TW202200211A - 用於治療癌症的ccr7抗體藥物軛合物 - Google Patents

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蜜雪兒 庫爾森
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曉黎 王
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Abstract

本申請揭露了使用CCR7抗體藥物軛合物治療濾泡性淋巴瘤的組成物和方法。本文還揭露了治療有需要的受試者的癌症之方法，該方法包括向所述受試者投與抗體藥物軛合物，其中該癌症表現CCR7，其中該抗體藥物軛合物以約0.1 mg/kg至約10 mg/kg投與於該受試者。

Description

用於治療癌症的CCR7抗體藥物軛合物
本發明總體上關於抗CCR7抗體、抗體片段及其免疫軛合物，以及它們用於治療或預防癌症之用途。
CC‑趨化因子受體7（CCR7）最初在1993年鑒定為淋巴細胞特異性受體（參見例如，Birkenbach等人, J Virol. [病毒學雜誌]1993年4月; 67(4):2209-20）。其表現局限於免疫細胞的亞群，如初始T細胞、中樞記憶T細胞（Tcm）、調節性T細胞（Treg）、初始B細胞、NK細胞和成熟抗原呈遞樹突細胞（DC）。CCR7調節免疫細胞向淋巴器官的和在淋巴器官內的歸巢，並且因此在平衡免疫和耐受中起關鍵作用（參見例如Förster等人, Nat Rev Immunol. [天然免疫學評論]2008年5月;8(5):362-71）。
CCR7係A類視紫紅質樣G蛋白偶聯受體（GPCR），具有兩個配位基CCL21和CCL19。CCR7結構尚未完全解析，然而，已發現某些模體對受體活性至關重要（參見例如，Legler等人, Int J Biochem Cell Biol. [國際生物化學與分子生物學雜誌] 2014年7月1日）。CCR7 和癌症
還已知CCR7（也稱為EBI1、BLR2、CC-CKR-7、CMKBR7、CD197和CDw197）在許多惡性腫瘤中過表現，該等惡性腫瘤包括B細胞惡性腫瘤（例如，CLL、MCL、柏基特氏淋巴瘤）、T細胞惡性腫瘤（例如，ATLL）、HNSCC、ESCC、胃癌、NSCLC、大腸直腸癌、胰臟癌、甲狀腺癌、乳癌和宮頸癌等。CCR7在例如大腸直腸癌、ESCC、胰臟癌、HNSCC和胃癌中的過表現與晚期腫瘤階段、淋巴結轉移和生存率低相關（參見例如，Malietzis等人, Journal of Surgical Oncology [外科腫瘤學雜誌] 2015;112:86–92；Irino等人, BMC Cancer [BMC癌症] 2014, 14:291；Guo等人, Oncology Letters [腫瘤學快報] 5: 1572-1578, 2013；Xia等人, Oral Dis. [口腔疾病] 2015年1月; 21(1):123-31; Du等人, Gastric Cancer. [胃癌] 2016年3月16日）。
此外，已顯示在例如HNSCC中的CCR7表現在對化學療法的抗性中起作用（參見例如，Wang等人, JNCI J Natl Cancer Inst [美國癌症研究所雜誌] (2008) 100 (7): 502-512。）。在某些癌症類型，如胰臟癌和鼻咽癌（NPC）中，已知CCR7促進癌症幹細胞樣細胞轉移和球體形成（參見例如，Zhang等人, PLOS ONE [公共科學圖書館綜合] 11 (8)；Lun等人, PLOS ONE [公共科學圖書館綜合] 7(12)）。CCR7在細胞遷移、侵襲性和EMT（上皮-間充質轉化）中的作用在體外和體內的各種癌症類型，如乳癌和胰臟癌中進行了描述（參見例如，Pang等人, Oncogene [癌基因] (2015), 1-13；Sperveslage等人, Int. J. Cancer [國際癌症雜誌]: 131, E371-E381 (2012)）。已被描述為CCR7傳訊必需的關鍵途徑包括b-抑制蛋白（Arrestin）介導的p38/ERK1/2和Rho傳訊（參見例如，Noor等人, J Neuroinflammation [神經炎症雜誌] 2012年4月25日; 9:77）。
已知許多癌症相關過程誘導CCR7表現。在HNSCC中，顯示CCR7表現由NF-kB和AP1轉錄因子經由直接結合CCR7啟動子中的位點誘導（Mburu等人, J. Biol. Chem. [生物化學雜誌] 2012, 287:3581-3590）。特別地，CCR7表現受腫瘤微環境中的各種因素調節。在該背景下，已知CCR7表現在HNSCC中經由b-防禦素3/NF-kB途徑誘導（參見例如，Mburu等人, Carcinogenesis [癌變] 第32卷 第2期 第168-174頁, 2010）並且在乳腺腫瘤細胞中經由內皮素受體A和缺氧誘導因子-1誘導（參見例如，Wilson等人, Cancer Res [癌症研究] 2006;66:11802-11807）。 抗體藥物軛合物
抗體藥物軛合物（「ADC」）已用於在癌症治療中局部遞送細胞毒性劑（參見例如，Lambert, Curr. Opinion In Pharmacology [藥理學新見] 5:543-549, 2005）。ADC允許靶向遞送藥物部分，其中可以實現具有最小毒性的最大功效。ADC包含針對結合經靶向用於治療干預的細胞的能力而選擇的抗體，該抗體與針對其細胞抑制或細胞毒活性而選擇的藥物連接。從而，抗體與靶細胞的結合將藥物遞送至需要其治療效果的位點。
已經揭露了許多識別並選擇性結合靶細胞（例如，癌細胞）的抗體用於在ADC中使用。儘管對ADC進行了大量工作，但與特定的目的靶標結合的抗體不足以預測ADC應用的成功。可以影響ADC治療效果的因素（除了靶標內在特徵之外）的實例包括需要定製微調的各個方面，如作為靶介導處置（TMDD）與功效驅動暴露之間平衡的最佳抗體親和力、對Fc介導的功能（抗體依賴性細胞介導的細胞毒性，ADCC）的評價、軛合方法（位點特異性與否）、與每種抗體軛合的藥物/有效負載分子的比率（「DAR」或「藥物抗體比率」）、連接子（linker）的可裂解性或穩定性、ADC的穩定性、以及ADC聚集的趨勢。
仍然需要具有改善特性的抗體、附接方法和細胞毒性有效負載，以用作有效的ADC治療組成物和方法。
在一些實施方式中，本申請揭露了一種在有需要的患者中治療癌症之方法，該方法包括向所述患者投與抗體藥物軛合物，其中該癌症係表現CCR7的濾泡性淋巴瘤（FL），其中該抗體藥物軛合物包含式： Ab—(L—(D)m )n 或其藥學上可接受的鹽；其中 Ab係結合人CCR7蛋白的抗體或其抗原結合片段； L係連接子； D係藥物部分； m係從1至8的整數；並且 n係從1至12的整數。
在一些實施方式中，本申請揭露了一種包含抗體藥物軛合物的組成物，用於在有需要的受試者的癌症的治療中使用，其中該癌症係表現CCR7的濾泡性淋巴瘤（FL），其中該抗體藥物軛合物包含式： Ab—(L—(D)m )n 或其藥學上可接受的鹽；其中 Ab係結合人CCR7蛋白的抗體或其抗原結合片段； L係連接子； D係藥物部分； m係從1至8的整數；並且 n係從1至12的整數。
在一些實施方式中，本申請揭露了抗體藥物軛合物在製造用於治療有需要的受試者的癌症的藥物中之用途，其中該癌症係表現CCR7的濾泡性淋巴瘤（FL），其中該抗體藥物軛合物包含式： Ab—(L—(D)m )n 或其藥學上可接受的鹽；其中 Ab係結合人CCR7蛋白的抗體或其抗原結合片段； L係連接子； D係藥物部分； m係從1至8的整數；並且 n係從1至12的整數。
在一些實施方式中，本申請揭露了抗體藥物軛合物用於治療有需要的受試者的癌症之用途，其中該癌症係表現CCR7的濾泡性淋巴瘤（FL），其中該抗體藥物軛合物包含式： Ab—(L—(D)m )n 或其藥學上可接受的鹽；其中 Ab係結合人CCR7蛋白的抗體或其抗原結合片段； L係連接子； D係藥物部分； m係從1至8的整數；並且 n係從1至12的整數。
在一些實施方式中，該癌症係復發性或難治性濾泡性淋巴瘤。
在一些實施方式中，結合CCR7的抗體或其抗原結合片段包含： a.  重鏈可變區，該重鏈可變區包含SEQ ID NO: 1的HCDR1（重鏈互補性決定區1）、SEQ ID NO: 2的HCDR2（重鏈互補性決定區2）、和SEQ ID NO: 3的HCDR3（重鏈互補性決定區3）；和輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 17的LCDR1（輕鏈互補性決定區1）、SEQ ID NO: 18的LCDR2（輕鏈互補性決定區2）、和SEQ ID NO: 19的LCDR3（輕鏈互補性決定區3）； b.  重鏈可變區，該重鏈可變區包含SEQ ID NO: 4的HCDR1、SEQ ID NO: 5的HCDR2、和SEQ ID NO: 6的HCDR3；和輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 20的LCDR1、SEQ ID NO: 21的LCDR2、和SEQ ID NO: 22的LCDR3； c.  重鏈可變區，該重鏈可變區包含SEQ ID NO: 7的HCDR1、SEQ ID NO: 8的HCDR2、和SEQ ID NO: 9的HCDR3；和輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 23的LCDR1、SEQ ID NO: 24的LCDR2、和SEQ ID NO: 25的LCDR3； d.  重鏈可變區，該重鏈可變區包含SEQ ID NO: 10的HCDR1、SEQ ID NO: 11的HCDR2、和SEQ ID NO: 12的HCDR3；和輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 26的LCDR1、SEQ ID NO: 27的LCDR2、和SEQ ID NO: 28的LCDR3； e.  重鏈可變區，該重鏈可變區包含SEQ ID NO: 33的HCDR1、SEQ ID NO: 34的HCDR2、和SEQ ID NO: 35的HCDR3；和輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 49的LCDR1、SEQ ID NO: 50的LCDR2、和SEQ ID NO: 51的LCDR3； f.  重鏈可變區，該重鏈可變區包含SEQ ID NO: 36的HCDR1、SEQ ID NO: 37的HCDR2、和SEQ ID NO: 38的HCDR3；和輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 52的LCDR1、SEQ ID NO: 53的LCDR2、和SEQ ID NO: 54的LCDR3； g.  重鏈可變區，該重鏈可變區包含SEQ ID NO: 39的HCDR1、SEQ ID NO: 40的HCDR2、和SEQ ID NO: 41的HCDR3；和輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 55的LCDR1、SEQ ID NO: 56的LCDR2、和SEQ ID NO: 57的LCDR3； h.  重鏈可變區，該重鏈可變區包含SEQ ID NO: 42的HCDR1、SEQ ID NO: 43的HCDR2、和SEQ ID NO: 44的HCDR3；和輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 58的LCDR1、SEQ ID NO: 59的LCDR2、和SEQ ID NO: 60的LCDR3； i.   重鏈可變區，該重鏈可變區包含SEQ ID NO: 65的HCDR1、SEQ ID NO: 66的HCDR2、和SEQ ID NO: 67的HCDR3；和輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 81的LCDR1、SEQ ID NO: 82的LCDR2、和SEQ ID NO: 83的LCDR3； j.   重鏈可變區，該重鏈可變區包含SEQ ID NO: 68的HCDR1、SEQ ID NO: 69的HCDR2、和SEQ ID NO: 70的HCDR3；和輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 84的LCDR1、SEQ ID NO: 85的LCDR2、和SEQ ID NO: 86的LCDR3； k.  重鏈可變區，該重鏈可變區包含SEQ ID NO: 71的HCDR1、SEQ ID NO: 72的HCDR2、和SEQ ID NO: 73的HCDR3；和輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 87的LCDR1、SEQ ID NO: 88的LCDR2、和SEQ ID NO: 89的LCDR3； l.   重鏈可變區，該重鏈可變區包含SEQ ID NO: 74的HCDR1、SEQ ID NO: 75的HCDR2、和SEQ ID NO: 76的HCDR3；和輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 90的LCDR1、SEQ ID NO: 91的LCDR2、和SEQ ID NO: 92的LCDR3； m. 重鏈可變區，該重鏈可變區包含SEQ ID NO: 596的HCDR1、SEQ ID NO: 597的HCDR2、和SEQ ID NO: 598的HCDR3；和輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 612的LCDR1、SEQ ID NO: 613的LCDR2、和SEQ ID NO: 614的LCDR3； n.  重鏈可變區，該重鏈可變區包含SEQ ID NO: 599的HCDR1、SEQ ID NO: 600的HCDR2、和SEQ ID NO: 601的HCDR3；和輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 615的LCDR1、SEQ ID NO: 616的LCDR2、和SEQ ID NO: 617的LCDR3； o.  重鏈可變區，該重鏈可變區包含SEQ ID NO: 602的HCDR1、SEQ ID NO: 603的HCDR2、和SEQ ID NO: 604的HCDR3；和輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 618的LCDR1、SEQ ID NO: 619的LCDR2、和SEQ ID NO: 620的LCDR3；或 p.  重鏈可變區，該重鏈可變區包含SEQ ID NO: 605的HCDR1、SEQ ID NO: 606的HCDR2、和SEQ ID NO: 607的HCDR3；和輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 621的LCDR1、SEQ ID NO: 622的LCDR2、和SEQ ID NO: 623的LCDR3。
在一些實施方式中，結合CCR7的抗體或其抗原結合片段包含： a.  重鏈可變區（VH），其包含SEQ ID NO: 13的胺基酸序列或與其具有至少約95%或更高同一性的序列，和輕鏈可變區（VL），其包含SEQ ID NO: 29的胺基酸序列或與其具有至少約95%或更高同一性的序列； b.  重鏈可變區（VH），其包含SEQ ID NO: 45的胺基酸序列或與其具有至少約95%或更高同一性的序列，和輕鏈可變區（VL），其包含SEQ ID NO: 61的胺基酸序列或與其具有至少約95%或更高同一性的序列； c.  重鏈可變區（VH），其包含SEQ ID NO: 77的胺基酸序列或與其具有至少約95%或更高同一性的序列，和輕鏈可變區（VL），其包含SEQ ID NO: 93的胺基酸序列或與其具有至少約95%或更高同一性的序列；或 d.  重鏈可變區（VH），其包含SEQ ID NO: 608的胺基酸序列或與其具有至少約95%或更高同一性的序列，和輕鏈可變區（VL），其包含SEQ ID NO: 624的胺基酸序列或與其具有至少約95%或更高同一性的序列。
在一些實施方式中，結合CCR7的抗體或其抗原結合片段包含： a.  重鏈，其包含SEQ ID NO: 15的胺基酸序列或與其具有至少約95%或更高同一性的序列，和輕鏈，其包含SEQ ID NO: 31的胺基酸序列或與其具有至少約95%或更高同一性的序列； b.  重鏈，其包含SEQ ID NO: 47的胺基酸序列或與其具有至少約95%或更高同一性的序列，和輕鏈，其包含SEQ ID NO: 63的胺基酸序列或與其具有至少約95%或更高同一性的序列； c.  重鏈，其包含SEQ ID NO: 79的胺基酸序列或與其具有至少約95%或更高同一性的序列，和輕鏈，其包含SEQ ID NO: 95的胺基酸序列或與其具有至少約95%或更高同一性的序列；或 d.  重鏈，其包含SEQ ID NO: 610的胺基酸序列或與其具有至少約95%或更高同一性的序列，和輕鏈，其包含SEQ ID NO: 626的胺基酸序列或與其具有至少約95%或更高同一性的序列。
在一些實施方式中，該抗體或其抗原結合片段包含一個或多個半胱胺酸取代。在一些實施方式中，該抗體或其抗原結合片段包含一個或多個半胱胺酸取代，該一個或多個半胱胺酸取代選自該抗體或其抗原結合片段的重鏈的S152C、S375C、或S152C和S375C二者，其中該位置係根據EU系統編號的。在一些實施方式中，該抗體係單株抗體。
在一些實施方式中，m係1。在一個實施方式中，n係約3至約4。在一個實施方式中，該連接子選自由以下組成之群組：可裂解連接子、不可裂解連接子、親水性連接子、預先帶電荷（procharged）的連接子、和基於二羧酸的連接子。
在一個實施方式中，該連接子衍生自交聯試劑，該交聯試劑選自由以下組成之群組：N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯（SPDP）、N-琥珀醯亞胺基4-(2-吡啶基二硫代)戊酸酯（SPP）、N-琥珀醯亞胺基4-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯（SPDB）、N-琥珀醯亞胺基-4-(2-吡啶基二硫代)-2-磺基-丁酸酯（磺基-SPDB）、N-琥珀醯亞胺基碘乙酸酯（SIA）、N-琥珀醯亞胺基(4-碘乙醯基)胺基苯甲酸酯（SIAB）、馬來醯亞胺PEG NHS、N-琥珀醯亞胺基4-(馬來醯亞胺基甲基)環己烷羧酸酯（SMCC）、N-磺基琥珀醯亞胺基4-(馬來醯亞胺基甲基)環己烷羧酸酯（磺基-SMCC）和2,5-二側氧基吡咯啶-1-基17-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-5,8,11,14-四側氧基-4,7,10,13-四氮雜十七碳-1-酸酯（CX1-1）。
在其他實施方式中，該連接子具有以下式 (IIA)：
Figure 02_image003
(IIA)； 其中* 與該抗體上的硫醇官能基連接，並且** 與藥物部分的硫醇官能基連接；並且其中： L1 係C1-6 伸烷基，其中亞甲基基團之一可以被氧替代； L2 係C1-6 伸烷基或者係-(CH2 CH2 O)y -CH2 -CH2 -，其中y係1至11； X係-C(O)-NH-、-NHC(O)-或三唑；並且伸烷基係直鏈或支鏈的。
在另一個實施方式中，該連接子具有以下式：
Figure 02_image005
其中y係1至11；* 與該抗體上的硫醇官能基連接，並且** 與該藥物部分的硫醇官能基連接。
在一個實施方式中，該藥物部分選自由以下組成之群組：V-ATP酶抑制劑、促凋亡劑、Bcl2抑制劑、MCL1抑制劑、HSP90抑制劑、IAP抑制劑、mTor抑制劑、微管穩定劑、微管去穩定化劑、澳瑞司他汀、鵝膏蕈鹼、吡咯苯并二氮呯、RNA聚合酶抑制劑、朵拉司他汀（dolastatin）、類美登素（maytansinoid）、MetAP（甲硫胺酸胺基肽酶）、蛋白質CRM1核輸出的抑制劑、DPPIV抑制劑、蛋白酶體抑制劑、粒線體中磷醯基轉移反應抑制劑、蛋白質合成抑制劑、激酶抑制劑、CDK2抑制劑、CDK9抑制劑、驅動蛋白抑制劑、HDAC抑制劑、DNA損傷劑、DNA烷基化劑、DNA嵌入劑、DNA小溝結合物和DHFR抑制劑。在一些實施方式中，該細胞毒性劑係類美登素，其中該類美登素係N(2')-去乙醯基-N(2')-(3-巰基-l-側氧基丙基)-美登素（DM1）、N(2’)-去乙醯基-N(2’)-(4-巰基-1-側氧基戊基)-美登素（DM3）或N(2')-去乙醯基-N2-(4-巰基-4-甲基-1-側氧基戊基)-美登素（DM4）。
在一個實施方式中，本文揭露的抗體藥物軛合物包括以下式 (VIII)：
Figure 02_image007
其中L1 係C1-6 伸烷基，其中亞甲基基團之一可以被氧替代； L2 係C1-6 伸烷基或者係-(CH2 CH2 O)y -CH2 -CH2 -，其中y係1至11； X係-C(O)-NH-、-NHC(O)-或三唑；並且伸烷基係直鏈或支鏈的；並且其中n係約3至約4；或其藥學上可接受的鹽。
在一個實施方式中，本文揭露的抗體藥物軛合物具有以下式：
Figure 02_image009
其中n係約3至約4，並且Ab係抗體，該抗體包含含有SEQ ID NO: 47的胺基酸序列的重鏈，和含有SEQ ID NO: 63的胺基酸序列的輕鏈；或其藥學上可接受的鹽。
在一些實施方式中，抗體藥物軛合物係非鹽形式。
在該治療或預防癌症之方法的一些實施方式中，將該抗體藥物軛合物或藥物組成物與一種或多種另外的治療性化合物組合投與至該患者。在一個實施方式中，該一種或多種另外的治療性化合物選自標準護理化學治療劑、共刺激分子或檢查點抑制劑。在一個實施方式中，該共刺激分子選自OX40、CD2、CD27、CDS、ICAM-1、LFA-1（CD11a/CD18）、ICOS（CD278）、4-1BB（CD137）、GITR、CD30、CD40、BAFFR、HVEM、CD7、LIGHT、NKG2C、SLAMF7、NKp80、CD160、B7-H3、STING或CD83配位基的促效劑。在另一個實施方式中，該檢查點抑制劑選自PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4和/或TGFRβ的抑制劑。
在一些實施方式中，本申請揭露了一種在有需要的受試者中治療癌症之方法，該方法包括向所述受試者投與抗體藥物軛合物，其中該癌症表現CCR7，其中該抗體藥物軛合物包含式： Ab—(L—(D)m )n 或其藥學上可接受的鹽；其中 Ab係結合人CCR7蛋白的抗體或其抗原結合片段； L係連接子； D係藥物部分； m係從1至8的整數；並且 n係從1至12的整數， 其中該抗體藥物軛合物以約0.1 mg/kg至約10 mg/kg投與於所述受試者。
在一些實施方式中，本申請揭露了一種包含抗體藥物軛合物的組成物，用於在有需要的受試者的癌症的治療中使用，其中該癌症表現CCR7，其中該抗體藥物軛合物包含式： Ab—(L—(D)m )n 或其藥學上可接受的鹽；其中 Ab係結合人CCR7蛋白的抗體或其抗原結合片段； L係連接子； D係藥物部分； m係從1至8的整數；並且 n係從1至12的整數， 其中該抗體藥物軛合物以約0.1 mg/kg至約10 mg/kg投與於所述受試者。
在一些實施方式中，本申請揭露了抗體藥物軛合物用於治療有需要的受試者的癌症之用途，其中該癌症表現CCR7，其中該抗體藥物軛合物包含式： Ab—(L—(D)m )n 或其藥學上可接受的鹽；其中 Ab係結合人CCR7蛋白的抗體或其抗原結合片段； L係連接子； D係藥物部分； m係從1至8的整數；並且 n係從1至12的整數， 其中該抗體藥物軛合物以約0.1 mg/kg至約10 mg/kg投與於所述受試者。
在一個實施方式中，本文揭露的抗體藥物軛合物具有以下式：
Figure 02_image009
其中n係約3至約4，並且Ab係抗體，該抗體包含含有SEQ ID NO: 47的胺基酸序列的重鏈，和含有SEQ ID NO: 63的胺基酸序列的輕鏈；或其藥學上可接受的鹽。
在一些實施方式中，抗體藥物軛合物係非鹽形式。
在一個實施方式中，癌症選自由以下組成之群組：慢性淋巴球性白血病（CLL）、外周T細胞淋巴瘤（PTCL）如成人T細胞白血病/淋巴瘤（ATLL）和間變性大細胞淋巴瘤（ALCL）、非何杰金氏淋巴瘤（NHL）如被套細胞淋巴瘤（MCL）、柏基特氏淋巴瘤、彌漫性大B細胞淋巴瘤（DLBCL）、和濾泡性淋巴瘤（FL）、胃癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、頭頸癌、鼻咽癌（NPC）、食道癌、大腸直腸癌、胰臟癌、甲狀腺癌、乳癌、腎細胞癌和宮頸癌。在特定實施方式中，癌症選自由以下組成之群組：慢性淋巴球性白血病（CLL）、外周T細胞淋巴瘤（PTCL）如成人T細胞白血病/淋巴瘤（ATLL）和間變性大細胞淋巴瘤（ALCL）、非何杰金氏淋巴瘤（NHL）如被套細胞淋巴瘤（MCL）、柏基特氏淋巴瘤、彌漫性大B細胞淋巴瘤（DLBCL）、和濾泡性淋巴瘤（FL）和非小細胞肺癌。在特定實施方式中，癌症係復發性或難治性癌症。
在一些實施方式中，將抗體藥物軛合物以約0.2 mg/kg投與於該受試者。在一些實施方式中，將抗體藥物軛合物以約0.4 mg/kg投與於該受試者。在一些實施方式中，將抗體藥物軛合物以約0.8 mg/kg投與於該受試者。在一些實施方式中，將抗體藥物軛合物以約1.2 mg/kg投與於該受試者。在一些實施方式中，將抗體藥物軛合物以約1.6 mg/kg投與於該受試者。在一些實施方式中，將抗體藥物軛合物以約2.4 mg/kg投與於該受試者。在一些實施方式中，將抗體藥物軛合物以約3.6 mg/kg投與於該受試者。在一些實施方式中，將抗體藥物軛合物以約4.8 mg/kg投與於該受試者。在一些實施方式中，將抗體藥物軛合物以約6.0 mg/kg投與於該受試者。
在一些實施方式中，將抗體藥物軛合物約每3週一次投與於該受試者。在一些實施方式中，治療受試者1個週期。在一些實施方式中，治療受試者2個週期。在一些實施方式中，治療受試者3個週期。在一些實施方式中，治療受試者4個週期。在一些實施方式中，治療受試者3個週期。在一些實施方式中，治療受試者5個週期。在一些實施方式中，將抗體藥物軛合物靜脈內投與於該受試者。
定義
除非另外聲明，否則如本文所用以下術語和短語意在具有以下意思：
術語「烷基」係指具有指定碳原子數目的單價飽和烴鏈。例如，C1-6 烷基係指具有從1至6個碳原子的烷基基團。烷基基團可以是直鏈的或支鏈的。代表性的支鏈烷基基團具有一個、兩個或三個分支。烷基基團的實例包括但不限於甲基、乙基、丙基（正丙基和異丙基）、丁基（正丁基、異丁基、二級丁基和三級丁基）、戊基（正戊基、異戊基和新戊基）以及己基。術語「伸烷基」係「烷基」的二價形式。
如本文所用，術語「抗體」係指免疫球蛋白家族的多肽，該多肽能夠非共價地、可逆地並以特異性方式結合相應的抗原。例如，天然存在的IgG抗體係包含藉由二硫鍵相互連接的至少兩條重（H）鏈和兩條輕（L）鏈的四聚體。每條重鏈由重鏈可變區（本文中縮寫為VH）和重鏈恒定區組成。重鏈恒定區由三個結構域（CH1、CH2和CH3）組成。每條輕鏈由輕鏈可變區（本文中縮寫為VL）和輕鏈恒定區組成。輕鏈恒定區包含一個結構域，CL。VH和VL區可進一步細分為高變區，稱為互補性決定區（CDR），其間穿插有稱為框架區（FR）的較保守區。每個VH和VL由從胺基末端排到羧基末端按以下順序排列的三個CDR和四個FR組成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。重鏈和輕鏈的可變區含有與抗原相互作用的結合結構域。抗體的恒定區可以介導免疫球蛋白與宿主組織或因子（包括免疫系統的各種細胞（例如，效應細胞）以及經典補體系統的第一組分（Clq））的結合。
術語「抗體」包括但不限於單株抗體、人抗體、人源化抗體、嵌合抗體和抗獨特型（抗Id）抗體（包括例如針對本發明抗體的抗Id抗體）。抗體可以屬於任何同種型/類別（例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY）或亞類（例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2）。
「互補性決定結構域」或「互補決定區」（「CDR」）可互換地是指VL和VH的高變區。CDR係抗體鏈的靶蛋白結合位點，該結合位點攜帶針對這種靶蛋白的特異性。每種人VL或VH中存在三個CDR（CDR1-3，從N末端順序編號），構成約15%-20%的可變結構域。CDR在結構上與靶蛋白的表位互補並因此直接負責結合特異性。剩餘的VL或VH區段（所謂的框架區）表現出較少的胺基酸序列變異（Kuby, Immunology [免疫學], 第4版, 第4章,弗裡曼出版公司（W.H. Freeman & Co.）, 紐約, 2000）。
CDR和框架區的位置可以使用本領域熟知的多種定義確定，例如，卡巴特（Kabat）、喬西亞（Chothia）、國際免疫遺傳學數據庫（IMGT）（在互聯網以下網址：www.imgt.org/）和AbM（參見例如，Johnson等人, Nucleic Acids Res. [核酸研究], 29:205-206 (2001)；Chothia和Lesk, J. Mol. Biol. [分子生物學雜誌], 196:901-917 (1987)；Chothia等人, Nature [自然], 342:877-883 (1989)；Chothia等人, J. Mol. Biol. [分子生物學雜誌], 227:799-817 (1992)；Al-Lazikani等人, J.Mol.Biol. [分子生物學雜誌], 273:927-748 (1997)）。抗原組合位點的定義還在以下文獻中描述：Ruiz等人, Nucleic Acids Res. [核酸研究], 28:219–221 (2000)；和Lefranc, M.P., Nucleic Acids Res. [核酸研究], 29:207-209 (2001)；MacCallum等人, J. Mol. Biol. [分子生物學雜誌], 262:732-745 (1996)；和Martin等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA [美國國家科學院院刊], 86:9268–9272 (1989)；Martin等人, Methods Enzymol. [酶學方法], 203:121–153 (1991)；和Rees等人, 在Sternberg M.J.E. (編), Protein Structure Prediction [蛋白質結構預測], 牛津大學出版社（Oxford University Press）, 牛津郡（Oxford）, 141-172 (1996)中。
可以將輕鏈和重鏈兩者分成結構和功能同源性區域。術語「恒定」和「可變」係在功能上使用。在這點上，應當理解輕鏈（VL）和重鏈（VH）部分兩者的可變結構域均決定抗原識別和特異性。相反地，輕鏈（CL）和重鏈（CH1、CH2或CH3）的恒定結構域賦予重要生物學特性例如分泌、經胎盤移動性（transplacentalmobility）、Fc受體結合、補體結合等。按照慣例，恒定區結構域離抗體的抗原結合位點或者胺基末端越遠，它的編號越大。N末端係可變區並且在C末端係恒定區；CH3和CL結構域實際上分別包含重鏈和輕鏈的羧基端結構域。
如本文所用，術語「抗原結合片段」係指抗體的一個或多個部分，該一個或多個部分保留與抗原的表位特異性地相互作用（例如，藉由結合、空間位阻、穩定/去穩定、空間分佈）的能力。結合片段的實例包括但不限於單鏈Fv（scFv）、駱駝抗體、二硫鍵連接的Fv（sdFv）、Fab片段、F(ab')片段，一種由VL、VH、CL和CH1結構域組成的單價片段；F(ab)2片段，包含在鉸鏈區藉由二硫橋連接的兩個Fab片段的二價片段；由VH和CH1結構域組成的Fd片段；由抗體的單臂的VL和VH結構域組成的Fv片段；由VH結構域組成的dAb片段（Ward等人, Nature [自然] 341:544-546, 1989）；和分離的互補性決定區（CDR）、或抗體的其他表位結合片段。
此外，雖然Fv片段的兩個結構域VL和VH係由單獨的基因編碼的，但是可以使用重組方法將這兩個結構域藉由能夠使它們形成為單條蛋白質鏈的合成連接子來相連，其中VL區和VH區配對形成單價分子（被稱為單鏈Fv（「scFv」）；參見例如，Bird等人, Science [科學] 242:423-426, 1988；和Huston等人 Proc. Natl. Acad. Sci. USA [美國家科學院院刊] 85:5879-5883, 1988）。術語「抗原結合片段」也意在涵蓋此類單鏈抗體。該等抗原結合片段係使用熟悉該項技術者已知的常規技術獲得的，並且以與完整抗體相同的方式針對效用來篩選該等片段。
抗原結合片段還可以摻入到單結構域抗體、大型抗體（maxibodies）、微型抗體（minibodies）、單結構域抗體、細胞內抗體、雙體抗體、三體抗體、四體抗體、v-NAR和bis-scFv中（參見例如，Hollinger和Hudson, Nature Biotechnology [自然生物技術] 23:1126-1136, 2005）。可以將抗原結合片段移植到基於多肽如III型纖網蛋白（Fn3）的支架中（參見美國專利號6,703,199，該專利描述了纖網蛋白多肽單體）。
可以將抗原結合片段摻入到包含一對串聯Fv區段（VH-CH1-VH-CH1）的單鏈分子中，該片段與互補輕鏈多肽一起形成一對抗原結合區（Zapata等人, Protein Eng. [蛋白質工程] 8:1057-1062, 1995；和美國專利號5,641,870）。
如本文所用，術語「單株抗體」或「單株抗體組成物」係指具有基本上相同的胺基酸序列或衍生自相同遺傳源的多肽，包括抗體和抗原結合片段等。此術語還包括具有單分子組成的抗體分子的製劑。單株抗體組成物表現出對特定表位的單一結合特異性和親和力。
如本文所用，術語「人抗體」包括具有可變區的抗體，其中框架和CDR區均衍生自人源序列。此外，如果抗體含有恒定區，則該恒定區也源自此類人序列，例如人種系序列或突變形式的人種系序列，或含有源自人框架序列分析的共有框架序列的抗體，例如，如Knappik等人，J. Mol. Biol. [分子生物學雜誌] 296:57-86, 2000）中所述。還包括衍生自人序列的抗體，其中已經為了親和力成熟或出於製造/有效負載軛合目的突變一個或多個CDR。參見Kilpatrick等人, 「Rapid development of affinity matured monoclonal antibodies using RIMMS [使用RIMMS進行的親和成熟單株抗體的快速開發],」 Hybridoma [雜交瘤]. 1997年8月;16(4):381-9。
本發明之人抗體可以包括不是由人序列編碼的胺基酸殘基（例如，藉由在體外隨機誘變或位點特異性誘變、或藉由在體內體細胞突變、或保守取代來引入突變以促進穩定性或生產）。
如本文所用，術語「識別」係指發現其表位並與之相互作用（例如，結合）的抗體或其抗原結合片段，無論該表位是否為線性或構象的。術語「表位」係指抗原上與本發明之抗體或抗原結合片段特異性結合的位點。表位可以從連續胺基酸或因蛋白質的立體折疊而並置的非連續胺基酸中形成。從連續胺基酸形成的表位一般在暴露於變性溶劑時保留，而因立體折疊形成的表位用變性溶劑處理時一般喪失。表位典型地包含至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13，14或15個處於獨特空間構象的胺基酸。確定表位的空間構象之方法包括本領域中的技術，例如，x射線結晶學和二維核磁共振（參見，例如Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology [分子生物學中之方法中的表位映射協議], 第66卷, G. E. Morris編輯 (1996)）。
如本文所用，術語「親和力」係指抗體與抗原之間在單個抗原位點處相互作用的強度。在每個抗原位點內，抗體「臂」的可變區藉由弱非共價力在許多位點處與抗原相互作用；相互作用越多，親和力越強。
術語「分離的抗體」係指基本上不含具有不同抗原特異性的其他抗體的抗體。然而，特異性結合一種抗原的分離的抗體可以對其他抗原具有交叉反應性。此外，分離的抗體可以基本上不含其他細胞材料和/或化學品。
術語「相應的人種系序列」係指編碼人可變區胺基酸序列或子序列的核酸序列，與由人種系免疫球蛋白可變區序列編碼的其他全部可變區胺基酸序列相比，該人可變區胺基酸序列或子序列與參考可變區胺基酸序列或子序列共有確定的最高胺基酸序列同一性。相應的人種系序列還可以是指與全部其他評價的可變區胺基酸序列相比，與參考可變區胺基酸序列或子序列具有最高胺基酸序列同一性的人可變區胺基酸序列或子序列。相應的人種系序列可以僅是框架區、僅是互補性決定區、係框架區和互補性決定區、可變區段（如上文所定義），或包含可變區的序列或子序列的其他組合。可以使用本文所述之方法，例如，使用BLAST、ALIGN或本領域已知的另一種比對演算法比對兩個序列，確定序列同一性。相應的人種系核酸或胺基酸序列可以與參考可變區核酸或胺基酸序列具有至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性。可以例如藉由可公開獲得的國際免疫遺傳學數據庫（IMGT）（在互聯網上以下網址：www.imgt.org/）和V-鹼基（在互聯網上以下網址：vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk），確定相應的人種系序列。
在描述抗原（例如，蛋白質）與抗體、抗體片段或抗體衍生的結合劑之間相互作用的語境中使用時，短語「特異性結合」或「選擇性結合」係指確定抗原在蛋白質異質群體和其他生物製品中例如在生物樣本（例如，血液、血清、血漿或組織樣本）中存在的結合反應。因此，在某些指明的免疫測定條件下，具有特定結合特異性的抗體或結合劑與特定抗原的結合至少兩倍於背景並且該等抗體或結合劑基本上不以顯著的量與樣本中存在的其他抗原結合。在一個實施方式中，在指明的免疫測定條件下，具有特定結合特異性的抗體或結合劑與特定抗原的結合至少十（10）倍於背景並且該等抗體或結合劑基本上不以顯著的量與樣本中存在的其他抗原結合。在這類條件下與抗體或結合劑特異性結合可能需要已經就其針對選擇特定蛋白質的特異性選擇抗體或結合劑。如果需要或適當，可以藉由扣除與來自其他物種（例如，小鼠或大鼠）或其他亞型的分子交叉反應的抗體，實現這種選擇。可替代地，在一些實施方式中，選擇與某些所期望分子交叉反應的抗體或抗體片段。
多種免疫測定方式可以用來選擇與特定蛋白特異性免疫反應的抗體。例如，固相ELISA免疫測定常規地用來選擇與蛋白質特異性免疫反應的抗體（關於可以用來確定特異免疫反應性的免疫測定方式和條件的描述，參見例如Harlow和Lane, Using Antibodies, A Laboratory Manual [使用抗體：實驗室手冊] (1998)）。典型地，特異性或選擇性結合反應將產生高於背景信號至少2倍和更典型地高於背景至少10至100倍的信號。
術語「平衡解離常數（KD，M）」係指解離速率常數（kd，時間-1）除以締合速率常數（ka，時間-1，M-1）。可以使用本領域的任何已知方法，測量平衡解離常數。本發明之抗體通常將具有小於約10-7 或10-8 M，例如，小於約10-9 M或10-10 M，在一些實施方式中，小於約10-11 M、10-12 M或10-13 M的平衡解離常數。
術語「生物利用率」係指投與至患者的給定量的藥物的全身性利用率（即，血液/血漿水平）。生物利用率係一個絕對術語，該絕對術語指示從所投與劑型到達總循環的藥物時間（速率）和總量（程度）的度量。
如本文所用，短語「基本上由……組成」係指方法或組成物中所包含的活性藥劑以及對該方法或組成物的預期目的而言無活性的任何賦形劑的類屬或物種。在一些實施方式中，短語「基本上由……組成」明確排除包含除本發明之抗體藥物軛合物之外的一種或多種另外的活性劑。在一些實施方式中，短語「基本上由……組成」明確地排除了包含除本發明之抗體藥物軛合物和第二共同投與的藥劑之外的一種或多種另外的活性劑。
術語「胺基酸」係指天然存在的、合成的和非天然的胺基酸，以及以類似於天然存在胺基酸的方式發揮作用的胺基酸類似物和胺基酸模擬物。天然存在的胺基酸係由遺傳密碼編碼的那些胺基酸，以及後來經修飾的那些胺基酸，例如羥脯胺酸、γ-羧基麩胺酸和O-鄰磷酸絲胺酸。胺基酸類似物係指與天然存在的胺基酸具有相同基本化學結構（即與氫、羧基基團、胺基基團和R基團結合的α-碳）的化合物，例如高絲胺酸、正白胺酸、甲硫胺酸亞碸、甲硫胺酸甲基鋶。此類類似物具有經修飾的R基團（例如正白胺酸）或經修飾的肽骨架，但保留與天然存在的胺基酸相同的基本化學結構。胺基酸模擬物係指具有如下結構的化合物，該結構與胺基酸的一般化學結構不同但是以與天然存在的胺基酸類似的方式起作用。
術語「保守修飾的變體」適用於胺基酸和核酸序列二者。對於特定核酸序列，保守修飾的變體係指編碼相同或基本上相同的胺基酸序列的那些核酸，或者在該核酸不編碼胺基酸序列的情況下，係指基本上相同的序列。由於遺傳密碼的簡並性，大量功能上相同的核酸編碼任何給定的蛋白質。例如，密碼子GCA、GCC、GCG和GCU都編碼胺基酸丙胺酸。因此，在密碼子指定丙胺酸的每個位置，該密碼子可以改變為任何所述之相應密碼子而不改變編碼的多肽。此類核酸變異係「緘默變異」，其係保守修飾變異中的一種。本文中編碼多肽的每個核酸序列也描述了核酸的每種可能的緘默變異。技術人員應認識到，核酸中的每個密碼子（除了通常是甲硫胺酸的唯一密碼子的AUG和通常是色胺酸的唯一密碼子的TGG）均可以被修飾以產生功能上相同的分子。因此，在每個該序列中均隱含了編碼多肽的核酸的每一種緘默變異。
對於多肽序列，「保守修飾的變體」包括對多肽序列的單獨取代、缺失或添加，它們導致某個胺基酸取代為化學上相似的胺基酸。提供在功能上相似的胺基酸的保守取代表在本領域係熟知的。此類保守修飾的變體係對本發明之多態變體、種間同源物和等位基因的補充，並且不排除該等多態變體、種間同源物和等位基因。以下八組含有彼此保守取代的胺基酸：1）丙胺酸（A）、甘胺酸（G）；2）天冬胺酸（D）、麩胺酸（E）；3）天冬醯胺（N）、麩醯胺酸（Q）；4）精胺酸（R）、離胺酸（K）；5）異白胺酸（I）、白胺酸（L）、甲硫胺酸（M）、纈胺酸（V）；6）苯丙胺酸（F）、酪胺酸（Y）、色胺酸（W）；7）絲胺酸（S）、蘇胺酸（T）；8）半胱胺酸（C）、甲硫胺酸（M）（參見例如，Creighton, Proteins[蛋白質] (1984)）。在一些實施方式中，術語「保守序列修飾」用於指不顯著影響或改變含有胺基酸序列的抗體的結合特徵的胺基酸修飾。
如本文所用，術語「優化的」係指已經改變核苷酸序列以使用在生產性細胞或生物體（通常是真核細胞，例如酵母細胞、畢赤酵母屬（Pichia）細胞、真菌細胞、木黴屬（Trichoderma）細胞、中國倉鼠卵巢細胞（CHO）或人細胞）中為較佳的密碼子編碼胺基酸序列。優化的核苷酸序列被工程化以完全或盡可能多地保留最初由起始核苷酸序列編碼的胺基酸序列，該起始核苷酸序列也稱為「親本」序列。
在兩個或更多個核酸序列或多肽序列的語境中，術語「相同百分比」或「同一性百分比」係指兩個或更多個序列或子序列相同的程度。如果兩個序列在正在比較的區域上具有相同的胺基酸序列或核苷酸序列，則它們係「相同的」。當在比較窗口或指定區域內進行比較和比對以尋求使用以下序列比較演算法之一或藉由手動比對和目視檢查所測量的最大對應時，如果兩個序列具有規定百分比的相同的胺基酸殘基或核苷酸（即，在規定區域上或當沒有規定時則在整個序列上，60%同一性，視需要65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%同一性），則兩個序列係「基本上相同的」。視需要，同一性存在於長度為至少約30個核苷酸（或10個胺基酸）的區域上，或更較佳的是在長度為100至500或1000或更多個核苷酸（或20、50、200或更多個胺基酸）的區域上。
對於序列比較，典型地一個序列充當參考序列，測試序列與該參考序列比較。當使用序列比較演算法時，將測試序列和參考序列輸入到電腦中，必要時指定子序列座標，並且指定序列演算法程式參數。可以使用預設程式參數，或者可以指定替代參數。然後，序列比較演算法將基於程式參數計算測試序列相對於參考序列的序列同一性百分比。
如本文所用，「比較窗」包括提及選自由20至600、通常約50至約200、更通常約100至約150組成之群組的多個鄰接位置中的任何一個的區段，其中在兩個序列最佳比對後，可以將序列與相同數量的鄰接位置的參考序列進行比較。用於比較的序列比對方法在本領域係熟知的。例如藉由Smith和Waterman Adv. Appl. Math. [應用數學進展] 2:482c (1970)的局部同源性演算法，藉由Needleman和Wunsch, J. Mol. Biol. [分子生物學期刊] 48:443 (1970)的同源性比對演算法，藉由Pearson和Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA [美國國家科學院院刊] 85:2444 (1988)的相似性方法研究，藉由該等演算法（威斯康辛州麥迪森的科學大道575號遺傳學電腦小組（Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI）的威斯康辛遺傳學套裝軟體中的GAP、BESTFIT、FASTA、和TFASTA）的電腦實現，或藉由手動比對和目測檢查（參見例如，Brent等人, Current Protocols in Molecular Biology [分子生物學實驗指南], 2003），可以進行用於比較的序列的最佳比對。
適用於確定序列同一性百分比和序列相似性的演算法的兩個實例係BLAST和BLAST 2.0演算法，它們分別描述於Altschul等人, Nuc.Acids Res. [核酸研究] 25:3389-3402, 1977；和Altschul等人, J. Mol. Biol. [分子生物學雜誌] 215:403-410, 1990。用於執行BLAST分析的軟體可藉由美國國家生物技術資訊中心（National Center for Biotechnology Information）公開地獲得。此演算法包括首先藉由鑒定查詢序列中長度為W的短字來鑒定高評分序列對（HSP），當與數據庫序列中的相同長度的字比對時，該長度為W的短字匹配或滿足一些正值閾值得分T。T被稱為鄰域字得分閾值（Altschul等人，同上）。該等最初的鄰域字命中點作為種子，用於啟動搜索以找到包含它們的更長的HSP。字命中點沿著每個序列在兩個方向上擴展，遠至可以增加累積比對得分。對於核苷酸序列，使用參數M（一對匹配殘基的獎勵得分；總是＞0）和N（錯配殘基的罰分；總是＜0）計算累積得分。對於胺基酸序列，使用評分矩陣來計算累積得分。當出現以下情形時，字命中點向各方向的延伸終止：累積比對得分從其最大獲得值跌落數量X；由於一個或多個負評分殘基比對的累積，累積得分走向零或更低；或到達任一序列的一端。BLAST演算法參數W、T和X決定了比對的靈敏度和速度。BLASTN程式（對於核苷酸序列）使用字長（W）11、期望值（E）10、M＝5、N＝-4和兩條股比較作為預設值。對於胺基酸序列，BLASTP程式使用字長3和期望值（E）10以及BLOSUM62評分矩陣（參見Henikoff和Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA [美國國家科學院院刊] 89:10915）比對（B）50、期望值（E）10、M=5、N=-4和兩條股比較作為預設值。
BLAST演算法還對兩個序列之間的相似性進行統計分析（參見例如，Karlin和Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA [美國國家科學院院刊] 90:5873-5787, 1993）。由BLAST演算法提供的一種相似性量度係最小總和概率（P(N)），其提供了兩個核苷酸或胺基酸序列之間偶然發生匹配的概率的指示。例如，如果在測試核酸與參考核酸的比較中的最小總和概率小於約0.2、更較佳的是小於約0.01、最較佳的是小於約0.001，則認為核酸與參考序列相似。
兩個胺基酸序列之間的同一性百分比也可以使用已併入ALIGN程式（2.0版）中的E. Meyers和W. Miller, Comput. Appl. Biosci.[電腦應用生物科學], 4:11-17 (1988)的演算法，利用PAM120權重殘基表、空位長度罰分12、空位罰分4來確定。此外，兩個胺基酸序列之間的同一性百分比可以使用已經併入GCG套裝軟體中的GAP程式（可從www.gcg.com獲得）中的Needleman和Wunsch, J. Mol, Biol.[分子生物學雜誌] 48:444-453, (1970)演算法，利用BLOSUM62矩陣或PAM250矩陣和空位權重16、14、12、10、8、6或4以及長度權重1、2、3、4、5或6來確定。
除了上述序列同一性百分比之外，兩個核酸序列或多肽基本上相同的另一個指示係由第一核酸編碼的多肽與針對由第二核酸編碼的多肽產生的抗體進行免疫交叉反應，如下所述。因此，多肽典型地與第二多肽基本上相同，例如其中兩種肽僅藉由保守取代而不同。兩個核酸序列基本上相同的另一個指示係兩個分子或它們的補體在嚴格條件下彼此雜交，如下所述。兩個核酸序列基本上相同的又另一個指示係可使用相同的引物來擴增序列。
術語「核酸」在本文中可與術語「多核苷酸」互換使用，並且是指呈單股或雙股形式的去氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。該術語包括含有已知核苷酸類似物或修飾的骨架殘基或連接的核酸，該核酸係合成的、天然存在的和非天然存在的，具有與參考核酸相似的結合特性，並且以類似於參考核苷酸的方式代謝。此類類似物的實例包括但不限於硫代磷酸酯、胺基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性-甲基膦酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽-核酸（PNA）。
除非另外指出，否則特定的核酸序列還隱含地涵蓋其保守修飾的變體（例如，簡並密碼子取代）、和互補序列以及明確指明的序列。具體地，如下文詳述，簡並密碼子取代可以藉由產生如下序列而實現，在該等序列中，一個或多個所選擇的（或全部）密碼子的第三位被混合鹼基和/或去氧肌苷殘基取代（Batzer等人, (1991) Nucleic Acid Res. [核酸研究] 19:5081；Ohtsuka等人, (1985) J. Biol. Chem. [生物化學雜誌] 260:2605-2608；和Rossolini等人, (1994) Mol. Cell.Probes [分子與細胞探針] 8:91-98）。
術語「可操地連接」在核酸的語境中是指兩個或更多個多核苷酸（例如，DNA）區段之間的功能性關係。典型地，它係指轉錄調節序列與已轉錄序列的功能性關係。例如，如果啟動子或增強子序列在適當的宿主細胞或其他表現系統中刺激或調節編碼序列的轉錄，則該啟動子或增強子序列與編碼序列可操作地連接。通常，與轉錄序列可操作地連接的啟動子轉錄調節序列與轉錄序列在物理上鄰接，即它們係順式作用的。然而，一些轉錄調控序列如增強子不需要在物理上鄰接或位於極為接近該等轉錄調控序列增強其轉錄的編碼序列的位置。
術語「多肽」和「蛋白質」在本文中可互換使用來指胺基酸殘基的聚合物。該術語適用於胺基酸聚合物，其中一個或多個胺基酸殘基係相應天然存在的胺基酸的人工化學模擬物，以及適用於天然存在的胺基酸聚合物和非天然存在的胺基酸聚合物。除非另外說明，否則特定的多肽序列還隱含地涵蓋其保守性修飾的變體。
如本文所用，術語「抗體藥物軛合物」或「免疫軛合物」係指抗體或其抗原結合片段與另一種藥劑如化學治療劑、毒素、免疫治療劑、成像探針等連接。該連接可以是共價鍵或非共價相互作用，如借助靜電力。可以採用本領域已知的多種連接子以形成抗體藥物軛合物。另外，可以將抗體藥物軛合物以可能是從編碼免疫軛合物的多核苷酸表現的融合蛋白的形式提供。如本文所用，「融合蛋白」係指藉由連接最初編碼分離的蛋白質（包括肽和多肽）的兩個或更多個基因或基因片段產生的蛋白質。融合基因的翻譯產生具有從每種原始蛋白質衍生的功能特性的單一蛋白。
術語「受試者」包括人類和非人類動物。非人動物包括所有脊椎動物，例如哺乳動物和非哺乳動物如非人靈長類、綿羊、狗、牛、雞、兩棲動物和爬行動物。除非指出時，否則術語「患者」或「受試者」在本文中可互換地使用。
如本文所用，術語「細胞毒素」或「細胞毒性劑」係指對細胞的生長和增殖有害並可以發揮作用以減少、抑制或摧毀細胞或惡性腫瘤的任何藥劑。
如本文所用，術語「抗癌劑」係指可以用來治療或預防細胞增殖性障礙如癌症的任何藥劑，包括但不限於細胞毒性劑、化學治療劑、放射療法和放射治療劑、靶向抗癌劑和免疫治療劑。
如本文所用，術語「藥物部分」或「有效負載」係指與本發明之抗體或抗原結合片段軛合的化學部分，並且可包括任何治療劑或診斷劑，例如抗癌劑、抗炎劑、抗感染劑（例如，抗真菌劑、抗細菌劑、抗寄生蟲劑、抗病毒劑）或麻醉劑。例如，藥物部分可以是抗癌劑，如細胞毒素。在某些實施方式中，藥物部分選自V-ATP酶抑制劑、HSP90抑制劑、IAP抑制劑、mTor抑制劑、微管穩定劑、微管去穩定化劑、澳瑞司他汀、朵拉司他汀、類美登素、MetAP（甲硫胺酸胺基肽酶）、RNA聚合酶抑制劑、吡咯苯并二氮呯（PBD）、鵝膏蕈鹼、蛋白質CRM1核輸出的抑制劑、DPPIV抑制劑、粒線體中磷醯基轉移反應抑制劑、蛋白質合成抑制劑、激酶抑制劑、CDK2抑制劑、CDK9抑制劑、蛋白酶體抑制劑、驅動蛋白抑制劑、HDAC抑制劑、DNA損傷劑、DNA烷基化劑、DNA嵌入劑、DNA小溝結合物和DHFR抑制劑。用於將該等藥物中每種藥物連接至與本發明抗體和方法相容的連接子之方法係本領域已知的。例如參見，Singh等人, (2009) Therapeutic Antibodies:  Methods and Protocols [治療性抗體：方法和方案], 第525卷, 445-457。此外，有效負載可以是生物物理探針、螢光團、自旋標記、紅外探針、親和探針、螯合劑、光譜探針、放射性探針、脂質分子、聚乙二醇、聚合物、自旋標記、DNA、RNA、蛋白質、肽、表面、抗體、抗體片段、奈米粒子、量子點、脂質體、PLGA粒子、糖或多糖。
術語「類美登素藥物部分」意指具有類美登素化合物結構的抗體-藥物軛合物的亞結構。美登素首次分離自東非灌木齒葉美登木（Maytenus serrata）（美國專利號3,896,111）。隨後，發現某些微生物也產生類美登素，如美登醇和C-3美登醇酯（美國專利號4,151,042）。已經報導合成性美登醇和美登醇類似物。參見美國專利號4,137,230、4,248,870；4,256,746；4,260,608；4,265,814；4,294,757；4,307,016；4,308,268；4,308,269；4,309,428；4,313,946；4,315,929；4,317,821；4,322,348；4,331,598；4,361,650；4,364,866；4,424,219；4,450,254；4,362,663；和4,371,533，以及Kawai等人, (1984) Chem. Pharm. Bull. [化學與藥學通報] 3441-3451），該等文獻中的每一個明確地藉由引用併入。可用於軛合的具體類美登素的實例包括DM1、DM3和DM4。
「腫瘤」係指無論是惡性還是良性的贅生性細胞生長和增殖，以及所有癌變前和癌變的細胞和組織。
術語「抗腫瘤活性」意指腫瘤細胞的增殖速率、活力或轉移活性的降低。例如，抗腫瘤活性可以由治療期間出現的異常細胞的生長速率下降或腫瘤尺寸穩定或減小或與無治療的對照相比因治療所致的存活期更長顯示。這種活性可使用公認的體外或體內腫瘤模型評估，該等腫瘤模型包括但不限於異種移植模型、同種異體移植模型、MMTV模型和本領域已知的用於研究抗腫瘤活性的其他已知模型。
術語「惡性腫瘤」係指非良性腫瘤或癌症。如本文所用，術語「癌症」包括以失調或失控的細胞生長為特徵的惡性腫瘤。示例性癌症包括：癌、肉瘤、白血病和淋巴瘤。
術語「癌症」包括原發性惡性腫瘤（例如，其細胞未移行至受試者身體中除原始腫瘤部位之外部位的那些）和繼發性惡性腫瘤（例如，因轉移、腫瘤細胞移行至與原始腫瘤部位不同的繼發部位而產生的那些）。
術語「CCR7」（也稱為BLR2、CC-CKR-7、CCR-7、CD197、CDw197、CMKBR7、EBI1或C-C模體趨化因子受體7）係指G蛋白偶聯受體家族的成員。人CCR7的核酸和胺基酸序列已以以下登錄號公佈於GenBank中：NP_001829、NP_001288643、NP_001288645、NP_001288646、NP_001288647（胺基酸序列）、和NM_001838、NM_001301714、NM_001301716、NM_001301717、NM_001301718（核苷酸序列）。如本文所用，將術語「CCR7」用於共同指CCR7蛋白的所有天然存在的同種型、或其變體。
術語「變體」係指與參考多肽具有基本上相同的胺基酸序列、或由基本上相同的核苷酸序列編碼，並且能夠具有參考多肽的一種或多種活性的多肽。例如，變體與參考多肽可以具有約85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列同一性，同時保留參考多肽的一種或多種活性。
如本文所用，術語任何疾病或障礙的「治療（treat、treating或treatment）」在一個實施方式中，係指減輕疾病或障礙（即，減慢或停滯或減少疾病或其至少一種臨床症狀的發展）。在另一個實施方式中，「治療（treat、treating或treatment）」係指緩解或減輕至少一種身體參數、包括不能被患者辨別的那些。在又另一個實施方式中，「治療（treat）」、「治療（treating）」或「治療（treatment）」係指在身體上（例如，可辨別的症狀的穩定化）、在生理上（例如，身體參數的穩定化）或二者上調節疾病或障礙。
如本文所使用的，術語任何疾病或障礙的「預防（prevent、preventing或prevention）」係指疾病或障礙的預防性治療；或延遲疾病或障礙的發作或進展。
術語「治療可接受量」或「治療有效劑量」可互換地指足以實現所期望結果（即，腫瘤尺寸減小、抑制腫瘤生長、防止轉移、抑制或防止病毒、細菌、真菌或寄生蟲感染）的量。在一些實施方式中，治療上可接受的量不誘導或不引起不期望的副作用。在一些實施方式中，治療上可接受的量誘導或引起副作用，但僅是由醫療服務提供者就患者的狀況而言可接受的那些。可以藉由首先投與低劑量並且隨後遞增增加該劑量直至實現所期望效果來確定治療可接受量。本發明分子的「預防有效劑量」和「治療有效劑量」可以分別防止疾病症狀發作或導致疾病症狀的嚴重程度下降，該等疾病症狀包括與癌症相關的症狀。
術語「共同投與」係指個體的血液中存在兩種活性藥劑。共同投與的活性藥劑可以並行或依序遞送。
本發明提供了結合CCR7的抗體、抗體片段（例如，抗原結合片段）、及其藥物軛合物，即抗體藥物軛合物或ADC。特別地，本發明提供了結合CCR7並且在這種結合時內化的抗體和抗體片段（例如，抗原結合片段）。本發明之抗體和抗體片段（例如，抗原結合片段）可用於產生抗體藥物軛合物。此外，本發明提供了抗體藥物軛合物，該等抗體藥物軛合物具有期望的藥物動力學特徵和其他期望屬性，並且因此可用於治療或預防表現CCR7的癌症。本發明進一步提供了包含本發明之抗體藥物軛合物的藥物組成物、以及製備此類藥物組成物和使用它們治療或預防癌症之方法。抗體藥物軛合物
本發明提供了抗體藥物軛合物，也稱作免疫軛合物，其中特異性結合CCR7的抗體、抗原結合片段或其功能等同物與藥物部分連接。在一個方面，本發明之抗體、抗原結合片段或其功能等同物藉由連接子經由共價連接與作為抗癌劑的藥物部分連接。本發明之抗體藥物軛合物可以遞送有效劑量的抗癌劑（例如，細胞毒性劑）至表現CCR7的腫瘤組織，由此可以實現較大的選擇性（和較低的有效劑量）。
在一個方面，本發明提供了一種具有式 (I) 的免疫軛合物： Ab—(L—(D)m )n 其中Ab表示本文所述之CCR7結合抗體； L係連接子； D係藥物部分； m係從1至8的整數；並且 n係從1-20的整數。在一個實施方式中，n係從1至10、2至8、或2至5的整數。在一個具體實施方式中，n係2、3或4。在一些實施方式中，m係1；在其他實施方式中，m係2、3或4。
雖然對於特定軛合物分子而言，藥物對抗體比率具有確切值（例如，在式 (I) 中為n乘以m），但是應理解當用來描述含有許多分子的樣本時，該值將經常是平均值，這歸因於典型地與軛合步驟相關的某種程度的非均勻性。免疫軛合物樣本的平均載量在本文中稱為藥物對抗體比率或「DAR」。在一些實施方式中，當藥物係類美登素時，將它稱為「MAR」。在一些實施方式中，DAR在約2與約6之間，並且典型地是約3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7.0、7.5、8.0。在一些實施方式中，按重量計至少50%的樣本係具有平均DAR加或減2的化合物，並且較佳的是至少50%的樣本係含有平均DAR加或減1的軛合物。實施方式包括其中DAR係約3.5、3.6、3.7、3.8或3.9的免疫軛合物。在一些實施方式中，「約n」的DAR意指DAR的測量值在n的20%內。
本發明還關於免疫軛合物，該等免疫軛合物包含與藥物部分連接或軛合的如本文揭露的抗體、抗體片段（例如，抗原結合片段）及其功能等同物。在一個實施方式中，藥物部分D係類美登素藥物部分，包括具有以下結構的那些：
Figure 02_image012
其中波浪線指示類美登素的硫原子與抗體藥物軛合物的連接子共價連接。R在每次出現時獨立地是H或C1 -C6 烷基。將醯胺基團連接至硫原子的伸烷基鏈可以是甲基、乙基或丙基，即，r係1、2或3。（美國專利號633,410；美國專利號5,208,020；Chari等人 (1992) Cancer Res. [癌症研究] 52;127-131；Lui等人 (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. [美國國家科學院院刊] 93:8618-8623）。
對於本發明之免疫軛合物，設想類美登素藥物部分的全部立體異構物，即在類美登素的手性碳處R組態和S組態的任何組合。在一個實施方式中，類美登素藥物部分具有以下立體化學。
Figure 02_image014
在一個實施方式中，類美登素藥物部分係N2’ -去乙醯基-N 2' -(3-巰基-1-側氧基丙基)-美登素（也稱作DM1）。DM1由以下結構式表示。
Figure 02_image016
DM1
在另一個實施方式中，類美登素藥物部分係N2’ -去乙醯基-N 2' -(4-巰基-1-側氧基戊基)-美登素（也稱作DM3）。DM3由以下結構式表示。
Figure 02_image018
DM3
在另一個實施方式中，類美登素藥物部分係N2’ -去乙醯基-N 2' -(4-甲基-4-巰基-1-側氧基戊基)-美登素（也稱作DM4）。DM4由以下結構式表示。
Figure 02_image020
DM4
藥物部分D可以藉由連接子L與抗體Ab連接。L係能夠藉由共價鍵使藥物部分與抗體連接的任何化學部分。交聯試劑係可以用來連接藥物部分和抗體以形成抗體藥物軛合物的雙官能或多官能試劑。可以使用具有能夠與藥物部分和抗體兩者結合的反應性官能基的交聯試劑來製備抗體藥物軛合物。例如，半胱胺酸、硫醇或胺，例如抗體的N末端或胺基酸側鏈如離胺酸，可以與交聯試劑的官能基形成鍵。可替代地，抗體藥物軛合物可以藉由以下方式製備：預先形成連接子-藥物部分（或藥物-連接子部分，兩個術語可互換使用），並且使連接子-藥物部分與抗體反應。在一些情況下，使用若干個連接部分將連接子部分逐步構建在藥物上，直到獲得所期望的連接子-藥物部分。
在一個實施方式中，L係可裂解連接子。在另一個實施方式中，L係不可裂解連接子。在一些實施方式中，L係酸不穩定連接子、光不穩定連接子、肽酶可裂解連接子、酯酶可裂解連接子、二硫鍵可裂解連接子、親水性連接子、預先帶電荷的連接子、糖苷酶可裂解連接子、磷酸二酯酶可裂解連接子、磷酸酶可裂解連接子、或基於二羧酸的連接子。
在藥物部分（例如類美登素）與抗體之間形成不可裂解連接子的合適的交聯試劑係本領域熟知的，並且可以形成包含硫原子（如SMCC）的不可裂解連接子或無硫原子的那些不可裂解連接子。在藥物部分（例如類美登素）與抗體之間形成不可裂解連接子的較佳的交聯試劑包含基於馬來醯亞胺基或基於鹵代乙醯基的部分。根據本發明，將此類不可裂解連接子描述為衍生自基於馬來醯亞胺基或基於鹵代乙醯基的部分。
包含基於馬來醯亞胺基的部分的交聯試劑包括但不限於N -琥珀醯亞胺基-4-(馬來醯亞胺基甲基)環己烷羧酸酯（SMCC）、磺基琥珀醯亞胺基4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-羧酸酯（磺基-SMCC）、N -琥珀醯亞胺基-4-(馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-羧基-(6-胺基己酸酯)（它係SMCC的「長鏈」類似物（LC-SMCC））、κ-馬來醯亞胺基十一烷酸N -琥珀醯亞胺基酯（KMUA）、γ-馬來醯亞胺基丁酸N -琥珀醯亞胺基酯（GMBS）、ε-馬來醯亞胺基己酸N -琥珀醯亞胺基酯（EMCS）、m-馬來醯亞胺基苯甲醯基-N-羥基琥珀醯亞胺酯（MBS）、N-(α-馬來醯亞胺基乙氧基)-琥珀醯亞胺酯（AMSA）、琥珀醯亞胺基-6-(β-馬來醯亞胺基丙醯胺基)己酸酯（SMPH）、N -琥珀醯亞胺基-4-(p-馬來醯亞胺基苯基)-丁酸酯（SMPB）、N-(-p-馬來醯亞胺基苯基)異氰酸酯（PMIP）和含有聚乙二醇間隔團的基於馬來醯亞胺基的交聯試劑，如MAL-PEG-NHS。該等交聯試劑形成衍生自基於馬來醯亞胺基的部分的不可裂解連接子。基於馬來醯亞胺基的交聯試劑的代表性結構在下文示出。
Figure 02_image022
Figure 02_image024
Figure 02_image026
在另一個實施方式中，連接子L衍生自N -琥珀醯亞胺基-4-(馬來醯亞胺基甲基)環己烷羧酸酯（SMCC）、磺基琥珀醯亞胺基4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-羧酸酯（磺基-SMCC）或MAL-PEG-NHS。
包含基於鹵代乙醯基的部分的交聯試劑包括N-琥珀醯亞胺基碘乙酸酯（SIA）、N-琥珀醯亞胺基(4-碘乙醯基)胺基苯甲酸酯（SIAB）、N-琥珀醯亞胺基溴乙酸酯（SBA）和N-琥珀醯亞胺基3-(溴乙醯胺基)丙酸酯（SBAP）。該等交聯試劑形成衍生自基於鹵代乙醯基的部分的不可裂解連接子。基於鹵代乙醯基的交聯試劑的代表性結構在下文示出。
Figure 02_image028
或
Figure 02_image030
在一個實施方式中，連接子L衍生自N-琥珀醯亞胺基碘乙酸酯（SIA）或N-琥珀醯亞胺基(4-碘乙醯基)胺基苯甲酸酯（SIAB）。
在藥物部分（例如類美登素）與抗體之間形成可裂解連接子的合適交聯試劑係本領域熟知的。含有二硫化物的連接子係藉由在生理條件下可以發生的二硫化物交換可裂解的連接子。根據本發明，將此類可裂解連接子描述為衍生自基於二硫化物的部分。合適的二硫化物交聯試劑包括N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯（SPDP）、N-琥珀醯亞胺基-4-(2-吡啶基二硫代)戊酸酯（SPP）、N-琥珀醯亞胺基-4-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯（SPDB）和N -琥珀醯亞胺基-4-(2-吡啶基二硫代)-2-磺基-丁酸酯（磺基-SPDB），其結構在下文示出。該等二硫化物交聯試劑形成衍生自基於二硫化物的部分的可裂解連接子。
Figure 02_image032
N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯（SPDP）、
Figure 02_image034
N-琥珀醯亞胺基-4-(2-吡啶基二硫代)戊酸酯（SPP）、
Figure 02_image036
N-琥珀醯亞胺基-4-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯（SPDB）以及
Figure 02_image038
N -琥珀醯亞胺基-4-(2-吡啶基二硫代)-2-磺基-丁酸酯（磺基-SPDB）。
在一個實施方式中，連接子L衍生自N-琥珀醯亞胺基-4-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯（SPDB）。
在藥物部分（例如類美登素）與抗體之間形成帶電荷連接子的合適交聯試劑稱作預先帶電荷的交聯試劑。在一個實施方式中，連接子L衍生自預先帶電荷的交聯試劑CX1-1。CX1-1的結構如下。
Figure 02_image040
2,5-二側氧基吡咯啶-1-基17-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-5,8,11,14-四側氧基-4,7,10,13-四氮雜十七碳-1-酸酯（CX1-1）
上文繪示的每種交聯試劑在交聯試劑的一端含有與抗體的一級胺反應以形成醯胺鍵的NHS-酯並且在另一端含有與類美登素藥物部分的巰基反應以形成硫醚或二硫鍵的馬來醯亞胺基團或吡啶基二硫化物基團。
在另一個實施方式中，在藥物部分（例如類美登素）與抗體之間形成可裂解連接子的合適交聯部分由以下式 (II) 表示：
Figure 02_image042
(II)； 其中： L1 係C1-6 伸烷基，其中亞甲基基團之一可以被氧替代； L2 係C1-6 伸烷基或者係-(CH2 CH2 O)y -CH2 -CH2 -，其中y係1至11；並且 X係-C(O)-NH-、-NHC(O)-或三唑； 其中伸烷基係直鏈或支鏈的。 在該實施方式的一個方面，y係5、7、9或11。在該實施方式的另一個方面，y小於5。 在又另一個實施方式中，根據式I的合適交聯部分選自由以下組成之群組：
Figure 02_image044
； 其中y係1至11。
對於上文繪示的交聯部分（即MBT、MPET、MEPET；MMTBT、MPPT、MPBT），馬來醯亞胺基團允許與抗體中半胱胺酸的巰基（或硫醇）反應，從而形成硫醚鍵；並且交聯部分的硫醇官能基與類美登素藥物部分的硫醇連接，形成可裂解二硫鍵。鑒於具有式 (I) 的連接部分的交叉反應性質（硫醇和馬來醯亞胺可以交叉反應），熟悉該項技術者應理解，連接部分必須逐步構建在藥物部分上，如方案1中繪示的。
根據以上實施方式，由交聯部分（即MBT、MPET、MEPET）產生的連接子可如下繪示：
Figure 02_image003
(IIA)； 其中* 與抗體上的硫醇官能基連接，並且** 與藥物部分（例如類美登素藥物部分DM1、DM3或DM4）的硫醇官能基連接。
根據以上實施方式，由交聯部分（即MBT、MPET、MEPET）產生的連接子可如下繪示：
Figure 02_image047
其中y係1至11；* 與抗體上的硫醇官能基連接，並且** 與藥物部分（例如類美登素藥物DM1、DM3或DM4）的硫醇官能基連接。
在一個較佳的實施方式中，連接子具有以下式：
Figure 02_image049
； 其中* 與抗體上的硫醇官能基連接，並且** 與類美登素藥物（DM1、DM3或DM4）的硫醇官能基連接。
在一個實施方式中，本發明關於具有下式的連接子-藥物部分：
Figure 02_image051
；其中 L1 係C1-6 伸烷基，其中亞甲基基團之一可以被氧替代； L2 係C1-6 伸烷基或者係-(CH2 CH2 O)y -CH2 -CH2 -，其中y係1至11；並且 X係-C(O)-NH-、-NHC(O)-或三唑； 其中伸烷基係直鏈或支鏈的。
在另一個實施方式中，本發明關於如本文方案1中揭露的以上連接子-藥物軛合物的逐步形成。
在一個實施方式中，本發明關於具有以下式 (III)、(IV) 和 (V) 之一的連接子-藥物部分化合物：
Figure 02_image053
其中L1 係C1-6 伸烷基，其中亞甲基基團之一可以被氧替代； L2 係C1-6 伸烷基或者係-(CH2 CH2 O)y -CH2 -CH2 -，其中y係1至11；並且 X係-C(O)-NH-、-NHC(O)-或三唑； 其中伸烷基係直鏈或支鏈的。
在一個實施方式中，本發明關於連接子-藥物部分化合物，該等連接子-藥物部分化合物選自以下式：
Figure 02_image055
；
Figure 02_image057
；
Figure 02_image059
；和
Figure 02_image061
。
在另一個實施方式中，本發明關於連接子-藥物部分化合物，該等連接子-藥物部分化合物選自以下式：
Figure 02_image063
Figure 02_image065
。
在另一個實施方式中，本發明之連接子-藥物由以下式中任一個表示：
Figure 02_image067
；其中y係1至11，較佳的是1至5。
在一個實施方式中，本發明之連接子-藥物由以下結構式中任一個表示：
Figure 02_image069
。
在一個實施方式中，本發明之軛合物由以下結構式中任一個表示：
Figure 02_image071
Figure 02_image073
，
Figure 02_image075
Figure 02_image077
其中： Ab係特異性結合CCR7的抗體或其抗原結合片段； n，指示藉由與Ab的一級胺形成醯胺鍵而連接至Ab的連接子-藥物（L-D-）基團的數量，係從1至20的整數。在一個實施方式中，n係從1至10、2至8或2至5的整數。在一個具體實施方式中，n係3或4。
在另一個實施方式中，本發明之軛合物由以下式 (VI)、(VII) 和 (VIII) 中任一個表示：
Figure 02_image079
； 其中： L1 係C1-6 伸烷基，其中亞甲基基團之一可以被氧替代； L2 係C1-6 伸烷基或者係-(CH2 CH2 O)y -CH2 -CH2 -，其中y係1至11；並且 X係-C(O)-NH-、-NHC(O)-或三唑； 其中該伸烷基係直鏈或支鏈的；並且 Ab係抗體或其抗原結合片段； n，指示藉由與Ab的一級胺形成醯胺鍵而連接至Ab的連接子-藥物（L-D-）基團的數量，係從1至20的整數。在一個實施方式中，n係從1至10、2至8或2至5的整數。在一個具體實施方式中，n係3或4。在一些實施方式中，抗體或其抗原結合片段結合腫瘤細胞上表現的抗原。在一個實施方式中，抗體或其抗原結合片段特異性結合CCR7。在其他實施方式中，抗體或其抗原結合片段特異性結合P-鈣黏著蛋白、鈣黏著蛋白6、FGFR2或FGFR4。
在另一個實施方式中，本發明之軛合物具有對應於具有式 (VI) 的軛合物的琥珀醯亞胺的打開形式的式 (VIA) 或 (VIB)：
Figure 02_image081
； 其中： L1 係C1-6 伸烷基，其中亞甲基基團之一可以被氧替代； L2 係C1-6 伸烷基或者係-(CH2 CH2 O)y -CH2 -CH2 -，其中y係1至11；並且 X係-C(O)-NH-、-NHC(O)-或三唑； 其中該伸烷基係直鏈或支鏈的；並且 Ab係抗體或抗原結合片段； n，指示藉由與Ab的一級胺形成醯胺鍵而連接至Ab的連接子-藥物（L-D-）基團的數量，係從1至20的整數。在一個實施方式中，n係從1至10、2至8或2至5的整數。在一個具體實施方式中，n係3或4。在一些實施方式中，抗體或其抗原結合片段結合腫瘤細胞上表現的抗原。在一個實施方式中，抗體或其抗原結合片段特異性結合CCR7。在其他實施方式中，抗體或其抗原結合片段特異性結合P-鈣黏著蛋白、鈣黏著蛋白6、FGFR2或FGFR4。
在另一個實施方式中，本發明之軛合物具有對應於具有式 (VII) 的軛合物的琥珀醯亞胺的打開形式的式 (VIIA) 或 (VIIB)：
Figure 02_image083
； 其中： L1 係C1-6 伸烷基，其中亞甲基基團之一可以被氧替代； L2 係C1-6 伸烷基或者係-(CH2 CH2 O)y -CH2 -CH2 -，其中y係1至11；並且 X係-C(O)-NH-、-NHC(O)-或三唑； 其中該伸烷基係直鏈或支鏈的；並且 Ab係抗體或其抗原結合片段； n，指示藉由與Ab的一級胺形成醯胺鍵而連接至Ab的連接子-藥物（L-D）基團的數量，係從1至20的整數。在一個實施方式中，n係從1至10、2至8或2至5的整數。在一個具體實施方式中，n係3或4。在一些實施方式中，抗體或其抗原結合片段結合腫瘤細胞上表現的抗原。在一個實施方式中，抗體或其抗原結合片段特異性結合CCR7。在其他實施方式中，抗體或其抗原結合片段特異性結合P-鈣黏著蛋白、鈣黏著蛋白6、FGFR2或FGFR4。
在另一個實施方式中，本發明之軛合物具有對應於具有式 (VIII) 的軛合物的琥珀醯亞胺的打開形式的式 (VIIIA)、(VIIIB)：
Figure 02_image085
； 其中： L1 係C1-6 伸烷基，其中亞甲基基團之一可以被氧替代； L2 係C1-6 伸烷基或者係-(CH2 CH2 O)y -CH2 -CH2 -，其中y係1至11；並且 X係-C(O)-NH-、-NHC(O)-或三唑； 其中該伸烷基係直鏈或支鏈的；並且 Ab係抗體或其抗原結合片段； n，指示藉由與Ab的一級胺形成醯胺鍵而連接至Ab的連接子-藥物（L-D-）基團的數量，係從1至20的整數。在一個實施方式中，n係從1至10、2至8或2至5的整數。在一個具體實施方式中，n係3或4。在一些實施方式中，抗體或其抗原結合片段結合腫瘤細胞上表現的抗原。在一個實施方式中，抗體或其抗原結合片段特異性結合CCR7。在其他實施方式中，抗體或其抗原結合片段特異性結合P-鈣黏著蛋白、鈣黏著蛋白6、FGFR2或FGFR4。
在一個實施方式中，本文揭露的其中連接子-藥物部分經由琥珀醯亞胺連接至抗體的每種抗體藥物軛合物還可以作為如在式 (VIA)、(VIB)、(VIIA)、(VIIB)、(VIIIA) 和 (VIIIB) 中大體繪示的琥珀醯亞胺的打開形式存在。
在又另一個實施方式中，本發明之軛合物由以下結構式中任一個表示：
Figure 02_image087
Figure 02_image089
Figure 02_image091
Figure 02_image093
Figure 02_image095
Figure 02_image097
Figure 02_image099
Figure 02_image101
Figure 02_image103
； 其中： Ab係抗體或其抗原結合片段； n，指示藉由與Ab的巰基形成硫酯鍵而連接至Ab的D-L基團的數量，係從1至12、或1至8、或較佳的是1至4的整數。在一個具體實施方式中，n係3或4。在一些實施方式中，抗體或其抗原結合片段結合腫瘤細胞上表現的抗原。在一個實施方式中，抗體或其抗原結合片段特異性結合CCR7。在其他實施方式中，抗體或其抗原結合片段特異性結合P-鈣黏著蛋白、鈣黏著蛋白6、FGFR2或FGFR4。
在另一個實施方式中，本發明之軛合物由以下結構式中任一個：
Figure 02_image105
和
Figure 02_image107
； 以及琥珀醯亞胺的相應打開形式表示； 其中： Ab係抗體或其抗原結合片段； n，指示藉由與Ab的巰基形成硫酯鍵而連接至Ab的D-L基團的數量，係從1至12、或1至8、或較佳的是1至4的整數。在一個具體實施方式中，n係3或4。在一些實施方式中，抗體或其抗原結合片段結合腫瘤細胞上表現的抗原。在一個實施方式中，抗體或其抗原結合片段特異性結合CCR7。在其他實施方式中，抗體或其抗原結合片段特異性結合P-鈣黏著蛋白、鈣黏著蛋白6、FGFR2或FGFR4。
在另一個實施方式中，本發明之軛合物由以下結構式中任一個：
Figure 02_image109
； 以及琥珀醯亞胺的相應打開形式表示； 其中： y係1至11，較佳的是1至5； Ab係抗體或其抗原結合片段； n，指示藉由與Ab的巰基形成硫酯鍵而連接至Ab的D-L基團的數量，係從1至12、或1至8、或較佳的是1至4的整數。在一個具體實施方式中，n係3或4。在一些實施方式中，抗體或其抗原結合片段結合腫瘤細胞上表現的抗原。在一個實施方式中，抗體或其抗原結合片段特異性結合CCR7。在其他實施方式中，抗體或其抗原結合片段特異性結合P-鈣黏著蛋白、鈣黏著蛋白6、FGFR2或FGFR4。
在又另一個實施方式中，本發明之軛合物由以下式：
Figure 02_image111
以及琥珀醯亞胺的相應打開形式表示； 其中： Ab係抗體或其抗原結合片段； n，指示藉由與Ab的巰基形成硫酯鍵而連接至Ab的D-L基團的數量，係從1至12、或1至8、或較佳的是1至4的整數。在一個具體實施方式中，n係3或4。在一些實施方式中，抗體或其抗原結合片段結合腫瘤細胞上表現的抗原。在一個實施方式中，抗體或其抗原結合片段特異性結合CCR7。在其他實施方式中，抗體或其抗原結合片段特異性結合P-鈣黏著蛋白、鈣黏著蛋白6、FGFR2或FGFR4。
在一個較佳的實施方式中，本發明之軛合物由以下式表示：
Figure 02_image113
其中： Ab係抗體或其抗原結合片段； n，指示藉由與Ab的巰基形成硫酯鍵而連接至Ab的D-L基團的數量，係從1至20的整數。在一些實施方式中，n係從1至12的整數。在一些實施方式中，n係從1至8的整數。在一些實施方式中，n係從1至4的整數。在一個具體實施方式中，n係3或4。在另一個實施方式中，平均n值係約3至約4。在一些實施方式中，抗體或其抗原結合片段結合腫瘤細胞上表現的抗原。在一個實施方式中，抗體或其抗原結合片段特異性結合CCR7。在其他實施方式中，抗體或其抗原結合片段特異性結合P-鈣黏著蛋白、鈣黏著蛋白6、FGFR2或FGFR4。
在一個實施方式中，軛合物中藥物（例如，DM1、DM3或DM4）對抗體的平均莫耳比（即，平均n值，也稱為類美登素抗體比率（MAR））係約1至約10、約2至約8（例如，1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0或8.1）、約2.5至約7、約3至約5、約2.5至約4.5（例如，約2.5、約2.6、約2.7、約2.8、約2.9、約3.0、約3.1、約3.3、約3.4、約3.5、約3.6、約3.7、約3.8、約3.9、約4.0、約4.1、約4.2、約4.3、約4.4、約4.5）、約3.0至約4.0、約3.2至約4.2、或約4.5至5.5（例如，約4.5、約4.6、約4.7、約4.8、約4.9、約5.0、約5.1、約5.2、約5.3、約5.4或約5.5）。
在本發明之一個方面，本發明之軛合物具有實質上高的純度並且具有以下特徵中的一個或多個：(a) 大於約90%（例如大於或等於約91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%）、較佳的是大於約95%的軛合物種類係單體的，(b) 軛合物製劑中的未軛合的連接子水平小於約10%（例如小於或等於約9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、或0%）（相對於總連接子），(c) 小於10%的軛合物種類係交聯的（例如小於或等於約9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、或0%），(d) 軛合物製劑中的游離藥物（例如DM1、DM3或DM4）水平小於約2%（例如小於或等於約1.5%、1.4%、1.3%、1.2%、1.1%、1.0%、0.9%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1%、或0%）（相對於總細胞毒性劑的mol/mol）和/或 (e) 儲存時（例如在約1週、約2週、約3週、約1個月、約2個月、約3個月、約4個月、約5個月、約6個月、約1年、約2年、約3年、約4年或約5年後），游離藥物（例如，DM1、DM3或DM4）的水平未實質性增加。游離藥物（例如，DM1、DM3或DM4）的水平「實質性增加」意指在某一儲存時間（例如約1週、約2週、約3週、約1個月、約2個月、約3個月、約4個月、約5個月、約6個月、約1年、約2年、約3年、約4年或約5年）後，游離藥物（例如，DM1、DM3或DM4）的水平增加小於約0.1%、約0.2%、約0.3%、約0.4%、約0.5%、約0.6%、約0.7%、約0.8%、約0.9%、約1.0%、約1.1%、約1.2%、約1.3%、約1.4%、約1.5%、約1.6%、約1.7%、約1.8%、約1.9%、約2.0%、約2.2%、約2.5%、約2.7%、約3.0%、約3.2%、約3.5%、約3.7%、或約4.0%。
如本文所用，術語「未軛合的連接子」係指與衍生自交聯試劑（例如，SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1）的連接子共價連接的抗體，其中抗體未藉由連接子共價偶聯至藥物（例如，DM1、DM3或DM4）（即，「未軛合的連接子」可以由Ab-MCC、Ab-SPDB或Ab-CX1-1表示）。1. 藥物部分
本發明提供了特異性結合CCR7的免疫軛合物。本發明之抗體藥物軛合物包含與藥物部分，例如抗癌劑、自體免疫治療劑、抗炎劑、抗真菌劑、抗細菌劑、抗寄生生物劑、抗病毒劑或麻醉劑軛合的抗CCR7抗體、抗體片段（例如，抗原結合片段）或功能等同物。可以使用本領域已知的任何方法，將本發明之抗體、抗體片段（例如，抗原結合片段）或功能等同物與若干個相同或不同的藥物部分軛合。
在某些實施方式中，本發明之免疫軛合物的藥物部分選自由以下組成之群組：V-ATP酶抑制劑、促凋亡劑、Bcl2抑制劑、MCL1抑制劑、HSP90抑制劑、IAP抑制劑、mTor抑制劑、微管穩定劑、微管去穩定化劑、RNA聚合酶抑制劑、鵝膏蕈鹼、吡咯苯并二氮呯、澳瑞司他汀、朵拉司他汀、類美登素、MetAP（甲硫胺酸胺基肽酶）、蛋白質CRM1核輸出的抑制劑、DPPIV抑制劑、Eg5抑制劑、蛋白酶體抑制劑、粒線體中磷醯基轉移反應抑制劑、蛋白質合成抑制劑、激酶抑制劑、CDK2抑制劑、CDK9抑制劑、驅動蛋白抑制劑、HDAC抑制劑、DNA損傷劑、DNA烷基化劑、DNA嵌入劑、DNA小溝結合物和DHFR抑制劑。
在某些實施方式中，本發明之免疫軛合物的藥物部分係以以下PCT公開號揭露的澳瑞司他汀：WO 2015/095301和WO 2015/189791，這兩個申請據此藉由引用併入。澳瑞司他汀藥物部分-連接子構建體的非限制性實例係：
Figure 02_image115
（其係如本申請中揭露的AURIX2）；和
Figure 02_image117
（其係如本申請中揭露的AURIX1）。
在一個實施方式中，本發明之免疫軛合物的藥物部分係類美登素藥物部分，如但不限於DM1、DM3或DM4。
此外，本發明之抗體、抗體片段（例如，抗原結合片段）或功能等同物可以與調節給定生物學應答的藥物部分軛合。藥物部分不應該解釋為限於經典的化學治療劑。例如，藥物部分可以是具有所期望生物活性的蛋白質、肽或多肽。此類蛋白質可包括例如毒素，如相思豆毒素、蓖麻毒素A、假單胞菌外毒素、霍亂毒素或白喉毒素；蛋白質，如腫瘤壞死因子、α-干擾素、β-干擾素、神經生長因子、血小板衍生生長因子、組織纖溶酶原活化物、細胞介素、凋亡劑、抗血管生成劑；或生物應答調節劑如淋巴因子。
在一個實施方式中，本發明之抗體、抗體片段（例如，抗原結合片段）或功能等同物與藥物部分，如細胞毒素、藥物（例如，免疫抑制劑）或放射性毒素軛合。細胞毒素的實例包括但不限於紫杉烷（參見例如，國際（PCT）專利號申請號WO 01/38318和PCT/US03/02675）、DNA-烷基化劑（例如，CC-1065類似物）、蒽環類、微管溶素（tubulysin）類似物、多卡米星類似物、澳瑞司他汀E、澳瑞司他汀F、類美登素和包含反應性聚乙二醇部分的細胞毒性劑（參見例如，Sasse等人, J. Antibiot. [抗生素雜誌](東京), 53, 879-85 (2000)；Suzawa等人, Bioorg. Med. Chem. [生物有機醫學與化學], 8, 2175-84 (2000)；Ichimura等人, J. Antibiot. [抗生素雜誌](東京), 44, 1045-53 (1991)；Francisco等人, Blood [血液學] (2003)（電子出版先於印刷出版）；美國專利號5,475,092、6,340,701、6,372,738和6,436,931、美國專利申請公開號2001/0036923 A1、等待審批的美國專利申請序號10/024,290和10/116,053，以及國際（PCT）專利申請號WO 01/49698）、泰素（taxon）、松胞菌素B、短桿菌肽D、溴化乙錠、依米丁、絲裂黴素、依託泊苷、替尼泊苷、長春新鹼、長春花鹼、秋水仙鹼、多柔比星、柔紅黴素、二羥基蒽二酮、米托蒽醌、光神黴素、放線菌素D、1-脫氫睾酮、糖皮質激素、普魯卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛爾和嘌呤黴素及其類似物或同系物。治療劑還包括例如抗代謝物（例如胺甲喋呤、6-巰基嘌呤、6-硫代鳥嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶胺烯咪胺）、消融劑（例如氮芥、塞替派苯丁酸氮芥、美法侖（meiphalan）、卡莫司汀（BSNU）和洛莫司汀（CCNU）、環磷醯胺、白消安、二溴甘露醇、鏈佐星、絲裂黴素C和順式二氯二胺鉑（II）（DDP）順鉑、蒽環類（例如，柔紅黴素（舊稱道諾黴素）和多柔比星）、抗生素類（例如更生黴素（舊稱放線菌素）、博來黴素、光神黴素和安麯黴素（AMC））以及抗有絲分裂劑（例如長春新鹼和長春花鹼）。（參見例如，西雅圖遺傳學公司（Seattle Genetics） US 20090304721）。
可以與本發明之抗體、抗體片段（抗原結合片段）或功能等同物軛合的細胞毒素的其他實例包括多卡米星、加利車黴素（calicheamicin）、美登素和澳瑞司他汀及其衍生物。
各種細胞毒素類型、連接子和使治療劑與抗體軛合之方法的是本領域已知的，參見例如Saito等人, (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. [先進藥物遞送評論] 55:199-215；Trail等人, (2003) Cancer Immunol. Immunother. [癌症免疫學和免疫療法] 52:328-337；Payne, (2003) Cancer Cell [癌細胞] 3:207-212；Allen, (2002) Nat. Rev. Cancer [自然綜述-癌症] 2:750-763；Pastan和Kreitman, (2002) Curr. Opin. Investig. Drugs [當前研究藥物觀點] 3:1089-1091；Senter和Springer, (2001) Adv. Drug Deliv. Rev. [先進藥物遞送評論] 53:247-264。
本發明之抗體、抗體片段（例如，抗原結合片段）或功能等同物也可以與放射性同位素軛合以產生細胞毒性放射藥物，稱之為放射免疫軛合物。可以與抗體軛合的用於診斷或治療性用途的放射性同位素的實例包括但不限於碘-131、銦-111、釔-90和鑥-177。本領域中建立了用於製備放射免疫軛合物之方法。放射免疫軛合物的實例係可商業獲得的，包括ZevalinTM （DEC製藥公司（DEC Pharmaceuticals））和BexxarTM （寇里克薩製藥公司（Corixa Pharmaceuticals）），並且可以利用本發明之抗體使用類似方法來製備放射免疫軛合物。在某些實施方式中，大環螯合劑係1,4,7,10-四氮雜環十二烷-N,N’,N’’,N’’’-四乙酸（DOTA），其可以經由連接子分子附接至抗體。此類連接子分子係本領域公知的，並且描述於Denardo等人, (1998) Clin Cancer Res. [臨床癌症研究]4(10):2483-90；Peterson等人, (1999) Bioconjug.Chem. [生物軛合化學] 10(4):553-7；和Zimmerman等人, (1999) Nucl.Med. Biol. [核醫學和生物學] 26(8):943-50，每一篇文獻均藉由引用以其全文併入。
本發明之抗體、抗體片段（例如，抗原結合片段）或功能等同物還可以與異源蛋白或多肽（或其片段、較佳的是與至少10個、至少20個、至少30個、至少40個、至少50個、至少60個、至少70個、至少80個、至少90個或至少100個胺基酸的多肽）軛合以產生融合蛋白。特別地，本發明提供了融合蛋白，該等融合蛋白包含本文所述之抗體片段（例如，抗原結合片段）（例如Fab片段、Fd片段、Fv片段、F(ab)2 片段、VH結構域、VH CDR、VL結構域或VL CDR）和異源蛋白質、多肽或肽。
可以藉由基因改組、模體改組、外顯子改組和/或密碼子改組（統稱為「DNA改組」）的技術生成另外的融合蛋白。可採用DNA改組來改變本發明抗體或其片段的活性（例如，具有較高親和力和較低解離速率的抗體或其片段）。通常參見，美國專利號5,605,793、5,811,238、5,830,721、5,834,252、和5,837,458；Patten等人, (1997) Curr.Opinion Biotechnol. [當前生物技術觀點] 8:724-33；Harayama, (1998) Trends Biotechnol. [生物技術趨勢] 16(2):76-82；Hansson等人, (1999) J. Mol. Biol. [分子生物學雜誌] 287:265-76；和Lorenzo和Blasco, (1998) Biotechniques [生物技術] 24(2):308- 313（該等專利和出版物中的每一篇均據此藉由引用以其全文併入）。抗體或其片段、或編碼的抗體或其片段可以藉由在重組之前藉由易錯PCR、隨機核苷酸插入或其他方法進行隨機誘變來改變。編碼特異性結合抗原的抗體或其片段的多核苷酸可以與一種或多種異源分子的一個或多個組分、模體、區段、部分、結構域、片段等重組。
此外，本發明之抗體、抗體片段（例如，抗原結合片段）或功能等同物可以與標誌物序列如肽軛合以促進純化。在較佳的實施方式中，標誌物胺基酸序列係六組胺酸肽（SEQ ID NO: 628），例如pQE運載體中提供的標籤（凱傑公司（QIAGEN, Inc.），伊頓大街（Eton Avenue）9259號，加利福尼亞州查茨沃思（Chatsworth），91311）等，其中許多係商購可得的。如Gentz等人, (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA [美國國家科學院院刊] 86:821-824中所述，例如六組胺酸（SEQ ID NO: 628）為純化融合蛋白提供便利。可用於純化的其他肽標籤包括但不限於，對應於衍生自流感血凝素蛋白的表位的血凝素（「HA」）標籤（Wilson等人, (1984) Cell [細胞] 37:767）和「FLAG」標籤（A. Einhauer等人, J. Biochem. Biophys. Methods [生化和生物物理方法雜誌] 49: 455-465, 2001）。根據本發明，抗體或抗原結合片段也可以與滲透腫瘤的肽軛合以提高它們的功效。
在其他實施方式中，本發明之抗體、抗體片段（例如，抗原結合片段）或功能等同物與診斷劑或可檢測劑軛合。此類免疫軛合物可用於監測或預後疾病或障礙的發作、發展、進展和/或嚴重程度以作為臨床試驗程序（如確定特定療法的功效）的一部分。這種診斷和檢測可以藉由將抗體與可檢測物質偶聯來實現，該等可檢測物質包括但不限於各種酶，如但不限於辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙醯膽鹼酯酶；輔基，例如但不限於鏈黴親和素/生物素和親和素/生物素；螢光材料，如但不限於Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 405、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 500、Alexa Fluor 514、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 610、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700、Alexa Fluor 750、傘形酮、螢光素、異硫氰酸螢光素、羅丹明、二氯三𠯤胺螢光素、丹磺醯氯或藻紅蛋白；發光材料，例如但不限於魯米諾；生物發光材料，例如但不限於螢光素酶、螢光素和水母素；放射性材料，如但不限於碘（131 I、125 I、123 I和121 I）、碳（14 C）、硫（35 S）、氚（3 H）、銦（115 In、113 In、112 In和111 In）、鍀（99 Tc）、鉈（201 Ti）、鎵（68 Ga、67 Ga）、鈀（103 Pd）、鉬（99 Mo）、氙（133 Xe）、氟（18 F）、153 Sm、177 Lu、159 Gd、149 Pm、140 La、175 Yb、166 Ho、90 Y、47 Sc、186 Re、188 Re、142 Pr、105 Rh、97 Ru、68 Ge、57 Co、65 Zn、85 Sr、32 P、153 Gd、169 Yb、51 Cr、54 Mn、75 Se、64 Cu、113 Sn和117 Sn；以及使用各種正電子發射斷層掃描的正電子發射金屬和非放射性順磁金屬離子。
本發明之抗體、抗體片段（例如，抗原結合片段）或功能等同物也可以附接至特別可用於靶抗原的免疫測定法或純化的固體支持物。這種固體支持物包括但不限於玻璃、纖維素、聚丙烯醯胺、尼龍、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。2. 連接子
如本文所用，「連接子」係能夠將抗體、抗體片段（例如，抗原結合片段）或功能等同物與另一個部分如藥物部分連接的任何化學部分。連接子可以在化合物或抗體仍保持活性的條件下易於裂解（可裂解連接子），如，酸誘導的裂解、光誘導的裂解、肽酶誘導的裂解、酯酶誘導的裂解、糖苷酶誘導的裂解、磷酸二酯酶誘導的裂解、磷酸酶誘導的裂解和二硫鍵裂解。可替代地，連接子可以對裂解有實質性抗性（例如，穩定連接子或不可裂解連接子）。在一些方面，連接子係預先帶電荷的連接子、親水性連接子或基於二羧酸的連接子。
在一方面，用於本發明中的連接子衍生自交聯試劑，如N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯（SPDP）、N-琥珀醯亞胺基4-(2-吡啶基二硫代)戊酸酯（SPP）、N-琥珀醯亞胺基4-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯（SPDB）、N -琥珀醯亞胺基-4-(2-吡啶基二硫代)-2-磺基-丁酸酯（磺基-SPDB）、N-琥珀醯亞胺基碘乙酸酯（SIA）、N-琥珀醯亞胺基(4-碘乙醯基)胺基苯甲酸酯（SIAB）、馬來醯亞胺PEG NHS、N-琥珀醯亞胺基4-(馬來醯亞胺基甲基)環己烷羧酸酯（SMCC）、N-磺基琥珀醯亞胺基4-(馬來醯亞胺基甲基)環己烷羧酸酯（磺基-SMCC）或2,5-二側氧基吡咯啶-1-基17-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-5,8,11,14-四側氧基-4,7,10,13-四氮雜十七碳-1-酸酯（CX1-1）。
不可裂解連接子係能夠使藥物如類美登素與抗體以穩定、共價方式連接的任何化學部分並且不歸入上文對可裂解連接子所列的分類。因此，不可裂解連接子對酸誘導的裂解、光誘導的裂解、肽酶誘導的裂解、酯酶誘導的裂解和二硫鍵裂解有實質性抗性。此外，不可裂解係指連接子中或毗鄰連接子的化學鍵在藥物如類美登素或抗體不喪失其活性的條件下經受住酸、光不穩定性裂解劑、肽酶、酯酶或裂解二硫鍵的化學或生理學化合物誘導的裂解的能力。
酸不穩定性連接子係在酸性pH下可裂解的連接子。例如，某些細胞內區室如胞內體和溶酶體具有酸性pH（pH 4-5）並且提供適於裂解酸不穩定性連接子的條件。
光不穩定性連接子係在體表和在光可抵達的許多體腔中可用的連接子。此外，紅外線可穿透組織。
一些連接子可以被肽酶裂解，即肽酶可裂解連接子。僅某些肽易於在細胞內部或外部被裂解，參見例如，Trout等人, 79 Proc. Natl. Acad. Sci. USA [美國國家科學院院刊], 626-629 (1982)和Umemoto等人 43 Int. J. Cancer [國際癌症雜誌], 677-684 (1989)。此外，肽由α-胺基酸和肽鍵組成，該等肽鍵在化學上係一個胺基酸的羧酸根與第二個胺基酸的胺基基團之間的醯胺鍵。將其他醯胺鍵，如離胺酸的羧酸根與ε-胺基基團之間的鍵不理解為係肽鍵並且視為不可裂解的。
一些連接子可以由酯酶裂解，即酯酶可裂解連接子。同樣，僅某些酯可以被細胞內部或外部存在的酯酶裂解。酯由羧酸和醇的縮合形成。簡單酯係用簡單醇如脂族醇和小環狀醇和小芳族醇產生的酯。
預先帶電荷的連接子衍生自帶電荷交聯試劑，該等帶電荷交聯試劑摻入到抗體藥物軛合物中後保持其電荷。預先帶電荷的連接子的實例可以在US 2009/0274713中找到。3. ADC 的軛合和製備
將連接子-有效負載與抗原結合部分軛合的許多方法係本領域已知的（例如綜述於：Antibody-Drug Conjugate [抗體-藥物軛合物], Methods in Molecular Biology [分子生物學方法], 第1045卷, L. Ducry編輯, Humana Press [胡馬納出版社] (2013)）。傳統上，將藥物與抗體的天然離胺酸或天然半胱胺酸殘基軛合。所得製劑係複合混合物。最近，採用位點特異性軛合方法來改善ADC製劑的治療指數和均質性（對於綜述：Panowski, S.; Bhakta, S.; Raab, H.; Polakis, P.; Junutula, J. R.mAbs [單株抗體]2014 ,6 , 34）。除了糖工程化之外（Zhou, Q.等人Bioconjugate chemistry [生物軛合化學]2014 ,25 , 510；Zhu, Z.等人mAbs [單株抗體]2014 ,6 , 1190）；製備位點特異性ADC的一些更常見方法係基於向抗體骨架中摻入工程化半胱胺酸（Junutula, J. R.等人,Nature biotechnology [自然生物技術]2008 ,26 , 925；Shinmi, D.等人,Bioconjugate chemistry [生物軛合化學]2016 ,27 , 1324）、非經典胺基酸（Tian, F.等人,Proceedings National Academy of Sciences USA [美國國家科學院院刊]2014 ,111 , 1766；Axup, J. Y.等人,Proceedings National Academy of Sciences USA [美國國家科學院院刊]2012 ,109 , 16101）或短肽序列（Drake, P. M.等人,Bioconjugate chemistry [生物軛合化學]2014 ,25 , 1331；Strop, P.等人,Chemistry & biology [化學與生物學]2013 ,20 , 161；Beerli, R. R.等人,PloS one [公共科學圖書館綜合]2015 ,10 , e0131177；Grunewald, J.等人,Bioconjugate chemistry [生物軛合化學]2015 ,26 , 2554）。該等方法提供了對細胞毒素的化學計量和連接位點的控制，從而使得軛合物相對於傳統製備的ADC具有較佳的藥物動力學（PK）、安全性和功效譜。
本發明之軛合物可以藉由本領域已知的任何方法來製備，該等方法如在美國專利號7,811,572、6,411,163、7,368,565和8,163,888，美國申請公開2011/0003969、2011/0166319、2012/0253021和2012/0259100，和PCT公開WO 2014/124316和WO 2015/138615中描述的那些方法。該等專利和專利申請公開的完整教導藉由引用併入本文。用於與工程化半胱胺酸抗體殘基軛合之方法
可以使用藉由例如定點誘變工程化到抗體中的半胱胺酸殘基來製備本發明之軛合物。此類位點特異性軛合物係均質的並且具有改善的特性（Junutula JR, Raab H, Clark S, Bhakta S, Leipold DD, Weir S, Chen Y, Simpson M, Tsai SP, Dennis MS, Lu Y, Meng YG, Ng C, Yang J, Lee CC, Duenas E, Gorrell J, Katta V, Kim A, McDorman K, Flagella K, Venook R, Ross S, Spencer SD, Lee Wong W, Lowman HB, Vandlen R, Sliwkowski MX, Scheller RH, Polakis P, Mallet W. (2008) Nature Biotechnology [自然生物技術] 26:925-932）。
因為在哺乳動物細胞中表現的抗體中的工程化半胱胺酸在其生物合成期間藉由加合物（二硫化物）如麩胱甘肽 （GSH）和/或半胱胺酸修飾（Chen等人 2009），所以最初表現的產物中的工程化半胱胺酸殘基對硫醇反應性試劑（如馬來醯亞胺基或溴乙醯胺或碘乙醯胺基團）不起反應。為了將有效負載與表現後的工程化半胱胺酸軛合，需要藉由還原該等二硫化物加合物去除麩胱甘肽 或半胱胺酸加合物，這通常還需要還原表現的蛋白質中的天然二硫化物。經加合的工程化半胱胺酸的去保護可以藉由以下方式完成：首先將抗體暴露於還原劑，例如二硫蘇糖醇（DTT）、TCEP、或還原的半胱胺酸，然後是允許再氧化抗體的所有天然二硫鍵以恢復和/或穩定化功能性抗體結構的程序。
可以採用若干種方法來還原和再氧化具有工程化Cys殘基以用於製備抗體藥物軛合物的抗體。嘗試使用高濃度的CuSO4 遵循文獻中先前描述的再氧化方案導致蛋白質沈澱（Junutula JR, Raab H, Clark S, Bhakta S, Leipold DD, Weir S, Chen Y, Simpson M, Tsai SP, Dennis MS, Lu Y, Meng YG, Ng C, Yang J, Lee CC, Duenas E, Gorrell J, Katta V, Kim A, McDorman K, Flagella K, Venook R, Ross S, Spencer SD, Lee Wong W, Lowman HB, Vandlen R, Sliwkowski MX, Scheller RH, Polakis P, Mallet W. (2008) Nature Biotechnology [自然生物技術] 26:925）。我們已經用若干種不同的還原和抗體再氧化方法成功製備並獲得了抗體藥物軛合物。
在一個實例中，將新鮮製備的DTT添加到純化的Cys突變型抗體中至最終濃度為10 mM。在與DTT在室溫下孵育1小時後，將混合物在4°C下用PBS透析3天，每天更換緩衝液以去除DTT並再氧化抗體的天然二硫鍵。一種替代性方法係藉由用PBS平衡的脫鹽柱如Sephadex G-25去除還原劑。一旦蛋白質完全還原，視需要將1 mM氧化的抗壞血酸鹽（脫氫-抗壞血酸）添加到脫鹽樣本，並且進行再氧化孵育20-24小時。
在另一個示例性方法中，藉由將20 mM濃度的完全還原的半胱胺酸添加到與蛋白A-瓊脂糖樹脂結合的抗體來完成工程化Cys殘基的去保護。藉由以下方式來實現對Cys加合物的還原：在室溫下孵育大約30-60分鐘，然後藉由用50個床的PBS洗滌樹脂來快速去除還原劑。藉由在添加或不添加50-2000 nM CuCl2 作為加速劑的情況下在室溫下孵育洗滌的漿液來實現對還原的抗體的再氧化。除了使用硫酸銅之外，本文的實例使用本文所述之每種方案，具有類似的結果。再氧化恢復鏈內二硫化物，而透析、脫鹽或蛋白A層析法去除還原劑以及最初與抗體的一個或多個工程化半胱胺酸連接的半胱胺酸和麩胱甘肽 。HPLC反相層析法典型地用於監測再氧化過程：將抗體載入到加熱至80°C的PLRP-S柱（4000 Å，50 mm x 2.1 mm，安捷倫（Agilent））上，並且使用含有0.1% TFA的30%-45% CH3CN的水溶液的線性梯度以1.5 mL/min洗脫，並且在215、254和280 nm處進行峰值檢測。
在再氧化後，將抗體與預先形成的連接子-藥物部分軛合。舉例來說，將預先形成的連接子-藥物部分（例如像MMTBT-DM4；MPET-DM4；MBT-DM4；MEPET-DM4；MPBT-DM1；和如本文所述之其他連接子-藥物部分）以相對於PBS緩衝液（pH 7.2）中的抗體的10莫耳當量添加到再氧化的Cys突變型抗體中。進行孵育1小時。藉由反相HPLC監測軛合過程，該反相HPLC能夠將軛合的抗體與非軛合的抗體分離。將軛合反應混合物在加熱至80°C的PRLP-S柱（4000 Å，50 mm x 2.1 mm，安捷倫）上分析，並且藉由含有0.1% TFA的30%-60%乙腈的水溶液的線性梯度進行柱洗脫，流速為1.5 ml/min。在280 nm、254 nm和215 nm處監測來自柱的蛋白質的洗脫。
在一個實施方式中，可以根據方案1至3製備用於半胱胺酸軛合的連接子-藥物部分的實例：
Figure 02_image119
方案1 其中： 藥物部分經由硫醇官能基連接至連接子； L1 係C1-6 伸烷基，其中亞甲基基團之一可以被氧替代； L2 係C1-6 伸烷基或者係-(CH2 CH2 O)y -CH2 -CH2 -，其中y係1至11；並且 X係-C(O)-NH-、-NHC(O)-或三唑； 其中該伸烷基係直鏈或支鏈的；並且 RG1和RG2係形成基團X的2個反應性基團。 形成醯胺或三唑的反應基團係本領域熟知的。 預先形成連接子-藥物部分的一個實例在方案2中表示，其中藥物部分係DM4；RG1係胺基基團並且RG2係活化酸，導致醯胺鍵（X）的形成：
Figure 02_image121
方案2. 預先形成連接子-藥物部分的另一個實例在方案3中表示，其中藥物部分係DM4；RG1係疊氮基團並且RG2係炔烴基團，導致四唑（X）的形成：
Figure 02_image123
方案3
具有連接的馬來醯亞胺的各種藥物部分與Cys突變型抗體的軛合效率根據所用藥物部分的溶解度而變化，然而，許多反應導致超過90%的軛合物。為了評價聚集狀態，將所得的軛合物在尺寸排阻層析柱（通用電氣公司（GE），Superdex200，3.2/30）中以0.1 ml/min的流速在PBS中分析。所有軛合物主要是單體的。大多數軛合物含有少於3%的二聚體和寡聚體材料，這表明具有連接的馬來醯亞胺的藥物部分與Cys突變型抗體的軛合不會引起聚集。
免疫軛合物的特徵還在於藥物部分與抗體結合部分的平均負載量，通常稱為藥物對抗體比率（DAR）。例如，從還原和去糖基化樣本的LC-MS數據外推出DAR值。LC/MS允許定量ADC中附接至抗體的有效負載（藥物部分）分子的平均數。HPLC將抗體分離成輕鏈和重鏈，並且還根據每條鏈的連接子-有效負載基團的數量分離重鏈（HC）和輕鏈（LC）。質譜數據能夠鑒定混合物中的組分種類，例如LC、LC+1、LC+2、HC、HC+1、HC+2等。由LC和HC鏈上的平均負載，可以計算ADC的平均DAR。給定免疫軛合物樣本的DAR表示附接至含有兩條輕鏈和兩條重鏈的四聚體抗體的藥物（有效負載）分子的平均數。用於與天然半胱胺酸抗體殘基軛合之方法
如本文所述之連接子-藥物部分也可以使用關於部分還原抗體的程序與非工程化抗體的天然半胱胺酸殘基軛合（Doronina, S. O., Toki, B. E., Torgov, M. Y., Mendelsohn, B. A., Cerveny, C. G., Chace, D. F., DeBlanc, R. L., Gearing,R. P., Bovee, T. D., Siegall, C. B., Francisco, J. A., Wahl, A. F., Meyer, D. L., and Senter, P. D. (2003) Development of potent monoclonal antibody auristatin conjugates for cancer therapy [用於癌症療法的有效單株抗體澳瑞司他汀軛合物的開發].Nat. Biotechnol. [自然生物技術]21 , 778-784）。以下方案係如何製備此類軛合物的非限制性實例：首先藉由添加TCEP至最終濃度為10 mM並且在37°C下孵育混合物1小時來將抗體（濃度典型地為5至10 mg/ml）的鏈間和鏈內二硫鍵在含有2 mM EDTA的PBS中部分還原。在脫鹽並添加1% w/v PS-20洗滌劑後，將部分還原的抗體（1-2 mg/ml）在4°C下與每10 mg抗體0.5至1 mg的含馬來醯亞胺的連接子有效負載化合物反應過夜。將所得的軛合物藉由蛋白A層析藉由標準方法純化並將緩衝液更換為PBS，並且典型地藉由質譜（MS）、分析型尺寸排阻層析（AnSEC）和分析型疏水相互作用層析（AnHIC）針對其藥物對抗體比率、聚集傾向和疏水性以及藉由活性測定進行概要分析。用於交聯至離胺酸抗體殘基的單步驟法
