CN101820920B - 新的缀合蛋白质和肽 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种将一种聚合物、尤其是PEG缀合至一种蛋白质或肽上的新方法，所述方法包括使一种聚合的缀合试剂与一种含有多聚组氨酸标签的蛋白质或肽在能够使缀合经由所述多聚组氨酸标签进行的条件下反应。形成的缀合物是新的。本发明还涉及新的通式(I)的缀合物，其中X和X’中的一个代表一种聚合物，另一个代表氢原子；每个Q独立地代表一种连接基团；W代表一种吸电子基团或可通过还原一种吸电子基团而得到的基团；或者，如果X’代表一种聚合物，则X-Q-W-一起可代表一种吸电子基团；另外，如果X代表一种聚合物，则X’和吸电子基团W可与其间的原子一起形成环；Z代表经由各组氨酸残基连接至A和B的一种蛋白质或一种肽；A为一种C1-5亚烷基或亚烯基链；并且B为一个键或一种C1-4亚烷基或亚烯基链。

Description

新的缀合蛋白质和肽
本发明涉及新的缀合蛋白质和肽，及其制备方法。
许多治疗活性分子，例如蛋白质，不具有获得临床医用药效所需要的性质。例如，许多天然蛋白质由于在施用于患者时具有一些固有缺陷而无法制成良药，所述缺陷包括：(1)蛋白质被血液和组织中存在的许多内肽酶和外肽酶消化；(2)许多蛋白质在某种程度上具有免疫性；以及(3)蛋白质可能通过肾超滤作用和内吞作用而被快速排泄。一些可在医药中用作活性治疗剂的分子具有全身毒性或缺乏最佳生物利用率和药物代谢动力学。在蛋白质从血液循环中快速清除的情况下，通常不得不将其频繁地施用于患者。频繁给药进一步增加了毒性——尤其是免疫诱发性毒性——的风险。
水溶性的合成聚合物，特别是聚烷撑二醇，广泛用于缀合治疗活性分子如蛋白质。以表明这些治疗性缀合物可通过延长循环时间和降低清除率、降低全身毒性、以及在一些情况下显示出提高的临床药效而有利地改变药物代谢动力学。使聚乙二醇PEG与蛋白质共价缀合的方法通常被称为“PEG化(PEGylation)”。
对于最优化药效以及确保剂量和剂量之间的一致性而言重要的是，对于每个分子而言，每个蛋白质缀合的聚合物分子的数目是相同的，并且在每个蛋白质分子中，每个聚合物分子均特定地共价缀合至相同的氨基酸残基。沿蛋白质分子位点上的非特定缀合会引起缀合产物的分布以及常常有未缀合的蛋白质，从而产生难以纯化和纯化昂贵的复杂混合物。
WO 2005/007197描述了一系列新的缀合试剂。所述缀合试剂可用以与生物分子例如蛋白质中的亲核基团反应，从而形成蛋白质-聚合物缀合物。这些试剂具有特别的效用，因为它们能够与蛋白质的一个二硫键中的两个硫原子缀合而得到新的硫醚缀合物。
固定金属离子亲和色谱(IMAC)是一种纯化蛋白质和肽的标准技术。在此技术中，通过合成方法将多聚组氨酸标签——常被称为“his-tag”(连续的多个组氨酸残基的短链，通常具有5或6个残基，在天然蛋白质中不存在)——连接至一种蛋白质，通常是连接至氨基酸链的末端之一。生成的蛋白质或肽被称为“组氨酸标签”蛋白质或肽。多聚组氨酸标签通过至少两个组氨酸残基与金属例如镍和钴强键合。在IMAC中，多聚组氨酸标签蛋白质穿过含镍柱或含钴柱。多聚组氨酸标签与所述柱强键合，从而使带有标签的蛋白质从混合物中分离出来。多聚组氨酸标签应用广泛，其可被连接至宽范围的蛋白质和肽，使它们或由此获得的产物之后从混合物中分离。
一些不带标签的蛋白质含有彼此接近的组氨酸残基，此类蛋白质也可键合至镍和钴IMAC柱，但通常与多聚组氨酸标签蛋白质相比键合强度较小。
我们现已发现一种将聚合物，尤其是PEG，缀合至蛋白质和肽上的改进的方法。在此方法中，聚合物被缀合至多聚组氨酸标签上。可以相信的是，出人意料地，能够结合至组氨酸残基上的反应试剂将优先与多聚组氨酸标签反应，而不是与天然蛋白质中存在的单个组氨酸残基反应。生成的缀合物是新的。WO 2005/007197中的反应试剂对于含多聚组氨酸标签的蛋白质和肽、以及天然蛋白质中含类似的组氨酸结构的蛋白质和肽而言，可作为极其有效且稳定的缀合剂来制备新的缀合物。
因此，本发明提供一种将聚合物缀合至含多聚组氨酸标签的蛋白质或肽上的方法，该方法包括使一种聚合的缀合试剂与所述蛋白质或肽在一定条件下反应，从而经由所述多聚组氨酸标签而发生缀合。本发明还提供一种将聚合物缀合至蛋白质或肽上的方法，该方法包括将一种多聚组氨酸标签引入所述蛋白质或肽中，然后使所述蛋白质或肽与一种聚合的缀合试剂在一定条件下反应，从而经由所述多聚组氨酸标签而发生缀合。
本发明的聚合物缀合物是新的，因此，本发明还提供一种含缀合至蛋白质或肽上的聚合物的化合物，所述缀合本质上经由多聚组氨酸标签进行。此类化合物可由以下通式表示：
X-Q’-(his)u-Z (I)
其中X代表一种聚合物；Q’代表一种连接基团；(his)u代表含u个组氨酸单元的多聚组氨酸标签；并且Z代表通过所述多聚组氨酸标签连接的一种蛋白质或肽。
能够键合至多聚组氨酸标签上的任意聚合的缀合试剂均可用于本发明方法。此类试剂包括WO 2005/007197中的双官能试剂，所述双官能试剂除了能结合至多聚组氨酸标签之外，还被发现能够结合至天然蛋白质或肽中存在(即在多聚组氨酸标签中不存在)的两个组氨酸残基，其中所述残基在天然结构中的位置足够靠近，能够使所述双官能试剂缀合至两个组氨酸残基。
因此，本发明还提供一种以下通式的化合物
其中X和X’中的一个代表一种聚合物，另一个代表氢原子；
每个Q独立地代表一种连接基团；
W代表一种吸电子基团或可通过还原一种吸电子基团而得到的基团；或者，如果X’代表一种聚合物，则X-Q-W-可一起代表一种吸电子基团；另外，如果X代表一种聚合物，则X’和吸电子基团W可与其间的原子一起形成环；
Z代表经由各组氨酸残基连接至A和B的一种蛋白质或一种肽；
A为一种C1-5亚烷基或亚烯基链；并且
B为一个键，或一种C1-4亚烷基或亚烯基链。
本发明的另一个组的新化合物由以下通式代表：
X-[Q-W-(CH＝CH)v-(CH2)2-Z]v’ (Ib)
其中X代表一种聚合物；Q代表一种连接基团；W代表一种吸电子基团或可通过还原一种吸电子基团而得到的部分；v代表0或1至4的整数；v’代表1至8的整数；并且Z代表经由一种多聚组氨酸标签连接的一种蛋白质或一种肽。在这些化合物中，v’优选代表1至6的整数，优选1至4，例如1。优选地，v为0。
可用于本发明方法的其它试剂包括能够酰基化或烷基化的试剂。所述试剂可为单官能或多官能的，包括例如PEG碳酸酯(例如PEG-对硝基苯基碳酸酯、PEG-琥珀酰亚胺碳酸酯、PEG-苯并三唑基碳酸酯)、PEG羧酸酯和PEG酯(例如PEG-琥珀酰亚胺酯和PEG-对硝基苯基酯及其衍生物)、PEG醛、PEG-氟代乙烷磺酰基化物(PEG-tresyl)或PEG-甲苯磺酰基化物(PEG-tosyl)、PEG-二氯三嗪或PEG-氯三嗪、PEG乙烯基砜、PEG马来酰亚胺和PEG-碘乙酰胺；以及含有除PEG之外的聚合物的相应试剂。
在本发明的新缀合物中，Z可由蛋白质或肽得到。在本说明书和通篇中，为简便将使用“蛋白质”一词，当提及“蛋白质”时，应当理解为提及的是“蛋白质或肽”，上下文另有要求的除外。
形成式Ia新缀合物的一部分的蛋白质必须含有至少两个组氨酸残基。这两个残基可存在于天然蛋白质中，在这种情况下，所述两个残基在天然结构中的位置必需足够靠近，以能够缀合至基团A和B。当两个组氨酸残基在蛋白质链中彼此邻近，或者它们可能会由于蛋白质的折叠而靠近时，所述缀合即可发生。这类蛋白质通常可结合至IMAC柱。例如，原核生物大肠杆菌(Escherichia coli)具有一种蛋白质YODA，由此可结合至IMAC柱。然而，优选的是，所述两个组氨酸残基构成已通过合适的方式连接至蛋白质或肽的多聚组氨酸标签——即在天然蛋白质或肽中不存在的组氨酸链——的一部分，所述方式例如化学方式、与多聚组氨酸标签或含有多聚组氨酸标签的部分一起进行转译后标记，或者通过蛋白质工程在与靶蛋白质融合的过程中插入组氨酸序列，例如通过使用编码所需长度的多聚组氨酸标签的具有短编码序列的基因。
