ES2885854T3 - Proceso para la conjugación de un péptido o proteína con un reactivo que comprende un grupo saliente que incluye una porción de PEG - Google Patents

Proceso para la conjugación de un péptido o proteína con un reactivo que comprende un grupo saliente que incluye una porción de PEG Download PDF

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Abstract

Un reactivo de conjugación capaz de reaccionar con al menos un nucleófilo presente en un péptido o proteína, cuyo reactivo lleva una carga útil que es un agente de diagnóstico, terapéutico o de marcado o un agente de unión para un agente de diagnóstico, terapéutico o de marcado, y cuyo reactivo contiene en al menos un grupo saliente que se pierde al reaccionar con dicho nucleófilo, caracterizado por que dicho grupo saliente incluye una porción -(CH2CH2O)n- en la que n es un número de seis o más, y en donde: a) dicho reactivo de conjugación es de fórmula (Ic), (Ic'), (Id), (Id'), (Ie), (Ie'), (IIa) o (IIIb): **(Ver fórmula)** o D-Q-W-CR4R4'-CR4.L.L' (IIa) D-Q-N H-CO-Ar-CO-(CH2)2-L (Illb) en donde: D representa una carga útil que es un agente de diagnóstico, terapéutico o de marcado o un agente de unión para un agente de diagnóstico, terapéutico o de marcado; Q representa un grupo de enlace; W representa un grupo captador de electrones; A representa una cadena de alquileno o alquenileno C1-5; B representa un enlace o una cadena de alquileno o alquenileno C1-4; Ar representa un arilo opcionalmente sustituido; cada R4 representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo C1-C4; R4' representa un átomo de hidrógeno o R4' y L' juntos representan un enlace; m es de 0 a 4; L es un grupo saliente que incluye una porción -(CH2CH2O)n- en la que n es un número de seis o más; y L' es un grupo saliente que incluye una porción -(CH2CH2O)n- en la que n es un número de seis o más, es un grupo saliente de otra estructura, o R4' y L' juntos representan un enlace; o los dos L de un reactivo de conjugación juntos representan un grupo saliente que incluye una porción - (CH2CH2O)n- en la que n es un número de seis o más; o L y L' juntos representan un grupo saliente que incluye una porción -(CH2CH2O)n- en la que n es un número de seis o más; o b) dicho reactivo de conjugación incluye uno de los siguientes grupos funcionales: **(Ver fórmula)** en el que un L es un grupo saliente que incluye una parte -(CH2CH2O)n- en el que n es un número de seis o más y el otro L es un grupo saliente que incluye una parte -(CH2CH2O)n- en el que n es un número de seis o más o es un grupo saliente de otra estructura; o **(Ver fórmula)** en la que L es un grupo saliente que incluye una porción -(CH2CH2O)n- en el que n es un número de seis o más; y en donde el átomo de nitrógeno de cada anillo de maleimida está unido a un grupo de fórmula D-Q, en donde D y Q son como se han definido anteriormente; y en donde la porción -(CH2CH2O)n- tiene un peso molecular de hasta 5 kDa; y también, en donde dicho grupo saliente es de la fórmula -SP, -OP, -SO2P, -OSO2P, -N+PR2R3, o es un grupo de fórmula -S-P-S-, -O-P-O-, -SO2-P-SO2-, -OSO2-P-OSO2- o - N+R2R3-P-N+R2R3-, en la que P es un grupo que incluye un porción -(CH2CH2O)n- y cada uno de R2 y R3 representa independientemente un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo C1-4 o un grupo P.

Description

DESCRIPCIÓN
Proceso para la conjugación de un péptido o proteína con un reactivo que comprende un grupo saliente que incluye una porción de PEG
Campo de la invención
Esta invención se refiere a un nuevo proceso para la conjugación de proteínas y péptidos, y a nuevos reactivos de conjugación.
Antecedentes de la invención
En los últimos años se ha dedicado mucha investigación a la conjugación de una amplia variedad de cargas útiles, por ejemplo, agentes de diagnóstico, terapéuticos y de etiquetado, a péptidos y proteínas para una amplia gama de aplicaciones. La propia proteína o péptido puede tener propiedades terapéuticas y/o puede ser una proteína de unión.
Los péptidos y las proteínas tienen un uso potencial como agentes terapéuticos y la conjugación es una forma de mejorar sus propiedades. Por ejemplo, monómeros hidrosolubles, polímeros sintéticos, particularmente polialquilenglicoles, se usan ampliamente para conjugar péptidos o proteínas terapéuticamente activos. Se ha demostrado que estos conjugados terapéuticos alteran la farmacocinética favorablemente al prolongar el tiempo de circulación y disminuir las tasas de aclaramiento, disminuir la toxicidad sistémica y, en varios casos, mostrar una mayor eficacia clínica. El proceso de conjugar covalentemente polietilenglicol, PEG, con proteínas se conoce comúnmente como "PEGilación".
Las proteínas de unión, anticuerpos particulares o fragmentos de anticuerpos, se conjugan con frecuencia. La especificidad de las proteínas de unión para marcadores específicos en la superficie de las células y moléculas diana ha llevado a su uso extensivo como agentes de diagnóstico o terapéuticos por derecho propio o como portadores de cargas útiles que pueden incluir agentes de diagnóstico y terapéuticos. Tales proteínas conjugadas con marcadores y grupos informadores, como fluoróforos, radioisótopos y enzimas, encuentran uso en aplicaciones de etiquetado e imagen, mientras que la conjugación con agentes citotóxicos y fármacos de quimioterapia para producir conjugados de anticuerpo-fármaco (ADC) permite la administración dirigida de dichos agentes a tejidos específicos o estructuras, por ejemplo tipos de células particulares, minimizando el impacto en el tejido normal y sano y reduciendo significativamente los efectos secundarios asociados con los tratamientos de quimioterapia. Tales conjugados tienen amplias aplicaciones terapéuticas potenciales en varias áreas de enfermedades, particularmente en el cáncer.
En la bibliografía se han descrito muchos métodos para conjugar proteínas y péptidos. Por ejemplo, el documento WO 95/13312 describe la conjugación mediante un resto sulfona. Probablemente, el proceso más comúnmente utilizado implica el uso de reactivos de conjugación basados en maleimidas. Tales reactivos se describen en muchas publicaciones, por ejemplo el documento WO 2004/060965. Se describe un enfoque alternativo el cual conduce a productos más homogéneos por Liberatore et al, Bioconj. Chem 1990, 1, 36-50, y del Rosario et al, Bioconj. Chem.
1990, 1,51-59, los cuales describen el uso de reactivos que pueden usarse para reticular los enlaces disulfuro en proteínas, que incluyen anticuerpos. El documento WO 2005/007197 describe un proceso para la conjugación de polímeros con proteínas, utilizando reactivos de conjugación novedosos que tienen la capacidad de conjugarse con ambos átomos de azufre derivados de un enlace disulfuro en una proteína para dar nuevos conjugados de tioéter, mientras que el documento WO 2009/047500 describe el uso de los mismos reactivos de conjugación para unirse a las etiquetas de polihistidina unidas a la proteína. El documento WO 2010/010324 describe el uso de reactivos monofuncionales capaces de unirse a un solo nucleófilo en una proteína. Los documentos WO 2013/190292, WO 2014/064424, WO 2014/184564 y WO 2014/064423 describen todos procesos de conjugación usando varios reactivos de conjugación.
La característica común de la mayoría de los procesos de conjugación es que la reacción de conjugación implica la pérdida de un grupo saliente presente en el reactivo de conjugación y la reacción del resto resultante con un nucleófilo presente en la proteína. Los grupos de salida notificados incluyen grupos del tipo -SR, -OR, -SO2R, -OSO2R, -N+R3 , -N+HR2 y -N+H2R, en donde R es alquilo o arilo y halógeno.
Marculescu et al, Chem. Commun. 2014, 50, 7139-7142, desvela reactivos de conjugación de ariloxmaleimida que contienen varios grupos salientes. Entre otros grupos salientes, se desvela un grupo que incluye MeO-(CH2CH2O)2-CH2CH2-. La misma estructura se desvela en la tesis doctoral de Christina Marculescu, "Development of Novel Maleimide Reagents for Protein Modification", University College London, agosto de 2014.
El documento US 2013/338231 A1 desvela compuestos que supuestamente son reactivos útiles para la conjugación de polímeros con proteínas y los conjugados resultantes.
El documento WO 2014/064423 A1 desvela conjugados específicos que contienen auristatinas y una proteína o péptido de unión, y los procesos para prepararlos. También se describen conjugados específicos de fármacos y una proteína o péptido de unión en los que está presente más de una copia del fármaco.
Krakert et al. Physical Chemistry Chemical Physics, 2010, 12, 507-515 se refiere a películas repelentes de proteínas y desvela reactivos de poli(etilenglicol) que incluyen grupos tiol y/o sulfonilo.
El documento WO 2011/077067 A1 desvela conjugados de eritropoyetina con un polímero que se caracterizan porque la eritropoyetina no está glicosilada y está conjugada con dos cadenas de polímero separadas, estando cada una de las cadenas de polímero unidas a la eritropoyetina en dos residuos de aminoácidos.
El documento WO 99/45964 A1 desvela un poli(etilenglicol) sustancialmente soluble en agua activado que tiene un esqueleto de poli(etilenglicol) lineal o ramificado y al menos un extremo unido al esqueleto a través de un enlace hidrolíticamente estable, en donde el extremo es ramificado y tiene grupos reactivos proximales. Los grupos reactivos libres son supuestamente capaces de reaccionar con restos activos en un agente biológicamente activo, tal como una proteína o péptido, formando así conjugados entre el poli(etilenglicol) activado y el agente biológicamente activo. El documento WO 95/13312 A1 desvela un derivado de poli(etilenglicol) que se activa con un resto sulfona para la unión selectiva a restos tiol en moléculas y superficies.
Sorprendentemente, ahora han descubierto que se pueden obtener resultados mejorados reemplazando grupos salientes conocidos en reactivos de conjugación conocidos por grupos salientes que comprenden un número definido de unidades repetidas derivadas de etilenglicol.
Sumario de la invención
La presente invención proporciona reactivos de conjugación capaces de reaccionar con al menos un nucleófilo presente en un péptido o proteína, reactivo que lleva una carga útil que es un agente de diagnóstico, terapéutico o de marcado o un agente de unión para un agente de diagnóstico, terapéutico o de marcado, y reactivo que contiene al menos un grupo saliente que se pierde al reaccionar con dicho nucleófilo, caracterizado por que dicho grupo saliente incluye una porción -(CH2CH2O)n- en la cual n es un número de seis o más, y en donde:
a) dicho reactivo de conjugación es de fórmula (Ic), (Ic'), (Id), (Id'), (Ie), (Ie'), (IIa) o (IIIb):
Figure imgf000003_0001
o
D-Q-W-CR4R4'-CR4 L.L' (IIa)
o
D-Q-NH-CO-Ar-CO-(CH2)2-L (IIIb)
en donde:
D representa una carga útil que es un agente de diagnóstico, terapéutico o de marcado o
un agente de unión para un agente de diagnóstico, terapéutico o de marcado;
Q representa un grupo de enlace;
W representa un grupo captador de electrones;
A representa una cadena de alquileno o alquenileno C1-5;
B representa un enlace o una cadena de alquileno o alquenileno C1-4;
Ar representa un arilo opcionalmente sustituido;
cada R4 representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo C1-C4;
R4' representa un átomo de hidrógeno o R4' y L' juntos representan un enlace;
m es de 0 a 4;
L es un grupo saliente que incluye una porción -(CH2CH2O)n- en la que n es un número de seis o más; y L' es un grupo saliente que incluye una porción -(CH2CH2O V en la que n es un número de seis o más, es un grupo saliente de otra estructura, o R4' y L' juntos representan un enlace; o
los dos L de un reactivo de conjugación juntos representan un grupo saliente que incluye una porción -(CH2CH2O)n- en la que n es un número de seis o más; o
L y L' juntos representan un grupo saliente que incluye una porción -(CH2CH2O V en la que n es un número de seis o más;
o
b) dicho reactivo de conjugación incluye uno de los siguientes grupos funcionales:
Figure imgf000004_0001
en el que un L es un grupo saliente que incluye una parte -(CH2CH2O V en el que n es un número de seis o más y el otro L es un grupo saliente que incluye una parte -(CH2CH2O V en el que n es un número de seis o más o es un grupo saliente de otra estructura; o
Figure imgf000004_0002
en la que L es un grupo saliente que incluye una porción -(CH2CH2O V en el que n es un número de seis o más;
y en donde el átomo de nitrógeno de cada anillo de maleimida está unido a un grupo de fórmula D-Q, en donde D y Q son como se han definido anteriormente;
y en donde la porción -(CH2CH2O V tiene un peso molecular de hasta 5 kDa; y
también, en donde dicho grupo saliente es de la fórmula -SP, -OP, -SO2P, -OSO2P, -N+PR2R3, o es un grupo de fórmula -S-P-S-, -O-P-O-, -SO2-P-SO2-, -OSO2-P-OSO2- o -N+R2R3-P-N+R2R3-, en la que P es un grupo que incluye un porción -(CH2CH2O V y cada uno de R2 y R3 representa independientemente un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo C1-4 o un grupo P.
La invención también proporciona un proceso para la conjugación de un péptido o proteína, que comprende hacer reaccionar dicho péptido o proteína con un reactivo de conjugación como se describe en el presente documento.
En un aspecto, la presente divulgación se refiere a un proceso para la conjugación de un péptido o proteína, que comprende hacer reaccionar dicho péptido o proteína con un reactivo de conjugación capaz de reaccionar con al menos un nucleófilo presente en dicho péptido o proteína, dicho reactivo contiene al menos un grupo saliente que se pierde al reaccionar con dicho nucleófilo; caracterizado por que dicho grupo saliente incluye una porción -(CH2CH2O V en la que n es un número de seis o más.
Reactivos de conjugación capaces de reaccionar con al menos un nucleófilo presente en un péptido o proteína, que contienen al menos un grupo saliente que se pierde al reaccionar con dicho nucleófilo, caracterizado por que dicho grupo saliente incluye una porción -(CH2CH2O)n- en la que también se desvelan es un número de seis o más.
En una realización adicional, la presente divulgación proporciona un proceso para la conjugación de un péptido o proteína, que comprende hacer reaccionar dicho péptido o proteína con un reactivo de conjugación capaz de reaccionar con dos nucleófilos en dicho péptido o proteína, conteniendo dicho reactivo un grupo saliente que se pierde al reaccionar con dichos nucleófilos, que tiene dos puntos de unión dentro del reactivo de conjugación, y que incluye una porción -(CH2CH2O)n1 en la que n1 es un número de dos o más. También se desvelan, reactivos de conjugación capaces de reaccionar con dos nucleófilos presentes en un péptido o proteína, que contienen un grupo saliente que se pierde al reaccionar con dichos nucleófilos, y en el que dicho grupo saliente tiene dos puntos de unión dentro del reactivo de conjugación e incluye una porción -(CH2CH2O)n1- en el que n1 es un número de dos o más.
A lo largo de esta memoria descriptiva, los péptidos y las proteínas se denominan conjuntamente "proteína" por conveniencia, y salvo que el contexto requiera lo contrario, se debe entender que una referencia a "proteína" incluye una referencia tanto a proteínas como a péptidos.
Descripción detallada de la invención
Grupos salientes
La presente invención se basa en el sorprendente hallazgo de que cuando se hace reaccionar un reactivo de conjugación que incluye al menos un grupo saliente, con al menos un nucleófilo presente en una proteína, un grupo que incluye una unidad repetida -(CH2CH2O V en el que n está en al menos 6 o n1 es al menos 2 , actúa como un grupo saliente mejorado en comparación con los grupos salientes conocidos y, donde n es al menos seis, en comparación con grupos salientes similares que tienen menos unidades -(CH2CH2O)- repetidas. El grupo saliente puede incluir, por ejemplo -(CH2CH2O V R 1 donde R1 es un grupo de protección. Puede usarse una amplia gama de grupos de protección. R1 puede ser, por ejemplo un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo, especialmente un grupo alquilo C1-4, particularmente un grupo metilo o un grupo arilo opcionalmente sustituido, por ejemplo un grupo fenilo opcionalmente sustituido, por ejemplo un grupo tolilo. Como alternativa, el grupo de protección puede incluir un grupo funcional tal como un grupo carboxilo o un grupo amina. Tales grupos de protección pueden tener, por ejemplo, la fórmula -CH2CH2CO2H o -CH2CH2NH2 , y pueden prepararse funcionalizando la unidad terminal de una cadena -(CH2CH2O)n-. Como alternativa, en lugar de estar terminado por un grupo de protección, el grupo -(CH2CH2O V o -(CH2CH2O)n1- puede tener dos puntos de unión dentro del reactivo de conjugación de manera que químicamente el equivalente de dos grupos salientes está presente, capaz de reaccionar con dos nucleófilos.
La porción de -(CH2CH2O V o -(CH2CH2O)n1- del grupo saliente se basa en PEG, polietilenglicol. El PEG puede ser de cadena lineal o ramificada y puede derivatizarse o funcionalizarse de cualquier forma. n es un número de 6 o más, por ejemplo 6 , 7, 8 , 9 o 10 o más. Por ejemplo, n puede ser de 6 a 9. n1 es un número de 2 o más, por ejemplo 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9 o 10 o más. Por ejemplo, n1 puede ser al menos 4; o n1 puede ser al menos 5, por ejemplo de 5 a 9; o n1 puede ser al menos 6 , por ejemplo de 6 a 9. No existe un límite superior particular para n o n1. n o n1 pueden ser, por ejemplo, 150 o menos, por ejemplo 120 o menos, por ejemplo 100 o menos. Por ejemplo n puede ser 6 o 7 a 150, por ejemplo de 6 o 7 a 120, mientras que n1 puede ser de 2, 3, 4, 5, 6 o 7 a 150, por ejemplo de 4, 5, 6 o 7 a 150, por ejemplo de 4, 5, 6 o 7 a 120. La porción de PEG -(CH2CH2O V o -(CH2CH2O)n1- de un grupo saliente puede tener, por ejemplo, un peso molecular de 1 a 5 kDa; puede ser por ejemplo 1 kDa, 2 kDa, 3 kDa, 4 kDa o 5 kDa. Si se desea, un grupo saliente puede contener dos o más porciones -(CH2CH2O V o -(CH2CH2O)n1- separadas por uno o más espaciadores.
Un grupo saliente en un reactivo de conjugación de acuerdo con la invención es adecuadamente de fórmula -SP, -OP, -SO2P, -OSO2P o -N+PR2R3, en la que P es un grupo que incluye una porción -(CH2CH2O V y cada uno de R2 y R3 representa independientemente un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo C1-4 o un grupo P. Los grupos salientes -N+PR2R3 pueden prepararse mediante protonación o cuaternización de un grupo -NPR2. Preferentemente, cada uno de R2y R3 representa un grupo alquilo C1-4, especialmente un grupo metilo, o, especialmente, un átomo de hidrógeno. Como alternativa, el reactivo de conjugación puede incluir un grupo de fórmula -S-P-S-; -O-P-O-; -SO2-P-SO2-; -OSO2-P-OSO2-; y -N+R2R3-P-N+R2R3-, en la que P es un grupo que incluye una porción -(CH2CH2O V o -(CH2CH2O)n1-. Como anteriormente, los grupos salientes -N+R2R3-P-N+R2R3- pueden prepararse mediante protonación o cuaternización de un grupo -NPR2-P-NR2. Los grupos específicos de este tipo incluyen -S-(CH2CH2O)n-CH2-CH2-S-, -O-(CH2CH2O)n-CH2-CH2-O-; -SO2-(CH2CH2O)n-CH2-CH2-SO2-; -OSO2-(CH2CH2O)n-CH2-CH2-OSO2-; o -N+R2R3-(CH2CH2O)n-CH2-CH2-N+R2R3-, o los grupos correspondientes que incluyen n1 en lugar de n también pueden incluir grupos del tipo:
Figure imgf000006_0001
o los grupos correspondientes que incluyen ni en lugar de n, donde el grupo -(CH2CH2O)n- o - (CH2CH2O)ni- es transportado por cualquier grupo de enlace adecuado, por ejemplo un grupo alquileno. Estos grupos divalentes son químicamente equivalentes a dos grupos salientes capaces de reaccionar con dos nucleófilos.
Si están presentes dos o más grupos P, cada P puede ser igual o diferente. Preferentemente, el grupo saliente es de fórmula -OSO2-P-OSO2-, por ejemplo -SO2-(CH2.CH2O)ni-CH2-CH2-SO2-, o, especialmente, -SO2P.
P puede incluir por ejemplo un grupo de fórmula -T-(CH2.CH2O)n- en la que T es un enlazador. P puede tener por ejemplo la fórmula -T-(cH2.CH2O)n-OR1. T puede ser por ejemplo un enlace directo, un grupo alquilo, por ejemplo un grupo alquilo C1-4 o un grupo arilo opcionalmente sustituido, especialmente un grupo fenilo opcionalmente sustituido. La presencia de un enlazador T que es un grupo alquilo C1-4 es a menudo conveniente porque la preparación del reactivo de conjugación generalmente implica el uso de un PEG disponible comercialmente, y estos con frecuencia terminan en un grupo que da lugar a un grupo T.
Reactivos de conjugación
Se conocen muchos reactivos de conjugación que pueden usarse para conjugar una carga útil con una proteína, y los nuevos reactivos de conjugación de la invención difieren de estos reactivos conocidos en la naturaleza del grupo o grupos salientes que contienen. Un reactivo de conjugación de acuerdo con la invención debe incluir al menos uno de los grupos salientes de acuerdo con la invención la invención. Puede incluir dos o más grupos salientes. Si están presentes dos o más grupos salientes, estos pueden ser iguales o diferentes. Por ejemplo, un grupo saliente puede ser un grupo saliente de acuerdo con la invención, mientras que otro grupo saliente puede ser un grupo saliente convencional. Si están presentes dos o más grupos salientes de acuerdo con la invención, pueden ser iguales o diferentes, por ejemplo, pueden contener porciones en las que cada n es diferente. Alternativamente, como se ha mencionado anteriormente, un reactivo de conjugación puede contener un solo grupo que es químicamente equivalente a dos grupos salientes y es capaz de reaccionar con dos nucleófilos.
En una realización preferida de la invención, el reactivo de conjugación contiene dos grupos salientes de acuerdo con la invención, o contiene un solo grupo que es químicamente equivalente a dos grupos salientes y es capaz de reaccionar con dos nucleófilos, siendo dicho reactivo capaz de reaccionar con dos grupos tiol formados por la reducción de un enlace disulfuro en una proteína o péptido. El uso de tales reactivos produce un conjugado, puenteando eficazmente el enlace disulfuro en la proteína o péptido.
Un grupo de reactivos se basa en las bis-halo- o bis-tio-maleimidas y derivados de las mismas como se describe en Smith et al, J. Am. Chem. Soc. 2010, 132, 1960-1965, y Schumaker et al, Bioconj. Chem., 2011,22, 132-136. Estos reactivos contienen el grupo funcional:
Figure imgf000007_0001
en el que al menos uno, preferentemente cada uno, L es un grupo saliente de acuerdo la invención. El átomo de nitrógeno del anillo de maleimida puede llevar una carga útil, por ejemplo, un agente de diagnóstico, terapéutico o de marcado, o un agente aglutinante para un agente de diagnóstico, terapéutico o de marcado, por ejemplo uno de la fórmula D-Q mencionada a continuación. Estos reactivos son capaces de tender un puente sobre un enlace disulfuro en una proteína o péptido.
De forma análoga, las maleimidas que contienen un solo grupo saliente L:
Figure imgf000007_0002
se puede usar. De nuevo, el átomo de nitrógeno del anillo de maleimida puede llevar una carga útil, por ejemplo, una de la fórmula D-Q- mencionada a continuación.
En el presente documento se desvelan reactivos de conjugación que contienen el grupo funcional:
Figure imgf000007_0003
“ “ (I)
en el que W representa un grupo captador de electrones, por ejemplo un grupo ceto, un grupo éster -O-CO-, un grupo sulfona -SO2- o un grupo ciano; A representa una cadena de alquileno o alquenileno C1-5; B representa un enlace o una cadena de alquileno o alquenileno C1-4; y cada L representa independientemente un grupo saliente, al menos uno de los cuales, preferentemente ambos, debe ser un grupo saliente de acuerdo con la invención, o ambos L juntos representan un grupo saliente de acuerdo con la invención. Los reactivos de este tipo que usan grupos salientes convencionales se describen en Bioconj. Chem 1990(1), 36-50, Bioconj. Chem 1990(1), 51-59, y J. Am. Chem. Soc.
110, 5211-5212. Cuando los reactivos que contienen tales grupos reaccionan con las proteínas, se pierde un primer grupo saliente L para formar in situ un reactivo de conjugación que contiene un grupo funcional de fórmula:
Figure imgf000007_0004
en la que m es 0 a 4, que reacciona con un primer nucleófilo. A continuación, se pierde el segundo grupo saliente L y se produce la reacción con un segundo nucleófilo. Como alternativa al uso de un reactivo que contiene el grupo funcional I como material de partida, se pueden usar reactivos que contienen el grupo funcional I' como material de partida.
Preferentemente W representa un grupo ceto. Preferentemente A representa -CH2- y B representa un enlace.
Los grupos funcionales particularmente preferidos de fórmula I e I' tienen las fórmulas:
Figure imgf000008_0001
Por ejemplo, el grupo puede ser de la fórmula:
Figure imgf000008_0002
b')
Otro grupo de reactivos de conjugación contiene el grupo funcional:
~W-CR4R4'-CR4L.L' (II)
en la que W tiene el significado y los significados preferidos dados anteriormente, y
cada R4 representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo C1-4, R4' representa un átomo de hidrógeno y cada L representa independientemente un grupo saliente, al menos uno de los cuales, preferentemente ambos, debe ser un grupo saliente de acuerdo con la invención, o ambos L juntos representan un grupo saliente de acuerdo con la invención; o
cada R4 representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo C1-4, L representa un grupo saliente de acuerdo con la presente invención, y R4' y L' juntos representan un enlace.
Los reactivos que contienen el grupo funcional I, I' o II son capaces de tender un puente sobre un enlace disulfuro en una proteína o péptido.
Otro grupo no reivindicado de reactivos de conjugación incluye el grupo funcional:
~W-(CH=CH)p-(CH2)2-L (III)
en la que W tiene el significado y los significados preferidos dados anteriormente y p representa 0 o un número entero de 1 a 4, preferentemente 0. Un reactivo especialmente preferido de este tipo incluye el grupo funcional:
~NH-CO-Ar-CO-(CH2 )2-L (IIIa)
en la que Ar representa un grupo arilo opcionalmente sustituido, especialmente fenilo.
Los reactivos de conjugación de acuerdo con la invención pueden contener más de un grupo funcional para la reacción con una proteína. Por ejemplo, un reactivo puede contener una agrupación funcional de fórmula I o I' en un extremo de la molécula, o cualquier otro grupo funcional que contenga al menos un grupo saliente de acuerdo con la invención, y una o más agrupaciones funcionales adicionales, que contengan un grupo saliente de acuerdo con la invención o ser un grupo funcional convencional capaz de conjugarse con una proteína o cualquier otra molécula, en cualquier otro lugar de la molécula. Tales estructuras se describen en, por ejemplo, Belcheva et al, J. Biomater. Sci Polymer Edn. 9(3), 207-226 y son útiles en la síntesis de conjugados que contienen múltiples proteínas.
Los nuevos reactivos de conjugación de la presente invención se pueden preparar mediante métodos análogos a los métodos conocidos. Por ejemplo, se puede introducir una molécula basada en PEG y que lleve una funcionalidad apropiada en un reactivo de conjugación de la misma manera que se introducen los grupos salientes convencionales. Por ejemplo, se puede introducir un PEG terminado en amino o tiol en un compuesto que contiene un grupo carbonilo usando la reacción de Mannich. Las reacciones específicas se ilustran en los ejemplos que siguen a continuación.