在一個實施方式中，本發明之軛合物可以藉由用於將藥物交聯至抗體上的離胺酸殘基的單步驟法製備。該方法包括在合適的pH下將抗體、藥物和交聯劑在基本上水性的介質中合併，該介質視需要含有一種或多種共溶劑。在一個實施方式中，該方法包括以下步驟：在具有約4至約9的pH的溶液中使本發明之抗體與藥物（例如，DM1或DM4）接觸以形成包含抗體和藥物的第一混合物，並且然後使包含抗體和藥物的第一混合物與交聯劑（例如，SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1）接觸以提供包含 (i) 軛合物（例如Ab-MCC-DM1、Ab-SPDB-DM4或Ab-CX1-1-DM1）、(ii) 游離藥物（例如，DM1或DM4）、和 (iii) 反應副產物的混合物。
在一個實施方式中，單步驟法包括在具有約6或更大（例如，約6至約9、約6至約7、約7至約9、約7至約8.5、約7.5至約8.5、約7.5至約8.0、約8.0至約9.0、或約8.5至約9.0）的pH的溶液中使抗體與藥物（例如，DM1或DM4）接觸並且然後與交聯劑（例如，SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1）接觸。例如，本發明之方法包括在具有約6.0、約6.1、約6.2、約6.3、約6.4、約6.5、約6.6、約6.7、約6.8、約6.9、約7.0、約7.1、約7.2、約7.3、約7.4、約7.5、約7.6、約7.7、約7.8、約7.9、約8.0、約8.1、約8.2、約8.3、約8.4、約8.5、約8.6、約8.7、約8.8、約8.9、或約9.0的pH的溶液中使細胞結合劑與藥物（例如，DM1或DM4）接觸並且然後與交聯劑（例如，SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1）接觸。在一個具體實施方式中，本發明之方法包括在具有約7.8的pH（例如，7.6至8.0的pH或7.7至7.9的pH）的溶液中使細胞結合劑與藥物（例如，DM1或DM4）接觸並且然後與交聯劑（例如，SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1）接觸。
單步驟法（即，使抗體與藥物（例如，DM1或DM4）接觸並且然後與交聯劑（例如，SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1接觸）可以在本領域已知的任何合適溫度下進行。例如，單步驟法可以在約20°C或更低（例如，約-10°C（條件係防止溶液凍結，例如藉由存在用來溶解細胞毒性劑的有機溶劑和雙官能交聯試劑）至約20°C、約0°C至約18°C、約4°C至約16°C）下、在室溫（例如，約20°C至約30°C或約20°C至約25°C）下、或在升高的溫度（例如，約30°C至約37°C）下發生。在一個實施方式中，單步驟法在約16°C至約24°C（例如，約16°C、約17°C、約18°C、約19°C、約20°C、約21°C、約22°C、約23°C、約24°C、或約25°C）的溫度下發生。在另一個實施方式中，單步驟法在約15°C或更低（例如，約-10°C至約15°C、或約0°C至約15°C）的溫度下進行。例如，該方法包括在約15°C、約14°C、約13°C、約12°C、約11°C、約10°C、約9°C、約8°C、約7°C、約6°C、約5°C、約4°C、約3°C、約2°C、約1°C、約0°C、約-1°C、約-2°C、約-3°C、約-4°C、約-5°C、約-6°C、約-7°C、約-8°C、約-9°C、或約-10°C的溫度下使抗體與藥物（例如，DM1或DM4）接觸並且然後與交聯劑（例如，SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1）接觸，條件係防止溶液凍結，例如藉由存在用來溶解交聯劑（例如，SMCC、磺基-SMCC、磺基-SPDB、SPDB或CX1-1）的一種或多種有機溶劑。在一個實施方式中，該方法包括在約-10°C至約15°C、約0°C至約15°C、約0°C至約10°C、約0°C至約5°C、約5°C至約15°C、約10°C至約15°C、或約5°C至約10°C的溫度下使抗體與藥物（例如，DM1或DM4）接觸並且然後與交聯劑（例如，SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1）接觸。在另一個實施方式中，該方法包括在約10°C的溫度（例如，8ºC至12ºC的溫度或9ºC至11ºC的溫度）下使抗體與藥物（例如，DM1或DM4）接觸並且然後與交聯劑（例如，SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1）接觸。
在一個實施方式中，藉由以下方式實現上述的接觸：提供抗體，然後使抗體與藥物（例如，DM1或DM4）接觸以形成包含抗體和藥物（例如，DM1或DM4）的第一混合物，並且然後使包含抗體和藥物（例如，DM1或DM4）的第一混合物與交聯劑（例如，SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1）接觸。例如，在一個實施方式中，在反應容器中提供抗體，添加藥物（例如，DM1或DM4）至反應容器中（從而與抗體接觸），並且然後將交聯劑（例如，SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1）添加到包含抗體和藥物（例如，DM1或DM4）的混合物中（從而與包含抗體和藥物的混合物接觸）。在一個實施方式中，在反應容器中提供抗體，並且向容器提供抗體後立即添加藥物（例如，DM1或DM4）至反應容器中。在另一個實施方式中，在反應容器中提供抗體，並且向容器提供抗體後某個時間區間（例如，在向該空間提供細胞結合劑後約5分鐘、約10分鐘、約20分鐘、約30分鐘、約40分鐘、約50分鐘，約1小時、約1天或更長時間）之後添加藥物（例如，DM1或DM4）至反應容器中。可以迅速（即，在短時間區間，如約5分鐘、約10分鐘內）或緩慢（如藉由使用泵）添加藥物（例如，DM1或DM4）。
然後可以將包含抗體和藥物（例如，DM1或DM4）的混合物與交聯劑（例如，SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1）在使抗體與藥物（例如，DM1或DM4）接觸後立即接觸或在使抗體與藥物（例如，DM1或DM4）接觸後的某個更晚時間點（例如，約5分鐘至約8小時或更長時間）接觸。例如，在一個實施方式中，在添加藥物（例如，DM1或DM4）至包含抗體的反應容器中後立即添加交聯劑（例如，SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1）至包含抗體和藥物（例如，DM1或DM4）的混合物中。可替代地，包含抗體和藥物（例如，DM1或DM4）的混合物可以在使抗體與藥物（例如，DM1或DM4）接觸後約5分鐘、約10分鐘、約20分鐘、約30分鐘、約1小時、約2小時、約3小時、約4小時、約5小時、約6小時、約7小時、約8小時或更長時間與交聯劑（例如，SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1）接觸。
在使包含抗體和藥物（例如，DM1或DM4）的混合物與交聯劑（例如，SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1）接觸後，使反應推進約1小時、約2小時、約3小時、約4小時、約5小時、約6小時、約7小時、約8小時、約9小時、約10小時、約11小時、約12小時、約13小時、約14小時、約15小時、約16小時、約17小時、約18小時、約19小時、約20小時、約21小時、約22小時、約23小時、約24小時、或更長（例如約30小時、約35小時、約40小時、約45小時、或約48小時）。
在一個實施方式中，單步驟法進一步包括使任何未反應的藥物（例如，DM1或DM4）和/或未反應的交聯劑（例如，SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1）淬滅的淬滅步驟。淬滅步驟典型地在純化軛合物之前進行。在一個實施方式中，藉由使混合物與淬滅試劑接觸來使混合物淬滅。如本文所用，「淬滅試劑」係指與游離藥物（例如，DM1或DM4）和/或游離交聯劑（例如，SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1）反應的試劑。在一個實施方式中，馬來醯亞胺或鹵乙醯胺淬滅試劑，如4-馬來醯亞胺丁酸、3-馬來醯亞胺丙酸、N-乙基馬來醯亞胺、碘乙醯胺或碘乙醯胺基丙酸，可以用來確保藥物（例如，DM1或DM4）中的任何未反應基團（如硫醇）淬滅。淬滅步驟可以説明防止藥物（例如，DM1）二聚化。二聚化的DM1可能難以去除。一旦用極性、帶電荷的硫醇淬滅試劑（如4-馬來醯亞胺丁酸或3-馬來醯亞胺丙酸）淬滅，多餘的未反應DM1轉化成極性、帶電荷的水溶性加合物，該加合物可以在純化步驟期間容易地與共價連接的軛合物分離。也可以使用非極性和中性硫醇淬滅試劑淬滅。在一個實施方式中，藉由使混合物與淬滅試劑接觸來使混合物淬滅，該淬滅試劑與未反應的交聯劑（例如，SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1）反應。例如，可以將親核試劑添加到混合物中以淬滅任何未反應的SMCC。親核試劑較佳的是含有胺基基團的親核試劑，如離胺酸、牛磺酸和羥胺。
在一個較佳的實施方式中，在使混合物與淬滅試劑接觸之前，允許反應（即，使抗體與藥物（例如，DM1或DM4）接觸並且然後與交聯劑（例如，SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1）接觸）推進至完成。在這個方面，在包含抗體和藥物（例如，DM1或DM4）的混合物與交聯劑（例如，SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1）接觸後約1小時至約48小時（例如約1小時、約2小時、約3小時、約4小時、約5小時、約6小時、約7小時、約8小時、約9小時、約10小時、約11小時、約12小時、約13小時、約14小時、約15小時、約16小時、約17小時、約18小時、約19小時、約20小時、約21小時、約22小時、約23小時、約24小時、或約25小時至約48小時）將淬滅試劑添加到混合物中。
可替代地，藉由將混合物的pH降低至約5.0（例如，4.8、4.9、5.0、5.1或5.2）來使混合物淬滅。在另一個實施方式中，藉由將pH降低至小於6.0、小於5.5、小於5.0、小於4.8、小於4.6、小於4.4、小於4.2、小於4.0來使混合物淬滅。可替代地，將pH降低至約4.0（例如，3.8、3.9、4.0、4.1或4.2）至約6.0（例如，5.8、5.9、6.0、6.1或6.2）、約4.0至約5.0、約4.5（例如，4.3、4.4、4.5、4.6或4.7）至約5.0。在一個實施方式中，藉由將混合物的pH降低至4.8來使混合物淬滅。在另一個實施方式中，藉由將混合物的pH降低至5.5來使混合物淬滅。
在一個實施方式中，單步驟法進一步包括從抗體釋放不穩定結合的連接子的保持步驟。保持步驟包括在純化軛合物之前（例如，在反應步驟後、在反應步驟與淬滅步驟之間、或在淬滅步驟後）保持混合物。例如，該方法包括 (a) 在具有約4至約9的pH的溶液中使抗體與藥物（例如，DM1、DM3或DM4）接觸以形成包含抗體和藥物（例如，DM1、DM3或DM4）的混合物；並且然後使包含抗體和藥物（例如，DM1、DM3或DM4）的混合物與交聯劑（例如，SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1）接觸，以提供包含 (i) 軛合物（例如Ab-MCC-DM1、Ab-SPDB-DM4或Ab-CX1-1-DM1）、(ii) 游離藥物（例如，DM1、DM3或DM4）、和 (iii) 反應副產物的混合物，(b) 保持在步驟 (a) 中製備的混合物以從細胞結合劑釋放不穩定結合的連接子，並且 (c) 純化混合物以提供純化的軛合物。
在另一個實施方式中，該方法包括 (a) 在具有約4至約9的pH的溶液中使抗體與藥物（例如，DM1、DM3或DM4）接觸以形成包含抗體和藥物（例如，DM1、DM3或DM4）的混合物；並且然後使包含抗體和藥物（例如，DM1、DM3或DM4）的混合物與交聯劑（例如，SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1）接觸，以提供包含 (i) 軛合物、(ii) 游離藥物（例如，DM1、DM3或DM4）、和 (iii) 反應副產物的混合物，(b) 淬滅在步驟 (a) 中製備的混合物以淬滅任何未反應的藥物（例如，DM1、DM3或DM4）和/或未反應的交聯劑（例如，SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1），(c) 保持在步驟 (b) 中製備的混合物以從細胞結合劑釋放不穩定結合的連接子，並且 (d) 純化混合物以提供純化的軛合物（例如，Ab-MCC-DM1、Ab-SPDB-DM4或Ab-CX1-1-DM1）。
可替代地，保持步驟可以在純化軛合物後進行，隨後進行額外的純化步驟。
在一個較佳的實施方式中，在保持步驟之前允許反應推進至完成。在這個方面，在包含抗體和藥物（例如，DM1、DM3或DM4）的混合物與交聯劑（例如，SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1）接觸後約1小時至約48小時（例如約1小時、約2小時、約3小時、約4小時、約5小時、約6小時、約7小時、約8小時、約9小時、約10小時、約11小時、約12小時、約13小時、約14小時、約15小時、約16小時、約17小時、約18小時、約19小時、約20小時、約21小時、約22小時、約23小時、約24小時、或約24小時至約48小時）可以進行保持步驟。
保持步驟包括將溶液維持在合適的溫度（例如，約0ºC至約37ºC）持續合適的時間段（例如，約1小時至約1週、約1小時至約24小時、約1小時至約8小時或約1小時至約4小時）以從抗體釋放不穩定結合的連接子，同時基本上不從抗體釋放穩定結合的連接子。在一個實施方式中，保持步驟包括將溶液維持在約20ºC或更低（例如，約0ºC至約18ºC、約4ºC至約16ºC）下、室溫（例如，約20ºC至約30ºC或約20ºC至約25ºC）下、或升高的溫度（例如，約30ºC至約37ºC）下。在一個實施方式中，保持步驟包括將溶液維持在約16°C至約24°C（例如，約15ºC、約16ºC、約17ºC、約18ºC、約19ºC、約20ºC、約21ºC、約22ºC、約23ºC、約24ºC、或約25ºC）的溫度下。在另一個實施方式中，保持步驟包括將溶液維持在約2°C至約8°C（例如，約0ºC、約1ºC、約2ºC、約3ºC、約4ºC、約5ºC、約6ºC、約7ºC、約8ºC、約9ºC、或約10ºC）的溫度下。在另一個實施方式中，保持步驟包括將溶液維持在約37°C（例如，約34ºC、約35ºC、約36ºC、約37ºC、約38ºC、約39ºC、或約40ºC）的溫度下。
保持步驟的持續時間取決於進行保持步驟的溫度和pH。例如，可以藉由在升高的溫度下進行保持步驟大幅度減少保持步驟的持續時間，最高溫度受細胞結合劑-細胞毒性劑軛合物的穩定性限制。保持步驟可以包括將溶液維持約1小時至約1天（例如，約1小時、約2小時、約3小時、約4小時、約5小時、約6小時、約7小時、約8小時、約9小時、約10小時、約12小時、約14小時、約16小時、約18小時、約20小時、約22小時、或約24小時）、約10小時至約24小時、約12小時至約24小時、約14小時至約24小時、約16小時至約24小時、約18小時至約24小時、約20小時至約24小時、約5小時至約1週、約20小時至約1週、約12小時至約1週（例如，約12小時、約16小時、約20小時、約24小時、約2天、約3天、約4天、約5天、約6天、或約7天）、或約1天至約1週。
在一個實施方式中，保持步驟包括將溶液在約2ºC至約8ºC的溫度下維持至少約12小時、至多一週的時段。在另一個實施方式中，保持步驟包括將溶液在約2ºC至約8ºC的溫度下維持過夜（例如，約12至約24小時，較佳的是約20小時）。
用於保持步驟的pH值較佳的是約4至約10。在一個實施方式中，用於保持步驟的pH值係約4或更大，但是小於約6（例如，4至5.9）或約5或更大，但是小於約6（例如，5至5.9）。在另一個實施方式中，用於保持步驟的pH值範圍為從約6至約10（例如，約6.5至約9、約6至約8）。例如，用於保持步驟的pH值可以是約6、約6.5、約7、約7.5、約8、約8.5、約9、約9.5、或約10。
在具體實施方式中，保持步驟可以包括將混合物在25°C下、在約6-7.5的pH下孵育約12小時至約1週，將混合物在4°C下、在約4.5-5.9的pH下孵育約5小時至約5天，或將混合物在25°C下、在約4.5-5.9的pH下孵育約5小時至約1天。
單步驟法可以視需要包括向反應步驟添加蔗糖以增加溶解度和軛合物的回收率。合乎需要地，將蔗糖以約0.1%（w/v）至約20%（w/v）（例如約0.1%（w/v）、1%（w/v）、5%（w/v）、10%（w/v）、15%（w/v）、或20%（w/v））的濃度添加。較佳的是，將蔗糖以約1%（w/v）至約10%（w/v）（例如約0.5%（w/v）、約1%（w/v）、約1.5%（w/v）、約2%（w/v）、約3%（w/v）、約4%（w/v）、約5%（w/v）、約6%（w/v）、約7%（w/v）、約8%（w/v）、約9%（w/v）、約10%（w/v）、或約11%（w/v））的濃度添加。此外，反應步驟還可以包括添加緩衝劑。可以使用本領域已知的任何合適緩衝劑。合適的緩衝劑包括例如檸檬酸鹽緩衝劑、乙酸鹽緩衝劑、琥珀酸鹽緩衝劑和磷酸鹽緩衝劑。在一個實施方式中，緩衝劑選自由以下組成之群組：HEPPSO（N-(2-羥乙基)哌𠯤-N'-(2-羥基丙磺酸)）、POPSO（哌𠯤-1,4-雙-(2-羥-丙烷-磺酸)脫水物）、HEPES（4-(2-羥乙基)哌𠯤-1-乙磺酸）、HEPPS（EPPS）（4-(2-羥乙基)哌𠯤-1-丙磺酸）、TES（N-[三(羥甲基)甲基]-2-胺基乙磺酸）、及其組合。
在一個實施方式中，單步驟法可以進一步包括純化混合物以提供純化的軛合物（例如，Ab-MCC-DM1、Ab-SPDB-DM4或Ab-CX1-1-DM1）的步驟。本領域已知的任何純化方法可以用來純化本發明之軛合物。在一個實施方式中，使用切向流過濾（TFF）、非吸附性層析、吸附性層析、吸附性過濾、選擇性沈澱或任何其他合適的純化過程以及其組合純化本發明之軛合物。在另一個實施方式中，在使軛合物經歷上文描述的純化過程之前，首先將軛合物藉由一個或多個PVDF膜過濾。可替代地，在使軛合物經歷上文描述的純化過程之後，將軛合物藉由一個或多個PVDF膜過濾。例如，在一個實施方式中，將軛合物藉由一個或多個PVDF膜過濾並且然後使用切向流過濾純化。可替代地，將軛合物使用切向流過濾純化並且然後藉由一個或多個PVDF膜過濾。
任何合適的TFF系統可以用於純化，包括Pellicon型系統（密理博公司（Millipore），比勒利卡（Billerica），麻塞諸塞州（MA））、Sartocon膜包系統（賽多利斯公司（Sartorius AG），埃奇伍德（Edgewood），紐約）、和Centrasette型系統（頗爾公司（Pall Corp.），東希爾斯（East Hills），紐約）。
任何合適的吸附性層析樹脂可以用於純化。較佳的吸附性層析樹脂包括羥基磷灰石層析、疏水性電荷誘導層析（HCIC）、疏水相互作用層析（HIC）、離子交換層析、混合模式離子交換層析、固定化金屬親和層析（IMAC）、染料配位基層析、親和層析、反相層析、及其組合。合適的羥基磷灰石樹脂的實例包括陶瓷羥基磷灰石（CHT I型和II型，伯樂生命醫學產品有限公司（Biorad Laboratories），赫拉克勒斯（Hercules），加利福尼亞州（CA））、HA Ultrogel羥基磷灰石（頗爾公司，東希爾斯，紐約）和陶瓷氟磷灰石（CFT I型和II型，伯樂生命醫學產品有限公司，赫拉克勒斯，加利福尼亞州）。合適的HCIC樹脂的實例係MEP Hypercel樹脂（頗爾公司，東希爾斯，紐約）。合適的HIC樹脂的實例包括丁基-瓊脂糖凝膠、己基-瓊脂糖凝膠、苯基-瓊脂糖凝膠和辛基瓊脂糖凝膠樹脂（全部來自通用電氣醫療集團（GE Healthcare），皮斯卡塔韋（Piscataway），新澤西州），以及Macro-prep甲基樹脂和Macro-prep三級丁基樹脂（伯樂生命醫學產品有限公司，赫拉克勒斯，加利福尼亞州）。合適的離子交換樹脂的實例包括SP-瓊脂糖凝膠、CM-瓊脂糖凝膠和Q-瓊脂糖凝膠樹脂（全部來自通用電氣醫療集團，皮斯卡塔韋，新澤西州）和Unosphere S樹脂（伯樂生命醫學產品有限公司，赫拉克勒斯，加利福尼亞州）。合適的混合模式離子交換劑的實例包括Bakerbond ABx樹脂（馬林克羅特貝克有限公司（JT Baker），菲力浦斯堡（Phillipsburg），新澤西州）。合適的IMAC樹脂的實例包含螯合瓊脂糖凝膠樹脂（通用電氣醫療集團，皮斯卡塔韋，新澤西州）和Profinity IMAC樹脂（伯樂生命醫學產品有限公司，赫拉克勒斯，加利福尼亞州）。合適的染料配位基樹脂的實例包含藍色瓊脂糖凝膠樹脂（通用電氣醫療集團，皮斯卡塔韋，新澤西州）和Affi-凝膠藍色樹脂（伯樂生命醫學產品有限公司，赫拉克勒斯，加利福尼亞州）。合適的親和樹脂的實例包括蛋白A瓊脂糖凝膠樹脂（例如，MabSelect，通用電氣醫療集團，皮斯卡塔韋，新澤西州）和凝集素親和樹脂，例如兵豆凝集素瓊脂糖凝膠樹脂（通用電氣醫療集團，皮斯卡塔韋，新澤西州），其中抗體攜帶適當的凝集素結合位點。合適的反相樹脂的實例包括C4、C8和C18樹脂（格雷斯（Grace）Vydac，希斯皮裡亞（Hesperia），加利福尼亞州）。
任何合適的非吸附性層析樹脂可以用於純化。合適的非吸附性層析樹脂的實例包括但不限於SEPHADEX™ G-25、G-50、G-100、SEPHACRYL™樹脂（例如S-200和S-300）、SUPERDEX™樹脂（例如SUPERDEX™ 75和SUPERDEX™ 200）、BIO-GEL®樹脂（例如P-6、P-10、P-30、P-60和P-100）和熟悉該項技術者已知的其他樹脂。用於交聯至離胺酸抗體殘基的兩步驟法和單罐法
在一個實施方式中，本發明之軛合物可以如美國專利7,811,572和美國專利申請公開號2006/0182750中所述製備。該方法包括以下步驟：(a) 使本發明之抗體與交聯劑（例如，SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1）接觸，以將連接子（即Ab-SMCC、Ab-SPDB或Ab-CX1-1）共價連接至抗體並且從而製備包含具有與之結合的連接子的抗體的第一混合物；(b) 視需要使第一混合物經歷純化過程以製備具有與之結合的連接子的抗體的經純化的第一混合物；(c) 藉由在具有約4至約9的pH的溶液中使具有與之結合的連接子的抗體與藥物（例如，DM1、DM3、或DM4）反應，使藥物（例如，DM1、DM3或DM4）與第一混合物中具有與之結合的連接子的抗體軛合以製備包含 (i) 軛合物（例如Ab-MCC-DM1、Ab-SPDB-DM4或Ab-CX1-1-DM1）、(ii) 游離藥物（例如，DM1、DM3或DM4）、和 (iii) 反應副產物的第二混合物；和 (d) 使第二混合物經歷純化過程以將軛合物從第二混合物的其他組分純化。可替代地，可以省略純化步驟 (b)。本文所述之任何純化方法均可以用於步驟 (b) 和 (d)。在一個實施方式中，將TFF用於步驟 (b) 和步驟 (d)。在另一個實施方式中，將TFF用於步驟 (b) 並且將吸附性層析（例如CHT）用於步驟 (d)。用於交聯至離胺酸抗體殘基的單步驟試劑和原位法
在一個實施方式中，可以藉由以下方式製備本發明之軛合物：使預先形成的連接子-藥物化合物（例如，SMCC-DM1、磺基-SMCC-DM1、SPDB-DM4或CX1-1-DM1）與本發明之抗體軛合，如美國專利6,441,163和美國專利申請公開號2011/0003969和2008/0145374中所述，隨後進行純化步驟。可以使用本文所述之任何純化方法。藉由使藥物（例如，DM1、DM3或DM4）與交聯劑（例如，SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1）反應製備連接子-藥物化合物。使連接子-藥物化合物（例如，SMCC-DM1、磺基-SMCC-DM1、SPDB-DM4或CX1-1-DM1）視需要在與抗體軛合之前經歷純化。抗 CCR7 抗體
本發明提供了特異性結合CCR7的抗體或抗體片段（例如，抗原結合片段）。本發明之抗體或抗體片段（例如，抗原結合片段）包括但不限於如實例中所述那樣分離的人單株抗體或其片段。
在某些實施方式中，本發明提供了特異性結合CCR7的抗體或抗體片段（例如，抗原結合片段），所述抗體或抗體片段（例如，抗原結合片段）包含具有SEQ ID NO: 13、45、77或608的胺基酸序列的VH結構域。在某些實施方式中，本發明還提供了特異性結合CCR7的抗體或抗體片段（例如，抗原結合片段），所述抗體或抗體片段（例如，抗原結合片段）包含具有下文表1和表4中列出的任一VH CDR的胺基酸序列的VH CDR。在具體實施方式中，本發明提供了特異性結合CCR7的抗體或抗體片段（例如，抗原結合片段），所述抗體包含以下（或可替代地，由以下組成）：一個、兩個、三個、四個、五個或更多個具有下文表1和表4中列出的任一VH CDR的胺基酸序列的VH CDR。
本發明提供了特異性結合CCR7的抗體或抗體片段（例如，抗原結合片段），所述抗體或抗體片段（例如，抗原結合片段）包含具有SEQ ID NO: 29、61、93或624的胺基酸序列的VL結構域。本發明還提供了特異性結合CCR7的抗體或抗體片段（例如，抗原結合片段），所述抗體或抗體片段（例如，抗原結合片段）包含具有下文表1和表4中列出的任一VL CDR的胺基酸序列的VL CDR。特別地，本發明提供了特異性結合CCR7的抗體或抗體片段（例如，抗原結合片段），所述抗體或抗體片段（例如，抗原結合片段）包含以下（或可替代地，由以下組成）：一個、兩個、三個或更多個具有下文表1和表4中列出的任一VL CDR的胺基酸序列的VL CDR。
本發明之其他抗體或抗體片段（例如，抗原結合片段）包含如下胺基酸，該等胺基酸已經突變，但在CDR區中與表1和表4中所述序列中繪示的CDR區具有至少60%、70%、80%、90%或95%同一性。在一些實施方式中，抗體包含突變胺基酸序列，其中當與表1和表4中所述序列中繪示的CDR區相比時，CDR區中不超過1、2、3、4或5個胺基酸已經突變。
本發明還提供了核酸序列，該等核酸序列編碼特異性結合CCR7的抗體的VH、VL、全長重鏈和全長輕鏈。此類核酸序列可以針對哺乳動物細胞中的表現進行優化。
貫穿在本申請的全文中，如果說明書的文本與序列表之間存在差異，則以說明書的文本為准。 [表1].本發明之抗CCR7抗體的實例
506E15 （ 人源化 CysMab DAPA ）    
SEQ ID NO: 1 HCDR1（組合的） GFTFSSYAMS
SEQ ID NO: 2 HCDR2（組合的） TISSGGSFTYYPDSVKG
SEQ ID NO: 3 HCDR3（組合的） RASTVVGTDFDV
SEQ ID NO: 4 HCDR1（卡巴特） SYAMS
SEQ ID NO: 5 HCDR2（卡巴特） TISSGGSFTYYPDSVKG
SEQ ID NO: 6 HCDR3（卡巴特） RASTVVGTDFDV
SEQ ID NO: 7 HCDR1（喬西亞） GFTFSSY
SEQ ID NO: 8 HCDR2（喬西亞） SSGGSF
SEQ ID NO: 9 HCDR3（喬西亞） RASTVVGTDFDV
SEQ ID NO: 10 HCDR1（IMGT） GFTFSSYA
SEQ ID NO: 11 HCDR2（IMGT） ISSGGSFT
SEQ ID NO: 12 HCDR3（IMGT） ARRASTVVGTDFDV
SEQ ID NO: 13 VH EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWIRQAPGKGLEWVATISSGGSFTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRASTVVGTDFDVWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO: 14 DNA VH GAAGTGCAGCTGGTGGAATCTGGCGGCGGACTGGTCAAGCCTGGCGGCTCCCTGAGACTGTCTTGCGCCGCCTCCGGCTTCACCTTCTCCAGCTACGCCATGTCCTGGATCCGGCAGGCCCCTGGCAAGGGACTGGAGTGGGTGGCCACCATCTCCTCCGGCGGCAGCTTCACCTACTACCCCGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGGGACAACGCCAAGAACTCCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAGACGGGCCTCCACCGTCGTGGGCACCGATTTCGATGTGTGGGGCCAGGGCACAACCGTGACCGTGTCCTCC
SEQ ID NO: 15 重鏈 （DAPA、CysMab突變加底線） EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWIRQAPGKGLEWVATISSGGSFTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRASTVVGTDFDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFP C PVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVA VSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAL A APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYP C DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 16 DNA重鏈 GAAGTGCAGCTGGTGGAATCTGGCGGCGGACTGGTCAAGCCTGGCGGCTCCCTGAGACTGTCTTGCGCCGCCTCCGGCTTCACCTTCTCCAGCTACGCCATGTCCTGGATCCGGCAGGCCCCTGGCAAGGGACTGGAGTGGGTGGCCACCATCTCCTCCGGCGGCAGCTTCACCTACTACCCCGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGGGACAACGCCAAGAACTCCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAGACGGGCCTCCACCGTCGTGGGCACCGATTTCGATGTGTGGGGCCAGGGCACAACCGTGACCGTGTCCTCCGCCTCCACCAAGGGACCCTCCGTGTTCCCTCTGGCCCCTTCCAGCAAGTCCACCTCTGGCGGCACCGCCGCTCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCTGCCCTGTGACAGTGTCCTGGAACTCCGGCGCTCTGACCTCCGGCGTGCACACCTTCCCTGCCGTGCTGCAGTCCTCCGGCCTGTACTCCCTGTCCTCCGTCGTGACCGTGCCTTCCTCCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCTCCAACACCAAAGTGGACAAGCGGGTGGAACCCAAGTCCTGCGACAAGACCCACACCTGTCCTCCCTGCCCTGCCCCTGAGCTGCTGGGAGGCCCTTCCGTGTTCCTGTTCCCTCCAAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCTGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGCCGTGTCCCACGAGGATCCCGAAGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAACAGTACAACTCCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAAGTGTCCAACAAGGCCCTGGCCGCTCCCATCGAAAAGACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAAGTGTACACACTGCCTCCCAGCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAAGTGTCCCTGACCTGCCTCGTGAAGGGCTTCTACCCCTGCGATATCGCCGTGGAGTGGGAGTCCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCTCCCGTGCTGGACAGCGACGGCTCATTCTTCCTGTACTCCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGAGCCCCGGCAAG
SEQ ID NO: 17 LCDR1（組合的） RASQDIGSSLN
SEQ ID NO: 18 LCDR2（組合的） ATSSLDS
SEQ ID NO: 19 LCDR3（組合的） LQYASSPPT
SEQ ID NO: 20 LCDR1（卡巴特） RASQDIGSSLN
SEQ ID NO: 21 LCDR2（卡巴特） ATSSLDS
SEQ ID NO: 22 LCDR3（卡巴特） LQYASSPPT
SEQ ID NO: 23 LCDR1（喬西亞） SQDIGSS
SEQ ID NO: 24 LCDR2（喬西亞） ATS
SEQ ID NO: 25 LCDR3（喬西亞） YASSPP
SEQ ID NO: 26 LCDR1（IMGT） QDIGSS
SEQ ID NO: 27 LCDR2（IMGT） ATS
SEQ ID NO: 28 LCDR3（IMGT） LQYASSPPT
SEQ ID NO: 29 VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTLTCRASQDIGSSLNWLQQKPGKAIKRLIYATSSLDSGVPSRFSGSRSGTDYTLTISSLQPEDFVVYYCLQYASSPPTFGGGTKLEIK
SEQ ID NO: 30 DNA VL GACATCCAGATGACCCAGAGCCCCTCCAGCCTGTCCGCCTCCGTGGGCGATAGAGTGACCCTGACCTGCCGGGCCTCCCAGGACATCGGCTCCTCCCTGAACTGGCTGCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCATCAAGCGGCTGATCTACGCCACCTCCTCCCTGGACTCCGGCGTGCCCTCCCGGTTCTCTGGCTCCAGATCCGGCACCGACTACACCCTGACCATCTCCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGTGGTGTACTACTGCCTGCAGTACGCCTCCAGCCCTCCCACCTTCGGCGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAG
SEQ ID NO: 31 輕鏈 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTLTCRASQDIGSSLNWLQQKPGKAIKRLIYATSSLDSGVPSRFSGSRSGTDYTLTISSLQPEDFVVYYCLQYASSPPTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO: 32 DNA輕鏈 GACATCCAGATGACCCAGAGCCCCTCCAGCCTGTCCGCCTCCGTGGGCGATAGAGTGACCCTGACCTGCCGGGCCTCCCAGGACATCGGCTCCTCCCTGAACTGGCTGCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCATCAAGCGGCTGATCTACGCCACCTCCTCCCTGGACTCCGGCGTGCCCTCCCGGTTCTCTGGCTCCAGATCCGGCACCGACTACACCCTGACCATCTCCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGTGGTGTACTACTGCCTGCAGTACGCCTCCAGCCCTCCCACCTTCGGCGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAGCGTACGGTGGCCGCTCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGACGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTCACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCATAAGGTGTACGCCTGCGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACAGGGGCGAGTGC
121G12 （人源化 CysMab 、 DAPA ）    
SEQ ID NO: 33 HCDR1（組合的） GFTFSTYAMS
SEQ ID NO: 34 HCDR2（組合的） TISDAGSYSYYPDNVKG
SEQ ID NO: 35 HCDR3（組合的） RGSRYEEYYVMDY
SEQ ID NO: 36 HCDR1（卡巴特） TYAMS
SEQ ID NO: 37 HCDR2（卡巴特） TISDAGSYSYYPDNVKG
SEQ ID NO: 38 HCDR3（卡巴特） RGSRYEEYYVMDY
SEQ ID NO: 39 HCDR1（喬西亞） GFTFSTY
SEQ ID NO: 40 HCDR2（喬西亞） SDAGSY
SEQ ID NO: 41 HCDR3（喬西亞） RGSRYEEYYVMDY
SEQ ID NO: 42 HCDR1（IMGT） GFTFSTYA
SEQ ID NO: 43 HCDR2（IMGT） ISDAGSYS
SEQ ID NO: 44 HCDR3（IMGT） ARRGSRYEEYYVMDY
SEQ ID NO: 45 VH EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMSWVRQAPGKGLEWVATISDAGSYSYYPDNVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGSRYEEYYVMDYWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO: 46 DNA VH GAAGTGCAGCTGGTGGAATCTGGCGGCGGACTGGTCAAGCCTGGCGGCTCCCTGAGACTGTCTTGCGCCGCCTCCGGCTTCACCTTCTCCACCTACGCCATGTCCTGGGTCCGACAGGCCCCTGGAAAGGGCCTGGAGTGGGTGGCCACCATCTCCGACGCCGGCTCCTACTCCTACTACCCCGACAACGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGGGACAACGCCAAGAACTCCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGACGGGGCTCCAGATACGAAGAGTACTACGTGATGGACTACTGGGGCCAGGGCACAACCGTGACCGTGTCCTCC
SEQ ID NO: 47 重鏈 （DAPA、CysMab突變加底線） EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMSWVRQAPGKGLEWVATISDAGSYSYYPDNVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGSRYEEYYVMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFP C PVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVV A VSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAL A APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYP C DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 48 DNA重鏈 GAAGTGCAGCTGGTGGAATCTGGCGGCGGACTGGTCAAGCCTGGCGGCTCCCTGAGACTGTCTTGCGCCGCCTCCGGCTTCACCTTCTCCACCTACGCCATGTCCTGGGTCCGACAGGCCCCTGGAAAGGGCCTGGAGTGGGTGGCCACCATCTCCGACGCCGGCTCCTACTCCTACTACCCCGACAACGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGGGACAACGCCAAGAACTCCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGACGGGGCTCCAGATACGAAGAGTACTACGTGATGGACTACTGGGGCCAGGGCACAACCGTGACCGTGTCCTCCGCCTCCACCAAGGGACCCTCCGTGTTCCCTCTGGCCCCTTCCAGCAAGTCCACCTCTGGCGGCACCGCCGCTCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCTGCCCTGTGACAGTGTCCTGGAACTCCGGCGCTCTGACCTCCGGCGTGCACACCTTCCCTGCCGTGCTGCAGTCCTCCGGCCTGTACTCCCTGTCCTCCGTCGTGACCGTGCCTTCCTCCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCTCCAACACCAAAGTGGACAAGCGGGTGGAACCCAAGTCCTGCGACAAGACCCACACCTGTCCTCCCTGCCCTGCCCCTGAGCTGCTGGGAGGCCCTTCCGTGTTCCTGTTCCCTCCAAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCTGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGCCGTGTCCCACGAGGATCCCGAAGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAACAGTACAACTCCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAAGTGTCCAACAAGGCCCTGGCCGCTCCCATCGAAAAGACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAAGTGTACACACTGCCTCCCAGCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAAGTGTCCCTGACCTGCCTCGTGAAGGGCTTCTACCCCTGCGATATCGCCGTGGAGTGGGAGTCCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCATTCTTCCTGTACTCCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGAGCCCCGGCAAG
SEQ ID NO: 49 LCDR1（組合的） RASQSISNNLH
SEQ ID NO: 50 LCDR2（組合的） YASQSIS
SEQ ID NO: 51 LCDR3（組合的） QQSSSWLT
SEQ ID NO: 52 LCDR1（卡巴特） RASQSISNNLH
SEQ ID NO: 53 LCDR2（卡巴特） YASQSIS
SEQ ID NO: 54 LCDR3（卡巴特） QQSSSWLT
SEQ ID NO: 55 LCDR1（喬西亞） SQSISNN
SEQ ID NO: 56 LCDR2（喬西亞） YAS
SEQ ID NO: 57 LCDR3（喬西亞） SSSWL
SEQ ID NO: 58 LCDR1（IMGT） QSISNN
SEQ ID NO: 59 LCDR2（IMGT） YAS
SEQ ID NO: 60 LCDR3（IMGT） QQSSSWLT
SEQ ID NO: 61 VL EIVLTQSPATLSVSPGERVTLSCRASQSISNNLHWYQQKPGQAPRLLIKYASQSISGIPARFSGSGSGTDFTLTISSVEPEDFGVYFCQQSSSWLTFGQGTKLEIK
SEQ ID NO: 62 DNA VL GAGATCGTGCTGACACAGTCCCCTGCCACCCTGTCTGTGTCTCCCGGCGAGAGAGTGACCCTGTCCTGCCGGGCCTCCCAGTCCATCTCCAACAACCTGCACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCCCCTCGGCTGCTGATTAAGTACGCCTCCCAGAGCATCTCCGGCATCCCTGCCAGATTCTCCGGCTCCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCTCCAGCGTGGAACCCGAGGACTTCGGCGTGTACTTCTGCCAGCAGTCCTCCTCCTGGCTGACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAAATCAAG
SEQ ID NO: 63 輕鏈 EIVLTQSPATLSVSPGERVTLSCRASQSISNNLHWYQQKPGQAPRLLIKYASQSISGIPARFSGSGSGTDFTLTISSVEPEDFGVYFCQQSSSWLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO: 64 DNA輕鏈 GAGATCGTGCTGACACAGTCCCCTGCCACCCTGTCTGTGTCTCCCGGCGAGAGAGTGACCCTGTCCTGCCGGGCCTCCCAGTCCATCTCCAACAACCTGCACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCCCCTCGGCTGCTGATTAAGTACGCCTCCCAGAGCATCTCCGGCATCCCTGCCAGATTCTCCGGCTCCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCTCCAGCGTGGAACCCGAGGACTTCGGCGTGTACTTCTGCCAGCAGTCCTCCTCCTGGCTGACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAAATCAAGCGTACGGTGGCCGCTCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGACGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTCACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCATAAGGTGTACGCCTGCGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACAGGGGCGAGTGC
674J13 （人源化， CysMab DAPA ）    
SEQ ID NO: 65 HCDR1（組合的） GYSITSGYSWH
SEQ ID NO: 66 HCDR2（組合的） HIHSSGSTNYNPSLKS
SEQ ID NO: 67 HCDR3（組合的） GGVQAFAY
SEQ ID NO: 68 HCDR1（卡巴特） SGYSWH
SEQ ID NO: 69 HCDR2（卡巴特） HIHSSGSTNYNPSLKS
SEQ ID NO: 70 HCDR3（卡巴特） GGVQAFAY
SEQ ID NO: 71 HCDR1（喬西亞） GYSITSGY
SEQ ID NO: 72 HCDR2（喬西亞） HSSGS
SEQ ID NO: 73 HCDR3（喬西亞） GGVQAFAY
SEQ ID NO: 74 HCDR1（IMGT） GYSITSGYS
SEQ ID NO: 75 HCDR2（IMGT） IHSSGST
SEQ ID NO: 76 HCDR3（IMGT） ARGGVQAFAY
SEQ ID NO: 77 VH DVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGYSITSGYSWHWIRQHPGKGLEWMAHIHSSGSTNYNPSLKSRITISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGGVQAFAYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 78 DNA VH GACGTGCAGCTGCAGGAATCTGGCCCTGGCCTGGTCAAGCCCTCCCAGACCCTGTCCCTGACCTGCACCGTGTCCGGCTACTCTATCACCTCCGGCTACAGCTGGCACTGGATCCGGCAGCACCCCGGCAAGGGCCTGGAATGGATGGCCCACATCCACTCCTCCGGCTCCACCAACTACAACCCCAGCCTGAAGTCCCGGATCACCATCTCCCGGGACACCTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGTCCTCCGTGACCGCCGCTGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAGAGGCGGCGTGCAGGCCTTCGCTTATTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTGTCCTCC
SEQ ID NO: 79 重鏈 （DAPA、CysMab突變加底線） DVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGYSITSGYSWHWIRQHPGKGLEWMAHIHSSGSTNYNPSLKSRITISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGGVQAFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFP C PVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVV A VSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAL A APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYP C DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 80 DNA重鏈 GACGTGCAGCTGCAGGAATCTGGCCCTGGCCTGGTCAAGCCCTCCCAGACCCTGTCCCTGACCTGCACCGTGTCCGGCTACTCTATCACCTCCGGCTACAGCTGGCACTGGATCCGGCAGCACCCCGGCAAGGGCCTGGAATGGATGGCCCACATCCACTCCTCCGGCTCCACCAACTACAACCCCAGCCTGAAGTCCCGGATCACCATCTCCCGGGACACCTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGTCCTCCGTGACCGCCGCTGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAGAGGCGGCGTGCAGGCCTTCGCTTATTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTGTCCTCCGCCAGCACCAAGGGACCCTCCGTGTTCCCTCTGGCCCCTTCCAGCAAGTCCACCTCTGGCGGCACCGCCGCTCTGGGCTGCCTCGTGAAGGACTACTTCCCCTGCCCCGTGACCGTGTCCTGGAACTCCGGCGCTCTGACCTCCGGCGTGCACACCTTCCCTGCCGTGCTGCAGTCCTCCGGCCTGTACTCCCTGTCCAGCGTCGTGACCGTGCCCTCCAGCTCTCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCTCCAACACCAAAGTGGACAAGCGGGTGGAACCCAAGTCCTGCGACAAGACCCACACCTGTCCTCCCTGCCCTGCCCCTGAGCTGCTGGGAGGCCCTTCCGTGTTCCTGTTCCCTCCAAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCTGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGCCGTGTCCCACGAGGATCCCGAAGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAACAGTACAACTCCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAAGTGTCCAACAAGGCCCTGGCCGCTCCCATCGAAAAGACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAAGTGTACACACTGCCTCCCAGCCGGGAAGAGATGACCAAGAATCAAGTGTCCCTGACCTGTCTGGTCAAGGGCTTCTACCCCTGCGATATCGCCGTGGAGTGGGAGTCCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCATTCTTCCTGTACTCCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAG
SEQ ID NO: 81 LCDR1（組合的） SASSSVIYMH
SEQ ID NO: 82 LCDR2（組合的） DTSKLAS
SEQ ID NO: 83 LCDR3（組合的） QQWSSNPLT
SEQ ID NO: 84 LCDR1（卡巴特） SASSSVIYMH
SEQ ID NO: 85 LCDR2（卡巴特） DTSKLAS
SEQ ID NO: 86 LCDR3（卡巴特） QQWSSNPLT
SEQ ID NO: 87 LCDR1（喬西亞） SSSVIY
SEQ ID NO: 88 LCDR2（喬西亞） DTS
SEQ ID NO: 89 LCDR3（喬西亞） WSSNPL
SEQ ID NO: 90 LCDR1（IMGT） SSVIY
SEQ ID NO: 91 LCDR2（IMGT） DTS
SEQ ID NO: 92 LCDR3（IMGT） QQWSSNPLT
SEQ ID NO: 93 VL EIVLTQSPATLSASPGERVTMSCSASSSVIYMHWYQQKPGQAPRRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTDYTLTISSMEPEDAAVYYCQQWSSNPLTFGQGTKLEIK
SEQ ID NO: 94 DNA VL GAGATCGTGCTGACACAGTCCCCTGCCACCCTGTCCGCCTCTCCAGGCGAGCGCGTGACAATGTCCTGCTCCGCCTCCTCCTCCGTGATCTACATGCACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCCCCTCGGCGGTGGATCTACGATACCTCCAAGCTGGCCTCCGGCGTGCCCGCCAGATTCTCCGGCTCTGGCTCTGGCACCGACTACACCCTGACCATCTCCAGCATGGAACCCGAGGACGCCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGTGGTCCTCCAACCCTCTGACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAAATCAAG
SEQ ID NO: 95 輕鏈 EIVLTQSPATLSASPGERVTMSCSASSSVIYMHWYQQKPGQAPRRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTDYTLTISSMEPEDAAVYYCQQWSSNPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO: 96 DNA輕鏈 GAGATCGTGCTGACACAGTCCCCTGCCACCCTGTCCGCCTCTCCAGGCGAGCGCGTGACAATGTCCTGCTCCGCCTCCTCCTCCGTGATCTACATGCACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCCCCTCGGCGGTGGATCTACGATACCTCCAAGCTGGCCTCCGGCGTGCCCGCCAGATTCTCCGGCTCTGGCTCTGGCACCGACTACACCCTGACCATCTCCAGCATGGAACCCGAGGACGCCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGTGGTCCTCCAACCCTCTGACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAAATCAAGCGTACGGTGGCCGCTCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGACGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTCACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCATAAGGTGTACGCCTGCGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACAGGGGCGAGTGC
本發明之其他抗體包括如下那些抗體，其中胺基酸或編碼胺基酸的核酸已經突變，但與表1和表4中所述之序列具有至少60%、70%、80%、90%或95%同一性。在一些實施方式中，當與表1和表4中所述序列中繪示的可變區相比時，在可變區中1、2、3、4或5個胺基酸已經突變，但同時保留與表1和表4中列出的抗體基本上相同的治療活性。
由於該等抗體中的每一種都可以結合CCR7，因此VH、VL、全長輕鏈和全長重鏈序列（胺基酸序列和編碼胺基酸序列的核苷酸序列）可以是「混合且匹配的」以產生本發明之其他CCR7結合抗體。可以使用本領域已知的結合測定（例如，ELISA和實例部分中描述的其他測定）來測試此類「混合且匹配的」CCR7結合抗體。當該等鏈被混合且匹配時，來自特定VH/VL配對的VH序列應當用結構上相似的VH序列替代。同樣，來自特定全長重鏈/全長輕鏈配對的全長重鏈序列應當用結構上相似的全長重鏈序列替代。同樣，來自特定VH/VL配對的VL序列應當用結構上相似的VL序列替代。同樣，來自特定全長重鏈/全長輕鏈配對的全長輕鏈序列應當用結構上相似的全長輕鏈序列替代。因此，在一個方面，本發明提供了一種分離的單株抗體或其抗原結合區，該單株抗體或其抗原結合區具有：重鏈可變區，該重鏈可變區包含選自由SEQ ID NO: 13、45、77和608組成之群組的胺基酸序列；和輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含選自由SEQ ID NO: 29、61、93和624組成之群組的胺基酸序列；其中抗體特異性結合CCR7。
在另一方面，本發明提供了 (i) 一種分離的單株抗體，該單株抗體具有：全長重鏈，該全長重鏈包含選自由SEQ ID NO: 15、47、79和610組成之群組、已針對在哺乳動物表現系統的細胞中的表現進行優化的胺基酸序列；和全長輕鏈，該全長輕鏈包含選自由SEQ ID NO: 31、63、95和626組成之群組、已針對在哺乳動物細胞中的表現進行優化的胺基酸序列；或 (ii) 一種包含其抗原結合部分的功能性蛋白。
在另一個方面，本發明提供了CCR7結合抗體，該CCR7結合抗體包含如表1和表4中所述之重鏈和輕鏈CDR1、CDR2和CDR3、或其組合。抗體的VH CDR1的胺基酸序列例如示於SEQ ID NO: 1、4、7、10、33、36、39、42、65、68、71和74中。抗體的VH CDR2的胺基酸序列例如示於SEQ ID NO: 2、5、8、11、34、37、40、43、66、69、72和75中。抗體的VH CDR3的胺基酸序列例如示於SEQ ID NO: 3、6、9、12、35、38、41、44、67、70、73和76中。抗體的VL CDR1的胺基酸序列例如示於SEQ ID NO: 17、20、23、26、49、52、55、58、81、84、87和90中。抗體的VL CDR2的胺基酸序列例如示於SEQ ID NO: 18、21、24、27、50、53、56、59、82、85、88和91中。抗體的VL CDR3的胺基酸序列例如示於SEQ ID NO: 19、22、25、28、51、54、57、60、83、86、89和92中。
鑒於該等抗體中的每一種都可以結合CCR7並且抗原結合特異性主要由CDR1、2和3區提供，VH CDR1、CDR2和CDR3序列以及VL CDR1、CDR2和CDR3序列可以「混合且匹配」（即，來自不同抗體的CDR可以被混合且匹配）。可以使用本領域已知的結合測定和實例中描述的那些結合測定（例如，ELISA）來測試此類「混合且匹配的」CCR7結合抗體。當混合並匹配VH CDR序列時，來自特定VH序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列應當置換為一種或多種結構上相似的CDR序列。同樣，當混合並匹配VL CDR序列時，來自特定VL序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列應當置換為一種或多種結構上相似的CDR序列。對於熟悉該項技術者來說容易清楚的是，可以藉由用來自本文針對本發明單株抗體所示的CDR序列的結構相似序列取代一個或多個VH和/或VL CDR區序列來產生新穎的VH和VL序列。
因此，在一些實施方式中，本發明提供了一種分離的單株抗體或其抗原結合區，該分離的單株抗體或其抗原結合區包含重鏈CDR1，該重鏈CDR1包含選自由SEQ ID NO: 1、4、7、10、33、36、39、42、65、68、71、74、596、599、602和605組成之群組的胺基酸序列；重鏈CDR2，該重鏈CDR2包含選自由SEQ ID NO: 2、5、8、11、34、37、40、43、66、69、72、75、597、600、603和606組成之群組的胺基酸序列；重鏈CDR3，該重鏈CDR3包含選自由SEQ ID NO: 3、6、9、12、35、38、41、44、67、70、73、76、598、601、604和607組成之群組的胺基酸序列；輕鏈CDR1，該輕鏈CDR1包含選自由SEQ ID NO: 17、20、23、26、49、52、55、58、81、84、87、90、612、615、618和621組成之群組的胺基酸序列；輕鏈CDR2，該輕鏈CDR2包含選自由SEQ ID NO: 18、21、24、27、50、53、56、59、82、85、88、91、613、616、619和622組成之群組的胺基酸序列；以及輕鏈CDR3，該輕鏈CDR3包含選自由SEQ ID NO: 19、22、25、28、51、54、57、60、83、86、89、92、614、617、620和623組成之群組的胺基酸序列；其中抗體特異性結合CCR7。
在一個具體實施方式中，特異性結合CCR7的抗體或抗體片段（例如抗原結合片段）包含SEQ ID NO: 1的重鏈CDR1；SEQ ID NO: 2的重鏈CDR2；SEQ ID NO: 3的重鏈CDR3；SEQ ID NO: 17的輕鏈CDR1；SEQ ID NO: 18的輕鏈CDR2；和SEQ ID NO: 19的輕鏈CDR3。
在一個具體實施方式中，特異性結合CCR7的抗體或抗體片段（例如抗原結合片段）包含SEQ ID NO: 4的重鏈CDR1；SEQ ID NO: 5的重鏈CDR2；SEQ ID NO: 6的重鏈CDR3；SEQ ID NO: 20的輕鏈CDR1；SEQ ID NO: 21的輕鏈CDR2；和SEQ ID NO: 22的輕鏈CDR3。
在一個具體實施方式中，特異性結合CCR7的抗體或抗體片段（例如抗原結合片段）包含SEQ ID NO: 7的重鏈CDR1；SEQ ID NO: 8的重鏈CDR2；SEQ ID NO: 9的重鏈CDR3；SEQ ID NO: 23的輕鏈CDR1；SEQ ID NO: 24的輕鏈CDR2；和SEQ ID NO: 25的輕鏈CDR3。
在一個具體實施方式中，特異性結合CCR7的抗體或抗體片段（例如抗原結合片段）包含SEQ ID NO: 10的重鏈CDR1；SEQ ID NO: 11的重鏈CDR2；SEQ ID NO: 12的重鏈CDR3；SEQ ID NO: 26的輕鏈CDR1；SEQ ID NO: 27的輕鏈CDR2；和SEQ ID NO: 28的輕鏈CDR3。
在一個具體實施方式中，特異性結合CCR7的抗體或抗體片段（例如抗原結合片段）包含SEQ ID NO: 33的重鏈CDR1；SEQ ID NO: 34的重鏈CDR2；SEQ ID NO: 35的重鏈CDR3；SEQ ID NO: 49的輕鏈CDR1；SEQ ID NO: 50的輕鏈CDR2；和SEQ ID NO: 51的輕鏈CDR3。
在一個具體實施方式中，特異性結合CCR7的抗體或抗體片段（例如抗原結合片段）包含SEQ ID NO: 36的重鏈CDR1；SEQ ID NO: 37的重鏈CDR2；SEQ ID NO: 38的重鏈CDR3；SEQ ID NO: 52的輕鏈CDR1；SEQ ID NO: 53的輕鏈CDR2；和SEQ ID NO: 54的輕鏈CDR3。
在一個具體實施方式中，特異性結合CCR7的抗體或抗體片段（例如抗原結合片段）包含SEQ ID NO: 39的重鏈CDR1；SEQ ID NO: 40的重鏈CDR2；SEQ ID NO: 41的重鏈CDR3；SEQ ID NO: 55的輕鏈CDR1；SEQ ID NO: 56的輕鏈CDR2；和SEQ ID NO: 57的輕鏈CDR3。
在一個具體實施方式中，特異性結合CCR7的抗體或抗體片段（例如抗原結合片段）包含SEQ ID NO: 42的重鏈CDR1；SEQ ID NO: 43的重鏈CDR2；SEQ ID NO: 44的重鏈CDR3；SEQ ID NO: 58的輕鏈CDR1；SEQ ID NO: 59的輕鏈CDR2；和SEQ ID NO: 60的輕鏈CDR3。
在一個具體實施方式中，特異性結合CCR7的抗體或抗體片段（例如抗原結合片段）包含SEQ ID NO: 65的重鏈CDR1；SEQ ID NO: 66的重鏈CDR2；SEQ ID NO: 67的重鏈CDR3；SEQ ID NO: 81的輕鏈CDR1；SEQ ID NO: 82的輕鏈CDR2；和SEQ ID NO: 83的輕鏈CDR3。
在一個具體實施方式中，特異性結合CCR7的抗體或抗體片段（例如抗原結合片段）包含SEQ ID NO: 68的重鏈CDR1；SEQ ID NO: 69的重鏈CDR2；SEQ ID NO: 70的重鏈CDR3；SEQ ID NO: 84的輕鏈CDR1；SEQ ID NO: 85的輕鏈CDR2；和SEQ ID NO: 86的輕鏈CDR3。
在一個具體實施方式中，特異性結合CCR7的抗體或抗體片段（例如抗原結合片段）包含SEQ ID NO: 71的重鏈CDR1；SEQ ID NO: 72的重鏈CDR2；SEQ ID NO: 73的重鏈CDR3；SEQ ID NO: 87的輕鏈CDR1；SEQ ID NO: 88的輕鏈CDR2；和SEQ ID NO: 89的輕鏈CDR3。
在一個具體實施方式中，特異性結合CCR7的抗體或抗體片段（例如抗原結合片段）包含SEQ ID NO: 74的重鏈CDR1；SEQ ID NO: 75的重鏈CDR2；SEQ ID NO: 76的重鏈CDR3；SEQ ID NO: 90的輕鏈CDR1；SEQ ID NO: 91的輕鏈CDR2；和SEQ ID NO: 92的輕鏈CDR3。
在一個具體實施方式中，特異性結合CCR7的抗體或抗體片段（例如抗原結合片段）包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含SEQ ID NO: 596的HCDR1、SEQ ID NO:597的HCDR2、和SEQ ID NO: 598的HCDR3；和輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 612的LCDR1、SEQ ID NO: 613的LCDR2、和SEQ ID NO: 614的LCDR3。
在一個具體實施方式中，特異性結合CCR7的抗體或抗體片段（例如抗原結合片段）包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含SEQ ID NO: 599的HCDR1、SEQ ID NO:600的HCDR2、和SEQ ID NO: 601的HCDR3；和輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 615的LCDR1、SEQ ID NO: 616的LCDR2、和SEQ ID NO: 617的LCDR3。
在一個具體實施方式中，特異性結合CCR7的抗體或抗體片段（例如抗原結合片段）包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含SEQ ID NO: 602的HCDR1、SEQ ID NO:603的HCDR2和SEQ ID NO: 604的HCDR3；和輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 618的LCDR1、SEQ ID NO: 619的LCDR2、和SEQ ID NO: 620的LCDR3。
在一個具體實施方式中，特異性結合CCR7的抗體或抗體片段（例如抗原結合片段）包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含SEQ ID NO: 605的HCDR1、SEQ ID NO:606的HCDR2、和SEQ ID NO: 607的HCDR3；和輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 621的LCDR1、SEQ ID NO: 622的LCDR2、和SEQ ID NO: 623的LCDR3。
在一個具體實施方式中，特異性結合CCR7的抗體或抗體片段（例如，抗原結合片段）包含含有SEQ ID NO: 13的胺基酸序列的重鏈可變區（VH）、和含有SEQ ID NO: 29的胺基酸序列的輕鏈可變區（VL）。
在一個具體實施方式中，特異性結合CCR7的抗體或抗體片段（例如，抗原結合片段）包含含有SEQ ID NO: 45的胺基酸序列的重鏈可變區（VH）、和含有SEQ ID NO: 61的胺基酸序列的輕鏈可變區（VL）。
在一個具體實施方式中，特異性結合CCR7的抗體或抗體片段（例如，抗原結合片段）包含含有SEQ ID NO: 77的胺基酸序列的重鏈可變區（VH）、和含有SEQ ID NO: 93的胺基酸序列的輕鏈可變區（VL）。
在一個具體實施方式中，特異性結合CCR7的抗體或抗體片段（例如，抗原結合片段）包含含有SEQ ID NO: 608的胺基酸序列的重鏈可變區（VH）、和含有SEQ ID NO: 624的胺基酸序列的輕鏈可變區（VL）。
在一個具體實施方式中，特異性結合CCR7的抗體或抗體片段（例如，抗原結合片段）包含含有SEQ ID NO: 15的胺基酸序列的重鏈、和含有SEQ ID NO: 31的胺基酸序列的輕鏈。
在一個具體實施方式中，特異性結合CCR7的抗體或抗體片段（例如，抗原結合片段）包含含有SEQ ID NO: 47的胺基酸序列的重鏈、和含有SEQ ID NO: 63的胺基酸序列的輕鏈。
在一個具體實施方式中，特異性結合CCR7的抗體或抗體片段（例如，抗原結合片段）包含含有SEQ ID NO: 79的胺基酸序列的重鏈、和含有SEQ ID NO: 95的胺基酸序列的輕鏈。
在一個具體實施方式中，特異性結合CCR7的抗體或抗體片段（例如，抗原結合片段）包含含有SEQ ID NO: 610的胺基酸序列的重鏈、和含有SEQ ID NO: 626的胺基酸序列的輕鏈。
在某些實施方式中，特異性結合CCR7的抗體係表1和表4中所述之抗體或抗體片段（例如，抗原結合片段）。1. 對表位和結合相同表位的抗體的鑒定
本發明還提供了特異性結合與表1和表4中所述之抗CCR7抗體相同的表位、或與表1和表4中所述之抗體交叉競爭的抗體和抗體片段（例如，抗原結合片段）。因此可以基於在CCR7結合測定（例如，經由BIACORE或熟悉該項技術者已知用於測量結合的測定）中與本發明之其他抗體交叉競爭（例如，以統計顯著方式競爭性抑制結合）的能力來鑒定另外的抗體和抗體片段（例如，抗原結合片段）。測試抗體抑制本發明之抗體和抗體片段（例如，抗原結合片段）與CCR7（例如，人CCR7）結合的能力表明，測試抗體可以與這種抗體或抗體片段（例如，抗原結合片段）競爭結合CCR7；根據非限制性理論，這種抗體可以結合CCR7蛋白上與該抗體競爭的抗體或抗體片段（例如，抗原結合片段）相同或相關（例如，結構上相似或空間上接近或重疊）的表位。在某些實施方式中，結合CCR7上與表1和表4中所述抗體或抗體片段（例如，抗原結合片段）相同的表位結合的抗體係人單株抗體或人源化單株抗體。可如本文所述那樣製備和分離此類人單株抗體或人源化單株抗體。2. 對 Fc 區框架的進一步改變
本發明之免疫軛合物可以包含經修飾的抗體或其抗原結合片段，該經修飾的抗體或其抗原結合片段進一步在VH和/或VL內部包含對框架殘基的修飾，例如以改善抗體的特性。在一些實施方式中，進行這種框架修飾以降低抗體的免疫原性。例如，一種方法係將一個或多個框架殘基「回復突變」為相應的種系序列。更確切地，已經歷體細胞突變的抗體可以含有與衍生抗體的種系序列不同的框架殘基。可以藉由將抗體框架序列與衍生抗體的種系序列進行比較來鑒定此類殘基。為了使框架區序列恢復為其種系組態，可以藉由例如定點誘變將體細胞突變「回復突變」為種系序列。此類「回復突變的」抗體也旨在為本發明所涵蓋。
另一種類型的框架修飾包括使框架區內或甚至一個或多個CDR區內的一個或多個殘基突變以去除T細胞表位，從而降低抗體的潛在免疫原性。此方法也稱為「去免疫化」，並且在Carr等人的美國專利公開號20030153043中有進一步詳細描述。
除了在框架或CDR區內進行的修飾之外或在於框架或CDR區內進行的修飾的替代方案中，可以將本發明之抗體工程化以包含Fc區內的修飾，典型地是為了改變抗體的一種或多種功能特性，如血清半衰期、補體結合、Fc受體結合和/或抗原依賴性細胞毒性（ADCC）。此外，本發明之抗體可以經化學修飾（例如，一個或多個化學部分可以附接至抗體）或經修飾以改變其糖基化，從而再次改變抗體的一種或多種功能特性。以下更詳細地描述了該等實施方式中的每一個。
在一個實施方式中，修飾CH1的鉸鏈區，使得鉸鏈區中半胱胺酸殘基的數目改變，例如增加或減少。該方法在Bodmer等人的美國專利號5,677,425中進一步描述。改變CH1鉸鏈區中半胱胺酸殘基的數目，以便例如促進輕鏈和重鏈的組裝或增加或降低抗體的穩定性。
在一些實施方式中，本文揭露的抗體或抗體片段包含經修飾或工程化的胺基酸殘基，例如一個或多個半胱胺酸殘基，以作為用於與藥物部分軛合的位點（Junutula JR等人: Nat Biotechnol [自然生物技術] 2008, 26:925-932）。在一個實施方式中，本發明提供了一種經修飾的抗體或抗體片段，該經修飾的抗體或抗體片段包含在本文所述之位置處用半胱胺酸對一個或多個胺基酸的取代。用於半胱胺酸取代的位點係在抗體或抗體片段的恒定區中並且因此適用於多種抗體或抗體片段，並且選擇位點以提供穩定且均質的軛合物。經修飾的抗體或片段可以具有一個、兩個或更多個半胱胺酸取代，並且該等取代可以與如本文所述之其他修飾和軛合方法組合使用。用於將半胱胺酸插入在抗體的特定位置處之方法係本領域已知的，參見例如Lyons等人, (1990) Protein Eng. [蛋白質工程], 3:703-708、WO 2011/005481、WO2014/124316、WO 2015/138615。在某些實施方式中，經修飾的抗體包含在其選自以下位置的恒定區上用半胱胺酸對一個或多個胺基酸的取代：抗體的重鏈的位置117、119、121、124、139、152、153、155、157、164、169、171、174、189、191、195、197、205、207、246、258、269、274、286、288、290、292、293、320、322、326、333、334、335、337、344、355、360、375、382、390、392、398、400和422，並且其中位置係根據EU系統編號的。在一些實施方式中，經修飾的抗體或抗體片段包含在其選自以下位置的恒定區上用半胱胺酸對一個或多個胺基酸的取代：抗體或抗體片段的輕鏈的位置107、108、109、114、129、142、143、145、152、154、156、159、161、165、168、169、170、182、183、197、199和203，其中位置係根據EU系統編號的，並且其中輕鏈係人κ輕鏈。在某些實施方式中，經修飾的抗體或其抗體片段包含在其恒定區上用半胱胺酸對兩個或更多個胺基酸的取代組合，其中組合包括在抗體重鏈的位置375、抗體重鏈的位置152、抗體重鏈的位置360、或抗體輕鏈的位置107處的取代，並且其中位置係根據EU系統編號的。在某些實施方式中，經修飾的抗體或其抗體片段包含在其恒定區上用半胱胺酸對一個胺基酸的取代，其中取代係抗體重鏈的位置375、抗體重鏈的位置152、抗體重鏈的位置360、抗體輕鏈的位置107、抗體輕鏈的位置165或抗體輕鏈的位置159並且其中位置係根據EU系統編號的，並且其中輕鏈係κ鏈。在具體實施方式中，經修飾的抗體或其抗體片段包含在其恒定區上用半胱胺酸對兩個胺基酸的取代組合，其中組合包括在抗體重鏈的位置375和抗體重鏈的位置152處的取代，其中位置係根據EU系統編號的。在具體實施方式中，經修飾的抗體或其抗體片段包含在抗體重鏈的位置360處用半胱胺酸對一個胺基酸的取代，其中位置係根據EU系統編號的。在其他具體實施方式中，經修飾的抗體或其抗體片段包含在抗體輕鏈的位置107處用半胱胺酸對一個胺基酸的取代並且其中位置係根據EU系統編號的，並且其中輕鏈係κ鏈。
在另外的實施方式中，可用於本發明之免疫軛合物的抗體或抗體片段（例如，抗原結合片段）包括經修飾或工程化的抗體，如以下抗體，該抗體經修飾以引入一個或多個其他反應性胺基酸（除半胱胺酸外）（包括Pcl、吡咯離胺酸、肽標籤（如S6、A1和ybbR標籤）和非天然胺基酸）以替代天然序列的至少一個胺基酸，從而在抗體或抗原結合片段上提供用於與具有互補反應性的藥物部分或連接子-藥物部分軛合的反應位點。例如，可以修飾抗體或抗體片段以摻入Pcl或吡咯離胺酸（W. Ou等人, (2011) PNAS [美國國家科學院院刊] 108 (26), 10437-10442；WO 2014124258）或非天然胺基酸（J.Y. Axup等人, Proc Natl Acad Sci U S A [美國國家科學院院刊], 109 (2012), 第16101-16106頁；對於綜述參見C.C.Liu和P.G.Schultz (2010) Annu Rev Biochem[生物化學年鑒] 79, 413-444；C.H.Kim等人, (2013), Curr Opin Chem Biol. [化學生物學研究現狀] 17, 412-419）作為與藥物軛合的位點。類似地，可以將用於酶學軛合方法的肽標籤引入到抗體中（Strop P.等人, Chem Biol. [化學生物學] 2013, 20(2):161-7；Rabuka D., Curr Opin Chem Biol. [化學生物學新見] 2010年12月;14(6):790-6；Rabuka D等人, Nat Protoc. [自然實驗手冊] 2012, 7(6):1052-67）。一個其他實例係使用4’-磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶（PPTase）用於輔酶A類似物的軛合（WO 2013184514）和（Grünewald等人, (2015) Bioconjugate Chem. [生物軛合化學] 26 (12), 2554-62）。用於將此類經修飾或工程化的抗體與有效負載或連接子-有效負載組合軛合之方法係本領域已知的。
在另一個實施方式中，使抗體的Fc鉸鏈區突變以降低抗體的生物半衰期。更具體地，將一個或多個胺基酸突變引入到Fc鉸鏈片段的CH2-CH3結構域介面區域中，使得抗體具有相對於天然Fc鉸鏈結構域SpA結合而言受損的葡萄球菌蛋白質A（SpA）結合。該方法在Ward等人的美國專利號6,165,745中進一步詳細描述。
在又其他實施方式中，藉由用不同的胺基酸殘基替代至少一個胺基酸殘基來改變Fc區，以改變抗體的效應子功能。例如，可以用不同的胺基酸殘基置換一個或多個胺基酸，使得抗體對效應配位基具有改變的親和力，但保留親本抗體的抗原結合能力。改變親和力的效應配位基可以是例如Fc受體或補體的C1組分。該方法描述於例如Winter等人的美國專利號5,624,821和5,648,260中。
在另一個實施方式中，選自胺基酸殘基的一個或多個胺基酸可以用不同的胺基酸殘基置換，使得抗體具有改變的C1q結合和/或降低或消除的補體依賴性細胞毒性（CDC）。該方法描述於例如Idusogie等人的美國專利號6,194,551中。
在另一個實施方式中，改變一個或多個胺基酸殘基，從而改變抗體固定補體的能力。該方法例如描述於Bodmer等人的PCT公開WO 94/29351中。異型胺基酸殘基包括但不限於IgG1、IgG2和IgG3亞類的重鏈的恒定區以及κ同種型的輕鏈的恒定區，如由Jefferis等人, MAbs. [單株抗體] 1:332-338 (2009)所述之。
含有此類突變的抗體融合蛋白複合物介導降低的或沒有的抗體依賴性細胞毒性（ADCC）或補體依賴性細胞毒性（CDC）。在一些實施方式中，IgG1恒定區的胺基酸殘基L234和L235被取代為A234和A235。在一些實施方式中，IgG1恒定區的胺基酸殘基N267被取代為A267。在一些實施方式中，IgG1恒定區的胺基酸殘基D265和P329被取代為A265和A329。在某些實施方式中，免疫球蛋白重鏈視需要包含選自以下中任一種的賦予降低的效應子功能的突變或突變組合：D265A、P329A、P329G、N297A、D265A/P329A、D265A/N297A、L234/L235A、P329A/L234A/L235A、和P329G/L234A/L235A。在具體實施方式中，免疫軛合物包含這樣的免疫球蛋白重鏈，該免疫球蛋白重鏈包含選自以下中任一種的賦予降低的效應子功能的突變或突變組合：D265A、P329A、P329G、N297A、D265A/P329A、D265A/N297A、L234/L235A、P329A/L234A/L235A、和P329G/L234A/L235A。
在另一個實施方式中，改變一個或多個胺基酸殘基，從而改變抗體固定補體的能力。該方法例如描述於Bodmer等人的PCT公開WO 94/29351中。在一個具體實施方式中，本發明之抗體或其抗原結合片段的一個或多個胺基酸被一個或多個異型胺基酸殘基替代。異型胺基酸殘基也包括但不限於IgG1、IgG2和IgG3亞類的重鏈的恒定區以及κ同種型的輕鏈的恒定區，如由Jefferis等人, MAbs. [單株抗體] 1:332-338 (2009)所述之。
在還另一個實施方式中，修飾抗體的糖基化。例如，可以製備無糖基化的抗體（即，抗體缺乏糖基化）。可以改變糖基化以例如增加抗體對「抗原」的親和力。此類碳水化合物修飾可以藉由例如改變抗體序列內的一個或多個糖基化位點來實現。例如，可以進行一個或多個胺基酸取代，這導致消除一個或多個可變區框架糖基化位點，從而消除該位點的糖基化。這種無糖基化可以增加抗體對於抗原的親和力。此種方法描述於例如Co等人的美國專利號5,714,350和6,350,861中。
在另一個實施方式中，修飾抗體以增加其生物半衰期。可以採用各種方法。例如，可以引入以下突變中的一種或多種：T252L、T254S、T256F，如Ward的美國專利號6,277,375中所述。可替代地，為了增加生物半衰期，可以在CH1或CL區內改變抗體，以含有取自IgG的Fc區的CH2結構域的兩個環的補救受體結合表位，如Presta等人的美國專利號5,869,046和6,121,022中所述。3. CCR7 抗體的產生
可以藉由本領域已知的任何手段產生抗CCR7抗體及其抗體片段（例如，抗原結合片段），該等手段包括但不限於重組表現、化學合成和酶促消化抗體四聚體，而全長單株抗體可以藉由例如雜交瘤或重組產生獲得。重組表現可以來自本領域已知的任何適當的宿主細胞，例如哺乳動物宿主細胞、細菌宿主細胞、酵母宿主細胞、昆蟲宿主細胞等。
本揭露進一步提供了編碼本文所述之抗體的多核苷酸，例如，編碼包含如本文所述之互補性決定區的重鏈或輕鏈可變區或區段的多核苷酸。在一些實施方式中，編碼重鏈可變區的多核苷酸與選自由SEQ ID NO: 14、46、78和609組成之群組的多核苷酸具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%核酸序列同一性。在一些實施方式中，編碼輕鏈可變區的多核苷酸與選自由SEQ ID NO: 30、62、94和625組成之群組的多核苷酸具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%核酸序列同一性。
在一些實施方式中，編碼重鏈的多核苷酸與SEQ ID NO: 16、48、80或611的多核苷酸具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%核酸序列同一性。在一些實施方式中，編碼輕鏈的多核苷酸與SEQ ID NO: 32、64、96或627的多核苷酸具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%核酸序列同一性。
本發明之多核苷酸可以僅編碼抗CCR7抗體的可變區序列。它們還可以編碼抗體的可變區和恒定區。一些多核苷酸序列編碼包含一種所例舉小鼠抗CCR7抗體的重鏈和輕鏈的可變區的多肽。一些其他多核苷酸編碼分別與一種小鼠抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區基本上相同的兩個多肽區段。
多核苷酸序列可以藉由從頭固相DNA合成或藉由PCR誘變編碼抗CCR7抗體或其結合片段的現有序列（例如，如下文實例中所述之序列）來產生。核酸的直接化學合成可以藉由本領域已知之方法完成，諸如Narang等人, Meth. Enzymol. [酶學方法] 68:90, 1979的磷酸三酯法；Brown等人, Meth. Enzymol. [酶學方法] 68:109, 1979的磷酸二酯法；Beaucage等人, Tetra.Lett. [四面體快報], 22:1859, 1981的二乙基亞磷醯胺方法；和美國專利號4,458,066的固體支持方法。藉由PCR向多核苷酸序列引入突變可以如以下文獻中所述進行，例如PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification [PCR技術：DNA擴增的原理和應用], H.A.Erlich (編輯), Freeman Press [弗裡曼出版社], 紐約, 紐約州, 1992；PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications [PCR方案：方法和應用指南], Innis等人, (編), Academic Press [學術出版社], 聖地牙哥, 加利福尼亞州, 1990；Mattila等人, Nucleic Acids Res. [核酸研究] 19:967, 1991；以及Eckert等人, PCR Methods and Applications [PCR方法和應用] 1:17, 1991。
本發明中還提供了用於產生上文描述的抗CCR7抗體的表現載體和宿主細胞。多種表現載體可以用來表現編碼抗CCR7抗體鏈或結合片段的多核苷酸。基於病毒的載體和非病毒表現載體均可用於在哺乳動物宿主細胞中產生抗體。非病毒載體和系統包括質體、附加型載體（典型地具有用於表現蛋白質或RNA的表現盒）以及人類人工染色體（參見例如，Harrington等人, Nat Genet. [自然遺傳學] 15:345, 1997）。例如，可用於哺乳動物（例如人）細胞中表現抗CCR7多核苷酸和多肽的非病毒載體包括pThioHis A、B和C、pcDNATM 3.1/His、pEBVHis A、B和C（英傑公司（Invitrogen），聖地牙哥，加利福尼亞州）、MPSV載體和本領域已知用於表現其他蛋白質的許多其他載體。有用的病毒載體包括基於逆轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、皰疹病毒的載體，基於SV40、乳頭瘤病毒、HBP EB病毒、牛痘病毒載體和塞姆利基森林病毒（Semliki Forest virus）（SFV）的載體。參見Brent等人, 同上；Smith, Annu.Rev. Microbiol. [微生物學年度評論] 49:807, 1995；和Rosenfeld等人, Cell [細胞] 68:143, 1992。
表現載體的選擇取決於待表現該載體的預期宿主細胞。典型地，表現載體含有與編碼抗CCR7抗體鏈或片段的多核苷酸可操作地連接的啟動子和其他調節序列（例如，增強子）。在一些實施方式中，採用誘導型啟動子以防止插入的序列在誘導條件之外的條件下表現。誘導型啟動子包括例如阿拉伯糖、lacZ、金屬硫蛋白啟動子或熱激啟動子。可以在非誘導條件下、而不在偏向宿主細胞更好耐受其表現產物的編碼序列的群體的情況下擴大經轉化的生物體的培養。除了啟動子之外，還可能需要或期望其他調節元件以高效表現抗CCR7抗體鏈或片段。該等元件典型地包括ATG起始密碼子和相鄰的核糖體結合位點或其他序列。此外，藉由包含適合於使用中的細胞系統的增強子，可以提高表現效率（參見例如，Scharf等人, Results Probl. Cell Differ. [細胞分化中的結果和問題] 20:125, 1994；和Bittner等人, Meth. Enzymol. [酶學方法], 153:516, 1987）。例如，SV40增強子或CMV增強子可以用來增加哺乳動物宿主細胞中的表現。
表現載體還可以提供分泌訊息序列位置，以與藉由插入的抗CCR7抗體序列編碼的多肽形成融合蛋白。更常見的是，所插入的抗CCR7抗體序列在包含在載體中之前與訊息序列連接。用於接收編碼抗CCR7抗體輕鏈和重鏈可變結構域的序列的載體有時也編碼恒定區或其部分。此類載體允許將可變區表現為具有恒定區的融合蛋白，從而導致產生完整抗體或其片段。典型地，此類恒定區係人類的。
用於攜帶並表現抗CCR7抗體鏈的宿主細胞可以是原核或真核的。大腸桿菌係一種可用於選殖並表現本發明多核苷酸的原核宿主。適合使用的其他微生物宿主包括桿菌（如枯草桿菌）和其他腸桿菌科（如沙門氏菌屬、沙雷氏菌屬）以及各種假單胞菌屬的種。在該等原核宿主中，還可以製備表現載體，該等表現載體典型地含有與宿主細胞相容的表現控制序列（例如，複製的起點）。此外，將存在任何數量的多種熟知的啟動子，如乳糖啟動子系統、色胺酸（trp）啟動子系統、β-內醯胺酶啟動子系統或來自噬菌體λ的啟動子系統。啟動子典型地視需要使用操縱基因序列控制表現，並且具有核糖體結合位點序列等，以用於啟動和完成轉錄和翻譯。其他微生物如酵母也可用於表現本發明之抗CCR7多肽。也可以使用與桿狀病毒載體組合的昆蟲細胞。
在一些較佳的實施方式中，哺乳動物宿主細胞用於表現和產生本發明之抗CCR7多肽。例如，它們可以是表現內源性免疫球蛋白基因的雜交瘤細胞系（例如，如實例中所述之骨髓瘤雜交瘤殖株）或攜帶外源表現載體的哺乳動物細胞系（例如，下文例舉的SP2/0骨髓瘤細胞）。該等包括任何正常的必死或正常或異常的永生的動物或人類細胞。例如，已經開發了許多能夠分泌完整免疫球蛋白的合適宿主細胞系，包括CHO細胞系、各種Cos細胞系、HeLa細胞、骨髓瘤細胞系、轉化的B細胞和雜交瘤。利用哺乳動物組織細胞培養物表現多肽在例如Winnacker, From Genes to Clones [從基因到殖株], VCH出版商, 紐約, 紐約州, 1987中進行了大體論述。用於哺乳動物宿主細胞的表現載體可包含表現控制序列，如複製起點、啟動子和增強子（參見例如，Queen等人, Immunol. Rev. [免疫學評論] 89:49-68, 1986），和必要的處理資訊位點，如核糖體結合位點、RNA剪接位點、多腺苷酸化位點和轉錄終止子序列。該等表現載體通常含有衍生自哺乳動物基因或衍生自哺乳動物病毒的啟動子。合適的啟動子可以是組成型的、細胞類型特異性的、階段特異性的和/或可調控的或可調節的。可用啟動子包括但不限於金屬硫蛋白啟動子、組成型腺病毒主要晚期啟動子、地塞米松誘導型MMTV啟動子、SV40啟動子、MRP polIII啟動子、組成型MPSV啟動子、四環素誘導型CMV啟動子（如人CMV立即早期啟動子）、組成型CMV啟動子和本領域已知的啟動子-增強子組合。
用於引入含有目的多核苷酸序列的表現載體之方法根據細胞宿主的類型而變化。例如，氯化鈣轉染通常用於原核細胞，而磷酸鈣處理或電穿孔可以用於其他細胞宿主（通常參見Sambrook等人, Molecular Cloning: A Laboratory Manual [分子選殖：實驗室手冊], 第4版）。其他方法包括例如電穿孔、磷酸鈣處理、脂質體介導的轉化、注射和顯微注射、彈擊法、病毒體、免疫脂質體、聚陽離子: 核酸軛合物、裸DNA、人工病毒粒體、與皰疹病毒結構蛋白VP22的融合物（Elliot和O'Hare, Cell [細胞] 88:223, 1997）、藥劑增強的DNA攝取、和離體轉導。對於重組蛋白的長期高產量生產，通常期望穩定的表現。例如，可以使用含有病毒複製起點或內源性表現元件和選擇性標誌物基因的本發明表現載體來製備穩定表現抗CCR7抗體鏈或結合片段的細胞系。在引入載體之後，可以使細胞在富集的培養基中生長1-2天，之後將它們轉換至選擇性培養基。選擇性標誌物的目的是賦予選擇抗性，並且它的存在允許在選擇性培養基中成功地表現引入的序列的細胞的生長。可以使用適合於細胞類型的組織培養技術來增殖抗性、穩定轉染的細胞。治療用途
本發明之抗體、抗體片段（例如，抗原結合片段）和抗體藥物軛合物可用於多種應用，包括但不限於治療或預防癌症，如實體癌症或血基質惡性腫瘤。在某些實施方式中，本發明之抗體、抗體片段（例如，抗原結合片段）和抗體藥物軛合物可用於抑制腫瘤生長、誘導分化、減小腫瘤體積、和/或降低腫瘤的致瘤性。使用方法可以是體外、離體或體內方法。
在一個方面，本發明之抗體、抗體片段（例如，抗原結合片段）和抗體藥物軛合物可用於檢測CCR7在生物樣本中的存在。如本文所用，術語「檢測」涵蓋定量或定性檢測。在某些實施方式中，生物樣本包括細胞或組織。在某些實施方式中，此類組織包含相對於其他組織以較高水平表現CCR7的正常組織和/或癌性組織。
在一個方面，本發明提供了一種檢測CCR7在生物樣本中的存在之方法。在某些實施方式中，該方法包括使生物樣本與抗CCR7抗體在允許抗體與抗原結合的條件下接觸，並且檢測是否在抗體與抗原之間形成複合物。
在一個方面，本發明提供了一種診斷與CCR7表現增加相關的障礙之方法。在某些實施方式中，該方法包括使測試細胞與抗CCR7抗體接觸；藉由檢測抗CCR7抗體與CCR7抗原的結合，（定量或定性地）測定測試細胞上的CCR7表現水平；並且比較測試細胞中的CCR7表現水平與對照細胞（例如，與測試細胞相同的組織來源的正常細胞或以與這種正常細胞相當的水平表現CCR7的細胞）上的CCR7表現水平，其中與對照細胞相比，測試細胞上CCR7的更高表現水平指示存在與CCR7表現增加相關的障礙。在某些實施方式中，測試細胞從疑似患有與CCR7表現增加相關的障礙的個體獲得。在某些實施方式中，障礙係細胞增殖性疾病，如癌症或腫瘤。在某些實施方式中，該方法包括測量CCR7基因在測試細胞中的拷貝數。
在某些實施方式中，診斷或檢測方法（如上文所述之那些）包括檢測抗CCR7抗體與細胞表面上表現的或膜製備物中的CCR7的結合，該膜製備物從在其表面上表現CCR7的細胞獲得。用於檢測抗CCR7抗體與細胞表面上表現的CCR7結合的示例性測定係「FACS」測定。
某些其他方法可以用來檢測抗CCR7抗體與CCR7的結合。此類方法包括但不限於本領域熟知的抗原結合測定，如蛋白質印跡、放射免疫測定、ELISA（酶聯免疫吸附測定）、「夾心」免疫測定、免疫沈澱測定、螢光免疫測定、蛋白A免疫測定和免疫組織化學（IHC）。
在某些實施方式中，抗CCR7抗體係標記的。標記包括但不限於直接檢測到的標記或部分（諸如螢光標記、發色標記、電子緻密標記、化學發光標記和放射性標記），以及間接檢測到（例如藉由酶促反應或分子相互作用）的部分，諸如酶或配位基。
在某些實施方式中，抗CCR7抗體固定在不溶性基質上。固定化能夠將抗CCR7抗體與在溶液中保持游離的任何CCR7蛋白分離。藉由使抗CCR7抗體在測定程序之前不溶，如藉由吸附至水不溶性基質或表面（Bennich等人, 美國專利號3,720,760）、或藉由共價偶聯（例如，使用戊二醛交聯），或藉由在抗CCR7抗體與CCR7蛋白之間形成複合物之後使抗CCR7抗體不溶（例如，藉由免疫沈澱），常規地完成這一點。
可以使用本發明之免疫軛合物替代抗CCR7抗體或除抗CCR7抗體外還使用本發明之免疫軛合物，進行診斷或檢測的任一個以上實施方式。
在一個實施方式中，本發明提供了一種治療或預防疾病之方法，該方法包括將本發明之抗體、抗體片段（例如，抗原結合片段）或抗體藥物軛合物給予至患者。本發明還提供了本發明之抗體、抗體片段（例如，抗原結合片段）或抗體藥物軛合物治療或預防患者的疾病之用途。在一些實施方式中，本發明提供了本發明之抗體、抗體片段（例如，抗原結合片段）或抗體藥物軛合物，用於治療或預防患者的疾病。在另外的實施方式中，本發明提供了本發明之抗體、抗體片段（例如，抗原結合片段）或抗體藥物軛合物在製造用於治療或預防患者的疾病的藥物中之用途。
在某些實施方式中，用本發明之抗體、抗體片段（例如，抗原結合片段）和抗體藥物軛合物治療的疾病係癌症。在某些實施方式中，癌症的特徵在於表現CCR7的細胞，本發明之抗體、抗體片段（例如，抗原結合片段）和抗體藥物軛合物結合該等細胞。在某些實施方式中，癌症的特徵在於相對於健康患者CCR7表現增加。在一些實施方式中，可以藉由CCR7 RNA的增加測量CCR7的表現。在其他實施方式中，癌症的特徵在於CCR7的DNA拷貝數增加。測量或測定CCR7表現水平的其他方法係熟悉該項技術者已知的。可以治療和/或預防的疾病的實例包括但不限於慢性淋巴球性白血病（CLL）、外周T細胞淋巴瘤（PTCL）如成人T細胞白血病/淋巴瘤（ATLL）和間變性大細胞淋巴瘤（ALCL）、非何杰金氏淋巴瘤（NHL）如被套細胞淋巴瘤（MCL）、柏基特氏淋巴瘤、彌漫性大B細胞淋巴瘤（DLBCL）、和濾泡性淋巴瘤（FL）、胃癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、頭頸癌、鼻咽癌（NPC）、食道癌、大腸直腸癌、胰臟癌、甲狀腺癌、乳癌、腎細胞癌和宮頸癌。
本發明提供了用於治療或預防癌症之方法，該方法包括投與治療有效量的本發明之抗體、抗體片段（例如，抗原結合片段）或抗體藥物軛合物。在某些實施方式中，癌症係實體癌症。在某些實施方式中，該受試者係人。在某些實施方式中，該癌症係抗性癌症和/或復發性癌症。在某些方面，例如，抗性癌症對酪胺酸激酶抑制劑，EGFR抑制劑、Her2抑制劑、Her3抑制劑、IGFR抑制劑和Met抑制劑有抗性。
在一些實施方式中，癌症係復發性或難治性（R/R）癌症。在一些實施方式中，癌症係R/R CLL。在一些實施方式中，癌症係R/R PTCL。在一些實施方式中，癌症係R/R DLBCL。在一些實施方式中，癌症係R/R MCL。在一些實施方式中，癌症係R/R FL。
在某些實施方式中，本發明提供了抑制腫瘤生長之方法，該方法包括向受試者投與治療有效量的本發明之抗體、抗體片段（例如，抗原結合片段）或抗體藥物軛合物。在某些實施方式中，該受試者係人。在某些實施方式中，該受試者患有腫瘤或已去除腫瘤。在某些實施方式中，腫瘤對其他酪胺酸激酶抑制劑，包括但不限於EGFR抑制劑、Her2抑制劑、Her3抑制劑、IGFR抑制劑和Met抑制劑有抗性。
在某些實施方式中，腫瘤表現抗CCR7抗體結合的CCR7。在某些實施方式中，腫瘤過表現人CCR7。在某些實施方式中，腫瘤具有增加的CCR7基因拷貝數。
本發明還提供了用於選擇患者以用本發明之抗體、抗體片段（例如，抗原結合片段）或抗體藥物軛合物治療之方法，該方法包括投與治療有效量的所述抗體、抗體片段（例如，抗原結合片段）或抗體藥物軛合物。在某些方面，該方法包括選擇患有酪胺酸激酶抑制劑抗性癌症的患者。在某些方面，設想了酪胺酸激酶抑制劑抗性癌症對EGFR抑制劑、Her2抑制劑、Her3抑制劑、IGFR抑制劑和/或Met抑制劑有抗性。在某些方面，設想了抗性癌症係Her2抗性癌症。在某些方面，設想了癌症係從頭抗性癌症，並且在仍其他方面，設想了癌症係復發性癌症。在本發明之某些方面，該等方法包括選擇患有從頭抗性癌症或復發性癌症的患者並且測量CCR7的表現。設想了在某些方面，復發性癌症或腫瘤起初不是表現CCR7的癌症或腫瘤，但是用酪胺酸激酶抑制劑治療後變成CCR7陽性癌症，該CCR7陽性癌症係酪胺酸激酶抑制劑抗性癌症或腫瘤或復發性癌症或腫瘤。
為了治療或預防疾病，本發明之抗體、抗體片段（例如，抗原結合片段）或抗體藥物軛合物的適當劑量取決於多種因素，如待治療疾病的類型、疾病的嚴重程度和過程、疾病的應答性、既往療法、患者臨床史等。抗體或藥劑可以一次性或經一系列治療投與，持續幾日至幾個月或直至實現治癒或實現疾病狀態的減輕（例如，腫瘤尺寸減小）。最佳給藥方案可以從測量患者體內的藥物累積量計算出並且將根據單獨抗體、抗體片段（例如，抗原結合片段）或抗體藥物軛合物的相對效力變化。治療醫師可以基於藥物在體液或組織中的所測停留時間和濃度，估計重複給藥率。組合療法
在某些情況下，將本發明之抗體、抗體片段（例如，抗原結合片段）或抗體藥物軛合物與其他治療劑組合，該等其他治療劑如其他抗癌劑、抗過敏劑、抗噁心劑（或抗嘔劑）、鎮痛藥、細胞保護劑及其組合。
在一個實施方式中，本發明之抗體、抗體片段（例如，抗原結合片段）或抗體藥物軛合物在藥物組合配製物或作為組合療法的給藥方案中與具有抗癌特性的第二化合物組合。藥物組合配製物或給藥方案的第二化合物可以對該組合的抗體或免疫軛合物具有互補活性，使得它們不彼此不利地影響。例如，本發明之抗體、抗體片段（例如，抗原結合片段）或抗體藥物軛合物可以與但不限於化學治療劑、酪胺酸激酶抑制劑、CCR7下游傳訊途徑抑制劑、IAP抑制劑、Bcl2抑制劑、Mcl1抑制劑和其他CCR7抑制劑組合給予。
如本文所用，術語「藥物組合」係指在一個劑量單位形式中的固定組合、或用於組合投與的非固定組合或成套藥盒，其中兩種或更多種治療劑可以在同一時間獨立地投與或在時間間隔內分別投與，特別地其中該等時間間隔允許組合配偶體顯示合作性例如協同效應。
術語「組合療法」係指投與兩種或更多種治療劑以治療或預防本揭露中描述的治療性病症或障礙。這種投與涵蓋以基本上同時的方式共同投與該等治療劑，如以具有固定比率的活性成分的單個膠囊投與。可替代地，這種投與涵蓋在多個容器中或在每種活性成分的獨立容器（例如，膠囊、粉末和液體）中共同投與。可以將粉末和/或液體在投與之前重構或稀釋到所希望的劑量。此外，這種投與也涵蓋在大致相同的時間或在不同的時間以依序方式使用每種類型的治療劑。在任何一種情況下，治療方案將在治療或預防本文所述之病症或障礙方面提供藥物組合的有益作用。
組合療法可以提供「協同」並且證明係「協同的」，即，當活性成分一起使用時所實現的效應大於由分別使用該等化合物所產生的效應的總和。當將活性成分為下述情形時可以獲得協同效應：(1) 以組合的單位劑量配製物的形式共同配製並同時投與或遞送；(2) 以單獨配製物的形式交替或平行遞送；或 (3) 藉由一些其他方案進行。當以交替療法遞送時，可以在依序（例如藉由在單獨注射器中不同的注射）投與或遞送化合物時獲得協同效應。通常，在交替療法期間，將有效劑量的每種活性成分依序地即順次地投與，而在組合療法中，將有效劑量的兩種或更多種活性成分一起投與。
考慮用於組合療法中的一般化學治療劑包括阿那曲唑（Arimidex® ）、比卡魯胺（Casodex® ）、硫酸博萊黴素（Blenoxane® ）、白消安（Myleran® ）、白消安注射液（Busulfex® ）、卡培他濱（Xeloda® ）、N4-戊氧羰基-5-去氧-5-氟胞苷、卡鉑（Paraplatin® ）、卡莫司汀（BiCNU® ）、苯丁酸氮芥（Leukeran® ）、順鉑（Platinol® ）、克拉屈濱（Leustatin® ）、環磷醯胺（Cytoxan® 或Neosar® ）、阿糖胞苷、胞嘧啶阿拉伯糖苷（Cytosar-U® ）、阿糖胞苷脂質體注射液（DepoCyt® ）、達卡巴𠯤（DTIC-Dome® ）、更生黴素（放線菌素D、Cosmegan）、鹽酸柔紅黴素（Cerubidine® ）、檸檬酸柔紅黴素脂質體注射液（DaunoXome® ）、地塞米松、多西他賽（Taxotere® ）、鹽酸阿黴素（Adriamycin® 、Rubex® ）、依託泊苷（Vepesid® ）、磷酸氟達拉濱（Fludara® ）、5-氟尿嘧啶（Adrucil® 、Efudex® ）、氟他胺（Eulexin® ）、替紮他濱（tezacitibine）、吉西他濱（雙氟去氧胞苷）、羥基脲（Hydrea® ）、伊達比星（Idamycin® ）、異環磷醯胺（IFEX® ）、伊立替康（Camptosar® ）、L-天冬醯胺酶（ELSPAR® ）、亞葉酸鈣、美法侖（Alkeran® ）、6-巰嘌呤（Purinethol® ）、胺甲喋呤（Folex® ）、米托蒽醌（Novantrone® ）、mylotarg、紫杉醇（Taxol® ）、費尼克斯（phoenix）（釔90/MX-DTPA）、噴司他丁（pentostatin）、聚苯丙生（polifeprosan）20與卡莫司汀的植入物（Gliadel®）、（Gliadel® ）、枸櫞酸他莫西芬（Nolvadex® ）、替尼泊苷（Vumon® ）、6-硫代鳥嘌呤、噻替派、替拉紮明（Tirazone® ）、注射用鹽酸托泊替康（Hycamptin® ）、長春花鹼（Velban® ）、長春新鹼（Oncovin® ）和長春瑞濱（Navelbine® ）、以及培美曲塞（pemetrexed）。
在一個方面，本發明提供了一種藉由向有需要的受試者給予與一種或多種酪胺酸激酶抑制劑組合的本發明抗體藥物軛合物來治療或預防癌症之方法，該一種或多種酪胺酸激酶抑制劑包括但不限於BTK抑制劑、EGFR抑制劑、Her2抑制劑、Her3抑制劑、IGFR抑制劑和Met抑制劑。
例如，酪胺酸激酶抑制劑包括但不限於依魯替尼（Ibrutinib）（PCI-32765）；鹽酸厄洛替尼（Erlotinib）（Tarceva®）；利尼法尼（Linifanib）（N-[4-(3-胺基-1H-吲唑-4-基)苯基]-N'-(2-氟-5-甲基苯基)脲，也稱為ABT 869，可購自基因泰克公司（Genentech））；蘋果酸舒尼替尼（Sutent®）；柏舒替尼（Bosutinib）（4-[(2,4-二氯-5-甲氧基苯基)胺基]-6-甲氧基-7-[3-(4-甲基哌𠯤-1-基)丙氧基]喹啉-3-甲腈，也稱為SKI-606，並且描述於美國專利號6,780,996中）；達沙替尼（Sprycel®）；帕唑帕尼（Votrient®）；索拉非尼（Nexavar®）；凡德他尼（ZD6474）；和伊馬替尼或甲磺酸伊馬替尼（Gilvec®和Gleevec®）。
表皮生長因子受體（EGFR）抑制劑包括但不限於鹽酸埃羅替尼（erlotinib）（Tarceva®）、吉非替尼（Iressa®）；N-[4-[(3-氯-4-氟苯基)胺基]-7-[[(3''S'')-四氫-3-呋喃基]氧基]-6-喹唑啉基]-4(二甲基胺基)-2-丁烯醯胺，Tovok®)；凡德他尼（Vandetanib）（Caprelsa®）；拉帕替尼（Tykerb®）；(3R,4R)-4-胺基-1-((4-((3-甲氧基苯基)胺基)吡咯并[2,1-f][1,2,4]三𠯤-5-基)甲基)哌啶-3-醇（BMS690514）；二鹽酸卡奈替尼（CI-1033）；6-[4-[(4-乙基-1-哌𠯤基)甲基]苯基]-N-[(1R)-1-苯基乙基]- 7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-胺（AEE788，CAS 497839-62-0）；木利替尼（Mubritinib）（TAK165）；培立替尼（EKB569）；阿法替尼（BIBW2992）；來那替尼（Neratinib）（HKI-272）；N-[4-[[1-[(3-氟苯基)甲基]-1H-吲唑-5-基]胺基]-5-甲基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三𠯤-6-基]-胺基甲酸，(3S)-3-𠰌啉基甲酯（BMS599626）；N-(3,4-二氯-2-氟苯基)-6-甲氧基-7-[[(3aα,5β,6aα)-八氫-2-甲基環戊二烯并[c]吡咯-5-基]甲氧基]-4-喹唑啉胺（XL647，CAS 781613-23-8）；和4-[4-[[(1R)-1-苯乙基]胺基]-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基]-苯酚（PKI166，CAS 187724-61-4）。