多聚组氨酸标签可含有任意所需数目的组氨酸残基，例如最高达约12个残基。其必须含有至少2个残基；优选含有至少3个残基，尤其是4至10个残基，尤其是5至8个残基，例如5或6个残基。其可仅含有组氨酸残基，或除了组氨酸残基之外，也可含有一种或多种间隔残基或序列。
目前尚未获知本发明的缀合物中存在的结合的确切性质。一种可能的缀合物的制备方法示于附图1中，该制备方法使用一种具体试剂示出，其中SO2R各自代表离去基团，且其中R优选代表烷基、芳基、烷芳基或芳烷基，尤其是甲苯基。图2(a)和2(b)示出可通过图1的方法制备的其它缀合物。在图1和2中，设想的是连接至相邻的组氨酸残基上，但是，如果不是间距太大阻碍了缀合物的形成，则也不能排除连接至间隔开的组氨酸残基的情况。
除了带有多聚组氨酸标签外，如果需要，蛋白质还可进行衍生化或官能化。特别是，在缀合之前，天然蛋白质可先与各种保护基团反应以保护其上的敏感基团；或者可预先使用本发明方法或其它方法使其与一种或多种聚合物或其它分子缀合。另外，本发明的缀合物还可具有在根据本发明进行缀合之后缀合至蛋白质上的一种或多种另外的聚合物(包括蛋白质)或其它分子。本发明的新缀合物——其中蛋白质与一种或两种另外的聚合物缀合——分别示于附图3(a)、3(b)和3(c)中。在这些图中，聚合物与其连接基团一起示意地表示为A、B和C，而x、y和z代表以任意结合方式经由组氨酸残基与蛋白质缀合的聚合物A、B和C的总数目。当然，一种或多种聚合物经由除组氨酸之外的残基缀合也是可行的。除了与一种或多种另外的聚合物(包括蛋白质)缀合外，所述蛋白质还可与一种或多种选自例如小分子，如治疗物或诊断物；唾液酸；糖；和淀粉的分子缀合。因此，图3中的B和C可代表此类分子。另外，图3示出的A、B和C位于彼此相邻的位置，但这仅是示意性的，它们也可彼此间隔开。
许多市售的蛋白质含有多聚组氨酸标签，这或者是因为这些蛋白质之前已经通过IMAC进行过纯化，或者是为了有助于以后对蛋白质本身或由其获得的产物进行纯化。如果需要使蛋白质与一种聚合物缀合，则与多聚组氨酸标签的缀合提供了一种极其方便的路径，这在之前是没有想到的。缀合产物、尤其是PEG化产物，可以高度一致性地获得。使用WO 2005/007197中的导致与两个组氨酸残基发生缀合的缀合试剂使得形成一个大环，从而形成一种特别稳定的选择性的缀合物，其通常以高产率获得。
因为组氨酸标签通常是连接至蛋白质的表面——通常为蛋白质链的一端，并可位于蛋白质中任意所需位点，所以在引入多聚组氨酸标签之后，以及在多聚组氨酸标签上的特定位点与聚合物缀合之后，蛋白质的生物活性仍能很大程度地保留。因此，本发明可用于形成先前被证明使用常规缀合方法难以获得的蛋白质缀合物。
只要多聚组氨酸标签含有足够数目的组氨酸残基，本发明的缀合物就仍可使用IMAC纯化。为实现所述纯化，在多聚组氨酸标签中，至少两个、优选更多个组氨酸残基需保持未缀合和可用于与IMAC柱中的镍结合的状态。在缀合后，游离组氨酸残基数目的减少使得与IMAC柱的结合在未缀合的肽或蛋白质和缀合的衍生物之间具有选择性。当与相同的生物分子发生多重缀合时，IMAC能够使所述多重缀合的衍生物分离。
在本发明的缀合物中，聚合物(例如X或X’)可为例如聚烷撑二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸酯(如聚丙烯酰吗啉)、聚甲基丙烯酸酯、聚噁唑啉、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺或聚甲基丙烯酰胺(如聚羧甲基丙烯酰胺)或具有磷脂酰胆碱侧基的聚丙烯酸酯或聚甲基丙烯酸酯(例如2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱)，或HPMA共聚物。另外，所述聚合物还可为一种对酶或水解降解敏感的物质。此类聚合物包括例如聚酯、聚缩醛、聚(原酸酯)、聚碳酸酯、聚(碳酸亚氨酯)、和聚酰胺如聚(氨基酸)。所述聚合物可为均聚物、无规共聚物或一种结构确定的共聚物如嵌段共聚物。例如，其可为由两种或更多种环氧烷，或者由聚(环氧烷)与聚酯、聚缩醛、聚(原酸酯)或者聚(氨基酸)获得的嵌段共聚物。可使用的多官能聚合物包括二乙烯基醚-马来酸酐和苯乙烯-马来酸酐的共聚物。
也可使用天然存在的聚合物，例如多醣，如壳多糖、右旋糖苷、糊精、脱乙酰壳多糖、淀粉、纤维素、糖原、聚(唾液酸)，及其衍生物。也可使用蛋白质作为聚合物。这使得一种蛋白质(例如抗体或抗体片段)可与第二种蛋白质(例如酶或其它活性蛋白质)缀合。此外，如果使用含有催化序列(catalytic sequence)的肽，例如糖基转移酶的O-多糖受体位点，则能够为随后的酶促反应提供基点(substrate)或靶。也可使用以下聚合物，例如多聚谷氨酸，以及由天然单体(如糖类或氨基酸)和合成单体(如环氧乙烷或甲基丙烯酸)获得的杂化聚合物。
如果聚合物为聚烷撑二醇，则优选含有C2和/或C3单元，尤其是聚乙二醇。聚合物、特别是聚烷撑二醇可含有单一的线型链，或具有支链结构，并可由许多或大或小的链组成。所称的Pluronic是一类重要的PEG嵌段共聚物。它们由亚乙基氧基和亚丙基氧基嵌段获得。可使用取代的聚烷撑二醇，例如甲氧基聚乙二醇。在本发明的一个优选实施方案中，单链聚乙二醇由一个合适的基团起头，而链的另一端连接至连接基团Q或Q′，如下文所讨论；所述合适的基团例如烷氧基(如甲氧基)、芳氧基、羧基或羟基。
所述聚合物可任选地以任意所需方式衍生化或官能化。反应基团可在聚合物的末端或端基处连接，或经由侧链连接基团沿聚合物链连接；在此情况下，所述聚合物为例如聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯或一种马来酸酐共聚物。含有多于一个生物分子的多聚体缀合物可产生协同和加合效果。如果需要，可使用常规方法将所述聚合物连接至固体载体。
当然，聚合物的最佳分子量取决于预期用途。优选地，数均分子量在从250g/mol，例如500g/mol，至约75,000g/mol的范围内。如果意欲使通式I化合物脱离循环和渗透组织，例如用于治疗由恶性肿瘤、感染或自身免疫性疾病或者由外伤引起的炎症，则可有利地使用在2000-30,000g/mol范围内的较低分子量聚合物。对于意欲使通式I化合物保留在循环系统中的应用而言，可有利地使用较高分子量的聚合物，例如在20,000-75,000g/mol范围内。
待使用的聚合物应当选择为能够使缀合物溶于其预期用途的溶剂介质中。对于生物应用，特别是对于对哺乳动物临床治疗给药的诊断和治疗应用而言，缀合物应可溶于水性介质。许多蛋白质，例如酶，具有工业用途，例如用于催化化学反应。对于意欲用于此类应用的缀合物而言，其可能需要同时溶于水性和有机溶剂，或溶于二者之一。当然，所述聚合物不应过度削弱所述蛋白质的预期功能。
优选地，所述聚合物为一种合成聚合物，并且优选地，其为一种水溶性聚合物。对许多应用而言，使用水溶性聚乙二醇是特别优选的。
所述聚合物经由一个连接基团而合适地与多聚组氨酸标签共价连接。式I的连接基团Q′可包括基团W(即，Q′可等同于式Ia的-Q-W-)。连接基团Q’或Q可为例如直接的键、亚烷基(优选C1-10亚烷基)或任选被取代的芳基或杂环基，所有上述基团可被一个或多个氧原子、硫原子、-NR基团(其中R含义如下)、酮基、-O-CO-基团和/或-CO-O-基团封端或间隔。合适的芳基包括苯基和萘基，合适的杂环基包括吡啶、吡咯、呋喃、吡喃、咪唑、吡唑、噁唑、哒嗪、嘧啶和嘌呤。与聚合物的连接可通过水解性不稳定键或稳定键进行。