Cargas útiles
Un reactivo de conjugación puede llevar una carga útil, por ejemplo, un agente de marcado, terapéutico o de diagnóstico, o un agente aglutinante para un agente de marcado, terapéutico o de diagnóstico. En este caso, los reactivos que contienen la unidad de fórmula I/I' pueden tener la fórmula (Ic) o (Ic') o, donde W representa un grupo ciano, (Id) o (Id'):
Figure imgf000009_0001
en las cuales Q representa un grupo de enlace y D representa la carga útil, preferentemente un agente de diagnóstico, terapéutico o de marcado, o un agente aglutinante para un agente de diagnóstico, terapéutico o de marcado. Preferentemente D-Q- incluye un fármaco o un polímero o tanto un fármaco como un polímero. Si está presente un fármaco, puede ser, por ejemplo, un fármaco citotóxico, y si está presente un polímero, este es preferentemente polietilenglicol.
Si D representa un agente aglutinante para un agente de diagnóstico, terapéutico o de marcado, la estructura preferida dependerá, por supuesto, de la estructura del agente de diagnóstico, terapéutico o de marcado en el producto finalmente deseado. Por ejemplo, puede estar presente cualquier grupo funcional capaz de reaccionar con el agente de diagnóstico, terapéutico o de marcado. Por ejemplo, pueden estar presentes grupos funcionales tales como -CO2H o un derivado reactivo del mismo, -NH2 o -OH. Los derivados activados de grupos de ácido carboxílico son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, se puede activar un ácido carboxílico mediante el uso de un éster activado tal como un éster de H-hidroxisuccinimida o un haluro de ácido. En una realización preferida, Q es un grupo fenilo opcionalmente sustituido y D es un agente aglutinante para un agente de diagnóstico, terapéutico o de marcado, por ejemplo, un grupo -CO2H, -NH2 u -OH.
Puede usarse cualquier grupo Q de enlace adecuado. En una realización, Q puede ser, por ejemplo, un enlace directo, un grupo alquileno (preferentemente un grupo alquileno C1-10), o un grupo arilo o heteroarilo opcionalmente sustituido, cualquiera de los cuales puede estar terminado o (en el caso de un grupo alquileno) interrumpido por uno o más átomos de oxígeno, átomos de azufre, grupos -NR (en los que R representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo (preferentemente alquilo C1-6), arilo (preferentemente fenilo) o alquil-arilo (preferentemente alquil-fenilo C1-6)), grupo ceto, grupos -O-CO-, grupos -CO-O-, grupos -O-CO-O-, -O-Co -n R-, -NR-CO-O-, -CO-NR- y/o -NR.CO-. Tales grupos arilo y heteroarilo Q forman una realización preferida de la invención. Los grupos arilo adecuados incluyen grupos fenilo y naftilo, mientras que los grupos heteroarilo adecuados incluyen piridina, pirrol, furano, pirano, imidazol, pirazol, oxazol, piridazina, pirimidina y purina. Los grupos de enlace Q especialmente adecuados son heteroarilo o, especialmente, grupos arilo, especialmente grupos fenilo. Cuando D es un grupo de unión, estos pueden contener, por ejemplo, un grupo -CO2 H, -NH2 o -OH como se ha descrito anteriormente. Cuando D es un agente de diagnóstico, terapéutico o de marcado, estos pueden tener un grupo de unión al grupo D, por ejemplo, un grupo que es, o contiene, un grupo -NR.CO- o -CO.NR-, por ejemplo un grupo -NH.CO- o -CO.NH-.
Los grupos específicos D-Q- donde D incluye un grupo de unión incluyen los siguientes:
Figure imgf000009_0002
o
Figure imgf000010_0001
en la que D representa un grupo de unión, por ejemplo -CO2H, -NH2 u -OH, cada uno de m y q representa un número entero de 1 a 6 , por ejemplo 2 o 3, y en el que el anillo de fenilo puede estar sin sustituir o sustituido por, por ejemplo, cualquiera de los sustituyentes mencionados a continuación.
Los sustituyentes que pueden estar presentes en un grupo arilo opcionalmente sustituido, especialmente fenilo o heteroarilo incluyen, por ejemplo, uno o más sustituyentes iguales o diferentes seleccionados entre alquilo (preferentemente alquilo C1-4, especialmente metilo, opcionalmente sustituido con OH o CO2H), -CN, -NO2 , -CO2R, -COH, -CH2OH, -COR, -OR, -OCOR, -OCO2R, -SR, -SOR, -SO2R, -NHCOR, -NRCOR, -NHCO2 R, -NR.CO2R, -NO, -NHOH, -NR.OH, -C=N-NHCOR, -C=N-NR.COR, -N+R3 , -N+H3 , -N+HR2 , -N+H2R, halógeno, por ejemplo flúor o cloro, -C=CR, -C=CR2 y -C=CHR, en las cuales cada R representa independientemente un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo (preferentemente alquilo C1-6), arilo (preferentemente fenilo) o alquil-arilo (preferentemente C1-6). Se prefiere especialmente la presencia de sustituyentes aceptores de electrones. Los sustituyentes preferidos incluyen, por ejemplo, CN, NO2 , -OR, -OCOR, -SR, -NHCOR, -NR.COR, -NHOH y -NR.COR.
En otra realización, un enlazador Q puede contener un grupo degradable, es decir, puede contener un grupo que se rompe en condiciones fisiológicas, separando D de la proteína a la que, en última instancia, se unirá. Como alternativa, Q puede ser un enlazador que no se puede escindir en condiciones fisiológicas. Cuando un enlazador se rompe en condiciones fisiológicas, preferentemente se puede escindir en condiciones intracelulares. Cuando la diana es intracelular, preferentemente el enlazador es sustancialmente insensible a las condiciones extracelulares (es decir, de modo que no se prohíbe la administración a la diana intracelular de una dosis suficiente del agente terapéutico).
Cuando Q contiene un grupo degradable, este es generalmente sensible a las condiciones hidrolíticas, por ejemplo, puede ser un grupo que se degrada a ciertos valores de pH (por ejemplo, condiciones ácidas). Las condiciones hidrolíticas/ácidas se pueden encontrar, por ejemplo, en endosomas o lisosomas. Ejemplos de grupos susceptibles de hidrólisis en condiciones ácidas incluyen hidrazonas, semicarbazonas, tiosemicarbazonas, amidas cis-acotínicas, ortoésteres y cetales. Ejemplos de grupos susceptibles a condiciones hidrolíticas incluyen:
Figure imgf000010_0002
En una realización preferida, el enlazador es o incluye
Figure imgf000010_0003
Por ejemplo, puede ser o incluir:
Figure imgf000011_0001
El enlazador Q también puede ser susceptible de degradación en condiciones reductoras. Por ejemplo, puede contener un grupo disulfuro que se puede escindir al exponerse a agentes reductores biológicos, tales como tioles. Ejemplos de grupos disulfuro incluyen:
Figure imgf000011_0002
en la que R, R', R" y R'" cada uno de es independientemente hidrógeno o alquilo C1-4. En una realización preferida, el enlazador es o incluye
Figure imgf000011_0003
Por ejemplo, puede ser o incluir
Figure imgf000011_0004
El enlazador Q también puede contener un grupo que es susceptible de degradación enzimática, por ejemplo, puede ser susceptible de escisión por una proteasa (por ejemplo, una proteasa lisosómica o endosómica) o peptidasa. Por ejemplo, puede contener un grupo peptidilo que comprende al menos uno, por ejemplo, al menos dos, o al menos tres residuos de aminoácidos (por ejemplo, Phe-Leu, Gly-Phe-Leu-Gly, Val-Ala, Val-Cit, Phe-Lys). Por ejemplo, puede ser o incluir una cadena de aminoácidos que tiene de 1 a 5, por ejemplo 2 a 4, aminoácidos. Otro ejemplo de un grupo susceptible a la degradación enzimática es:
Figure imgf000012_0001
en donde AA representa una secuencia de aminoácidos específica de proteasa, tal como Val-Cit.
En una realización preferida, el enlazador Q es o incluye:
Figure imgf000012_0002
Por ejemplo, puede ser o incluir
Figure imgf000012_0003
El enlazador Q de la presente invención lleva un solo grupo D. El enlazador Q de la presente divulgación puede llevar un solo grupo D, o más de un grupo D. Se pueden incorporar múltiples grupos D mediante el uso de un enlazador de ramificación Q, que puede incorporar, por ejemplo, un aspartato o glutamato o un residuo similar. Esto introduce un elemento de ramificación de fórmula:
Figure imgf000012_0004
donde b es 1, 2 o 3, b = 1 es aspartato y b = 2 es glutamato, y b = 3 representa una realización preferida. Cada uno de los restos acilo en la fórmula anterior se puede acoplar a un grupo D. El grupo de ramificación anterior se puede incorporar un grupo -CO.CH2-, por lo tanto:
Figure imgf000013_0001
Si se desea, el aspartato o glutamato o residuo similar se puede acoplar a mas aspartato y/o glutamato y/o residuos similares, por ejemplo:
Figure imgf000013_0002
etc.
Todos los enlazadores anteriores se pueden unir a un polímero, por ejemplo mediante un enlace amida. Los polímeros se analizan a continuación.
Los reactivos preferidos que incluyen la unidad de fórmula I/I' incluyen:
Figure imgf000013_0003
en la que Q y D tienen los significados dados anteriormente.
Un reactivo particularmente preferido de este tipo tiene la fórmula:
o
Figure imgf000014_0001
en la que Ar representa un arilo opcionalmente sustituido, especialmente fenilo, grupo, por ejemplo uno de los enumerados anteriormente. Por ejemplo, el reactivo, o un precursor del reactivo, puede ser de la fórmula:
Figure imgf000015_0001
en la que D es un grupo -CO2H, -NH2 o -OH, especialmente un grupo -CO2H y cada uno de m y q es un número entero de 1 a 6 , por ejemplo 2 o 3. Preferentemente uno de m y q es 2 y el otro es 3.
Los reactivos anteriores se pueden funcionalizar para transportar cualquier carga útil deseada. Por ejemplo, el grupo NH2 mostrado en las fórmulas (Ig)/(Ig'), el grupo de ácido carboxílico en las fórmulas (Ih)/(Ih') o el grupo hidroxi en las fórmulas (Ii)/(Ii'), o el grupo D correspondiente en la fórmula Ij anterior puede usarse para reaccionar con cualquier grupo adecuado con el fin de adjuntar una carga útil, dando un compuesto en el que el grupo NH2 o el grupo ácido carboxílico se convierte en parte de otro grupo D-Q-; o el grupo arilo/fenilo en las fórmulas (If), (If), (Ig), (Ig'), (Ih), (Ih'), (Ii), (Ii') o (Ij) anteriores pueden llevar un grupo reactivo adecuado adicional, que se puede usar para adjuntar una carga útil. De acuerdo con la invención, la carga útil es un agente de diagnóstico, terapéutico o de marcado o un agente de unión para un agente de diagnóstico, terapéutico o de marcado.
Otros reactivos de conjugación preferidos que llevan una carga útil tienen las fórmulas:
D-Q-W-CR2R2 '-CR2.L.L' (IIa)
o
D-Q-NH-CO-Ar-CO-(CH2)2-L (IIIb)
en la que los diversos sustituyentes tienen los significados y significados preferidos dados anteriormente. También se desvelan reactivos de conjugación que llevan una carga útil que tienen las fórmulas:
D-Q-(CH=CH)p-(CH2 )2-L (IIIa)
en la que los diversos sustituyentes tienen los significados y significados preferidos dados anteriormente.
Cuando D o Q incorpora un polímero, el reactivo de conjugación puede ser uno de los reactivos que tienen la estructura básica descrita en los documentos WO 99/45964, WO 2005/007197 o WO 2010/100430, Preferentemente, un reactivo que contiene polímero de la divulgación contiene un grupo funcional de fórmula I como se describe anteriormente y tiene la fórmula Ii a continuación:
Figure imgf000016_0001
en la que uno de X y X' representa un polímero y el otro representa un átomo de hidrógeno;
Q representa un grupo de enlace;
W representa un grupo captador de electrones, por ejemplo un grupo ceto, un grupo éster -O-CO- o un grupo sulfona -SO2-; o, si X' representa un polímero, X-Q-W juntos pueden representar un grupo de captación de electrones, por ejemplo un grupo ciano;
A representa una cadena de alquileno o alquenileno C1-5;
B representa un enlace o una cadena de alquileno o alquenileno C1-4; y
cada L representa independientemente un grupo saliente según la presente invención, o ambos L juntos representan un grupo saliente de acuerdo con la invención.
Los reactivos de conjugación relacionados de la divulgación tienen la fórmula general (Ii'):
Figure imgf000016_0002
en la que X, X', Q, W, A y L tienen los significados dados para la fórmula general Ii, y m representa de 0 a 4.
Los reactivos de conjugación relacionados de la invención tienen la fórmula general (Ila):
X-Q-W-CR4R4'-CR4 L.L' (Ila)
en la que X, Q y W tienen los significados dados para la fórmula general Ii, y
cada R4 representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo C1-4, R4' representa un átomo de hidrógeno y cada L representa independientemente un grupo saliente, al menos uno de los cuales, preferentemente ambos, debe ser un grupo saliente de acuerdo con la invención, o ambos L juntos representan un grupo saliente de acuerdo con la invención; o
cada R4 representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo C1-4, L representa un grupo saliente de acuerdo con la presente invención, y R4' y L' juntos representan un enlace.
Los significados preferidos para los diversos sustituyentes en las fórmulas Ii, Ii' y IIa son los indicados anteriormente. En las fórmulas Ii y Ii', preferentemente X representa un polímero y X'-Q- representa un átomo de hidrógeno. El enlace al polímero X puede ser por medio de un enlace hidrolíticamente lábil o por un enlace no lábil.
Un reactivo de conjugación polimérico especialmente preferido tiene la fórmula:
Figure imgf000016_0003
o
Figure imgf000017_0001
Otro grupo de reactivos para usar en el proceso desvelado en el presente documento se basa en los descritos en el documento WO 2010/010324. Estos reactivos tienen la fórmula general:
X-[Q-W-(CH=CH)p-(CH2)2-L]q (IIIc)
en la que X, Q, W y L tienen los significados y significados preferidos dados anteriormente; p representa 0 o un número entero de 1 a 4, preferentemente 0; y q representa un número entero de 1 a 8, preferentemente 1. Un reactivo especialmente preferido para usar en el proceso de la invención tiene la fórmula:
X-NH-CO-Ar-CO-(CH2 )2-L (IIId)
En realizaciones preferidas de las fórmulas anteriores, el enlazador Q o el polímero X pueden incorporar una carga útil, por ejemplo, un agente de diagnóstico, terapéutico o de marcado. Particularmente valiosos son los reactivos de las fórmulas anteriores en las que el enlazador Q o el polímero X incorporan una molécula de fármaco: estos reactivos pueden usarse, por ejemplo, en la síntesis de conjugados anticuerpo-fármaco.
Cualquier carga útil deseada, por ejemplo, un agente de diagnóstico, terapéutico o de marcado, o un agente de unión para un agente de diagnóstico, terapéutico o de marcado, puede incluirse en los reactivos de conjugación de acuerdo con la divulgación. En los reactivos de conjugación de acuerdo con la invención puede incluirse cualquier agente de diagnóstico, terapéutico o de marcado, o agente de unión para un agente de diagnóstico, terapéutico o de marcado. Se prefiere la inclusión de una o más moléculas de fármaco, por ejemplo, un agente citotóxico o una toxina. Las auristatinas y los maitansinoides son fármacos citotóxicos típicos. A menudo se prefiere que los conjugados de fármacos, particularmente los conjugados de anticuerpos y fármacos, contengan múltiples copias del fármaco. Los agentes de marcado (que debe entenderse que incluyen agentes de formación de imágenes) pueden incluir, por ejemplo, un radionúclido, un agente fluorescente (por ejemplo, una sonda fluorescente derivatizada con amina tal como 5-d¡met¡lam¡nonaftaleno-1-(A/-(2-am¡noetil))sulfonam¡da-dans¡let¡lend¡am¡na, Oregon Green® 488 cadaverine (número de catálogo 0-10465, Molecular Probes), dansyl cadaverine, N-(2-aminoetil)-4-amino-3,6-disulfo-1,8-naftalimida, sal dipotásica (etilendiamina amarilla lucifer) o etilendiamina rodamina B (número de catálogo L-2424, Molecular Probes), o una sonda fluorescente derivatizada con tiol, por ejemplo BODIPY® FL L-cistina (número de catálogo B-20340, Molecular Probes). Un agente aglutinante puede ser, por ejemplo, un agente quelante, por ejemplo desferrioxamina o biotina, que luego podría usarse para unirse a cualquier otro resto deseado, por ejemplo uno de los mencionados anteriormente, o puede ser un grupo reactivo como se discutió anteriormente.
Nuestra solicitud en trámite GB 1418984 proporciona un conjugado que comprende una proteína, péptido y/o polímero unido a una carga útil que contiene maitansina mediante un enlazador, un reactivo de conjugación útil para formar tales conjugados y un compuesto que contiene maitansina para usar como carga útil. Las cargas útiles y los compuestos que contienen maitansina consisten en al menos dos restos de maitansina unidos entre sí a través de un grupo puente no degradable. Estas maitansinas se pueden usar como cargas útiles en la presente invención, y los reactivos forman un aspecto de la presente invención. Nuestra solicitud en trámite desvela lo siguiente:
"La presente invención proporciona en un primer aspecto un compuesto que contiene maitansina, en el que al menos dos restos de maitansina (D) están unidos entre sí a través de un grupo puente (Bd). El grupo puente (Bd) no es degradable en condiciones fisiológicas. Ventajosamente, el grupo puente (Bd) tiene al menos 3 átomos de carbono de cadena y opcionalmente contiene espaciadores de poli(etilenglicol) además de los 3 átomos de carbono de cadena. Ventajosamente, no hay dos heteroátomos adyacentes entre sí en el grupo puente. Ventajosamente, el grupo puente no incluye el resto: -C(O)-CH(NR1X)-(CH2)b-C(O)-, donde b es 1, 2 o 3, R1 se selecciona entre hidrógeno y alquilo C1 a C6 y X es cualquier grupo. El compuesto que contiene maitansina del primer aspecto, en el que están presentes dos restos de maitansina, puede estar representado por la siguiente fórmula (I):
D-Bd-D (I)
En un segundo aspecto, la invención proporciona un reactivo de conjugación, que contiene un grupo funcional capaz de reaccionar con un péptido o proteína y/o un grupo funcional capaz de reaccionar con un polímero, estando la carga útil unida al grupo o grupos funcionales mediante uno o más enlazadores, caracterizado por que el reactivo de conjugación comprende una carga útil que contiene maitansina que consta de al menos dos restos de maitansina unidos entre sí a través de un grupo puente no degradable, con la condición de que cuando el reactivo de conjugación comprenda un grupo funcional capaz de reaccionar con un péptido o proteína, el enlazador que une la carga útil al grupo funcional capaz de reaccionar con un péptido o proteína es degradable. Cuando el reactivo de conjugación contiene un grupo funcional capaz de reaccionar con al menos un nucleófilo presente en un péptido o proteína, incluyendo el grupo funcional al menos un grupo saliente que se pierde al reaccionar con dicho nucleófilo, la carga útil que contiene maitansina consiste en al menos dos restos de maitansina unidos entre sí a través de un grupo puente no degradable se unen ventajosamente al grupo funcional capaz de reaccionar con al menos un nucleófilo presente en un péptido o proteína mediante un enlazador degradable. El reactivo de conjugación contiene opcionalmente un grupo funcional capaz de reaccionar con al menos un nucleófilo presente en un péptido o proteína, incluyendo el grupo funcional ventajosamente al menos un grupo saliente que se pierde al reaccionar con dicho nucleófilo, caracterizado por que el reactivo de conjugación comprende una carga útil que contiene maitansina que consta de al menos dos restos de maitansina, especialmente dos restos de maitansina, unidos entre sí a través de un grupo puente no degradable, y en el que la carga útil está unida al grupo funcional capaz de reaccionar con al menos un nucleófilo presente en un péptido o proteína a través de un enlazador, especialmente un enlazador degradable. El enlazador es adecuado para unir el grupo puente a una proteína o péptido capaz de unirse a un compañero o diana. Preferentemente, el grupo puente (Bd) de la carga útil que contiene maitansina (D2Bd) está conectado a un enlazador degradable (Lkd) que incluye un grupo degradable que se rompe en condiciones fisiológicas. El grupo degradable puede, por ejemplo, ser sensible a condiciones hidrolíticas, especialmente condiciones ácidas; ser susceptible de degradación en condiciones reductoras; o ser susceptible a la degradación enzimática.
El reactivo de conjugación que contiene maitansina del segundo aspecto, en el que están presentes dos restos de maitansina, puede estar representado por la siguiente fórmula (II):
D2Bd-Lk-F (II)
en la que D2Bd representa una carga útil que contiene maitansina que consta de dos restos de maitansina unidos entre sí a través de un grupo puente no degradable, Lk es un enlazador, especialmente un enlazador degradable (Lkd), y F representa un grupo funcional capaz de reaccionar con un péptido o proteína y/o un grupo funcional capaz de reaccionar con un polímero.
La presente invención proporciona además un proceso para la conjugación de un péptido, proteína y/o polímero, que comprende hacer reaccionar dicho péptido, proteína y/o polímero con un reactivo de conjugación del segundo aspecto de la invención. Cuando el reactivo de conjugación se hace reaccionar con un péptido o polímero, dicho reactivo de conjugación es ventajosamente capaz de reaccionar con al menos un nucleófilo presente en dicho péptido o proteína, conteniendo dicho reactivo ventajosamente al menos un grupo saliente que se pierde al reaccionar con dicho nucleófilo.
La invención también proporciona en un tercer aspecto un conjugado que comprende una proteína, péptido y/o polímero unido a una carga útil que contiene maitansina mediante un enlazador, caracterizado por que la carga útil que contiene maitansina consta de al menos dos restos de maitansina unidos entre sí a un grupo puente no degradable. Cuando el conjugado comprende una proteína o péptido, el enlazador que une la carga útil a la proteína o péptido es ventajosamente degradable. El conjugado del tercer aspecto de la invención puede, por ejemplo, comprender un resto de fármaco que contiene maitansina (D2Bd) enlazado mediante un enlazador (Lk), especialmente un enlazador degradable (Lkd), a una proteína o péptido (Ab) capaz de unirse a un compañero o diana, en el que el resto de fármaco que contiene maitansina (D2Bd) comprende al menos dos restos de maitansina (D) unidos entre sí a través de un grupo puente no degradable (Bd). Un conjugado que contiene maitansina del tercer aspecto de la invención, en el que están presentes dos restos de maitansina (D), puede representarse mediante la siguiente fórmula (III):
D2Bd-Lk-Ab (III)
El enlazador (Lk) es ventajosamente un enlazador degradable (Lkd) que incluye un grupo degradable que se escinde en condiciones fisiológicas separando el resto de fármaco que contiene maitansina (D2Bd) que comprende al menos dos restos de maitansina (D) unidos entre sí a través de un grupo puente (Bd) de la proteína o péptido (Ab) capaz de unirse a un compañero o diana. El grupo degradable puede, por ejemplo, ser sensible a condiciones hidrolíticas, especialmente condiciones ácidas; ser susceptible de degradación en condiciones reductoras; o ser susceptible a la degradación enzimática. El grupo puente no degradable (Bd) no contiene grupos que sean susceptibles de escisión en las mismas condiciones que aquellas en las que se escinde el grupo degradable en el enlazador degradable.
El compuesto que contiene maitansina del primer aspecto de la invención puede, por ejemplo, comprender o consistir en al menos dos restos de maitansina (D), especialmente dos restos de maitansina, unidos entre sí a través de un grupo puente (Bd) que tiene al menos 3 átomos de carbono de cadena, especialmente al menos 7 átomos de carbono de cadena, y unidades opcionales de poli (etilenglicol) además de los átomos de carbono de cadena, con la condición de que no haya dos heteroátomos adyacentes entre sí en el grupo puente y con la condición de que el grupo puente no incluye el resto: -C(O)-CH(NR1X)-(CH2 )b-C(O)-, donde b es 1, 2 o 3, R1 se selecciona entre hidrógeno y alquilo C1 a C6 y X es cualquier grupo. Opcionalmente, el grupo puente incorpora de 0 a 8 grupos carbonilo, especialmente de 2 a 8 grupos carbonilos. El grupo puente incorpora opcionalmente de 0 a 4 dobles enlaces carbono-carbono insaturados; y/o de 0 a 4 grupos arilo o heteroarilo C3 a C10 en la cadena. Opcionalmente, la cadena está intercalada con 0 a 11, especialmente 2 a 11, heteroátomos de cadena seleccionados entre N, O y S, con la condición de que no haya dos heteroátomos adyacentes entre sí. Ventajosamente, una cadena de átomos de carbono en el grupo puente está sustituida con un grupo conector colgante seleccionado de amina, carboxi, alquino, azida, hidroxilo o tiol. Ventajosamente, el grupo puente incluye al menos un enlace amida en la cadena".
El uso de la presente invención permite la conjugación eficaz de una gama muy amplia de cargas útiles. Los rendimientos obtenidos usando tecnologías conocidas pueden ser bajos para algunas cargas útiles. Por ejemplo, la conjugación de proteínas con cargas útiles que no contienen PEG puede ser de bajo rendimiento, y el uso de la presente invención puede dar mayores rendimientos. Además, la conjugación puede ocurrir significativamente más rápidamente y por lo tanto más eficientemente que cuando se utilizan tecnologías conocidas.
Polímeros presentes en los reactivos de conjugación
Como se ha mencionado anteriormente, el reactivo de conjugación puede usarse para conjugar un oligómero o un polímero (denominado conjuntamente en el presente documento "polímero" por conveniencia), especialmente un polímero sintético soluble en agua, particularmente polialquilenglicol, a una proteína. En otras palabras, la carga útil (por ejemplo, D o X en las fórmulas generales anteriores) puede ser, o puede incluir, un polímero. Un polímero puede ser, por ejemplo, un polialquilenglicol, una polivinilpirrolidona, un poliacrilato, por ejemplo, poliacriloil morfolina, un polimetacrilato, un polioxazolina, un alcohol polivinílico, un poliacrilamida o polimethacrilamida, por ejemplo policarboximatacrilamida o un copolímero HPMA. Además, el polímero puede ser un polímero que sea susceptible de degradación enzimática o hidrolítica. Tales polímeros, por ejemplo, incluyen poliésteres, poliacetales, poli(orto ésteres), policarbonatos, poli(imino carbonatos) y poliamidas, tales como poli(aminoácidos). Un polímero puede ser un homopolímero, copolímero aleatorio o un copolímero definido estructuralmente tal como un copolímero de bloque, por ejemplo, puede ser un copolímero de bloque derivado de dos o más óxidos de alquileno, o de poli(óxido de alquileno) y un poliéster, poliacetal, poli(ortoéster) o un poli(aminoácido). Los polímeros polifuncionales que pueden usarse incluyen copolímeros de divinileter-anhídrido maleico y estireno-anhídrido maleico.
También se pueden usar polímeros de origen natural, por ejemplo polisacáridos tales como quitina, dextrano, dextrina, quitosano, almidón, celulosa, glucógeno, poli(ácido sialílico), ácido hialurónico y derivados de los mismos. Puede usarse una proteína como polímero. Esto permite la conjugación con la primera proteína, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, de una segunda proteína, por ejemplo una enzima u otra proteína activa, o una proteína de andamiaje como la avidina que puede unirse a moléculas biotiniladas. Además, si se usa un péptido que contiene una secuencia catalítica, por ejemplo, un sitio aceptor de O-glicano para glicosiltransferasa, permite la incorporación de un sustrato o una diana para la posterior reacción enzimática. También se pueden usar polímeros como el ácido poliglutámico, así como polímeros híbridos derivados de monómeros naturales como sacáridos o aminoácidos y monómeros sintéticos como óxido de etileno o ácido metacrílico.
Si el polímero es un polialquilenglicol, este es preferentemente uno que contiene unidades C2 y/o C3, y es especialmente un polietilenglicol. Un polímero, particularmente un polialquilenglicol, puede contener una sola cadena lineal, o puede tener una morfología ramificada compuesta por muchas cadenas pequeñas o grandes. Los denominados Pluronics son una clase importante de copolímeros de bloque de PEG. Estos se derivan de bloques de óxido de etileno y óxido de propileno. Pueden usarse polialquilenglicoles sustituidos o tapados, por ejemplo metoxipolietilenglicol. El polímero puede ser, por ejemplo, un polímero de peine producido por el método descrito en el documento WO 2004/113394. Por ejemplo, el polímero puede ser un polímero en forma de peine que tiene una fórmula general:
(E)e-(F)f-(G)g
donde:
E, cuando está presente, se puede obtener mediante polimerización adicional de uno o más monómeros olefínicamente insaturados que no son como se definen en F;
F se puede obtener mediante polimerización adicional de una pluralidad de monómeros que son lineales, ramificados o en forma de estrella, sustituidos o no sustituidos, y tienen un resto olefínicamente insaturado; G, cuando está presente, se puede obtener mediante polimerización adicional de uno o más monómeros olefínicamente insaturados que no son como se definen en F;
e y g son un número entero entre 0 y 500;
f es un número entero de 0 a 1 0 0 0 ;
en donde al menos está presente uno de D, E y F.