EGFR抗體包括但不限於西妥昔單抗（Erbitux®）；帕尼單抗（Vectibix®）；馬妥珠單抗（EMD-72000）；；尼妥珠單抗（Nimotuzumab）（hR3）；紮妥木單抗（Zalutumumab）；TheraCIM h-R3；MDX0447（CAS 339151-96-1）；和ch806（mAb-806，CAS 946414-09-1）。
人表皮生長因子受體2（Her2受體）（也稱為Neu、ErbB-2、CD340或p185）抑制劑包括但不限於曲妥珠單抗（Herceptin®）；帕妥珠單抗（Omnitarg®）；恩美曲妥珠單抗（trastuzumab emtansine）（Kadcyla®）；來那替尼（HKI-272，(2E)-N-[4-[[3-氯-4-[(吡啶-2-基)甲氧基]苯基]胺基]-3-氰基-7-乙氧喹啉-6-基]-4-(二甲基胺基)丁-2-烯醯胺，並且描述於PCT公開號WO 05/028443）；拉帕替尼或二甲苯磺酸拉帕替尼（Tykerb®）；(3R,4R)-4-胺基-1-((4-((3-甲氧基苯基)胺基)吡咯并[2,1-f][1,2,4]三𠯤-5-基)甲基)哌啶-3-醇（BMS690514）；(2E)-N-[4-[(3-氯-4-氟苯基)胺基]-7-[[(3S)-四氫-3-呋喃基]氧基]-6-喹唑啉基]-4-(二甲基胺基)-2-丁烯醯胺（BIBW-2992，CAS 850140-72-6）；N-[4-[[1-[(3-氟苯基)甲基]-1H-吲唑-5-基]胺基]-5-甲基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三𠯤-6-基]-胺基甲酸、(3S)-3-𠰌啉基甲酯（BMS 599626，CAS 714971-09-2）；二鹽酸卡奈替尼（PD183805或CI-1033）；和N-(3,4-二氯-2-氟苯基)-6-甲氧基-7-[[(3aα,5β,6aα)-八氫-2-甲基環戊[c]吡咯-5-基]甲氧基]- 4-喹唑啉胺（XL647，CAS 781613-23-8）。
Her3抑制劑包括但不限於LJM716、MM-121、AMG-888、RG7116、REGN-1400、AV-203、MP-RM-1、MM-111和MEHD-7945A。
MET抑制劑包括但不限於卡博替尼（Cabozantinib）（XL184，CAS 849217-68-1）；氟列替布（Foretinib）（GSK1363089，以前稱為XL880，CAS 849217-64-7）；替萬替尼（Tivantinib）（ARQ197，CAS 1000873-98-2）；1-(2-羥基-2-甲基丙基)-N -(5-(7-甲氧基喹啉-4-基氧基)吡啶-2-基)-5-甲基-3-側氧基-2-苯基-2,3-二氫-1H -吡唑-4-甲醯胺（AMG 458）；克唑替尼（Xalkori®，PF-02341066）；(3Z)-5-(2,3-二氫-1H-吲哚-1-基磺醯基)-3-({3,5-二甲基-4-[(4-甲基哌𠯤-1-基)羰基]-1H-吡咯-2-基}亞甲基)-1,3-二氫-2H-吲哚-2-酮（SU11271）；(3Z)-N-(3-氯苯基)-3-({3,5-二甲基-4-[(4-甲基哌𠯤-1-基)羰基]-1H-吡咯-2-基}亞甲基)-N-甲基-2-側氧基吲哚啉-5-磺醯胺（SU11274）；(3Z)-N-(3-氯苯基)-3-{[3,5-二甲基-4-(3-𠰌啉-4-基丙基)-1H-吡咯-2-基]亞甲基}-N-甲基-2-側氧基吲哚啉-5-磺醯胺（SU11606）；6-[二氟[6-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-1,2,4-三唑并[4,3-b]嗒𠯤-3-基]甲基]-喹啉（JNJ38877605，CAS 943540-75-8）；2-[4-[1-(喹啉-6-基甲基)-1H-[1,2,3]三唑并[4,5-b]吡𠯤-6-基]-1H-吡唑-1-基]乙醇（PF04217903，CAS 956905-27-4）；N-((2R)-1,4-二㗁𠮿-2-基甲基)-N-甲基-N'-[3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-5-側氧基-5H-苯并[4,5]環庚并[1,2-b]吡啶-7-基]磺醯胺（MK2461，CAS 917879-39-1）；6-[[6-(1-甲基-1H -吡唑-4-基)-1,2,4-三唑并[4,3-b ]嗒𠯤-3-基]硫代]-喹啉（SGX523，CAS 1022150-57-7）；和 (3Z )-5-[[(2,6-二氯苯基)甲基]磺醯基]-3-[[3,5-二甲基-4-[[(2R )-2-(1-吡咯啶基甲基)-1-吡咯啶基]羰基]-1H -吡咯-2-基]亞甲基]-1,3-二氫-2H -吲哚-2-酮（PHA665752，CAS 477575-56-7）。
IGF1R抑制劑包括但不限於BMS-754807、XL-228、OSI-906、GSK0904529A、A-928605、AXL1717、KW-2450、MK0646、AMG479、IMCA12、MEDI-573和BI836845。參見例如，Yee, JNCI [國家癌症研究所雜誌], 104；975 (2012)的綜述。
在另一個方面，本發明提供了一種藉由向有需要的受試者給予與一種或多種CCR7下游傳訊途徑抑制劑組合的本發明抗體藥物軛合物來治療或預防癌症之方法，該一種或多種CCR7下游傳訊途徑抑制劑包括但不限於β-抑制蛋白抑制劑、GRK抑制劑、MAPK抑制劑、PI3K抑制劑、JAK抑制劑等。
例如，磷酸肌醇3-激酶（PI3K）抑制劑包括但不限於艾拉利司（Idelalisib）（Zydelig，GS-1101，Cal-101）、4-[2-(1H-吲哚-4-基)-6-[[4-(甲磺醯基)哌𠯤-1-基]甲基]噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基]𠰌啉（也稱為GDC 0941並且描述於PCT公開號WO 09/036082和WO 09/055730）；2-甲基-2-[4-[3-甲基-2-側氧基-8-(喹啉-3-基)-2,3-二氫咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基]苯基]丙腈（也稱為BEZ 235或NVP-BEZ 235，並且描述於PCT公開號WO 06/122806）；4-(三氟甲基)-5-(2,6-二𠰌啉代嘧啶-4-基)吡啶-2-胺（也稱為BKM120或NVP-BKM120，並且描述於PCT公開號WO2007/084786）；托紮舍替（Tozasertib）（VX680或MK-0457，CAS 639089-54-6）；(5Z)-5-[[4-(4-吡啶基)-6-喹啉基]亞甲基]-2,4-四氫噻唑二酮（GSK1059615，CAS 958852-01-2）；(1E,4S,4aR,5R,6aS,9aR)-5-(乙醯氧基)-1-[(二-2-丙烯基胺基)亞甲基]-4,4a,5,6,6a,8,9,9a-八氫-11-羥基-4-(甲氧基甲基)-4a,6a-二甲基-環戊二烯并[5,6]萘并[1,2-c]哌喃-2,7,10(1H)-三酮（PX866，CAS 502632-66-8）；和8-苯基-2-(𠰌啉-4-基)-色烯-4-酮（LY294002，CAS 154447-36-6）。
在又另一個方面，本發明提供了一種藉由向有需要的受試者投與與一種或多種促凋亡劑組合的本發明抗體藥物軛合物來治療或預防癌症之方法，該一種或多種促凋亡劑包括但不限於IAP抑制劑、Bcl2抑制劑、MCl1抑制劑、Trail劑、Chk抑制劑。
例如，IAP抑制劑包括但不限於LCL161、GDC-0917、AEG-35156、AT406、和TL32711。IAP抑制劑的其他實例包括但不限於WO 04/005284、WO 04/007529、WO 05/097791、WO 05/069894、WO 05/069888、WO 05/094818、US 2006/0014700、US 2006/0025347、WO 06/069063、WO 06/010118、WO 06/017295、和WO 08/134679（所有該等文獻都藉由引用併入本文）中揭露的那些。
BCL-2抑制劑包括但不限於維奈妥拉（Venetoclax）（也稱為GDC-0199、ABT-199、RG7601）；4-[4-[[2-(4-氯苯基)-5,5-二甲基-1-環己烯-1-基]甲基]-1-哌𠯤基]-N-[[4-[[(1R)-3-(4-𠰌啉基)-1-[(苯基硫)甲基]丙基]胺基]-3-[(三氟甲基)磺醯基]苯基]磺醯基]苯甲醯胺（也稱為ABT-263並且描述於PCT公開號WO 09/155386中）；四制癌素A；抗黴素；棉酚（(-)BL-193）；奧巴妥拉（Obatoclax）；乙基-2-胺基-6-環戊基-4-(1-氰基-2-乙氧基-2-氧乙基)-4H色酮-3-甲酸酯（HA14 - 1）；奧利默森（Oblimersen）（G3139，Genasense®）；Bak BH3肽；(-)-棉酚乙酸（AT-101）；4-[4-[(4'-氯[1,1'-二苯基]-2-基)甲基]-1-哌𠯤基]-N -[[4-[[(1R )-3-(二甲基胺基)-1-[(苯硫基)甲基]丙基]胺基]-3-硝基苯基]磺醯基]-苯甲醯胺（ABT-737，CAS 852808-04-9）；和那維托克萊克斯（Navitoclax）（ABT-263，CAS 923564-51-6）。
促凋亡受體促效劑（PARA）包括DR4（TRAILR1）和DR5（TRAILR2），包括但不限於度拉納明（Dulanermin）（AMG-951，RhApo2L/TRAIL）；瑪帕妥木單抗（Mapatumumab）（HRS-ETR1，CAS 658052-09-6）；來沙木單抗（Lexatumumab）（HGS-ETR2，CAS 845816-02-6）；Apomab（Apomab®）；西他土珠（Conatumumab）（AMG655，CAS 896731-82-1）；和替加珠單抗（Tigatuzumab）（CS1008，CAS 946415-34-5，可購自第一三共株式會社（Daiichi Sankyo））。
檢查點激酶（CHK）抑制劑包括但不限於7-羥基星形孢菌素（UCN-01）；6-溴-3-(1-甲基-1H -吡唑-4-基)-5-(3R )-3-哌啶基-吡唑并[1,5-a ]嘧啶-7-胺（SCH900776，CAS 891494-63-6）；5-(3-氟苯基)-3-脲基噻吩-2-羧酸 N-[(S)-哌啶-3-基]醯胺（AZD7762，CAS 860352-01-8）；4-[((3S)-1-氮雜二環[2.2.2]辛-3-基)胺基]-3-(1H-苯并咪唑-2-基)-6-氯喹啉-2(1H)-酮（CHIR 124，CAS 405168-58-3）；7-胺基更生黴素（7-AAD）、Isogranulatimide、debromohymenialdisine；N-[5-溴-4-甲基-2-[(2S)-2-𠰌啉基甲氧基]-苯基]-N'-(5-甲基-2-吡𠯤基)脲（LY2603618，CAS 911222-45-2）；蘿蔔硫素（CAS 4478-93-7、4-甲基亞磺醯基丁基異硫氰酸鹽）；9,10,11,12-四氫- 9,12-環氧-1H -二吲哚[1,2,3-fg :3',2',1'-kl ]吡咯并[3,4-i ][1,6]苯并二氮芳辛-1,3(2H )-二酮（SB-218078，CAS 135897-06-2）；和TAT-S216A（YGRKKRRQRRRLYRSPAMPENL（SEQ ID NO: 629））、和CBP501（(d-Bpa)sws(d-Phe-F5)(d-Cha)rrrqrr）。
在另一個實施方式中，本發明提供了一種藉由向有需要的受試者投與與一種或多種免疫調節劑（例如共刺激分子的活化劑或免疫檢查點分子的抑制劑中一者或多者）組合的本發明抗體藥物軛合物來治療或預防癌症之方法。
在某些實施方式中，免疫調節劑係共刺激分子的活化劑。在一個實施方式中，該共刺激分子的促效劑選自OX40、CD2、CD27、CDS、ICAM-1、LFA-1（CD11a/CD18）、ICOS（CD278）、4-1BB（CD137）、GITR、CD30、CD40、BAFFR、HVEM、CD7、LIGHT、NKG2C、SLAMF7、NKp80、CD160、B7-H3、STING或CD83配位基的促效劑（例如，激動性抗體或其抗原結合片段、或可溶性融合物）。
在某些實施方式中，免疫調節劑係免疫檢查點分子的抑制劑。在一個實施方式中，該免疫調節劑係PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4和/或TGFR β的抑制劑。在一個實施方式中，免疫檢查點分子的抑制劑抑制PD-1、PD-L1、LAG-3、TIM-3或CTLA4、或其任何組合。術語「抑制」或「抑制劑」包括給定分子（例如免疫檢查點抑制劑）的某些參數（例如活性）的降低。例如，該術語包括至少5%、10%、20%、30%、40%、50%或更多的活性（例如PD-1或PD-L1活性）的抑制。因此，抑制不必是100%。
抑制性分子的抑制可以在DNA、RNA或蛋白水平進行。在一些實施方式中，抑制性核酸（例如，dsRNA、siRNA或shRNA）可以用於對抑制性分子的表現進行抑制。在其他實施方式中，抑制信號的抑制劑係多肽，例如，可溶性配位基（例如，PD-1-Ig或CTLA-4 Ig）或與抑制性分子結合的抗體或其抗原結合片段；例如，與PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4和/或TGFR β、或其組合結合的抗體或其片段（在本文中也稱為「抗體分子」）。
在一個實施方式中，該抗體分子係完全抗體或其片段（例如Fab、F(ab')2 、Fv、或單鏈Fv片段（scFv））。在又其他實施方式中，該抗體分子具有重鏈恒定區（Fc），該重鏈恒定區（Fc）選自例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD、和IgE的重鏈恒定區；具體地，選自例如IgG1、IgG2、IgG3、和IgG4的重鏈恒定區，更具體地，選自IgG1或IgG4（例如人IgG1或IgG4）的重鏈恒定區。在一個實施方式中，重鏈恒定區係人IgG1或人IgG4。在一個實施方式中，將恒定區改變（例如突變）以修飾抗體分子的特性（例如，以增加或減少Fc受體結合、抗體糖基化、半胱胺酸殘基數目、效應細胞功能、或補體功能中的一種或多種）。
在某些實施方式中，抗體分子處於雙特異性或多特異性抗體分子的形式。在一個實施方式中，雙特異性抗體分子具有針對PD-1或PD-L1的第一結合特異性，和第二結合特異性，例如針對TIM-3、LAG-3、或PD-L2的第二結合特異性。在一個實施方式中，該雙特異性抗體分子與PD-1或PD-L1和TIM-3結合。在另一個實施方式中，該雙特異性抗體分子與PD-1或PD-L1和LAG-3結合。在另一個實施方式中，該雙特異性抗體分子與PD-1和PD-L1結合。在又另一個實施方式中，該雙特異性抗體分子與PD-1和PD-L2結合。在另一個實施方式中，該雙特異性抗體分子與TIM-3和LAG-3結合。可以在多特異性抗體分子（例如，三特異性抗體）中產生前述分子的任何組合，該三特異性抗體包括針對PD-1或PD-1的第一結合特異性和針對以下兩者或更多者的第二結合特異性和第三結合特異性：TIM-3、LAG-3或PD-L2。
在某些實施方式中，免疫調節劑係PD-1（例如，人PD-1）的抑制劑。在另一個實施方式中，免疫調節劑係PD-L1（例如，人PD-L1）的抑制劑。在一個實施方式中，PD-1或PD-L1的抑制劑係PD-1或PD-L1的抗體分子。PD-1或PD-L1抑制劑可以單獨投與、或與其他免疫調節劑組合投與，例如與LAG-3、TIM-3或CTLA4的抑制劑組合投與。在示例性實施方式中，將PD-1或PD-L1的抑制劑（例如，抗PD-1或PD-L1抗體分子）與LAG-3抑制劑（例如，抗LAG-3抗體分子）組合投與。在另一個實施方式中，將PD-1或PD-L1的抑制劑（例如，抗PD-1或PD-L1抗體分子）與TIM-3抑制劑（例如，抗TIM-3抗體分子）組合投與。在又其他實施方式中，將PD-1或PD-L1的抑制劑（例如，抗PD-1抗體分子）與LAG-3抑制劑（例如，抗LAG-3抗體分子）和TIM-3抑制劑（例如，抗TIM-3抗體分子）組合投與。免疫調節劑與PD-1抑制劑（例如，PD-L2、CTLA4、TIM3、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4和/或TGFR中一者或多者）的其他組合還處於本發明範圍內。本領域已知的或本文揭露的任何抗體分子均可用於上述檢查點分子抑制劑的組合中。
在一個實施方式中，該PD-1抑制劑係選自納武單抗（Nivolumab）、派姆單抗（Pembrolizumab）或匹地利珠單抗（Pidilizumab）的抗PD-1抗體。在一些實施方式中，該抗PD-1抗體係納武單抗。納武單抗的替代性名稱包括MDX-1106、MDX-1106-04、ONO-4538或BMS-936558。在一些實施方式中，該抗PD-1抗體係納武單抗（CAS登記號：946414-94-4）。納武單抗係特異性阻斷PD1的完全人IgG4單株抗體。納武單抗（殖株5C4）和特異性結合PD1的其他人單株抗體揭露於美國專利號8,008,449和PCT公開號WO 2006/121168中。
在其他實施方式中，該抗PD-1抗體係帕姆單抗。派姆單抗（商品名KEYTRUDA，以前稱為蘭布羅利珠單抗（Lambrolizumab），也稱為Merck 3745、MK-3475或SCH-900475）係與PD1結合的人源化IgG4單株抗體。派姆單抗揭露於例如Hamid, O.等人 (2013)New England Journal of Medicine [新英格蘭醫學期刊] 369 (2): 134–44, PCT公開號WO 2009/114335，以及美國專利號8,354,509中。
在一些實施方式中，該抗PD-1抗體係匹地利珠單抗。皮地利珠單抗（CT-011；治療科技公司（Cure Tech））係與PD1結合的人源化IgG1k單株抗體。匹地利珠單抗和其他人源化抗PD-1單株抗體揭露於PCT公開號WO 2009/101611中。其他抗PD1抗體揭露於美國專利號8,609,089、美國公開號2010028330、和/或美國公開號20120114649中。其他抗PD1抗體包括AMP 514（安普利公司）。
在一些實施方式中，PD-1抑制劑係PDR001或WO 2015/112900中揭露的任何其他抗PD-1抗體。
在一些實施方式中，該PD-1抑制劑係免疫黏附素（例如包含融合到恒定區（例如免疫球蛋白序列的Fc區）的PD-Ll或PD-L2的細胞外或PD-1結合部分的免疫黏附素）。在一些實施方式中，該PD-1抑制劑係AMP-224。
在一些實施方式中，該PD-Ll抑制劑係抗PD-Ll抗體。在一些實施方式中，該抗PD-Ll抑制劑選自例如WO 2013/0179174中揭露的，並且具有本文揭露的序列（或與其基本上相同或相似的序列，例如與指定序列至少85%、90%、95%相同或更高程度相同的序列）的YW243.55.S70、MPDL3280A、MEDI-4736或MDX-1105MSB-0010718C（也稱為A09-246-2）。
在一個實施方式中，該PD-L1抑制劑係MDX-1105。MDX-1105，也稱為BMS-936559，係PCT公開號WO 2007/005874中描述的抗PD-Ll抗體。
在一個實施方式中，該PD-L1抑制劑係YW243.55.S70。YW243.55.S70抗體係PCT公開號WO 2010/077634中描述的抗PD-Ll（重鏈可變區序列和輕鏈可變區序列分別示於SEQ ID No. 20和21中）。
在一個實施方式中，該PD-L1抑制劑係MDPL3280A（基因泰克公司/羅氏公司（Genentech/Roche））。MDPL3280A係與PD-L1結合的人Fc優化的IgG1單株抗體。MDPL3280A和針對PD-L1的其他人單株抗體揭露於美國專利號：7,943,743和美國公開號: 20120039906。
在其他實施方式中，該PD-L2抑制劑係AMP-224。AMP-224係阻斷PD1與B7-H1之間的相互作用的PD-L2 Fc融合可溶性受體（B7-DCIg；艾普利穆恩公司；例如，揭露於PCT公開號WO2010/027827和WO2011/066342中）。
在一個實施方式中，LAG-3抑制劑係抗LAG-3抗體分子。在一個實施方式中，LAG-3抑制劑係BMS-986016。藥物組成物
為了製備包含免疫軛合物的藥物組成物或無菌組成物，將本發明之免疫軛合物與藥學上可接受的載劑或賦形劑混合。組成物可以另外地含有一種或多種適於治療或預防表現CCR7的癌症（包括但不限於慢性淋巴球性白血病（CLL）、外周T細胞淋巴瘤（PTCL）如成人T細胞白血病/淋巴瘤（ATLL）和間變性大細胞淋巴瘤（ALCL）、非何杰金氏淋巴瘤（NHL）如被套細胞淋巴瘤（MCL）、柏基特氏淋巴瘤、彌漫性大B細胞淋巴瘤（DLBCL）、和濾泡性淋巴瘤（FL）、胃癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、頭頸癌、鼻咽癌（NPC）、食道癌、大腸直腸癌、胰臟癌、甲狀腺癌、乳癌、腎細胞癌和宮頸癌）的其他治療劑。
在一些實施方式中，癌症係復發性或難治性（R/R）癌症。在一些實施方式中，癌症係R/R CLL。在一些實施方式中，癌症係R/R PTCL。在一些實施方式中，癌症係R/R DLBCL。在一些實施方式中，癌症係R/R MCL。在一些實施方式中，癌症係R/R FL。
治療劑和診斷劑的配製物可以藉由與生理學上可接受的載劑、賦形劑、或穩定劑以例如凍乾粉末、漿液、水性溶液、洗劑或懸浮液的形式混合來製備（參見例如，Hardman等人, Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics [Goodman和Gilman的治療的藥理學基礎], 麥格勞-希爾集團（McGraw-Hill）, 紐約市, 紐約州, 2001；Gennaro, Remington: The Science and Practice of Pharmacy [雷明頓：藥物科學與實踐], Lippincott, Williams, and Wilkins [利平科特•威廉斯和威爾金斯出版公司], 紐約, 紐約州, 2000；Avis等人 (編), Pharmaceutical Dosage Forms: parenteral Medications [藥物劑型：腸胃外用藥], Marcel Dekker [馬塞爾德克爾公司], NY [紐約市], 1993；Lieberman等人 (編輯), Pharmaceutical Dosage Forms: tablets [藥物劑型：片劑], Marcel Dekker [馬塞爾 德克爾公司], 紐約, 1990；Lieberman等人 (編), Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems [藥物劑型：分散系統], 馬塞爾•德克爾公司（Marcel Dekker）, 紐約州, 1990；Weiner和Kotkoskie, Excipient Toxicity and Safety [賦形劑毒性和安全性], 馬塞爾•德克爾公司（Marcel Dekker, Inc.）, 紐約市, 紐約州, 2000）。
為治療劑選擇投與方案取決於幾種因素，包括實體的血清或組織周轉速率、症狀水平、實體的免疫原性和生物基質中的靶細胞可及性。在某些實施方式中，投與方案使遞送至患者的治療劑的量最大化，與可接受水平的副作用一致。因此，遞送的生物製品的量部分地取決於具體實體和正在治療的病症的嚴重程度。選擇適當劑量的抗體、細胞介素和小分子的指南係可獲得的（參見例如，Wawrzynczak, Antibody Therapy [抗體療法], Bios Scientific Pub. Ltd [Bios科學出版社有限公司], Oxfordshire [牛津郡], 英國, 1996；Kresina (編輯), Monoclonal Antibodies, Cytokines and Arthritis [單株抗體、細胞介素和關節炎], Marcel Dekker [馬塞爾 德克爾公司], 紐約, 紐約州, 1991；Bach (編輯), Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases [自免疫疾病中的單株抗體和肽療法], Marcel Dekker [馬塞爾 德克爾公司], 紐約, 紐約州, 1993；Baert等人, New Engl. J. Med. [新英格蘭醫學雜誌] 348:601-608, 2003；Milgrom等人, New Engl. J. Med. [新英格蘭醫學雜誌] 341:1966-1973, 1999；Slamon等人, New Engl. J. Med. [新英格蘭醫學雜誌] 344:783-792, 2001；Beniaminovitz等人, New Engl. J. Med. [新英格蘭醫學雜誌] 342:613-619, 2000；Ghosh等人, New Engl. J. Med. [新英格蘭醫學雜誌] 348:24-32, 2003；Lipsky等人, New Engl. J. Med. [新英格蘭醫學雜誌] 343:1594-1602, 2000）。
由臨床醫生，例如，使用本領域已知或疑似影響治療或預防或預計影響治療或預防的參數或因素確定適當的劑量。通常，劑量始於或多或少小於最佳劑量的量並此後將它以小增量增加，直至相對於任何不利副作用，實現所期望的或最佳的效果。重要的診斷量值包括症狀（例如炎症）的那些量值或產生的炎性細胞介素的水平。
可以改變本發明藥物組成物中活性成分的實際劑量水平，以便獲得一定量的活性成分，該活性成分的量有效地實現對於特定的患者、組成物和投與方式的所期望的治療應答，而對患者沒有毒性。所選劑量水平取決於多種藥物動力學因素，包括所用的本發明特定組成物或其酯、鹽或醯胺的活性；投與途徑；投與時間；正在使用的特定化合物的排泄速率；治療的持續時間；與所用特定組成物組合使用的其他藥物、化合物和/或材料；正在治療的患者的年齡、性別、體重、狀況、總體健康和既往病史；以及醫學領域中已知的類似因素。
包含本發明之抗體或其片段的組成物可藉由連續輸注提供，或藉由例如一天、一週、或每週1-7次、每一週一次、每三週一次、每四週一次、每五週一次、每六週一次、每七週一次、或每八週一次的間隔劑量提供。在一個具體實施方式中，本文揭露的抗體藥物軛合物可以每三週提供一次。可藉由靜脈內、皮下、局部、口服、經鼻、經直腸、肌肉內、腦內或藉由吸入來提供劑量。特定劑量方案係一個關於避免明顯不希望的副作用的最大劑量或給藥頻率的方案。
可以使用以千克（kg）計的患者體重乘以按mg/kg計的待投與的劑量，計算本發明之抗體或其片段的劑量。對於本發明之免疫軛合物，投與於患者的劑量可以是從約0.1 mg/kg至10 mg/kg患者體重。例如，投與於患者的劑量係、係約、少於約、或至少約0.1 mg/kg、0.2 mg/kg、0.3 mg/kg、0.4 mg/kg、0.5 mg/kg、0.6 mg/kg、0.7 mg/kg、0.8 mg/kg、0.9 mg/kg、1.0 mg/kg、1.1 mg/kg、1.2 mg/kg、1.3 mg/kg、1.4 mg/kg、1.5 mg/kg、1.6 mg/kg、1.7 mg/kg、1.8 mg/kg、1.9 mg/kg、2.0 mg/kg、2.1 mg/kg、2.2 mg/kg、2.3 mg/kg、2.4 mg/kg、2.5 mg/kg、2.6 mg/kg、2.7 mg/kg、2.8 mg/kg、2.9 mg/kg、3.0 mg/kg、3.1 mg/kg、3.2 mg/kg、3.3 mg/kg、3.4 mg/kg、3.5 mg/kg、3.6 mg/kg、3.7 mg/kg、3.8 mg/kg、3.9 mg/kg、4.0 mg/kg、4.1 mg/kg、4.2 mg/kg、4.3 mg/kg、4.4 mg/kg、4.5 mg/kg、4.6 mg/kg、4.7 mg/kg、4.8 mg/kg、4.9 mg/kg、5.0 mg/kg、5.1 mg/kg、5.2 mg/kg、5.3 mg/kg、5.4 mg/kg、5.5 mg/kg、5.6 mg/kg、5.7 mg/kg、5.8 mg/kg、5.9 mg/kg、6.0 mg/kg、6.1 mg/kg、6.2 mg/kg、6.3 mg/kg、6.4 mg/kg、6.5 mg/kg、6.6 mg/kg、6.7 mg/kg、6.8 mg/kg、6.9 mg/kg、7.0 mg/kg、7.1 mg/kg、7.2 mg/kg、7.3 mg/kg、7.4 mg/kg、7.5 mg/kg、7.6 mg/kg、7.7 mg/kg、7.8 mg/kg、7.9 mg/kg、8.0 mg/kg 8.1 mg/kg、8.2 mg/kg、8.3 mg/kg、8.4 mg/kg、8.5 mg/kg、8.6 mg/kg、8.7 mg/kg、8.8 mg/kg、8.9 mg/kg、9.0 mg/kg 9.1 mg/kg、9.2 mg/kg、9.3 mg/kg、9.4 mg/kg、9.5 mg/kg、9.6 mg/kg、9.7 mg/kg、9.8 mg/kg、9.9 mg/kg、10.0 mg/kg患者體重、或在任何兩個上述值之間的範圍。在一些實施方式中，該劑量可以是0.2 mg/kg患者體重。在一些實施方式中，該劑量可以是0.4 mg/kg患者體重。在一些實施方式中，該劑量可以是0.6 mg/kg患者體重。在一些實施方式中，該劑量可以是0.8 mg/kg患者體重。在一些實施方式中，該劑量可以是1.2 mg/kg患者體重。在一些實施方式中，該劑量可以是1.6 mg/kg患者體重。在一些實施方式中，該劑量可以是2.4 mg/kg患者體重。在一些實施方式中，該劑量可以是3.6 mg/kg患者體重。在一些實施方式中，該劑量可以是4.8 mg/kg患者體重。在一些實施方式中，該劑量可以是6.0 mg/kg患者體重。
可以重複本發明之免疫軛合物的劑量並且各次投與可以相隔、相隔約、相隔小於約、或相隔至少約1天、2天、3天、5天、10天、15天、30天、45天、2月、75天、3個月、4個月、5個月、6個月、或在任何兩個上述值之間的範圍的間隔。在一些實施方式中，本發明之免疫軛合物可以每週給予兩次、每週給予一次、每兩週給予一次、每三週給予一次、每四週給予一次或較小頻率地給予。在一個具體實施方式中，本發明之免疫軛合物的劑量每3週重複一次。在一些實施方式中，可以治療患者一個週期、兩個週期、三個週期、四個週期、五個週期或更多個週期。
特定患者的有效量可以根據如以下的因素改變：所治療的病症、患者的總體健康狀況、投與之方法、途徑和劑量和副作用的嚴重程度（參見例如，Maynard等人, A Handbook of SOPs for Good Clinical Practice [用於良好臨床實踐的SOP指南], Interpharm Press [國際藥物出版社], Boca Raton, Fla. [佛羅里達州波卡拉頓], 1996；Dent, Good Laboratory and Good Clinical Practice [良好實驗和良好臨床實踐], Urch Publ. [厄奇出版社], 倫敦, 英國, 2001）。
投與途徑可以是藉由例如局部或皮膚應用、藉由皮下、靜脈內、腹膜內、腦內、肌內、眼內、動脈內、腦脊內、病灶內投與進行的注射或輸注、或藉由持續釋放系統或植入物（參見例如，Sidman等人, Biopolymers [生物聚合物] 22:547-556, 1983；Langer等人, J. Biomed.Mater. [控釋生物活性材料國際研討會學報]Res. [生物醫學材料研究雜誌] 15:167-277, 1981；Langer, Chem. Tech. [化學技術] 12:98-105, 1982；Epstein等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA [美國國家科學院院刊] 82:3688-3692, 1985；Hwang等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA [美國國家科學院院刊] 77:4030-4034, 1980；美國專利號6,350,466和6,316,024）。必要時，組成物也可以包含增溶劑或用於減輕注射部位疼痛的局部麻醉藥如利多卡因，或兩者。此外，也可以採用肺部投與，例如藉由使用吸入器或霧化器以及含有霧化劑的配製物。參見例如，美國專利號6,019,968、5,985,320、5,985,309、5,934,272、5,874,064、5,855,913、5,290,540和4,880,078；以及PCT公開號WO 92/19244、WO 97/32572, WO 97/44013、WO 98/31346和WO 99/66903，將該等專利中的每一個藉由引用以其整體併入本文。
本發明之組成物還可以經由一種或多種投與途徑、使用在本領域中已知的各種方法中的一種或多種來投與。如熟悉該項技術者將理解的，投與途經和/或模式將根據所希望的結果而變化。所選擇的用於本發明之免疫軛合物的投與途徑包括靜脈內、肌內、皮內、腹膜內、皮下、脊柱或其他腸胃外投與途徑，例如藉由注射或輸注。腸胃外投與可以代表除了腸道和局部投與以外的投與方式，通常藉由注射，並且包括但不限於靜脈內、肌內、動脈內、鞘內、囊內、眶內、心內、皮內、腹膜內、經氣管、皮下、表皮下、關節內、囊下、蛛網膜下、脊柱內、硬腦膜外以及胸骨內注射和輸注。可替代地，本發明之組成物可以經由非腸胃外途徑，如局部、表皮或黏膜投與途徑投與，例如鼻內、口服、陰道、直腸、舌下或局部投與。在一個實施方式中，藉由輸注投與本發明之免疫軛合物。在另一個實施方式中，皮下投與本發明之免疫軛合物。
如果本發明之免疫軛合物在控制釋放或持續釋放系統中投與，則可以使用泵來實現控制釋放或持續釋放（參見Langer, 同上；Sefton, CRC Crit. Ref Biomed. Eng. [CRC關鍵引用生物醫學工程] 14:20, 1987；Buchwald等人, Surgery [外科學] 88:507, 1980；Saudek等人, N. Engl. J. Med. [新英格蘭醫學雜誌] 321:574, 1989）。可以使用聚合物材料來實現本發明之療法的控制釋放或持續釋放（參見例如，Medical Applications of Controlled Release [控制釋放的醫學應用], Langer和Wise (編輯), CRC Pres. [CRC出版社], Boca Raton [波卡拉頓], Fla. [佛羅里達州], 1974；Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance [受控的藥物生物利用率、藥物產物設計以及性能], Smolen和Ball (編), Wiley [威利出版公司], New York [紐約市], 1984；Ranger和Peppas, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. [高分子科學雜誌，高分子化學評論] 23:61, 1983；還參見Levy等人, Science [科學] 228:190, 1985；During等人, Ann. Neurol. [神經學記錄] 25:351, 1989；Howard等人, J. Neurosurg. [神經外科雜誌] 7 1:105, 1989, 美國專利號5,679,377；美國專利號5,916,597；美國專利號5,912,015；美國專利號5,989,463；美國專利號5,128,326；PCT公開號WO 99/15154；以及PCT公開號WO 99/20253）。用於緩釋配製物中的聚合物的實例包括但不限於聚(甲基丙烯酸2-羥乙酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸)、聚(乙烯-共-乙酸乙烯酯)、聚(甲基丙烯酸)、聚乙交酯（PLG）、聚酸酐、聚(N-乙烯基吡咯啶酮)、聚(乙烯醇)、聚丙烯醯胺、聚(乙二醇)、聚丙交酯（PLA）、聚(丙交酯-共-乙交酯)（PLGA）以及聚原酸酯。在一個實施方式中，用於緩釋配製物的聚合物係惰性的，不含可浸出的雜質，在儲存時穩定，無菌並且可生物降解。可以將控釋系統或緩釋系統放置在預防性或治療性靶附近，因此僅要求全身性劑量的一部分（參見例如，Goodson, 於：Medical Applications of Controlled Release [控制釋放的醫學應用], 同上, 第2卷, 第115-138頁, 1984）。
控釋系統在Langer, Science [科學] 249:1527-1533, 1990的綜述中討論。可以使用熟悉該項技術者已知的任何技術來產生包含本發明之一種或多種免疫軛合物的持續釋放配製物。參見例如，美國專利號4,526,938；PCT公開WO 91/05548；PCT公開WO 96/20698；Ning等人, Radiotherapy & Oncology [放射療法與腫瘤學] 39:179-189, 1996；Song等人, PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology [PDA藥物科學與技術雜誌] 50:372-397, 1995；Cleek等人, Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. [關於生物活性材料控釋的國際研討會的議事錄] 24:853-854, 1997；和Lam等人, Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. [關於生物活性材料控釋的國際研討會的議事錄] 24:759-760, 1997，該文獻中的每一個藉由引用以其整體併入本文中。
如果局部投與本發明之免疫軛合物，則可以將它們以油膏劑、乳膏劑、透皮貼劑、洗劑、凝膠劑、噴霧劑、氣溶膠、溶液劑、乳劑的形式或熟悉該項技術者熟知的其他形式配製。參見例如，Remington's Pharmaceutical Sciences and Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms [雷明頓氏製藥科學和藥物劑型引言], 第19版, Mack Pub. Co. [馬克出版公司], Easton [ 伊斯頓], Pa. [賓夕法尼亞州] (1995)。對於不可噴霧的局部劑型，通常使用黏性至半固體或固體形式，其包含載劑或一種或多種與局部施用相容並且具有動態黏度的賦形劑，在一些情況下，其具有大於水的動態黏度。合適的配製物包括但不限於溶液、懸浮液、乳油劑、乳膏劑、軟膏劑、粉劑、搽劑、油膏劑等，如果需要，可以是滅菌的或與輔助劑（例如，防腐劑、穩定劑、潤濕劑、緩衝液、或鹽）混合，用於影響多種特性，例如滲透壓。其他合適的局部劑型包括可噴霧氣溶膠製劑，其中在一些情況下將活性成分與固體或液體惰性載劑組合包裝在具有加壓的揮發性物質（例如，氣體推進劑，諸如氟利昂（freon））的混合物中或擠瓶中。如果希望，還可以將保濕劑或濕潤劑添加到藥物組成物和劑型中。此類另外的成分的實例係本領域熟知的。
如果鼻內投與包含免疫軛合物的組成物，則可以將它以氣溶膠形式、噴霧劑、霧化劑或以滴劑形式配製。特別地，根據本發明使用的預防劑或治療劑可以在使用合適推進劑（例如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合適氣體）的情況下，以從加壓的包裝或霧化器中提供的氣溶膠噴霧劑形式便利地遞送。在加壓的氣溶膠的情況下，可以藉由提供閥門以遞送經計量的量來確定劑量單位。在吸入器或吹入器中使用的膠囊劑和藥筒（由例如明膠組成）可以配製成含有化合物和合適粉末基料諸如乳糖或澱粉的粉末混合物。
與第二治療劑（例如，細胞介素、類固醇、化學治療劑、抗生素或放射）共同投與或治療之方法在本領域中是已知的（參見例如，Hardman等人, (編輯)(2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics [Goodman和Gilman的治療的藥理學基礎], 第10版, McGraw-Hill [麥格勞-希爾集團], 紐約市, 紐約州；Poole和Peterson (編輯)(2001) Pharmacotherapeutics for Advanced Practice: A Practical Approach [用於先進實踐的藥物治療學：實用方法], Lippincott, Williams & Wilkins [利平科特、威廉姆斯和威爾金斯出版社], Phila., Pa. [賓夕法尼亞州費城市]；Chabner和Longo (編)(2001) Cancer Chemotherapy and Biotherapy [癌症化學療法和生物療法], Lippincott, Williams & Wilkins [利平科特、威廉姆斯和威爾金斯出版社], Phila., Pa. [賓夕法尼亞州費城市]）。治療劑的有效量可以將症狀減少至少10%；至少20%；至少約30%；至少40%、或至少50%。
可以與本發明之免疫軛合物組合投與的另外療法（例如，預防劑或治療劑）可以與本發明之免疫軛合物相隔少於5分鐘、相隔少於30分鐘、相隔1小時、相隔約1小時、相隔約1小時至約2小時、相隔約2小時至約3小時、相隔約3小時至約4小時、相隔約4小時至約5小時、相隔約5小時至約6小時、相隔約6小時至約7小時、相隔約7小時至約8小時、相隔約8小時至約9小時、相隔約9小時至約10小時、相隔約10小時至約11小時、相隔約11小時至約12小時、相隔約12小時至18小時、相隔18小時至24小時、相隔24小時至36小時、相隔36小時至48小時、相隔48小時至52小時、相隔52小時至60小時、相隔60小時至72小時、相隔72小時至84小時、相隔84小時至96小時、或相隔96小時至120小時進行投與。兩種或更多種療法可以在同一患者訪視中投與。
在某些實施方式中，可以配製本發明之免疫軛合物以確保適當的體內分佈。例如，血腦屏障（BBB）排除許多高度親水性化合物。為了確保本發明之治療性化合物穿過BBB（如果需要），可以將它們配製在例如脂質體中。對於製備脂質體之方法，參見，例如，美國專利號4,522,811；5,374,548；和5,399,331。脂質體可以包含一個或多個被選擇性轉運至特定細胞或器官中的部分，因而增強靶向的藥物遞送（參見例如，Ranade, (1989) J. Clin. Pharmacol. [臨床藥理學雜誌] 29:685）。示例性的靶向部分包括葉酸或生物素（參見，例如，Low等人的美國專利號5,416,016）；甘露糖苷（Umezawa等人, (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun.[生物化學與生物物理研究通訊] 153:1038）；抗體（Bloeman等人, 1995, FEBS Lett.[歐洲生化學會聯合會快報] 357:140；Owais等人, (1995) Antimicrob. Agents Chemother. [抗微生物劑化學療法] 39:180）；表面活性劑蛋白A受體（Briscoe等人, (1995) Am. J. Physiol.[美國生理學雜誌] 1233:134）；p 120 （Schreier等人, (1994) J. Biol. Chem.[生物化學雜誌] 269:9090）；還參見K. Keinanen; M. L. Laukkanen (1994) FEBS Lett.[歐洲生化學會聯合會快報] 346:123；J. J. Killion; I. J. Fidler (1994) Immunomethods[免疫方法] 4:273。
本發明提供了用於向有需要的受試者單獨或與其他療法組合投與包含本發明之免疫軛合物的藥物組成物的方案。本發明之組合療法的療法（例如，預防劑或治療劑）可以同時或順序地投與於受試者。本發明之組合療法的療法（例如，預防劑或治療劑）也可以循環投與。循環療法關於投與第一療法（例如，第一預防劑或治療劑）一段時間，隨後投與第二療法（例如，第二預防劑或治療劑）一段時間並重複這種依序投與，即，該循環，以減少對一種療法（例如，藥劑）的耐藥性形成，以避免或減少一種療法（例如，藥劑）的副作用和/或以改善療法的功效。
本發明之組合療法的療法（例如，預防劑或治療劑）可以並行投與於受試者。
術語「並行」不限於在完全相同的時間投與療法（例如，預防劑或治療劑），而是意指將包含抗體或其片段的藥物組成物以這樣的順序並在這樣的時間間隔內投與至受試者，該順序和該時間間隔使得本發明之抗體藥物軛合物可以與一種或多種其他療法一起發揮作用，以提供與如果另外投與它們相比增加的益處。例如，可以將每種療法在相同的時間或以任何次序依序在不同的時間點投與至受試者；然而，如果不在相同的時間投與，則應當在時間上充分接近地投與該療法，以提供所希望的治療或預防作用。可以將每種療法以任何適當的形式和藉由任何合適的途徑分別投與至受試者。在多種實施方式中，將療法（例如，預防劑或治療劑）相隔少於5分鐘、相隔少於15分鐘、相隔少於30分鐘、相隔少於1小時、相隔約1小時、相隔約1小時至約2小時、相隔約2小時至約3小時、相隔約3小時至約4小時、相隔約4小時至約5小時、相隔約5小時至約6小時、相隔約6小時至約7小時、相隔約7小時至約8小時、相隔約8小時至約9小時、相隔約9小時至約10小時、相隔約10小時至約11小時、相隔約11小時至約12小時、相隔24小時、相隔48小時、相隔72小時、或相隔1週投與於受試者。在其他實施方式中，將兩種或更多種療法（例如，預防劑或治療劑）在同一患者訪視中投與。
組合療法的預防劑或治療劑可以在同一種藥物組成物中投與至受試者。可替代地，組合療法的預防劑或治療劑可以在單獨的藥物組成物中並行投與至受試者。預防劑或治療劑可以藉由相同或不同投與途徑投與至受試者。組合療法的預防劑或治療劑可以在同一種藥物組成物中投與至受試者。可替代地，組合療法的預防劑或治療劑可以在單獨的藥物組成物中並行投與至受試者。預防劑或治療劑可以藉由相同或不同投與途徑投與至受試者。實例 實例 1 ：抗 CCR7 抗體的產生 人、大鼠、小鼠和食蟹猴 CCR7 的表現構建體的產生
基於來自GenBank或Uniprot數據庫的胺基酸序列（SEQ ID NO: 97、SEQ ID NO: 99、SEQ ID NO: 101），合成全長人、食蟹猴（cynomolgus monkey）和小鼠CCR7基因。基於使用從各種大鼠組織分離的mRNA所生成的胺基酸序列資訊（SEQ ID NO: 103），基因合成大鼠CCR7 cDNA模板。將所有合成的DNA片段選殖到合適的表現載體中。 [表2]：CCR7的胺基酸和核苷酸序列資訊
人 CCR7  
SEQ ID NO: 97 MDLGKPMKSVLVVALLVIFQVCLCQDEVTDDYIGDNTTVDYTLFESLCSKKDVRNFKAWFLPIMYSIICFVGLLGNGLVVLTYIYFKRLKTMTDTYLLNLAVADILFLLTLPFWAYSAAKSWVFGVHFCKLIFAIYKMSFFSGMLLLLCISIDRYVAIVQAVSAHRHRARVLLISKLSCVGIWILATVLSIPELLYSDLQRSSSEQAMRCSLITEHVEAFITIQVAQMVIGFLVPLLAMSFCYLVIIRTLLQARNFERNKAIKVIIAVVVVFIVFQLPYNGVVLAQTVANFNITSSTCELSKQLNIAYDVTYSLACVRCCVNPFLYAFIGVKFRNDLFKLFKDLGCLSQEQLRQWSSCRHIRRSSMSVEAETTTTFSP
SEQ ID NO: 98 ATGGACCTGGGGAAACCAATGAAAAGCGTGCTGGTGGTGGCTCTCCTTGTCATTTTCCAGGTATGCCTGTGTCAAGATGAGGTCACGGACGATTACATCGGAGACAACACCACAGTGGACTACACTTTGTTCGAGTCTTTGTGCTCCAAGAAGGACGTGCGGAACTTTAAAGCCTGGTTCCTCCCTATCATGTACTCCATCATTTGTTTCGTGGGCCTACTGGGCAATGGGCTGGTCGTGTTGACCTATATCTATTTCAAGAGGCTCAAGACCATGACCGATACCTACCTGCTCAACCTGGCGGTGGCAGACATCCTCTTCCTCCTGACCCTTCCCTTCTGGGCCTACAGCGCGGCCAAGTCCTGGGTCTTCGGTGTCCACTTTTGCAAGCTCATCTTTGCCATCTACAAGATGAGCTTCTTCAGTGGCATGCTCCTACTTCTTTGCATCAGCATTGACCGCTACGTGGCCATCGTCCAGGCTGTCTCAGCTCACCGCCACCGTGCCCGCGTCCTTCTCATCAGCAAGCTGTCCTGTGTGGGCATCTGGATACTAGCCACAGTGCTCTCCATCCCAGAGCTCCTGTACAGTGACCTCCAGAGGAGCAGCAGTGAGCAAGCGATGCGATGCTCTCTCATCACAGAGCATGTGGAGGCCTTTATCACCATCCAGGTGGCCCAGATGGTGATCGGCTTTCTGGTCCCCCTGCTGGCCATGAGCTTCTGTTACCTTGTCATCATCCGCACCCTGCTCCAGGCACGCAACTTTGAGCGCAACAAGGCCATCAAGGTGATCATCGCTGTGGTCGTGGTCTTCATAGTCTTCCAGCTGCCCTACAATGGGGTGGTCCTGGCCCAGACGGTGGCCAACTTCAACATCACCAGTAGCACCTGTGAGCTCAGTAAGCAACTCAACATCGCCTACGACGTCACCTACAGCCTGGCCTGCGTCCGCTGCTGCGTCAACCCTTTCTTGTACGCCTTCATCGGCGTCAAGTTCCGCAACGATCTCTTCAAGCTCTTCAAGGACCTGGGCTGCCTCAGCCAGGAGCAGCTCCGGCAGTGGTCTTCCTGTCGGCACATCCGGCGCTCCTCCATGAGTGTGGAGGCCGAGACCACCACCACCTTCTCCCCA
食蟹猴 CCR7   
SEQ ID NO: 99 MDLGKPMKSVLVVALLVIFQVCLCQDEVTDDYIGDNTTVDYTLFESLCSKKDVRNFKAWFLPIMYSIICFVGLLGNGLVVLTYIYFKRLKTMTDTYLLNLAVADILFLLTLPFWAYSAAKSWVFGVHFCKLIFAIYKMSFFSGMLLLLCISIDRYVAIVQAVSAHRHRARVLLISKLSCVGIWILATVLSIPELLYSGLQRSSSEQAMRCSLITEHVEAFITIQVAQMVIGFLVPLLAMSFCYLVIIRTLLQARNFERNKAIKVIIAVVVVFIVFQLPYNGVVLAQTVANFNITSSTCELSKQLNIAYDVTYSLACVRCCVNPFLYAFIGVKFRNDLFKLFKDLGCLSQEQLRQWSSCRHIRRSSMSVEAETTTTFSP
SEQ ID NO: 100 ATGGACCTGGGGAAACCAATGAAAAGCGTGCTGGTGGTGGCTCTCCTTGTCATTTTCCAGGTATGCCTGTGTCAAGATGAGGTCACGGACGATTACATCGGAGACAACACCACAGTGGACTACACTTTGTTCGAGTCTTTGTGCTCCAAGAAGGACGTGCGGAACTTTAAAGCCTGGTTCCTCCCTATCATGTACTCCATCATTTGTTTCGTGGGCCTACTGGGCAATGGGCTGGTCGTGTTGACCTATATCTATTTCAAGAGGCTCAAGACCATGACCGATACCTACCTGCTCAACCTGGCGGTGGCAGACATCCTCTTCCTCCTGACCCTTCCCTTCTGGGCCTACAGCGCGGCCAAGTCCTGGGTCTTCGGTGTCCACTTTTGCAAGCTCATCTTTGCCATCTACAAGATGAGCTTCTTCAGTGGCATGCTCCTACTTCTTTGCATCAGCATTGACCGCTACGTGGCCATCGTCCAGGCTGTCTCAGCTCACCGCCACCGTGCCCGCGTCCTTCTCATCAGCAAGCTGTCCTGTGTGGGCATCTGGATACTAGCCACAGTGCTCTCCATCCCAGAGCTCCTGTACAGTGGCCTCCAGAGGAGCAGCAGTGAGCAAGCGATGCGATGCTCTCTCATCACAGAGCATGTGGAGGCCTTTATCACCATCCAGGTGGCCCAGATGGTGATCGGCTTTCTGGTCCCCCTGCTGGCCATGAGCTTCTGTTACCTTGTCATCATCCGCACCCTGCTCCAGGCACGCAACTTTGAGCGCAACAAGGCCATCAAGGTGATCATCGCTGTGGTCGTGGTCTTCATAGTCTTCCAGCTGCCCTACAATGGGGTGGTCCTGGCCCAGACGGTGGCCAACTTCAACATCACCAGTAGCACCTGTGAGCTCAGTAAGCAACTCAACATCGCCTACGACGTCACCTACAGCCTGGCCTGCGTCCGCTGCTGCGTCAACCCTTTCTTGTACGCCTTCATCGGCGTCAAGTTCCGCAACGATCTCTTCAAGCTCTTCAAGGACCTGGGCTGCCTCAGCCAGGAGCAGCTCCGGCAGTGGTCTTCCTGTCGGCACATCCGGCGCTCCTCCATGAGTGTGGAGGCCGAGACCACCACCACCTTCTCCCCA
小鼠 CCR7   
SEQ ID NO: 101 MDPGKPRKNVLVVALLVIFQVCFCQDEVTDDYIGENTTVDYTLYESVCFKKDVRNFKAWFLPLMYSVICFVGLLGNGLVILTYIYFKRLKTMTDTYLLNLAVADILFLLILPFWAYSEAKSWIFGVYLCKGIFGIYKLSFFSGMLLLLCISIDRYVAIVQAVSAHRHRARVLLISKLSCVGIWMLALFLSIPELLYSGLQKNSGEDTLRCSLVSAQVEALITIQVAQMVFGFLVPMLAMSFCYLIIIRTLLQARNFERNKAIKVIIAVVVVFIVFQLPYNGVVLAQTVANFNITNSSCETSKQLNIAYDVTYSLASVRCCVNPFLYAFIGVKFRSDLFKLFKDLGCLSQERLRHWSSCRHVRNASVSMEAETTTTFSP
SEQ ID NO: 102 ATGGACCCAGGGAAACCCAGGAAAAACGTGCTGGTGGTGGCTCTCCTTGTCATTTTCCAGGTGTGCTTCTGCCAAGATGAGGTCACCGATGACTACATCGGCGAGAATACCACGGTGGACTACACCCTGTACGAGTCGGTGTGCTTCAAGAAGGATGTGCGGAACTTTAAGGCCTGGTTCCTGCCTCTCATGTATTCTGTCATCTGCTTCGTGGGCCTGCTCGGCAACGGGCTGGTGATACTGACGTACATCTATTTCAAGAGGCTCAAGACCATGACGGATACCTACCTGCTCAACCTGGCCGTGGCAGACATCCTTTTCCTCCTGATTCTTCCCTTCTGGGCCTACAGCGAAGCCAAGTCCTGGATCTTTGGCGTCTACCTGTGTAAGGGCATCTTTGGCATCTATAAGTTAAGCTTCTTCAGCGGGATGCTGCTGCTCCTATGCATCAGCATTGACCGCTACGTAGCCATCGTCCAGGCCGTGTCGGCTCATCGCCACCGCGCCCGCGTGCTTCTCATCAGCAAGCTGTCCTGTGTGGGCATCTGGATGCTGGCCCTCTTCCTCTCCATCCCGGAGCTGCTCTACAGCGGCCTCCAGAAGAACAGCGGCGAGGACACGCTGAGATGCTCACTGGTCAGTGCCCAAGTGGAGGCCTTGATCACCATCCAAGTGGCCCAGATGGTTTTTGGGTTCCTAGTGCCTATGCTGGCTATGAGTTTCTGCTACCTCATTATCATCCGTACCTTGCTCCAGGCACGCAACTTTGAGCGGAACAAGGCCATCAAGGTGATCATTGCCGTGGTGGTAGTCTTCATAGTCTTCCAGCTGCCCTACAATGGGGTGGTCCTGGCTCAGACGGTGGCCAACTTCAACATCACCAATAGCAGCTGCGAAACCAGCAAGCAGCTCAACATTGCCTATGACGTCACCTACAGCCTGGCCTCCGTCCGCTGCTGCGTCAACCCTTTCTTGTATGCCTTCATCGGCGTCAAGTTCCGCAGCGACCTCTTCAAGCTCTTCAAGGACTTGGGCTGTCTCAGCCAGGAACGGCTCCGGCACTGGTCTTCCTGCCGGCATGTACGGAACGCGTCGGTGAGCATGGAGGCGGAGACCACCACAACCTTCTCCCCG
大鼠 CCR7   
SEQ ID NO: 103 MDLGKPTKNVLVVALLVIFQVCFCQDEVTDDYIGENTTVDYTLYESVCFKKDVRNFKAWFLPLMYSVICFVGLLGNGLVVLTYIYFKRLKTMTDTYLLNLAVADILFLMILPFWAYSEAKSWIFGAYLCKSIFGIYKLSFFSGMLLLLCISIDRYVAIVQAVSAHRHRARVLLISKLSCIGIWTLAFFLSIPELLYSGLQKNSGEDTWRCSLVSAQVEALIAIQVAQMVVGFVLPMLAMSFCYLVIIRTLLQARNFERNKAIKVIIAVVVVFVVFQLPYNGVVLAQTVANFNITNSSCEASKQLNIAYDVTYSLASVRCCVNPFLYAFIGVKFRSDLFKLFKDLGCLSQERLRQWSSCRHVRHTSVSMEAETTTTFSP
SEQ ID NO: 104 ATGGACCTGGGGAAGCCCACGAAAAACGTGCTGGTGGTGGCTCTCCTGGTCATTTTCCAGGTGTGCTTCTGCCAAGATGAGGTCACAGACGACTACATCGGCGAGAACACCACCGTGGACTACACCCTGTATGAGTCGGTGTGCTTCAAGAAGGATGTGCGGAACTTTAAGGCCTGGTTCCTCCCTCTCATGTACTCAGTCATTTGCTTCGTGGGCCTGCTAGGCAATGGGCTGGTGGTGCTGACATACATCTATTTCAAGAGACTGAAGACCATGACGGATACCTACCTGCTCAACCTGGCCGTGGCAGACATCCTCTTCCTCATGATCCTTCCCTTCTGGGCCTACAGCGAAGCCAAGTCCTGGATCTTTGGTGCCTACCTGTGTAAGAGCATCTTTGGCATCTACAAGTTAAGCTTCTTCAGCGGGATGTTGCTGCTCCTGTGTATCAGCATTGACCGCTATGTGGCCATCGTCCAGGCCGTGTCAGCCCACCGGCACCGCGCCCGCGTGCTTCTCATCAGCAAGCTGTCCTGTATAGGCATCTGGACGCTGGCCTTTTTCCTTTCTATCCCTGAGCTGCTCTACAGCGGCCTCCAGAAGAACAGCGGCGAGGACACGTGGAGATGCTCCCTGGTCAGTGCCCAAGTGGAGGCCTTGATCGCCATCCAAGTGGCCCAGATGGTTGTTGGGTTTGTACTGCCTATGCTGGCTATGAGTTTCTGCTACCTGGTTATCATCCGCACTCTGCTCCAGGCGCGAAACTTCGAGCGGAACAAGGCCATCAAGGTGATCATCGCTGTGGTCGTAGTGTTCGTCGTCTTCCAGCTGCCCTACAATGGGGTGGTCCTGGCCCAGACCGTGGCCAATTTCAACATCACCAATAGCAGCTGCGAAGCCAGCAAGCAGCTCAACATTGCCTATGACGTCACCTACAGCCTGGCCTCCGTCCGCTGCTGTGTCAACCCTTTCTTGTATGCCTTCATCGGCGTCAAGTTCCGCAGCGACCTCTTCAAGCTCTTCAAGGACTTGGGCTGCCTCAGCCAGGAACGGCTCCGGCAGTGGTCTTCCTGCCGCCATGTACGGCACACGTCCGTGAGCATGGAGGCGGAGACTACCACCACCTTCTCCCCG
穩定表現 CCR7 的細胞系的產生
使用逆轉錄病毒轉導產生穩定表現CCR7的細胞系。遵循製造商的建議使用Fugene 6轉染試劑（普洛麥格公司（Promega），美國，目錄號E2692）、用CCR7逆轉錄病毒表現載體和pCL-Eco或pCL-10A1包裝載體（諾維斯公司（Novus），美國，目錄號NBP2-29540或NBP2-2952）共轉染293T細胞。將細胞在37ºC的濕潤CO2 培養箱中孵育，並且在轉染後48小時收集病毒上清液。使NIH/3T3和300.19細胞生長至接近匯合的單層。從細胞去除生長培養基，並且在8 ug聚凝胺/ml（最終濃度）（EMD密理博公司（EMD Millipore），目錄號TR-1003-G）的存在下添加病毒上清液。在37°C下孵育3-6小時後，添加新鮮的介質。然後在適當的選擇條件下培養細胞以產生穩定表現CCR7的細胞系。病毒樣顆粒（ VLP ）的產生、表現和純化
將HEK293T或NIH/3T3細胞維持在具有10% FBS的DMEM中。為製備VLP，將細胞交換到具有4% FBS的DMEM中，然後與CCR7表現質體和逆轉錄病毒Gag表現質體按µg比率為3 : 2共轉染。轉染後48小時，收集細胞上清液，並在臺式離心機中藉由以2500 xg 離心5 min使上清液澄清，並保持在冰上。在Sorvall RC 6+超速離心機中的貝克曼（Beckman）Coulter SW 32 Ti轉頭中，通過在貝克曼Ultra-Clear 38 ml離心管（目錄號344058）中的20%蔗糖墊、藉由以100,000 xg 超速離心將VLP進行純化。將所得沈澱重懸於300 µl冷的無菌PBS中，並使用BCA測定（Pierce目錄號23225）進行定量。CCR7 免疫原支架的結構衍生性產生
G偶聯蛋白受體家族的成員係含有7個跨膜螺旋（TM1…TM7）的膜蛋白，每個跨膜螺旋藉由不同長度的連接序列連接。蛋白質的胺基末端在細胞表面的外側，這表明蛋白質的4個區域潛在地暴露在細胞表面上，即胺基末端（N末端）和3個細胞外環區（EC1、EC2和EC3）。因此，該等區域可用作抗體的抗原。
設想，可以將這4個條目中的一個或多個的組合插入到可溶性蛋白質支架中，以在結構上接近CCR7的細胞外暴露區域。
為了確定CCR7的最佳細胞外區域，使用緊密同源物CXCR4的晶體結構（Wu等人, 「Structures of the CXCR4 chemokine GPCR with small-molecule and cyclic peptide antagonists [具有小分子和環肽拮抗劑的CXCR4趨化因子GPCR的結構].」 (2010) Science [科學] 330: 1066-1071），使用CXCR4結構與蛋白質數據庫條目（3ODU、3OE0、3OE6、3OE8、3OE9）的組合和建模軟體建立模型。從模型推斷連接的跨膜螺旋間隙的胺基酸暴露於蛋白質的表面上。該等區域在下表3中鑒定。 [表3]：CCR7免疫原支架的胺基酸和核苷酸序列資訊
SEQ ID NO: 描述 注解
105 CCR7 （NP_001829.1| C-C趨化因子受體類型7） MDLGKPMKSVLVVALLVIFQVCLC QDEVTDDYIGDNTTVDYTLFESLCSKKDVR NFKAWFLPIMYSIICFVGLLGNGLVVLTYIYFKRLKTMTDTYLLNLAVADILFLLTLPFWAYSAAKSWVFGVH FCKLIFAIYKMSFFSGMLLLLCISIDRYVAIVQAVSAHRHRARVLLISKLSCVGIWILATVLSIPELL YSDLQRSSSEQAMRCSLIT EHVEAFITIQVAQMVIGFLVPLLAMSFCYLVIIRTLLQARNFERNKAIKVIIAVVVVFIVFQLPYNGVVLAQTVANFNITSST CELSKQLNIAYDVTYSLACVRCCVNPFLYAFIGVKFRNDLFKLFKDLGCLSQEQLRQWSSCRHIRRSSMSVEAETTTTFSP    CCR7，先質。 細胞外區域以粗體突出顯示。 插入區域或其衍生物以粗體示出且加底線。
106 N末端 QDEVTDDYIGDNTTVDYTLFESLCSKKDVR CCR7 N末端細胞外序列
107 EC1 KSWVFGVH CCR7細胞外環1
108 EC2 YSDLQRSSSEQAMRCSLIT CCR7細胞外環2
109 EC3 FNITSST CCR7細胞外環3
110 EC2_C24S YSDLQRSSSEQAMRSSLIT   
111 H_MGFTX1 EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSDYGMLWVRQAPEKGLEWIAYISSGSSTIYYADRVKGRFTISRDNAKNTLFLQMTSLRSEDTAMYYCSTGTFAYWGQGTPVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDC 小鼠Fab支架的重鏈
112 L_MGFTX1 DVVMTQNPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLIYNNGNTYLHWYRQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPFTFGSGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC    小鼠Fab支架的輕鏈
113 H_FabCCR7M1 QDEVTDDYIGDNTTVDYTLFESLCSKKDVR EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSDYGMLWVRQAPEKGLEWIAYISSGSSTIYYADRVKGRFTISRDNAKNTLFLQMTSLRSEDTAMYYCSTGT YSDLQRSSSEQAMRSSLIT FAYWGQGTPVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDC 插入N末端和EC2的Fab重鏈。 插入的序列加底線且以粗體示出
114 H_FabCCR7M1 CAAGATGAGGTCACGGACGATTACATCGGAGACAACACCACAGTGGACTACACTTTGTTCGAGTCTTTGTGCTCCAAGAAGGACGTGCGGgaggtgcagctggtggagtctggtggtggtctggtcaagcctggaggttccctgaaactgagttgtgccgcatctgggtttacattctctgactacggaatgctgtgggtgaggcaggcaccagagaagggcctggaatggatcgcttatatttccagcggatctagtactatctactatgcagacagggtcaagggccggttcaccattagcagagataacgccaaaaataccctgtttctgcagatgacatcactgaggtccgaggataccgctatgtattattgctccacagggactTACAGTGACCTCCAGAGGAGCAGCAGTGAGCAAGCGATGCGATCCTCTCTCATCACAtttgcttactggggacaggggacacccgtgaccgtcagctcagccaagaccaccccccccagcgtgtaccctctggcccctggctctgccgcccagaccaacagcatggtgaccctgggctgcctggtgaagggctacttccccgagcccgtgaccgtgacctggaacagcggcagcctgagcagcggcgtgcacaccttccccgccgtgctgcagagcgacctgtacaccctgagcagctctgtgaccgtgcccagcagcacctggcccagcgagaccgtgacatgcaacgtggcccaccccgccagctccaccaaggtggacaagaaaatcgtgccccgggactgc HFabCCR7M1重鏈的DNA序列。插入的序列以大寫體示出
115 L_MGFTX1 atgtcgtgatgactcagaatccactgtccctgcctgtgtccctgggcgatcaggcttccattagctgtcgttcctctcagtccctgatctacaacaatggtaacacctacctgcactggtatagacagaagcccggccagtcccctaagctgctgatctacaaagtgagtaataggttctcaggagtcccagaccggttttccggcagcggatctgggaccgatttcacactgaaaatctctagggtggaggccgaagacctgggcgtctacttttgtagtcagagcactcacgtccccttcaccttcggcagcggaacaaaactggaaatcaagcgcgctgatgccgcccctaccgtgagcatcttcccccccagcagcgagcagctgaccagcggcggagccagcgtggtgtgcttcctgaacaacttctaccccaaggacatcaacgtgaagtggaagatcgacggcagcgagcggcagaacggcgtgctgaacagctggaccgaccaggacagcaaggactccacctacagcatgagcagcaccctgaccctgaccaaggacgagtacgagcggcacaacagctacacctgcgaggccacccacaagaccagcaccagccccatcgtgaagagcttcaaccggaacgagtgc L_MGFTX1的DNA序列
環EC1和EC3的小尺寸以及EC3與其他三個區域的空間分離優先使用N末端和EC2環作為候選表位。
對N末端序列到小鼠Fab（其中EC2序列插入到Fab的各個環區中，如在框架1、CDR-H3或CDR3-H1中）的晶體結構中的融合物建模顯示如果假設在兩個序列中具有一定程度的靈活性，則該等可以是CCR7中該等區域的結構的合理近似。用於小鼠免疫的免疫原支架產生
用於小鼠免疫的移植構建體藉由以下方式產生：將來自表3的N末端序列與小鼠Fab支架的重鏈的N末端融合（命名為MGFTX1）並且將EC2序列的修飾形式（其中位置24處的半胱胺酸殘基突變為絲胺酸）（表3和SEQ ID NO: 113的加底線 + 加粗的序列）移植到MGFTX1支架的CDR3中，然後產生重鏈免疫球蛋白鏈和輕鏈免疫球蛋白鏈以生成最終的蛋白質構建體。因此，命名為FabCCR7M1的構建體含有小鼠框架，該小鼠框架應係免疫耐受的、與小鼠免疫應答所針對的人序列結合。
將N末端序列與MGFTX1支架的重鏈直接融合。基於可用的結構或同源性模型數據，選擇EC2的插入點作為CDR環的中點。使用標準分子生物學方法、利用編碼相關序列的重組DNA產生Fab移植蛋白。
例如，將含有EC2的每種抗體的可變區插入到合成的重鏈CDR3中。經由PCR擴增編碼可變區的DNA，並且將所得的片段亞選殖到含有輕鏈恒定區或重鏈恒定區和Fc區的載體中。以這種方式產生FabCCR7M1蛋白，該等蛋白對應於N末端的融合和EC2到H3中的插入。所得的構建體示於表3中。重鏈載體和輕鏈載體的適當組合的轉染導致含有一個N末端和一個EC2分子的重組Fab的表現。
選擇哪個CDR用於移植係基於環的暴露和N末端的接近度的參數來確定。此時，由於融合和移植後環的靈活性，建模軟體僅部分地用於預測哪個CDR和CDR內的哪個位置將提供所需參數。MGFTX1支架與EC2_C24S（表3，SEQ ID NO: 110）組合的結構顯示了序列係暴露的和靈活的，如藉由缺乏大多數序列的電子密度判斷的。
總之，CDR中的插入點係在結構基礎上選擇的，假設了移植到CDR中將提供與天然抗原一定程度的結構相似性。雜交瘤的產生
使用要求在多個位點處重複免疫（RIMMS）的程序（McIntyre GD. Hybridoma [雜交瘤] 1997），將Bcl-2轉基因小鼠（C57BL/6-Tgn (bcl-2) 22 WEHI菌株）用抗原進行免疫。簡而言之，在外周淋巴結（PLN）近側的8個特定位點處向小鼠注射用1-3 µg CCR7免疫原。該過程在12天期間內重複8次。在第12天，收集測試出血並藉由FACS分析血清抗體滴定度。在一些情況下，將BALB/c和/或C57Bl/6小鼠用穩定過表現人CCR7（SEQ ID NO: 97）的NIH3T3或300.19細胞免疫。向動物皮下注射在PBS中的5 X 106 個細胞，一個月一次，持續3個月，隨後用25 µg表現人CCR7的VLP靜脈內增強。增強後兩天，收集測試出血並藉由FACS分析血清抗體滴定度。從高滴定度小鼠中取出脾臟和彙集的PLN。為收穫淋巴細胞，將脾和PLN用DMEM洗滌兩次，並然後通過70微米篩網（Falcon#352350）解離。將所得淋巴細胞在Cytofusion培養基（BTXpress Cytofusion®電穿孔培養基，目錄號47001）中融合之前再洗滌2次。
對於融合，將F0骨髓瘤細胞與淋巴細胞按1 : 4比率混合。將細胞混合物離心，懸浮在Cytofusion培養基中，並隨後添加到電融合室（哈佛儀器同軸腔室9 ML 部件編號470020）中。按照製造商的說明書，使用CEEF-50B雜交免疫（Hybrimune）/雜交瘤系統（細胞波科學公司（Cyto Pulse Sciences, Inc））進行電融合。允許融合的細胞在室中恢復5 min，在不含HAT的融合培養基（DMEM + 20% FBS，1%青/鏈黴素/葡萄糖，1X NEAA，0.5X HFCS）中1/10稀釋並在37°C下放置1小時。添加4X HAT培養基（DMEM + 20% FBS，1%青/鏈黴素/葡萄糖，1X NEAA，4X HAT，0.5X HFCS）以製得1X溶液，並且調整密度至1.67 X 104 個細胞/ml。將細胞以60 µl/孔鋪板於384孔板中。FACS 篩選
融合後10天，使用流動式細胞測量術篩選雜交瘤板中CCR7特異性抗體的存在，以確認候選抗體與穩定過表現或內源性表現CCR7的細胞系的特異性結合。將細胞用PBS徹底沖洗並且用Accutase（密理博公司#SCR005）處理以從生長板上提起並重懸於冷的PBS中。根據製造商的指導，將細胞生物素化、用螢光染料（FluoReporter細胞表面生物素化套組（kit），賽默飛世爾科技公司（Thermo Fisher Scientific）目錄號F-20650；PE-Cy7鏈黴親和素，賽默飛世爾科技公司目錄號SA1012）標記。將細胞以大約1 X 106 個細胞/ml重懸於FACS緩衝液（1X DPBS，3% FBS，5 mM EDTA，0.1%疊氮化鈉）中。在384孔板中，將20 µL的雜交瘤上清液預接種並添加20 µL的細胞懸浮液。將細胞在4°C下孵育1小時，用冷的FACS緩衝液洗滌兩次，並重懸於20 µL的1 : 400第二抗體FACS緩衝液（別藻藍素軛合的F(ab')2山羊抗人IgG，Fcγ特異性；傑克遜免疫研究公司，目錄號109-136-098）中。在4°C下再孵育45 min後，將細胞用FACS緩衝液洗滌兩次並重懸於20 uL FACS緩衝液 + 2 µg/ml碘化丙啶（西格瑪奧德里奇公司（Sigma Aldrich）目錄號P4864-10ML）中。使用FlowJo™軟體在活的單一細胞上計算幾何平均螢光強度。抗體純化
製備包含鼠類可變區和人恒定區的嵌合抗體。另外，設計包含半胱胺酸突變（例如，重鏈的位置K360C、或位置E152C和S375C處的半胱胺酸）的嵌合形式以用於如本文中進一步詳細描述那樣軛合藥物部分和製備ADC。獲得雜交瘤的可變區（VH和VL）DNA序列用於產生針對選擇的雜交瘤mAb121G12、mAb506E15、mAb674J13和mAb684E12中的每一種的優化序列（例如，較佳的是特徵人源化）。使用標準方法，藉由RACE從獲自每種所選雜交瘤細胞系的RNA擴增來自鼠單株抗體的可變區DNA。分別針對674J13、121G12、506E15和684E12雜交瘤中每一種的每條鼠類可變重鏈/輕鏈的多肽序列示出在SEQ ID NO: 128/SEQ ID NO: 144、SEQ ID NO: 160/SEQ ID NO: 176、SEQ ID NO: 192/SEQ ID NO: 208和SEQ ID NO: 224/SEQ ID NO: 240中。針對每一種雜交瘤的對應衍生的可變重鏈/輕鏈核苷酸序列示出在SEQ ID NO: 129/SEQ ID NO: 145、SEQ ID NO: 161/SEQ ID NO: 177、SEQ ID NO: 193/SEQ ID NO: 209和SEQ ID NO: 225/SEQ ID NO: 241中。為了製備嵌合抗體，將編碼雜交瘤VL和VH結構域的DNA序列亞選殖到表現載體中，該等表現載體含有對應的人野生型或工程化Cys或D265A/P329A（DAPA）突變重鏈和人輕鏈恒定區序列（IgG1，κ）。抗體的人源化
設計可變區構建體以實現序列的人源化和優化（例如，去除翻譯後修飾、非較佳的位點等），從而包含半胱胺酸突變（例如重鏈的位置K360C、或位置E152C和S375C處的半胱胺酸）用於如本文進一步詳細描述那些軛合藥物部分和製備ADC；以及Fc效應子突變的修飾（例如Fc區中的D265A/P329A），從而包含具有降低的Fc效應子功能的構建體，及其組合。
編碼人源化VL和VH結構域的DNA序列以GeneArt（生命技術公司（Life Technologies Inc.），雷根斯堡（Regensburg），德國）訂購，包含針對灰倉鼠（Cricetulus griseus）優化的密碼子。將編碼VL和VH結構域的序列從GeneArt來源的載體亞選殖到適於在哺乳動物細胞中產生蛋白質的表現載體中。將重鏈和輕鏈選殖到單獨的表現運載體中以允許共轉染。
藉由使用PEI（聚乙烯亞胺，MW 25,000線性，Polysciences公司，美國，目錄號23966）作為轉染試劑將載體共轉染到Freestyle™ 293表現細胞（英傑公司，美國）中來產生重組抗體（IgG1，κ）。藉由在室溫（RT）下將1 g PEI溶解在900 ml細胞培養級水中來製備PEI原液。為了有利於PEI溶解，藉由添加HCl將溶液酸化至pH 3-5，然後用NaOH中和至最終pH為7.05。最終，將體積調整至1 L並且將溶液通過0.22 um過濾器無菌過濾、等分並且冷凍在80oC下，直到進一步使用。
將Freestyle™ 293細胞（Gibco™，賽默飛世爾科技公司，美國，目錄號R79007）在37°C濕潤的培養箱中在5% CO2 下、在軌道式振盪器（100-120 rpm）上的振盪燒瓶（康寧公司（Corning），圖克斯伯裡（Tewksbury），麻塞諸塞州）中、在Freestyle™ 293培養基（Gibco™，賽默飛世爾科技公司，美國，目錄號12338018）中培養。對於暫態轉染，將細胞生長至大約3 x 106 個細胞/ml的密度，並且然後將1 ug過濾器滅菌的DNA/ml培養物（0.5 ug重鏈 + 0.5 ug輕鏈）添加到OptiMem（賽默飛世爾科技公司，美國，#11058021）溶液中的2 ug PEI/1 ug DNA並且在RT下孵育8分鐘。將混合物逐滴添加到Freestyle™ 293細胞中，伴有輕輕渦旋。轉染後，將細胞培養一至兩週，然後從上清液中純化抗體。為了產生用於抗體產生的穩定細胞系，使用製造商的建議將運載體藉由核轉染（Nucleofector™ 96孔shuttle™；龍沙集團（Lonza））共轉染到CHO細胞中，並且在振盪燒瓶中在選擇條件下培養長達四週。藉由離心收穫細胞，並且回收上清液用於抗體純化。使用蛋白A、蛋白G或MabSelect SuRe（通用電氣醫療生命科學部門（GE Healthcare Life Sciences））柱純化抗體。在載入上清液之前，用PBS平衡樹脂。結合樣本後，用PBS洗滌柱，並且用賽默（Thermo）（Pierce）IgG pH 2.8（目錄號21004）洗脫抗體。將洗脫液級分用檸檬酸三鈉脫水緩衝液，pH 8.5（西格瑪奧德里奇公司目錄號S4641-1Kg）中和，並且然後在PBS，pH 7.2中透析過夜。抗體匯總
表4闡述了衍生自鼠類雜交瘤的親本抗CCR7抗體和人源化抗CCR7抗體的有關序列資訊。貫穿本申請，當描述抗體時，術語「雜交瘤」和「親本」可互換使用並且是指衍生自雜交瘤的Ab。 [表4]：雜交瘤和人源化抗CCR7抗體的胺基酸和核苷酸序列
親本 674J13  hIgG1     
SEQ ID NO: 116 HCDR1（組合的） GYSITSGYSWH
SEQ ID NO: 117 HCDR2（組合的） HIHSSGSTNYNPSLKS
SEQ ID NO: 118 HCDR3（組合的） GGVQAFAY
SEQ ID NO: 119 HCDR1（卡巴特） SGYSWH
SEQ ID NO: 120 HCDR2（卡巴特） HIHSSGSTNYNPSLKS
SEQ ID NO: 121 HCDR3（卡巴特） GGVQAFAY
SEQ ID NO: 122 HCDR1（喬西亞） GYSITSGY
SEQ ID NO: 123 HCDR2（喬西亞） HSSGS
SEQ ID NO: 124 HCDR3（喬西亞） GGVQAFAY
SEQ ID NO: 125 HCDR1（IMGT） GYSITSGYS
SEQ ID NO: 126 HCDR2（IMGT） IHSSGST
SEQ ID NO: 127 HCDR3（IMGT） ARGGVQAFAY
SEQ ID NO: 128 VH DVQLQESGPDLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSGYSWHWIRQFPGNKLEWMAHIHSSGSTNYNPSLKSRISIIRDTSKNLFFLQLNSVTTEDTATYYCARGGVQAFAYWGQGTLVTVSA
SEQ ID NO: 129 DNA VH GATGTGCAGCTTCAGGAGTCAGGACCTGACCTGGTGAAACCTTCTCAGTCACTTTCACTCACCTGCACTGTCACTGGCTACTCCATCACCAGTGGTTATAGCTGGCACTGGATCCGGCAGTTTCCAGGAAACAAACTGGAGTGGATGGCCCACATCCACTCCAGTGGTAGCACTAACTACAACCCATCTCTCAAAAGTCGCATCTCTATCATTCGAGACACATCCAAGAACCTGTTCTTCCTGCAGTTGAATTCTGTGACTACTGAGGACACAGCCACATATTACTGTGCAAGAGGGGGGGTACAGGCCTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA
SEQ ID NO: 130 重鏈（WT Fc） DVQLQESGPDLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSGYSWHWIRQFPGNKLEWMAHIHSSGSTNYNPSLKSRISIIRDTSKNLFFLQLNSVTTEDTATYYCARGGVQAFAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 131 DNA重鏈 gatgtgcagcttcaggagtcaggacctgacctggtgaaaccttctcagtcactttcactcacctgcactgtcactggctactccatcaccagtggttatagctggcactggatccggcagtttccaggaaacaaactggagtggatggcccacatccactccagtggtagcactaactacaacccatctctcaaaagtcgcatctctatcattcgagacacatccaagaacctgttcttcctgcagttgaattctgtgactactgaggacacagccacatattactgtgcaagagggggggtacaggcctttgcttactggggccaagggactctggtcactgtctctgcaGCTAGCACCAAGGGCCCAAGTGTGTTTCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGTCTACTTCCGGCGGAACTGCTGCCCTGGGTTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACAGTGTCCTGGAACTCTGGGGCTCTGACTTCCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACAGTGCCCTCCAGCTCTCTGGGAACCCAGACCTATATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTGGAGCCCAAGAGCTGCGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCAGCTCCAGAACTGCTGGGAGGGCCTTCCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCAGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCAGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACAGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAGTGCAAAGTCTCCAACAAGGCCCTGCCAGCCCCAATCGAAAAGACAATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCACGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCCAGCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGATATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCAGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCAGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGAGCCTGAGCCCCGGCAAG
SEQ ID NO: 132 LCDR1（組合的） SASSSVIYMH
SEQ ID NO: 133 LCDR2（組合的） DTSKLAS
SEQ ID NO: 134 LCDR3（組合的） QQWSSNPLT
SEQ ID NO: 135 LCDR1（卡巴特） SASSSVIYMH
SEQ ID NO: 136 LCDR2（卡巴特） DTSKLAS
SEQ ID NO: 137 LCDR3（卡巴特） QQWSSNPLT
SEQ ID NO: 138 LCDR1（喬西亞） SSSVIY
SEQ ID NO: 139 LCDR2（喬西亞） DTS
SEQ ID NO: 140 LCDR3（喬西亞） WSSNPL
SEQ ID NO: 141 LCDR1（IMGT） SSVIY
SEQ ID NO: 142 LCDR2（IMGT） DTS
SEQ ID NO: 143 LCDR3（IMGT） QQWSSNPLT
SEQ ID NO: 144 VL QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVIYMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTTLELK
SEQ ID NO: 145 DNA VL CAAATTGTCCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGTGCCAGTTCAAGTGTAATTTACATGCACTGGTACCAGCAGAAGTCAGGCACCTCCCCCAAAAGATGGATTTATGACACATCCAAACTGGCTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTGGTAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAGTAGTAACCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCACGTTGGAGCTGAAA
SEQ ID NO: 146 輕鏈 QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVIYMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTTLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO: 147 DNA輕鏈 CAAATTGTCCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGTGCCAGTTCAAGTGTAATTTACATGCACTGGTACCAGCAGAAGTCAGGCACCTCCCCCAAAAGATGGATTTATGACACATCCAAACTGGCTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTGGTAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAGTAGTAACCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCACGTTGGAGCTGAAACGTACGGTGGCCGCTCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGACGAGCAGCTGAAGAGTGGCACCGCCAGCGTGGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTCACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCATAAGGTGTACGCCTGCGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACAGGGGCGAGTGC
親本 121G12 hIgG1    
SEQ ID NO: 148 HCDR1（組合的） GFTFSTYAMS
SEQ ID NO: 149 HCDR2（組合的） TISDGGSYSYYPDNVKG
SEQ ID NO: 150 HCDR3（組合的） RGSRYEEYYVMDY
SEQ ID NO: 151 HCDR1（卡巴特） TYAMS
SEQ ID NO: 152 HCDR2（卡巴特） TISDGGSYSYYPDNVKG
SEQ ID NO: 153 HCDR3（卡巴特） RGSRYEEYYVMDY
SEQ ID NO: 154 HCDR1（喬西亞） GFTFSTY
SEQ ID NO: 155 HCDR2（喬西亞） SDGGSY
SEQ ID NO: 156 HCDR3（喬西亞） RGSRYEEYYVMDY
SEQ ID NO: 157 HCDR1（IMGT） GFTFSTYA
SEQ ID NO: 158 HCDR2（IMGT） ISDGGSYS
SEQ ID NO: 159 HCDR3（IMGT） ARRGSRYEEYYVMDY
SEQ ID NO: 160 VH EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSTYAMSWVRQTPEKRLEWVATISDGGSYSYYPDNVKGRFTISRDNAKNNLYLQMSHLKSEDTAMYYCARRGSRYEEYYVMDYWGQGTSVTVSS
SEQ ID NO: 161 DNA VH GAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTACCTATGCCATGTCTTGGGTTCGCCAGACTCCGGAAAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCAACCATTAGTGATGGTGGTAGTTATTCGTACTATCCAGACAATGTAAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACAACCTATACCTGCAAATGAGCCATCTGAAGTCTGAGGACACAGCCATGTATTACTGTGCAAGACGAGGTAGTAGGTACGAAGAGTACTATGTTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO: 162 重鏈 （WT Fc） EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSTYAMSWVRQTPEKRLEWVATISDGGSYSYYPDNVKGRFTISRDNAKNNLYLQMSHLKSEDTAMYYCARRGSRYEEYYVMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 163 DNA重鏈 GAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTACCTATGCCATGTCTTGGGTTCGCCAGACTCCGGAAAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCAACCATTAGTGATGGTGGTAGTTATTCGTACTATCCAGACAATGTAAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACAACCTATACCTGCAAATGAGCCATCTGAAGTCTGAGGACACAGCCATGTATTACTGTGCAAGACGAGGTAGTAGGTACGAAGAGTACTATGTTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCAAGTGTGTTTCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGTCTACTTCCGGCGGAACTGCTGCCCTGGGTTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACAGTGTCCTGGAACTCTGGGGCTCTGACTTCCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACAGTGCCCTCCAGCTCTCTGGGAACCCAGACCTATATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTGGAGCCCAAGAGCTGCGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCAGCTCCAGAACTGCTGGGAGGGCCTTCCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCAGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCAGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACAGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAGTGCAAAGTCTCCAACAAGGCCCTGCCAGCCCCAATCGAAAAGACAATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCACGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCCAGCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGATATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCAGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCAGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGAGCCTGAGCCCCGGCAAG
SEQ ID NO: 164 LCDR1（組合的） RASQSISNNLH
SEQ ID NO: 165 LCDR2（組合的） YASQSIS
SEQ ID NO: 166 LCDR3（組合的） QQSNSWLT
SEQ ID NO: 167 LCDR1（卡巴特） RASQSISNNLH
SEQ ID NO: 168 LCDR2（卡巴特） YASQSIS
SEQ ID NO: 169 LCDR3（卡巴特） QQSNSWLT
SEQ ID NO: 170 LCDR1（喬西亞） SQSISNN
SEQ ID NO: 171 LCDR2（喬西亞） YAS
SEQ ID NO: 172 LCDR3（喬西亞） SNSWL
SEQ ID NO: 173 LCDR1（IMGT） QSISNN
SEQ ID NO: 174 LCDR2（IMGT） YAS
SEQ ID NO: 175 LCDR3（IMGT） QQSNSWLT
SEQ ID NO: 176 VL DIVLTQSPATLSVTPGDSVSLSCRASQSISNNLHWYQQKSHESPKLLIKYASQSISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVETEDFGMYFCQQSNSWLTFGAGTKLGLK
SEQ ID NO: 177 DNA VL GATATTGTGCTAACTCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTGACTCCAGGAGATAGCGTCAGTCTTTCCTGCAGGGCCAGCCAAAGTATTAGCAACAACCTACACTGGTATCAACAGAAATCACATGAGTCTCCAAAACTTCTCATCAAGTATGCTTCCCAGTCCATCTCTGGGATCCCCTCCAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACTCTCAGTATCAACAGTGTGGAGACTGAAGATTTTGGAATGTATTTCTGTCAACAGAGTAACAGCTGGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGGGCTGAAA
SEQ ID NO: 178 輕鏈 DIVLTQSPATLSVTPGDSVSLSCRASQSISNNLHWYQQKSHESPKLLIKYASQSISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVETEDFGMYFCQQSNSWLTFGAGTKLGLKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO: 179 DNA輕鏈 GATATTGTGCTAACTCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTGACTCCAGGAGATAGCGTCAGTCTTTCCTGCAGGGCCAGCCAAAGTATTAGCAACAACCTACACTGGTATCAACAGAAATCACATGAGTCTCCAAAACTTCTCATCAAGTATGCTTCCCAGTCCATCTCTGGGATCCCCTCCAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACTCTCAGTATCAACAGTGTGGAGACTGAAGATTTTGGAATGTATTTCTGTCAACAGAGTAACAGCTGGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGGGCTGAAACGTACGGTGGCCGCTCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGACGAGCAGCTGAAGAGTGGCACCGCCAGCGTGGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTCACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCATAAGGTGTACGCCTGCGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACAGGGGCGAGTGC
親本 506E15  hIgG1    
SEQ ID NO: 180 HCDR1（組合的） GFTFSSYAMS
SEQ ID NO: 181 HCDR2（組合的） TISSGGSFTYYPDSVKG
SEQ ID NO: 182 HCDR3（組合的） RASTVVGTDFDV
SEQ ID NO: 183 HCDR1（卡巴特） SYAMS
SEQ ID NO: 184 HCDR2（卡巴特） TISSGGSFTYYPDSVKG
SEQ ID NO: 185 HCDR3（卡巴特） RASTVVGTDFDV
SEQ ID NO: 186 HCDR1（喬西亞） GFTFSSY
SEQ ID NO: 187 HCDR2（喬西亞） SSGGSF
SEQ ID NO: 188 HCDR3（喬西亞） RASTVVGTDFDV
SEQ ID NO: 189 HCDR1（IMGT） GFTFSSYA
SEQ ID NO: 190 HCDR2（IMGT） ISSGGSFT
SEQ ID NO: 191 HCDR3（IMGT） ARRASTVVGTDFDV
SEQ ID NO: 192 VH EVMLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYAMSWIRQTPEKRLEWVATISSGGSFTYYPDSVKGRFTISRDNVKNTLYLQMSSLRSEDTAMYYCARRASTVVGTDFDVWGAGTTVTVSS
SEQ ID NO: 193 DNA VH GAAGTGATGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAGCTATGCCATGTCTTGGATTCGCCAGACTCCGGAGAAGAGACTGGAGTGGGTCGCAACCATCAGTAGTGGTGGTAGTTTCACCTACTATCCAGACAGTGTGAAGGGGCGATTCACCATTTCTAGAGACAATGTCAAGAACACCCTGTACCTGCAAATGAGCAGTCTGAGGTCTGAAGACACGGCCATGTATTACTGTGCAAGACGGGCTTCTACGGTAGTAGGTACGGACTTCGATGTCTGGGGCGCAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO: 194 重鏈 （WT Fc） EVMLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYAMSWIRQTPEKRLEWVATISSGGSFTYYPDSVKGRFTISRDNVKNTLYLQMSSLRSEDTAMYYCARRASTVVGTDFDVWGAGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 195 DNA重鏈 GAAGTGATGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAGCTATGCCATGTCTTGGATTCGCCAGACTCCGGAGAAGAGACTGGAGTGGGTCGCAACCATCAGTAGTGGTGGTAGTTTCACCTACTATCCAGACAGTGTGAAGGGGCGATTCACCATTTCTAGAGACAATGTCAAGAACACCCTGTACCTGCAAATGAGCAGTCTGAGGTCTGAAGACACGGCCATGTATTACTGTGCAAGACGGGCTTCTACGGTAGTAGGTACGGACTTCGATGTCTGGGGCGCAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCAAGTGTGTTTCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGTCTACTTCCGGCGGAACTGCTGCCCTGGGTTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACAGTGTCCTGGAACTCTGGGGCTCTGACTTCCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACAGTGCCCTCCAGCTCTCTGGGAACCCAGACCTATATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTGGAGCCCAAGAGCTGCGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCAGCTCCAGAACTGCTGGGAGGGCCTTCCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCAGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCAGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACAGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAGTGCAAAGTCTCCAACAAGGCCCTGCCAGCCCCAATCGAAAAGACAATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCACGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCCAGCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGATATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCAGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCAGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGAGCCTGAGCCCCGGCAAG
SEQ ID NO: 196 LCDR1（組合的） RASQDIGSSLN
SEQ ID NO: 197 LCDR2（組合的） ATSSLDS
SEQ ID NO: 198 LCDR3（組合的） LQYASSPPT
SEQ ID NO: 199 LCDR1（卡巴特） RASQDIGSSLN
SEQ ID NO: 200 LCDR2（卡巴特） ATSSLDS
SEQ ID NO: 201 LCDR3（卡巴特） LQYASSPPT
SEQ ID NO: 202 LCDR1（喬西亞） SQDIGSS
SEQ ID NO: 203 LCDR2（喬西亞） ATS
SEQ ID NO: 204 LCDR3（喬西亞） YASSPP
SEQ ID NO: 205 LCDR1（IMGT） QDIGSS
SEQ ID NO: 206 LCDR2（IMGT） ATS
SEQ ID NO: 207 LCDR3（IMGT） LQYASSPPT
SEQ ID NO: 208 VL DIQMTQSPSSLSASLGERVSLTCRASQDIGSSLNWLQQEPDGTIKRLIYATSSLDSGVPKRFSGSRSGSDYSLTISSLESEDFVVYYCLQYASSPPTFGGGTKLEIK
SEQ ID NO: 209 DNA VL GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCTTATCTGCCTCTCTGGGAGAAAGAGTCAGTCTCACTTGTCGGGCAAGTCAGGACATTGGTAGTAGCTTAAACTGGCTTCAGCAGGAACCAGATGGAACTATTAAACGCCTGATCTATGCCACATCCAGTTTAGATTCTGGTGTCCCCAAAAGGTTCAGTGGCAGTAGGTCTGGGTCAGATTATTCTCTCACCATCAGCAGCCTTGAGTCTGAAGATTTTGTAGTCTATTACTGTCTACAATATGCTAGTTCGCCTCCGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA
SEQ ID NO: 210 輕鏈 DIQMTQSPSSLSASLGERVSLTCRASQDIGSSLNWLQQEPDGTIKRLIYATSSLDSGVPKRFSGSRSGSDYSLTISSLESEDFVVYYCLQYASSPPTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO: 211 DNA輕鏈 GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCTTATCTGCCTCTCTGGGAGAAAGAGTCAGTCTCACTTGTCGGGCAAGTCAGGACATTGGTAGTAGCTTAAACTGGCTTCAGCAGGAACCAGATGGAACTATTAAACGCCTGATCTATGCCACATCCAGTTTAGATTCTGGTGTCCCCAAAAGGTTCAGTGGCAGTAGGTCTGGGTCAGATTATTCTCTCACCATCAGCAGCCTTGAGTCTGAAGATTTTGTAGTCTATTACTGTCTACAATATGCTAGTTCGCCTCCGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGTACGGTGGCCGCTCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGACGAGCAGCTGAAGAGTGGCACCGCCAGCGTGGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTCACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCATAAGGTGTACGCCTGCGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACAGGGGCGAGTGC
     