可存在于一个任选取代的芳基或杂环基上的取代基包括例如一个或多个相同或不同的选自以下的取代基：-CN、-NO2、-CO2R、-COH、-CH2OH、-COR、-OR、-OCOR、-OCO2R、-SR、-SOR、-SO2R、-NHCOR、-NRCOR、-NHCO2R、-NR’CO2R、-NO、-NHOH、-NR’OH、-C＝N-NHCOR、-C＝N-NR’COR、-N+R3、-N+H3、-N+HR2、-N+H2R、卤素(例如氟或氯)、-C≡CR、-C＝CR2和-C＝CHR，其中R或R’各自独立地代表氢原子或烷基(优选C1-6烷基)或芳基(优选苯基)。尤其优选存在吸电子取代基。
优选地，式Ia化合物中连接氢原子的基团Q为亚烷基或直接的键。最优选地，式Ia中的X为一种聚合物，且X’-Q-为H-。
W可代表例如酮基或醛基CO、酯基-O-CO-或砜基-SO2-，或一个通过还原例如CH.OH基团、醚基CH.OR、酯基CH.O.C(O)R，氨基CH.NH2、CH.NHR或CH.NR2，或酰胺基CH.NHC(O)R或CH.N(C(O)R)2而获得的基团。如果X-Q-W-一起代表一个吸电子基团，则该基团可为例如氰基。
当然，本发明的缀合方法中使用的精确条件取决于使用的缀合剂和被缀合的蛋白质或肽。这些条件为本领域技术人员的公知常识。例如，反应的pH通常在pH 4至pH 10之间，一般在约6和约8.5之间，例如约6.5至8.0，优选约7.0-7.5。反应混合物中的蛋白质或肽的浓度通常会在0.20mg/ml以上，一般在0.4mg/ml以上，例如0.5mg/ml至1.5mg/ml。当使用WO 2005/007197中的双官能试剂时，所述方法包括使以下物质之一与含有至少两个组氨酸残基的蛋白质或肽反应：
(i)一种通式(II)化合物，
其中X和X’中的一个代表一种聚合物，另一个代表氢原子；
Q代表一种连接基团；
W’代表一种吸电子基团，例如酮基、酯基-O-CO-或砜基-SO2-；或者如果X’代表一种聚合物，则X-Q-W’一起可代表一种吸电子基团；
A代表一种C1-5亚烷基或亚烯基链；
B代表一个键，或一种C1-4亚烷基或亚烯基链；并且
每个L独立地代表一种离去基团；
或者
(ii)一种通式(III)化合物，
其中X、X’、Q、W’、A和L具有通式II中所给出的含义，此外，如果X代表一种聚合物，则X’和吸电子基团W’可与其间的原子一起形成环，m代表1至4的整数。
缀合剂II和III彼此化学等价，并记载于WO 2005/007197中。它们的特征是具有一个交叉官能化的、潜在交叉缀合的双烷基化部分，所述部分对两种亲核试剂具有选择性。所述反应在一定条件下进行，以使所述试剂与待缀合的蛋白质中的两个组氨酸残基结合。出人意料的是，可获得对两个组氨酸残基的高选择性。其它缀合方法易于生成产物的混合物；例如，之前已发现，选择性地与组氨酸残基键合而不与赖氨酸残基键合是困难的。
所述或每个离去基团L可代表例如-SR、-SO2R、-OSO2R、-N+R3、-N+HR2、-N+H2R、卤素、或其中R含义如上，代表含有至少一个吸电子取代基的取代芳基，尤其是苯基，所述吸电子取代基例如-CN、-NO2、-CO2R、-COH、-CH2OH、-COR、-OR、-OCOR、-OCO2R、-SR、-SOR、-SO2R、-NHCOR、-NRCOR、-NHCO2R、-NR’CO2R、-NO、-NHOH、-NR’OH、-C＝N-NHCOR、-C＝N-NR’COR、-N+R3、-N+HR2、-N+H2R、卤素(尤其是氯或氟)、-C≡CR、-C＝CR2和-C＝CHR，其中R和R’含义如上。
其中W’和X’一起形成环的典型结构包括
其中n为1至4的整数，以及
在本发明方法的一个优选实施方案中，使用一种以下通式的试剂：
以制备一种新的以下通式的缀合物：
本发明方法的该实施方案的一个关键特征是α-亚甲基离去基团和双键与作为迈克尔(Michael)活化部分的吸电子官能团交叉缀合。如果在交叉官能性试剂中，离去基团倾向于发生消除而不是直接取代，并且吸电子基团是适于发生Michael反应的活化部分，则通过相继的迈克尔反应和逆迈克尔反应可发生连续的分子内二烷基化。所述离去部分用以掩蔽潜在缀合的双键，该双键直到第一个烷基化发生之后才暴露，然后由相继交互发生的迈克尔和逆迈克尔反应引发二烷基化，如J.Am.Chem.Soc.1979，101，3098-3110和J.Am.Chem.Soc.1988，110，5211-5212中所述。吸电子基团和离去基团最好选择为使双烷基化可通过相继的迈克尔反应和逆迈克尔反应进行。也可制备具有与双键缀合的、或位于离去基团和吸电子基团之间的另外的多重键的交叉官能团烷基化试剂，如J.Am.Chem.Soc.1988，110，5211-5212中所述。
本发明的新缀合物的一些实例包括下列物质：
可用于本发明方法的试剂的一些实例包括下列物质：
对于蛋白质而言，无论是在天然蛋白质中还是在多聚组氨酸标签中，组氨酸残基之间都彼此靠近，优选彼此相邻。当然，除聚乙二醇之外的聚合物也可代替上式中的PEG。不愿受任何理论束缚，与组氨酸残基的键合可如下式所示：
但与组氨酸中其它氮原子键合也是可行的。
上述方法的中间产物是一种通式Ia的化合物，其中W为一个吸电子基团。此类化合物本身也具有实用性；由于本发明方法在合适的条件下是可逆的，因此其中W为一个吸电子部分的式Ia化合物还可用于需要释放游离蛋白质的应用中，例如直接的临床应用中。然而，吸电子部分W可被还原为一个抑制释放蛋白质的部分，此类化合物也可用于许多临床、工业和诊断应用。另外，一旦W被还原，就不能再发生逆反应，这意味着如果添加一种更强的亲核物质，将不会观察到交换现象。因此，成为可能的是，例如，经由一个多聚组氨酸标签PEG化；还原W；然后还原蛋白质中的二硫键；随后通过还原的二硫键进行PEG化反应。对于一些蛋白质，也可不还原基团W而进行所述过程。
如此，例如含有酮基的部分W可被还原为含有CH(OH)基团的部分；醚基CH.OR可通过羟基与醚化剂的反应而获得；酯基CH.O.C(O)R可通过羟基与酰化剂的反应而获得；胺基CH.NH2、CH.NHR或CH.NR2可由酮或醛通过还原胺化而制备；或者酰胺CH.NHC(O)R或CH.N(C(O)R)2可通过胺的酰化而形成。为氰基的基团X-Q-W-可被还原为胺基。
所述方法可在所有反应物可溶的溶剂或溶剂混合物中进行。可使蛋白质与通式II或III的化合物在水性反应介质中直接反应。根据亲核试剂的pH要求，也可对所述反应介质进行缓冲。所述反应的最佳pH通常为至少6.0，一般在约6.8至约8.5之间，例如约6.5或7.0至8.0，例如约7.5-8.0，但优选约7.0至7.5。出人意料的是，本发明的方法在碱性pH下能够选择性地连接至组氨酸残基(特别是多聚组氨酸标签中的组氨酸残基)，而PEG化作用的文献方法倾向于教导碱性条件会导致非选择性的PEG化，包括赖氨酸残基的PEG化，并且教导组氨酸的PEG化在pH 6.0至6.5的条件下最优。甚至在这种情况下，文献方法提供的也是非选择性的PEG化，包括赖氨酸的PEG化。当然，最佳反应条件取决于所用的具体反应物，但总体上，使用朝向上述范围下端点的pH将倾向于提高与组氨酸结合的选择性，而使用朝向上述范围上端点的pH将倾向于提高产率。
3-37℃之间的反应温度通常是合适的：如果缀合反应在蛋白质可发生分解或变质的温度下进行，则蛋白质的分解或变质会削弱功效。在有机介质(例如THF、乙酸乙酯、丙酮)中进行的反应通常在最高达环境温度的温度下进行。
与许多其它试剂不同，通过使用化学计量当量或略微过量的所需试剂，蛋白质可与所需试剂有效地缀合。然而，由于所述试剂不与用于使蛋白质溶剂化的水性介质发生竞争性反应，因此可与超过化学计量的试剂进行缀合反应。过量的试剂和产物可容易地在蛋白质的常规纯化过程中通过离子交换色谱分离，或通过使用镍的分离方法分离。
