有假关节，并且本文公开的利福霉素类似物或包含抗-MSR1抗体或其MSR1抗原结合片段和利福霉素类似物的ADC用于治疗和/或预防假关节周围组织的金黄色葡萄球菌感染。在一些实施方案中，受试者具有导管，并且本文公开的利福霉素类似物或包含抗-MSR1抗体或其MSR1抗原结合片段和利福霉素类似物的ADC用于治疗和/或预防导管和/或导管周围组织的金黄色葡萄球菌感染。在一些实施方案中，受试者植入了异物，并且本文公开的利福霉素类似物或包含抗-MSR1抗体或其MSR1抗原结合片段和利福霉素类似物的ADC用于治疗和/或预防异物和/或异物周围组织的金黄色葡萄球菌感染。在一些实施方案中，受试者患有乳腺炎，并且本文公开的抗体可用于治疗乳腺炎。所述治疗方法包含向有此需要的受试者施用治疗有效量的包含利福霉素类似物的药物组合物或包含抗-MSR1抗体或其MSR1抗原结合片段和利福霉素类似的ADC。
在另一个方面，本发明提供了抗体-药物缀合物，其包含通过接头或通过接头-间隔基与本申请任何实施方案的利福霉素类似物化合物缀合的抗体或其抗原结合片段。
在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段结合巨噬细胞消除受体1(MSR1)。
在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段可以包含：
(i)HCDR1结构域，其包含选自的氨基酸序列SEQ ID NO：4、36、52、92和284；
(ii)HCDR2结构域，其包含选自的氨基酸序列SEQ ID NO：6、38、54、94和286；
(iii)HCDR3结构域，其包含选自的氨基酸序列SEQ ID NO：8、40、56、96和288；
(iv)LCDR1结构域，其包含选自的氨基酸序列SEQ ID NO：12、44、60、100和292；
(v)LCDR2结构域，其包含选自的氨基酸序列SEQ ID NO：14、46、62、102和294；和
(vi)LCDR3结构域，其包含选自的氨基酸序列SEQ ID NO：16、48、64、104和296。
药物组合物和施用方法
还提供了这样的方法，其包含向有需要的受试者施用包含本文公开的蛋白质或抗体缀合物的治疗组合物。治疗组合物可以包含本文所述的任何缀合物和药学上可接受的载体或稀释剂。
本说明书的蛋白质-药物缀合物尤其可用于治疗、预防和/或改善与其同源抗原表达或活性相关或由其介导的任何疾病或病症，或可通过阻断其同源抗原与受体或配体之间的相互作用或以其他方式抑制抗原活性和/或信号传导，和/或促进受体摄入和/或减少细胞表面受体数量来治疗。例如，本说明书的蛋白质-药物缀合物可用于治疗表达其同源抗原和/或响应于抗原介导的信号传导的肿瘤。本文提供的抗体和缀合物还可用于治疗在脑和脑膜、口咽、肺和支气管树、胃肠道、男性和女性生殖道、肌肉、骨骼、皮肤和附属物中产生的原发性和/或转移性肿瘤。结缔组织、脾脏、免疫系统、造血细胞和骨髓、肝脏和泌尿道以及特殊的感觉器官如眼。在某些实施方案中，本说明书的蛋白质-药物缀合物用于治疗以下癌症中的一种或多种：肾细胞癌、胰腺癌、头颈癌、前列腺癌、恶性神经胶质瘤、骨肉瘤、结肠直肠癌、胃癌(例如，具有MET扩增的胃癌)、恶性间皮瘤、多发性骨髓瘤、卵巢癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、滑膜肉瘤、甲状腺癌、乳腺癌或黑素瘤。
在本文所述的治疗方法的上下文中，蛋白质-药物缀合物可以作为单一疗法(即，作为唯一的治疗部分)或与一种或多种另外的治疗部分(在本文另外部分描述的实例)组合施用。
本文提供了包含本文提供的蛋白质-药物缀合物的药物(即治疗性)组合物。本说明书的药物组合物与适合的载体、赋形剂和提供改善的转移、递送、耐受性等的其他试剂一起配制。许多适当的制剂可以在所有药物化学家已知的处方集中找到：Remington′sPharmaceutical Sciences，Mack Publishing Company，Easton，Pa。这些制剂包括例如粉末、糊剂、软膏、胶冻、蜡、油、脂质、含有脂质(阳离子或阴离子)的囊泡(例如LIPOFECTINTM，Life Technologies，Carlsbad，Calif.)、DNA缀合物、无水吸收糊剂、水包油和油包水型乳液、聚乙二醇乳液(各种分子量的聚乙二醇)、半固体凝胶和含有碳蜡的半固体混合物。还参见Powell等人“Compendium of excipients for parenteral formulations”PDA(1998)J.Pharm.Sci.Technol.52：238-311。
施用于患者的蛋白质-药物缀合物的剂量可以根据患者的年龄和体型、目标疾病、病症、施用途径等的不同而变化。在某些实施方案中，根据体重或体表面积计算剂量。在成年患者中，通常以约0.01-约20mg/kg体重、更优选约0.02-约7、约0.03-约5或约0.05-约3mg/kg体重的单剂量静脉内施用本说明书的抗体可能是有利的。根据病症的严重程度的不同，可以调整治疗的频率和持续时间。施用抗体的有效剂量和时间表可以根据经验确定；例如，可以通过定期评估来监测患者进展，并相应地调整剂量。此外，可以使用本领域众所周知的方法进行剂量的种间缩放(例如Mordenti等人，1991，Pharmaceut.Res.8：1351)。
各种递送系统是已知的并且可用于施用本说明书的药物组合物，例如包封在脂质体、微粒、微胶囊中、能够表达突变病毒的重组细胞、受体介导的胞吞作用(参见例如Wu等人，1987，J.Biol.Chem.262：4429-4432)。导入方法包括但不限于真皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外和口服途径。组合物可以通过任何便利的途径施用，例如通过输注或推注，通过上皮或粘膜皮肤粘膜层(例如口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)吸收，并且可以与其他生物活性剂一起施用。施用可以是全身的或局部的。
本说明书的药物组合物可以用标准针头和注射器皮下或静脉内递送。此外，关于皮下递送，笔式递送装置容易地应用于递送本说明书的药物组合物。这种笔递送装置可以是可重复使用的或一次性的。可重复使用的笔式递送装置通常利用包含药物组合物的可更换药筒。一旦药筒内的所有药物组合物已被施用并且药筒是空的，则可以便利地丢弃空药筒并用包含药物组合物的新药筒替换。然后可以重复使用笔递送装置。在一次性笔递送装置中，没有可更换的药筒。相反，一次性笔递送装置预填充有保持在装置内的贮存器中的药物组合物。一旦容器中的药物组合物被清空，则丢弃整个装置。
许多可重复使用的笔和自动注射器递送装置可应用于皮下递送本说明书的药物组合物。实例包括但不限于AUTOPENTM(Owen Mumford，Inc.，Woodstock，UK)、DISETRONICTM笔(Disetronic Medical Systems，Bergdorf，Switzerland)、HUMALOG MIX 75/25TM笔、HUMALOGTM笔、HUMALIN 70/30TM笔(Eli Lilly and Co.，Indianapolis，Ind.)、NOVOPENTM I、II和III(Novo Nordisk，Copenhagen，Denmark)，NOVOPEN JUNIORTM(Novo Nordisk，Copenhagen，Denmark)、BDTM笔(Becton Dickinson，Franklin Lakes，N.J.)、OPTIPENTM、OPTIPEN PROTM、OPTIPEN STARLETTM和OPTICLIKTM(sanofi-aventis，Frankfurt，Germany)等。应用于皮下递送本说明书的药物组合物的一次性笔递送装置的实例包括但不限于SO-LOSTARTM笔(sanofi-aventis)、FLEXPENTM(Novo Nordisk)和KWIKPENTM(Eli Lilly)、SURECLICKTM自动注射器(Amgen，Thousand Oaks，Calif.)、PENLETTM(Haselmeier，Stuttgart，Germany)、EPIPEN(Dey，L.P.)和HUMIRATM笔(Abbott Labs，Abbott Park，Ill.)等。
在某些情况下，药物组合物可以在控释系统中递送。在一个实施方案中，可以使用泵(参见Langer，上文；Sefton，1987，CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14：201)。在另一个实施方案中，可以使用聚合物材料；参见Medical Applications of Controlled Release，Langerand Wise(eds.)，1974，CRC Pres.，Boca Raton，Fla。在另一个实施方案中，控释系统可以放置在组合物的靶标附近，因此仅需要全身剂量的一部分(参见例如Goodson，1984，Medical Applications of Controlled Release，上文，第2卷，pp.115-138)。在Langer，1990，Science 249：1527-1533的综述中讨论了其他控释系统。
可注射制剂可以包括用于静脉内、皮下、皮内和肌内注射、点滴输注等的剂型。这些可注射制剂可以通过公知的方法制备。例如，可注射制剂可以例如通过将本文所述的抗体或其盐溶解、悬浮或乳化在常规用于注射的无菌水性介质或油性介质中来制备。作为注射用水性介质，存在例如生理盐水、包含葡萄糖和其他助剂的等渗溶液等，其可以与适当的增溶剂如醇(例如乙醇)、多元醇(例如丙二醇、聚乙二醇)、非离子表面活性剂[例如聚山梨醇酯80、HCO-50(氢化蓖麻油的聚氧乙烯(50mol)加合物)]等组合使用。如此制备的注射剂优选填充在适合的安瓿中。作为油性介质，使用例如芝麻油、大豆油等，其可以与增溶剂例如苯甲酸苄酯、苄醇等联用。因此，优选将制备的注射液填充在适当的安瓿中。
有利地，将本文所述的用于口服或肠胃外使用的药物组合物制备成适于配合活性成分剂量的单位剂量的剂型。单位剂量的这类剂型包括例如片剂、丸剂、胶囊、注射剂(安瓿)、栓剂等。所含的上述抗体的量通常为单位剂量中每剂型约5-约500mg；特别是在注射形式中，在某些实施方案中，包含约5-约100mg的上述抗体，并且对于其他剂型，包含约10-约250mg的上述抗体。
“化疗剂”是可用于治疗癌症的化学化合物，与作用机制无关。化疗剂的类别包括但不限于：烷化剂、抗代谢药、纺锤体毒剂植物生物碱、细胞毒性/抗肿瘤抗生素、拓扑异构酶抑制剂、抗体、光敏剂和激酶抑制剂。化疗剂包括用于“靶向疗法”和常规化疗的化合物。
化疗剂的实例包括：埃罗替尼(
Figure BDA0004000531960001061
Genentech/OSI Pharm.)、多西他赛(
Figure BDA0004000531960001071
Sanofi-Aventis)、5-FU(氟尿嘧啶、5-氟尿嘧啶，CAS No.51-21-8)、吉西他滨(
Figure BDA0004000531960001072
Lilly)、PD-0325901(CAS No.391210-10-9，Pfizer)、顺铂(顺二胺，二氯铂(ll)，CAS No.15663-27-1)、卡铂(CAS No.41575-94-4)、紫杉醇(
Figure BDA0004000531960001073
Bristol-MyersSquibb Oncology，Princeton，N.J.)、曲妥珠单抗(
Figure BDA0004000531960001074
Genentech)、替莫唑胺(4-甲基-5-氧代-2，3，4，6，8-五氮杂双环[4.3.0]壬-2，7，9-三烯-9-甲酰胺，CASNo.85622-93-1，
Figure BDA0004000531960001075
Figure BDA0004000531960001076
Schering Plough)、他莫昔芬((Z)-2-[4-(1，2-二苯基丁-1-烯基)苯氧基]-/V，/V-二甲基乙胺，
Figure BDA0004000531960001077
)和多柔比星
Figure BDA0004000531960001078
Akti-1/2、HPPD和雷帕霉素。
化疗剂的更多实例包括：奥沙利铂(
Figure BDA0004000531960001079
Sanofi)、硼替佐米(
Figure BDA00040005319600010710
Millennium Pharm.)、索坦(
Figure BDA00040005319600010711
SU1 1248，Pfizer)、来曲唑(
Figure BDA00040005319600010712
Novartis)、甲磺酸伊马替尼(
Figure BDA00040005319600010713
Novartis)、XL-518(Mek抑制剂，Exelixis，WO 2007/044515)、ARRY-886(Mek抑制剂，AZD6244，Array BioPharma，AstraZeneca)、SF-1 126(PI3K抑制剂，Semafore Pharmaceuticals)、BEZ-235(PI3K抑制剂，Novartis)、XL-147(PI3K抑制剂，Exelixis)、PTK787/ZK 222584(Novartis)、氟维司群(
Figure BDA00040005319600010714
AstraZeneca)、甲酰四氢叶酸(亚叶酸)、雷帕霉素(西罗莫司，
Figure BDA00040005319600010715
Wyeth)、拉帕替尼(
Figure BDA00040005319600010716
GSK572016，Glaxo Smith Kline)、洛那法尼(SARASARTM，SCH 66336，Schering Plough)、索拉非尼(
Figure BDA00040005319600010717
BAY43-9006，BayerLabs)、吉非替尼(
Figure BDA00040005319600010718
AstraZeneca)、伊立替康(
Figure BDA00040005319600010719
CPT-11，Pfizer)、替吡法尼(ZARNESTRATM，Johnson&Johnson)、ABRAXANETM(不含克列莫佛)、紫杉醇的白蛋白改造的纳米粒制剂(American Pharmaceutical Partners，Schaumberg，II)、凡德他尼(rINN，ZD6474，
Figure BDA00040005319600010720
AstraZeneca)、chloranmbucil，AG1478，AG1571(SU 5271；Sugen)、坦西莫司(
Figure BDA00040005319600010721
Wyeth)、帕唑帕尼(GlaxoSmithKline)、坎磷酰胺(
Figure BDA00040005319600010722
Telik)、塞替派和环磷酰胺
Figure BDA00040005319600010723
烷基磺酸盐，如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；如苯并多巴、卡波醌、美妥多巴和奥美托帕；乙烯亚胺和甲基拉美拉明，包括六甲蜜胺、三亚乙基蜜胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺和三甲美拉明；乙酸配质(特别是布来他星和布他替宁)；喜树碱(包括合成类似物拓扑替康)；苔藓抑素；华红素；CC-1065(包括其阿多来新、卡折来新和比折来新合成类似物)；隐形霉素(特别是隐形霉素1和隐形霉素8)；多拉司他汀；多卡米星(包括合成类似物，KW-2189和CB1-TM1)；五加素；水鬼蕉碱；sarcodictyin；斯蓬西他汀；氮芥如苯丁酸氮芥，萘氮芥、氯磷酰胺、雌氮芥、异环磷酰胺、氮芥、盐酸氧氮芥、美法仑、新氮芥、胆甾醇对苯乙酸氮芥、泼尼氮芥、曲磷胺、尿嘧啶氮芥；亚硝基脲，如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀和雷米诺斯汀；抗生素，例如烯二炔抗生素(例如加利车霉素、加利车霉素γI、加利车霉素ωl(AngewChem.Intl.Ed.Engl.(1994)33：183-186)；地奈米星、地奈米星A；双膦酸盐，例如氯膦酸盐；埃斯波霉素；以及新制癌菌素生色团和相关的色蛋白烯二炔抗生素生色团)、阿片霉素、放线菌素、奥特他霉素、偶氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素、辣椒素、洋红霉素、嗜癌菌素、嗜铬菌素、更生霉素、柔红霉素、地托比星、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、吗啉代-多柔比星、氰基吗啉代-多柔比星、2-吡咯啉代-多柔比星和脱氧多柔比星)、表柔比星、依索比星、伊达比星、奈莫柔比星、麻西罗霉素、丝裂霉素如丝裂霉素C、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素、培洛霉素、泊非霉素、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑菌素、链脲菌素、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗代谢药，如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，如二甲叶酸、甲氨蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙；嘌呤类似物，如氟达拉滨、6-巯嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、双脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷；雄激素如卡鲁睾酮、丙酸屈他雄酮、环硫雄醇、美雄烷、睾内酯；抗肾上腺素，如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂如亚叶酸；粗葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；恩尿嘧啶；安吖啶；阿莫司汀；比生群；依达曲沙；去光胺；秋水仙胺；地吖醌；厄尔福尼；醋酸依利醋铵；埃坡霉素；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯硝苯胺；美登素类化合物，如美坦辛和安丝菌素；米托胍腙；米托蒽醌；莫匹丹醇；硝烯尿；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；洛索蒽醌；鬼臼酸；2-乙基酰肼；丙卡巴肼；
Figure BDA0004000531960001081
多糖复合物(JHSNatural Products，Eugene，OR)；雷佐生；根霉素；西佐非兰；锗螺胺；替奴佐酸；三亚胺醌；2，2′，2″-三氯三乙胺；单端孢霉烯类(尤其是T-2毒素、维拉库林A、杆胞菌素A和安吉苷)；乌拉坦；长春地辛；达卡巴嗪；甘露醇氮芥；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；噻替派；6-硫鸟嘌呤；巯嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物如顺铂和卡铂；长春碱；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨
Figure BDA0004000531960001082
诺消灵；替尼泊苷；依达曲沙；道诺霉素；氨基蝶呤；卡培他滨(
Figure BDA0004000531960001083
Roche)，伊班膦酸盐；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；维生素a酸类，如视黄酸A酸；上述任一种的可接受的盐、酸和衍生物。
在“化疗剂”的定义中还包括：(i)起调节或抑制激素对肿瘤作用的作用的抗激素药，例如抗雌激素药和选择性雌激素受体调节剂(SERM)，包括例如他莫昔芬(包括
Figure BDA0004000531960001091
柠檬酸他莫昔芬)、雷洛昔芬、屈洛昔芬、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬、雷洛昔芬、LY 117018、奥那司酮和
Figure BDA0004000531960001092
(柠檬酸托瑞米芬)；(ii)抑制芳香酶的芳香酶抑制剂，其调节肾上腺中的雌激素产生，例如4(5)-咪唑、氨鲁米特、
Figure BDA0004000531960001093
(醋酸甲地孕酮)、
Figure BDA0004000531960001094
(依西美坦；Pfizer)、福美坦、法倔唑、
Figure BDA0004000531960001095
(伏氯唑)、
Figure BDA0004000531960001096
(来曲唑；Novartis)和
Figure BDA0004000531960001097
(阿那曲唑；AstraZeneca)；(iii)抗雄激素药，例如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林：以及曲沙他滨(1，3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；(iv)蛋白激酶抑制剂，如MEK抑制剂(WO 2007/044515)；(v)脂质激酶抑制剂；(vi)反义寡核苷酸，特别是抑制涉及异常细胞增殖的信号传导途径中的基因表达的那些反义寡核苷酸，例如PKC-α、Raf和H-Ras，例如奥利默森(oblimersen)(
Figure BDA0004000531960001098
Genta Inc.)；(vii)核酶，例如VEGF表达抑制剂(例如
Figure BDA0004000531960001099
)和HER2表达抑制剂；(viii)疫苗，例如基因治疗疫苗，例如，
Figure BDA00040005319600010910
和
Figure BDA00040005319600010911
Figure BDA00040005319600010912
rlL-2；拓扑异构酶1抑制剂，如
Figure BDA00040005319600010913
rmRH；(ix)抗血管生成剂，例如贝伐单抗(
Figure BDA00040005319600010914
Genentech)；以及上述任一种的药学上可接受的盐、酸和衍生物。
在“化疗剂”的定义中还包括治疗性抗体，例如阿仑珠单抗(Campath)、贝伐单抗(
Figure BDA00040005319600010915
Genentech)；西妥昔单抗(
Figure BDA00040005319600010916
Imclone)；帕木单抗(
Figure BDA00040005319600010917
Amgen)，利妥昔单抗(
Figure BDA00040005319600010918
Genentech/Biogen Idee)，奥法木单抗(
Figure BDA00040005319600010919
GSK)，帕妥珠单抗(PERJETATM，OMNITARGTM，2C4，Genentech)，曲妥珠单抗(
Figure BDA00040005319600010920
Genentech)，托西莫单抗(Bexxar，Corixia)，和抗体药物缀合物，吉妥珠单抗奥佐米星(
Figure BDA00040005319600010921
Wyeth)。“化疗剂”的定义中还包括调节在癌症病理学中特别重要的特定分子或分子类别的药剂。感兴趣的特定分子的实例是VEGF和EGFR(HER1、HER2和/或HER3)。一类关注的分子的实例为免疫检查点调节剂，例如抗PDL-1或CTLA4免疫调节剂。这类适合的活性剂的实例包括抗体、核酸(例如核酶、siRNA)和小分子。在一些实施方案中，所述药剂抑制特定分子的表达和/或活性。在一些实施方案中，所述药剂激活所述特异性分子的表达和/或活性。
与本申请的缀合物组合的具有作为化疗剂的治疗潜能的人源化单克隆抗体包括：阿仑珠单抗、阿泊珠单抗、阿塞珠单抗、阿替珠单抗、巴匹珠单抗、贝伐单抗、bivatuzumabmertansine、莫坎妥珠单抗、西利珠单抗、培塞利珠单抗、西德福妥珠单抗、西妥珠单抗、达珠单抗、艾库组单抗、依法珠单抗、依帕珠单抗、厄利珠单抗、非维珠单抗、芳妥珠单抗、吉姆单抗奥佐米星、奥英妥珠单抗、伊匹木单抗、拉贝珠单抗、林妥珠单抗、马妥珠单抗、美泊利单抗、莫维珠单抗、莫托珠单抗、那他珠单抗、尼妥珠单抗、诺洛珠单抗、纳马珠单抗、奥瑞珠单抗、奥马佐单抗、帕利珠单抗、帕考珠单抗、培妥珠单抗、pecfusituzumab、pectuzumab、培妥珠单抗、培克珠单抗、拉利珠单抗、雷珠单抗、利左单抗、瑞利珠单抗、利西珠单抗、罗维珠单抗、鲁利单抗、西罗珠单抗、西利珠单抗、松妥珠单抗、tacatuzumab tetraxetan、他度珠单抗、他利珠单抗、替非珠单抗、托珠单抗、托利珠单抗、曲妥珠单抗、西莫白介素单抗、土库图单抗、乌马珠单抗、乌珠单抗和维西珠单抗。
除活性成分、即本申请的蛋白质-药物缀合物外，本申请的药物组合物和用于本申请的用途的药物组合物可以包含药学上可接受的赋形剂、载体、缓冲剂、稳定剂或本领域技术人员众所周知的其他材料。这样的材料应当是无毒的，并且不应干扰活性成分的功效。载体或其他材料的确切性质将取决于施用途径，其可以是口服或通过注射，例如皮肤、皮下或静脉内。
在另一个方面，本文提供了药物组合物，其包含抗体-药物缀合物和药学上可接受的载体，所述抗体-药物偶联物包含特异性结合MSR1的重组人抗体或其片段，该药物组合物还包含利福霉素类似物。在相关方面，实施方案涉及一种组合物，其为包含抗-MSR1抗体并且还包含利福霉素类似物的抗体-药物缀合物和第二治疗部分的组合。在一个实施方案中，第二治疗部分为有利地与包含抗-MSR1抗体的抗体-药物缀合物组合的任何药剂。在一个实施方案中，第二治疗部分为抗体-药物缀合物，其包含与第二药物或治疗部分缀合的抗-MSR1抗体。涉及抗-MSR1抗体的示例性组合疗法、共制剂和ADC在本文其他部分公开。
在某些实施方案中，本申请提供了包含本申请的蛋白质-药物缀合物的药物组合物。本申请的药物组合物与适合的载体、赋形剂和其他赋形剂一起配制，其提供改善的转移、递送、耐受性等的药剂。许多适当的制剂可以在所有药物化学家已知的处方集中找到：Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Company，Easton，PA。这些制剂包括例如粉末、糊剂、软膏、胶冻、蜡、油、脂质、含有脂质(阳离子或阴离子)的囊泡(例如LIPOFECTINTM，Life Technologies，Carlsbad，CA)、DNA缀合物、无水吸收糊剂、水包油和油包水型乳液、聚乙二醇乳液(各种分子量的聚乙二醇)、半固体凝胶和含有碳蜡的半固体混合物。还参见Powell等人″Compendium of excipients for parenteral formulations″PDA(1998)J Pharm Sci Technol 52：238-311。
在某些实施方案中，本申请包括方法，其包含向有此需要的受试者施用包含特异性结合HER2的抗-HER2抗体或其抗原结合片段的治疗组合物。该治疗组合物可以包含如本文公开的任何抗体或抗原结合分子和药学上可接受的载体或稀释剂。表述“有此需要的受试者”意指表现出癌症的一种或多种症状或标志的人或非人动物(例如，表达肿瘤或患有下文提及的任何癌症的受试者)，或以其他方式将受益于HER2活性的抑制或降低或HER2+细胞(例如，乳腺癌细胞)的消耗的人或非人动物。
在另一个方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含特异性结合HER2的重组人抗体或其片段和药学上可接受的载体。在相关方面，本申请的特征在于一种组合物，其为抗-HER2抗体和第二治疗部分的组合。在一个实施方案中，第二治疗部分是有利地与抗-HER2抗体组合的任何药剂。涉及本申请的抗-HER2抗体的另外的组合疗法和共制剂在本文其他部分公开。
在另一个方面，本申请提供了使用本申请的抗-HER2抗体靶向/杀伤表达HER2的肿瘤细胞的治疗方法，其中所述治疗方法包含向有此需要的受试者施用治疗有效量的包含本申请的抗-HER2抗体的药物组合物。在一些情况下，抗-HER2抗体(或其抗原结合片段)可用于治疗乳腺癌，或可以通过包括但不限于经修饰的Fc结构域以增加ADCC的方法更具毒性(参见，例如Shield等人(2002)JBC 277：26733)、放射免疫疗法、抗体-药物缀合物或用于增加肿瘤消融效率的其他方法的方法来修饰以更具细胞毒性。