親本 684E12 hIgG1    
SEQ ID NO: 212 HCDR1（組合的） GFTFSNFAMS
SEQ ID NO: 213 HCDR2（組合的） TISTGGTYTYYPDSVKG
SEQ ID NO: 214 HCDR3（組合的） RGYDGVDK
SEQ ID NO: 215 HCDR1（卡巴特） SNFAMS
SEQ ID NO: 216 HCDR2（卡巴特） TISTGGTYTYYPDSVKG
SEQ ID NO: 217 HCDR3（卡巴特） RGYDGVDK
SEQ ID NO: 218 HCDR1（喬西亞） GFTFSNF
SEQ ID NO: 219 HCDR2（喬西亞） STGGTY
SEQ ID NO: 220 HCDR3（喬西亞） RGYDGVDK
SEQ ID NO: 221 HCDR1（IMGT） GFTFSNFA
SEQ ID NO: 222 HCDR2（IMGT） ISTGGTYT
SEQ ID NO: 223 HCDR3（IMGT） TRRGYDGVDK
SEQ ID NO: 224 VH EVHLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSNFAMSWVRQTPEKRLEWVATISTGGTYTYYPDSVKGRFTISRDNAKKTLYLQMSSLRSEDTAMYYCTRRGYDGVDKWGQGTTLTVSS
SEQ ID NO: 225 DNA VH gaagtgcatctggtggagtctgggggaggcttagtgaagcctggagggtccctgaaactctcctgtgcagcctctggattcactttcagtaactttgccatgtcttgggttcgccagactccggagaagagactggagtgggtcgcaaccattagtactggtggtacttacacctactatccagacagtgtgaagggtcgattcaccatctccagagacaatgccaagaaaaccctgtacctgcaaatgagcagtctgaggtctgaggacacggccatgtattactgtacaagacgggggtacgacggcgtggacaaatggggccaaggcaccactctcacagtctcctca
SEQ ID NO: 226 重鏈 （WT Fc） EVHLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSNFAMSWVRQTPEKRLEWVATISTGGTYTYYPDSVKGRFTISRDNAKKTLYLQMSSLRSEDTAMYYCTRRGYDGVDKWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 227 DNA重鏈 GAAGTGCATCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAACTTTGCCATGTCTTGGGTTCGCCAGACTCCGGAGAAGAGACTGGAGTGGGTCGCAACCATTAGTACTGGTGGTACTTACACCTACTATCCAGACAGTGTGAAGGGTCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAAAACCCTGTACCTGCAAATGAGCAGTCTGAGGTCTGAGGACACGGCCATGTATTACTGTACAAGACGGGGGTACGACGGCGTGGACAAATGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCAgctagcaccaagggcccaagtgtgtttcccctggcccccagcagcaagtctacttccggcggaactgctgccctgggttgcctggtgaaggactacttccccgagcccgtgacagtgtcctggaactctggggctctgacttccggcgtgcacaccttccccgccgtgctgcagagcagcggcctgtacagcctgagcagcgtggtgacagtgccctccagctctctgggaacccagacctatatctgcaacgtgaaccacaagcccagcaacaccaaggtggacaagagagtggagcccaagagctgcgacaagacccacacctgccccccctgcccagctccagaactgctgggagggccttccgtgttcctgttcccccccaagcccaaggacaccctgatgatcagcaggacccccgaggtgacctgcgtggtggtggacgtgtcccacgaggacccagaggtgaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcacaacgccaagaccaagcccagagaggagcagtacaacagcacctacagggtggtgtccgtgctgaccgtgctgcaccaggactggctgaacggcaaagaatacaagtgcaaagtctccaacaaggccctgccagccccaatcgaaaagacaatcagcaaggccaagggccagccacgggagccccaggtgtacaccctgccccccagccgggaggagatgaccaagaaccaggtgtccctgacctgtctggtgaagggcttctaccccagcgatatcgccgtggagtgggagagcaacggccagcccgagaacaactacaagaccacccccccagtgctggacagcgacggcagcttcttcctgtacagcaagctgaccgtggacaagtccaggtggcagcagggcaacgtgttcagctgcagcgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagtccctgagcctgagccccggcaag
SEQ ID NO: 228 LCDR1（組合的） KSGQSLLDSDGKTYLN
SEQ ID NO: 229 LCDR2（組合的） LVSKLDS
SEQ ID NO: 230 LCDR3（組合的） WQGTHFPQT
SEQ ID NO: 231 LCDR1（卡巴特） KSGQSLLDSDGKTYLN
SEQ ID NO: 232 LCDR2（卡巴特） LVSKLDS
SEQ ID NO: 233 LCDR3（卡巴特） WQGTHFPQT
SEQ ID NO: 234 LCDR1（喬西亞） GQSLLDSDGKTY
SEQ ID NO: 235 LCDR2（喬西亞） LVS
SEQ ID NO: 236 LCDR3（喬西亞） GTHFPQ
SEQ ID NO: 237 LCDR1（IMGT） QSLLDSDGKTY
SEQ ID NO: 238 LCDR2（IMGT） LVS
SEQ ID NO: 239 LCDR3（IMGT） WQGTHFPQT
SEQ ID NO: 240 VL DVVMTQTPLTLSVTIGQPASISCKSGQSLLDSDGKTYLNWFLQRPGQSPKRLIYLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCWQGTHFPQTFGGGTKLEIK
SEQ ID NO: 241 DNA VL gatgttgtgatgacccagactccactcactttgtcggttaccattggacaaccagcctccatctcttgcaagtcaggtcagagcctcttagatagtgatggaaagacatatttgaattggtttttacagaggccaggccagtctccaaagcgcctaatctatctggtgtctaaactggactctggagtccctgacaggttcactggcagtggatcagggacagatttcacactgaaaatcagcagagtggaggctgaggatttgggagtttattattgctggcaaggtacacattttcctcagacgttcggtggaggcaccaagctggaaatcaaa
SEQ ID NO: 242 輕鏈 DVVMTQTPLTLSVTIGQPASISCKSGQSLLDSDGKTYLNWFLQRPGQSPKRLIYLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCWQGTHFPQTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO: 243 DNA輕鏈 GATGTTGTGATGACCCAGACTCCACTCACTTTGTCGGTTACCATTGGACAACCAGCCTCCATCTCTTGCAAGTCAGGTCAGAGCCTCTTAGATAGTGATGGAAAGACATATTTGAATTGGTTTTTACAGAGGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCGCCTAATCTATCTGGTGTCTAAACTGGACTCTGGAGTCCCTGACAGGTTCACTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATTTGGGAGTTTATTATTGCTGGCAAGGTACACATTTTCCTCAGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAAcgtacggtggccgctcccagcgtgttcatcttcccccccagcgacgagcagctgaagagtggcaccgccagcgtggtgtgcctgctgaacaacttctacccccgggaggccaaggtgcagtggaaggtggacaacgccctgcagagcggcaacagccaggagagcgtcaccgagcaggacagcaaggactccacctacagcctgagcagcaccctgaccctgagcaaggccgactacgagaagcataaggtgtacgcctgcgaggtgacccaccagggcctgtccagccccgtgaccaagagcttcaacaggggcgagtgc
     