另一类可用于与组氨酸标签缀合的化合物由以下通式(IV)化合物表示：
X-[Q-W’-(CH＝CH)v-(CH2)2-L]v’ (IV)
其中X、Q、v和v’含义如上，W’代表吸电子基团，L代表离去基团。这种缀合方法形成的直接产物是式Ib的化合物，其中W为吸电子基团。如果需要，生成的式Ib化合物可被转化为任意其它所需产物。特别是，吸电子基团可被还原，如上所述。
一种特别优选的通式IV的试剂具有以下的通式IVa：
X-[NH-CO-Ar-W’-(CH＝CH)v-(CH2)2-SO2R]v’(IVa)
其中Ar代表未取代或取代的芳基，尤其是苯基，其中任选的取代基选自上述对于连接基团Q中含有的芳基所提及的那些；R、W’、v和v’含义如上；以制备以下通式的新缀合物：
X-[NH-CO-Ar-W-(CH＝CH)v-(CH2)2-Z]v’(Ic)
在这些优选的化合物中，优选v为0，并优选v’代表一个1至4的整数，尤其是1。优选W’代表CO基团，且W代表CO基团或CH.OH基团。优选R代表C1-4烷基-芳基，尤其是对甲苯基。优选Ar为未取代的苯基。优选X为聚烷撑二醇，尤其是聚乙二醇。
当使用通式IV的试剂时，使用的合适的反应条件与关于试剂II和III的上下文中所讨论的反应条件相同。
认为使用式IV的试剂的缀合方法通过形成具有以下通式的中间体化合物进行
X-[Q-W’-(CH＝CH)v-CH＝CH2]v’(V)
其中X、Q、W’、v和v’含义如上。如果优选在待缀合的分子的存在下原位生成上式V的化合物，则在整个过程中使用相对较高的pH是合适的。或者，如果优选在一个单独的步骤中形成上式V的化合物并随后加入待缀合的分子，则第一步适于在相对较高的pH(例如7.5至8.0)下进行，而下一步适于在较低的pH(例如6.0至6.5)下进行。
如上所述，根据存在的组氨酸残基的数目，可使多于一种的聚合物与合适的蛋白质缀合，这示意性地在图3中示出。例如，两个聚合物可与一个6-残基多聚组氨酸标签缀合。这提供了一种将多个聚合物残基连接至一个蛋白质上的有用方法。当希望使用一种较低分子量PEG获得一种较高分子量产物时，例如使用三个20kD PEG链获得一个60kD分子量产物时，或当希望将两种不同聚合物例如一个蛋白质和一个PEG加至另一蛋白质以获得多重功效时，或当希望在一个步骤中实现例如糖基化和PEG化时，所述方法可能是需要的。所述多重缀合通常难以使用常规缀合技术实现。
许多蛋白质含有游离半胱氨酸残基和/或二硫桥键，且用于制备本发明的新缀合物的缀合剂也可与暴露的半胱氨酸残基和还原的二硫桥键反应。根据反应条件和蛋白质结构，所述缀合剂较之与多聚组氨酸标签中的组氨酸残基的反应而言，可优先与这些部分反应。因此，如果需要缀合一种除含有多聚组氨酸标签外还含有此类部分的蛋白质，则如果需要可使用合适的嵌段方法。例如，所述部分可通过与符合上述通式II、III或IV——其中聚合物为相对低分子量的部分——的试剂进行缀合而嵌入。然后可使用所需试剂进行与组氨酸残基的缀合。
通式I的化合物具有许多应用。其可以例如直接临床应用于患者，因此，本发明还提供了一种含有一种本发明的化合物和一种可药用载体的药物组合物。本发明还提供了一种用于治疗的本发明的化合物，以及一种治疗患者的方法，所述方法包括对患者施用药物有效量的本发明的化合物或药物组合物。通过适当选用蛋白质可得到任意需要的药效，例如创伤治疗、酶替代治疗、蛋白质替代治疗、伤口护理、毒物去除、抗炎、抗感染、免疫调节、接种疫苗或抗癌。
本发明的化合物也可用于非临床应用。例如，许多生理活性化合物例如酶能够在有机溶剂中催化反应，且本发明的化合物可用于此类应用。另外，本发明的化合物可用作诊断工具。本发明的化合物可包括一种显影剂，例如一种放射性核苷酸(radio nucleotide)，以能够在活体内跟踪所述化合物。
所述蛋白质可为例如一种肽、多肽、抗体、抗体片段、酶、细胞因子、趋化因子、受体、血液因子、肽激素、毒素、转录蛋白或多聚体蛋白。
下面给出一些根据所需应用可用于本发明的具体蛋白质。酶包括糖类专一性酶(carbohydrate-specific enzyme)、蛋白水解酶等。对于普遍的工业(基于有机物的反应)和生物应用以及具体的治疗应用而言，重要的酶包括氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶和连接酶，如US 4,179,337所公开。重要的具体的酶包括天冬酰胺酶、精氨酸酶、腺甙脱氨酶、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、胰凝乳蛋白酶、脂肪酶、尿酸酶、胆红素氧化酶、葡糖氧化酶、葡萄糖苷酸酶、半乳糖苷酶、葡糖脑苷脂酶、葡萄糖苷酸酶、谷氨酰胺酶。
本发明的化合物中使用的蛋白质包括例如因子VII、VIII或IX和其它血液因子，胰岛素、ACTH、高血糖素、生长激素抑制素、生长激素、胸腺素、甲状旁腺激素、色素激素、生长调节素、红细胞生成素、黄体化激素、下丘脑释放因子、抗利尿激素、催乳激素、白细胞介素、干扰素、集落刺激因子、血红素、细胞因子、抗体、绒毛膜促性腺激素、促卵泡成熟激素、垂体甲状腺刺激素和组织纤维蛋白溶酶原激活剂。
某些上述蛋白质如白细胞介素、干扰素和集落刺激因子也以非糖基化的形式存在，并且通常通过重组蛋白质技术制备。所述非糖基化的变体也可用于本发明。
其它重要的蛋白质有变应原蛋白质，Dreborg等的Crit.Rev.Therap.Drug Carrier Syst.(1990)6315365中公开了，当与一种聚合物如聚(环氧烷)缀合时，变应原蛋白质具有降低的变应原性，并因而适于用作耐受诱发剂。在所公开的变应原中有豚草抗原E、蜂毒、尘螨变应原等。
糖聚肽如免疫球蛋白、卵清蛋白、脂肪酶、葡糖脑苷脂酶、外源凝集素、组织纤维蛋白溶酶原激活剂和糖基化的白细胞介素、干扰素和集落刺激因子是重要的，免疫球蛋白有例如IgG、IgE、IgM、IgA、IgD及其片段。
特别重要的有用于诊断和治疗目的的临床药物中的受体和配体结合蛋白质以及抗体和抗体片段。所述抗体可单独使用或可与另一种原子或分子如一种放射性同位素或一种细胞毒素/抗感染药共价缀合(“加载”)。抗原决定基可用于接种以产生一种免疫性的聚合物-蛋白质缀合物。
下列实施例示例说明本发明。实施例的结果示于附图4至20中。在实施例中，使用含有一种具有6个组氨酸残基的多聚组氨酸标签的蛋白质proBNP和含有一种具有8个组氨酸残基的多聚组氨酸标签的β突触核蛋白。在心脏组织中，脑促尿钠排泄肽(BNP)作为一种134氨基酸前体(BNP前体)被合成，用蛋白酶使其裂解以形成一种108氨基酸proBNP。β突触核蛋白是一种主要在脑组织中存在的小的可溶性蛋白质，具有类伴侣蛋白活性。使用的其它蛋白质有干扰素α-2b、内皮他丁(endostatin)和一种抗TNFα域抗体片段。
实施例1：His6-proBNP的12kDa PEG化
PEG试剂结构：
将PEG双砜(结构(1))在pH 7.8的50mM磷酸钠缓冲液(10mg/mL)中培养5小时，以制备12kDa PEG单砜(结构(2))。将两等份的溶于pH7.8的50mM磷酸钠中的C端6×组氨酸标签proBNP(Abcam，ab51402，13kDa)(10μL，0.5mg/mL)用冰冷却，然后加入1摩尔当量(相对于蛋白质的浓度)或3摩尔当量的12kDa PEG单砜(分别为1.6μL或4.8μL)。然后将所述反应混合物置于冰箱中放置16小时。