Un polímero para la conjugación a una proteína puede opcionalmente derivatizarse o funcionalizarse de cualquier forma deseada. En una realización preferida, el polímero lleva, por ejemplo, un agente de diagnóstico, un agente terapéutico o un agente de marcado, por ejemplo uno de los mencionados anteriormente, o un agente aglutinante capaz de unir un agente de diagnóstico, un agente terapéutico o un agente de etiquetado. Los grupos reactivos se pueden unir en el extremo o grupo terminal del polímero, o a lo largo de la cadena del polímero a través de conectores colgantes; en tal caso, el polímero es, por ejemplo, un copolímero de poliacrilamida, polimetacrilamida, poliacrilato, polimetacrilato o anhídrido maleico. Los conjugados multiméricos que contienen más de una molécula biológica pueden generar beneficios sinérgicos y aditivos. Si se desea, el polímero se puede acoplar a un soporte sólido usando métodos convencionales.
El peso molecular óptimo del polímero dependerá, por supuesto, de la aplicación pretendida. Se pueden usar polímeros de cadena larga, por ejemplo, el peso molecular promedio en número puede ser hasta alrededor de 75.000, por ejemplo hasta 50.000, 40.000 o 30.000 g/mol. Por ejemplo, el peso molecular medio numérico puede estar en el intervalo de 500 g/mol a aproximadamente 75.000 g/mol. Sin embargo, oligómeros muy pequeños, que consisten en cadenas de PEG discretas con, por ejemplo, tan solo 2 unidades repetidas, por ejemplo de 2 a 50 unidades repetidas, son útiles para algunas aplicaciones y están presentes en una realización preferida de la invención. Por ejemplo, el polímero puede contener de 2 a 48, por ejemplo pueden usarse de 2 a 36 unidades, por ejemplo de 2 a 24. Pueden usarse, por ejemplo, PEG de cadena lineal o ramificada con 12, 20, 24, 36, 40 o 48 unidades repetidas. Cuando se pretende que la proteína a conjugar deje la circulación y penetre en el tejido, por ejemplo para su uso en el tratamiento de la inflamación causada por malignidad, infección o enfermedad autoinmune, o por traumatismo, puede ser ventajoso usar un polímero de menor peso molecular en el intervalo hasta 30.000 g/mol. Para solicitudes en las que se pretende que el conjugado polímero-proteína permanezca en circulación, puede ser ventajoso usar un polímero de mayor peso molecular, por ejemplo en el intervalo de 20.000 - 75.000 g/mol.
El polímero que se utilizará debe seleccionarse de modo que el conjugado sea soluble en el medio disolvente para su uso previsto. Para solicitudes biológicas, particularmente para aplicaciones de diagnóstico y solicitudes terapéuticas para administración terapéutica clínica a un mamífero, el conjugado será soluble en medio acuoso.
Preferentemente, el polímero es un polímero sintético y preferentemente es un polímero soluble en agua. El uso de un polietilenglicol soluble en agua es particularmente preferido para muchas aplicaciones.
Nuestra solicitud en trámite GB 1418986 se refiere al uso de enlazadores que contienen PEG de una estructura particular, y estos pueden usarse en la presente invención. Esa solicitud desvela lo siguiente:
"La invención proporciona un conjugado de una proteína o péptido con un agente terapéutico, de diagnóstico o de marcado, conteniendo dicho conjugado una porción de unión de proteína o péptido y una porción de polietilenglicol; en la que dicha proteína o porción de enlace peptídico tiene la fórmula general:
Figure imgf000020_0001
en la que Pr representa dicha proteína o péptido, cada Nu representa un nucleófilo presente o unido a la proteína o péptido, cada uno de A y B representa independientemente una cadena de alquileno o alquenileno C1-4, y W representa un grupo de extracción de electrones o un grupo obtenido por reducción de un grupo de extracción de electrones; y en la que dicha porción de polietilenglicol es o incluye una cadena de polietilenglicol colgante que tiene un grupo extremo terminal de fórmula -CH2CH2OR en la que R representa un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo, por ejemplo un grupo alquilo C1-4, especialmente un grupo metilo o un grupo arilo opcionalmente sustituido, especialmente un grupo fenilo, especialmente un grupo fenilo no sustituido.
La invención también proporciona un reactivo de conjugación capaz de reaccionar con una proteína o péptido, e incluye un agente terapéutico, de diagnóstico o de marcado y una porción de polietilenglicol; dicho reactivo de conjugación incluye un grupo de fórmula:
Figure imgf000020_0002
en la que W representa un grupo sustractor de electrones, A y B tienen los significados dados anteriormente, m es de 0 a 4, y cada L representa independientemente un grupo saliente; y en la que dicha porción de polietilenglicol es o incluye una cadena de polietilenglicol colgante que tiene un grupo extremo terminal de fórmula -CH2CH2OR en la que R representa un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo, por ejemplo un grupo alquilo C1-4, especialmente un grupo metilo o un grupo arilo opcionalmente sustituido, especialmente un grupo fenilo, especialmente un grupo fenilo no sustituido.
La invención también proporciona un proceso para la preparación de un conjugado de acuerdo con la invención, que comprende hacer reaccionar una proteína o péptido con un reactivo de conjugación de acuerdo con la invención.
El conjugado de la invención se puede representar esquemáticamente por la fórmula:
Figure imgf000021_0001
(III)
en la que D representa el agente terapéutico, de diagnóstico o de marcado, F' representa el grupo de fórmula I y PEG representa la cadena colgante de polietilenglicol que tiene un grupo extremo terminal de fórmula -CH2CH2OR.
El reactivo de la invención se puede representar esquemáticamente por la fórmula:
Figure imgf000021_0002
en la que D representa el agente terapéutico, de diagnóstico o de marcado, F representa el grupo de fórmula II o II', y PEG representa la cadena colgante de polietilenglicol que tiene un grupo extremo terminal de fórmula -CH2CH2OR. El grupo funcional F es capaz de reaccionar con dos nucleófilos presentes en una proteína o péptido como se explica a continuación.
Una porción de polietilenglicol (PEG) de los conjugados y reactivos de la invención es o incluye una cadena de PEG colgante que tiene un grupo extremo terminal de fórmula -CH2CH2OR en la que R representa un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo, por ejemplo un grupo alquilo C1-4, especialmente un grupo metilo o un grupo arilo opcionalmente sustituido, especialmente un grupo fenilo, especialmente un grupo fenilo no sustituido. Preferentemente, R es un grupo metilo o un átomo de hidrógeno.
El tamaño total de la porción de PEG dependerá, por supuesto, de la aplicación prevista. Para algunas solicitudes, se pueden usar PEG de alto peso molecular, por ejemplo, el peso molecular promedio en número puede ser hasta alrededor de 75.000, por ejemplo hasta 50.000, 40.000 o 30.000 g/mol. Por ejemplo, el peso molecular medio numérico puede estar en el intervalo de 500 g/mol a alrededor de 75.000. Sin embargo, se pueden preferir porciones de PEG más pequeñas para algunas solicitudes.
En una realización preferida, todo el PEG en la porción de PEG está presente en la cadena de PEG colgante. En otra realización, el PEG también puede estar presente en el esqueleto de la molécula, y esto se comenta con más detalle a continuación.
Al igual que con la parte de PEG, el tamaño de la cadena de PEG colgante dependerá de la solicitud prevista. Para algunas solicitudes, se pueden usar cadenas de PEG colgantes de alto peso molecular, por ejemplo, el peso molecular promedio en número puede ser hasta alrededor de 75.000, por ejemplo hasta 50.000, 40.000 o 30.000 g/mol. Por ejemplo, el peso molecular medio numérico puede estar en el intervalo de 500 g/mol a alrededor de 75.000. Sin embargo, para muchas aplicaciones, se pueden usar cadenas de PEG colgantes más pequeñas. Por ejemplo dicha cadena de PEG puede tener un peso molecular de hasta 3.000 g/mol. Sin embargo, oligómeros muy pequeños, que consisten en cadenas de PEG discretas con, por ejemplo, tan solo 2 unidades repetidas, por ejemplo de 2 a 50 unidades repetidas, son útiles para algunas aplicaciones y están presentes en una realización preferida de la invención. La cadena de PEG colgante puede ser de cadena lineal o ramificada. Se pueden usar, por ejemplo, cadenas de PEG, por ejemplo cadenas lineales o ramificadas con 12, 20, 24, 36, 40 o 48 unidades repetidas".
Procesos de conjugación
Los reactivos de conjugación que contienen un grupo saliente de acuerdo con la invención se pueden hacer reaccionar con una proteína o péptido para formar un conjugado, y tal reacción constituye un aspecto adicional de la invención. También se desvela la reacción de un reactivo de conjugación que tiene una de las estructuras I, I', II o III descritas anteriormente (incluidas todas las subestructuras preferidas) con una proteína o péptido para formar un conjugado. El producto inmediato del proceso de conjugación utilizando uno de estos reactivos es un conjugado que contiene un grupo W atractor de electrones. Sin embargo, el proceso de conjugación es reversible en condiciones adecuadas. Esto puede ser deseable para algunas aplicaciones, por ejemplo, cuando se requiere una liberación rápida de la proteína, pero para otras aplicaciones, la liberación rápida de la proteína puede ser indeseable. Por lo tanto, puede ser deseable estabilizar los conjugados mediante la reducción del resto W captador de electrones para dar un resto que evite la liberación de la proteína. Por consiguiente, el proceso descrito anteriormente puede comprender una etapa opcional adicional de reducir el grupo W de extracción de electrones en el conjugado. El uso de un borohidruro, por ejemplo borohidruro sódico, cianoborohidruro sódico, borohidruro potásico o triacetoxiborohidruro sódico, como agente reducto es particularmente preferido. Otros agentes reductores que pueden usarse incluyen, por ejemplo, cloruro de estaño (II), alcóxidos, tales como alcóxido de aluminio e hidruro de litio y aluminio.
Por lo tanto, por ejemplo, un resto W que contiene un grupo ceto puede reducirse a un resto que contiene un grupo CH(OH); se puede obtener un grupo éter CH.OR mediante la reacción de un grupo hidroxi con un agente eterificante; se puede obtener un grupo éster CH.O.C(O)R mediante la reacción de un grupo hidroxi con un agente acilante; un grupo amina CH.NH2, CH.NHR o CH.NR2 se puede preparar a partir de cetona por aminación reductora; o una amida CH.NHC(O)R o CH.N(C(O)R)2 puede formarse por acilación de una amina. Una sulfona se puede reducir a un sulfóxido, sulfuro o tioléter. Un grupo ciano puede reducirse a un grupo amina.
Una característica clave del uso de reactivos de conjugación de fórmula I o II descritos anteriormente es que un grupo saliente de a-metileno y un doble enlace se conjugan de forma cruzada con una función de extracción de electrones que sirve como un resto activador de Michael. Si el grupo saliente es propenso a la eliminación en el reactivo de función cruzada en lugar de al desplazamiento directo y el grupo atractor de electrones es un resto activador adecuado para la reacción de Michael, entonces la bis-alquilación intramolecular secuencial puede ocurrir por reacciones consecutivas de Michael y retro Michael. El resto saliente sirve para enmascarar un doble enlace conjugado latente que no se expone hasta después de que se ha producido la primera alquilación para dar un reactivo de fórmula I' y la bis-alquilación resulta de reacciones secuenciales e interactivas de Michael y retro Michael. Los agentes alquilantes de funcionalidad cruzada pueden contener múltiples enlaces conjugados con el doble enlace o entre el grupo saliente y el grupo atractor de electrones.
Cuando la unión a la proteína se realiza a través de dos átomos de azufre derivados de un enlace disulfuro en la proteína, el proceso puede llevarse a cabo reduciendo el enlace disulfuro in situ, después de lo cual el producto reducido reacciona con el reactivo que tiene una de las estructuras I o II. Preferentemente, el enlace disulfuro se reduce y cualquier exceso de agente reductor se elimina, por ejemplo, mediante intercambio de tampón, antes de introducir el reactivo conjugado. El disulfuro se puede reducir, por ejemplo, con ditiotreitol, mercaptoetanol o triscarboxietilfosfina usando métodos convencionales.
Las reacciones de conjugación se pueden llevar a cabo en condiciones similares a los procesos de conjugación conocidos, incluidas las condiciones desveladas en la técnica anterior mencionada anteriormente. Por ejemplo, cuando se utilizan reactivos de conjugación que tienen una de las estructuras I, I' o II, la reacción de conjugación se puede llevar a cabo en condiciones de reacción similares a las descritas en los documentos WO 2005/007197, WO 2009/047500, WO 2014/064423 y WO 2014/064424. El proceso puede llevarse a cabo, por ejemplo, en un disolvente o una mezcla de disolventes en la que todos los reactivos sean solubles. Por ejemplo, se puede permitir que la proteína reaccione directamente con el reactivo de conjugación de polímero en un medio de reacción acuoso. Este medio de reacción también se puede tamponar, dependiendo de los requisitos de pH del nucleófilo. El pH óptimo para la reacción será generalmente de al menos 4,5, normalmente entre aproximadamente 5,0 y aproximadamente 8,5, preferentemente entre aproximadamente 6,0 y 7,5. Las condiciones óptimas de reacción dependerán, por supuesto, de los reactivos específicos empleados.
Las temperaturas de reacción entre 3-40 °C son generalmente adecuadas cuando se usa un medio de reacción acuoso. Las reacciones llevadas a cabo en medios orgánicos (por ejemplo, THF, acetato de etilo, acetona) se llevan a cabo normalmente a temperaturas hasta la ambiente. En una realización preferida, la reacción se lleva a cabo en tampón acuoso que puede contener una proporción de disolvente orgánico, por ejemplo hasta 20 % en volumen de disolvente orgánico, normalmente de 5 a 20 % en volumen de disolvente orgánico.
La proteína se puede conjugar de forma eficaz utilizando un equivalente estequiométrico o un ligero exceso de reactivo de conjugación. Sin embargo, también es posible realizar la reacción de conjugación con un exceso de reactivo de conjugación, y esto puede ser deseable para algunas proteínas. El exceso de reactivo puede retirarse fácilmente por medios convencionales, por ejemplo, intercambio iónico o cromatografía HPLC, durante la purificación posterior del conjugado.
Por supuesto, es posible conjugar más de un reactivo de conjugación con una proteína, donde la proteína contiene suficientes puntos de unión adecuados. Por ejemplo, en una proteína que contiene dos enlaces disulfuro diferentes, o en una proteína que contiene un enlace disulfuro y también lleva una etiqueta de polihistidina, es posible conjugar dos moléculas del reactivo por molécula de proteína.
Proteínas
Cualquier péptido o proteína deseado que contenga grupos nucleofílicos puede conjugarse usando el proceso de la presente invención. Las proteínas adecuadas incluyen, por ejemplo, péptidos, polipéptidos, anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, enzimas, citocinas, quimiocinas, receptores, factores sanguíneos, hormonas peptídicas, toxina, proteínas de transcripción o proteínas multiméricas.
A continuación se dan algunas proteínas específicas que se pueden conjugar usando la presente invención. Las enzimas incluyen enzimas específicas de carbohidratos, enzimas proteolíticas y similares, por ejemplo las oxidoreductasas, transferasas, hidrolasas, liasas, isomerases y ligasas desvelads por US 4.179.337. Las enzimas específicas de interés incluyen asparaginasa, arginasa, adenosina desaminasa, superóxido dismutasa, catalasa, quimiotripsina, lipasa, uricasa, bilirrubina oxidasa, glucosa oxidasa, glucuronidasa, galactosidasa, glucocerbrosidasa, glucuronidasa y glutaminasa.
Las proteínas sanguíneas incluyen albúmina, transferrina, Factor VII, Factor VIII o Factor IX, factor von Willebrand, insulina, ACTH, gluágeno, somatostatina, somatotropinas, timosina, hormona paratiroidea, hormonas pigmentarias, somatomedinas,, eritropoyetina, hormona luteinizante, factores de liberación hipotalámicos, hormonas antidiuréticas, prolactina, interleucinas, interferones, por ejemplo IFN-a o IFN-p, factores estimulantes de colonias, hemoglobina, citocinas, anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, gonadotropina coriónica, hormona estimulante de folículos, hormona estimulante de la tiroides y activador del plasminógeno tisular.
Otras proteínas de interés son las proteínas alergénicas desveladas por Dreborg et al Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Syst. (1990) 6 315-365 tienen una alergenicidad reducida cuando se conjugan con un polímero tal como poli(óxido de alquileno) y, en consecuencia, son adecuados para su uso como inductores de tolerancia. Entre los alérgenos desvelados se encuentran el antígeno E de ambrosía, el veneno de abeja, el alérgeno de ácaros y similares.
Glicopolipéptidos, tales como inmunoglobulinas,, ovoalbúmina, lipasa, glucocerebrosidasa, lectinas, activador del plasminógeno tisular e interleucinas glicosiladas, los interferones y los factores estimulantes de colonias son de interés, al igual que las inmunoglobulinas, tales como IgG, IgE, IgM, IgA, IgD y fragmentos de los mismos.
Son de particular interés proteínas de unión a ligandos y receptores y anticuerpos y fragmentos de anticuerpos que se utilizan en medicina clínica con fines diagnósticos y terapéuticos. La proteína de unión / anticuerpo puede conjugarse con un agente de diagnóstico, terapéutico o de marcado, por ejemplo, un radioisótopo o un fármaco citotóxico/antiinfeccioso. Se prefiere especialmente el uso de la invención en la preparación de conjugados anticuerpofármaco donde el fármaco es un fármaco citotóxico, por ejemplo, una auristatina o maitansinoide.
La proteína puede derivatizarse o funcionalizarse si se desea. En particular, antes de la conjugación, la proteína, por ejemplo una proteína nativa, puede haber reaccionado con varios grupos bloqueantes para proteger a los grupos sensibles de la misma; o puede haber sido conjugado previamente con uno o más polímeros u otras moléculas, ya sea usando el proceso de esta invención o usando un proceso alternativo. En una realización de la invención, contiene una etiqueta de polihistidina, que puede ser dirigida por el reactivo de conjugación de acuerdo con la invención.
En el aspecto de la divulgación en el que el reactivo de conjugación es capaz de reaccionar con dos nucleófilos presentes en un péptido o proteína, el reactivo puede definirse como en las cláusulas siguientes.1
1. Un reactivo de conjugación que es capaz de reaccionar con dos nucleófilos presentes en un péptido o proteína, que contiene un grupo saliente que se pierde al reaccionar con dichos nucleófilos, y en el que dicho grupo saliente tiene dos puntos de unión dentro del reactivo de conjugación e incluye un porción -(CH2CH2O)n1 en la que n1 es un número de dos o más.
2. Un reactivo de conjugación como se define en la cláusula 1, en la que n1 es de 2 a 5, o de 5 a 9.
3. Un reactivo de conjugación como se define en la cláusula 1 o en la cláusula 2, en el que la porción -(CH2CH2O)n1-tiene un peso molecular de hasta 5 kDa.
4. Un reactivo como se define en cualquiera de las cláusulas anteriores, en la que dicho grupo saliente es de fórmula -S-P-S-, -O-P-O-, -SO2-P-SO2-, -OSO2-P-OSO2- o -N+R2R3-P-N+R2R3-, en la que P es un grupo que incluye una porción -(CH2CH2O)n1- y cada uno de R2 y R3 representa independientemente un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo C1-4 o un grupo P.
5. Un reactivo como se define en cualquiera de las cláusulas 1 a 4, en la que dicho grupo saliente es -S-(CH2CH2O)n1-(CH2CH2)-S-, -O-(CH2CH2O)n1-(CH2CH2)-O-, -SO2-(CH2CH2O)n1-(CH2CH2)-SO2-, -OSO2-(CH2CH2O)n1-(CH2CH2 )-OSO2-, -N+R2R3-(CH2CH2O)n1-(CH2CH2 )-N+R2R3-, o uno de los grupos de fórmula
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donde R1 es un grupo de protección y cada uno de R2 y R3 representa independientemente un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo C1-4.
6. Un reactivo como se define en la cláusula 5, en la que dicho grupo saliente es -SO2-(CH2CH2O)n-(CH2CH2)-SO2-
7. Un reactivo como se define en la cláusula 5, en la que R1 representa un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo C1-4, un grupo arilo opcionalmente sustituido o un grupo de fórmula -CH2CH2CO2H o -CH2CH2NH2.
8. Un reactivo como se define en cualquiera de las cláusulas anteriores, que lleva una carga útil que es un agente de diagnóstico, terapéutico o de marcado o un agente de unión para un agente de diagnóstico, terapéutico o de marcado.
9. Un reactivo como se define en cualquiera de las cláusulas 1 a 8 , que contiene el grupo funcional I, I', II o III:
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en la que W representa un grupo captador de electrones; A representa una cadena de alquileno o alquenileno C1-5 ; B representa un enlace o una cadena de alquileno o alquenileno C1-4; y ambos L juntos representan un grupo saliente que incluye una porción -(CH2CH2O)n1- en la que n1 es un número de dos o más; o
~W-CR4R4'-CR4 L.L' (II)
en la que W tiene el significado dado para la fórmula general I, y (i) cada R4 representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo C1-4, R4' representa un átomo de hidrógeno, y L y L' juntos representan un grupo saliente que incluye una porción -(CH2CH2O)n1- en la que n es un número de dos o más.
10. Un reactivo como se define en la cláusula 9 que tiene la fórmula general:
Figure imgf000024_0003
o
D-Q-W-CR2R2'-CR2.L.L' (IIa)
en la que Q representa un grupo de enlace y D representa una carga útil que es un agente de diagnóstico, terapéutico o de marcado o un agente de enlace para un agente de diagnóstico, terapéutico o de marcado. 11. Un reactivo como se define en la cláusula 10, que contiene el grupo funcional:
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en la que Q representa un grupo de enlace y D representa una carga útil que es un agente de diagnóstico, terapéutico o de marcado o un agente de enlace para un agente de diagnóstico, terapéutico o de marcado. 13. Un reactivo como se define en la cláusula 10 o la cláusula 12, en la que D-Q incluye un fármaco o un polímero o tanto un fármaco como un polímero.
14. Un reactivo como se define en la cláusula 13, en la que el fármaco, si está presente, es un fármaco citotóxico, y el polímero, si está presente, es polietilenglicol.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 muestra los resultados del Ejemplo 17.
La figura 2 muestra los resultados del Ejemplo 18.
La figura 3 muestra los resultados del Ejemplo 19.
La figura 4 muestra los resultados del Ejemplo 20.
Las figuras 5, 6 y 7 muestran los resultados del Ejemplo 21.
La figura 8 muestra los resultados del Ejemplo 22.
La figura 9 muestra los resultados del Ejemplo 25.
La Figura 10 muestra los resultados del Ejemplo 49 obtenidos después de 2 horas de tiempo de reacción.
La Figura 11 muestra los resultados del Ejemplo 49 obtenidos después de 4 horas de tiempo de reacción.
Los siguientes Ejemplos ilustran la invención.
Ejemplo 1: Síntesis de un reactivo de conjugación 2 que comprende 7 unidades de repetición de grupos salientes de etilenglicol.
Etapa 1: Síntesis del compuesto 1.
Figure imgf000026_0001
A una solución agitada de ácido 4-[2,2-bis[(p-tolilsulfonil)-metil]acetil]benzoico (1,50 g, Nature Protocols, 2006, 1(54), 2241-2252) en dimetilformamida (DMF, 70 ml) se le añadieron alfa-metoxi-omega-mercapto hepta(etilenglicol) (3,20 g, Iris Biotech) y trietilamina (2,50 ml). La mezcla de reacción resultante se agitó en una atmósfera de nitrógeno inerte a temperatura ambiente. Después de 19 h, los volátiles se retiraron al vacío. El residuo resultante se disolvió en agua (2,4 ml) y se purificó por cromatografía en columna C18 de fase inversa eluyendo con tampón A (v/v): agua:acetonitrilo al 5 %:ácido trifluoroacético al 0,05 % y tampón B (v/v): acetonitrilo:ácido trifluoroacético al 0,05 % (100:0 v/v a 0:100 v/v). El disolvente orgánico se retiró al vacío y el disolvente acuoso se retiró por liofilización para dar el compuesto 1, ácido 4-[2,2-bis[alfa-metoxi-omega-tio-hepta(etilenglicol)]acetil]-benzoico en forma de un aceite incolor transparente, espeso (1,77 g, 66 %) m/z [M+H+] 901.
Etapa 2: Síntesis del reactivo 2.
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A una solución agitada de 1 (1,32 g) en metanol:agua (18 ml, 9:1 v/v) a temperatura ambiente se le añadió Oxone® (2,70 g). Después de 2,5 h, los volátiles se retiraron al vacío y el agua se retiró azeotrópicamente con acetonitrilo (2 x 15 ml). El residuo resultante se disolvió en diclorometano (3 x 10 ml), se filtró a través de una columna de sulfato de magnesio y se lavó con diclorometano (2 x 7 ml). El eluyente y los lavados se combinaron y los volátiles se retiraron al vacío para dar un aceite espeso, de color amarillo pálido transparente 1,29 g, 92%. Una porción del residuo (700 mg) se disolvió en agua:acetonitrilo (1,50 ml, 3:1 v/v), y se purificó por cromatografía en columna C18 de fase inversa eluyendo con tampón A (v/v): agua:acetonitrilo al 5 %:ácido trifluoroacético al 0,05 % y tampón B (v/v): acetonitrilo:ácido trifluoroacético al 0,05% (100:0 v/v a 0:100 v/v). El disolvente orgánico se retiró al vacío y el disolvente acuoso se retiró por liofilización para dar el reactivo 2, ácido 4-[2,2-bis[alfa-metoxi-omega-sulfonil hepta(etilenglicol)]acetil]benzoico en forma de un aceite espeso, incoloro, transparente (524 mg, 68 %) m/z [M+H+] 965.
Ejemplo 2: Síntesis de un reactivo de PEGilación 3 que comprende 7 grupos salientes de etilenglicol de unidades repetidas y un PEG de 10 kDa.
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Una solución agitada del reactivo 2 (14 mg) en DMF (600 pl) se enfrió a 0 °C en una atmósfera de argón y se añadieron hexafluorofosfato de 3-óxido de 1-[bis(dimetilamino)metileno]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]piridinio (HATU) (5,5 mg) y N-metilmorfolina (NMM) (1,5 pl). La solución se agitó durante 0,5 h a 0 °C cuando se añadió una solución de H2N-PEG-OMe de 10 kDa (132 mg) en diclorometano (600 pl). La solución resultante se agitó durante 5 min a 0 °C antes de la adición de HATU (5,5 mg) y NMM (1,5 pl) adicionales. La solución de reacción se dejó en agitación a 0 °C durante 2 h antes de calentarse a temperatura ambiente. Después de 22 h, los volátiles se retiraron al vacío. El residuo resultante se disolvió en agua y acetonitrilo (v/v; 1/1, 2,0 ml), y se purificó por cromatografía en columna C18 de fase inversa eluyendo con tampón A (v/v): agua:acetonitrilo al 5 %:ácido trifluoroacético al 0,05 % y tampón B (v/v): acetonitrilo:ácido trifluoroacético al 0,05% (100:0 v/v a 0:100 v/v). El disolvente orgánico se retiró al vacío y el disolvente acuoso se retiró por liofilización para dar el reactivo 3 bis-mPEG(7u)sulfona-propanoil-benzamida-PEG(10 kDa)OMe en forma de un polvo de color blanco (72 mg, 53 %). RMN 1H (600 MHz, MeOH-54 ) 3,35 (6H), 3,36 (3H), 3,40 (4H), 3,46-3,59 (10H), 3,56-3,70 (1065H, m, PEG), 3,71-3,77 (7H), 3,85-3,91 (4H), 4,76 (1H), 8,00 (2H), 8,18 (2H).