親本 674J13 hIgG1 CysMab    
SEQ ID NO: 244 HCDR1（組合的） GYSITSGYSWH
SEQ ID NO: 245 HCDR2（組合的） HIHSSGSTNYNPSLKS
SEQ ID NO: 246 HCDR3（組合的） GGVQAFAY
SEQ ID NO: 247 HCDR1（卡巴特） SGYSWH
SEQ ID NO: 248 HCDR2（卡巴特） HIHSSGSTNYNPSLKS
SEQ ID NO: 249 HCDR3（卡巴特） GGVQAFAY
SEQ ID NO: 250 HCDR1（喬西亞） GYSITSGY
SEQ ID NO: 251 HCDR2（喬西亞） HSSGS
SEQ ID NO: 252 HCDR3（喬西亞） GGVQAFAY
SEQ ID NO: 253 HCDR1（IMGT） GYSITSGYS
SEQ ID NO: 254 HCDR2（IMGT） IHSSGST
SEQ ID NO: 255 HCDR3（IMGT） ARGGVQAFAY
SEQ ID NO: 256 VH DVQLQESGPDLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSGYSWHWIRQFPGNKLEWMAHIHSSGSTNYNPSLKSRISIIRDTSKNLFFLQLNSVTTEDTATYYCARGGVQAFAYWGQGTLVTVSA
SEQ ID NO: 257 DNA VH GATGTGCAGCTTCAGGAGTCAGGACCTGACCTGGTGAAACCTTCTCAGTCACTTTCACTCACCTGCACTGTCACTGGCTACTCCATCACCAGTGGTTATAGCTGGCACTGGATCCGGCAGTTTCCAGGAAACAAACTGGAGTGGATGGCCCACATCCACTCCAGTGGTAGCACTAACTACAACCCATCTCTCAAAAGTCGCATCTCTATCATTCGAGACACATCCAAGAACCTGTTCTTCCTGCAGTTGAATTCTGTGACTACTGAGGACACAGCCACATATTACTGTGCAAGAGGGGGGGTACAGGCCTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA
SEQ ID NO: 258 重鏈 （Cys Mab突變加底線） DVQLQESGPDLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSGYSWHWIRQFPGNKLEWMAHIHSSGSTNYNPSLKSRISIIRDTSKNLFFLQLNSVTTEDTATYYCARGGVQAFAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFP C PVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYP C DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 259 DNA重鏈 GATGTGCAGCTTCAGGAGTCAGGACCTGACCTGGTGAAACCTTCTCAGTCACTTTCACTCACCTGCACTGTCACTGGCTACTCCATCACCAGTGGTTATAGCTGGCACTGGATCCGGCAGTTTCCAGGAAACAAACTGGAGTGGATGGCCCACATCCACTCCAGTGGTAGCACTAACTACAACCCATCTCTCAAAAGTCGCATCTCTATCATTCGAGACACATCCAAGAACCTGTTCTTCCTGCAGTTGAATTCTGTGACTACTGAGGACACAGCCACATATTACTGTGCAAGAGGGGGGGTACAGGCCTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCAgctagcaccaagggcccaagtgtgtttcccctggcccccagcagcaagtctacttccggcggaactgctgccctgggttgcctggtgaaggactacttcccctgtcccgtgacagtgtcctggaactctggggctctgacttccggcgtgcacaccttccccgccgtgctgcagagcagcggcctgtacagcctgagcagcgtggtgacagtgccctccagctctctgggaacccagacctatatctgcaacgtgaaccacaagcccagcaacaccaaggtggacaagagagtggagcccaagagctgcgacaagacccacacctgccccccctgcccagctccagaactgctgggagggccttccgtgttcctgttcccccccaagcccaaggacaccctgatgatcagcaggacccccgaggtgacctgcgtggtggtggacgtgtcccacgaggacccagaggtgaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcacaacgccaagaccaagcccagagaggagcagtacaacagcacctacagggtggtgtccgtgctgaccgtgctgcaccaggactggctgaacggcaaagaatacaagtgcaaagtctccaacaaggccctgccagccccaatcgaaaagacaatcagcaaggccaagggccagccacgggagccccaggtgtacaccctgccccccagccgggaggagatgaccaagaaccaggtgtccctgacctgtctggtgaagggcttctacccctgtgatatcgccgtggagtgggagagcaacggccagcccgagaacaactacaagaccacccccccagtgctggacagcgacggcagcttcttcctgtacagcaagctgaccgtggacaagtccaggtggcagcagggcaacgtgttcagctgcagcgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagtccctgagcctgagccccggcaag
SEQ ID NO: 260 LCDR1（組合的） SASSSVIYMH
SEQ ID NO: 261 LCDR2（組合的） DTSKLAS
SEQ ID NO: 262 LCDR3（組合的） QQWSSNPLT
SEQ ID NO: 263 LCDR1（卡巴特） SASSSVIYMH
SEQ ID NO: 264 LCDR2（卡巴特） DTSKLAS
SEQ ID NO: 265 LCDR3（卡巴特） QQWSSNPLT
SEQ ID NO: 266 LCDR1（喬西亞） SSSVIY
SEQ ID NO: 267 LCDR2（喬西亞） DTS
SEQ ID NO: 268 LCDR3（喬西亞） WSSNPL
SEQ ID NO: 269 LCDR1（IMGT） SSVIY
SEQ ID NO: 270 LCDR2（IMGT） DTS
SEQ ID NO: 271 LCDR3（IMGT） QQWSSNPLT
SEQ ID NO: 272 VL QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVIYMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTTLELK
SEQ ID NO: 273 DNA VL CAAATTGTCCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGTGCCAGTTCAAGTGTAATTTACATGCACTGGTACCAGCAGAAGTCAGGCACCTCCCCCAAAAGATGGATTTATGACACATCCAAACTGGCTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTGGTAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAGTAGTAACCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCACGTTGGAGCTGAAA
SEQ ID NO: 274 輕鏈 QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVIYMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTTLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO: 275 DNA輕鏈 CAAATTGTCCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGTGCCAGTTCAAGTGTAATTTACATGCACTGGTACCAGCAGAAGTCAGGCACCTCCCCCAAAAGATGGATTTATGACACATCCAAACTGGCTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTGGTAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAGTAGTAACCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCACGTTGGAGCTGAAACGTACGGTGGCCGCTCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGACGAGCAGCTGAAGAGTGGCACCGCCAGCGTGGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTCACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCATAAGGTGTACGCCTGCGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACAGGGGCGAGTGC
     
親本 674J13  hIgG1 DAPA CysMab    
SEQ ID NO: 276 HCDR1（組合的） GYSITSGYSWH
SEQ ID NO: 277 HCDR2（組合的） HIHSSGSTNYNPSLKS
SEQ ID NO: 278 HCDR3（組合的） GGVQAFAY
SEQ ID NO: 279 HCDR1（卡巴特） SGYSWH
SEQ ID NO: 280 HCDR2（卡巴特） HIHSSGSTNYNPSLKS
SEQ ID NO: 281 HCDR3（卡巴特） GGVQAFAY
SEQ ID NO: 282 HCDR1（喬西亞） GYSITSGY
SEQ ID NO: 283 HCDR2（喬西亞） HSSGS
SEQ ID NO: 284 HCDR3（喬西亞） GGVQAFAY
SEQ ID NO: 285 HCDR1（IMGT） GYSITSGYS
SEQ ID NO: 286 HCDR2（IMGT） IHSSGST
SEQ ID NO: 287 HCDR3（IMGT） ARGGVQAFAY
SEQ ID NO: 288 VH DVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGYSITSGYSWHWIRQHPGKGLEWMAHIHSSGSTNYNPSLKSRITISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGGVQAFAYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 289 DNA VH GACGTGCAGCTGCAGGAATCTGGCCCTGGCCTGGTGAAACCCTCCCAGACCCTGTCCCTGACCTGCACCGTGTCCGGCTACTCCATCACCTCCGGCTACAGCTGGCACTGGATCCGGCAGCACCCCGGCAAGGGCCTGGAATGGATGGCCCACATCCACTCCTCCGGCTCCACCAACTACAACCCCAGCCTGAAGTCCAGAATCACCATCAGCCGGGACACCTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGTCCTCCGTGACCGCCGCTGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAGAGGCGGCGTGCAGGCCTTCGCTTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACAGTGTCCTCC
SEQ ID NO: 290 重鏈 （DAPA、CysMab突變加底線） DVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGYSITSGYSWHWIRQHPGKGLEWMAHIHSSGSTNYNPSLKSRITISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGGVQAFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFP C PVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVV A VSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAL A APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYP C DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 291 DNA重鏈 GACGTGCAGCTGCAGGAATCTGGCCCTGGCCTGGTGAAACCCTCCCAGACCCTGTCCCTGACCTGCACCGTGTCCGGCTACTCCATCACCTCCGGCTACAGCTGGCACTGGATCCGGCAGCACCCCGGCAAGGGCCTGGAATGGATGGCCCACATCCACTCCTCCGGCTCCACCAACTACAACCCCAGCCTGAAGTCCAGAATCACCATCAGCCGGGACACCTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGTCCTCCGTGACCGCCGCTGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAGAGGCGGCGTGCAGGCCTTCGCTTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACAGTGTCCTCCGCTAGCACCAAGGGCCCAAGTGTGTTTCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGTCTACTTCCGGCGGAACTGCTGCCCTGGGTTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCTGTCCCGTGACAGTGTCCTGGAACTCTGGGGCTCTGACTTCCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACAGTGCCCTCCAGCTCTCTGGGAACCCAGACCTATATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTGGAGCCCAAGAGCTGCGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCAGCTCCAGAACTGCTGGGAGGGCCTTCCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCAGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGCCGTGTCCCACGAGGACCCAGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACAGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAGTGCAAAGTCTCCAACAAGGCCCTGGCTGCCCCAATCGAAAAGACAATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCACGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCCAGCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCTGTGATATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCAGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCAGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGAGCCTGAGCCCCGGCAAG
SEQ ID NO: 292 LCDR1（組合的） SASSSVIYMH
SEQ ID NO: 293 LCDR2（組合的） DTSKLAS
SEQ ID NO: 294 LCDR3（組合的） QQWSSNPLT
SEQ ID NO: 295 LCDR1（卡巴特） SASSSVIYMH
SEQ ID NO: 296 LCDR2（卡巴特） DTSKLAS
SEQ ID NO: 297 LCDR3（卡巴特） QQWSSNPLT
SEQ ID NO: 298 LCDR1（喬西亞） SSSVIY
SEQ ID NO: 299 LCDR2（喬西亞） DTS
SEQ ID NO: 300 LCDR3（喬西亞） WSSNPL
SEQ ID NO: 301 LCDR1（IMGT） SSVIY
SEQ ID NO: 302 LCDR2（IMGT） DTS
SEQ ID NO: 303 LCDR3（IMGT） QQWSSNPLT
SEQ ID NO: 304 VL EIVLTQSPATLSASPGERVTMSCSASSSVIYMHWYQQKPGQAPRRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTDYTLTISSMEPEDAAVYYCQQWSSNPLTFGQGTKLEIK
SEQ ID NO: 305 DNA VL GAGATCGTGCTGACCCAGTCCCCTGCCACCCTGTCTGCTAGCCCTGGCGAGCGCGTGACAATGTCCTGCTCCGCCTCCTCCTCCGTGATCTACATGCACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCCCCTCGGCGGTGGATCTACGATACCTCCAAGCTGGCCTCCGGCGTGCCCGCCAGATTCTCCGGCTCTGGCTCTGGCACCGACTACACCCTGACCATCTCCAGCATGGAACCCGAGGACGCCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGTGGTCCTCCAACCCCCTGACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAAATCAAG
SEQ ID NO: 306 輕鏈 EIVLTQSPATLSASPGERVTMSCSASSSVIYMHWYQQKPGQAPRRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTDYTLTISSMEPEDAAVYYCQQWSSNPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO: 307 DNA輕鏈 GAGATCGTGCTGACCCAGTCCCCTGCCACCCTGTCTGCTAGCCCTGGCGAGCGCGTGACAATGTCCTGCTCCGCCTCCTCCTCCGTGATCTACATGCACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCCCCTCGGCGGTGGATCTACGATACCTCCAAGCTGGCCTCCGGCGTGCCCGCCAGATTCTCCGGCTCTGGCTCTGGCACCGACTACACCCTGACCATCTCCAGCATGGAACCCGAGGACGCCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGTGGTCCTCCAACCCCCTGACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAAATCAAGCGTACGGTGGCCGCTCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGACGAGCAGCTGAAGAGTGGCACCGCCAGCGTGGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTCACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCATAAGGTGTACGCCTGCGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACAGGGGCGAGTGC
     
親本 121G12 hIgG1 CysMab    
SEQ ID NO: 308 HCDR1（組合的） GFTFSTYAMS
SEQ ID NO: 309 HCDR2（組合的） TISDAGSYSYYPDNVKG
SEQ ID NO: 310 HCDR3（組合的） RGSRYEEYYVMDY
SEQ ID NO: 311 HCDR1（卡巴特） TYAMS
SEQ ID NO: 312 HCDR2（卡巴特） TISDAGSYSYYPDNVKG
SEQ ID NO: 313 HCDR3（卡巴特） RGSRYEEYYVMDY
SEQ ID NO: 314 HCDR1（喬西亞） GFTFSTY
SEQ ID NO: 315 HCDR2（喬西亞） SDAGSY
SEQ ID NO: 316 HCDR3（喬西亞） RGSRYEEYYVMDY
SEQ ID NO: 317 HCDR1（IMGT） GFTFSTYA
SEQ ID NO: 318 HCDR2（IMGT） ISDAGSYS
SEQ ID NO: 319 HCDR3（IMGT） ARRGSRYEEYYVMDY
SEQ ID NO: 320 VH EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSTYAMSWVRQTPEKRLEWVATISDGGSYSYYPDNVKGRFTISRDNAKNNLYLQMSHLKSEDTAMYYCARRGSRYEEYYVMDYWGQGTSVTVSS
SEQ ID NO: 321 DNA VH （CysMab突變加底線） GAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTACCTATGCCATGTCTTGGGTTCGCCAGACTCCGGAAAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCAACCATTAGTGATGGTGGTAGTTATTCGTACTATCCAGACAATGTAAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACAACCTATACCTGCAAATGAGCCATCTGAAGTCTGAGGACACAGCCATGTATTACTGTGCAAGACGAGGTAGTAGGTACGAAGAGTACTATGTTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO: 322 重鏈 （CysMab突變加底線） EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSTYAMSWVRQTPEKRLEWVATISDGGSYSYYPDNVKGRFTISRDNAKNNLYLQMSHLKSEDTAMYYCARRGSRYEEYYVMDYWGQGTSVTVSSastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfp C pvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkrvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfyp C diavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk
SEQ ID NO: 323 DNA重鏈 GAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTACCTATGCCATGTCTTGGGTTCGCCAGACTCCGGAAAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCAACCATTAGTGATGGTGGTAGTTATTCGTACTATCCAGACAATGTAAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACAACCTATACCTGCAAATGAGCCATCTGAAGTCTGAGGACACAGCCATGTATTACTGTGCAAGACGAGGTAGTAGGTACGAAGAGTACTATGTTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAgctagcaccaagggcccaagtgtgtttcccctggcccccagcagcaagtctacttccggcggaactgctgccctgggttgcctggtgaaggactacttcccctgtcccgtgacagtgtcctggaactctggggctctgacttccggcgtgcacaccttccccgccgtgctgcagagcagcggcctgtacagcctgagcagcgtggtgacagtgccctccagctctctgggaacccagacctatatctgcaacgtgaaccacaagcccagcaacaccaaggtggacaagagagtggagcccaagagctgcgacaagacccacacctgccccccctgcccagctccagaactgctgggagggccttccgtgttcctgttcccccccaagcccaaggacaccctgatgatcagcaggacccccgaggtgacctgcgtggtggtggacgtgtcccacgaggacccagaggtgaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcacaacgccaagaccaagcccagagaggagcagtacaacagcacctacagggtggtgtccgtgctgaccgtgctgcaccaggactggctgaacggcaaagaatacaagtgcaaagtctccaacaaggccctgccagccccaatcgaaaagacaatcagcaaggccaagggccagccacgggagccccaggtgtacaccctgccccccagccgggaggagatgaccaagaaccaggtgtccctgacctgtctggtgaagggcttctacccctgtgatatcgccgtggagtgggagagcaacggccagcccgagaacaactacaagaccacccccccagtgctggacagcgacggcagcttcttcctgtacagcaagctgaccgtggacaagtccaggtggcagcagggcaacgtgttcagctgcagcgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagtccctgagcctgagccccggcaag   
SEQ ID NO: 324 LCDR1（組合的） RASQSISNNLH
SEQ ID NO: 325 LCDR2（組合的） YASQSIS
SEQ ID NO: 326 LCDR3（組合的） QQSSSWLT
SEQ ID NO: 327 LCDR1（卡巴特） RASQSISNNLH
SEQ ID NO: 328 LCDR2（卡巴特） YASQSIS
SEQ ID NO: 329 LCDR3（卡巴特） QQSSSWLT
SEQ ID NO: 330 LCDR1（喬西亞） SQSISNN
SEQ ID NO: 331 LCDR2（喬西亞） YAS
SEQ ID NO: 332 LCDR3（喬西亞） SSSWL
SEQ ID NO: 333 LCDR1（IMGT） QSISNN
SEQ ID NO: 334 LCDR2（IMGT） YAS
SEQ ID NO: 335 LCDR3（IMGT） QQSSSWLT
SEQ ID NO: 336 VL DIVLTQSPATLSVTPGDSVSLSCRASQSISNNLHWYQQKSHESPKLLIKYASQSISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVETEDFGMYFCQQSNSWLTFGAGTKLGLK
SEQ ID NO: 337 DNA VL GATATTGTGCTAACTCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTGACTCCAGGAGATAGCGTCAGTCTTTCCTGCAGGGCCAGCCAAAGTATTAGCAACAACCTACACTGGTATCAACAGAAATCACATGAGTCTCCAAAACTTCTCATCAAGTATGCTTCCCAGTCCATCTCTGGGATCCCCTCCAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACTCTCAGTATCAACAGTGTGGAGACTGAAGATTTTGGAATGTATTTCTGTCAACAGAGTAACAGCTGGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGGGCTGAAA
SEQ ID NO: 338 輕鏈 DIVLTQSPATLSVTPGDSVSLSCRASQSISNNLHWYQQKSHESPKLLIKYASQSISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVETEDFGMYFCQQSNSWLTFGAGTKLGLKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO: 339 DNA輕鏈 GATATTGTGCTAACTCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTGACTCCAGGAGATAGCGTCAGTCTTTCCTGCAGGGCCAGCCAAAGTATTAGCAACAACCTACACTGGTATCAACAGAAATCACATGAGTCTCCAAAACTTCTCATCAAGTATGCTTCCCAGTCCATCTCTGGGATCCCCTCCAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACTCTCAGTATCAACAGTGTGGAGACTGAAGATTTTGGAATGTATTTCTGTCAACAGAGTAACAGCTGGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGGGCTGAAACGTACGGTGGCCGCTCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGACGAGCAGCTGAAGAGTGGCACCGCCAGCGTGGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTCACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCATAAGGTGTACGCCTGCGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACAGGGGCGAGTGC
     