使用SDS-PAGE分析所形成的反应混合物以根据大小分离其成分，用Instant Blue(Novexin)着色后形成的凝胶示于图4中。在图4中，标记M的泳道(lane)示出Novex Sharp蛋白质标记(Invitrogen)。泳道1中标记B的带(band)是提供的His6-proBNP试样(Abcam，1mg/mL)。带A为杂质。泳道2由1当量的12kDa PEG反应混合物获得，并示出标记C、D和E的带，其分别对应于单PEG化产物、二PEG化产物和三PEG化产物。标记A和B的较低带分别对应于所提供的试样中的未反应的His6-proBNP和杂质。泳道3由3当量的12kDa PEG反应混合物获得，并示出标记C、D和E的带，其分别对应于单PEG化产物、二PEG化产物和三PEG化产物。标记B和A的较低带分别对应于提供的试样中的未反应的His6-proBNP和杂质。
然后也使用碘化钡对所述凝胶着色以使PEG可视化，结果示于图5中。泳道1中的带对应于未反应的PEG试剂，标记为C，标记D、E和F的带分别对应于单PEG化产物、二PEG化产物和三PEG化产物。标记B和A的较低带分别对应于所提供的试样中的未反应的His6-proBNP和杂质。泳道3由3当量的12kDa PEG反应混合物获得，其示出标记C的带，其对应于未反应PEG试剂；标记D、E和F的带，其分别对应于单PEG化产物、二PEG化产物和三PEG化产物。标记B和A的较低带分别对应于所提供的试样中的未反应的His6-proBNP前体和杂质。
实施例2：His6-proBNP的30kDa PEG化
将PEG双砜(实施例1中的结构(1))在pH为7.8的50mM磷酸钠缓冲液(10mg/mL)中培养5小时，以制备30kDa PEG单砜(实施例1中的结构(2))。将两等份的溶于pH 7.8的50mM磷酸钠中的C端6×组氨酸标签proBNP(Abcam，ab51402)(10μL，0.5mg/mL)用冰冷却，然后加入1摩尔当量(相对于蛋白质的浓度)或3摩尔当量的30kDa PEG单砜(分别为2.0μL或6.0μL)。然后将所述反应物置于冰箱中放置16小时。
所得反应混合物使用SDS-PAGE进行分析，以根据大小分离其成分，使用Instant Blue(Novexin)着色后形成的凝胶示于图6中。标记M的泳道示出Novex Sharp蛋白质标记(Invitrogen)作为校准物。泳道1中标记B的带是所提供的His6-proBNP试样(Abcam，1mg/mL)。带A为杂质。标记2的泳道由1当量的30kDa PEG反应混合物获得，并示出标记C的带，其对应于单PEG化的产物；以及标记A和B的较低带，其分别对应于所提供的试样中未反应的His6-proBNP和杂质。标记3的泳道由3当量的30kDa PEG反应混合物获得，其示出标记C和D的带，其分别对应于单PEG化产物和二PEG化产物；以及标记B和A的较低带，其分别对应于所提供的试样中未反应的His6-proBNP和杂质。
然后将所述凝胶使用碘化钡着色以使PEG可视化，结果示于图7中。标记M的泳道示出作为校准物的Novex Sharp蛋白质标记(Invitrogen)。泳道1中标记B的带是所提供的His6-proBNP试样(Abcam，1mg/mL)。带A为杂质。标记2的泳道由1当量的30kDaPEG反应混合物获得，且示出标记C的带，其对应于单PEG化的产物；标记F的带，其对应于PEG杂质；标记D、E和F的带，其分别对应于单PEG化产物和二PEG化产物，以及标记B和A的较低带，其分别对应于所提供的试样中未反应的His6-proBNP和杂质。标记3的泳道由3当量的30kDa PEG反应混合物获得，并示出标记C的带，其对应于未反应的PEG试剂；标记F的带，其对应于PEG杂质；标记D和E的带，其分别对应于单PEG化产物和二PEG化产物；以及标记B和A的带，其分别对应于所提供的试样中未反应的His6-proBNP和杂质。
实施例3：His8-β突触核蛋白的12kDa PEG化和与不带组氨酸标签的β突触核蛋白的对比反应
将PEG双砜(实施例1中的结构(1))在pH 7.8的50mM磷酸钠缓冲液(10mg/mL)中培养5小时，以制备12kDa PEG单砜(实施例1中的结构(2))。将两等份的溶于pH 7.8的50mM磷酸钠中的N端8×组氨酸标签β突触核蛋白(Abcam cat.no.ab40545，15kDa)(10μL，0.39mg/mL)用冰冷却，然后加入1摩尔当量(相对于蛋白质浓度)或者3摩尔当量的12kDa PEG单砜(分别为1.6μL或4.7μL)。然后将所述反应物置于冰箱中放置16小时。
使用SDS-PAGE分析形成的反应混合物以根据大小分离其成分，用Instant Blue(Novexin)着色后生成的凝胶示于图8中。标记M的泳道示出作为校准物的Novex Sharp蛋白质标记(Invitrogen)。
泳道1中标记B的带是由Abcam提供的His8-β突触核蛋白试样(0.8mg/mL)。带A为杂质。标记2的泳道由1当量的12kDa PEG反应混合物获得，并示出标记C和D的带，其分别对应于单PEG化产物和二PEG化产物；以及标记A和B的较低带，其分别对应于提供的试样中的未反应的His8-β突触核蛋白和杂质。标记3的泳道由3当量的12kDa PEG反应混合物获得，并示出标记C、D、E和F的带，其分别相应于单PEG化产物、二PEG化产物、三PEG化产物和四PEG化产物；以及标记B和A的较低带，其分别对应于提供的试样中的未反应的His8-β突触核蛋白和杂质。
然后再将所述凝胶用碘化钡着色以使PEG可视化，形成的凝胶示于图9中。在图9中，标记M的泳道示出作为校准物的Novex Sharp蛋白质标记(Invitrogen)。标记1的泳道由Abcam提供的His8-β突触核蛋白获得。标记2的泳道由1当量的12kDa PEG反应混合物获得，并示出标记C、D和E的带，其分别对应于单PEG化产物、二PEG化产物和三PEG化产物；以及标记B和A的较低带，其分别对应于提供的试样中的未反应的His8-β突触核蛋白和杂质。标记3的泳道由3当量的12kDa PEG反应混合物获得，并示出标记D、E和F的带，其分别对应于单PEG化产物、二PEG化产物、三PEG化产物和四PEG化产物；以及标记B和A的较低带，其分别对应于提供的试样中的未反应的His8-β突触核蛋白和杂质。带C为PEG杂质。
在pH 7.0时使用1当量的PEG试剂(2)对His8-β突触核蛋白和不带组氨酸标签的β突触核蛋白(Abcam.cat no.ab48853)进行对比12kDa PEG化研究，SDS-PAGE结果示于图10中。标记M的泳道示出作为校准物的Novex Sharp蛋白质标记(Invitrogen)。His8-β突触核蛋白结果示于标记1的泳道中。在泳道1中，标记B的带是未反应的His8-β突触核蛋白，标记C的带是单PEG化的His8-β突触核蛋白。标记2的泳道示出不带组氨酸标签的β突触核蛋白反应，唯一可见的带为标记A且其为不带组氨酸标签的β突触核蛋白。泳道2中没有PEG化的蛋白质带。
实施例4：His8-β突触核蛋白的30kDa PEG化
将PEG双砜(实施例1中的结构(1))在pH 7.8的50mM磷酸钠缓冲液(10mg/mL)中培养5小时，以制备30kDa PEG单砜(实施例1中的结构(2))。将一份溶于pH 7.8的50mM磷酸钠中的N端8×组氨酸标签β突触核蛋白(Abcam，ab40545，15kDa)(10μL，0.39mg/mL)用冰冷却，然后加入1摩尔当量(对于蛋白质浓度)的30kDa PEG单砜(1.6μL)。然后将所述反应物置于冰箱中放置16小时。
使用SDS-PAGE分析形成的反应混合物以根据大小分离其成分，用Instant Blue(Novexin)着色后形成的凝胶示于图11中。在图11中，标记M的泳道示出作为校准物的Novex Sharp蛋白质标记(Invitrogen)。标记1的泳道由Abcam提供的His8-β突触核蛋白试样(0.8mg/mL)获得，标记B的带是带有多聚组氨酸标签的蛋白质，并且标记A的带为杂质。标记2的泳道由1当量的30kDa PEG反应混合物获得，并示出标记C的带，其对应于单PEG化产物；以及标记A和B的较低带，其分别对应于提供的试样中的未反应的His8-β突触核蛋白和杂质。