Ejemplo 3: Síntesis de un reactivo de conjugación fluorescente 4 que comprende 7 unidades de repetición de grupos salientes de etilenglicol y un colorante rodamina B
Figure imgf000027_0001
El reactivo 2 (38 mg) y la lisamina rodamina B etilendiamina (20 mg, Invitrogen) se disolvieron en 1,5 ml de DMF anhidra y se enfriaron a 0 °C. Se añadió HATU (15 mg) y la solución se agitó durante 2 min antes de la adición de NMM (8,7 |jl). La mezcla de reacción se agitó durante 2 h a 0 °C. La reacción en bruto se concentró parcialmente a alto vacío durante 3 h, después se purificó por cromatografía en columna C18 de fase inversa eluyendo con tampón A (v/v): agua: acetonitrilo al 5 %:ácido trifluoroacético al 0,05 % y tampón B (v/v): acetonitrilo:ácido trifluoroacético al 0,05 % (100:0 v/v a 0:100 v/v). El disolvente orgánico se retiró al vacío y el disolvente acuoso se retiró por liofilización para dar el reactivo 4 , bis-mPEG(7u)sulfona-propanoil-benzamida-rodamina en forma de un sólido de color púrpura (43 mg, 69 %). m/z [M+H]+ (1549, 80 %), [M+2H]2+ (783, 100 %). RMN 1H (600 MHz; MeOH-54 ) 1,45 (9H, s), 2,40-2,45 (8H, m), 3,40-3,46 (2H, m), 3,52-3,66 (m, PEG y CH2-Ts), 4,27 (1H, c), 8,01 (2H, d), 8,08 (1H, dd), 8,15 (2H, d), 8,66 (1H, d).
Ejemplo 4: Síntesis de un reactivo de conjugación 5 que comprende 7 grupos salientes de etilenglicol de unidades repetidas y una carga útil citotóxica de auristatina.
Figure imgf000027_0002
A la sal TFA de la sal val-cit-PAB-MMAE que tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000027_0003
(25,0 mg) se le añadió una solución de reactivo 2 (15,6 mg) en DMF (1,5 ml) y se agitó en una atmósfera de nitrógeno inerte a temperatura ambiente durante 5 min. La mezcla se enfrió a 0 °C y se añadieron alícuotas de HATU (6,1 mg) y NMM (1,8 j l ) cada 20 min para un total de 5 adiciones. Después de 1,5 h, la mezcla de reacción se calentó a temperatura ambiente. Después de 2 h, los volátiles se retiraron al vacío. El residuo resultante se disolvió en agua y acetonitrilo (v/v; 1/1, 0,6 ml), y se purificó por cromatografía en columna C18 de fase inversa eluyendo con tampón A (v/v): agua:acetonitrilo al 5 %:ácido trifluoroacético al 0,05 % y tampón B (v/v): acetonitrilo:ácido trifluoroacético al 0,05 % (100:0 v/v a 0:100 v/v). El disolvente orgánico se retiró al vacío y el disolvente acuoso se retiró por liofilización para dar el reactivo 5, bis-mPEG(7u)sulfona-propanoil-benzamida-val-cit-PAB-MMAE en forma de un polvo de color blanco (22,4 mg, 68 %) m/z [M+2H2+] 1035.
Ejemplo 5: Síntesis de un reactivo de conjugación 6 que comprende 7 unidades de repetición de grupos salientes de etilenglicol y una carga útil citotóxica de auristatina
Figure imgf000028_0001
Etapa 1: Síntesis del compuesto 7.
Figure imgf000028_0002
Se prepararon soluciones madre de HATU (394 mg) en DMF (4 ml) y NMM (114 j l) en DMF (4 ml). A una solución de DMF (1o ml) del reactivo 2 (250 mg) se le añadió H2N-dPEG-(24u)-(CO2*Bu) (405 mg). La mezcla se diluyó con DMF (5 ml) y se agitó en una atmósfera de nitrógeno inerte a temperatura ambiente durante 5 min. La mezcla se enfrió a 0 °C y se añadieron alícuotas de HATU (1 ml) y NMM (1 ml) cada 10 min para un total de 4 adiciones. Después de 40 min la mezcla de reacción se calentó a temperatura ambiente. Después de 2,5 h, los volátiles se retiraron al vacío. El residuo resultante se disolvió en agua (2 ml), y el producto se aisló por cromatografía en columna C18 de fase inversa eluyendo con tampón A (v/v): agua:acetonitrilo al 5 %:ácido trifluoroacético al 0,05 % y tampón B (v/v): acetonitrilo:ácido trifluoroacético al 0,05% (100:0 v/v a 0:100 v/v), el disolvente orgánico se retiró al vacío y el disolvente acuoso se retiró por liofilización para dar el compuesto 7 , bis-mPEG(7u)sulfona-propanoil-benzamida-PEG(24u)-‘butil éster en forma de un aceite espeso, de color amarillo pálido, transparente (422 mg, 76 %) m/z [M-(tBu)+3H3+] 698,46 Da.
Etapa 2: Síntesis del compuesto 8.
Figure imgf000028_0003
El reactivo 7 (382 mg) se disolvió en ácido fórmico (5 ml). La mezcla de reacción se agitó en una atmósfera de nitrógeno inerte a temperatura ambiente durante 1 h. El ácido fórmico se retiró por liofilización. El sólido resultante se disolvió en agua (1 ml), y el producto se aisló por cromatografía en columna C18 de fase inversa eluyendo con tampón A (v/v): agua:acetonitrilo al 5%:ácido trifluoroacético al 0,05% y tampón B (v/v): acetonitrilo:ácido trifluoroacético al 0,05 % (100:0 v/v a 0:100 v/v), el disolvente orgánico se retiró al vacío y el disolvente acuoso se retiró por liofilización para dar el compuesto 8, ácido bis-mPEG(7u)sulfona-propanoil-benzamida-PEG(24u) en forma de un sólido de color blanco (194 mg, 53 %) m/z [M+3H3+] 698,33 Da.
Etapa 3: Síntesis del reactivo 6.
El reactivo 8 (15 mg) se disolvió en DMF (0,2 ml) y se añadió sal val-cit-PAB-MMAE.TFA (11 mg) en DMF (0,2 ml). La mezcla se enfrió a 0 °C y se agitó en una atmósfera inerte. Se añadieron de manera sucesiva HATU (2,7 mg) y NMM (0,7 mg) y la mezcla de reacción se dejó en agitación a 0 °C. Se añadieron cantidades adicionales de HATU (2,7 mg) y NMM (0,4 mg) cada 20 min para un total de 5 adiciones y la mezcla de reacción se agitó a 0 °C. Después de 1 h 40 min, la reacción se enfrió a -20 °C durante 16 h. La solución de reacción se inactivó con agua (0,4 ml) y se purificó por cromatografía en columna C18 de fase inversa eluyendo con tampón A (v/v): agua:acetonitrilo al 5 %:ácido trifluoroacético al 0,05% y tampón B (v/v): acetonitrilo:ácido trifluoroacético al 0,05% (100:0 v/v a 0:100 v/v). El disolvente orgánico se retiró al vacío y el disolvente acuoso se retiró por liofilización para dar el reactivo 6 , bismPEG(7u)sulfona-propanoil-benzamida-PEG(24u)-val-cit-PAB-MMAE en forma de un aceite espeso, incoloro, transparente (7,9 mg, 34 %) m/z [M+2H]2+ 1599,98.
Ejemplo 6: Síntesis de un reactivo de conjugación 9 que comprende 7 unidades repetidas de grupos salientes de etilenglicol y una carga útil citotóxica de maitansinoide
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A una solución agitada del val-ala-PAB-AHX-DM1 que tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000029_0002
(5,2 mg) en DMF anhidra (400 j l) se añadió reactivo 2 (6 mg) y se agitó durante 5 min a 0 °C. Se añadieron de manera sucesiva HATU (2,62 mg) y n Mm (0,44 mg) y la mezcla de reacción se dejó en agitación a 0 °C. Después de 20 min, se añadió una cantidad adicional de HATU (2,62 mg) y NMM (0,44 mg) y la mezcla de reacción se agitó a 0 °C. Después de 2,5 h, la reacción se enfrió a -20 °C durante 16 h. La solución de reacción se concentró al vacío y después se purificó por cromatografía en columna C18 de fase inversa eluyendo con tampón A (v/v): agua:acetonitrilo al 5 %:ácido trifluoroacético al 0,05 % y tampón B (v/v): acetonitrilo:ácido trifluoroacético al 0,05 % (100:0 v/v a 0:100 v/v). El disolvente orgánico se retiró al vacío y el disolvente acuoso se retiró por liofilización para dar el reactivo 9, bismPEG(7u)sulfona-propanoil-benzamida-val-ala-PAB-AHX-DMl en forma de un aceite incoloro, transparente (6,5 mg, 74 %) m/z [M+H+] 2030.
Ejemplo 7: Síntesis de un reactivo de conjugación 10 que comprende 7 unidades repetidas de grupos salientes de etilenglicol y una carga útil citotóxica de maitansinoide
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A una solución agitada de val-ala-PAB-AHX-DM1 (5,0 mg) en DMF anhidra (400 j l) se le añadió reactivo 8 (13 mg) y se agitó durante 5 min a 0 °C. Se añadieron de manera sucesiva HATU (2,62 mg) y NMM (0,44 mg) y la mezcla de reacción se dejó en agitación a 0 °C. Después de 20 min, se añadió una cantidad adicional de HATU (2,62 mg) y NMM (0,44 mg) y la mezcla de reacción se agitó a 0 °C. Después de 2,5 h, la reacción se enfrió a -20 °C durante 16 h. La solución de reacción se concentró al vacío y después se purificó por cromatografía en columna C18 de fase inversa eluyendo con tampón A (v/v): agua:acetonitrilo al 5 %:ácido trifluoroacético al 0,05% y tampón B (v/v): acetonitrilo:ácido trifluoroacético al 0,05% (100:0 v/v a 0:100 v/v). El disolvente orgánico se retiró al vacío y el disolvente acuoso se retiró por liofilización para dar el reactivo 10, bis-mPEG(7u)sulfona-propanoil-benzamida-PEG(24u)-val-ala-PAB-AHX-DM1 en forma de un aceite espeso de color amarillo (5,6 mg, 41 %) m/z [M-OH+H]2+ 1571,5.
Ejemplo 8: Síntesis de los reactivos de conjugación 12, 13, 14 y 15 que comprenden 2 unidades de repetición, 12 unidades de repetición, grupos salientes de etilenglicol polimérico de 1 kDa, 2 kDa o 5 kDa respectivamente y una carga útil citotóxica de maitansinoide.
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Reactivos de maitansanoides bis-mPEG(12u)sulfona-propanoil-benzamida-PEG(24u)-val-ala-PAB-AHX-DM1 12, bismPEG(1 kDa)sulfona-propanoil-benzamida-PEG(24u)-val-ala-PAB-AHX-DM1 13, bis-mPEG(2 kDa)sulfonapropanoil-benzamida-PEG(24u)-val-ala-PAB-AHX-DM1 14 y bis-mPEG(5 kDa)sulfona-propanoil-benzamida-PEG(24u)-val-ala-PAB-AHX-DM1 15 se sintetizaron de manera análoga como se describe para el reactivo 10 en el Ejemplo 7, usando los tioles 2-(2-metoxietoxi)etanotiol, alfa-metoxi-omega-mercapto dodeca(etilenglicol), alfa-metoxiomega-mercapto poli(etilenglicol 1 kDa), alfa-metoxi-omega-mercapto poli(etilenglicol 2 kDa) y alfa-metoxi-omegamercapto poli(etilenglicol 5 kDa) respectivamente en lugar de alfa-metoxi-omega-mercapto hepta(etilenglicol) para la síntesis del compuesto 1 en el Ejemplo 1.
Ejemplo 9: Síntesis de los reactivos de conjugación 17, 18, 19 y 20 que comprenden 2 unidades de repetición, 12 unidades de repetición, grupos salientes de etilenglicol polimérico de 1 kDa, 2 kDa o 5 kDa respectivamente y una carga útil citotóxica de auristatina.
Figure imgf000031_0001
Reactivos de auristatina bis-mPEG (12u) sulfona-propanoil-benzamida-PEG (24u) -val-cit-PAB-MMAE 17, bismPEG(1 kDa)sulfona-propanoil-benzamida-PEG(24u)-val-cit-PAB-MMAE 18, bis-mPEG(2 kDa)sulfona-propanoilbenzamida-PEG(24u)-val-cit-PAB-MMAE 19 y bis-mPEG(5 kDa)sulfona-propanoil-benzamida-PEG(24u)-val-cit-PAB-MMAE 20 se sintetizaron de una manera análoga como se describe para el reactivo 6 en el Ejemplo 5, usando los tioles 2-(2-metoxietoxi)etanotiol, alfa-metoxi-omega-mercapto dodeca(etilenglicol), alfa-metoxi-omega-mercapto poli(etilenglicol 1 kDa), alfa-metoxi-omega-mercapto poli(etilenglicol 2 kDa) y alfa-metoxi-omega-mercapto poli(etilenglicol 5 kDa) respectivamente en lugar de alfa-metoxi-omega-mercapto hepta(etilenglicol) para la síntesis del compuesto 1 en el Ejemplo 1.
Ejemplo 10: Síntesis del reactivo de conjugación 21 que comprende una carga útil citotóxica de maitansinoide
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Etapa 1: Síntesis del compuesto 22.
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Una solución de Fmoc-L-Glu-(OtBu)-OH (36 mg) en DMF (2 ml) se enfrió a 0 °C en una atmósfera de argón y se añadió hexafluorofosfato de (benzotriazol-1-iloxi)tris-(dimetilamino)fosfonio (BOP) (41 mg), seguido de NH2-PEG(24u)-OMe (100 mg) y N,N-diisopropiletilamina (19 jl). La solución se dejó calentar a temperatura ambiente y después de 22 h los volátiles se retiraron al vacío. El residuo resultante se disolvió en diclorometano (1 ml) y se purificó por cromatografía en columna de fase normal eluyendo con diclorometano:metanol (100:0 v/v a 80:20 v/v). El disolvente orgánico se retiró al vacío para dar Fmoc-L-Glu-[O*Bu]-[PEG(24u)-OMe] en forma de un aceite incoloro (84 mg, 67 %). Se añadió piperidina (49 j l ) a una solución del compuesto Fmoc-L-Glu-[O*Bu]-[PEG(24u)-OMe] (74 mg) en DMF (2 ml) en una atmósfera de argón y la solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante 22 h, después de que los volátiles se retiraron al vacío. El residuo resultante se trituró con hexano (3 x 0,7 ml). El disolvente orgánico se decantó cada vez y el residuo resultante se secó al vacío para dar el compuesto 22, L-Glu-[OtBu]-[PEG(24u)-OMe] en forma de un sólido de color blanco (61 mg, 97 %). m/z [M+H]+ (1097, 10 %), [M+2H]2+ (1035, 100 %).
Etapa 2: Síntesis del compuesto 23.
Figure imgf000032_0003
Una solución del compuesto 22 (26,6 mg) en DMF (550 j l) se enfrió a 0 °C en una atmósfera de argón a la cual se le añadió HATU (10,5 mg) y la solución se agitó durante 0,5 h a 0 °C. A esto se le añadió una solución del reactivo 2 (32 mg) en DMF (550 jl). La solución resultante se agitó durante 5 min a 0 °C antes de la adición de NMM (2,9 j l ) y HATU (10,5 mg). La solución de reacción se dejó en agitación a 0 °C durante 2 h antes de calentarse a temperatura ambiente y se agitó durante un adicional de 3,5 h. Después de este tiempo, los volátiles se retiraron al vacío. El residuo resultante se disolvió en agua y acetonitrilo (v/v; 1/1, 1,2 ml), y se purificó por cromatografía en columna C18 de fase inversa eluyendo con tampón A (v/v): agua:acetonitrilo al 5 %: ácido fórmico al 0,1 % y tampón B (v/v): acetonitrilo: ácido fórmico al 0,1 % (100:0 v/v a 0:100 v/v). El disolvente orgánico se retiró al vacío y el disolvente acuoso removed por liofilización para dar bis-mPEG(7u)sulfona-propanoil-benzamida-L-Glu-[OtBu]-[PEG(24u)-OMe] en forma de un aceite incoloro (30,5 mg, 55 %). RMN 1H (400 MHz, MeOH-54 ) 8,19 (2H, d), 8,04 (2H, d), 4,83 -4,71 (1H, m), 4,58 (1H, dd,), 3,92 - 3,83 (6H, m), 3,78 - 3,56 (140H, m), 3,57-3,51 (6H, m), 3,40 (4H, dd), 3,36 (3H, s), 3,35 (6H, s), 2,41 (2H, t), 2,24 -2,13 (1H, m), 2,10 -1,98 (1H, m), 1,45 (9H, s); m/z [M+Na]+ (2243, 50 %), [M+H]+ (2221, 40 %), [M+Na+2H]3+ (747,100 %). Una solución de bis-mPEG(7u)sulfona-propanoil-benzamida-L-Glu-[OtBu]-[PEG(24u)-oMe] (30 mg) en diclorometano (2 ml) en una atmósfera de argón se enfrió a 0 °C a la cual se le añadió ácido trifluoroacético (500 j l) y la solución resultante se agitó durante 1,5 h. La mezcla de reacción se dejó calentar a temperatura ambiente y se agitó durante un adicional de 1 h. Después de este tiempo los volátiles se retiraron al vacío. El residuo resultante se disolvió en agua y acetonitrilo (v/v; 1/1, 0,6 ml), y se purificó por cromatografía en columna C18 de fase inversa eluyendo con tampón A (v/v): agua:acetonitrilo al 5 %:ácido trifluoroacético al 0,05 % y tampón B (v/v): acetonitrilo:ácido trifluoroacético al 0,05 % (100:0 v/v a 0:100 v/v). El disolvente orgánico se retiró al vacío y el disolvente acuoso se retiró por liofilización para dar el compuesto 23, bis-mPEG(7u)sulfona-propanoil-benzamida-L-Glu-[OHHPEG(24u)-OMe] en forma de un aceite incoloro (20 mg, 68 %). RMN 1H (400 MHz, MeOH-d4) 8,19 (2H, d), 8,04 (2H, d), 4,81 -4,72 (1H, m), 4,59 (1H, dd), 3,92 - 3,84 (6H, m), 3,67 - 3,50 (146H, m), 3,40 (4H, dd), 3,36 (3H, s), 3,35 (6H, s), 2,48 (2H, t), 2,26 -2,15 (1H, m), 2,15 -2,03 (1H, m); m/z [M+H]+ (2165, 55 %), [M+2H]2+ (1083, 60 %), [M+2H+Na]3+ (729, 100 %).
Etapa 3: Síntesis del reactivo 21
Una solución del compuesto 23 (15,0 mg) en DMF (600 j l) se enfrió a 0 °C en una atmósfera de argón. Se añadió HATU (2,9 mg) y la solución se agitó durante 0,5 h a 0 °C. A esto se le añadió una solución de val-ala-PAB-AHX-DM1 (9,2 mg) y NMM (0,8 j l ) en DMF (600 jl), que se había agitado a temperatura ambiente durante 0,5 h. Después de 5 min, se añadió una cantidad adicional de HATU (2,9 mg) y NMM (0,8 j l ) y la mezcla de reacción se agitó a 0 °C. Después de 3 h, se añadió una cantidad adicional de HATU (0,7 mg) y la mezcla de reacción se agitó a 0 °C. Después de un adicional 2 h, la reacción se almacenó a -20 °C durante 16 h. La solución de reacción se concentró al vacío y se purificó por cromatografía en columna C18 de fase inversa eluyendo con tampón A (v/v): agua:acetonitrilo al 5 %:ácido trifluoroacético al 0,05 % y tampón B (v/v): acetonitrilo:ácido trifluoroacético al 0,05 % (100:0 v/v a 0:100 v/v). El disolvente orgánico se retiró al vacío y el disolvente acuoso removed por liofilización para dar el compuesto 21, bis-mPEG(7u)sulfona-propanoil-benzamida-L-Glu-[val-ala-PAB-AHX-DM1]-[PEG(24u)-OMe] en forma de un aceite espeso, incoloro, transparente (14,3 mg, 64%). RMN 1H (600 MHz, MeOH-54 ) (señales características seleccionadas) 5,69 (1H, dd,), 6,59 (1H, dd), 6,68 (1H, s), 6,69 (1H, d), 7,10 (1H, s), 7,28 (2H, d), 7,57 (2H, d), 8,01 (2H, d), 8,16 (2H, d); m/z [M-AHX-DM1]+ (2422, 40 %).
Ejemplo 11A: Síntesis de un reactivo de conjugación 24 que comprende 7 grupos salientes poliméricos de unidades repetidas y una carga útil citotóxica de maitansinoide
Figure imgf000033_0001
Una solución del compuesto 23 (12,4 mg) en DMF (500 j l) se enfrió a 0 °C en una atmósfera de argón. Se añadió HATU (2,4 mg) y la solución se agitó durante 0,5 h a 0 °C. A esto se le añadió una solución de val-cit-AHX-DM1 (preparada de una manera análoga al compuesto 50 usando AHX-DM1 en lugar del compuesto 47, 6,4 mg) y NMM (0,7 j l ) en DMF (500 jl), que se había agitado a temperatura ambiente durante 0,5 h. Después de 5 min, se añadió una cantidad adicional de HATU (1,2 mg) y NMM (0,4 j l ) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente. Después de 2 h, se añadió una cantidad adicional de HATU (1,2 mg) y NMM (0,4 j l ) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente. Después de un adicional de 1 h, la solución de reacción se concentró al vacío y se purificó por cromatografía en columna C18 de fase inversa eluyendo con tampón A (v/v): agua:acetonitrilo al 5 %:ácido trifluoroacético al 0,05% y tampón B (v/v): acetonitrilo:ácido trifluoroacético al 0,05% (100:0 v/v a 0:100 v/v). El disolvente orgánico se retiró al vacío y el disolvente acuoso removed por liofilización para dar bis-mPEG(7u)sulfonapropanoil-benzamida-L-Glu-[val-cit-AHX-DM1]-[PEG(24u)-OMe] 24 en forma de un aceite espeso, incolor, transparente (9,6 mg, 53 %). m/z [M -H2O]+ (3148, 8 %), [M - H2O]2+ (1575, 40 %), [M-H2OP+ (1050, 100 %), 1036 [M-NHCO-H2O]3+.
Ejemplo 11B: Síntesis de un reactivo de conjugación 25 que comprende una carga útil citotóxica de auristatina
Figure imgf000034_0001
El reactivo 25 se sintetizó de forma análoga al reactivo 24 del Ejemplo 11A a partir del compuesto 23 y la sal TFA valcit-PAB-MMAE. Se aisló Bis-mPEG(7u)sulfona-propanoil-benzamida-L-Glu-[val-cit-PAB-MMAE]-[PEG(24u)-OMe] 25 en forma de un aceite incoloro. m/z [M+H]+ (3270, 12 %), [M+2H]2+ (1636, 50 %), [M+3H]3+ (1091, 100 %).
Ejemplo 12: Síntesis del reactivo de conjugación 2Z para aplicaciones de formación de imágenes y quelantes que comprende grupos salientes de etilenglicol polimérico de 7 unidades repetidas y desferrioxamina
Figure imgf000034_0002
Etapa 1: Síntesis del compuesto 28.
Figure imgf000034_0003
A una solución de ácido 21-(Boc-amino)-4,7,10,13,16,19-hexaoxaheneicosanoico (50 mg, Sigma-Aldrich) en DMF (2 ml) en una atmósfera de argón a temperatura ambiente se le añadió hexafluorofosfato de (benzotriazol-1 -iloxi)tris-(dimetilamino)fosfonio (BOP) (73 mg) y la solución se agitó durante 0,5 h. A esto se le añadió una solución de mesilato de desferrioxamina (87 mg, Sigma-Aldrich) y W,A/-diisopropiletilamina (29 j l ) en DMF (2 ml) que se había agitado a temperatura ambiente durante 0,5 h. Después de 24 h la solución de reacción se concentró al vacío y después se purificó directamente por cromatografía en columna C18 de fase inversa eluyendo con tampón A (v/v): agua:acetonitrilo al 5 %:ácido fórmico al 0,1 % y tampón B (v/v): acetonitrilo:ácido fórmico al 0,1 % (100:0 v/v a 50:50 v/v). El disolvente orgánico se retiró al vacío y el disolvente acuoso se retiró por liofilización para dar el compuesto 28, BocNH-PEG(6u)-desferrioxamina en forma de un sólido de color blanco (50 mg, 46 %) m/z [M+Na]+ (1019, 50 %), [M+H]+ (997, 95 %), [M+2H]2+ (499, 100 %); RMN 1H (600 MHz; MeOH- 84 ) 1,28-1,38 (7H, m), 1,43 (9H, s), 1,49-1,55 (6H, m), 1,60-1,67 (5H, m), 2,09 (3H, s), 2,41-2,47 (6H, m), 2,76 (4H, t), 3,14-3,19 (6H, m), 3,21 (2H, t), 3,50 (2H, t), 3,57-3,65 (27H, m), 3,70-3,73 (2H, t).
Etapa 2: Síntesis del compuesto 29.
Figure imgf000034_0004
Una solución del compuesto 28 (49 mg) en diclorometano (DCM) (3 ml) en una atmósfera de argón se enfrió a 0 °C y se añadió ácido trifluoroacético (TFA) (750 jl). La solución se dejó calentar a temperatura ambiente. Después de 1 h, se añadió tolueno (2 ml) a la mezcla de reacción y los volátiles se retiraron al vacío. El residuo resultante se disolvió en tampón A (v/v): agua:acetonitrilo al 5 %:ácido fórmico al 0,1 % (2 ml) y el disolvente acuoso se retiró por liofilización para retirar cualquier TFA residual y para dar el compuesto 29, NH2-PEG(6 u)-desferrioxamina en forma de un sólido de color blanco (44 mg, rendimiento cuantitativo) que se usó en la siguiente etapa sin purificación adicional: m/z [M+H]+ (897, 100 %), [M+2H]2+ (449, 100 %).
Etapa 3: Síntesis del reactivo 27.
Una solución del reactivo 2 (17 mg) en DMF (750 |jl) se enfrió a 0 °C en una atmósfera de argón antes de añadirse HATU (8,0 mg) y la solución se agitó durante 0,5 h a 0 °C. A esto se le añadió una solución del compuesto 29 (23 mg) y NMM (2,1 j l ) en DMF (750 j l) y la mezcla de reacción se agitó a 0 °C. Se añadieron cantidades adicionales del reactivo 2, HATU y NMM durante 4 h. Después de un adicional de 15 h, la solución de reacción se concentró al vacío y después se purificó por cromatografía en columna C18 de fase inversa eluyendo con tampón A (v/v): agua:acetonitrilo al 5 %:ácido trifluoroacético al 0,05 % y tampón B (v/v): acetonitrilo:ácido trifluoroacético al 0,05 % (100:0 v/v a 50:50 v/v). El disolvente orgánico se retiró al vacío y el disolvente acuoso se retiró por liofilización para dar el reactivo 27, bis-mPEG(7u)sulfona-propanoil-benzamida-PEG(6u)-desferrioxamina en forma de un aceite incoloro transparente (20,6 mg, 49 %) m/z [M+H]+ (1844, 95 %), [M+2H]2+ (922, 100 %), [M+3H]3+ (615, 100 %).
Ejemplo 13 (comparativo): Síntesis del reactivo de conjugación 30 para aplicaciones de formación de imágenes y quelantes que comprende grupos salientes de tosilo y deferoxamina
Figure imgf000035_0001
A una solución del compuesto 29 (43 mg) en DMF (2,5 ml) se le añadió NMM (6 j l) y la solución se agitó durante 0,5 h a temperatura ambiente. A esto se le añadió una solución del ácido 4-[2,2-bis[(p-tolilsulfonil)-metil]acetil]benzoico conocido (29 mg, Nature Protocols, 2006, 1(54), 2241-2252) en DMF (700 jl). Se añadió NMM adicional a la mezcla de reacción después de 1 h, 2 h, 19 h, 23 h y 25 h (15,6 j l en total). Después de 26 h la solución de reacción se concentró al vacío y después se purificó por cromatografía en columna C18 de fase inversa eluyendo con tampón A (v/v): agua:acetonitrilo al 5 %:ácido trifluoroacético al 0,05% y tampón B (v/v): acetonitrilo:ácido trifluoroacético al 0,05 % (100:0 v/v a 0:100 v/v). El disolvente orgánico se retiró al vacío y el disolvente acuoso se retiró por liofilización para dar el reactivo 30, bis-tolilsulfona-propanoil-benzamida PEG(6u)-desferrioxamina en forma de un aceite incoloro transparente (19 mg, 29 %) m/z [M+H]+ (1379, 98 %), [M+2H]2+ (690,100 %); RMN 1H (600 MHz; MeOH- 84 ) 1,28-1,36 (7H, m), 1,48-1,55 (6H, m), 1,59-1,65 (5H, m), 2,09 (3H, s), 2,40-2,46 (6H, m), 2,50 (6H, s), 2,74-2,78 (4H, m), 3,14­ 3,17 (5H, m), 3,55-3,61 (23H, m), 3,62-3,70 (12H, m), 3,75-3,80 (2H, m), 4,09-4,14 (1H, m), 7,44 (4H, d), 7,55 (2H, d), 7,62 (4H, d), 7,82 (2H, d).