親本 121G12  hIgG1 DAPA CysMab    
SEQ ID NO: 340 HCDR1（組合的） GFTFSTYAMS
SEQ ID NO: 341 HCDR2（組合的） TISDAGSYSYYPDNVKG
SEQ ID NO: 342 HCDR3（組合的） RGSRYEEYYVMDY
SEQ ID NO: 343 HCDR1（卡巴特） TYAMS
SEQ ID NO: 344 HCDR2（卡巴特） TISDAGSYSYYPDNVKG
SEQ ID NO: 345 HCDR3（卡巴特） RGSRYEEYYVMDY
SEQ ID NO: 346 HCDR1（喬西亞） GFTFSTY
SEQ ID NO: 347 HCDR2（喬西亞） SDAGSY
SEQ ID NO: 348 HCDR3（喬西亞） RGSRYEEYYVMDY
SEQ ID NO: 349 HCDR1（IMGT） GFTFSTYA
SEQ ID NO: 350 HCDR2（IMGT） ISDAGSYS
SEQ ID NO: 351 HCDR3（IMGT） ARRGSRYEEYYVMDY
SEQ ID NO: 352 VH EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMSWVRQAPGKGLEWVATISDAGSYSYYPDNVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGSRYEEYYVMDYWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO: 353 DNA VH GAGGTGCAGCTGGTGGAATCTGGCGGAGGCCTGGTGAAACCCGGCGGATCCCTGAGACTGTCCTGCGCCGCCTCCGGCTTCACCTTCTCCACCTACGCCATGTCCTGGGTGCGGCAGGCTCCCGGCAAGGGCCTGGAATGGGTGGCCACCATCTCCGACGCCGGCTCCTACTCCTACTACCCCGACAACGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCCGGGACAACGCCAAGAACTCCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAGACGGGGCTCCAGATACGAAGAGTACTACGTGATGGACTATTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACAGTGTCCTCC
SEQ ID NO: 354 重鏈 （DAPA、CysMab突變加底線） EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMSWVRQAPGKGLEWVATISDAGSYSYYPDNVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGSRYEEYYVMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFP C PVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVV A VSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAL A APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYP C DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 355 DNA重鏈 GAGGTGCAGCTGGTGGAATCTGGCGGAGGCCTGGTGAAACCCGGCGGATCCCTGAGACTGTCCTGCGCCGCCTCCGGCTTCACCTTCTCCACCTACGCCATGTCCTGGGTGCGGCAGGCTCCCGGCAAGGGCCTGGAATGGGTGGCCACCATCTCCGACGCCGGCTCCTACTCCTACTACCCCGACAACGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCCGGGACAACGCCAAGAACTCCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAGACGGGGCTCCAGATACGAAGAGTACTACGTGATGGACTATTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACAGTGTCCTCCGCTAGCACCAAGGGCCCAAGTGTGTTTCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGTCTACTTCCGGCGGAACTGCTGCCCTGGGTTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCTGTCCCGTGACAGTGTCCTGGAACTCTGGGGCTCTGACTTCCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACAGTGCCCTCCAGCTCTCTGGGAACCCAGACCTATATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTGGAGCCCAAGAGCTGCGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCAGCTCCAGAACTGCTGGGAGGGCCTTCCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCAGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGCCGTGTCCCACGAGGACCCAGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACAGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAGTGCAAAGTCTCCAACAAGGCCCTGGCTGCCCCAATCGAAAAGACAATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCACGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCCAGCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCTGTGATATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCAGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCAGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGAGCCTGAGCCCCGGCAAG
SEQ ID NO: 356 LCDR1（組合的） RASQSISNNLH
SEQ ID NO: 357 LCDR2（組合的） YASQSIS
SEQ ID NO: 358 LCDR3（組合的） QQSSSWLT
SEQ ID NO: 359 LCDR1（卡巴特） RASQSISNNLH
SEQ ID NO: 360 LCDR2（卡巴特） YASQSIS
SEQ ID NO: 361 LCDR3（卡巴特） QQSSSWLT
SEQ ID NO: 362 LCDR1（喬西亞） SQSISNN
SEQ ID NO: 363 LCDR2（喬西亞） YAS
SEQ ID NO: 364 LCDR3（喬西亞） SSSWL
SEQ ID NO: 365 LCDR1（IMGT） QSISNN
SEQ ID NO: 366 LCDR2（IMGT） YAS
SEQ ID NO: 367 LCDR3（IMGT） QQSSSWLT
SEQ ID NO: 368 VL EIVLTQSPATLSVSPGERVTLSCRASQSISNNLHWYQQKPGQAPRLLIKYASQSISGIPARFSGSGSGTDFTLTISSVEPEDFGVYFCQQSSSWLTFGQGTKLEIK
SEQ ID NO: 369 DNA VL GAGATCGTGCTGACCCAGTCCCCTGCCACCCTGTCCGTGTCTCCCGGCGAGAGAGTGACCCTGTCCTGCCGGGCCTCCCAGTCCATCTCCAACAACCTGCACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCCCCTCGGCTGCTGATTAAGTACGCCTCCCAGAGCATCTCCGGCATCCCTGCCAGATTCTCCGGCTCCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCTCCAGCGTGGAACCCGAGGACTTCGGCGTGTACTTCTGCCAGCAGTCCTCATCCTGGCTGACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAAATCAAG
SEQ ID NO: 370 輕鏈 EIVLTQSPATLSVSPGERVTLSCRASQSISNNLHWYQQKPGQAPRLLIKYASQSISGIPARFSGSGSGTDFTLTISSVEPEDFGVYFCQQSSSWLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO: 371 DNA輕鏈 GAGATCGTGCTGACCCAGTCCCCTGCCACCCTGTCCGTGTCTCCCGGCGAGAGAGTGACCCTGTCCTGCCGGGCCTCCCAGTCCATCTCCAACAACCTGCACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCCCCTCGGCTGCTGATTAAGTACGCCTCCCAGAGCATCTCCGGCATCCCTGCCAGATTCTCCGGCTCCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCTCCAGCGTGGAACCCGAGGACTTCGGCGTGTACTTCTGCCAGCAGTCCTCATCCTGGCTGACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAAATCAAGCGTACGGTGGCCGCTCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGACGAGCAGCTGAAGAGTGGCACCGCCAGCGTGGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTCACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCATAAGGTGTACGCCTGCGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACAGGGGCGAGTGC
     
親本 506E15 hIgG1 CysMab    
SEQ ID NO: 372 HCDR1（組合的） GFTFSSYAMS
SEQ ID NO: 373 HCDR2（組合的） TISSGGSFTYYPDSVKG
SEQ ID NO: 374 HCDR3（組合的） RASTVVGTDFDV
SEQ ID NO: 375 HCDR1（卡巴特） SYAMS
SEQ ID NO: 376 HCDR2（卡巴特） TISSGGSFTYYPDSVKG
SEQ ID NO: 377 HCDR3（卡巴特） RASTVVGTDFDV
SEQ ID NO: 378 HCDR1（喬西亞） GFTFSSY
SEQ ID NO: 379 HCDR2（喬西亞） SSGGSF
SEQ ID NO: 380 HCDR3（喬西亞） RASTVVGTDFDV
SEQ ID NO: 381 HCDR1（IMGT） GFTFSSYA
SEQ ID NO: 382 HCDR2（IMGT） ISSGGSFT
SEQ ID NO: 383 HCDR3（IMGT） ARRASTVVGTDFDV
SEQ ID NO: 384 VH EVMLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYAMSWIRQTPEKRLEWVATISSGGSFTYYPDSVKGRFTISRDNVKNTLYLQMSSLRSEDTAMYYCARRASTVVGTDFDVWGAGTTVTVSS
SEQ ID NO: 385 DNA VH GAAGTGATGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAGCTATGCCATGTCTTGGATTCGCCAGACTCCGGAGAAGAGACTGGAGTGGGTCGCAACCATCAGTAGTGGTGGTAGTTTCACCTACTATCCAGACAGTGTGAAGGGGCGATTCACCATTTCTAGAGACAATGTCAAGAACACCCTGTACCTGCAAATGAGCAGTCTGAGGTCTGAAGACACGGCCATGTATTACTGTGCAAGACGGGCTTCTACGGTAGTAGGTACGGACTTCGATGTCTGGGGCGCAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO: 386 重鏈 （CysMab突變加底線） EVMLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYAMSWIRQTPEKRLEWVATISSGGSFTYYPDSVKGRFTISRDNVKNTLYLQMSSLRSEDTAMYYCARRASTVVGTDFDVWGAGTTVTVSSastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfp C pvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkrvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfyp C diavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk
SEQ ID NO: 387 DNA重鏈 GAAGTGATGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAGCTATGCCATGTCTTGGATTCGCCAGACTCCGGAGAAGAGACTGGAGTGGGTCGCAACCATCAGTAGTGGTGGTAGTTTCACCTACTATCCAGACAGTGTGAAGGGGCGATTCACCATTTCTAGAGACAATGTCAAGAACACCCTGTACCTGCAAATGAGCAGTCTGAGGTCTGAAGACACGGCCATGTATTACTGTGCAAGACGGGCTTCTACGGTAGTAGGTACGGACTTCGATGTCTGGGGCGCAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAgctagcaccaagggcccaagtgtgtttcccctggcccccagcagcaagtctacttccggcggaactgctgccctgggttgcctggtgaaggactacttcccctgtcccgtgacagtgtcctggaactctggggctctgacttccggcgtgcacaccttccccgccgtgctgcagagcagcggcctgtacagcctgagcagcgtggtgacagtgccctccagctctctgggaacccagacctatatctgcaacgtgaaccacaagcccagcaacaccaaggtggacaagagagtggagcccaagagctgcgacaagacccacacctgccccccctgcccagctccagaactgctgggagggccttccgtgttcctgttcccccccaagcccaaggacaccctgatgatcagcaggacccccgaggtgacctgcgtggtggtggacgtgtcccacgaggacccagaggtgaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcacaacgccaagaccaagcccagagaggagcagtacaacagcacctacagggtggtgtccgtgctgaccgtgctgcaccaggactggctgaacggcaaagaatacaagtgcaaagtctccaacaaggccctgccagccccaatcgaaaagacaatcagcaaggccaagggccagccacgggagccccaggtgtacaccctgccccccagccgggaggagatgaccaagaaccaggtgtccctgacctgtctggtgaagggcttctacccctgtgatatcgccgtggagtgggagagcaacggccagcccgagaacaactacaagaccacccccccagtgctggacagcgacggcagcttcttcctgtacagcaagctgaccgtggacaagtccaggtggcagcagggcaacgtgttcagctgcagcgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagtccctgagcctgagccccggcaag
SEQ ID NO: 388 LCDR1（組合的） RASQDIGSSLN
SEQ ID NO: 389 LCDR2（組合的） ATSSLDS
SEQ ID NO: 390 LCDR3（組合的） LQYASSPPT
SEQ ID NO: 391 LCDR1（卡巴特） RASQDIGSSLN
SEQ ID NO: 392 LCDR2（卡巴特） ATSSLDS
SEQ ID NO: 393 LCDR3（卡巴特） LQYASSPPT
SEQ ID NO: 394 LCDR1（喬西亞） SQDIGSS
SEQ ID NO: 395 LCDR2（喬西亞） ATS
SEQ ID NO: 396 LCDR3（喬西亞） YASSPP
SEQ ID NO: 397 LCDR1（IMGT） QDIGSS
SEQ ID NO: 398 LCDR2（IMGT） ATS
SEQ ID NO: 399 LCDR3（IMGT） LQYASSPPT
SEQ ID NO: 400 VL DIQMTQSPSSLSASLGERVSLTCRASQDIGSSLNWLQQEPDGTIKRLIYATSSLDSGVPKRFSGSRSGSDYSLTISSLESEDFVVYYCLQYASSPPTFGGGTKLEIK
SEQ ID NO: 401 DNA VL GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCTTATCTGCCTCTCTGGGAGAAAGAGTCAGTCTCACTTGTCGGGCAAGTCAGGACATTGGTAGTAGCTTAAACTGGCTTCAGCAGGAACCAGATGGAACTATTAAACGCCTGATCTATGCCACATCCAGTTTAGATTCTGGTGTCCCCAAAAGGTTCAGTGGCAGTAGGTCTGGGTCAGATTATTCTCTCACCATCAGCAGCCTTGAGTCTGAAGATTTTGTAGTCTATTACTGTCTACAATATGCTAGTTCGCCTCCGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA
SEQ ID NO: 402 輕鏈 DIQMTQSPSSLSASLGERVSLTCRASQDIGSSLNWLQQEPDGTIKRLIYATSSLDSGVPKRFSGSRSGSDYSLTISSLESEDFVVYYCLQYASSPPTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO: 403 DNA輕鏈 GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCTTATCTGCCTCTCTGGGAGAAAGAGTCAGTCTCACTTGTCGGGCAAGTCAGGACATTGGTAGTAGCTTAAACTGGCTTCAGCAGGAACCAGATGGAACTATTAAACGCCTGATCTATGCCACATCCAGTTTAGATTCTGGTGTCCCCAAAAGGTTCAGTGGCAGTAGGTCTGGGTCAGATTATTCTCTCACCATCAGCAGCCTTGAGTCTGAAGATTTTGTAGTCTATTACTGTCTACAATATGCTAGTTCGCCTCCGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGTACGGTGGCCGCTCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGACGAGCAGCTGAAGAGTGGCACCGCCAGCGTGGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTCACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCATAAGGTGTACGCCTGCGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACAGGGGCGAGTGC
     
親本 506E15  hIgG1 DAPA CysMab    
SEQ ID NO: 404 HCDR1（組合的） GFTFSSYAMS
SEQ ID NO: 405 HCDR2（組合的） TISSGGSFTYYPDSVKG
SEQ ID NO: 406 HCDR3（組合的） RASTVVGTDFDV
SEQ ID NO: 407 HCDR1（卡巴特） SYAMS
SEQ ID NO: 408 HCDR2（卡巴特） TISSGGSFTYYPDSVKG
SEQ ID NO: 409 HCDR3（卡巴特） RASTVVGTDFDV
SEQ ID NO: 410 HCDR1（喬西亞） GFTFSSY
SEQ ID NO: 411 HCDR2（喬西亞） SSGGSF
SEQ ID NO: 412 HCDR3（喬西亞） RASTVVGTDFDV
SEQ ID NO: 413 HCDR1（IMGT） GFTFSSYA
SEQ ID NO: 414 HCDR2（IMGT） ISSGGSFT
SEQ ID NO: 415 HCDR3（IMGT） ARRASTVVGTDFDV
SEQ ID NO: 416 VH EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWIRQAPGKGLEWVATISSGGSFTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRASTVVGTDFDVWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO: 417 DNA VH GAGGTGCAGCTGGTGGAATCTGGCGGAGGCCTGGTGAAACCCGGCGGATCCCTGAGACTGTCCTGCGCCGCCTCCGGCTTCACCTTCTCCAGCTACGCCATGTCCTGGATCCGGCAGGCTCCCGGCAAGGGCCTGGAATGGGTGGCCACCATCTCCTCCGGCGGCAGCTTCACCTACTACCCCGACAGCGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCCGGGACAACGCCAAGAACTCCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAGACGGGCCTCCACCGTCGTGGGAACCGACTTCGATGTGTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACAGTGTCCTCC
SEQ ID NO: 418 重鏈 （DAPA、CysMab突變加底線） EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWIRQAPGKGLEWVATISSGGSFTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRASTVVGTDFDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFP C PVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVV A VSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAL A APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYP C DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 419 DNA重鏈 GAGGTGCAGCTGGTGGAATCTGGCGGAGGCCTGGTGAAACCCGGCGGATCCCTGAGACTGTCCTGCGCCGCCTCCGGCTTCACCTTCTCCAGCTACGCCATGTCCTGGATCCGGCAGGCTCCCGGCAAGGGCCTGGAATGGGTGGCCACCATCTCCTCCGGCGGCAGCTTCACCTACTACCCCGACAGCGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCCGGGACAACGCCAAGAACTCCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAGACGGGCCTCCACCGTCGTGGGAACCGACTTCGATGTGTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACAGTGTCCTCCGCTAGCACCAAGGGCCCAAGTGTGTTTCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGTCTACTTCCGGCGGAACTGCTGCCCTGGGTTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCTGTCCCGTGACAGTGTCCTGGAACTCTGGGGCTCTGACTTCCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACAGTGCCCTCCAGCTCTCTGGGAACCCAGACCTATATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTGGAGCCCAAGAGCTGCGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCAGCTCCAGAACTGCTGGGAGGGCCTTCCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCAGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGCCGTGTCCCACGAGGACCCAGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACAGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAGTGCAAAGTCTCCAACAAGGCCCTGGCTGCCCCAATCGAAAAGACAATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCACGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCCAGCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCTGTGATATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCAGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCAGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGAGCCTGAGCCCCGGCAAG
SEQ ID NO: 420 LCDR1（組合的） RASQDIGSSLN
SEQ ID NO: 421 LCDR2（組合的） ATSSLDS
SEQ ID NO: 422 LCDR3（組合的） LQYASSPPT
SEQ ID NO: 423 LCDR1（卡巴特） RASQDIGSSLN
SEQ ID NO: 424 LCDR2（卡巴特） ATSSLDS
SEQ ID NO: 425 LCDR3（卡巴特） LQYASSPPT
SEQ ID NO: 426 LCDR1（喬西亞） SQDIGSS
SEQ ID NO: 427 LCDR2（喬西亞） ATS
SEQ ID NO: 428 LCDR3（喬西亞） YASSPP
SEQ ID NO: 429 LCDR1（IMGT） QDIGSS
SEQ ID NO: 430 LCDR2（IMGT） ATS
SEQ ID NO: 431 LCDR3（IMGT） LQYASSPPT
SEQ ID NO: 432 VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTLTCRASQDIGSSLNWLQQKPGKAIKRLIYATSSLDSGVPSRFSGSRSGTDYTLTISSLQPEDFVVYYCLQYASSPPTFGGGTKLEIK
SEQ ID NO: 433 DNA VL GACATCCAGATGACCCAGTCCCCCTCCAGCCTGTCCGCCTCCGTGGGCGATAGAGTGACCCTGACCTGCCGGGCCTCCCAGGACATCGGCTCCTCCCTGAACTGGCTGCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCATCAAGCGGCTGATCTACGCCACCTCCTCCCTGGACTCCGGCGTGCCCTCCCGGTTCTCCGGCTCTAGATCCGGCACCGACTACACCCTGACCATCTCCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGTGGTGTACTACTGCCTGCAGTACGCCTCCAGCCCCCCCACCTTTGGCGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAG
SEQ ID NO: 434 輕鏈 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTLTCRASQDIGSSLNWLQQKPGKAIKRLIYATSSLDSGVPSRFSGSRSGTDYTLTISSLQPEDFVVYYCLQYASSPPTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO: 435 DNA輕鏈 GACATCCAGATGACCCAGTCCCCCTCCAGCCTGTCCGCCTCCGTGGGCGATAGAGTGACCCTGACCTGCCGGGCCTCCCAGGACATCGGCTCCTCCCTGAACTGGCTGCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCATCAAGCGGCTGATCTACGCCACCTCCTCCCTGGACTCCGGCGTGCCCTCCCGGTTCTCCGGCTCTAGATCCGGCACCGACTACACCCTGACCATCTCCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGTGGTGTACTACTGCCTGCAGTACGCCTCCAGCCCCCCCACCTTTGGCGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAGCGTACGGTGGCCGCTCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGACGAGCAGCTGAAGAGTGGCACCGCCAGCGTGGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTCACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCATAAGGTGTACGCCTGCGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACAGGGGCGAGTGC
     
親本 684E12 hIgG1 CysMab    
SEQ ID NO: 436 HCDR1（組合的） GFTFSNFAMS
SEQ ID NO: 437 HCDR2（組合的） TISTGGTYTYYPDSVKG
SEQ ID NO: 438 HCDR3（組合的） RGYDGVDK
SEQ ID NO: 439 HCDR1（卡巴特） SNFAMS
SEQ ID NO: 440 HCDR2（卡巴特） TISTGGTYTYYPDSVKG
SEQ ID NO: 441 HCDR3（卡巴特） RGYDGVDK
SEQ ID NO: 442 HCDR1（喬西亞） GFTFSNF
SEQ ID NO: 443 HCDR2（喬西亞） STGGTY
SEQ ID NO: 444 HCDR3（喬西亞） RGYDGVDK
SEQ ID NO: 445 HCDR1（IMGT） GFTFSNFA
SEQ ID NO: 446 HCDR2（IMGT） ISTGGTYT
SEQ ID NO: 447 HCDR3（IMGT） TRRGYDGVDK
SEQ ID NO: 448 VH EVHLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSNFAMSWVRQTPEKRLEWVATISTGGTYTYYPDSVKGRFTISRDNAKKTLYLQMSSLRSEDTAMYYCTRRGYDGVDKWGQGTTLTVSS
SEQ ID NO: 449 DNA VH GAAGTGCATCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAACTTTGCCATGTCTTGGGTTCGCCAGACTCCGGAGAAGAGACTGGAGTGGGTCGCAACCATTAGTACTGGTGGTACTTACACCTACTATCCAGACAGTGTGAAGGGTCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAAAACCCTGTACCTGCAAATGAGCAGTCTGAGGTCTGAGGACACGGCCATGTATTACTGTACAAGACGGGGGTACGACGGCGTGGACAAATGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA
SEQ ID NO: 450 重鏈 （CysMab突變加底線） EVHLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSNFAMSWVRQTPEKRLEWVATISTGGTYTYYPDSVKGRFTISRDNAKKTLYLQMSSLRSEDTAMYYCTRRGYDGVDKWGQGTTLTVSSastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfp C pvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkrvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfyp C diavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk
SEQ ID NO: 451 DNA重鏈 （CysMab突變加底線） GAAGTGCATCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAACTTTGCCATGTCTTGGGTTCGCCAGACTCCGGAGAAGAGACTGGAGTGGGTCGCAACCATTAGTACTGGTGGTACTTACACCTACTATCCAGACAGTGTGAAGGGTCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAAAACCCTGTACCTGCAAATGAGCAGTCTGAGGTCTGAGGACACGGCCATGTATTACTGTACAAGACGGGGGTACGACGGCGTGGACAAATGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCAgctagcaccaagggcccaagtgtgtttcccctggcccccagcagcaagtctacttccggcggaactgctgccctgggttgcctggtgaaggactacttcccctgtcccgtgacagtgtcctggaactctggggctctgacttccggcgtgcacaccttccccgccgtgctgcagagcagcggcctgtacagcctgagcagcgtggtgacagtgccctccagctctctgggaacccagacctatatctgcaacgtgaaccacaagcccagcaacaccaaggtggacaagagagtggagcccaagagctgcgacaagacccacacctgccccccctgcccagctccagaactgctgggagggccttccgtgttcctgttcccccccaagcccaaggacaccctgatgatcagcaggacccccgaggtgacctgcgtggtggtggacgtgtcccacgaggacccagaggtgaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcacaacgccaagaccaagcccagagaggagcagtacaacagcacctacagggtggtgtccgtgctgaccgtgctgcaccaggactggctgaacggcaaagaatacaagtgcaaagtctccaacaaggccctgccagccccaatcgaaaagacaatcagcaaggccaagggccagccacgggagccccaggtgtacaccctgccccccagccgggaggagatgaccaagaaccaggtgtccctgacctgtctggtgaagggcttctacccctgtgatatcgccgtggagtgggagagcaacggccagcccgagaacaactacaagaccacccccccagtgctggacagcgacggcagcttcttcctgtacagcaagctgaccgtggacaagtccaggtggcagcagggcaacgtgttcagctgcagcgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagtccctgagcctgagccccggcaag
SEQ ID NO: 452 LCDR1（組合的） KSGQSLLDSDGKTYLN
SEQ ID NO: 453 LCDR2（組合的） LVSKLDS
SEQ ID NO: 454 LCDR3（組合的） WQGTHFPQT
SEQ ID NO: 455 LCDR1（卡巴特） KSGQSLLDSDGKTYLN
SEQ ID NO: 456 LCDR2（卡巴特） LVSKLDS
SEQ ID NO: 457 LCDR3（卡巴特） WQGTHFPQT
SEQ ID NO: 458 LCDR1（喬西亞） GQSLLDSDGKTY
SEQ ID NO: 459 LCDR2（喬西亞） LVS
SEQ ID NO: 460 LCDR3（喬西亞） GTHFPQ
SEQ ID NO: 461 LCDR1（IMGT） QSLLDSDGKTY
SEQ ID NO: 462 LCDR2（IMGT） LVS
SEQ ID NO: 463 LCDR3（IMGT） WQGTHFPQT
SEQ ID NO: 464 VL DVVMTQTPLTLSVTIGQPASISCKSGQSLLDSDGKTYLNWFLQRPGQSPKRLIYLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCWQGTHFPQTFGGGTKLEIK
SEQ ID NO: 465 DNA VL gatgttgtgatgacccagactccactcactttgtcggttaccattggacaaccagcctccatctcttgcaagtcaggtcagagcctcttagatagtgatggaaagacatatttgaattggtttttacagaggccaggccagtctccaaagcgcctaatctatctggtgtctaaactggactctggagtccctgacaggttcactggcagtggatcagggacagatttcacactgaaaatcagcagagtggaggctgaggatttgggagtttattattgctggcaaggtacacattttcctcagacgttcggtggaggcaccaagctggaaatcaaa
SEQ ID NO: 466 輕鏈 DVVMTQTPLTLSVTIGQPASISCKSGQSLLDSDGKTYLNWFLQRPGQSPKRLIYLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCWQGTHFPQTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO: 467 DNA輕鏈 GATGTTGTGATGACCCAGACTCCACTCACTTTGTCGGTTACCATTGGACAACCAGCCTCCATCTCTTGCAAGTCAGGTCAGAGCCTCTTAGATAGTGATGGAAAGACATATTTGAATTGGTTTTTACAGAGGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCGCCTAATCTATCTGGTGTCTAAACTGGACTCTGGAGTCCCTGACAGGTTCACTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATTTGGGAGTTTATTATTGCTGGCAAGGTACACATTTTCCTCAGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAAcgtacggtggccgctcccagcgtgttcatcttcccccccagcgacgagcagctgaagagtggcaccgccagcgtggtgtgcctgctgaacaacttctacccccgggaggccaaggtgcagtggaaggtggacaacgccctgcagagcggcaacagccaggagagcgtcaccgagcaggacagcaaggactccacctacagcctgagcagcaccctgaccctgagcaaggccgactacgagaagcataaggtgtacgcctgcgaggtgacccaccagggcctgtccagccccgtgaccaagagcttcaacaggggcgagtgc
     
親本 684E12 hIgG1 DAPA CysMab    
SEQ ID NO: 468 HCDR1（組合的） GFTFSNFAMS
SEQ ID NO: 469 HCDR2（組合的） TISTGGTYTYYPDSVKG
SEQ ID NO: 470 HCDR3（組合的） RGYDGVDK
SEQ ID NO: 471 HCDR1（卡巴特） SNFAMS
SEQ ID NO: 472 HCDR2（卡巴特） TISTGGTYTYYPDSVKG
SEQ ID NO: 473 HCDR3（卡巴特） RGYDGVDK
SEQ ID NO: 474 HCDR1（喬西亞） GFTFSNF
SEQ ID NO: 475 HCDR2（喬西亞） STGGTY
SEQ ID NO: 476 HCDR3（喬西亞） RGYDGVDK
SEQ ID NO: 477 HCDR1（IMGT） GFTFSNFA
SEQ ID NO: 478 HCDR2（IMGT） ISTGGTYT
SEQ ID NO: 479 HCDR3（IMGT） TRRGYDGVDK
SEQ ID NO: 480 VH EVHLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSNFAMSWVRQTPEKRLEWVATISTGGTYTYYPDSVKGRFTISRDNAKKTLYLQMSSLRSEDTAMYYCTRRGYDGVDKWGQGTTLTVSS
SEQ ID NO: 481 DNA VH GAAGTGCATCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAACTTTGCCATGTCTTGGGTTCGCCAGACTCCGGAGAAGAGACTGGAGTGGGTCGCAACCATTAGTACTGGTGGTACTTACACCTACTATCCAGACAGTGTGAAGGGTCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAAAACCCTGTACCTGCAAATGAGCAGTCTGAGGTCTGAGGACACGGCCATGTATTACTGTACAAGACGGGGGTACGACGGCGTGGACAAATGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA
SEQ ID NO: 482 重鏈 （DAPA、CysMab突變加底線） EVHLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSNFAMSWVRQTPEKRLEWVATISTGGTYTYYPDSVKGRFTISRDNAKKTLYLQMSSLRSEDTAMYYCTRRGYDGVDKWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFP C PVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVV A VSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAL A APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYP C DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 483 DNA重鏈 GAAGTGCATCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAACTTTGCCATGTCTTGGGTTCGCCAGACTCCGGAGAAGAGACTGGAGTGGGTCGCAACCATTAGTACTGGTGGTACTTACACCTACTATCCAGACAGTGTGAAGGGTCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAAAACCCTGTACCTGCAAATGAGCAGTCTGAGGTCTGAGGACACGGCCATGTATTACTGTACAAGACGGGGGTACGACGGCGTGGACAAATGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCAgctagcaccaagggcccaagtgtgtttcccctggcccccagcagcaagtctacttccggcggaactgctgccctgggttgcctggtgaaggactacttcccctgtcccgtgacagtgtcctggaactctggggctctgacttccggcgtgcacaccttccccgccgtgctgcagagcagcggcctgtacagcctgagcagcgtggtgacagtgccctccagctctctgggaacccagacctatatctgcaacgtgaaccacaagcccagcaacaccaaggtggacaagagagtggagcccaagagctgcgacaagacccacacctgccccccctgcccagctccagaactgctgggagggccttccgtgttcctgttcccccccaagcccaaggacaccctgatgatcagcaggacccccgaggtgacctgcgtggtggtggccgtgtcccacgaggacccagaggtgaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcacaacgccaagaccaagcccagagaggagcagtacaacagcacctacagggtggtgtccgtgctgaccgtgctgcaccaggactggctgaacggcaaagaatacaagtgcaaagtctccaacaaggccctggctgccccaatcgaaaagacaatcagcaaggccaagggccagccacgggagccccaggtgtacaccctgccccccagccgggaggagatgaccaagaaccaggtgtccctgacctgtctggtgaagggcttctacccctgtgatatcgccgtggagtgggagagcaacggccagcccgagaacaactacaagaccacccccccagtgctggacagcgacggcagcttcttcctgtacagcaagctgaccgtggacaagtccaggtggcagcagggcaacgtgttcagctgcagcgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagtccctgagcctgagccccggcaag
SEQ ID NO: 484 LCDR1（組合的） KSGQSLLDSDGKTYLN
SEQ ID NO: 485 LCDR2（組合的） LVSKLDS
SEQ ID NO: 486 LCDR3（組合的） WQGTHFPQT
SEQ ID NO: 487 LCDR1（卡巴特） KSGQSLLDSDGKTYLN
SEQ ID NO: 488 LCDR2（卡巴特） LVSKLDS
SEQ ID NO: 489 LCDR3（卡巴特） WQGTHFPQT
SEQ ID NO: 490 LCDR1（喬西亞） GQSLLDSDGKTY
SEQ ID NO: 491 LCDR2（喬西亞） LVS
SEQ ID NO: 492 LCDR3（喬西亞） GTHFPQ
SEQ ID NO: 493 LCDR1（IMGT） QSLLDSDGKTY
SEQ ID NO: 494 LCDR2（IMGT） LVS
SEQ ID NO: 495 LCDR3（IMGT） WQGTHFPQT
SEQ ID NO: 496 VL DVVMTQTPLTLSVTIGQPASISCKSGQSLLDSDGKTYLNWFLQRPGQSPKRLIYLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCWQGTHFPQTFGGGTKLEIK
SEQ ID NO: 497 DNA VL gatgttgtgatgacccagactccactcactttgtcggttaccattggacaaccagcctccatctcttgcaagtcaggtcagagcctcttagatagtgatggaaagacatatttgaattggtttttacagaggccaggccagtctccaaagcgcctaatctatctggtgtctaaactggactctggagtccctgacaggttcactggcagtggatcagggacagatttcacactgaaaatcagcagagtggaggctgaggatttgggagtttattattgctggcaaggtacacattttcctcagacgttcggtggaggcaccaagctggaaatcaaa
SEQ ID NO: 498 輕鏈 DVVMTQTPLTLSVTIGQPASISCKSGQSLLDSDGKTYLNWFLQRPGQSPKRLIYLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCWQGTHFPQTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO: 499 DNA輕鏈 GATGTTGTGATGACCCAGACTCCACTCACTTTGTCGGTTACCATTGGACAACCAGCCTCCATCTCTTGCAAGTCAGGTCAGAGCCTCTTAGATAGTGATGGAAAGACATATTTGAATTGGTTTTTACAGAGGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCGCCTAATCTATCTGGTGTCTAAACTGGACTCTGGAGTCCCTGACAGGTTCACTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATTTGGGAGTTTATTATTGCTGGCAAGGTACACATTTTCCTCAGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAAcgtacggtggccgctcccagcgtgttcatcttcccccccagcgacgagcagctgaagagtggcaccgccagcgtggtgtgcctgctgaacaacttctacccccgggaggccaaggtgcagtggaaggtggacaacgccctgcagagcggcaacagccaggagagcgtcaccgagcaggacagcaaggactccacctacagcctgagcagcaccctgaccctgagcaaggccgactacgagaagcataaggtgtacgcctgcgaggtgacccaccagggcctgtccagccccgtgaccaagagcttcaacaggggcgagtgc
     
人源化 674J13  hIgG1 DAPA    
SEQ ID NO: 500 HCDR1（組合的） GYSITSGYSWH
SEQ ID NO: 501 HCDR2（組合的） HIHSSGSTNYNPSLKS
SEQ ID NO: 502 HCDR3（組合的） GGVQAFAY
SEQ ID NO: 503 HCDR1（卡巴特） SGYSWH
SEQ ID NO: 504 HCDR2（卡巴特） HIHSSGSTNYNPSLKS
SEQ ID NO: 505 HCDR3（卡巴特） GGVQAFAY
SEQ ID NO: 506 HCDR1（喬西亞） GYSITSGY
SEQ ID NO: 507 HCDR2（喬西亞） HSSGS
SEQ ID NO: 508 HCDR3（喬西亞） GGVQAFAY
SEQ ID NO: 509 HCDR1（IMGT） GYSITSGYS
SEQ ID NO: 510 HCDR2（IMGT） IHSSGST
SEQ ID NO: 511 HCDR3（IMGT） ARGGVQAFAY
SEQ ID NO: 512 VH DVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGYSITSGYSWHWIRQHPGKGLEWMAHIHSSGSTNYNPSLKSRITISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGGVQAFAYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 513 DNA VH GACGTGCAGCTGCAGGAATCTGGCCCTGGCCTGGTGAAACCCTCCCAGACCCTGTCCCTGACCTGCACCGTGTCCGGCTACTCCATCACCTCCGGCTACAGCTGGCACTGGATCCGGCAGCACCCCGGCAAGGGCCTGGAATGGATGGCCCACATCCACTCCTCCGGCTCCACCAACTACAACCCCAGCCTGAAGTCCAGAATCACCATCAGCCGGGACACCTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGTCCTCCGTGACCGCCGCTGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAGAGGCGGCGTGCAGGCCTTCGCTTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACAGTGTCCTCC
SEQ ID NO: 514 重鏈 （DAPA突變加底線） DVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGYSITSGYSWHWIRQHPGKGLEWMAHIHSSGSTNYNPSLKSRITISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGGVQAFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVV a VSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAL a APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 515 DNA重鏈 GACGTGCAGCTGCAGGAATCTGGCCCTGGCCTGGTGAAACCCTCCCAGACCCTGTCCCTGACCTGCACCGTGTCCGGCTACTCCATCACCTCCGGCTACAGCTGGCACTGGATCCGGCAGCACCCCGGCAAGGGCCTGGAATGGATGGCCCACATCCACTCCTCCGGCTCCACCAACTACAACCCCAGCCTGAAGTCCAGAATCACCATCAGCCGGGACACCTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGTCCTCCGTGACCGCCGCTGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAGAGGCGGCGTGCAGGCCTTCGCTTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACAGTGTCCTCCGCTAGCACCAAGGGCCCAAGTGTGTTTCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGTCTACTTCCGGCGGAACTGCTGCCCTGGGTTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACAGTGTCCTGGAACTCTGGGGCTCTGACTTCCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACAGTGCCCTCCAGCTCTCTGGGAACCCAGACCTATATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTGGAGCCCAAGAGCTGCGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCAGCTCCAGAACTGCTGGGAGGGCCTTCCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCAGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGCCGTGTCCCACGAGGACCCAGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACAGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAGTGCAAAGTCTCCAACAAGGCCCTGGCTGCCCCAATCGAAAAGACAATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCACGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCCAGCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGATATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCAGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCAGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGAGCCTGAGCCCCGGCAAG
SEQ ID NO: 516 LCDR1（組合的） SASSSVIYMH
SEQ ID NO: 517 LCDR2（組合的） DTSKLAS
SEQ ID NO: 518 LCDR3（組合的） QQWSSNPLT
SEQ ID NO: 519 LCDR1（卡巴特） SASSSVIYMH
SEQ ID NO: 520 LCDR2（卡巴特） DTSKLAS
SEQ ID NO: 521 LCDR3（卡巴特） QQWSSNPLT
SEQ ID NO: 522 LCDR1（喬西亞） SSSVIY
SEQ ID NO: 523 LCDR2（喬西亞） DTS
SEQ ID NO: 524 LCDR3（喬西亞） WSSNPL
SEQ ID NO: 525 LCDR1（IMGT） SSVIY
SEQ ID NO: 526 LCDR2（IMGT） DTS
SEQ ID NO: 527 LCDR3（IMGT） QQWSSNPLT
SEQ ID NO: 528 VL EIVLTQSPATLSASPGERVTMSCSASSSVIYMHWYQQKPGQAPRRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTDYTLTISSMEPEDAAVYYCQQWSSNPLTFGQGTKLEIK
SEQ ID NO: 529 DNA VL GAGATCGTGCTGACCCAGTCCCCTGCCACCCTGTCTGCTAGCCCTGGCGAGCGCGTGACAATGTCCTGCTCCGCCTCCTCCTCCGTGATCTACATGCACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCCCCTCGGCGGTGGATCTACGATACCTCCAAGCTGGCCTCCGGCGTGCCCGCCAGATTCTCCGGCTCTGGCTCTGGCACCGACTACACCCTGACCATCTCCAGCATGGAACCCGAGGACGCCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGTGGTCCTCCAACCCCCTGACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAAATCAAG
SEQ ID NO: 530 輕鏈 EIVLTQSPATLSASPGERVTMSCSASSSVIYMHWYQQKPGQAPRRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTDYTLTISSMEPEDAAVYYCQQWSSNPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO: 531 DNA輕鏈 GAGATCGTGCTGACCCAGTCCCCTGCCACCCTGTCTGCTAGCCCTGGCGAGCGCGTGACAATGTCCTGCTCCGCCTCCTCCTCCGTGATCTACATGCACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCCCCTCGGCGGTGGATCTACGATACCTCCAAGCTGGCCTCCGGCGTGCCCGCCAGATTCTCCGGCTCTGGCTCTGGCACCGACTACACCCTGACCATCTCCAGCATGGAACCCGAGGACGCCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGTGGTCCTCCAACCCCCTGACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAAATCAAGCGTACGGTGGCCGCTCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGACGAGCAGCTGAAGAGTGGCACCGCCAGCGTGGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTCACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCATAAGGTGTACGCCTGCGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACAGGGGCGAGTGC
     
人源化 121G12  hIgG1 DAPA    
SEQ ID NO: 532 HCDR1（組合的） GFTFSTYAMS
SEQ ID NO: 533 HCDR2（組合的） TISDAGSYSYYPDNVKG
SEQ ID NO: 534 HCDR3（組合的） RGSRYEEYYVMDY
SEQ ID NO: 535 HCDR1（卡巴特） TYAMS
SEQ ID NO: 536 HCDR2（卡巴特） TISDAGSYSYYPDNVKG
SEQ ID NO: 537 HCDR3（卡巴特） RGSRYEEYYVMDY
SEQ ID NO: 538 HCDR1（喬西亞） GFTFSTY
SEQ ID NO: 539 HCDR2（喬西亞） SDAGSY
SEQ ID NO: 540 HCDR3（喬西亞） RGSRYEEYYVMDY
SEQ ID NO: 541 HCDR1（IMGT） GFTFSTYA
SEQ ID NO: 542 HCDR2（IMGT） ISDAGSYS
SEQ ID NO: 543 HCDR3（IMGT） ARRGSRYEEYYVMDY
SEQ ID NO: 544 VH EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMSWVRQAPGKGLEWVATISDAGSYSYYPDNVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGSRYEEYYVMDYWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO: 545 DNA VH GAGGTGCAGCTGGTGGAATCTGGCGGAGGCCTGGTGAAACCCGGCGGATCCCTGAGACTGTCCTGCGCCGCCTCCGGCTTCACCTTCTCCACCTACGCCATGTCCTGGGTGCGGCAGGCTCCCGGCAAGGGCCTGGAATGGGTGGCCACCATCTCCGACGCCGGCTCCTACTCCTACTACCCCGACAACGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCCGGGACAACGCCAAGAACTCCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAGACGGGGCTCCAGATACGAAGAGTACTACGTGATGGACTATTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACAGTGTCCTCC
SEQ ID NO: 546 重鏈 （DAPA突變加底線） EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMSWVRQAPGKGLEWVATISDAGSYSYYPDNVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGSRYEEYYVMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVV a VSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAL a APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 547 DNA重鏈 GAGGTGCAGCTGGTGGAATCTGGCGGAGGCCTGGTGAAACCCGGCGGATCCCTGAGACTGTCCTGCGCCGCCTCCGGCTTCACCTTCTCCACCTACGCCATGTCCTGGGTGCGGCAGGCTCCCGGCAAGGGCCTGGAATGGGTGGCCACCATCTCCGACGCCGGCTCCTACTCCTACTACCCCGACAACGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCCGGGACAACGCCAAGAACTCCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAGACGGGGCTCCAGATACGAAGAGTACTACGTGATGGACTATTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACAGTGTCCTCCGCTAGCACCAAGGGCCCAAGTGTGTTTCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGTCTACTTCCGGCGGAACTGCTGCCCTGGGTTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACAGTGTCCTGGAACTCTGGGGCTCTGACTTCCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACAGTGCCCTCCAGCTCTCTGGGAACCCAGACCTATATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTGGAGCCCAAGAGCTGCGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCAGCTCCAGAACTGCTGGGAGGGCCTTCCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCAGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGCCGTGTCCCACGAGGACCCAGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACAGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAGTGCAAAGTCTCCAACAAGGCCCTGGCTGCCCCAATCGAAAAGACAATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCACGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCCAGCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGATATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCAGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCAGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGAGCCTGAGCCCCGGCAAG
SEQ ID NO: 548 LCDR1（組合的） RASQSISNNLH
SEQ ID NO: 549 LCDR2（組合的） YASQSIS
SEQ ID NO: 550 LCDR3（組合的） QQSSSWLT
SEQ ID NO: 551 LCDR1（卡巴特） RASQSISNNLH
SEQ ID NO: 552 LCDR2（卡巴特） YASQSIS
SEQ ID NO: 553 LCDR3（卡巴特） QQSSSWLT
SEQ ID NO: 554 LCDR1（喬西亞） SQSISNN
SEQ ID NO: 555 LCDR2（喬西亞） YAS
SEQ ID NO: 556 LCDR3（喬西亞） SSSWL
SEQ ID NO: 557 LCDR1（IMGT） QSISNN
SEQ ID NO: 558 LCDR2（IMGT） YAS
SEQ ID NO: 559 LCDR3（IMGT） QQSSSWLT
SEQ ID NO: 560 VL EIVLTQSPATLSVSPGERVTLSCRASQSISNNLHWYQQKPGQAPRLLIKYASQSISGIPARFSGSGSGTDFTLTISSVEPEDFGVYFCQQSSSWLTFGQGTKLEIK
SEQ ID NO: 561 DNA VL GAGATCGTGCTGACCCAGTCCCCTGCCACCCTGTCCGTGTCTCCCGGCGAGAGAGTGACCCTGTCCTGCCGGGCCTCCCAGTCCATCTCCAACAACCTGCACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCCCCTCGGCTGCTGATTAAGTACGCCTCCCAGAGCATCTCCGGCATCCCTGCCAGATTCTCCGGCTCCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCTCCAGCGTGGAACCCGAGGACTTCGGCGTGTACTTCTGCCAGCAGTCCTCATCCTGGCTGACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAAATCAAG
SEQ ID NO: 562 輕鏈 EIVLTQSPATLSVSPGERVTLSCRASQSISNNLHWYQQKPGQAPRLLIKYASQSISGIPARFSGSGSGTDFTLTISSVEPEDFGVYFCQQSSSWLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO: 563 DNA輕鏈 GAGATCGTGCTGACCCAGTCCCCTGCCACCCTGTCCGTGTCTCCCGGCGAGAGAGTGACCCTGTCCTGCCGGGCCTCCCAGTCCATCTCCAACAACCTGCACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCCCCTCGGCTGCTGATTAAGTACGCCTCCCAGAGCATCTCCGGCATCCCTGCCAGATTCTCCGGCTCCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCTCCAGCGTGGAACCCGAGGACTTCGGCGTGTACTTCTGCCAGCAGTCCTCATCCTGGCTGACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAAATCAAGCGTACGGTGGCCGCTCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGACGAGCAGCTGAAGAGTGGCACCGCCAGCGTGGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTCACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCATAAGGTGTACGCCTGCGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACAGGGGCGAGTGC
     
人源化 506E15  hIgG1 DAPA    
SEQ ID NO: 564 HCDR1（組合的） GFTFSSYAMS
SEQ ID NO: 565 HCDR2（組合的） TISSGGSFTYYPDSVKG
SEQ ID NO: 566 HCDR3（組合的） RASTVVGTDFDV
SEQ ID NO: 567 HCDR1（卡巴特） SYAMS
SEQ ID NO: 568 HCDR2（卡巴特） TISSGGSFTYYPDSVKG
SEQ ID NO: 569 HCDR3（卡巴特） RASTVVGTDFDV
SEQ ID NO: 570 HCDR1（喬西亞） GFTFSSY
SEQ ID NO: 571 HCDR2（喬西亞） SSGGSF
SEQ ID NO: 572 HCDR3（喬西亞） RASTVVGTDFDV
SEQ ID NO: 573 HCDR1（IMGT） GFTFSSYA
SEQ ID NO: 574 HCDR2（IMGT） ISSGGSFT
SEQ ID NO: 575 HCDR3（IMGT） ARRASTVVGTDFDV
SEQ ID NO: 576 VH EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWIRQAPGKGLEWVATISSGGSFTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRASTVVGTDFDVWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO: 577 DNA VH GAGGTGCAGCTGGTGGAATCTGGCGGAGGCCTGGTGAAACCCGGCGGATCCCTGAGACTGTCCTGCGCCGCCTCCGGCTTCACCTTCTCCAGCTACGCCATGTCCTGGATCCGGCAGGCTCCCGGCAAGGGCCTGGAATGGGTGGCCACCATCTCCTCCGGCGGCAGCTTCACCTACTACCCCGACAGCGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCCGGGACAACGCCAAGAACTCCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAGACGGGCCTCCACCGTCGTGGGAACCGACTTCGATGTGTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACAGTGTCCTCC
SEQ ID NO: 578 重鏈 （DAPA突變加底線） EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWIRQAPGKGLEWVATISSGGSFTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRASTVVGTDFDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVV a VSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAL a APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 579 DNA重鏈 GAGGTGCAGCTGGTGGAATCTGGCGGAGGCCTGGTGAAACCCGGCGGATCCCTGAGACTGTCCTGCGCCGCCTCCGGCTTCACCTTCTCCAGCTACGCCATGTCCTGGATCCGGCAGGCTCCCGGCAAGGGCCTGGAATGGGTGGCCACCATCTCCTCCGGCGGCAGCTTCACCTACTACCCCGACAGCGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCCGGGACAACGCCAAGAACTCCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAGACGGGCCTCCACCGTCGTGGGAACCGACTTCGATGTGTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACAGTGTCCTCCGCTAGCACCAAGGGCCCAAGTGTGTTTCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGTCTACTTCCGGCGGAACTGCTGCCCTGGGTTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACAGTGTCCTGGAACTCTGGGGCTCTGACTTCCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACAGTGCCCTCCAGCTCTCTGGGAACCCAGACCTATATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTGGAGCCCAAGAGCTGCGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCAGCTCCAGAACTGCTGGGAGGGCCTTCCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCAGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGCCGTGTCCCACGAGGACCCAGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACAGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAGTGCAAAGTCTCCAACAAGGCCCTGGCTGCCCCAATCGAAAAGACAATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCACGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCCAGCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGATATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCAGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCAGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGAGCCTGAGCCCCGGCAAG
SEQ ID NO: 580 LCDR1（組合的） RASQDIGSSLN
SEQ ID NO: 581 LCDR2（組合的） ATSSLDS
SEQ ID NO: 582 LCDR3（組合的） LQYASSPPT
SEQ ID NO: 583 LCDR1（卡巴特） RASQDIGSSLN
SEQ ID NO: 584 LCDR2（卡巴特） ATSSLDS
SEQ ID NO: 585 LCDR3（卡巴特） LQYASSPPT
SEQ ID NO: 586 LCDR1（喬西亞） SQDIGSS
SEQ ID NO: 587 LCDR2（喬西亞） ATS
SEQ ID NO: 588 LCDR3（喬西亞） YASSPP
SEQ ID NO: 589 LCDR1（IMGT） QDIGSS
SEQ ID NO: 590 LCDR2（IMGT） ATS
SEQ ID NO: 591 LCDR3（IMGT） LQYASSPPT
SEQ ID NO: 592 VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTLTCRASQDIGSSLNWLQQKPGKAIKRLIYATSSLDSGVPSRFSGSRSGTDYTLTISSLQPEDFVVYYCLQYASSPPTFGGGTKLEIK
SEQ ID NO: 593 DNA VL GACATCCAGATGACCCAGTCCCCCTCCAGCCTGTCCGCCTCCGTGGGCGATAGAGTGACCCTGACCTGCCGGGCCTCCCAGGACATCGGCTCCTCCCTGAACTGGCTGCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCATCAAGCGGCTGATCTACGCCACCTCCTCCCTGGACTCCGGCGTGCCCTCCCGGTTCTCCGGCTCTAGATCCGGCACCGACTACACCCTGACCATCTCCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGTGGTGTACTACTGCCTGCAGTACGCCTCCAGCCCCCCCACCTTTGGCGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAG
SEQ ID NO: 594 輕鏈 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTLTCRASQDIGSSLNWLQQKPGKAIKRLIYATSSLDSGVPSRFSGSRSGTDYTLTISSLQPEDFVVYYCLQYASSPPTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO: 595 DNA輕鏈 GACATCCAGATGACCCAGTCCCCCTCCAGCCTGTCCGCCTCCGTGGGCGATAGAGTGACCCTGACCTGCCGGGCCTCCCAGGACATCGGCTCCTCCCTGAACTGGCTGCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCATCAAGCGGCTGATCTACGCCACCTCCTCCCTGGACTCCGGCGTGCCCTCCCGGTTCTCCGGCTCTAGATCCGGCACCGACTACACCCTGACCATCTCCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGTGGTGTACTACTGCCTGCAGTACGCCTCCAGCCCCCCCACCTTTGGCGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAGCGTACGGTGGCCGCTCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGACGAGCAGCTGAAGAGTGGCACCGCCAGCGTGGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTCACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCATAAGGTGTACGCCTGCGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACAGGGGCGAGTGC
        