制备本申请化合物的方法
缀合伯胺化合物的技术是本领域已知的。本文采用位点特异性缀合技术来使用经由转谷氨酰胺酶的谷氨酰胺缀合来指导与谷氨酰胺的缀合(参见例如Schibli，AngewChemie Inter Ed.2010，49，9995)。还参见WO 2017147542，其主题明确地并入本文。本文提供了制备如本文所述的谷氨酰胺酰基修饰的蛋白质和蛋白质-药物缀合物(例如ADC)的方法和可用于所提供的方法的组合物，以及通过所述方法产生的组合物。缀合的蛋白质可用于测定、诊断和治疗，包括治疗有次需要的受试者的癌症。
在某些实施方案中，该方法至少包含下列步骤(2)，其中反应性胺化合物为本申请的反应性接头-有效负载化合物。
所述方法包含在抗体的谷氨酰胺残基处进行转谷氨酰胺酶反应。抗体可以为本领域技术人员已知的任何抗体。有用的抗体在本文的章节中描述。
本领域技术人员将认识到抗体应包含至少一个谷氨酰胺残基。在某些实施方案中，所述抗体在EU编号系统中编号为295的一个或多个重链位置处包含谷氨酰胺残基。在本申请中，该位置称作谷氨酰胺295，或Gln295，或0295。本领域技术人员将认识到，这是许多抗体的野生型序列中的保守谷氨酰胺残基。在其他有用的实施方案中，可以将抗体改造以包含谷氨酰胺残基。用于修饰抗体序列以包括谷氨酰胺残基的技术在本领域技术人员的技能范围内(参见，例如Ausubel等人，Current Protoc.Mol.Biol)。
在某些实施方案中，抗体包含两个谷氨酰胺残基，每个重链中有一个。在特定实施方案中，抗体在每条重链中包含Q295残基。在另外的实施方案中，抗体包含一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个或更多个谷氨酰胺残基。这些谷氨酰胺残基可以在重链、轻链或重链和轻链两者中。这些谷氨酰胺残基可以为野生型残基或改造的残基。可以根据标准技术制备抗体。
本领域技术人员将认识到，抗体通常在重链序列中的残基N297处、靠近残基Q295处被糖基化。残基N297处的糖基化可干扰残基Q295处的转谷氨酰胺酶(Dennler等人，同上)，并影响药物与抗体比(DAR)。因此，在有利的实施方案中，抗体未被糖基化。在某些实施方案中，抗体为去糖基化的或无糖基化的。
在去糖基化步骤中，可以通过本领域技术人员显而易见的任何技术使抗体去糖基化。在特定实施方案中，通过从抗体中除去一种或多种寡糖来制备去糖基化抗体。去糖基化可以通过本领域技术人员显而易见的任何技术进行。在某些实施方案中，抗体通过化学方式去糖基化。在某些实施方案中，抗体通过酶促方式去糖基化。在某些实施方案中，可以通过在不使多肽糖基化的系统中表达来使抗体去糖基化。有用的表达系统包括例如原核表达系统。
在某些实施方案中，本文提供了包含下列步骤的方法：
(1)使抗体去糖基化。
抗体可以通过本领域技术人员认为适合的任何技术去糖基化。在某些实施方案中，使抗体与能够裂解抗体与寡糖之间的键的试剂接触。所述试剂可以是本领域技术人员已知的任何试剂。在具体的实施方案中，所述试剂是能够裂解天冬酰胺侧链与N-连接的寡糖之间的键的酶。在某些实施方案中，所述试剂是PNGase F或肽-N4-(N-乙酰基-β-葡糖胺基)天冬酰胺酰胺酶或EC 3.5.1.52。试剂如PNGase F可以从商业来源获得。在某些实施方案中，所述试剂是蛋白质去糖基化混合物(New England Biolabs)。所述试剂以适合于糖基化抗体的量和反应体积的量使用。在某些实施方案中，每约1μg糖基化抗体使用约0.4单位的试剂。
在某些实施方案中，从反应混合物中分离去糖基化抗体。可以通过本领域技术人员认为适合的任何技术分离去糖基化抗体。在特定实施方案中，可以通过尺寸排阻色谱、亲和色谱、过滤、离心超滤或认为适合的任何其他技术分离去糖基化抗体。
然后使没有干扰糖基化的抗体与伯胺化合物反应。在某些实施方案中，无糖基化抗体与伯胺化合物反应以产生谷氨酰胺酰基修饰的蛋白质(例如抗体)。在某些实施方案中，去糖基化的抗体与伯胺化合物反应以产生谷氨酰胺酰基修饰的蛋白质(例如抗体)。出于本说明书的目的，去糖基化抗体可以从任何来源或通过本领域技术人员认为适合的任何技术获得或产生。在某些实施方案中，根据上述步骤(1)使抗体去糖基化。在另外的实施方案中，足以使去糖基化或无糖基化抗体包含至少一个谷氨酰胺残基，所述谷氨酰胺残基充分不含干扰糖基化或其它结构，以可用于与转谷氨酰胺酶反应，如下所述。
伯胺可以是在转谷氨酰胺酶存在下能够与谷氨酰胺残基形成共价键的任何伯胺。有用的伯胺描述于本文的章节中。
在另一个实施方案中，提供了用于生产谷氨酰胺酰基-修饰的抗体的方法，包含下列步骤：
(2)在转谷氨酰胺酶存在下，在约7.0-约8.0之间的反应pH下，在适于伯胺与抗体的多肽链中的谷氨酰胺侧链共价偶联的条件下，用足量的伯胺化合物处理抗体。如本文所讨论的，抗体可以为去糖基化的、无糖基化的，否则以其他方式不含干扰性糖基化。
在另一个实施方案中，提供了用于生产谷氨酰胺酰基-修饰的抗体的方法，包含下列步骤：
(i)向溶剂中添加去糖基化抗体或无糖基化抗体；
(ii)添加至少5摩尔当量的伯胺化合物；
(iii)在使得反应pH约为6.5-约8.5的pH下添加转谷酰胺酶；并且
(iv)混合最终的反应混合物。
在另一个实施方案中，步骤(iv)包含混合最终的反应混合物至少4小时。在某些实施方案中，步骤(iv)包含搅拌最终的反应混合物。在其他实施方案中，步骤(iv)包含振摇反应混合物。
转谷氨酰胺酶可以是本领域技术人员认为适合的任何转谷氨酰胺酶。在某些实施方案中，转谷氨酰胺酶是催化伯胺化合物上的游离氨基和谷氨酰胺残基侧链上的酰基之间形成异肽键的酶。转谷氨酰胺酶也称作蛋白质-谷氨酰胺-Y-谷氨酰转移酶。在具体实施方案中，所述转谷氨酰胺酶分类为EC 2.3.2.13。转谷氨酰胺酶可以来自任何认为适合的来源。在某些实施方案中，所述转谷氨酰胺酶为微生物转谷氨酰胺酶。有用的转谷氨酰胺酶已经从茂原链霉菌(Streptomyces mobaraense)、肉桂链霉菌(Streptomyces cinnamoneum)、灰色链霉菌(Streptomyces griseo-carneum)、淡紫链霉菌(Streptomyces lavendulae)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中分离。还可以使用非微生物转谷氨酰胺酶，包括哺乳动物转谷氨酰胺酶。在某些实施方案中，转谷氨酰胺酶可以通过任何技术产生或从技术人员认为适合的任何来源获得。在特定实施例中，转谷氨酰胺酶获自商业来源。
在步骤(2)中，反应典型地在溶剂中进行。在某些实施方案中，溶剂选自水溶液，例如缓冲溶液或缓冲水、盐水、缓冲盐水、有机溶剂、用磷酸盐缓冲的水、HEPES和MOPS。例如，在一个实施方案中，溶剂为BuPh磷酸缓冲盐水。
在步骤(2)的反应中，抗体可以为本领域技术人员认为适合的任何浓度。在某些实施方案中，抗体以0.1-5mg/ml的浓度存在。在特定实施方案中，抗体以约0.1mg/ml、约0.2mg/ml、约0.3mg/ml、约0.4mg/ml、约0.5mg/ml、约0.6mg/ml、约0.7mg/ml、约0.8mg/ml、约0.9mg/ml、约1.0mg/ml、约1.1mg/ml、约1.2mg/ml、约1.3mg/ml、约1.4mg/ml、约1.5mg/ml、约1.6mg/ml、约1.7mg/ml、约1.8mg/ml、约1.9mg/ml、约2.0mg/ml、约2.5mg/ml、约3.0mg/ml、约3.5mg/ml、约4.0mg/ml、约4.5mg/ml或约5.0mg/ml的浓度存在。
伯胺化合物的浓度可以是本领域技术人员认为适合的任何浓度。在某些实施方案中，伯胺化合物的浓度决定反应的效率(即，提供有用的DAR)。伯胺化合物的浓度可以提供少量的高分子量副产物和高DAR。在某些实施方案中，相对于抗体的浓度，伯胺化合物的浓度为至少约34摩尔当量。在某些实施方案中，相对于抗体的浓度，伯胺化合物的浓度为至少约50摩尔当量。在某些实施方案中，伯胺化合物的浓度相对于抗体的浓度为至少约75摩尔当量。在某些实施方案中，相对于抗体的浓度，伯胺化合物的浓度为至少约85摩尔当量。在某些实施方案中，相对于抗体的浓度，伯胺化合物的浓度为至少约100摩尔当量。在某些实施方案中，相对于抗体的浓度，伯胺化合物的浓度为至少约125摩尔当量。在某些实施方案中，相对于抗体的浓度，伯胺化合物的浓度为至少约150摩尔当量。在某些实施方案中，相对于抗体的浓度，伯胺化合物的浓度为至少约175摩尔当量。在某些实施方案中，相对于抗体的浓度，伯胺化合物的浓度为至少约200摩尔当量。在某些实施方案中，伯胺化合物在下式中：在一些实施方案中，所述抗体的浓度相对于抗体的浓度为至少约300摩尔当量。在某些实施方案中，相对于抗体的浓度，伯胺化合物的浓度为至少约400摩尔当量。在某些实施方案中，相对于抗体的浓度，伯胺化合物的浓度为至少约500摩尔当量。在某些实施方案中，相对于抗体的浓度，伯胺化合物的浓度为至少约600摩尔当量。在某些实施方案中，相对于抗体的浓度，伯胺化合物的浓度为至少约700摩尔当量。在某些实施方案中，相对于抗体的浓度，伯胺化合物的浓度为至少约800摩尔当量。在某些实施方案中，相对于抗体的浓度，伯胺化合物的浓度为至少约900摩尔当量。在某些实施方案中，相对于抗体的浓度，伯胺化合物的浓度为至少约1000摩尔当量。本领域技术人员将认识到，上述范围存在伯胺化合物的溶解度的上限。在某些实施方案中，任何上述浓度小于约500摩尔当量或小于约1000摩尔当量。
转谷氨酰胺酶的U/mg去糖基化抗体的量度可以是本领域技术人员认为适合的任何量。在某些实施方案中，转谷氨酰胺酶至少约为0.5-约30U/mg去糖基化抗体。转谷氨酰胺酶至少约为0.5-约6U/mg去糖基化抗体。转谷氨酰胺酶至少约为1-约30U/mg去糖基化抗体。转谷氨酰胺酶至少约为1.75U/mg去糖基化抗体。转谷氨酰胺酶至少约为2.2U/mg去糖基化抗体。转谷氨酰胺酶至少约为2.5U/mg去糖基化抗体。转谷氨酰胺酶至少约为3.5U/mg去糖基化抗体。转谷氨酰胺酶至少约为5U/mg去糖基化抗体。转谷氨酰胺酶至少约为10U/mg去糖基化抗体。转谷氨酰胺酶至少约为25U/mg去糖基化抗体。出于放大目的，转谷氨酰胺酶至少约为12U/mg去糖基化抗体。
步骤(2)的反应在本领域技术人员认为适合的任何温度下进行。在具体实施方案中，反应在约20℃-约40℃、约25℃-约40℃或约25℃-约37℃的任意温度下进行。在具体的实施方案中，反应在室温下进行。在具体的实施方案中，反应在约25℃、约30℃、约35℃或约37℃下进行。
步骤(2)的反应可以在本领域技术人员认为适合的任何体积中进行，并且取决于反应的大小。在具体实施方案中，反应体积约为10μL-约10mL、约10μL-约5mL、约10μL-约2.5mL、约10μL-约1.0mL、约10μL-约0.5mL、约10μL-约250μL或约10μL-约100μL。
步骤(2)的反应可以进行任何认为适于形成谷氨酰胺酰基修饰的抗体的时间。在某些实施方案中，反应进行约1-约48小时。在具体实施方案中，反应进行约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约15小时、约20小时、约25小时、约30小时、约40小时或约48小时。反应进行至少4小时、至少18小时或至少24小时。反应进程可以通过标准技术监测，例如尺寸排阻色谱、质谱、MALDI、SDS-PAGE、蛋白质印迹等。
在某些实施方案中，从反应混合物中分离或纯化谷氨酰胺酰基修饰的抗体。谷氨酰胺酰基修饰的抗体可以通过本领域技术人员认为适合的任何技术分离或纯化。在具体的实施方案中，谷氨酰胺酰基修饰的蛋白(例如抗体)可以通过色谱、尺寸排阻色谱、亲和色谱或认为适合的任何其他技术分离。例如，在一个实施方案中，通过亲和层析纯化谷氨酰胺酰基修饰的抗体。作为另一个实例，在一个实施方案中，通过蛋白A色谱法纯化谷氨酰胺酰基修饰的抗体。作为另一个实例，在一个实施方案中，通过亲和色谱和蛋白A色谱纯化谷氨酰胺酰基修饰的抗体。
在某些实施方案中，步骤(2)的反应几乎不得到或无高分子量副产物。高分子量副产物可以为是包含在取决于转谷氨酰胺酶和/或最终反应pH的反应中共价键合的两个或更多个重链基团的高分子量种类。在某些实施方案中，步骤(2)的反应提供了不包含基于SDS-PAGE凝胶检查、经由目视检查、染色和/或其他检测方法的可检测副产物的组合物。在某些实施方案中，步骤(2)的反应提供了包含相对于期望的谷氨酰胺酰基修饰的抗体小于10％的副产物的组合物。在某些实施方案中，步骤(2)的反应提供了包含相对于谷氨酰胺酰基修饰的抗体小于5％的副产物的组合物。在某些实施方案中，步骤(2)的反应提供组合物包含相对于谷氨酰胺酰基修饰的抗体少于4％的副产物。在某些实施方案中，步骤(2)的反应提供了包含相对于谷氨酰胺酰基修饰的抗体小于3％的副产物的组合物。在某些实施方案中，步骤(2)的反应提供了包含相对于谷氨酰胺酰基修饰的抗体小于2％的副产物的组合物。在某些实施方案中，步骤(2)的反应提供了包含相对于谷氨酰胺酰基修饰的抗体小于1％的副产物的组合物。在某些实施方案中，步骤(2)的反应提供了包含相对于谷氨酰胺酰基修饰的抗体小于1％的交联抗体的组合物。相对量可以基于质量或摩尔计算。
在某些实施方案中，伯胺化合物包含能够在转谷氨酰胺化后进一步反应的反应性基团(在本文中称作反应性胺接头，例如H2N-SP-W)。在这些实施方案中，谷氨酰胺酰基修饰的抗体可以与反应性有效负载化合物(例如W-D)或反应性接头-有效负载化合物(W-L-D)反应以形成抗体-有效负载缀合物。反应性有效负载化合物、反应性接头化合物或反应性接头-有效负载化合物包含能够与伯胺化合物的反应性基团反应的反应性基团。在某些实施方案中，伯胺化合物包含二烯，并且反应性有效负载化合物或反应性连接体-有效负载化合物包含与二烯反应形成狄尔斯-阿尔德加合物的亲双烯体。在某些实施方案中，伯胺化合物包含能够与二烯形成狄尔斯-阿尔德加合物的亲双烯体，并且反应性有效负载化合物或反应性接头-有效负载化合物包含二烯。
有用的反应性有效负载化合物和反应性连接体-有效负载化合物的实例描述在以上部分中。
因此，本文提供了包含下列步骤的方法：
(3)用反应性接头-有效负载化合物反应或处理谷氨酰胺酰基修饰的抗体以形成抗体-有效负载缀合物。
反应可以在本领域技术人员认为适合的条件下进行。在某些实施方案中，在适于在谷氨酰胺酰基修饰的抗体和接头-有效负载化合物之间形成键的条件下，用反应性接头-有效负载化合物接触或处理谷氨酰胺酰基修饰的抗体。在某些实施方案中，在适于在谷氨酰胺酰基修饰的抗体和接头-有效负载化合物之间形成狄尔斯-阿尔德加合物的条件下，用反应性接头-有效负载化合物接触或处理谷氨酰胺酰基修饰的抗体。适合的反应条件是本领域技术人员众所周知的。示例性反应在以下实施例中提供。
另外，本文提供了包含下列步骤的方法：
(3)使谷氨酰胺酰基修饰的抗体与反应性有效负载化合物反应或用反应性有效负载化合物处理谷氨酰胺酰基修饰的抗体以形成抗体-有效负载缀合物。
反应可以在本领域技术人员认为适合的条件下进行。在某些实施方案中，在适于在谷氨酰胺酰基修饰的抗体和有效负载之间形成键的条件下，用反应性有效负载化合物接触或处理谷氨酰胺酰基修饰的抗体。在某些实施方案中，在适于在谷氨酰胺酰基修饰的抗体和有效负载化合物之间形成狄尔斯-阿尔德加合物的条件下，用反应性有效负载化合物接触或处理谷氨酰胺酰基修饰的抗体。适合的反应条件是本领域技术人员众所周知的。示例性反应在以下实施例中提供。
在某些实施方案中，本文提供了包含下列步骤的方法：
(3a)使谷氨酰胺酰基修饰的抗体与反应性接头化合物反应或用反应性接头化合物处理谷氨酰胺酰基修饰的抗体以形成抗体-接头缀合物；并且
(3b)使抗体-接头缀合物与反应性有效负载化合物反应或用反应性有效负载化合物处理抗体-接头缀合物以形成抗体-有效负载缀合物。
反应可以在本领域技术人员认为适合的条件下进行。在某些实施方案中，在适于在谷氨酰胺酰基修饰的抗体和接头之间形成键的条件下，用反应性接头化合物接触或处理谷氨酰胺酰基修饰的抗体。在某些实施方案中，在适于在抗体-接头缀合物和有效负载之间形成键的条件下，用反应性有效负载化合物接触或处理抗体-接头缀合物。在某些实施方案中，反应性接头化合物包含与本文所述的伯胺化合物的反应性基团反应的第一反应性基团，和能够与反应性有效负载化合物或反应性接头-有效负载化合物反应的第二反应性基团，并且(1)在步骤(3a)的反应条件下是惰性的或(2)用保护基团保护以在步骤(3a)的反应条件下是惰性的。将所述受保护的第二反应性基团脱保护并进行步骤(3b)。适合的反应条件和保护基团是本领域技术人员众所周知的。示例性反应在以下实施例中提供。
在某些实施方案中，从反应混合物中分离或纯化抗体-药物缀合物。可以通过本领域技术人员认为适合的任何技术分离或纯化抗体-药物缀合物。在特定实施方案中，可以通过尺寸排阻色谱、亲和色谱、过滤或认为适合的任何其他技术分离抗体-药物缀合物。
在某些实施方案中，步骤(3)、(3a)或(3b)的反应几乎不得到或无副产物。副产物可以为包含在取决于转谷氨酰胺酶和/或最终反应pH的反应中彼此共价键合的两个或更多个重链多肽的高分子量种类。步骤(3)、(3a)或(3b)的反应提供包含相对于抗体-有效负载缀合物小于10％的副产物的组合物。在某些实施方案中，步骤(3)、(3a)或(3b)的反应提供包含相对于抗体-有效负载缀合物小于5％的副产物的组合物。在某些实施方案中，步骤(3)、(3a)或(3b)的反应提供包含相对于抗体-有效负载缀合物小于4％的副产物的组合物。在某些实施方案中，步骤(3)、(3a)或(3b)的反应提供包含相对于抗体-有效负载缀合物小于3％的副产物的组合物。在某些实施方案中，步骤(3)、(3a)或(3b)的反应提供包含相对于抗体-有效负载缀合物小于2％的副产物的组合物。在某些实施方案中，步骤(3)、(3a)或(3b)的反应提供包含相对于抗体-有效负载缀合物小于1％的副产物的组合物。相对量可以基于质量或摩尔计算。
在一些实施方案中，其中谷氨酰胺酰基修饰的抗体包含两个或更多个反应单元，例如当SP为支链时，步骤3可以重复两次或更多次以用相同或不同的反应性有效负载或接头-有效负载使抗体官能化。
在这类实施方案中，步骤3在相同或不同条件下进行两次或多次，例如在相同或不同pH下。
在一个非限制性实施方案中，其中SP为支链的并且包含两个二烯，步骤3可以进行两次，其中第一次的步骤3在第一种pH下进行，而第二次的步骤3在第二种pH下进行。在一个实施方案中，第一种pH约为6.7-约8.5或约7.0-约7.6或约7.2-约7.4或约7.2。在一个实施方案中，第二种pH约为4.5-约6.3或约5.0-约6.0或约5.5。
实施例
下列实施例示例了本说明书的具体方面。实施例不应被解释为限制性的，因为实施例仅提供对实施方案及其各个方面的具体理解和实施。
如本文所用，除非另有相反的指定，否则，本文的方法和实施例中使用的符号和规则与目前科学文献中使用的那些一致，例如Journal of the American Chemical Societyor the Journal ofBiological Chemistr。特别地、但不限于下列缩写用于实施例并且贯穿于本说明书中：
Figure BDA0004000531960001191
Figure BDA0004000531960001201
如本文所用，在这些方法、方案和实施例中使用的符号和惯例，无论特定缩写是否被具体定义，都与当代科学文献(例如Journal of the American Chemical Society或Journal of Biological Chemistry)中使用的符号和惯例一致。
一般方法
所用的所有溶剂均购自Sigma Aldrich或Fisher Scientific，无需进一步纯化即可使用。在Varian Inova 300MHz和500MHz NMR仪器上记录1H-NMR光谱。化学位移(δ)相对于用于分析的NMR溶剂以ppm报告，并且报告为s-单峰、d-双峰、t-三重峰、q-四重峰、dd-双联双峰、dt-双联重三重峰、dq-双联四重峰和m-多重峰。偶合常数(J)以赫兹(Hz)报告。在具有电喷雾电离源和三重四重离子阱分析仪的Agilent 1200系列或1100系列LC/MS系统上，使用Merck Chromolith RP-18e分析型HPLC柱(整体，50×2mm)和以下分析型HPLC方法测定色谱纯度：注射体积5μL；流速1mL/min；5→95％乙腈水溶液+0.05％AcOH，历时5min(方法A)；或0.1％TFA(方法B)5min；或：1→30％乙腈水溶液，其包含0.1％TFA，历时5min(方法C)；Agilent二极管阵列检测器，波长＝254、220或195nm；室温；或使用Kinetex 1.7μm C18100A柱(50×2.1mm)和以下分析型UPLC方法(方法D)的Waters UPLC/MS-5SQD系统；注射体积5μL；流速0.6mL/min；10→90％乙腈(包含0.02％HCOOH)在水(含有0.02％HCOOH)中的溶液，历时2.5min；全二极管阵列检测器；室温。使用Bruker Ultraflextreme MALDI-TOF/TOF质谱仪分析适当的缀合物。除非另有说明，否则所有原料和溶剂均商购且不经纯化即使用。
实施例1：2-(环戊-1，3-二烯-1-基)乙-1-胺和2-(环戊-1，4-二烯-1-基)乙-1-胺(3)的合成
Figure BDA0004000531960001211
在Ar气氛中向在0℃冷却5min的2-溴乙胺氢溴酸盐(1)(1.01g，4.93mmol)在THF(10mL)中的溶液中滴加氰基环戊二烯氨基钠(2)(5.0ml的2.4M的THF溶液)，历时5min。搅拌该反应混合物，同时温热至22℃。24h后，将该反应混合物转入分液漏斗，用EtOAc(3x)萃取。用H2O、然后用盐水洗涤合并的有机层，用Na2SO4干燥，过滤，浓缩。通过柱色谱法纯化得到的残余物(0→20％在DCM中的[1％在MeOH中的NH4OH])，得到311mg的3(74％收率).LC/MS：保留时间0.214min.(ESI)计算值C7H12N：[M+H]+110；测定值110.1H-NMR(500MHz；CDCl3)：δ6.44-6.08(m，3H)，3.48(s，2H)，2.98(t，J＝1.5Hz，1H)，2.89(dt，J＝10.3，6.8Hz，3H)，2.57-2.50(m，2H)。
实施例2：2-(五甲基环戊-1，3-二烯-1-基)乙-1-胺(6)和6-氨基-N-(2-(1，2，3，4，5-五甲基环戊-2，4-二烯-1-基)乙基)己酰胺草酸盐(9)的合成
如下所述由化合物1合成Diels Alder连接6和9基。
Figure BDA0004000531960001212
步骤1：在Ar气氛中向在0℃冷却5min的2-溴乙胺氢溴酸盐1(750mg，3.66mmol)在无水THF(10mL)中的溶液中滴加1，2，3，4，5-五甲基环戊二烯氨基钠5(17.6ml的0.5M的THF溶液)，5min。搅拌该反应混合物，同时温热至22℃。20h后，用H2O使该反应混合物淬灭，转入分液漏斗，用EtOAc(3x)萃取。用H2O、然后用盐水洗涤合并的有机层，用MgSO4干燥，过滤，浓缩。通过柱色谱法纯化得到的残余物(0→50％在DCM中的[0.1N在MeOH中的NH3])，得到615mg的化合物6(3.44mmol，94％收率)，为淡褐色半固体。LC/MS(方法B)：保留时间1.94min.(ESI)计算值C12H22N：[M+H]+180：测定值180.1H-NMR(500MHz；CDCl3)：δ2.05(t，J＝7.5Hz，2H)，1.75(s，6H)，1.70(s，6H)，1.60(t，J＝7.5Hz，2H)，1.23(bs，2H)，0.87(s，3H)。
步骤2：在Ar气氛中中向化合物6(118mg，0.658mmol)在THF(4.0mL)的溶液中加入Fmoc-6-己酸NHS酯(326mg，0.724mmol)。1h后，浓缩该反应混合物，通过柱色谱法纯化(0→100％EtOAc的己烷溶液)，得到208mg的化合物7(0.404mmol，61％收率).LC/MS(方法A)：保留时间4.38min.(ESI)计算值C33H43N2O3：[M+H]+515；测定值515.
步骤3：向化合物7(208mg，0.404mmol)在DCM(2.0mL)在Ar气氛中中的溶液中加入DBU(121mL，0.809mmol)。20min后，浓缩该反应混合物，通过柱色谱法纯化(0→100％[0.1MNH3在MeOH中的]在DCM中的)，得到98.9mg的化合物8(0.339mmol，84％收率).LC/MS(方法B)：保留时间1.02min.(ESI)计算值C18H33N2O：[M+H]+293；测定值293.
步骤4：向化合物8(98.9mg，0.339mmol)在EtOAc(1mL)中的溶液中加入饱和草酸的EtOAc溶液(～20滴)。过滤形成的沉淀，用5mL EtOAc洗涤，然后高度真空干燥，得到70.8mg的化合物9(0.185mmol，47％收率)，为黄褐色固体。LC/MS(方法B)：保留时间0.21min.(ESI)C18H33N2O游离碱的计算值：[M+H]+293；测定值293.1H-NMR(500MHz；CD3OD)：δ2.89(t，J＝7.6Hz，2H)，2.46-2.43(m，2H)，2.13(t，J＝7.4Hz，2H)，1.77(s，6H)，1.73(s，6H)，1.66-1.58(m，6H)，1.37(quintet，J＝7.7Hz，2H)，0.88(s，3H)。
实施例3：4-(1，2，3，4，5-五甲基环戊-2，4-二烯-1-基)丁-1-胺(10)的合成
Figure BDA0004000531960001221
根据实施例2的步骤1，使用4-溴丁胺氢溴酸盐合成化合物10，得到157.0mg的化合物10(0.757mmol，58％收率)，为黄褐色固体。LC/MS(方法A)：保留时间1.60min.(ESI)计算值C14H26N：[M+H]+208；测定值208.1H-NMR(500MHz；CDCl3)：δ2.57(t，J＝7.0Hz，2H)，1.75(s，6H)，1.66(s，6H)，1.45(bs，2H)，1.37(t，J＝8.2Hz，2H)，1.29(五重峰，J＝7.3Hz，2H)，0.85(s，3H)，0.62-0.55(m，2H)。
实施例4：2-(2-(2-(1，2，3，4，5-五甲基环戊-2，4-二烯-1-基)乙氧基)乙氧基)乙-1-胺乙酸盐(13)的合成
Figure BDA0004000531960001231
步骤1.将Boc-氨基-PEG2-溴化物11(32mg，0.103mmol)溶于1，4-二噁烷(1.0mL)，用Ar吹扫，然后用4M HCl的1，4-二噁烷溶液(0.26mL，1.029mmol)处理。1d后，真空浓缩该反应体系，然后高度真空干燥3h，得到粗的化合物12，为淡黄色油状物。
步骤2.向在Ar气氛中在0℃冷却5min的粗的12(0.103mmol)在无水THF(1.0mL)中的溶液中滴加1，2，3，4，5-五甲基环戊二烯氨基钠5(0.6ml，0.309mmol，0.5M的THF溶液)，历时5min。搅拌该反应混合物，同时温热至r。20h后，用H2O使该反应混合物淬灭，转入分液漏斗，用EtOAc(3x)萃取。用H2O、然后用盐水洗涤合并的有机层，用MgSO4干燥，过滤，浓缩。通过柱色谱法纯化得到的残余物(0→50％[0.1N NH3在MeOH中的]在DCM中的)，真空浓缩纯的级分。然后用1eq的AcOH处理游离胺，真空浓缩，高度真空干燥，得到15mg的化合物13(0.0458mmol，45％收率)，为金色油状物。LC/MS(方法A)：保留时间1.90min.(ESI)C16H30NO2游离碱的计算值：[M+H]+268.2；测定值268.3.1H NMR(500MHz；CD3OD)δ3.51-3.72(m，6H)3.42-3.47(m，2H)3.06-3.15(m，2H)2.75-2.81(m，2H)1.74-1.81(m，9H)1.63-1.74(m，7H)0.85-0.91(m，3H)。
实施例5：乙酸(2-(2-(3-氧代-3-((2-(1，2，3，4，5-五甲基环戊-2，4-二烯烯-1-基)乙基)氨基)丙氧基)乙氧基)乙基)-l5-氮烷基(azaneyl)酯(16)
Figure BDA0004000531960001232
Figure BDA0004000531960001241
步骤1：在室温向酸14(49mg，0.1228mmol)在DMF(1.0mL)中的溶液中加入胺6(20mg，0.1116mmol)在THF(0.1mL)和EDC(43mg，0.2232mmol)中的溶液。搅拌18h后，通过判断反应完成，直接通过使用C18Aq Isco柱(30g)的色谱法纯化。洗脱液：CH3CN的H2O溶液，各自包含0.05％的AcOH(0％-100％)。合并包含产物的级分，冻干，得到35mg的化合物15(0.0624mmol，56％收率)，为淡黄白色固体。LC/MS(方法A)：保留时间3.57min.(ESI)计算值C34H45N2O5：[M+H]+561.3；测定值561.3.