然后再用碘化钡对所述凝胶着色以使PEG可视化，形成的凝胶示于图12中。在图12中，标记M的泳道示出作为校准物的Novex Sharp蛋白质标记(Invitrogen)。标记1的泳道由Abcam提供的His8-β突触核蛋白获得。标记2的泳道由1当量的30kDa PEG反应混合物获得，并示出标记C的带，其对应于未反应的PEG试剂；标记E和G的带，其对应于PEG杂质；标记D和F的带，其分别对应于单PEG化产物和二PEG化产物；以及标记B和A的较低带，其分别对应于提供的试样中的未反应的His8-β突触核蛋白和杂质。
实施例5：用10kDa和20kDa PEG试剂3对C端8组氨酸序列的IFNα-2b中的组氨酸的PEG化
步骤1，对羧基-3-呱啶基苯丙酮盐酸盐3(2)的合成
向250ml的圆底烧瓶中加入对乙酰基苯甲酸(15.0g，3(1))、11.11g哌啶盐酸盐和8.23g多聚甲醛。然后加入无水乙醇(90ml)和浓盐酸(1ml)，所得悬浮液在氩气下加热回流10h，同时进行搅拌。停止回流后，加入丙酮(150ml)并将反应混合物冷却至室温。生成的白色沉淀通过玻璃滤器(G3)分离，并用冷丙酮洗涤两次。然后将固体在真空下干燥，得到一种白色晶体粉末(3(2)，9.72g)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ1.79，2.96，3.45(br m，哌啶部分的CH2)，3.36(t，2H，COCH2)，3.74(t，2H，NCH2)，8.09(m，4H，ArH)。
步骤2：4-(3-(对甲苯基硫)丙酰基)苯甲酸3(5)的合成
将对羧基-3-呱啶基苯丙酮盐酸盐3(2)(1.0g)和4-甲基苯硫酚(417mg，3(3))悬浮于无水乙醇(7.5ml)和甲醇(5ml)的混合物中。然后加入哌啶(50l)，并将悬浮液在氩气环境中在搅拌下加热回流6h。冷却至室温后，得到的白色沉淀用玻璃滤器(G3)滤出，用冷丙酮小心洗涤并真空干燥，得到3(3)(614mg)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ2.27(s，3H，苯基-CH3)，3.24，3.39(t，2x 2H，CH2)，7.14，7.26(d，2x 2H，甲苯基部分的ArH)，8.03(m，4H，羧酸部分的ArH)。
步骤3：4-(3-甲苯磺酰基丙酰基)苯甲酸3(4)的合成
将4-(3-(对甲苯基硫)丙酰基)苯甲酸3(4)(160mg)悬浮于水(10ml)和甲醇(10ml)的混合物中。在冰浴中冷却后，加入过硫酸氢钾(720mg，Aldrich)，并将反应混合物升温至室温并搅拌过夜(15h)。所得悬浮液用另外的水(40ml)稀释以变得接近均匀，然后将混合物用氯仿(总计100ml)萃取三次。合并的氯仿萃取物用盐水洗涤，然后用MgSO4干燥。在30℃于真空下使挥发物蒸发，得到一种白色固体3(4)(149mg)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ2.41(s，3H，苯基-CH3)，3.42(t，2H，CO-CH2)，3.64(t，2H，SO2-CH2)，7.46，7.82(d，2x 2H，甲苯基部分的ArH)，8.03(m，4H，羧酸部分的ArH)。
步骤4：PEG化的4-(3-甲苯磺酰基丙酰基)苯甲酸，PEG试剂3的合成
将4-(3-甲苯磺酰基丙酰基)苯甲酸3(4)(133mg)和O-(2-氨基乙基)-O′-甲基-PEG(MW 10kDa，502mg，BioVectra)溶于干燥的甲苯(5ml)中。在真空且不加热的条件下除去溶剂，然后在氩气下将干燥固体残渣再溶于干燥的二氯甲烷中(15ml)。在氩气下向在冰浴中冷却后的溶液中缓慢加入二异丙基碳二亚胺(DIPC，60mg)。然后将反应混合物室温搅拌过夜(15h)。然后在真空下(30℃，水浴)除去挥发物，得到一种固体残渣，将所述固体残渣微热(35℃)溶于丙酮(20ml)中。所述溶液在非吸水脱脂棉上过滤以除去不溶物。然后将溶液在干冰浴中冷却，得到一种白色沉淀，将所述白色沉淀离心分离(4600rpm，30min)。倾出液体相，并将所述沉淀步骤重复三次。随后减压干燥所得灰白色固体，得到PEG试剂3(437mg)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ2.46(s，3H，苯基-CH3)，3.38(s，3H，PEG-OCH3)，3.44-3.82(br m，PEG)，7.38，7.83(d，2x 2H，甲苯基部分的ArH)，7.95(m，4H，羧酸部分的ArH)。
步骤5：对C端his8-标签的IFNα-2b的组氨酸的PEG化
向20μl的IFNα-2b溶液(1.13mg/ml，溶于含有2mM EDTA和150mM NaCl的10mM磷酸钠缓冲液中，pH 7.5)中加入1摩尔当量的10kDa PEG试剂3(1.8μl的6mg/ml的去离子水溶液)，所得溶液室温培养过夜。使用还是通过与上述所给的类似的方法制备的1摩尔当量的20kDa PEG试剂重复进行一次(3.3μl的6.6mg/ml的去离子水溶液。然后两种试样均通过SDS-PAGE分析(Novex4-12％Bis-Tris凝胶、MES电泳缓冲液——其均从Invitrogen获得——以及Instant Blue着色(Expedeon cat.No.ISB1L))。结果示于图13中。在标记1的泳道中的是蛋白质标记。泳道2只有起始IFN。泳道3示出10kDa PEG试剂反应的结果。在对应于用1至5PEG链缀合的IFN的30和160KDa蛋白质标记之间存在5条不同的带。泳道4示出20kDa PEG试剂反应的结果。在对应于1至3PEG链缀合的IFN的60和110KDa蛋白质标记之间存在3条不同的带。标记5的泳道是没有着色的20kDa PEG试剂，所以所述带不可见。标记6的泳道是没有着色的10kDa PEG试剂，所述所述带不可见。
实施例6：His8-β-突触核蛋白的5kDa PEG化
将PEG双砜(结构(4))在pH 7.8的50mM磷酸钠缓冲液(5mg/mL)中培养3小时，以制备5kDa PEG单砜(结构(5))。将两等份的溶于pH 7.4的50mM磷酸钠中的N端8×组氨酸标签β突触核蛋白(Abcam cat.no.ab40545，15.4kDa)(10μL，0.38mg/mL)用冰冷却，然后加入1摩尔当量(相对于蛋白质浓度)或者3摩尔当量的5kDa PEG单砜(5)(分别是0.25μL或0.74μL)。作为对照，将两等份的β突触核蛋白(Abcam cat.no.ab48853，14.3kDa)用相同的方式处理，并提供1摩尔当量(0.18μL)或者3当量(0.52μL)的5kDaPEG单砜。然后将反应物在室温培养6h。所得反应溶液使用SDS-PAGE进行分析，并用Instant Blue(Expedeon)着色，如图14所示。标记M的泳道示出作为校准物的Novex Sharp蛋白质标记(Invitrogen)。标记1和2的泳道分别由1当量的5kDa PEG反应混合物和3当量的PEG反应混合物获得。标记A的带是His8-β突触核蛋白。其下微弱的带是由Abcam提供的蛋白质中的杂质。标记B、C、D和E的带分别对应于单PEG化、二PEG化、三PEG化和四PEG化的蛋白质产物。
实施例7：在不同pH时的His6-抗TNF-α域抗体片段的10kDaPEG化