人源化 684E12 hIgG1 DAPA CysMab    
SEQ ID NO: 596 HCDR1（組合的） GFTFSNFAMS
SEQ ID NO: 597 HCDR2（組合的） TISTGGTYTYYPDSVKG
SEQ ID NO: 598 HCDR3（組合的） RGYSGVDK
SEQ ID NO: 599 HCDR1（卡巴特） SNFAMS
SEQ ID NO: 600 HCDR2（卡巴特） TISTGGTYTYYPDSVKG
SEQ ID NO: 601 HCDR3（卡巴特） RGYSGVDK
SEQ ID NO: 602 HCDR1（喬西亞） GFTFSNF
SEQ ID NO: 603 HCDR2（喬西亞） STGGTY
SEQ ID NO: 604 HCDR3（喬西亞） RGYSGVDK
SEQ ID NO: 605 HCDR1（IMGT） GFTFSNFA
SEQ ID NO: 606 HCDR2（IMGT） ISTGGTYT
SEQ ID NO: 607 HCDR3（IMGT） TRRGYSGVDK
SEQ ID NO: 608 VH EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSNFAMSWVRQAPGKGLEWVSTISTGGTYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGYSGVDKWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO: 609 DNA VH GAGGTGCAGCTGGTGGAATCTGGCGGAGGCCTGGTGAAACCCGGCGGATCCCTGAGACTGTCCTGCGCCGCCTCCGGCTTCACCTTCTCCAACTTCGCCATGTCCTGGGTGCGGCAGGCTCCCGGCAAGGGCCTGGAATGGGTGTCCACCATCTCCACCGGCGGCACCTACACCTACTACCCCGACAGCGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCCGGGACAACGCCAAGAACTCCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAGACGGGGCTACTCAGGCGTGGACAAATGGGGCCAGGGCACCACCGTGACAGTGTCCTCC
SEQ ID NO: 610 重鏈 （DAPA、CysMab突變加底線） EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSNFAMSWVRQAPGKGLEWVSTISTGGTYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGYSGVDKWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFP C PVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVV A VSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAL A APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYP C DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 611 DNA重鏈 GAGGTGCAGCTGGTGGAATCTGGCGGAGGCCTGGTGAAACCCGGCGGATCCCTGAGACTGTCCTGCGCCGCCTCCGGCTTCACCTTCTCCAACTTCGCCATGTCCTGGGTGCGGCAGGCTCCCGGCAAGGGCCTGGAATGGGTGTCCACCATCTCCACCGGCGGCACCTACACCTACTACCCCGACAGCGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCCGGGACAACGCCAAGAACTCCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAGACGGGGCTACTCAGGCGTGGACAAATGGGGCCAGGGCACCACCGTGACAGTGTCCTCCgctagcaccaagggcccaagtgtgtttcccctggcccccagcagcaagtctacttccggcggaactgctgccctgggttgcctggtgaaggactacttcccctgtcccgtgacagtgtcctggaactctggggctctgacttccggcgtgcacaccttccccgccgtgctgcagagcagcggcctgtacagcctgagcagcgtggtgacagtgccctccagctctctgggaacccagacctatatctgcaacgtgaaccacaagcccagcaacaccaaggtggacaagagagtggagcccaagagctgcgacaagacccacacctgccccccctgcccagctccagaactgctgggagggccttccgtgttcctgttcccccccaagcccaaggacaccctgatgatcagcaggacccccgaggtgacctgcgtggtggtggccgtgtcccacgaggacccagaggtgaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcacaacgccaagaccaagcccagagaggagcagtacaacagcacctacagggtggtgtccgtgctgaccgtgctgcaccaggactggctgaacggcaaagaatacaagtgcaaagtctccaacaaggccctggctgccccaatcgaaaagacaatcagcaaggccaagggccagccacgggagccccaggtgtacaccctgccccccagccgggaggagatgaccaagaaccaggtgtccctgacctgtctggtgaagggcttctacccctgtgatatcgccgtggagtgggagagcaacggccagcccgagaacaactacaagaccacccccccagtgctggacagcgacggcagcttcttcctgtacagcaagctgaccgtggacaagtccaggtggcagcagggcaacgtgttcagctgcagcgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagtccctgagcctgagccccggcaag
SEQ ID NO: 612 LCDR1（組合的） KSGQSLLDSTGKTYLN
SEQ ID NO: 613 LCDR2（組合的） LVSKLDS
SEQ ID NO: 614 LCDR3（組合的） WQGTHFPQT
SEQ ID NO: 615 LCDR1（卡巴特） KSGQSLLDSTGKTYLN
SEQ ID NO: 616 LCDR2（卡巴特） LVSKLDS
SEQ ID NO: 617 LCDR3（卡巴特） WQGTHFPQT
SEQ ID NO: 618 LCDR1（喬西亞） GQSLLDSTGKTY
SEQ ID NO: 619 LCDR2（喬西亞） LVS
SEQ ID NO: 620 LCDR3（喬西亞） GTHFPQ
SEQ ID NO: 621 LCDR1（IMGT） QSLLDSTGKTY
SEQ ID NO: 622 LCDR2（IMGT） LVS
SEQ ID NO: 623 LCDR3（IMGT） WQGTHFPQT
SEQ ID NO: 624 VL DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSGQSLLDSTGKTYLNWFLQRPGQSPRRLIYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGTHFPQTFGGGTKLEIK
SEQ ID NO: 625 DNA VL GACGTGGTGATGACCCAGTCCCCCCTGTCCCTGCCTGTGACCCTGGGCCAGCCTGCCTCCATCTCCTGCAAGTCCGGCCAGTCCCTGCTGGACTCCACTGGCAAGACCTACCTGAACTGGTTCCTGCAGCGGCCTGGCCAGTCCCCTCGGCGGCTGATCTACCTGGTGTCCAAGCTGGACAGCGGCGTGCCCGACAGATTCTCCGGCTCTGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCTCCCGGGTGGAAGCCGAGGACGTGGGCGTGTACTACTGCTGGCAGGGCACCCACTTCCCCCAGACCTTCGGCGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAG
SEQ ID NO: 626 輕鏈 DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSGQSLLDSTGKTYLNWFLQRPGQSPRRLIYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGTHFPQTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO: 627 DNA輕鏈 GACGTGGTGATGACCCAGTCCCCCCTGTCCCTGCCTGTGACCCTGGGCCAGCCTGCCTCCATCTCCTGCAAGTCCGGCCAGTCCCTGCTGGACTCCACTGGCAAGACCTACCTGAACTGGTTCCTGCAGCGGCCTGGCCAGTCCCCTCGGCGGCTGATCTACCTGGTGTCCAAGCTGGACAGCGGCGTGCCCGACAGATTCTCCGGCTCTGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCTCCCGGGTGGAAGCCGAGGACGTGGGCGTGTACTACTGCTGGCAGGGCACCCACTTCCCCCAGACCTTCGGCGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAGcgtacggtggccgctcccagcgtgttcatcttcccccccagcgacgagcagctgaagagtggcaccgccagcgtggtgtgcctgctgaacaacttctacccccgggaggccaaggtgcagtggaaggtggacaacgccctgcagagcggcaacagccaggagagcgtcaccgagcaggacagcaaggactccacctacagcctgagcagcaccctgaccctgagcaaggccgactacgagaagcataaggtgtacgcctgcgaggtgacccaccagggcctgtccagccccgtgaccaagagcttcaacaggggcgagtgc
實例 2 ：對抗體誘導的 ADCC 活性的體外評估
使用替代物ADCC報導基因測定評估候選抗體介導ADCC的能力。將表現CCR7和CD20的JVM2細胞用作靶細胞。將JVM2細胞洗滌並以8 x 104 個細胞/ml重懸。該測定中的效應細胞係穩定表現CD16V158和NFAT依賴性螢光素酶報告基因的Jurkat細胞系（Jurkat-V158）；螢光素酶的表現係藉由CD16進行經典ADCC傳訊的替代物。簡而言之，將懸浮生長的Jurkat-V158細胞旋轉沈降以去除用過的培養基，將沈澱重懸於測定培養基中並調整至1.6 x 106 個細胞/ml。混合等體積的效應細胞和靶細胞以製備細胞的主混合物，產生靶細胞與效應細胞比率為1 : 5或1 : 20。在測定培養基中稀釋滴定抗體，在測定孔中最終最高濃度為50 ug/mL。將12.5 uL Ab溶液添加到384孔圓底板中，並且然後添加12.5 ul主細胞混合物。藉由移液將抗體和細胞充分混合，並且在37°C下在5% CO2 中孵育4小時。孵育後，向每個孔中添加15 uL Bright Glo底物（普洛麥格公司#G7572）並且在RT下以1050 rpm振盪5 min。在Envision讀板器（珀金埃爾默公司（Perkin Elmer））上讀取發光信號。
包括CD20靶向抗體作為陽性對照，並且如藉由螢光素酶活性所測量顯示出大量的NFAT傳訊。類似地，候選物抗CCR7抗體誘導顯著的ADCC活性（圖1）。
下表匯總了使用JVM2和Jurkat-V158細胞在ADCC測定中運行的各種抗體形式的代表性結果。 [表5]：非人源化和人源化抗CCR7抗體的ADCC活性
   ADCC活性；IC50（nM）
121G12非人源化CysMab 0.077
506E15非人源化CysMab 0.131
674J13非人源化CysMab 1.09
684E12非人源化CysMab 2.63
121G12人源化CysMab 有，但曲線擬合不足
506E15人源化CysMab 0.054
674J13人源化CysMab 有，但曲線擬合不足
CD20對照ADCC 0.132
使用非人源化506E15抗體作為代表性有ADCC能力的抗CCR7抗體在具有一系列CCR7受體數量的各種細胞系中進行ADCC測定，以確定ADCC活性所需的最小受體密度和是否對正常的CCR7+ T細胞有足夠的安全限度。下表匯總了一些數據。 [表6]：非人源化506E15抗體的ADCC活性
細胞系 CCR7受體數量 506E15  IC50（nM） 506E15（max RLU）
JVM2 66,500 0.046 5840
MOTN-1 64,600 0.077 5387
DEL 62,000 0.074 6480
CMLT-1 29,000 0.011 4400
SR786 27,800 0.011 4067
PEER 8,700 0.038 3360
ALL-SIL 6,200 0.008 3720
Jurkat V158 3,400 0.004 3267
DND-41 1,700 0.002 3733
正常T細胞 ＜ 1.5 K 體內消耗 n.a.
數據顯示，甚至與正常T細胞上的CCR7受體水平相當的非常低的CCR7受體水平也足以實現顯著的ADCC活性。還使用NK細胞與CCR7+癌細胞的共培養活力測定評估ADCC，並且收集到類似的發現（在此未討論）。
這符合下面描述的觀察結構，即在體內觀察到T細胞消耗並且發現T細胞消耗係基於ADCC機制的。該等發現證實：從安全角度來看，ADCC模式不適於CCR7。因此，將所有候選物均轉換為Fc緘默（DAPA）形式，以提高整體中靶安全性。
重複ADCC體外報告基因測定並且確認DAPA Fc突變形式的非人源化抗CCR7抗體缺乏ADCC活性（圖2）。實例 3 ：抗體的生物化學表徵 抗 CCR7 抗體對 CCR7 的親和力
各種抗體和ADC對CCR7及其物種異種同源物的親和力使用FACS測定。將純化的IgG滴定以確定結合細胞表面表現的CCR7的EC50值。
為此目的，將CCR7陽性細胞收穫（用Accutase分離黏附細胞），用FACS緩衝液（PBS/3% FCS/0.02%疊氮化鈉）洗滌兩次，並且在FACS緩衝液中稀釋至大約2 x 106 個細胞/ml。所有隨後的步驟在冰上進行以防止受體內化。將100 µl細胞懸浮液/孔轉移到96孔U形底板（Falcon）中。將2 x 105 個細胞/孔與目的抗CCR7抗體的抗體濃度的系列稀釋液在4°C下一起孵育60分鐘，輕輕振盪，該等抗體濃度跨越數個對數變化，從100 nM的高值開始。孵育後，將細胞旋轉沈降（1200 rpm，2 min，4°C）並用FACS緩衝液洗滌三次。以1 : 400添加螢光團軛合的抗hFcγ-APC（傑克森免疫研究公司（Jackson ImmunoResearch））檢測抗體，並且將樣本在黑暗中在冰上孵育1 h，輕輕振盪。最終洗滌後，將細胞重懸於100 µl含有0.2 μg/ml DAPI的FACS緩衝液中，然後在流動式細胞測量術機器（BD LSRFortessa細胞分析儀；目錄號647177）上讀取。在Flowjo 10.0.8中計算活的單一細胞的平均螢光強度（MFI），並且輸出到Graphpad Prism6中用於EC50測定。
藉由測量對被工程化為過表現CCR7的同基因細胞對以及表現CCR7旁系同源物（例如CCR9、CCR6、CXCR4和CCR8）的細胞系的表觀結合親和力來評估選擇性。所有抗CCR7抗體以特異性方式僅與表現CCR7的細胞結合，如下表7所示。 [表7]：各種抗CCR7抗體與表現CCR7的細胞的結合
   表觀FACS結合（在5 ug/ml下）
人源化CysMab（Fc野生型）抗體 121G12 506E15 674J13 684E12
NIH3T3細胞 不結合 不結合 不結合 不結合
NIH3T3.hCCR7 結合 結合 結合 結合
PF382細胞 （CCR7-/CCR9+/CCR6+） 不結合 不結合 不結合 不結合
HEK293-CXCR4 不結合 不結合 不結合 不結合
CHO-CCR8 不結合 不結合 不結合 不結合
在類似的實驗中，使用工程化的同基因匹配細胞系組（NIH3T3系列）和CD4+ T細胞測試抗體的交叉反應性，該等CD4+ T細胞從健康供體以及食蟹猴、維斯塔爾（Wistar）大鼠和CD-1小鼠的若干個PBMC批次中純化。發現所有抗體以相似的表觀親和力特異性結合人和食蟹猴CCR7，如下表8和9所示。只有非人源化121G12抗體具有齧齒動物交叉反應性。 [表8]：各種非人源化抗CCR7抗體的交叉反應性
   表觀FACS親和力；EC50（nM）
非人源化CysMab抗體 121G12 506E15 674J13 684E12
人CD4+ T細胞 22-30 4.6-9.7 0.39-1.4 n.d.
食蟹猴CD4+ T細胞 5.8-12 6.6 0.45 n.d.
小鼠CD4+ T細胞 48-51 不結合 不結合 n.d.
大鼠CD4+ T細胞 18-31 不結合 不結合 n.d.
NIH3T3.人CCR7 1.3 n.d. 3.6 ＞30
NIH3T3.食蟹猴CCR7 1.3 n.d. n.d. 結合
NIH3T3.小鼠CCR7 2.5 不結合 不結合 不結合
NIH3T3.大鼠CCR7 2.4 不結合 不結合 不結合
Jeko-1癌細胞（CCR7+） 1.5 n.d. n.d. 12
[表9]：各種人源化抗CCR7抗體的交叉反應性
   表觀FACS親和力；EC50（nM）
人源化CysMab抗體 121G12 506E15 674J13 684E12
人CD4+ T細胞 30-34 7.8-11 0.87-2.7 6.7
食蟹猴CD4+ T細胞 12 7 0.5 n.d.
NIH3T3.人CCR7 1 n.d. n.d. n.d.
NIH3T3.食蟹猴CCR7 0.9 n.d. n.d. n.d.
為了確定受體密度對表觀親和力的影響，並因此確定親合力對抗體的細胞結合作出的貢獻，對具有不同表現水平的人的表現CCR7的癌細胞系和正常CCR7陽性PBMC衍生的T細胞進行FACS滴定實驗。使用來自Bangs Laboratories公司的微球作為計數標準並遵循製造商的說明書，經由FACS進行受體定量。示例性結果示出在下表10中。 [表10]：與受體密度相關的親合力對表觀親和力的貢獻
      表觀FACS親和力；EC50（nM）
人源化CysMab.DAPA抗體 CCR7受體密度 121G12 506E15 674J13 684E12
NIH3T3.hCCR7細胞 ＞1,000,000 2.5 1.8 0.64 n.d.
DEL癌細胞 約100,000 1.78 3.09 0.47 n.d.
人CD4+ T細胞 ＜2,000 約30 約10 約2 約7
所有抗CCR7抗體顯示出親合力對表觀親和力的顯著貢獻，並且結合強度與受體密度相關性降低。與指示代表性DEL癌細胞相比，特別是121G12在正常CD4+ T細胞所代表的低表現CCR7的細胞上顯示出顯著較弱的結合。
特別是121G12的親和力相對較弱，在抗CCR7抗體中顯示出最強的親合力效應，這對於利用正常細胞與癌細胞之間的受體密度差異作為偏向抗體與癌細胞結合的方式係最佳的。在 ELISA 中與重組 hCCR7 的結合
還使用重組CCR7（傲銳東源公司（Origene）#TP306614）在基於ELISA的測定中評估了結合和親和力。將Maxisorp™ 384孔板（賽默Nunc）用稀釋於PBS中的3.5 µg/ml的重組CCR7包被。在室溫下在PBS中用3% BSA（牛血清白蛋白）阻斷1小時，用PBS-T（PBS中的0.01%吐溫20）將板洗滌3x後，以系列稀釋液添加第一抗體並且在室溫下孵育1小時。將板再次洗滌，並且藉由以下方式來檢測結合的抗體：與軛合至辣根過氧化物酶（HRP；傑克森免疫研究公司，目錄號115-035-098）的1 : 5000抗hFc γ在室溫下孵育1小時，隨後用PBS-T洗滌並之後添加SureBlue過氧化物酶底物（KPL，目錄號#52-00-03）底物。15分鐘後，記錄在650 nM處的吸光度並在GraphPad Prism6中分析。
所有測試的抗CCR7抗體能夠結合重組hCCR7（表11；圖3）。 [表11]：人源化抗CCR7抗體對重組hCCR7的結合親和力
人源化CysMab抗體 親和力，Kd（nM）
121G12.DAPA 0.677
506E15.DAPA 5.731
674J13.DAPA 0.006
與雙 Fab 移植物（ FabGraft ）的結合
進行Fab移植物ELISA以評估與最小表位空間的結合，該最小表位空間包含CCR7的N末端和EC2。簡言之，將Maxisorp™ 384孔板（賽默Nunc）用5 µg/ml的Fab移植物包被。在其他方面遵循上文所述之通用ELISA方案說明書。所有抗CCR7抗體均能夠結合雙Fab移植物，如下表12中所示。 [表12]：人源化抗CCR7抗體對Fab移植物的結合親和力
人源化CysMab抗體 ELISA；Kd（nM）
121G12.DAPA 0.023
506E15.DAPA 0.025
674J13.DAPA 0.023
用 VLP 的 pH 依賴性 ELISA
已知CCR7結合的CCL19內化受體-配位基複合物。然而，當CCR7再循環回細胞表面時，CCL19被分選到溶酶體中進行降解，這顯示出內吞CCR7及其配位基的相反命運（Otero等人, J Immunol [免疫學雜誌] 2006; 177:2314-2323）。對於成功的抗CCR7 ADC，較佳的是抗體表現與配位基相似，例如快速內化，但不循環回退出CCR7。為了實現這一目標，我們確保選擇ph依賴性抗體，該等抗體在低pH條件下顯示出與CCR7的較弱結合。
為了評估抗CCR7抗體的pH依賴性，使用表現CCR7的病毒樣顆粒（VLP）進行ELISA。簡言之，將Maxisorp™ 384孔板（賽默Nunc）用25 µg/ml的VLP包被。將第一抗體在pH5.8（1 : 1；dH2O : 0.1M檸檬酸鹽緩衝液，150 mM NaCl）或pH7.4緩衝液中孵育。在其他方面遵循上文所述之通用ELISA方案說明書。
在針對每種候選物的多種人源化變體中，在中性（7.4）和酸性（5.8）pH下抗體結合的比較顯示所有CCR7候選抗體在pH 7.4下具有改善的親和力（表13）。以下實體係基於其優越的ph依賴性以及其他特徵而選擇的。 [表13]：人源化抗CCR7抗體對表現CCR7的VLP的pH依賴性
   ELISA；Kd（nM）
人源化CysMab抗體 pH7.4緩衝液 pH5.8緩衝液 倍數變化（pH5.8/7.4）
121G12 0.1411 0.5207 4
506E15 0.0571 0.4942 9
674J13 0.0162 0.1657 10
684E12 0.0374 0.5041 13
b 抑制蛋白測定
為了確定抗CCR7抗體的功能性，將β-抑制蛋白測定使用來自DiscoverX公司的PathHunter快速檢測套組（#93-0247）以激動模式進行以評估激動性功能或以拮抗模式進行以評估拮抗功能。
在激動模式中，將CHO-flpin-hCCR7（由DiscoverX產生的表現帶ProLink、β-抑制蛋白-EA標籤的hCCR7的細胞系）以8 x 104 個細胞/孔、以20 µl/孔接種於384孔板中的具有阿黴素100 ng/ml的生長培養基（Ham's F-12/Glutamax培養基；英傑公司 + 10% FBS + 0.5 mg/ml G418 + 0.2 mg/ml潮黴素B；英傑公司 + 5 µg/ml殺稻瘟菌素；吉博克公司（Gibco））中，用金屬蓋覆蓋，在37°C 5% CO2 孵育過夜。第二天，使用配位基hCCL19（安迪生物（R＆D），361/MI-025/CF），用測試抗體或陽性對照在1x測定緩衝液（20 mM HEPES/0.1% BSA/1x HBSS pH7.4）中產生5x工作溶液的系列稀釋液。向每個孔中添加5 µl抗體或配位基的5x工作溶液，短暫旋轉沈降，並且在37°C/5% CO2 下孵育2 h。孵育後，向每個孔中添加25 µl檢測試劑，在室溫下在黑暗中孵育，同時振盪20 min。然後，在Envision機器上測量針對酶活性的發光信號。最後，使用Excel分析酶活性。
在拮抗模式中，如上所述那樣接種CHO-flpin-hCCR7細胞。第二天，對於每種測試抗體或陽性對照MAB197（安迪生物參考抗體；配位基拮抗劑）或陰性對照hIgG，在1x測定緩衝液中產生6x工作溶液（0.5 µM x 6 = 3.0 µM）。向每個孔中添加5 µl抗體或對照的6x工作溶液，短暫旋轉沈降，並且在37°C/5% CO2 下孵育30 min。在孵育期間，對於hCCL19，在1x測定緩衝液中產生6x工作溶液的系列稀釋液。孵育後，向每個孔中添加5 µl hCCL19的6x工作溶液，短暫旋轉沈降，並且在37°C/5% CO2 下孵育90 min。孵育後，向每個孔中添加25 µl檢測試劑，在室溫下在黑暗中孵育，同時振盪20 min。然後，在Envision機器上測量針對酶活性的發光信號並且在Excel中分析。
親本抗CCR7抗體中沒有一個在激動模型中顯示出活性（圖4A）。然而，當以拮抗形式運行時，506E15和121G12被鑒定為強拮抗劑，例如配位基阻斷性抗體（圖4B，4C）。674J12係中性的非配位基阻斷性抗體。684E12係弱拮抗劑。與配位基的 FACS 競爭測定
為了確認與CCR7配位基的抗體競爭，在過量配位基濃度存在下進行FACS測定。如上所述進行FACS測定。對方案進行了一些改變，例如，將CCL19保持在1 µM的恒定濃度下，同時將第一抗體同時施加至DEL細胞，該第一抗體跨越數個對數變化，從100 nM的高值開始。在冰冷的FACS緩衝液中孵育30 min的時間後，洗滌細胞，施加二級抗-hFc.PE抗體15 min，並且如上所述測定MFI。
圖5顯示人源化CysMab.DAPA 674J13不受過量CCL19存在的影響，這確認了其中性功能。人源化CysMab.DAPA 121G12和506E15的結合親和力確實因存在過量配位基受到強烈影響。在具有一系列受體密度的細胞系上的內化能力
成功的抗CCR7 ADC的另一個方面係確保CCR7的差異表現分佈的最佳使用。作為正常的表現CCR7的細胞的代表，從健康供體PBMC分離CD4+ T細胞。此外，選擇了多種CCR7陽性癌細胞系，它們展示出一系列受體密度。我們特意選擇了對CCR7+ T細胞具有比CCR7+ 癌細胞更弱的表觀FACS結合親和力的抗體。此外，在此描述的pHrodo測定利用在抗CCR7抗體上的低pH活化的螢光團標記來評估如藉由螢光測量的細胞中的抗體攝入是否與受體密度相關。較佳的是使對正常細胞的抗體攝取最小化以使治療窗最大化。
簡而言之，遵循製造商的說明書，用馬來醯亞胺-pHrodo（賽默飛世爾公司）標記CysMab形式的抗CCR7抗體，得到DAR = 4（藥物，例如螢光團對抗體比率）實體。如上所述進行FACS測定。對方案進行了一些改變，例如，為了允許內化，將第一抗體以5 µg/ml與細胞在37°C下在培養基中孵育6 h，然後用含有疊氮化鈉的冰冷FACS緩衝液洗滌以停止反應。
下表14匯總了三種抗體在一組細胞系上的內化能力。使用非靶向pHrodo標記的抗體作為對照，並且發現高達400 MFI構成信號的背景雜音，例如非靶標介導的抗體-軛合物攝取。數據顯示，所有三種抗CCR7抗體均需要CCR7受體水平在大多數CCR7+ 癌細胞系的典型範圍內，例如，高於20,000個受體，以高效地內化和累積軛合物質，同時使正常的CD4+ T細胞不受傷害。 [表14]：各種抗CCR7抗體的內化能力
細胞系 受體數量 pHrodo（6 h MFI）
人源化121G12.CysMab. DAPA 人源化506E15.CysMab. DAPA 人源化617J13.CysMab. DAPA
CD4+ T細胞 2000 278 429 402
JVM3 8717 148 238 146
CMLT1 19583 301 465 561
Jeko-1 28852 450 908 1389
Mec2 50840 1340 3089 3004
L1236 61602 1237 3126 5824
MOTN1 84200 1026 2899 2539
DEL 110685 1913 3058 3777
MJ 111121 1649 3870 3259
KE97 152093 1567 2723 4416
L540 167549 6836 16117 11800
使用 Octet Red96 系統的表位分級（ Epitope binning ）
使用測量生物膜層干涉技術（BLI）的Octet Red96系統（ForteBio公司，美國）進行抗hCCR7親本抗體的表位分級。根據製造商的建議（美國Avidity有限公司，目錄號BirA500），經由AviTag™，利用BirA生物素連接酶將CCR7免疫原支架生物素化。將生物素化的免疫原支架以1.5 µg/ml載入到預平衡的鏈黴親和素感測器（ForteBio公司，美國）上。然後將感測器轉移到含有在1X動力學緩衝液（ForteBio公司，美國）中的100 nM抗體A的溶液裡。將感測器在1X動力學緩衝液中簡單洗滌並轉移至含有100 nM競爭者抗體的第二溶液中。使用Octet Red96系統分析軟體（版本6.3，ForteBio公司，美國）根據原始數據測定結合動力學。在所有成對組合（作為抗體A和作為競爭者抗體）中測試抗體。 [表15]：抗體分級結果
分箱 抗體
1 684E12；MAB197
2 674J13
3 506E15
4 121G12
使用 CCR7 突變的表位映射
利用突變型CCR7細胞系進行另外的表位映射。產生表現人CCR7的突變變體的NIH/3T3細胞系。在特定位置引入突變以將人CCR7殘基交換成相應的鼠類CCR7殘基。產生的突變包括D35E、F44Y、L47V、S49F、D198G、R201K、S202N、S204G、Q206D、A207T、M208L、I213V、T214S、E215A和H216Q。藉由定點誘變產生突變型CCR7質體構建體，並且將該等構建體引入到NIH/3T3細胞中以產生穩定表現的細胞系。藉由流動式細胞測量術評估候選抗體與每種突變型CCR7細胞系的特異性結合。將細胞用PBS徹底沖洗，並且用Accutase（密理博公司#SCR005）處理以從生長板上提起，並以大約1*105 個細胞/90 µL重懸於1x FACS緩衝液（PBS中2% FBS + 0.1% NaN3）中。在96孔U形底板中，將10 µL的FACS緩衝液中的10x抗體溶液預接種並且添加90 µL的細胞懸浮液。將細胞在4°C下孵育30分鐘，用冷的PBS洗滌1x，並重懸於100 µL的1 : 500第二抗體1x FACS緩衝液（別藻藍素軛合的F(ab’)2山羊抗人IgG，Fcγ特異性；傑克遜免疫研究公司，目錄號109-136-098）中。在4°C下再孵育15 min後，將細胞用PBS洗滌兩次並重懸於100 µL的1xFACS緩衝液 + 4 μg/mL碘化丙啶（生命技術公司（Life Technologies），目錄號P3566中）。使用FlowJo在活的單一細胞上計算幾何平均螢光強度並且作為WT CCR7幾何平均螢光強度的%進行繪圖。
對點突變CCR7的基於EC50的親和力顯示，所有測試的抗體均具有不同的結合譜，這暗示構象表位的不同利用（圖6）。在所有顯示的抗體中，506E15具有與MAB197最相似的結合模式，例如，當CCR7的N末端中的殘基F44或L47突變時，二者均顯示出結合親和力的顯著下降，但當EC2環中的M208或I213突變時，並非如此。121G12和674J13似乎利用構象表位空間內的一組不同的關鍵接觸點，因為它們在8個測試點突變中的至少4個中與MAB197不同。實例 4 ： CCR7 抗體藥物軛合物的產生和表徵 在下面的部分中， uL 和 μL 可互換地用來指微升。類似地， uM 和 μM 可互換的用來指微莫耳；並且 um 用來指微米。 實例 4A ：抗體藥物軛合物 121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4 的製備
Figure 02_image125
Figure 02_image127
經純化的 121G12.CysMab.DAPA 和 MPET.DM4 的軛合：
起始材料係在10 mM組胺酸鹽酸鹽緩衝液中的127 mg/ml（OD280，對於10 mg/ml IgG溶液具有13.7的消光係數）的121G12.CysMab.DAPA抗體。向7.9 ml抗體（1003 mg）中添加16 ml 0.5 M磷酸鈉 pH 8（泰克諾瓦公司（Teknova）S1280），驗證pH為＞ 7，然後在室溫下在輕輕渦旋下將抗體吸收到100.3 ml RMP蛋白A樹脂（通用電氣醫療集團（GE Healthcare）1-223BPO/I）上，持續25分鐘。將裝載在10 mg Ab/ml床上的樹脂用15個床體積的1xPBS緩衝液（海殖株公司（Hyclone）SH30256.02）藉由穿過瓶頂0.2 um過濾裝置（Nalgene 567-0020）真空過濾進行洗滌，然後重懸於100.3 ml 1x PBS，得到50%漿液。
向漿液中添加4329 ul的在0.5 M磷酸鹽pH 8（向其中以13.6 g/L的比率添加NaOH（阿法埃莎公司（Alfa Aesar）A16037））中配製的0.5 M半胱胺酸（西格瑪G121-03）。將漿液在室溫下不時地渦旋30分鐘，然後藉由穿過瓶頂0.2 um過濾裝置真空過濾、在至少10個過濾和添加的循環中用50個床體積的1xPBS洗滌。將經洗滌的樹脂重懸於100.3 ml 1xPBS（50%漿液）中，並且添加1003 ul 100 uM CuCl2 （奧德里奇751944）（淨500 nM Cu2+ ）以引發再氧化。藉由以下方式測試抗體的再氧化：取出漿液的30 ul等分試樣，添加1 ul已知使RPLC的抗體峰偏移的參考馬來醯亞胺（WO 2015/095301的實例3，第110頁）的20 mM原液，混合1分鐘，7,000x g旋轉10秒，去除上清液，添加60 ul賽默IgG洗脫緩衝液（賽默科技公司（Thermo Scientific）21009），14,000x g旋轉10秒，對上清液取樣並如下藉由RPLC分析產物：將2 ul樣本注射到加熱的（80°C）4.6 x 50 mm安捷倫PLRP-S柱（5 µm顆粒，4000Å孔徑）上，該柱平衡至在29.5% CH3 CN/水中的0.1%三氟乙酸（密理博公司TX1280P-1、Burdick和Jackson 407-4），以1.5 ml/min運行。用5分鐘梯度洗脫柱至44.5% CH3 CN/水，維持1.9分鐘，並且在280 nm處檢測峰。將軛合的最佳時間定義為主要產物峰最大、後期洗脫峰最小化並且早期洗脫峰尚未增加的時間。
當RPLC測定表明再氧化係最佳的時（在這種情況下為60分鐘），添加3010 ul在DMSO中的20 mM MPET.DM4原液，並且不時地在室溫下將漿液輕輕渦旋30分鐘。然後在至少10個過濾和添加的循環中用20個床體積的1xPBS洗滌漿液。
然後將漿液轉移到燒結柱（Pierce 7375021）上，用0.5個床體積的賽默IgG洗脫緩衝液預洗脫（丟棄），然後用2個床體積的相同緩衝液洗脫。將全部的洗脫液（201 ml）用20.1 ml 0.5 M磷酸鈉pH 8中和，然後使用旋轉濃縮器（Amicon UFC905024）以3,000 x g濃縮至60 ml。然後將濃縮物施加到平衡至1xPBS的24 x PD-10緩衝液交換柱（通用電氣醫療集團17-0851-01）上，載入2.5 ml濃縮物並按照製造商用3.5 ml 1xPBS洗脫。
對於穩定性研究，將材料與相同製備的批次彙集以提供2克起始材料。將彙集的材料用10 mM組胺酸氯化物緩衝液pH 5（來自JT貝克公司（JTBaker）2080-05的組胺酸）進行徹底透析（Slidealyzer燒瓶，賽默科技公司87762），濃縮至約30 mg/ml，然後分別將蔗糖（密理博公司1.00892.1003）和吐溫20（JT貝克公司4116-04）添加到240 mM和0.02%（v/v）。將相對於穩定性研究所需材料過量的材料交換回至1xPBS。將樣本等分並用液氮快速冷凍並且儲存在-80°C下。對於配製用於穩定性測試的材料，最終濃度為23.9 mg/ml，並且對於在1xPBS中配製的材料，最終濃度為18.9 mg/ml。
對所得樣本的分析如下：
參數 穩定性樣本 1xPBS 樣本
濃度（ mg/ml ） 23.9 18.9
熱原（ EU/ml ） 0.1 0.05
聚集體 % ＜1 ＜1
DAR 3.79 3.79
分析方法： 藉由OD280測定濃度，對於10 mg/ml IgG溶液消光係數為13.7。使用在TECAN Safire讀板器上讀取的動力學QCL測定（龍沙沃克斯維爾公司50-650H）測定熱原。藉由在Shodex KW-G保護柱（湯姆森儀器公司目錄號6960955）和KW-803柱（TIC目錄號6960940）上的分析型尺寸排阻層析測定聚集體百分比，該柱用流動相[20 mM Tris 約pH7.65（用10 mM Tris pH7.4，10 mM Tris pH8製備），200 mM NaCl，0.02%疊氮化鈉]平衡，在280 nm處數據獲取。藉由以下方式製備樣本的等分試樣用於DAR測定：將樣本在1xPBS中稀釋至2 mg/ml，用PNGaseF（內部）在50°C下將樣本去糖基化10分鐘，藉由與蛋白A結合去除PNGaseF，用1xPBS洗滌，用1%甲酸洗脫。然後將樣本注射到2.1 x 50 mm PLRP-S柱（8 µm顆粒，1000Å孔徑）上，該柱平衡至在20% CH3 CN/水（英傑公司）中的0.1%甲酸，以0.5 ml/min運行。將柱以20% CH3 CN/水洗滌3分鐘，然後用0.1分鐘梯度洗脫至0.1%甲酸90% CH3 CN/水，維持1.9分鐘。質譜數據在安捷倫1260儀器上獲得，並且用MassHunter定性分析B.05.00在110-180 kDa範圍內解卷積。將對應於各種計算的DAR態的峰面積根據每個峰的DAR進行加權，然後將DAR4峰的求和且加權的面積除以所有加權峰的總和，以獲得DAR值。連接子有效負載 MPET.DM4 的製備：
Figure 02_image129
分析方法
除非另有說明，否則將以下HPLC和HPLC/MS方法用於製備中間體和實例。
LC/MS分析在安捷倫1200sl/6140系統上進行。
柱：沃特世（Waters）Acquity HSS T3 C18，50 x 2.0，1.8 um流動相： A) H2 O + 0.05% TFA ； B ：乙腈 + 0.035% TFA 泵方法：
時間 A% B% 流速（mL/min）
0 90 10 0.9
1.35 0 100 0.9
1.36 0 100 0.9
1.95 0 100 0.9
1.96 90 10 0.9
2.0 90 10 0.9
檢測：UV二極體陣列在190 nm - 400 nm MS掃描：200 - 1350amuELSD ： 60°C MS 參數：
極性 陽性
乾燥氣體 12
霧化器壓力 50
乾燥氣體溫度 350
毛細管電壓 3000
(14S,16S,32S,33S,2R,4S,10E,12E,14R)-86-氯-14-羥基-85,14-二甲氧基-33,2,7,10-四甲基-12,6-二側氧基-7-氮雜-1(6,4)-氧氮雜環己烷（oxazinana）-3(2,3)-環氧乙烷-8(1,3)-苯環十四蕃-10,12-二烯-4-基 N-(4-((2-(3-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)丙醯胺基)乙基)二氫硫基)-4-甲基戊醯基)-N-甲基-L-丙胺酸酯
Figure 02_image131
步驟1：(14S,16S,32S,33S,2R,4S,10E,12E,14R)-86-氯-14-羥基-85,14-二甲氧基-33,2,7,10-四甲基-12,6-二側氧基-7-氮雜-1(6,4)-氧氮雜環己烷-3(2,3)-環氧乙烷-8(1,3)-苯環十四蕃-10,12-二烯-4-基 N-(4-((2-胺基乙基)二氫硫基)-4-甲基戊醯基)-N-甲基-L-丙胺酸酯的製備
在室溫下，向溶解在PBS緩衝液（10.5 mL）和無水THF（21 mL）中的DM4（480 mg，0.62 mmol）中添加2-(吡啶-2-基二氫硫基)乙-1-胺（151 mg，0.68 mmol）和DIEA（0.27 mL，1.54 mmol）。將反應混合物在室溫下攪拌30 min並真空濃縮。將水性殘餘物用CH3 CN（1 mL）和H2 O（2 mL）稀釋，並藉由反相ISCO（用含有0.05% TFA的10%-60%乙腈-H2 O洗脫）純化。將含有所希望的產物的級分凍乾以獲得所希望的產物（555 mg，93%產率）。1 H NMR (400 MHz, MeOD-d 4 ) δ ppm 0.83 (s, 3 H) 1.21 (d,J =5.0 Hz, 3 H) 1.25 (s, 3 H) 1.28 (s, 3 H) 1.30 (d,J =5.0 Hz, 3 H) 1.45-1.55 (m, 3 H) 1.67 (s, 3 H) 1.84-1.88 (m, 1 H) 1.95 - 2.01 (m, 1 H) 2.14 (dd,J =5.0和15.0 Hz, 1 H) 2.37-2.43 (m, 1 H) 2.53-2.59 (m, 1 H) 2.64 (dd,J =10.0和15.0 Hz, 1 H) 2.82-2.89 (m, 5 H) 2.91 (d,J =10.0 Hz, 1 H) 3.16 (dd,J =5.0和10.0 Hz, 2 H) 3.20 (s, 3 H) 3.23 (d,J =10.0 Hz, 1 H) 3.35 (s, 3 H) 3.55 (d,J =5.0 Hz, 1 H) 3.58 (d,J =10.0 Hz, 1 H) 4.15-4.20 (m, 1 H) 4.64 (dd,J =5.0和10.0 Hz, 1 H) 5.43 (q,J =5.0 Hz, 2 H) 5.66 (dd,J =10.0和15.0 Hz, 1 H) ) 6.58 (dd,J =10.0和15.0 Hz, 1 H) 6.65 (d,J =10.0 Hz, 1 H) 6.66 (s, 1 H) 7.11 (bs, 1H) 7.28 (bs, 1H)；MS m/z  855.3 (M+H)，保留時間0.988分鐘。
步驟2：(14S,16S,32S,33S,2R,4S,10E,12E,14R)-86-氯-14-羥基-85,14-二甲氧基-33,2,7,10-四甲基-12,6-二側氧基-7-氮雜-1(6,4)-氧氮雜環己烷-3(2,3)-環氧乙烷-8(1,3)-苯環十四蕃-10,12-二烯-4-基 N-(4-((2-(3-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)丙醯胺基)乙基)二氫硫基)-4-甲基戊醯基)-N-甲基-L-丙胺酸酯的製備
在室溫下，向溶解在無水DMSO（7 mL）中的(14S,16S,32S,33S,2R,4S,10E,12E,14R)-86-氯-14-羥基-85,14-二甲氧基-33,2,7,10-四甲基-12,6-二側氧基-7-氮雜-1(6,4)-氧氮雜環己烷-3(2,3)-環氧乙烷-8(1,3)-苯環十四蕃-10,12-二烯-4-基 N-(4-((2-胺基乙基)二氫硫基)-4-甲基戊醯基)-N-甲基-L-丙胺酸酯（555 mg，0.57 mmol）中添加2,5-二側氧基吡咯啶-1-基 3-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)丙酸酯（171 mg，0.63 mmol）和DIEA（249 mL，1.43 mmol）。將反應混合物在室溫下攪拌15 min，並使用TFA中和。將混合物用冰浴冷卻至0°C，然後添加CH3 CN（2 mL）和H2 O（7 mL），並且然後藉由反相ISCO（用含有0.05% TFA的10%-70%乙腈-H2 O洗脫）純化。將含有所希望的產物的級分凍乾以獲得所希望的產物（430 mg，66%產率）。）。1 H NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ ppm 0.81 (s, 3 H) 1.23 (s, 3 H) 1.24 (s, 3 H) 1.25 (s, 1 H) 1.28 (d,J =5.0 Hz, 3 H) 1.31 (d,J =5.0 Hz, 3 H) 1.43-1.49 (m, 1 H) 1.61 (d,J =15.0 Hz, 1 H) 1.64 (s, 3 H) 1.81-1.87 (m, 1 H) 1.94 - 2.01 (m, 1 H) 2.19 (dd,J =5.0和15.0 Hz, 1 H) 2.30-2.36 (m, 1 H) 2.54 (t,J =5.0 Hz, 2 H) 2.61 (dd,J =10.0和15.0 Hz, 1 H) 2.70 (t,J =5.0 Hz, 2 H)  2.88 (s, 3 H) 3.00 (d,J =10.0 Hz, 1 H) 3.13 (d,J =10.0 Hz, 1 H) 3.21 (s, 3 H) 3.55 (s, 3 H) 3.45 (q,J =5.0 Hz, 2 H)  3.49 (d,J =5.0 Hz, 1 H) 3.62 (d,J =10.0 Hz, 1 H) 3.83 (t,J =5.0 Hz, 1 H) 3.98 (s, 3 H) 4.32 (m, 1 H) 4.80 (dd,J =5.0和10.0 Hz, 1 H) 5.28 (d,J =5.0 Hz, 1 H) 5.66 (dd,J =10.0和15.0 Hz, 1 H) ) 6.22 (bs, 1 H) 6.42 (dd,J =10.0和15.0 Hz, 1 H) 6.50 (s, 1 H) 6.63 (s, 1 H) 6.66 (d,J =10.0 Hz, 1 H) 6.70 (s, 2H) 6.83(s, 1H)；MS m/z  988.3 (M+H-H2 O)，保留時間1.145分鐘。實例 4B ：抗體藥物軛合物 121G12.DAPA.sSPDB.DM4 的製備
Figure 02_image133
Figure 02_image135
在22°C下向25 mM HEPES緩衝液pH 7.6（3 ml；無菌）和二甲基乙醯胺（DMAc；0.12 ml）的攪拌溶液中添加121G12.DAPA；MW約145546 g/mol；62 mg（0.426 µmol））在磷酸鉀緩衝液（10 mM，pH6；無菌）中的溶液（1.695 ml）。添加溶解在0.242 ml DMAc中的類美登素DM4（2.42 mg（3.101 µmol）。添加溶解在0.970 ml DMAc中的連接子磺基SPDB（0.970 mg（2.386 µmol，校正用於測定）。18 h後，藉由SEC-UV和HPLC分析反應混合物的反應完成性。
從小分子副產物中純化反應混合物，並且藉由在Amicon膜單元；截留值30 kDa上過濾進行緩衝液交換，使用10 mM PBS-pH7.4緩衝液（無菌）用於洗滌。將得到的Amicon-滲餘物合併，並且稀釋至10 mg/ml（UV），得到2.9 ml的抗體藥物軛合物121G12.DAPA.sSPDB-DM4在10 mM PBS-pH7.4緩衝液中的溶液（49%蛋白質回收率）。
藉由SEC-UV，將藥物抗體比率確定為n = 3.6，並且單體純度為98.7%。內毒素水平為0.14 EU/mg（BET Endosafe-測試）。實例 4C ：抗體藥物軛合物 684E12.SMCC.DM1 的製備
Figure 02_image137
向抗體（親本684E12）溶液（7.1 mg/mL，3.4 mL，約47 µM，PBS，pH 7.4）中添加100 µL的2 mM DM1（0.17 mg）的DMA溶液和50 µL的4 mM磺基-SMCC（0.15 mg）的DMA溶液並且將混合物在4°C下孵育並輕輕攪拌過夜。孵育後，將反應混合物經由在HiPrep 26/10脫鹽柱（通用電氣醫療集團）上使用PBS，pH 7.4作為運行緩衝液進行脫鹽來純化並無菌過濾。藉由MALDI-MS分析純化的軛合物，並且估計DAR為2.6。分析型SEC顯示樣本中存在3.7%的聚集體（或96.3%單體），並且LAL測試（PTS，查理斯河實驗室（Charles River Laboratories））確定內毒素值為0.36 EU/mg。實例 4D ：抗體藥物軛合物 506E15.AURIX1 的製備 起始材料係在1x磷酸鹽緩衝鹽水（1xPBS）中的18.8 mg/ml（OD280，對於10 mg/ml IgG溶液具有13.7的消光係數）的506E15.CysMab（WT Fc）抗體。將1.76 ml的抗體吸收到3 ml RMP蛋白A樹脂（通用電氣醫療集團1-223BPO/I）上，並且向所得漿液中添加240 ul的在0.5 M磷酸鹽pH 8（向其中以13.6 g/L的比率添加NaOH（阿法埃莎公司A16037））中配製的0.5 M半胱胺酸（西格瑪G121-03）。將漿液在室溫下不時地渦旋30分鐘，然後藉由穿過瓶頂0.2 um過濾裝置真空過濾、在至少10個過濾和添加的循環中用50個床體積的1xPBS洗滌。將經洗滌的樹脂重懸於2 ml 1xPBS（50%漿液）中，並且添加60 ul 100 uM CuCl2（奧德里奇751944）（淨100 nM Cu2+ ）以引發再氧化。在420分鐘後，再添加90 ul的100 uM CuCl2以進一步加速再氧化。藉由以下方式測試抗體的再氧化：取出漿液的30 ul等分試樣，添加1 ul已知使RPLC的抗體峰偏移的參考馬來醯亞胺：（WO 2015/095301的實例3，第110頁）的20 mM原液，混合1分鐘，7,000x g旋轉10秒，去除上清液，添加60 ul賽默IgG洗脫緩衝液（賽默科技公司21009），14,000x g旋轉10秒，對上清液取樣並如下藉由RPLC分析產物：將2 ul樣本注射到加熱的（80°C）4.6 x 50 mm安捷倫PLRP-S柱（5 µm顆粒，4000Å孔徑）上，該柱平衡至在29.5% CH3 CN/水中的0.1%三氟乙酸（密理博公司TX1280P-1、Burdick和Jackson 407-4），以1.5 ml/min運行。用5分鐘梯度洗脫柱至44.5% CH3 CN/水，維持1.9分鐘，並且在280 nm處檢測峰。將軛合的最佳時間定義為主要產物峰最大、後期洗脫峰最小化並且早期洗脫峰尚未增加的時間。
當RPLC測定表明再氧化係最佳的時（在這種情況下為565分鐘），添加220 ul在DMSO中的20 mM AURIX1原液，並且不時地在室溫下將漿液輕輕渦旋70分鐘。然後在至少10個過濾和添加的循環中用20個床體積的1xPBS洗滌漿液。
然後將漿液轉移到燒結柱（Pierce 7375021）上，用0.5個床體積的賽默IgG洗脫緩衝液預洗脫（丟棄），然後用2個床體積的相同緩衝液洗脫。將全部的洗脫液（6 ml）用0.6 ml 0.5 M磷酸鈉pH 8中和，使用旋轉濃縮器（Amicon UFC905024）以3,000 x g濃縮至2.5 ml，施加到平衡至1xPBS的PD-10緩衝液交換柱（通用電氣醫療集團17-0851-01）上，載入2.5 ml濃縮物並按照製造商用3.5 ml 1xPBS洗脫。產率為22 mg（66%）。實例 4E ：抗體藥物軛合物 506E15.CysMab.DAPA.AURIX2 的製備 起始材料係在1x磷酸鹽緩衝鹽水（1xPBS）中的10 mg/ml（OD280，對於10 mg/ml IgG溶液具有13.7的消光係數）的506E15.CysMab.DAPA抗體。將2.0 ml的抗體吸收到2ml RMP蛋白A樹脂（通用電氣醫療集團1-223BPO/I）上，並且向所得漿液中添加160 ul的在0.5 M磷酸鹽pH 8（向其中以13.6 g/L的比率添加NaOH（阿法埃莎公司A16037））中配製的0.5 M半胱胺酸（西格瑪G121-03）。將漿液在室溫下不時地渦旋30分鐘，然後藉由穿過瓶頂0.2 um過濾裝置真空過濾、在至少10個過濾和添加的循環中用50個床體積的1xPBS洗滌。將經洗滌的樹脂重懸於2 ml 1xPBS（50%漿液）中，並且添加10 ul 100 uM CuCl2（奧德里奇751944）（淨250 nM Cu2+ ）以引發再氧化。藉由以下方式測試抗體的再氧化：取出漿液的30 ul等分試樣，添加1 ul已知使RPLC的抗體峰偏移的參考馬來醯亞胺（WO 2015/095301的實例3，第110頁）的20 mM原液，混合1分鐘，7,000x g旋轉10秒，去除上清液，添加60 ul賽默IgG洗脫緩衝液（賽默科技公司21009），14,000x g旋轉10秒，對上清液取樣並如下藉由RPLC分析產物：將2 ul樣本注射到加熱的（80°C）4.6 x 50 mm安捷倫PLRP-S柱（5 µm顆粒，4000Å孔徑）上，該柱平衡至在29.5% CH3 CN/水中的0.1%三氟乙酸（密理博公司TX1280P-1、Burdick和Jackson 407-4），以1.5 ml/min運行。用5分鐘梯度洗脫柱至44.5% CH3 CN/水，維持1.9分鐘，並且在280 nm處檢測峰。將軛合的最佳時間定義為主要產物峰最大、後期洗脫峰最小化並且早期洗脫峰尚未增加的時間。
當RPLC測定表明再氧化係最佳的時（在這種情況下為295分鐘），添加80 ul在DMSO中的20 mM AURIX2原液，並且不時地在室溫下將漿液輕輕渦旋85分鐘。然後在至少10個過濾和添加的循環中用20個床體積的1xPBS洗滌漿液。
然後將漿液轉移到燒結柱（Pierce 7375021）上，用0.5個床體積的賽默IgG洗脫緩衝液預洗脫（丟棄），然後用2個床體積的相同緩衝液洗脫。將全部的洗脫液（4 ml）用0.4 ml 0.5 M磷酸鈉pH 8中和，施加到平衡至1xPBS的2 x PD-10緩衝液交換柱（通用電氣醫療集團17-0851-01）上，載入2.5 ml洗脫液並按照製造商用3.5 ml 1xPBS洗脫。產率為13.3 mg（67%）。實例 4F ：抗體藥物軛合物 674J13.CysMab.AURIX1 的製備
起始材料係在1x磷酸鹽緩衝鹽水（1xPBS）中的9 mg/ml（OD280，對於10 mg/ml IgG溶液具有13.7的消光係數）的674J13.CysMab（WT Fc）抗體。向57.6 ml抗體中添加DTT至200 mM（英傑公司15508-013）並且將溶液孵育75分鐘以強烈還原Ab。然後將經還原的Ab施加到平衡至1xPBS的PD-10緩衝液交換柱（通用電氣醫療集團17-0851-01）上，載入2.5 ml濃縮物並按照製造商用3.5 ml 1xPBS洗脫。將來自PD10的洗脫液彙集，然後重新施加到新鮮的PD10柱上以更完全地去除DTT。需注意，在單獨的實驗中，PD10層析柱在去除DTT方面比僅藉由尺寸排除機制所看到的更有效，條件係層析柱僅使用一次。
藉由以下方式測試抗體的再氧化：取出漿液的30 ul等分試樣，添加1 ul已知使RPLC的抗體峰偏移的AURIX1的20 mM原液，混合1分鐘，7,000x g旋轉10秒，去除上清液，添加60 ul賽默IgG洗脫緩衝液（賽默科技公司21009），14,000x g旋轉10秒，對上清液取樣並如下藉由RPLC分析產物：將2 ul樣本注射到加熱的（80°C）4.6 x 50 mm安捷倫PLRP-S柱（5 µm顆粒，4000Å孔徑）上，該柱平衡至在29.5% CH3 CN/水中的0.1%三氟乙酸（密理博公司TX1280P-1、Burdick和Jackson 407-4），以1.5 ml/min運行。用5分鐘梯度洗脫柱至44.5% CH3 CN/水，維持1.9分鐘，並且在280 nm處檢測峰。將軛合的最佳時間定義為主要產物峰最大、後期洗脫峰最小化並且早期洗脫峰尚未增加的時間。
當RPLC測定表明再氧化係最佳的時（在這種情況下為180分鐘），添加290 ul在DMSO中的20 mM AURIX1原液以及6 ml RMP蛋白A樹脂（通用電氣醫療集團1-223BPO/I）。將漿液在室溫下不時地輕輕渦旋40分鐘。然後在至少10個過濾和添加的循環中用20個床體積的1xPBS洗滌漿液。
然後將漿液轉移到燒結柱（Pierce 7375021）上，用0.5個床體積的賽默IgG洗脫緩衝液預洗脫（丟棄），然後用2個床體積的相同緩衝液洗脫。將全部的洗脫液（11.5 ml）用1.2 ml 0.5 M磷酸鈉pH 8中和，使用旋轉濃縮器（Amicon UFC905024）以3,000 x g濃縮至2.5 ml，施加到平衡至1xPBS的PD-10緩衝液交換柱（通用電氣醫療集團17-0851-01）上，載入2.5 ml濃縮物並按照製造商用3.5 ml 1xPBS洗脫。產率為26 mg（41%）實例 4G ：抗體藥物軛合物 674J13.CysMab.DAPA.AURIX2 的製備
起始材料係在1x磷酸鹽緩衝鹽水（1xPBS）中的31.7 mg/ml（OD280，對於10 mg/ml IgG溶液具有13.7的消光係數）的674J13.CysMab.DAR4.DAPA抗體。將9.5 ml的抗體吸收到30.1 ml RMP蛋白A樹脂（通用電氣醫療集團1-223BPO/I）上並且向所得漿液中添加1800 mg DTT（英傑公司15508-013）以強烈還原Ab（淨200 mM DTT）。將漿液在室溫下渦旋20分鐘，然後藉由穿過瓶頂0.2 um過濾裝置真空過濾、在至少10個過濾和添加的循環中用50個床體積的1xPBS洗滌。將經洗滌的樹脂重懸於2 ml 1xPBS中並且在室溫下渦旋 - 不添加銅（該添加加速再氧化太嚴重）。藉由以下方式測試抗體的再氧化：取出漿液的30 ul等分試樣，添加1 ul已知使RPLC的抗體峰偏移的參考馬來醯亞胺（WO 2015/095301的實例3，第110頁）的20 mM原液，混合1分鐘，7,000x g旋轉10秒，去除上清液，添加60 ul賽默IgG洗脫緩衝液（賽默科技公司（Thermo Scientific）21009），14,000x g旋轉10秒，對上清液取樣並如下藉由RPLC分析產物：將2 ul樣本注射到加熱的（80°C）4.6 x 50 mm安捷倫PLRP-S柱（5 µm顆粒，4000Å孔徑）上，該柱平衡至在29.5% CH3 CN/水中的0.1%三氟乙酸（密理博公司TX1280P-1、Burdick和Jackson 407-4），以1.5 ml/min運行。用5分鐘梯度洗脫柱至44.5% CH3 CN/水，維持1.9分鐘，並且在280 nm處檢測峰。將軛合的最佳時間定義為主要產物峰最大、後期洗脫峰最小化並且早期洗脫峰尚未增加的時間。
當RPLC測定表明再氧化係最佳的時（在這種情況下為80分鐘），添加903 ul在DMSO中的20 mM AURIX2原液，並且不時地在室溫下將漿液輕輕渦旋50分鐘。然後在至少10個過濾和添加的循環中用20個床體積的1xPBS洗滌漿液。
然後將漿液轉移到燒結柱（Pierce 7375021）上，用0.5個床體積的賽默IgG洗脫緩衝液預洗脫（丟棄），然後用2個床體積的相同緩衝液洗脫。將全部的洗脫液（60.2 ml）用6.0 ml 0.5 M磷酸鈉 pH 8中和，使用旋轉濃縮器（Amicon UFC905024）以3,000 x g濃縮至17.5 ml，施加到平衡至1xPBS的7個PD-10緩衝液交換柱（通用電氣醫療集團17-0851-01）上，載入2.5 ml濃縮物並按照製造商用3.5 ml 1xPBS洗脫。產率為243 mg（81%）實例 4H ：抗體藥物軛合物 121G12.CysMab.DAPA.AURIX1 的製備
起始材料係在1x磷酸鹽緩衝鹽水（1xPBS）中的16.7 mg/ml（OD280，對於10 mg/ml IgG溶液具有13.7的消光係數）的121G12.CysMab.DAPA抗體。將3.6 ml的抗體吸收到6 ml RMP蛋白A樹脂（通用電氣醫療集團1-223BPO/I）上，並且將所得漿液在室溫下渦旋125分鐘，然後添加544 ul的在0.5 M磷酸鹽pH 8（向其中以13.6 g/L的比率添加NaOH（阿法埃莎公司A16037））中配製的0.5 M半胱胺酸（西格瑪G121-03）。將漿液在室溫下不時地渦旋60分鐘，然後藉由穿過瓶頂0.2 um過濾裝置真空過濾、在至少10個過濾和添加的循環中用50個床體積的1xPBS洗滌。將經洗滌的樹脂重懸於2 ml 1xPBS（50%漿液）中，並且添加16 ul 100 uM CuCl2 （奧德里奇751944）（淨250 nM Cu2+ ）以引發再氧化。藉由以下方式測試抗體的再氧化：取出漿液的30 ul等分試樣，添加1 ul已知使RPLC的抗體峰偏移的AURIX1的20 mM原液，混合1分鐘，7,000x g旋轉10秒，去除上清液，添加60 ul賽默IgG洗脫緩衝液（賽默科技公司21009），14,000x g旋轉10秒，對上清液取樣並如下藉由RPLC分析產物：將2 ul樣本注射到加熱的（80°C）4.6 x 50 mm安捷倫PLRP-S柱（5 µm顆粒，4000Å孔徑）上，該柱平衡至在29.5% CH3 CN/水中的0.1%三氟乙酸（密理博公司TX1280P-1、Burdick和Jackson 407-4），以1.5 ml/min運行。用5分鐘梯度洗脫柱至44.5% CH3 CN/水，維持1.9分鐘，並且在280 nm處檢測峰。將軛合的最佳時間定義為主要產物峰最大、後期洗脫峰最小化並且早期洗脫峰尚未增加的時間。
當RPLC測定表明再氧化係最佳的時（在這種情況下為170分鐘），添加67 ul在DMSO中的20 mM AURIX1原液，並且不時地在室溫下將漿液輕輕渦旋120分鐘。然後在至少10個過濾和添加的循環中用20個床體積的1xPBS洗滌漿液。
然後將漿液轉移到燒結柱（Pierce 7375021）上，用0.5個床體積的賽默IgG洗脫緩衝液預洗脫（丟棄），然後用2個床體積的相同緩衝液洗脫。將全部的洗脫液（15 ml）用1.5 ml 0.5 M磷酸鈉pH 8中和，使用旋轉濃縮器（Amicon UFC905024）以3,000 x g濃縮至5 ml，施加到平衡至1xPBS的2 x PD-10緩衝液交換柱（通用電氣醫療集團17-0851-01）上，載入2.5 ml洗脫液並按照製造商用3.5 ml 1xPBS洗脫。產率為54 mg（92%）。實例 4I ：抗體藥物軛合物 121G12.CysMab.AURIX1 的製備
起始材料係在1x磷酸鹽緩衝鹽水（1xPBS）中的12.5 mg/ml（OD280，對於10 mg/ml IgG溶液具有13.7的消光係數）的121G12.CysMab（Fc WT）抗體。將4.8 ml的抗體吸收到6 ml RMP蛋白A樹脂（通用電氣醫療集團1-223BPO/I）上，並且將所得漿液在室溫下渦旋125分鐘，然後添加592 ul的在0.5 M磷酸鹽pH 8（向其中以13.6 g/L的比率添加NaOH（阿法埃莎公司A16037））中配製的0.5 M半胱胺酸（西格瑪G121-03）。將漿液在室溫下不時地渦旋60分鐘，然後藉由穿過瓶頂0.2 um過濾裝置真空過濾、在至少10個過濾和添加的循環中用50個床體積的1xPBS洗滌。將經洗滌的樹脂重懸於2 ml 1xPBS（50%漿液）中，並且添加16 ul 100 uM CuCl2 （奧德里奇751944）（淨250 nM Cu2+ ）以引發再氧化。藉由以下方式測試抗體的再氧化：取出漿液的30 ul等分試樣，添加1 ul已知使RPLC的抗體峰偏移的AURIX1的20 mM原液，混合1分鐘，7,000x g旋轉10秒，去除上清液，添加60 ul賽默IgG洗脫緩衝液（賽默科技公司21009），14,000x g旋轉10秒，對上清液取樣並如下藉由RPLC分析產物：將2 ul樣本注射到加熱的（80°C）4.6 x 50 mm安捷倫PLRP-S柱（5 µm顆粒，4000Å孔徑）上，該柱平衡至在29.5% CH3CN/水中的0.1%三氟乙酸（密理博公司TX1280P-1、Burdick和Jackson 407-4），以1.5 ml/min運行。用5分鐘梯度洗脫柱至44.5% CH3 CN/水，維持1.9分鐘，並且在280 nm處檢測峰。將軛合的最佳時間定義為主要產物峰最大、後期洗脫峰最小化並且早期洗脫峰尚未增加的時間。
當RPLC測定表明再氧化係最佳的時（在這種情況下為160分鐘），添加67 ul在DMSO中的20 mM AURIX1原液，並且不時地在室溫下將漿液輕輕渦旋120分鐘。然後在至少10個過濾和添加的循環中用20個床體積的1xPBS洗滌漿液。
然後將漿液轉移到燒結柱（Pierce 7375021）上，用0.5個床體積的賽默IgG洗脫緩衝液預洗脫（丟棄），然後用2個床體積的相同緩衝液洗脫。將全部的洗脫液（15 ml）用1.5 ml 0.5 M磷酸鈉pH 8中和，使用旋轉濃縮器（Amicon UFC905024）以3,000 x g濃縮至5 ml，施加到平衡至1xPBS的2 x PD-10緩衝液交換柱（通用電氣醫療集團17-0851-01）上，載入2.5 ml洗脫液並按照製造商用3.5 ml 1xPBS洗脫。產率為52 mg（89%）。分析方法： 藉由OD280測定濃度，對於10 mg/ml IgG溶液消光係數為13.7。使用在TECAN Safire讀板器上讀取的動力學QCL測定（龍沙沃克斯維爾公司50-650H）測定熱原。藉由在Shodex KW-G保護柱（湯姆森儀器公司目錄號6960955）和KW-803柱（TIC目錄號6960940）上的分析型尺寸排阻層析測定聚集體百分比，該柱用流動相[20 mM Tris 約pH7.65（用10 mM Tris pH7.4，10 mM Tris pH8製備），200 mM NaCl，0.02%疊氮化鈉]平衡，在280 nm處數據獲取。藉由以下方式製備樣本的等分試樣用於DAR測定：將樣本在1xPBS中稀釋至2 mg/ml，用PNGaseF（內部）在50°C下將樣本去糖基化10分鐘，藉由與蛋白A結合去除PNGaseF，用1xPBS洗滌，並且用1%甲酸洗脫。將樣本藉由以下方式還原：添加¼體積的含有0.5 M TCEP的5 M乙酸銨pH 5.0並且在室溫下孵育30分鐘。然後將樣本注射到2.1 x 50 mm PLRP-S柱（8 µm顆粒，1000Å孔徑）上，該柱平衡至在20% CH3 CN/水（英傑公司）中的0.1%甲酸，以0.5 ml/min運行。將柱以20% CH3 CN/水洗滌3分鐘，然後用0.1分鐘梯度洗脫至0.1%甲酸90% CH3 CN/水，維持1.9分鐘。質譜數據在安捷倫1260儀器上獲得，並且用MassHunter定性分析B.05.00在15-60 kDa範圍內解卷積。將對應於各種計算的DAR態的峰面積根據每個峰的DAR進行加權，然後將DAR4峰的求和且加權的面積除以所有加權峰的總和，以獲得DAR值。對所得樣本的分析如下：
參數 506E15.DAPA . AURIX2 506E15. AURIX1 674J13.DAPA. AURIX2 674J13. AURIX1 121G12. AURIX1 121G12.DAPA AURIX1
濃度（ mg/ml ） 1.9 6.7 9 8.4 7.5 7.8
熱原（ EU/ml ） 0.05 0.42 0.05 ＜0.5 0.05 0.05
聚集體 % ＜1 ＜1 2.8 ＜1 1.2 1.9
DAR 3.80 3.78 HC 3.93 LC 0.03 HC 3.8 3.80 3.80
實例 4J ：使用其他 CysMab 抗體製備另外的軛合物
將實例4A中描述之方法也用於用其他半胱胺酸工程化抗體產生MPET.DM4軛合物。
將該等方法用於使用PCT公開號WO 2016/203432中揭露的以下抗體產生抗P-鈣黏著蛋白Ab.CysMab.MPET.DM4：抗體NOV169N31Q（E152C-S375C）、NEG0012（E152C-S375C）、NEG0013（E152C-S375C）、NEG0016（E152C-S375C）、NEG0064（E152C-S375C）、NEG0067（E152C-S375C）、NOV169N31Q（K360C（HC）-K107C（LC））、NEG0012（K360C（HC）-K107C（LC））、NEG0013（K360C（HC）-K107C（LC））、NEG0016（K360C（HC）-K107C（LC））、NEG0064（K360C（HC）-K107C（LC））和NEG0067（K360C（HC）-K107C（LC））。實例 5 ：體外 ADC 表徵
藉由各種功能性和分析型方法表徵抗體藥物軛合物（ADC）。如藉由FACS所評估，ADC保持與細胞上的靶CCR7蛋白結合。對於所有ADC，FACS結合測定中的幾何平均螢光強度在未軛合抗體的值的20%內。藉由分析型SEC，顯示ADC為在所期望分子量下的＞ 95%材料；在對於初始反應產物未觀察到該結果的情況下，製備型SEC的使用達到了必要的規格。藥物抗體比率（DAR）藉由以下方式評估：對去糖基化的還原抗體樣本進行LCMS，對各個DAR種類的豐度求和並根據每個DAR種類上藥物分子的數量進行加權（例如，單個DAR2離子計數為2，單個DAR1離子計數為1）。包含含有兩個半胱胺酸突變的恒定區的軛合物至少等於或高於DAR 3.4，且最常見的是等於或高於DAR 3.8。這與報導的軛合物一致。實例 6 ：對細胞增殖的抑制 / 細胞活力測定
在上面我們顯示出所有三種抗CCR7抗體的螢光團-軛合形式在一組細胞系中可以內化CCR7並且在細胞的低pH部分有效地累積軛合的螢光團。在此我們顯示了抗體在軛合物質係有毒有效負載的環境中內化和細胞內累積軛合物質的能力。
在背馱式ADC（pgADC）環境中，藉由在治療四天後評估細胞活力來研究與有效負載軛合的第二抗體片段複合的抗CCR7抗體的細胞毒性作用。製備CCR7特異性IgG的三倍稀釋液並且與恒定量的有效負載偶聯的Fab片段混合。有效負載偶聯的Fab片段的最終濃度為0.5 µg/ml。Fab試劑係與MMAF或皂草素（Advanced Targeting Systems公司，Fab-Zap）軛合的抗小鼠Fc定向的Fab。在室溫下預孵育30 min後，將10 μl/孔的抗體-有效負載複合物一式三份地添加到384孔底白板中。接種對應的CCR7（+）細胞，使得它們的密度對於懸浮細胞小於1 x 106 個/ml並且對於黏附細胞達到80%匯合。收穫細胞（用Accutase分離黏附細胞）並重懸至大約2 x 104 個細胞/ml。將細胞添加到384孔板中、在抗體-有效負載複合物（20 µl/孔）之上。將板在37°C和5% CO2 下孵育4天。隨後，製備20 μl/孔的CellTiter-Glo溶液（CellTiter-Glo®發光細胞活力測定；普洛麥格公司，#G7571）並且添加到細胞中。只有活細胞產生ATP，ATP係螢光素酶反應（由CellTiter-Glo提供）所需的，從而導致發光。據此，藉由發光信號確定細胞活力，在22°C和400 rpm下孵育10 min後使用Envision 2104多標籤讀取器測量該發光信號。使用Graphpad Prism軟體計算IC50值。
圖7A和圖7B顯示所有四種抗CCR7抗體均能夠使用MMAF軛合的試劑以背馱式測定形式對CCR7+ KE97細胞進行濃度依賴性細胞殺傷。下表匯總了使用MMAF或皂草素作為工具背馱式有效負載的實驗結果。 [表16]：pgADC細胞毒性測定中抗CCR7抗體的IC50和AMAX
   抗mFc.MMAF Fab-ZAP
   IC50（nM） AMAX（%） IC50（nM） AMAX（%）
121G12親本 0.055 104 0.064 43
506E15親本 0.070 95 0.135 60
674J13親本 0.137 102 6.12 31
684E12親本 0.214 80 2.60 33
MAB197（安迪生物） 0.142 85 0.155 40
使用靶陰性細胞系評估pgADC殺傷的特異性。在圖8中示出了使用FabZap試劑的一個實例。與CCR7陰性NIH3T3親代細胞或mIgG對照抗體相比，在KE97和NIH3T3.hCCR7細胞中觀察到121G12 pgADC活性的特異性CCR7依賴性增加。實例 7 ：小鼠交叉反應性非軛合或 AURIX1 軛合的抗 CCR7 抗體對體內正常小鼠造血細胞的影響
跨物種的正常組織表現限於造血來源的細胞，包括血液和淋巴器官中的CD4+和CD8+ T細胞，這呈現出靶向CCR7的ADC的潛在安全性不利因素，特別是在可能導致ADCC和淋巴細胞消耗的野生型Fc形式中。
為了確定用ADC靶向CCR7對體內正常造血細胞的影響，在健康雌性6-8週齡CD-1小鼠中以野生型或緘默（DAPA）Fc形式評價與AURIX1未軛合或軛合的小鼠交叉反應性121G12親本Ab。使小鼠接受121G12親本Cys-Mab.野生型Fc.hIgG1（121G12.wt.Fc）、121G12親本Cys-Mab.DAPA.hIgG1（121G12.DAPA.Fc）、121G12親本.Cys-Mab.野生型Fc.hIgG1.AURIX1（121G12.wt.Fc.AURIX1）或121G12.親本.Cys-Mab.DAPA.hIgG1.AURIX1（121G12.DAPA.Fc.AURIX1）的單一IV治療，最終劑量為10 mg/kg。將所有劑量調整至個體小鼠體重。
在治療後第25天，提取脾並且使用gentleMACS解離器（美天旎公司（Miltenyi Biotec Inc），聖地牙哥，加利福尼亞州）解離成單細胞懸浮液。然後將每個樣本的100萬個細胞用Ab的混合物染色以確定單獨治療對CD4+和CD8a+ T細胞的影響，該混合物包含BUV737大鼠抗小鼠CD8a抗體、殖株53-6.7（1 : 100）（BD生物科學事業部（BD Biosciences），聖約瑟（San Jose），加利福尼亞州，目錄號564297）和BV510大鼠抗小鼠CD4，殖株RM4-5（1 : 200）（BD生物科學事業部，聖約瑟，加利福尼亞州，目錄號563106）。將樣本在4°C下孵育30 min，在冰冷的海殖株磷酸鹽緩衝鹽水（海殖株實驗室公司（Hyclone Laboratories），洛根（Logan），猶他州（Utah））中洗滌，並且在BD LSRFortessaTM細胞分析儀（BD生物科學事業部，聖約瑟，加利福尼亞州）上評價。使用總脾細胞計數來確定CD4+或CD8a+ T細胞消耗。使用T檢驗來確定組間的顯著性。
如表17和圖9中所示，在用121G12.wt.FC或121G12.wt.Fc.AURIX1 Ab以10 mg/kg治療的第3天觀察到脾臟中CD4+（FC 0.5-0.6）和CD8a+ T細胞（FC 0.3-0.5）的強烈減少，這表明T細胞消耗影響獨立於AURIX1有效負載的存在。藉由引入DAPA突變使Fc緘默，挽救了該等效應。相對於未治療組，121G12.DAPA.Fc和121G12.DAPA.Fc.AURIX1均未能影響T細胞群。該等數據表明抗CCR7 ADC可能具有T細胞消耗安全性不利因素，該不利因素可藉由Fc的DAPA緘默來挽救。 [表17]：121G12抗體對CD-1小鼠中的CD4+和CD8a+ T細胞群的影響
Figure 02_image139
Figure 02_image141
在治療第25天評估實驗。倍數變化（FC）=對於所指示治療組的第25天的平均脾細胞計數/對於未治療對照組的第3天的平均脾細胞計數。使用T檢驗來確定相對於未治療組的顯著性（* p＜0.05，*** p＜0.001；NS = 不顯著）。實例 8 ：直接軛合物的抗 CCR7 ADC 活性
藉由在治療4天後評估細胞活力來研究在與各種有效負載直接軛合的抗體（ADC）結合並內化到CCR7（+）細胞中後的細胞毒性作用。將ADC的三倍稀釋液一式三份地（10 µl/ml）添加到384孔底白板中。接種對應的CCR7（+）細胞，使得它們的密度對於懸浮細胞小於1 x 106 個/ml並且對於黏附細胞達到80%匯合。收穫細胞（用Accutase分離黏附細胞）並重懸至大約2 x 104 個細胞/ml。將細胞添加到384孔板中、在抗體（20 µl/孔）之上。將板在37°C和5% CO2 下孵育4天。隨後，製備20 μl/孔的CellTiter-Glo溶液（CellTiter-Glo®發光細胞活力測定；普洛麥格公司，#G7571）並且添加到細胞中。藉由發光信號確定細胞活力，在22°C和400 rpm下孵育10 min後使用Envision讀取器測量該發光信號。使用Graphpad Prism軟體計算IC50值。
下表示出了用與AURIX1或AURIX2軛合、呈野生型Fc或緘默（DAPA）Fc形式的抗CCR7 CysMab抗體測量細胞活力效應的實例。 [表18]：細胞毒性測定中抗CCR7 ADC的IC50
      細胞活力測定中的ADC活性；IC50（nM）
細胞系 癌症類型 506E15.CysMab.AURIX1 674J13. CysMab.AURIX1 506E15. CysMab.DAPA. AURIX2 674J13. CysMab.DAPA.AURIX2
DEL ALCL 0.0029 0.0741 0.0084 0.1167
KE97 多發性骨髓瘤 0.0031 0.03 0.0131 0.0658
為了評估ADC的靶特異性和受體水平依賴性，在具有不同CCR7受體水平的細胞系中測試ADC活性。下表示出了呈CysMab.DAPA形式並與AURIX2軛合的人源化674J13抗體的實例。基於對有效負載的類似敏感性選擇細胞系。 [表19]：呈DAPA形式並與AURIX2軛合的人源化674J13抗體的IC50
         細胞活力測定中的ADC活性；IC50（nM）
細胞系 癌症類型 CCR7受體水平 674J13.CysMab.DAPA.AURIX2
DEL ALCL 約100,000 0.2417（＞95% AMAX）
KE97 多發性骨髓瘤 約100,000 0.1018（＞95% AMAX）
SR786 間變性大細胞淋巴瘤 約28,000 2.737（90% AMAX）
CML-T1 T細胞白血病 約29,000 3.779（60% AMAX）
DND-41 T細胞白血病 1,700 ＜ 20% AMAX
NCI-H82 小細胞肺癌 0 無殺傷
如在pHrodo實驗中所見，ADC活性需要比ADCC模式更高程度的受體數量。確切的受體截止值取決於各種參數（例如，抗體親合力、有效負載效力），但是此處示出的數據描述了一般概念。使用DAPA形式的親合力依賴性抗CCR7抗體，使ADC活性對癌症細胞的偏倚超過正常CCR7+ PBMC，該等正常CCR7+ PBMC在此由具有少於2,000個CCR7受體的癌細胞系代表。實例 9 ：位點特異性 MPET.DM4 ADC 的引入
DM4軛合的ADC在ADC領域中已很好地建立。在此，我們描述了使用抗體的CysMab形式對位點特異性軛合的MPET.DM4的產生和使用，該CysMab形式具有產生其中DAR（藥物對抗體比率）係約4的可重複均質、DAR控制的ADC批次的優點。已經描述了非位點特異性軛合物通常含有具有高DAR的顯著群體，這與不利的生物物理特徵相關，該等不利的生物物理特徵包括增加的疏水性、並且因此包括更快速的清除率、差的PK譜和增加的毒性。下面我們示出了基於MPET.DM4的抗CCR7 ADC相對於其sSPDB.DM4對應物的各種體外和體內評估。實例 10 ： MPET.DM4 相對於 sSPDB.DM4 ADC 的 FACS 結合親和力
與非位點特異性軛合相比，位點特異性軛合的另一個潛在改進可能是結構上在必需CSD殘基附近的離胺酸軛合位點的潛在干擾。可以預期到此類離胺酸位點的有效負載軛合影響ADC的結合親和力。為了使用在此描述的CysMab軛合的MPET.DM4相對於內源性離胺酸軛合的sSPDB.DM4測試ADC的結合親和力，藉由如上所述之FACS測定結合親和力。下表匯總了一些代表性親和力數據，該數據顯示出sSPDB.DM4 ADC相對於MPET.DM4 ADC的結合親和力輕微下降。 [表20]：抗CCR7 ADC的結合親和力
      FACS中的ADC親和力；EC50（nM）
細胞系 CCR7受體水平 121G12. CysMab.DAR4未軛合的 121G12. CysMab.DAPA. MPET.DM4 （DAR 3.8） 121G12. DAPA.sSPDB.DM4 (DAR3.9)
DEL ≥100,000 5.24 5.61 8.42
實例 11 ： MPET.DM4 相對於 sSPDB.DM4 ADC 的體外活性
如上所述，在體外活力測定中評估ADC 121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4和121G12.DAPA.sSPDB.DM4（DAR3.9）的細胞毒性作用。下表顯示了與sSPDB.DM4相比MPET.DM4軛合物的類似的略微改善的活性。這可能是保守親和力較佳或其他因素的結果。 [表21]：抗CCR7 ADC的體外細胞毒活性
   細胞活力測定中的ADC活性；IC50（nM）
細胞系 121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4 121G12.DAPA.sSPDB.DM4 (DAR3.9)
L540 2.944 3.905
DEL 2.286 2.983
KE97 2.171 3.177
將121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4 ADC在涵蓋各種適應症環境的多種癌細胞系中進一步測試，其中實現了與受體密度相關的實質性細胞殺傷。 [表22]：抗CCR7 ADC在細胞系中的體外細胞毒活性
細胞系 癌症類型 相關受體密度（%） 121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4 IC50（nM）
SUPHD1 何杰金氏淋巴瘤 310 1.69
L540 何杰金氏淋巴瘤 175 4.90
KE97 多發性骨髓瘤 100 2.24
JVM2 MCL 79 4.62
MOTN1 CLL 67 4.24
DEL ALCL 67 2.28
OCI-Ly3 ABC-DLBCL 43 6.42
Toledo DLBCL 20 n.d.
Mec-2 CLL 15 ＞20
PEER T-ALL 2 ＞20
實例 12 ： 121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4 和 121G12.DAPA.sSPDB.DM4 對 SCID-Beige 小鼠中 KE97 多發性骨髓瘤異種移植模型的劑量依賴性體內功效
為了證實121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4和121G12.DAPA.sSPDB.DM4在體內的靶向抗腫瘤活性，在雌性SCID-beige小鼠中藉由將3 x 106 個細胞皮下注射到每隻小鼠的右肋部中建立KE97異種移植模型。一旦腫瘤達到大約135 mm3 時，根據腫瘤體積將小鼠隨機分入治療組（n=8隻/組）。使小鼠接受最終劑量為0.5、2或5 mg/kg的121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4（DAR4）、0.5、2或5 mg/kg的121G12.DAPA.sSPDB.DM4（DAR 3.9）、或5 mg/kg的非特異性同種型對照IgG1.CysMab.DAPA.MPET.DM4的IV治療。將所有劑量調整至個體小鼠體重。
所有測試試劑在研究中均耐受，並且在任何治療組中均未觀察到毒性或體重減輕的明顯臨床症狀（表23）。 [表23]：在KE97異種移植模型中的抗CCR7 ADC劑量應答功效
      腫瘤反應 宿主反應
治療 劑量，方案 ∆T/∆C（%） 消退（%） ∆ 體重（%） 存活（活的/總數）
無治療 無 100 - 2.09 8/8
IgG1.CysMab.DAPA.MPET.DM4 5 mg/kg 單劑量 92.94 - 3.02 8/8
121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4 0.5 mg/kg 單劑量 78.62 - 1.05 8/8
121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4 2 mg/kg 單劑量 - 33.07* 2.74 8/8
121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4 5 mg/kg 單劑量 - 53.66* 0.46 8/8
121G12.DAPA.sSPDB.DM4 0.5 mg/kg 單劑量 85.38 - 1.84 8/8
121G12.DAPA.sSPDB.DM4 2 mg/kg 單劑量 13.77* - 0.59 8/8
121G12.DAPA.sSPDB.DM4 5 mg/kg 單劑量 - 32.63* 3.63 8/8
在治療第9天（移植後第23天）評價實驗，* p＜ 0.001，相對於對照未治療組（單向方差分析/Tukey多重比較檢驗）。% ∆T/∆C = 100 ∆T/∆C 其中：∆T =在研究的D23藥物治療組的平均腫瘤體積 - 在初始給藥日藥物治療組的平均腫瘤體積；∆C =在研究的D23對照組的平均腫瘤體積 - 在初始給藥日D14對照組的平均腫瘤體積。消退% = (1- T最終/T初始) x 100，其中T最終係D23平均腫瘤體積並且T初始定義為在移植後D14的腫瘤體積。∆體重（%） = (D23平均體重 - D14平均體重)* 100/治療D14的平均體重。
在用非特異性同種型對照IgG1.CysMab.DAPA.MPET.DM4以5 mg/kg治療後未觀察到顯著的抗腫瘤功效。121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4治療產生劑量依賴性抗腫瘤功效，其中∆T/∆C值為78.62%（0.5 mg/kg），而2和5 mg/kg的劑量在第一劑量後D9（植入後D23）分別導致33%和54%的平均消退。121G12.DAPA.sSPDB.DM4治療也展示出劑量依賴性抗腫瘤功效，其中∆T/∆C值為85.38%（0.5 mg/kg）和13.77%（2 mg/kg），而5 mg/kg劑量在第一劑量後D9（植入後D23）導致33%的平均消退。在植入後D23-D25，使對照組和0.5 mg/kg治療組安樂死，並且使其餘組在植入後D28接受2或5 mg/kg 的121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4或2或5 mg/kg的121G12.DAPA.sSPDB.DM4的第二劑量。直到在植入後D42的研究結束時，對於2和5 mg/kg的121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4，以及5 mg/kg的121G12.DAPA.sSPDB.DM4觀察到持續的腫瘤消退。以2 mg/kg使用121G12.DAPA.sSPDB.DM4時，應答更加異種，其中大約25%的小鼠顯示出持續的腫瘤消退，而該組的其餘小鼠顯示出穩定的疾病或腫瘤進展（圖10，表23）。實例 13 ： 121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4 相對於 121G12.DAPA.sSPDB.DM4 在較大起始腫瘤體積下的 KE97 多發性骨髓瘤模型中的功效評估
使用KE97多發性骨髓瘤細胞系建立較高障礙的體內模型，以進一步區分不同的可裂解連接子的抗腫瘤功效，比較了121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4 121G12.DAPA.sSPDB.DM4（DAR3.9）在第一劑量下在具有較大起始腫瘤體積的腫瘤中的功效。在雌性SCID-beige小鼠中藉由將3 x 106 個細胞皮下注射到每隻小鼠的右肋部中建立KE97異種移植模型。一旦腫瘤達到大約450 mm3 時，根據腫瘤體積將小鼠隨機分入兩個治療組（n=8）。使小鼠接受2 mg/kg的121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4或121G12.DAPA.sSPDB.DM4的IV治療。
用121G12.DAPA.sSPDB.DM4以2 mg/kg治療後未觀察到顯著的抗腫瘤功效。121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4治療在單劑量治療下導致75%（8隻中的6隻）小鼠的部分消退/延長停滯（圖11）。121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4在該模型中強烈優於121G12.DAPA.sSPDB.DM4（D25平均腫瘤體積分別為524.83 ± 143.20相對於1337.13 ± 35.13，p ＜ 0.001；非配對T檢驗）。實例 14 ： 121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4 對原發性患者衍生非小細胞肺癌 HLUX1934 腫瘤模型的體內功效
在表現CCR7的HLUX1934原發性非小細胞肺癌異種移植模型中評價121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4的抗腫瘤活性。使雌性無胸腺裸鼠皮下植入腫瘤片段到每隻小鼠的右脅部中。一旦腫瘤達到大約100 mm3 時，根據腫瘤體積將小鼠隨機分入治療組（n=8）。使小鼠接受10 mg/kg的121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4（DAR4）、或10 mg/kg的非特異性同種型對照IgG1.CysMab.DAPA.MPET.DM4的IV治療。2週後遞送每種抗體的第二劑量。將所有劑量調整至個體小鼠體重。
10 mg/kg的非特異性同種型對照IgG1.CysMab.DAPA.MPET.DM4相對於未治療組顯現出略微延遲的腫瘤生長（∆T/∆C值53.07%），這可能是由於抗體與HLUX1934模型中的脫靶的非特異性結合。121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4治療導致更明顯的功效，該功效藉由給予第二劑量而維持。10 mg/kg劑量的121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4治療耐受性良好，植入後D34沒有明顯的體重減輕並且∆T/∆C值為18.83%。（圖12，表24）。 [表24]：HLUX1934 NSCLC患者衍生模型中的121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4功效。在植入後第34天（治療後D23）評價實驗。
      腫瘤反應 宿主反應
治療 劑量 ∆T/∆C（%） ∆ 體重（%） 存活（活的/總數）
無治療 無 100 5.12 5/8**
IgG1.CysMab.DAPA.MPET.DM4 10 mg/kg 53.07 2.81 8/8
121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4 10 mg/kg 18.83* 0.61 8/8
* p ＜ 0.001，相對於對照未治療組（單向方差分析/Tukey多重比較檢驗）。% ∆T/∆C = 100 ∆T/∆C 其中：∆T =在研究的D34藥物治療組的平均腫瘤體積 - 在初始給藥日藥物治療組的平均腫瘤體積；∆C = 在研究的D34對照組的平均腫瘤體積 - 在初始給藥日對照組的平均腫瘤體積。∆體重（%） = (D34平均體重 - D11平均體重)* 100/治療D11的平均體重。* 未治療組中的由於治療後D25-D27過度腫瘤負荷而安樂死的小鼠。實例 15 ： 684E12.SMCC.DM1 對 SCID-Beige 小鼠中 KE97 多發性骨髓瘤異種移植模型的體內功效
為了證實684E12.SMCC.DM1在體內的靶向抗腫瘤活性，在雌性SCID-beige小鼠中藉由將3 x 106 個細胞皮下注射到每隻小鼠的右肋部中建立KE97異種移植模型。一旦腫瘤達到大約200 mm3 時，根據腫瘤體積將小鼠隨機分入治療組（n=8隻/組）。使小鼠接受最終劑量為2或6 mg/kg的親本684E12.SMCC.DM1（DAR2.6）、或6 mg/kg的非特異性同種型對照IgG1.SMCC.DM1的IV治療。將所有劑量調整至個體小鼠體重。
所有測試試劑在研究中均耐受，並且在任何治療組中均未觀察到毒性或體重減輕的明顯臨床症狀。在用非特異性同種型對照IgG1.SMCC.DM1或親本684E12.SMCC.DM1以2 mg/kg治療後未觀察到顯著的抗腫瘤功效。親本684E12.SMCC.DM1 6 mg/kg治療在劑量後D11導致∆T/∆C值6.72%（p ＜ 0.0001，單向方差分析/Tukey多重比較檢驗）（圖13）。實例 16 ： 121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4 在 KE97 腫瘤模型中產生的體內中靶藥效動力學標誌物調節
利用在用121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4治療後磷酸化組蛋白H3標誌物陽性腫瘤細胞的累積評估抗CCR7 ADC在體內誘導G2/M阻滯的能力。
進行研究，其中在雌性SCID-beige小鼠中藉由將3 x 106 個細胞皮下注射到每隻小鼠的右肋部中建立KE97異種移植模型。一旦腫瘤達到大約140 mm3 時，根據腫瘤體積將小鼠隨機分入治療組（n=3隻/組）。使小鼠接受最終劑量為2、5或10 mg/kg的121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4、或10 mg/kg的非特異性同種型對照IgG1.CysMab.DAPA.MPET.DM4的單一IV治療。將所有劑量調整至個體小鼠體重。治療後48小時收集腫瘤用於藉由下述免疫組織化學染色評估磷酸化組蛋白H3水平。
為了藉由免疫組織化學測量磷酸化組蛋白H3陽性細胞核的累積，從文塔納醫療系統公司（Ventana Medical Systems）（圖森（Tuscon），亞利桑那州（AZ），目錄號760-4591）獲得靶向人組蛋白H3的磷酸化絲胺酸10周圍的殘基的兔多株抗體。IHC方案包括對文塔納Discovery細胞調理劑1抗原修復試劑的加熱和溫和暴露（32 min）。將樣本在室溫下與第一抗體（由製造商預稀釋）一起孵育60 min。隨後與OmniMap抗兔HRP第二Ab（文塔納，圖森，亞利桑那州，目錄號760-4311）（由製造商預稀釋）一起孵育12 min。
在圖14A中，儘管代表性的未治療和同種型對照IgG1.CysMab.DAPA.MPET.DM4顯示偶然的磷酸化組蛋白H3陽性腫瘤細胞，但在給予121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4後48小時檢測到磷酸化組蛋白H3免疫染色的穩健劑量依賴性增加。使用MatLab（邁斯沃克公司（MathWorks），納蒂克 麻塞諸塞州）進行信號的定量，其中將磷酸化組蛋白H3信號的總面積（µm2 ）藉由細胞核的總面積（µm2 ）歸一化，產生以下針對每個治療組所示的磷酸化組蛋白H3比率（%）值。圖14B中的該等數據表明121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4能夠在腫瘤異種移植物中引發強烈的G2/M阻滯，這與有效負載的預期作用機制一致。實例 17 ：用於產生 121G12.CysMab.DAPA 抗體之方法
該實例描述了用於從細胞培養物中產生CCR7抗體121G12.CysMab.DAPA之方法，其中Ab由編碼Ab的載體表現。一旦Ab在細胞培養物中表現，將Ab如下從細胞培養物中純化：
121G12.CysMab.DAPA抗體藥物物質中間體的純化方法中的第一步包括藉由串聯的深層過濾然後0.2 µm過濾去除細胞。
第二步包括蛋白A親和液相層析步驟。根據整體產品的總量，將該步驟分若干次運行進行。每次運行允許最大載入量為大約20 g/L柱體積。用大約pH 3.0下的50 mM乙酸進行洗脫。操作溫度為18°C-28°C。將所有洗脫液彙集並且在病毒滅活步驟之前儲存在2°C-8°C下。
第三步係「低pH處理」病毒滅活。將步驟2的中間體溶液調整至18°C-28°C並將pH調整至3.5（範圍3.4-3.6）。然後保持產物中間體溶液以進行病毒滅活，持續70分鐘（範圍60-90分鐘）。保持時間之後，將溶液調整至pH 6.0（範圍5.8-6.2）。在該步驟結束時，對溶液進行深層過濾、串聯有0.2 µm過濾，並且儲存在2°C-8°C下。
第四步係處於結合/洗脫模式的陽離子交換層析，包括整合的柱上還原。根據滴定度，將該步驟分若干次運行進行。每次運行允許載入量為大約30 g/L柱體積。用含有20 mM琥珀酸鈉，pH 6.0的緩衝液A平衡柱。使用20 mM磷酸鈉、1 mM EDTA、7 mM L-半胱胺酸，pH 7.1作為還原緩衝液進行柱上還原。用緩衝液A去除還原緩衝液，並且用緩衝液A和含有10 mM琥珀酸鈉、300 mM氯化鈉，pH 6.0的緩衝液B以從10%至90%的線性梯度進行洗脫。在多模式陰離子交換層析步驟之前，可以將洗脫液和彙集物儲存在2°C-8°C下。
該方法的第五步係處於流通模式的陰離子交換層析。根據滴定度，將該步驟分若干次運行進行。每次運行允許最大載入量為大約350 g/L柱體積。操作溫度為18°C-28°C。使用20 mM琥珀酸鈉、119 mM氯化鈉，pH 6.0進行平衡。在病毒去除步驟之前，將最終的滲濾液儲存在2°C-8°C下。
步驟六病毒過濾包括用0.1 µm過濾器預過濾，然後用Planova 20N奈米過濾器進行病毒過濾。在病毒過濾之前，將來自步驟5的中間體溶液的溫度調整至18°C-28°C。操作溫度為18°C-28°C。奈米過濾後，將中間體儲存在2°C-8°C或18°C-28°C下。
第七步超濾/滲濾包括進行上濃縮步驟至大約70 g/L，然後用10 mM磷酸鉀，pH 6.0進行第1次滲濾步驟。將至少7的滲濾交換因子定為目標，然後稀釋至大約50 g/L。將最終的藥物物質中間體進行0.2 μm過濾並且儲存在2°C-8°C下。
在第八步和最後一步中，將最終的整體藥物物質中間體等分填充到合適的容器中，並且在冷凍後儲存在-60°C以下。 [表25]   純化和還原過程的流程圖
步驟 操作
步驟1 收穫、細胞去除和過濾
步驟2 親和層析 （MabSelect SuRE）
步驟3 在pH 3.5下病毒滅活
步驟4 陽離子交換層析 和 柱上還原 （Fractogel EMD SO3（M））
步驟5 多模式陰離子交換層析 （Capto黏附）
步驟6 藉由奈米過濾去除病毒 （Planova 20N）
步驟7 超濾/滲濾和最終過濾
步驟8 填充和深度冷凍
實例 18 ： 121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4 對 NSG 小鼠中的 OCI-LY3 ABC-DLBCL 異種移植模型的劑量依賴性體內功效。
為了證實121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4在ABC-DLBCL模型中的體內靶向抗腫瘤活性，在雌性NSG小鼠中藉由將10 x 106 個細胞皮下注射到每隻小鼠的右肋部中建立OCI-LY3異種移植模型。一旦腫瘤達到大約140 mm3 時，根據腫瘤體積將小鼠隨機分入治療組（n=6隻/組）。使小鼠在研究的第1天和第15天接受最終劑量為0.5、1或2 mg/kg的121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4（DAR4）、或2 mg/kg的非特異性同種型對照hIgG1.CysMab.DAPA.MPET.DM4的IV治療。將所有劑量調整至個體小鼠體重。所有測試試劑在研究中均耐受，並且在任何治療組中均未觀察到毒性或體重減輕的明顯臨床症狀（表26）。
在用非特異性同種型對照hIgG1.CysMab.DAPA.MPET.DM4以2 mg/kg治療後未觀察到顯著的抗腫瘤功效。121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4治療產生劑量依賴性抗腫瘤功效，其中∆T/∆C值為74.6%（0.5 mg/kg）和10.7%（1 mg/kg），而2 mg/kg劑量在研究的第28天導致65.9%的平均消退。在121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4 2 mg/kg組中6隻小鼠中有3隻顯示出完全消退（圖15）。 [表26]：在治療的第28天OCI-LY3異種移植模型中的抗CCR7 ADC劑量應答功效。
腫瘤反應 宿主反應
治療 劑量，方案 ∆ T/ ∆ C （ % ） 消退（ % ） ∆ 體重（ % ） 存活率（活的 / 總數）
無治療 無 100.0 - 5.6 6/6
hIgG1.CysMab.DAPA.MPET.DM4 2 mg/kg 在D1和D15給藥 119.7 - 1.8 5/6
121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4 0.5 mg/kg 在D1和D15給藥 74.6 - 3.5 5/6
121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4 1 mg/kg 在D1和D15給藥 10.7**    2.9 6/6
121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4 2 mg/kg 在D1和D15給藥 - 65.9** -0.8 6/6
在治療第28天評價實驗，** p＜0.005，相對於對照未治療組（單向方差分析/Tukey多重比較檢驗）。% ∆T/∆C = 100 ∆T/∆C 其中：∆T =在研究的D28藥物治療組的平均腫瘤體積 - 在初始給藥日藥物治療組的平均腫瘤體積；∆C =在研究的D28對照組的平均腫瘤體積 - 在初始給藥日D1對照組的平均腫瘤體積。如果∆T ＜ 0，則計算消退% = (1- T最終 /T初始 ) x 100，其中T最終 係D28平均腫瘤體積並且T初始 定義為在治療D1的腫瘤體積。∆ 體重（%） =（平均體重D28-平均體重D1） *100/治療的平均體重D1。實例 19 ： 121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4 對 SCID-bg 小鼠中的 Toledo GCB-DLBCL 異種移植模型的劑量依賴性體內功效。
為了證實121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4在GCB-DLBCL模型中的體內靶向抗腫瘤活性，在雌性Scid-bg小鼠中藉由將3 x 106 個細胞皮下注射到每隻小鼠的右肋部中建立Toledo異種移植模型。一旦腫瘤達到大約100 mm3 時，根據腫瘤體積將小鼠隨機分入治療組（n=4隻/組）。使小鼠在研究的第1天和第15天接受最終劑量為2或5 mg/kg的121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4（DAR4）、或5 mg/kg的非特異性同種型對照hIgG1.CysMab.DAPA.MPET.DM4的IV治療。將所有劑量調整至個體小鼠體重。所有測試試劑在研究中均耐受，並且在任何治療組中均未觀察到毒性或體重減輕的明顯臨床症狀（表27）。
在用非特異性同種型對照hIgG1.CysMab.DAPA.MPET.DM4以5 mg/kg治療後未觀察到顯著的抗腫瘤功效。121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4治療產生劑量依賴性抗腫瘤功效，其中∆T/∆C值為52.7%（2 mg/kg）和20.6%（5 mg/kg）（圖16，表27）。 [表27]：在治療的第20天Toledo異種移植模型中的抗CCR7 ADC劑量應答功效。
腫瘤反應 宿主反應
治療 劑量，方案 ∆ T/ ∆ C （ % ） ∆ 體重（ % ） 存活（活的 / 總數）
無治療 無 100.0 4.9 3/6
hIgG1.CysMab.DAPA.MPET.DM4 5 mg/kg 在D1和D15給藥 94.5 1.0 3/6
121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4 2 mg/kg 在D1和D15給藥 52.7* 3.2 4/6
121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4 5 mg/kg 在D1和D15給藥 20.6 ** 0.1 4/6
在治療第20天評價實驗，* p ＜ 0.05，** p ＜ 0.005相比於對照未治療組（單向方差分析/Tukey多重比較檢驗）。% ∆T/∆C = 100 ∆T/∆C 其中：∆T =在研究的D20藥物治療組的平均腫瘤體積 - 在初始給藥日藥物治療組的平均腫瘤體積；∆C =在研究的D20對照組的平均腫瘤體積 - 在初始給藥日D1對照組的平均腫瘤體積。∆體重（%） = (D20平均體重 - D1平均體重)* 100/治療D1的平均體重。實例 20 ： 121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4 對 SCID-bg 小鼠中的 DEL ALCL 異種移植模型的體內功效。
為了證實121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4在CCR7陽性ALCL模型中的體內靶向抗腫瘤活性，在雌性Scid-bg小鼠中藉由將3 x 106 個細胞皮下注射到每隻小鼠的右肋部中建立DEL異種移植模型。一旦腫瘤達到大約100 mm3 時，根據腫瘤體積將小鼠隨機分入治療組（n=4隻/組）。使小鼠在研究的第1天和第15天接受最終劑量為2 mg/kg的121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4（DAR4）、或2 mg/kg的非特異性同種型對照同種型.MPET.DM4的IV治療。將所有劑量調整至個體小鼠體重。
在用非特異性同種型對照hIgG1.CysMab.DAPA.MPET.DM4以2 mg/kg治療後未觀察到顯著的抗腫瘤功效。用121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4 2 mg/kg的治療在單一劑量後在研究的第14天導致40.2%的平均消退（p ＜ 0.01）。使小鼠在第15天接受第二劑量並且監測超過三週。一隻異常動物未能對第二劑量的治療產生應答並且由於腫瘤負荷，必須在第28天進行安樂死。另外一隻動物顯示疾病進展緩慢，並且在第28天也被取下用於靶標表現跟蹤。四隻小鼠中的兩隻繼續顯示對腫瘤生長的持續影響（圖17）。所有治療均耐受良好，沒有明顯的體重減輕。實例 21 ： 121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4 對原發性患者衍生非小細胞肺癌 HLUX1787 腫瘤模型的體內功效
在表現CCR7的HLUX1787原發性非小細胞肺癌異種移植模型中評價121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4的抗腫瘤活性。使雌性NSG小鼠皮下植入腫瘤片段到每隻小鼠的右脅部中。一旦腫瘤達到大約150 mm3 時，根據腫瘤體積將小鼠隨機分入治療組（n=6隻/組）。使小鼠在第1天接受0.5、2或5 mg/kg的121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4（DAR4）的IV治療並且2週後在第15天遞送第二劑量。將所有劑量調整至個體小鼠體重。
對於低劑量的經軛合的Ab未觀察到顯著的抗腫瘤功效，然而對於5 mg/kg的121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4治療觀察到部分消退或穩定疾病。第二劑量後兩週觀察到持續的腫瘤功效，在治療的D30產生1.3%的∆T/∆C值（p ＜ 0.001；單向方差分析/Tukey多重比較檢驗）（圖18）。所有治療均耐受良好，沒有明顯的體重減輕。實例 22 ：人 DLBCL PDX 模型中的 121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4 活性
為了研究患者群體中121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4誘導的功效和CCR7流行病學之間的關係，在一組11個未選擇的DLBCL患者衍生的異種移植中研究121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4（圖19）。該等11個DLBCL PDX衍生自高達3次先前治療耐藥/復發的患者，雖然一些患者作為PDX模型接受過另外的治療。該等先前治療獲取了多種與利妥昔單抗組合的化療方案。
以10 mg/kg i.v. Q2W的劑量日程表，121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4在7/11 DLBCL模型中達成了PR或CR，這表示總體反應率為約64%。採用定量PCR（RD-2019-00253）確定每個模型（使用未治療的對照腫瘤）的CCR7 RNA表現水平。RNA數據和腫瘤反應數據的整合表明121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4敏感性和靶標表現之間的相關性（圖19）。
總之，該等數據提供了DLBCL中121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4的臨床前活性的證據，並且表明CCR7靶標表現與對121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4的敏感性有關。實例 23 ：小鼠和食蟹猴中 121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4 的非 GLP 藥物動力學
在小鼠研究中，在i.v.投與121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4後，總Ab和ADC的暴露接近成比例，高達10 mg/kg劑量。在單一劑量投與121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4後72小時後，兩個譜分離，表示DM4與ADC的解軛合（圖20）。121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4的T1/2為約4-5天。121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4的第二劑量後，121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4的累積率為約1.1-1.3。
在非GLP猴研究中，在投與121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4後，在給藥後約72 h，觀察到總Ab和ADC濃度譜分離，表明DM4解軛合（圖21）。幾乎所有樣本的DM4和s-甲基-DM4（sDM4）均低於定量水平（BLQ，1.56 ng/ml）。121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4顯示出在2和4 mg/kg劑量之間的劑量比例關係。由於121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4組（給予兩次劑量的2 mg/kg）和另一個121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4組（給予兩次劑量的4 mg/kg劑量和兩次劑量的8 mg/kg）中建議的免疫原性，未評估累積。2 mg/kg的第二劑量和4 mg/kg的第二劑量後觀察到免疫原性，並且8 mg/kg劑量後未觀察到免疫原性進一步增強。實例 24 ：食蟹猴中 121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4 的 GLP 重複劑量藥物動力學
總體而言，每三週一次全身暴露於121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4已經在食蟹猴GLP研究中測試的所有劑量下證明，如藉由四種主要分析物tAb、tADC、DM4和sDM4進行測量。藥物動力學參數估計值總結於表28中。 [表28]：121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4在猴（合併的雄性和雌性動物）中以1、3和8 mg/kg劑量每三週多次給予IV輸注劑量後ADC、tAb和DM4的平均毒代動力學（TK）參數
劑量 研究天數 TK參數 N tAb ADC DM4
1 mg/kg 1 C最大 （µg/mL） 6 25.5 21.4 0.00103
AUC0-504h (µg*h/mL) 6 2360 1500 0.0445
22 C最大 （µg/mL） 6 2.32 1.40 0.000407
AUC0-504h (µg*h/mL) 6 84.0 NC NC
3 mg/kg 1 C最大 （µg/mL） 6 99.5 63.1 0.00441
AUC0-504h (µg*h/mL) 6 8850 4860 0.198
22 C最大 （µg/mL） 6 34.1 31.3 0.00213
AUC0-504h (µg*h/mL) 6 2500 1450 0.0754
8 mg/kg 1 C最大 （µg/mL） 10 226 161 0.0121
AUC0-504h (µg*h/mL) 10 24800 12800 0.512
22 C最大 （µg/mL） 10 163 113 0.00784
AUC0-504h (µg*h/mL) 10 7520 4250 0.208
NC =無法計算
投與121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4後，tADC的濃度與總Ab的濃度相比下降更快，表明DM4的解軛合（圖22）。在1 mg/kg至8 mg/kg的劑量範圍內，在第一劑量後，121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4顯示出近似的劑量比例關係。由於第二劑量跨各劑量水平建議的免疫原性，未觀察到累積。第二劑量8 mg/kg 121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4後，基於AUC168h的累積率為0.34。除潛在的免疫原性效應外，靶標介導的分佈可能在清除1 mg/kg劑量水平的121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4中起作用。第一劑量1 mg/kg、3 mg/kg和8 mg/kg劑量後，tAb的T1/2分別為37小時、90小時和94小時。在所有劑量後，tADC的T1/2約為3天。121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4的毒代動力學似乎沒有性別差異。
DM4的濃度普遍低，＜0.008%的ADC濃度（莫耳比＜0.4%），表明循環中DM4很低。DM4暴露以大約劑量比例性方式增加。未觀察到DM4的累積。DM4的T1/2為約3-4天。sDM4對幾乎所有樣本皆為BLQ。因此，沒有對sDM4的PK參數進行估計。實例 25 ： 121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4 在患有復發 / 難治性慢性淋巴球性白血病（ CLL ）和非何杰金氏淋巴瘤（ NHL ）的患者中的 I/Ib 期開放標籤、多中心劑量遞增研究 研究設計 研究設計的說明
這係一項FIH、開放標籤、I/Ib期、多中心研究，其由作為單一藥劑的121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4的劑量遞增部分、隨後的擴展部分組成。研究設計總結在圖23中。遞增部分將在患有復發/難治性慢性淋巴球性白血病（r/r CLL）和非何杰金氏淋巴瘤（r/r NHL）的患者中進行。一旦確定了單一藥劑121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4的MTD/RD，研究將在定義的患者群體中使用單一藥劑121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4以擴展部分繼續。
對於劑量遞增部分每個群組中的前三名受試者，將採用交錯方法進行招募，並且將發生如下情況： •   第1受試者給藥，等待至少48小時 •   第2受試者給藥，等待至少48小時 •   第3受試者給藥
在衛生管理機構要求所有受試者錯開的國家，招募將限制在前三名受試者。
將每3週一次（Q3W）靜脈內投與121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4。根據2018年國際慢性淋巴球性白血病研討會（International Workshop on Chronic Lymphocytic Leukemia）（iwCLL）修訂指南（Hallek等人, Blood [血液學]; 131(25):2745-2760 (2018)）或非何杰金氏淋巴瘤（Lugano分類）反應評估的建議（Cheson等人, J Clin Oncol [臨床腫瘤學雜誌]; 32(27):3059-68 (2014)），將投與研究藥物直到受試者出現不可接受的毒性、進展性疾病，或在研究者或患者酌情決定下中止治療。如果可用的非臨床和臨床數據（包括初步PK、PD、安全性和有效性結果）支持的話，可在研究期間實施替代性的給藥方案（例如，頻率更低的給藥）。
可以探索向該FIH研究的劑量擴展部分添加患有NHL的青少年受試者。一旦已鑒定出成人受試者的初始安全性譜和藥理活性劑量，青少年受試者就可以符合招募。如果在劑量遞增階段滿足該等條件，青少年受試者可以參與，並將以成人中正在探索的相同劑量水平被招募。擴展部分中將要研究的適應證 •   第1組：單一藥劑121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4，r/r慢性淋巴球性白血病（CLL） •   第2組：單一藥劑121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4，r/r外周T細胞淋巴瘤（PTCL） •   第3組：單一藥劑121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4，r/r彌漫性大B細胞淋巴瘤（DLBCL） •   第4組：單一藥劑121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4，r/r被套細胞淋巴瘤（MCL） •   第5組：單一藥劑121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4，r/r濾泡性淋巴瘤（FL）
擴展部分中適應證的最終選擇和優先排序將以研究的劑量遞增部分中的結果為指導。劑量遞增
在劑量遞增期間，患有r/r CLL和r/r NHL的受試者將接受單一藥劑121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4治療，直至達到MTD/RD。劑量遞增將從組合的群體開始，但如果觀察到不同的毒性譜，允許CLL和NHL單獨劑量遞增。劑量遞增將由遵循控制過量用藥的劑量遞增（EWOC）原則的適應性貝葉斯分層邏輯回歸模型（BHLRM）來指導。在劑量遞增過程中，估計需要28名受試者才能確定MTD/RD。RD係指用於擴展的推薦的一種或多種方案和一種或多種劑量，並且在CLL和NHL之間可能不同。
將評估該研究治療的安全性（包括劑量-DLT關係）和耐受性，並基於對該等數據的審查，確定用於在擴展部分中使用的一種或多種方案和一種或多種劑量。RD也將由有關PK、PD和初步抗腫瘤活性的可用資訊來指導。劑量擴展
一旦確定了每個疾病領域（NHL或CLL）的RD，將在擴展部分中招募另外的受試者，以便於進一步表徵研究藥物的PK、PD和安全性譜，並評估單一藥劑121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4的初始抗腫瘤活性。
劑量擴展部分可能僅僅在研究者和其他研究人員考慮所有可用毒性資訊（包括非DLT的不良事件和實驗室異常）和BHLRM對未來受試者的風險評估後開始。還將考慮可用的PK、初步功效和PD資訊。
在擴展部分，受試者將根據腫瘤類型被分配到不同的組，如圖23所示。每組將招募大約20名受試者。基於來自劑量遞增部分新出現數據的審查或來自擴展群組的數據的正在進行的審查，該等組中的任一組的招募可以提前停止。來自劑量遞增部分的數據可用於研究的擴展部分中的適應證優先排序。基本原理 研究設計的基本原理
該I/Ib期、開放標籤研究的設計旨在表徵單一藥劑121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4在患有r/r CLL和r/r NHL的受試者中的安全性和耐受性，並且確定了用於進一步研究的推薦劑量和方案。該劑量遞增允許建立121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4的MTD，並以貝葉斯分層邏輯回歸模型（BHLRM）為指導。BHLRM係一種公認的在癌症受試者中評估MTD之方法。適應性BHLRM將以控制過量用藥的劑量遞增（escalation with overdose control，EWOC）原則為指導，以控制研究中未來受試者的DLT風險。這能夠納入可用的先前資訊並基於關於臨床研究中觀察到的觀察劑量限制性毒性（dose limiting toxicities；DLT）的新資訊更新模型參數。在試驗的任何階段，藉由模型針對每個適應證推薦的劑量皆為基於來自先前群組的所有可用DLT資訊的全部歷史，而不是僅在最後一組患者中觀察到的DLT數量。然後，更新的模型提供了上述各個疾病領域從當前劑量到下一個預測劑量水平的DLT概率的資訊。EMEA已接受貝葉斯反應自我調整模型在小型數據集上之用途（「Guideline on clinical trials in small populations [小群體臨床試驗指南]」，2007年2月1日）並得到眾多出版物的認可（Babb等人, Statist Med [醫學統計學]; 17: 1103-1120 (1998), Neuenschwander等人, Statistics in medicine [醫學統計學]; 27(13), 第2420-2439頁 (2008), Neuenschwander等人, Clinical Trials [臨床試驗]; 7(1), 第5-18頁 (2010), Neuenschwander等人, In Statistical Methods in Drug Combination Studies. [藥物組合研究中的統計學方法] Zhao W和Yang H (編), Chapman和Hall/CRC, 2014），並且其發展和適當使用係FDA的關鍵路徑發端（FDA’s Critical Path Initiative）的一個方面。
考慮到不同的適應證（r/r CLL和r/r NHL）可能具有彼此完全不同的臨床表現，該等適應證之間的MTD和RD可能不同。因此，該研究使用模型來評估單一藥劑121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4針對這兩個疾病領域的每一個跨劑量水平在DLT率方面的相似性水平。如果CLL和NHL的DLT率相似，則該模型允許在CLL和NHL之間共用資訊，以減少MTD估計中的不確定性。然而，如果可用的安全性數據（包括DLT、SAE、低級別AE或晚期毒性）表明121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4在CLL和NHL之間的DLT率和毒性譜存在差異，研究設計將允許分離CLL和NHL之間潛在的進一步遞增，並確定每個適應證的單獨的MTD/RD。
在劑量遞增會議上，由研究者和其他研究人員基於對受試者的耐受性和安全性資訊（包括DLT風險的BHLRM概述）以及在決策時可用的PK、PD和初始活性資訊的審查，做出新劑量水平的決策。
研究的擴展部分具有多組設計的開放標籤。擴展部分的目的是進一步評估單一藥劑121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4以選擇的劑量針對r/r CLL、PTCL、DLBCL、MCL和/或FL的安全性、耐受性、PK、PD和初步抗腫瘤活性。研究的劑量遞增部分中的發現可以告知擴展部分中適應證的優先排序。
患有晚期難治性疾病的青少年受試者參加測試新型藥劑臨床試驗的選擇相對有限。有必要更多地獲得系統劑量發現研究和靶向相關機制的藥劑（Gore等人, J Clin. Oncol [臨床腫瘤學雜誌]; 35(33):3781-3787 (2017), Leong等人, J Clin Pharmacol [臨床藥理學雜誌]; 57增刊 10:S129-S135 (2017)）。
一旦已鑒定出成人的初始安全性譜和121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4的藥理活性劑量，患有晚期抗性或難治性NHL疾病的青少年受試者就可以有資格參加該臨床試驗。≥12歲的受試者的納入得到了已發表文獻的支持，該等文獻表明，與成人相比，藥物在青少年中具有相似的毒性譜、最大耐受劑量和藥物動力學參數（Moreno等人, Nat Rev Clin Oncol [自然評論:臨床腫瘤學]; 14(8):497-507 (2017)，Chuk等人, Clin Cancer Res [臨床癌症研究]; 23(1):9-12 (2017)，Momper等人, JAMA Pediatr [美國醫學會雜誌兒科學]; 167(10):926-32 (2013)，Leong等人, J Clin Pharmacol [臨床藥理學雜誌]; 57增刊 10:S129-S135 (2017)）。劑量 / 方案的基本原理和治療持續時間
根據ICH S9指南，121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4的起始劑量係基於猴中GLP重複劑量毒性研究中觀察到的HNSTD（8 mg/kg）的1/6計算的，其給出起始劑量為0.4 mg/kg。0.4 mg/kg的劑量提供了基於體表面積的大約6倍的安全界限，並且相對於在GLP猴研究中以8 mg/kg第一劑量投與後觀察到的121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4暴露，121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4的Cmax大約係18倍並且121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4的AUC係9倍（表29）。在0.4 mg/kg劑量下，基於文獻中報導的暴露預計不會發生眼毒性，該等暴露係在使用DM4有效載荷的其他ADC的臨床研究中，在經歷過這種不良事件的受試者中觀察的（Moore等人, Cancer [癌症]; 123(16):3080-3087 (2017)；Moore等人, J.Clin.Oncol [臨床腫瘤學雜誌]: 32:15 (增刊): 5571 (2014)）。
來自小鼠OCI-Ly3異種移植模型的功效和PK數據的探索性腫瘤動力學建模表明，平均濃度為7.5 ug/mL可導致腫瘤停滯。基於建模和模擬，預測人體有效劑量為1.1 mg/kg，該劑量預計能實現腫瘤停滯。
基於在食蟹猴中（其中納入應用於晚期腫瘤適應證的標準安全界限）觀察到的非臨床安全性、耐受性和PK數據選擇每三週一次（Q3W）投與121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4。121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4的劑量將在使用BHLRM，並在對可用數據進行臨床審查之後在順序群組中遞增。 [表29]：121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4在猴中的暴露倍數相對於患者中的預期起始劑量和治療劑量
在 GLP 食蟹猴研究中的 HNSTD 患者中的起始劑量 2 患者中預期的治療劑量 2
劑量（mg/kg） 8 0.4 1.1
Cmax (μg/mL)3 161 9 25
AUC (0-504hr) (μg/mL*hr)3 12800 1379 3793
與患者相比， 猴中的預期 暴露倍數    18/91 6/31
1 分別基於Cmax或AUC的倍數。2 基於來自猴121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4 PK的異速比例，起始劑量和第一121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4劑量後治療劑量的人暴露預測3 在猴研究中第一劑量後獲得的暴露群體
本研究將在患有復發性或難治性CLL和NHL的患者中進行，該等患者接受了針對他們的適應證標準護理療法（至少有2種先前的療法方案，包括抗CD20療法、針對CLL的BTK抑制劑和維奈托克；針對NHL的抗CD20療法）並失敗了，或者不能耐受或不適合批准的療法，並且對他們來說沒有治癒性療法。
研究者或被指定者必須確保在研究中僅向滿足所有以下納入標準且不滿足任何排除標準的患者提供治療。納入標準
符合納入這項研究的受試者必須滿足以下所有標準：對於所有患有 CLL 的患者： 1.  確診為慢性淋巴球性白血病（CLL）對於所有患有 NHL 的患者： 2.  組織學上確診為B細胞或T細胞非何杰金氏淋巴瘤（NHL） 3.  必須具有適合活檢的疾病部位，並且在篩選和治療期間適合並願意進行研究要求的活檢。排除標準 ， 適用於 CLL 和 NHL
符合任何以下標準的受試者不具有納入此研究的資格。 1.  對ADC、單株抗體（mAb）和/或其賦形劑有過敏或其他嚴重超敏反應/輸注反應的病史，使得患者不能耐受免疫球蛋白/單株抗體的投與 2.  使用基於美登素（DM1或DM4）的ADC進行治療的任何既往病史 3.  已知對類美登素不耐受 4.  患有任何活動性或慢性角膜障礙的患者 5.  患有妨礙視網膜或眼底監測的任何其他病症的患者。 6.  排除活動性CNS受累的患者，除非該CNS受累已得到有效治療，且條件係局部治療在招募之前＞ 4週。對於CNS疾病已得到有效治療且在全身性療法下穩定的患者，只要符合所有其他納入和排除標準，就可以招募。 7.  受損的心功能或臨床顯著的心臟疾病 8.  已知的HIV感染史 9.  活動性HBV或HCV感染治療 研究治療
術語「研究藥物」指用於該研究的121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4。研究藥物和對照藥物 [表30]：研究藥物和對照藥物
研究 / 對照藥物 （名稱和強度） 藥物劑型 投與途徑 起始劑量 頻率和 / 或方案 供應類型
121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4 50 mg 小瓶中的凍乾物（輸注用溶液的粉末） 靜脈內使用 0.4 mg/kg 每3週（Q3W） 開放標籤散裝供應；小瓶
如果來自該研究的新證據表明，隨著研究進行期間數據的出現，可能會較佳的替代性的給藥方案，那麼可以探索那些方案。另外的研究治療
在治療中，患者必須每天向雙眼施用4-6次無防腐劑潤滑滴眼液（每隻眼睛滴1-2滴）。建議使用一次性滴眼液。
如果患者發生輸注反應，患者可在隨後的給藥日接受預先用藥。在可控制的2級輸注相關反應後，建議所有隨後的患者在輸注121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4前至少30分鐘接受對醋胺酚/對乙醯胺基酚（650 mg PO）和鹽酸苯海拉明或等效抗組胺藥（25-50 mg PO或IV）的預先用藥。3級或不可控制的2級輸注相關反應後，所有隨後的患者應在輸注121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4之前另外接受地塞米松（10 mg PO或IV）或等效皮質類固醇的預先用藥。
急性過敏反應應根據機構護理標準的需要進行治療。包括劑量修改指南。在過敏/類過敏反應的事件中，這包括恢復正常心肺狀態所需的任何治療。如果患者出現嚴重的過敏/類過敏反應，應立即停止輸注。患者僅可在與研究人員討論後恢復研究治療。如果受試者經歷≥3級過敏/類過敏反應，受試者將永久中止該研究。
患者應在配備有心肺復蘇設備的設施中接受治療。應當有可供使用的適當的復蘇設備和隨時可用的醫生。
「輸注相關反應」的CTCAE v5.0類別應該用於描述121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4輸液反應，除非研究者考慮其他類別（如「變態反應」、「過敏性反應」或「細胞介素釋放綜合症」）在特定情況下更合適。如果不確定急性事件是否為細胞介素釋放綜合症，則應採集適當的血液樣本進行實驗室評估。治療組 （ arm/group ）
所有受試者將接受121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4單一藥劑，並將在劑量遞增部分期間分配給特定群組，或在其首次篩查就診時分配給適用的擴展組。
本研究不進行受試者隨機化。治療持續時間
每個週期為21天。安排的劑量可能會延遲，以便從未消退的AE中恢復。在這種情況下，一旦AE已消退至1級或基線，則可以恢復給藥，並且週期的開始和隨後的週期將相應地改變。如果受試者由於與一種或多種研究藥物相關的未消退的AE而需要從安排的劑量的預定日期起劑量中斷＞ 21天，則受試者必須中止研究治療，除非受試者正在接受臨床益處，並且研究者認為繼續接受研究治療符合受試者的最佳利益。受試者可在與研究人員討論後重新開始治療。
根據2018年國際慢性淋巴球性白血病研討會（International Workshop on Chronic Lymphocytic Leukemia）（iwCLL）修訂指南（Hallek等人, Blood [血液學]; 131(25):2745-2760 (2018)）（針對CLL患者）或非何杰金氏淋巴瘤（Lugano分類）反應評估的建議（Cheson等人, J Clin Oncol [臨床腫瘤學雜誌]; 32(27):3059-68 (2014)）（針對NHL患者），受試者可繼續用121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4治療直到受試者出現不可接受的毒性、確認的疾病進展，和/或在研究者或受試者酌情決定下中止治療、或撤回同意。
如果由於藥物相關毒性而不得不跳過多於2個劑量的121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4，那麼應永久中止121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4。符合研究中止的標準，但根據研究者的評估，有臨床受益的證據（例如其他部位的疾病縮小或症狀改善）而無安全問題的受試者，在研究者和醫學監護人員之間進行討論之後，可允許繼續進行研究。研究者將告知患者繼續研究治療的選擇以及其他治療選擇及其益處（如果存在）。起始劑量
基於猴中GLP毒理學研究中8 mg/kg Q3W的HNSTD，FIH試驗中計算的121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4的起始劑量為0.4 mg/kg。基於人體暴露的體表面積比例估計，0.4 mg/kg的劑量提供了大約6倍的安全界限。此外，與GLP猴研究中觀察到的8 mg/kg下的相應暴露相比，在0.4 mg/kg的起始劑量下，人中的暴露的Cmax的安全界限為約18倍，AUC的安全界限為約9倍。這種起始劑量被認為具有任何意想不到的不良事件的低風險。儘管基於異種移植小鼠模型預測的有效劑量為1.1 mg/kg，但在較低劑量時可觀察到活性。暫定劑量水平
基於121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4的人PK的初期預期和121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4全身暴露與毒性之間關係的預期，表31描述了本試驗期間可能評估的121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4的起始劑量和暫定劑量水平。基於預期的有效劑量選擇針對較低劑量水平的劑量增量。在劑量遞增電話會議期間與參與調查人員討論之後，將基於BHLRM指導下的可用毒性、PK和PD數據確定實際劑量水平。在研究期間，可以添加另外的劑量水平，包括在表31所示的暫定劑量水平之間的中等劑量水平和/或高於6.0 mg/kg的劑量。起始劑量為0.4 mg/kg。 [表31]     暫定劑量水平
劑量水平 擬議的 121G12.CYSMAB. DAPA.MPET.DM4 劑量 Q3W* 與先前劑量相比的增量
-1** 0.2 mg/kg -50%
1 0.4 mg/kg （起始劑量）
2 0.8 mg/kg 100%
3 1.6 mg/kg 100%
4 2.4 mg/kg 50%
5 3.6 mg/kg 50%
6 4.8 mg/kg 33 %
7 6.0 mg/kg 25 %
* 在研究過程中可以添加另外的和/或中等劑量水平。可以添加低於MTD的任何劑量水平下的群組以更好地理解安全性、PK或PD。 **劑量水平 -1代表需要從起始劑量水平降低劑量的受試者的治療劑量。該研究不允許低於劑量水平-1的劑量減少。
擴展部分的劑量遞增和劑量選擇的指南
進行劑量遞增以建立將在擴展部分中使用的121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4的一種或多種劑量。具體而言，考慮到最大耐受劑量（MTD），研究人員認為一種或多種劑量具有最合適的受益風險，如藉由對安全性、耐受性、PK、任何可用的功效和PD的審查所評估的。
在DLT評估期內，在超過33%的經治療的受試者中，MTD係被評估為具有低於25%的導致劑量限制性毒性（DLT）的風險的最高劑量。為I期擴展選擇的一種或多種劑量可以是等於或小於該MTD的任何劑量，並且可以在不確定MTD的情況下聲明。每個劑量遞增群組將從1至6個新治療的受試者開始。他們必須有足夠的暴露和跟蹤，才能被認為可評估劑量遞增決策。
如果任何受試者在DLT評估期間經歷DLT，則最小群組規模將增加到包括至少3名患有DLT的任何疾病領域的受試者。
如果一個或多個受試者中止且不符合可評估性標準，則可以使用替代策略將其他受試者招募到同一群組中，以便於支持受益風險評估。
群組中前3名受試者之間以高於先前測試的並顯示為安全的任何劑量的劑量水平的起始給藥將錯開至少48小時，即第二名和第三名患者只能在先前患者接受其輸注後至少48小時接受第一次輸注，這將藉由研究人員的書面溝通予以確認。
當群組中的所有受試者均已完成DLT評估期或終止時，將做出劑量遞增決策。決策將由研究人員在劑量遞增電話會議中做出並將基於正在進行的研究中從評估的所有劑量水平可獲得的所有相關數據的綜合，包括安全性資訊、PK、可用的PD和初始功效。
藉由貝葉斯分層邏輯回歸模型（BHLRM），研究人員做出的任何劑量遞增決策都將不會超過滿足EWOC原則的劑量水平。在所有情況下，下一個遞增群組的劑量將不會超過先前測試的安全劑量的100%增加。研究人員在考慮所有可用的臨床數據後可以建議劑量的較小增加。
為更好地理解在進行進一步遞增之前或當時121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4的安全性、耐受性、PK、PD或抗癌活性，可以按任何劑量水平、或低於先前測試並顯示為安全的最高劑量招募1-6名受試者的富集群組（例如，在選擇的適應證中）。
為降低將受試者暴露於過度毒性劑量的風險，當2名受試者在新的群組中經歷DLT時，將使用來自所有群組中的最新資訊更新BHLRM，而無需等待來自當前群組的所有受試者完成評估期。
如果所述2個DLT發生在遞增群組中，則該群組的招募將停止，並且下一個群組將以滿足EWOC標準的較低劑量開放。
如果所述2個DLT發生在富集群組中，則在重新評估所有相關數據後，僅當劑量仍符合EWOC標準時，其他受試者才可以被招募到開放群組中。可替代地，如果不能繼續募集到同一劑量中，則可以將新受試者群組募集到滿足EWOC標準的較低劑量中。
即使在新招募的受試者被認為不能接受該劑量的事件中，如果符合受試者的最大利益，正在進行的受試者可以在研究人員的酌情決定下繼續以該劑量水平進行治療。
除了2個DLT的情況外，在群組完成之前，基於新的安全性發現（包括但不限於觀察DLT），當前正在測試的劑量可能逐步降級。在決定逐步降級之後，如果後續群組中的數據支持這一點（符合EWOC標準），則可能發生再遞增。
必要時，研究設計允許分離CLL和NHL之間潛在的進一步遞增，和確定每個疾病領域單獨的MTD/RD。在開始研究時，假設CLL和NHL的劑量和DLT概率之間的關係係相同的。然而，在整個研究過程中，BHLRM可以根據觀察到的DLT資訊估計CLL和NHL之間DLT的不同概率，並且可以為兩個疾病領域確定下一群組的不同劑量水平。在這種情況下，將在每個鑒定的劑量水平下開放1至6名患者的群組，從相關疾病領域招募患者，跨疾病領域最多總共有6名患者在比先前顯示為安全的最高劑量水平更高的劑量水平下治療。
除非另有定義，否則本文使用的技術和科學術語具有與熟知本揭露所屬領域的專業人員通常理解的相同含義。
除非另外指明，否則沒有詳細地具體描述的所有方法、步驟、技術和操作可以並且已經按照本身已知的方式進行，這應係技術人員所清楚的。再次對例如本文提及的標準手冊和普通背景技術和其中引用的另外的參考文獻進行引用。除非另外指明，否則本文引用的每個參考文獻都藉由引用以其全文而併入。
本發明之請求項係非限制性的並且提供於下文中。
儘管本文已經詳細揭露了具體方面和請求項，但是這僅是出於說明的目的以舉例方式來進行的，並且這並不旨在對所附請求項的範圍或任何相應的未來申請的請求項主題的範圍加以限制。具體而言，本發明人考慮到，在不脫離如由請求項定義的本揭露的精神和範圍的情況下，可以對本揭露進行多種替代、改變和修飾。核酸起始材料、目的殖株或文庫類型的選擇被認為對於具有本文描述的方面的知識的熟悉該項技術者而言係常規的。其他方面、優點和修飾被認為落入下列請求項的範圍內。使用不超過常規的實驗，熟悉該項技術者應認識到或能夠確認本文描述的本發明之具體方面的很多等效物。此類等效物旨在為下列請求項所涵蓋。在今後提交的相應申請中重寫請求項的範圍可能是由於不同國家專利法的限制，而不應當被理解為放棄請求項的主題。
無
[圖1]繪示了關於使用替代物ADCC報告基因測定的呈CysMab形式的非人源化和人源化抗CCR7抗體的體外ADCC活性之實驗數據。
[圖2]繪示了關於使用替代物ADCC報告基因測定的非人源化抗CCR7抗體的DAPA Fc突變形式的體外ADCC活性之實驗數據。
[圖3]繪示了關於使用基於ELISA的測定的呈CysMab.DAPA形式的抗CCR7抗體與重組hCCR7的結合之實驗數據。
[圖4A-C]繪示了關於在激動模式（圖4A）和拮抗劑模式（如4B、圖4C）中使用β-抑制蛋白測定的親本抗CCR7抗體的功能性之實驗數據。
[圖5]繪示了關於使用FACS測定的呈CysMab.DAPA形式的抗CCR7抗體與CCR7配位基的競爭之實驗數據。
[圖6]繪示了關於使用突變型CCR7蛋白表位映射親本抗CCR7抗體之實驗數據。
[圖7A-B]繪示了與有效負載軛合的第二抗體片段複合的親本抗CCR7抗體的背馱式（piggyback）ADC（pgADC）測定之實驗數據。
[圖8]繪示了關於使用靶陰性細胞系的與有效負載軛合的第二抗體片段複合的121G12親本Ab的細胞毒性效應的背馱式ADC（pgADC）殺傷測定之實驗數據。
[圖9]繪示了說明使用呈CysMab野生型Fc形式的小鼠CCR7交叉反應性121G12親本Ab的CD4+和CD8a+ T細胞消耗的圖，該121G12親本Ab作為單獨的抗體或與澳瑞司他汀細胞毒素軛合，其效應藉由轉換至DAPA緘默的Fc形式來挽救。
[圖10]繪示了說明抗體藥物軛合物121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4和121G12.DAPA.sSPDB.DM4在KE97多發性骨髓瘤異種移植模型中的劑量應答功效之圖。
[圖11]繪示了說明抗體藥物軛合物121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4和121G12.sSPDB.DM4在KE97多發性骨髓瘤模型中的活性的圖，其中給藥以大於圖10的起始腫瘤負荷開始。
[圖12]繪示了說明軛合物121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4在原發性非小細胞肺腫瘤模型HLUX1934中的體內活性之圖。
[圖13]繪示了說明經軛合的親本684E12.SMCC.DM1在KE97多發性骨髓瘤異種移植模型中的活性之圖。
[圖14A-B]繪示了在單劑量的121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4以2、5或10 mg/kg或同種型對照IgG1.CysMab.DAPA.MPET.DM4以10 mg/kg治療後在48小時處KE97腫瘤上的磷酸化組蛋白H3 IHC圖像（圖14A）和定量的磷酸化組蛋白H3信號（圖14B），這證明在用抗CCR7 ADC治療後誘導有絲分裂阻滯（磷酸化組蛋白H3）。
[圖15]繪示了說明121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4對OCI-LY3 ABC-DLBCL異種移植模型的劑量應答功效之圖。
[圖16]繪示了說明121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4對Toledo GCB-DLBCL異種移植模型的劑量應答功效之圖。
[圖17]繪示了說明121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4對DEL ALCL異種移植模型的功效之圖。
[圖18]繪示了說明121G12.CysMab.DAPA.MPET.DM4對HLUX1787 NSCLC患者衍生的異種移植模型的劑量應答功效之圖。
[圖19A]和[19B]示出了在一組與CCR7表現相關的DLBCL PDX模型中的121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4的功效。應答類別改編自RECIST標準，並且定義如下（按此順序應用）：完全應答= CR =最佳平均應答＜-40%並且最大腫瘤消退＜-95%。部分消退= PR =最佳平均應答＜-20%並且最佳最小應答 ＜-50%。穩定疾病= SD = 最佳平均應答＜30%並且最佳最小應答＜35%。進展性疾病= PD =不滿足以上任何標準，如果觀察到有應答，但出現了耐藥性，應用CR--＞PD、PR--＞PD、SD--＞PD。
[圖20]繪示了說明非GLP 121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4在OCI-Ly3異種移植腫瘤荷瘤NSG小鼠中濃度時間譜之圖。
[圖21A]和[21B]繪示了說明非GLP 121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4在猴中的濃度時間譜之圖。
[圖22]繪示了說明GLP 121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4在猴中的濃度時間譜之圖。
[圖23]繪示了說明121G12.CYSMAB.DAPA.MPET.DM4在患有復發/難治性慢性淋巴球性白血病（CLL）和非何杰金氏淋巴瘤（NHL）的患者中I/Ib期開放標籤、多中心劑量遞增研究的研究設計之圖。
無
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Claims (22)