Ejemplo 14: Síntesis de un reactivo de conjugación 31. que comprende un grupo saliente hexaPEG-disulfona y una carga útil citotóxica maitansinoide
Figure imgf000035_0002
Etapa 1: Síntesis del compuesto 32.
Figure imgf000035_0003
A una solución agitada de ácido 4-[2,2-bis[(p-tolilsulfonil)-metil]acetil]benzoico (542 mg, Nature Protocols, 2006, 1(54), 2241-2252) en DMF (40 ml) se le añadieron hexa(etilenglicol)ditiol (400 |jl) y CS2CO3 (2,4 g). La mezcla de reacción resultante se agitó en una atmósfera de nitrógeno inerte a temperatura ambiente. Después de 40 h, los volátiles se retiraron al vacío. El residuo resultante se disolvió en agua (4 ml), y se purificó por cromatografía en columna C18 de fase inversa eluyendo con tampón A (v/v): agua:acetonitrilo al 5 %:ácido trifluoroacético al 0,05 % y tampón B (v/v): acetonitrilo:ácido trifluoroacético al 0,05% (100:0 v/v a 0:100 v/v). El disolvente orgánico se retiró al vacío y el disolvente acuoso se retiró por liofilización para dar el compuesto 32, ácido hexaPEG-ditioéter propanoil-benzoico en forma de un sólido de color blanco (180 mg, 33,1 %) m/z [M+Na+] 525. RMN 1H (600 MHz, CDCh) 2,72-2,78 (4H, m, CH2-S), 2,95-3,04 (4H, m), 3,65-3,72 (18H, m, PEG), 4,76 (1H, m), 8,11 (2H, d), 8,21 (2H, d).
Etapa 2: Síntesis del compuesto 33.
Figure imgf000036_0001
El compuesto 33, ácido hexaPEG-disulfona propanoil-benzoico se sintetizó de forma análoga a la descrita para el reactivo 2 en el Ejemplo 1, usando el compuesto 32 en lugar del compuesto 1.
Etapa 3: Síntesis del compuesto 34.
Figure imgf000036_0002
El compuesto 34, hexaPEG-disulfona propanoil-benzamida-PEG (24u)-‘butil éster se sintetizó de una manera análoga a la descrita para el compuesto 7 en el Ejemplo 5, usando el compuesto 33 en lugar del compuesto 2.
Etapa 4: Síntesis del compuesto 35.
Figure imgf000036_0003
El compuesto 35, ácido hexaPEG-disulfona propanoil-benzamida-PEG (24u)-ácido se sintetizó de una manera análoga a la descrita para el compuesto 8 en el Ejemplo 5, usando el compuesto 34 en lugar del compuesto 7.
Etapa 5: Síntesis del reactivo 31.
El reactivo maitansanoide hexaPEG-disulfona propanoil-benzamida-PEG (24u)-val-ala-PAB-AHX-DM1 31 se sintetizó de forma análoga a la descrita para el reactivo 10 en el Ejemplo 7, usando el compuesto 35 en lugar del compuesto 8. Ejemplo 15 (comparativo): Síntesis de un reactivo de conjugación 36 que comprende grupos salientes tosilo y un colorante rodamina B
Figure imgf000037_0001
Etapa 1: Síntesis del compuesto 37.
Figure imgf000037_0002
El compuesto 37, 4-[2,2-bis[(p-tolilsulfonil)-metil]acetil]benzamida-PEG(12u)-ácido se sintetizó de una manera análoga a la descrita para el reactivo 8 en el Ejemplo 5, usando al ácido 4-[2,2-bis[(p-tolilsulfonil)-metil]acetil]benzoico conocido (Nature Protocols, 2006, 1(54), 2241-2252) en lugar del reactivo 2.
Etapa 2: Síntesis del reactivo 3 6.
El reactivo 36, 4-[2,2-bis[(p-tolilsulfonil)-metil]acetil]benzamida-PEG(12u)-rodamina B se sintetizó de una manera análoga a la descrita para el reactivo 4 en el Ejemplo 3, usando el compuesto 37 en lugar del reactivo 2.
Ejemplo 16 (fuera de las reivindicaciones): Síntesis de un reactivo de conjugación 38 que comprende un grupo saliente polimérico de 7 unidades repetidas, un grupo saliente arilo y una carga útil citotóxica de auristatina
Figure imgf000037_0003
Etapa 1: Síntesis del compuesto 39.
A una solución agitada del ácido 4-[2,2-bis[(p-tolilsulfonil)-metil]acetil]benzoico conocido (200 mg, Nature Protocols, 2006, 1(54), 2241-2252) en dimetilformamida (DMF, 8 ml) se le añadieron alfa-metoxi-omega-mercapto hepta(etilenglicol) (142 mg) y NMM (264 jl). La mezcla de reacción resultante se agitó en una atmósfera de nitrógeno inerte a temperatura ambiente. Después de 19 h, los volátiles se retiraron al vacío y el residuo resultante se disolvió en acetonitrilo (800 jl), y se purificó por cromatografía en columna C18 de fase inversa eluyendo con tampón A (v/v): agua:acetonitrilo al 5 %:ácido trifluoroacético al 0,05 % y tampón B (v/v): acetonitrilo:ácido trifluoroacético al 0,05 % (100:0 v/v a 0:100 v/v). El disolvente orgánico se retiró al vacío y el disolvente acuoso se retiró por liofilización para dar el compuesto 39, ácido mono-mPEG(7u)sulfona-propanoil-benzamida-mono-(tosilmetil) propanoil)benzoico en forma de un aceite espeso, incoloro, transparente (132 mg, 47 %) m/z [M+H+] 701,1.
Etapa 2: Síntesis del reactivo 40.
Figure imgf000038_0001
A una solución agitada del compuesto 39 (116 mg) en metanol:agua (5 ml, 9:1 v/v) a temperatura ambiente se le añadió Oxone© (305 mg). Después de 75 min, los volátiles se retiraron al vacío y el agua se retiró azeotrópicamente con acetonitrilo (3 x 15 ml). El residuo resultante se disolvió en diclorometano (3 x 10 ml), se filtró a través de una columna de sulfato de magnesio y se lavó con diclorometano (2 x 7 ml). El eluyente y los lavados se combinaron and los volátiles se retiraron al vacío para dar un aceite espeso, de color amarillo pálido, transparente. El residuo se disolvió en agua:acetonitrilo (800 jl, 1:4 v/v), y se purificó por cromatografía en columna C18 de fase inversa eluyendo con tampón A (v/v): agua:acetonitrilo al 5 %:ácido trifluoroacético al 0,05 % y tampón B (v/v): acetonitrilo:ácido trifluoroacético al 0,05 % (100:0 v/v a 0:100 v/v). El disolvente orgánico se retiró al vacío y el disolvente acuoso se retiró por liofilización para dar el compuesto 40, ácido 4-(3-((2-hepta(etilenglicol) metoxietil) sulfonil)-2-(tosilmetil) propanoil)benzoico en forma de un aceite espeso, incoloro, transparente (103 mg, 78 %) m/z [M+H+] 733,2.
Etapa 3: Síntesis del reactivo 38
A la sal val-cit-PAB-MMAE.TFA (25,0 mg) se le añadió una solución de reactivo 40 (11,8 mg) en DMF (1,5 ml) y se agitó en una atmósfera inerte a temperatura ambiente durante 5 min. La mezcla se enfrió a 0 °C y se añadieron alícuotas de HATU (6,1 mg) y NMM (1,8 j l ) durante un periodo de 5 h para un total de 5 adiciones. Después de 1,5 h, la mezcla de reacción se calentó a temperatura ambiente. Después de 6 h, los volátiles se retiraron al vacío, y el residuo resultante se disolvió en agua y acetonitrilo (v/v; 1/4, 0,6 ml), y se purificó por cromatografía en columna C18 de fase inversa eluyendo con tampón A (v/v): agua:acetonitrilo al 5 %:ácido trifluoroacético al 0,05 % y tampón B (v/v): acetonitrilo:ácido trifluoroacético al 0,05% (100:0 v/v a 0:100 v/v). El disolvente orgánico se retiró al vacío y el disolvente acuoso se retiró por liofilización para dar el reactivo 38, mono-mPEG(7u)sulfona-mono-(tosil metil propanoilbenzamida-)-val-cit-PAB-MMAE en forma de un polvo de color blanco brillante (13,0 mg, 44 %) m/z [M+2H2+] 919,3.
Ejemplo 17: La PEGilación en un enlace disulfuro Fab reducido usando el reactivo 3 y comparación con el reactivo de PEGilación conocido 4-[2,2-bis[(p-tolilsulfonil)-metil]acetil]benzamida-PEG (10kDa)-OMe 41 (Nature Protocols, 2006, 1(54), 2241-2252)
Figure imgf000038_0002
El disulfuro intercatenario de un Fab (5,71 mg, 2,33 mg/ml en PBS producido por digestión con papaína de trastuzumab) se redujo añadiendo 50 j l de solución acuosa de ditiotreitol (DTT) 0,5 M e incubando a 22 °C durante 1 h. Después, se retiró el agente reductor usando una columna PD10 equilibrada con tampón fosfato sódico 20 mM, NaCl 150 mM, EDTA 20 mM, pH 7,5 y el Fab reducido se diluyó adicionalmente a 1,24 mg/ml con el mismo tampón.
Los reactivos 3 y 41 se disolvieron independientemente en agua ultrapura a 10 mg/ml y se añadieron a soluciones separadas de Fab reducido a 1,5 equivalentes molares de reactivo PEG a Fab. Se dejó que las reacciones de PEGilación progresaran a 22 °C, después de lo cual se tomaron muestras para el análisis de SDS-PAGE después de 2 y 4 h.
El % de conversión a Fab PEGilado se estimó basándose en la densidad de banda SDS-PAGE usando un sistema ImageQuant ™ (GE Healthcare). Los resultados se muestran en la Figura 1, que compara el grado de conjugación del reactivo de PEGilación 3 (barras de color negro) frente al reactivo 41 (barras de color blanco) con el Fab. La reacción con el reactivo 3 dio un 63 % y un 83 % de conversión en Fab PEGilado a las 2 h y 4 h respectivamente. Para el reactivo 41, las conversiones fueron 35 % y 51 % a las 2 y 4 h respectivamente. Estos datos muestran que el reactivo 3 reacciona más rápidamente, produciendo una mayor cantidad de Fab PEGilado en un período de tiempo más corto que el reactivo 41.
Ejemplo 18: PEGilación en un enlace interferón-disulfuro alfa utilizando el reactivo 3 y comparación con el conocido reactivo de PEGilación 41
Se cambió el tampón de interferón a-2a (IFN) (4 ml, 0,93 mg/ml, en Tris 20 mM pH 8,0, NaCl ~ 100 mM, inhibidores de proteasa, EDTA 1 mM, glicerol al 10 %) en solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7,4 usando columnas Zeba ™ spin de 5 ml. El IFN se redujo mediante el tratamiento con DTT (25 mM) durante 30 min a 22 °C. El reductor se retiró usando una columna de desalación PD10 equilibrada con PBS a pH 7,4. Los reactivos 3 y 41 (1,5 equiv. por sulfuro de IFN) se conjugaron con IFN (0,7 mg/ml) a 4 °C. Las muestras de las mezclas de reacción se analizaron mediante SDS-PAGE después de 1 h, 2 h y 4 h de incubación. El % de conversión a IFN PEGilado se estimó basándose en la densidad de banda SDS-PAGE usando un sistema ImageQuant ™ (GE Healthcare). Los resultados se muestran en la Figura 2, que compara la eficacia de conjugación del reactivo fluorescente 4 que posee grupos salientes poliméricos de etilenglicol y un reactivo análogo 41 que carece de grupos salientes poliméricos. El reactivo 3 reaccionó más rápido y produjo una mayor cantidad de IFN-PEG (10kDa) -OMe (banda correspondiente a aproximadamente 35 kDa), en comparación con el punto de tiempo equivalente para el reactivo 41.
Ejemplo 19: Comparación de la eficacia de conjugación del reactivo fluorescente 4 que posee grupos salientes de etilenglicol polimérico y un reactivo análogo 36 que carece de grupos salientes poliméricos
Usando un método de conjugación similar al descrito en el Ejemplo 17, los reactivos 4 y 36 se disolvieron por separado en MeCN al 100% a 1,53 mg/ml y 1,67 mg/ml, respectivamente, antes de la conjugación. A la solución de Fab (1,24 mg/ml, 0,475 ml en PBS), se le añadió el reactivo 4 o el reactivo 36 (18 j l ) correspondiente a 1,5 equivalentes. Se dejó que la reacción progresara 22 h a 22 °C y se tomaron muestras para el análisis de SDS-PAGE durante la reacción. El % de conversión a Fab conjugado con rodamina se estimó basándose en la densidad de banda de SDS-PAGE usando un sistema ImageQuant™ (GE Healthcare). Los resultados se muestran en la Figura 3, que compara la conversión a Fab conjugado con rodamina usando el reactivo 4 (barras de color negro) y el reactivo 36 (barras de color blanco), a 1,5 equivalentes de reactivo. El reactivo 4 dio una mayor conversión a Fab conjugado en cada punto de tiempo.
Ejemplo 20: Comparación de la conjugación de anticuerpos del reactivo citotóxico 5 que posee grupos salientes de etilenglicol polimérico con un reactivo análogo 4 2 (4-[2,2-bis[(p-tolilsulfonil)-metil]acetil]benzamida-val-cit-PAB-MMAE) carece de grupos salientes poliméricos.
El reactivo 4 2 se sintetizó como se describe en el documento WO2014064423.
Ambos reactivos 5 y 4 2 se conjugaron con el anticuerpo trastuzumab usando un método análogo a los ejemplos descritos en el documento WO2014064423. Brevemente, trastuzumab (5,2 mg/ml) se redujo con tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) a 40 °C durante 1 h. A continuación, se realizó la conjugación del anticuerpo con 1,5 equivalentes molares de reactivo 5 o 4 2 por enlace disulfuro entre cadenas disolviendo tanto el reactivo 5 como el reactivo 4 2 en DMF hasta una concentración final de 1,6 mM. La solución de anticuerpo se diluyó a 4,21 mg/ml con tampón de fosfato sódico 20 mM, NaCl 150 mM, EDTA 20 mM, pH 7,5. Se añadieron los reactivos 5 y 4 2 para separar alícuotas de anticuerpo. La concentración final de anticuerpo en la reacción se ajustó a 4 mg/ml con tampón de fosfato sódico 20 mM, NaCl 150 mM, EDTA 20 mM, pH 7,5. Cada solución se mezcló suavemente y se incubó a 22 °C durante 22 h. A las 16 y 22 h se tomó una alícuota, se trató con A/-acetil-L-cisteína (20 equiv. sobre reactivo) durante 1 h a 22 °C y después se analizó por HIC. El % de conversión de producto con una relación de fármaco a anticuerpo (DAR) de cuatro se determinó en función del % de área de los picos de absorbancia medidos a 280 nm de los cromatogramas de HIC y los resultados se muestran en la Figura 4, que muestra la comparación de la conjugación de los reactivos 5 (barras de color negro) y 4 2 (barras de color blanco) con un anticuerpo. Los resultados de la Figura 4 muestran que el 6 % del conjugado DAR 4 se produjo con el reactivo 4 2 después de 22 h, mientras que el reactivo 5 dio 78 % de conjugado DAR 4 después de 22 h.
Ejemplo 21: Comparación de la conjugación de anticuerpos de los reactivos citotóxicos 5, 6 y 10 que poseen todos grupos salientes de etilenglicol polimérico con los reactivos análogos 4 2 , 4 3 y 4 4 que carecen de grupos salientes poliméricos
El reactivo 43 se sintetizó como se describe en el documento WO2014064423 y el reactivo 44 se sintetizó como se describe en el documento WO2014064424.
(a) Comparación de la conjugación de anticuerpos del reactivo citotóxico 43 (4-[2,2-bis[(p-tolilsulfonil)-metil]acetil]benzamida-PEG(24u)-val-cit-PAB-MMAE) y el reactivo 5.
Las condiciones de reacción utilizadas para la conjugación del reactivo citotóxico 43 con el anticuerpo (escala de 5 mg) fueron las mismas que las descritas anteriormente para el Ejemplo 20 con las siguientes diferencias: Los reactivos 43 y 5 se prepararon como soluciones de MeCN 3,2 mM. Se tomaron alícuotas de la solución de reacción después de 0,5, 1,2, 4 y 22 h, se inactivaron mediante tratamiento con W-acetil-L-cisteína (1 h a 22 °C) y se analizaron por HIC. Los resultados de estas reacciones de conjugación se muestran en la Figura 5, que es un análisis del curso del tiempo que compara la velocidad de conjugación (DAR promedio) para el reactivo 5 y el reactivo 43 durante 22 h. En la Figura 5, se puede ver que la velocidad de formación del producto fue mucho más rápida para el reactivo 5 que para el reactivo 43. Las especies de DAR 4 se purificaron de cada mezcla de reacción usando HIC y se analizaron por SDS-PAGE. A partir del análisis SDS-PAGE, el % de la mitad de las especies de anticuerpos presentes para cada muestra se determinó mediante el análisis ImageQuant™ del gel teñido y el resultado se muestra en la Tabla 1, donde el conjugado preparado a partir del reactivo 43 tenía casi el doble de la mitad de especies de anticuerpos que el conjugado producido a partir del reactivo 5. Esto indica que el conjugado producido a partir del reactivo 5 tenía un enlace covalente intercadena significativamente más pesado a pesado y se parece mejor a la estructura del anticuerpo no conjugado.
Tabla 1
Figure imgf000040_0001
(b) Comparación de la conjugación de anticuerpos del reactivo citotóxico 44 (4-[2,2-bis[(p-tolilsulfonil)-metil]acetil]benzamida-PEG(24u)-val-ala-PAB-AHX-DM1) y el reactivo 10.
Las condiciones de reacción utilizadas para la conjugación del reactivo citotóxico 44 con el anticuerpo (escala de 3,8 mg) fueron las mismas que las descritas anteriormente para el Ejemplo 20. Se tomó una alícuota de la solución de reacción después de 16 y 22 h y se inactivó mediante tratamiento con W-acetil-L-cisteína. Cada alícuota se analizó mediante HIC y se determinó el % de conversión al producto DAR 4. El resultado se muestra en la Figura 6, que es una comparación de la conjugación de los reactivos 10 (barras de color negro) y 44 (barras de color blanco) con un anticuerpo. Puede verse que el reactivo 10 dio más producto DAR 4 después de 16 h y 22 h.
(c) Comparación de la conjugación de anticuerpos del reactivo citotóxico 43 (4-[2,2-bis[(p-tolilsulfonil)-metil]acetil]benzamida-PEG(24u)-val-cit-PAB-MMAE) y el reactivo 6.
Las condiciones de reacción utilizadas para la conjugación del reactivo citotóxico 6 con el anticuerpo (escala de 1 mg) fueron análogas a las descritas anteriormente para el Ejemplo 20 con las siguientes diferencias: El reactivo 6 se preparó como una solución de MeCN 3,2 mM y la concentración de MeCN en la reacción fue del 5 %. Se tomó una alícuota de la solución de reacción después de 4 h, se inactivó mediante tratamiento con W-acetil-L-cisteína, se analizó mediante HIC analítica y se determinó el % de producto DAR 4 presente. Los resultados se muestran en la Figura 7, que es una comparación de la conjugación de los reactivos 6 (barra de color negro) y 43 (barra de color blanco) con un anticuerpo. Puede verse que el reactivo 6 (barra de color negro) dio significativamente más producto DAR 4 después de 4 h que el reactivo 43 (barra de color blanco).
Ejemplo 22: Comparación de la conjugación de anticuerpos del reactivo citotóxico 12 que posee grupos salientes de etilenglicol polimérico con un reactivo análogo 44 sin grupos salientes poliméricos
Las condiciones de reacción utilizadas para la conjugación del reactivo citotóxico 12 con el anticuerpo (escala de 1 mg) fueron las mismas que las descritas anteriormente para el Ejemplo 20. Se tomó una alícuota de la solución de reacción después de 4 h, se inactivó mediante tratamiento con W-acetil-L-cisteína y se analizó por HIC. Los resultados se muestran en la Figura 8, que es una comparación de la conjugación de los reactivos 44 (barra de color blanco) y 12 (barra de color negro) con un anticuerpo. En la figura 8, se puede ver que el reactivo 12 dio un rendimiento significativamente mayor del producto DAR 4 después de 4 h en comparación con el reactivo 44.
Ejemplo 23: Comparación de la conjugación de anticuerpos de los reactivos citotóxicos 14, 15 y 31 que poseen grupos salientes poliméricos de etilenglicol con un reactivo análogo 44 sin grupos salientes poliméricos.
Las condiciones de reacción utilizadas para la conjugación de los reactivos citotóxicos 14, 15 y 31 con el anticuerpo (escala de 1 mg) fueron las mismas que las descritas anteriormente para el Ejemplo 20. Se tomó una alícuota de la solución de reacción después de 4 h y se inactivó mediante tratamiento con W-acetil-L-cisteína. Cada alícuota se analizó mediante HIC y se determinó el % de producto DAR 4 presente. Los resultados de la conjugación con los reactivos 14, 15, 31 y 44 se muestran en la Tabla 2, donde se puede ver que los reactivos 14, 15 y 31 dieron más del doble de la cantidad de producto DAR 4 en comparación con el reactivo 44 después de 4 h.
Tabla 2: Comparación de la conjugación de los reactivos 14, 15, 31 y 44 con un anticuerpo después de 4 h de reacción.
Figure imgf000041_0001
Ejemplo 24: Preparación de conjugados de anticuerpo fármaco
Se prepararon conjugados de anticuerpo fármaco a partir de los reactivos 21, 24 y 25 mediante métodos análogos a los descritos en los documentos WO2014064423 y WO2014064424. Brevemente, el anticuerpo (trastuzumab o brentuximab) se redujo usando tris(2-carboxietil)fosfina a 40 °C durante 1 h. Después, se realizó la conjugación del anticuerpo con 1,5 equivalentes molares de reactivo por enlace disulfuro entre cadenas disolviendo los reactivos hasta una concentración final de 1,6 mM en acetonitrilo o DMF. La solución de anticuerpo se diluyó a 4,21 mg/ml con tampón de fosfato sódico 20 mM, NaCl 150 mM, EDTA 20 mM, pH 7,5. Se añadieron reactivos al anticuerpo y la concentración final de anticuerpo en la reacción se ajustó a 4 mg/ml con tampón fosfato sódico 20 mM, NaCl 150 mM, EDTA 20 mM, pH 7,5. Cada solución se mezcló suavemente y se incubó a 22 °C. El producto de conjugado de anticuerpo fármaco se purificó mediante cromatografía de interacción hidrófoba para cada conjugado.
Ejemplo 25: PEGilación de un interferón alfa marcado con histidina utilizando el reactivo 3 a pH 6,6 y 7,9
La conjugación de interferón a-2a (IFN) que posee una etiqueta 8-histidina con el reactivo 3 se llevó a cabo a 2,5 mg/ml a pH 6,6 o pH 7,9, lograda mezclando acetato sódico pH 5,3 o fosfato sódico pH 8,0 con fosfato sódico pH 7,4 respectivamente. Se usó el reactivo 3 a 1, 1,5 y 2 equiv. por IFN. Las mezclas de reacción resultantes se incubaron durante 22 ha 22 °C con un análisis intermedio a las 4 h. Las mezclas de reacción se analizaron mediante SDS-PAGE y los resultados se muestran en la Figura 9. En la figura 9, el carril M indica estándares de proteína Novex; el carril 1 indica IFN a pH 5,4; el carril 2 indica IFN a pH 8,0; los carriles 3-5 indican el producto conjugado de 1, 1,5 y 2 equiv. de reactivo 3 respectivamente a las 4 h a pH 6,6; el carril 6 indica producto conjugado de 1,5 equiv. de reactivo 3 a las 4 h, pH 7,9; los carriles 7-9 indican el producto conjugado de 1, 1,5 y 2 equiv. de reactivo 3 respectivamente a las 22 h a pH 6,6; el carril 10 indica producto conjugado de 1,5 equiv. de reactivo 3 respectivamente a 22 h a pH 7,9.
Ejemplo 26: Síntesis de un reactivo puente de disulfuro 45
Etapa 1: Síntesis del compuesto 46.
Figure imgf000042_0001
A una solución agitada de maitansina aminohexanoica (AHX-DMI).sal TFA (29,4 mg) de fórmula:
Figure imgf000042_0002
en dimetilformamida (DMF) (400 |jl) se le añadió una solución de bis-pentafluorofenilo éster del ácido 4-(N-Boc-amino)-1,6-heptanodioico (10,2 mg) en DMF (200 jl). La solución se enfrió a 0°C antes de la adición de N,N-diisopropiletilamina (DIPEA) (13,5 jl). La solución se dejó calentar a temperatura ambiente y se agitó durante 18,5 h. La solución de reacción se purificó por cromatografía en columna C18 de fase inversa eluyendo con tampón A (v/v): agua:acetonitrilo al 5 %:ácido trifluoroacético al 0,05 % y tampón B (v/v): acetonitrilo:ácido trifluoroacético al 0,05 % (100:0 v/v a 0:100 v/v). El disolvente se retiró por liofilización para dar el compuesto 46, 4-(N-boc-amino)-1,6-heptanodiamida bis-AHX-DM1 (rendimiento cuantitativo asumido, 29,7 mg) en forma de un sólido de color blanco m/z [M+2H-2(H2O)-NHCO]2+ 844 (100 %), [M+H]+ 1767.
Etapa 2: Síntesis de carga útil citotóxica 4Z-
Figure imgf000042_0003
El compuesto 46 (rendimiento cuantitativo supuesto, 29,7 mg) se disolvió en ácido fórmico (700 j l) y la solución se agitó a temperatura ambiente durante 1,5 h. Los volátiles se retiraron al vacío y el residuo se convirtió en la sal del ácido trifluoroacético disolviéndolo en una mezcla de tampón A:tampón B 50:50 % v/v (1,5 ml, tampón A (v/v): agua:acetonitrilo al 5 %:ácido trifluoroacético al 0,05 % y tampón B (v/v): acetonitrilo:ácido trifluoroacético al 0,05 %). La solución se agitó a temperatura ambiente durante 5 min antes de retirar el disolvente por liofilización. El proceso se repitió para dar el compuesto 47, 4-(amino)-1,6-heptano-diamida bis-AHX-DM1 en forma de un sólido de color blanquecino (18,0 mg, 60 % en 2 etapas) m/z [M+2H-2(H2O)-NHCO)]2+ 794 (100 %), [M+H]+ 1667.
Etapa 3: Síntesis del compuesto 4 8.
Figure imgf000043_0001
El compuesto 4 8 se sintetizó siguiendo el procedimiento descrito en la patente (EP 0624377 A2) para dar un sólido de color blanco con datos espectroscópicos de acuerdo con lo informado previamente.
Etapa 4: Síntesis del compuesto 49-
Figure imgf000043_0002
Se prepararon soluciones madre del compuesto 4 8 (20,0 mg) en DMF (500 j l) y HATU (40,0 mg) en DMF (400 jl). A una solución agitada del compuesto 47 (14,0 mg) en DMF (700 j l) se le añadieron alícuotas de la solución madre del compuesto 4 8 (126,9 j l ) y la solución madre de HATU (77,8 jl). La solución de reacción se enfrió a 0 °C antes de la adición de DIPEA (4,11 jl). La solución se agitó a 0 °C durante 50 min antes de que se añadieran alícuotas adicionales de la solución madre del compuesto 4 8 (126,9 jl), la solución madre de HATU (77,8 j l) y DIPEA (4,11 jl). La solución se agitó durante 40 min a 0 °C. La solución de reacción se purificó por cromatografía en columna C18 de fase inversa eluyendo con tampón A (v/v): agua:ácido trifluoroacético al 0,05 % y tampón B (v/v): acetonitrilo:ácido trifluoroacético al 0,05 % (100:0 v/v a 0:100 v/v). El disolvente se retiró por liofilización para dar el compuesto 49, 4-(Fmoc-val-citamido)-1,6-heptanodiamida bis-AHX-DM1 (rendimiento cuantitativo asumido, 16,9 mg) en forma de un sólido de color blanquecino m/z [M+2H-2(H2O)]2+ 1055 (100 %).