步骤2：将化合物15(20.0mg，0.0357mmol)溶于DMF(0.7mL)，然后加入5％哌啶的DMF溶液(0.1mL，0.0525mmol)。2h后，通过判断反应完成，直接通过反相C18Aq Isco柱(30g)纯化该混合物。洗脱液：CH3CN的H2O溶液，各自包含0.05％的AcOH(0％-100％)。合并包含产物的级分，冻干，得到10.0mg的化合物16(0.0251mmol，70％收率)，为金色油状物。LC/MS(方法A)：保留时间1.69min.(ESI)C19H35N2O3游离碱的计算值：[M+H]+339.3；测定值339.3.1HNMR(500MHz；CD3OD)δ3.69(t，J＝6.35Hz，2H)3.59-3.63(m，5H)3.55-3.58(m，2H)2.88(t，J＝5.13Hz，2H)2.41-2.49(m，2H)2.36(t，J＝6.11Hz，2H)1.89(s，1H)1.77(s，6H)1.68-1.75(m，7H)1.58-1.68(m，2H)0.88(s，3H)。
实施例6：(S)-6-氨基-N-(2-(1，2，3，4，5-五甲基环戊-2，4-二烯-1-基)乙基)-2-(3-(1，2，3，4，5-五甲基环戊-2，4-二烯-1-基)丙酰氨基)己酰胺草酸盐(23)的合成
Figure BDA0004000531960001242
Figure BDA0004000531960001251
步骤1.在Ar气氛中向在干冰/丙酮浴中冷却至-78℃的1，2，3，4，5-五甲基环戊二烯氨基钠5(9.41mL的0.5M的THF溶液，4.70mmol)在THF(7.8mL)中的溶液中加入3-溴-乙基丙酸酯17(0.50mL，3.92mmol)，在-78℃搅拌该混合物。1.5h后，除去冷浴，将该反应混合物再搅拌45min。然后通过添加H2O(280mL)和SiO2(280mg)使该反应混合物淬灭。5min后，通过SiO2小垫过滤该混合物，用DCM(20mL)洗涤滤饼。然后浓缩滤液，溶于EtOH(3.0mL)，用冰/H2O浴冷却至0℃。然后加入NaOH(329mg，8.23mmol)的H2O(3.0mL)溶液，将该混合物在0℃搅拌19h，此时LC/MS通过判断反应完成。然后将该混合物倾倒在1N HCl(水溶液)(10mL)上，用DCM(3x20mL)萃取。用盐水(20mL)洗涤合并的有机层，用MgSO4干燥，过滤，浓缩，得到粗的酸18.LC/MS(方法A)：保留时间3.07min.(ESI)计算值C13H21N：[M+H]+209；测定值209.
步骤2.将粗的酸18(3.92mmol)溶于THF(5.6mL)，然后加入NHS-OH(632mg，5.49mmol)、EDC(902mg，4.70mmol)和DCM(5.6mL)。15h后，再加入NHS-OH(300mg，2.61mmol)，将该混合物搅拌至通过LC/MS判断反应完成。通过垫过滤该混合物，用DCM(50mL)洗涤，然后浓缩滤液。通过柱色谱法纯化得到的残余物(0→50％EtOAc的己烷溶液)，得到893mg的19(2.93mmol，75％收率，历时2步)，为黄白色固体。LC/MS(方法A)：保留时间3.38min.(ESI)计算值C17H24NO4：[M+H]+306；测定值306.
步骤3.向溶于DMA(0.50mL)的Fmoc-Ne-赖氨酸20(49.4mg，0.134mmol)和NHS酯19(45.0mg，0.147mmol)中加入二异丙基乙胺(36mL，0.201mmol)。15h后，通过LC/MS判断反应完成，直接通过反相C18Aq Isco柱(50g)纯化。洗脱液：CH3CN的H2O溶于，各自包含0.05％的AcOH(30％-95％)。合并包含产物的级分，冻干，得到23.9mg的化合物21，为白色固体(0.0428mmol，32％收率)，其中污染有20％的未知杂质。LC/MS(方法A)：保留时间3.53min.(ESI)计算值C34H43N2O5：[M+H]+559；测定值559.
步骤4：将酸21(26.5mg，0.0474mmol)和胺6(8.5mg，0.0474mmol)溶于DCM(1.0mL)。然后向该反应混合物中加入EDC(13.6mg，0.0709mmol)和HOBt(9.6mg，0.0710mmol)。1h后，通过LC/MS判断反应完成，直接通过柱色谱法(12g)(0→100％EtOAc的己烷溶液)纯化，得到16.2mg的化合物22(0.0225mmol，47％收率)，为白色固体。LC/MS(方法A)：保留时间4.44min.(ESI)计算值C46H62N3O4：[M+H]+720；测定值720.
步骤5.将化合物22(16.2mg，0.0225mmol)溶于DCM(0.5mL)，然后加入DBU(3.4mL，0.0225mmol)。10min后，通过LC/MS判断反应完成，真空浓缩该反应混合物，将得到的残余物溶于DMSO(1mL)，通过反相C18Aq Isco柱(15.5g)纯化。洗脱液：CH3CN的H2O溶液，各自包含0.05％的AcOH(10％-80％)。合并包含产物的级分，冻干，得到the乙酸盐of23(7.4mg，0.0149mmol)，为黄白色固体。将该物质溶于1∶1 MeCN/H2O，加入草酸二水合物(2.2mg，0.0174mmol)。冻干该混合物，得到7.2mg的草酸盐23(0.0122mmol，54％收率)，为黄褐色固体。LC/MS(方法A)：保留时间2.52min.(ESI)C31H52N3O游离碱的计算值2：[M+H]+498；测定值498.1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)：δ7.65-7.61(m，3H)，7.56-7.53(m，1H)，4.02-3.98(m，1H)，2.74-2.70(m，2H)，2.25-2.22(m，2H)，1.82-1.77(m，2H)，1.72(s，12H)，1.66(d，J＝13.8Hz，12H)，1.58-1.53(m，2H)，1.53-1.44(m，4H)，1.37-1.32(m，2H)，1.27-1.14(m，2H)，1.08-1.05(m，1H)，0.97-0.89(m，1H)，0.84(s，3H)，0.81(s，3H)。
实施例7：乙酸(S)-6-氨基-N-(2-(呋喃-3-基)乙基)-2-(3-(1，2，3，4，5-五甲基环戊-2，4-二烯-1-基)丙酰氨基)己酰亚氨酯(27)的合成
Figure BDA0004000531960001261
步骤1：向在Ar气氛中在DCM中的(2.6mL)BocNHLys(Fmoc)OH 24(200mg，0.427mmol)和2-(呋喃-3-基)乙-1-胺(43mg，0.388mmol)加入EDC(112mg，0.582mmol)。16h后，通过判断反应完成，直接通过柱色谱法(40g)(10→100％EtOAc的己烷溶液)纯化，得到142.7mg的化合物25(0.254mmol，66％收率)，为白色固体。LC/MS(方法A)：保留时间3.19min.(ESI)计算值C32H40N3O6：[M+H]+562；测定值562.
步骤2：用15％在DCM中的TFA(1.0mL)处理化合物25(21.4mg，0.0381mmol)。30min后，通过判断反应完成，真空浓缩，从1∶1 MeCN/H2O(1mL)中冻干，以除去TFA。然后将粗产物溶于DCM(1.0mL)，加入DIEA(20mL，0.114mmol)。一旦证实pH为碱性，则加入NHS酯19(14.0mg，0.0457mmol)。5h后，再加入NHS酯19(18.0mg，0.0589mmol)。再经过16h后，然后直接通过柱色谱法(12g)(10→100％EtOAc的己烷溶液)纯化该反应混合物，得到18.4mg的化合物26(0.0282mmol，74％收率)，为白色固体。LC/MS(方法A)：保留时间3.74min.(ESI)计算值C40H50N3O5：[M+H]+652；测定值652.
步骤3：将化合物26(28.0mg，0.430mmol)溶于DCM(1.0mL)，然后加入DBU(12.8mL，0.0859mmol)。5min后，通过LC/MS判断反应完成，直接通过反相C18Aq Isco柱(15.5g)纯化该混合物。洗脱液：CH3CN的H2O溶液，各自包含0.05％的AcOH(10％-100％)。合并包含产物的级分，冻干，得到10.4mg的化合物27(0.212mmol，49％收率)，为透明薄膜状物。LC/MS(方法A)：保留时间2.65min.(ESI)C25H40N3O3游离碱的计算值：[M+H]+430；测定值430.1H-NMR(500MHz；CD3OD)：δ7.41(t，J＝1.5Hz，1H)，7.32(s，1H)，6.34(s，1H)，4.20(dd，J＝8.5，5.8Hz，1H)，3.42-3.33(m，4H)，2.85-2.81(m，2H)，2.61(t，J＝7.0Hz，2H)，1.90(s，3H)，1.77(s，6H)，1.73-1.68(m，10H)，1.62-1.50(m，6H)，1.37-1.28(m，2H)，0.91(s，3H)。
实施例8：(S)-6-氨基-N-(2-(2-(2-(1，2，3，4，5-五甲基环戊-2，4-二烯-1-基)乙氧基)乙氧基)乙基)-2-(3-(1，2，3，4，5-五甲基环戊-2，4-二烯-1-基)丙酰氨基)己酰胺乙酸盐(29)
Figure BDA0004000531960001271
步骤1：将酸21(50mg，0.0896mmol)和胺6(26.3mg，0.0985mmol)溶于DMF(1.6mL)。然后向该反应混合物中加入EDC(32.6mg，0.0170mmol)和HOBt(10.9mg，0.0806mmol)。3h后，通过LC/MS判断反应完成，直接通过使用C18Aq Isco柱(50g)的色谱法纯化.洗脱液：CH3CNin H2O，各自包含0.05％的AcOH(0％-100％)。合并包含产物的级分，冻干，得到55mg的化合物28(0.0681mmol，76％收率)，为白色固体。LC/MS(方法A)：保留时间4.55min.(ESI)计算值C50H70N3O6：[M+H]+808.5；测定值808.5.
步骤2：将化合物28(55.0mg，0.0681mmol)溶于DMF(1.4mL)，然后加入5％哌啶的DMF溶液(0.8mL，0.4087mmol)。30min后，通过LC/MS判断反应完成，直接通过反相C18AqIsco柱(50g)纯化该混合物。洗脱液：CH3CN in H2O，各自包含0.05％的AcOH(0％-100％)。合并包含产物的级分，冻干，得到24.0mg的化合物29(0.0372mmol，55％收率)，为白色固体。LC/MS(方法A)：保留时间2.59min.(ESI)C35H60N3O4游离碱的计算值：[M+H]+586.5；测定值586.4.1H-NMR(500MHz；CD3OD)：δ4.23(dd，J＝8.5，5.6Hz，1H)3.45-3.55(m，4H)3.37-3.43(m，2H)3.33-3.36(m，2H)2.73-2.86(m，3H)1.90(s，2H)1.73-1.80(m，15H)1.66-1.73(m，15H)1.47-1.63(m，6H)1.29-1.44(m，2H)0.90(d，J＝2.93Hz，6H)。
实施例9：草酸3-(环戊-1，3-二烯-1-基)丙-1-铵草酸盐和3-(环戊-1，4-二烯-1-基)丙-1-铵(30)的合成
Figure BDA0004000531960001281
根据实施例1，使用3-溴丙基胺合成化合物30。根据实施例2的步骤4形成草酸盐，得到150.7mg的化合物30(0.707mmol，31％收率)，为黄褐色固体。LC/MS(方法A)：保留时间0.24min.(ESI)C8H14N游离碱的计算值：[M+H]+124；测定值124.1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)：δ7.86-7.53(bs，2H)，6.45(s，1H)，6.41(dt，J＝2.5，1.2Hz，0.5H)，6.28-6.27(m，0.5H)，6.19(s，0.5H)，6.06(s，0.5H)，2.94(s，1H)，2.89(s，1H)，2.80-2.76(m，2H)，2.45-2.42(m，1H)，2.39-2.36(m，1H)，1.79-1.73(m，2H)。
实施例10：4-(环戊-1，3-二烯-1-基)丁-1-铵草酸盐和4-(环戊-1，4-二烯-1-基)丁-1-铵草酸盐(31)的合成
Figure BDA0004000531960001291
根据实施例1，使用4-溴丁胺氢溴酸盐合成化合物31。根据实施例2的步骤4形成草酸盐，得到20.1mg的化合物31(0.0884mmol，6.2％收率)，为黄褐色固体。LC/MS(方法C)：保留时间2.68min.(ESI)C9H16N游离碱的计算值：[M+H]+138；测定值138.1H-NMR(500MHz；CD3OD)：δ6.54-6.04(m，3H)，3.00-2.75(m，4H)，2.50-2.47(m，1H)，2.45-2.42(m，1H)，1.89-1.77(m，1H)，1.69-1.64(m，4H)，1.21(d，J＝6.9Hz，1H)。
实施例11：2乙酸-(2-(2-(2-(环戊-1，4-二烯-1-基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙-1-铵乙酸盐和2-(2-(2-(2-(环戊-1，3-二烯-1-基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙-1-铵(34)的合成
Figure BDA0004000531960001292
步骤1.将Boc-氨基-PEG3-溴化物32(157mg，0.441mmol)溶于AcOH(2.0mL)，用Ar吹扫，然后用33％HBr的乙酸溶液(1.0mL)处理。1h后，真空浓缩该反应体系，然后高度真空干燥1h。将得到的残余物与无水Et2O(2x)一起研磨，然后与CHCl3共沸，高度真空干燥，得到142mg的粗的化合物33(0.421mmol，95％收率)，为金色油状物。
步骤2.将粗的33混悬于无水DME(3.0mL)，超声处理至我去溶解。然后在Ar气氛中将该溶液冷却至0℃，用环戊二烯氨基钠2(0.50mL的2.4M的THF溶液，1.20mmol)处理。1h后，用10％HOAc(水溶液)(1.0mL)使该反应体系淬灭，浓缩，用MeCN(1.5mL)稀释得到的残余物，直接通过反相C18Aq Isco柱(50g)纯化。洗脱液：CH3CN的H2O溶液，各自包含0.05％的AcOH(10％-50％)。合并包含产物的级分，冻干，得到不纯化合物33。使用C18AqIsco柱(50g)进行第二次反相纯化洗脱液：CH3CN的H2O溶液，各自包含0.05％的AcOH(10％-35％))。合并包含产物的级分，冻干，得到24mg的化合物34(0.0796mmol，19％收率)，为金色油状物。LC/MS(方法A)：保留时间0.74min.(ESI)C13H24NO3游离碱的计算值：[M+H]+242；测定值242.1H-NMR(500MHz；CDCl3)：δ6.50-6.12(m，3H)，3.91-3.86(m，1H)，3.71-3.63(m，12H)，3.24-3.20(m，1H)，3.02-2.96(m，4H)，2.76-2.73(m，1H)，2.71-2.68(m，1H)。
实施例12：乙酸6-氧代-6-((2-(2，3，4，5-四甲基环戊-2，4-二烯-1-基)乙基)氨基)己-1-铵、乙酸6-氧代-6-((2-(1，2，3，4-四甲基环戊-2，4-二烯-1-基)乙基)氨基)己-1-铵(次要成分)和乙酸6-氧代-6-((2-(1，2，3，5-四甲基环戊-2，4-二烯-1-基)乙基)氨基)己-1-铵(次要成分)(38)的合成
如下所述由化合物35合成Diels Alder接头36和38。
Figure BDA0004000531960001301
步骤1.向在无水THF(20mL)中的2，3，4，5-四甲基环戊二烯35(1.00g，8.18mmol)中加入nBuLi(6.6mL的1.6M的己烷溶液，10.6mmol)。将得到的混悬液在环境温度搅拌2h。在单独的容器中，将溴乙胺氢溴酸盐1(419mg，2.05mmol)混悬于无水THF(2.0mL)，在Ar气氛中用冰/H2O浴冷却至0℃。然后向冷混合物中加入得到35的锂盐，历时5min。再使用无水THF(2x5ml)将任何剩余的锂盐转移至反应混合物中。搅拌该反应混合物，同时温热至22℃。20h后，用H2O使该反应混合物淬灭，转至分液漏斗，用EtOAc(3x)萃取。用H2O、然后用盐水洗涤合并的有机层，用MgSO4干燥，过滤，浓缩。通过柱色谱法纯化得到的残余物(0→70％在DCM中的[0.1N在MeOH中的NH3])，得到101mg的化合物36(0.611mmol，30％收率)，为淡褐色半固体。LC/MS(方法B)：保留时间2.05min.(ESI)计算值C11H20N：[M+H]+166；测定值166.1H-NMR(500MHz；CDCl3)：δ5.78(s，0.8H)，5.75(s，0.2H)，5.29(t，J＝0.7Hz，0.1H)，2.64(bs，0.2H)，2.34-2.29(m，1H)，2.12-2.08(m，2H)，1.87-1.82(m，3H)，1.79(s，3H)，1.77(d，J＝0.7Hz，3H)，1.75(dd，J＝6.3，0.6Hz，2H)，1.68(s，3H)，1.66(s，1H)，1.64-1.60(m，2H)，0.96(d，J＝0.9Hz，1H)，0.90(s，3H)。
步骤2.根据DMA中的实施例2的步骤2合成化合物37，得到95.4mg的化合物37(0.191mmol，85％收率)，为黄白色固体。LC/MS(方法A)：保留时间3.73min.(ESI)计算值C32H41N2O3：[M+H]+501；测定值501.
步骤3.根据实施例2中的步骤3合成化合物38。一旦通过LC/MS判断反应完成，则浓缩该反应体系，用DMSO(0.5mL)稀释得到的残余物，直接通过反相C18Aq Isco柱(50g)纯化。洗脱液：CH3CN in H2O，各自包含0.05％的AcOH(10％-70％)。合并包含产物的级分，冻干，得到20.5mg的化合物38(0.0606mmol，62％收率)，为黄色薄膜状物。LC/MS(方法B)：保留时间2.32min.(ESI)游离胺C17H31N2O计算值：[M+H]+279；测定值279.1H-NMR(500MHz；CD3OD)：δ5.81(d，J＝1.6Hz，0.8H)，5.74(d，J＝1.2Hz，0.2H)，2.87(t，J＝7.6Hz，3H)，2.77(ddd，J＝13.3，10.7，5.4Hz，0.2H)，2.72-2.66(m，0.2H)，2.51-2.48(m，2H)，2.14(td，J＝7.4，2.8Hz，2H)，1.89(s，3H)，1.85-1.84(m，0.8H)，1.81(d，J＝7.7Hz，3H)，1.77(dd，J＝7.4，1.0Hz，4H)，1.72-1.69(m，4H)，1.66-1.57(m，8H)，1.40-1.35(m，2H)，1.01-1.00(m，0.2H)，0.97(s，0.7H)，0.91(s，3H)。
实施例13：乙酸(S)-6-((6-((2-(环己-1，5-二烯-1-基)乙基)氨基)-6-氧代己基)氨基)-6-氧代-5-(3-(1，2，3，4，5-五甲基环戊-2，4-二烯-1-基)丙酰氨基)己-1-铵(主要)和乙酸(S)-6-((6-((2-(环己-1，3-二烯-1-基)乙基)氨基)-6-氧代己基)氨基)-6-氧代-5-(3-(1，2，3，4，5-五甲基环戊-2，4-二烯-1-基)丙酰氨基)己-1-铵(次要)(46)的合成
如下所述由化合物39合成Diels Alder接头42、44和46。
Figure BDA0004000531960001311
步骤1.在-78℃在Ar气氛中将LDA(7.2mL，14.4mmol，2.0M溶液)加入到10mL无水THF中，随后添加环己酮39(1.26g，13.1mmol)在10mL无水THF中的溶液。将该混合物在-78℃搅拌30min，然后滴加PhN(Tf)2(5.1g，14.4mmol)在10mL无水THF中的溶液。15min后，除去冷浴，将得到的混合物在室温搅拌2h。用10％NH4Cl溶液使得到的混合物淬灭，用乙醚(50mLx2)萃取。用盐水洗涤合并的有机层，用Na2SO4干燥，真空浓缩，得到深棕色油状物。通过柱色谱法纯化得到的残余物(0-5％EtOAc的己烷溶液)，得到1.57g的化合物40(6.88mmol，53％收率)，为无色油状物。LC(方法A)：保留时间3.03min.MS(FID)计算值C7H7F3O3S[M]228；测定值228.
步骤2.根据Org.Lett.2013，15，3966-3969中报道的已知方法制备化合物41。在油浴中在加热65℃三氟甲磺酸环己-1，5-二烯-1-基酯40(410mg，0.18mmol)、Pd2(dba)3(82mg，0.009mmol)、XPhos(103mg，0.12mmol)、Cs2CO3(1.4g，4.32mmol)和硝基甲烷(20mL)的溶液，用Isco柱色谱法(0-2％EtOAc的己烷溶液)纯化后得到化合物41(134mg，49％)，为澄清油状物。LC(方法A)：保留时间2.9min.MS(FID)计算值C8H11NO2[M]153；测定值153.
步骤3.在室温向化合物41(50mg，0.326mmol)在AcOH(2.5mL)中的溶液中加入Zn粉(213mmol，3.26mmol)。2h后，通过LC/MS判断反应完成。通过C盐过滤得到的混合物，浓缩，得到60mg的粗的化合物42，其污染有乙酸盐，不经进一步纯化用于下一步。LC/MS(方法A)：保留时间0.18min和0.25min.(ESI)C8H14N游离碱的计算值[M+H]+124.1；测定值124.2.
步骤4.根据DMA中的实施例2的步骤2合成化合物43，得到35.2mg的化合物43(0.0768mmol，28％收率)，为黄白色固体。LC/MS(方法A)：保留时间3.33min.(ESI)计算值C29H35N2O3：[M+H]+459；测定值459.
步骤5.根据实施例2中的步骤3合成化合物44。一旦通过LC/MS判断反应完成，则浓缩该反应体系，用DMSO(0.5mL)稀释得到的残余物，直接通过反相C18Aq Isco柱(15.5g)纯化。洗脱液：CH3CN的H2O溶液，各自包含0.05％的AcOH(0％-70％)。合并包含产物的级分，冻干，得到不纯化合物44。使用EZ Prep(Gemini，30x150mm)进行第二次反相纯化。洗脱液：CH3CN的H2O溶液，各自包含0.05％的AcOH(5％-70％)。合并包含产物的级分，冻干，得到7.3mg的化合物44(0.0309mmol，40％收率)，为透明薄膜状物。LC/MS(方法B)：保留时间1.82min.(ESI)C14H25N2O游离碱的计算值：[M+H]+237；测定值237.1H-NMR(500MHz；CD3OD)：δ6.11-6.09(m，0.1H)，5.85(s，2H)，5.81-5.78(m，0.2H)，5.55(s，1H)，5.49(s，0.2H)，3.23(t，J＝7.3Hz，2H)，2.85(t，J＝7.5Hz，2H)，2.66(s，0.1H)，2.58-2.54(m，0.2H)，2.24-2.18(m，4H)，2.13-2.05(m，3H)，1.90(s，1H)，1.75-1.69(m，0.4H)，1.68-1.59(m，4H)，1.42-1.36(m，2H)。
步骤6.向化合物44(9.9mg，0.0421mmol)在DMA(1.1mL)中的溶液中加入化合物21(35.3mg，0.0631mmol)、HATU(32.0mg，0.0842mmol)和NMM(14μL，0.126mmol)在DMA(0.40mL)中的溶液。2小时后，用AcOH使反应淬灭，直接通过反相C18Aq Isco柱(50g)纯化。洗脱液：CH3CN的H2O溶液，各自包含0.05％的AcOH(30％-95％)。合并包含产物的级分，冻干，得到19.8mg的化合物45(0.0255mmol，61％收率)，为白色固体。UPLC/MS(方法D)：保留时间2.29min.(ESI)计算值C48H65N4O5：[M+H]+778；测定值778.
步骤7.向化合物45(19.8mg，0.0255mmol)在DMA(0.85mL)中的溶液中加入DBU(4.1mg，0.0268mmol)在DMA(30μL)中的溶液。25分钟后，用AcOH使该反应体系淬灭，直接通过反相C18Aq Isco柱(30g)纯化。洗脱液：CH3CN的H2O溶液，各自包含0.05％的AcOH(30％-95％)。合并包含产物的级分，冻干，得到5.7mg的化合物46(0.0103mmol，40％收率)，为白色固体。LC/MS(方法B)：保留时间2.16min.(ESI)C33H55N4O3游离碱的计算值：[M+H]+555；测定值555.1H-NMR(300MHz；CDCl3)：δ7.52(d，J＝3.8Hz，1H)，6.35(d，J＝7.5Hz，1H)，6.09(d，J＝9.6Hz，0.2H)，5.83(q，J＝10.0Hz，3H)，5.52(s，1H)，5.31(d，J＝7.0Hz，3H)，4.84(d，J＝26.1Hz，0.5H)，4.36(q，J＝7.1Hz，1H)，3.48(s，1H)，3.29(q，J＝6.4Hz，2H)，3.18(dt，J＝13.6，6.8Hz，2H)，2.86(t，J＝6.8Hz，2H)，2.51(s，0.2H)，2.18(dd，J＝16.8，7.2Hz，3H)，2.11(s，3H)，1.94(s，3H)，1.75-1.59(m，20H)，1.54-1.25(m，10H)，0.88(s，3H)。
实施例14：乙酸(S)-6-((2-(呋喃-3-基)乙基)氨基)-5-(3-(呋喃-3-基)丙酰氨基)-6-氧代己-1-铵(48)的合成
Figure BDA0004000531960001331
Figure BDA0004000531960001341
步骤1：根据实施例7中的步骤2，使用在DMF(1.0mL)中的粗的脱保护的胺25(27mg，0.0584mmol)、3-(呋喃-3-基)丙酸(9.8mg，0.070mmol)和EDCI(20mg，0.105mmol)和TEA(16mL，0.117mmol)合成化合物47。15h后，通过LC/MS判断反应完成.然后直接通过EZ Prep(Gemini，30x150mm)纯化粗反应混合物。洗脱液：CH3CN的H2O溶液，各自包含0.05％的AcOH(10％-95％)。合并包含产物的级分，冻干，得到13.5mg的化合物47(0.0231mmol，40％收率)，为白色固体。LC/MS(方法A)：保留时间3.2min.(ESI)计算值C34H38N3O6：[M+H]+584.3；测定值584.3.