  1. 一種在有需要的患者中治療癌症之方法，該方法包括向所述患者投與抗體藥物軛合物，其中該癌症係表現CCR7的濾泡性淋巴瘤（FL），其中該抗體藥物軛合物包含式 Ab—(L—(D)m )n 或其藥學上可接受的鹽；其中 Ab係結合人CCR7蛋白的抗體或其抗原結合片段； L係連接子； D係藥物部分； m係從1至8的整數；並且 n係從1至12的整數。
  2. 一種包含抗體藥物軛合物的組成物，用於在有需要的受試者的癌症的治療中使用，其中該癌症係表現CCR7的濾泡性淋巴瘤（FL），其中該抗體藥物軛合物包含式 Ab—(L—(D)m )n 或其藥學上可接受的鹽；其中 Ab係結合人CCR7蛋白的抗體或其抗原結合片段； L係連接子； D係藥物部分； m係從1至8的整數；並且 n係從1至12的整數。
  3. 抗體藥物軛合物在製造用於治療有需要的受試者的癌症的藥物中之用途，其中該癌症係表現CCR7的濾泡性淋巴瘤（FL），其中該抗體藥物軛合物包含式 Ab—(L—(D)m )n 或其藥學上可接受的鹽；其中 Ab係結合人CCR7蛋白的抗體或其抗原結合片段； L係連接子； D係藥物部分； m係從1至8的整數；並且 n係從1至12的整數。
  4. 抗體藥物軛合物用於治療有需要的受試者的癌症之用途，其中該癌症係表現CCR7的濾泡性淋巴瘤（FL），其中該抗體藥物軛合物包含式 Ab—(L—(D)m )n 或其藥學上可接受的鹽；其中 Ab係結合人CCR7蛋白的抗體或其抗原結合片段； L係連接子； D係藥物部分； m係從1至8的整數；並且 n係從1至12的整數。
  5. 如請求項1-4中任一項所述之方法、組成物或用途，其中該癌症係復發性或難治性濾泡性淋巴瘤。
  6. 如請求項1-5中任一項所述之方法、組成物或用途，其中該抗體藥物軛合物包含以下式：
    Figure 03_image009
    其中n係約3至約4，並且Ab係抗體，該抗體包含含有SEQ ID NO: 47的胺基酸序列的重鏈，和含有SEQ ID NO: 63的胺基酸序列的輕鏈；或其藥學上可接受的鹽。
  7. 如請求項1-6中任一項所述之方法、組成物或用途，其中該抗體藥物軛合物呈非鹽形式。
  8. 如請求項1-7中任一項所述之方法、組成物或用途，其中將該抗體藥物軛合物或組成物與一種或多種另外的治療性化合物組合投與於該患者。
  9. 如請求項8所述之方法、組成物或用途，其中該一種或多種另外的治療性化合物選自標準護理化學治療劑、共刺激分子或檢查點抑制劑。
  10. 如請求項9所述之方法、組成物或用途，其中該共刺激分子選自OX40、CD2、CD27、CDS、ICAM-1、LFA-1（CD11a/CD18）、ICOS（CD278）、4-1BB（CD137）、GITR、CD30、CD40、BAFFR、HVEM、CD7、LIGHT、NKG2C、SLAMF7、NKp80、CD160、B7-H3、STING或CD83配位基的促效劑。
  11. 如請求項9所述之方法、組成物或用途，其中該檢查點抑制劑選自PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4和/或TGFRβ的抑制劑。
  12. 一種在有需要的受試者中治療或預防癌症之方法，該方法包括向所述受試者投與抗體藥物軛合物，其中該癌症表現CCR7，其中該抗體藥物軛合物包含式 Ab—(L—(D)m )n 或其藥學上可接受的鹽；其中 Ab係結合人CCR7蛋白的抗體或其抗原結合片段； L係連接子； D係藥物部分； m係從1至8的整數；並且 n係從1至12的整數， 其中該抗體藥物軛合物以約0.1 mg/kg至約10 mg/kg投與於所述受試者。
  13. 一種包含抗體藥物軛合物的組成物，用於在有需要的受試者的癌症的治療中使用，其中該癌症表現CCR7，其中該抗體藥物軛合物包含式 Ab—(L—(D)m )n 或其藥學上可接受的鹽；其中 Ab係結合人CCR7蛋白的抗體或其抗原結合片段； L係連接子； D係藥物部分； m係從1至8的整數；並且 n係從1至12的整數， 其中該抗體藥物軛合物以約0.1 mg/kg至約10 mg/kg投與於所述受試者。
  14. 抗體藥物軛合物在製造用於治療有需要的受試者的癌症的藥物中之用途，其中該癌症表現CCR7，其中該抗體藥物軛合物包含式 Ab—(L—(D)m )n 或其藥學上可接受的鹽；其中 Ab係結合人CCR7蛋白的抗體或其抗原結合片段； L係連接子； D係藥物部分； m係從1至8的整數；並且 n係從1至12的整數， 其中該抗體藥物軛合物以約0.1 mg/kg至約10 mg/kg投與於所述受試者。
  15. 抗體藥物軛合物用於治療有需要的受試者的癌症之用途，其中該癌症表現CCR7，其中該抗體藥物軛合物包含式 Ab—(L—(D)m )n 或其藥學上可接受的鹽；其中 Ab係結合人CCR7蛋白的抗體或其抗原結合片段； L係連接子； D係藥物部分； m係從1至8的整數；並且 n係從1至12的整數， 其中該抗體藥物軛合物以約0.1 mg/kg至約10 mg/kg投與於所述受試者。
  16. 如請求項12-15中任一項所述之方法、組成物或用途，其中該抗體藥物軛合物包含以下式：
    Figure 03_image009
    其中n係約3至約4，並且Ab係抗體，該抗體包含含有SEQ ID NO: 47的胺基酸序列的重鏈，和含有SEQ ID NO: 63的胺基酸序列的輕鏈；或其藥學上可接受的鹽。
  17. 如請求項12-16中任一項所述之方法、組成物或用途，其中該抗體藥物軛合物呈非鹽形式。
  18. 如請求項12-17中任一項所述之方法、組成物或用途，其中該癌症選自由以下組成之群組：慢性淋巴球性白血病（CLL）、外周T細胞淋巴瘤（PTCL）例如成人T細胞白血病/淋巴瘤（ATLL）和間變性大細胞淋巴瘤（ALCL）、非何杰金氏淋巴瘤（NHL）例如被套細胞淋巴瘤（MCL）、柏基特氏淋巴瘤、彌漫性大B細胞淋巴瘤（DLBCL）、和濾泡性淋巴瘤（FL）和非小細胞肺癌。
  19. 如請求項12-18中任一項所述之方法、組成物或用途，其中該癌症係復發性或難治性癌症。
  20. 如請求項12-19中任一項所述之方法、組成物或用途，其中該抗體藥物軛合物約每3週一次投與於該受試者。
  21. 如請求項12-20中任一項所述之方法、組成物或用途，其中治療該受試者1個週期、2個週期、3個週期、4個週期或5個週期。
  22. 如請求項12-21中任一項所述之方法、組成物或用途，其中將該抗體藥物軛合物靜脈內投與於該受試者。
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