将PEG双砜(实施例1中的结构(1)，10mg/mL)在pH 7.8的50mM磷酸钠缓冲液(5mg/mL)中培养3小时，以制备10kDa PEG单砜(实施例1中的结构(2))。在4个不同pH(pH 6.2、pH 6.7、pH 7.0和pH 7.4)制备C端6×组氨酸标签抗TNFα域抗体片段(12.7kDa)于50mM磷酸钠、150mM氯化钠和2mM EDTA中的溶液(0.6mg/mL)。向处于四个不同pH中每一个的His6-域溶液(10μL，0.6mg/mL)中加入三摩尔当量的10kDa PEG单砜((2)，1.41μL)。然后将反应物在室温培养3h。
使用SDS-PAGE分析形成的反应溶液，并用Instant Blue(Expedeon)着色，如图15所示。标记M的泳道示出Novex Sharp蛋白质标记(Invitrogen)。标记1至4的泳道分别在pH 6.2、pH 6.7、pH 7.0和pH 7.41由使用3摩尔当量的10kDa PEG的反应混合物获得。标记A的带是未反应的His6-抗TNFα域抗体片段。标记B的带是单PEG化的域产物。标记C和D的带分别对应于二PEG化和三PEG化的域片段。在四个pH中每一个时均观察到PEG化，且PEG化的程度随pH的增加而增加。
实施例8：使用10kDa、20kDa、30kDa和40kDa PEG的His6-抗TNF-α域抗体片段的PEG化
10kDa、20kDa、30kDa和40kDa PEG双砜(实施例1的结构(1))在室温下分别于pH 7.8的50mM磷酸钠缓冲液中培养3小时，以得到相应的PEG单砜(实施例1的结构(2))。对于10kDa、20kDa、30kDa和40kDa PEG而言，PEG的浓度分别为10mg/mL、20mg/mL、30mg/mL和40mg/mL。然后向四等份的C端6组氨酸标签抗TNF域抗体(12.7kDa)于50mM磷酸钠、150mM氯化钠和2mM EDTA中的溶液(1.25mg/mL，5μL)中加入10kDa、20kDa、30kDa和40kDa PEG单砜溶液(0.74μL，1.5摩尔当量)。然后将该反应物在4℃培养8小时。然后使用SDS-PAGE分析所述反应溶液，如图16所示。标记M的泳道示出作为校准物的Novex Sharp蛋白质标记(Invitrogen)。标记1的泳道是作为参照示出的His6-抗TNF域抗体片段。标记2至5的泳道分别由10kDa、20kDa、30kDa和40kDa PEG的反应获得。标记A的带是未反应的His6-抗TNF域。标记B的带(B10、B20、B30和B40)分别对应于10、20、30和40kDa PEG的单PEG化的域片段。标记C10的带对应于10kDa PEG反应的二PEG化产物，C20带对应于20kDa PEG反应的二PEG化产物。
实施例9：His6-内皮他丁的2kDa PEG化以及与不带多聚组氨酸标签的内皮他丁的对比反应
将PEG双砜(实施例1中的结构(1))在pH 7.8的50mM磷酸钠缓冲液中(1mg/mL)培养4小时，以制备2kDa PEG单砜(实施例1中的结构(2))。将两等份的溶于pH 6.2的50mM磷酸钠中的C端6×组氨酸标签内皮他丁(Calbiochem cat.no.324743)(30μL，0.5mg/mL)用冰冷却，然后加入1摩尔当量(相对于蛋白质浓度)或者3摩尔当量的2kDa PEG单砜(分别是1.4μL或4.2μL)。然后将反应混合物置于冰箱中放置16小时。
将两等份的溶于pH 6.2的50mM磷酸钠中的不带标签的内皮他丁(Calbiochem cat.no.324769)(10μL，0.2mg/mL)也用冰冷却，然后加入1摩尔当量(相对于蛋白质浓度)或者3摩尔当量的2kDaPEG单砜(0.1mg/mL)(分别是2.0μL或6.0μL)。然后将反应物置于冰箱中放置16小时。
使用SDS-PAGE分析形成的反应溶液以根据大小分离其成分，用Instant Blue(Expedeon)着色后形成的凝胶示于图17中。在图17中，标记M的点的左侧柱(left-hand column)示出Novex Sharp蛋白质标记(Invitrogen)。标记1的泳道由1当量的2kDa PEG与His6-内皮他丁反应的试样获得，并示出标记B和C的分别对应于未反应的蛋白质和单PEG化产物的带。标记2的泳道由3当量的2kDa PEG与His6-内皮他丁反应的试样获得，并示出标记B和C的分别对应于未反应的蛋白质和单PEG化的产物的带。标记3和4的泳道分别由1当量的2kDa PEG与内皮他丁反应和3当量的2kDa PEG与内皮他丁反应获得。对两个反应而言，仅存在一个分别标记为A和B的对应于未反应的蛋白质的带，表明2kDa PEG仅与His6-内皮他丁反应。
实施例10：His8-干扰素α的20kDa和30kDa PEG化及与不带组氨酸标签的干扰素α的对比反应
在含有150mM氯化钠的pH 7.4的50mM磷酸钠缓冲液(PBS)中制备N端8×组氨酸标签干扰素α-2b溶液(2.63mL，1.14mg/mL)，然后加入1.7摩尔当量的(相对于蛋白质浓度)的20kDa PEG双砜(实施例1的结构(1))(420μL的11.5mg/mL 20kDa PEG双砜的去离子水溶液)。将反应物置于冰箱中18小时。通过SDS-PAGE分析所述形成的反应混合物，结果示于图18中。在图18中，标记M的泳道示出作为校准物的Novex Sharp蛋白质标记(Invitrogen)。标记1的泳道示出所述反应溶液，其中标记A的带对应于未反应的IFN，标记B的带对应于单PEG化的IFN，标记C的带对应于二PEG化的IFN，及标记D的带对应于三PEG化的IFN。
第二个反应使用1当量的0.5mg/ml的30kDa PEG与pH 7.5的N端8×组氨酸标签干扰素α-2b溶液(3.2mL，0.793mg/mL)。结果与20kDa反应类似，在60和80kDa蛋白质标记间可见一个单PEG化的IFN带，一个在110和160kDa间的对应于二PEG化的IFN的带和在160和260kDa蛋白质标记间的对应于三PEG化的IFN的第三个带。使用不带组氨酸标签的INFα-2b的对比反应显示，在相同条件下，18h后，与1当量的PEG试剂(1)不发生反应，结果示于图18的泳道2。
实施例11：使用聚(乙烯吡咯烷酮)(PVP双砜)缀合至N端8×组氨酸标签干扰素α
制备带末端氨基的PVP：将半胱胺(0.042g)、二氧杂环已烷(8ml)和一个磁力搅拌棒装入一个压力管中。微热形成溶液后，在室温下用氩气吹扫该溶液5min。然后仍在吹扫下加入1-乙烯基-2-吡咯烷酮(2.0g)，再过5min后，加入2，2’-偶氮二(2-甲基丙腈)(0.089g)。再经过2min后，在氩气下用螺帽将压力管密封，并在搅拌下置于60℃的油浴23h。将所述管及其中所含物质冷却至室温后，加入乙醚(15ml)以使聚合产物沉淀。倾倒掉液相并将固体残渣再溶于丙酮(3ml)中。然后将形成的丙酮溶液滴加至快速搅拌的乙醚(25ml)中，沉淀在具有微弱真空脉冲的2号烧结玻璃漏斗上分离。所述固体用新鲜乙醚(10ml)洗涤，然后在室温真空下干燥(质量＝1.24g，白色固体)。
将蛋白质反应性末端基团缀合至PVP-胺：在氩气下将PVP-胺(500mg)、4-[2，2-二[(对甲苯基磺酰基)甲基]乙酰基]-苯甲酸(125mg)和4-二甲基氨基吡啶(6mg)与无水二氯甲烷(10ml)混合，然后在搅拌下加入1，3-二异丙基碳二亚胺(80μl)。所得混合物室温搅拌20h，然后通过非吸水脱脂棉过滤。然后向滤液中加入乙醚(20ml)并通过离心法(2000rpm，2min，2℃)分离形成的沉淀。倾倒掉液相，并用乙酸乙酯(5ml)使剩余的残渣涡动(vortexed)几分钟。倾倒掉乙酸乙酯相后，将固体残渣再溶于二氯甲烷(5ml)中，接着加入乙酸乙酯(15ml)。将所述溶液在干冰中放置15min以使固体沉淀，然后将所述固体通过离心法(2000rpm，2min，2℃)分离。用新鲜乙酸乙酯(5ml)使得到的粘性残渣涡动，然后在室温真空下干燥(质量＝0.118g)。