步骤2.将化合物47(10mg，0.0171mmol)溶于DCM(1.2mL)，在室温滴加5％哌啶的DMF溶液(200mL)。16h后，通过LC/MS判断反应完成。浓缩该混合物以除去全部挥发性物质，溶于0.5mL DMSO。通过EZ Prep(Gemini，30x150mm)纯化粗残余物。洗脱液：CH3CN的H2O溶液，各自包含0.05％的AcOH(10％-95％)。合并包含产物的级分，冻干，得到6.1mg的化合物48(0.0145mmol，85％收率)，为白色固体。LC/MS(方法A)：保留时间1.4min.(ESI)C19H28N3O4游离碱的计算值：[M+H]+362.2；测定值362.2.1H-NMR(500MHz；CD3OD)：δ7.41(dt，J＝5.6，1.7Hz，2H)，7.33(dd，J＝1.5，0.8Hz，1H)，7.30(dd，J＝1.5，0.9Hz，1H)，6.35(ddd，J＝4.4，1.7，0.8Hz，2H)，4.26(dd，J＝8.8，5.5Hz，1H)，3.40-3.34(m，3H)，2.85-2.79(m，2H)，2.74(td，J＝7.2，4.5Hz，2H)，2.62(t，J＝7.1Hz，2H)，2.51-2.48(m，2H)，1.90(s，2H)，1.78-1.71(m，1H)，1.60-1.54(m，3H)，1.32-1.22(m，2H)。
实施例15：乙酸5-(3-甲氧基呋喃-2-基)戊-1-铵(53)的合成
Figure BDA0004000531960001342
Figure BDA0004000531960001351
步骤1：如文献中报道的制备化合物49(Bioconjugate Chem.2018，29，2046-2414)。用LAH(1.1mL，1.5eq.的1.0M的THF溶液)还原化合物49(150mg，0.706mmol)，随后用酒石酸钾钠水溶液(0.5mL)处理，得到相应的醇50(136mg，定量收率).LC/MS(方法A)：保留时间1.9min.(ESI)计算值C10H17O3：[M+H]+185.1；测定值185.1.
步骤2：在Ar气氛中在冰/H2O浴中向在无水DCM(2.5mL)中的化合物50(130mg，0.705mmol)中加入TEA(150μL，1.5eq.)，随后滴加甲磺酰氯(71μL，1.3eq.)。将得到的混合物在0℃搅拌30min，然后在室温搅拌2h。通过添加H2O使反应淬灭，用DCM(3x)萃取。用盐水洗涤合并的有机层，用Na2SO4干燥，得到143mg的粗的化合物51(0.545mmol，78％收率)，不经进一步纯化用于下一步。UPLC/MS(方法D)：保留时间1.4min.(ESI)计算值C11H19O5S：[M+H]+263.1；测定值262.9.
步骤3：将化合物51(143mg，0.545mmol)和K-邻苯二甲酰亚胺(110mg，0.599mmol)在DMF(1mL)中的混合物在KI(9mg，0.1eq.)存在下在室温搅拌3天，直至通过LC/MS判断反应完成，然后真空浓缩挥发性物质。通过柱色谱法纯化得到的残余物(0-60％EtOAc的己烷溶液)，得到64mg的化合物52(0.204mmol，38％收率).LC/MS(方法A)：保留时间3.1min.(ESI)计算值C18H20NO4：[M+H]+314.1；测定值314.1.
步骤4：将化合物52(30mg，0.0957mmol)溶于EtOH(0.5mL)，在环境温度加入NH2-NH2·H2O(10μL，0.143mmol，1.5当量)。16h后，将该反应体系适度加热至40℃以完成反应。真空浓缩粗混合物，将得到的残余物溶于DMSO(1mL)，通过EZ Prep(Gemini，30x150mm)纯化。洗脱液：CH3CN的H2O溶液，各自包含0.05％的AcOH(10％-95％)。合并包含产物的级分，冻干，得到8.5mg的化合物53(0.0464mmol，48％收率).UPLC/MS(方法D)：保留时间0.83min.(ESI)C10H18NO2游离碱的计算值：[M+H]+184.1；测定值183.9.1H-NMR(500MHz；CDCl3)：δ7.10(t，J＝2.4Hz，1H)，6.26(d，J＝0.8Hz，1H)，3.71(s，3H)，3.15(bs，2H)，2.72-2.70(m，2H)，2.60-2.57(m，2H)，2.00(s，3H)，1.64-1.58(m，2H)，1.51-1.48(m，2H)，1.36-1.32(m，2H)。
实施例16：乙酸3-(3-甲氧基呋喃-2-基)丙-1-铵(57)的合成
Figure BDA0004000531960001361
步骤1：在冰浴中在Ar气氛中向NaH(95.4mg，2.39mmol，1.5eq.)在无水THF(3mL)中的混悬液中滴加(氰基甲基)膦酸二乙酯(295μL，1.82mmol，1.15eq.)。将得到的混合物搅拌030min，然后向这种冷溶液中滴加化合物54(200mg，1.59mmol)在THF(1mL)中的溶液。5min后，除去冰浴。将该反应混合物在室温搅拌1h。用H2O使该反应体系淬灭，用EtOAc萃取。通过柱色谱法纯化粗残余物(0-90％EtOAc的己烷溶液)，得到220mg的化合物54(1.48mmol，93％收率)，为黄白色固体。UPLC/MS(方法D)：保留时间1.09min和1.19min.(Z/E＝1：9).(ESI)计算值C8H8NO2：[M+H]+150.1；测定值149.9.
步骤2：用Wilkinson催化剂RdCl(PPh3)3(68mg，0.1eq.)在THF/MeOH(4mL，1∶1，v/v)的混合物中在H2压力下处理化合物55(110mg，0.737mmol)。48h后反应完成，得到粗的选择性还原的产物56。通过柱色谱法纯化粗残余物(0-90％EtOAc的己烷溶液)，得到44mg的化合物56(0.291mmol，40％收率).UPLC/MS(方法D)：保留时间1.01min.(ESI)计算值C8H10NO2：[M+H]+152.1；测定值151.9.
步骤3：用LAH(84μL，0.0843mmol，1.5eq)在冰浴中处理化合物56(8.5mg，0.0562mmol)。2h后，谨慎地用H2O(0.5mL)和1.0M NaOH溶液(0.5mL)使冷混合物淬灭。用Et2O萃取期望的产物，真空浓缩，得到2.5mg的化合物56(0.0161mmol，29％收率).UPLC/MS(方法D)：保留时间0.53min.(ESI)计算值C8H14NO2：[M+H]+156.1；测定值155.9.1H-NMR(500MHz；CDCl3)：δ7.12(s，1H)，6.27(s，1H)，3.73(s，3H)，2.75(bs，2H)，2.66(t，J＝7.3Hz，2H)，2.06-2.05(m，2H)，1.81-1.78(m，2H)。
抗体和去糖基化
在下列实施例中，使用400U/mg mAb PNGaseF(NEB P0704L)在PBS pH 7.4在37℃使两种抗体，即来自Carter等人，PNAS1992 89 4285的具有来源于humAb4D5-8的可变区的抗-HER2抗体、也称作曲妥珠单抗和来源于具有与肿瘤或感染性疾病无关的免疫抗原的非结合同种型对照去糖基化。使用旋转过滤器(Amicon，30kDa截止值)对反应混合物进行缓冲液交换成PBS pH 7.4。这使得295Q残基被转谷酰胺酶接近以将抗体缀合至2的最大负载。
在以下实施例中还使用了包含N297Q突变的抗-MSR1抗体H1121234N，该突变消除了Fc在该位点的N-连接糖基化。突变允许抗体在重链的295Q和297Q处缀合至4的最大负载。包含相同N297Q突变的非结合抗体用作非结合同种型对照。
实施例17-化合物3接头的细菌转谷酰胺酶缀合
mAb-3中间体-谷氨酰基修饰的mAbs
Figure BDA0004000531960001371
使去糖基化对照HER2和MSR1抗体以1mg/mL在PBS pH 7.4中缀合。以相对于抗体50-150倍摩尔过量添加接头3，并通过每μg抗体添加12个单位的细菌转谷氨酰胺酶(Zedira，T1001)引发反应，并在37℃下孵育4-16小时。通过旋转过滤器(Amicon，30kDa截止值)或使用Superdex 200 Increase 10/300GL柱的尺寸排阻色谱法除去过量的接头3。使用与Xevo G2-S QT质谱仪连接的Waters Acquity UPLC，通过ESI-MS分析缀合物以测定接头抗体比(LAR)。在C4柱(2.1X50mm ACQUITY UPLC BEH蛋白质C4，1.7um，300A)上以10min梯度(分钟：流动相B的百分比；0∶10％，1∶10％，5∶90％，7∶90％，7.2∶10％，10∶10％)进行色谱分离。流动相A为0.1％甲酸的水溶液，流动相B为0.1％甲酸的乙腈溶液。流速设定在0.3mL/min。检测器TOF扫描设定为m/z 500-4500，主要参数如所列(毛细管电压3.0kV、取样锥80V、源偏移在100V、源温度150℃、去溶剂化温度450草、锥气0L/hr、去溶剂化气体800L/hr)。用MassLynx软件内的Maxent函数对光谱进行去卷积。当根据强度加权时，所得分子离子相当于表3中列出的负载。尺寸排阻HPLC确定所有缀合物均＞95％单体。
实施例18-狄尔斯-阿尔德与谷氨酰基修饰的mAbs在pH＝7.2缀合：方法A
在pH 7.2-7.4的PBS和10％DMSO中以3-5mg/ml缀合mAb-3中间体。将接头-有效负载mc-VC-PABC-MMAE，Doronina，S.O.等人，Nat.Biotechnol.200321 778；mc-VA-PBD，Jeffrey，S.C.等人，Protein Conjugate Chem.2013 24 1256；mal-PEG8-VC-PABQ-Rifanalog和mal-VC-PABQ-Rifalogue，Lehar，S.M.等人，Nature 2015 527 323-328(其各自如下所示)以相对于抗体3.5-10倍摩尔过量添加等人，Nature 2015 527 323-328(其各自在下文说明)，并在室温下孵育45-120分钟。通过蛋白质A色谱法(Pierce Protein AColumns，ThermoScientific，产品编号20356)或使用Superdex 200 Increase 10/300GL柱的尺寸排阻色谱纯化缀合物。通过LC-MS(根据实施例17中描述的方法)测定药物与抗体比。当根据强度加权时，所得分子离子相当于表3中列出的负载。尺寸排阻HPLC确定所有缀合物均＞95％单体。
Figure BDA0004000531960001381
Figure BDA0004000531960001391
实施例19-与谷氨酰基修饰的mAbs在pH＝5.5的狄尔斯-阿尔德缀合：方法B
使mAb-3中间体以4mg/mL在50mM组氨酸缓冲液pH 5.5中缀合。10％DMSO用于mc-VC-PABC-MMAE。以相对于抗体10-20倍摩尔过量添加接头-有效负载mc-VC-PABC-MMAE或Alexa FluorTM 647C2马来酰亚胺(Invitrogen)，并在室温下孵育24-40小时。使用Superdex200 Increase 10/300GL柱通过尺寸排阻色谱法纯化缀合物。通过LC-MS(根据实施例2中所述的方法)测定药物与抗体比。当根据强度加权时，所得分子离子相当于所列的负载量。在表3中。尺寸排阻HPLC确定所有缀合物均>95％单体。
实施例20-化合物4接头的赖氨酸缀合
mAb-4中间体-随机修饰的mAb
Figure BDA0004000531960001392
使对照和HER2抗体以5mg/ml在50mM磷酸盐缓冲液pH 8.0中缀合。以相对于抗体2-3倍摩尔过量添加接头4(St.Amant，A.H.等人，Protein Conjugate Chem.2018 29 2406)并在室温下孵育2小时。使用旋转过滤器(Amicon，30kDa截止值)将反应混合物缓冲液交换为PBS，pH7.4。使用实施例17中描述的方法，通过ESI-MS分析缀合物以测定接头抗体比(LAR)。当根据强度加权时，所得分子离子相当于表3中列出的负载。
实施例21-与随机mAb中间体的狄尔斯-阿尔德缀合
在PBS pH 7.4和10％DMSO中以3-5mg/ml缀合mAb-4中间体。如上所示，以相对于抗体4倍摩尔过量添加有效负载(mc-VA-PBD)，在室温下孵育2小时。通过用活性炭处理除去过量的接头-有效负载，然后使用Sephadex PD10柱(GE Healthcare，产品编号17085101)脱盐。使用实施例2中所述的方法通过ESI-MS分析缀合物以测定药物抗体比(DAR)。当根据强度加权时，所得分子离子相当于表3中列出的负载。尺寸排阻HPLC确定所有缀合物均>95％单体。
表3列出了每种缀合物的载量(LAR和DAR)。转谷氨酰胺酶缀合的3产生接近2的理论值的LAR。使抗体-3二烯中间体与狄尔斯-阿尔德马来酰亚胺配偶体mc-VC-PABC-MMAE、mal-PEG8-VC-PABQ-Rifanalog或链间二硫化物聚集倾向的mc-VA-PBD反应(Jeffrey，S.C.等人，Protein Conjugate Chem.2013 24 1256)产生具有相似值的DAR。赖氨酸缀合的二烯4产生1.2和1.8的LAR，然而，与相同马来酰亚胺的狄尔斯-阿尔德反应产生较低相对DAR的缀合物。这些结果表明，组合的转谷氨酰胺酶和狄尔斯-阿尔德缀合可以适应多种马来酰亚胺接头-有效负载，改善总体效率，并将它们位点选择性地定位在具有低水平聚集体的抗体上。
表3
Figure BDA0004000531960001401
Figure BDA0004000531960001411
*Alexa FluorTM 647C2马来酰亚胺/抗体比
实施例22-逐步狄尔斯-阿尔德缀合
在某些实施方案中，方法A和方法B可以在带有两个二烯的相同抗体-接头-有效负载中间体上连续进行。该策略可以用于产生携带相同有效负载或两个不同有效负载部分的抗体-有效负载缀合物。例如，通过实施例18的方法A将具有化合物27接头的抗体与mc-vc-PAB-MMAE缀合，随后通过实施例19的方法B进一步与Alexa FluorTM 647缀合。通过旋转过滤器(Amicon，30kDa截止值)在方法A和B之间进行缓冲液交换步骤，以通过PBS pH＝7.2除去额外的有效负载，然后用50mM组氨酸pH＝5.5缓冲液改变方法B)的pH。
表4
Figure BDA0004000531960001412
Figure BDA0004000531960001421
实施例23-体外细胞毒性测定
在本实施例中，评估了各种抗体-药物缀合物和裸有效负载在体外杀伤表达抗原的肿瘤细胞的能力。.
将SKBR3(Her2+)细胞以每孔8000个细胞接种在96孔板中的完全生长培养基中并生长过夜。对于细胞活力曲线，将连续稀释的缀合物或裸有效载荷以100nM-5pM的终浓度加入细胞中并孵育3天。使用类似条件运行NCI H929和NCI H1975(HER2-)细胞作为阴性对照。为了测量活力，将细胞与CCK8(Dojindo)一起孵育最后2小时，并在Victor(Perkin Elmer)上测定450nm处的吸光度(OD450)。背景技术从所有孔中减去根据洋地黄皂苷(40nM)处理的细胞确定的背景OD450水平，并将活力表示为未处理对照的百分比。根据10-点响应曲线上的四参数逻辑方程(GraphPad Prism)确定IC50值。HER2-3-mc-VC-PAB-MMAE ADC和同种型Cntl-3-mc-VC-PAB-MMAE ADC的IC50分别为0.096nM和＞100nM。链间二硫化物缀合物具有与转谷氨酰胺酶位点特异性狄尔斯-阿尔德缀合物相似的IC5o值。这表明狄尔斯-阿尔德缀合对抗体药物缀合物的功能没有影响。针对有效负载当量校正IC50值，并且其他转谷氨酰胺酶位点特异性狄尔斯-阿尔德缀合物的细胞活力的结果如表5中所示。为了比较，mc-VC-PABC-MMAE链间二硫化物缀合的分子根据Doronina，S.O.等人，Nat.Biotechnol.2003 21 778制备。根据来自Jeffrey，S.C.等人，Protein Conjugate Chem.2013 24 1256的结果，缀合mc-VA-PBD的所有尝试均不成功，并进一步证明了位点特异性转谷氨酰胺酶反应与狄尔斯-阿尔德偶联方法组合的效用。
表5
Figure BDA0004000531960001431
Figure BDA0004000531960001441
*PNR＝未达到坪值
实施例24-胞内金黄色葡萄球菌抗体-药物缀合物杀伤测定
为了测试ADC减少胞内金黄色葡萄球菌的能力，使本申请的利福霉素类似物与实施例1中鉴定的抗-MSR1抗体或也在实施例1中鉴定的同种型对照抗体缀合。
使THP-1单核细胞系在培养基(RMPI+10％FBS+1％青霉素/链霉素)中生长，然后以1e细胞/孔的密度接种在24孔板中，并在使用200nM PMA感染前分化成巨噬细胞3天。在实验之前，用温热培养基(不含FBS的RMPI)洗涤THP-1以除去青霉素/链霉素。使金黄色葡萄球菌NRS384的过夜培养物在RPMI中生长，用PBS洗涤两次，并以1e7cfu/m重悬于PBS中。用RMPI+10％FBS中的金黄色葡萄球菌混悬液以1e6cfu/孔感染THP-1，感染复数为10∶1(金黄色葡萄球菌：巨噬细胞)。将板以300×g旋转5分钟以使细菌的粘附同步，然后在37℃下孵育2小时。通过用温热培养基(不含FBS的RMPI)洗涤两次除去自由漂浮的细菌，并通过加入含有50μg/ml庆大霉素的培养基(RMPI+10％FBS)杀灭剩余的胞外金黄色葡萄球菌。1小时后，抽吸培养基，并将指定的mAb和ADC以稀释系列一式三份添加到包含50μg/ml庆大霉素的培养基(RMPI+10％FBS)中的感染的巨噬细胞中，以防止金黄色葡萄球菌的胞外生长。稀释系列以10ug/mL开始，其中对于MSR1 ADC：MSR1-mc-VC-PABQ-Rifalogue(链间CYS)、MSR1-mal-PEG8-VC-PABQ-Rifanalog(链间CYS)、MSR1-3-mc-VC-PABQ-Rifalogue(TG-DA)，按照1∶3稀释5个点(10、3.3、1.1、0.37和0.12ug/mL终浓度)。仅在最高浓度下测试MSR1 mAb、同种型对照mAb和同种型对照ADCs：同种型Cntl-mc-VC-PABQ-Rifalogue(链间CYS)、同种型Cntl-mal-PEG8-VC-PABQ-Rifanalog(链间CYS)和同种型Cntl-3-mc-VC-PABQ-Rifalogue(TG-DA。还包括未处理的孔作为感染的基线。24小时后，将板用不含FBS的温热RPMI洗涤两次，然后加入50μL在PBS中的0.1％Triton X-100以裂解THP-1；裂解后，向每个孔中加入450μL PBS。通过在PBS中连续稀释并铺板到胰蛋白酶大豆琼脂平板上，根据菌落形成单位计数金黄色葡萄球菌存活量。将结果概括在表6中。
表6：抗-MSR1 Ab-抗生素的平均菌落形成单位
Figure BDA0004000531960001451
Figure BDA0004000531960001461
如表6中所示，MSR1 mc-VC-PABQ-Rifalogue ADC、MSR1 3-mc-VC-PABQ-Rifalogue(链间CYS和TG-DA)和MSR1-mal-PEG8-VC-PABQ-Rifanalog(链间CYS)在10、3.3和1.1mg/mL的浓度下表现出体外从感染的巨噬细胞根除胞内金黄色葡萄球菌的能力，在较低浓度下活性剂量依赖性降低。用10μtg/ml的未缀合抗体(同种型对照mAb、抗-MSR1 mAb)和同种型对照ADC(链间CYS和TG-DA)处理的巨噬细胞以与未处理的对照相似的水平携带胞内金黄色葡萄球菌。这些数据表明，MSR1-3-mc-VC-PABQ-Rifalogue(链间CYS和TG-DA)可用于有效杀灭驻留在巨噬细胞储库内的病原体。
实施例25-胞内金黄色葡萄球菌抗体-药物缀合物杀伤测定
使本申请的利福霉素类似物与包含N297Q突变的抗-MSR1抗体H1121234N缀合，这种突变消除了该位点处Fc的N-连接糖基化，也用于实施例1中，以测试ADC减少胞内金黄色葡萄球菌的能力。突变允许抗体在重链的295Q和297Q处缀合至4的最大负载。包含相同N297Q突变的非结合抗体用作非结合同种型对照抗体，也用于实施例1中。
使THP-1单核细胞系在培养基(RMPI+10％FBS+1％青霉素/链霉素)中生长，然后以1e5细胞/孔的密度接种在48孔板中，并在使用200nM PMA感染前分化成巨噬细胞3天。在实验之前，用温热培养基(不含FBS的RMPI)洗涤THP-1以除去青霉素/链霉素。使金黄色葡萄球菌NRS384的过夜培养物在RPMI中生长，用PBS洗涤两次，并以1e7 cfu/mL重悬于PBS中。用RMPI+10％FBS中的金黄色葡萄球菌混悬液以1e6 cfu/孔感染THP-1，感染复数为10∶1(金黄色葡萄球菌∶巨噬细胞)。将板以300×g旋转5分钟以使细菌的粘附同步，然后在37℃下孵育2小时。通过用温热培养基(不含FBS的RMPI)洗涤两次除去自由漂浮的细菌，并通过加入包含50μg/ml庆大霉素的培养基(RMPI+10％FBS)杀灭剩余的胞外金黄色葡萄球菌。1小时后，抽吸培养基，并将指定的mAb和ADC以稀释系列一式两份添加到包含50μg/ml庆大霉素的培养基(RMPI+10％FBS)中的感染的巨噬细胞中，以防止金黄色葡萄球菌的胞外生长。稀释系列以30μg/mL开始，其中对于MSR1 ADC(TG-DA)：MSR1-3-mal-PEG8-VC-PABQ-Rifanalog和MSR1-3-mc-VC-PABQ-Rifalogue，按照1∶3稀释6个点(30、10、3.3、1.1、0.37和0.12μg/mL终浓度)。仅在最高浓度下测试对照ADC(通过本申请转谷氨酰胺酶-狄尔斯-阿尔德(“TG-DA”)方法制备)：同种型Cntl-3-mc-PEG8-VC-PABQ-Rifanalog、同种型Cntrl-3-mc-VC-PABQ-Rifalogue和未缀合的抗体。还包括未处理的孔作为感染的基线。24小时后，将板用不含FBS的温热RPMI洗涤两次，然后加入50μL在PBS中的0.1％Triton X-100以裂解THP-1；裂解后，向每个孔中加入450μL PBS。通过在PBS中连续稀释并铺板到胰蛋白酶大豆琼脂平板上，根据菌落形成单位计数金黄色葡萄球菌存活量。将结果概括在表7中。
表7：抗-MSR1 Ab-抗生素的平均菌落形成单位
Figure BDA0004000531960001471
Figure BDA0004000531960001481
如表7中所示，MSR1-3-mc-VC-PABQ-Rifalogue(TG-DA)和MSR1-3-mc-PEG8-VC-PABQ-Rifanalog(TG-DA)表现出在体外从感染的巨噬细胞减少胞内金黄色葡萄球菌的能力，在较低浓度下活性剂量依赖性降低，在最高浓度下细菌负荷减少3-4个对数。用30μg/ml的对照mAbs处理的巨噬细胞以与未处理的对照相似的水平携带胞内金黄色葡萄球菌，并且与未处理的对照相比，ADC同种型Cntl-3-mc-VC-PABQ-Rifalogue(TG-DA)和同种型Cntl-3-mal-PEG8-VC-PABQ-Rifanalog使胞内金黄色葡萄球菌减少约1log。这些数据表明，抗-MSR1ADC、MSR1-3-mc-VC-PABQ-Rifalogue(TG-DA)和MSR1-3-mc-PEG8-VC-PABQ-Rifanalog(TG-DA)可以用于有效杀灭驻留在巨噬细胞储库内的病原体。
由于在不脱离本申请的范围和精神的情况下，可以对上述主题进行各种改变，所以旨在将包含在上述描述中或在所附权利要求中限定的所有主题解释为对本申请的描述和示例明。根据上述教导，本申请的许多变型和改变是可能的。因此，本说明书旨在涵盖落入所附权利要求的范围内的所有这些替代、变型和改变。
本文引用的所有专利、申请、出版物、测试方法、文献和其他材料均通过引用整体并入本文，如同实质上理存在于本说明书中一样。
                         序列表
<110>  瑞泽恩制药公司
<120>  狄尔斯-阿尔德缀合方法
<130>  250298.000130
<160>  466
<170>  PatentIn 版本3.5
<210>  1
<211>  363
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  1
caggtccaat tggtacagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtg      60
tcctgcaagg tttccggata caccctcact gaattatcca tacactgggt gcgccaggtt     120
cctggaaaag gacttgagtg gatgggaggt tttgatcctg aagagggtga aacaatcttc     180
gcacaggagt tccgggacag agtcaccttg accgaggaca catctccaga cacagcctac     240
atggagttga gcagcctgaa atctgaggac gcggccgtat attactgtac aaccccccga     300
tattgtaata atggtatatg ttatgactac tggggccagg gaaccctggt caccgtctct     360
tca                                                                   363
<210>  2
<211>  121
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  2
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Glu Leu
            20                  25                  30
Ser Ile His Trp Val Arg Gln Val Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Gly Phe Asp Pro Glu Glu Gly Glu Thr Ile Phe Ala Gln Glu Phe
    50                  55                  60
Arg Asp Arg Val Thr Leu Thr Glu Asp Thr Ser Pro Asp Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Ala Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Thr Thr Pro Arg Tyr Cys Asn Asn Gly Ile Cys Tyr Asp Tyr Trp Gly
            100                 105                 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>  3
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  3
ggatacaccc tcactgaatt atcc                                             24
<210>  4
<211>  8
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  4
Gly Tyr Thr Leu Thr Glu Leu Ser
1               5
<210>  5
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  5
tttgatcctg aagagggtga aaca                                             24
<210>  6
<211>  8
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  6
Phe Asp Pro Glu Glu Gly Glu Thr
1               5
<210>  7
<211>  42
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  7
acaacccccc gatattgtaa taatggtata tgttatgact ac                         42
<210>  8
<211>  14
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  8
Thr Thr Pro Arg Tyr Cys Asn Asn Gly Ile Cys Tyr Asp Tyr
1               5                   10
<210>  9
<211>  327
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  9
gacatccaga tgacccagtc gccttcctcc ctgtctgcat ctgtgggaga cagagtcacc      60
atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc aactatttaa attggtatca gcagaaacca     120
gggaaagccc ctaagctcct gatctatact gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca     180
aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tcttcaaact     240
gaagattttg caacttacta ttgtcaacag agttacagta attttccgat caccttcggc     300
caagggacac gactggagat taaacga                                         327
<210>  10
<211>  109
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  10
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Tyr
            20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Thr Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Thr
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Asn Phe Pro
                85                  90                  95
Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg
            100                 105
<210>  11
<211>  18
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  11
cagagcatta gcaactat                                                    18
<210>  12
<211>  6
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  12
Gln Ser Ile Ser Asn Tyr
1               5
<210>  13
<211>  9
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  13
actgcatcc                                                               9
<210>  14
<211>  3
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  14
Thr Ala Ser
1
<210>  15
<211>  30
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  15
caacagagtt acagtaattt tccgatcacc                                       30
<210>  16
<211>  10
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  16
Gln Gln Ser Tyr Ser Asn Phe Pro Ile Thr
1               5                   10
<210>  17
<211>  360
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  17
gtgcagctgg tggagtctgg gggaggcttg gtccagcctg gagggtccct gagactctcc      60
tgtgcagcct ctggattcac cttcagtgac cactacatgg actgggtccg tcaggctcct     120
gggaaggggc tggagtgggt tggccgaacc agaaacaaag ctaatagtca caccacagaa     180
tacgccgcgt ctgtgagtgg cagattcacc atctcaagag atgattcaaa gaactcattg     240
tatctgcaaa tgaacagcct gaaaaccgag gacacggccg tgtattattg cactagagcc     300
ggtataattg gaaccctctt tgactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca     360
<210>  18
<211>  120
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  18
Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser
1               5                   10                  15
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp His Tyr
            20                  25                  30
Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly
        35                  40                  45
Arg Thr Arg Asn Lys Ala Asn Ser His Thr Thr Glu Tyr Ala Ala Ser
    50                  55                  60
Val Ser Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser Leu
65                  70                  75                  80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
                85                  90                  95
Cys Thr Arg Ala Gly Ile Ile Gly Thr Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>  19
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  19
ggattcacct tcagtgacca ctac                                             24
<210>  20
<211>  8
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  20
Gly Phe Thr Phe Ser Asp His Tyr
1               5
<210>  21
<211>  30
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  21
accagaaaca aagctaatag tcacaccaca                                       30
<210>  22
<211>  10
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  22
Thr Arg Asn Lys Ala Asn Ser His Thr Thr
1               5                   10
<210>  23
<211>  36
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  23
actagagccg gtataattgg aaccctcttt gactac                                36
<210>  24
<211>  12
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  24
Thr Arg Ala Gly Ile Ile Gly Thr Leu Phe Asp Tyr
1               5                   10
<210>  25
<211>  327
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  25
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc      60
atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca     120
gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccgtca     180
aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct     240
gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacagta cccctccgat caccttcggc     300
caagggacac gactggagat taaacga                                         327
<210>  26
<211>  109
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  26
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro
                85                  90                  95
Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg
            100                 105
<210>  27
<211>  18
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  27
cagagcatta gcagctat                                                    18
<210>  28
<211>  6
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  28
Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
1               5
<210>  29
<211>  9
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  29
gctgcatcc                                                               9
<210>  30
<211>  3
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  30
Ala Ala Ser
1
<210>  31
<211>  30
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  31
caacagagtt acagtacccc tccgatcacc                                       30
<210>  32
<211>  10
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  32
Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro Ile Thr
1               5                   10
<210>  33
<211>  363
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  33
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggagggtc cctgagactc      60
tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt gaccactata tggactgggt ccgccaggct     120
ccagggaagg ggctggaatg ggttggccgt actcgaaaca aagctaatag tcacaccaca     180
gaatacaccg cgtctgtgac aggcagattc accatctcaa gagatgattc aagaaactca     240
ctatatctgc aaatgaacag cctgaaaacc gaggacacgg ccgtatatta ctgtgttaga     300
gccggtataa ttggaaccct ctttgactat tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc     360
tca                                                                   363
<210>  34
<211>  121
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  34
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp His
            20                  25                  30
Tyr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Gly Arg Thr Arg Asn Lys Ala Asn Ser His Thr Thr Glu Tyr Thr Ala
    50                  55                  60
Ser Val Thr Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Arg Asn Ser
65                  70                  75                  80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
                85                  90                  95
Tyr Cys Val Arg Ala Gly Ile Ile Gly Thr Leu Phe Asp Tyr Trp Gly
            100                 105                 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>  35
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  35
ggattcacct tcagtgacca ctat                                             24
<210>  36
<211>  8
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  36
Gly Phe Thr Phe Ser Asp His Tyr
1               5
<210>  37
<211>  30
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  37
actcgaaaca aagctaatag tcacaccaca                                       30
<210>  38
<211>  10
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  38
Thr Arg Asn Lys Ala Asn Ser His Thr Thr
1               5                   10
<210>  39
<211>  36
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  39
gttagagccg gtataattgg aaccctcttt gactat                                36
<210>  40
<211>  12
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  40
Val Arg Ala Gly Ile Ile Gly Thr Leu Phe Asp Tyr
1               5                   10
<210>  41
<211>  327
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  41
gacatccaga tgacccagtt tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc      60
atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctttttaa attggtttca gcagaaacca     120
gggaaagccc ctaagttcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca     180
aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctacaacct     240
gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacagtt cccctccgat caccttcggc     300
caagggacac gactggagat taaacga                                         327
<210>  42
<211>  109
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  42
Asp Ile Gln Met Thr Gln Phe Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Phe
            20                  25                  30
Leu Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Phe Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Ser Pro Pro
                85                  90                  95
Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg
            100                 105
<210>  43
<211>  18
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  43
cagagcatta gcagcttt                                                    18
<210>  44
<211>  6
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  44
Gln Ser Ile Ser Ser Phe
1               5
<210>  45
<211>  9
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  45
gctgcatcc                                                               9
<210>  46
<211>  3
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  46
Ala Ala Ser
1
<210>  47
<211>  30
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  47
caacagagtt acagttcccc tccgatcacc                                       30
<210>  48
<211>  10
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  48
Gln Gln Ser Tyr Ser Ser Pro Pro Ile Thr
1               5                   10
<210>  49
<211>  357
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  49
caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc      60
acctgcactg tcactggtgg ctccatcagt aggaactact ggagttggat ccggcagccc     120
ccagggaagg gactggaatg gattggatat atctattaca gtgggagtat cgactacaat     180
ccctccctca agagtcgagt caccatatca gtagacacgt ccaagaacca gttctccctg     240
aagctgagtt ctatgaccgc tgcggacacg gccgtatact actgtgcgag agatcggtgg     300
aactggaaat acggtatgga cgtctggggc caagggacca cggtcatcgt ctcgtca        357
<210>  50
<211>  119
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  50
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Gly Ser Ile Ser Arg Asn
            20                  25                  30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Ile Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
    50                  55                  60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65                  70                  75                  80
Lys Leu Ser Ser Met Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Asp Arg Trp Asn Trp Lys Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly
            100                 105                 110
Thr Thr Val Ile Val Ser Ser
        115
<210>  51
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  51
ggtggctcca tcagtaggaa ctac                                             24
<210>  52
<211>  8
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  52
Gly Gly Ser Ile Ser Arg Asn Tyr
1               5
<210>  53
<211>  21
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  53
atctattaca gtgggagtat c                                                21
<210>  54
<211>  7
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  54
Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Ile
1               5
<210>  55
<211>  39
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  55
gcgagagatc ggtggaactg gaaatacggt atggacgtc                             39
<210>  56
<211>  13
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  56
Ala Arg Asp Arg Trp Asn Trp Lys Tyr Gly Met Asp Val
1               5                   10
<210>  57
<211>  327
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  57
gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc      60
ctctcctgca gggccagtca gactgttaga aacaactact tagcctggta ccaccagaaa     120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca     180
gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag     240
cctgaagatt ttacagtgta ttactgtcac cagtatggta actcaccttg gacgttcggc     300
caagggacca aaatggaaat caaacga                                         327
<210>  58
<211>  109
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  58
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Thr Val Arg Asn Asn
            20                  25                  30
Tyr Leu Ala Trp Tyr His Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
        35                  40                  45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65                  70                  75                  80
Pro Glu Asp Phe Thr Val Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Gly Asn Ser Pro
                85                  90                  95
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Met Glu Ile Lys Arg
            100                 105
<210>  59
<211>  21
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  59
cagactgtta gaaacaacta c                                                21
<210>  60
<211>  7
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  60
Gln Thr Val Arg Asn Asn Tyr
1               5
<210>  61
<211>  9
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  61
ggtgcatcc                                                               9
<210>  62
<211>  3
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  62
Gly Ala Ser
1
<210>  63
<211>  27
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  63
caccagtatg gtaactcacc ttggacg                                          27
<210>  64
<211>  9
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  64
His Gln Tyr Gly Asn Ser Pro Trp Thr
1               5
<210>  65
<211>  363
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  65
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggagggtc cctgagactc      60
tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt gaccactaca tggactgggt ccgccaggct     120
cctgggaagg ggctggagtg ggttggccga actagaaaca aagctaatag ttacaccaca     180
gaatacgccg cgtctgtgag tggcagattc accatctcaa gagatgattc aaagaactca     240
ttatatctgc aaatgaacag cctgaaaacc gaggacacgg ccgtgtatta ttgcactaga     300
gccggtataa ttggaaccct ctttgactac tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc     360
tca                                                                   363
<210>  66
<211>  121
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  66
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp His
            20                  25                  30
Tyr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Gly Arg Thr Arg Asn Lys Ala Asn Ser Tyr Thr Thr Glu Tyr Ala Ala
    50                  55                  60
Ser Val Ser Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser
65                  70                  75                  80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
                85                  90                  95
Tyr Cys Thr Arg Ala Gly Ile Ile Gly Thr Leu Phe Asp Tyr Trp Gly
            100                 105                 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>  67
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  67
ggattcacct tcagtgacca ctac                                             24
<210>  68
<211>  8
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  68
Gly Phe Thr Phe Ser Asp His Tyr
1               5
<210>  69
<211>  30
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  69
actagaaaca aagctaatag ttacaccaca                                       30
<210>  70
<211>  10
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  70
Thr Arg Asn Lys Ala Asn Ser Tyr Thr Thr
1               5                   10
<210>  71
<211>  36
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  71
actagagccg gtataattgg aaccctcttt gactac                                36
<210>  72
<211>  12
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  72
Thr Arg Ala Gly Ile Ile Gly Thr Leu Phe Asp Tyr
1               5                   10
<210>  73
<211>  327
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  73
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc      60
atcacttgcc gggcaagtca gatcattggt agatatttaa attggtttca gcagaaacca     120
gggaaagtcc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaacgtgg ggtcccatca     180
aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct     240
gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacaata cccctccgat caccttcggc     300
caagggacac gactggagat taaacga                                         327
<210>  74
<211>  109
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  74
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ile Ile Gly Arg Tyr
            20                  25                  30
Leu Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Asn Thr Pro Pro
                85                  90                  95
Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg
            100                 105
<210>  75
<211>  18
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  75
cagatcattg gtagatat                                                    18
<210>  76
<211>  6
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  76
Gln Ile Ile Gly Arg Tyr
1               5
<210>  77
<211>  9
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  77
gctgcatcc                                                               9
<210>  78
<211>  3
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  78
Ala Ala Ser
1
<210>  79
<211>  30
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  79
caacagagtt acaatacccc tccgatcacc                                       30
<210>  80
<211>  10
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  80
Gln Gln Ser Tyr Asn Thr Pro Pro Ile Thr
1               5                   10
<210>  81
<211>  363
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  81
caggtccagc tggtgcagtc tggggctgag gtgagggagc ctggggcctc agtgaagctc      60
tcctgcaagg tttccggata caccctcact gaattatcca tccactgggt gcgacaggct     120
cctggaaaag gacttgagtg gatgggaggt tttgatcctg aagagggtga aacagtctac     180
gcacagaagt tccggggcag agtcaccctg accgaggaca taagtccaga cacggcctac     240
atggagctga gcagcctgac ctctgaggac acggccgtat attattgtgc aaccccccgc     300
tattgtaata atggtatatg ttatgactac tggggccagg gaaccctaat caccgtctcc     360
tca                                                                   363
<210>  82
<211>  121
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  82
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Arg Glu Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Glu Leu
            20                  25                  30
Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Gly Phe Asp Pro Glu Glu Gly Glu Thr Val Tyr Ala Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Arg Gly Arg Val Thr Leu Thr Glu Asp Ile Ser Pro Asp Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Thr Pro Arg Tyr Cys Asn Asn Gly Ile Cys Tyr Asp Tyr Trp Gly
            100                 105                 110
Gln Gly Thr Leu Ile Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>  83
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  83
ggatacaccc tcactgaatt atcc                                             24
<210>  84
<211>  8
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  84
Gly Tyr Thr Leu Thr Glu Leu Ser
1               5
<210>  85
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  85
tttgatcctg aagagggtga aaca                                             24
<210>  86
<211>  8
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  86
Phe Asp Pro Glu Glu Gly Glu Thr
1               5
<210>  87
<211>  42
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  87
gcaacccccc gctattgtaa taatggtata tgttatgact ac                         42
<210>  88
<211>  14
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  88
Ala Thr Pro Arg Tyr Cys Asn Asn Gly Ile Cys Tyr Asp Tyr
1               5                   10
<210>  89
<211>  324
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  89
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc      60
atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca     120
gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccgtca     180
aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct     240
gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacagta cccctccgat caccttcggc     300
caagggacac gactggagat taaa                                            324
<210>  90
<211>  108
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  90
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro
                85                  90                  95
Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
            100                 105
<210>  91
<211>  18
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  91
cagagcatta gcagctat                                                    18
<210>  92
<211>  6
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  92
Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
1               5
<210>  93
<211>  9
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  93
gctgcatcc                                                               9
<210>  94
<211>  3
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  94
Ala Ala Ser
1
<210>  95
<211>  30
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  95
caacagagtt acagtacccc tccgatcacc                                       30
<210>  96
<211>  10
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  96
Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro Ile Thr
1               5                   10
<210>  97
<211>  363
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  97
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc      60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagt aattatgcca tgacctgggt ccgccaggct     120
ccagggacgg ggctggagtg ggtctcagct attagtggtc gtggtagtaa cacatactac     180
acagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa catgctgtat     240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggcctcat attactgtgc gaaagatcgt     300
tttactacag tggggaactg gttcgacccc tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc     360
tca                                                                   363
<210>  98
<211>  121
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  98
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
            20                  25                  30
Ala Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Thr Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Ala Ile Ser Gly Arg Gly Ser Asn Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Met Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ser Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Lys Asp Arg Phe Thr Thr Val Gly Asn Trp Phe Asp Pro Trp Gly
            100                 105                 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>  99
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  99
ggattcacct ttagtaatta tgcc                                             24
<210>  100
<211>  8
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  100
Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Ala
1               5
<210>  101
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  101
attagtggtc gtggtagtaa caca                                             24
<210>  102
<211>  8
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  102
Ile Ser Gly Arg Gly Ser Asn Thr
1               5
<210>  103
<211>  42
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  103
gcgaaagatc gttttactac agtggggaac tggttcgacc cc                         42
<210>  104
<211>  14
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  104
Ala Lys Asp Arg Phe Thr Thr Val Gly Asn Trp Phe Asp Pro
1               5                   10
<210>  105
<211>  327
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  105
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc      60
atcacttgcc gggcaagtca gagtattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca     120
gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcgtccagtt tgcaaaatgg ggtcccatca     180
aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcagcct     240
gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacagta gtcttccgat caccttcggc     300
caagggacac gactggatat taaacga                                         327
<210>  106
<211>  109
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  106
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Asn Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Ser Leu Pro
                85                  90                  95
Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Asp Ile Lys Arg
            100                 105
<210>  107
<211>  18
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  107
cagagtatta gcagctat                                                    18
<210>  108
<211>  6
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  108
Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
1               5
<210>  109
<211>  9
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  109
gctgcgtcc                                                               9
<210>  110
<211>  3
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  110
Ala Ala Ser
1
<210>  111
<211>  30
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  111
caacagagtt acagtagtct tccgatcacc                                       30
<210>  112
<211>  10
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  112
Gln Gln Ser Tyr Ser Ser Leu Pro Ile Thr
1               5                   10
<210>  113
<211>  357
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  113
caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc      60
acctgcactg tcactggtgg ctccatcagt aggaactact ggagttggat ccggcagccc     120
ccagggaagg gactggaatg gattggatat atctattaca gtgggagtat caactacaat     180
ccctccctca agagtcgagt caccatatca gtggacatgt ctaagaacca gttctcccta     240
aagctgaatt ctgtgaccgc tgcggacacg gccgtgtact actgtgcgag agatcgatgg     300
aactggaaat acggtatgga cgtctggggc caagggacca cggtcatcgt ctcgtca        357
<210>  114
<211>  119
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  114
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Gly Ser Ile Ser Arg Asn
            20                  25                  30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Ile Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
    50                  55                  60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Met Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65                  70                  75                  80
Lys Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Asp Arg Trp Asn Trp Lys Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly
            100                 105                 110
Thr Thr Val Ile Val Ser Ser
        115
<210>  115
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  115
ggtggctcca tcagtaggaa ctac                                             24
<210>  116
<211>  8
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  116
Gly Gly Ser Ile Ser Arg Asn Tyr
1               5
<210>  117
<211>  21
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  117
atctattaca gtgggagtat c                                                21
<210>  118
<211>  7
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  118
Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Ile
1               5
<210>  119
<211>  39
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  119
gcgagagatc gatggaactg gaaatacggt atggacgtc                             39
<210>  120
<211>  13
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  120
Ala Arg Asp Arg Trp Asn Trp Lys Tyr Gly Met Asp Val
1               5                   10
<210>  121
<211>  327
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  121
gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc      60
ctctcctgca gggccagtca gactgttaga aacagctact tagcctggta ccaccagaaa     120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca     180
gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag     240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gttcatattg gacgttcggc     300
caagggacca aaatggaaat caaacga                                         327
<210>  122
<211>  109
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  122
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Thr Val Arg Asn Ser
            20                  25                  30
Tyr Leu Ala Trp Tyr His Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
        35                  40                  45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65                  70                  75                  80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Tyr
                85                  90                  95
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Met Glu Ile Lys Arg
            100                 105
<210>  123
<211>  21
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  123
cagactgtta gaaacagcta c                                                21
<210>  124
<211>  7
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  124
Gln Thr Val Arg Asn Ser Tyr
1               5
<210>  125
<211>  9
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  125
ggtgcatcc                                                               9
<210>  126
<211>  3
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  126
Gly Ala Ser
1
<210>  127
<211>  27
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  127
cagcagtatg gtagttcata ttggacg                                          27
<210>  128
<211>  9
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  128
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Tyr Trp Thr
1               5
<210>  129
<211>  363
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  129
caggtccagc tggtgcagtc tgggtctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc      60
tcctgcaagg tttccggata caccctcact gaattatcca tacactgggt gcgacaggct     120
cctggaaaag gacttgagtg gatgggaggt tttgatcctg aagatggtga aacaatctac     180
gcacagaagt tccggggcag agtcaccatg accgaggaca tatctccaga cacagcctac     240
atggagctga gcagcctgag atctgaagac acggccgtat attactgtgc aaccccccgc     300
tattgtaata atggtatatg ttatgactat tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc     360
tca                                                                   363
<210>  130
<211>  121
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  130
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Glu Leu
            20                  25                  30
Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Gly Phe Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Arg Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Ile Ser Pro Asp Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Thr Pro Arg Tyr Cys Asn Asn Gly Ile Cys Tyr Asp Tyr Trp Gly
            100                 105                 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>  131
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  131
ggatacaccc tcactgaatt atcc                                             24
<210>  132
<211>  8
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  132
Gly Tyr Thr Leu Thr Glu Leu Ser
1               5
<210>  133
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  133
tttgatcctg aagatggtga aaca                                             24
<210>  134
<211>  8
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  134
Phe Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr
1               5
<210>  135
<211>  42
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  135
gcaacccccc gctattgtaa taatggtata tgttatgact at                         42
<210>  136
<211>  14
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  136
Ala Thr Pro Arg Tyr Cys Asn Asn Gly Ile Cys Tyr Asp Tyr
1               5                   10
<210>  137
<211>  327
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  137
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctataggaga cagagtcacc      60
atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca     120
gggaaagccc ctatgctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca     180
aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaaact     240
gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacagta cccctccgat caccttcggc     300
caagggacac gactggagat taaacga                                         327
<210>  138
<211>  109
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  138
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Ile Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Met Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Thr
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro
                85                  90                  95
Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg
            100                 105
<210>  139
<211>  18
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  139
cagagcatta gcagctat                                                    18
<210>  140
<211>  6
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  140
Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
1               5
<210>  141
<211>  9
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  141
gctgcatcc                                                               9
<210>  142
<211>  3
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  142
Ala Ala Ser
1
<210>  143
<211>  30
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  143
caacagagtt acagtacccc tccgatcacc                                       30
<210>  144
<211>  10
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  144
Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro Ile Thr
1               5                   10
<210>  145
<211>  345
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  145
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtcaagc ctggagggtc cctgagactc      60
tcctgtgcag cctctggatt catttttagt gactactaca tgagctggat ccgccaggct     120
ccagggaagg ggctggagtg ggtttcatac attagtagta gtggtactac catatatgga     180
gactctgtga agggccgatt caccatgtcc agggacaacg ccaagaactc actgtatctg     240
caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gccgtgtatt actgtgcgag gaactacgct     300
ctctttgact actggggcca gggaaccctg gtcaccgtct cctca                     345
<210>  146
<211>  115
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  146
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Asp Tyr
            20                  25                  30
Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Thr Thr Ile Tyr Gly Asp Ser Val Lys
    50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Met Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Asn Tyr Ala Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
            100                 105                 110
Val Ser Ser
        115
<210>  147
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  147
ggattcattt ttagtgacta ctac                                             24
<210>  148
<211>  8
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  148
Gly Phe Ile Phe Ser Asp Tyr Tyr
1               5
<210>  149
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  149
attagtagta gtggtactac cata                                             24
<210>  150
<211>  8
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  150
Ile Ser Ser Ser Gly Thr Thr Ile
1               5
<210>  151
<211>  27
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  151
gcgaggaact acgctctctt tgactac                                          27
<210>  152
<211>  9
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  152
Ala Arg Asn Tyr Ala Leu Phe Asp Tyr
1               5
<210>  153
<211>  324
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  153
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc      60
atcacttgcc aggcgagtca ggacattagc aaatatttaa attggtatca gcagaaacca     120
gggaaagccc ctaagctcct gatctactat acatccaatt tggaaacagg ggtcccatca     180
aggttcagtg gaagtggatc tgggacagat tttactttca ccatcagcag cctgcagcct     240
gaagatattg caacatatta ctgtcaccag tctgattatc tcccattcac tttcggccct     300
gggaccaaag tggatatcaa acga                                            324
<210>  154
<211>  108
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  154
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
            20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Tyr Thr Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Ser Asp Tyr Leu Pro Phe
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg
            100                 105
<210>  155
<211>  18
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  155
caggacatta gcaaatat                                                    18
<210>  156
<211>  6
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  156
Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
1               5
<210>  157
<211>  9
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  157
tatacatcc                                                               9
<210>  158
<211>  3
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  158
Tyr Thr Ser
1
<210>  159
<211>  27
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  159
caccagtctg attatctccc attcact                                          27
<210>  160
<211>  9
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  160
His Gln Ser Asp Tyr Leu Pro Phe Thr
1               5
<210>  161
<211>  363
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  161
cagctgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc      60
acctgcactg tctctggtgg ctccatcagc cgtattagtt actactgggg ctggatccgc     120
cagcccccag ggaaggggct ggagtggatt gggagtatct atgatagtgg gagtacctac     180
tacaacccgt ccctcaagag tcgagtcacc atatccatag acacgtccaa gaaccagttc     240
tccctgaagc tgagctctgt gaccgccgca gacacggctg tgtattactg tgtgagatat     300
agcagttcgt ccgccttcgc ttttgactac tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc     360
tca                                                                   363
<210>  162
<211>  121
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  162
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Arg Ile
            20                  25                  30
Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Ile Gly Ser Ile Tyr Asp Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
    50                  55                  60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Ile Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65                  70                  75                  80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
                85                  90                  95
Cys Val Arg Tyr Ser Ser Ser Ser Ala Phe Ala Phe Asp Tyr Trp Gly
            100                 105                 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>  163
<211>  30
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  163
ggtggctcca tcagccgtat tagttactac                                       30
<210>  164
<211>  10
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  164
Gly Gly Ser Ile Ser Arg Ile Ser Tyr Tyr
1               5                   10
<210>  165
<211>  21
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  165
atctatgata gtgggagtac c                                                21
<210>  166
<211>  7
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  166
Ile Tyr Asp Ser Gly Ser Thr
1               5
<210>  167
<211>  39
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  167
gtgagatata gcagttcgtc cgccttcgct tttgactac                             39
<210>  168
<211>  13
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  168
Val Arg Tyr Ser Ser Ser Ser Ala Phe Ala Phe Asp Tyr
1               5                   10
<210>  169
<211>  324
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  169
gacatccaga tgacccagtc tccatcttcc gtgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc      60
atcacttgtc gggcgagtca gggtattagc agttggttag cctggtatca gcagaaacca     120
gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca     180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct     240
gaagattttg caacttacta ttgtcaacag gctaacagtt tcccattcac tttcggccct     300
gggaccaaag tggatatcaa acga                                            324
<210>  170
<211>  108
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  170
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Phe
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg
            100                 105
<210>  171
<211>  18
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  171
cagggtatta gcagttgg                                                    18
<210>  172
<211>  6
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  172
Gln Gly Ile Ser Ser Trp
1               5
<210>  173
<211>  9
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  173
gctgcatcc                                                               9
<210>  174
<211>  3
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  174
Ala Ala Ser
1
<210>  175
<211>  27
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  175
caacaggcta acagtttccc attcact                                          27
<210>  176
<211>  9
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  176
Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Phe Thr
1               5
<210>  177
<211>  360
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  177
cagctgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc      60
acctgcactg tctctggtgg ctccatcagc agtagtactt actactgggg ctggatccgc     120
cagcccccag ggaaggggct ggagtggatt gggagtttct attatagtgg gagcacctac     180
tacaacccgt ccctcaagag tcgagtcacc atatccgtag gcacgtccaa gaaccagttc     240
tccctgaagc tgagctctgt gaccgccgca gacacggctg tttatttctg tgcgagaggg     300
gggctcctgg ggagaccttt tgttatctgg ggccaaggga caatggtcac cgtctcttca     360
<210>  178
<211>  120
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  178
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser
            20                  25                  30
Thr Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Ile Gly Ser Phe Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
    50                  55                  60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Gly Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65                  70                  75                  80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Phe
                85                  90                  95
Cys Ala Arg Gly Gly Leu Leu Gly Arg Pro Phe Val Ile Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>  179
<211>  30
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  179
ggtggctcca tcagcagtag tacttactac                                       30
<210>  180
<211>  10
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  180
Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser Thr Tyr Tyr
1               5                   10
<210>  181
<211>  21
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  181
ttctattata gtgggagcac c                                                21
<210>  182
<211>  7
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  182
Phe Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr
1               5
<210>  183
<211>  36
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  183
gcgagagggg ggctcctggg gagacctttt gttatc                                36
<210>  184
<211>  12
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  184
Ala Arg Gly Gly Leu Leu Gly Arg Pro Phe Val Ile
1               5                   10
<210>  185
<211>  324
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  185
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc      60
atcacttgcc gggcaagtca gggcattaga aatgatttag gctggtatca gcagaaacca     120
gggaaagccc ctaagcgcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca     180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca caatcagcag cctgcagcct     240
gaagattttg caacttatta ctgtctacag cataatagtt acccgctcac tttcggcgga     300
gggaccaagg tggagatcaa acga                                            324
<210>  186
<211>  108
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  186
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp
            20                  25                  30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Ser Tyr Pro Leu
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
            100                 105
<210>  187
<211>  18
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  187
cagggcatta gaaatgat                                                    18
<210>  188
<211>  6
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  188
Gln Gly Ile Arg Asn Asp
1               5
<210>  189
<211>  9
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  189
gctgcatcc                                                               9
<210>  190
<211>  3
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  190
Ala Ala Ser
1
<210>  191
<211>  27
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  191
ctacagcata atagttaccc gctcact                                          27
<210>  192
<211>  9
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  192
Leu Gln His Asn Ser Tyr Pro Leu Thr
1               5
<210>  193
<211>  366
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  193
gaggtgcagc tggtggagtc taggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc      60
tcctgtgcag cctctggatt cacttttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct     120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacattctac     180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacggtatat     240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagccctc     300
gtattgcgat ttttggagtg gttaggggac tactggggcc agggaaccct ggtcaccgtc     360
tcctca                                                                366
<210>  194
<211>  122
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  194
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Arg Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Lys Ala Leu Val Leu Arg Phe Leu Glu Trp Leu Gly Asp Tyr Trp
            100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>  195
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  195
ggattcactt ttagcagcta tgcc                                             24
<210>  196
<211>  8
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  196
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala
1               5
<210>  197
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  197
attagtggta gtggtggtag caca                                             24
<210>  198
<211>  8
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  198
Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr
1               5
<210>  199
<211>  45
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  199
gcgaaagccc tcgtattgcg atttttggag tggttagggg actac                      45
<210>  200
<211>  15
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  200
Ala Lys Ala Leu Val Leu Arg Phe Leu Glu Trp Leu Gly Asp Tyr
1               5                   10                  15
<210>  201
<211>  321
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  201
gacatccaga tgacccagtc tccttccacc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc      60
atcacttgtc gggccagtca gagtattagt agctggttgg cctggtttca gcagaaacca     120
gggaaagccc ctaagctcct gatctataag gcgtctagtt tagaaagtgg ggtcccatca     180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct     240
gatgattttg caacttatta ctgtcaacag tataaaagtt attggacgtt cggccaaggg     300
accaaggtgg aaatcaaacg a                                               321
<210>  202
<211>  107
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  202
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Lys Ser Tyr Trp Thr
                85                  90                  95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
            100                 105
<210>  203
<211>  18
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  203
cagagtatta gtagctgg                                                    18
<210>  204
<211>  6
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  204
Gln Ser Ile Ser Ser Trp
1               5
<210>  205
<211>  9
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  205
aaggcgtct                                                               9
<210>  206
<211>  3
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  206
Lys Ala Ser
1
<210>  207
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  207
caacagtata aaagttattg gacg                                             24
<210>  208
<211>  8
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  208
Gln Gln Tyr Lys Ser Tyr Trp Thr
1               5
<210>  209
<211>  372
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  209
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ctggtacagc ctggggggtc cctgagactc      60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct     120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcaagt attagtggta gtggtgatag cacattctac     180
acagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca tttccaagaa cacgctgtat     240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagatcgt     300
cttctatggt tcggggactt aatatccccc tttcactact ggggccaggg aaccctggtc     360
accgtctcct ca                                                         372
<210>  210
<211>  124
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  210
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Asp Ser Thr Phe Tyr Thr Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ile Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Lys Asp Arg Leu Leu Trp Phe Gly Asp Leu Ile Ser Pro Phe His
            100                 105                 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>  211
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  211
ggattcacct ttagcagcta tgcc                                             24
<210>  212
<211>  8
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  212
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala
1               5
<210>  213
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  213
attagtggta gtggtgatag caca                                             24
<210>  214
<211>  8
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  214
Ile Ser Gly Ser Gly Asp Ser Thr
1               5
<210>  215
<211>  51
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  215
gcgaaagatc gtcttctatg gttcggggac ttaatatccc cctttcacta c               51
<210>  216
<211>  17
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  216
Ala Lys Asp Arg Leu Leu Trp Phe Gly Asp Leu Ile Ser Pro Phe His
1               5                   10                  15
Tyr
<210>  217
<211>  327
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  217
gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc      60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc aacatctact tagcctggta ccagcagaaa     120
cctgcccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca     180
gacaggttta gtgtcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag     240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcacctcg gacgttcggc     300
caagggacca aggtggaaat caaacga                                         327
<210>  218
<211>  109
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  218
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Ile
            20                  25                  30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Ala Gln Ala Pro Arg Leu Leu
        35                  40                  45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Val Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65                  70                  75                  80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
                85                  90                  95
Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
            100                 105
<210>  219
<211>  21
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  219
cagagtgtta gcaacatcta c                                                21
<210>  220
<211>  7
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  220
Gln Ser Val Ser Asn Ile Tyr
1               5
<210>  221
<211>  9
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  221
ggtgcatcc                                                               9
<210>  222
<211>  3
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  222
Gly Ala Ser
1
<210>  223
<211>  27
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  223
cagcagtatg gtagctcacc tcggacg                                          27
<210>  224
<211>  9
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  224
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Arg Thr
1               5
<210>  225
<211>  366
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  225
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc      60
tcctgtacag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagttgggt ccgccaggct     120
ccagggaagg ggctggaatg ggtctcagct attagtggga ctggtagtag tacatacttc     180
acagactccg tgaagggccg gttcgccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat     240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagatgga     300
gagtggctct ctacggtgac cctttttgac tactggggcc agggaaccct ggtcaccgtc     360
tcctca                                                                366
<210>  226
<211>  122
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  226