Etapa 5: Síntesis del compuesto 50.
Figure imgf000044_0001
A una solución agitada del compuesto 49 (rendimiento cuantitativo asumido, 16,9 mg) en DMF (500 |jl) se le añadió piperidina (3,04 jl). La solución de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1,5 h antes de la purificación por cromatografía en columna C18 de fase inversa eluyendo con tampón A (v/v): agua:ácido trifluoroacético al 0,05 % y tampón B (v/v): acetonitrilo:ácido trifluoroacético al 0,05 % (100:0 v/v a 0:100 v/v). El disolvente se retiró por liofilización para dar el compuesto 50, 4-(val-cit-amido)-1,6-heptanodiamida bis-AHX-DM1 en forma de un sólido de color blanquecino (8,8 mg, 55 % en 2 etapas) m/z [M+2H]2+ 962 (100 %).
Etapa 6: Síntesis del reactivo puente de disulfuro 45 que comprende la carga útil citotóxica 4Z-
Se prepararon soluciones madre del compuesto 8 (13,5 mg) en DMF (100 jl), HATU (10,0 mg) en DMF (200 j l) y NMM (5,83 j l ) en DMF (94,2 jl). A una solución agitada de 50 (1,8 mg) en Dm F (80 j l ) se le añadieron alícuotas de la solución madre del compuesto 23 (16,5 j l ) y solución madre del HATU (20,2 jl). La solución de reacción se enfrió a 0 °C antes de añadir una alícuota de solución madre de NMM (5 jl). La solución se dejó en agitación a 0 °C durante 1 h antes de calentarse a temperatura ambiente. Después de 3,5 h, la solución de reacción se purificó por cromatografía en columna C18 de fase inversa eluyendo con tampón A (v/v): agua:ácido trifluoroacético al 0,05 % y tampón B (v/v): acetonitrilo:ácido trifluoroacético al 0,05 % (100:0 v/v a 0:100 v/v). El disolvente se retiró por liofilización para dar el reactivo 45, bis-mPEG(7u)sulfona-propanoil-benzamida-val-cit-amido)-1,6-heptanodiamida bis-AHX-DM1 en forma de un sólido (1,5 mg, 42% ) m/z [M+4H-2(H2O)]4+ 992 (100 %), [M+3H-2(H2O)]3+ 1321, [M+2H-2(H2O)]2+ 1982.
Ejemplo 2Z: Síntesis de un reactivo puente de disulfuro 51 que comprende la carga útil citotóxica 4Z.
Figure imgf000044_0002
Etapa 1: Síntesis del reactivo 51.
Se prepararon soluciones madre de HATU (10 mg) en DMF (200 j l) y NMM (5,83 j l) en DMF (94,2 jl). El compuesto 23 (5,4 mg) se disolvió en una solución del compuesto 50 (3,6 mg) en DMF (254 |jl) con agitación. A la solución agitada se le añadió una alícuota de solución madre de HATU (40 jl). La solución se enfrió a 0 °C antes de añadirse una alícuota de solución madre de NMM (10 jl). Después de 50 min, además, se añadieron alícuotas de solución madre de HATU (6,67 j l) y solución madre de n Mm (1,67 jl). La solución de reacción se agitó a 0 °C durante unos 20 minutos adicionales y se purificó directamente por cromatografía en columna C18 de fase inversa eluyendo con tampón A (v/v): agua:ácido trifluoroacético al 0,05 % y tampón B (v/v): acetonitrilo:ácido trifluoroacético al 0,05 % (100:0 v/v a 0:100 v/v). El disolvente se retiró por liofilización para dar el reactivo 51 en forma de un sólido de color blanquecino (3,8 mg, 53 %) m/z [M+4H-(H2O)-NHCO]4+ 1003 (100 %), [M+3H-2(H2O)-NHCO]3+ 1331, [M+2H 2(H2O)]2+ 2017.
Ejemplo 28: Síntesis de un reactivo puente de disulfuro 56 que comprende la carga útil citotóxica 47.
Figure imgf000045_0001
Etapa 1: Síntesis del compuesto 57.
Figure imgf000045_0002
Se preparó una solución madre de hidroxibenzotriazol (HOBt, 6,6 mg) en DMF (200 jl). A una solución agitada de carga útil citotóxica 47 (10 mg) en DMF (500 j l) se le añadieron Fmoc-val-ala-PAB-PNP (3,7 mg) y una alícuota de solución madre de HOBt (2 jl). La solución de reacción se enfrió a 0 °C antes de añadirse DIPEA (2,14 jl). Después, la solución de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 18 h antes de la purificación por cromatografía en columna C18 de fase inversa, eluyendo con tampón A (v/v): agua:ácido trifluoroacético al 0,05 % y tampón B (v/v): acetonitrilo:ácido trifluoroacético al 0,05 % (100:0 v/v a 0:100 v/v). El disolvente se retiró por liofilización para el reactivo 57 Fmoc-val-ala-PAB-amido-1,6-heptanodiamida bis-AHX-DM1.
Figure imgf000046_0001
El compuesto de bis-maitansinoida, compuesto 58 amina-val-ala-PAB-amido-1,6-heptanodiamida bis-AHX-DMI se sintetizó de forma análoga a la descrita para el compuesto 50 usando el compuesto 57 en lugar del compuesto 49.
Etapa 3: Síntesis del reactivo 56.
El reactivo bis-maitansinoida bis-mPEG(7u)sulfona-propanoil-benzamida-Glu-[NH-PEG(24u)-OMeHval-ala-PAB-amido-1,6-heptanodiamida bis-AHX-DM1] 56 se sintetizó de manera análoga a la que se ha descrito para el reactivo 51, usando el compuesto 58 en lugar del compuesto 50.
Ejemplo 29: Síntesis de un reactivo puente de disulfuro 59 que comprende la carga útil citotóxica AHX-DM1.
Figure imgf000046_0002
A una solución agitada de val-cit-AHX-DMI (5,0 mg) en DMF anhidra (400 j l ) se le añadió el reactivo 8 (13 mg) y se agitó durante 5 min a 0 °C. Se añadieron de manera sucesiva HATU (2,62 mg) y NMM (0,44 mg) y la mezcla de reacción se dejó en agitación a 0 °C. Después de 20 min, se añadió una cantidad adicional de HATU (2,62 mg) y NMM (0,44 mg) y la mezcla de reacción se agitó a 0 °C. Después de 2,5 h, la reacción se enfrió a -20 °C durante 16 h. La solución de reacción se concentró al vacío y después se purificó por cromatografía en columna C18 de fase inversa eluyendo con tampón A (v/v): agua:acetonitrilo al 5 %:ácido trifluoroacético al 0,05 % y tampón B (v/v): acetonitrilo:ácido trifluoroacético al 0,05% (100:0 v/v a 0:100 v/v). El disolvente orgánico se retiró al vacío y el disolvente acuoso se retiró por liofilización para dar el reactivo 59, bis-mPEG(7u)sulfona-propanoil-benzamida-PEG(24u)-val-cit-AHX-DM1 en forma de un aceite espeso de color amarillo (5,6 mg, 41 %) m/z [m -OH+H]2+ 1571,5.
Ejemplo 30: Producción de conjugado de anticuerpo-fármaco 60 usando reactivo puente de disulfuro 45; conjugado de anticuerpo-fármaco 61 usando reactivo de puente de disulfuro 51 y conjugado de fármaco-anticuerpo 62 usando reactivo puente de disulfuro 56
Los conjugados de anticuerpo-fármaco se prepararon mediante métodos análogos a los descritos en los documentos WO2014064423 y WO2014064424. Brevemente, el anticuerpo (trastuzumab o brentuximab) se redujo usando tris (2-carboxietil) fosfina a 40 °C durante 1 h. Después, se realizó la conjugación del anticuerpo con 1,5 equivalentes molares de reactivo (es decir, 45, 51 o 56) por enlace disulfuro entre cadenas disolviendo los reactivos hasta una concentración final de 1,6 mM en acetonitrilo o DMF. La solución de anticuerpo se diluyó a 4,21 mg/ml con tampón de fosfato sódico 20 mM, NaCl 150 mM, EDTA 20 mM, pH 7,5. Se añadieron reactivos al anticuerpo y la concentración final de anticuerpo en la reacción se ajustó a 4 mg/ml con tampón fosfato sódico 20 mM, NaCI 150 mM, EDTA 20 mM, pH 7,5. Cada solución se mezcló suavemente y se incubó a 22 °C. El producto de conjugado de anticuerpo-fármaco se purificó mediante cromatografía de interacción hidrófoba para cada conjugado para dar productos con una relación definida de fármaco a anticuerpo (DAR). El % de conversión al producto DAR4 para los reactivos 45, 51 y 56 fue del 30 %, 65 % y 40 %, respectivamente, según lo determinado por HIC.
Ejemplo 31: Síntesis de un reactivo de conjugación de PEG 63 que comprende 7 unidades repetidas de grupos salientes de etilenglicol y enlazador arilo fluorado.
Figure imgf000047_0001
Etapa 1: Síntesis del compuesto 64:
Figure imgf000047_0002
Se añadieron formaldehído (solución al 37 %) (144 jl), piperidina (14,4 j l ) y clorhidrato de piperidina (134 mg) a una mezcla de ácido 4-acetil-2-fluorobenzoico (200 mg) y 4-metilbenceno tiol (272 mg) en etanol absoluto (1,5 ml). La mezcla de reacción se calentó a reflujo durante 2,5 h, tiempo durante el cual se añadió una porción adicional de formaldehído (solución al 37 %) (144 j l) (después de 1,5 h). Después, la mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente y se agitó durante una noche. Se añadieron cantidades adicionales de formaldehído (solución al 37 %) (288 j l) y piperidina (14,4 j l ) y la mezcla de reacción se calentó a reflujo durante un adicional de 8 h. Después, la mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente y se agitó durante una noche. Los volátiles se retiraron al vacío. El residuo resultante se disolvió en agua:acetonitrilo (800 jl , 1:3 v/v) y se purificó por cromatografía en columna C18 de fase inversa eluyendo con tampón A (v/v): agua: ácido trifluoroacético al 0,05 % y tampón B (v/v): acetonitrilo:ácido trifluoroacético al 0,05 % (98:2 v/v a 0:100 v/v). El disolvente orgánico se retiró al vacío y el disolvente acuoso se retiró por liofilización para dar el compuesto 64, ácido bis-(metilbenceno sulfuro propanoil)-2-fluoro-benzoico en forma de cristales de color naranja pálido (196,0 mg, 39 %) m/z [M+H]+ 454,20 Da; RMN 1H (400 MHz, CDCh) 2,35 (6H, s, OMe), 3,20-3,30 (4H, m, CH2), 3,70-3,80 (1H, m, CH), 7,10 (4H, d, Ar-H), 7,15 (4H, d, Ar-H), 7,20 (1H, s, Ar-H), 7,35 (1H, d, Ar-H), 7,90 (1H, t, Ar-H).
Etapa 2: Síntesis del compuesto 65:
Figure imgf000047_0003
A una solución agitada del compuesto 64 (75 mg) en metanol:agua (2,0 ml, 9:1 v/v) a temperatura ambiente se le añadió Oxone® (304 mg, Sigma-Aldrich). Después de 2 h, los volátiles se retiraron al vacío. El residuo resultante se disolvió en diclorometano (3 x 5,0 ml), se filtró a través de una columna de sulfato de magnesio y se lavó con diclorometano (2 x 5 ml). El eluyente y los lavados se combinaron y los volátiles se retiraron al vacío para dar el compuesto 65, ácido bis-(tosil propanoil)-2-fluoro-benzoico en forma de un polvo de color blanco (84,0 mg, 98 %) m/z [M+H]+ 519,15 Da.
Etapa 3: Síntesis del compuesto 66:
Figure imgf000048_0001
A una solución del compuesto 65 (75 mg) en DMF (2,0 ml) se le añadieron Et3N (240 pl, Acros Organics) y MeO-PEG-(7u)-SH (154 mg, Iris Biotech). La reacción se agitó en una atmósfera de nitrógeno inerte a temperatura ambiente. Después de 6 h, los volátiles se retiraron al vacío. El residuo resultante se disolvió en agua:acetonitrilo (2,0 ml, 1:1 v/v) y se purificó por cromatografía en columna C18 de fase inversa eluyendo con tampón A (v/v): agua: ácido trifluoroacético al 0,05% y tampón B (v/v): acetonitrilo:ácido trifluoroacético al 0,05% (98:2 v/v a 0:100 v/v). El disolvente orgánico se retiró al vacío y el disolvente acuoso se retiró por liofilización para dar el compuesto 67, ácido bis-mPEG(7u)-sulfuro-propanoil-2-fluoro-benzoico en forma de un aceite incoloro (101 mg, 78 %) m/z [M+H]+ 919,45 Da.
Etapa 4: Síntesis del compuesto 67:
Figure imgf000048_0002
A una solución agitada del compuesto 66 (80 mg) en metanol:agua (2,0 ml, 9:1 v/v) a temperatura ambiente se le añadió Oxone® (160 mg, Sigma-Aldrich). Después de 3 h, los volátiles se retiraron al vacío. El residuo resultante se disolvió en diclorometano (3 x 4 ml), se filtró a través de una columna de sulfato de magnesio y se lavó con diclorometano (2 x 5 ml). El eluyente y los lavados se combinaron y los volátiles se retiraron al vacío. El aceite resultante se disolvió en agua y se liofilizó para dar el compuesto 67, ácido bis-mPEG(7u)-sulfona-propanoil-2-fluorobenzoico en forma de un aceite incoloro transparente (82 mg, 95 %) m/z [M+H]+ 983,26 Da.
Etapa 5: Síntesis del compuesto 63:
Se prepararon soluciones madre de HATU (40,0 mg, Novabiochem) en DMF (200 pl) y NMM (11,8 pl, Acros Organics) en DMF (200 pl). A una solución de DMF (800 pl) del compuesto 67 (25,0 mg) se le añadió H2N-PEG(24u)-OMe (23,4 mg, Iris Biotech). La mezcla de reacción resultante se agitó a temperatura ambiente en una atmósfera de nitrógeno inerte. Se añadieron alícuotas de HATU (40,0 pl) y NMM (40,0 pl) cada 10 min durante un total de 3 adiciones y las alícuotas restantes de HATU (80,0 pl) y NMM (80,0 pl) se añadieron a los 30 min. Después de 60 min, los volátiles se retiraron al vacío. El residuo resultante se disolvió en agua (1,0 ml) y se purificó por cromatografía en columna C18 de fase inversa eluyendo con tampón A (v/v): agua: ácido trifluoroacético al 0,05 % y tampón B (v/v): acetonitrilo:ácido trifluoroacético al 0,05 % (98:2 v/v a 0:100 v/v). El disolvente orgánico se retiró al vacío y el disolvente acuoso se retiró por liofilización para dar el reactivo 63, bis-mPEG(7u)-sulfona-propanoil-2-fluoro-benzamida-PEG(24u) en forma de un aceite de color incolor transparente (17,5 mg, 40 %) m/z [M+3H]3+ 684,94 Da.
Ejemplo 32: S ín te s is d e un re a c t iv o d e c o n ju g a c ió n d e P E G 68 q u e c o m p re n d e 7 u n id a d e s d e re p e t ic ió n d e g ru p o s s a lie n te s d e e t ile n g lic o l a m in o .
Figure imgf000049_0001
Etapa 1: Síntesis del compuesto 69.
Figure imgf000049_0002
Se prepararon soluciones de madre de HATU (632 mg, Novabiochem) en DMF (1,6 ml) y NMM (183 pl, Acros Organics) en DMF (1,6 ml). A una DMF (4,0 ml) del ácido 4-(3-tosil-2-(tosilmetil)propanoil)benzoico (199 mg, BioVectra) se le añadió H2N-PEG(24u)-CO2*Bu (400,0 mg, Iris Biotech). La mezcla de reacción resultante se agitó a temperatura ambiente en una atmósfera de nitrógeno inerte. Las alícuotas de HATU (320 pl) y NMM (320 pl) se añadieron cada 10 min para un total de 5 adiciones. Después de 120 min, los volátiles se retiraron al vacío. El residuo resultante se disolvió en agua:acetonitrilo (2,0 ml, 1:3 v/v) y se purificó por cromatografía en columna C18 de fase inversa eluyendo con tampón A (v/v): agua: ácido trifluoroacético al 0,05 % y tampón B (v/v): acetonitrilo:ácido trifluoroacético al 0,05 % (98:2 v/v a 0:100 v/v). El disolvente orgánico se retiró al vacío y el disolvente acuoso se retiró por liofilización para dar el compuesto 69, bis-(tosil propanoil)-benzamida-PEG(24u)-‘Butil éster en forma de un aceite de color naranja transparente (184 mg, 33 %) m/z [M+Na+H]2+ 853,43 Da, [M-(tBu)+2H]2+ 814,83 Da.
Etapa 2: Síntesis del compuesto 68.
A una solución de 69 (32 mg) en DMF (500 pl) se le añadieron carbonato sódico anhidro (24,1 mg, Fisher Scientific) y MeO-PEG-(7u)-NH2 (19 mg, Iris Biotech). La reacción se agitó a temperatura ambiente en una atmósfera de nitrógeno inerte. Después de 18 h, los volátiles se retiraron al vacío. El residuo resultante se disolvió en agua (1,0 ml) y se purificó por cromatografía en columna C18 de fase inversa eluyendo con tampón A (v/v): agua: ácido trifluoroacético al 0,05 % y tampón B (v/v): acetonitrilo:ácido trifluoroacético al 0,05 % (98:2 v/v a 0:100 v/v). El disolvente orgánico se retiró al vacío y el disolvente acuoso se retiró por liofilización para dar el reactivo 68, bis-mPEG(7u)-amino-propanoilbenzamida-PEG(24u)-‘Butil éster en forma de un aceite incoloro transparente (15,0 mg, 38 %) m/z [M+2H]2+ 1026,09 Da, [M+3H]3+ 665,45 Da.
Ejemplo 33: Síntesis de un reactivo de conjugación 70 que comprende una unidad de maleimida, 7 unidades de repetición de grupos salientes de etilenglicol.
Etapa 1: Síntesis del compuesto 71.
Figure imgf000050_0001
Se disolvió 3,4-dibromofuran-2,5-diona (300 mg, Sigma Aldrich) en ácido acético (4,0 ml, Fisher Scientific) y a esta se le añadió CO2*Bu-PEG-(24u)-NH (705 mg, Iris Biotech). La reacción se agitó a 75 °C en una atmósfera de nitrógeno inerte. Después de 3 h la reacción se agitó a temperatura ambiente y después de 21 h, los volátiles se retiraron al vacío. El residuo resultante se disolvió en agua y acetonitrilo (v/v; 1/1, 4,0 ml) y se purificó por cromatografía en columna C18 de fase inversa eluyendo con tampón A (v/v): agua: ácido trifluoroacético al 0,05 % y tampón B (v/v): acetonitrilo:ácido trifluoroacético al 0,05 % (98:2 v/v a 0:100 v/v). El disolvente orgánico se retiró al vacío y el disolvente acuoso se retiró por liofilización para dar el compuesto 71, dibromo-maleimida-PEG(24u)-‘Butil éster en forma de un sólido opaco de color blanquecino (427 mg, 51 %) m/z [MH-(‘Bu)]2+ 692,68 Da.
Etapa 2: Síntesis del compuesto 70.
A una solución de 71 (250 mg) en DMF (1,5 ml) se le añadieron alfa-metoxi-omega-mercapto hepta(etilenglicol) (186 mg, Iris Biotech) y trietilamina (145 pl). La mezcla de reacción resultante se agitó en una atmósfera de nitrógeno inerte a temperatura ambiente. El bromhidrato de trietilamina precipitado rápidamente se volvió a disolver en la mezcla de reacción con DMF (1,0 ml) y después de 30 min se retiraron los volátiles al vacío. El residuo resultante se disolvió en ácido fórmico (3 ml, Sigma Aldrich) y la mezcla de reacción se agitó en una atmósfera de nitrógeno inerte a temperatura ambiente. Después de 30 min, se añadió ácido trifluoroacético (50 pl, Acros Organics) y después de 60 min se añadió más ácido trifluoroacético (300 pl). Después de 100 min, los volátiles se retiraron al vacío. El residuo resultante se disolvió en agua (1,5 ml) y se purificó por cromatografía en columna C18 de fase inversa eluyendo con tampón A (v/v): agua: ácido trifluoroacético al 0,05 % y tampón B (v/v): acetonitrilo:ácido trifluoroacético al 0,05 % (98:2 v/v a 0:100 v/v). El disolvente orgánico se retiró al vacío y el disolvente acuoso se retiró por liofilización para dar el reactivo 70, bis-mPEG(7u)-maleimida-PEG(24u)-ácido en forma de un sólido ceroso de color amarillo (146 mg, 43 %) m/z [MHa]3+ 646,28 Da.
Ejemplo 34: Síntesis de un reactivo de conjugación 72 que comprende un grupo saliente de etilenglicol de 7 unidades repetidas y una carga útil citotóxica de auristatina.
Figure imgf000050_0002
Etapa 1: Síntesis del compuesto 73.
Figure imgf000050_0003
A una solución agitada de ácido 4-(3-tosilpropanoil)benzoico (99 mg, Bioconjugate Chem. 2014, (25) 460-469,) en dimetilformamida (DMF, 5,0 ml) se le añadieron alfa-metoxi-omega-mercapto hepta(etilenglicol) (170 mg, Iris Biotech) y trietilamina (250 pl). La mezcla de reacción resultante se agitó en una atmósfera de nitrógeno inerte a temperatura ambiente. Se añadió una porción adicional de trietilamina (120 pl) a la mezcla de reacción después de 4 h. Los volátiles se retiraron al vacío después de 95,0 h y el residuo resultante se disolvió en agua/acetonitrilo (2 ml, 1:1 v/v) y se purificó por cromatografía en columna C18 de fase inversa eluyendo con tampón A (v/v): agua:acetonitrilo al 5 %:ácido trifluoroacético al 0,05% y tampón B (v/v): acetonitrilo:ácido trifluoroacético al 0,05% (100:0 v/v a 0:100 v/v). El disolvente orgánico se retiró al vacío y el disolvente acuoso se retiró por liofilización para dar el compuesto 73, ácido mPEG(7u)-sulfuro-propanoil-benzoico en forma de un sólido de color blanco (200 mg, 126 %, con disolvente residual) m/z [M+H]+ (533).
Etapa 2: Síntesis del compuesto 74.
Figure imgf000051_0001
A una solución agitada de 73 (200 mg) en metanol:agua (5,5 ml, 9:1 v/v) a temperatura ambiente se le añadió Oxone® (320 mg). Después de 4,5 h, los volátiles se retiraron al vacío. El residuo resultante se disolvió en diclorometano (4 x 3 ml), se filtró a través de una columna de sulfato de magnesio y se lavó con diclorometano (2 x 3 ml). El eluyente y los lavados se combinaron y los volátiles se retiraron al vacío para dar un aceite espeso transparente. El residuo se disolvió en agua:acetonitrilo (1,0 ml, 4:1 v/v), y se purificó por cromatografía en columna C18 de fase inversa eluyendo con tampón A (v/v): agua:acetonitrilo al 5%:ácido trifluoroacético al 0,05% y tampón B (v/v): acetonitrilo:ácido trifluoroacético al 0,05 % (100:0 v/v a 0:100 v/v). El disolvente orgánico se retiró al vacío y el disolvente acuoso se retiró por liofilización para dar el reactivo 74, ácido mPEG(7u)-sulfona-propanoil-benzoico en forma de un sólido de color blanco (90 mg, 60 %) m/z [M+H]+ (565).
Etapa 3: Síntesis del compuesto 72.
A una solución agitada de val-cit-PAB-MMAE (30 mg) en DMF anhidra (500 pl) se le añadió el compuesto 73 (11 mg) y se agitó durante 5 min a 0 °C. Se añadieron de manera sucesiva HATU (9,95 mg) y NMM (4,26 pl) y la mezcla de reacción se dejó en agitación a 0 °C. Después de 0,5 h y 2 h se añadió una cantidad adicional de HATU y NMM y después de un adicional de 2,0 h la solución de reacción se concentró después al vacío y después se purificó por cromatografía en columna C18 de fase inversa eluyendo con tampón A (v/v): agua:acetonitrilo al 5 %:ácido trifluoroacético al 0,05% y tampón B (v/v): acetonitrilo:ácido trifluoroacético al 0,05% (100:0 v/v a 0:100 v/v). El disolvente orgánico se retiró al vacío y el disolvente acuoso se retiró por liofilización para dar el reactivo 72, mPEG(7u)-sulfona-propanoil-benzamida-val-cit-PAB-MMAE en forma de un sólido de color blanquecino (15,0 mg, 46% ) m/z [M+H]+ (1671).
Ejemplo 35: Síntesis de un reactivo de conjugación 75 que comprende 7 unidades repetidas de grupos salientes de etilenglicol y un enlazador de furano.
Figure imgf000051_0002
Etapa 1: Síntesis del reactivo 76
Figure imgf000051_0003
A una suspensión de yoduro de W,W-dimetilmetilenoiminio (407 mg) en DMF (3,0 ml) se le añadió ácido 5-acetilfuran-2-carboxílico (169 mg). La mezcla de reacción se calentó a 125 °C y se agitó en una atmósfera inerte durante 90 min. A una porción de la mezcla de reacción (1,0 ml) se le añadieron mPEG-(7u)-SH (325 mg) y Et3N (363 pl). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente en una atmósfera inerte durante 90 min. Los volátiles se retiraron al vacío. El residuo resultante se disolvió en agua (1,0 ml) y se purificó por cromatografía en columna C18 de fase inversa eluyendo con tampón A (v/v): agua: ácido trifluoroacético al 0,05 % y tampón B (v/v): acetonitrilo:ácido trifluoroacético al 0,05 % (98:2 v/v a 0:100 v/v). El disolvente orgánico se retiró al vacío y el disolvente acuoso se retiró por liofilización para dar el reactivo 76, ácido bis-mPEG(7u)-sulfuro-propanoil-furan-2-carboxílico en forma de un aceite de color amarillo pálido (119 mg, 36 %). Cálculo del rendimiento basado en 1/3' parte de la mezcla de reacción inicial usada. RMN 1H (400 MHz, DMSO) 2,60-2,70 (4H, m, CH2), 2,80-2,90 (4H, m, CH2 ), 3,24 (6H, s, OMe), 3,40-3,60 (m, PEG), 3,90-3,95 (1H, m, CH), 7,36 (1H, d, Ar-H), 7,69 (1H, d, Ar-H).
Etapa 2: Síntesis del reactivo 77
Figure imgf000052_0001
A una solución de 76 (30,0 mg) en metanol:agua (1,0 ml, 9:1 v/v) se le añadió Oxone® (62,1 mg, Sigma-Aldrich). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente en una atmósfera inerte durante 120 min. La mezcla de reacción en bruto se concentró al vacío. El residuo resultante se disolvió en diclorometano (3 x 5,0 ml), se filtró a través de una columna de sulfato de magnesio y se lavó con diclorometano (2 x 5,0 ml). El eluyente y los lavados se combinaron and los volátiles se retiraron al vacío para dar el reactivo 7Z, ácido bis-mPEG(7u)-sulfona-propanoil-furan-2-carboxílico en forma de un aceite incoloro transparente (31,0 mg, 97 %). m/z [M+H]+ 955,28 Da.