PVP双砜的分馏：将从上述步骤获得的固体物质与20mM乙酸钠、150mM NaCl的pH 4.0水缓冲液混合，然后在13000rpm下离心直至得到透明溶液。从固体残渣中除去溶液相，然后在以1ml/min流动的20mM乙酸钠缓冲液，150mM，pH 4.0的HiLoad 16/60SuperdexTM 200pg凝胶过滤柱上(GE Healthcare)通过在峰洗脱期间收集每一分钟的馏分而使所述溶液相分馏。在72至80min洗脱的馏分用于蛋白质缀合。
PVP与N端8×组氨酸标签IFNα的缀合：在含有150mM氯化钠的7.5的50mM磷酸钠缓冲液(PBS)中制备IFN(0.025mg，0.5mg/ml)。向50μl的IFN(25μg，0.5mg/ml)中加入50μl分馏的PVP双砜溶液(72min、74min、76min、78min和80min时的馏分)。将形成的溶液缓和地混合并在4℃放置过夜。通过SDS-PAGE分析形成的反应溶液，结果示于图19中。在图19中，标记M的泳道示出作为校准物的NovexSharp蛋白质标记(Invitrogen)。标记2至5的泳道示出使用不同尺寸的PVP试剂馏分(从2至5分别是72min至80min时的PVP馏分)的反应溶液。标记B的带示出获得的单PVP化及多PVP化的IFN。
实施例12：使用N端8×组氨酸标签干扰素α进行的干扰素α与干扰素α的多聚体缀合
在含有150mM氯化钠的pH 7.5的50mM磷酸钠缓冲液(PBS)中制备N端8×组氨酸标签干扰素α-2b溶液(50μL，1.14mg/mL)，然后加入0.125摩尔当量(相对于蛋白质浓度)的10kDa PEG双官能PEG试剂(6)(0.47μL的8mg/mL(6)的水溶液)。将反应物在室温放置18小时。通过SDS-PAGE分析形成的反应混合物。使用Instant Blue(Expedeon)着色之后，所得凝胶示出50kDa和60kDa Novex sharp蛋白质标记(Invitrogen)之间的带，其对应于IFN-PEG-IFN融合缀合物。
实施例13：N端8×组氨酸标签干扰素α与含有游离半胱氨酸的人血浆白蛋白(HAS)的多聚体缀合
向在含有150mM氯化钠的pH 7.5的50mM磷酸钠缓冲液(PBS)中制备的N端8×组氨酸标签干扰素α-2b溶液(1mL，1.14mg/mL)中加入人血浆白蛋白(相对于IFN为3摩尔当量，10.77mg)并使其溶解。向该溶液中加入10kDa PEG二(双砜)(实施例12中的结构(6))(相对于IFN为1摩尔当量，75μL的8mg/mL 10kDa PEG二(双砜)(6)水溶液)。将该反应混合物在室温放置18小时。将所得反应混合物通过离子交换色谱，接着通过金属离子亲和色谱纯化，然后通过SDS-PAGE分析，结果示于图20中。在图20中，标记M的泳道示出作为校准物的Novex Sharp蛋白质标记(Invitrogen)。标记1的泳道示出纯化的反应溶液，其中标记A的带是未反应的IFN，标记B的带是单PEG化的IFN，标记C的带是IFN-PEG-IFN，及标记D的带是IFN-PEG-白蛋白。

Claims (20)

1.一种用于制备包含一种缀合至蛋白质或肽上的聚合物的化合物的方法，所述缀合经由一种多聚组氨酸标签进行，所述方法包括使一种聚合的缀合试剂与一种含有多聚组氨酸标签的蛋白质或肽在能够使缀合经由所述多聚组氨酸标签进行的条件下反应，其中所述聚合物选自：聚烷撑二醇，一种聚乙烯吡咯烷酮，一种聚丙烯酸酯，一种聚甲基丙烯酸酯，一种聚噁唑啉，一种聚乙烯醇，一种聚丙烯酰胺，一种聚甲基丙烯酰胺，一种水解聚马来酸酐共聚物，一种聚酯、聚缩醛、聚(原酸酯)、聚碳酸酯、聚(碳酸亚胺酯)、聚酰胺，一种环氧烷与一种聚酯、聚缩醛、聚(原酸酯)或聚(氨基酸)的共聚物，一种多糖，一种蛋白质、多聚谷氨酸，或者二乙烯基醚-马来酸酐与苯乙烯-马来酸酐的共聚物。
2.权利要求1的方法，其中所述多聚组氨酸标签含有2至12个组氨酸残基。
3.权利要求2的方法，其中所述多聚组氨酸标签含有4至10个组氨酸残基。
4.权利要求1的方法，其中所述聚合物是一种聚烷撑二醇。
5.权利要求4的方法，其中所述聚合物是一种含有C2和/或C3单元的聚烷撑二醇。
6.权利要求5的方法，其中所述聚合物是一种聚乙二醇。
7.权利要求1的方法，其中所述聚合物是一种蛋白质。
8.权利要求1的方法，其中所述缀合的蛋白质或肽是一种抗体、抗体片段、酶、细胞因子、趋化因子、受体、血液因子、肽激素、毒素、转录蛋白或多聚体蛋白。
9.权利要求8的方法，其中所述缀合的蛋白质或肽是一种抗体或一种抗体片段。
10.权利要求1的方法，其中所述缀合的蛋白质或肽为一种已与一种或多种嵌段基团反应以保护其上的敏感基团的天然蛋白质；或为一种蛋白质，所述蛋白质还缀合有一种或多种聚合物、作为治疗剂或诊断剂的小分子、唾液酸、糖和/或淀粉。
11.权利要求1的方法，其中所制备的化合物为一种以下通式的化合物：
其中X和X’中的一个代表一种如权利要求1所定义的聚合物，另一个代表氢原子；
每个Q独立地代表一种连接基团；
W代表一种吸电子基团或通过还原一种吸电子基团而得到的基团；或者，如果X’代表一种聚合物，则X-Q-W-一起可代表一种吸电子基团；另外，如果X代表一种聚合物，则X’和吸电子基团W可与其间的原子一起形成环；
Z代表经由一种多聚组氨酸标签连接至A和B的一种蛋白质或一种肽；
A是一种C1-5亚烷基链或C1-5亚烯基链；并且
B是一个键或一种C1-4亚烷基链或C1-4亚烯基链；
所述方法包括：使（i）一种以下通式的化合物
其中X和X’中的一个代表一种如权利要求1所定义的聚合物，另一个代表氢原子；
Q代表一种连接基团；
W’代表一种吸电子基团；或者，如果X’代表一种聚合物，X-Q-W’一起可代表一种吸电子基团；
A代表一种C1-5亚烷基链或C1-5亚烯基链；
B代表一个键或一种C1-4亚烷基链或C1-4亚烯基链；且
每个L独立地代表一种离去基团；
或者（ii）一种以下通式的化合物
其中X、X’、Q、W’、A和L具有对于通式II所给出的含义，此外，如果X代表一种聚合物，则X’和吸电子基团W’可与其间的原子一起形成环，且m代表一个1至4的整数；
与一种含有多聚组氨酸标签的蛋白质或肽反应；以及如果需要，还原所述吸电子基团W’。
12.权利要求11的方法，其中每个Q独立地代表一个直接的键、一种C1-10亚烷基或一种任选被取代的芳基或杂芳基，其中任一基团可被一个或多个氧原子、硫原子、-NR基团、酮基、-O-CO-基团和/或–CO-O-基团封端或间隔，其中R代表氢原子或烷基或芳基。
13.权利要求12的方法，其中Q是一种亚烷基或一个直接的键。
14.权利要求12的方法，其中W代表酮基或醛基CO、酯基-O-CO-或砜基-SO2-，或一种通过还原酮基或醛基CO、酯基-O-CO-或砜基-SO2-基团获得的基团；或其中X-Q-W-一起代表一种吸电子基团。
15.权利要求12的方法，其中X是一种聚合物，且X’-Q-为H-。
16.权利要求1的方法，其中所制备的化合物具有以下通式：
X-[Q-W-(CH=CH)v-(CH2)2-Z]v’ （Ib）
其中X代表一种如权利要求1所定义的聚合物；Q代表一种连接基团；W代表一种吸电子基团或通过还原一种吸电子基团而得到的基团；v代表0或一个从1至4的整数；v’代表一个从1至8的整数；并且Z代表经由一种多聚组氨酸标签连接的一种蛋白质或一种肽。
17.权利要求16的方法，其中v为0。
18.权利要求1的方法，所述方法在6.8至8.5的pH值范围内进行。
19.权利要求18的方法，所述方法在7.0至8.0的pH值范围内进行。
20.权利要求19的方法，所述方法在7.5至8.0的pH值范围内进行。
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