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Ala Ile Ser Gly Thr Gly Ser Ser Thr Tyr Phe Thr Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Ala Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Lys Asp Gly Glu Trp Leu Ser Thr Val Thr Leu Phe Asp Tyr Trp
            100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>  227
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  227
ggattcacct ttagcagcta tgcc                                             24
<210>  228
<211>  8
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  228
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala
1               5
<210>  229
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  229
attagtggga ctggtagtag taca                                             24
<210>  230
<211>  8
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  230
Ile Ser Gly Thr Gly Ser Ser Thr
1               5
<210>  231
<211>  45
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  231
gcgaaagatg gagagtggct ctctacggtg accctttttg actac                      45
<210>  232
<211>  15
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  232
Ala Lys Asp Gly Glu Trp Leu Ser Thr Val Thr Leu Phe Asp Tyr
1               5                   10                  15
<210>  233
<211>  330
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  233
gaaattgtga tgacgcagtc tccagccacc ctgtctgtgt ctccagggga aagagccacc      60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcaacttag cctggtacca gcagaaacct     120
ggccaggctc ccaggctcct catctatggt gcatccacca gggccactgg tatcccagcc     180
aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagtct     240
gaagattttg cactttatta ctgtcagcag tattttatct ggcctccgca tcccactttc     300
ggccctggga ccaaagtgga tatcaaacga                                      330
<210>  234
<211>  110
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  234
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Leu Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Phe Ile Trp Pro Pro
                85                  90                  95
His Pro Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg
            100                 105                 110
<210>  235
<211>  18
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  235
cagagtgtta gcagcaac                                                    18
<210>  236
<211>  6
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  236
Gln Ser Val Ser Ser Asn
1               5
<210>  237
<211>  9
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  237
ggtgcatcc                                                               9
<210>  238
<211>  3
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  238
Gly Ala Ser
1
<210>  239
<211>  33
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  239
cagcagtatt ttatctggcc tccgcatccc act                                   33
<210>  240
<211>  11
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  240
Gln Gln Tyr Phe Ile Trp Pro Pro His Pro Thr
1               5                   10
<210>  241
<211>  363
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  241
caggtgcagc tggtggagtc tgggggagcc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc      60
tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt tactatggca tgcactgggt ccgccaggct     120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatcatatg atggaagtaa aaaatactat     180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat     240
ctgcaaatga acagcctgag agctgaggac acggctgtgt attactgtgc gaaagatctg     300
acagtagact tctactacgg tatggacgtc tggggccaag ggaccacggt caccgtctcc     360
tca                                                                   363
<210>  242
<211>  121
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  242
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Ala Val Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Tyr
            20                  25                  30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Lys Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Lys Asp Leu Thr Val Asp Phe Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly
            100                 105                 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>  243
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  243
ggattcacct tcagttacta tggc                                             24
<210>  244
<211>  8
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  244
Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Tyr Gly
1               5
<210>  245
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  245
atatcatatg atggaagtaa aaaa                                             24
<210>  246
<211>  8
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  246
Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Lys Lys
1               5
<210>  247
<211>  42
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  247
gcgaaagatc tgacagtaga cttctactac ggtatggacg tc                         42
<210>  248
<211>  14
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  248
Ala Lys Asp Leu Thr Val Asp Phe Tyr Tyr Gly Met Asp Val
1               5                   10
<210>  249
<211>  324
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  249
gacatccaga tgacccagtc tccatcttcc gtgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc      60
atcacttgtc gggcgagtca gggtattagc agctggttag cctggtatca gcagaaacca     120
gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct acatccagtt tgcaaagtgg ggccccatca     180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct     240
gaagattttg caacttactt ttgtcaacag gctaacagtt tcccatacac ttttggccag     300
gggaccaagc tggagatcaa acga                                            324
<210>  250
<211>  108
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  250
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Ala Thr Ser Ser Leu Gln Ser Gly Ala Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Tyr
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
            100                 105
<210>  251
<211>  18
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  251
cagggtatta gcagctgg                                                    18
<210>  252
<211>  6
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  252
Gln Gly Ile Ser Ser Trp
1               5
<210>  253
<211>  9
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  253
gctacatcc                                                               9
<210>  254
<211>  3
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  254
Ala Thr Ser
1
<210>  255
<211>  27
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  255
caacaggcta acagtttccc atacact                                          27
<210>  256
<211>  9
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  256
Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Tyr Thr
1               5
<210>  257
<211>  342
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  257
caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc      60
acctgcactg tctctgatgg ctccatcagt agttactact ggagctggat ccggcagccc     120
ccagggaggg gactggagtg gattgggttt atctattaca gtgggagcac cagctacaac     180
ccctccctca agagtcgagt caccatttca gtagacacgt ccatgagcca gttctccctg     240
aagctgaggt ctgtgaccgc cgcagacacg gccgtgtatt actgtgcgcg tgggagcccc     300
tttgactact ggggcccggg aaccctggtc accgtctcct ca                        342
<210>  258
<211>  114
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  258
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Asp Gly Ser Ile Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Phe Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
    50                  55                  60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Met Ser Gln Phe Ser Leu
65                  70                  75                  80
Lys Leu Arg Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Gly Ser Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val
            100                 105                 110
Ser Ser
<210>  259
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  259
gatggctcca tcagtagtta ctac                                             24
<210>  260
<211>  8
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  260
Asp Gly Ser Ile Ser Ser Tyr Tyr
1               5
<210>  261
<211>  21
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  261
atctattaca gtgggagcac c                                                21
<210>  262
<211>  7
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  262
Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr
1               5
<210>  263
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  263
gcgcgtggga gcccctttga ctac                                             24
<210>  264
<211>  8
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  264
Ala Arg Gly Ser Pro Phe Asp Tyr
1               5
<210>  265
<211>  327
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  265
gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc      60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcaaaga     120
cctggccagg ctcccagcct cctcatctct ggtgcatcca ggagggccac tggcatccca     180
gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag aagactggag     240
cctgaagatt ttgcaatgta ttactgtcag cagtatggta gttcacctcc cactttcggc     300
ggagggacca aggtggagat caaacga                                         327
<210>  266
<211>  109
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  266
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
            20                  25                  30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala Pro Ser Leu Leu
        35                  40                  45
Ile Ser Gly Ala Ser Arg Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Arg Arg Leu Glu
65                  70                  75                  80
Pro Glu Asp Phe Ala Met Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
                85                  90                  95
Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
            100                 105
<210>  267
<211>  21
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  267
cagagtgtta gcagcagcta c                                                21
<210>  268
<211>  7
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  268
Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr
1               5
<210>  269
<211>  9
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  269
ggtgcatcc                                                               9
<210>  270
<211>  3
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  270
Gly Ala Ser
1
<210>  271
<211>  27
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  271
cagcagtatg gtagttcacc tcccact                                          27
<210>  272
<211>  9
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  272
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Pro Thr
1               5
<210>  273
<211>  363
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  273
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc      60
tcctgtgcag cctctggatt cacgttcagt aactatgcta tgcactgggt ccgccaggct     120
ccagggaagg gactggaata tgtttcagct attagtagta atgggggtag tacatattat     180
gcagactctg tgaagggcag aatcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat     240
cttcaaatgg gcagcctgag agctgaggat atggctgtgt attactgtgc gagagggcga     300
ccgtactact actacttcgg tatggacgtc tggggccaag ggaccacggt caccgtctcc     360
tca                                                                   363
<210>  274
<211>  121
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  274
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
            20                  25                  30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Val
        35                  40                  45
Ser Ala Ile Ser Ser Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Gly Ser Leu Arg Ala Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Gly Arg Pro Tyr Tyr Tyr Tyr Phe Gly Met Asp Val Trp Gly
            100                 105                 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>  275
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  275
ggattcacgt tcagtaacta tgct                                             24
<210>  276
<211>  8
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  276
Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Ala
1               5
<210>  277
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  277
attagtagta atgggggtag taca                                             24
<210>  278
<211>  8
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  278
Ile Ser Ser Asn Gly Gly Ser Thr
1               5
<210>  279
<211>  42
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  279
gcgagagggc gaccgtacta ctactacttc ggtatggacg tc                         42
<210>  280
<211>  14
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  280
Ala Arg Gly Arg Pro Tyr Tyr Tyr Tyr Phe Gly Met Asp Val
1               5                   10
<210>  281
<211>  339
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  281
gatattgtga tgactcagac tccagtctcc tcacctgtca cccttggaca gccggcctcc      60
atctcctgca ggtctagtca aagcctcgta cacagtgatg gaaacaccta cttgagttgg     120
tttcagcaga ggccgggcca gcctccaaga ctcctaattt ataagatttc taaccggttc     180
tctggggtcc cagacagatt cagtggcagt ggggcaggga cagatttcac actgaaaatc     240
agcagggtgg aagctgagga tgtcggggtt tattactgca tgcaagctac acaatttcct     300
ctcaatttcg gcggagggac caaggtggag atcaaacga                            339
<210>  282
<211>  113
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  282
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Val Ser Ser Pro Val Thr Leu Gly
1               5                   10                  15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
            20                  25                  30
Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Ser Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Pro
        35                  40                  45
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Ile Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
    50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala
                85                  90                  95
Thr Gln Phe Pro Leu Asn Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105                 110
Arg
<210>  283
<211>  33
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  283
caaagcctcg tacacagtga tggaaacacc tac                                   33
<210>  284
<211>  11
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  284
Gln Ser Leu Val His Ser Asp Gly Asn Thr Tyr
1               5                   10
<210>  285
<211>  9
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  285
aagatttct                                                               9
<210>  286
<211>  3
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  286
Lys Ile Ser
1
<210>  287
<211>  27
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  287
atgcaagcta cacaatttcc tctcaat                                          27
<210>  288
<211>  9
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  288
Met Gln Ala Thr Gln Phe Pro Leu Asn
1               5
<210>  289
<211>  366
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  289
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc      60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagg acctatgcca tgacctgggt ccgccaggct     120
ccagggaagg ggctagactg ggtctcagct attactggtg atggtggtaa tacatactac     180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatt tccagagaca attccaagaa cacgctgtat     240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccatct attactgtgc gaaagatcag     300
agattcagct ttgctctata ctactttgac tactggggcc agggaaccct ggtcactgtc     360
tcctca                                                                366
<210>  290
<211>  122
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  290
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Thr Tyr
            20                  25                  30
Ala Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Asp Trp Val
        35                  40                  45
Ser Ala Ile Thr Gly Asp Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Lys Asp Gln Arg Phe Ser Phe Ala Leu Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp
            100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>  291
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  291
ggattcacct ttaggaccta tgcc                                             24
<210>  292
<211>  8
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  292
Gly Phe Thr Phe Arg Thr Tyr Ala
1               5
<210>  293
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  293
attactggtg atggtggtaa taca                                             24
<210>  294
<211>  8
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  294
Ile Thr Gly Asp Gly Gly Asn Thr
1               5
<210>  295
<211>  45
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  295
gcgaaagatc agagattcag ctttgctcta tactactttg actac                      45
<210>  296
<211>  15
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  296
Ala Lys Asp Gln Arg Phe Ser Phe Ala Leu Tyr Tyr Phe Asp Tyr
1               5                   10                  15
<210>  297
<211>  324
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  297
gacatccaga tgacccagtc tccatcttcc gtgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc      60
atcacttgtc gggcgagtca gggtattagc agctggttag cctggtatca gcagaaacca     120
gggaacgccc ctaagctcct gatctatgct gcattcagtt tgcaaagtgg ggtcccgtca     180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct     240
gaagattttg caacttacta ttgtcaacag gctaacaatt tcccgtggac gttcggccaa     300
gggaccaagg tggaaatcaa acga                                            324
<210>  298
<211>  108
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  298
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ala Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Ala Ala Phe Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Asn Phe Pro Trp
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
            100                 105
<210>  299
<211>  18
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  299
cagggtatta gcagctgg                                                    18
<210>  300
<211>  6
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  300
Gln Gly Ile Ser Ser Trp
1               5
<210>  301
<211>  9
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  301
gctgcattc                                                               9
<210>  302
<211>  3
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  302
Ala Ala Phe
1
<210>  303
<211>  27
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  303
caacaggcta acaatttccc gtggacg                                          27
<210>  304
<211>  9
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  304
Gln Gln Ala Asn Asn Phe Pro Trp Thr
1               5
<210>  305
<211>  354
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  305
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc      60
tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt aactatgaca tgcactgggt ccgccaggct     120
ccaggcaagg ggctggagtg gatggcagtt atatcatatg atggaattaa taaatattat     180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat     240
ctgcaaatga acagcctgag agctgaggac acggctgtgt attactgtgc gaaaggtact     300
tactcctggt acttcgatct ctggggccgt ggcaccctgg tcactgtctc ctca           354
<210>  306
<211>  118
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  306
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
            20                  25                  30
Asp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ile Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Lys Gly Thr Tyr Ser Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr
            100                 105                 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>  307
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  307
ggattcacct tcagtaacta tgac                                             24
<210>  308
<211>  8
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  308
Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Asp
1               5
<210>  309
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  309
atatcatatg atggaattaa taaa                                             24
<210>  310
<211>  8
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  310
Ile Ser Tyr Asp Gly Ile Asn Lys
1               5
<210>  311
<211>  33
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  311
gcgaaaggta cttactcctg gtacttcgat ctc                                   33
<210>  312
<211>  11
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  312
Ala Lys Gly Thr Tyr Ser Trp Tyr Phe Asp Leu
1               5                   10
<210>  313
<211>  324
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  313
gacatccaga tgacccagtc tccttccacc ctgtctacat ctgtaggaga cagagtcacc      60
atcacttgcc gggccagtca gactattagt agctggttgg cctggtatca gcagaaacca     120
gggaaagccc ctaagctcct gatctataag gcgtctcgtt tagaaagtgg ggtcccatca     180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct     240
gatgattttg caacttatta ctgccaacag tataatagtt attcgtggac gttcggccaa     300
gggaccaagg tggaaatcaa acga                                            324
<210>  314
<211>  108
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  314
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Thr Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Thr Ile Ser Ser Trp
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Lys Ala Ser Arg Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Ser Trp
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
            100                 105
<210>  315
<211>  18
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  315
cagactatta gtagctgg                                                    18
<210>  316
<211>  6
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  316
Gln Thr Ile Ser Ser Trp
1               5
<210>  317
<211>  9
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  317
aaggcgtct                                                               9
<210>  318
<211>  3
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  318
Lys Ala Ser
1
<210>  319
<211>  27
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  319
caacagtata atagttattc gtggacg                                          27
<210>  320
<211>  9
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  320
Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Ser Trp Thr
1               5
<210>  321
<211>  366
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  321
gaagtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggcaggtc cctgagactc      60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttgat gcttatgcca tgcactgggt ccggcaagct     120
ccagggaagg gcctggagtg ggtctcaggt attagttgga atagtggtag cataggctat     180
gcggactctg tgaagggccg attcaccatt tccagagaca acgccaagaa ctccctgtat     240
ctgcaaatga acagtctgag agaagaggac acggccttgt attactgtgc aaaagataaa     300
attttggaac tttactacta cggtatggac gtctggggcc aagggaccac ggtcaccgtc     360
tcctca                                                                366
<210>  322
<211>  122
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  322
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Ala Tyr
            20                  25                  30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Glu Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Lys Asp Lys Ile Leu Glu Leu Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp
            100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>  323
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  323
ggattcacct ttgatgctta tgcc                                             24
<210>  324
<211>  8
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  324
Gly Phe Thr Phe Asp Ala Tyr Ala
1               5
<210>  325
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  325
attagttgga atagtggtag cata                                             24
<210>  326
<211>  8
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  326
Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile
1               5
<210>  327
<211>  45
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  327
gcaaaagata aaattttgga actttactac tacggtatgg acgtc                      45
<210>  328
<211>  15
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  328
Ala Lys Asp Lys Ile Leu Glu Leu Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val
1               5                   10                  15
<210>  329
<211>  369
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  329
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggagac ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc      60
tcctgttcag cctctggatt cacctttaac atctatgcca tgagctgggt ccgccaggct     120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcaggt attagtggta gtggtggtag cacatactac     180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attcaaagaa cacgctgtat     240
ttccaaatga atagcctgag agtcgaggac acggccgtat attactgtgc gaaaaaaata     300
agcagctcgt cctactacta ctacgctatg gacgtctggg gccaagggac cacggtcacc     360
gtctcctca                                                             369
<210>  330
<211>  123
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  330
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ile Tyr
            20                  25                  30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Gly Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Phe Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Lys Lys Ile Ser Ser Ser Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Val
            100                 105                 110
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>  331
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  331
ggattcacct ttaacatcta tgcc                                             24
<210>  332
<211>  8
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  332
Gly Phe Thr Phe Asn Ile Tyr Ala
1               5
<210>  333
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  333
attagtggta gtggtggtag caca                                             24
<210>  334
<211>  8
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  334
Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr
1               5
<210>  335
<211>  48
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  335
gcgaaaaaaa taagcagctc gtcctactac tactacgcta tggacgtc                   48
<210>  336
<211>  16
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  336
Ala Lys Lys Ile Ser Ser Ser Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Val
1               5                   10                  15
<210>  337
<211>  355
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  337
caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc      60
tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agatatgata tcagctgggt gcgacaggcc     120
cctggacaag gacttgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggtac atcaaactac     180
gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accacggacg aatccacgag tacagtctac     240
atggagctga gcagtctgag atctgaagac acggccgtgt attattgtgc gagaggaggt     300
cgatatggct ggttcgaccc ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc ctcag          355
<210>  338
<211>  118
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  338
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Arg Tyr
            20                  25                  30
Asp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ser Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Thr Asp Glu Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Gly Gly Arg Tyr Gly Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr
            100                 105                 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>  339
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  339
ggaggcacct tcagcagata tgat                                             24
<210>  340
<211>  8
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  340
Gly Gly Thr Phe Ser Arg Tyr Asp
1               5
<210>  341
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  341
atcatcccta tctttggtac atca                                             24
<210>  342
<211>  8
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  342
Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ser
1               5
<210>  343
<211>  33
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  343
gcgagaggag gtcgatatgg ctggttcgac ccc                                   33
<210>  344
<211>  11
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  344
Ala Arg Gly Gly Arg Tyr Gly Trp Phe Asp Pro
1               5                   10
<210>  345
<211>  375
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  345
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc      60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctttgcca tgagctgggt ccgccaggct     120
ccagggaagg aactggagtg ggtctcatct attagtggtc gtggtggtag cacatactac     180
gcagactccg tgaggggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagat cacgctgtat     240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagatatt     300
gtcttccggt ataccagctc ggcctactgg tacttcgatc tctggggccg tggcaccctg     360
gtcaccgtct cctca                                                      375
<210>  346
<211>  125
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  346
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
            20                  25                  30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Ser Ile Ser Gly Arg Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Ile Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Lys Asp Ile Val Phe Arg Tyr Thr Ser Ser Ala Tyr Trp Tyr Phe
            100                 105                 110
Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120                 125
<210>  347
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  347
ggattcacct ttagcagctt tgcc                                             24
<210>  348
<211>  8
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  348
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Ala
1               5
<210>  349
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  349
attagtggtc gtggtggtag caca                                             24
<210>  350
<211>  8
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  350
Ile Ser Gly Arg Gly Gly Ser Thr
1               5
<210>  351
<211>  54
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  351
gcgaaagata ttgtcttccg gtataccagc tcggcctact ggtacttcga tctc            54
<210>  352
<211>  18
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  352
Ala Lys Asp Ile Val Phe Arg Tyr Thr Ser Ser Ala Tyr Trp Tyr Phe
1               5                   10                  15
Asp Leu
<210>  353
<211>  375
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  353
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc      60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatggca tgaactgggt ccgccaggct     120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagtt attagtggta gtggtggtag cacatactac     180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat     240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagatcgt     300
tggacgtatt actatgatag tagtggttcc ccctttgact actggggcca gggaaccctg     360
gtcaccgtct cctca                                                      375
<210>  354
<211>  125
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  354
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Val Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Lys Asp Arg Trp Thr Tyr Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Ser Pro Phe
            100                 105                 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120                 125
<210>  355
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  355
ggattcacct ttagcagcta tggc                                             24
<210>  356
<211>  8
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  356
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly
1               5
<210>  357
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  357
attagtggta gtggtggtag caca                                             24
<210>  358
<211>  8
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  358
Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr
1               5
<210>  359
<211>  54
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  359
gcgaaagatc gttggacgta ttactatgat agtagtggtt ccccctttga ctac            54
<210>  360
<211>  18
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  360
Ala Lys Asp Arg Trp Thr Tyr Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Ser Pro Phe
1               5                   10                  15
Asp Tyr
<210>  361
<211>  324
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  361
gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc      60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa     120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca     180
gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag     240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcaccttg gacgttcggc     300