Etapa 3: Síntesis del reactivo 75
Se prepararon soluciones madre de HATU (51,5 mg) en DMF (200 pl) y NMM (15,0 pl) en DMF (200 pl). Una solución de DMF (500 pl) de ácido bis-mPEG(7u)-sulfona-propanoil-furan-2-carboxílico 77 (31,0 mg) se añadió a una solución de DMF (500 pl) de H2N-PEG(24u)-OMe (29,5 mg, Iris Biotech). La mezcla de reacción resultante se agitó a temperatura ambiente en una atmósfera de nitrógeno inerte. Se añadieron alícuotas de HATU (40 pl) y NMM (40 pl) a los 0 min, 10 min, 30 min y se añadió una alícuota de HATU (80 pl) y NMM (80 pl) a los 90 min. Después de 120 min, los volátiles se retiraron al vacío. El residuo resultante se disolvió en agua:acetonitrilo (1,0 ml, 1:1 v/v) y se purificó por cromatografía en columna C18 de fase inversa eluyendo con tampón A (v/v): agua: ácido trifluoroacético al 0,05 % y tampón B (v/v): acetonitrilo:ácido trifluoroacético al 0,05 % (98:2 v/v a 0:100 v/v). El disolvente orgánico se retiró al vacío y el disolvente acuoso se retiró por liofilización para dar el reactivo 75, bis-mPEG(7u)-sulfona-propanoil-furan-2 amida-PEG(24u)-OMe en forma de un aceite incoloro transparente (9,6 mg, 18 %). m/z [M+2H]2+ 1012,76 Da.
Ejemplo 36: Síntesis de un reactivo de conjugación 78 que comprende 7 unidades de repetición de grupos salientes de sulfuro de etilenglicol.
Figure imgf000052_0002
A una solución de 1-(4-hidroxifenil)-3-tosil-2-(tosilmetil)propan-1-ona (400 mg) en DMF (8,0 ml) se le añadieron Et3N (708 pl, Acros Organics) y MeO-PEG-(7u)-SH (905 mg, Iris Biotech). La reacción se agitó en una atmósfera de nitrógeno inerte a temperatura ambiente. Después de 48 h, los volátiles se retiraron al vacío. El residuo resultante se disolvió en agua:acetonitrilo (2,0 ml, 1:1 v/v) y se purificó por cromatografía en columna C18 de fase inversa eluyendo con tampón A (v/v): agua: ácido trifluoroacético al 0,05 % y tampón B (v/v): acetonitrilo:ácido trifluoroacético al 0,05 % (98:2 v/v a 0:100 v/v). El disolvente orgánico se retiró al vacío y el disolvente acuoso se retiró por liofilización para dar el compuesto 79 en forma de un aceite incoloro transparente (322 mg, 43 %) m/z [M+H]+ 873,49 Da.
Ejemplo 37: S ín te s is d e u n re a c t iv o d e c o n ju g a c ió n 79 q u e c o m p re n d e 7 u n id a d e s re p e t id a s d e g ru p o s s a lie n te s de e t ile n g lic o l s u lfo n a .
Figure imgf000053_0001
A una solución agitada de compuesto 78 (20,0 mg) en metanol:agua (500 pl, 9:1 v/v) a temperatura ambiente se le añadió Oxone® (42,2 mg, Sigma-Aldrich). Después de 3 h, los volátiles se retiraron al vacío. El residuo resultante se disolvió en agua:acetonitrilo (800 pl, 1: 1 v/v) y se purificó por cromatografía en columna C18 de fase inversa eluyendo con tampón A (v/v): agua: ácido trifluoroacético al 0,05 % y tampón B (v/v): acetonitrilo:ácido trifluoroacético al 0,05 % (98:2 v/v a 0:100 v/v). El disolvente orgánico se retiró al vacío y el disolvente acuoso se retiró por liofilización para dar el compuesto 79 en forma de un aceite incoloro transparente (19,5 mg, 91 %) m/z [M+H]+ 936,86 Da.
Ejemplo 38: Síntesis de un reactivo de conjugación 80 que comprende 7 unidades repetidas de grupos salientes de etilenglicol sulfona y un enlazador de éster fenólico.
Figure imgf000053_0002
Etapa 1: Síntesis del compuesto 81:
Figure imgf000053_0003
A una solución de mPEG(24u)-COOH (38,4 mg, Iris Biotech) en DMF (400 pl) se le añadieron HATU (26,1 mg) y DIPEA (12,0 pl). La reacción se agitó en una atmósfera de nitrógeno inerte a temperatura ambiente durante 5,0 min. A esta mezcla se le añadió el compuesto 79 (20,0 mg) disuelto en DMF (100 pl). La reacción se agitó en una atmósfera de nitrógeno inerte a temperatura ambiente durante un adicional de 42 h. Después de 42 h, los volátiles se retiraron al vacío. El residuo resultante se disolvió en agua (800 pl) y se purificó por cromatografía en columna C18 de fase inversa eluyendo con tampón A (v/v): agua: ácido trifluoroacético al 0,05 % y tampón B (v/v): acetonitrilo:ácido trifluoroacético al 0,05 % (98:2 v/v a 0:100 v/v). El disolvente orgánico se retiró al vacío y el disolvente acuoso se retiró por liofilización para dar el compuesto 81 en forma de un aceite incoloro transparente (15,4 mg, 34 %) m/z [M+2H-mPEG(7u) fragmento]2* 824,34 Da.
Etapa 2: Síntesis del compuesto 80:
A una solución agitada de compuesto 81 (14,0 mg) en metanol:agua (500 pl, 9:1 v/v) a temperatura ambiente se le añadió Oxone® (13,1 mg, Sigma-Aldrich). Después de 230 min, los volátiles se retiraron al vacío. El residuo resultante se disolvió en agua (1,0 ml) y se purificó por cromatografía en columna C18 de fase inversa eluyendo con tampón A (v/v): agua: ácido trifluoroacético al 0,05 % y tampón B (v/v): acetonitrilo:ácido trifluoroacético al 0,05 % (98:2 v/v a 0:100 v/v). El disolvente orgánico se retiró al vacío y el disolvente acuoso se retiró por liofilización para dar el compuesto 80 en forma de un aceite incoloro transparente (12,7 mg, 88 %) m/z [M+3H]3* 679,16 Da.
Ejemplo 39: S ín te s is d e u n re a c t iv o d e c o n ju g a c ió n 82 q u e c o m p re n d e 7 u n id a d e s re p e t id a s d e g ru p o s s a lie n te s de e t ile n g lic o l s u lfo n a , e n la z a d o r no a ro m á tic o y u n a c a rg a ú til c ito tó x ic a d e a u r is ta t in a .
Figure imgf000054_0001
Etapa 1: Síntesis del compuesto 83:
Figure imgf000054_0002
A una solución agitada de ácido 3-bromo-2-(bromometil)propiónico (1,32 g, Alfa Aesar) en metanol (50,0 ml) a temperatura ambiente se le añadieron gránulos de hidróxido sódico triturados (428 mg, Fisher Scientific). La mezcla se calentó hasta que los sólidos se disolvieron. Se añadió la sal sódica del ácido bencenosulfínico (1,76 g, Sigma Aldrich) y la mezcla de reacción se calentó a reflujo en una atmósfera de nitrógeno inerte. Después de 4,0 h, la mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente y se agitó durante una noche en una atmósfera de nitrógeno inerte. Después de 20 h, los volátiles se retiraron al vacío. El residuo resultante se disolvió en hidróxido sódico 0,5 M (30 ml) y se lavó con éter dietílico (3 x 10,0 ml). La fracción acuosa se hizo ácida con ácido clorhídrico al 37 % y dio un precipitado de color blanco. El precipitado se recogió por filtración de Buchner, el retenido se lavó con agua destilada (3 x 20,0 ml) y el disolvente acuoso se retiró por liofilización para dar el compuesto 83 en forma de un polvo de color blanco (632 mg, 32 %) m/z [M+H]+ 369,08 Da; [M+Na]+ 391,04 Da.
Etapa 2: Síntesis del compuesto 84:
Figure imgf000054_0003
A una solución agitada del compuesto 83 (111 mg) en dimetilformamida (2,0 ml) a temperatura ambiente se le añadieron alfa-metoxi-omega-mercapto hepta(etilenglicol) (428 mg, Iris Biotech) y trietilamina (251 jl). La mezcla de reacción resultante se agitó en una atmósfera de nitrógeno inerte a temperatura ambiente. Después de 20 h, la mezcla en bruto de reacción se diluyó con agua (1,0 ml) y se purificó por cromatografía en columna C18 de fase inversa eluyendo con tampón A (v/v): agua: ácido trifluoroacético al 0,05 % y tampón B (v/v): acetonitrilo:ácido trifluoroacético al 0,05 % (98:2 v/v a 0:100 v/v). El disolvente orgánico se retiró al vacío y el disolvente acuoso se retiró por liofilización para dar el compuesto 84 en forma de un aceite incoloro transparente (154 mg, 64 %) m/z [M-PEG-(7u)]+ 473,05 Da.
Etapa 3: Síntesis del compuesto 85:
A una solución agitada de ácido bis-mPEG(7u)-sulfuro-propanoico (65,0 mg) en metanol:agua (1,5 ml, 9:1 v/v) a temperatura ambiente se le añadió Oxone® (151 mg, Sigma-Aldrich). Después de 3,0 h, los volátiles se retiraron al vacío. El residuo resultante se disolvió en agua (800 j l) y se purificó por cromatografía en columna C18 de fase inversa eluyendo con tampón A (v/v): agua: ácido trifluoroacético al 0,05 % y tampón B (v/v): acetonitrilo:ácido trifluoroacético al 0,05 % (98:2 v/v a 0:100 v/v). El disolvente orgánico se retiró al vacío y el disolvente acuoso se retiró por liofilización para dar el compuesto 85 en forma de un aceite incoloro transparente (41,7 mg, 59 %) m/z [M+H]+ 860,91 Da.
Etapa 4: Síntesis del compuesto 82:
Se prepararon soluciones madre de HATU (26,4 mg) en DMF (200 j l) y NMM (7,6 j l) en DMF (200 jl). Se añadió una solución de DMF (200 j l) del compuesto 83 (12,0 mg) a una solución de d Mf (400 j l ) de NH2-Val-Cit-PAB-MMAE (21,5 mg, Concortis). La mezcla de reacción resultante se agitó a temperatura ambiente en una atmósfera de nitrógeno inerte. Se añadieron alícuotas de HATU (80 j l ) y NMM (80 j l ) a los 0 min y 40 min para un total de 2 adiciones. Después de 180 min, los volátiles se retiraron al vacío. El residuo resultante se disolvió en agua:acetonitrilo (1,0 ml, 1:1 v/v) y se purificó por cromatografía en columna C18 de fase inversa eluyendo con tampón A (v/v): agua: ácido trifluoroacético al 0,05% y tampón B (v/v): acetonitrilo:ácido trifluoroacético al 0,05% (98:2 v/v a 0:100 v/v). El disolvente orgánico se retiró al vacío y el disolvente acuoso se retiró por liofilización para dar el reactivo 82 en forma de un polvo de color blanco (13,6 mg, 50 %). m/z [M+2H]2+ 983,45 Da.
Ejemplo 40: Síntesis de un reactivo de conjugación 86 que comprende 7 unidades repetidas de grupos salientes de etilenglicol sulfona y enlazador no aromático.
Figure imgf000055_0001
Etapa 1: Síntesis del compuesto 87.
Figure imgf000055_0002
A una solución agitada del compuesto 84 (15,0 mg) en tolueno (250 j l) a temperatura ambiente se le añadieron mPEG-(23u)-OH (19,7 mg, Iris Biotech), trifenilfosfina (5,43 mg, Sigma Aldrich) y azodicarboxilato de diisopropilo (4,1 jl, Sigma Aldrich). La mezcla de reacción resultante se agitó en una atmósfera de nitrógeno inerte a temperatura ambiente. Después de 30 min, se añadieron trifenilfosfina (5,43 mg, Sigma Aldrich) y azodicarboxilato de diisopropilo (4,10 jl , Sigma Aldrich) adicionales. La mezcla de reacción se agitó en una atmósfera de nitrógeno inerte a temperatura ambiente. Después de 1,0 h, los volátiles se retiraron al vacío. El residuo resultante se disolvió en agua (700 j l) y se purificó por cromatografía en columna C18 de fase inversa eluyendo con tampón A (v/v): agua: ácido trifluoroacético al 0,05% y tampón B (v/v): acetonitrilo:ácido trifluoroacético al 0,05% (98:2 v/v a 0:100 v/v). El disolvente orgánico se retiró al vacío y el disolvente acuoso se retiró por liofilización para dar el compuesto 87 en forma de una cera incolora transparente (18,5 mg, 54 %) m/z [M-PEG-(7u)]+ 750,19 Da.
Etapa 2: Síntesis del compuesto 86.
A una solución agitada del compuesto 87 (14,5 mg) en metanol:agua (1,0 ml, 9:1 v/v) a temperatura ambiente se le añadió Oxone® (14,7 mg, Sigma-Aldrich). Después de 3,0 h, la mezcla de reacción se filtró a través de algodón (lecho de 1,5 cm). El producto en bruto se purificó por cromatografía en columna C18 de fase inversa eluyendo con tampón A (v/v): agua: ácido trifluoroacético al 0,05 % y tampón B (v/v): acetonitrilo:ácido trifluoroacético al 0,05 % (98:2 v/v a 0:100 v/v). El disolvente orgánico se retiró al vacío y el disolvente acuoso se retiró por liofilización para dar el compuesto 86 en forma de una cera incolora transparente (7,1 mg, 47 %) m/z [M+3H]3+ 629,91 Da.
Ejemplo 41: Síntesis de un reactivo de conjugación bifuncional 88 que comprende 7 unidades repetidas de grupos salientes de etilenglicol sulfona y un espaciador de polietilenglicol.
Figure imgf000056_0001
Se prepararon soluciones madre de HATU (448 mg) en DMF (2,0 ml) y NMM (129 |jl) en DMF (2,0 ml). Una solución de DMF (500 j l) de amino-PEG-(11u)-amina (64,1 mg, Iris Biotech) se añadió a una solución de DMF (2,0 ml) de ácido 4-[2,2-bis[alfa-metoxi-omega-sulfonil hepta(etilenglicol)]acetil]benzoico (250 mg). La mezcla de reacción resultante se agitó a temperatura ambiente en una atmósfera de nitrógeno inerte. Se añadieron alícuotas de HATU (800 j l) y NMM (800 j l) en el tiempo 0 min y se añadieron alícuotas de HATU (200 j l) y NMM (200 j l) en el tiempo 50 min para un total de 2 adiciones. Después de 2,0 h, los volátiles se retiraron al vacío. El residuo resultante se disolvió en agua (1,0 ml) y se purificó por cromatografía en columna C18 de fase inversa eluyendo con tampón A (v/v): agua: ácido trifluoroacético al 0,05% y tampón B (v/v): acetonitrilo:ácido trifluoroacético al 0,05% (98:2 v/v a 0:100 v/v). El disolvente orgánico se retiró al vacío y el disolvente acuoso se retiró por liofilización para dar el reactivo 88 en forma de un aceite incoloro transparente (200 mg, 69 %). m/z [M+H]2+ 1219,5 Da [M+2H]3+ 813,35 Da, [M+3H]4+ 610,28 Da.
Ejemplo 42: Síntesis de un reactivo de conjugación 89 que comprende 7 unidades repetidas de grupos salientes de etilenglicol sulfona y una cadena lateral de ácido sulfónico.
Figure imgf000056_0002
A una solución agitada de ácido 3-(A/-(3-sulfoprop¡l)-4-(3-tos¡l-2-(tos¡lmetil)propano¡l)benzam¡do)propano¡co (Click Chemistry Tools LLC, 20,0 mg) en dimetilformamida (500 j l) a temperatura ambiente se le añadieron alfa-metoxiomega-mercapto hepta(etilenglicol) (30,2 mg, Iris Biotech) y trietilamina (23,6 jl). La mezcla de reacción resultante se agitó en una atmósfera de nitrógeno inerte a temperatura ambiente. Después de 3,5 h, el producto intermedio en bruto se purificó mediante cromatografía en columna C18 de fase inversa eluyendo con tampón A (v/v): agua: ácido trifluoroacético al 0,05% y tampón B (v/v): acetonitrilo:ácido trifluoroacético al 0,05% (98:2 v/v a 0:100 v/v). El disolvente orgánico se retiró al vacío y el disolvente acuoso se retiró por liofilización.
El residuo transparente incoloro resultante se disolvió en metanol: agua (750 jl, 9:1 v/v) y la solución se añadió a Oxone® (52,1 mg, Sigma-Aldrich). La mezcla de reacción resultante se agitó en una atmósfera de nitrógeno inerte a temperatura ambiente. Después de 4,5 h el producto en bruto se purificó por cromatografía en columna C18 de fase inversa eluyendo con tampón A (v/v): agua: ácido trifluoroacético al 0,05 % y tampón B (v/v): acetonitrilo:ácido trifluoroacético al 0,05 % (98:2 v/v a 0:100 v/v). El disolvente orgánico se retiró al vacío y el disolvente acuoso se retiró por liofilización para dar el compuesto 89 en forma de un aceite incoloro transparente (4,71 mg, 14 %) m/z [M+H]2+ 579,67 Da, [M+H2O]2* 588,17 Da.
Ejemplo 43: PEGilación en un enlace disulfuro Fab reducido usando los reactivos de conjugación 63, 68 (fuera de las reivindicaciones) y 70.
Al Fab de trastuzumab producido por digestión con papaína se le añadió una solución madre de DTT 1 M (25 jl, concentración final 10 mM), la mezcla de reducción se mezcló brevemente usando un vórtice y se incubó a 22 °C durante 1 h. A continuación, se retiró el reductor usando una columna PD10 (GE Healthcare) equilibrada con tampón de fosfato sódico 20 mM pH 7,5, NaCl 150 mM, EDTA 20 mM. El Fab reducido se diluyó adicionalmente a 1,2 mg/ml con el mismo tampón. Los reactivos 63, 68 y 70 se disolvieron independientemente en acetonitrilo a 0,719 mM y se añadieron a soluciones separadas de Fab reducido (1,5 equiv. de reactivo por Fab). Se dejó que las reacciones de PEGilación progresaran a 22 °C, después de lo cual se tomaron muestras para el análisis de HPLC HIC después de 22 h. El análisis de HPLC HIC de cada mezcla de reacción mostró que el % de conversión a Fab PEGilado para los reactivos 63, 68 y 70 fue del 95 %, 90 % y 90 % respectivamente.
Ejemplo 44: Conjugación del reactivo 7 2 con trastuzumab parcialmente reducido. Se calentó trastuzumab (3,5 mg, 5,2 mg/ml) en fosfato sódico 20 mM, pH 7,5 (EDTA 20 mM; NaCl 150 mM) a 40 °C durante 15 min. Al trastuzumab, se le añadió TCEP 2,08 mM (28 j l) y la mezcla resultante se incubó a 40 °C durante 1 h. Después de 1 h, el trastuzumab tratado con TCEP se enfrió a 22 °C. Una porción de la solución de trastuzumab (3,2 mg, 0,64 ml, 5,0 mg/ml) se diluyó con fosfato sódico 20 mM, pH 7,5 (EDTA 20 mM; NaCI 150 mM) (0,12 ml). Se cargaron tres viales con la solución de mAb diluida (1 mg, 238 jl). Las soluciones del reactivo 72, (3,2 mM) se prepararon en DMF. Las soluciones del reactivo (12,5 jl, 6,0 equiv. por mAb) se añadieron a viales separados, las reacciones se mezclaron y después se incubaron a 22 °C. A las 22 h, las muestras de la reacción se inactivaron con W-acetil-L-cisteína (20 equiv. sobre reactivo) antes del análisis por HIC. El análisis de HIC HPLC mostró que el DAR promedio de Trastuzumab conjugado con el reactivo 72 fue de 4,5.
Ejemplo 45: Conjugación de los reactivos 82 y 86 a trastuzumab.
Ambos reactivos 82 y 86 se conjugaron con el anticuerpo trastuzumab usando protocolos idénticos. Brevemente, trastuzumab (5,2 mg/ml) en tampón (tampón de fosfato sódico 20 mM, NaCl 150 mM, EDTA 20 mM, pH 8,4) se redujo con TCEP (6 equiv.) a 40 °C durante 1 h. La conjugación del anticuerpo con 1,5 equivalentes molares de reactivo 82 u 86 por enlace disulfuro entre cadenas se realizó después a 40 °C. Esto se logró mediante la adición de reactivo 82 o reactivo 86 en acetonitrilo (acetonitrilo al 5 % v/v en cada reacción). La solución de anticuerpo se diluyó a 4,0 mg/ml con tampón de fosfato sódico 20 mM, NaCl 150 mM, EDTA 20 mM, pH 8,4. Cada solución se mezcló suavemente y se incubó a 40 °C durante 22 h. A las 22 h, las reacciones se trataron con W-acetil-L-cisteína (20 equiv. sobre reactivo) durante 1 h a 22 °C. Las reacciones se analizaron posteriormente mediante HIC analítico. El % de conversión en producto utilizando los reactivos 82 y 86 se determinó en base al % de área de los picos de absorbancia medidos a 280 nm a partir de los cromatogramas de HIC. Para los reactivos 82 y 86, el % de conversión a valores de producto fue 100 % y 50 % respectivamente.
Ejemplo 46: PEGilación en un enlace disulfuro Fab reducido usando los reactivos de conjugación 75, 79 y 80 y el reactivo 89.
Los reactivos 75, 79, 80 y 89 se conjugaron a Fabtrast de una manera similar a la descrita para los reactivos de conjugación 63, 68 y 70 en el ejemplo 43. Después de 22 h de reacción de conjugación, las muestras se analizaron mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras y no reductoras. El % de conversión de Fabtrast PEGilado con cada uno de los reactivos se estimó a partir de las mediciones de densidad de banda usando un sistema ImageQuant™ LAS 4010 (GE Healthcare) usando geles teñidos con InstantBlue™. Para los reactivos 75, 79, 80 y 89, los valores del % de conversión fueron 90 %, 20 %, 75 % y 40 % respectivamente.
Ejemplo 47: Síntesis de los reactivos de conjugación 90 (comparativo) y 91 (comparativo) que comprenden 3 o 5 grupos salientes de etilenglicol polimérico de unidades repetidas, respectivamente, y una carga útil citotóxica de auristatina.
Figure imgf000057_0001
Los reactivos de auristatina bis-mPEG(3u)sulfona-propanoil-benzamida-val-cit-PAB-MMAE 90 y bismPEG(5u)sulfona-propanoil-benzamida-val-cit-PAB-MMAE 91 se sintetizaron de forma análoga a el descrito para el reactivo 5 en el Ejemplo 4, usando los tioles 2-[2-(2-metoxietoxi)etoxi]-etanotiol y 2,5,8,11,14-pentaoxahexadecano-16-tiol respectivamente en lugar de alfa-metoxi-omega -mercapto hepta(etilenglicol) para la síntesis del compuesto 1 del Ejemplo 1.
Ejemplo 48: Síntesis de un reactivo de PEGilación 92 que comprende un único grupo saliente de etilenglicol de 7 unidades repetidas y un PEG de 24 unidades.
Figure imgf000058_0001
La síntesis del reactivo 92, mono-mPEG(7u)sulfona-(metil-acriloil)-benzamida-L-Glu-[OH]-[PEG(24u)-OMe] se realizó de acuerdo con Nature Protocols (2006, 1, 2241-2252) usando el compuesto 23 en el Ejemplo 10.
Ejemplo 49: Comparación de la conjugación de anticuerpos de los reactivos citotóxicos 90 (comparativo), 91 (comparativo) y 5 que poseen grupos salientes de etilenglicol polimérico.
Las condiciones de reacción usadas para la conjugación de los reactivos citotóxicos 90, 91 y 5 con trastuzumab (escala de 1 mg) fueron las mismas que las descritas anteriormente para el Ejemplo 20, usando MeCN al 1,25 % v/v como disolvente en la reacción de conjugación en lugar de DMF. Se tomaron alícuotas de la solución de reacción después de 2 y 4 h y cada una se inactivó mediante tratamiento con N-acetil-L-cisteína. Cada alícuota se analizó mediante HIC y se determinó % del perfil de producto DAR. Los resultados de la conjugación con los reactivos 90, 91 y 5 se muestran en la Tabla 3 y las Figuras 10 (2 horas) y 11 (4 horas). Se puede observar que los resultados obtenidos al usar el reactivo de acuerdo con la presente invención mejoran significativamente en comparación con los resultados obtenidos usando los reactivos de comparación, ya que la homogeneidad del producto es mucho mayor, siendo el producto predominantemente el conjugado DAR4 deseado.
Tabla 3: Comparación de la conjugación de los reactivos 90, 91 y 5 con un anticuerpo después de 2 h y 4 h de reacción.
Figure imgf000058_0002
Ejemplo 50: Pegilación en un enlace disulfuro Fab reducido usando el reactivo 92.
El reactivo 92 se conjugó con un Fab reducido usando las mismas condiciones que las descritas en el Ejemplo 17. Las reacciones se analizaron posteriormente mediante SDS-PAGE y se observó el producto principal, Fab PEGilado, a 49 kDa frente a los estándares de proteína de peso molecular.
Ejemplo 51: Síntesis del reactivo de conjugación 93 que comprende una carga útil citotóxica de auristatina E ta p a 1: S ín te s is d e l c o m p u e s to 94.
Figure imgf000059_0001
Se disolvieron Boc-L-Glu (135 mg) y hexafluorofosfato de (benzotriazol-1-iloxi)tris-(dimetilamino)fosfonio (BOP) (724 mg) en DMF anhidra (4 ml) y se agitaron a 0 °C en una atmósfera de nitrógeno durante 1,25 h. Después, esta solución se añadió a una solución de H2N-PEG(12u)-Me (685 mg) y NMM (180 j l) en DMF (3 ml). Después, la solución se agitó en atmósfera de N2 durante 4 h. Después, la solución se agitó a 0-4 °C en una atmósfera de nitrógeno durante 4,5 h. Además, se añadieron BOP (241 mg) y NMM (60 jl), la mezcla de reacción se dejó durante 24 h a 4 °C. Los volátiles se retiraron al vacío y el residuo resultante se purificó por cromatografía ultrarrápida C18 de fase inversa eluyendo con tampón A (v/v): agua: acetonitrilo al 5 %:ácido fórmico al 0,1 % y tampón B (v/v): acetonitrilo:ácido fórmico al 0,1 % (100:0 v/v a 65:35 v/v). El disolvente orgánico se retiró al vacío y el disolvente acuoso se retiró por liofilización. El material se volvió a purificar por cromatografía ultrarrápida de fase normal eluyendo con acetato de etilo:metanol (100:0 v/v a 0:100 v/v). El disolvente orgánico se retiró al vacío y el disolvente acuoso se retiró por liofilización para dar el compuesto 94, Boc-Glu-[PEG(12u)-Me]2 en forma de un aceite incoloro (450 mg). m/z [M+H]+ (1331, 100 %), [M+2H]2+ (665, 100%).
Etapa 2: Síntesis del compuesto 95.
Figure imgf000059_0002
El compuesto 94 (450 mg) se disolvió en DCM (25 ml) a la que se le añadió TFA (2,5 ml). La solución se agitó a temperatura ambiente durante 5 h. Después de que los volátiles se retiraron al vacío. El residuo resultante se purificó por cromatografía ultrarrápida C18 de fase inversa eluyendo con tampón A (v/v): agua:acetonitrilo al 5 %:ácido trifluoroacético al 0,05% y tampón B (v/v): acetonitrilo:ácido trifluoroacético al 0,05% (100:0 v/v a 60:40 v/v). El disolvente orgánico se retiró al vacío y el disolvente acuoso se retiró por liofilización para dar el compuesto 95, Glu-[HN-PEG(12u)-Me]2 TFA en forma de una goma incolora transparente (320 mg) m/z [M+Na]1+ (1253,0, 10 %) [M+H]2+ (616,8, 100%).
Etapa 3: Síntesis del compuesto 96
Figure imgf000059_0003
A una solución agitada de Fmoc-L-Glu-(OtBu)-OH (36 mg) en DMF anhidra (2 ml) se le añadió HATU (37 mg). La mezcla de reacción se agitó a 0 °C en una atmósfera de nitrógeno durante 1 h y después se añadió a una solución del compuesto 95 (103,5 mg) y NMM (19 j l ) en DMF (1 ml). Se añadió DMF adicional (1 ml). La reacción agitada se dejó calentar a temperatura ambiente durante 5 h. Los volátiles se retiraron al vacío. El aceite de color amarillo pálido resultante se purificó mediante cromatografía ultrarrápida C18 de fase inversa eluyendo con tampón A (v/v): agua:acetonitrilo al 5 %:ácido fórmico al 0,1 % y tampón B (v/v): acetonitrilo:ácido fórmico al 0,1 % (100:0 v/v a 50:50 v/v). El disolvente orgánico se retiró al vacío y el disolvente acuoso se retiró por liofilización para dar el compuesto 96 Fmoc-L-Glu-(O‘Bu)-Glu-[HN-PEG(12u)-Me]2 (173 mg) en forma de una pasta de color blanco. m/z [M+1]1 (1638, 100 %) & [M+Na] (1660, 57%).