caagggacca aggtggaaat caaa                                            324
<210>  362
<211>  108
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  362
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
            20                  25                  30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
        35                  40                  45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65                  70                  75                  80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
                85                  90                  95
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105
<210>  363
<211>  21
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  363
cagagtgtta gcagcagcta c                                                21
<210>  364
<211>  7
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  364
Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr
1               5
<210>  365
<211>  9
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  365
ggtgcatcc                                                               9
<210>  366
<211>  3
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  366
Gly Ala Ser
1
<210>  367
<211>  27
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  367
cagcagtatg gtagctcacc ttggacg                                          27
<210>  368
<211>  9
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  368
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Trp Thr
1               5
<210>  369
<211>  363
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  369
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc tttgtacagc ctggggggtc cctgagactc      60
tcctgtgcag cctctggatt cacttttagc agttatgcca tgagttgggt ccgccaggct     120
ccaggtaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta ctggtagtaa cacatactac     180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat     240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgttt actactgtgc gaaagatcgc     300
gtgactacag taacctacta ctttgactac tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc     360
tca                                                                   363
<210>  370
<211>  121
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  370
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Phe Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Ala Ile Ser Gly Thr Gly Ser Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Lys Asp Arg Val Thr Thr Val Thr Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly
            100                 105                 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>  371
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  371
ggattcactt ttagcagtta tgcc                                             24
<210>  372
<211>  8
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  372
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala
1               5
<210>  373
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  373
attagtggta ctggtagtaa caca                                             24
<210>  374
<211>  8
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  374
Ile Ser Gly Thr Gly Ser Asn Thr
1               5
<210>  375
<211>  42
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  375
gcgaaagatc gcgtgactac agtaacctac tactttgact ac                         42
<210>  376
<211>  14
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  376
Ala Lys Asp Arg Val Thr Thr Val Thr Tyr Tyr Phe Asp Tyr
1               5                   10
<210>  377
<211>  372
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  377
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc      60
tcctgtgcag cctctggttt cacctttagc agctatgcca tgaactgggt ccgccaggct     120
ccagggaagg gactggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtgatag cacatactac     180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaggac cacgctgtct     240
ctgcaattga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagatcga     300
ctactatggt tcggggaatt aggatcccca tttcactact ggggccaggg aaccctggtc     360
accgtctcct ca                                                         372
<210>  378
<211>  124
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  378
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Asp Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Arg Thr Thr Leu Ser
65                  70                  75                  80
Leu Gln Leu Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Lys Asp Arg Leu Leu Trp Phe Gly Glu Leu Gly Ser Pro Phe His
            100                 105                 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>  379
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  379
ggtttcacct ttagcagcta tgcc                                             24
<210>  380
<211>  8
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  380
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala
1               5
<210>  381
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  381
attagtggta gtggtgatag caca                                             24
<210>  382
<211>  8
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  382
Ile Ser Gly Ser Gly Asp Ser Thr
1               5
<210>  383
<211>  51
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  383
gcgaaagatc gactactatg gttcggggaa ttaggatccc catttcacta c               51
<210>  384
<211>  17
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  384
Ala Lys Asp Arg Leu Leu Trp Phe Gly Glu Leu Gly Ser Pro Phe His
1               5                   10                  15
Tyr
<210>  385
<211>  363
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  385
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggaacagc ctggggggtc cctgagactc      60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct     120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagtc attagtggta gtggtggtta cacaaactac     180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat     240
ctgcaaatga accgcctgag agccgaggac tcggccgttt attactgtgc gaggcataat     300
tggaactacg actattacgg tatggacgtc tggggccagg ggaccacggt caccgtctcc     360
tca                                                                   363
<210>  386
<211>  121
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  386
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Glu Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Val Ile Ser Gly Ser Gly Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Arg Leu Arg Ala Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg His Asn Trp Asn Tyr Asp Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly
            100                 105                 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>  387
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  387
ggattcacct ttagcagcta tgcc                                             24
<210>  388
<211>  8
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  388
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala
1               5
<210>  389
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  389
attagtggta gtggtggtta caca                                             24
<210>  390
<211>  8
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  390
Ile Ser Gly Ser Gly Gly Tyr Thr
1               5
<210>  391
<211>  42
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  391
gcgaggcata attggaacta cgactattac ggtatggacg tc                         42
<210>  392
<211>  14
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  392
Ala Arg His Asn Trp Asn Tyr Asp Tyr Tyr Gly Met Asp Val
1               5                   10
<210>  393
<211>  360
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  393
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagt ctgggaggtc cctgagactc      60
tcctgtgcag ccgctggatt caccttcagt aattatggca tgcactgggt ccgccaggct     120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcactt atgtcatttg atggaagtga taaatactat     180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgttgtat     240
ctgcaaatga acagcctgag agctgaggac acggctctgt attactgtgc gaaaggatac     300
gatttttgga gtggttattg ggactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca     360
<210>  394
<211>  120
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  394
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Ser Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ala Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
            20                  25                  30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Leu Met Ser Phe Asp Gly Ser Asp Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Lys Gly Tyr Asp Phe Trp Ser Gly Tyr Trp Asp Tyr Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>  395
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  395
ggattcacct tcagtaatta tggc                                             24
<210>  396
<211>  8
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  396
Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Gly
1               5
<210>  397
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  397
atgtcatttg atggaagtga taaa                                             24
<210>  398
<211>  8
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  398
Met Ser Phe Asp Gly Ser Asp Lys
1               5
<210>  399
<211>  39
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  399
gcgaaaggat acgatttttg gagtggttat tgggactac                             39
<210>  400
<211>  13
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  400
Ala Lys Gly Tyr Asp Phe Trp Ser Gly Tyr Trp Asp Tyr
1               5                   10
<210>  401
<211>  351
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  401
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacaac ctggggggtc cctgagactc      60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc acctatgcca tgagctgggt ccgccaggct     120
ccagggaagg ggcttgagtg ggtctcaact attagtggtc gttctgatat tacatacttc     180
gcagactccg tgaagggccg gtttaccgtc tccagagaca attccaagac cacgctatat     240
ctccaaatga acagtctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gacagatgac     300
gacctgcccc ttgactactg gggccaggga accctggtca ccgtctcctc a              351
<210>  402
<211>  117
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  402
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
            20                  25                  30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Thr Ile Ser Gly Arg Ser Asp Ile Thr Tyr Phe Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ser Lys Thr Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Thr Asp Asp Asp Leu Pro Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
            100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>  403
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  403
ggattcacct ttagcaccta tgcc                                             24
<210>  404
<211>  8
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  404
Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Ala
1               5
<210>  405
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  405
attagtggtc gttctgatat taca                                             24
<210>  406
<211>  8
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  406
Ile Ser Gly Arg Ser Asp Ile Thr
1               5
<210>  407
<211>  30
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  407
gcgacagatg acgacctgcc ccttgactac                                       30
<210>  408
<211>  10
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  408
Ala Thr Asp Asp Asp Leu Pro Leu Asp Tyr
1               5                   10
<210>  409
<211>  354
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  409
caggtgcagc tggtgcagtc tgggactgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc      60
tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agatatactt tcagctgggt gcgacaggcc     120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggtac aacaaactac     180
gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accacggacg aatccacgag cacagtctac     240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attattgtac cagaggaggt     300
cgatatggct ggttcgaccc ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc ctca           354
<210>  410
<211>  118
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  410
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Thr Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Arg Tyr
            20                  25                  30
Thr Phe Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Thr Asp Glu Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Thr Arg Gly Gly Arg Tyr Gly Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr
            100                 105                 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>  411
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  411
ggaggcacct tcagcagata tact                                             24
<210>  412
<211>  8
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  412
Gly Gly Thr Phe Ser Arg Tyr Thr
1               5
<210>  413
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  413
atcatcccta tctttggtac aaca                                             24
<210>  414
<211>  8
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  414
Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Thr
1               5
<210>  415
<211>  33
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  415
accagaggag gtcgatatgg ctggttcgac ccc                                   33
<210>  416
<211>  11
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  416
Thr Arg Gly Gly Arg Tyr Gly Trp Phe Asp Pro
1               5                   10
<210>  417
<211>  403
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<220>
<221>  misc_feature
<223>  His-myc tagged human MSR1 antibody (extracellular domain)
<400>  417
His His His His His His Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu
1               5                   10                  15
Gly Gly Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Lys Trp Glu Thr
            20                  25                  30
Lys Asn Cys Ser Val Ser Ser Thr Asn Ala Asn Asp Ile Thr Gln Ser
        35                  40                  45
Leu Thr Gly Lys Gly Asn Asp Ser Glu Glu Glu Met Arg Phe Gln Glu
    50                  55                  60
Val Phe Met Glu His Met Ser Asn Met Glu Lys Arg Ile Gln His Ile
65                  70                  75                  80
Leu Asp Met Glu Ala Asn Leu Met Asp Thr Glu His Phe Gln Asn Phe
                85                  90                  95
Ser Met Thr Thr Asp Gln Arg Phe Asn Asp Ile Leu Leu Gln Leu Ser
            100                 105                 110
Thr Leu Phe Ser Ser Val Gln Gly His Gly Asn Ala Ile Asp Glu Ile
        115                 120                 125
Ser Lys Ser Leu Ile Ser Leu Asn Thr Thr Leu Leu Asp Leu Gln Leu
    130                 135                 140
Asn Ile Glu Asn Leu Asn Gly Lys Ile Gln Glu Asn Thr Phe Lys Gln
145                 150                 155                 160
Gln Glu Glu Ile Ser Lys Leu Glu Glu Arg Val Tyr Asn Val Ser Ala
                165                 170                 175
Glu Ile Met Ala Met Lys Glu Glu Gln Val His Leu Glu Gln Glu Ile
            180                 185                 190
Lys Gly Glu Val Lys Val Leu Asn Asn Ile Thr Asn Asp Leu Arg Leu
        195                 200                 205
Lys Asp Trp Glu His Ser Gln Thr Leu Arg Asn Ile Thr Leu Ile Gln
    210                 215                 220
Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Glu Lys Gly Asp Arg Gly Pro Thr Gly
225                 230                 235                 240
Glu Ser Gly Pro Arg Gly Phe Pro Gly Pro Ile Gly Pro Pro Gly Leu
                245                 250                 255
Lys Gly Asp Arg Gly Ala Ile Gly Phe Pro Gly Ser Arg Gly Leu Pro
            260                 265                 270
Gly Tyr Ala Gly Arg Pro Gly Asn Ser Gly Pro Lys Gly Gln Lys Gly
        275                 280                 285
Glu Lys Gly Ser Gly Asn Thr Leu Thr Pro Phe Thr Lys Val Arg Leu
    290                 295                 300
Val Gly Gly Ser Gly Pro His Glu Gly Arg Val Glu Ile Leu His Ser
305                 310                 315                 320
Gly Gln Trp Gly Thr Ile Cys Asp Asp Arg Trp Glu Val Arg Val Gly
                325                 330                 335
Gln Val Val Cys Arg Ser Leu Gly Tyr Pro Gly Val Gln Ala Val His
            340                 345                 350
Lys Ala Ala His Phe Gly Gln Gly Thr Gly Pro Ile Trp Leu Asn Glu
        355                 360                 365
Val Phe Cys Phe Gly Arg Glu Ser Ser Ile Glu Glu Cys Lys Ile Arg
    370                 375                 380
Gln Trp Gly Thr Arg Ala Cys Ser His Ser Glu Asp Ala Gly Val Thr
385                 390                 395                 400
Cys Thr Leu
<210>  418
<211>  403
<212>  PRT
<213>  Macaca fascicularis
<220>
<221>  misc_feature
<223>  His-myc tagged monkey MSR1 antibody (extracellular domain)
<400>  418
His His His His His His Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu
1               5                   10                  15
Gly Gly Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Lys Trp Glu Thr
            20                  25                  30
Lys Asn Cys Ser Ile Gly Ser Thr Asn Ala Asp Asp Ile Thr Gln Ser
        35                  40                  45
Leu Thr Gly Lys Gly Asn Asp Ser Glu Ala Glu Thr Arg Phe Gln Glu
    50                  55                  60
Val Phe Met Glu His Met Ser Asn Met Glu Lys Arg Ile Gln His Ile
65                  70                  75                  80
Ser Asp Met Glu Ala Asn Leu Ile Asp Ala Glu His Phe Gln Asn Phe
                85                  90                  95
Ser Met Thr Thr Asp Gln Arg Phe Asn Asp Ile Leu Leu Gln Leu Ser
            100                 105                 110
Thr Leu Phe Ser Ser Val Gln Gly His Gly Asn Thr Ile Asp Glu Ile
        115                 120                 125
Ser Lys Ser Leu Ile Ser Leu Asn Thr Thr Leu Leu Asp Leu Gln Leu
    130                 135                 140
Asn Ile Glu Lys Leu Asn Gly Lys Ile Gln Glu Lys Thr Phe Lys Gln
145                 150                 155                 160
Gln Glu Glu Ile Ser Lys Leu Glu Glu His Val Tyr Asn Val Ser Ala
                165                 170                 175
Glu Ile Met Ala Met Lys Glu Glu Gln Val His Leu Glu Gln Glu Ile
            180                 185                 190
Lys Gly Glu Val Lys Val Leu Asn Asn Ile Thr Asn Asp Leu Arg Leu
        195                 200                 205
Lys Asp Trp Glu His Ser Gln Thr Leu Arg Asn Ile Thr Leu Ile Gln
    210                 215                 220
Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Glu Lys Gly Asp Arg Gly Pro Thr Gly
225                 230                 235                 240
Glu Ser Gly Pro Arg Gly Phe Pro Gly Pro Val Gly Pro Pro Gly Leu
                245                 250                 255
Lys Gly Asp Arg Gly Ala Ile Gly Phe Pro Gly Ser Arg Gly Leu Pro
            260                 265                 270
Gly Tyr Ala Gly Arg Pro Gly Asn Ser Gly Pro Lys Gly Gln Lys Gly
        275                 280                 285
Glu Lys Gly Ser Gly Asn Thr Leu Thr Ser Phe Lys Lys Val Arg Leu
    290                 295                 300
Val Gly Gly Ser Gly Pro His Glu Gly Arg Val Glu Ile Leu His Ser
305                 310                 315                 320
Gly Gln Trp Gly Thr Ile Cys Asp Asp Arg Trp Glu Val Arg Val Gly
                325                 330                 335
Gln Val Ile Cys Arg Ser Leu Gly Tyr Pro Gly Val Gln Ala Val His
            340                 345                 350
Lys Ala Ala His Phe Gly Gln Gly Thr Gly Pro Ile Trp Leu Asn Glu
        355                 360                 365
Val Tyr Cys Phe Gly Arg Glu Ser Ser Ile Glu Glu Cys Lys Ile Arg
    370                 375                 380
Gln Trp Gly Thr Arg Thr Cys Ser His Ser Glu Asp Ala Gly Val Thr
385                 390                 395                 400
Cys Thr Leu
<210>  419
<211>  360
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  419
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ctggtcaagc cgggggggtc cctgagactc      60
tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agatatagta tgaactgggt ccgccaggct     120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcatcc attagcagta gcagtagtta catatactac     180
ggagacacag tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa gtcactgtat     240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtct attactgtgt gagagatcga     300
ggacagctcg tcctctactt tgactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca     360
<210>  420
<211>  120
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  420
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr
            20                  25                  30
Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Gly Asp Thr Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Val Arg Asp Arg Gly Gln Leu Val Leu Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>  421
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  421
ggattcactt tcagtagata tagt                                             24
<210>  422
<211>  8
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  422
Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr Ser
1               5
<210>  423
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  423
attagcagta gcagtagtta cata                                             24
<210>  424
<211>  8
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  424
Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile
1               5
<210>  425
<211>  39
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  425
gtgagagatc gaggacagct cgtcctctac tttgactac                             39
<210>  426
<211>  13
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  426
Val Arg Asp Arg Gly Gln Leu Val Leu Tyr Phe Asp Tyr
1               5                   10
<210>  427
<211>  324
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  427
gacatccaga tgacccagtc tccagcctcc ctgtctacat ctataagaga cagagtcacc      60
atcacttgcc gggcaagtct gagcattagc agctttttaa attggtttca gcagagacca     120
gggaaagccc ctaaactcct gatctatgtt gcatccaatt tgcaaagtgg ggtcccatca     180
agattcagtg acagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct     240
gaagattttg caacttacta ctgtcaacag aattacagta cccctccgat caccttcggc     300
caagggacac gactggagat taaa                                            324
<210>  428
<211>  108
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  428
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Thr Ser Ile Arg
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Leu Ser Ile Ser Ser Phe
            20                  25                  30
Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Val Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Asp
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Tyr Ser Thr Pro Pro
                85                  90                  95
Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
            100                 105
<210>  429
<211>  18
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  429
ctgagcatta gcagcttt                                                    18
<210>  430
<211>  6
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  430
Leu Ser Ile Ser Ser Phe
1               5
<210>  431
<211>  9
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  431
gttgcatcc                                                               9
<210>  432
<211>  3
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  432
Val Ala Ser
1
<210>  433
<211>  30
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  433
caacagaatt acagtacccc tccgatcacc                                       30
<210>  434
<211>  10
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  434
Gln Gln Asn Tyr Ser Thr Pro Pro Ile Thr
1               5                   10
<210>  435
<211>  369
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  435
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc      60
tcctgtgcgg gctctggatt caccttcagt agctatggct tgcactgggt ccgccaggct     120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatcatatg atggaagtaa taaatattat     180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat     240
ctgcaaatga gcagcctgag agctgaggac acggctgtgt attactgtgc gaaagatcga     300
cttgtacgat attctgactg gccattcttt gactattggg gccagggaac cctggtcacc     360
gtctcctca                                                             369
<210>  436
<211>  123
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  436
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Gly Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Lys Asp Arg Leu Val Arg Tyr Ser Asp Trp Pro Phe Phe Asp Tyr
            100                 105                 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>  437
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  437
ggattcacct tcagtagcta tggc                                             24
<210>  438
<211>  8
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  438
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly
1               5
<210>  439
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  439
atatcatatg atggaagtaa taaa                                             24
<210>  440
<211>  8
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  440
Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys
1               5
<210>  441
<211>  48
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  441
gcgaaagatc gacttgtacg atattctgac tggccattct ttgactat                   48
<210>  442
<211>  16
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  442
Ala Lys Asp Arg Leu Val Arg Tyr Ser Asp Trp Pro Phe Phe Asp Tyr
1               5                   10                  15
<210>  443
<211>  324
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  443
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc      60
atcacttgcc gggcaagtca aaacattacc agctatttga attgctatca gcagaaacca     120
gggaaagccc ctaaactcct gatctatgct gcatccagtt tgyaaagtgg ggtcccatca     180
aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct     240
gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agtttcagta gtcctccgat caccttcggc     300
caagggacac gactggagat taca                                            324
<210>  444
<211>  108
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (55)..(55)
<223>  Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400>  444
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
Leu Asn Cys Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Xaa Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Phe Ser Ser Pro Pro
                85                  90                  95
Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Thr
            100                 105
<210>  445
<211>  18
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  445
caaaacatta ccagctat                                                    18
<210>  446
<211>  6
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  446
Gln Asn Ile Thr Ser Tyr
1               5
<210>  447
<211>  9
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  447
gctgcatcc                                                               9
<210>  448
<211>  3
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  448
Ala Ala Ser
1
<210>  449
<211>  30
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  449
caacagagtt tcagtagtcc tccgatcacc                                       30
<210>  450
<211>  10
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  450
Gln Gln Ser Phe Ser Ser Pro Pro Ile Thr
1               5                   10
<210>  451
<211>  348
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  451
caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc      60
acctgcactg tctctggtgg ctccatcagt agttactact ggagctggat ccggcagccc     120
ccagggaagg gactggaatg gattgggtac atctattaca gtgggagcgc caactacaac     180
ccctccctca agagtcgagt caccatatca gtagacacgt ccaagaacca gttctccctg     240
aagctaagct ctgtgaccgc tgcggacacg gccgtgtatt actgtgtgag agaccgggac     300
ctactccttg accactgggg ccagggaacc ctggtcaccg tctcctca                  348
<210>  452
<211>  116
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  452
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Ala Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
    50                  55                  60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65                  70                  75                  80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val
                85                  90                  95
Arg Asp Arg Asp Leu Leu Leu Asp His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
            100                 105                 110
Thr Val Ser Ser
        115
<210>  453
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  453
ggtggctcca tcagtagtta ctac                                             24
<210>  454
<211>  8
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  454
Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr Tyr
1               5
<210>  455
<211>  21
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  455
atctattaca gtgggagcgc c                                                21
<210>  456
<211>  7
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  456
Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Ala
1               5
<210>  457
<211>  30
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  457
gtgagagacc gggacctact ccttgaccac                                       30
<210>  458
<211>  10
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  458
Val Arg Asp Arg Asp Leu Leu Leu Asp His
1               5                   10
<210>  459
<211>  324
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  459
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc      60
atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca     120
gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca     180
aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct     240
gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacagta cccctccgat caccttcggc     300
caagggacac gactggagat taaa                                            324
<210>  460
<211>  108
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  460
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro
                85                  90                  95
Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
            100                 105
<210>  461
<211>  18
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  461
cagagcatta gcagctat                                                    18
<210>  462
<211>  6
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  462
Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
1               5
<210>  463
<211>  9
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  463
gctgcatcc                                                               9
<210>  464
<211>  3
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  464
Ala Ala Ser
1
<210>  465
<211>  30
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  465
caacagagtt acagtacccc tccgatcacc                                       30
<210>  466
<211>  10
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成的
<400>  466
Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro Ile Thr
1               5                   10

Claims (159)

1.具有式(I)的结构的化合物：
Figure FDA0004000531950000011
其中：
BA为结合剂；
Gln为谷氨酰胺残基；
SP不存在或为间隔基；
Z为狄尔斯-阿尔德加合物；
L为接头；
D为治疗部分，其中所述治疗部分为美登素类化合物、tubulysin、澳瑞他汀、多拉司他汀、喜树碱、吡咯并苯并二氮杂卓、抗生素、抗病毒剂、抗炎剂、免疫调节剂、抗真菌剂、类固醇或其类似物或衍生物，或D为成像剂部分；
n为1-3的整数；其中当n为2或3时，Z、L和D可以相同或不同；且
d为1-6的整数。
2.权利要求1的式(IA)的化合物：
Figure FDA0004000531950000012
3.权利要求1的式(IB)的化合物：
Figure FDA0004000531950000013
4.权利要求1的化合物，其中n为1或2。
5.权利要求3的化合物，其中两个部分D相同。
6.权利要求3的化合物，其中两个部分D不同。
7.权利要求3的化合物，其中两个狄尔斯-阿尔德加合物Z相同。
8.权利要求3的化合物，其中两个狄尔斯-阿尔德加合物Z不同。
9.具有式(II)的结构的化合物：
Figure FDA0004000531950000021
其中：
BA为结合剂；
Gln为谷氨酰胺残基；
SP不存在或为间隔基；
Q为CHR、(CHR)2或O桥；
R每次出现时独立地为H、C1-3烷基、-OC1-3烷基或-NHC1-3烷基；
L为接头；
D为治疗部分；其中所述治疗部分为美登素类化合物、tubulysin、澳瑞他汀、多拉司他汀、喜树碱、吡咯并苯并二氮杂卓、抗生素、抗病毒剂、抗炎剂、免疫调节剂、抗真菌剂、类固醇或其类似物或衍生物，或D为成像剂部分；
n为1-3的整数；且
d为1-6的整数。
10.权利要求9的式(IIA)的化合物：
Figure FDA0004000531950000022
11.权利要求9的式(IIB)的化合物：
Figure FDA0004000531950000023
12.权利要求11的化合物，其中两个部分D相同。
13.权利要求11的化合物，其中两个部分D不同。
14.权利要求9的式(IIIA)的化合物：
Figure FDA0004000531950000031
15.权利要求9的式(IIIB)的化合物：
Figure FDA0004000531950000032
16.权利要求9的式(IIIC)的化合物：
Figure FDA0004000531950000033
17.权利要求9-16任一项的化合物，其中R每次出现时为H。
18.权利要求9-16任一项的化合物，其中至少一个R不为H。
19.权利要求18或19的化合物，其中至少一个R为C1-3烷基。
20.权利要求18的化合物，其中至少一个R为甲基。
21.具有式(IV)的结构的化合物：
Figure FDA0004000531950000034
其中：
BA为结合剂；
Gln为谷氨酰胺残基；
SP不存在或为间隔基；
L为接头；
D为治疗部分，其中所述治疗部分为美登素类化合物、tubulysin、溴瑞他汀、多拉司他汀、喜树碱、吡咯并苯并二氮杂卓、抗生素、抗病毒剂、抗炎剂、免疫调节剂、抗真菌剂、类固醇或其类似物或衍生物，或D为成像剂部分；且
d为1-6的整数。
22.权利要求1-21任一项的化合物，其中BA为抗体或其抗原结合片段。
23.权利要求22的化合物，其中BA为单克隆人源化抗体。
24.权利要求22或23的化合物，其中BA为HER-2抗体、其抗原结合片段、MSR1抗体或其抗原结合片段。
25.权利要求1-24任一项的化合物，其中Gln每次出现时独立地为Q295或N297Q。
26.上述权利要求任一项的化合物，其中d为2、4或6。
27.权利要求26的化合物，其中d为2。
28.权利要求26的化合物，其中d为4。
29.上述权利要求任一项的化合物，其中D为治疗部分；其中所述治疗部分为美登素类化合物、tubulysin、澳瑞他汀、多拉司他汀、喜树碱、吡咯并苯并二氮杂卓、抗生素、抗病毒剂、抗炎剂、免疫调节剂、抗真菌剂或其类似物或衍生物。
30.上述权利要求任一项的化合物，其中D为治疗部分；其中所述治疗部分为澳瑞他汀、吡咯并苯并二氮杂卓(PBD)、安沙霉素抗生素或其类似物或衍生物。
31.上述权利要求任一项的化合物，其中D为治疗部分，其中所述治疗部分为一甲基溴瑞他汀E(MMAE)、PBD-1、利福霉素或其类似物或衍生物.