Etapa 4: Síntesis del compuesto 9Z
Figure imgf000060_0001
A una solución agitada del compuesto 96 (173 mg) en DMF anhidra (3,2 ml) se le añadió piperidina (104 jl). La solución se agitó a temperatura ambiente en argón durante 1,5 h. Los volátiles se retiraron al vacío y el residuo se trituró de manera repetida con hexano. El producto se secó al vacío para dar el compuesto 9Z, L-Glu-(O‘Bu)-L-Glu-[HN-PEG(12u)-Me]2 (152 mg) en forma de un aceite incoloro transparente. m/z [M+H]1+ (1416,7, 85%), [M+2H]2+ (708,5, 100 %), [M+Na]1+ (1438,7, 30 %).
Etapa 5: Síntesis del compuesto 98
Figure imgf000060_0002
A una solución agitada de ácido 4-[2,2-bis[alfa-metoxi-omega-sulfonil hepta(etilenglicol)]acetil]benzoico (114 mg) en DMF anhidra (3 ml) se le añadió HATU (51 mg). La mezcla de reacción se agitó a 0 °C durante 0,5 h, después se añadió a una solución de L-Glu(O‘Bu)-Glu-[HN-PEG(12u)-OMe]2. (152 mg) en DMF (2 ml) y se lavó con DMF adicional (1 ml), seguido de NMM (15 jl). La mezcla de reacción se agitó a 0-15 °C durante 3,5 h, después de las cuales los volátiles se retiraron al vacío. El residuo resultante se purificó por cromatografía ultrarrápida C18 de fase inversa eluyendo con tampón A (v/v): agua:acetonitrilo al 5 %:ácido fórmico al 0,1 % y tampón B (v/v): acetonitrilo:ácido fórmico al 0,1 % (100:0 v/v a 55:45 v/v). El disolvente orgánico se retiró al vacío y el disolvente acuoso se retiró por liofilización para dar el compuesto 98, Bis-mPEG(7u)sulfona-propanoil-benzamida-L-Glu-(O‘Bu)-Glu-[HN-pEG(12u)-Me]2 (161 mg) en forma de un aceite incoloro transparente. m/z [M+H]1+ (2366,7, 100%), [m 2H]2+ (1184,0, 80 %) [M+H2O]3+ (795,5, 100 %).
E ta p a 6: S ín te s is d e l c o m p u e s to 99
Figure imgf000061_0001
A la solución agitada del compuesto 98 (58 mg) en DCM anhidro (6 ml) se le añadió TFA (6 ml). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 h después de las cuales los volátiles se retiraron al vacío, se disolvieron en agua (25 ml) y se liofilizaron para dar el compuesto 99, Bis-mPEG(7u)sulfona-propanoil-benzamida-L-Glu-(OH)-Glu-[HN-PEG(12u)-OMe]2 (160,6 mg) en forma de un aceite incoloro transparente. m/z [M+H]1+ (2306,8, 90%), [M+2H]2+ (1153,0, 100 %).
Etapa 7: Síntesis del reactivo 93
El reactivo 93 se sintetizó de forma análoga al reactivo 24 del Ejemplo 11A a partir del compuesto 99 y la sal TFA valcit-PAB-MMAE. Bis-mPEG(7u)sulfona-propanoil-benzamida-L-Glu-(val-cit-PAB-MMAE)-Glu-[HN-PEG(12u)-Me]2 93 se aisló en forma de un aceite incoloro (69 %). m/z [M+H]1+ (3410,4, 90 %), [M+2H]2+ (1706,2, 60 %), [M+3H]3+ (1137,2, 85 %), [M+4H]4+ (852,8, 70 %).
La conjugación de Brentuximab con el reactivo de conjugación 93 se llevó a cabo como se describe en el Ejemplo 21 durante 16 h. Los resultados del HIC analítico muestran que la conversión al producto DAR4 fue del 67 %.
Ejemplo 52: Síntesis del reactivo de conjugación 100 que comprende una carga útil citotóxica de auristatina
Figure imgf000061_0002
El reactivo 100 se sintetizó de manera análoga al reactivo 24 del Ejemplo 11A usando el compuesto 20B en lugar del compuesto 23 y sal val-cit-PAB-MMAE TFA en lugar de val-cit-AHX-DM1.
El compuesto 20B se preparó de una manera análoga al compuesto 23 en el Ejemplo 10, usando H2N-PEG(12u)-tri(m-dpEG(24u) en lugar de H2N-PEG(24u). Bis-mPEG(7u)sulfona-propanoil-benzamida-L-Glu-[val-cit-PAB-MMAE]-[PEG(12u)-tri(m-dPEG(24u))] 100 se aisló en forma de un aceite incoloro. m/z [M+2H]2+(3166, 20 %), [M+3H]3+ (2111, 50 %), [M+4H]4+ (1583, 100 %).
La conjugación de Brentuximab con el reactivo de conjugación 100 se llevó a cabo como se describe en el Ejemplo 21 durante 16 h. Los resultados del HIC analítico muestran que la conversión al producto DAR4 fue del 65 %.
Ejemplo 53: Síntesis del reactivo de conjugación 101 que comprende dos cargas útiles citotóxicas de auristatina
Figure imgf000062_0001
Etapa 1: Síntesis del compuesto 102.
Figure imgf000062_0002
A una solución agitada de Fmoc-L-Glu-(O*Bu)-OH (2 g) en DMF anhidra (18 ml) se le añadieron HOBt (666 mg) y DIC (768 |jl). La mezcla de reacción se agitó a 0 °C durante 10 min y después 2,5 h a temperatura ambiente. Se añadieron H-L-Glu-(O‘Bu)-OH (1,19 g) y DIPEA (2,46 ml) y la mezcla de reacción se agitó durante 18 h a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se diluyó con agua (100 ml) y se acidificó a pH 2,0 añadiendo HCl diluido. La capa acuosa se extrajo con EtOAc (3 x 100 ml), y las fases orgánicas combinadas se lavaron con agua (2 x 50 ml) y solución de salmuera saturada (1 x 50 ml). La capa de EtOAc se secó sobre Na2SO4 durante 2 h y después se concentró en un rotavapor. El producto se aisló por cromatografía ultrarrápida C18 de fase inversa eluyendo con tampón A (v/v): agua: acetonitrilo al 5 %: ácido fórmico al 0,1 % y tampón B (v/v): acetonitrilo: ácido fórmico al 0,1 % (100:0 v/v a 80:20 v/v). El disolvente orgánico se retiró al vacío y el disolvente acuoso se retiró por liofilización para dar el compuesto Fmoc-L-Glu-(OtBu)-L-Glu-(OtBu)-OH 102 (875 mg) en forma de un sólido de color blanco. m/z [M+H]1+ (610,8, 85%), [M+Na]1+ (633,1, 55%), [2M+Na]+ (1243,2, 55 %).
E ta p a 2: S ín te s is d e l c o m p u e s to 103.
Figure imgf000063_0001
A una solución agitada de Fmoc-L-Glu-(OtBu)-L-Glu-(OtBu)-OH (510 mg) y NH2-PEG(24u)-OMe (1 g) en DMF anhidra (5 ml) se le añadieron y N,N-diisopropiletilamina (44 |jl) y HATU (48 mg). La mezcla de reacción se agitó a 0 °C durante 10 min y después 16 h a temperatura ambiente. La solución se concentró al vacío hasta 2 ml y el residuo se purificó por cromatografía ultrarrápida C18 de fase inversa eluyendo con tampón A (v/v): agua:acetonitrilo al 5 %:ácido fórmico al 0,1 % y tampón B (v/v): acetonitrilo:ácido fórmico al 0,1 % (100:0 v/v a 83:17 v/v). El disolvente orgánico se retiró al vacío y el disolvente acuoso se retiró por liofilización para dar el compuesto 103, Fmoc-Glu-(OtBu)-Glu-(OtBu)-PEG(24u)-OMe (644 mg) en forma de una pasta de color blanco. m/z [M+H]1+(1681,0, 40 %), [M+Na]1+(1704,0, 30%) y [M+2H]2+ (841,4, 55 %).
Etapa 3: Síntesis del compuesto 104.
Figure imgf000063_0002
A una solución agitada de Fmoc-Glu-(OtBu)-Glu-(OtBu)-PEG(24u)-OMe (193 mg) en DMF anhidra (900 j l) se le añadió piperidina (34 j l ) y la mezcla de reacción se agitó 1 h a temperatura ambiente. La solución se concentró al vacío a sequedad y el residuo se trituró con Et2O (2 x 2,5 ml). El producto se secó al vacío para dar el compuesto 104, H-L-Glu-(OtBu)-Glu-(OtBu)-PEG(24u)-OMe 166 mg) en forma de un sólido de color blanquecino.
Etapa 4: Síntesis del compuesto 105.
Figure imgf000063_0003
El reactivo 105 se sintetizó de manera análoga al compuesto 23 del Ejemplo 10 a partir del compuesto 104 y ácido 4-[2,2-bis[alfa-metoxi-omega-sulfonil hepta(etilenglicol)]acetil]benzoico. Bis-mPEG(7u)sulfona-propanoil-benzamida-Glu-(OtBu)-Glu-(OtBu)-PEG(24u)-OMe 105 se aisló en forma de un aceite incoloro. m/z [M+H]1+ (2407,2, 25 %), [M+Na]1+ (2429,4, 70 %).
Etapa 5: Síntesis del compuesto 106.
Figure imgf000064_0001
El reactivo 106 se sintetizó de manera análoga al reactivo 23 del Ejemplo 10 a partir del compuesto 105. BismPEG(7u)sulfona-propanoil-benzamida-Glu-(OH)-Glu-(OH)-PEG(24u)-OMe 106 se aisló en forma de un aceite incoloro. m/z [M+H]1+ (2294,2, 20 %), [M+Na]1 (2317,4, 10 %) y [M+2Na]2+ (1217,4, 100 %).
Etapa 6: Síntesis del reactivo 101.
A una solución agitada del compuesto 106 (28 mg), sal val-cit-PAB-MMAE TFA (31 mg) y HATU (14 mg) en DMF anhidra (1,5 ml) se le añadió N-metilmorfolina (7 j l ) y la mezcla de reacción se agitó a 0 °C durante 5 h. La solución se diluyó con agua (1 ml) y se purificó por cromatografía ultrarrápida C18 de fase inversa eluyendo con tampón A (v/v): agua:acetonitrilo al 5 %:TFA al 0,1 % y tampón B (v/v): acetonitrilo:TFA al 0,1 % (100:0 v/v a 60:40 v/v).
El disolvente orgánico se retiró al vacío y el disolvente acuoso se retiró por liofilización para dar el compuesto 101, bismPEG(7u)sulfona-propanoil-benzamida-bis-[Glu-(val-cit-PAB-MMAE)]-PEG(24u)-OMe (36 mg) en forma de un sólido de color blanco. m/z [M+2H]2+ (2252,7, 20 %), [M+3H]3+ (1501,6.7, 40 %) y [M+4H]4+ (1126,6, 100 %).
La conjugación de Brentuximab con el reactivo de conjugación 101 se llevó a cabo como se describe en el Ejemplo 21 durante 16 h. Los resultados del HIC analítico muestran que la conversión al producto DAR4 fue del 56 %.
Ejemplo 54: Síntesis del reactivo de conjugación 107 que comprende dos cargas útiles citotóxicas de auristatina.
E ta p a 1: S ín te s is d e l c o m p u e s to 108.
Figure imgf000065_0001
A una solución agitada de Boc-L-Glu(OH)-OH (51,6 mg) en DMF anhidra ( 6 ml) se le añadió BOP (277 mg). La solución se agitó a 0 °C durante 20 min antes de añadirse MeO-PEG(24)-NH2 (500 mg) seguido de NMM (69 jl). Después de 4 h, se añadieron cantidades adicionales de BOP (92 mg) y NMM (23 jl). Después de un adicional de 2,5 h, la mezcla de reacción se almacenó a -20 °C durante 18 h antes de concentrarse al vacío y se purificó por cromatografía en columna C18 de fase inversa, eluyendo con tampón A (v/v): agua: ácido trifluoroacético al 0,05 % y tampón B (v/v): acetonitrilo: ácido trifluoroacético al 0,05 % (100:0 v/v a 0:100 v/v). El disolvente orgánico se retiró al vacío y el disolvente acuoso se retiró por liofilización para dar un sólido de color blanco (373 mg). Se añadió ácido fórmico ( 6 ml) al sólido y la mezcla resultante se agitó en una atmósfera inerte durante 60 min antes de concentrarse al vacío. El residuo se disolvió en agua al 95 %:acetonitrilo al 5 %: ácido trifluoroacético al 0,05 % ( ~ 6 ml) y la liofilización durante una noche para dar TFAH 2N-Glu(PEG(24)-OMe)-PEG(24)-OMe, compuesto 108, en forma de un sólido de color blanquecino (330 mg). m/z [M+2H]2+ (1144, 5 %), [M+3H]3+ (763, 35 %), [M+4H] (573, 100 %).
Etapa 2: Síntesis del compuesto 109.
Figure imgf000065_0002
A una solución agitada de Fmoc-Glu(OtBu)-OH (2 g) en DMF anhidra (18 ml) a 0 °C se le añadieron HOBt ( 666 mg) y DIC (768 jl). La mezcla de reacción se dejó calentar a TA y después de 2 h, se añadieron Glu(O‘Bu)-OH (1,19 g) y DIPEA (2,46 ml). Después de agitar durante 20 h, la mezcla de reacción se concentró al vacío y se purificó por cromatografía en columna C18 de fase inversa, eluyendo con tampón A (v/v): agua:ácido trifluoroacético al 0,05 % y tampón B (v/v): acetonitrilo:ácido trifluoroacético al 0,05 % (100:0 v/v a 0:100 v/v). El disolvente orgánico se retiró al vacío y el disolvente acuoso se retiró por liofilización para dar Fmoc-(L-Glu(O‘Bu))2-OH, compuesto 109, en forma de un sólido de color blanco (1,03 g). m/z [2M+H]+ (1221, 15 %), [M+H]+ (611,60 %), [M-‘Bu+H]+ (554, 65 %), [M-2‘Bu+H]+ (499, 100 %).
Etapa 4: Síntesis del compuesto 110.
A una solución agitada del compuesto 108 (330 mg) en DMF anhidra (10 ml) se le añadió el compuesto 109 (100 mg). A 0 °C, después se añadieron HATU (156 mg) y NMM (45 j l ) y la solución resultante se agitó durante 5 min antes de la adición adicional de NMM (3 j l ) y HATU (11 mg). Se dejó agitar la solución de reacción durante otros 20 min antes de calentarla a temperatura ambiente, después de lo cual se continuó agitando durante 4 h más. Después de este tiempo, se añadieron cantidades adicionales de HATU (51 mg) y NMM (15 jl). Después de un adicional de 1,5 h, la mezcla se almacenó a -20 °C durante 18 h antes de purificarse mediante cromatografía en columna de fase inversa C18, eluyendo con tampón A (v/v): agua:ácido trifluoroacético al 0,05% y tampón B (v/v): acetonitrilo:ácido trifluoroacético al 0,05% (100:0 v/v a 0:100 v/v). El disolvente orgánico se retiró al vacío y el disolvente acuoso removed por liofilización para dar Fmoc-(L-Glu(O‘Bu))2-L-Glu(PEG(24)-OMe)-PEG(24)-OMe, compuesto 110, en forma de un sólido de color blanco (193 mg). m/z [M+3H]3+ (961, 20 %), [M-‘Bu+4H]4+ (707, 100 %), [M-2‘Bu+4H]4+ (693, 85 %), [M+5H]5+ (577, 75 %).
Etapa 5: Síntesis del compuesto 111.
Figure imgf000066_0001
A una solución agitada de 111 (193 mg) en DMF anhidra (1,5 ml) se le añadió piperidina (20 jl). Después de 90 min, se añadió una cantidad adicional de piperidina (13 j l) y la reacción se agitó durante otros 90 min antes de almacenarse a -20 °C durante 18 h. El disolvente se retiró a alto vacío y el residuo resultante se trituró en hexano. El residuo se secó adicionalmente a alto vacío durante 30 min antes de disolverse en una mezcla 50:50 de tampón A:tampón B (2 ml, tampón A (v/v): agua:ácido trifluoroacético al 0,05 % y tampón B (v/v): acetonitrilo:ácido trifluoroacético al 0,05%) y se liofilozó durante una noche para dar TFA-H2N-(L-Glu(O‘Bu))2-L-Glu(PEG(24)-OMe)-PEG(24)-OMe, compuesto 1 1 1 , en forma de un sólido de color azul pálido (186 mg). m/z [M+3H]3+ (887, 20 %), [M+4H]4+ (6 6 6 , 100 %), [M+5H]5+ (533, 30 %).
Etapa 6 : Síntesis del compuesto 112.
Figure imgf000066_0002
A una solución agitada de ácido 4-[2,2-bis[alfa-metoxi-omega-sulfonil hepta(etilenglicol)]acetil]benzoico (71 mg) en DMF anhidra (1,5 ml) se le añadió a HATU (28 mg). La mezcla se enfrió a 0 °C y se agitó en una atmósfera inerte durante 30 min. Se añadió una solución de 111 (186 mg) en DMF anhidra (2,5 ml), seguido de HATU (22,9 mg) y NMM (14,7 j l) y la mezcla se dejó calentar a TA.
Después de 3 h, se añadieron cantidades adicionales de ácido 4-[2,2-bis[alfa-metoxi-omega-sulfonil hepta(etilenglicol)]acetil]benzoico (18 mg), HATU (50,8 mg) y NMM (15 jl). Después de un adicional de 1,5 h, se añadieron cantidades adicionales de ácido 4-[2,2-bis[alfa-metoxi-omega-sulfonil hepta(etilenglicol)]acetil]benzoico (9 mg), HATU (51 mg) y NMM (15 jl). La mezcla de reacción se agitó durante un adicional de 8 h y se purificó dos veces por cromatografía en columna C18 de fase inversa, eluyendo con tampón A (v/v): agua:ácido trifluoroacético al 0,05 % y tampón B (v/v): acetonitrilo:ácido trifluoroacético al 0,05 % (100:0 v/v a 0:100 v/v). El disolvente orgánico se retiró al vacío y el disolvente acuoso removed por liofilización para dar 1 1 2 , en forma de un aceite de color amarillo pálido (cuantitativo asumido), m/z [M+4H]4+ (902, 60 %), [M-‘Bu+4H]4+ (8 8 8 , 60 %), [M-2‘Bu+4H]4+ (874, 45 %), [M-‘Bu+5H]5+(711, 100 %).
Etapa 7: Síntesis del compuesto 113.
Figure imgf000067_0001
Se añadió ácido fórmico (2 ml) a 112 en una atmósfera inerte. La mezcla de reacción se agitó durante 60 min antes de concentrarse al vacío. El material se purificó por cromatografía en columna C18 de fase inversa, eluyendo con tampón A (v/v): agua:ácido trifluoroacético al 0,05 % y tampón B (v/v): acetonitrilo:ácido trifluoroacético al 0,05 % (100:0 v/v a 0:100 v/v). El disolvente orgánico se retiró al vacío y el disolvente acuoso se retiró por liofilización para dar 113, en forma de un aceite incoloro (28,1 mg). m/z [M+3H]3+ (1165, 5 %), [M+4H]4+ (874, 65 %), [M+5H]5+ (699, 1 00 %).
Etapa 7: Síntesis del reactivo 107.
A una solución agitada de 113 (15 mg) en DMF anhidra (270 pl) se le añadió HATU (4 mg). La mezcla se enfrió a 0 °C y se agitó en una atmósfera inerte durante 20 min. Se añadió una solución de val-Cit-PAB-MMAE (12 mg) en DMF anhidra (300 pl), seguido de HATU (2,5 mg) y NMM (2 pl) y la mezcla se dejó calentar a TA. Después de 4 h 20 min, se añadieron cantidades adicionales de HATu (3,3 mg) y NMM (0,9 pl). La mezcla de reacción se agitó durante un adicional de 2 h antes de almacenarse a -20 °C durante 18 h. Tras el calentamiento a TA, se añadieron HATU (3,3 mg) y NMM (0,9 pl) a la solución agitada. Después de unas 4,5 h, se añadieron cantidades adicionales de HATU (1,6 mg) y NMM (0,5 pl) y la reacción se dejó agitar durante un adicional de 2,5 h antes de almacenarse a -20 °C durante 18 h. El material se purificó por cromatografía en columna C18 de fase inversa, eluyendo con tampón A (v/v): agua:ácido trifluoroacético al 0,05% y tampón B (v/v): acetonitrilo:ácido trifluoroacético al 0,05% (100:0 v/v a 0:100 v/v). El disolvente orgánico se retiró al vacío y el disolvente acuoso removed por liofilización para dar 107, en forma de un sólido de color blanco (13,8 mg). m/z [M+4H]4+ (1426, 5 %), [M+5H]5+ (1141, 70%), [M+6 H]6+ (951, 100 %), [M+7H]7+ (815, 20%).
La conjugación de Brentuximab con el reactivo de conjugación 107 se llevó a cabo como se describe en el Ejemplo 21 durante 17 h. Los resultados del HIC analítico muestran que la conversión al producto DAR4 fue del 61 %.

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un reactivo de conjugación capaz de reaccionar con al menos un nucleófilo presente en un péptido o proteína, cuyo reactivo lleva una carga útil que es un agente de diagnóstico, terapéutico o de marcado o un agente de unión para un agente de diagnóstico, terapéutico o de marcado, y cuyo reactivo contiene en al menos un grupo saliente que se pierde al reaccionar con dicho nucleófilo, caracterizado por que dicho grupo saliente incluye una porción -(CH2CH2Ü)n- en la que n es un número de seis o más, y en donde:
    a) dicho reactivo de conjugación es de fórmula (Ic), (Ic'), (Id), (Id'), (Ie), (Ie'), (IIa) o (IIIb):
    Figure imgf000068_0001
    o
    D-Q-W-CR4R4 '-CR4 L.L' (IIa)
    o
    D-Q-N H-CO-Ar-CO-(CH2)2-L (Illb)
    en donde:
    D representa una carga útil que es un agente de diagnóstico, terapéutico o de marcado o
    un agente de unión para un agente de diagnóstico, terapéutico o de marcado;
    Q representa un grupo de enlace;
    W representa un grupo captador de electrones;
    A representa una cadena de alquileno o alquenileno C1-5;
    B representa un enlace o una cadena de alquileno o alquenileno C1-4;
    Ar representa un arilo opcionalmente sustituido;
    cada R4 representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo C1-C4;
    R4 ' representa un átomo de hidrógeno o R4 ' y L' juntos representan un enlace;
    m es de 0 a 4;
    L es un grupo saliente que incluye una porción -(CH2CH2O)n- en la que n es un número de seis o más; y L' es un grupo saliente que incluye una porción -(CH2CH2O V en la que n es un número de seis o más, es un grupo saliente de otra estructura, o R4 ' y L' juntos representan un enlace; o
    los dos L de un reactivo de conjugación juntos representan un grupo saliente que incluye una porción -(CH2CH2O)n- en la que n es un número de seis o más; o
    L y L' juntos representan un grupo saliente que incluye una
    porción -(CH2CH2O)n- en la que n es un número de seis o más;
    o
    b) dicho reactivo de conjugación incluye uno de los siguientes grupos funcionales:
    Figure imgf000069_0001
    en el que un L es un grupo saliente que incluye una parte -(CH2CH2O)n- en el que n es un número de seis o más y el otro L es un grupo saliente que incluye una parte -(CH2CH2O V en el que n es un número de seis o más o es un grupo saliente de otra estructura; o
    Figure imgf000069_0002
    en la que L es un grupo saliente que incluye una porción -(CH2CH2O V en el que n es un número de seis o más; y en donde el átomo de nitrógeno de cada anillo de maleimida está unido a un grupo de fórmula D-Q, en donde D y Q son como se han definido anteriormente;
    y en donde la porción -(CH2CH2O V tiene un peso molecular de hasta 5 kDa; y
    también, en donde dicho grupo saliente es de la fórmula -SP, -OP, -SO2P, -OSO2P, -N+PR2R3, o es un grupo de fórmula -S-P-S-, -O-P-O-, -SO2-P-SO2-, -OSO2-P-OSO2- o - N+R2R3-P-N+R2R3-, en la que P es un grupo que incluye un porción -(CH2CH2O V y cada uno de R2 y R3 representa independientemente un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo C1-4 o un grupo P.
    2. Un reactivo de conjugación de acuerdo con la reivindicación 1, en el que n es de 6 a 9.
    3. Un reactivo de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que dicho grupo saliente es de fórmula -SO2P.
    4. Un reactivo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho grupo saliente incluye -(CH2CH2O V R 1 donde R1 es un grupo de protección; o en el que dicho grupo -(CH2CH2O)n-tiene dos puntos de unión dentro del reactivo.
    5. Un reactivo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho grupo saliente es -S-(CH2CH2O)n-(CH2CH2 )-S-, -O-(CH2CH2O)n-(CH2CH2 )-O-, -SO2-(CH2CH2O)n-(CH2CH2)-SO2-, -OSO2-(CH2CH2O)n-(CH2CH2 )-OSO2-, -N+R2R3-(CH2CH2O)n-(CH2CH2)-N+R2R3-, o uno de los grupos de fórmula
    Figure imgf000070_0001
    donde R1 es un grupo de protección y cada uno de R2 y R3 representa independientemente un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo C1-4.
    6. Un reactivo de acuerdo con la reivindicación 5, en el que dicho grupo saliente es -SO2-(CH2CH2O)n-(CH2CH2)-SO2-, o en el que R1 representa un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo C1-4, un grupo arilo opcionalmente sustituido o un grupo de fórmula -CH2CH2CO2H o -CH2CH2NH2.
    7. Un reactivo como se reivindica en cualquier reivindicación precedente, en el que D-Q incluye un fármaco o un polímero o tanto un fármaco como un polímero.
    8. Un reactivo de acuerdo con la reivindicación 7, en la que el fármaco, si está presente, es un fármaco citotóxico, y el polímero, si está presente, es polietilenglicol.
    9. Un reactivo de conjugación capaz de reaccionar con dos nucleófilos presentes en un péptido o proteína, que contiene un grupo saliente que se pierde al reaccionar con dichos nucleófilos, caracterizado por que dicho grupo saliente tiene dos puntos de unión dentro del reactivo de conjugación e incluye una porción: (C ^C H 2O)n1- en el que n1 es un número de dos o más, y en el que dicho reactivo de conjugación es de fórmula (Ic), (Id), (Ie) o (IIa):
    Figure imgf000070_0002
    o
    D-Q-W-CR4R4 '-CR4.L.L' (IIa)
    en donde:
    D representa una carga útil que es un agente de diagnóstico, terapéutico o de marcado o un agente de unión para un agente de diagnóstico, terapéutico o de marcado;
    Q representa un grupo de enlace;
    W representa un grupo captador de electrones;
    A representa una cadena de alquileno o alquenileno C1-5;
    B representa un enlace o una cadena de alquileno o alquenileno C1-4;
    R4 representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo C1-4, R4 ' representa un átomo de hidrógeno;
    los dos L de un reactivo de conjugación juntos representan un grupo saliente que incluye una porción -(CH2CH2O)n1- en la que n1 es un número de dos o más; o L y L' juntos representan un grupo saliente que incluye una porción -(CH2CH2O)ni- en la que n i es un número de dos o más;
    y en donde la porción -(CH2CH2O)ni- tiene un peso molecular de hasta 5 kDa; y también en donde dicho grupo saliente es de la fórmula -S-P-S-, -O-P-O-, -SO2-P-SO2-, -OSO2-P-OSO2- o - N+R2R3-P-N+R2R3-, en la que P es un grupo que incluye una porción -(CH2CH2O)n1- y cada uno de R2 y R3 representa independientemente un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo C1-4 o un grupo P.
    10. Un proceso para la conjugación de un péptido o proteína, que comprende hacer reaccionar dicho péptido o proteína con un reactivo de conjugación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.
    11. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 10, en el que la proteína es un receptor o proteína de unión a ligando o un anticuerpo o fragmento de anticuerpo.
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