32.上述权利要求任一项的化合物，其中D为成像剂部分，其中成像剂包含染料、螯合剂、放射性核素或寡核苷酸。
33.权利要求32的化合物，其中D为Alexa Fluor荧光染料，其选自Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 555和Alexa Fluor 568。
34.权利要求32的化合物，其中D为Alexa Fluor 647。
35.上述权利要求任一项的化合物，其中SP为以下一个或多个：-(CH2)u-、-((CH2)u-O-)v-、-NH-或-C(O)-及其组合，其中下标u和v每次出现时独立地为1-20的整数。
36.权利要求35的化合物，其中SP为如下的一个或多个：-(CH2)u-、C(O)-、-NH-、-(CH2)u-NH-C(O)-、-(CH2)u-C(O)-NH-、-(CH2)u-C(O)-NH-(CH2)v-、-(CH2-CH2-O)v-、-(CH2)u-(O-CH2-CH2)v-C(O)-NH-、-(CH2-CH2-O)v-(CH2)u-C(O)-NH-(CH2)u-、-NH-(CH2)u-、-NH-(CH2)u-C(O)-、-NH-(CH2)u-C(O)-NH-(CH2)v-、-NH-(CH2-CH2-O)v-、-NH-(CH2-CH2-O)v-C(O)-、-NH-(CH2-CH2-O)v-(CH2)u-、-NH-(CH2-CH2-O)v-(CH2)u-C(O)-、-NH-(CH2-CH2-O)v-(CH2)u-C(O)-NH-(CH2)u-、-(CH2)u-NH-C(O)-、-(CH2)u-C(O)-NH-(CH2-CH2-O)v-C(O)-NH-、-NH-(CH2)u-C(O)-NH-
Figure FDA0004000531950000051
Figure FDA0004000531950000052
或其组合；且其中下标u、v、w和x独立地为1-20的整数。
37.权利要求35-36任一项的化合物，其中SP为-(CH2)u-；且其中下标u为1-5的整数。
38.权利要求35-36任一项的化合物，其中SP为
Figure FDA0004000531950000053
其中下标u、v、w和x独立地为1-12的整数。
39.权利要求35-36和38任一项的化合物，其中SP为
Figure FDA0004000531950000061
40.权利要求35-36和38-39任一项的化合物，其中两个部分D相同。
41.权利要求35-36和38-39任一项的化合物，其中两个部分D不同。
42.上述权利要求任一项的化合物，其中Z为式2a的部分：
Figure FDA0004000531950000062
其中R′独立地为H、C1-3烷基或两个R′一起构成CHR、CHR-CHR或O桥，且
其中R每次出现时独立地为H、C1-3烷基或-OC1-3烷基。
43.上述权利要求任一项的化合物，其中Z为式2a’的部分：
Figure FDA0004000531950000063
其中R′独立地为H、C1-3烷基或两个R′一起构成CH2、CH2CH2或O桥。
44.权利要求42的化合物，其中Z为式2a-1至2a-3的任意一个的部分：
Figure FDA0004000531950000064
45.权利要求38的化合物，其中Z为式2a-1的部分：
Figure FDA0004000531950000065
46.权利要求42的化合物，其中至少一个R不为H。
47.权利要求46的化合物，其中Z为式2a-4至2a-6的任意一个的部分：
Figure FDA0004000531950000071
其中至少一个R不为H。
48.权利要求46的化合物，其中Z为式2a-7至2a-12的任意一个的部分：
Figure FDA0004000531950000072
49.权利要求8的化合物，其中部分Z每次出现时独立地选自2a-1至2a-12。
50.权利要求49的化合物，其中一个部分Z为2a-7，而另一个部分Z为2a-11。
51.权利要求49的化合物，其中一个部分Z为2a-7，而另一个部分Z为2a-12。
52.权利要求38的化合物，其中片段-SP-Z-选自
Figure FDA0004000531950000073
其中两个部分Z相同。
53.权利要求38的化合物，其中片段-SP-Z-选自
Figure FDA0004000531950000074
其中两个部分Z不同。
54.上述权利要求任一项的化合物，其中L包含一种或多种氨基酸。
55.权利要求46的化合物，其中L还包含如下的一个或多个：-NH-、-S-、-O-、-(CH2)n-、-(CH2-CH2-O-)m-、-C(O)-、
Figure FDA0004000531950000081
其中下标m和n每次出现时独立地为0-20的整数。
56.权利要求46或55的化合物，其中一个或多个氨基酸为甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸或瓜氨酸。
57.权利要求46或55的化合物，其中一个或多个氨基酸为缬氨酸-瓜氨酸(-VC-)或缬氨酸-丙氨酸(-VA-)。
58.权利要求0-57任一项的化合物，其中L为：
Figure FDA0004000531950000082
其中l、m和n每次出现时独立地为0-20的整数；且p为0-4的整数。
59.权利要求0-58任一项的化合物，其中L为：
Figure FDA0004000531950000083
其中n为1-6的整数；m为2-10的整数；p为1-3的整数，且所述氨基酸每次出现时独立地为缬氨酸、瓜氨酸或丙氨酸。
60.权利要求0-59任一项的化合物，其中部分D通过叔氨基连接至接头L。
61.权利要求1的化合物，其中片段
Figure FDA0004000531950000091
具有式(I-DA)：
Figure FDA0004000531950000092
其中
Figure FDA0004000531950000093
为与间隔基或结合剂的键，且其中部分D通过氨基连接。
62.权利要求61的化合物，其中D为美登素类化合物或如本文所述的美登素类化合物类似物。
63.权利要求1的化合物，其中片段
Figure FDA0004000531950000094
具有式(I-DA1)：
Figure FDA0004000531950000095
64.权利要求1的化合物，其中片段
Figure FDA0004000531950000096
具有式(I-DB)：
Figure FDA0004000531950000097
其中
Figure FDA0004000531950000098
为与间隔基或结合剂的键，且其中部分D通过氨基连接。
65.权利要求64的化合物，其中D为吡咯并苯并二氮杂卓(PBD)或其类似物或衍生物。
66.权利要求64的化合物，其中D为PBD-1：
Figure FDA0004000531950000099
或其类似物或衍生物。
67.权利要求1的化合物，其中片段
Figure FDA0004000531950000101
具有式(I-DB1)：
Figure FDA0004000531950000102
其中
Figure FDA0004000531950000103
为与间隔基或结合剂的键。
68.权利要求1的化合物，其中片段
Figure FDA0004000531950000104
具有式(I-DC)：
Figure FDA0004000531950000105
其中
Figure FDA0004000531950000106
为与间隔基或结合剂的键，且其中部分D通过氨基连接。
69.权利要求68的化合物，其中D为利福霉素或其类似物或衍生物。
70.权利要求1的化合物，其中片段
Figure FDA0004000531950000107
具有式(I-DC1)：
Figure FDA0004000531950000108
其中
Figure FDA0004000531950000109
为与间隔基或结合剂的键。
71.权利要求1的化合物，其中片段
Figure FDA00040005319500001010
具有式(I-DC2)：
Figure FDA0004000531950000111
其中
Figure FDA0004000531950000112
为与间隔基或结合剂的键。
72.上述权利要求任一项的式(II)的化合物：
Figure FDA0004000531950000113
其中：
BA为HER-2抗体、其抗原结合片段、MSR1抗体或其抗原结合片段；且
D为治疗部分，其中治疗部分为一甲基溴瑞他汀E(MMAE)、PBD-1、利福霉素或其类似物或衍生物。
73.权利要求72的化合物，具有式(I-A1’)-(I-A10’)的结构：
Figure FDA0004000531950000114
Figure FDA0004000531950000121
Figure FDA0004000531950000131
Figure FDA0004000531950000141
其中d为1-6的整数。
74.权利要求72的化合物，具有式(I-B1’)的结构：
Figure FDA0004000531950000142
(I-B1’)，其中d为1-6的整数。
75.权利要求72的化合物，具有式(I-C1’)的结构
Figure FDA0004000531950000151
Figure FDA0004000531950000152
其中d为1-6的整数。
76.组合物，包含权利要求1-0任一项的化合物群，该组合物具有约0.5-约8.0的药物-抗体比(DAR)。
77.权利要求76的组合物，具有约1.0-约2.5的DAR。
78.权利要求77的组合物，具有约2的DAR。
79.权利要求76的组合物，具有约3.0-约4.5的DAR。
80.权利要求79的组合物，具有约4的DAR。
81.生产权利要求1-0任一项的化合物的方法，该方法包含下列步骤：
a.)使：i)具有式(V-x)的结构的化合物：
Figure FDA0004000531950000153
其中：
BA为结合剂；
SP不存在或为间隔基；
X为包含二烯的部分；
l为1-6的整数；且
n为1或2；
接触ii)式(VI-y)的化合物：
Y-L-D    (VI-y)；
其中：
Y为包含亲双烯体的部分；
L为接头；且
D为治疗部分，其中所述治疗部分为美登素类化合物、tubulysin、澳瑞他汀、多拉司他汀、喜树碱、吡咯并苯并二氮杂卓、抗生素、抗病毒剂、抗炎剂、免疫调节剂、抗真菌剂、类固醇或其类似物或衍生物，或D为成像剂部分；并且
b.)分离产生的化合物。
82.权利要求81的方法，包含制备具有式(V-x)的结构的化合物，其包含下列步骤：
1.)使i)具有至少一个受体谷氨酰胺残基的结合剂和ii)式V-x1的化合物在转谷氨酰胺酶(TGase)存在下接触：
NH2-SP-X    (V-x1)，其中：
SP不存在或为间隔基；且
X为包含二烯的部分；且
2.)分离产生的化合物。
83.权利要求81的方法，包含制备具有式(V-x)的结构的化合物，其包含下列步骤：
1.)使i)具有至少一个受体谷氨酰胺残基的结合剂和ii)式V-x2的化合物在转谷氨酰胺酶(TGase)存在下接触：
Figure FDA0004000531950000161
其中：
SP不存在或为间隔基；且
X为包含二烯的部分，其中两个X部分相同；并且
2.)分离产生的化合物。
84.权利要求81的方法，包含制备具有式(V-x)的结构的化合物，其包含下列步骤：
1.)使i)具有至少一个受体谷氨酰胺残基的结合剂和ii)式V-x2的化合物在转谷氨酰胺酶(TGase)存在下接触
Figure FDA0004000531950000162
其中：
SP不存在或为间隔基；且
X为包含二烯的部分，其中两个X部分并且；并且
2.)分离产生的化合物。
85.权利要求81-84任一项的方法，其中X每次出现时独立地选自
Figure FDA0004000531950000171
其中
R每次出现时独立地为H、C1-3烷基、-OC1-3烷基或-NHC1-3烷基。
86.权利要求85的方法，其中R每次出现时为H。
87.权利要求85的方法，其中至少一个R不为H。
88.权利要求85的方法，其中至少一个R为C1-3烷基。
89.权利要求85的方法，其中至少一个R为甲基。
90.权利要求81-82任一项的方法，其中X为
Figure FDA0004000531950000172
且Y为
Figure FDA0004000531950000173
91.生产权利要求3的式(1B)的化合物的方法，该方法包含下列步骤：
a.)使：i)具有式(V-x)的结构的化合物：
Figure FDA0004000531950000174
其中：
BA为结合剂；
SP不存在或为间隔基；
X为包含二烯的部分；
l为1-6的整数；
接触ii)式(VI-y)的化合物：
Y-L-D    (VI-y)；
其中：
Y为包含亲双烯体的部分；
L为接头；且
D为治疗部分，其中所述治疗部分为美登素类化合物、tubulysin、澳瑞他汀、多拉司他汀、喜树碱、吡咯并苯并二氮杂卓、抗生素、抗病毒剂、抗炎剂、免疫调节剂、抗真菌剂、类固醇或其类似物或衍生物，或D为成像剂部分；
产生具有式(V-x’z)的结构的化合物：
Figure FDA0004000531950000181
b.)使式(V-x’z)的化合物接触式(VI-y)的化合物：Y-L-D    (VI-y)；并且
c.)分离产生的式(1B)的化合物。
92.权利要求91的方法，其中两个X部分相同。
93.权利要求91的方法，其中两个X部分不同。
94.权利要求91的方法，其中步骤a.)的D部分与步骤b.)的D部分不同。
95.权利要求91的方法，其中步骤a.)的D部分与步骤b.)的D部分相同。
96.权利要求91-95任一项的方法，其中步骤a.)在约7.0-约7.6的pH下进行。
97.权利要求96的方法，其中步骤a.)在约7.2-约7.4的pH下进行。
98.权利要求96的方法，其中步骤a.)在约7.2的pH下进行。
99.权利要求91-98任一项的方法，其中步骤b.)在约5.0-约6.0的pH下进行。
100.权利要求99的方法，其中步骤b.)在约5.3-约5.7的pH下进行。
101.权利要求99的方法，其中步骤b.)在约5.5的pH下进行。
102.权利要求91-101任一项的方法，还包含在步骤a.)后和步骤b.)前的缓冲液交换步骤。
103.权利要求91-102任一项的方法，其中X每次出现时独立地选自
Figure FDA0004000531950000182
其中
R每次出现时独立地为H、C1-3烷基、-OC1-3烷基或-NHC1-3烷基。
104.权利要求103的方法，其中R每次出现时为H。
105.权利要求103的方法，其中至少一个R不为H。
106.权利要求103的方法，其中至少一个R为C1-3烷基。
107.权利要求103的方法，其中至少一个R为甲基。
108.生产权利要求1-0任一项的化合物的方法，该方法包含下列步骤：
a.)使：i)具有式(V-y)的结构的化合物：
Figure FDA0004000531950000191
其中：
BA为结合剂；
SP不存在或为间隔基；
Y为亲双烯体部分；
l为1-6的数值；且
n为1或2；
与ii)式(VI-x)的化合物接触：
X-L-D    (VI-x)，其中：
X为二烯部分；
L为接头；且
D为治疗部分，其中所述治疗部分为美登素类化合物、tubulysin、澳瑞他汀、多拉司他汀、喜树碱、吡咯并苯并二氮杂卓、抗生素、抗病毒剂、抗炎剂、免疫调节剂、抗真菌剂、类固醇或其类似物或衍生物，D为成像剂部；并且
b.)分离产生的化合物。
109.权利要求91的方法，包含制备具有式(V-y)的结构的化合物，其包含下列步骤：1.)使i)具有至少一个受体谷氨酰胺残基的结合剂和ii)式V-y1的化合物在转谷氨酰胺酶(TGase)存在下接触：
NH2-SP-Y    (V-y1)，其中：
SP不存在或为间隔基；
Y为包含亲双烯体的部分并且
2.)分离产生的化合物。
110.权利要求91的方法，包含制备具有式(V-y)的结构的化合物，其包含下列步骤：
1.)使i)具有至少一个受体谷氨酰胺残基的结合剂和ii)式V-y2的化合物在转谷氨酰胺酶(TGase)存在下接触：
Figure FDA0004000531950000201
其中：
SP不存在或为间隔基；
Y为包含亲双烯体的部分，其中两个Y部分相同；并且
2.)分离产生的化合物。
111.权利要求91的方法，包含制备具有式(V-y)的结构的化合物，其包含下列步骤：
1.)使i)具有至少一个受体谷氨酰胺残基的结合剂和ii)式V-y2的化合物在转谷氨酰胺酶(TGase)存在下接触
Figure FDA0004000531950000202
其中：
SP不存在或为间隔基；
Y为包含亲双烯体的部分，其中两个Y部分；并且
2.)分离产生的化合物。
112.权利要求91或权利要求109的方法，其中X为
Figure FDA0004000531950000203
且Y为
Figure FDA0004000531950000204
113.权利要求82-112任一项的方法，其中结合剂是无糖基化的。
114.权利要求82-113任一项的方法，其中结合剂在接触步骤前去糖基化。
115.权利要求81-114任一项的方法，其中BA为HER-2抗体、其抗原结合片段、MSR1抗体或其抗原结合片段。
116.权利要求任一项的方法81-115，其中Gln每次出现时独立地为Q295或N297Q。
117.权利要求81-116任一项的方法，其中d为2或4。
118.权利要求117的方法，其中d为2。
119.权利要求117的方法，其中d为4。
120.权利要求81和102-118任一项的方法，其中SP为-(CH2)u-、-((CH2)u-O-)v-、-NH-、-C(O)-的一个或多个或其组合，其中下标u和v每次出现时独立地为1-20的整数。
121.权利要求81和102-120任一项的方法，其中SP为-(CH2)u-、C(O)-、-NH-、-(CH2)u-NH-C(O)-、-(CH2)u-C(O)-NH-、-(CH2)u-C(O)-NH-(CH2)v-、-(CH2-CH2-O)v-、-(CH2)u-(O-CH2-CH2)v-C(O)-NH-、-(CH2-CH2-O)v-(CH2)u-C(O)-NH-(CH2)u-、-NH-(CH2)u-、-NH-(CH2)u-C(O)-、-NH-(CH2)u-C(O)-NH-(CH2)v-、-NH-(CH2-CH2-O)v-、-NH-(CH2-CH2-O)v-C(O)-、-NH-(CH2-CH2-O)v-(CH2)u-、-NH-(CH2-CH2-O)v-(CH2)u-C(O)-、-NH-(CH2-CH2-O)v-(CH2)u-C(O)-NH-(CH2)u-、-(CH2)u-NH-C(O)-、-(CH2)u-C(O)-NH-(CH2-CH2-O)v-C(O)-NH-、-NH-(CH2)u-C(O)-NH-的一个或多个或其组合；其中下标u和v独立地为0-20的整数。
122.权利要121求的方法，其中SP为-(CH2)u-；且中下标u为1-5的整数。
123.权利要求91-107任一项的方法，其中SP为
Figure FDA0004000531950000211
Figure FDA0004000531950000212
其中下标u、v、w和x独立地为1-12的整数。
124.权利要求123的方法，其中SP为
Figure FDA0004000531950000213
Figure FDA0004000531950000214
其中下标u、v、w和x独立地为1-12的整数。
125.权利要求123的方法，其中SP为
Figure FDA0004000531950000215
126.权利要求91-107和123-125任一项的方法，其中
Figure FDA0004000531950000221
为
Figure FDA0004000531950000222
127.权利要求81-122任一项的方法，其中X为下式3或4的二烯部分：
Figure FDA0004000531950000223
其中R为H或C1-3烷基；且Q为CH2、CH2CH2或O。
128.权利要求123的方法，其中X为下式4a的二烯部分：
Figure FDA0004000531950000224
129.权利要求81-0任一项的方法，其中：
Y为如下式5或6的亲双烯体：
Figure FDA0004000531950000225
其中：
R′为H或C1-3烷基；J每次出现时独立地为CH或N；且K为CH、N、
Figure FDA0004000531950000231
或NH-N。
130.权利要求129的方法，其中Y为式6a的亲双烯体部分：
Figure FDA0004000531950000232
131.权利要求81-0任一项的方法，其中L包含一种或多种氨基酸。
132.权利要求131的方法，其中L还包含以下的一个或多个：-NH-、-S-、-O-、-(CH2)n-、-(CH2-O-)m-、-C(O)-、
Figure FDA0004000531950000233
133.权利要求131的方法，其中一个或多个氨基酸为甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸或瓜氨酸。
134.权利要求131-133任一项的方法，其中L包含
Figure FDA0004000531950000234
且D包含叔胺，其与L的亚甲基部分共价连接，形成季铵部分。
135.权利要求81-134任一项的方法，其中D为治疗部分；其中所述治疗部分为澳瑞他汀、吡咯并苯并二氮杂卓(PBD)、安沙霉素抗生素或其类似物或衍生物。
136.权利要求81-134任一项的方法，其中D为治疗部分；其中所述治疗部分为一甲基澳瑞他汀E(MMAE)、PBD-1、利福霉素或它们的类似物或衍生物，或D为成像剂部分Alexa Fluor647。
137.权利要求81-135任一项的方法，其中：
BA为HER-2抗体、其抗原结合片段、MSR1抗体或其抗原结合片段；
X为下式4a的二烯部分：
Figure FDA0004000531950000235
Y为式6a的亲双烯体部分：
Figure FDA0004000531950000241
且
D为治疗部分，其中所述治疗部分为一甲基澳瑞他汀E(MMAE)、PBD-1、利福霉素；及其类似物或衍生物或D为成像剂部分Alexa Fluor 647。
138.权利要求81-90任一项的方法，该方法包含下列步骤：
a.)通过下列步骤生产化合物：
1.)使i)具有至少一个受体谷氨酰胺残基的结合剂和ii)式V-x1a的化合物在转谷氨酰胺酶(TGase)存在下接触：
Figure FDA0004000531950000242
其中结合剂为去糖基化HER-2抗体、其抗原结合片段、MSR1抗体或其抗原结合片段；
2.)分离产生的化合物；且
b.)使步骤a.)的化合物接触如下式(V-A)、(V-B)或(V-C)的化合物：
Figure FDA0004000531950000243
Figure FDA0004000531950000244
其中D为治疗部分；其中所述治疗部分为一甲基澳瑞他汀E(MMAE)、吡咯并苯并二氮杂卓(PBD)、利福霉素或其通过质量部分的氨基连接的类似物或衍生物或D为成像剂部分Alexa Fluor 647；并且
c.)分离产生的化合物。
139.通过权利要求81-137任一项的方法生产的化合物。
140.药物组合物，包含权利要求1-0和139任一项的化合物或权利要求76-80任一项的组合物和稀释剂、载体和/或赋形剂。
141.权利要求140的药物组合物，其中该组合物为胃肠外制剂。
142.对需要的受试者治疗病症的方法，包含向该受试者施用治疗有效量的包含权利要求1-0和139任一项的化合物的组合物、权利要求76-80任一项的组合物或权利要求140或141的药物组合物。
143.权利要求142的方法，其中所述病症为癌症。
144.权利要求143的方法，其中所述病症为HER2+乳腺癌。
145.权利要求142-144任一项的方法，其中BA为HER2抗体或其抗原结合片段。
146.权利要求142-145任一项的方法，其中D为细胞毒性剂。
147.权利要求142-146任一项的方法，其中所述癌症的特征在于在以下一个或多个中产生的原发性和/或转移性肿瘤：前列腺、膀胱、子宫颈、肺、结肠、肾、乳腺、胰腺、胃、子宫和卵巢。
148.权利要求142-147任一项的方法，其中所述癌症为前列腺癌、膀胱癌、宫颈癌、肺癌、结肠癌、肾癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌、子宫癌或卵巢癌。
149.权利要求142-147任一项的方法，其中D选自：多拉司他汀、澳瑞他汀、美登素类化合物、吡咯并苯并二氮杂和tubulysin相互作用剂。
150.权利要求149的方法，其中D为MMAE或PDB。
151.权利要求142的方法，其中所述病症为感染。
152.权利要求151的方法，其中BA为MSR1抗体或其抗原结合片段。
153.权利要求151或152的方法，其中D为利福霉素或其类似物或衍生物。
154.权利要求151-153任一项的方法，其中所述病症为细菌感染。
155.权利要求151-153任一项的方法，其中所述病症为病毒感染。
156.权利要求142的方法，其中所述病症为炎性病症。
157.权利要求156的方法，其中BA为MSR1抗体或其抗原结合片段。
158.权利要求156或155的方法，其中所述病症为免疫系统疾病。
159.权利要求156-158任一项的方法，其中所述炎性病症为：因癌症导致的高钙血症、梅尼埃病、偏头痛、丛集性头痛、严重口疮性溃疡、喉头炎、严重肺结核、对梅毒的赫克斯海默反应、代偿失调的心力衰竭、过敏性鼻炎或鼻息肉。
CN202180043012.0A 2020-04-16 2021-04-16 狄尔斯-阿尔德缀合方法 Pending CN115968304A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202063010903P 2020-04-16 2020-04-16
US63/010,903 2020-04-16
PCT/US2021/027707 WO2021211984A1 (en) 2020-04-16 2021-04-16 Diels-alder conjugation methods

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN115968304A true CN115968304A (zh) 2023-04-14

Family

ID=75870734

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202180043012.0A Pending CN115968304A (zh) 2020-04-16 2021-04-16 狄尔斯-阿尔德缀合方法

Country Status (10)

Country Link
US (1) US11701427B2 (zh)
EP (1) EP4135775A1 (zh)
JP (1) JP2023521885A (zh)
KR (1) KR20230004651A (zh)
CN (1) CN115968304A (zh)
AU (1) AU2021255711A1 (zh)
CA (1) CA3179154A1 (zh)
IL (1) IL297027A (zh)
MX (1) MX2022012821A (zh)
WO (1) WO2021211984A1 (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023215737A1 (en) * 2022-05-03 2023-11-09 Genentech, Inc. Anti-ly6e antibodies, immunoconjugates, and uses thereof

Family Cites Families (42)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS58180487A (ja) 1982-04-16 1983-10-21 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 抗生物質ｄｃ−８１およびその製造法
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
JP4124480B2 (ja) 1991-06-14 2008-07-23 ジェネンテック・インコーポレーテッド 免疫グロブリン変異体
US5663149A (en) 1994-12-13 1997-09-02 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Human cancer inhibitory pentapeptide heterocyclic and halophenyl amides
US5714586A (en) 1995-06-07 1998-02-03 American Cyanamid Company Methods for the preparation of monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
US20070258987A1 (en) 2000-11-28 2007-11-08 Seattle Genetics, Inc. Recombinant Anti-Cd30 Antibodies and Uses Thereof
JP5064037B2 (ja) 2004-02-23 2012-10-31 ジェネンテック， インコーポレイテッド 複素環式自壊的リンカーおよび結合体
TW200539855A (en) 2004-03-15 2005-12-16 Wyeth Corp Calicheamicin conjugates
CN114053429A (zh) 2004-06-01 2022-02-18 健泰科生物技术公司 抗体-药物偶联物和方法
JP2008521828A (ja) 2004-11-29 2008-06-26 シアトル ジェネティックス， インコーポレイテッド 操作された抗体およびイムノコンジュゲート
PL1934174T3 (pl) 2005-10-07 2011-09-30 Exelixis Inc Azetydyny jako inhibitory w leczeniu chorób proliferacyjnych
US7750116B1 (en) 2006-02-18 2010-07-06 Seattle Genetics, Inc. Antibody drug conjugate metabolites
WO2008122039A2 (en) 2007-04-02 2008-10-09 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Selenocysteine mediated hybrid antibody molecules
US7985557B2 (en) 2007-05-23 2011-07-26 Ventana Medical Systems, Inc. Polymeric carriers for immunohistochemistry and in situ hybridization
SG189817A1 (en) 2008-04-30 2013-05-31 Immunogen Inc Potent conjugates and hydrophilic linkers
KR101763559B1 (ko) 2008-07-21 2017-08-14 폴리테릭스 리미티드 생물학적 분자의 컨쥬게이팅을 위한 신규한 시약 및 방법
KR101000067B1 (ko) 2008-12-30 2010-12-10 엘지전자 주식회사 고효율 태양전지용 레이저 소성장치 및 고효율 태양전지 제조방법
EP2889624B1 (en) 2009-08-10 2018-10-03 UCL Business PLC Reversible covalent linkage of functional molecules
PE20130342A1 (es) 2010-04-15 2013-04-20 Spirogen Sarl Pirrolobenzodiacepinas y conjugados de las mismas
US20130244905A1 (en) 2010-07-06 2013-09-19 Ed Grabczyk Reporter for RNA Polymerase II Termination
EP2601298B1 (en) 2010-08-02 2016-11-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mice that make binding proteins comprising vl domains
EP3170821B1 (en) 2011-05-27 2021-09-15 Ambrx, Inc. Compositions containing, methods involving, and uses of non-natural amino acid linked dolastatin derivatives
US8815226B2 (en) 2011-06-10 2014-08-26 Mersana Therapeutics, Inc. Protein-polymer-drug conjugates
BR112014008888A2 (pt) 2011-10-14 2017-04-18 Seattle Genetics Inc pirrolobenzodiazepinas
EP3309162A1 (en) 2011-10-14 2018-04-18 Seattle Genetics, Inc. Targeted conjugates of pyrrolobenzodiazepines
ES2687246T3 (es) 2011-10-14 2018-10-24 Seattle Genetics, Inc. Pirrolobenzodiazepinas y conjugados dirigidos
CN104011018B (zh) 2011-10-14 2016-12-14 麦迪穆有限责任公司 可用于制备吡咯并苯并二氮杂卓的合成方法和中间体
WO2013068874A1 (en) 2011-11-11 2013-05-16 Pfizer Inc. Antibody-drug conjugates
CN104244718A (zh) 2011-12-05 2014-12-24 伊格尼卡生物治疗公司 抗体-药物缀合物以及相关化合物、组合物和方法
CA2858806A1 (en) 2011-12-23 2013-06-27 Innate Pharma Enzymatic conjugation of polypeptides
EP3912642B1 (en) 2012-10-23 2023-04-12 Synaffix B.V. Modified antibody, antibody-conjugate and process for the preparation thereof
WO2014072482A1 (en) 2012-11-09 2014-05-15 Innate Pharma Recognition tags for tgase-mediated conjugation
MA38496B2 (fr) 2013-03-15 2021-01-29 Regeneron Pharma Molécules biologiquement actives, leurs conjugués, et utilisations thérapeutiques
KR102252925B1 (ko) 2013-08-26 2021-05-18 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 마크롤라이드 디아스테레오머를 포함하는 약제학적 조성물, 이의 합성 방법 및 치료학적 용도
CA2950155C (en) 2014-06-02 2021-11-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Biologically active molecule conjugates, reagents and methods of manufacture, and therapeutic uses
KR20170131587A (ko) 2015-03-27 2017-11-29 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. 메이탄시노이드 유도체, 이의 컨주게이트, 및 사용 방법
CA3011440A1 (en) 2016-01-25 2017-08-03 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Maytansinoid derivatives, conjugates thereof, and methods of use
WO2017147542A2 (en) 2016-02-26 2017-08-31 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Optimized transglutaminase site-specific antibody conjugation
CN111065622A (zh) 2017-05-18 2020-04-24 里珍纳龙药品有限公司 双八氢菲羧酰胺类化合物及其蛋白质偶联物
US20210246224A1 (en) 2018-04-30 2021-08-12 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Antibodies, and bispecific antigen-binding molecules that bind her2 and/or aplp2, conjugates, and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
MX2022012821A (es) 2022-11-07
KR20230004651A (ko) 2023-01-06
AU2021255711A1 (en) 2022-10-27
WO2021211984A1 (en) 2021-10-21
EP4135775A1 (en) 2023-02-22
JP2023521885A (ja) 2023-05-25
IL297027A (en) 2022-12-01
US20220378918A1 (en) 2022-12-01
CA3179154A1 (en) 2021-10-21
US11701427B2 (en) 2023-07-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109415439B (zh) 用于癌症治疗的抗pd-1和抗-lag3抗体
AU2016347385B2 (en) Antibody conjugates comprising toll-like receptor agonist
US20200164084A1 (en) Antibody conjugates comprising toll-like receptor agonist and combination therapies
US20190194315A1 (en) Antibody drug conjugates
KR20220130160A (ko) 에리불린 유도체의 약물 접합체, 이를 제조하기 위한 방법 및 의료분야에서 이의 용도
KR20210008008A (ko) 항-msr1 항체 및 이의 사용 방법
JP2020506703A (ja) 抗ｃｃｒ７抗体薬物コンジュゲート
MX2014011688A (es) Anticuerpos frente a los ligandos del receptor b1 de bradicinina.
KR20230038738A (ko) 단백질에서 글루타민 잔기에 접합된 캄토테신 유사체 및 그의 용도
JP2022533215A (ja) 親水性基を含むリンカーを有する抗体薬剤コンジュゲート
JP2022509929A (ja) Ｓｔｉｎｇアゴニストを含むｄｃ－ｓｉｇｎ抗体コンジュゲート
JP2022515760A (ja) Ｐｍｅｌ１７に対する抗体及びその結合体
CN115968304A (zh) 狄尔斯-阿尔德缀合方法
TW202200211A (zh) 用於治療癌症的ccr7抗體藥物軛合物
IL303059A (en) Antibodies against CD48, antibody-drug conjugates and uses thereof
NZ790996A (en) Anti-ccr7 antibody drug conjugates

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination